ペプチドのリン酸基を脱離する方法及びペプチドの解析方法
酵素を用いずに化学的処理によってペプチドのリン酸基を脱離する方法及びその方法を用いてペプチドの解析を効率良く行う方法を提供する。フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む試剤を用いてペプチドのリン酸基を脱離する方法、及びその方法を用いたペプチドの解析方法。フッ化水素含有化合物は、好ましくはフッ化水素−ピリジンを用いる。ペプチドのリン酸基の脱離は、試剤に含まれるフッ化水素、フッ化水素酸中のフッ化水素、及びフッ化水素含有化合物中のフッ化水素の合計量が、試剤に対し１０〜１００重量％となるように用い、−１０〜５０℃の反応温度で行う。またペプチドの解析は、好ましくはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いた質量分析によって行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、タンパク質化学及びペプチド・タンパク質の質量分析学に関する。
【背景技術】
多くのタンパク質は、ゲノムから転写、翻訳された後、さらに修飾（翻訳後修飾）されることでその活性や機能が調節されている。翻訳後修飾反応としては、リン酸化、硫酸化、アセチル化、糖付加、脂質修飾等が挙げられるが、特にリン酸化反応は、細胞内情報伝達、細胞内代謝活性、細胞周期等を制御する重要な役割を担っている。したがって、このような翻訳後修飾形態を有するタンパク質を解析することは、タンパク質の機能を理解する上で大変重要である。
例えば、リン酸化修飾を受けたタンパク質の解析を行う場合、脱リン酸化がしばしば行われる。従来、この脱リン酸化は、アルカリ性フォスファターゼ等の酵素を用いて行われてきた。しかし、解析するタンパク質によっては、酵素の基質特異性や構造依存性等が原因して脱リン酸化が不完全に起こるという問題がある。
一方、リン酸化された糖鎖を、フッ化水素酸を用いて脱リン酸化する方法が知られている（例えば、非特許文献１〜３参照。）。
非特許文献１ イー・ファックス（Ｅ．Ｆｕｃｈｓ）、シー・ジルバーグ（Ｃ．Ｇｉｌｖａｒｇ）著、「アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、第９０巻、１９７８年、ｐ．４６５−４７３
非特許文献２ シー・ジェイ・リー（Ｃ．Ｊ．Ｌｅｅ）、ビー・エー・フレイサー（Ｂ．Ａ．Ｆｒａｓｅｒ）著、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、第２５５巻、１９８０年、ｐ．６８４７−６８５３
非特許文献３ エル・アール・フィリップス（Ｌ．Ｒ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）、オー・ニシムラ（Ｏ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）、ビー・エー・フレイサー（Ｂ．Ａ．Ｆｒａｓｅｒ）著、「カルボハイドレイト・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、（米国）、第１２１巻、１９８３年、ｐ．２４３−２５５
【発明の開示】
発明の目的
そこで、本発明の目的は、酵素を用いずに化学的処理によってペプチドのリン酸基を脱離する方法及びその方法を用いてペプチドの解析を効率良く行う方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、鋭意検討した結果、ペプチドを、フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む試剤と反応させることによって上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む試剤を用いてペプチドのリン酸基を脱離する方法である。
なお、本明細書においてペプチドとは、タンパク質を含む意味で用いる。
本発明は、前記フッ化水素含有化合物がフッ化水素−ピリジンである、前記のペプチドのリン酸基を脱離する方法である。
本発明は、前記試剤に含まれる前記フッ化水素、前記フッ化水素酸中のフッ化水素、及び前記フッ化水素含有化合物中のフッ化水素の合計量が、前記試剤に対し１０〜１００重量％である、前記のペプチドのリン酸基を脱離する方法である。
本発明は、脱離の反応温度が−１０〜５０℃である、前記のペプチドのリン酸基を脱離する方法である。
本発明は、脱離の反応を液相反応又は気相反応で行う、前記のペプチドのリン酸基を脱離する方法である。
本発明は、前記のペプチドのリン酸基を脱離する方法を用いたペプチドの解析方法である。
本発明は、質量分析を用いる、前記のペプチドの解析方法である。
質量分析には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）及び飛行時間型質量分析法（ＴＯＦＭＳ）を用いることが好ましい。
本発明は、フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む試剤を用いてペプチドのリン酸基を脱離することで見出されるペプチドを含む新規化合物である。
本発明は、前記得られた新規化合物から開発される医薬品候補化合物である。
【図面の簡単な説明】
図１は、配列表の配列番号１に記載のホスホペプチド、そのホスホペプチドをフッ化水素によって脱リン酸化して得られた配列表の配列番号２に記載のペプチド、及び別途調製された配列番号２と同じ配列を有するペプチドの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルチャートの比較図である。
図２は、配列表の配列番号３に記載のホスホペプチド、そのホスホペプチドをフッ化水素によって脱リン酸化して得られた配列表の配列番号４に記載のペプチド、及び別途調製された配列番号４と同じ配列を有するペプチドの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルチャートの比較図である。
図３は、配列表の配列番号５に記載のホスホペプチド、そのホスホペプチドをフッ化水素によって脱リン酸化して得られた配列表の配列番号６に記載のペプチド、及び別途合成した配列番号６と同じ配列を有するペプチドの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルチャートの比較図である。
図４は、配列表の配列番号１に記載のホスホペプチド、及びそのホスホペプチドをフッ化水素−ピリジンによって脱リン酸化して得られた配列表の配列番号２に記載のペプチドの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルチャートの比較図である。
図５は、配列表の配列番号７に記載のホスホペプチド、及びそのホスホペプチドをフッ化水素−ピリジンによって脱リン酸化して得られた配列表の配列番号８に記載のペプチドの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルチャートの比較図である。
図６は、配列表の配列番号９に記載のホスホペプチド、及びそのホスホペプチドをフッ化水素−ピリジンによって脱リン酸化して得られた配列表の配列番号１０に記載のペプチドの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルチャートの比較図である。
発明を実施するための形態
本発明においては、フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む試剤を用い、試料のペプチドが有するリン酸基を脱離する。本発明において、この試剤は脱リン酸化剤としての役割を果たす。
リン酸化の形態としては、モノエステル化に限らない。つまり、リン酸モノエステル化、リン酸ジエステル化の形態が挙げられ、理論上、リン酸トリエステル化の形態も挙げられる。
本発明は化学的手法であるため、基質特異性や構造依存性を有する酵素を用いた手法とは異なりペプチドの種類に関係なく脱リン酸化が完全に進行する。従って、どのような種類のペプチドであっても適応できるという利点がある。
本発明の方法においては、前記試剤とペプチドとを反応させる。試剤には、フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つが含まれる。フッ化水素含有化合物としては、フッ化水素−ピリジン等が挙げられる。この試剤は、無溶媒又は溶液で用いることができる。
また反応は、液相反応でも気相反応でも良い。
試剤は、フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から１種を選択して用いても良いし、２種を選択し組み合わせて用いても良い。
フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から１種を選択して用いる場合、試剤は、含まれるフッ化水素、フッ化水素酸中のフッ化水素、又はフッ化水素含有化合物中のフッ化水素の量が、前記試剤に対し好ましくは１０重量％〜１００重量％、より好ましくは１０〜８０重量％、更に好ましくは１０〜７０重量％となるように用いる。
すなわち、フッ化水素を選択する場合は、試剤を、無溶媒のフッ化水素（１００重量％）、又はフッ化水素を含む溶液として用いることができる。フッ化水素を含む溶液は、フッ化水素の量が試剤に対し好ましくは１０重量％以上、１００重量％未満、より好ましくは１０〜８０重量％、更に好ましくは１０〜７０重量％となるように用いる。本明細書においては、フッ化水素を含む溶液のうち特に水溶液のものを別段にフッ化水素酸として記載する。フッ化水素酸を選択する場合は、試剤を、フッ化水素酸、又はフッ化水素酸を含む溶液として用いることができる。この場合、フッ化水素酸中のフッ化水素の量が、試剤に対して好ましくは１０重量％以上、１００重量％未満、より好ましくは１０〜８０重量％、更に好ましくは１０〜７０重量％となるように用いる。また、フッ化水素含有化合物を選択する場合は、試剤を、無溶媒のフッ化水素含有化合物、又はフッ化水素含有化合物を含む溶液として用いることができる。無溶媒のフッ化水素含有化合物は、含有フッ化水素が好ましくは１０重量％以上、１００重量％未満、より好ましくは１０〜８０重量％、更に好ましくは１０〜７０重量％のものを用いる。フッ化水素含有化合物を含む溶液は、試剤に対してフッ化水素含有化合物中のフッ化水素の量が好ましくは１０重量％以上、１００重量％未満、より好ましくは１０〜８０重量％、更に好ましくは１０〜７０重量％となるように用いる。
フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から２種を選択し組み合わせて用いる場合、フッ化水素とフッ化水素酸以外の組み合わせ、すなわち、フッ化水素及びフッ化水素含有化合物、又はフッ化水素酸及びフッ化水素含有化合物の組み合わせが可能である。この場合、試剤は、無溶媒で、又は溶液で用いることができる。いずれの場合も、フッ化水素及びフッ化水素含有化合物中のフッ化水素、又はフッ化水素酸中のフッ化水素及びフッ化水素含有化合物中のフッ化水素の合計量が、試剤全体に対して好ましくは１０〜１００重量％、より好ましくは１０〜８０重量％、更に好ましくは１０〜７０重量％となるように用いる。
上記範囲の濃度にすることにより、脱リン酸化反応が十分に進行する。１０重量％より少ないと、脱リン酸化が完結しないことがある。
ペプチドの量に対する試剤の量は特に限定されないが、試剤に含まれるフッ化水素、フッ化水素酸中のフッ化水素、及びフッ化水素含有化合物中のフッ化水素の合計量を、ペプチドの量に対して例えば１０〜１０００００重量％用いることができる。
本発明における反応温度は、−１０〜５０℃が好ましく、０〜２５℃がより好ましい。上記範囲の温度にすることにより、脱リン酸化反応が十分に進行する。−１０℃より低い温度では、脱リン酸化反応の進行が極めて遅くなる傾向にある。５０℃より高い温度では、副生成物が増加する傾向にある。
本発明における反応時間は特に限定されないが、例えば１０分〜５時間で反応行うことができる。
上述のようにして、ホスホペプチドのリン酸基が脱離されたペプチドを得る。なお、この方法ではペプチド結合はインタクトに保たれる。
本発明のペプチドのリン酸基を脱離する方法を用いると、ペプチドの解析を効率よく行うことができる。
例えば、上述のようにしてリン酸基の脱離を行ったペプチドを、そのままか、又は必要に応じて断片化した後、種々の分析法によって解析することができる。あるいは、ホスホペプチドを必要に応じ断片化した後にリン酸基の脱離を行い、その後、種々の分析法によって解析しても良い。分析法としては、質量分析法を用いることが好ましい。ペプチドの解析方法の一例として、ペプチドを断片化した後に質量分析を行う場合は、例えば次のようにして解析することができる。
まず、ホスホペプチドを酵素消化等により断片化し、得られたホスホペプチド断片混合物のマススペクトルを測定する。次いで、脱リン酸化反応を行い、得られたペプチド断片混合物のマススペクトルを測定する。双方のマススペクトルを比較し、変化したスペクトルピークから、修飾を受けていたペプチド断片を判定することができる。また、変化した質量の差から、そのリン酸基を判定することができる。例えば、リン酸モノエステル化されたアミノ酸残基を持つペプチドを本発明に従って処理した場合、リン酸基１個あたり分子量が８０減少したペプチドのピークが検出される。
次に、修飾されているペプチド断片のタンデムマスを測定することによって、修飾を受けているアミノ酸残基及びその部位を決定することができる。
また、質量分析には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）及び飛行時間型質量分析法（ＴＯＦＭＳ）を用いることが好ましい。
上記した本発明の方法を用いると、従来の酵素方法では脱リン酸化が不完全なために解析が困難であったペプチドの同定、及びその機能を明らかにすることが容易になる。すなわち、本発明の方法は、リン酸化タンパク質のプロテオーム解析により広く応用することができる。本発明によって明らかにされたタンパク質が特定の疾患に関与するものである場合、該タンパク質を標的として特異的に作用し、その機能を効果的に制御する化合物をコンピュータで理論的にデザインすることによって、医薬品候補化合物を創出することができる。また、該タンパク質をコードする遺伝子の情報を見出し、該遺伝子の発現を特異的に制御する物質を医薬品候補化合物として創出することができる。本発明の方法は、これら医薬品候補化合物の創出をより効率的なものにすることができる。
【実施例】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。以下において、「％」は特に断りのない限り、すべて重量基準である。
リン酸化を受け得るアミノ酸残基は、主としてセリン、スレオニン及びチロシンの３種であるため、まず、次の３種のホスホペプチドについてフッ化水素（ＨＦ）による脱リン酸化を行った。
１．ＷＡＧＧＤＡｐＳＧＥ（配列表の配列番号１）（セリン残基がリン酸化されたペプチド）
２．ＴＲＤＩｐＹＥＴＤＹＹＲＫ（配列表の配列番号３）（チロシン残基がリン酸化されたペプチド）
３．ＧＦＥｐＴＶＰＥＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号５）（スレオニン残基がリン酸化されたペプチド）
【実施例１】
アミノ酸配列がＷＡＧＧＤＡｐＳＧＥ（配列表の配列番号１）であるホスホペプチド（アメリカン・ペプチド・カンパニー社製、カイウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）のデルタ睡眠誘発ペプチド（Ｄｅｌｔａ Ｓｌｅｅｐ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＤＳＩＰ））を用いた。このホスホペプチドはセリン残基がリン酸化されており、リン酸化セリン残基をｐＳで表している。
凍結乾燥させた配列番号１のホスホペプチド１００μｇに５０％フッ化水素酸（水溶液）５０μｌを氷冷下で加え、０℃で３時間反応させた。ドラフト中で反応溶液にＮ２気流を吹き付けて蒸発・乾固した。得られた残渣を水１００μｌに溶解し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（（株）島津製作所製、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）を用いて測定した。
図１は、上記反応条件（５０％ＨＦ、０℃、３時間（３ｈｒ））により脱リン酸化が起こってアミノ酸配列がＷＡＧＧＤＡＳＧＥ（配列表の配列番号２）のペプチドが得られたことを確認するために、得られたマススペクトルチャートと他のスペクトルチャートとを比較したものである。上段は、上記反応による生成物のスペクトルチャート（シグナル強度：２４０ｍＶ）、中段は、別途調製された配列番号２と同じ配列を有するペプチドのスペクトルチャート（シグナル強度：１４９８ｍＶ）、下段は、ホスホペプチドＷＡＧＧＤＡｐＳＧＥ（配列表の配列番号１）のスペクトルチャート（シグナル強度：４６９ｍＶ）である。図１中のスペクトルチャートは全て、横軸にイオンの質量／電荷（Ｍａｓｓ／Ｃｈａｒｇｅ（ｍ／ｚ））、縦軸にイオンの相対強度（Ｉｎｔ．）を表す。
上段のスペクトルチャートにおいては、（ｍ／ｚ）＝８４９．３９（Ｍ＋）の分子イオンピークが検出された。この分子イオンピークは、下段のスペクトルチャートで検出された（ｍ／ｚ）＝９２９．３４（Ｍ＋）の分子イオンピークより分子量が８０小さい。この差は、ホスホペプチドの分子量と、それを脱リン酸化することによって得られるペプチドの分子量との差に相当する。さらに、上段のスペクトルチャートは、中段のスペクトルチャートと良い一致を示した。これらのことから、副反応を起こすことなく目的の脱リン酸化が行われたことが分かった。
【実施例２】
アミノ酸配列がＴＲＤＩｐＹＥＴＤＹＹＲＫ（配列表の配列番号３）であるホスホペプチド（シグマ社製、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）のインスリンレセプター１１４２−１１５３（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １１４２−１１５３））を用いた。このホスホペプチドはＮ末端から５番目のチロシン残基がリン酸化されており、リン酸化チロシン残基をｐＹで表している。
凍結乾燥させた配列番号２のホスホペプチド１００μｇに５０％フッ化水素酸（水溶液）５０μｌを氷冷下で加え、０℃で３時間反応させた。ドラフト中で反応溶液にＮ２気流を吹き付けて蒸発・乾固した。得られた残渣を水１００μｌに溶解し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（（株）島津製作所製、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）を用いて測定した。
図２は、上記反応条件（５０％ＨＦ、０℃、３時間（３ｈｒ））により脱リン酸化が起こってアミノ酸配列がＴＲＤＩＹＥＴＤＹＹＲＫ（配列表の配列番号４）のペプチドが得られたことを確認するために、得られたマススペクトルチャートと他のスペクトルチャートとを比較したものである。上段は、上記反応による生成物のスペクトルチャート（シグナル強度：２５３ｍＶ）、中段は、別途調製された配列番号４と同じ配列を有するペプチドのスペクトルチャート（シグナル強度：１２３ｍＶ）、下段は、ホスホペプチドＴＲＤＩｐＹＥＴＤＹＹＲＫ（配列表の配列番号３）のスペクトルチャート（シグナル強度：１２３ｍＶ）である。図２中のスペクトルチャートは全て、横軸にイオンの質量／電荷（Ｍａｓｓ／Ｃｈａｒｇｅ（ｍ／ｚ））、縦軸にイオンの相対強度（Ｉｎｔ．）を表す。
上段のスペクトルチャートにおいては、（ｍ／ｚ）＝１６２２．７６（Ｍ＋）の分子イオンピークが検出された。この分子イオンピークは、下段のスペクトルチャートで検出された（ｍ／ｚ）＝１０７２．７９（Ｍ＋）の分子イオンピークより分子量が８０小さい。この差は、ホスホペプチドの分子量と、それを脱リン酸化することによって得られるペプチドの分子量との差に相当する。さらに、上段のスペクトルチャートは、中段のスペクトルチャートと良い一致を示した。これらのことから、副反応を起こすことなく目的の脱リン酸化が行われたことが分かった。
【実施例３】
アミノ酸配列がＧＦＥｐＴＶＰＥＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号５）であるホスホペプチドを合成した。このホスホペプチドはＮ末端から４番目のスレオニン残基がリン酸化されており、リン酸化スレオニン残基をｐＴで表している。さらにこのホスホペプチドは、Ｃ末端のグリシン残基がアミド化されており、アミド化されたグリシン残基をＧ−ＮＨ２で表している。
凍結乾燥させた配列番号３のホスホペプチド１００μｇに５０％フッ化水素酸（水溶液）５０μｌを室温下で加え、室温で３時間反応させた。ドラフト中で反応溶液にＮ２気流を吹き付けて蒸発・乾固した。得られた残渣を水１００μｌに溶解し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（（株）島津製作所製、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）を用いて測定した。
図３は、上記反応条件（５０％ＨＦ、室温（ＲＴ）、３時間（３ｈｒ））により脱リン酸化が起こってアミノ酸配列がＧＦＥＴＶＰＥＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号６）のペプチドが得られたことを確認するために、得られたマススペクトルチャートと他のスペクトルチャートとを比較したものである。なお、配列番号６のペプチドは、アミド化されているＣ末端のグリシンをＧ−ＮＨ２で表している。上段は、上記反応による生成物のスペクトルチャート（シグナル強度：４０ｍＶ）、中段は、別途合成した配列番号６と同じ配列を有するペプチドのスペクトルチャート（シグナル強度：３２５ｍＶ）、下段は、ホスホペプチドＧＦＥｐＴＶＰＥＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号５）のスペクトルチャート（シグナル強度：１７７ｍＶ）である。図３中のスペクトルチャートは全て、横軸にイオンの質量／電荷（Ｍａｓｓ／Ｃｈａｒｇｅ（ｍ／ｚ））、縦軸にイオンの相対強度（Ｉｎｔ．）を表す。
上段のスペクトルチャートにおいては、（ｍ／ｚ）＝９７３．８６（Ｍ＋＋Ｋ），９５７．９０（Ｍ＋＋Ｎａ），９３５．５２（Ｍ＋＋Ｈ）の分子イオンピークが検出された。これら分子イオンピークは、下段のスペクトルチャートで検出された（ｍ／ｚ）＝１０５３．６４（Ｍ＋＋Ｋ），１０３７．６５（Ｍ＋＋Ｎａ），１０１５．６６（Ｍ＋＋Ｈ）の分子イオンピークより分子量がそれぞれ８０小さい。この差は、ホスホペプチドの分子量と、それを脱リン酸化することによって得られるペプチドの分子量との差に相当する。さらに、上段のスペクトルチャートは、中段のスペクトルチャートと良い一致を示した。これらのことから、副反応を起こすことなく目的の脱リン酸化が行われたことが分かった。
さらに、次の３種のホスホペプチドについて、フッ化水素−ピリジン（ＨＦ−Ｐｙ）による脱リン酸化を行った。
４．ＷＡＧＧＤＡｐＳＧＥ（配列表の配列番号１）（セリン残基がリン酸化されたペプチド）
５．Ａｃ−ＩｐＹＧＥＦ−ＮＨ２（配列表の配列番号７）（チロシン残基がリン酸化されたペプチド）
６．ＧＦＥＴＶＰＥｐＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号９）（スレオニン残基がリン酸化されたペプチド）
【実施例４】
実施例１で用いたのと同じ、アミノ酸配列がＷＡＧＧＤＡｐＳＧＥ（配列表の配列番号１）のホスホペプチドを用いた。
凍結乾燥させた配列番号１のホスホペプチド１００μｌに７０％フッ化水素−ピリジン５０μｌを氷冷下で加えて溶解し、０℃で１時間反応させた。反応溶液を真空ポンプ減圧下で濃縮乾固した。得られた残渣を水２０μｌに溶解し、ＺｉｐＴｉｐ（ミリポア社製）による処理を行った後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（（株）島津製作所製、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）を用いて測定した。
図４上段は、上記反応条件（７０％ＨＦ−Ｐｙ、０℃（０ ｄｅｇ．Ｃ）、１時間（１ｈｒ））による脱リン酸化によって得られた、アミノ酸配列がＷＡＧＧＤＡＳＧＥ（配列表の配列番号２）のペプチドのスペクトルチャート（シグナル強度：１３０ｍＶ）を示す。また、図４下段は、ホスホペプチドＷＡＧＧＤＡｐＳＧＥ（配列表の配列番号１）のスペクトルチャート（シグナル強度：５２５ｍＶ）を示す。図４中のスペクトルチャートは全て、横軸にイオンの質量／電荷（Ｍａｓｓ／Ｃｈａｒｇｅ（ｍ／ｚ））、縦軸にイオンの相対強度（Ｉｎｔ．）を表す。
上段のスペクトルチャートにおいては、（ｍ／ｚ）＝８４９．３６（Ｍ＋）の分子イオンピークが検出された。この分子イオンピークは、下段のスペクトルチャートで検出された（ｍ／ｚ）＝９２９．３４（Ｍ＋）の分子イオンピークより分子量が８０小さい。この差は、ホスホペプチドの分子量と、それを脱リン酸化することによって得られるペプチドの分子量との差に相当する。このことから、副反応を起こすことなく目的の脱リン酸化が行われたことが分かった。
【実施例５】
アミノ酸配列がＡｃ−ＩｐＹＧＥＦ−ＮＨ２（配列表の配列番号７）であるホスホペプチドを合成した。このホスホペプチドはＮ末端から２番目のチロシン残基がリン酸化されており、リン酸化チロシン残基をｐＹで表している。またこのホスホペプチドは、Ｎ末端のイソロイシン残基がアセチル化されており、アセチル化されたイソロイシン残基をＡｃ−Ｉで表している。さらにこのホスホペプチドはＣ末端のフェニルアラニン残基がアミド化されており、アミド化されたフェニルアラニン残基をＦ−ＮＨ２で表している。
脱リン酸化すべきホスホペプチドに上記配列番号７のペプチドを用いた以外は、実施例４と同様の操作を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（（株）島津製作所製、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）を用いて測定した。
図５上段は、実施例５の反応条件（７０％ＨＦ−Ｐｙ、０℃（０ ｄｅｇ．Ｃ）、１時間（１ｈｒ））による脱リン酸化によって得られた、アミノ酸配列がＡｃ−ＩｐＹＧＥＦ−ＮＨ２（配列表の配列番号８）のペプチドのスペクトルチャート（シグナル強度：６８ｍＶ）を示す。なお、配列番号８のペプチドは、アセチル化されているＮ末端のイソロイシンをＡｃ−Ｉ、アミド化されているＣ末端のフェニルアラニンをＦ−ＮＨ２で表している。また、図５下段は、ホスホペプチドＡｃ−ＩｐＹＧＥＦ−ＮＨ２（配列表の配列番号７）のスペクトルチャート（シグナル強度：１１９ｍＶ）を示す。図５中のスペクトルチャートは全て、横軸にイオンの質量／電荷（Ｍａｓｓ／Ｃｈａｒｇｅ（ｍ／ｚ））、縦軸にイオンの相対強度（Ｉｎｔ．）を表す。
上段のスペクトルチャートにおいては、（ｍ／ｚ）＝７０７．３６（Ｍ＋＋Ｋ），６９１．３８（Ｍ＋＋Ｎａ）の分子イオンピークが検出された。これら分子イオンピークは、下段のスペクトルチャートで検出された（ｍ／ｚ）＝７８７．４２（Ｍ＋＋Ｋ），７７１．４７（Ｍ＋＋Ｎａ）の分子イオンピークより分子量がそれぞれ８０小さい。この差は、ホスホペプチドの分子量と、それを脱リン酸化することによって得られるペプチドの分子量との差に相当する。このことから、副反応を起こすことなく目的の脱リン酸化が行われたことが分かった。
【実施例６】
アミノ酸配列がＧＦＥＴＶＰＥｐＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号９）であるホスホペプチドを合成した。このホスホペプチドはＮ末端から８番目のスレオニン残基がリン酸化されており、リン酸化スレオニン残基をｐＴで表している。またこのホスホペプチドはＣ末端のグリシン残基がアミド化されており、アミド化されたグリシン残基をＧ−ＮＨ２で表している。
脱リン酸化すべきホスホペプチドに上記配列番号９のペプチドを用いた以外は、実施例４と同様の操作を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（（株）島津製作所製、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）を用いて測定した。
図６上段は、実施例６の反応条件（７０％ＨＦ−Ｐｙ、０℃（０ ｄｅｇ．Ｃ）、１時間（１ｈｒ））による脱リン酸化によって得られた、アミノ酸配列がＧＦＥＴＶＰＥＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号１０）のペプチドのスペクトルチャート（シグナル強度：５．６ｍＶ）を示す。なお、配列番号１０のペプチドは、アミド化されているＣ末端のグリシンをＧ−ＮＨ２で表している。また、図６下段は、ホスホペプチドＧＦＥＴＶＰＥｐＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号９）のスペクトルチャート（シグナル強度：２０８ｍＶ）を示す。図６中のスペクトルチャートは全て、横軸にイオンの質量／電荷（Ｍａｓｓ／Ｃｈａｒｇｅ（ｍ／ｚ））、縦軸にイオンの相対強度（Ｉｎｔ．）を表す。
上段のスペクトルチャートにおいては、（ｍ／ｚ）＝９７３．５０（Ｍ＋＋Ｋ），９５７．５４（Ｍ＋＋Ｎａ）の分子イオンピークが検出された。これら分子イオンピークは、下段のスペクトルチャートで検出された（ｍ／ｚ）＝１０５３．６４（Ｍ＋＋Ｋ），１０３７．６５（Ｍ＋＋Ｎａ）の分子イオンピークより分子量がそれぞれ８０小さい。この差は、ホスホペプチドの分子量と、それを脱リン酸化することによって得られるペプチドの分子量との差に相当する。このことから、副反応を起こすことなく目的の脱リン酸化が行われたことが分かった。
以上のホスホペプチドを用いた実施例全てにおいて、副反応を起こすことなく脱リン酸化が行われた。このように本発明の方法は、反応の特異性や構造依存性がなく、どのようなペプチドに対しても適用することができる。
【実施例７】
上記実施例１〜６で述べたモデルペプチドに加え、α−カゼイン（牛乳（ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ）由来）を用いた脱リン酸化を行った。α−カゼインを定法によりトリプシン消化して消化断片の混合物を得、次いでＩＭＡＣ法（Ｇａカラム）によりホスホペプチドを濃縮した。このサンプルを５０％フッ化水素酸（水溶液）５０μｌで処理し、０℃、３時間で、脱リン酸化を行った。その結果、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトル上の（ｍ／ｚ）が２０００までの範囲において（ｍ／ｚ）＝１６６１．２，１９５２．３の２本のホスホペプチド由来のピークが、フッ化水素処理後それぞれ（ｍ／ｚ）＝１５８０．９，１８７２．０へと変化した。処理前と処理後の質量数の差は８０であるので、各々のフラグメントは１ヶ所リン酸化されていたことが分かった。
上記実施例では、５種のモデルペプチド及びα−カゼインの脱リン酸化を示した。しかしながら、本発明は、これらに限定されることなく、全てのペプチド、タンパク質に適用することができる。そのため、前述の実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、特許請求の範囲の均等範囲に属する変更は、全て本発明の範囲内のものである。
なお、配列表フリーテキスト（人工配列の記載（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ））において、配列番号２はデルタ睡眠誘発ペプチドを脱リン酸化したペプチドであり、配列番号４はインスリンレセプター１１４２−１１５３を脱リン酸化したペプチドであり、配列番号５、７、９は合成ホスホペプチドであり、配列番号６、８、１０は合成ホスホペプチド５、７、９をそれぞれ脱リン酸化したペプチドである。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、酵素を用いずに化学的処理によってペプチドのリン酸基を脱離する方法及びその方法を用いてペプチドの解析を効率良く行う方法が提供される。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【技術分野】
本発明は、タンパク質化学及びペプチド・タンパク質の質量分析学に関する。
【背景技術】
多くのタンパク質は、ゲノムから転写、翻訳された後、さらに修飾（翻訳後修飾）されることでその活性や機能が調節されている。翻訳後修飾反応としては、リン酸化、硫酸化、アセチル化、糖付加、脂質修飾等が挙げられるが、特にリン酸化反応は、細胞内情報伝達、細胞内代謝活性、細胞周期等を制御する重要な役割を担っている。したがって、このような翻訳後修飾形態を有するタンパク質を解析することは、タンパク質の機能を理解する上で大変重要である。
例えば、リン酸化修飾を受けたタンパク質の解析を行う場合、脱リン酸化がしばしば行われる。従来、この脱リン酸化は、アルカリ性フォスファターゼ等の酵素を用いて行われてきた。しかし、解析するタンパク質によっては、酵素の基質特異性や構造依存性等が原因して脱リン酸化が不完全に起こるという問題がある。
一方、リン酸化された糖鎖を、フッ化水素酸を用いて脱リン酸化する方法が知られている（例えば、非特許文献１〜３参照。）。
非特許文献１ イー・ファックス（Ｅ．Ｆｕｃｈｓ）、シー・ジルバーグ（Ｃ．Ｇｉｌｖａｒｇ）著、「アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、第９０巻、１９７８年、ｐ．４６５−４７３
非特許文献２ シー・ジェイ・リー（Ｃ．Ｊ．Ｌｅｅ）、ビー・エー・フレイサー（Ｂ．Ａ．Ｆｒａｓｅｒ）著、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、第２５５巻、１９８０年、ｐ．６８４７−６８５３
非特許文献３ エル・アール・フィリップス（Ｌ．Ｒ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）、オー・ニシムラ（Ｏ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）、ビー・エー・フレイサー（Ｂ．Ａ．Ｆｒａｓｅｒ）著、「カルボハイドレイト・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、（米国）、第１２１巻、１９８３年、ｐ．２４３−２５５
【発明の開示】
発明の目的
そこで、本発明の目的は、酵素を用いずに化学的処理によってペプチドのリン酸基を脱離する方法及びその方法を用いてペプチドの解析を効率良く行う方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、鋭意検討した結果、ペプチドを、フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む試剤と反応させることによって上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む試剤を用いてペプチドのリン酸基を脱離する方法である。
なお、本明細書においてペプチドとは、タンパク質を含む意味で用いる。
本発明は、前記フッ化水素含有化合物がフッ化水素−ピリジンである、前記のペプチドのリン酸基を脱離する方法である。
本発明は、前記試剤に含まれる前記フッ化水素、前記フッ化水素酸中のフッ化水素、及び前記フッ化水素含有化合物中のフッ化水素の合計量が、前記試剤に対し１０〜１００重量％である、前記のペプチドのリン酸基を脱離する方法である。
本発明は、脱離の反応温度が−１０〜５０℃である、前記のペプチドのリン酸基を脱離する方法である。
本発明は、脱離の反応を液相反応又は気相反応で行う、前記のペプチドのリン酸基を脱離する方法である。
本発明は、前記のペプチドのリン酸基を脱離する方法を用いたペプチドの解析方法である。
本発明は、質量分析を用いる、前記のペプチドの解析方法である。
質量分析には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）及び飛行時間型質量分析法（ＴＯＦＭＳ）を用いることが好ましい。
本発明は、フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む試剤を用いてペプチドのリン酸基を脱離することで見出されるペプチドを含む新規化合物である。
本発明は、前記得られた新規化合物から開発される医薬品候補化合物である。
【図面の簡単な説明】
図１は、配列表の配列番号１に記載のホスホペプチド、そのホスホペプチドをフッ化水素によって脱リン酸化して得られた配列表の配列番号２に記載のペプチド、及び別途調製された配列番号２と同じ配列を有するペプチドの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルチャートの比較図である。
図２は、配列表の配列番号３に記載のホスホペプチド、そのホスホペプチドをフッ化水素によって脱リン酸化して得られた配列表の配列番号４に記載のペプチド、及び別途調製された配列番号４と同じ配列を有するペプチドの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルチャートの比較図である。
図３は、配列表の配列番号５に記載のホスホペプチド、そのホスホペプチドをフッ化水素によって脱リン酸化して得られた配列表の配列番号６に記載のペプチド、及び別途合成した配列番号６と同じ配列を有するペプチドの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルチャートの比較図である。
図４は、配列表の配列番号１に記載のホスホペプチド、及びそのホスホペプチドをフッ化水素−ピリジンによって脱リン酸化して得られた配列表の配列番号２に記載のペプチドの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルチャートの比較図である。
図５は、配列表の配列番号７に記載のホスホペプチド、及びそのホスホペプチドをフッ化水素−ピリジンによって脱リン酸化して得られた配列表の配列番号８に記載のペプチドの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルチャートの比較図である。
図６は、配列表の配列番号９に記載のホスホペプチド、及びそのホスホペプチドをフッ化水素−ピリジンによって脱リン酸化して得られた配列表の配列番号１０に記載のペプチドの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルチャートの比較図である。
発明を実施するための形態
本発明においては、フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む試剤を用い、試料のペプチドが有するリン酸基を脱離する。本発明において、この試剤は脱リン酸化剤としての役割を果たす。
リン酸化の形態としては、モノエステル化に限らない。つまり、リン酸モノエステル化、リン酸ジエステル化の形態が挙げられ、理論上、リン酸トリエステル化の形態も挙げられる。
本発明は化学的手法であるため、基質特異性や構造依存性を有する酵素を用いた手法とは異なりペプチドの種類に関係なく脱リン酸化が完全に進行する。従って、どのような種類のペプチドであっても適応できるという利点がある。
本発明の方法においては、前記試剤とペプチドとを反応させる。試剤には、フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つが含まれる。フッ化水素含有化合物としては、フッ化水素−ピリジン等が挙げられる。この試剤は、無溶媒又は溶液で用いることができる。
また反応は、液相反応でも気相反応でも良い。
試剤は、フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から１種を選択して用いても良いし、２種を選択し組み合わせて用いても良い。
フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から１種を選択して用いる場合、試剤は、含まれるフッ化水素、フッ化水素酸中のフッ化水素、又はフッ化水素含有化合物中のフッ化水素の量が、前記試剤に対し好ましくは１０重量％〜１００重量％、より好ましくは１０〜８０重量％、更に好ましくは１０〜７０重量％となるように用いる。
すなわち、フッ化水素を選択する場合は、試剤を、無溶媒のフッ化水素（１００重量％）、又はフッ化水素を含む溶液として用いることができる。フッ化水素を含む溶液は、フッ化水素の量が試剤に対し好ましくは１０重量％以上、１００重量％未満、より好ましくは１０〜８０重量％、更に好ましくは１０〜７０重量％となるように用いる。本明細書においては、フッ化水素を含む溶液のうち特に水溶液のものを別段にフッ化水素酸として記載する。フッ化水素酸を選択する場合は、試剤を、フッ化水素酸、又はフッ化水素酸を含む溶液として用いることができる。この場合、フッ化水素酸中のフッ化水素の量が、試剤に対して好ましくは１０重量％以上、１００重量％未満、より好ましくは１０〜８０重量％、更に好ましくは１０〜７０重量％となるように用いる。また、フッ化水素含有化合物を選択する場合は、試剤を、無溶媒のフッ化水素含有化合物、又はフッ化水素含有化合物を含む溶液として用いることができる。無溶媒のフッ化水素含有化合物は、含有フッ化水素が好ましくは１０重量％以上、１００重量％未満、より好ましくは１０〜８０重量％、更に好ましくは１０〜７０重量％のものを用いる。フッ化水素含有化合物を含む溶液は、試剤に対してフッ化水素含有化合物中のフッ化水素の量が好ましくは１０重量％以上、１００重量％未満、より好ましくは１０〜８０重量％、更に好ましくは１０〜７０重量％となるように用いる。
フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から２種を選択し組み合わせて用いる場合、フッ化水素とフッ化水素酸以外の組み合わせ、すなわち、フッ化水素及びフッ化水素含有化合物、又はフッ化水素酸及びフッ化水素含有化合物の組み合わせが可能である。この場合、試剤は、無溶媒で、又は溶液で用いることができる。いずれの場合も、フッ化水素及びフッ化水素含有化合物中のフッ化水素、又はフッ化水素酸中のフッ化水素及びフッ化水素含有化合物中のフッ化水素の合計量が、試剤全体に対して好ましくは１０〜１００重量％、より好ましくは１０〜８０重量％、更に好ましくは１０〜７０重量％となるように用いる。
上記範囲の濃度にすることにより、脱リン酸化反応が十分に進行する。１０重量％より少ないと、脱リン酸化が完結しないことがある。
ペプチドの量に対する試剤の量は特に限定されないが、試剤に含まれるフッ化水素、フッ化水素酸中のフッ化水素、及びフッ化水素含有化合物中のフッ化水素の合計量を、ペプチドの量に対して例えば１０〜１０００００重量％用いることができる。
本発明における反応温度は、−１０〜５０℃が好ましく、０〜２５℃がより好ましい。上記範囲の温度にすることにより、脱リン酸化反応が十分に進行する。−１０℃より低い温度では、脱リン酸化反応の進行が極めて遅くなる傾向にある。５０℃より高い温度では、副生成物が増加する傾向にある。
本発明における反応時間は特に限定されないが、例えば１０分〜５時間で反応行うことができる。
上述のようにして、ホスホペプチドのリン酸基が脱離されたペプチドを得る。なお、この方法ではペプチド結合はインタクトに保たれる。
本発明のペプチドのリン酸基を脱離する方法を用いると、ペプチドの解析を効率よく行うことができる。
例えば、上述のようにしてリン酸基の脱離を行ったペプチドを、そのままか、又は必要に応じて断片化した後、種々の分析法によって解析することができる。あるいは、ホスホペプチドを必要に応じ断片化した後にリン酸基の脱離を行い、その後、種々の分析法によって解析しても良い。分析法としては、質量分析法を用いることが好ましい。ペプチドの解析方法の一例として、ペプチドを断片化した後に質量分析を行う場合は、例えば次のようにして解析することができる。
まず、ホスホペプチドを酵素消化等により断片化し、得られたホスホペプチド断片混合物のマススペクトルを測定する。次いで、脱リン酸化反応を行い、得られたペプチド断片混合物のマススペクトルを測定する。双方のマススペクトルを比較し、変化したスペクトルピークから、修飾を受けていたペプチド断片を判定することができる。また、変化した質量の差から、そのリン酸基を判定することができる。例えば、リン酸モノエステル化されたアミノ酸残基を持つペプチドを本発明に従って処理した場合、リン酸基１個あたり分子量が８０減少したペプチドのピークが検出される。
次に、修飾されているペプチド断片のタンデムマスを測定することによって、修飾を受けているアミノ酸残基及びその部位を決定することができる。
また、質量分析には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）及び飛行時間型質量分析法（ＴＯＦＭＳ）を用いることが好ましい。
上記した本発明の方法を用いると、従来の酵素方法では脱リン酸化が不完全なために解析が困難であったペプチドの同定、及びその機能を明らかにすることが容易になる。すなわち、本発明の方法は、リン酸化タンパク質のプロテオーム解析により広く応用することができる。本発明によって明らかにされたタンパク質が特定の疾患に関与するものである場合、該タンパク質を標的として特異的に作用し、その機能を効果的に制御する化合物をコンピュータで理論的にデザインすることによって、医薬品候補化合物を創出することができる。また、該タンパク質をコードする遺伝子の情報を見出し、該遺伝子の発現を特異的に制御する物質を医薬品候補化合物として創出することができる。本発明の方法は、これら医薬品候補化合物の創出をより効率的なものにすることができる。
【実施例】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。以下において、「％」は特に断りのない限り、すべて重量基準である。
リン酸化を受け得るアミノ酸残基は、主としてセリン、スレオニン及びチロシンの３種であるため、まず、次の３種のホスホペプチドについてフッ化水素（ＨＦ）による脱リン酸化を行った。
１．ＷＡＧＧＤＡｐＳＧＥ（配列表の配列番号１）（セリン残基がリン酸化されたペプチド）
２．ＴＲＤＩｐＹＥＴＤＹＹＲＫ（配列表の配列番号３）（チロシン残基がリン酸化されたペプチド）
３．ＧＦＥｐＴＶＰＥＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号５）（スレオニン残基がリン酸化されたペプチド）
【実施例１】
アミノ酸配列がＷＡＧＧＤＡｐＳＧＥ（配列表の配列番号１）であるホスホペプチド（アメリカン・ペプチド・カンパニー社製、カイウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）のデルタ睡眠誘発ペプチド（Ｄｅｌｔａ Ｓｌｅｅｐ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ；ＤＳＩＰ））を用いた。このホスホペプチドはセリン残基がリン酸化されており、リン酸化セリン残基をｐＳで表している。
凍結乾燥させた配列番号１のホスホペプチド１００μｇに５０％フッ化水素酸（水溶液）５０μｌを氷冷下で加え、０℃で３時間反応させた。ドラフト中で反応溶液にＮ２気流を吹き付けて蒸発・乾固した。得られた残渣を水１００μｌに溶解し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（（株）島津製作所製、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）を用いて測定した。
図１は、上記反応条件（５０％ＨＦ、０℃、３時間（３ｈｒ））により脱リン酸化が起こってアミノ酸配列がＷＡＧＧＤＡＳＧＥ（配列表の配列番号２）のペプチドが得られたことを確認するために、得られたマススペクトルチャートと他のスペクトルチャートとを比較したものである。上段は、上記反応による生成物のスペクトルチャート（シグナル強度：２４０ｍＶ）、中段は、別途調製された配列番号２と同じ配列を有するペプチドのスペクトルチャート（シグナル強度：１４９８ｍＶ）、下段は、ホスホペプチドＷＡＧＧＤＡｐＳＧＥ（配列表の配列番号１）のスペクトルチャート（シグナル強度：４６９ｍＶ）である。図１中のスペクトルチャートは全て、横軸にイオンの質量／電荷（Ｍａｓｓ／Ｃｈａｒｇｅ（ｍ／ｚ））、縦軸にイオンの相対強度（Ｉｎｔ．）を表す。
上段のスペクトルチャートにおいては、（ｍ／ｚ）＝８４９．３９（Ｍ＋）の分子イオンピークが検出された。この分子イオンピークは、下段のスペクトルチャートで検出された（ｍ／ｚ）＝９２９．３４（Ｍ＋）の分子イオンピークより分子量が８０小さい。この差は、ホスホペプチドの分子量と、それを脱リン酸化することによって得られるペプチドの分子量との差に相当する。さらに、上段のスペクトルチャートは、中段のスペクトルチャートと良い一致を示した。これらのことから、副反応を起こすことなく目的の脱リン酸化が行われたことが分かった。
【実施例２】
アミノ酸配列がＴＲＤＩｐＹＥＴＤＹＹＲＫ（配列表の配列番号３）であるホスホペプチド（シグマ社製、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）のインスリンレセプター１１４２−１１５３（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １１４２−１１５３））を用いた。このホスホペプチドはＮ末端から５番目のチロシン残基がリン酸化されており、リン酸化チロシン残基をｐＹで表している。
凍結乾燥させた配列番号２のホスホペプチド１００μｇに５０％フッ化水素酸（水溶液）５０μｌを氷冷下で加え、０℃で３時間反応させた。ドラフト中で反応溶液にＮ２気流を吹き付けて蒸発・乾固した。得られた残渣を水１００μｌに溶解し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（（株）島津製作所製、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）を用いて測定した。
図２は、上記反応条件（５０％ＨＦ、０℃、３時間（３ｈｒ））により脱リン酸化が起こってアミノ酸配列がＴＲＤＩＹＥＴＤＹＹＲＫ（配列表の配列番号４）のペプチドが得られたことを確認するために、得られたマススペクトルチャートと他のスペクトルチャートとを比較したものである。上段は、上記反応による生成物のスペクトルチャート（シグナル強度：２５３ｍＶ）、中段は、別途調製された配列番号４と同じ配列を有するペプチドのスペクトルチャート（シグナル強度：１２３ｍＶ）、下段は、ホスホペプチドＴＲＤＩｐＹＥＴＤＹＹＲＫ（配列表の配列番号３）のスペクトルチャート（シグナル強度：１２３ｍＶ）である。図２中のスペクトルチャートは全て、横軸にイオンの質量／電荷（Ｍａｓｓ／Ｃｈａｒｇｅ（ｍ／ｚ））、縦軸にイオンの相対強度（Ｉｎｔ．）を表す。
上段のスペクトルチャートにおいては、（ｍ／ｚ）＝１６２２．７６（Ｍ＋）の分子イオンピークが検出された。この分子イオンピークは、下段のスペクトルチャートで検出された（ｍ／ｚ）＝１０７２．７９（Ｍ＋）の分子イオンピークより分子量が８０小さい。この差は、ホスホペプチドの分子量と、それを脱リン酸化することによって得られるペプチドの分子量との差に相当する。さらに、上段のスペクトルチャートは、中段のスペクトルチャートと良い一致を示した。これらのことから、副反応を起こすことなく目的の脱リン酸化が行われたことが分かった。
【実施例３】
アミノ酸配列がＧＦＥｐＴＶＰＥＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号５）であるホスホペプチドを合成した。このホスホペプチドはＮ末端から４番目のスレオニン残基がリン酸化されており、リン酸化スレオニン残基をｐＴで表している。さらにこのホスホペプチドは、Ｃ末端のグリシン残基がアミド化されており、アミド化されたグリシン残基をＧ−ＮＨ２で表している。
凍結乾燥させた配列番号３のホスホペプチド１００μｇに５０％フッ化水素酸（水溶液）５０μｌを室温下で加え、室温で３時間反応させた。ドラフト中で反応溶液にＮ２気流を吹き付けて蒸発・乾固した。得られた残渣を水１００μｌに溶解し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（（株）島津製作所製、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）を用いて測定した。
図３は、上記反応条件（５０％ＨＦ、室温（ＲＴ）、３時間（３ｈｒ））により脱リン酸化が起こってアミノ酸配列がＧＦＥＴＶＰＥＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号６）のペプチドが得られたことを確認するために、得られたマススペクトルチャートと他のスペクトルチャートとを比較したものである。なお、配列番号６のペプチドは、アミド化されているＣ末端のグリシンをＧ−ＮＨ２で表している。上段は、上記反応による生成物のスペクトルチャート（シグナル強度：４０ｍＶ）、中段は、別途合成した配列番号６と同じ配列を有するペプチドのスペクトルチャート（シグナル強度：３２５ｍＶ）、下段は、ホスホペプチドＧＦＥｐＴＶＰＥＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号５）のスペクトルチャート（シグナル強度：１７７ｍＶ）である。図３中のスペクトルチャートは全て、横軸にイオンの質量／電荷（Ｍａｓｓ／Ｃｈａｒｇｅ（ｍ／ｚ））、縦軸にイオンの相対強度（Ｉｎｔ．）を表す。
上段のスペクトルチャートにおいては、（ｍ／ｚ）＝９７３．８６（Ｍ＋＋Ｋ），９５７．９０（Ｍ＋＋Ｎａ），９３５．５２（Ｍ＋＋Ｈ）の分子イオンピークが検出された。これら分子イオンピークは、下段のスペクトルチャートで検出された（ｍ／ｚ）＝１０５３．６４（Ｍ＋＋Ｋ），１０３７．６５（Ｍ＋＋Ｎａ），１０１５．６６（Ｍ＋＋Ｈ）の分子イオンピークより分子量がそれぞれ８０小さい。この差は、ホスホペプチドの分子量と、それを脱リン酸化することによって得られるペプチドの分子量との差に相当する。さらに、上段のスペクトルチャートは、中段のスペクトルチャートと良い一致を示した。これらのことから、副反応を起こすことなく目的の脱リン酸化が行われたことが分かった。
さらに、次の３種のホスホペプチドについて、フッ化水素−ピリジン（ＨＦ−Ｐｙ）による脱リン酸化を行った。
４．ＷＡＧＧＤＡｐＳＧＥ（配列表の配列番号１）（セリン残基がリン酸化されたペプチド）
５．Ａｃ−ＩｐＹＧＥＦ−ＮＨ２（配列表の配列番号７）（チロシン残基がリン酸化されたペプチド）
６．ＧＦＥＴＶＰＥｐＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号９）（スレオニン残基がリン酸化されたペプチド）
【実施例４】
実施例１で用いたのと同じ、アミノ酸配列がＷＡＧＧＤＡｐＳＧＥ（配列表の配列番号１）のホスホペプチドを用いた。
凍結乾燥させた配列番号１のホスホペプチド１００μｌに７０％フッ化水素−ピリジン５０μｌを氷冷下で加えて溶解し、０℃で１時間反応させた。反応溶液を真空ポンプ減圧下で濃縮乾固した。得られた残渣を水２０μｌに溶解し、ＺｉｐＴｉｐ（ミリポア社製）による処理を行った後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（（株）島津製作所製、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）を用いて測定した。
図４上段は、上記反応条件（７０％ＨＦ−Ｐｙ、０℃（０ ｄｅｇ．Ｃ）、１時間（１ｈｒ））による脱リン酸化によって得られた、アミノ酸配列がＷＡＧＧＤＡＳＧＥ（配列表の配列番号２）のペプチドのスペクトルチャート（シグナル強度：１３０ｍＶ）を示す。また、図４下段は、ホスホペプチドＷＡＧＧＤＡｐＳＧＥ（配列表の配列番号１）のスペクトルチャート（シグナル強度：５２５ｍＶ）を示す。図４中のスペクトルチャートは全て、横軸にイオンの質量／電荷（Ｍａｓｓ／Ｃｈａｒｇｅ（ｍ／ｚ））、縦軸にイオンの相対強度（Ｉｎｔ．）を表す。
上段のスペクトルチャートにおいては、（ｍ／ｚ）＝８４９．３６（Ｍ＋）の分子イオンピークが検出された。この分子イオンピークは、下段のスペクトルチャートで検出された（ｍ／ｚ）＝９２９．３４（Ｍ＋）の分子イオンピークより分子量が８０小さい。この差は、ホスホペプチドの分子量と、それを脱リン酸化することによって得られるペプチドの分子量との差に相当する。このことから、副反応を起こすことなく目的の脱リン酸化が行われたことが分かった。
【実施例５】
アミノ酸配列がＡｃ−ＩｐＹＧＥＦ−ＮＨ２（配列表の配列番号７）であるホスホペプチドを合成した。このホスホペプチドはＮ末端から２番目のチロシン残基がリン酸化されており、リン酸化チロシン残基をｐＹで表している。またこのホスホペプチドは、Ｎ末端のイソロイシン残基がアセチル化されており、アセチル化されたイソロイシン残基をＡｃ−Ｉで表している。さらにこのホスホペプチドはＣ末端のフェニルアラニン残基がアミド化されており、アミド化されたフェニルアラニン残基をＦ−ＮＨ２で表している。
脱リン酸化すべきホスホペプチドに上記配列番号７のペプチドを用いた以外は、実施例４と同様の操作を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（（株）島津製作所製、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）を用いて測定した。
図５上段は、実施例５の反応条件（７０％ＨＦ−Ｐｙ、０℃（０ ｄｅｇ．Ｃ）、１時間（１ｈｒ））による脱リン酸化によって得られた、アミノ酸配列がＡｃ−ＩｐＹＧＥＦ−ＮＨ２（配列表の配列番号８）のペプチドのスペクトルチャート（シグナル強度：６８ｍＶ）を示す。なお、配列番号８のペプチドは、アセチル化されているＮ末端のイソロイシンをＡｃ−Ｉ、アミド化されているＣ末端のフェニルアラニンをＦ−ＮＨ２で表している。また、図５下段は、ホスホペプチドＡｃ−ＩｐＹＧＥＦ−ＮＨ２（配列表の配列番号７）のスペクトルチャート（シグナル強度：１１９ｍＶ）を示す。図５中のスペクトルチャートは全て、横軸にイオンの質量／電荷（Ｍａｓｓ／Ｃｈａｒｇｅ（ｍ／ｚ））、縦軸にイオンの相対強度（Ｉｎｔ．）を表す。
上段のスペクトルチャートにおいては、（ｍ／ｚ）＝７０７．３６（Ｍ＋＋Ｋ），６９１．３８（Ｍ＋＋Ｎａ）の分子イオンピークが検出された。これら分子イオンピークは、下段のスペクトルチャートで検出された（ｍ／ｚ）＝７８７．４２（Ｍ＋＋Ｋ），７７１．４７（Ｍ＋＋Ｎａ）の分子イオンピークより分子量がそれぞれ８０小さい。この差は、ホスホペプチドの分子量と、それを脱リン酸化することによって得られるペプチドの分子量との差に相当する。このことから、副反応を起こすことなく目的の脱リン酸化が行われたことが分かった。
【実施例６】
アミノ酸配列がＧＦＥＴＶＰＥｐＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号９）であるホスホペプチドを合成した。このホスホペプチドはＮ末端から８番目のスレオニン残基がリン酸化されており、リン酸化スレオニン残基をｐＴで表している。またこのホスホペプチドはＣ末端のグリシン残基がアミド化されており、アミド化されたグリシン残基をＧ−ＮＨ２で表している。
脱リン酸化すべきホスホペプチドに上記配列番号９のペプチドを用いた以外は、実施例４と同様の操作を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（（株）島津製作所製、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）を用いて測定した。
図６上段は、実施例６の反応条件（７０％ＨＦ−Ｐｙ、０℃（０ ｄｅｇ．Ｃ）、１時間（１ｈｒ））による脱リン酸化によって得られた、アミノ酸配列がＧＦＥＴＶＰＥＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号１０）のペプチドのスペクトルチャート（シグナル強度：５．６ｍＶ）を示す。なお、配列番号１０のペプチドは、アミド化されているＣ末端のグリシンをＧ−ＮＨ２で表している。また、図６下段は、ホスホペプチドＧＦＥＴＶＰＥｐＴＧ−ＮＨ２（配列表の配列番号９）のスペクトルチャート（シグナル強度：２０８ｍＶ）を示す。図６中のスペクトルチャートは全て、横軸にイオンの質量／電荷（Ｍａｓｓ／Ｃｈａｒｇｅ（ｍ／ｚ））、縦軸にイオンの相対強度（Ｉｎｔ．）を表す。
上段のスペクトルチャートにおいては、（ｍ／ｚ）＝９７３．５０（Ｍ＋＋Ｋ），９５７．５４（Ｍ＋＋Ｎａ）の分子イオンピークが検出された。これら分子イオンピークは、下段のスペクトルチャートで検出された（ｍ／ｚ）＝１０５３．６４（Ｍ＋＋Ｋ），１０３７．６５（Ｍ＋＋Ｎａ）の分子イオンピークより分子量がそれぞれ８０小さい。この差は、ホスホペプチドの分子量と、それを脱リン酸化することによって得られるペプチドの分子量との差に相当する。このことから、副反応を起こすことなく目的の脱リン酸化が行われたことが分かった。
以上のホスホペプチドを用いた実施例全てにおいて、副反応を起こすことなく脱リン酸化が行われた。このように本発明の方法は、反応の特異性や構造依存性がなく、どのようなペプチドに対しても適用することができる。
【実施例７】
上記実施例１〜６で述べたモデルペプチドに加え、α−カゼイン（牛乳（ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ）由来）を用いた脱リン酸化を行った。α−カゼインを定法によりトリプシン消化して消化断片の混合物を得、次いでＩＭＡＣ法（Ｇａカラム）によりホスホペプチドを濃縮した。このサンプルを５０％フッ化水素酸（水溶液）５０μｌで処理し、０℃、３時間で、脱リン酸化を行った。その結果、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトル上の（ｍ／ｚ）が２０００までの範囲において（ｍ／ｚ）＝１６６１．２，１９５２．３の２本のホスホペプチド由来のピークが、フッ化水素処理後それぞれ（ｍ／ｚ）＝１５８０．９，１８７２．０へと変化した。処理前と処理後の質量数の差は８０であるので、各々のフラグメントは１ヶ所リン酸化されていたことが分かった。
上記実施例では、５種のモデルペプチド及びα−カゼインの脱リン酸化を示した。しかしながら、本発明は、これらに限定されることなく、全てのペプチド、タンパク質に適用することができる。そのため、前述の実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、特許請求の範囲の均等範囲に属する変更は、全て本発明の範囲内のものである。
なお、配列表フリーテキスト（人工配列の記載（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ））において、配列番号２はデルタ睡眠誘発ペプチドを脱リン酸化したペプチドであり、配列番号４はインスリンレセプター１１４２−１１５３を脱リン酸化したペプチドであり、配列番号５、７、９は合成ホスホペプチドであり、配列番号６、８、１０は合成ホスホペプチド５、７、９をそれぞれ脱リン酸化したペプチドである。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、酵素を用いずに化学的処理によってペプチドのリン酸基を脱離する方法及びその方法を用いてペプチドの解析を効率良く行う方法が提供される。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む試剤を用いてペプチドのリン酸基を脱離する方法。
【請求項２】
前記フッ化水素含有化合物がフッ化水素−ピリジンである、請求の範囲第１項に記載のペプチドのリン酸基を脱離する方法。
【請求項３】
前記試剤に含まれる前記フッ化水素、前記フッ化水素酸中のフッ化水素、及び前記フッ化水素含有化合物中のフッ化水素の合計量が、前記試剤に対し１０〜１００重量％である、請求の範囲第１項に記載のペプチドのリン酸基を脱離する方法。
【請求項４】
脱離の反応温度が−１０〜５０℃である、請求の範囲第１項に記載のペプチドのリン酸基を脱離する方法。
【請求項５】
脱離の反応を液相反応又は気相反応で行う、請求の範囲第１項に記載のペプチドのリン酸基を脱離する方法。
【請求項６】
請求の範囲第１項に記載のペプチドのリン酸基を脱離する方法を用いたペプチドの解析方法。
【請求項７】
質量分析を用いる、請求の範囲第６項に記載のペプチドの解析方法。
【請求項８】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）及び飛行時間型質量分析法（ＴＯＦＭＳ）を用いる、請求の範囲第７項に記載のペプチドの解析方法。
【請求項９】
フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む試剤を用いてペプチドのリン酸基を脱離することで見出されるペプチドを含む新規化合物。
【請求項１０】
請求の範囲第９項で得られた新規化合物から開発される医薬品候補化合物。
【請求項１】
フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む試剤を用いてペプチドのリン酸基を脱離する方法。
【請求項２】
前記フッ化水素含有化合物がフッ化水素−ピリジンである、請求の範囲第１項に記載のペプチドのリン酸基を脱離する方法。
【請求項３】
前記試剤に含まれる前記フッ化水素、前記フッ化水素酸中のフッ化水素、及び前記フッ化水素含有化合物中のフッ化水素の合計量が、前記試剤に対し１０〜１００重量％である、請求の範囲第１項に記載のペプチドのリン酸基を脱離する方法。
【請求項４】
脱離の反応温度が−１０〜５０℃である、請求の範囲第１項に記載のペプチドのリン酸基を脱離する方法。
【請求項５】
脱離の反応を液相反応又は気相反応で行う、請求の範囲第１項に記載のペプチドのリン酸基を脱離する方法。
【請求項６】
請求の範囲第１項に記載のペプチドのリン酸基を脱離する方法を用いたペプチドの解析方法。
【請求項７】
質量分析を用いる、請求の範囲第６項に記載のペプチドの解析方法。
【請求項８】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）及び飛行時間型質量分析法（ＴＯＦＭＳ）を用いる、請求の範囲第７項に記載のペプチドの解析方法。
【請求項９】
フッ化水素、フッ化水素酸、及びフッ化水素含有化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む試剤を用いてペプチドのリン酸基を脱離することで見出されるペプチドを含む新規化合物。
【請求項１０】
請求の範囲第９項で得られた新規化合物から開発される医薬品候補化合物。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７２１０６
【国際公開日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６８２０２（Ｐ２００４−５６８２０２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／００４３０５
【国際出願日】平成１５年４月３日（２００３．４．３）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／００４３０５
【国際出願日】平成１５年４月３日（２００３．４．３）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]