ペプチドギャップ結合モジュレーター
ギャップ結合によって仲介される細胞間コミュニケーションを促進するペプチドを開示する。本発明は、ギャップ結合細胞間コミュニケーション(GJIC)障害に関連した疾患の治療における使用を含めて、多種多様な有用な適用例を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞間ギャップ結合コミュニケーションを調節できるペプチドに関する。本発明はまた、このペプチドを用いてこのような細胞間ギャップ結合コミュニケーションを調節する方法、前記コミュニケーションに関連した状態の予防および/または治療用の薬物の製造のためのこのペプチドの使用、および前記ペプチドを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞間コミュニケーションが細胞の恒常性、増殖、および分化に必須であるという認識が広まってきている。このような細胞間コミュニケーションは、ギャップ結合によって促進されると考えられている。これらの構造は、細胞を結合させる経路であり、「クロストーク」を可能にすると考えられている。一般には、Sperelakis, N.、(1989)、「Cell Interactions and Gap Junctions」、N. Sperelakis、William C. Cole(編集)を参照されたい。
【０００３】
コネキシンは、オリゴマー化してギャップ結合と呼ばれる細胞間チャネルを形成する内在性膜タンパク質である。様々な哺乳動物系で最も豊富なギャップ結合タンパク質は、コネキシン43(「Cx43」)である。
【０００４】
ギャップ結合チャネルは、細胞と細胞の直接のコミュニケーションに関与する。これらのチャネルは、細胞環境の変化に応答し、タンパク質の相互作用によって調節される動的な孔である。心臓では、ギャップ結合チャネルは、電気的刺激の通路の重要な機構である(Lernerら、「Accelerated Onset and Increased Incidence of Ventricular Arrhythmias Induced by Ischemia in Cx43-deficient Mice」、Circ.、101(5):547〜552頁、(2000);Gutsteinら、「Conditional Gene Targeting of Connexin43: Exploring the Consequences of Gap Junction Remodeling in the Heart」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):345〜348頁、(2001);Vaidyaら、「Null Mutation of Connexin43 Causes Slow Propagation of Ventricular Activation in the Late Stages of Mouse Embryonic Development」、Circ. Res.、88(11):1196〜1202頁、(2001))。各チャネルは、細胞外空間に亘って結合する2つの同一の六量体構造すなわちコネクソンからなる。この結果は、動的に調節される透過性の孔である。コネクソンの各サブユニットは、分子コネキシンである。この分子は、図1に例示するように、N末端(「NT」)、細胞質ループ(「CL」)、およびC末端(「CT」)ドメインが細胞質空間にある状態で膜に存在する。加えて、反対側のコネクソンへの結合に関与する4つの膜貫通ドメインおよび2つの細胞外ドメイン(細胞外ループ)が存在する。マウスゲノムには少なくとも20、ヒトゲノムには21の異なるコネキシンアイソタイプが存在する(Willeckeら、「Structural and Functional Diversity of Connexin Genes in the Mouse and Human Genome」、Biol. Chem.、383(5):725〜737頁、(2002))。心臓、脳、および他の組織で最も豊富なコネキシンアイソタイプは、43kDaのタンパク質、Cx43である。ギャップ結合は、イオンおよび小分子の細胞間の通過を許容し、コネキシン分子と微小環境との間の様々な化学的相互作用によって調節される。したがって、ギャップ結合は、動的フィルターとして機能し、細胞間メッセージの通過を制御して機能を調節する。
【０００５】
以前の研究は、Cx43チャネルの制御が、ゲート開閉粒子(gating particle)として機能するCTドメインと、ゲート開閉粒子の受容体として機能するコネキシン分子の別個の領域との会合によるものであることを示唆した(Duffyら、「pH-Dependent Intramolecular Binding and Structure Involving Cx43 Cytoplasmic Domains」、J. Biol. Chem.、277(39):36706〜36714頁、(2002);Morenoら、「Role of the Carboxyl Terminal of Connexin43 in Transjunctional Fast Voltage Gating」、Circ, Res.、90(4):450〜457頁、(2002), 92(1):e30 (2003) (erratum))。別の研究は、この分子内相互作用を、ギャップ結合斑の微小環境における他の分子間相互作用によって調節できることを示した(Morleyら、「Intramolecular Interactions Mediate pH Regulation of Connexin43 Channels」、Biophys. J.、70(3):1294〜1302頁、(1996))。したがって、Cx43ギャップ結合斑の明らかになりつつある実態は、タンパク質が一斉に細胞間コミュニケーションを調節する巨大分子複合体である。これらの相互作用の中心は、CTドメインである。このCTドメインは、多種のキナーゼの基質(Duffyら、「Regulation of Connexin43 Protein Complexes by Intracellular Acidification」、Circ. Res.、94(2):215〜222頁、(2004);Giepmansら、「Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the Regulation of Cell-cell Communication」、J. Biol. Chem.、276(11):8544〜8549頁、(2001);Kanemitsuら、「Tyrosine Phosph
orylation of Connexin 43 by v-Src is Mediated by SH2 and SH3 Domain Interactions」、J. Biol. Chem.、272(36):22824〜22831頁、(1997);Lampeら、「Phosphorylation of Connexin43 on Serine368 by Protein Kinase C Regulates Gap Junctional Communication」、J. Cell Biol.、149(7):1503〜1512頁、(2000);Lauら、「Regulation of Connexin43 Function by Activated Tyrosine Protein Kinases」、J. Bioenerg. Biomembr.、28(4):359〜368頁、(1996);Shinら、「The Regulatory Role of the C-Terminal Domain of Connexin43」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):271-275 (2001);TenBroekら、「Ser364 of Connexin43 and the Upregulation of Gap Junction Assembly by cAMP」、J. Cell Biol.、155(7):1307〜1318頁、(2001))、非触媒タンパク質のリガンド(Giepmans & Moolenaar、「The Gap Junction Protein Connexin43 Interacts with the Second PDZ Domain of the Zona Occludens-1 Protein」、Curr. Biol.、8(16):931〜934頁、(1998);Giepmansら、「Connexin-43 Interactions with ZO-1 and Alpha- and Beta-tubulin」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):219〜223頁、(2001);Toyofukuら、「Direct Association of the Gap Junction Protein Connexin-43 with ZO-1 in Cardiac Myocytes」、J. Biol. Chem.、273(21):12725〜12731頁、(1998);Toyofukuら、「c-Src Regulates the Interaction between Connexin-43 and ZO-1 in Cardiac Myocytes」、J. Biol. Chem.、276(3):1780〜1788頁、(2000);Zhouら、「Dissection of the Molecular Basis of pp60(v-Src) Induced Gating of Connexin 43 Gap Junction Channels」、J. Cell Biol.、144(5):1033〜1045頁、(1999);Aiら、「Wnt-1 Regulation of Connexin43 in Cardiac Myocytes」、J. Clin. Invest.、105(2):161〜171頁、(2000);Xuら、「N-Cadherin and Cx43[alpha]1 Gap Junctions Modulates Mouse Neural Crest Cell Motility Via Distinct Pathways」、Cell Adhes. Commun.、8(4-6):321〜324頁、(2001);Schubertら、「Connexin Family Members Target to Lipid Raft Domains and Interact with Caveolin-1」、Biochem.、41(18):5754〜5764頁、(2002))、および細胞間のカップリングを調節するゲート開閉粒子(Duffyら、「pH-Dependent Intramolecular Binding and Structure Involving Cx43 Cytoplasmic Domains」、J. Biol. Chem.、277(39):36706〜36714頁、(2002);Morenoら、「Role of the Carboxyl Terminal of Connexin43 in Transjunctional Fast Voltage Gating」、Circ. Res. 90(4):450〜457頁、(2002)、92(1):e30 (2003) (erratum);Morleyら、「Intramolecular Interactions Mediate pH Regulation of Connexin43 Channels」、Biophys. J.、70(3):1294〜1302頁、(1996);Anumonwoら、「The Carboxyl Terminal Domain Regulates the Unitary Conductance and Voltage Dependence of Connexin40 Gap Junction Channels」、Circ. Res.、88(7):666〜673頁、(2001))として働くCTドメインである。
【０００６】
ギャップ結合の薬理が、Srinivasらによって総説されている(Srinivasら、「Prospects for Pharmacological Targeting of Gap Junction Channels」、CARDIAC ELECTROPHYSIOLOGY: FROM CELL TO BEDSIDE、158〜167頁、(Douglas Zipes & Jose Jalife編集、第4版、2004年))。ギャップ結合機能の調節用の特定の薬物はほとんど存在しない。長鎖アルカノール(ヘプタノールおよびオクタノール)は、脱共役剤として長い間使用されてきた。膜流動性が主な標的であると考えられているが、その作用機序は不明である。全身麻酔も、ギャップ結合を脱共役させることが示されたが(Burt & Spray、「Volatile Anesthetics Block Intercellular Communication between Neonatal Rat Myocardial Cells」、Circ. Res.、65(3):829〜837頁、(1989))、同様にその作用機序は不明であり、ギャップ結合タンパク質に特異的ではない。ブタンジオンモノオキシム(butanedione monoxime)(Herve & Sarrouilhe、「Modulation of Junctional Communication by Phosphorylation: Protein Phosphatases, the Missing Link in the Chain」、Biol. Cell、94(7-8):423〜432頁、(2002))などのある種の物質は、脱共役につながるギャップ結合のリン酸化を調節すると考えられている。フルフェナム酸は、ギャップ結合の有効な阻害剤であることが示されているが、その機序は、間接的であり、どのコネキシンタンパク質にも特異的ではないと考えられている(Srinivas & Spray、「Closure of Gap Junction Channels by Arylaminobenzoates」、Mol. Pharmacol.、63(6):1389〜1397頁、(2003))。
【０００７】
ペプチドは、ギャップ結合チャネルの機能を変化させることが示されている。抗不整脈ペプチド10(「AAP10」)は、ギャップ結合コミュニケーション(Mullerら、「Actions of the Antiarrhythmic Peptide AAP10 on Intercellular Coupling」、Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol.、356(1):76〜82頁、(1997);Dheinら、「Effects of the New Antiarrhythmic Peptide ZP123 on Epicardial Activation and Repolarization Pattern」、Cell Commun. Adhes.、10(4-6):371〜378頁、(2003))を、膜受容体との相互作用によって間接的に変化させ、場合によっては、標的細胞の様々な変化を引き起こしうるPKC依存性機構(Dheinら、「Protein Kinase Ca Mediates the Effect of Antiarrhythmic Peptide on Gap Junction Conductance」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):257〜264頁、(2001))によっても間接的に変化させる。ギャップ結合形成の特異的な阻害は、細胞外ループペプチドの使用で実証された(Kwak & Jongsma、「Selective Inhibition of Gap Junction Channel Activity by Synthetic Peptides」、J. Physiol.、516(3):679〜685頁、(1999))。これらのペプチドは、細胞外ギャップでのコネキシンの結合を防止してギャップ結合を阻害すると考えられている。これらの効果は遅く、この相互作用は、高濃度のペプチドを必要とする(Dahlら、「Attempts to Define Functional Domains of Gap Junction Proteins with Synthetic Peptides」、Biophys. J.、67(5):1816〜1822頁、(1994))。
【０００８】
構造、結合、および機能アッセイを使用してペプチドに基づくCx43制御手法を開発する戦略ならびにギャップ結合チャネルを開いた状態に維持できる作用物質が要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第98/11125号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2007/078990号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Sperelakis, N.、(1989)、「Cell Interactions and Gap Junctions」、N. Sperelakis、William C. Cole(編集)
【非特許文献２】Lernerら、「Accelerated Onset and Increased Incidence of Ventricular Arrhythmias Induced by Ischemia in Cx43-deficient Mice」、Circ.、101(5):547〜552頁、(2000)
【非特許文献３】Gutsteinら、「Conditional Gene Targeting of Connexin43: Exploring the Consequences of Gap Junction Remodeling in the Heart」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):345〜348頁、(2001)
【非特許文献４】Vaidyaら、「Null Mutation of Connexin43 Causes Slow Propagation of Ventricular Activation in the Late Stages of Mouse Embryonic Development」、Circ. Res.、88(11):1196〜1202頁、(2001)
【非特許文献５】Willeckeら、「Structural and Functional Diversity of Connexin Genes in the Mouse and Human Genome」、Biol. Chem.、383(5):725〜737頁、(2002)
【非特許文献６】Duffyら、「pH-Dependent Intramolecular Binding and Structure Involving Cx43 Cytoplasmic Domains」、J. Biol. Chem.、277(39):36706〜36714頁、(2002)
【非特許文献７】Morenoら、「Role of the Carboxyl Terminal of Connexin43 in Transjunctional Fast Voltage Gating」、Circ, Res.、90(4):450〜457頁、(2002)、92(1):e30 (2003) (erratum)
【非特許文献８】Morleyら、「Intramolecular Interactions Mediate pH Regulation of Connexin43 Channels」、Biophys. J.、70(3):1294〜1302頁、(1996)
【非特許文献９】Duffyら、「Regulation of Connexin43 Protein Complexes by Intracellular Acidification」、Circ. Res.、94(2):215〜222頁、(2004)
【非特許文献１０】Giepmansら、「Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the Regulation of Cell-cell Communication」、J. Biol. Chem.、276(11):8544〜8549頁、(2001)
【非特許文献１１】Kanemitsuら、「Tyrosine Phosphorylation of Connexin 43 by v-Src is Mediated by SH2 and SH3 Domain Interactions」、J. Biol. Chem.、272(36):22824〜22831頁、(1997)
【非特許文献１２】Lampeら、「Phosphorylation of Connexin43 on Serine368 by Protein Kinase C Regulates Gap Junctional Communication」、J. Cell Biol.、149(7):1503〜1512頁、(2000)
【非特許文献１３】Lauら、「Regulation of Connexin43 Function by Activated Tyrosine Protein Kinases」、J. Bioenerg. Biomembr.、28(4):359〜368頁、(1996)
【非特許文献１４】Shinら、「The Regulatory Role of the C-Terminal Domain of Connexin43」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):271-275 (2001)
【非特許文献１５】TenBroekら、「Ser364 of Connexin43 and the Upregulation of Gap Junction Assembly by cAMP」、J. Cell Biol.、155(7):1307〜1318頁、(2001)
【非特許文献１６】Giepmans & Moolenaar、「The Gap Junction Protein Connexin43 Interacts with the Second PDZ Domain of the Zona Occludens-1 Protein」、Curr. Biol.、8(16):931〜934頁、(1998)
【非特許文献１７】Giepmansら、「Connexin-43 Interactions with ZO-1 and Alpha- and Beta-tubulin」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):219〜223頁、(2001)
【非特許文献１８】Toyofukuら、「Direct Association of the Gap Junction Protein Connexin-43 with ZO-1 in Cardiac Myocytes」、J. Biol. Chem.、273(21):12725〜12731頁、(1998)
【非特許文献１９】Toyofukuら、「c-Src Regulates the Interaction between Connexin-43 and ZO-1 in Cardiac Myocytes」、J. Biol. Chem.、276(3):1780〜1788頁、(2000)
【非特許文献２０】Zhouら、「Dissection of the Molecular Basis of pp60(v-Src) Induced Gating of Connexin 43 Gap Junction Channels」、J. Cell Biol.、144(5):1033〜1045頁、(1999)
【非特許文献２１】Aiら、「Wnt-1 Regulation of Connexin43 in Cardiac Myocytes」、J. Clin. Invest.、105(2):161〜171頁、(2000)
【非特許文献２２】Xuら、「N-Cadherin and Cx43[alpha]1 Gap Junctions Modulates Mouse Neural Crest Cell Motility Via Distinct Pathways」、Cell Adhes. Commun.、8(4-6):321〜324頁、(2001)
【非特許文献２３】Schubertら、「Connexin Family Members Target to Lipid Raft Domains and Interact with Caveolin-1」、Biochem.、41(18):5754〜5764頁、(2002)
【非特許文献２４】Anumonwoら、「The Carboxyl Terminal Domain Regulates the Unitary Conductance and Voltage Dependence of Connexin40 Gap Junction Channels」、Circ. Res.、88(7):666〜673頁、(2001)
【非特許文献２５】Srinivasら、「Prospects for Pharmacological Targeting of Gap Junction Channels」、CARDIAC ELECTROPHYSIOLOGY: FROM CELL TO BEDSIDE、158〜167頁、(Douglas Zipes & Jose Jalife編集、第4版、2004年)
【非特許文献２６】Burt & Spray、「Volatile Anesthetics Block Intercellular Communication between Neonatal Rat Myocardial Cells」、Circ. Res.、65(3):829〜837頁、(1989)
【非特許文献２７】Herve & Sarrouilhe、「Modulation of Junctional Communication by Phosphorylation: Protein Phosphatases, the Missing Link in the Chain」、Biol. Cell、94(7-8):423〜432頁、(2002)
【非特許文献２８】Srinivas & Spray、「Closure of Gap Junction Channels by Arylaminobenzoates」、Mol. Pharmacol.、63(6):1389〜1397頁、(2003)
【非特許文献２９】Mullerら、「Actions of the Antiarrhythmic Peptide AAP10 on Intercellular Coupling」、Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol.、356(1):76〜82頁、(1997)
【非特許文献３０】Dheinら、「Effects of the New Antiarrhythmic Peptide ZP123 on Epicardial Activation and Repolarization Pattern」、Cell Commun. Adhes.、10(4-6):371〜378頁、(2003)
【非特許文献３１】Dheinら、「Protein Kinase Ca Mediates the Effect of Antiarrhythmic Peptide on Gap Junction Conductance」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):257〜264頁、(2001)
【非特許文献３２】Kwak & Jongsma、「Selective Inhibition of Gap Junction Channel Activity by Synthetic Peptides」、J. Physiol.、516(3):679〜685頁、(1999)
【非特許文献３３】Dahlら、「Attempts to Define Functional Domains of Gap Junction Proteins with Synthetic Peptides」、Biophys. J.、67(5):1816〜1822頁、(1994)
【非特許文献３４】K. M. Abdullahら、(1999)、Endocrine、10 35〜41頁
【非特許文献３５】M. Saitohら、(1997)、Carcinogenesis、18:1319〜1328頁
【非特許文献３６】J. A. Goligerら、(1995)、Mol.Biol.Cell、6 1491〜1501頁
【非特許文献３７】G. J. Christら、(2000)、Braz. J Med Biol. Res.、33:423〜429頁
【非特許文献３８】R. Dermietzel、(1998)、Brain Res. Brain Res. Rev.、26:176〜183頁
【非特許文献３９】H. Aldskogiusら、(1998)、Prog. Neurobiol、55:1〜26頁
【非特許文献４０】D. Mackayら、(1999)、Am J Hum.Genet、64 1357〜1364頁
【非特許文献４１】S. G. Spanakisら、(1998)、Invest Ophthalmol. Vis.Sci.、39:1320〜1328頁
【非特許文献４２】LAIRD, D.W.、(2006)、Life cycle of connexins in health and disease. Biochem J、394、527〜43頁
【非特許文献４３】PROCHNOW, N. & DERMIETZEL, R.、(2008)、「Connexons and cell adhesion: a romantic phase.」、Histochem Cell Biol、130、71〜7頁
【非特許文献４４】CHUNG, E.、COOK, P.W.、PARKOS, C.A.、PARK, Y.K.、PITTELKOW, M.R. & COFFEY, R.J.、(2005)、「Amphiregulin causes functional downregulation of adherens junctions in psoriasis.」、J Invest Dermatol、124、1134〜40頁
【非特許文献４５】DJALILIAN, A.R.、MCGAUGHEY, D.、PATEL, S.、SEO, E.Y.、YANG, C.、CHENG, J.、TOMIC, M.、SINHA, S.、ISHIDA-YAMAMOTO、A. & SEGRE, J.A、(2006)、「Connexin 26 regulates epidermal barrier and wound remodeling and promotes psoriasiform response.」、J Clin Invest、116、1243〜53頁
【非特許文献４６】LUCKE, T.、CHOUDHRY, R.、THOM, R.、SELMER, I.S.、BURDEN, A.D. & HODGINS, M. B.、(1999)、「Upregulation of connexin 26 is a feature of keratinocyte differentiation in hyperproliferative epidermis, vaginal epithelium, and buccal epithelium.」、J Invest Dermatol、112、354〜61頁
【非特許文献４７】「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第17版、Alfonso R. Gennaro編集、Mark Publishing Company、Easton, PA, U.S.A.、1985年
【非特許文献４８】B.D.Larsen、A.Holm、Int.J Pept.Protein Res.1994、43 1〜9頁
【非特許文献４９】Salamonら、「Surface Plasmon Resonance Spectroscopy as a Tool for Investigating the Biochemical and Biophysical Properties of Membrane Protein Systems. II: Applications to Biological Systems」、Biochim. Biophys. Acta、1331(2):131〜152頁、(1997)
【非特許文献５０】Langら、「Surface Plasmon Resonance as a Method to Study the Kinetics and Amplitude of Protein-protein Binding」、PRACTICAL METHODS IN CARDIOVASCULAR RESEARCH 936〜947頁、(Stefan Dhein、Friedrich Wilhelm Mohr & Mario Delmar編集、2005)
【非特許文献５１】Shibayamaら、「Identification of a Novel Peptide that Interferes with the Chemical Regulation of Connexin-43」、Circ. Res.、98:1365〜72頁、(2006)
【非特許文献５２】MacUra & Ernst、「Elucidation of Cross Relaxation in Liquids by Two-dimensional NMR Spectroscopy」、Mol. Phys. 41:95〜117頁、(1980)
【非特許文献５３】Kayら、「Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity」、J. Am. Chem. Soc.、114:10663〜10665頁、(1992)
【非特許文献５４】Delaglioら、「NMRPipe: A Multidimensional Spectral Processing System Based on UNIX Pipes」、J. Biomol. NMR、6(3):277〜293頁、(1995)
【非特許文献５５】Sorgen、「How to Solve a Protein Structure by Nuclear Magnetic Resonance - The Connexin43 Carboxyl Terminal Domain」、PRACTICAL METHODS IN CARDIOVASCULAR RESEARCH、948〜958頁、(Stefan Dhein, Friedrich Wilhelm Mohr & Mario Delmar編集、2005)
【非特許文献５６】Zhongら、「LacSwitch II Regulation of Connexin43 cDNA Expression Enables Gap-junction Single-channel Analysis」、Biotechniques、34(5):1034〜1034頁、1041〜1044頁、1046頁、(2003)
【非特許文献５７】Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004)
【非特許文献５８】Sekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004)
【非特許文献５９】Johnston & Ramon、「Electrotonic Coupling in Internally Perfused Crayfish Segmented Axons」、J. Physiol.、317:509〜518頁、(1981)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、当分野のこれらの問題点を解消することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、一般に、ギャップ結合細胞間コミュニケーション(GJIC)を調節するペプチドに関する。本発明は、GJICの障害に関連した病態の治療または予防における使用を含めて、多種多様な有用な適用例を有する。
【００１３】
本発明の第1の態様では、式Iによるペプチドおよびその薬学的に許容される塩を提供する:
式I:
R1-Z-(L-R)p-R2
[式中、R1は、H、Ac、ベンゾイル、およびTfaから選択され、
Zは、A1-A2-A3-A4またはそのレトロ類似体であり、
A1は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A2は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A3は、任意選択によりBで修飾される、好ましくはGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択される任意のアミノ酸であり、または任意選択によりBで修飾されるリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)であり、
A4は、Trp、Tyr、Phe、もしくはHisなどの芳香族アミノ酸、Ala、Val、Leu、もしくはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはMetであるか、または欠失しており、
Bは疎水性基であり、
Lは、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15またはそのレトロ類似体であり、
X1は、Gly、Ala、Ser、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、または欠失しており、
X2は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X3は、Gly、Ala、Ser、Leu、Val、Ile、または欠失しており、
X4は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X5は、Gly、Ala、Ser、Arg、Lys、His、または欠失しており、
X6は、Val、Ile、Leu、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X7は、Pro、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X8は、Trp、Tyr、Phe、Leu、Val、Ile、または欠失しており、
X9は、Trp、Tyr、Phe、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X10は、Gly、Ala、Ser、Arg、Lys、His、または欠失しており、
X11は、Arg、Lys、His、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X12は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X13は、Val、Leu、Ile、または欠失しており、
X14は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X15は、Arg、Lys、His、または欠失しており、
Qは、A5-A6-A7-A8またはそのレトロ類似体であり、
A5は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A6は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A7は、任意選択によりBで修飾される、好ましくはGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択される任意のアミノ酸であり、または任意選択によりBで修飾されるリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)であり、
A8は、Trp、Tyr、Phe、もしくはHisなどの芳香族アミノ酸、Ala、Val、Leu、もしくはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはMetであるか、あるいは欠失しており、
R2は、NH2、OH、OR、NHR、NRRであり、
RはC1〜C6アルキルであり、
pは0、1、2、3、4、または5である]。
【００１４】
本発明の第1の態様の一部の好適な実施形態では、p=1であり、したがって本発明のペプチドは式IIによって表される。
式II:
R1-Z-L-Q-R2
式中、Z、L、Q、R1、およびR2は、式Iで定義した通りである。
【００１５】
本発明の第1の態様の他の好適な実施形態では、p=0であり、したがって本発明のペプチドは式IIIによって表される。
式III:
R1-Z-R2
式中、Z、R1、およびR2は、式Iで定義した通りである。
【００１６】
本発明のペプチドはまた、酵素分解に対してペプチドを安定させるためにアルキル化または他の方法で修飾されたペプチド結合を含むことができ、かつ/またはD-アミノ酸を含むことができる。
【００１７】
本発明の範囲内のペプチドは、本明細書に記載する一実施形態では、遊離N末端基および/またはC末端基を有する。これらの基は、一部の本発明の使用では、遊離したままとすることができる。しかしながら、別の実施形態では、これらのペプチドは、ブロックされたC末端基および遊離N末端基を有することができる。別法では、このようなペプチドは、ブロックされたN末端基および遊離C末端基、またはブロックされたN末端基およびC末端基を有することができる。分子の両側の末端基の性質は特に重要ではない。
【００１８】
加えて、ペプチド内のアミノ酸残基は、D-アミノ酸でもL-アミノ酸でもよい。特定の態様では、化合物の安定性を向上させるために、好ましくはD-アミノ酸とすることができる。
【００１９】
本発明によるペプチドは、多種多様な重要な用途および利点がある。
【００２０】
例えば、このようなペプチドは、細胞間コミュニケーションの減少、細胞間コミュニケーションの過結合、または細胞コミュニケーションの誤調節につながるギャップ結合機能の障害に関連した病態の予防および/または治療に使用することができる。
【００２１】
したがって、一態様では、本発明は、治療方法に使用するための、本明細書に記載するペプチドを提供する。好ましくは、この治療方法は、ギャップ結合コミュニケーション障害が関与する病態を治療する。
【００２２】
本発明の別の態様は、ギャップ結合機能の障害に関連した病態の予防および/または治療用の薬物の製造に関する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、このような病態を有するまたは発症するリスクのある患者に、上記のいずれかのペプチドを治療有効量投与する段階を含む、治療方法を提供する。好適な一態様では、患者はヒトである。
【００２４】
治療できる病態の例として、心血管疾患、気道上皮の炎症、肺胞組織の障害、膀胱失禁(bladder incontinence)、蝸牛の疾患による難聴、内皮損傷、糖尿病性網膜症および糖尿病性ニューロパチー、中枢神経系および脊髄の虚血、歯周部の疾患を含む歯組織の障害、腎疾患、骨髄移植不全、創傷、勃起不全、膀胱失禁(urinary bladder incontinence)、神経障害痛、亜慢性および慢性炎症、骨髄および幹細胞移植の癌および障害、細胞および組織の移植の際または外科手術などの医療処置の際に起こる状態、ならびに過剰な活性酸素種および/またはフリーラジカルおよび/または硝酸によって引き起こされる状態が挙げられるが、これらに限定されるものではない。治療できる状態のさらなる例として、乾癬、骨粗鬆症、および糖尿病が挙げられる。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のいずれかのペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。好ましくは、医薬組成物は、上記の治療方法における使用に適している。好ましくは、このような担体は、滅菌され、発熱物質およびウイルスを含んでいない。
【００２６】
以下の説明では、本発明の実施形態および実施例を、図面を参照しながら説明する。本明細書に記載する実施形態および実施例は、例示目的であって、本発明の範囲を限定すると解釈すべきものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】1.5mMオクタノールで灌流(太い矢印で開始を示す)する前および最中のCx43-発現N2a細胞対から得た結合部電流(Ij)トレースのグラフである(結合部通過電圧:60mV、パルス期間:10秒、パルス間間隔:10秒)。パッチピペットを、通常のピペット内液で満たした。
【図１Ｂ】1.5mMオクタノールで灌流(太い矢印で開始を示す)する前および最中のCx43-発現N2a細胞対から得た結合部電流(Ij)トレースのグラフである(結合部通過電圧:60mV、パルス期間:10秒、パルス間間隔:10秒)。ピペット内液には、0.1mMの濃度のペプチド2371を含めた。パッチピペットにおけるペプチド2371は、オクタノール誘導脱共役を防止した。
【図１Ｃ】1.5mMオクタノールで灌流(太い矢印で開始を示す)する前および最中のCx43-発現N2a細胞対から得た結合部電流(Ij)トレースのグラフである(結合部通過電圧:60mV、パルス期間:10秒、パルス間間隔:10秒)。ピペット内液には、ペプチド2372を含めた。パッチピペットにおけるペプチド2372は、オクタノール誘導脱共役を防止した。
【図２Ａ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。実験は、ピペット内液中に0.1mMペプチド2366、2371、2372、および2497が非存在(N=7)または存在(N=7)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。「脱共役」は、図1A〜図1Cに例示し実施例7に記載した電圧クランププロトコル下での結合部電流の完全な喪失を指す。 図2A、図2C、および図2Eは、オクタノールの灌流の開始後の1分経過毎のカップリングしたままの細胞対のパーセントを例示している。図2B、図2D、および図2Fは、オクタノール灌流の開始後の時間の関数として平均結合コンダクタンス(Gj)を示している。各細胞対に対して、Gjは、オクタノール曝露前に記録した値に対して測定した。ペプチド2371(図2Aおよび図2B)、2372(図2Aおよび図2B)、および2366(図2Cおよび図2D)において、平均Gjが初めは低下するが後に上昇することが観察できる。この上昇は、脱共役剤によって初めは閉じられていたギャップ結合を再開させるこれらのペプチドの能力を反映している。ペプチド2497(図2Eおよび図2F)は、Gjの脱共役を防止している。
【図２Ｂ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。実験は、ピペット内液中に0.1mMペプチド2366、2371、2372、および2497が非存在(N=7)または存在(N=7)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。「脱共役」は、図1A〜図1Cに例示し実施例7に記載した電圧クランププロトコル下での結合部電流の完全な喪失を指す。 図2A、図2C、および図2Eは、オクタノールの灌流の開始後の1分経過毎のカップリングしたままの細胞対のパーセントを例示している。図2B、図2D、および図2Fは、オクタノール灌流の開始後の時間の関数として平均結合コンダクタンス(Gj)を示している。各細胞対に対して、Gjは、オクタノール曝露前に記録した値に対して測定した。ペプチド2371(図2Aおよび図2B)、2372(図2Aおよび図2B)、および2366(図2Cおよび図2D)において、平均Gjが初めは低下するが後に上昇することが観察できる。この上昇は、脱共役剤によって初めは閉じられていたギャップ結合を再開させるこれらのペプチドの能力を反映している。ペプチド2497(図2Eおよび図2F)は、Gjの脱共役を防止している。
【図２Ｃ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。実験は、ピペット内液中に0.1mMペプチド2366、2371、2372、および2497が非存在(N=7)または存在(N=7)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。「脱共役」は、図1A〜図1Cに例示し実施例7に記載した電圧クランププロトコル下での結合部電流の完全な喪失を指す。 図2A、図2C、および図2Eは、オクタノールの灌流の開始後の1分経過毎のカップリングしたままの細胞対のパーセントを例示している。図2B、図2D、および図2Fは、オクタノール灌流の開始後の時間の関数として平均結合コンダクタンス(Gj)を示している。各細胞対に対して、Gjは、オクタノール曝露前に記録した値に対して測定した。ペプチド2371(図2Aおよび図2B)、2372(図2Aおよび図2B)、および2366(図2Cおよび図2D)において、平均Gjが初めは低下するが後に上昇することが観察できる。この上昇は、脱共役剤によって初めは閉じられていたギャップ結合を再開させるこれらのペプチドの能力を反映している。ペプチド2497(図2Eおよび図2F)は、Gjの脱共役を防止している。
【図２Ｄ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。実験は、ピペット内液中に0.1mMペプチド2366、2371、2372、および2497が非存在(N=7)または存在(N=7)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。「脱共役」は、図1A〜図1Cに例示し実施例7に記載した電圧クランププロトコル下での結合部電流の完全な喪失を指す。 図2A、図2C、および図2Eは、オクタノールの灌流の開始後の1分経過毎のカップリングしたままの細胞対のパーセントを例示している。図2B、図2D、および図2Fは、オクタノール灌流の開始後の時間の関数として平均結合コンダクタンス(Gj)を示している。各細胞対に対して、Gjは、オクタノール曝露前に記録した値に対して測定した。ペプチド2371(図2Aおよび図2B)、2372(図2Aおよび図2B)、および2366(図2Cおよび図2D)において、平均Gjが初めは低下するが後に上昇することが観察できる。この上昇は、脱共役剤によって初めは閉じられていたギャップ結合を再開させるこれらのペプチドの能力を反映している。ペプチド2497(図2Eおよび図2F)は、Gjの脱共役を防止している。
【図２Ｅ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。実験は、ピペット内液中に0.1mMペプチド2366、2371、2372、および2497が非存在(N=7)または存在(N=7)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。「脱共役」は、図1A〜図1Cに例示し実施例7に記載した電圧クランププロトコル下での結合部電流の完全な喪失を指す。 図2A、図2C、および図2Eは、オクタノールの灌流の開始後の1分経過毎のカップリングしたままの細胞対のパーセントを例示している。図2B、図2D、および図2Fは、オクタノール灌流の開始後の時間の関数として平均結合コンダクタンス(Gj)を示している。各細胞対に対して、Gjは、オクタノール曝露前に記録した値に対して測定した。ペプチド2371(図2Aおよび図2B)、2372(図2Aおよび図2B)、および2366(図2Cおよび図2D)において、平均Gjが初めは低下するが後に上昇することが観察できる。この上昇は、脱共役剤によって初めは閉じられていたギャップ結合を再開させるこれらのペプチドの能力を反映している。ペプチド2497(図2Eおよび図2F)は、Gjの脱共役を防止している。
【図２Ｆ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。実験は、ピペット内液中に0.1mMペプチド2366、2371、2372、および2497が非存在(N=7)または存在(N=7)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。「脱共役」は、図1A〜図1Cに例示し実施例7に記載した電圧クランププロトコル下での結合部電流の完全な喪失を指す。 図2A、図2C、および図2Eは、オクタノールの灌流の開始後の1分経過毎のカップリングしたままの細胞対のパーセントを例示している。図2B、図2D、および図2Fは、オクタノール灌流の開始後の時間の関数として平均結合コンダクタンス(Gj)を示している。各細胞対に対して、Gjは、オクタノール曝露前に記録した値に対して測定した。ペプチド2371(図2Aおよび図2B)、2372(図2Aおよび図2B)、および2366(図2Cおよび図2D)において、平均Gjが初めは低下するが後に上昇することが観察できる。この上昇は、脱共役剤によって初めは閉じられていたギャップ結合を再開させるこれらのペプチドの能力を反映している。ペプチド2497(図2Eおよび図2F)は、Gjの脱共役を防止している。
【図３Ａ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。二重細胞パッチクランプ実験は、ピペット内液中に0.1mMペプチド2517が非存在(黒のトレース;四角のデータ点)または存在(赤のトレース;丸のデータ点)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。
【図３Ｂ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。二重細胞パッチクランプ実験を、ピペット内液中に0.1mMペプチド2518が非存在(黒のトレース;四角のデータ点)または存在(赤のトレース;丸のデータ点)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。
【図３Ｃ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。二重細胞パッチクランプ実験を、ピペット内液中に0.1mMペプチド2519が非存在(黒のトレース;四角のデータ点)または存在(赤のトレース;丸のデータ点)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。
【図３Ｄ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。二重細胞パッチクランプ実験を、ピペット内液中に0.1mMペプチド2520が非存在(黒のトレース;四角のデータ点)または存在(赤のトレース;丸のデータ点)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。
【図３Ｅ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。二重細胞パッチクランプ実験を、ピペット内液中に0.1mMペプチド2624が非存在(黒のトレース;四角のデータ点)または存在(赤のトレース;丸のデータ点)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
上記したように、本発明は、ギャップ結合細胞間コミュニケーション(GJIC)を調節するペプチドに関する。本発明は、GJICの障害に関連した病態の治療または予防における使用を含めて、多種多様な有用な適用例を有する。
【００２９】
本発明のペプチドは、上記したように式Iによって表される。
【００３０】
A1が塩基性アミノ酸である実施形態では、好ましくは、A1はLysまたはArgである。A1がリジン模倣物である実施形態では、好ましくは、A1は(4S,2R)Ampである。A2が塩基性アミノ酸である実施形態では、好ましくは、A2はLysまたはArgである。A2がリジン模倣物である実施形態では、好ましくは、A2は(4S,2R)Amp(Ac)である。一部の実施形態では、A1およびA2は、同じアミノ酸または同じリジン模倣物であることが好ましい。例えば、A1およびA2は共に、Arg、Lys、または(4S,2R)Ampとすることができる。p=0および/またはA4が欠失している場合は、A1およびA2が同一であることが特に好ましい。
【００３１】
A4が存在する場合は、A3は、好ましくは、Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸であり、より好ましくは、AsnまたはGlnである。p=0でA4が存在する場合は、A3はAsnまたはGlnであることが好ましい。
【００３２】
A4が欠失している場合は、A3は、好ましくは、Bで修飾されたGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸、Bで修飾されたリジン模倣物、またはGlx(CONH-B)であり、より好ましくは、Lys(NH-B)、Asn(CONH-B)、Glx(CONH-B)、またはBで修飾されたリジン模倣物である。A3は、Lys(NH-B)、Glx(CONH-B)、またはBで修飾されたリジン模倣物とすることができる。例えば、A3は、Lys(4-ヒドロキシベンゾイル)またはAsn(ベンジル)とすることができる。
【００３３】
一部の実施形態では、A4は、好ましくは、Trp、Tyr、Phe、またはHisなどの芳香族アミノ酸または欠失している。より好ましくは、A4は、Trp、Tyr、Phe、または欠失している。最も好ましくは、A4は、Tyrまたは欠失している。p=0である一部の実施形態では、A4は、Ala、Val、Leu、またはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはアミノ酸Metであることが好ましいであろう。
【００３４】
本ペプチドは、ZがA4-A3-A2-A1であるZのレトロ類似体を含むことができる。
【００３５】
上記したように、Bは疎水性基である。好ましくは、Bは、任意選択で置換される芳香族炭素環、好ましくは6員または12員の芳香族炭素環を含む疎水性基である。Bは、後述するように任意選択で置換してもよい。好ましくは、Bは、任意選択で置換されるアラルキル基、アリール基、またはアロイル基、例えば、ベンジル、ヒドロキシベンジル、フェニル、ヒドロキシフェニル、ナフチル、ヒドロキシナフチル、ベンゾイル、ヒドロキシベンゾイル、ナフトイル、またはヒドロキシナフトイルなどである。最も好ましくは、Bは、ベンジル、4-ヒドロキシベンジル、ベンゾイル、または4-ヒドロキシベンゾイルである。
【００３６】
本発明のアミノ酸残基がBで修飾されている場合は、好ましくは、Bは共有結合によってアミノ酸残基に付着される。より好ましくは、Bは、アミノ酸残基の側鎖に共有結合によって付着される。最も好ましくは、Bは、ペプチド主鎖から遠位側の側鎖の末端に付着される。
【００３７】
pが0ではない実施形態では、Qが存在する。本ペプチドは、QがA8-A7-A6-A5であるQのレトロ類似体を含むことができる。
【００３８】
A5が塩基性アミノ酸である場合は、好ましくは、A5はLysまたはArgである。A5がリジン模倣物である場合は、好ましくは、A5は(4S,2R)Ampである。A6が塩基性アミノ酸である場合は、好ましくは、A6はLysまたはArgである。A6がリジン模倣物である場合は、好ましくは、A6は(4S,2R)Amp(Ac)である。一部の実施形態では、A5およびA6は、同じアミノ酸または同じリジン模倣物であることが好ましい。例えば、A5およびA6は共に、Arg、Lys、または(4S,2R)Ampとすることができる。
【００３９】
A8が存在する場合は、A7は、好ましくは、Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸であり、より好ましくは、AsnまたはGlnである。
【００４０】
A8が欠失している場合は、A7は、好ましくは、Bで修飾されたGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸、Bで修飾されたリジン模倣物、またはGlx(CONH-B)であり、より好ましくは、Lys(NH-B)、Asn(CONH-B)、Glx(CONH-B)、またはBで修飾されたリジン模倣物である。A7は、Lys(NH-B)、Glx(CONH-B)、またはBで修飾されたリジン模倣物とすることができる。例えば、A7は、Lys(4-ヒドロキシベンゾイル)またはAsn(ベンジル)とすることができる。
【００４１】
一部の実施形態では、A8は、好ましくは、Trp、Tyr、Phe、またはHisなどの芳香族アミノ酸または欠失している。より好ましくは、A8は、Trp、Tyr、Phe、または欠失している。最も好ましくは、A8は、Tyrまたは欠失している。p=0である一部の実施形態では、A8は、Ala、Val、Leu、またはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはアミノ酸Metであることが好ましいであろう。
【００４２】
A1およびA5は、同じアミノ酸もしくは同じリジン模倣物であり、かつ/またはA2およびA6は、同じアミノ酸もしくはリジン模倣物であり、かつ/またはA3およびA7は、同じアミノ酸もしくはリジン模倣物であるか、または共にGlx(NH-B)であり、かつ/またはA4およびA8は、同じアミノ酸もしくは共に欠失していることが好ましいであろう。
【００４３】
p=0でない一部の実施形態では、Lが存在しない、すなわちX1〜X15のそれぞれが欠失していることが好ましい。
【００４４】
好ましくは、pは、0または1であり、より好ましくは0である。
【００４５】
好ましくは、R1はAcである。好ましくは、R2はNH2である。一部の好適な実施形態では、R1はAcであり、R2はNH2である。
【００４６】
本発明のペプチドの第1のサブセットは、式IIIによって表されるペプチドである。すなわち、p=0であり、
A1は、Lys、Arg、または(2S4R)Ampであり、
A2は、Lys、Arg、または(2S4R)Amp(Ac)であり、
A3は、A4が欠失している場合は、Lys(NH-B)またはAsn(CONH-B)であり、A4が存在する場合は、AsnまたはGlnであり、
A4は、Trp、Tyr、Phe、His、または欠失している。
【００４７】
本発明のペプチドの第1のサブセットでは、A1およびA2は同じ、すなわちA1およびA2は共にLys、Arg、またはAmpであることが好ましい。また、この第1のサブセットでは、A3は、A4が欠失している場合は、Lys(4-ヒドロキシベンゾイル)またはAsn(ベンジル)であり、A4が存在する場合は、Asnであることが好ましい。また、この第1のサブセットでは、A4はTyrまたは欠失していることが好ましい。また、この第1のサブセットでは、R1はAcであり、R2はNH2であることが好ましい。
【００４８】
本発明のペプチドの第2のサブセットは、p=1、2、3、4、または5であるペプチドであり、
A1およびA5は、同じアミノ酸または同じリジン模倣物であり、
A2およびA6は、同じアミノ酸またはリジン模倣物であり、
A3およびA7は、同じアミノ酸もしくはリジン模倣物、または共にGlx(NH-B)であり、
A4およびA8は、同じアミノ酸または共に欠失している。
【００４９】
第2のサブセット内のより好ましいペプチドは、p=1である式IIによって表される。この第2のサブセットでは、A1およびA5ならびにA2およびA6は、すべて同じアミノ酸またはリジン模倣物であることが好ましい。また、この第2のサブセットでは、A1およびA5は共にArgであることが好ましい。また、この第2のサブセットでは、A2およびA6は共にArgであることが好ましい。また、この第2のサブセットでは、A3およびA7は共にAsnであることが好ましい。また、この第2のサブセットでは、A4およびA8は共にTyrであることが好ましい。
【００５０】
本発明による化合物の例として、
Ac-Lys-Lys-Asn-Phe-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Tyr-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-His-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Trp-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Val-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Leu-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Ile-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Met-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-His-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Trp-NH2
Ac-Arg-ArgAsn-Ile-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Met-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Val-NH2
Ac-Arg-ArgAsn-Leu-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Phe-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-Tyr-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-His-NH2
Ac(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-Trp-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-Phe-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-Ile-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)Asn-Met-NH2
Ac-(D-Arg)-(DArg)-Asn-Val-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-Leu-NH2
Ac-Tyr-Asn-Arg-Arg-NH2
Ac-Tyr-Asn-Lys-Arg-NH2
Ac-Tyr-Asn-Arg-Lys-NH2
Ac-Tyr-Asn-Lys-Lys-NH2
Ac-(D-Tyr)-(D-Asn)-(D-Arg)-(D-Arg)-NH2
Ac-(D-Tyr)-(D-Asn)-(D-Lys)-(D-Arg)-NH2
Ac-(D-Tyr)-(D-Asn)-(D-Arg)-(D-Lys)-NH2
Ac-(D-Tyr)-(D-Asn)-(D-Lys)-(D-Lys)-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Phe-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Tyr-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-His-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Trp-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Val-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Leu-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Ile-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Met-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-His-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Trp-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Ile-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Met-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Val-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Leu-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Phe-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Phe-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Tyr-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-His-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Trp-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Val-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Leu-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Ile-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Met-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Phe-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-His-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Trp-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Val-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Leu-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Ile-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Met-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Phe-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-His-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Trp-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Val-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Leu-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Ile-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Met-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn(CONH-(4-ヒドロキシベンジル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Lys(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn(CONH-(ベンジル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Lys(NH(ベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn(CONH-(α-メチルナフチル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Lys(NH(α-ナフトイル))-NH2
Ac-Lys(4-ヒドロキシベンゾイル)-Arg-Arg-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn(CONH-(4-ヒドロキシベンジル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Lys(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn(CONH-(ベンジル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Lys(NH(ベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn(CONH-(α-メチルナフチル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Lys(NH(α-ナフトイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Damba(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Orn(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Dab(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Dapa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Daa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Amp(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-(4S-Amoa)(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Phe(4-NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-ArgArg-Ameg(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-pmGly(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Ica(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Apa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Damba(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Orn(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Dab(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Dapa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Daa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Amp(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-(4S-Amoa)(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Phe(4-NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Ameg(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-pmGly(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Ica(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Apa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Damba(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Orn(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Dab(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Dapa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Daa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Amp(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-(4S-Amoa)(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Phe(4-NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Ameg(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-pmGly(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Ica(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Apa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Damba(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Orn(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Dab(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Dapa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Daa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Amp(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-(4S-Amoa)(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Phe(4-NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Ameg(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-pmGly(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Ica(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Apa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Tyr-Lys-Lys-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Tyr-Arg-Lys-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Tyr-Lys-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Lys-Lys-Asn-Tyr-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Tyr-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
が挙げられる。
【００５１】
本発明の範囲内のより具体的なペプチドを、以下のTable 1(表1)に示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
本発明による別のペプチドの例として、化合物2624:Ac-Lys-Lys-Lys(4-ヒドロキシベンゾイル)-NH2が挙げられる。
【００５４】
上の表に列記したペプチドのほとんどの例では、R1はAcであり、R2はNH2である。上の表に列記したペプチドのR1基およびR2基は、示したR1基およびR2基に限定されるものではなく、本発明の範囲内のあらゆるR1基およびR2基とすることができる。上記のR1基およびR2基は、上の表に列記したペプチドに対して好ましいR1基およびR2基であろう。
【００５５】
本発明によるより具体的なペプチドは、一態様では、ギャップ結合によって仲介される細胞間コミュニケーションを促進し、かつ/または維持し、または阻害する。本発明はまた、細胞間ギャップ結合コミュニケーション障害に関連した病態の治療用の医薬組成物の調製および使用ならびにこのような組成物の使用方法に関する。
【００５６】
定義
特段の記載がない限り、以下の定義は、以下の記載に使用する特定の用語についてのものである。
【００５７】
本明細書および特許請求の範囲のすべてにおいて、天然のアミノ酸に対する3文字コードならびにSarcosin(Sar)などの他のα-アミノ酸に対して一般に許容されている3文字コードを使用する。L型またはD型を特定しない場合は、そのアミノ酸は、L型またはD型のいずれにもできることを理解されたい。
【００５８】
用語「ハロゲン」は、F、Cl、Br、およびIを指すが、FおよびIが好ましい。
【００５９】
用語「アルキル」は、任意の炭素原子の水素原子を除くことでアルカンから得た1価の基:CnH2n+1-を指す。非分岐鎖アルカンの末端炭素原子から水素原子を除いて得た基は、ノルマルアルキル(n-アルキル)基:H[CH2]n-のサブクラスを構成する。基RCH2-、R2CH-(RはHに等しくない)、およびR3C-(RはHに等しくない)はそれぞれ、1級、2級、および3級アルキル基である。C(1〜22)アルキルは、1個〜22個の炭素原子を有するあらゆるアルキル基を指し、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、ブチル、ペンチル、およびヘキシル、ならびにこれらのすべての可能な異性体などのC(1〜6)アルキルを含む。
【００６０】
語句「低級アルキル」は、炭素原子が約6個未満、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、またはブチルである直鎖または分岐鎖アルキルを意味する。
【００６１】
用語「アルケニル」は、1つまたは複数の炭素-炭素二重結合を含む直鎖、分岐鎖、または環状炭化水素基を指す。C(2〜22)アルケニルは、2個〜22個の炭素原子を有するあらゆるアルケニル基を指し、C(2〜6)アルケニル、ビニル、アリル、および1-ブテニルなどを含む。
【００６２】
用語「アラルキル」は、アリールC(1〜22)アルキルを指し、用語「アリール」は、本明細書ではフェニルまたはナフチルを意味する。
【００６３】
アロイルは、以下に示す構造を有する基を意味する。
【００６４】
【化１】
【００６５】
Arはアリールである。
【００６６】
語句「疎水性基」は、任意選択で置換される芳香族炭素環、好ましくは6〜12員の芳香族炭素環を含む。疎水性基は、後述するように任意選択で置換することができる。例示的な疎水性基は、ベンジル、フェニル、およびナフチルを含む。
【００６７】
本明細書で用いる用語「任意選択で置換される」は、基の1つまたは複数の水素原子(例えば、1、2、3、4、5、または6個の水素原子)のそれぞれを、製薬化学で一般に使用される置換原子または置換基で置換することができることを意味する。各置換基は、同じでも異なっていてもよい。適当な置換基の例として、ヒドロキシル、1級アミン(すなわち、NH2)、2級アミン、3級アミン、アミド、カルバメート、尿素、ヒドラジド、ハロゲン化合物、亜硝酸塩、ニトロ、硫化物、スルホキシド、スルホン、スルホンアミド、チオール、カルボキシ、アルデヒド、ケト、カルボン酸、エステル、アミド、イミン、およびイミド、ならびにこれらのチオ誘導体が挙げられる。好ましくは、1〜3個の任意選択の置換基が存在することができる。疎水性基が単環式芳香族炭素環によって表される実施形態では、第4位で置換されることが好ましく、置換基がヒドロキシルであることが好ましい。
【００６８】
Glx(CONH-B)は、以下に示す構造を有する部分を意味する。
【００６９】
【化２】
【００７０】
本明細書で用いる用語「リジン模倣物」(LM)は、以下に示す構造の1つを有する部分を意味する:
【００７１】
【化３Ａ】
【００７２】
【化３Ｂ】
【００７３】
Ampは、上に示したNH2基のN原子によって近接するアミノ酸またはさらにリジン模倣物に付着することによってα-アミノ酸として(上に示したように)またはγ-アミノ酸として用いることができる。この例は、化合物2517:H-(2S4R)Amp((2S4R)Amp(Ac))-Asn-Tyr-NH2であり、以下に示す構造を有する。
【００７４】
【化４】
【００７５】
第2のAmp(すなわち、H-(2S4R)Amp((2S4R)Amp(Ac))-Asn-Tyr-NH2に組み込まれたAmp)は、第1のAmp(すなわち、第1のAmpはγ-アミノ酸として用いられている)の側鎖のNH2基のN原子に付着しているため、括弧内に示している。第2のAmpは、アセチル化されているため、アセチル基が第2のAmpの後の括弧内にある。
【００７６】
本発明のペプチドにおけるリジン模倣物は、任意選択で置換することができ、好ましくは、置換基はAcである。
【００７７】
ペプチド配列ZおよびQへのLMの組み込み方の例は次の通りである。
R1-Z-R2については:
R1-LM(NH2)-A2-A3-A4-R2
R1-LM(NH2)-LM(NH2)-A3-A4-R2
R1-A1-LM(NH2)-A3-A4-R2
R2-Z-L-Q-R1については:
R1-LM(NH2)-A2-A3-A4-L-A5A6-A7-A8-R2
R1-LM(NH2)-LM(NH2)-A3-A4-L-A5-A6A7-A8-R2
R1-A1-LM(NH2)-A3-A4-L-A5-A6-A7-A8-R2
R1-A1-A2-LM(NH-B)-L-A5-A6-A7-A8-R2
R1-LM(NH2)-A2-A3-A4-L-LM(NH2)-A6-A7-A8-R2
R1-LM(NH2)-LM(NH2)-A3-A4-L-LM(NH2)-LM(NH2)-A7-A8-R2
R1-A1-LM(NH2)-A3-A4-L-A5-LM(NH2)-A7-A8-R2
【００７８】
リジン模倣物がBで修飾された場合は、以下に示す部分となる。
【００７９】
【化５Ａ】
【００８０】
【化５Ｂ】
【００８１】
本発明のペプチドへのLM(NH-B)の組み込みの例は次の通りである。
R1-Z-R2については:
R1-A1-A2-LM(NH-B)-R2
R1-LM-A2-LM(NH-B)-R2
R1-LM-LM-LM(NH-B)-R2
R1-A1-LM-LM(NH-B)-R2
R2-Z-L-Q-R1については:
R1-A1-A2-LM(NH-B)-L-A5-A6-LM(NH-B)-R2
R1-A1-A2-LM(NH-B)-L-LM(NH2)-A6-LM(NH-B)-R2
R1-A1-A2-LM(NH-B)-L-A5-LM(NH2)-LM(NH-B)-R2
R1-A1-A2-LM(NH-B)-L-LM(NH2)-LM(NH2)-LM(NH-B)-R2
R1-LM(NH2)-A2-LM(NH-B)-L-A5-A6-LM(NH-B)-R2
R1-A1-LM(NH2)-LM(NH-B)-L-LM(NH2)-A6-LM(NH-B)-R2
R1-LM(NH2)-LM(NH2)-LM(NH-B)-L-A5-LM(NH2)-LM(NH-B)-R2
R1-LM(NH2)-LM(NH2)-LM(NH-B)-L-LM(NH2)-LM(NH2)-LM(NH-B)-R2
等
【００８２】
レトロ類似体の例は次の通りである。
R1-A4-A3-A2-A1-R1
R1-A4-A3-LM(NH2)-LM(NH2)-R2
R1-LM(NH-B)-A2-A1-R2
本明細書の定義に用いる炭素数(例えば、C1〜10アルキル、C2〜10アルケニル、C2〜10アルキニル、C6〜20アリールなど)は、炭素主鎖および炭素側鎖についてであり、置換基の炭素原子は含まない。
【００８３】
用語「細胞間コミュニケーションモジュレーター」、「ギャップ結合ファシリテーター」、「ギャップ結合コミュニケーションを促進する化合物」、および「ギャップ結合オープナー」などはすべて、この作用の背後の特定の機構とは無関係に、GJICを促進する、維持する、または(例えば、阻害または増強のいずれかによって)正常化する化合物を指す。より具体的には、用語「ギャップ結合オープナー」は、細胞外空間と細胞内空間との間のギャップ結合を通過できる分子の交換を正常化(すなわち、増加)させ、かつ/またはGJICの増大を正常化することができる物質を指すこともある。
【００８４】
用語「作用薬」は、任意のペプチドの標的である組織、細胞、または細胞画分と相互作用し、同じまたは少なくとも実質的に同じ生理反応を引き起こすことができるペプチドを指す。
【００８５】
用語「拮抗薬」は、組織、細胞、または細胞画分が任意のペプチドと接触した後にこれらの組織、細胞、または細胞画分で観察される1つまたは複数の生理反応を阻害または弱めるペプチドを指す。
【００８６】
本明細書で用いる「正常化する」は、生理反応が正常な患者で観察される生理反応とはほとんど異ならなくなるような生理反応の変化を指す。したがって、正常化は、関係する病態によって、生理反応の増大または減少を伴いうる。
【００８７】
本願で使用する省略形は、以下に示すように定義する。
【００８８】
【表２】
【００８９】
本明細書で言及するすべての参照文献は、参照によりその全容が本明細書に組み込まれている。
【００９０】
当業者であれば、本発明および特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示するものの変形形態、変更形態、および他の実施形態に想到するであろう。
【００９１】
治療の方法および適用
一態様では、本発明は、GJICの障害に関連した状態を有するまたは発症するリスクのある患者に、上記したいずれかのペプチドを治療に有効な量投与する方法を提供する。本発明によるペプチドを用いて治療できる患者として、動物、好ましくは哺乳動物、例えば、げっ歯類(マウス、ラット、ハムスター、およびラビットなどのウサギを含む)、イヌ、ブタ、ヤギ(一般なあらゆる家畜)、および霊長類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適な一態様では、患者はヒトである。
【００９２】
別の態様では、本発明は、患者に本発明によるペプチドを治療有効量投与することを含めた、ギャップ結合コミュニケーション障害が関与する病態の治療用の薬物を製造するための本ペプチドの使用に関する。
【００９３】
本発明のさらなる態様では、治療方法に使用するための本明細書に記載のペプチドを提供する。好ましくは、この治療方法は、ギャップ結合コミュニケーション障害が関与する病態の治療である。
【００９４】
治療できる状態の例として、心血管疾患、気道上皮の炎症、肺胞組織の障害、膀胱失禁、蝸牛の疾患による難聴、内皮損傷、糖尿病性網膜症および糖尿病性ニューロパチー、中枢神経系および脊髄の虚血、歯周部の疾患を含む歯組織の障害、腎疾患、骨髄移植不全、創傷、勃起不全、膀胱失禁、神経障害痛、亜慢性および慢性炎症、骨髄および幹細胞移植の癌および障害、細胞および組織の移植の際または外科手術などの医療処置の際に起こる状態、ならびに過剰な活性酸素種および/またはフリーラジカルおよび/または硝酸によって引き起こされる状態が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９５】
上記したように、本発明の目的は、ギャップ結合細胞間コミュニケーション(GJIC)を調節するペプチドを提供することである。したがって、本発明に一致する多くのペプチドは、細胞の脱共役を減少させる能力、活動電位期間の分散を正常化する能力、および伝導速度を正常化する能力、ギャップ結合の細胞の量を制御してコネキシンの発現を正常化する(必要に応じて上方制御または下方制御する)能力;ギャップ結合の分解を正常化する(阻害または促進する)能力、コネキシンの血漿膜への細胞輸送を正常化する(増加または減少させる)能力;コネキシンの機能的ギャップ結合への組み込みを促進する能力;既存のギャップ結合の開口を正常化する、例えば、ギャップ結合が阻害剤によって(例えば、1種または複数種のコネキシン(例えば、Cx43など)の細胞質カルボキシル末端ドメインの過剰リン酸化を仲介または促進するなどして)閉じられたまたはゲートで閉鎖されたときの開口を誘発または促進するか、またはギャップ結合が異常に開いたとき(例えば、シャルコー・マリー・ツース病)にギャップ結合を閉じる能力などの1つまたは複数を含むことができる。
【００９６】
不整脈
好適な一態様では、本発明は、心血管疾患、例えば、急性虚血性心疾患(例えば、安定狭心症、不安定狭心症、急性心筋梗塞)、うっ血性心不全(例えば、収縮期心不全、弛緩期心不全、高心拍出量性心不全、低拍出量性心不全、右心不全、または左心不全)、先天心疾患、肺性心、心筋症、心筋炎、高血圧性心疾患、および冠動脈血管再生などの際に起こる不整脈および血栓合併症の治療用の薬学的に活性な抗不整脈ペプチドおよびその使用法を提供する。
【００９７】
特定の実施形態では、本発明による抗不整脈ペプチドは、徐脈型不整脈(例えば、洞結節、房室結節、ヒス束、右脚、または左脚における疾患による)およびリエントリーに関連した頻拍性不整脈(例えば、心房期外収縮、房室接合部性期外収縮、心室期外収縮、心房細動、心房粗動、発作性上室頻拍、洞房結節リエントリー性頻拍、房室結節リエントリー性頻拍、および非持続性心室性頻脈)を治療および/または予防するために、単独で用いられるか、またはクラスI剤(例えば、リドカイン)、クラスII剤(例えば、メトプロロールまたはプロプラノロール)、クラスIII剤(例えば、アミオダロンまたはソタロール)、またはクラスIV剤(例えば、ベラパミル)などの他の抗不整脈化合物と組み合わせて用いられる。
【００９８】
加えてまたは別法では、本発明によるペプチドは、リエントリー不整脈;心室リエントリー(例えば、急性心筋梗塞、慢性心筋梗塞、安定狭心症、および不安定狭心症の際などに起こる);感染性または自律神経性の心筋症;心房細動;再分極交互脈;単形性心室頻拍;T波交互脈;徐脈型不整脈;および一般的な心組織の収縮性の減少、および血栓症などの1つまたは複数を治療するために用いられる。
【００９９】
骨粗鬆症
GJICが骨の形成に重要であることは理解されている。さらに好ましいペプチドは、これに加えてまたは別法として、このようなペプチドの存在下での骨芽細胞のカルシウム波形成および/またはアルカリホスファターゼ活性を測定する「標準的な骨芽細胞活性アッセイ」と本明細書で呼ぶ骨芽細胞活性を増大させる。好ましくは、このようなペプチドは、波に関連した細胞数(fura-2などのカルシウム感受性蛍光染料を用いて細胞内Ca2+のレベルを測定し、蛍光を発した細胞を計数して決定する)の増加として示されるカルシウム波活性を増大させた。アルカリホスファターゼ活性を用いても、標準的な比色アッセイによって骨芽細胞活性の測定を行うことができる。
【０１００】
さらなる態様では、本発明によるペプチドは、骨の形成、成長、または維持に影響を与える骨粗鬆症または他の病態の予防および/または治療に用いられる。低酸素の際のヒト骨芽細胞間の減弱GJICを正常化することができるペプチドは、骨吸収に対して骨形成が障害された骨疾患の治療に特に適している。このような方法に使用するのに最適なペプチドは、GJICの適切な維持の結果として細胞の活力および成長をモニタリングする手段を提供する、骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼ(ALP)活性の増大についてのアッセイで選択できる。一態様では、ヒト骨芽細胞は、1×10-13〜1×10-6の異なる濃度のペプチドで刺激し、未処理コントロールと比較する。通常の培養条件下で、好ましくは、ペプチドはALP活性を増大させる。さらに好ましくは、ペプチドは、10-11〜10-8mol/lの範囲の濃度の低酸素状態の際にALP活性を刺激する。したがって、このアッセイを用いて、骨組織における不十分な血管新生、低酸素、および虚血に関連した骨疾患の治療および/または予防用のペプチド組成物を最適化することができる。
【０１０１】
別の態様では、本発明によるペプチドは、細胞間結合の障害を伴う関節疾患の予防および/または治療に用いられる。例えば、本ペプチドは、代謝的負荷を伴う関節疾患の予防および/または治療に用いることができる。これらの関節疾患には、血管新生の減少または骨折軟骨組織の治癒に関連したあらゆる形態の関節炎が含まれうる。
【０１０２】
癌
さらに別の態様では、本発明によるペプチドは癌の治療に用いられる。発癌は、成長因子、発現遺伝子、および癌抑制遺伝子が関与する成長制御機構の進行性の障害を特徴とする。発癌および腫瘍形成における一般的なテーマは、GJICの下方制御である。色素移動アッセイを用いた腫瘍細胞におけるギャップ結合の透過性は、通常は、周囲組織におけるGJICよりも低い。さらに、ギャップ結合のゲート開閉は、GJICを減少させる腫瘍プロモーターによる影響を受けることが知られている。したがって、一態様では、本発明によるペプチドは、単独または従来の抗癌療法と組み合わせて、癌の治療薬として用いられる。
【０１０３】
創傷
さらなる態様では、本発明によるペプチドは、創傷の治療、特に創傷の治癒を早めるために用いられる。創傷の治癒には、多数種の細胞の相互作用が関与し、ギャップ結合によって仲介される細胞間コミュニケーションは、組織の修復および再生に関与する細胞の成長および発達の際の細胞の代謝の調整に重要な役割を果たすと考えられている(K. M. Abdullahら、(1999)、Endocrine、10 35〜41頁;M. Saitohら、(1997)、Carcinogenesis、18:1319〜1328頁;J. A. Goligerら、(1995)、Mol.Biol.Cell、6 1491〜1501頁)。ペプチドは、当分野で周知の担体(例えば、軟膏やクリームなど)を用いて局所投与によって創傷部位に投与するか、または、例えば、慢性胃潰瘍病変の治療などのように内部組織の創傷の治療のために全身投与することができる。
【０１０４】
内皮ギャップ結合細胞間コミュニケーションが関係するさらなる機能は、外傷、血管形成、内皮の成長および老化の後の内皮細胞の遊走、および血管運動反応の調整である(G. J. Christら、(2000)、Braz. J Med Biol. Res.、33:423〜429頁)。したがって、一態様では、本発明によるペプチドは、代謝の要求が高まった状態(例えば、運動、頻脈)および虚血の際に伝導血管反応を促進して血液供給を改善するために用いられる。
【０１０５】
また、ギャップ結合は、グリア区画の個々のメンバー間の調整された長距離シグナル伝達のために分子を結合すると考えられている。同様に、星状細胞は、一方の極が血管床に接触し、他方の極がニューロン実質に近接して機能的に分極しているため、ニューロンの代謝支持として非常に適している(R. Dermietzel、(1998)、Brain Res. Brain Res. Rev.、26:176〜183頁)。したがって、好適な一実施形態では、本発明によるペプチドは、グリア細胞とニューロンとの間の代謝支持の増加による脳の虚血性損傷の予防が必要な患者に投与される。このような患者には、鬱病、不安症、学習および記憶障害、恐怖症、および幻覚などの兆候を示しうる器質精神病の患者、または外傷性脳傷害の患者が含まれうる。好ましくは、このようなペプチドは、中枢神経系に利用できるように選択または製剤される(すなわち、血管-脳の障壁を通過する輸送を促進する担体と共に提供するか、またはこのような担体とコンジュゲートして提供する)。
【０１０６】
本発明によるペプチドはまた、神経傷害傷後または未熟細胞(前駆細胞)の脳組織への移植の際、例えば、神経外傷、脳虚血、および慢性神経変性疾患、例えばパーキンソン病またはハンチントン病の患者における修復を促進するために用いることもできる(H. Aldskogiusら、(1998)、Prog. Neurobiol、55:1〜26頁)。
【０１０７】
糖尿病
Cx43からなるギャップ結合チャネルは、膵島のグルコース感受性細胞とラット膵島細胞腺腫細胞系のグルコース感受性細胞を機能的に結合する[91]。対照的に、インスリンを異常に分泌しているいくつかの細胞系の細胞は、Cx43を発現せず、ギャップ結合がほとんどなく、カップリングが弱い。Cx43 cDNAの安定したトランスフェクションによるこれらの障害の修正後、適度なレベルでCx43を発現し、Cx43をカップリングする細胞は、天然β-細胞で観察されているように、野生型(カップリングしていない)細胞およびCx43を過剰発現しているトランスフェクト細胞の両方で観察されたものと比較すると著しく高いインスリン遺伝子およびインスリン量の発現を示す。これらの発見は、十分なCx43のカップリングが、適切なインスリンの産生および貯蔵に必要であることを示している[91]。さらに、グリベンクラミドによるインスリン放出のin vivo刺激は、Cx43の発現の上昇および膵島内の近接するβ-細胞間の細胞と細胞のカップリングの上昇に関連している。
【０１０８】
これらの観察結果は、膵島のβ-細胞同士をカップリングするギャップ結合がインスリンの産生および放出にとって重要な役割を果たしていることを示している。したがって、本発明のさらに別の目的は、ギャップ結合の電気伝導を向上させて、インスリン非依存性糖尿病患者の糖耐性を改善する物質を提供することである。
【０１０９】
さらに別の態様では、本発明によるペプチドは、糖尿病を治療するために用いられる。本発明のさらに別の目的は、ギャップ結合の電気伝導を向上させて、インスリン非依存性糖尿病患者の糖耐性を改善する物質を提供することにある。
【０１１０】
特定の実施形態では、本発明によるペプチドは、細胞間ギャップ結合チャネルに対する影響によって、白内障の治療および/または予防(D. Mackayら、(1999)、Am J Hum.Genet、64 1357〜1364頁)、角膜の栄養不良の病態における角膜の血管新生の治療および/または予防、角膜病変の治癒の促進(S. G. Spanakisら、(1998)、Invest Ophthalmol. Vis.Sci.、39:1320〜1328頁)、および/または高血圧の予防に用いることができる。
【０１１１】
乾癬
乾癬は、慢性皮膚疾患である。組織学的に、乾癬は、表皮の過剰増殖、伸びた顕著な血管、および厚い血管周囲のリンパ球浸潤を特徴とする。乾癬は、現在は、自己免疫疾患とみなされている。この疾患は、すべての年齢群で発症するが、主に成人が発症する。乾癬は、男性と女性で同等のようである。乾癬は、皮膚細胞が皮膚表面の下側のそれらの起源から急速に増大する際に生じ、皮膚細胞が成熟する機会を得る前に皮膚表面に積み重なる。通常は、この変化(代謝回転とも呼ぶ)には約1カ月かかるが、乾癬では、この変化が僅か2、3日で起こる。その典型的な形態では、乾癬は、銀白色の鱗屑で覆われた厚くて赤い(炎症)のパッチ状の皮膚になる。時にプラークとも呼ばれるこのようなパッチ状の皮膚は、通常は痒みまたは痛みを伴う。パッチ状の皮膚は、肘、膝、脚の他の部分、頭皮、腰、顔面、掌、および足の裏などにできるが、体のどの皮膚にも出現しうる。乾癬は、体表の5%未満にできた場合は軽度、5〜30%の場合は中程度、30%を超える場合は重度とみなされる。乾癬は、通常は、頭皮および四肢の伸筋表面、特に肘や膝に出現する。
【０１１２】
発症部位を示す亜型、例えば、屈側性乾癬(皮膚病変が鼠径部などの屈曲表面に起きる)、または皮膚変化のパターンを示す亜型、例えば、環状乾癬(病変が環状のパッチに生じる乾癬)、または皮膚病変の種類を示す亜型、例えば、膿疱性乾癬(丘疹、プラーク、または斑点よりも膿疱が勝っている)など多数の乾癬の亜型が存在する。びらん性で通常は非対称の少関節炎である乾癬性関節炎は、この慢性の再発性丘疹鱗屑皮膚障害と共に起こりうる。
【０１１３】
乾癬の症状は、軽度、中程度、または重度であり得る。現在、乾癬は治癒しないが、重症度に応じて症状を治療することができる。
【０１１４】
健常な皮膚の維持の中心は、接着および緻密結合、接着斑、およびギャップ結合細胞間コミュニケーションチャネルを含めて、緻密かつ高度に整列した細胞と細胞の付着ネットワークである(LAIRD, D.W.、(2006)、Life cycle of connexins in health and disease. Biochem J、394、527〜43頁;PROCHNOW, N. & DERMIETZEL, R.、(2008)、「Connexons and cell adhesion: a romantic phase.」、Histochem Cell Biol、130、71〜7頁)。このような細胞間結合は、上皮の増殖、遊走、および分化において極めて重要な役割を果たすが、乾癬にかかると、これらすべてが様々な程度に変更される(CHUNG, E.、COOK, P.W.、PARKOS, C.A.、PARK, Y.K.、PITTELKOW, M.R. & COFFEY, R.J.、(2005)、「Amphiregulin causes functional downregulation of adherens junctions in psoriasis.」、J Invest Dermatol、124、1134〜40頁;DJALILIAN, A.R.、MCGAUGHEY, D.、PATEL, S.、SEO, E.Y.、YANG, C.、CHENG, J.、TOMIC, M.、SINHA, S.、ISHIDA-YAMAMOTO、A. & SEGRE, J.A、(2006)、「Connexin 26 regulates epidermal barrier and wound remodeling and promotes psoriasiform response.」、J Clin Invest、116、1243〜53頁)。
【０１１５】
ギャップ結合の構成タンパク質であるコネキシンの発現は、基底層および棘僧のCx43が上側顆粒層のCx26によって通常は置換されている表皮内で空間的および一時的に制御される。しかしながら、乾癬斑では、Cx26は、他の過剰増殖性の層別化された上皮と同様のパターンで表皮の至るところで大幅に増加し、棘層のCx43(通常は最も豊富)を置換しているようである(LUCKE, T.、CHOUDHRY, R.、THOM, R.、SELMER, I.S.、BURDEN, A.D. & HODGINS, M. B.、(1999)、「Upregulation of connexin 26 is a feature of keratinocyte differentiation in hyperproliferative epidermis, vaginal epithelium, and buccal epithelium.」、J Invest Dermatol、112、354〜61頁)。乾癬で見られるコネキシンの空間的再分布に加えて、関連した接着結合の下方制御も起こり、特に、E-カドヘリンにおける顕著な減少は、正常な表皮よりも基底細胞および上側棘層に関連している(Chungら、2005)。したがって、乾癬表皮細胞の過剰増殖および分化の変化は、ギャップ結合および接着結合の両方の広範なリモデリングに関連している。
【０１１６】
したがって、本発明のさらに別の目的は、接着および緻密結合、接着斑、およびギャップ結合細胞間コミュニケーションチャネルを含めて、緻密かつ高度に整列した細胞と細胞の付着作業を確保することによって皮膚を健常に維持する物質を提供することにある。
【０１１７】
本発明によるペプチドおよび医薬組成物を、ギャップ結合コミュニケーション障害(異常な減少または増加)に関連したあらゆる状態または病状の治療に用いることができることは、当業者には明らかであろう。好ましくは、1種または複数種の本ペプチドまたは1種または複数種の本ペプチドを含む医薬組成物を、治療が必要な患者に治療有効量投与する。本明細書で用いる「治療有効量」は、所定の状態または病状の症状を緩和する量であり、好ましくは、所定の状態または病状のある患者の生理反応を正常化する量である。症状の緩和または生理反応の正常化は、当分野で日常的な方法を用いて決定することができ、所定の状態または病状で異なるであろう。一態様では、1種または複数種の本ペプチドまたは1種または複数種の本ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量は、DMFのない患者のパラメータの値と実質的に同じ値(好ましくは、患者のパラメータの値の+30%以内、さらに好ましくは、+20%以内、一層好ましくは、10%以内)まで測定可能な生理学的パラメータを回復させる量である。
【０１１８】
好適な本発明のペプチドの活性の特定および任意選択の定量に有用な特定のアッセイを後述する。これらのアッセイは、限定目的ではなく、本発明のペプチドをそのギャップ結合調節能力について調べることができる様々なアッセイを単に例示するためのものである。これらのアッセイは、相互に排他的ではない、すなわち本発明によるペプチドが、ある特定のアッセイで活性を示すが、別の特定のアッセイでは、異なる活性を示すか、または活性を示さないことを理解されたい。これは、個々のペプチドの多様性およびこれらのペプチドを調べるアッセイの種類の反映であろう。
【０１１９】
医薬組成物
本発明はまた、薬学的に許容される担体および/または希釈剤と組み合わせた、上記のペプチドの1種または複数種を含む医薬組成物にも関する。投与のための製剤は、当業者に公知の方法、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第17版、Alfonso R. Gennaro編集、Mark Publishing Company、Easton, PA, U.S.A.、1985年およびこの最新版、ならびに研究書「Drugs and the Pharmaceutical Sciences」シリーズ、Marcel Dekkerに一般に記載されているように調製することができる。
【０１２０】
利用する医薬担体または希釈剤は、従来の固形または液体担体とすることができる。固形担体の例として、ラクトース、テラアルバ、スクロース、シクロデキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはセルロースの低級アルキルエーテルが挙げられる。液体担体の例として、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレン、および水を挙げることができる。
【０１２１】
同様に、担体または希釈剤は、当分野で既知のあらゆる徐放性材料、例えば、単独またはワックスと混合したモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルが挙げられる。
【０１２２】
液体担体を用いる場合、製剤は、経口摂取に適したシロップまたは液体の形態にすることができる。
【０１２３】
所定の治療に用いられる活性化合物の実際に好適な量は、例えば、利用している特定の化合物、製剤した特定の組成物、投与方法、および患者の特徴、例えば、人種、性別、体重、健康状態、および年齢によって様々であることを理解されたい。所定のプロトコルの投与に対する最適な投与速度は、当業者が、このようなガイドラインにしたがって行われる従来の投与量決定試験を用いて容易に確かめることができる。適当な投与量範囲は、1日に付き体重1kg当たり約1〜約100mgとすることができる。
【０１２４】
本発明の治療化合物は、プロトン化された水溶性の形態、例えば、薬学的に許容される塩、通常は酸付加塩、例えば、無機酸付加塩、例えば、塩酸塩、硫酸塩、またはリン酸塩として、または有機酸塩、例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、またはクエン酸塩として、適切に投与することができる。本発明の治療化合物の薬学的に許容される塩には、金属塩、特にアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩;アルカリ土類金属塩、例えば、マグネシウム塩またはカルシウム塩;アンモニウム塩、例えば、アンモニウムまたはテトラメチルアンモニウム塩;またはアミノ酸付加塩、例えば、リジン、グリシン、またはフェニルアラニン塩も含まれうる。
【０１２５】
本発明の化合物は、末梢血管疾患を治療するために局所投与することもできるため、クリームまたは軟膏として製剤することもできる。
【０１２６】
本ペプチドは、非経口投与、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内、直腸内、膣内、または腹膜内投与のために、無菌の溶液または懸濁液などの組成物に製剤することもできる。
【０１２７】
(実施例)
以下に記載する実施例を用いて本発明をさらに例示する。以降に記載するものは単なる例であり、本発明の範囲内に収まったまま、細部の変更が可能であることを理解されたい。
【０１２８】
(実施例1)
ペプチド合成
すべてのペプチドは、固相法または液相法のいずれかによって合成した。しかしながら、固相ペプチド合成のより詳細な説明が、参照によりその全容が本明細書に組み込まれる国際公開第98/11125号パンフレットおよび国際公開第2007/078990号パンフレットに記載されている。
【０１２９】
a.一般ペプチド合成
装置および合成法
N-α-アミノ酸の保護基として9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)および側鎖の官能基のための適当な一般的保護基を用いて、濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器で、ペプチドをバッチ式に合成した。
【０１３０】
溶媒
溶媒DMF(N,N-ジメチルホルムアミド、Riedel de-Haen、Germany)を、強力なカチオン交換樹脂(Lewatit S 100 MB/H強酸、Bayer AG Leverkusen、Germany)が充填されたカラムに通して精製し、使用の前に、遊離アミンが存在する場合は黄色(Dhbt-O‐アニオン)に変化する3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン(Dhbt-OH)の添加により遊離アミンについて分析した。溶媒DCM(分析用ジクロロメタン、Riedel de-Haen、Germany)は、精製しないで直接用いた。アセトニトリル(HPLC用、Lab-Scan、Dublin Ireland)は、精製しないで直接用いた。
【０１３１】
アミノ酸
Fmoc-保護アミノ酸は、適当な側鎖保護形態でAdvanced ChemTech (ACT)から購入した。他の方法で保護されたアミノ酸(Boc-Asp(OFm)-OH、Boc-D-Asp(OFm)-OH、Fmoc-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Boc-Lys(Fmoc)-OH、Boc-D-Lys(Fmoc)-OH、Boc-Orn(Fmoc)-OHは、Bachem (Switzerland)から購入し、Fmoc-Lys(ivDde)-OH、Fmoc-Sar-OHは、NovaBiochem (Switzerland)から購入した。
【０１３２】
安息香酸およびベンジルアミン誘導体
安息香酸およびベンジルアミン誘導体は、Aldrichから購入し、さらに精製することなく使用した。
【０１３３】
カップリング試薬
カップリング試薬ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)は、(Riedel de-Haen、Germany)から購入し、PyBopは、Advanced ChemTechから購入した。
【０１３４】
リンカー
(4-ヒドロキシメチルフェノキシ)酢酸(HMPA)は、スイス国のNovabiochemから購入し、DICによって生成した予備形成1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)エステルとして樹脂に結合させた。
【０１３５】
固体支持体
ペプチドを、TentaGel S樹脂0.22〜0.31mmol/g(TentaGel-S-NH2;TentaGel-S-Ram、Rapp polymere、Germany)上で、Fmoc法によって合成した。
【０１３６】
触媒および他の試薬
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)は、ドイツ国のAldrichから、エチレンジアミンは、Flukaから、ピペリジンおよびピリジンは、独国フランクフルトのRiedel de-Haenから、4-(N,N-ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)は、スイス国のFlukaから購入し、対称無水物を用いるカップリング反応の触媒として用いた。エタンジチオールは、独国フランクフルトのRiedel de-Haenから購入し、3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン(Dhbt-OH)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(HOAt)は、スイス国のFlukaから入手した。
【０１３７】
カップリング手順
適切なn-α-保護アミノ酸から生成し、DMFに溶解した対称無水物として、第1のアミノ酸をカップリングさせることができる。次いで、得られたアミノ酸を、DMFに溶解したDICによって適切なn-α-保護アミノ酸およびHOBtまたはHOAtから作製したin situ生成HOBtまたはHOAtエステルとしてカップリングさせることができる。試験中のFmoc脱保護を防止するために、80℃でニンヒドリン試験を行ってアシル化をチェックした(B.D.Larsen、A.Holm、Int.J Pept.Protein Res.1994、43 1〜9頁)。
【０１３８】
N-α-アミノ保護基(Fmoc)の脱保護
Fmoc基の脱保護は、DMFに溶解した20%ピペリジンによって処理(1×5分および1×10分)し、排出されたDMFにDhbt-OHを添加した後、黄色が検出できなくなるまでDMFで洗浄(5×15ml、各5分)して行った。
【０１３９】
Allyl/Alocの脱保護
15〜20mlのCHCl3、AcOH、NMM(37:2:1)に溶解させた3当量のPd(PPh3)4溶液をペプチド樹脂に加えた。この処理は、この混合物にN2流をバブリングして室温で3時間続けた。
【０１４０】
HOBt-エステルのカップリング
3当量のN-α-アミノ保護アミノ酸を、3当量のHOBtおよび3当量のDICと共にDMFに溶解してから、この樹脂に加えた。
【０１４１】
予備形成対称無水物
6当量のN-α-アミノ保護アミノ酸をDCMに溶解して0℃に冷却した。DIC(3当量)を加え、反応を10分間続けた。溶媒を減圧除去し、残留物をDMFに溶解した。この溶液を直ちに樹脂に加え、次いで0.1当量のDMAPを加えた。
【０１４２】
酸を用いたペプチドの樹脂からの切断
95%のトリフルオロ酢酸(TFA、Riedel de-Haen、Frankfurt, Germany)-水v/vまたは95%TFAと5%エタンジチオールv/vで、室温で2時間処理して、ペプチドを樹脂から切断した。濾過した樹脂を95%TFA-水で洗浄し、減圧下で濾液および洗浄液を蒸発させた。残渣をエーテルで洗浄し、酢酸-水から凍結乾燥させた。粗製凍結乾燥産物を、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によって分析し、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESMS)によって同定した。
【０１４３】
TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成(PEG-PS)
TentaGel樹脂(1g、0.22〜0.31mmol/g)を、濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れた。この樹脂をDMF(15ml)中で膨潤させ、DMFに溶解した20%ピペリジンで処理して、樹脂上の非プロトン化アミノ基の存在を保証した。この樹脂を排出し、排出されたDMFにDhbt-OHを添加した後、黄色が検出できなくなるまでDMFで洗浄した。HMPA(3当量)を、上記のように予備形成HOBt-エステルとしてカップリングさせ、このカップリングを24時間続けた。樹脂を排出し、DMFで洗浄し(5×5ml、各5分)、ニンヒドリン試験によってアシル化をチェックした。第1のアミノ酸を、上記したように予備形成対称無水物としてカップリングさせた。配列にしたがって続くアミノ酸を、上記したように予備形成Fmoc保護HOBtエステル(3当量)としてカップリングさせた。特定の定めがない限り、このカップリングを2時間続けた。余分な試薬を除去するために、樹脂を排出して、DMFで洗浄した(5×15ml、各5分)。すべてのアシル化を、80℃でニンヒドリン試験を行ってチェックした。合成の完了後、ペプチド-樹脂を、DMF(3×15ml、各5分)、DCM(3×15ml、各1分)、および最後にジエチルエーテル(3×15ml、各1分)で洗浄し、減圧乾燥した。
【０１４４】
分取HPLC条件
分取クロマトグラフィーを、AFC2000自動フラクションコレクター/オートサンプラーを備えたVISION Workstation(PerSeptive Biosystem)を用いて行った。VISION-3ソフトウェアを、機器の制御およびデータ取得のために用いた。
【０１４５】
カラム
Kromasil(EKA Chemicals)KR100-10-C8 100Å、C-8、10μm;CER2230、250×50.8mmまたはVYDAC218TP101550、300Å、C-18、10〜15μm、250×50mm。使用した緩衝液系は、A:MQVに溶解した0.1%TFA、B:0.085%TFA、10%MQV、90%MeCNを含んでいた。流速は、35〜40ml/分とし、カラム温度は、25℃とした。UV検出は、215nmおよび280nmで行った。適した勾配を、個々のペプチドに対して最適化した。
【０１４６】
分析HPLC条件
勾配HPLC分析を、HP 1100クォターナリポンプ(Quaternary Pump)、HP 1100オートサンプラー、HP 1100カラムサーモスタット、およびHP 1100多波長検出器からなるHewlett Packard HP 1100 HPLCシステムを用いて行った。LCソフトウェア(A.06.01改訂版)用のHewlett Packardケムステーションを、機器の制御およびデータ取得のために用いた。
【０１４７】
分析HPLCでは、VYDAC 238TP5415、C-18、5μm、300Å、またはJupiter、Phenomenex 00F-4053-E0;5μm C-18、300Å 150x4.6mm他などの様々なカラムを適宜用いた。緩衝液系は、A:MQVに溶解した0.1% TFA、B:0.085% TFA、10% MQV、90% MeCNを含んでいた。流速は1ml/分とした。好ましいカラム温度は、40℃であった。UV検出は、215nmで行った。上記のように、適した勾配を、個々のペプチドに対して最適化した。
【０１４８】
質量分析
ペプチドを、超勾配メタノール(super gradient methanol)(Labscan、Dublin, Ireland)、Milli-Q水(Mollipore、Bedford, MA)およびギ酸(Merck、Damstadt, Germany)(50:50:0.1v/v/v)に溶解して1〜10μg/mlの濃度にした。ペプチド溶液(20μl)を、+/-0.1m/zの精度のLCT質量分析計(Micromass、Manchester, UK)を用いてESI-TOF-MSによって陽極性モードで分析した。
【０１４９】
一般合成手順
すべての合成では、乾燥TentaGel-S-NH2(0.23mmol/g、1g)を、濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」に記載されているように処理した。リジンおよびその類似体(例えば、オルニチン2,4-ジアミノブタン酸(Ornithin,2,4-Diaminobutanoic acid)、1,3-ジアミノプロパン酸など)が、C末端に位置している場合は、これらを、側鎖官能性のivDdeまたはAloc保護基(例えば、Fmoc-Lys(Aloc)-OH)のいずれかを備えたN-α-Fmoc保護誘導体としてカップリングさせた。リジンおよびその類似体が、N末端に位置している場合は、これらを、側鎖官能性のFmoc保護基(例えば、Boc-Lys(Fmoc)-OH)を備えたN-α-Boc保護誘導体としてカップリングさせた。アスパラギン酸、グルタミン酸、およびこれらの類似体が、C末端に位置している場合は、これらを、側鎖官能性のAllylic保護基(例えば、Fmoc-Asp(Oallyl)-OH)を備えたN-α-Fmoc保護誘導体としてカップリングさせた。アスパラギン酸、グルタミン酸、およびこれらの類似体が、N末端に位置している場合は、これらを、側鎖官能性のFm保護基(例えば、Boc-Asp(OFm)-OH)を備えたN-α-Boc保護誘導体としてカップリングさせた。これら以外のアミノ酸が、C末端に位置している場合は、これを、側鎖官能性の適当な保護基を備えたN-α-Fmoc保護誘導体としてカップリングさせ、N末端に位置している場合は、これを、側鎖官能性の適当な保護基を備えたN-α-Boc保護誘導体としてカップリングさせた。
【０１５０】
いずれの場合も、ジペプチドは、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはこれらの類似体の側鎖保護基の脱保護の後に合成した。
【０１５１】
リジンまたはその類似体の場合は、カルボキシル酸として官能性を持った疎水性基を、THFに溶解したDICによってin situ生成HOBtエステルにカップリングさせた。
【０１５２】
アスパラギン酸、グルタミン酸、またはこれらの類似体の場合は、アミンとして官能性を持った疎水性基を、トリエチルアミンによって触媒されるDMFに溶解したDICによって側鎖カルボキシル酸の予備生成HOBtエステルにカップリングさせた。
【０１５３】
すべてのカップリングは、少なくとも2時間続けた。上記したように、80℃でニンヒドリン試験を行ってアシル化をチェックした。合成の完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×15ml、各1分)、DCM(3×15ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×15ml、各1分)で洗浄し、減圧乾燥した。次いで、ペプチドを、上記したように樹脂から切断して凍結乾燥させた。
【０１５４】
上記したように分取HPLCで精製した後、ペプチド産物を収集し、ペプチドの同定をES-MSで行った。
【０１５５】
上記の手順は、以下に例示するすべてのペプチドおよび本明細書のTable 1(表1)に示すペプチドの合成に用いた。
【０１５６】
(実施例2)
組換えタンパク質の産生
組換えCx43CTは、参照によりその全容が本明細書に組み込まれるDuffyら、「pH-Dependent Intramolecular Binding and Structure Involving Cx43 Cytoplasmic Domains」、J. Biol. Chem.、277(39):36706〜36714頁、(2002)に記載されているように産生した。簡単に述べると、ラットCx43由来のcDNAをpGEX-6P-2 (Amersham)に導入して、大腸菌(BL-21)で発現させた。得られたGST融合タンパク質を、GST PreScission Protease(登録商標)(Amersham Biosciences)から切断した。切断後の組換え産物は、4個の追加アミノ酸(GPLG)に先行したrCx43の配列255〜382を含んでいた。タンパク質濃度を、Bio-Rad DCタンパク質アッセイを用いて測定した。タンパク質の純度をSDS-PAGEによって評価した。
【０１５７】
(実施例3)
表面プラズモン共鳴(SPR)
SPRは、リアルタイムで結合の振幅および動態を決定する分光法である(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Salamonら、「Surface Plasmon Resonance Spectroscopy as a Tool for Investigating the Biochemical and Biophysical Properties of Membrane Protein Systems. II: Applications to Biological Systems」、Biochim. Biophys. Acta、1331 (2):131〜152頁、(1997);Duffyら、「Functional Demonstration of Connexin-protein Binding Using Surface Plasmon Resonance」、Cell Adhes. Commun.、8(4-6):225〜229頁、(2001);Langら、「Surface Plasmon Resonance as a Method to Study the Kinetics and Amplitude of Protein-protein Binding」、PRACTICAL METHODS IN CARDIOVASCULAR RESEARCH 936〜947頁、(Stefan Dhein、Friedrich Wilhelm Mohr & Mario Delmar編集、2005))。組換えCx43CTは、カルボキシルメチルデキストランマトリックスに共有結合させた(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Salamonら、「Surface Plasmon Resonance Spectroscopy as a Tool for Investigating the Biochemical and Biophysical Properties of Membrane Protein Systems. II: Applications to Biological Systems」、Biochim. Biophys. Acta、1331(2):131〜152頁、(1997))。特定のペプチドを提示し、実施可能な場合は、解離定数(KD)を、1:1(Langmuir)結合および解離速度モデル(Biacoreソフトウェアパッケージ)を用いて、リガンドの結合および解離の経時的変化から算出した。両方の相(結合および解離)では、記録の初めの5〜8秒は、フローセル内のペプチドの分布から生じるアーチファクトを回避するために、フィットに含めなかった(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Langら、「Surface Plasmon Resonance as a Method to Study the Kinetics and Amplitude of Protein-protein Binding」、PRACTICAL METHODS IN CARDIOVASCULAR RESEARCH 936〜947頁、(Stefan Dhein、Friedrich Wilhelm Mohr & Mario Delmar編集、2005))。
【０１５８】
(実施例3a)
SPRを用いたペプチドのCx43に対する結合の決定
Table 2(表3)およびTable 3(表4)に示すペプチドを、表面プラズモン共鳴(「SPR」)を用いてCx43のカルボキシル末端ドメイン(CT)に対する結合について調べた。SPRは、元のRXPE配列を同定するために用いられた方法である(Shibayamaら、「Identification of a Novel Peptide that Interferes with the Chemical Regulation of Connexin-43」、Circ. Res.、98:1365〜72頁、(2006))。任意の単位における反応の振幅に対するペプチドの濃度をTable 2(表3)に示す。反応の振幅は、ライゲートの質量の関数でもあり、個々のペプチドの分子量によって正規化したデータをTable 3(表4)に示す。これらのデータは、僅かアミノ酸4個の長さのペプチドが、Cx43のカルボキシル末端ドメイン(CT)に結合できること示している。
【０１５９】
【表３】
【０１６０】
【表４】
【０１６１】
(実施例4)
核磁気共鳴(NMR)
すべてのNMRデータは、凍結探針を用いてVarian INOVA 600-MHz NMR分光計で得ることができ(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、MacUra & Ernst、「Elucidation of Cross Relaxation in Liquids by Two-dimensional NMR Spectroscopy」、Mol. Phys. 41:95〜117頁、(1980));試料の温度は7℃に維持する。勾配増強2次元1H-15N HSQC実験(Gradient-enhanced two-dimensional 1H-15N HSQC experiments)(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Kayら、「Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity」、J. Am. Chem. Soc.、114:10663〜10665頁、(1992))を用いて、15N標識Cx43CTにおけるすべての主鎖アミド共鳴を観察する。データは、t2の1024の複合点およびt1の128の複合点で得た。スイープ幅は、陽子次元で10,000Hzであり、窒素次元で2,500Hzである。ペプチドのCx43CTに対する濃度は、約2.4〜0.8mM(3:1の比)であった。すべてのNMRデータは、NMRPipe(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Delaglioら、「NMRPipe: A Multidimensional Spectral Processing System Based on UNIX Pipes」、J. Biomol. NMR、6(3):277〜293頁、(1995))を用いて処理し、NMRView(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sorgen、「How to Solve a Protein Structure by Nuclear Magnetic Resonance - The Connexin43 Carboxyl Terminal Domain」、PRACTICAL METHODS IN CARDIOVASCULAR RESEARCH
、948〜958頁、(Stefan Dhein, Friedrich Wilhelm Mohr & Mario Delmar編集、2005))を用いて分析した。
【０１６２】
(実施例5)
電気生理学的分析
N2a(Neuroblastoma)細胞に対して実験を行った。Cx43は、lac-スイッチ安定系(IPTG 0.1〜1.0mMによって誘導(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Zhongら、「LacSwitch II Regulation of Connexin43 cDNA Expression Enables Gap-junction Single-channel Analysis」、Biotechniques、34(5):1034〜1034頁、1041〜1044頁、1046頁、(2003)))で発現させるか、またはeGFPをコードするIRESプラスミドを用いて一過性に発現させた(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004); Sekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004))。M257(アミノ酸257位で切断されたCx43の変異体(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Morleyら、「Intramolecular Interactions Mediate pH Regulation of Connexin43 Channels」、Biophys. J.、70(3):1294〜1302頁、(1996)))を、eGFP含有IRESプラスミドを用いてN2a細胞で一過性に発現させた。細胞を、落射蛍光(Nikon Diaphoto200、Filter: 520〜560 nm)用の倒立顕微鏡のステージに載せた。結合部電流(Ij)を、二重全細胞電圧クランプ構造(保持電位:-40mV、細胞間電位差Vj:+60MV、ステップ期間:10〜30秒)内のeGFP-陽性細胞対から記録した。パッチピペットを、
セシウム含有溶液で満たした(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004); Sekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004))。pHの低い実験の場合は、HEPESの代わりにMES(10mM)を用いた。ピペットの抵抗は、4.0〜6.0MΩであった。合成ペプチドを、最終濃度0.1mMになるまでピペット溶液で希釈した。記録の際は、細胞は、セシウム含有溶液中で、室温で維持した(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004); Sekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004))。一部の実験では、オクタノール(2.0mM)を記録の際に灌流させた。単チャネル検出におけるデータの取得および記録、ならびに基準は、参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loo
p Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004)およびSekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004)に報告されているものと同様とした。
【０１６３】
(実施例6)
Cx43CT-化合物の相互作用の定量分析
特定の実験:
(1)Cx43CT-化合物の解離定数の決定
各化合物のCx43CTに対する結合動態を、SPRによって評価する。様々な濃度の結合物を用い、結合および解離の速度を、Langmuir 1:1動態モデル(Biacore)にフィットさせる。このモデルは、結合の1次動態を推定する。適切なフィッティングにより、推定KDが得られる。しかしながら、化合物のCx43CTとの相互作用が1対1モデルから逸脱し、KD値が生成されないことも起こりうる。このような場合は、架橋結合の実験および以下に提案するNMRを利用する。
【０１６４】
(2)架橋剤を用いた結合の濃度-依存関係
このシステムにより、たとえ結合動態がKDの決定に適していないとしても、化合物-Cx43CT結合の量的パラメータを設定することができる。架橋結合を、Cx43CTの一定濃度および化合物の連続希釈について調べた。化合物の濃度が低下すると、低い移動性のバンド(すなわち、化合物-Cx43CT複合体に一致する)を犠牲にして単量体および二量体Cx43CTのバンドの密度が漸進的に上昇することが予想される。結合密度の非結合密度に対する比を、化合物の濃度の関数としてプロットする。S字状の濃度-依存関係が予想される。最大値の半分の結合に一致するペプチド濃度を、見掛けEC50と定義した。
【０１６５】
(3)核磁気共鳴(NMR)による化合物誘導Cx43CT共鳴シフトの同定
以前の研究により、空間における位置がRXP4およびRXPEによって影響を受けるCx43CTのアミノ酸が同定された。Cx43CTの共鳴地図を、候補化合物で繰返す。官能基に対して同様の効果を持つペプチドも同じアミノ酸領域に結合するという仮説を立てる。
【０１６６】
(実施例7)
二重パッチクランプによる機能性評価
化合物を、オクタノール誘導脱共役を阻害する能力について調べた。また、化合物を、酸性化誘導脱共役を阻害する能力についても調べる。
【０１６７】
特定の実験
実験を、Shibayamaら、(2006)に記載されているようにモデル化した。Cx43-発現N2a細胞対間の結合コンダクタンスを、従来の二重パッチクランプを用いて評価した。ペプチドをパッチピペット溶液で希釈し、細胞をオクタノールまたは細胞内の低いpHに曝す。化合物の非存在下で、コントロール実験を行った。結果を図3A〜図3Eに示す。図3A〜図3Eは、Cx43-発現N2a細胞から記録されたカップリングにおける時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。図3A〜図3Eはそれぞれ、ペプチド2517、2518、2529、2520、および2624に関する。パッチクランプ実験は、ピペット内液に溶解した0.1mMのペプチド2517、2518、2519、2520、および2624の非存在下(黒のトレース、四角のデータ点)または存在下(赤のトレース、丸のデータ点)で行った。時間0は、オクタノール灌流の開始に一致する。結合コンダクタンスの相対的低下が決定された。
【０１６８】
脱共役は、結合コンダクタンスの完全な喪失によって明確になる。ペプチドの存在時および非存在時に脱共役している細胞対の数を決定した。ペプチドの効果がCx43CTドメインの完全性に依存するか否かを決定するために別の研究を行う。
【０１６９】
(実施例8)
ペプチドのCx43CTに対する結合
本明細書の特定のペプチドのCx43CTに対する結合能は、これらのペプチドがCx43チャネルの動作を変化させうることを示唆している。ギャップ結合部電流を、Cx43をトランスフェクトしたN2a細胞から記録した。巨視的電流を低下させて1つのチャネルの現象を検出できるようにするために、細胞対をオクタノールで灌流した(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Anumonwoら、「The Carboxyl Terminal Domain Regulates the Unitary Conductance and Voltage Dependence of Connexin40 Gap Junction Channels」、Circ. Res.、88(7):666〜673頁、(2001); Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res. 95(4):e22〜e28頁、(2004); Sekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004))。本明細書の特定のペプチドがピペット内液中に存在することにより、図1A〜図1Cに示すように、Cx43チャネルのオクタノール誘導閉止が防止される。図1Aは、コントロール条件(ペプチドを含まない)下でCx43-発現細胞対から得た結合部電流トレースを示している。結合部通過電圧(Vj)は+60mVとした。矢印で示す点でオクタノールを灌流に加えた。僅かに遅れて、結合部電流が急速に低下し、オクタノールの添加後3分以内に0になった。オクタノールがギャップ結合を高効率で脱共役する能力は文献(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Johnston & Ramon、「Electrotonic Coupling in Internally Perfused Crayfish Segmented Axons」、J. Physiol.、317:509〜518頁、(1981))に詳細に報告されている。図1Bおよび図1Cに示すトレースは、異なる細胞対から得た。ここで、ペプチド2371および2372は、ピペット内液で希釈した。オクタノールの添加の3分後、Gjの低下は、全くまたは僅かしか観察されなかった。累積データを図2A〜図2Fに示す。図2A、図2C、および図2Eは、オクタノール灌流の後も結合したままの細胞対のパーセントを示している(脱共役は、60mVの結合部通過電圧パルスによって誘発される結合部電流が0と定義)。7つの異なる細胞対を、ペプチド含有溶液で満たしたパッチピペットを用いて記録した。7つの対はペプチドを用いずに試験した。コントロール実験(ペプチドを使用しない)は、ペプチドの存在下で脱共役に失敗したプレートと同じプレートの細胞に対して行った。図2Aに示すように、ペプチド2372に曝露された細胞対はいずれも、オクタノール灌流後に脱共役しなかったが(破線)、ペプチド2371および2366(図2Aおよび図2C)での処理中、細胞対は、脱共役してから再結合した。ペプチドの非存在下、コントロール細胞対の7個の内の6個が(コントロールは実線)、オクタノール灌流の2分後に完全な脱共役を示した。図2Bは、オクタノール灌流の開始後、時間の関数として結合コンダクタンスの時間経過による変化を示している(Gj;個々の実験のコントロールに対して測定)。ペプチドの非存在下で得たデータは、実線および閉じた記号で示している。これらの結果は、オクタノール灌流の約2分後に漸近値に達するGjの特徴的な急激な低下を示している。破線は、ペプチド2371、2372、2366、および2497の存在下で得たデータに一致している。ペプチド2372では脱共役が観察されなかったが、Gjの僅かな低下は明らかであった。結局、データは、すべての化合物2371、2372、2366、および2497が、Cx43-発現細胞対のオクタノール誘導脱共役を防止したことを示している。さらに、2366、2371、および2372は、脱共役した細胞を共役細胞に戻すことができた。ペプチドの効果は、パッチピペット内のいかなるペプチド分子の存在にも起因するものではない。実際、以前の研究が、細胞質ループに由来するペプチドがチャネルの特徴は変更したが、オクタノール感受性を変化させなかったことを示した(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004))。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞間ギャップ結合コミュニケーションを調節できるペプチドに関する。本発明はまた、このペプチドを用いてこのような細胞間ギャップ結合コミュニケーションを調節する方法、前記コミュニケーションに関連した状態の予防および/または治療用の薬物の製造のためのこのペプチドの使用、および前記ペプチドを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞間コミュニケーションが細胞の恒常性、増殖、および分化に必須であるという認識が広まってきている。このような細胞間コミュニケーションは、ギャップ結合によって促進されると考えられている。これらの構造は、細胞を結合させる経路であり、「クロストーク」を可能にすると考えられている。一般には、Sperelakis, N.、(1989)、「Cell Interactions and Gap Junctions」、N. Sperelakis、William C. Cole(編集)を参照されたい。
【０００３】
コネキシンは、オリゴマー化してギャップ結合と呼ばれる細胞間チャネルを形成する内在性膜タンパク質である。様々な哺乳動物系で最も豊富なギャップ結合タンパク質は、コネキシン43(「Cx43」)である。
【０００４】
ギャップ結合チャネルは、細胞と細胞の直接のコミュニケーションに関与する。これらのチャネルは、細胞環境の変化に応答し、タンパク質の相互作用によって調節される動的な孔である。心臓では、ギャップ結合チャネルは、電気的刺激の通路の重要な機構である(Lernerら、「Accelerated Onset and Increased Incidence of Ventricular Arrhythmias Induced by Ischemia in Cx43-deficient Mice」、Circ.、101(5):547〜552頁、(2000);Gutsteinら、「Conditional Gene Targeting of Connexin43: Exploring the Consequences of Gap Junction Remodeling in the Heart」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):345〜348頁、(2001);Vaidyaら、「Null Mutation of Connexin43 Causes Slow Propagation of Ventricular Activation in the Late Stages of Mouse Embryonic Development」、Circ. Res.、88(11):1196〜1202頁、(2001))。各チャネルは、細胞外空間に亘って結合する2つの同一の六量体構造すなわちコネクソンからなる。この結果は、動的に調節される透過性の孔である。コネクソンの各サブユニットは、分子コネキシンである。この分子は、図1に例示するように、N末端(「NT」)、細胞質ループ(「CL」)、およびC末端(「CT」)ドメインが細胞質空間にある状態で膜に存在する。加えて、反対側のコネクソンへの結合に関与する4つの膜貫通ドメインおよび2つの細胞外ドメイン(細胞外ループ)が存在する。マウスゲノムには少なくとも20、ヒトゲノムには21の異なるコネキシンアイソタイプが存在する(Willeckeら、「Structural and Functional Diversity of Connexin Genes in the Mouse and Human Genome」、Biol. Chem.、383(5):725〜737頁、(2002))。心臓、脳、および他の組織で最も豊富なコネキシンアイソタイプは、43kDaのタンパク質、Cx43である。ギャップ結合は、イオンおよび小分子の細胞間の通過を許容し、コネキシン分子と微小環境との間の様々な化学的相互作用によって調節される。したがって、ギャップ結合は、動的フィルターとして機能し、細胞間メッセージの通過を制御して機能を調節する。
【０００５】
以前の研究は、Cx43チャネルの制御が、ゲート開閉粒子(gating particle)として機能するCTドメインと、ゲート開閉粒子の受容体として機能するコネキシン分子の別個の領域との会合によるものであることを示唆した(Duffyら、「pH-Dependent Intramolecular Binding and Structure Involving Cx43 Cytoplasmic Domains」、J. Biol. Chem.、277(39):36706〜36714頁、(2002);Morenoら、「Role of the Carboxyl Terminal of Connexin43 in Transjunctional Fast Voltage Gating」、Circ, Res.、90(4):450〜457頁、(2002), 92(1):e30 (2003) (erratum))。別の研究は、この分子内相互作用を、ギャップ結合斑の微小環境における他の分子間相互作用によって調節できることを示した(Morleyら、「Intramolecular Interactions Mediate pH Regulation of Connexin43 Channels」、Biophys. J.、70(3):1294〜1302頁、(1996))。したがって、Cx43ギャップ結合斑の明らかになりつつある実態は、タンパク質が一斉に細胞間コミュニケーションを調節する巨大分子複合体である。これらの相互作用の中心は、CTドメインである。このCTドメインは、多種のキナーゼの基質(Duffyら、「Regulation of Connexin43 Protein Complexes by Intracellular Acidification」、Circ. Res.、94(2):215〜222頁、(2004);Giepmansら、「Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the Regulation of Cell-cell Communication」、J. Biol. Chem.、276(11):8544〜8549頁、(2001);Kanemitsuら、「Tyrosine Phosph
orylation of Connexin 43 by v-Src is Mediated by SH2 and SH3 Domain Interactions」、J. Biol. Chem.、272(36):22824〜22831頁、(1997);Lampeら、「Phosphorylation of Connexin43 on Serine368 by Protein Kinase C Regulates Gap Junctional Communication」、J. Cell Biol.、149(7):1503〜1512頁、(2000);Lauら、「Regulation of Connexin43 Function by Activated Tyrosine Protein Kinases」、J. Bioenerg. Biomembr.、28(4):359〜368頁、(1996);Shinら、「The Regulatory Role of the C-Terminal Domain of Connexin43」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):271-275 (2001);TenBroekら、「Ser364 of Connexin43 and the Upregulation of Gap Junction Assembly by cAMP」、J. Cell Biol.、155(7):1307〜1318頁、(2001))、非触媒タンパク質のリガンド(Giepmans & Moolenaar、「The Gap Junction Protein Connexin43 Interacts with the Second PDZ Domain of the Zona Occludens-1 Protein」、Curr. Biol.、8(16):931〜934頁、(1998);Giepmansら、「Connexin-43 Interactions with ZO-1 and Alpha- and Beta-tubulin」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):219〜223頁、(2001);Toyofukuら、「Direct Association of the Gap Junction Protein Connexin-43 with ZO-1 in Cardiac Myocytes」、J. Biol. Chem.、273(21):12725〜12731頁、(1998);Toyofukuら、「c-Src Regulates the Interaction between Connexin-43 and ZO-1 in Cardiac Myocytes」、J. Biol. Chem.、276(3):1780〜1788頁、(2000);Zhouら、「Dissection of the Molecular Basis of pp60(v-Src) Induced Gating of Connexin 43 Gap Junction Channels」、J. Cell Biol.、144(5):1033〜1045頁、(1999);Aiら、「Wnt-1 Regulation of Connexin43 in Cardiac Myocytes」、J. Clin. Invest.、105(2):161〜171頁、(2000);Xuら、「N-Cadherin and Cx43[alpha]1 Gap Junctions Modulates Mouse Neural Crest Cell Motility Via Distinct Pathways」、Cell Adhes. Commun.、8(4-6):321〜324頁、(2001);Schubertら、「Connexin Family Members Target to Lipid Raft Domains and Interact with Caveolin-1」、Biochem.、41(18):5754〜5764頁、(2002))、および細胞間のカップリングを調節するゲート開閉粒子(Duffyら、「pH-Dependent Intramolecular Binding and Structure Involving Cx43 Cytoplasmic Domains」、J. Biol. Chem.、277(39):36706〜36714頁、(2002);Morenoら、「Role of the Carboxyl Terminal of Connexin43 in Transjunctional Fast Voltage Gating」、Circ. Res. 90(4):450〜457頁、(2002)、92(1):e30 (2003) (erratum);Morleyら、「Intramolecular Interactions Mediate pH Regulation of Connexin43 Channels」、Biophys. J.、70(3):1294〜1302頁、(1996);Anumonwoら、「The Carboxyl Terminal Domain Regulates the Unitary Conductance and Voltage Dependence of Connexin40 Gap Junction Channels」、Circ. Res.、88(7):666〜673頁、(2001))として働くCTドメインである。
【０００６】
ギャップ結合の薬理が、Srinivasらによって総説されている(Srinivasら、「Prospects for Pharmacological Targeting of Gap Junction Channels」、CARDIAC ELECTROPHYSIOLOGY: FROM CELL TO BEDSIDE、158〜167頁、(Douglas Zipes & Jose Jalife編集、第4版、2004年))。ギャップ結合機能の調節用の特定の薬物はほとんど存在しない。長鎖アルカノール(ヘプタノールおよびオクタノール)は、脱共役剤として長い間使用されてきた。膜流動性が主な標的であると考えられているが、その作用機序は不明である。全身麻酔も、ギャップ結合を脱共役させることが示されたが(Burt & Spray、「Volatile Anesthetics Block Intercellular Communication between Neonatal Rat Myocardial Cells」、Circ. Res.、65(3):829〜837頁、(1989))、同様にその作用機序は不明であり、ギャップ結合タンパク質に特異的ではない。ブタンジオンモノオキシム(butanedione monoxime)(Herve & Sarrouilhe、「Modulation of Junctional Communication by Phosphorylation: Protein Phosphatases, the Missing Link in the Chain」、Biol. Cell、94(7-8):423〜432頁、(2002))などのある種の物質は、脱共役につながるギャップ結合のリン酸化を調節すると考えられている。フルフェナム酸は、ギャップ結合の有効な阻害剤であることが示されているが、その機序は、間接的であり、どのコネキシンタンパク質にも特異的ではないと考えられている(Srinivas & Spray、「Closure of Gap Junction Channels by Arylaminobenzoates」、Mol. Pharmacol.、63(6):1389〜1397頁、(2003))。
【０００７】
ペプチドは、ギャップ結合チャネルの機能を変化させることが示されている。抗不整脈ペプチド10(「AAP10」)は、ギャップ結合コミュニケーション(Mullerら、「Actions of the Antiarrhythmic Peptide AAP10 on Intercellular Coupling」、Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol.、356(1):76〜82頁、(1997);Dheinら、「Effects of the New Antiarrhythmic Peptide ZP123 on Epicardial Activation and Repolarization Pattern」、Cell Commun. Adhes.、10(4-6):371〜378頁、(2003))を、膜受容体との相互作用によって間接的に変化させ、場合によっては、標的細胞の様々な変化を引き起こしうるPKC依存性機構(Dheinら、「Protein Kinase Ca Mediates the Effect of Antiarrhythmic Peptide on Gap Junction Conductance」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):257〜264頁、(2001))によっても間接的に変化させる。ギャップ結合形成の特異的な阻害は、細胞外ループペプチドの使用で実証された(Kwak & Jongsma、「Selective Inhibition of Gap Junction Channel Activity by Synthetic Peptides」、J. Physiol.、516(3):679〜685頁、(1999))。これらのペプチドは、細胞外ギャップでのコネキシンの結合を防止してギャップ結合を阻害すると考えられている。これらの効果は遅く、この相互作用は、高濃度のペプチドを必要とする(Dahlら、「Attempts to Define Functional Domains of Gap Junction Proteins with Synthetic Peptides」、Biophys. J.、67(5):1816〜1822頁、(1994))。
【０００８】
構造、結合、および機能アッセイを使用してペプチドに基づくCx43制御手法を開発する戦略ならびにギャップ結合チャネルを開いた状態に維持できる作用物質が要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第98/11125号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2007/078990号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Sperelakis, N.、(1989)、「Cell Interactions and Gap Junctions」、N. Sperelakis、William C. Cole(編集)
【非特許文献２】Lernerら、「Accelerated Onset and Increased Incidence of Ventricular Arrhythmias Induced by Ischemia in Cx43-deficient Mice」、Circ.、101(5):547〜552頁、(2000)
【非特許文献３】Gutsteinら、「Conditional Gene Targeting of Connexin43: Exploring the Consequences of Gap Junction Remodeling in the Heart」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):345〜348頁、(2001)
【非特許文献４】Vaidyaら、「Null Mutation of Connexin43 Causes Slow Propagation of Ventricular Activation in the Late Stages of Mouse Embryonic Development」、Circ. Res.、88(11):1196〜1202頁、(2001)
【非特許文献５】Willeckeら、「Structural and Functional Diversity of Connexin Genes in the Mouse and Human Genome」、Biol. Chem.、383(5):725〜737頁、(2002)
【非特許文献６】Duffyら、「pH-Dependent Intramolecular Binding and Structure Involving Cx43 Cytoplasmic Domains」、J. Biol. Chem.、277(39):36706〜36714頁、(2002)
【非特許文献７】Morenoら、「Role of the Carboxyl Terminal of Connexin43 in Transjunctional Fast Voltage Gating」、Circ, Res.、90(4):450〜457頁、(2002)、92(1):e30 (2003) (erratum)
【非特許文献８】Morleyら、「Intramolecular Interactions Mediate pH Regulation of Connexin43 Channels」、Biophys. J.、70(3):1294〜1302頁、(1996)
【非特許文献９】Duffyら、「Regulation of Connexin43 Protein Complexes by Intracellular Acidification」、Circ. Res.、94(2):215〜222頁、(2004)
【非特許文献１０】Giepmansら、「Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the Regulation of Cell-cell Communication」、J. Biol. Chem.、276(11):8544〜8549頁、(2001)
【非特許文献１１】Kanemitsuら、「Tyrosine Phosphorylation of Connexin 43 by v-Src is Mediated by SH2 and SH3 Domain Interactions」、J. Biol. Chem.、272(36):22824〜22831頁、(1997)
【非特許文献１２】Lampeら、「Phosphorylation of Connexin43 on Serine368 by Protein Kinase C Regulates Gap Junctional Communication」、J. Cell Biol.、149(7):1503〜1512頁、(2000)
【非特許文献１３】Lauら、「Regulation of Connexin43 Function by Activated Tyrosine Protein Kinases」、J. Bioenerg. Biomembr.、28(4):359〜368頁、(1996)
【非特許文献１４】Shinら、「The Regulatory Role of the C-Terminal Domain of Connexin43」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):271-275 (2001)
【非特許文献１５】TenBroekら、「Ser364 of Connexin43 and the Upregulation of Gap Junction Assembly by cAMP」、J. Cell Biol.、155(7):1307〜1318頁、(2001)
【非特許文献１６】Giepmans & Moolenaar、「The Gap Junction Protein Connexin43 Interacts with the Second PDZ Domain of the Zona Occludens-1 Protein」、Curr. Biol.、8(16):931〜934頁、(1998)
【非特許文献１７】Giepmansら、「Connexin-43 Interactions with ZO-1 and Alpha- and Beta-tubulin」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):219〜223頁、(2001)
【非特許文献１８】Toyofukuら、「Direct Association of the Gap Junction Protein Connexin-43 with ZO-1 in Cardiac Myocytes」、J. Biol. Chem.、273(21):12725〜12731頁、(1998)
【非特許文献１９】Toyofukuら、「c-Src Regulates the Interaction between Connexin-43 and ZO-1 in Cardiac Myocytes」、J. Biol. Chem.、276(3):1780〜1788頁、(2000)
【非特許文献２０】Zhouら、「Dissection of the Molecular Basis of pp60(v-Src) Induced Gating of Connexin 43 Gap Junction Channels」、J. Cell Biol.、144(5):1033〜1045頁、(1999)
【非特許文献２１】Aiら、「Wnt-1 Regulation of Connexin43 in Cardiac Myocytes」、J. Clin. Invest.、105(2):161〜171頁、(2000)
【非特許文献２２】Xuら、「N-Cadherin and Cx43[alpha]1 Gap Junctions Modulates Mouse Neural Crest Cell Motility Via Distinct Pathways」、Cell Adhes. Commun.、8(4-6):321〜324頁、(2001)
【非特許文献２３】Schubertら、「Connexin Family Members Target to Lipid Raft Domains and Interact with Caveolin-1」、Biochem.、41(18):5754〜5764頁、(2002)
【非特許文献２４】Anumonwoら、「The Carboxyl Terminal Domain Regulates the Unitary Conductance and Voltage Dependence of Connexin40 Gap Junction Channels」、Circ. Res.、88(7):666〜673頁、(2001)
【非特許文献２５】Srinivasら、「Prospects for Pharmacological Targeting of Gap Junction Channels」、CARDIAC ELECTROPHYSIOLOGY: FROM CELL TO BEDSIDE、158〜167頁、(Douglas Zipes & Jose Jalife編集、第4版、2004年)
【非特許文献２６】Burt & Spray、「Volatile Anesthetics Block Intercellular Communication between Neonatal Rat Myocardial Cells」、Circ. Res.、65(3):829〜837頁、(1989)
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、当分野のこれらの問題点を解消することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、一般に、ギャップ結合細胞間コミュニケーション(GJIC)を調節するペプチドに関する。本発明は、GJICの障害に関連した病態の治療または予防における使用を含めて、多種多様な有用な適用例を有する。
【００１３】
本発明の第1の態様では、式Iによるペプチドおよびその薬学的に許容される塩を提供する:
式I:
R1-Z-(L-R)p-R2
[式中、R1は、H、Ac、ベンゾイル、およびTfaから選択され、
Zは、A1-A2-A3-A4またはそのレトロ類似体であり、
A1は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A2は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A3は、任意選択によりBで修飾される、好ましくはGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択される任意のアミノ酸であり、または任意選択によりBで修飾されるリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)であり、
A4は、Trp、Tyr、Phe、もしくはHisなどの芳香族アミノ酸、Ala、Val、Leu、もしくはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはMetであるか、または欠失しており、
Bは疎水性基であり、
Lは、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15またはそのレトロ類似体であり、
X1は、Gly、Ala、Ser、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、または欠失しており、
X2は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X3は、Gly、Ala、Ser、Leu、Val、Ile、または欠失しており、
X4は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X5は、Gly、Ala、Ser、Arg、Lys、His、または欠失しており、
X6は、Val、Ile、Leu、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X7は、Pro、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X8は、Trp、Tyr、Phe、Leu、Val、Ile、または欠失しており、
X9は、Trp、Tyr、Phe、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X10は、Gly、Ala、Ser、Arg、Lys、His、または欠失しており、
X11は、Arg、Lys、His、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X12は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X13は、Val、Leu、Ile、または欠失しており、
X14は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X15は、Arg、Lys、His、または欠失しており、
Qは、A5-A6-A7-A8またはそのレトロ類似体であり、
A5は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A6は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A7は、任意選択によりBで修飾される、好ましくはGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択される任意のアミノ酸であり、または任意選択によりBで修飾されるリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)であり、
A8は、Trp、Tyr、Phe、もしくはHisなどの芳香族アミノ酸、Ala、Val、Leu、もしくはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはMetであるか、あるいは欠失しており、
R2は、NH2、OH、OR、NHR、NRRであり、
RはC1〜C6アルキルであり、
pは0、1、2、3、4、または5である]。
【００１４】
本発明の第1の態様の一部の好適な実施形態では、p=1であり、したがって本発明のペプチドは式IIによって表される。
式II:
R1-Z-L-Q-R2
式中、Z、L、Q、R1、およびR2は、式Iで定義した通りである。
【００１５】
本発明の第1の態様の他の好適な実施形態では、p=0であり、したがって本発明のペプチドは式IIIによって表される。
式III:
R1-Z-R2
式中、Z、R1、およびR2は、式Iで定義した通りである。
【００１６】
本発明のペプチドはまた、酵素分解に対してペプチドを安定させるためにアルキル化または他の方法で修飾されたペプチド結合を含むことができ、かつ/またはD-アミノ酸を含むことができる。
【００１７】
本発明の範囲内のペプチドは、本明細書に記載する一実施形態では、遊離N末端基および/またはC末端基を有する。これらの基は、一部の本発明の使用では、遊離したままとすることができる。しかしながら、別の実施形態では、これらのペプチドは、ブロックされたC末端基および遊離N末端基を有することができる。別法では、このようなペプチドは、ブロックされたN末端基および遊離C末端基、またはブロックされたN末端基およびC末端基を有することができる。分子の両側の末端基の性質は特に重要ではない。
【００１８】
加えて、ペプチド内のアミノ酸残基は、D-アミノ酸でもL-アミノ酸でもよい。特定の態様では、化合物の安定性を向上させるために、好ましくはD-アミノ酸とすることができる。
【００１９】
本発明によるペプチドは、多種多様な重要な用途および利点がある。
【００２０】
例えば、このようなペプチドは、細胞間コミュニケーションの減少、細胞間コミュニケーションの過結合、または細胞コミュニケーションの誤調節につながるギャップ結合機能の障害に関連した病態の予防および/または治療に使用することができる。
【００２１】
したがって、一態様では、本発明は、治療方法に使用するための、本明細書に記載するペプチドを提供する。好ましくは、この治療方法は、ギャップ結合コミュニケーション障害が関与する病態を治療する。
【００２２】
本発明の別の態様は、ギャップ結合機能の障害に関連した病態の予防および/または治療用の薬物の製造に関する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、このような病態を有するまたは発症するリスクのある患者に、上記のいずれかのペプチドを治療有効量投与する段階を含む、治療方法を提供する。好適な一態様では、患者はヒトである。
【００２４】
治療できる病態の例として、心血管疾患、気道上皮の炎症、肺胞組織の障害、膀胱失禁(bladder incontinence)、蝸牛の疾患による難聴、内皮損傷、糖尿病性網膜症および糖尿病性ニューロパチー、中枢神経系および脊髄の虚血、歯周部の疾患を含む歯組織の障害、腎疾患、骨髄移植不全、創傷、勃起不全、膀胱失禁(urinary bladder incontinence)、神経障害痛、亜慢性および慢性炎症、骨髄および幹細胞移植の癌および障害、細胞および組織の移植の際または外科手術などの医療処置の際に起こる状態、ならびに過剰な活性酸素種および/またはフリーラジカルおよび/または硝酸によって引き起こされる状態が挙げられるが、これらに限定されるものではない。治療できる状態のさらなる例として、乾癬、骨粗鬆症、および糖尿病が挙げられる。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のいずれかのペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。好ましくは、医薬組成物は、上記の治療方法における使用に適している。好ましくは、このような担体は、滅菌され、発熱物質およびウイルスを含んでいない。
【００２６】
以下の説明では、本発明の実施形態および実施例を、図面を参照しながら説明する。本明細書に記載する実施形態および実施例は、例示目的であって、本発明の範囲を限定すると解釈すべきものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】1.5mMオクタノールで灌流(太い矢印で開始を示す)する前および最中のCx43-発現N2a細胞対から得た結合部電流(Ij)トレースのグラフである(結合部通過電圧:60mV、パルス期間:10秒、パルス間間隔:10秒)。パッチピペットを、通常のピペット内液で満たした。
【図１Ｂ】1.5mMオクタノールで灌流(太い矢印で開始を示す)する前および最中のCx43-発現N2a細胞対から得た結合部電流(Ij)トレースのグラフである(結合部通過電圧:60mV、パルス期間:10秒、パルス間間隔:10秒)。ピペット内液には、0.1mMの濃度のペプチド2371を含めた。パッチピペットにおけるペプチド2371は、オクタノール誘導脱共役を防止した。
【図１Ｃ】1.5mMオクタノールで灌流(太い矢印で開始を示す)する前および最中のCx43-発現N2a細胞対から得た結合部電流(Ij)トレースのグラフである(結合部通過電圧:60mV、パルス期間:10秒、パルス間間隔:10秒)。ピペット内液には、ペプチド2372を含めた。パッチピペットにおけるペプチド2372は、オクタノール誘導脱共役を防止した。
【図２Ａ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。実験は、ピペット内液中に0.1mMペプチド2366、2371、2372、および2497が非存在(N=7)または存在(N=7)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。「脱共役」は、図1A〜図1Cに例示し実施例7に記載した電圧クランププロトコル下での結合部電流の完全な喪失を指す。 図2A、図2C、および図2Eは、オクタノールの灌流の開始後の1分経過毎のカップリングしたままの細胞対のパーセントを例示している。図2B、図2D、および図2Fは、オクタノール灌流の開始後の時間の関数として平均結合コンダクタンス(Gj)を示している。各細胞対に対して、Gjは、オクタノール曝露前に記録した値に対して測定した。ペプチド2371(図2Aおよび図2B)、2372(図2Aおよび図2B)、および2366(図2Cおよび図2D)において、平均Gjが初めは低下するが後に上昇することが観察できる。この上昇は、脱共役剤によって初めは閉じられていたギャップ結合を再開させるこれらのペプチドの能力を反映している。ペプチド2497(図2Eおよび図2F)は、Gjの脱共役を防止している。
【図２Ｂ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。実験は、ピペット内液中に0.1mMペプチド2366、2371、2372、および2497が非存在(N=7)または存在(N=7)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。「脱共役」は、図1A〜図1Cに例示し実施例7に記載した電圧クランププロトコル下での結合部電流の完全な喪失を指す。 図2A、図2C、および図2Eは、オクタノールの灌流の開始後の1分経過毎のカップリングしたままの細胞対のパーセントを例示している。図2B、図2D、および図2Fは、オクタノール灌流の開始後の時間の関数として平均結合コンダクタンス(Gj)を示している。各細胞対に対して、Gjは、オクタノール曝露前に記録した値に対して測定した。ペプチド2371(図2Aおよび図2B)、2372(図2Aおよび図2B)、および2366(図2Cおよび図2D)において、平均Gjが初めは低下するが後に上昇することが観察できる。この上昇は、脱共役剤によって初めは閉じられていたギャップ結合を再開させるこれらのペプチドの能力を反映している。ペプチド2497(図2Eおよび図2F)は、Gjの脱共役を防止している。
【図２Ｃ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。実験は、ピペット内液中に0.1mMペプチド2366、2371、2372、および2497が非存在(N=7)または存在(N=7)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。「脱共役」は、図1A〜図1Cに例示し実施例7に記載した電圧クランププロトコル下での結合部電流の完全な喪失を指す。 図2A、図2C、および図2Eは、オクタノールの灌流の開始後の1分経過毎のカップリングしたままの細胞対のパーセントを例示している。図2B、図2D、および図2Fは、オクタノール灌流の開始後の時間の関数として平均結合コンダクタンス(Gj)を示している。各細胞対に対して、Gjは、オクタノール曝露前に記録した値に対して測定した。ペプチド2371(図2Aおよび図2B)、2372(図2Aおよび図2B)、および2366(図2Cおよび図2D)において、平均Gjが初めは低下するが後に上昇することが観察できる。この上昇は、脱共役剤によって初めは閉じられていたギャップ結合を再開させるこれらのペプチドの能力を反映している。ペプチド2497(図2Eおよび図2F)は、Gjの脱共役を防止している。
【図２Ｄ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。実験は、ピペット内液中に0.1mMペプチド2366、2371、2372、および2497が非存在(N=7)または存在(N=7)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。「脱共役」は、図1A〜図1Cに例示し実施例7に記載した電圧クランププロトコル下での結合部電流の完全な喪失を指す。 図2A、図2C、および図2Eは、オクタノールの灌流の開始後の1分経過毎のカップリングしたままの細胞対のパーセントを例示している。図2B、図2D、および図2Fは、オクタノール灌流の開始後の時間の関数として平均結合コンダクタンス(Gj)を示している。各細胞対に対して、Gjは、オクタノール曝露前に記録した値に対して測定した。ペプチド2371(図2Aおよび図2B)、2372(図2Aおよび図2B)、および2366(図2Cおよび図2D)において、平均Gjが初めは低下するが後に上昇することが観察できる。この上昇は、脱共役剤によって初めは閉じられていたギャップ結合を再開させるこれらのペプチドの能力を反映している。ペプチド2497(図2Eおよび図2F)は、Gjの脱共役を防止している。
【図２Ｅ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。実験は、ピペット内液中に0.1mMペプチド2366、2371、2372、および2497が非存在(N=7)または存在(N=7)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。「脱共役」は、図1A〜図1Cに例示し実施例7に記載した電圧クランププロトコル下での結合部電流の完全な喪失を指す。 図2A、図2C、および図2Eは、オクタノールの灌流の開始後の1分経過毎のカップリングしたままの細胞対のパーセントを例示している。図2B、図2D、および図2Fは、オクタノール灌流の開始後の時間の関数として平均結合コンダクタンス(Gj)を示している。各細胞対に対して、Gjは、オクタノール曝露前に記録した値に対して測定した。ペプチド2371(図2Aおよび図2B)、2372(図2Aおよび図2B)、および2366(図2Cおよび図2D)において、平均Gjが初めは低下するが後に上昇することが観察できる。この上昇は、脱共役剤によって初めは閉じられていたギャップ結合を再開させるこれらのペプチドの能力を反映している。ペプチド2497(図2Eおよび図2F)は、Gjの脱共役を防止している。
【図２Ｆ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。実験は、ピペット内液中に0.1mMペプチド2366、2371、2372、および2497が非存在(N=7)または存在(N=7)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。「脱共役」は、図1A〜図1Cに例示し実施例7に記載した電圧クランププロトコル下での結合部電流の完全な喪失を指す。 図2A、図2C、および図2Eは、オクタノールの灌流の開始後の1分経過毎のカップリングしたままの細胞対のパーセントを例示している。図2B、図2D、および図2Fは、オクタノール灌流の開始後の時間の関数として平均結合コンダクタンス(Gj)を示している。各細胞対に対して、Gjは、オクタノール曝露前に記録した値に対して測定した。ペプチド2371(図2Aおよび図2B)、2372(図2Aおよび図2B)、および2366(図2Cおよび図2D)において、平均Gjが初めは低下するが後に上昇することが観察できる。この上昇は、脱共役剤によって初めは閉じられていたギャップ結合を再開させるこれらのペプチドの能力を反映している。ペプチド2497(図2Eおよび図2F)は、Gjの脱共役を防止している。
【図３Ａ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。二重細胞パッチクランプ実験は、ピペット内液中に0.1mMペプチド2517が非存在(黒のトレース;四角のデータ点)または存在(赤のトレース;丸のデータ点)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。
【図３Ｂ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。二重細胞パッチクランプ実験を、ピペット内液中に0.1mMペプチド2518が非存在(黒のトレース;四角のデータ点)または存在(赤のトレース;丸のデータ点)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。
【図３Ｃ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。二重細胞パッチクランプ実験を、ピペット内液中に0.1mMペプチド2519が非存在(黒のトレース;四角のデータ点)または存在(赤のトレース;丸のデータ点)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。
【図３Ｄ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。二重細胞パッチクランプ実験を、ピペット内液中に0.1mMペプチド2520が非存在(黒のトレース;四角のデータ点)または存在(赤のトレース;丸のデータ点)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。
【図３Ｅ】Cx43-発現N2a細胞から記録したカップリングの時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。二重細胞パッチクランプ実験を、ピペット内液中に0.1mMペプチド2624が非存在(黒のトレース;四角のデータ点)または存在(赤のトレース;丸のデータ点)している状態で行った。時間0は、オクタノールの灌流の開始に一致している。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
上記したように、本発明は、ギャップ結合細胞間コミュニケーション(GJIC)を調節するペプチドに関する。本発明は、GJICの障害に関連した病態の治療または予防における使用を含めて、多種多様な有用な適用例を有する。
【００２９】
本発明のペプチドは、上記したように式Iによって表される。
【００３０】
A1が塩基性アミノ酸である実施形態では、好ましくは、A1はLysまたはArgである。A1がリジン模倣物である実施形態では、好ましくは、A1は(4S,2R)Ampである。A2が塩基性アミノ酸である実施形態では、好ましくは、A2はLysまたはArgである。A2がリジン模倣物である実施形態では、好ましくは、A2は(4S,2R)Amp(Ac)である。一部の実施形態では、A1およびA2は、同じアミノ酸または同じリジン模倣物であることが好ましい。例えば、A1およびA2は共に、Arg、Lys、または(4S,2R)Ampとすることができる。p=0および/またはA4が欠失している場合は、A1およびA2が同一であることが特に好ましい。
【００３１】
A4が存在する場合は、A3は、好ましくは、Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸であり、より好ましくは、AsnまたはGlnである。p=0でA4が存在する場合は、A3はAsnまたはGlnであることが好ましい。
【００３２】
A4が欠失している場合は、A3は、好ましくは、Bで修飾されたGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸、Bで修飾されたリジン模倣物、またはGlx(CONH-B)であり、より好ましくは、Lys(NH-B)、Asn(CONH-B)、Glx(CONH-B)、またはBで修飾されたリジン模倣物である。A3は、Lys(NH-B)、Glx(CONH-B)、またはBで修飾されたリジン模倣物とすることができる。例えば、A3は、Lys(4-ヒドロキシベンゾイル)またはAsn(ベンジル)とすることができる。
【００３３】
一部の実施形態では、A4は、好ましくは、Trp、Tyr、Phe、またはHisなどの芳香族アミノ酸または欠失している。より好ましくは、A4は、Trp、Tyr、Phe、または欠失している。最も好ましくは、A4は、Tyrまたは欠失している。p=0である一部の実施形態では、A4は、Ala、Val、Leu、またはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはアミノ酸Metであることが好ましいであろう。
【００３４】
本ペプチドは、ZがA4-A3-A2-A1であるZのレトロ類似体を含むことができる。
【００３５】
上記したように、Bは疎水性基である。好ましくは、Bは、任意選択で置換される芳香族炭素環、好ましくは6員または12員の芳香族炭素環を含む疎水性基である。Bは、後述するように任意選択で置換してもよい。好ましくは、Bは、任意選択で置換されるアラルキル基、アリール基、またはアロイル基、例えば、ベンジル、ヒドロキシベンジル、フェニル、ヒドロキシフェニル、ナフチル、ヒドロキシナフチル、ベンゾイル、ヒドロキシベンゾイル、ナフトイル、またはヒドロキシナフトイルなどである。最も好ましくは、Bは、ベンジル、4-ヒドロキシベンジル、ベンゾイル、または4-ヒドロキシベンゾイルである。
【００３６】
本発明のアミノ酸残基がBで修飾されている場合は、好ましくは、Bは共有結合によってアミノ酸残基に付着される。より好ましくは、Bは、アミノ酸残基の側鎖に共有結合によって付着される。最も好ましくは、Bは、ペプチド主鎖から遠位側の側鎖の末端に付着される。
【００３７】
pが0ではない実施形態では、Qが存在する。本ペプチドは、QがA8-A7-A6-A5であるQのレトロ類似体を含むことができる。
【００３８】
A5が塩基性アミノ酸である場合は、好ましくは、A5はLysまたはArgである。A5がリジン模倣物である場合は、好ましくは、A5は(4S,2R)Ampである。A6が塩基性アミノ酸である場合は、好ましくは、A6はLysまたはArgである。A6がリジン模倣物である場合は、好ましくは、A6は(4S,2R)Amp(Ac)である。一部の実施形態では、A5およびA6は、同じアミノ酸または同じリジン模倣物であることが好ましい。例えば、A5およびA6は共に、Arg、Lys、または(4S,2R)Ampとすることができる。
【００３９】
A8が存在する場合は、A7は、好ましくは、Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸であり、より好ましくは、AsnまたはGlnである。
【００４０】
A8が欠失している場合は、A7は、好ましくは、Bで修飾されたGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸、Bで修飾されたリジン模倣物、またはGlx(CONH-B)であり、より好ましくは、Lys(NH-B)、Asn(CONH-B)、Glx(CONH-B)、またはBで修飾されたリジン模倣物である。A7は、Lys(NH-B)、Glx(CONH-B)、またはBで修飾されたリジン模倣物とすることができる。例えば、A7は、Lys(4-ヒドロキシベンゾイル)またはAsn(ベンジル)とすることができる。
【００４１】
一部の実施形態では、A8は、好ましくは、Trp、Tyr、Phe、またはHisなどの芳香族アミノ酸または欠失している。より好ましくは、A8は、Trp、Tyr、Phe、または欠失している。最も好ましくは、A8は、Tyrまたは欠失している。p=0である一部の実施形態では、A8は、Ala、Val、Leu、またはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはアミノ酸Metであることが好ましいであろう。
【００４２】
A1およびA5は、同じアミノ酸もしくは同じリジン模倣物であり、かつ/またはA2およびA6は、同じアミノ酸もしくはリジン模倣物であり、かつ/またはA3およびA7は、同じアミノ酸もしくはリジン模倣物であるか、または共にGlx(NH-B)であり、かつ/またはA4およびA8は、同じアミノ酸もしくは共に欠失していることが好ましいであろう。
【００４３】
p=0でない一部の実施形態では、Lが存在しない、すなわちX1〜X15のそれぞれが欠失していることが好ましい。
【００４４】
好ましくは、pは、0または1であり、より好ましくは0である。
【００４５】
好ましくは、R1はAcである。好ましくは、R2はNH2である。一部の好適な実施形態では、R1はAcであり、R2はNH2である。
【００４６】
本発明のペプチドの第1のサブセットは、式IIIによって表されるペプチドである。すなわち、p=0であり、
A1は、Lys、Arg、または(2S4R)Ampであり、
A2は、Lys、Arg、または(2S4R)Amp(Ac)であり、
A3は、A4が欠失している場合は、Lys(NH-B)またはAsn(CONH-B)であり、A4が存在する場合は、AsnまたはGlnであり、
A4は、Trp、Tyr、Phe、His、または欠失している。
【００４７】
本発明のペプチドの第1のサブセットでは、A1およびA2は同じ、すなわちA1およびA2は共にLys、Arg、またはAmpであることが好ましい。また、この第1のサブセットでは、A3は、A4が欠失している場合は、Lys(4-ヒドロキシベンゾイル)またはAsn(ベンジル)であり、A4が存在する場合は、Asnであることが好ましい。また、この第1のサブセットでは、A4はTyrまたは欠失していることが好ましい。また、この第1のサブセットでは、R1はAcであり、R2はNH2であることが好ましい。
【００４８】
本発明のペプチドの第2のサブセットは、p=1、2、3、4、または5であるペプチドであり、
A1およびA5は、同じアミノ酸または同じリジン模倣物であり、
A2およびA6は、同じアミノ酸またはリジン模倣物であり、
A3およびA7は、同じアミノ酸もしくはリジン模倣物、または共にGlx(NH-B)であり、
A4およびA8は、同じアミノ酸または共に欠失している。
【００４９】
第2のサブセット内のより好ましいペプチドは、p=1である式IIによって表される。この第2のサブセットでは、A1およびA5ならびにA2およびA6は、すべて同じアミノ酸またはリジン模倣物であることが好ましい。また、この第2のサブセットでは、A1およびA5は共にArgであることが好ましい。また、この第2のサブセットでは、A2およびA6は共にArgであることが好ましい。また、この第2のサブセットでは、A3およびA7は共にAsnであることが好ましい。また、この第2のサブセットでは、A4およびA8は共にTyrであることが好ましい。
【００５０】
本発明による化合物の例として、
Ac-Lys-Lys-Asn-Phe-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Tyr-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-His-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Trp-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Val-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Leu-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Ile-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Met-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-His-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Trp-NH2
Ac-Arg-ArgAsn-Ile-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Met-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Val-NH2
Ac-Arg-ArgAsn-Leu-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Phe-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-Tyr-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-His-NH2
Ac(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-Trp-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-Phe-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-Ile-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)Asn-Met-NH2
Ac-(D-Arg)-(DArg)-Asn-Val-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-Leu-NH2
Ac-Tyr-Asn-Arg-Arg-NH2
Ac-Tyr-Asn-Lys-Arg-NH2
Ac-Tyr-Asn-Arg-Lys-NH2
Ac-Tyr-Asn-Lys-Lys-NH2
Ac-(D-Tyr)-(D-Asn)-(D-Arg)-(D-Arg)-NH2
Ac-(D-Tyr)-(D-Asn)-(D-Lys)-(D-Arg)-NH2
Ac-(D-Tyr)-(D-Asn)-(D-Arg)-(D-Lys)-NH2
Ac-(D-Tyr)-(D-Asn)-(D-Lys)-(D-Lys)-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Phe-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Tyr-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-His-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Trp-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Val-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Leu-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Ile-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Met-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-His-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Trp-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Ile-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Met-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Val-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Leu-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Phe-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Phe-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Tyr-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-His-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Trp-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Val-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Leu-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Ile-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Met-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Phe-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-His-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Trp-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Val-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Leu-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Ile-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Met-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Phe-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-His-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Trp-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Val-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Leu-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Ile-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Met-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn(CONH-(4-ヒドロキシベンジル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Lys(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn(CONH-(ベンジル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Lys(NH(ベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn(CONH-(α-メチルナフチル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Lys(NH(α-ナフトイル))-NH2
Ac-Lys(4-ヒドロキシベンゾイル)-Arg-Arg-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn(CONH-(4-ヒドロキシベンジル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Lys(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn(CONH-(ベンジル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Lys(NH(ベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn(CONH-(α-メチルナフチル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Lys(NH(α-ナフトイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Damba(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Orn(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Dab(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Dapa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Daa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Amp(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-(4S-Amoa)(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Phe(4-NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-ArgArg-Ameg(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-pmGly(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Ica(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Apa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Damba(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Orn(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Dab(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Dapa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Daa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Amp(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-(4S-Amoa)(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Phe(4-NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Ameg(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-pmGly(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Ica(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Apa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Damba(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Orn(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Dab(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Dapa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Daa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Amp(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-(4S-Amoa)(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Phe(4-NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Ameg(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-pmGly(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Ica(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Apa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Damba(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Orn(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Dab(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Dapa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Daa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Amp(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-(4S-Amoa)(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Phe(4-NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Ameg(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-pmGly(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Ica(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Apa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Tyr-Lys-Lys-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Tyr-Arg-Lys-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Tyr-Lys-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Lys-Lys-Asn-Tyr-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Tyr-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
が挙げられる。
【００５１】
本発明の範囲内のより具体的なペプチドを、以下のTable 1(表1)に示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
本発明による別のペプチドの例として、化合物2624:Ac-Lys-Lys-Lys(4-ヒドロキシベンゾイル)-NH2が挙げられる。
【００５４】
上の表に列記したペプチドのほとんどの例では、R1はAcであり、R2はNH2である。上の表に列記したペプチドのR1基およびR2基は、示したR1基およびR2基に限定されるものではなく、本発明の範囲内のあらゆるR1基およびR2基とすることができる。上記のR1基およびR2基は、上の表に列記したペプチドに対して好ましいR1基およびR2基であろう。
【００５５】
本発明によるより具体的なペプチドは、一態様では、ギャップ結合によって仲介される細胞間コミュニケーションを促進し、かつ/または維持し、または阻害する。本発明はまた、細胞間ギャップ結合コミュニケーション障害に関連した病態の治療用の医薬組成物の調製および使用ならびにこのような組成物の使用方法に関する。
【００５６】
定義
特段の記載がない限り、以下の定義は、以下の記載に使用する特定の用語についてのものである。
【００５７】
本明細書および特許請求の範囲のすべてにおいて、天然のアミノ酸に対する3文字コードならびにSarcosin(Sar)などの他のα-アミノ酸に対して一般に許容されている3文字コードを使用する。L型またはD型を特定しない場合は、そのアミノ酸は、L型またはD型のいずれにもできることを理解されたい。
【００５８】
用語「ハロゲン」は、F、Cl、Br、およびIを指すが、FおよびIが好ましい。
【００５９】
用語「アルキル」は、任意の炭素原子の水素原子を除くことでアルカンから得た1価の基:CnH2n+1-を指す。非分岐鎖アルカンの末端炭素原子から水素原子を除いて得た基は、ノルマルアルキル(n-アルキル)基:H[CH2]n-のサブクラスを構成する。基RCH2-、R2CH-(RはHに等しくない)、およびR3C-(RはHに等しくない)はそれぞれ、1級、2級、および3級アルキル基である。C(1〜22)アルキルは、1個〜22個の炭素原子を有するあらゆるアルキル基を指し、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、ブチル、ペンチル、およびヘキシル、ならびにこれらのすべての可能な異性体などのC(1〜6)アルキルを含む。
【００６０】
語句「低級アルキル」は、炭素原子が約6個未満、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、またはブチルである直鎖または分岐鎖アルキルを意味する。
【００６１】
用語「アルケニル」は、1つまたは複数の炭素-炭素二重結合を含む直鎖、分岐鎖、または環状炭化水素基を指す。C(2〜22)アルケニルは、2個〜22個の炭素原子を有するあらゆるアルケニル基を指し、C(2〜6)アルケニル、ビニル、アリル、および1-ブテニルなどを含む。
【００６２】
用語「アラルキル」は、アリールC(1〜22)アルキルを指し、用語「アリール」は、本明細書ではフェニルまたはナフチルを意味する。
【００６３】
アロイルは、以下に示す構造を有する基を意味する。
【００６４】
【化１】
【００６５】
Arはアリールである。
【００６６】
語句「疎水性基」は、任意選択で置換される芳香族炭素環、好ましくは6〜12員の芳香族炭素環を含む。疎水性基は、後述するように任意選択で置換することができる。例示的な疎水性基は、ベンジル、フェニル、およびナフチルを含む。
【００６７】
本明細書で用いる用語「任意選択で置換される」は、基の1つまたは複数の水素原子(例えば、1、2、3、4、5、または6個の水素原子)のそれぞれを、製薬化学で一般に使用される置換原子または置換基で置換することができることを意味する。各置換基は、同じでも異なっていてもよい。適当な置換基の例として、ヒドロキシル、1級アミン(すなわち、NH2)、2級アミン、3級アミン、アミド、カルバメート、尿素、ヒドラジド、ハロゲン化合物、亜硝酸塩、ニトロ、硫化物、スルホキシド、スルホン、スルホンアミド、チオール、カルボキシ、アルデヒド、ケト、カルボン酸、エステル、アミド、イミン、およびイミド、ならびにこれらのチオ誘導体が挙げられる。好ましくは、1〜3個の任意選択の置換基が存在することができる。疎水性基が単環式芳香族炭素環によって表される実施形態では、第4位で置換されることが好ましく、置換基がヒドロキシルであることが好ましい。
【００６８】
Glx(CONH-B)は、以下に示す構造を有する部分を意味する。
【００６９】
【化２】
【００７０】
本明細書で用いる用語「リジン模倣物」(LM)は、以下に示す構造の1つを有する部分を意味する:
【００７１】
【化３Ａ】
【００７２】
【化３Ｂ】
【００７３】
Ampは、上に示したNH2基のN原子によって近接するアミノ酸またはさらにリジン模倣物に付着することによってα-アミノ酸として(上に示したように)またはγ-アミノ酸として用いることができる。この例は、化合物2517:H-(2S4R)Amp((2S4R)Amp(Ac))-Asn-Tyr-NH2であり、以下に示す構造を有する。
【００７４】
【化４】
【００７５】
第2のAmp(すなわち、H-(2S4R)Amp((2S4R)Amp(Ac))-Asn-Tyr-NH2に組み込まれたAmp)は、第1のAmp(すなわち、第1のAmpはγ-アミノ酸として用いられている)の側鎖のNH2基のN原子に付着しているため、括弧内に示している。第2のAmpは、アセチル化されているため、アセチル基が第2のAmpの後の括弧内にある。
【００７６】
本発明のペプチドにおけるリジン模倣物は、任意選択で置換することができ、好ましくは、置換基はAcである。
【００７７】
ペプチド配列ZおよびQへのLMの組み込み方の例は次の通りである。
R1-Z-R2については:
R1-LM(NH2)-A2-A3-A4-R2
R1-LM(NH2)-LM(NH2)-A3-A4-R2
R1-A1-LM(NH2)-A3-A4-R2
R2-Z-L-Q-R1については:
R1-LM(NH2)-A2-A3-A4-L-A5A6-A7-A8-R2
R1-LM(NH2)-LM(NH2)-A3-A4-L-A5-A6A7-A8-R2
R1-A1-LM(NH2)-A3-A4-L-A5-A6-A7-A8-R2
R1-A1-A2-LM(NH-B)-L-A5-A6-A7-A8-R2
R1-LM(NH2)-A2-A3-A4-L-LM(NH2)-A6-A7-A8-R2
R1-LM(NH2)-LM(NH2)-A3-A4-L-LM(NH2)-LM(NH2)-A7-A8-R2
R1-A1-LM(NH2)-A3-A4-L-A5-LM(NH2)-A7-A8-R2
【００７８】
リジン模倣物がBで修飾された場合は、以下に示す部分となる。
【００７９】
【化５Ａ】
【００８０】
【化５Ｂ】
【００８１】
本発明のペプチドへのLM(NH-B)の組み込みの例は次の通りである。
R1-Z-R2については:
R1-A1-A2-LM(NH-B)-R2
R1-LM-A2-LM(NH-B)-R2
R1-LM-LM-LM(NH-B)-R2
R1-A1-LM-LM(NH-B)-R2
R2-Z-L-Q-R1については:
R1-A1-A2-LM(NH-B)-L-A5-A6-LM(NH-B)-R2
R1-A1-A2-LM(NH-B)-L-LM(NH2)-A6-LM(NH-B)-R2
R1-A1-A2-LM(NH-B)-L-A5-LM(NH2)-LM(NH-B)-R2
R1-A1-A2-LM(NH-B)-L-LM(NH2)-LM(NH2)-LM(NH-B)-R2
R1-LM(NH2)-A2-LM(NH-B)-L-A5-A6-LM(NH-B)-R2
R1-A1-LM(NH2)-LM(NH-B)-L-LM(NH2)-A6-LM(NH-B)-R2
R1-LM(NH2)-LM(NH2)-LM(NH-B)-L-A5-LM(NH2)-LM(NH-B)-R2
R1-LM(NH2)-LM(NH2)-LM(NH-B)-L-LM(NH2)-LM(NH2)-LM(NH-B)-R2
等
【００８２】
レトロ類似体の例は次の通りである。
R1-A4-A3-A2-A1-R1
R1-A4-A3-LM(NH2)-LM(NH2)-R2
R1-LM(NH-B)-A2-A1-R2
本明細書の定義に用いる炭素数(例えば、C1〜10アルキル、C2〜10アルケニル、C2〜10アルキニル、C6〜20アリールなど)は、炭素主鎖および炭素側鎖についてであり、置換基の炭素原子は含まない。
【００８３】
用語「細胞間コミュニケーションモジュレーター」、「ギャップ結合ファシリテーター」、「ギャップ結合コミュニケーションを促進する化合物」、および「ギャップ結合オープナー」などはすべて、この作用の背後の特定の機構とは無関係に、GJICを促進する、維持する、または(例えば、阻害または増強のいずれかによって)正常化する化合物を指す。より具体的には、用語「ギャップ結合オープナー」は、細胞外空間と細胞内空間との間のギャップ結合を通過できる分子の交換を正常化(すなわち、増加)させ、かつ/またはGJICの増大を正常化することができる物質を指すこともある。
【００８４】
用語「作用薬」は、任意のペプチドの標的である組織、細胞、または細胞画分と相互作用し、同じまたは少なくとも実質的に同じ生理反応を引き起こすことができるペプチドを指す。
【００８５】
用語「拮抗薬」は、組織、細胞、または細胞画分が任意のペプチドと接触した後にこれらの組織、細胞、または細胞画分で観察される1つまたは複数の生理反応を阻害または弱めるペプチドを指す。
【００８６】
本明細書で用いる「正常化する」は、生理反応が正常な患者で観察される生理反応とはほとんど異ならなくなるような生理反応の変化を指す。したがって、正常化は、関係する病態によって、生理反応の増大または減少を伴いうる。
【００８７】
本願で使用する省略形は、以下に示すように定義する。
【００８８】
【表２】
【００８９】
本明細書で言及するすべての参照文献は、参照によりその全容が本明細書に組み込まれている。
【００９０】
当業者であれば、本発明および特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示するものの変形形態、変更形態、および他の実施形態に想到するであろう。
【００９１】
治療の方法および適用
一態様では、本発明は、GJICの障害に関連した状態を有するまたは発症するリスクのある患者に、上記したいずれかのペプチドを治療に有効な量投与する方法を提供する。本発明によるペプチドを用いて治療できる患者として、動物、好ましくは哺乳動物、例えば、げっ歯類(マウス、ラット、ハムスター、およびラビットなどのウサギを含む)、イヌ、ブタ、ヤギ(一般なあらゆる家畜)、および霊長類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適な一態様では、患者はヒトである。
【００９２】
別の態様では、本発明は、患者に本発明によるペプチドを治療有効量投与することを含めた、ギャップ結合コミュニケーション障害が関与する病態の治療用の薬物を製造するための本ペプチドの使用に関する。
【００９３】
本発明のさらなる態様では、治療方法に使用するための本明細書に記載のペプチドを提供する。好ましくは、この治療方法は、ギャップ結合コミュニケーション障害が関与する病態の治療である。
【００９４】
治療できる状態の例として、心血管疾患、気道上皮の炎症、肺胞組織の障害、膀胱失禁、蝸牛の疾患による難聴、内皮損傷、糖尿病性網膜症および糖尿病性ニューロパチー、中枢神経系および脊髄の虚血、歯周部の疾患を含む歯組織の障害、腎疾患、骨髄移植不全、創傷、勃起不全、膀胱失禁、神経障害痛、亜慢性および慢性炎症、骨髄および幹細胞移植の癌および障害、細胞および組織の移植の際または外科手術などの医療処置の際に起こる状態、ならびに過剰な活性酸素種および/またはフリーラジカルおよび/または硝酸によって引き起こされる状態が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９５】
上記したように、本発明の目的は、ギャップ結合細胞間コミュニケーション(GJIC)を調節するペプチドを提供することである。したがって、本発明に一致する多くのペプチドは、細胞の脱共役を減少させる能力、活動電位期間の分散を正常化する能力、および伝導速度を正常化する能力、ギャップ結合の細胞の量を制御してコネキシンの発現を正常化する(必要に応じて上方制御または下方制御する)能力;ギャップ結合の分解を正常化する(阻害または促進する)能力、コネキシンの血漿膜への細胞輸送を正常化する(増加または減少させる)能力;コネキシンの機能的ギャップ結合への組み込みを促進する能力;既存のギャップ結合の開口を正常化する、例えば、ギャップ結合が阻害剤によって(例えば、1種または複数種のコネキシン(例えば、Cx43など)の細胞質カルボキシル末端ドメインの過剰リン酸化を仲介または促進するなどして)閉じられたまたはゲートで閉鎖されたときの開口を誘発または促進するか、またはギャップ結合が異常に開いたとき(例えば、シャルコー・マリー・ツース病)にギャップ結合を閉じる能力などの1つまたは複数を含むことができる。
【００９６】
不整脈
好適な一態様では、本発明は、心血管疾患、例えば、急性虚血性心疾患(例えば、安定狭心症、不安定狭心症、急性心筋梗塞)、うっ血性心不全(例えば、収縮期心不全、弛緩期心不全、高心拍出量性心不全、低拍出量性心不全、右心不全、または左心不全)、先天心疾患、肺性心、心筋症、心筋炎、高血圧性心疾患、および冠動脈血管再生などの際に起こる不整脈および血栓合併症の治療用の薬学的に活性な抗不整脈ペプチドおよびその使用法を提供する。
【００９７】
特定の実施形態では、本発明による抗不整脈ペプチドは、徐脈型不整脈(例えば、洞結節、房室結節、ヒス束、右脚、または左脚における疾患による)およびリエントリーに関連した頻拍性不整脈(例えば、心房期外収縮、房室接合部性期外収縮、心室期外収縮、心房細動、心房粗動、発作性上室頻拍、洞房結節リエントリー性頻拍、房室結節リエントリー性頻拍、および非持続性心室性頻脈)を治療および/または予防するために、単独で用いられるか、またはクラスI剤(例えば、リドカイン)、クラスII剤(例えば、メトプロロールまたはプロプラノロール)、クラスIII剤(例えば、アミオダロンまたはソタロール)、またはクラスIV剤(例えば、ベラパミル)などの他の抗不整脈化合物と組み合わせて用いられる。
【００９８】
加えてまたは別法では、本発明によるペプチドは、リエントリー不整脈;心室リエントリー(例えば、急性心筋梗塞、慢性心筋梗塞、安定狭心症、および不安定狭心症の際などに起こる);感染性または自律神経性の心筋症;心房細動;再分極交互脈;単形性心室頻拍;T波交互脈;徐脈型不整脈;および一般的な心組織の収縮性の減少、および血栓症などの1つまたは複数を治療するために用いられる。
【００９９】
骨粗鬆症
GJICが骨の形成に重要であることは理解されている。さらに好ましいペプチドは、これに加えてまたは別法として、このようなペプチドの存在下での骨芽細胞のカルシウム波形成および/またはアルカリホスファターゼ活性を測定する「標準的な骨芽細胞活性アッセイ」と本明細書で呼ぶ骨芽細胞活性を増大させる。好ましくは、このようなペプチドは、波に関連した細胞数(fura-2などのカルシウム感受性蛍光染料を用いて細胞内Ca2+のレベルを測定し、蛍光を発した細胞を計数して決定する)の増加として示されるカルシウム波活性を増大させた。アルカリホスファターゼ活性を用いても、標準的な比色アッセイによって骨芽細胞活性の測定を行うことができる。
【０１００】
さらなる態様では、本発明によるペプチドは、骨の形成、成長、または維持に影響を与える骨粗鬆症または他の病態の予防および/または治療に用いられる。低酸素の際のヒト骨芽細胞間の減弱GJICを正常化することができるペプチドは、骨吸収に対して骨形成が障害された骨疾患の治療に特に適している。このような方法に使用するのに最適なペプチドは、GJICの適切な維持の結果として細胞の活力および成長をモニタリングする手段を提供する、骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼ(ALP)活性の増大についてのアッセイで選択できる。一態様では、ヒト骨芽細胞は、1×10-13〜1×10-6の異なる濃度のペプチドで刺激し、未処理コントロールと比較する。通常の培養条件下で、好ましくは、ペプチドはALP活性を増大させる。さらに好ましくは、ペプチドは、10-11〜10-8mol/lの範囲の濃度の低酸素状態の際にALP活性を刺激する。したがって、このアッセイを用いて、骨組織における不十分な血管新生、低酸素、および虚血に関連した骨疾患の治療および/または予防用のペプチド組成物を最適化することができる。
【０１０１】
別の態様では、本発明によるペプチドは、細胞間結合の障害を伴う関節疾患の予防および/または治療に用いられる。例えば、本ペプチドは、代謝的負荷を伴う関節疾患の予防および/または治療に用いることができる。これらの関節疾患には、血管新生の減少または骨折軟骨組織の治癒に関連したあらゆる形態の関節炎が含まれうる。
【０１０２】
癌
さらに別の態様では、本発明によるペプチドは癌の治療に用いられる。発癌は、成長因子、発現遺伝子、および癌抑制遺伝子が関与する成長制御機構の進行性の障害を特徴とする。発癌および腫瘍形成における一般的なテーマは、GJICの下方制御である。色素移動アッセイを用いた腫瘍細胞におけるギャップ結合の透過性は、通常は、周囲組織におけるGJICよりも低い。さらに、ギャップ結合のゲート開閉は、GJICを減少させる腫瘍プロモーターによる影響を受けることが知られている。したがって、一態様では、本発明によるペプチドは、単独または従来の抗癌療法と組み合わせて、癌の治療薬として用いられる。
【０１０３】
創傷
さらなる態様では、本発明によるペプチドは、創傷の治療、特に創傷の治癒を早めるために用いられる。創傷の治癒には、多数種の細胞の相互作用が関与し、ギャップ結合によって仲介される細胞間コミュニケーションは、組織の修復および再生に関与する細胞の成長および発達の際の細胞の代謝の調整に重要な役割を果たすと考えられている(K. M. Abdullahら、(1999)、Endocrine、10 35〜41頁;M. Saitohら、(1997)、Carcinogenesis、18:1319〜1328頁;J. A. Goligerら、(1995)、Mol.Biol.Cell、6 1491〜1501頁)。ペプチドは、当分野で周知の担体(例えば、軟膏やクリームなど)を用いて局所投与によって創傷部位に投与するか、または、例えば、慢性胃潰瘍病変の治療などのように内部組織の創傷の治療のために全身投与することができる。
【０１０４】
内皮ギャップ結合細胞間コミュニケーションが関係するさらなる機能は、外傷、血管形成、内皮の成長および老化の後の内皮細胞の遊走、および血管運動反応の調整である(G. J. Christら、(2000)、Braz. J Med Biol. Res.、33:423〜429頁)。したがって、一態様では、本発明によるペプチドは、代謝の要求が高まった状態(例えば、運動、頻脈)および虚血の際に伝導血管反応を促進して血液供給を改善するために用いられる。
【０１０５】
また、ギャップ結合は、グリア区画の個々のメンバー間の調整された長距離シグナル伝達のために分子を結合すると考えられている。同様に、星状細胞は、一方の極が血管床に接触し、他方の極がニューロン実質に近接して機能的に分極しているため、ニューロンの代謝支持として非常に適している(R. Dermietzel、(1998)、Brain Res. Brain Res. Rev.、26:176〜183頁)。したがって、好適な一実施形態では、本発明によるペプチドは、グリア細胞とニューロンとの間の代謝支持の増加による脳の虚血性損傷の予防が必要な患者に投与される。このような患者には、鬱病、不安症、学習および記憶障害、恐怖症、および幻覚などの兆候を示しうる器質精神病の患者、または外傷性脳傷害の患者が含まれうる。好ましくは、このようなペプチドは、中枢神経系に利用できるように選択または製剤される(すなわち、血管-脳の障壁を通過する輸送を促進する担体と共に提供するか、またはこのような担体とコンジュゲートして提供する)。
【０１０６】
本発明によるペプチドはまた、神経傷害傷後または未熟細胞(前駆細胞)の脳組織への移植の際、例えば、神経外傷、脳虚血、および慢性神経変性疾患、例えばパーキンソン病またはハンチントン病の患者における修復を促進するために用いることもできる(H. Aldskogiusら、(1998)、Prog. Neurobiol、55:1〜26頁)。
【０１０７】
糖尿病
Cx43からなるギャップ結合チャネルは、膵島のグルコース感受性細胞とラット膵島細胞腺腫細胞系のグルコース感受性細胞を機能的に結合する[91]。対照的に、インスリンを異常に分泌しているいくつかの細胞系の細胞は、Cx43を発現せず、ギャップ結合がほとんどなく、カップリングが弱い。Cx43 cDNAの安定したトランスフェクションによるこれらの障害の修正後、適度なレベルでCx43を発現し、Cx43をカップリングする細胞は、天然β-細胞で観察されているように、野生型(カップリングしていない)細胞およびCx43を過剰発現しているトランスフェクト細胞の両方で観察されたものと比較すると著しく高いインスリン遺伝子およびインスリン量の発現を示す。これらの発見は、十分なCx43のカップリングが、適切なインスリンの産生および貯蔵に必要であることを示している[91]。さらに、グリベンクラミドによるインスリン放出のin vivo刺激は、Cx43の発現の上昇および膵島内の近接するβ-細胞間の細胞と細胞のカップリングの上昇に関連している。
【０１０８】
これらの観察結果は、膵島のβ-細胞同士をカップリングするギャップ結合がインスリンの産生および放出にとって重要な役割を果たしていることを示している。したがって、本発明のさらに別の目的は、ギャップ結合の電気伝導を向上させて、インスリン非依存性糖尿病患者の糖耐性を改善する物質を提供することである。
【０１０９】
さらに別の態様では、本発明によるペプチドは、糖尿病を治療するために用いられる。本発明のさらに別の目的は、ギャップ結合の電気伝導を向上させて、インスリン非依存性糖尿病患者の糖耐性を改善する物質を提供することにある。
【０１１０】
特定の実施形態では、本発明によるペプチドは、細胞間ギャップ結合チャネルに対する影響によって、白内障の治療および/または予防(D. Mackayら、(1999)、Am J Hum.Genet、64 1357〜1364頁)、角膜の栄養不良の病態における角膜の血管新生の治療および/または予防、角膜病変の治癒の促進(S. G. Spanakisら、(1998)、Invest Ophthalmol. Vis.Sci.、39:1320〜1328頁)、および/または高血圧の予防に用いることができる。
【０１１１】
乾癬
乾癬は、慢性皮膚疾患である。組織学的に、乾癬は、表皮の過剰増殖、伸びた顕著な血管、および厚い血管周囲のリンパ球浸潤を特徴とする。乾癬は、現在は、自己免疫疾患とみなされている。この疾患は、すべての年齢群で発症するが、主に成人が発症する。乾癬は、男性と女性で同等のようである。乾癬は、皮膚細胞が皮膚表面の下側のそれらの起源から急速に増大する際に生じ、皮膚細胞が成熟する機会を得る前に皮膚表面に積み重なる。通常は、この変化(代謝回転とも呼ぶ)には約1カ月かかるが、乾癬では、この変化が僅か2、3日で起こる。その典型的な形態では、乾癬は、銀白色の鱗屑で覆われた厚くて赤い(炎症)のパッチ状の皮膚になる。時にプラークとも呼ばれるこのようなパッチ状の皮膚は、通常は痒みまたは痛みを伴う。パッチ状の皮膚は、肘、膝、脚の他の部分、頭皮、腰、顔面、掌、および足の裏などにできるが、体のどの皮膚にも出現しうる。乾癬は、体表の5%未満にできた場合は軽度、5〜30%の場合は中程度、30%を超える場合は重度とみなされる。乾癬は、通常は、頭皮および四肢の伸筋表面、特に肘や膝に出現する。
【０１１２】
発症部位を示す亜型、例えば、屈側性乾癬(皮膚病変が鼠径部などの屈曲表面に起きる)、または皮膚変化のパターンを示す亜型、例えば、環状乾癬(病変が環状のパッチに生じる乾癬)、または皮膚病変の種類を示す亜型、例えば、膿疱性乾癬(丘疹、プラーク、または斑点よりも膿疱が勝っている)など多数の乾癬の亜型が存在する。びらん性で通常は非対称の少関節炎である乾癬性関節炎は、この慢性の再発性丘疹鱗屑皮膚障害と共に起こりうる。
【０１１３】
乾癬の症状は、軽度、中程度、または重度であり得る。現在、乾癬は治癒しないが、重症度に応じて症状を治療することができる。
【０１１４】
健常な皮膚の維持の中心は、接着および緻密結合、接着斑、およびギャップ結合細胞間コミュニケーションチャネルを含めて、緻密かつ高度に整列した細胞と細胞の付着ネットワークである(LAIRD, D.W.、(2006)、Life cycle of connexins in health and disease. Biochem J、394、527〜43頁;PROCHNOW, N. & DERMIETZEL, R.、(2008)、「Connexons and cell adhesion: a romantic phase.」、Histochem Cell Biol、130、71〜7頁)。このような細胞間結合は、上皮の増殖、遊走、および分化において極めて重要な役割を果たすが、乾癬にかかると、これらすべてが様々な程度に変更される(CHUNG, E.、COOK, P.W.、PARKOS, C.A.、PARK, Y.K.、PITTELKOW, M.R. & COFFEY, R.J.、(2005)、「Amphiregulin causes functional downregulation of adherens junctions in psoriasis.」、J Invest Dermatol、124、1134〜40頁;DJALILIAN, A.R.、MCGAUGHEY, D.、PATEL, S.、SEO, E.Y.、YANG, C.、CHENG, J.、TOMIC, M.、SINHA, S.、ISHIDA-YAMAMOTO、A. & SEGRE, J.A、(2006)、「Connexin 26 regulates epidermal barrier and wound remodeling and promotes psoriasiform response.」、J Clin Invest、116、1243〜53頁)。
【０１１５】
ギャップ結合の構成タンパク質であるコネキシンの発現は、基底層および棘僧のCx43が上側顆粒層のCx26によって通常は置換されている表皮内で空間的および一時的に制御される。しかしながら、乾癬斑では、Cx26は、他の過剰増殖性の層別化された上皮と同様のパターンで表皮の至るところで大幅に増加し、棘層のCx43(通常は最も豊富)を置換しているようである(LUCKE, T.、CHOUDHRY, R.、THOM, R.、SELMER, I.S.、BURDEN, A.D. & HODGINS, M. B.、(1999)、「Upregulation of connexin 26 is a feature of keratinocyte differentiation in hyperproliferative epidermis, vaginal epithelium, and buccal epithelium.」、J Invest Dermatol、112、354〜61頁)。乾癬で見られるコネキシンの空間的再分布に加えて、関連した接着結合の下方制御も起こり、特に、E-カドヘリンにおける顕著な減少は、正常な表皮よりも基底細胞および上側棘層に関連している(Chungら、2005)。したがって、乾癬表皮細胞の過剰増殖および分化の変化は、ギャップ結合および接着結合の両方の広範なリモデリングに関連している。
【０１１６】
したがって、本発明のさらに別の目的は、接着および緻密結合、接着斑、およびギャップ結合細胞間コミュニケーションチャネルを含めて、緻密かつ高度に整列した細胞と細胞の付着作業を確保することによって皮膚を健常に維持する物質を提供することにある。
【０１１７】
本発明によるペプチドおよび医薬組成物を、ギャップ結合コミュニケーション障害(異常な減少または増加)に関連したあらゆる状態または病状の治療に用いることができることは、当業者には明らかであろう。好ましくは、1種または複数種の本ペプチドまたは1種または複数種の本ペプチドを含む医薬組成物を、治療が必要な患者に治療有効量投与する。本明細書で用いる「治療有効量」は、所定の状態または病状の症状を緩和する量であり、好ましくは、所定の状態または病状のある患者の生理反応を正常化する量である。症状の緩和または生理反応の正常化は、当分野で日常的な方法を用いて決定することができ、所定の状態または病状で異なるであろう。一態様では、1種または複数種の本ペプチドまたは1種または複数種の本ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量は、DMFのない患者のパラメータの値と実質的に同じ値(好ましくは、患者のパラメータの値の+30%以内、さらに好ましくは、+20%以内、一層好ましくは、10%以内)まで測定可能な生理学的パラメータを回復させる量である。
【０１１８】
好適な本発明のペプチドの活性の特定および任意選択の定量に有用な特定のアッセイを後述する。これらのアッセイは、限定目的ではなく、本発明のペプチドをそのギャップ結合調節能力について調べることができる様々なアッセイを単に例示するためのものである。これらのアッセイは、相互に排他的ではない、すなわち本発明によるペプチドが、ある特定のアッセイで活性を示すが、別の特定のアッセイでは、異なる活性を示すか、または活性を示さないことを理解されたい。これは、個々のペプチドの多様性およびこれらのペプチドを調べるアッセイの種類の反映であろう。
【０１１９】
医薬組成物
本発明はまた、薬学的に許容される担体および/または希釈剤と組み合わせた、上記のペプチドの1種または複数種を含む医薬組成物にも関する。投与のための製剤は、当業者に公知の方法、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第17版、Alfonso R. Gennaro編集、Mark Publishing Company、Easton, PA, U.S.A.、1985年およびこの最新版、ならびに研究書「Drugs and the Pharmaceutical Sciences」シリーズ、Marcel Dekkerに一般に記載されているように調製することができる。
【０１２０】
利用する医薬担体または希釈剤は、従来の固形または液体担体とすることができる。固形担体の例として、ラクトース、テラアルバ、スクロース、シクロデキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはセルロースの低級アルキルエーテルが挙げられる。液体担体の例として、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレン、および水を挙げることができる。
【０１２１】
同様に、担体または希釈剤は、当分野で既知のあらゆる徐放性材料、例えば、単独またはワックスと混合したモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルが挙げられる。
【０１２２】
液体担体を用いる場合、製剤は、経口摂取に適したシロップまたは液体の形態にすることができる。
【０１２３】
所定の治療に用いられる活性化合物の実際に好適な量は、例えば、利用している特定の化合物、製剤した特定の組成物、投与方法、および患者の特徴、例えば、人種、性別、体重、健康状態、および年齢によって様々であることを理解されたい。所定のプロトコルの投与に対する最適な投与速度は、当業者が、このようなガイドラインにしたがって行われる従来の投与量決定試験を用いて容易に確かめることができる。適当な投与量範囲は、1日に付き体重1kg当たり約1〜約100mgとすることができる。
【０１２４】
本発明の治療化合物は、プロトン化された水溶性の形態、例えば、薬学的に許容される塩、通常は酸付加塩、例えば、無機酸付加塩、例えば、塩酸塩、硫酸塩、またはリン酸塩として、または有機酸塩、例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、またはクエン酸塩として、適切に投与することができる。本発明の治療化合物の薬学的に許容される塩には、金属塩、特にアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩;アルカリ土類金属塩、例えば、マグネシウム塩またはカルシウム塩;アンモニウム塩、例えば、アンモニウムまたはテトラメチルアンモニウム塩;またはアミノ酸付加塩、例えば、リジン、グリシン、またはフェニルアラニン塩も含まれうる。
【０１２５】
本発明の化合物は、末梢血管疾患を治療するために局所投与することもできるため、クリームまたは軟膏として製剤することもできる。
【０１２６】
本ペプチドは、非経口投与、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内、直腸内、膣内、または腹膜内投与のために、無菌の溶液または懸濁液などの組成物に製剤することもできる。
【０１２７】
(実施例)
以下に記載する実施例を用いて本発明をさらに例示する。以降に記載するものは単なる例であり、本発明の範囲内に収まったまま、細部の変更が可能であることを理解されたい。
【０１２８】
(実施例1)
ペプチド合成
すべてのペプチドは、固相法または液相法のいずれかによって合成した。しかしながら、固相ペプチド合成のより詳細な説明が、参照によりその全容が本明細書に組み込まれる国際公開第98/11125号パンフレットおよび国際公開第2007/078990号パンフレットに記載されている。
【０１２９】
a.一般ペプチド合成
装置および合成法
N-α-アミノ酸の保護基として9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)および側鎖の官能基のための適当な一般的保護基を用いて、濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器で、ペプチドをバッチ式に合成した。
【０１３０】
溶媒
溶媒DMF(N,N-ジメチルホルムアミド、Riedel de-Haen、Germany)を、強力なカチオン交換樹脂(Lewatit S 100 MB/H強酸、Bayer AG Leverkusen、Germany)が充填されたカラムに通して精製し、使用の前に、遊離アミンが存在する場合は黄色(Dhbt-O‐アニオン)に変化する3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン(Dhbt-OH)の添加により遊離アミンについて分析した。溶媒DCM(分析用ジクロロメタン、Riedel de-Haen、Germany)は、精製しないで直接用いた。アセトニトリル(HPLC用、Lab-Scan、Dublin Ireland)は、精製しないで直接用いた。
【０１３１】
アミノ酸
Fmoc-保護アミノ酸は、適当な側鎖保護形態でAdvanced ChemTech (ACT)から購入した。他の方法で保護されたアミノ酸(Boc-Asp(OFm)-OH、Boc-D-Asp(OFm)-OH、Fmoc-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Boc-Lys(Fmoc)-OH、Boc-D-Lys(Fmoc)-OH、Boc-Orn(Fmoc)-OHは、Bachem (Switzerland)から購入し、Fmoc-Lys(ivDde)-OH、Fmoc-Sar-OHは、NovaBiochem (Switzerland)から購入した。
【０１３２】
安息香酸およびベンジルアミン誘導体
安息香酸およびベンジルアミン誘導体は、Aldrichから購入し、さらに精製することなく使用した。
【０１３３】
カップリング試薬
カップリング試薬ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)は、(Riedel de-Haen、Germany)から購入し、PyBopは、Advanced ChemTechから購入した。
【０１３４】
リンカー
(4-ヒドロキシメチルフェノキシ)酢酸(HMPA)は、スイス国のNovabiochemから購入し、DICによって生成した予備形成1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)エステルとして樹脂に結合させた。
【０１３５】
固体支持体
ペプチドを、TentaGel S樹脂0.22〜0.31mmol/g(TentaGel-S-NH2;TentaGel-S-Ram、Rapp polymere、Germany)上で、Fmoc法によって合成した。
【０１３６】
触媒および他の試薬
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)は、ドイツ国のAldrichから、エチレンジアミンは、Flukaから、ピペリジンおよびピリジンは、独国フランクフルトのRiedel de-Haenから、4-(N,N-ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)は、スイス国のFlukaから購入し、対称無水物を用いるカップリング反応の触媒として用いた。エタンジチオールは、独国フランクフルトのRiedel de-Haenから購入し、3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン(Dhbt-OH)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(HOAt)は、スイス国のFlukaから入手した。
【０１３７】
カップリング手順
適切なn-α-保護アミノ酸から生成し、DMFに溶解した対称無水物として、第1のアミノ酸をカップリングさせることができる。次いで、得られたアミノ酸を、DMFに溶解したDICによって適切なn-α-保護アミノ酸およびHOBtまたはHOAtから作製したin situ生成HOBtまたはHOAtエステルとしてカップリングさせることができる。試験中のFmoc脱保護を防止するために、80℃でニンヒドリン試験を行ってアシル化をチェックした(B.D.Larsen、A.Holm、Int.J Pept.Protein Res.1994、43 1〜9頁)。
【０１３８】
N-α-アミノ保護基(Fmoc)の脱保護
Fmoc基の脱保護は、DMFに溶解した20%ピペリジンによって処理(1×5分および1×10分)し、排出されたDMFにDhbt-OHを添加した後、黄色が検出できなくなるまでDMFで洗浄(5×15ml、各5分)して行った。
【０１３９】
Allyl/Alocの脱保護
15〜20mlのCHCl3、AcOH、NMM(37:2:1)に溶解させた3当量のPd(PPh3)4溶液をペプチド樹脂に加えた。この処理は、この混合物にN2流をバブリングして室温で3時間続けた。
【０１４０】
HOBt-エステルのカップリング
3当量のN-α-アミノ保護アミノ酸を、3当量のHOBtおよび3当量のDICと共にDMFに溶解してから、この樹脂に加えた。
【０１４１】
予備形成対称無水物
6当量のN-α-アミノ保護アミノ酸をDCMに溶解して0℃に冷却した。DIC(3当量)を加え、反応を10分間続けた。溶媒を減圧除去し、残留物をDMFに溶解した。この溶液を直ちに樹脂に加え、次いで0.1当量のDMAPを加えた。
【０１４２】
酸を用いたペプチドの樹脂からの切断
95%のトリフルオロ酢酸(TFA、Riedel de-Haen、Frankfurt, Germany)-水v/vまたは95%TFAと5%エタンジチオールv/vで、室温で2時間処理して、ペプチドを樹脂から切断した。濾過した樹脂を95%TFA-水で洗浄し、減圧下で濾液および洗浄液を蒸発させた。残渣をエーテルで洗浄し、酢酸-水から凍結乾燥させた。粗製凍結乾燥産物を、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によって分析し、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESMS)によって同定した。
【０１４３】
TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成(PEG-PS)
TentaGel樹脂(1g、0.22〜0.31mmol/g)を、濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れた。この樹脂をDMF(15ml)中で膨潤させ、DMFに溶解した20%ピペリジンで処理して、樹脂上の非プロトン化アミノ基の存在を保証した。この樹脂を排出し、排出されたDMFにDhbt-OHを添加した後、黄色が検出できなくなるまでDMFで洗浄した。HMPA(3当量)を、上記のように予備形成HOBt-エステルとしてカップリングさせ、このカップリングを24時間続けた。樹脂を排出し、DMFで洗浄し(5×5ml、各5分)、ニンヒドリン試験によってアシル化をチェックした。第1のアミノ酸を、上記したように予備形成対称無水物としてカップリングさせた。配列にしたがって続くアミノ酸を、上記したように予備形成Fmoc保護HOBtエステル(3当量)としてカップリングさせた。特定の定めがない限り、このカップリングを2時間続けた。余分な試薬を除去するために、樹脂を排出して、DMFで洗浄した(5×15ml、各5分)。すべてのアシル化を、80℃でニンヒドリン試験を行ってチェックした。合成の完了後、ペプチド-樹脂を、DMF(3×15ml、各5分)、DCM(3×15ml、各1分)、および最後にジエチルエーテル(3×15ml、各1分)で洗浄し、減圧乾燥した。
【０１４４】
分取HPLC条件
分取クロマトグラフィーを、AFC2000自動フラクションコレクター/オートサンプラーを備えたVISION Workstation(PerSeptive Biosystem)を用いて行った。VISION-3ソフトウェアを、機器の制御およびデータ取得のために用いた。
【０１４５】
カラム
Kromasil(EKA Chemicals)KR100-10-C8 100Å、C-8、10μm;CER2230、250×50.8mmまたはVYDAC218TP101550、300Å、C-18、10〜15μm、250×50mm。使用した緩衝液系は、A:MQVに溶解した0.1%TFA、B:0.085%TFA、10%MQV、90%MeCNを含んでいた。流速は、35〜40ml/分とし、カラム温度は、25℃とした。UV検出は、215nmおよび280nmで行った。適した勾配を、個々のペプチドに対して最適化した。
【０１４６】
分析HPLC条件
勾配HPLC分析を、HP 1100クォターナリポンプ(Quaternary Pump)、HP 1100オートサンプラー、HP 1100カラムサーモスタット、およびHP 1100多波長検出器からなるHewlett Packard HP 1100 HPLCシステムを用いて行った。LCソフトウェア(A.06.01改訂版)用のHewlett Packardケムステーションを、機器の制御およびデータ取得のために用いた。
【０１４７】
分析HPLCでは、VYDAC 238TP5415、C-18、5μm、300Å、またはJupiter、Phenomenex 00F-4053-E0;5μm C-18、300Å 150x4.6mm他などの様々なカラムを適宜用いた。緩衝液系は、A:MQVに溶解した0.1% TFA、B:0.085% TFA、10% MQV、90% MeCNを含んでいた。流速は1ml/分とした。好ましいカラム温度は、40℃であった。UV検出は、215nmで行った。上記のように、適した勾配を、個々のペプチドに対して最適化した。
【０１４８】
質量分析
ペプチドを、超勾配メタノール(super gradient methanol)(Labscan、Dublin, Ireland)、Milli-Q水(Mollipore、Bedford, MA)およびギ酸(Merck、Damstadt, Germany)(50:50:0.1v/v/v)に溶解して1〜10μg/mlの濃度にした。ペプチド溶液(20μl)を、+/-0.1m/zの精度のLCT質量分析計(Micromass、Manchester, UK)を用いてESI-TOF-MSによって陽極性モードで分析した。
【０１４９】
一般合成手順
すべての合成では、乾燥TentaGel-S-NH2(0.23mmol/g、1g)を、濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」に記載されているように処理した。リジンおよびその類似体(例えば、オルニチン2,4-ジアミノブタン酸(Ornithin,2,4-Diaminobutanoic acid)、1,3-ジアミノプロパン酸など)が、C末端に位置している場合は、これらを、側鎖官能性のivDdeまたはAloc保護基(例えば、Fmoc-Lys(Aloc)-OH)のいずれかを備えたN-α-Fmoc保護誘導体としてカップリングさせた。リジンおよびその類似体が、N末端に位置している場合は、これらを、側鎖官能性のFmoc保護基(例えば、Boc-Lys(Fmoc)-OH)を備えたN-α-Boc保護誘導体としてカップリングさせた。アスパラギン酸、グルタミン酸、およびこれらの類似体が、C末端に位置している場合は、これらを、側鎖官能性のAllylic保護基(例えば、Fmoc-Asp(Oallyl)-OH)を備えたN-α-Fmoc保護誘導体としてカップリングさせた。アスパラギン酸、グルタミン酸、およびこれらの類似体が、N末端に位置している場合は、これらを、側鎖官能性のFm保護基(例えば、Boc-Asp(OFm)-OH)を備えたN-α-Boc保護誘導体としてカップリングさせた。これら以外のアミノ酸が、C末端に位置している場合は、これを、側鎖官能性の適当な保護基を備えたN-α-Fmoc保護誘導体としてカップリングさせ、N末端に位置している場合は、これを、側鎖官能性の適当な保護基を備えたN-α-Boc保護誘導体としてカップリングさせた。
【０１５０】
いずれの場合も、ジペプチドは、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはこれらの類似体の側鎖保護基の脱保護の後に合成した。
【０１５１】
リジンまたはその類似体の場合は、カルボキシル酸として官能性を持った疎水性基を、THFに溶解したDICによってin situ生成HOBtエステルにカップリングさせた。
【０１５２】
アスパラギン酸、グルタミン酸、またはこれらの類似体の場合は、アミンとして官能性を持った疎水性基を、トリエチルアミンによって触媒されるDMFに溶解したDICによって側鎖カルボキシル酸の予備生成HOBtエステルにカップリングさせた。
【０１５３】
すべてのカップリングは、少なくとも2時間続けた。上記したように、80℃でニンヒドリン試験を行ってアシル化をチェックした。合成の完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×15ml、各1分)、DCM(3×15ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×15ml、各1分)で洗浄し、減圧乾燥した。次いで、ペプチドを、上記したように樹脂から切断して凍結乾燥させた。
【０１５４】
上記したように分取HPLCで精製した後、ペプチド産物を収集し、ペプチドの同定をES-MSで行った。
【０１５５】
上記の手順は、以下に例示するすべてのペプチドおよび本明細書のTable 1(表1)に示すペプチドの合成に用いた。
【０１５６】
(実施例2)
組換えタンパク質の産生
組換えCx43CTは、参照によりその全容が本明細書に組み込まれるDuffyら、「pH-Dependent Intramolecular Binding and Structure Involving Cx43 Cytoplasmic Domains」、J. Biol. Chem.、277(39):36706〜36714頁、(2002)に記載されているように産生した。簡単に述べると、ラットCx43由来のcDNAをpGEX-6P-2 (Amersham)に導入して、大腸菌(BL-21)で発現させた。得られたGST融合タンパク質を、GST PreScission Protease(登録商標)(Amersham Biosciences)から切断した。切断後の組換え産物は、4個の追加アミノ酸(GPLG)に先行したrCx43の配列255〜382を含んでいた。タンパク質濃度を、Bio-Rad DCタンパク質アッセイを用いて測定した。タンパク質の純度をSDS-PAGEによって評価した。
【０１５７】
(実施例3)
表面プラズモン共鳴(SPR)
SPRは、リアルタイムで結合の振幅および動態を決定する分光法である(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Salamonら、「Surface Plasmon Resonance Spectroscopy as a Tool for Investigating the Biochemical and Biophysical Properties of Membrane Protein Systems. II: Applications to Biological Systems」、Biochim. Biophys. Acta、1331 (2):131〜152頁、(1997);Duffyら、「Functional Demonstration of Connexin-protein Binding Using Surface Plasmon Resonance」、Cell Adhes. Commun.、8(4-6):225〜229頁、(2001);Langら、「Surface Plasmon Resonance as a Method to Study the Kinetics and Amplitude of Protein-protein Binding」、PRACTICAL METHODS IN CARDIOVASCULAR RESEARCH 936〜947頁、(Stefan Dhein、Friedrich Wilhelm Mohr & Mario Delmar編集、2005))。組換えCx43CTは、カルボキシルメチルデキストランマトリックスに共有結合させた(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Salamonら、「Surface Plasmon Resonance Spectroscopy as a Tool for Investigating the Biochemical and Biophysical Properties of Membrane Protein Systems. II: Applications to Biological Systems」、Biochim. Biophys. Acta、1331(2):131〜152頁、(1997))。特定のペプチドを提示し、実施可能な場合は、解離定数(KD)を、1:1(Langmuir)結合および解離速度モデル(Biacoreソフトウェアパッケージ)を用いて、リガンドの結合および解離の経時的変化から算出した。両方の相(結合および解離)では、記録の初めの5〜8秒は、フローセル内のペプチドの分布から生じるアーチファクトを回避するために、フィットに含めなかった(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Langら、「Surface Plasmon Resonance as a Method to Study the Kinetics and Amplitude of Protein-protein Binding」、PRACTICAL METHODS IN CARDIOVASCULAR RESEARCH 936〜947頁、(Stefan Dhein、Friedrich Wilhelm Mohr & Mario Delmar編集、2005))。
【０１５８】
(実施例3a)
SPRを用いたペプチドのCx43に対する結合の決定
Table 2(表3)およびTable 3(表4)に示すペプチドを、表面プラズモン共鳴(「SPR」)を用いてCx43のカルボキシル末端ドメイン(CT)に対する結合について調べた。SPRは、元のRXPE配列を同定するために用いられた方法である(Shibayamaら、「Identification of a Novel Peptide that Interferes with the Chemical Regulation of Connexin-43」、Circ. Res.、98:1365〜72頁、(2006))。任意の単位における反応の振幅に対するペプチドの濃度をTable 2(表3)に示す。反応の振幅は、ライゲートの質量の関数でもあり、個々のペプチドの分子量によって正規化したデータをTable 3(表4)に示す。これらのデータは、僅かアミノ酸4個の長さのペプチドが、Cx43のカルボキシル末端ドメイン(CT)に結合できること示している。
【０１５９】
【表３】
【０１６０】
【表４】
【０１６１】
(実施例4)
核磁気共鳴(NMR)
すべてのNMRデータは、凍結探針を用いてVarian INOVA 600-MHz NMR分光計で得ることができ(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、MacUra & Ernst、「Elucidation of Cross Relaxation in Liquids by Two-dimensional NMR Spectroscopy」、Mol. Phys. 41:95〜117頁、(1980));試料の温度は7℃に維持する。勾配増強2次元1H-15N HSQC実験(Gradient-enhanced two-dimensional 1H-15N HSQC experiments)(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Kayら、「Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity」、J. Am. Chem. Soc.、114:10663〜10665頁、(1992))を用いて、15N標識Cx43CTにおけるすべての主鎖アミド共鳴を観察する。データは、t2の1024の複合点およびt1の128の複合点で得た。スイープ幅は、陽子次元で10,000Hzであり、窒素次元で2,500Hzである。ペプチドのCx43CTに対する濃度は、約2.4〜0.8mM(3:1の比)であった。すべてのNMRデータは、NMRPipe(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Delaglioら、「NMRPipe: A Multidimensional Spectral Processing System Based on UNIX Pipes」、J. Biomol. NMR、6(3):277〜293頁、(1995))を用いて処理し、NMRView(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sorgen、「How to Solve a Protein Structure by Nuclear Magnetic Resonance - The Connexin43 Carboxyl Terminal Domain」、PRACTICAL METHODS IN CARDIOVASCULAR RESEARCH
、948〜958頁、(Stefan Dhein, Friedrich Wilhelm Mohr & Mario Delmar編集、2005))を用いて分析した。
【０１６２】
(実施例5)
電気生理学的分析
N2a(Neuroblastoma)細胞に対して実験を行った。Cx43は、lac-スイッチ安定系(IPTG 0.1〜1.0mMによって誘導(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Zhongら、「LacSwitch II Regulation of Connexin43 cDNA Expression Enables Gap-junction Single-channel Analysis」、Biotechniques、34(5):1034〜1034頁、1041〜1044頁、1046頁、(2003)))で発現させるか、またはeGFPをコードするIRESプラスミドを用いて一過性に発現させた(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004); Sekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004))。M257(アミノ酸257位で切断されたCx43の変異体(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Morleyら、「Intramolecular Interactions Mediate pH Regulation of Connexin43 Channels」、Biophys. J.、70(3):1294〜1302頁、(1996)))を、eGFP含有IRESプラスミドを用いてN2a細胞で一過性に発現させた。細胞を、落射蛍光(Nikon Diaphoto200、Filter: 520〜560 nm)用の倒立顕微鏡のステージに載せた。結合部電流(Ij)を、二重全細胞電圧クランプ構造(保持電位:-40mV、細胞間電位差Vj:+60MV、ステップ期間:10〜30秒)内のeGFP-陽性細胞対から記録した。パッチピペットを、
セシウム含有溶液で満たした(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004); Sekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004))。pHの低い実験の場合は、HEPESの代わりにMES(10mM)を用いた。ピペットの抵抗は、4.0〜6.0MΩであった。合成ペプチドを、最終濃度0.1mMになるまでピペット溶液で希釈した。記録の際は、細胞は、セシウム含有溶液中で、室温で維持した(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004); Sekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004))。一部の実験では、オクタノール(2.0mM)を記録の際に灌流させた。単チャネル検出におけるデータの取得および記録、ならびに基準は、参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loo
p Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004)およびSekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004)に報告されているものと同様とした。
【０１６３】
(実施例6)
Cx43CT-化合物の相互作用の定量分析
特定の実験:
(1)Cx43CT-化合物の解離定数の決定
各化合物のCx43CTに対する結合動態を、SPRによって評価する。様々な濃度の結合物を用い、結合および解離の速度を、Langmuir 1:1動態モデル(Biacore)にフィットさせる。このモデルは、結合の1次動態を推定する。適切なフィッティングにより、推定KDが得られる。しかしながら、化合物のCx43CTとの相互作用が1対1モデルから逸脱し、KD値が生成されないことも起こりうる。このような場合は、架橋結合の実験および以下に提案するNMRを利用する。
【０１６４】
(2)架橋剤を用いた結合の濃度-依存関係
このシステムにより、たとえ結合動態がKDの決定に適していないとしても、化合物-Cx43CT結合の量的パラメータを設定することができる。架橋結合を、Cx43CTの一定濃度および化合物の連続希釈について調べた。化合物の濃度が低下すると、低い移動性のバンド(すなわち、化合物-Cx43CT複合体に一致する)を犠牲にして単量体および二量体Cx43CTのバンドの密度が漸進的に上昇することが予想される。結合密度の非結合密度に対する比を、化合物の濃度の関数としてプロットする。S字状の濃度-依存関係が予想される。最大値の半分の結合に一致するペプチド濃度を、見掛けEC50と定義した。
【０１６５】
(3)核磁気共鳴(NMR)による化合物誘導Cx43CT共鳴シフトの同定
以前の研究により、空間における位置がRXP4およびRXPEによって影響を受けるCx43CTのアミノ酸が同定された。Cx43CTの共鳴地図を、候補化合物で繰返す。官能基に対して同様の効果を持つペプチドも同じアミノ酸領域に結合するという仮説を立てる。
【０１６６】
(実施例7)
二重パッチクランプによる機能性評価
化合物を、オクタノール誘導脱共役を阻害する能力について調べた。また、化合物を、酸性化誘導脱共役を阻害する能力についても調べる。
【０１６７】
特定の実験
実験を、Shibayamaら、(2006)に記載されているようにモデル化した。Cx43-発現N2a細胞対間の結合コンダクタンスを、従来の二重パッチクランプを用いて評価した。ペプチドをパッチピペット溶液で希釈し、細胞をオクタノールまたは細胞内の低いpHに曝す。化合物の非存在下で、コントロール実験を行った。結果を図3A〜図3Eに示す。図3A〜図3Eは、Cx43-発現N2a細胞から記録されたカップリングにおける時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。図3A〜図3Eはそれぞれ、ペプチド2517、2518、2529、2520、および2624に関する。パッチクランプ実験は、ピペット内液に溶解した0.1mMのペプチド2517、2518、2519、2520、および2624の非存在下(黒のトレース、四角のデータ点)または存在下(赤のトレース、丸のデータ点)で行った。時間0は、オクタノール灌流の開始に一致する。結合コンダクタンスの相対的低下が決定された。
【０１６８】
脱共役は、結合コンダクタンスの完全な喪失によって明確になる。ペプチドの存在時および非存在時に脱共役している細胞対の数を決定した。ペプチドの効果がCx43CTドメインの完全性に依存するか否かを決定するために別の研究を行う。
【０１６９】
(実施例8)
ペプチドのCx43CTに対する結合
本明細書の特定のペプチドのCx43CTに対する結合能は、これらのペプチドがCx43チャネルの動作を変化させうることを示唆している。ギャップ結合部電流を、Cx43をトランスフェクトしたN2a細胞から記録した。巨視的電流を低下させて1つのチャネルの現象を検出できるようにするために、細胞対をオクタノールで灌流した(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Anumonwoら、「The Carboxyl Terminal Domain Regulates the Unitary Conductance and Voltage Dependence of Connexin40 Gap Junction Channels」、Circ. Res.、88(7):666〜673頁、(2001); Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res. 95(4):e22〜e28頁、(2004); Sekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004))。本明細書の特定のペプチドがピペット内液中に存在することにより、図1A〜図1Cに示すように、Cx43チャネルのオクタノール誘導閉止が防止される。図1Aは、コントロール条件(ペプチドを含まない)下でCx43-発現細胞対から得た結合部電流トレースを示している。結合部通過電圧(Vj)は+60mVとした。矢印で示す点でオクタノールを灌流に加えた。僅かに遅れて、結合部電流が急速に低下し、オクタノールの添加後3分以内に0になった。オクタノールがギャップ結合を高効率で脱共役する能力は文献(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Johnston & Ramon、「Electrotonic Coupling in Internally Perfused Crayfish Segmented Axons」、J. Physiol.、317:509〜518頁、(1981))に詳細に報告されている。図1Bおよび図1Cに示すトレースは、異なる細胞対から得た。ここで、ペプチド2371および2372は、ピペット内液で希釈した。オクタノールの添加の3分後、Gjの低下は、全くまたは僅かしか観察されなかった。累積データを図2A〜図2Fに示す。図2A、図2C、および図2Eは、オクタノール灌流の後も結合したままの細胞対のパーセントを示している(脱共役は、60mVの結合部通過電圧パルスによって誘発される結合部電流が0と定義)。7つの異なる細胞対を、ペプチド含有溶液で満たしたパッチピペットを用いて記録した。7つの対はペプチドを用いずに試験した。コントロール実験(ペプチドを使用しない)は、ペプチドの存在下で脱共役に失敗したプレートと同じプレートの細胞に対して行った。図2Aに示すように、ペプチド2372に曝露された細胞対はいずれも、オクタノール灌流後に脱共役しなかったが(破線)、ペプチド2371および2366(図2Aおよび図2C)での処理中、細胞対は、脱共役してから再結合した。ペプチドの非存在下、コントロール細胞対の7個の内の6個が(コントロールは実線)、オクタノール灌流の2分後に完全な脱共役を示した。図2Bは、オクタノール灌流の開始後、時間の関数として結合コンダクタンスの時間経過による変化を示している(Gj;個々の実験のコントロールに対して測定)。ペプチドの非存在下で得たデータは、実線および閉じた記号で示している。これらの結果は、オクタノール灌流の約2分後に漸近値に達するGjの特徴的な急激な低下を示している。破線は、ペプチド2371、2372、2366、および2497の存在下で得たデータに一致している。ペプチド2372では脱共役が観察されなかったが、Gjの僅かな低下は明らかであった。結局、データは、すべての化合物2371、2372、2366、および2497が、Cx43-発現細胞対のオクタノール誘導脱共役を防止したことを示している。さらに、2366、2371、および2372は、脱共役した細胞を共役細胞に戻すことができた。ペプチドの効果は、パッチピペット内のいかなるペプチド分子の存在にも起因するものではない。実際、以前の研究が、細胞質ループに由来するペプチドがチャネルの特徴は変更したが、オクタノール感受性を変化させなかったことを示した(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004))。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I:
R1-Z-(L-Q)p-R2
を有するペプチドであって、
式中、R1は、H、Ac、ベンゾイル、およびTfaから選択され、
Zは、A1-A2-A3-A4またはそのレトロ類似体であり、
A1は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A2は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A3は、任意選択によりBで修飾される、好ましくはGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択される任意のアミノ酸であり、または任意選択によりBで修飾されるリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)であり、
A4は、Trp、Tyr、Phe、もしくはHisなどの芳香族アミノ酸、Ala、Val、Leu、もしくはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはMetであるか、または欠失しており、
Bは疎水性基であり、
Lは、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15またはそのレトロ類似体であり、
X1は、Gly、Ala、Ser、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、または欠失しており、
X2は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X3は、Gly、Ala、Ser、Leu、Val、Ile、または欠失しており、
X4は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X5は、Gly、Ala、Ser、Arg、Lys、His、または欠失しており、
X6は、Val、Ile、Leu、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X7は、Pro、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X8は、Trp、Tyr、Phe、Leu、Val、Ile、または欠失しており、
X9は、Trp、Tyr、Phe、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X10は、Gly、Ala、Ser、Arg、Lys、His、または欠失しており、
X11は、Arg、Lys、His、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X12は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X13は、Val、Leu、Ile、または欠失しており、
X14は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X15は、Arg、Lys、His、または欠失しており、
Qは、A5-A6-A7-A8またはそのレトロ類似体であり、
A5は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A6は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A7は、任意選択によりBで修飾される、好ましくはGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択される任意のアミノ酸であり、または任意選択によりBで修飾されるリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)であり、
A8は、Trp、Tyr、Phe、もしくはHisなどの芳香族アミノ酸、Ala、Val、Leu、もしくはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはMetであるか、または欠失しており、
R2は、NH2、OH、OR、NHR、NRRであり、
RはC1〜C6アルキルであり、
pは0、1、2、3、4、または5であるペプチド。
【請求項２】
A4が存在する場合は、A3が、Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸であり、A4が欠失している場合は、A3が、Bで修飾されたGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸であり、またはBで修飾されたリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)である、請求項1に記載のペプチド。
【請求項３】
p=0であり、
A1が、Lys、Arg、または(2S4R)Ampであり、
A2が、Lys、Arg、または(2S4R)Ampであり、
A4が欠失している場合は、A3がLys(NH-B)またはAsn(CONH-B)であり、A4が存在する場合は、A3がAsnまたはGlnであり、
A4が、Trp、Tyr、Phe、His、または欠失している、請求項1に記載のペプチド。
【請求項４】
p=0である、請求項1から3のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
p=1、2、3、4、または5であり、
A8が存在する場合は、A7が、Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択され、
A8が欠失している場合は、A7が、Bで修飾されたGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸であり、またはBで修飾されたリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)である、請求項1または2に記載のペプチド。
【請求項６】
p=1、2、3、4、または5であり、
A1およびA5が、同じアミノ酸または同じリジン模倣物であり、
A2およびA6が、同じアミノ酸またはリジン模倣物であり、
A3およびA7が、同じアミノ酸もしくはリジン模倣物、または共にGlx(NH-B)であり、
A4およびA8が、同じアミノ酸、または共に欠失している、請求項1、2、または5に記載のペプチド。
【請求項７】
Bが、6〜12員の任意選択で置換される芳香族炭素環を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
Bが、6〜12員の芳香族炭素環を含む、任意選択で置換されるアラルキル基、アリール基、またはアロイル基である、請求項7に記載のペプチド。
【請求項９】
Bが、ベンジル、4-ヒドロキシベンジル、ベンゾイル、または4-ヒドロキシベンゾイルである、請求項8に記載のペプチド。
【請求項１０】
Ac-Tyr-Asn-Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Tyr-Asn-Arg-Arg-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Tyr-Asn-Arg-Arg-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Arg-Asn-Pro-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Ala-Val-Pro-Phe-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Val-Pro-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-(8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸)-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
H-(2S,4R)Amp((2S,4R)Amp(Ac))-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn(CONH-Bzl)-NH2
Ac-Arg-Arg-Lys(NH-4-ヒドロキシベンゾイル)-NH2
Ac-Lys(NH-4-ヒドロキシベンゾイル)Arg-Arg-NH2
およびこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項1、7、8、および9のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
治療方法で使用するための、請求項1から10のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
ギャップ結合コミュニケーション障害を伴う病態を治療する治療方法で使用するための、請求項11に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記病態が、心血管疾患、気道上皮の炎症、肺胞組織の障害、膀胱失禁、難聴、内皮損傷、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、中枢神経系の虚血、脊髄の虚血、歯組織の障害、腎疾患、骨髄移植不全、創傷、勃起不全、泌尿器に関する膀胱失禁、神経障害痛、亜慢性および慢性炎症、癌、移植不全、過剰な活性酸素種および/またはフリーラジカルおよび/または硝酸によって引き起こされる状態からなる群から選択される、請求項12に記載のペプチド。
【請求項１４】
組織、細胞、または細胞画分の機能のモジュレーターである、請求項1から13のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１５】
細胞集団におけるギャップ結合コミュニケーションを調節するための方法であって、細胞集団に請求項1から14のいずれか一項に記載のペプチドを有効量投与し、それにより細胞間のギャップ結合コミュニケーションを調節する工程を含む方法。
【請求項１６】
前記投与をin vivoで行う、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
ギャップ結合コミュニケーション障害を伴う病態を有するまたはこのような病態を発症するリスクのある患者を治療する方法であって、患者に請求項1から14のいずれか一項に記載のペプチドを治療有効量投与する工程を含む方法。
【請求項１８】
前記患者がヒトである、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記病態が、心血管疾患、気道上皮の炎症、肺胞組織の障害、膀胱失禁、難聴、内皮損傷、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、中枢神経系の虚血、脊髄の虚血、歯組織の障害、腎疾患、骨髄移植不全、創傷、勃起不全、泌尿器に関する膀胱失禁、神経障害痛、亜慢性および慢性炎症、癌、移植不全、過剰な活性酸素種および/またはフリーラジカルおよび/または硝酸によって引き起こされる状態、糖尿病、骨粗鬆症、ならびに乾癬からなる群から選択される、請求項17または18に記載の方法。
【請求項２０】
ギャップ結合コミュニケーション障害を伴う病態の治療用の薬物を製造するための、請求項1から14のいずれか一項に記載のペプチドの使用であって、前記治療が、患者に前記ペプチドを治療有効量投与する工程を含む使用。
【請求項２１】
前記患者がヒトである、請求項20に記載の使用。
【請求項２２】
前記病態が、心血管疾患、気道上皮の炎症、肺胞組織の障害、膀胱失禁、難聴、内皮損傷、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、中枢神経系の虚血、脊髄の虚血、歯組織の障害、腎疾患、骨髄移植不全、創傷、勃起不全、泌尿器に関する膀胱失禁、神経障害痛、亜慢性および慢性炎症、癌、移植不全、過剰な活性酸素種および/またはフリーラジカルおよび/または硝酸によって引き起こされる状態、糖尿病、骨粗鬆症、ならびに乾癬からなる群から選択される、請求項20または21のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
請求項1から14に記載のペプチドおよび薬学的担体を含む医薬組成物。
【請求項１】
式I:
R1-Z-(L-Q)p-R2
を有するペプチドであって、
式中、R1は、H、Ac、ベンゾイル、およびTfaから選択され、
Zは、A1-A2-A3-A4またはそのレトロ類似体であり、
A1は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A2は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A3は、任意選択によりBで修飾される、好ましくはGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択される任意のアミノ酸であり、または任意選択によりBで修飾されるリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)であり、
A4は、Trp、Tyr、Phe、もしくはHisなどの芳香族アミノ酸、Ala、Val、Leu、もしくはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはMetであるか、または欠失しており、
Bは疎水性基であり、
Lは、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15またはそのレトロ類似体であり、
X1は、Gly、Ala、Ser、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、または欠失しており、
X2は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X3は、Gly、Ala、Ser、Leu、Val、Ile、または欠失しており、
X4は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X5は、Gly、Ala、Ser、Arg、Lys、His、または欠失しており、
X6は、Val、Ile、Leu、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X7は、Pro、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X8は、Trp、Tyr、Phe、Leu、Val、Ile、または欠失しており、
X9は、Trp、Tyr、Phe、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X10は、Gly、Ala、Ser、Arg、Lys、His、または欠失しており、
X11は、Arg、Lys、His、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X12は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X13は、Val、Leu、Ile、または欠失しており、
X14は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X15は、Arg、Lys、His、または欠失しており、
Qは、A5-A6-A7-A8またはそのレトロ類似体であり、
A5は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A6は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A7は、任意選択によりBで修飾される、好ましくはGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択される任意のアミノ酸であり、または任意選択によりBで修飾されるリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)であり、
A8は、Trp、Tyr、Phe、もしくはHisなどの芳香族アミノ酸、Ala、Val、Leu、もしくはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはMetであるか、または欠失しており、
R2は、NH2、OH、OR、NHR、NRRであり、
RはC1〜C6アルキルであり、
pは0、1、2、3、4、または5であるペプチド。
【請求項２】
A4が存在する場合は、A3が、Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸であり、A4が欠失している場合は、A3が、Bで修飾されたGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸であり、またはBで修飾されたリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)である、請求項1に記載のペプチド。
【請求項３】
p=0であり、
A1が、Lys、Arg、または(2S4R)Ampであり、
A2が、Lys、Arg、または(2S4R)Ampであり、
A4が欠失している場合は、A3がLys(NH-B)またはAsn(CONH-B)であり、A4が存在する場合は、A3がAsnまたはGlnであり、
A4が、Trp、Tyr、Phe、His、または欠失している、請求項1に記載のペプチド。
【請求項４】
p=0である、請求項1から3のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
p=1、2、3、4、または5であり、
A8が存在する場合は、A7が、Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択され、
A8が欠失している場合は、A7が、Bで修飾されたGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸であり、またはBで修飾されたリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)である、請求項1または2に記載のペプチド。
【請求項６】
p=1、2、3、4、または5であり、
A1およびA5が、同じアミノ酸または同じリジン模倣物であり、
A2およびA6が、同じアミノ酸またはリジン模倣物であり、
A3およびA7が、同じアミノ酸もしくはリジン模倣物、または共にGlx(NH-B)であり、
A4およびA8が、同じアミノ酸、または共に欠失している、請求項1、2、または5に記載のペプチド。
【請求項７】
Bが、6〜12員の任意選択で置換される芳香族炭素環を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
Bが、6〜12員の芳香族炭素環を含む、任意選択で置換されるアラルキル基、アリール基、またはアロイル基である、請求項7に記載のペプチド。
【請求項９】
Bが、ベンジル、4-ヒドロキシベンジル、ベンゾイル、または4-ヒドロキシベンゾイルである、請求項8に記載のペプチド。
【請求項１０】
Ac-Tyr-Asn-Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Tyr-Asn-Arg-Arg-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Tyr-Asn-Arg-Arg-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Arg-Asn-Pro-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Ala-Val-Pro-Phe-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Val-Pro-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-(8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸)-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
H-(2S,4R)Amp((2S,4R)Amp(Ac))-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn(CONH-Bzl)-NH2
Ac-Arg-Arg-Lys(NH-4-ヒドロキシベンゾイル)-NH2
Ac-Lys(NH-4-ヒドロキシベンゾイル)Arg-Arg-NH2
およびこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項1、7、8、および9のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
治療方法で使用するための、請求項1から10のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
ギャップ結合コミュニケーション障害を伴う病態を治療する治療方法で使用するための、請求項11に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記病態が、心血管疾患、気道上皮の炎症、肺胞組織の障害、膀胱失禁、難聴、内皮損傷、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、中枢神経系の虚血、脊髄の虚血、歯組織の障害、腎疾患、骨髄移植不全、創傷、勃起不全、泌尿器に関する膀胱失禁、神経障害痛、亜慢性および慢性炎症、癌、移植不全、過剰な活性酸素種および/またはフリーラジカルおよび/または硝酸によって引き起こされる状態からなる群から選択される、請求項12に記載のペプチド。
【請求項１４】
組織、細胞、または細胞画分の機能のモジュレーターである、請求項1から13のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１５】
細胞集団におけるギャップ結合コミュニケーションを調節するための方法であって、細胞集団に請求項1から14のいずれか一項に記載のペプチドを有効量投与し、それにより細胞間のギャップ結合コミュニケーションを調節する工程を含む方法。
【請求項１６】
前記投与をin vivoで行う、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
ギャップ結合コミュニケーション障害を伴う病態を有するまたはこのような病態を発症するリスクのある患者を治療する方法であって、患者に請求項1から14のいずれか一項に記載のペプチドを治療有効量投与する工程を含む方法。
【請求項１８】
前記患者がヒトである、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記病態が、心血管疾患、気道上皮の炎症、肺胞組織の障害、膀胱失禁、難聴、内皮損傷、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、中枢神経系の虚血、脊髄の虚血、歯組織の障害、腎疾患、骨髄移植不全、創傷、勃起不全、泌尿器に関する膀胱失禁、神経障害痛、亜慢性および慢性炎症、癌、移植不全、過剰な活性酸素種および/またはフリーラジカルおよび/または硝酸によって引き起こされる状態、糖尿病、骨粗鬆症、ならびに乾癬からなる群から選択される、請求項17または18に記載の方法。
【請求項２０】
ギャップ結合コミュニケーション障害を伴う病態の治療用の薬物を製造するための、請求項1から14のいずれか一項に記載のペプチドの使用であって、前記治療が、患者に前記ペプチドを治療有効量投与する工程を含む使用。
【請求項２１】
前記患者がヒトである、請求項20に記載の使用。
【請求項２２】
前記病態が、心血管疾患、気道上皮の炎症、肺胞組織の障害、膀胱失禁、難聴、内皮損傷、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、中枢神経系の虚血、脊髄の虚血、歯組織の障害、腎疾患、骨髄移植不全、創傷、勃起不全、泌尿器に関する膀胱失禁、神経障害痛、亜慢性および慢性炎症、癌、移植不全、過剰な活性酸素種および/またはフリーラジカルおよび/または硝酸によって引き起こされる状態、糖尿病、骨粗鬆症、ならびに乾癬からなる群から選択される、請求項20または21のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
請求項1から14に記載のペプチドおよび薬学的担体を含む医薬組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【公表番号】特表２０１０−５３３６９０（Ｐ２０１０−５３３６９０Ａ）
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１６５６１（Ｐ２０１０−５１６５６１）
【出願日】平成２０年７月１４日（２００８．７．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００２４０５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１０７３３
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
【出願人】（５０１４６６１８９）ジーランド・ファーマ・ア／エス (3)
【出願人】（５０３０３５９９２）ザ・リサーチ・ファウンデーション・オブ・ステイト・ユニヴァーシティ・オブ・ニューヨーク (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１４日（２００８．７．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００２４０５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１０７３３
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
【出願人】（５０１４６６１８９）ジーランド・ファーマ・ア／エス (3)
【出願人】（５０３０３５９９２）ザ・リサーチ・ファウンデーション・オブ・ステイト・ユニヴァーシティ・オブ・ニューヨーク (7)
【Ｆターム（参考）】
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