ペプチド粉末形態の製造方法
本発明は、ＧＬＰ−１ペプチド類縁体の自由流動性均質粉末形態の製造方法を含む。この方法は、好ましくはクロマトグラフィーでの精製方法で直接得られた水性有機溶媒中のペプチド類縁体の溶液が、噴霧乾燥プロセスに供され、自由流動性均質粉末の形態で回収されることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド粉末形態の製造方法、特にＧＬＰ−１ペプチド薬物の自由流動性均質粉末形態に関する。
【０００２】
好適なペプチド薬物は、ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の類縁体、特に配列番号１：
【０００３】
His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2,
【０００４】
（式中、これらのアミノ酸のうちの２６個は、天然のＬ配置であり、４個は、キラルではない）のアミノ酸配列を持つＧＬＰ−１類縁体である。Ａｉｂは、α−アミノイソ酪酸を意味する。このペプチドは、（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２とも名付けられ、その薬学的用途および固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）による調製は、ＰＣＴ公開ＷＯ２００３／３４３３１に記載されている。
【０００５】
ＧＬＰ−１類縁体の合成は、また、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）および溶液での断片カップリングの双方を包含するハイブリッドアプローチに従うことができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１４７８１６には、３つの断片を調製しかつこれらの断片を溶液中でカップリングすることによる（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の調製が記載されている。
【０００６】
個々の合成工程は、通常、高度に選択的であるが、多工程化学合成の最後には、生成物は、典型的には、薬物として使用するには十分に純粋ではない。そこで、粗生成物は、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）に供されて、さらにペプチドが精製されて、９６〜９９％（面積）の範囲の純度が実現される。ＲＰ−ＨＰＬＣ段階後に、生成物は、通常、典型的には１〜１５％（ｗ／ｗ）のペプチドの濃度を持つ溶液の形態で得られる。
【０００７】
薬物製剤化に好適である乾燥最終生成物を得るために、溶液は、凍結乾燥または析出手法のいずれかに供される。
【０００８】
しかしながら、この技術分野で公知の手順では、自由流動性ではない形態で生成物が供給されるという問題がある。さらに、凍結乾燥および析出手法は時間がかかり、バッチ式で適用する必要がある。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、ＧＬＰ−１ペプチド薬物を自由流動性均質粉末形態で供給することが可能であり、また工業的規模で適用可能な方法を開発することである。
【００１０】
この目的は、以下に概括するような、本発明の方法で達成されうることが見出された。
【００１１】
ＧＬＰ−１ペプチド類縁体の自由流動性均質粉末形態の製造方法は、水性有機溶媒中のペプチド類縁体の溶液を、噴霧乾燥プロセスに供し、自由流動性均質粉末の形態で回収することを特徴とする。ペプチドの溶液は、ＲＰ−ＨＰＬＣ段階から、またはＲＰ−ＬＰＬＣ（低圧液体クロマトグラフィー）もしくはＲＰ−ＭＰＬＣ（中圧液体クロマトグラフィー）から、直接得られる。
【００１２】
用語「自由流動性」は、噴霧乾燥ＧＬＰ−１ペプチド類縁体が好ましい流動特性を示す性質を記述するものであり、すなわちそのＧＬＰ−１ペプチドは、凝集物または塊を形成する傾向を持たない均質粉末形態である。
【００１３】
用語「ＧＬＰ−１ペプチド類縁体」は、天然のヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）類縁体、ＧＬＰ−１（７−３７）およびＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２ならびにＧＬＰ−１ペプチドの合成類縁体（ＧＬＰ−１類縁体）を包含する。
【００１４】
好ましいＧＬＰ−１類縁体は、配列番号１：
【００１５】
His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2,
【００１６】
のアミノ酸配列を持つヒトＧＬＰ−１類縁体、すなわち（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２およびＰＣＴ公開ＷＯ２００３／３４３３１に記載されているさらなる類縁体である。（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２が最も好ましい。この短縮形は、形式上、１〜６番目のアミノ酸残基を欠失させ、Ｃ末端をアミド化し、８位（Ａｌａ）および３５位（Ｇｌｙ）の天然由来のアミノ酸残基をα−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）で置換することによる、天然のヒトＧＬＰ−１（１−３７）に由来する類縁体を表示する。
【００１７】
ＧＬＰ−１ペプチドの好適な類縁体は、さらに、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、（Ｇｌｙ８）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｇｌｙ８）ＧＬＰ−１（７−３６）、（Ｓｅｒ３４）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｖａｌ８）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｖａｌ８，Ｇｌｕ２２）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ヘキサデカノイル）））−Ｌｙｓ２６Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）（リラグルチド）およびＤ−Ａｌａ８Ｌｙｓ３７−（２−（２−（２−マレイミドプロピオンアミド（エトキシ）エトキシ）アセトアミド））ＧＬＰ−１（７−３７）（ＣＪＣ−１１３１）からさらに選択することができる。
【００１８】
ＧＬＰ−１ペプチドのさらなる類縁体は、エキセンジン（exendin）−３、配列番号２：
【００１９】
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
【００２０】
のアミノ酸配列を有するエキセンジン−４（エキセナチド）、エキセンジン−４酸、エキセンジン−４（１−３０）、エキセンジン−４（１−３０）アミド、エキセンジン−４（１−２８）、エキセンジン−４（１−２８）アミド、１４Ｌｅｕ，２５Ｐｈｅエキセンジン−４アミドと１４Ｌｅｕ，２５Ｐｈｅエキセンジン−４（１−２８）アミドおよびＡＶＥ−００１０（配列番号３：
【００２１】
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
【００２２】
のアミノ酸配列を有するエキセジン類縁体）から選択されるエキセジン類縁体であることができる。
【００２３】
図面は、以下に概括する意味を有する。
【００２４】
図１は、噴霧乾燥プロセスのフローチャートを示す。
図２ａは、析出（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の走査電子顕微鏡観察を示す。
図２ｂは、噴霧乾燥（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の走査電子顕微鏡観察を示す。
【００２５】
本発明の好ましい態様において、その方法は、水性有機溶媒中のペプチド類縁体の溶液が、分取ＨＰＬＣから直接得られ、噴霧乾燥プロセスに供給されることを特徴とする。
【００２６】
この噴霧乾燥プロセスは、
ａ）水性有機溶媒中のペプチドの溶液を、供給槽（１）からフィルター（２）を経て供給し、
ｂ）噴霧室（３）中のろ過された溶液を、霧化器（４）を用いて霧化し、
ｃ）霧化された混合物を注入口（５）を経て供給される高温乾燥気体と混合することにより、溶媒を気化させて、ペプチド粉末を析出させ、
ｄ）気体粉末混合物を、ペプチドを自由流動性均質粉末として収集することができるサイクロン（６）に供給する、
工程を含む
【００２７】
工程ａ）
工程ａ）は、水性有機溶媒中のペプチドの溶液を、供給槽（１）からフィルター（２）を経て供給することを必要とする。
【００２８】
上で概括したように、水性有機溶媒中のペプチド類縁体の溶液は、分取ＨＰＬＣ（図１中で「Ａ」の記号で表す）から直接取り出すことが好ましい。水とアセトニトリルおよびＴＨＦの混合物が精製工程で溶媒として使用される場合、ペプチド溶液のさらなる濃縮を、水と脂肪族アルコールの混合物を溶媒として使用して、ＨＰＬＣにより、あるいはＬＰＬＣ（低圧液体クロマトグラフィー）または（中圧液体クロマトグラフィー）により行う必要がある。
【００２９】
水性有機溶媒は、通常、２０％〜８０％ｗ／ｗの水と２０％〜８０％ｗ／ｗの脂肪族アルコールの混合物、好ましくは４０％〜７０％ｗ／ｗの水と３０％〜６０％ｗ／ｗの脂肪族アルコールの混合物である。
【００３０】
脂肪族アルコールは、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｓ−ブタノールまたはｔ−ブタノール、好ましくはメタノールまたはエタノールから選択することができる。
【００３１】
水性有機溶媒中のペプチド含有量は、一般に、０．５％〜１５％ｗ／ｗ、好ましくは１．０％〜１０％ｗ／ｗ、より好ましくは０．５％〜８％ｗ／ｗの範囲である。
【００３２】
ペプチドの溶液は、好適には、ｐＨ安定化用の、通常の緩衝剤を含んでいる。好適な緩衝剤は、好ましくは、０．０５％〜０．２５％ｗ／ｗの範囲で加えられる酢酸アンモニウム、または０．０５％〜１％ｗ／ｗの範囲で加えられる酢酸から選択される。より好ましくは、緩衝剤は、０．０５％〜１％ｗ／ｗの量の酢酸である。
【００３３】
ペプチドの溶液は、供給槽（１）からフィルター（２）を経て、通常１ｋｇ／ｈ〜２０ｋｇ／ｈ、好ましくは５ｋｇ／ｈ〜１５ｋｇ／ｈの供給速度で、噴霧室（３）へ供給される。使用される噴霧乾燥装置のサイズに応じて、供給速度は、したがって、５〜１０の倍率で増加させることができる。
【００３４】
ペプチドの溶液の温度は、５℃〜３５℃の間で選択することができる。
【００３５】
フィルター（２）のサイズは、一般に、０．２μｍ〜４．０μｍの範囲である。
【００３６】
工程ｂ）
工程ｂ）は、噴霧室（３）中のろ過された溶液を、霧化器（４）を用いて霧化することを要する。
【００３７】
一般に、ロータリーホイール霧化器が使用される。霧化器速度は、１０，０００ｒｐｍ〜３０，０００ｒｐｍの範囲で選択される。
【００３８】
工程ｃ）
工程ｃ）は、霧化された混合物を注入口（５）を経て供給される高温乾燥気体と混合することにより、溶媒を気化させて、ペプチド粉末を析出させることを要する。
【００３９】
「高温乾燥気体」として、窒素、二酸化炭素または空気を使用することができる。好ましい「高温乾燥気体」は、１００℃〜２００℃、好ましくは１１０℃〜１４０℃の温度で適用され得る窒素である。
【００４０】
高温乾燥気体は、３００ｋｇ／ｈ〜５００ｋｇ／ｈの供給速度で、噴霧室（３）に供給される。使用される噴霧乾燥装置のサイズに応じて、供給速度は、結果として、５〜１０の倍率で増加させることができる。
【００４１】
工程ｄ）
工程ｄ）は、気体粉末混合物を、ペプチドを自由流動性均質粉末として収集することができるサイクロン（６）に供給することを要する。
【００４２】
サイクロン（６）に供給される気体は、一般に、５０℃〜１５０℃、好ましくは５０℃〜１１０℃、より好ましくは６０℃〜８０℃の温度である。
【００４３】
ペプチドは、袋状ハウジング（Ｂ）のような、この技術分野で周知の装置で収集することができる。
【００４４】
気体回収
【００４５】
本発明の好ましい態様においては、気体は、以下の気体回収工程：
ｅ）サイクロン（６）を離れる気体をフィルター（７）で精製する；
ｆ）凝縮器（８）中で水性溶媒を凝縮する；
ｇ）加熱器（９）中で凝縮器（８）を離れた気体を加熱し、噴霧室（３）に高温乾燥気体を再導入する；
に従って回収することができる。
【００４６】
フィルター（７）は、好適には、フィルター中に留まった微粒子を収集するのに適切な装置（Ｃ）に接続されている。
【００４７】
凝縮器（８）もまた、凝縮した溶媒を回収するのに適切な装置（Ｄ）に接続されている。
【００４８】
加熱器（９）中で、気体は、再び、噴霧乾燥プロセス中の「高温乾燥気体」として使用するための温度にされる。
【００４９】
あるいは、新鮮な気体のみを使用することができる。噴霧乾燥プロセスは、その後、気体が回収されるときの「閉鎖サイクル」モードでの運転に対して、「開放サイクル」モードで運転される。
【００５０】
生成物の特性
本発明に係る噴霧乾燥プロセスから得られるペプチドは、一般に、自由流動性均質粉末形態である。したがって、析出した生成物と比較すると、粒子は、より低い比表面積およびより低い嵩密度を示す。噴霧乾燥生成物の粒子の大部分は、析出した生成物に比べて、直径が極めて小さい。
【００５１】
好ましい態様において、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の自由流動性均質粉末は、ＢＥＴ法（ＩＳＯ９２７７）により測定された比表面積が０．５ｍ２／ｇ〜５ｍ２／ｇ、好ましくは０．５ｍ２／ｇ〜２．５ｍ２／ｇであること、すなわち、析出した生成物について測定された値よりも相当低い値を特徴とする。
【００５２】
噴霧乾燥（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２は、さらに、２００μｍ未満、好ましくは１５０μｍ未満、より好ましくは１００μｍ未満の粒径分布ｄ９０（レーザー散乱により測定）を特徴とし、これは、粒子の９０％が、２００μｍ未満、好ましくは１００μｍ未満の粒径を有することを意味する。６０％より多い析出したペプチドは、５００μｍを超える粒径を有している。
【００５３】
噴霧乾燥（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粒子の平均径は、一般に、１０〜６０μｍの範囲内、好ましくは２０〜４０μｍの範囲内、より好ましくは２０〜３０μｍの範囲内である。
【００５４】
噴霧乾燥（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の加工性パラメーター嵩密度は、一般に、０．２５ｇ／ｃｍ３未満、好ましくは０．２ｇ／ｃｍ３未満であるが、０．１ｇ／ｃｍ３未満に調整することができ、したがって、０．３〜０．４ｇ／ｃｍ３を超える値を示す析出生成物に比べて優れている。
【００５５】
噴霧乾燥した生成物の嵩密度およびタップ密度は、水性有機溶媒（供給溶液）中の水と脂肪族アルコールとの比、供給溶液中のペプチドの濃度および酢酸塩の濃度、ならびに供給溶液のｐＨ値のようなパラメーターに依存して調整することができることが見出された。供給溶液中の酢酸塩の量が少ないと、嵩密度が０．１ｇ／ｃｍ３未満の噴霧乾燥（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２が得られ、供給溶液中の酢酸塩がより多いと、約０．２〜０．２５ｇ／ｃｍ３の嵩密度となる。
【００５６】
したがって、０．１ｇ／ｃｍ３未満の嵩密度を持つ（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の噴霧乾燥粉末は、ペプチドの溶液（供給溶液）が２％ｗ／ｗ未満の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２と０．１５、好ましくは０．１０％ｗ／ｗ未満の酢酸塩を含むことを特徴とする本明細書に記載の方法により得られる。約０．２０〜０．２５ｇ／ｃｍ３の嵩密度を持つ（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の噴霧乾燥粉末は、ペプチドの溶液（供給溶液）が７〜８％ｗ／ｗの（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２と０．４〜０．６％ｗ／ｗの範囲の酢酸塩を含むことを特徴とする本明細書に記載の方法により得られる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、噴霧乾燥プロセスのフローチャートを示す。
【図２ａ】図２ａは、析出（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の走査電子顕微鏡観察を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、噴霧乾燥（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の走査電子顕微鏡観察を示す。
【００５８】
以下の実施例は、本発明を限定することなく本発明を例証する。
【００５９】
実施例
実施例Ａ：
ペプチドの調製
粗ペプチド（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２は、ＷＯ２００７／１４７８１６に記載の方法に従って、３種の断片を製造し、これらの断片を溶液中でカップリングすることにより調製することができる。
【００６０】
実施例Ｂ：
ＲＰ−ＨＰＬＣ精製
粗ペプチドの精製は、ＲＰ（逆相）固定相上で行われる。そこで、吸着剤は、シリカゲル（例えば、Kromasil 100-16-C18）またはアクリルエステルマクロ網状吸着剤（例えば、Amberchrom CG71M）のようなＲＰ材である。精製は、約２のｐＨでの１回目に通過させるクロマトグラフィー精製と、それに続く約９のｐＨでの２回目の通過を含む。
【００６１】
１回目のクロマトグラフィー
粗（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を水／アセトニトリル／酢酸（例えば、９０／９／１ ｖ／ｖ／ｖ）中に溶解し、ＨＰＬＣカラムにロードし（２０ｇ／Ｌまでロード、床深さ：約２５ｃｍ）、精製プログラム（長さ４５ｃｍのカラムについての例が、表１に記載されている）を開始する。画分を集め、水または希水酸化アンモニウム溶液で希釈しうる。
【００６２】
【表１】
【００６３】
ＡとＢの比は、主ピーク（ペプチド（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２）についてのわずかな滞留に対応して、精製プログラムに示した％有機溶媒をほぼ達成するために変更してもよい。イベント時間、グラジエントおよびローディングアスペクト（loading aspects）は、精製を最適化するために、変更してもよい。たまった画分は、さらに、２回目のクロマトグラフィーの条件により精製される。
【００６４】
２回目のクロマトグラフィー
（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２のクロマトグラフィー１からのたまった希釈画分を、ＨＰＬＣカラムにロードし、精製プログラム（表２および表３中の４５ｃｍカラムについての例を参照）を開始する。画分を集め、水または希酢酸で希釈しうる。
【００６５】
【表２】
【００６６】
ＣとＤの比は、主ピーク（ペプチド（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２）についてのわずかな滞留に対応して、精製プログラムに示した％有機溶媒をほぼ達成するために変更してもよい。イベント時間、グラジエントおよびローディングアスペクトは、精製を最適化するために、変更してもよい。
【００６７】
たまった画分は、本明細書で後述する析出プロセスまたは噴霧乾燥プロセス中で直接使用することができる。
【００６８】
【表３】
【００６９】
ＥとＦの比は、主ピーク（ペプチド（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２）についてのわずかな滞留に対応して、精製プログラムに示した％有機溶媒をほぼ達成するために変更してもよい。イベント時間、グラジエントおよびローディングアスペクトは、精製を最適化するために、変更してもよい。
【００７０】
たまった画分は、水または希酢酸で希釈してもよい。次いで、これらを、直接、以下の濃縮工程用のＨＰＬＣカラムにロードする。
【００７１】
（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の濃縮：
濃縮のための以下の工程は、代替２ａを２回目のクロマトグラフィー工程中で使用した場合に、場合により行われる。クロマトグラフィー２からのたまった希釈画分をカラムにロードし、弱い移動相（表４中の初期緩衝剤または水性酢酸／エタノール（８５／１５ ｖ／ｖ）で平衡化される。緩衝剤組成を、強い移動相（表４中の最終緩衝剤または水性酢酸／エタノール（２０／８０ ｖ／ｖ）に変え、（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２がカラムから溶離されるにつれて、それを集める。
【００７２】
【表４】
【００７３】
イベント時間、グラジエントおよびローディングアスペクトは、精製を最適化するために、変更してもよい。いくつかの濃度での操作を組み合わせ、そして（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２含有溶液のエタノール含有量を測定した（例えば、ＧＣにより）。
【００７４】
比較例Ｃ：
沈殿
適切な反応器中で、メチルtert−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）１８４ｋｇを、２４〜２６℃の温度で、エタノール１２２ｋｇと混合した。分取ＨＰＬＣから得られた（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の精製溶液３６．７ｋｇを、５〜１５分以内で加えた。混合物を３４℃〜３６℃の温度に加熱し、１時間攪拌し、次いで、２４℃〜２６℃に冷却した。フィルター乾燥器（０．２ｍ２）上でろ過した後、ケーキを１５分間窒素で乾燥し、さらに、２５℃〜３０℃で９時間、真空下に（１００mbar未満）乾燥した。次いで、ケーキをそれぞれ３．４ｋｇのエタノールで２回洗浄し、２５℃で１９時間、真空下に（１００mbar未満）乾燥した。得られた生成物を、エタノール含有量が１％未満に減少するまで、湿った窒素を３時間と乾燥窒素を１時間、交互に、フィルター乾燥器に下から通すことにより加湿した。これにより、生成物は湿気を含むようになり、他の乾燥サイクルが必要であった。乾燥窒素を３時間、フィルター乾燥器に下から通すことにより、水分を、約６％に調整した。６０１ｇの生成物（ＨＰＬＣアッセイによる収率：９２％）が得られた（９７．９％（面積）の（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、６．１％のＨ２Ｏ、０．７３％のエタノールおよび０．０２％のＭＴＢＥを含む）。
【００７５】
噴霧乾燥実施例１ａおよび１ｂ
実施例１ａおよび１ｂに適用された噴霧乾燥条件：
【００７６】
【表５】
【００７７】
噴霧乾燥（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２は、熱分解に関連する新たな不純物が全くない良品質のものであった（以下の表６参照）。それは、約１〜２％（ｗ／ｗ）のエタノール、４〜５％（ｗ／ｗ）の水、および３％（ｗ／ｗ）の酢酸塩を含んでいた（表４）。
【００７８】
【表６】
【００７９】
実施例２ａ〜２ｆ
残留エタノールの量を最少にするために、プロセスパラメーターをいくつか変えて、さらに小スケールでの最適化の試行を行った：
【００８０】
【表７】
【００８１】
したがって、継続的な「インサイツ」窒素パージを行って、２３〜２８％のエタノールの相対的な減少を成功裏に達成した（表８）。
【００８２】
【表８】
【００８３】
実施例３ａおよび３ｂ：
引き続く多キログラムスケールでのバッチを、以下の最適化されたパラメーターを用いて行った：
【００８４】
【表９】
【００８５】
２つのバッチの得られた品質特性を、表１０に示す：
【００８６】
【表１０】
【００８７】
実施例４
１．８７％（ｗ／ｗ）の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、６１％（ｗ／ｗ）の水および３７％（ｗ／ｗ）のエタノールを含む溶液１６０ｋｇを、Niro SD-4-R-CC（噴霧室 Φ１．２ｘ０．７５ｍ、容量 ８ｋｇＨ２Ｏ／ｈ）に供給した。約１５時間後、微粉末（分析値は、上の実施例３ａ参照）２．７３ｋｇをサイクロンから収集した。
【００８８】
【表１１】
【００８９】
実施例５：
さらなる最適化の試行を行って、下流での加工を容易にするために噴霧乾燥粉末の嵩密度をいかにして調整できるかを決定した。結果を表１２に示す。実施例５ａ〜５ｆは、供給溶液の組成を変えて、すなわち、溶媒比率（エタノールと水との）、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の濃度、および異なるｐＨをもたらす供給溶液中の酢酸塩の濃度を変更して、実施例５ａ〜５ｆを行った。分取ＨＰＬＣ溶液の噴霧乾燥を直接にかつさらなる修正をすることなく行うために、その変更は、最終の分取ＨＰＬＣ工程で統合した。
【００９０】
【表１２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド粉末形態の製造方法、特にＧＬＰ−１ペプチド薬物の自由流動性均質粉末形態に関する。
【０００２】
好適なペプチド薬物は、ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の類縁体、特に配列番号１：
【０００３】
His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2,
【０００４】
（式中、これらのアミノ酸のうちの２６個は、天然のＬ配置であり、４個は、キラルではない）のアミノ酸配列を持つＧＬＰ−１類縁体である。Ａｉｂは、α−アミノイソ酪酸を意味する。このペプチドは、（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２とも名付けられ、その薬学的用途および固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）による調製は、ＰＣＴ公開ＷＯ２００３／３４３３１に記載されている。
【０００５】
ＧＬＰ−１類縁体の合成は、また、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）および溶液での断片カップリングの双方を包含するハイブリッドアプローチに従うことができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１４７８１６には、３つの断片を調製しかつこれらの断片を溶液中でカップリングすることによる（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の調製が記載されている。
【０００６】
個々の合成工程は、通常、高度に選択的であるが、多工程化学合成の最後には、生成物は、典型的には、薬物として使用するには十分に純粋ではない。そこで、粗生成物は、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）に供されて、さらにペプチドが精製されて、９６〜９９％（面積）の範囲の純度が実現される。ＲＰ−ＨＰＬＣ段階後に、生成物は、通常、典型的には１〜１５％（ｗ／ｗ）のペプチドの濃度を持つ溶液の形態で得られる。
【０００７】
薬物製剤化に好適である乾燥最終生成物を得るために、溶液は、凍結乾燥または析出手法のいずれかに供される。
【０００８】
しかしながら、この技術分野で公知の手順では、自由流動性ではない形態で生成物が供給されるという問題がある。さらに、凍結乾燥および析出手法は時間がかかり、バッチ式で適用する必要がある。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、ＧＬＰ−１ペプチド薬物を自由流動性均質粉末形態で供給することが可能であり、また工業的規模で適用可能な方法を開発することである。
【００１０】
この目的は、以下に概括するような、本発明の方法で達成されうることが見出された。
【００１１】
ＧＬＰ−１ペプチド類縁体の自由流動性均質粉末形態の製造方法は、水性有機溶媒中のペプチド類縁体の溶液を、噴霧乾燥プロセスに供し、自由流動性均質粉末の形態で回収することを特徴とする。ペプチドの溶液は、ＲＰ−ＨＰＬＣ段階から、またはＲＰ−ＬＰＬＣ（低圧液体クロマトグラフィー）もしくはＲＰ−ＭＰＬＣ（中圧液体クロマトグラフィー）から、直接得られる。
【００１２】
用語「自由流動性」は、噴霧乾燥ＧＬＰ−１ペプチド類縁体が好ましい流動特性を示す性質を記述するものであり、すなわちそのＧＬＰ−１ペプチドは、凝集物または塊を形成する傾向を持たない均質粉末形態である。
【００１３】
用語「ＧＬＰ−１ペプチド類縁体」は、天然のヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）類縁体、ＧＬＰ−１（７−３７）およびＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２ならびにＧＬＰ−１ペプチドの合成類縁体（ＧＬＰ−１類縁体）を包含する。
【００１４】
好ましいＧＬＰ−１類縁体は、配列番号１：
【００１５】
His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg-NH2,
【００１６】
のアミノ酸配列を持つヒトＧＬＰ−１類縁体、すなわち（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２およびＰＣＴ公開ＷＯ２００３／３４３３１に記載されているさらなる類縁体である。（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２が最も好ましい。この短縮形は、形式上、１〜６番目のアミノ酸残基を欠失させ、Ｃ末端をアミド化し、８位（Ａｌａ）および３５位（Ｇｌｙ）の天然由来のアミノ酸残基をα−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）で置換することによる、天然のヒトＧＬＰ−１（１−３７）に由来する類縁体を表示する。
【００１７】
ＧＬＰ−１ペプチドの好適な類縁体は、さらに、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、（Ｇｌｙ８）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｇｌｙ８）ＧＬＰ−１（７−３６）、（Ｓｅｒ３４）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｖａｌ８）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｖａｌ８，Ｇｌｕ２２）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ヘキサデカノイル）））−Ｌｙｓ２６Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）（リラグルチド）およびＤ−Ａｌａ８Ｌｙｓ３７−（２−（２−（２−マレイミドプロピオンアミド（エトキシ）エトキシ）アセトアミド））ＧＬＰ−１（７−３７）（ＣＪＣ−１１３１）からさらに選択することができる。
【００１８】
ＧＬＰ−１ペプチドのさらなる類縁体は、エキセンジン（exendin）−３、配列番号２：
【００１９】
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
【００２０】
のアミノ酸配列を有するエキセンジン−４（エキセナチド）、エキセンジン−４酸、エキセンジン−４（１−３０）、エキセンジン−４（１−３０）アミド、エキセンジン−４（１−２８）、エキセンジン−４（１−２８）アミド、１４Ｌｅｕ，２５Ｐｈｅエキセンジン−４アミドと１４Ｌｅｕ，２５Ｐｈｅエキセンジン−４（１−２８）アミドおよびＡＶＥ−００１０（配列番号３：
【００２１】
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
【００２２】
のアミノ酸配列を有するエキセジン類縁体）から選択されるエキセジン類縁体であることができる。
【００２３】
図面は、以下に概括する意味を有する。
【００２４】
図１は、噴霧乾燥プロセスのフローチャートを示す。
図２ａは、析出（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の走査電子顕微鏡観察を示す。
図２ｂは、噴霧乾燥（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の走査電子顕微鏡観察を示す。
【００２５】
本発明の好ましい態様において、その方法は、水性有機溶媒中のペプチド類縁体の溶液が、分取ＨＰＬＣから直接得られ、噴霧乾燥プロセスに供給されることを特徴とする。
【００２６】
この噴霧乾燥プロセスは、
ａ）水性有機溶媒中のペプチドの溶液を、供給槽（１）からフィルター（２）を経て供給し、
ｂ）噴霧室（３）中のろ過された溶液を、霧化器（４）を用いて霧化し、
ｃ）霧化された混合物を注入口（５）を経て供給される高温乾燥気体と混合することにより、溶媒を気化させて、ペプチド粉末を析出させ、
ｄ）気体粉末混合物を、ペプチドを自由流動性均質粉末として収集することができるサイクロン（６）に供給する、
工程を含む
【００２７】
工程ａ）
工程ａ）は、水性有機溶媒中のペプチドの溶液を、供給槽（１）からフィルター（２）を経て供給することを必要とする。
【００２８】
上で概括したように、水性有機溶媒中のペプチド類縁体の溶液は、分取ＨＰＬＣ（図１中で「Ａ」の記号で表す）から直接取り出すことが好ましい。水とアセトニトリルおよびＴＨＦの混合物が精製工程で溶媒として使用される場合、ペプチド溶液のさらなる濃縮を、水と脂肪族アルコールの混合物を溶媒として使用して、ＨＰＬＣにより、あるいはＬＰＬＣ（低圧液体クロマトグラフィー）または（中圧液体クロマトグラフィー）により行う必要がある。
【００２９】
水性有機溶媒は、通常、２０％〜８０％ｗ／ｗの水と２０％〜８０％ｗ／ｗの脂肪族アルコールの混合物、好ましくは４０％〜７０％ｗ／ｗの水と３０％〜６０％ｗ／ｗの脂肪族アルコールの混合物である。
【００３０】
脂肪族アルコールは、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｓ−ブタノールまたはｔ−ブタノール、好ましくはメタノールまたはエタノールから選択することができる。
【００３１】
水性有機溶媒中のペプチド含有量は、一般に、０．５％〜１５％ｗ／ｗ、好ましくは１．０％〜１０％ｗ／ｗ、より好ましくは０．５％〜８％ｗ／ｗの範囲である。
【００３２】
ペプチドの溶液は、好適には、ｐＨ安定化用の、通常の緩衝剤を含んでいる。好適な緩衝剤は、好ましくは、０．０５％〜０．２５％ｗ／ｗの範囲で加えられる酢酸アンモニウム、または０．０５％〜１％ｗ／ｗの範囲で加えられる酢酸から選択される。より好ましくは、緩衝剤は、０．０５％〜１％ｗ／ｗの量の酢酸である。
【００３３】
ペプチドの溶液は、供給槽（１）からフィルター（２）を経て、通常１ｋｇ／ｈ〜２０ｋｇ／ｈ、好ましくは５ｋｇ／ｈ〜１５ｋｇ／ｈの供給速度で、噴霧室（３）へ供給される。使用される噴霧乾燥装置のサイズに応じて、供給速度は、したがって、５〜１０の倍率で増加させることができる。
【００３４】
ペプチドの溶液の温度は、５℃〜３５℃の間で選択することができる。
【００３５】
フィルター（２）のサイズは、一般に、０．２μｍ〜４．０μｍの範囲である。
【００３６】
工程ｂ）
工程ｂ）は、噴霧室（３）中のろ過された溶液を、霧化器（４）を用いて霧化することを要する。
【００３７】
一般に、ロータリーホイール霧化器が使用される。霧化器速度は、１０，０００ｒｐｍ〜３０，０００ｒｐｍの範囲で選択される。
【００３８】
工程ｃ）
工程ｃ）は、霧化された混合物を注入口（５）を経て供給される高温乾燥気体と混合することにより、溶媒を気化させて、ペプチド粉末を析出させることを要する。
【００３９】
「高温乾燥気体」として、窒素、二酸化炭素または空気を使用することができる。好ましい「高温乾燥気体」は、１００℃〜２００℃、好ましくは１１０℃〜１４０℃の温度で適用され得る窒素である。
【００４０】
高温乾燥気体は、３００ｋｇ／ｈ〜５００ｋｇ／ｈの供給速度で、噴霧室（３）に供給される。使用される噴霧乾燥装置のサイズに応じて、供給速度は、結果として、５〜１０の倍率で増加させることができる。
【００４１】
工程ｄ）
工程ｄ）は、気体粉末混合物を、ペプチドを自由流動性均質粉末として収集することができるサイクロン（６）に供給することを要する。
【００４２】
サイクロン（６）に供給される気体は、一般に、５０℃〜１５０℃、好ましくは５０℃〜１１０℃、より好ましくは６０℃〜８０℃の温度である。
【００４３】
ペプチドは、袋状ハウジング（Ｂ）のような、この技術分野で周知の装置で収集することができる。
【００４４】
気体回収
【００４５】
本発明の好ましい態様においては、気体は、以下の気体回収工程：
ｅ）サイクロン（６）を離れる気体をフィルター（７）で精製する；
ｆ）凝縮器（８）中で水性溶媒を凝縮する；
ｇ）加熱器（９）中で凝縮器（８）を離れた気体を加熱し、噴霧室（３）に高温乾燥気体を再導入する；
に従って回収することができる。
【００４６】
フィルター（７）は、好適には、フィルター中に留まった微粒子を収集するのに適切な装置（Ｃ）に接続されている。
【００４７】
凝縮器（８）もまた、凝縮した溶媒を回収するのに適切な装置（Ｄ）に接続されている。
【００４８】
加熱器（９）中で、気体は、再び、噴霧乾燥プロセス中の「高温乾燥気体」として使用するための温度にされる。
【００４９】
あるいは、新鮮な気体のみを使用することができる。噴霧乾燥プロセスは、その後、気体が回収されるときの「閉鎖サイクル」モードでの運転に対して、「開放サイクル」モードで運転される。
【００５０】
生成物の特性
本発明に係る噴霧乾燥プロセスから得られるペプチドは、一般に、自由流動性均質粉末形態である。したがって、析出した生成物と比較すると、粒子は、より低い比表面積およびより低い嵩密度を示す。噴霧乾燥生成物の粒子の大部分は、析出した生成物に比べて、直径が極めて小さい。
【００５１】
好ましい態様において、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の自由流動性均質粉末は、ＢＥＴ法（ＩＳＯ９２７７）により測定された比表面積が０．５ｍ２／ｇ〜５ｍ２／ｇ、好ましくは０．５ｍ２／ｇ〜２．５ｍ２／ｇであること、すなわち、析出した生成物について測定された値よりも相当低い値を特徴とする。
【００５２】
噴霧乾燥（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２は、さらに、２００μｍ未満、好ましくは１５０μｍ未満、より好ましくは１００μｍ未満の粒径分布ｄ９０（レーザー散乱により測定）を特徴とし、これは、粒子の９０％が、２００μｍ未満、好ましくは１００μｍ未満の粒径を有することを意味する。６０％より多い析出したペプチドは、５００μｍを超える粒径を有している。
【００５３】
噴霧乾燥（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の粒子の平均径は、一般に、１０〜６０μｍの範囲内、好ましくは２０〜４０μｍの範囲内、より好ましくは２０〜３０μｍの範囲内である。
【００５４】
噴霧乾燥（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の加工性パラメーター嵩密度は、一般に、０．２５ｇ／ｃｍ３未満、好ましくは０．２ｇ／ｃｍ３未満であるが、０．１ｇ／ｃｍ３未満に調整することができ、したがって、０．３〜０．４ｇ／ｃｍ３を超える値を示す析出生成物に比べて優れている。
【００５５】
噴霧乾燥した生成物の嵩密度およびタップ密度は、水性有機溶媒（供給溶液）中の水と脂肪族アルコールとの比、供給溶液中のペプチドの濃度および酢酸塩の濃度、ならびに供給溶液のｐＨ値のようなパラメーターに依存して調整することができることが見出された。供給溶液中の酢酸塩の量が少ないと、嵩密度が０．１ｇ／ｃｍ３未満の噴霧乾燥（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２が得られ、供給溶液中の酢酸塩がより多いと、約０．２〜０．２５ｇ／ｃｍ３の嵩密度となる。
【００５６】
したがって、０．１ｇ／ｃｍ３未満の嵩密度を持つ（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の噴霧乾燥粉末は、ペプチドの溶液（供給溶液）が２％ｗ／ｗ未満の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２と０．１５、好ましくは０．１０％ｗ／ｗ未満の酢酸塩を含むことを特徴とする本明細書に記載の方法により得られる。約０．２０〜０．２５ｇ／ｃｍ３の嵩密度を持つ（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の噴霧乾燥粉末は、ペプチドの溶液（供給溶液）が７〜８％ｗ／ｗの（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２と０．４〜０．６％ｗ／ｗの範囲の酢酸塩を含むことを特徴とする本明細書に記載の方法により得られる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、噴霧乾燥プロセスのフローチャートを示す。
【図２ａ】図２ａは、析出（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の走査電子顕微鏡観察を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、噴霧乾燥（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の走査電子顕微鏡観察を示す。
【００５８】
以下の実施例は、本発明を限定することなく本発明を例証する。
【００５９】
実施例
実施例Ａ：
ペプチドの調製
粗ペプチド（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２は、ＷＯ２００７／１４７８１６に記載の方法に従って、３種の断片を製造し、これらの断片を溶液中でカップリングすることにより調製することができる。
【００６０】
実施例Ｂ：
ＲＰ−ＨＰＬＣ精製
粗ペプチドの精製は、ＲＰ（逆相）固定相上で行われる。そこで、吸着剤は、シリカゲル（例えば、Kromasil 100-16-C18）またはアクリルエステルマクロ網状吸着剤（例えば、Amberchrom CG71M）のようなＲＰ材である。精製は、約２のｐＨでの１回目に通過させるクロマトグラフィー精製と、それに続く約９のｐＨでの２回目の通過を含む。
【００６１】
１回目のクロマトグラフィー
粗（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２を水／アセトニトリル／酢酸（例えば、９０／９／１ ｖ／ｖ／ｖ）中に溶解し、ＨＰＬＣカラムにロードし（２０ｇ／Ｌまでロード、床深さ：約２５ｃｍ）、精製プログラム（長さ４５ｃｍのカラムについての例が、表１に記載されている）を開始する。画分を集め、水または希水酸化アンモニウム溶液で希釈しうる。
【００６２】
【表１】
【００６３】
ＡとＢの比は、主ピーク（ペプチド（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２）についてのわずかな滞留に対応して、精製プログラムに示した％有機溶媒をほぼ達成するために変更してもよい。イベント時間、グラジエントおよびローディングアスペクト（loading aspects）は、精製を最適化するために、変更してもよい。たまった画分は、さらに、２回目のクロマトグラフィーの条件により精製される。
【００６４】
２回目のクロマトグラフィー
（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２のクロマトグラフィー１からのたまった希釈画分を、ＨＰＬＣカラムにロードし、精製プログラム（表２および表３中の４５ｃｍカラムについての例を参照）を開始する。画分を集め、水または希酢酸で希釈しうる。
【００６５】
【表２】
【００６６】
ＣとＤの比は、主ピーク（ペプチド（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２）についてのわずかな滞留に対応して、精製プログラムに示した％有機溶媒をほぼ達成するために変更してもよい。イベント時間、グラジエントおよびローディングアスペクトは、精製を最適化するために、変更してもよい。
【００６７】
たまった画分は、本明細書で後述する析出プロセスまたは噴霧乾燥プロセス中で直接使用することができる。
【００６８】
【表３】
【００６９】
ＥとＦの比は、主ピーク（ペプチド（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２）についてのわずかな滞留に対応して、精製プログラムに示した％有機溶媒をほぼ達成するために変更してもよい。イベント時間、グラジエントおよびローディングアスペクトは、精製を最適化するために、変更してもよい。
【００７０】
たまった画分は、水または希酢酸で希釈してもよい。次いで、これらを、直接、以下の濃縮工程用のＨＰＬＣカラムにロードする。
【００７１】
（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の濃縮：
濃縮のための以下の工程は、代替２ａを２回目のクロマトグラフィー工程中で使用した場合に、場合により行われる。クロマトグラフィー２からのたまった希釈画分をカラムにロードし、弱い移動相（表４中の初期緩衝剤または水性酢酸／エタノール（８５／１５ ｖ／ｖ）で平衡化される。緩衝剤組成を、強い移動相（表４中の最終緩衝剤または水性酢酸／エタノール（２０／８０ ｖ／ｖ）に変え、（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２がカラムから溶離されるにつれて、それを集める。
【００７２】
【表４】
【００７３】
イベント時間、グラジエントおよびローディングアスペクトは、精製を最適化するために、変更してもよい。いくつかの濃度での操作を組み合わせ、そして（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２含有溶液のエタノール含有量を測定した（例えば、ＧＣにより）。
【００７４】
比較例Ｃ：
沈殿
適切な反応器中で、メチルtert−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）１８４ｋｇを、２４〜２６℃の温度で、エタノール１２２ｋｇと混合した。分取ＨＰＬＣから得られた（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の精製溶液３６．７ｋｇを、５〜１５分以内で加えた。混合物を３４℃〜３６℃の温度に加熱し、１時間攪拌し、次いで、２４℃〜２６℃に冷却した。フィルター乾燥器（０．２ｍ２）上でろ過した後、ケーキを１５分間窒素で乾燥し、さらに、２５℃〜３０℃で９時間、真空下に（１００mbar未満）乾燥した。次いで、ケーキをそれぞれ３．４ｋｇのエタノールで２回洗浄し、２５℃で１９時間、真空下に（１００mbar未満）乾燥した。得られた生成物を、エタノール含有量が１％未満に減少するまで、湿った窒素を３時間と乾燥窒素を１時間、交互に、フィルター乾燥器に下から通すことにより加湿した。これにより、生成物は湿気を含むようになり、他の乾燥サイクルが必要であった。乾燥窒素を３時間、フィルター乾燥器に下から通すことにより、水分を、約６％に調整した。６０１ｇの生成物（ＨＰＬＣアッセイによる収率：９２％）が得られた（９７．９％（面積）の（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、６．１％のＨ２Ｏ、０．７３％のエタノールおよび０．０２％のＭＴＢＥを含む）。
【００７５】
噴霧乾燥実施例１ａおよび１ｂ
実施例１ａおよび１ｂに適用された噴霧乾燥条件：
【００７６】
【表５】
【００７７】
噴霧乾燥（Ａｉｂ８，３５）ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２は、熱分解に関連する新たな不純物が全くない良品質のものであった（以下の表６参照）。それは、約１〜２％（ｗ／ｗ）のエタノール、４〜５％（ｗ／ｗ）の水、および３％（ｗ／ｗ）の酢酸塩を含んでいた（表４）。
【００７８】
【表６】
【００７９】
実施例２ａ〜２ｆ
残留エタノールの量を最少にするために、プロセスパラメーターをいくつか変えて、さらに小スケールでの最適化の試行を行った：
【００８０】
【表７】
【００８１】
したがって、継続的な「インサイツ」窒素パージを行って、２３〜２８％のエタノールの相対的な減少を成功裏に達成した（表８）。
【００８２】
【表８】
【００８３】
実施例３ａおよび３ｂ：
引き続く多キログラムスケールでのバッチを、以下の最適化されたパラメーターを用いて行った：
【００８４】
【表９】
【００８５】
２つのバッチの得られた品質特性を、表１０に示す：
【００８６】
【表１０】
【００８７】
実施例４
１．８７％（ｗ／ｗ）の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、６１％（ｗ／ｗ）の水および３７％（ｗ／ｗ）のエタノールを含む溶液１６０ｋｇを、Niro SD-4-R-CC（噴霧室 Φ１．２ｘ０．７５ｍ、容量 ８ｋｇＨ２Ｏ／ｈ）に供給した。約１５時間後、微粉末（分析値は、上の実施例３ａ参照）２．７３ｋｇをサイクロンから収集した。
【００８８】
【表１１】
【００８９】
実施例５：
さらなる最適化の試行を行って、下流での加工を容易にするために噴霧乾燥粉末の嵩密度をいかにして調整できるかを決定した。結果を表１２に示す。実施例５ａ〜５ｆは、供給溶液の組成を変えて、すなわち、溶媒比率（エタノールと水との）、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の濃度、および異なるｐＨをもたらす供給溶液中の酢酸塩の濃度を変更して、実施例５ａ〜５ｆを行った。分取ＨＰＬＣ溶液の噴霧乾燥を直接にかつさらなる修正をすることなく行うために、その変更は、最終の分取ＨＰＬＣ工程で統合した。
【００９０】
【表１２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＰ−１ペプチド類縁体の自由流動性均質粉末形態の製造方法であって、水性有機溶媒中のペプチド類縁体の溶液を、噴霧乾燥プロセスに供し、自由流動性均質粉末の形態で回収する方法。
【請求項２】
水性有機溶媒中のペプチド溶液が、分取ＨＰＬＣ、ＬＰＬＣまたはＭＰＬＣから得られる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
水性有機溶媒中のペプチド溶液が、分取ＨＰＬＣから得られる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
噴霧乾燥プロセスが、
ａ）水性有機溶媒中のペプチドの溶液を供給槽（１）からフィルター（２）を経て供給し、
ｂ）噴霧室（３）中のろ過された溶液を、霧化器（４）を用いて霧化し、
ｃ）霧化された混合物を注入口（５）を経て供給される高温乾燥気体と混合することにより、溶媒を気化させて、ペプチド粉末を沈殿させ、
ｄ）気体粉末混合物を、ペプチドを自由流動性均質粉末として収集することができるサイクロン（６）に供給する、
工程を含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
水性有機溶媒が、２０％〜８０％ｗ／ｗの水と２０％〜８０％ｗ／ｗの脂肪族アルコールの混合物である、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
脂肪族アルコールが、メタノールまたはエタノールである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ペプチドの溶液が、緩衝剤を含むものである、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
ペプチドの溶液が、酢酸塩を含むものである、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
ペプチドの溶液が、０．４〜０．６％ｗ／ｗの酢酸塩を含むものである、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドの溶液が、０．１５％ｗ／ｗ未満の酢酸塩を含むものである、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
噴霧乾燥プロセスの工程ａ）において、ペプチドの溶液が、１ｋｇ／ｈ〜２０ｋｇ／ｈの供給速度で供給槽（１）からフィルター（２）を経て供給される、請求項４記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドの溶液が、５℃〜３５℃の温度である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
噴霧乾燥プロセスの工程ａ）において、フィルター（２）のサイズが０．２μｍ〜４．０μｍの範囲である、請求項４、１１および１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
噴霧乾燥プロセスの工程ｂ）において、ロータリーホイール霧化器を使用する、請求項４記載の方法。
【請求項１５】
霧化器速度が、１０，０００ｒｐｍ〜３０，０００ｒｐｍの範囲で選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
噴霧乾燥プロセスの工程ｃ）において、１００℃〜２００℃の温度の窒素が、高温乾燥気体として使用される、請求項４記載の方法。
【請求項１７】
高温乾燥気体が、３００ｋｇ／ｈ〜５００ｋｇ／ｈの供給速度で供給される、請求項４および１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
噴霧乾燥プロセスの工程ｄ）において、サイクロン（６）内へ供給される気体が５０℃〜１１０℃の温度である、請求項４記載の方法。
【請求項１９】
噴霧乾燥プロセスが、さらに、
ｅ）サイクロン（６）を離れる気体をフィルター（７）で精製する；
ｆ）凝縮器（８）中で水性有機溶媒を凝縮する；
ｇ）加熱器（９）中で凝縮器（８）を離れた気体を加熱し、噴霧室（３）に高温乾燥気体を再導入する；
工程を含む、請求項４記載の方法。
【請求項２０】
ＧＬＰ−１ペプチド類縁体が、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、（Ｇｌｙ８）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｇｌｙ８）ＧＬＰ−１（７−３６）、（Ｓｅｒ３４）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｖａｌ８）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｖａｌ８，Ｇｌｕ２２）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、（Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ヘキサデカノイル）））−Ｌｙｓ２６Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ−Ａｌａ８Ｌｙｓ３７−（２−（２−（２−マレイミドプロピオンアミド（エトキシ）エトキシ）アセトアミド））ＧＬＰ−１（７−３７）、エキセンジン−３、エキセンジン−４、エキセンジン−４酸、エキセンジン−４（１−３０）、エキセンジン−４（１−３０）アミド、エキセンジン−４（１−２８）、エキセンジン−４（１−２８）アミド、１４Ｌｅｕ，２５Ｐｈｅエキセンジン−４アミドと１４Ｌｅｕ，２５Ｐｈｅエキセンジン−４（１−２８）アミドおよびＡＶＥ−００１０よりなる群から選択される請求項１〜１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
ＧＬＰ−１ペプチド類縁体が、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２である、請求項１〜１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれか一項記載の方法で得られ得る、ＧＬＰ−１ペプチド類縁体。
【請求項２３】
（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の自由流動性均質粉末形態。
【請求項２４】
粒子が、０．５ｍ２／ｇ〜５ｍ２／ｇの比表面積（ＢＥＴ）を有する、請求項２３記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の自由流動性均質粉末形態。
【請求項２５】
粒子の９０％が、２００μｍ未満の直径を有する、請求項２２または２３記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の自由流動性均質粉末形態。
【請求項２６】
本明細書中で前記された新規な方法および新規な粉末形態。
【請求項１】
ＧＬＰ−１ペプチド類縁体の自由流動性均質粉末形態の製造方法であって、水性有機溶媒中のペプチド類縁体の溶液を、噴霧乾燥プロセスに供し、自由流動性均質粉末の形態で回収する方法。
【請求項２】
水性有機溶媒中のペプチド溶液が、分取ＨＰＬＣ、ＬＰＬＣまたはＭＰＬＣから得られる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
水性有機溶媒中のペプチド溶液が、分取ＨＰＬＣから得られる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
噴霧乾燥プロセスが、
ａ）水性有機溶媒中のペプチドの溶液を供給槽（１）からフィルター（２）を経て供給し、
ｂ）噴霧室（３）中のろ過された溶液を、霧化器（４）を用いて霧化し、
ｃ）霧化された混合物を注入口（５）を経て供給される高温乾燥気体と混合することにより、溶媒を気化させて、ペプチド粉末を沈殿させ、
ｄ）気体粉末混合物を、ペプチドを自由流動性均質粉末として収集することができるサイクロン（６）に供給する、
工程を含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
水性有機溶媒が、２０％〜８０％ｗ／ｗの水と２０％〜８０％ｗ／ｗの脂肪族アルコールの混合物である、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
脂肪族アルコールが、メタノールまたはエタノールである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ペプチドの溶液が、緩衝剤を含むものである、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
ペプチドの溶液が、酢酸塩を含むものである、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
ペプチドの溶液が、０．４〜０．６％ｗ／ｗの酢酸塩を含むものである、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドの溶液が、０．１５％ｗ／ｗ未満の酢酸塩を含むものである、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
噴霧乾燥プロセスの工程ａ）において、ペプチドの溶液が、１ｋｇ／ｈ〜２０ｋｇ／ｈの供給速度で供給槽（１）からフィルター（２）を経て供給される、請求項４記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドの溶液が、５℃〜３５℃の温度である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
噴霧乾燥プロセスの工程ａ）において、フィルター（２）のサイズが０．２μｍ〜４．０μｍの範囲である、請求項４、１１および１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
噴霧乾燥プロセスの工程ｂ）において、ロータリーホイール霧化器を使用する、請求項４記載の方法。
【請求項１５】
霧化器速度が、１０，０００ｒｐｍ〜３０，０００ｒｐｍの範囲で選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
噴霧乾燥プロセスの工程ｃ）において、１００℃〜２００℃の温度の窒素が、高温乾燥気体として使用される、請求項４記載の方法。
【請求項１７】
高温乾燥気体が、３００ｋｇ／ｈ〜５００ｋｇ／ｈの供給速度で供給される、請求項４および１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
噴霧乾燥プロセスの工程ｄ）において、サイクロン（６）内へ供給される気体が５０℃〜１１０℃の温度である、請求項４記載の方法。
【請求項１９】
噴霧乾燥プロセスが、さらに、
ｅ）サイクロン（６）を離れる気体をフィルター（７）で精製する；
ｆ）凝縮器（８）中で水性有機溶媒を凝縮する；
ｇ）加熱器（９）中で凝縮器（８）を離れた気体を加熱し、噴霧室（３）に高温乾燥気体を再導入する；
工程を含む、請求項４記載の方法。
【請求項２０】
ＧＬＰ−１ペプチド類縁体が、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、（Ｇｌｙ８）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｇｌｙ８）ＧＬＰ−１（７−３６）、（Ｓｅｒ３４）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｖａｌ８）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｖａｌ８，Ｇｌｕ２２）ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、（Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ヘキサデカノイル）））−Ｌｙｓ２６Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ−Ａｌａ８Ｌｙｓ３７−（２−（２−（２−マレイミドプロピオンアミド（エトキシ）エトキシ）アセトアミド））ＧＬＰ−１（７−３７）、エキセンジン−３、エキセンジン−４、エキセンジン−４酸、エキセンジン−４（１−３０）、エキセンジン−４（１−３０）アミド、エキセンジン−４（１−２８）、エキセンジン−４（１−２８）アミド、１４Ｌｅｕ，２５Ｐｈｅエキセンジン−４アミドと１４Ｌｅｕ，２５Ｐｈｅエキセンジン−４（１−２８）アミドおよびＡＶＥ−００１０よりなる群から選択される請求項１〜１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
ＧＬＰ−１ペプチド類縁体が、（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２である、請求項１〜１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれか一項記載の方法で得られ得る、ＧＬＰ−１ペプチド類縁体。
【請求項２３】
（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の自由流動性均質粉末形態。
【請求項２４】
粒子が、０．５ｍ２／ｇ〜５ｍ２／ｇの比表面積（ＢＥＴ）を有する、請求項２３記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の自由流動性均質粉末形態。
【請求項２５】
粒子の９０％が、２００μｍ未満の直径を有する、請求項２２または２３記載の（Ａｉｂ８，３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の自由流動性均質粉末形態。
【請求項２６】
本明細書中で前記された新規な方法および新規な粉末形態。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【公表番号】特表２０１２−５１３４３８（Ｐ２０１２−５１３４３８Ａ）
【公表日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４２７６９（Ｐ２０１１−５４２７６９）
【出願日】平成２１年１２月１５日（２００９．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７１８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７２６２１
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１５日（２００９．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６７１８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７２６２１
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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