ペンタメチレンジアミンの製造方法
【課題】製造工程で副生塩がほとんど無く、安価な製品が供給可能なペンタメチレンジアミンの製造方法を提供する。
【解決手段】リジン水溶液に炭酸ガスを吹き込むことによりリジン炭酸塩水溶液を調製し、該 リジン炭酸塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させて、該酵素の反応によりペンタメチレンジアミン炭酸塩を生成させることを含むペンタメチレンジアミンの製造方法であって、反応溶液の攪拌動力、温度および圧力から選ばれる少なくとも一つの条件を調節することにより、反応溶液に中和剤を添加せずに、反応が完結するまで該酵素の反応に適したｐＨに維持することを特徴とするペンタメチレンジアミンの製造方法。
【解決手段】リジン水溶液に炭酸ガスを吹き込むことによりリジン炭酸塩水溶液を調製し、該 リジン炭酸塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させて、該酵素の反応によりペンタメチレンジアミン炭酸塩を生成させることを含むペンタメチレンジアミンの製造方法であって、反応溶液の攪拌動力、温度および圧力から選ばれる少なくとも一つの条件を調節することにより、反応溶液に中和剤を添加せずに、反応が完結するまで該酵素の反応に適したｐＨに維持することを特徴とするペンタメチレンジアミンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペンタメチレンジアミンの製造方法、該方法により得られるペンタメチレンジアミンを原料として用いるポリアミドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、プラスチックの原料としては、主にナフサ等の化石原料が用いられている。しかし、プラスチックを廃棄する場合、再生利用する場合を除くと、焼却等の手法で廃棄せざるを得ないが、これは炭酸ガスの放出を招くこととなる。そこで、地球温暖化防止及び循環型社会の形成に向けて、プラスチックの製造原料をバイオマス由来の原料に置き換えることが嘱望されている。このようなニーズは、フィルム、自動車部品、電気・電子部品、機械部品等の射出成型品、繊維、モノフィラメント等、多岐にわたる。
【０００３】
プラスチックの中でも、ポリアミド樹脂は、機械的強度、耐熱性、耐薬品性等に優れており、いわゆるエンジニアリングプラスチックスの１つとして多くの分野で用いられている。中でもフィルムは、二軸延伸ポリプロピレンフィルムや二軸延伸ポリエステルフィルム等に比べ、優れた機械的特性、耐熱性、透明性、ガスバリア性などの特徴を有しており、食品、医薬品、雑貨などの包装用フィルムとして広く利用されている。
【０００４】
バイオマス由来の原料を使用して製造されるポリアミド樹脂としては、ペンタメチレンジアミン及びジカルボン酸からなる塩（ペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩）を原料とし、これらを重合させて得られるものが知られている。例えば、５，６−ナイロンは、ペンタメチレンジアミン及びアジピン酸からなる塩（ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩）を重合することにより製造される。
【０００５】
ポリアミド樹脂の原料となるペンタメチレンジアミン及び／又はペンタメチレンジアミン塩（ペンタメチレンジアミン類）を製造する方法として、例えば、特許文献１〜３には、リジン及び／又はリジン塩（リジン類）の溶液を原料とし、これにリジン脱炭酸酵素（Lysine Decarboxylase：ＬＤＣ）を作用させ、酵素的脱炭酸反応をさせることにより、ペンタメチレンジアミン類の溶液を得る方法が開示されている。リジン脱炭酸酵素としては、微生物由来のものが用いられる。
【０００６】
ここで、リジンの酵素的脱炭酸の至適ｐＨは中性付近にあり、このｐＨに反応溶液を維持するように酸を中和剤として添加しながら、脱炭酸反応を行う方法が知られている。しかしながら、無機酸や有機酸を中和剤として用いる場合、ペンタメチレンジアミンを精製する際に添加した酸由来の塩が副生する等の問題があった。
【０００７】
これを解決する方法としてポリアミド樹脂の原料であるアジピン酸で中和する方法がある（特許文献４）。この場合は精製工程における副生塩の削減は可能であるが、晶析による精製になるため、高純度にするためには収率を下げるか、有機溶媒等を用いる必要があった。また、中和に炭酸ガスを用いる方法もある。この場合も副生塩を削減は可能であるが、反応中に炭酸ガスを通気しているため、多くの炭酸ガスを必要とする問題があった（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２２３７７０号公報
【特許文献２】特開２００２−２２３７７１号公報
【特許文献３】特開２００４−１１４号公報
【特許文献４】特開２００５−００６６５０号公報
【特許文献５】ＷＯ２００６／１２３７７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、製造工程で副生塩がほとんど無く、安価な製品が供給可能なペンタメチレンジアミンの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、リジン炭酸塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させる際に、攪拌、温度、圧力を調整して反応により生成する炭酸ガスを反応系内に可能な限りとどめれば、反応溶液のｐＨを反応に適した値に維持でき、反応溶液中に無機酸、有機酸、炭酸ガス等の中和剤を添加しなくても精製の容易なペンタメチレンジアミン炭酸塩が製造できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【００１１】
即ち、本発明の要旨は、下記［１］〜［６］に存する。
［１］リジン水溶液に炭酸ガスを吹き込むことによりリジン炭酸塩水溶液を調製し、該リジン炭酸塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させて、該酵素の反応によりペンタメチレンジアミン炭酸塩を生成させることを含むペンタメチレンジアミンの製造方法であって、反応溶液の攪拌動力、温度および圧力から選ばれる少なくとも一つの条件を調節することにより、反応溶液に中和剤を添加せずに、反応が完結するまで該酵素の反応に適したｐＨに維持することを特徴とするペンタメチレンジアミンの製造方法。
［２］反応に適したｐＨが、ｐＨ６．５〜８．５の範囲内である、上記［１］に記載の方法。
［３］攪拌動力が１ｗ／Ｌ以下である、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］反応溶液からペンタメチレンジアミン炭酸塩を分離し、分離したペンタメチレンジアミン炭酸塩を熱分解することによりペンタメチレンジアミンを得る、上記［１］ないし［３］のいずれかに記載の方法。
［５］熱分解により発生する炭酸ガスを、リジン炭酸塩水溶液の調製に用いる、上記［４］に記載の方法。
［６］上記［１］ないし［５］のいずれかに記載の方法で得られるペンタメチレンジアミンとジカルボン酸とを重縮合させることを特徴とするポリアミドの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、無機酸、有機酸、炭酸ガス等の中和剤を反応溶液中に添加することなくペンタメチレンジアミンを製造することができるので、生成する副生塩の削減が可能となり、安価なペンタメチレンジアミンを効率的に供給することができる。さらにバイオマス由来の原料を用いることが可能であるため、地球温暖化の防止や循環型社会を形成する上で極めて有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例で用いたｃａｄ遺伝子増幅株が有するプラスミドｐＣＡＤ１の構築方法とその物理地図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の代表例であり、これらの内容に本発明は限定されるものではない。
【００１５】
本発明のペンタメチレンジアミンの製造方法は、リジン水溶液に炭酸ガスを吹き込むことによりリジン炭酸塩水溶液を調製し、該リジン炭酸塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させて、該酵素の反応によりペンタメチレンジアミン炭酸塩を生成させることを含む方法であって、反応溶液の攪拌動力、温度および圧力から選ばれる少なくとも一つの条件を調節することにより、反応溶液に中和剤を添加せずに、反応が完結するまで該酵素の反応に適したｐＨに維持することに特徴をもつものである。
【００１６】
反応に用いるリジン炭酸塩は、１００％の炭酸塩である必要は無く、部分的に他のリジン塩、具体的にはリジン塩酸塩、リジン硫酸塩等を含んでいても良い。
【００１７】
リジン炭酸塩はリジン水溶液に炭酸ガスを吹き込むことで調製される。この炭酸ガスとして、後述するペンタメチレンジアミン炭酸塩の熱分解で発生する炭酸ガスを利用することが好ましい。
炭酸ガスの吹き込みは、加圧下で行っても良い。これにより、溶液をより低いｐＨとすることができる。
【００１８】
反応に用いるリジン炭酸塩の溶液は、酵素的脱炭酸反応に際し、それに適したｐＨとなるように調整する。具体的には、ｐＨとしては、通常６．０以上、好ましくは６．５以上、より好ましくは７．０以上であり、上限は、通常８．５以下、好ましくは８．０以下、より好ましくは７．５以下である。
【００１９】
リジンの酵素的脱炭酸によりペンタメチレンジアミンを生成する反応は、例えば、上記のようにして中和されたリジン溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素（以下これを「ＬＤＣ」と略称することがある）を添加することによって行うことができる。
【００２０】
ＬＤＣとしては、リジンに作用してペンタメチレンジアミンを生成し得るものであれば特に制限はない。ＬＤＣとしてはＬＤＣを産生する微生物、植物細胞又は動物細胞等の細胞を用いてもよい。ＬＤＣ又はそれを産生する細胞は、１種でもよく、２種以上の混合物であってもよい。また、細胞をそのまま用いてもよく、ＬＤＣを含む細胞処理物を用いてもよい。細胞処理物としては、細胞破砕液、及びその分画物が挙げられる。また、精製された酵素であっても構わない。
【００２１】
前記微生物としては、大腸菌（E. coli）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス（Bacillus subtills）等のバチルス属細菌等の細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の真核細胞が挙げられる。これらの中では細菌、特に大腸菌（E. coli）が好ましい。
【００２２】
前記微生物は、ＬＤＣを産生する限り、野生株でもよく、変異株であってもよい。また、ＬＤＣ活性が上昇するように改変された組換え株であってもよい。植物細胞又は昆虫細胞等の動物細胞も、ＬＤＣ活性が上昇するように改変された組換え細胞として用いることができる。
【００２３】
次に、ＬＤＣ活性が上昇するように微生物や細胞を改変する方法について説明する。
ＬＤＣ活性は、遺伝子のコピー数を高めること、遺伝子の転写調節領域の改良などによって上昇させることができる。これらの手法は単独、あるいは組み合わせて行うことができる。
【００２４】
ＬＤＣをコードする遺伝子（ＬＤＣ遺伝子）のコピー数を高めることは、ＬＤＣ遺伝子を多コピー型のベクターと連結して、該遺伝子を宿主細胞に導入して形質転換すうことにより達成できる。また、ＬＤＣ遺伝子のコピー数を高めるには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体ＤＮＡ上に遺伝子を多コピー存在させるには、相同組換え用プラスミド等を用いることにより達成できる。
【００２５】
転写調節領域の改良によるＬＤＣ活性の上昇は、遺伝子の転写量を増加させる改変を加えることである。例えば、宿主内で強力に発現するプロモーターを導入しても良く、大腸菌においては、例えばｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐ等のプロモーターの導入が好適である。また、プロモーターに変異を導入することによってプロモーター強化を行い、下流にある遺伝子の転写量を増加させることもできる。
【００２６】
ＬＤＣ遺伝子としては、コードされるＬＤＣが、リジンの脱炭酸反応に有効利用できるものであれば特に制限されないが、大腸菌（E. coli）等の細菌や、特開２００２−２２３７７０号公報に記載の微生物のＬＤＣ遺伝子が挙げられる。
【００２７】
大腸菌（E. coli）のＬＤＣ遺伝子としては、ｃａｄＡ遺伝子及びｌｄｃ遺伝子（米国特許第５，８２７，６９８号）が知られている。これらの中ではｃａｄＡ遺伝子が好ましい。大腸菌（E. coli）のｃａｄＡ遺伝子は既に配列が知られている（N. Watson et al., Journal of bacteriology (1992), vo.174, p.530-540; S. Y. Meng et al., Journal of bacteriology (1992) vo.174, p.2659-2668; GenBank accession No.M76411）、その配列に基づいて作成したプライマーを用いてＰＣＲにより遺伝子を増幅させることにより、大腸菌（E. coli）染色体ＤＮＡから単離することができる。このようなプライマーとしては、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
【００２８】
ＬＤＣ遺伝子は、野生型であってもよいし、変異型であってもよい。変異部位はＬＤＣ活性が保存されていれば良い。遺伝子に変異を生じさせるには、当該遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法以外に、部位特異的変異法(Kramer,W. and Frita,H.J., Methods in Enzymology, vol.154,P.350(1987))リコンビナントＰＣＲ法(PCR Technology, Stockton Press(1989))等がある。
【００２９】
前記ＬＤＣを産生する微生物や細胞、好ましくはＬＤＣ活性が上昇するように改変された微生物又は細胞を、それら微生物又は細胞の特性に応じて、それ自体既知のＬＤＣの産生に適した方法で培養することにより、本発明で用いるＬ−リジン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）を調製することができる。
【００３０】
培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地でよい。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の加水分解物等の糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトール等のアルコール類、グルコン酸、フマール酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン、大豆加水分解物等の有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。これらの他に、必要に応じて、リン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００３１】
培養条件も制限は無く、例えば大腸菌（E. coli）の場合は、好気的条件下で１６〜７２時間程度実施するのがよく、培養温度は３０〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。ｐＨ調整には無機或いは有機の酸性又はアルカリ性物質、更にアンモニア等を使用することができる。
【００３２】
なお、ＬＤＣ遺伝子が、誘導可能なプロモーターによって発現が調節されている場合には、誘導剤を培地に添加すると効果的である。
【００３３】
培養後、細胞は、遠心分離機や膜分離を用いて、培養液から回収することができる。回収した細胞は、そのまま用いてもよいが、破砕抽出物を用いても良い。ＬＤＣを含む破砕抽出物は、細胞を、超音波、フレンチプレス、ダイナミル又は酵素処理することにより得ることができる。また、破砕抽出物から定法に従って精製した酵素を用いることもできる。
【００３４】
本発明においては、上記のとおり、リジン炭酸塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）を作用させて、該酵素の反応により、リジンを脱炭酸させてペンタメチレンジアミンを生成させる。このとき、水溶液（反応溶液）中に存在する炭酸が対イオンとなり、ペンタメチレンジアミン炭酸塩が生成する。
【００３５】
ここで、リジン脱炭酸反応の際には、生産速度および反応収率向上のため、反応溶液にピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサルおよびピリドキサルリン酸から選ばれる少なくとも１種のビタミンＢ６を添加することが好ましく、なかでもピリドキサルリン酸を添加することが特に好ましい。ビタミンＢ６を添加する方法には特に制限はなく、反応中に適宜添加すれば良い。
【００３６】
酵素の添加量を多くすれば生産速度は速くなるが、酵素作成のコストが高くなる。また、多量の酵素添加により、酵素たんぱく質由来の不純物がペンタメチレンジアミンとジカルボン酸の重縮合を阻害する場合がある。このため、酵素の添加量は、反応が良好に進む範囲内でできるだけ少量にすることが好ましい。具体的には、１Ｌあたりの酵素量は通常１００〜５０，０００Ｕであり、より好ましくは５００〜３０，０００Ｕである。なお、Ｕは酵素（ＬＤＣ）活性の単位、即ちｐＨ６．５、温度３７度の条件で１分間に１マイクロモルのリジンをペンタメチレンジアミンに変換することができる酵素量である。
【００３７】
リジン炭酸塩の溶液にＬＤＣを添加して反応を開始した後は、反応の進行に伴い、リジンから遊離される炭酸ガスが反応溶液から放出され、ｐＨが上昇する。従って、反応溶液のｐＨがＬＤＣによる脱炭酸反応に適したｐＨに維持可能なように、温度、圧力および攪拌から選ばれる少なくとも一つの条件を調節して生成する炭酸ガスをできる限り系内にとどめておく必要がある。
【００３８】
温度は低いほど炭酸ガスが溶液中に溶解するため好ましいが、低くなるほど反応速度が低下し、また冷却コストがかかることになる。具体的には、通常３０℃〜４５℃であり、より好ましくは３５〜４０℃である。
【００３９】
攪拌はしないほうが好ましいが、菌体等の固体を含んだ反応の場合は、均一な混合状態となる程度に攪拌することが好ましい。攪拌はＬＤＣによる脱炭酸反応に適したｐＨに保持されればよい。単位体積当たりの攪拌動力に特に限定は無いが、通常０．０１Ｗ／Ｌ以上であり、またその上限は、通常７Ｗ／Ｌ未満、好ましくは１Ｗ／Ｌ以下である。
【００４０】
ここで、溶液の撹拌にともない撹拌翼の軸に負荷トルクが生ずる。トルクとは軸中心からの距離［ｍ］と接線方向の力の積であり、その慣用単位は力に重量キログラムを用いた［ｋｇｆ・ｍ］である。負荷トルクＴ［ｋｇｆ・ｍ］が求まると、撹拌の動力Ｐ’［ｋｇｆ・ｍ／ｓ］＝２πＮＴ／６０で求めることができる（Ｎ：軸回転速度［ｒ．ｐ．ｍ．］）。これをＰ［Ｗ］単位に換算（１ｋｇｆ・ｍ／ｓ＝９．８０×１０-6Ｗ）し、反応液１Ｌあたりの値を、本発明における撹拌動力とする。
【００４１】
攪拌翼、反応槽、邪魔板の形状などはほぼ均一な混合状態ができれば特に限定されないが、攪拌翼は低粘性流体の混合に適したタービンやマリンプロペラ翼が好ましい。また、低回転でも十分な混合を得るために、攪拌翼の直径は、通常、反応槽直径の３分の一以上にすること、また、攪拌翼を高さの異なる位置に複数枚をとりつけることが好ましい。
【００４２】
圧力は常圧でも構わないが、高いほうが炭酸ガスの溶液中に溶解するため好ましい。
特に攪拌動力を多く必要な場合は圧力が高いほうがｐＨを維持するために有利である。具体的には、通常、大気圧（９８ｋＰａ）〜１ＭＰａであり、より好ましくは大気圧（９８ｋＰａ）〜０．３ＭＰａである。
【００４３】
ｐＨは、反応が進行する範囲、すなわち酵素の反応に適した範囲であれば特に限定されないが、反応中のｐＨは炭酸ガスの形態と酵素の至摘ｐＨによって決定される。反応に適したｐＨは、通常６．０〜８．５の範囲内、好ましくは６．５〜８．５の範囲内、より好ましくは７．０〜８．５の範囲内である。なお、ｐＨ６．０程度の反応溶液を調製するためには、加圧下で炭酸ガスを吹き込む必要がある。
【００４４】
本発明において、反応の完結は、反応溶液中のリジン残存量で決められる。リジンの残存量が少ないほど好ましく、リジン残存量が通常１０％未満、好ましくは２％以下となった時を反応の完結と見なす。
ここで、反応溶液中のリジン残存量は、アミノ酸分析計や酵素電極を利用したリジン分析計で分析できる。
【００４５】
本発明において、反応溶液のｐＨは、上記のとおり、反応溶液に中和剤を添加することなく、反応の完結まで酵素の反応に適したｐＨに維持される。
【００４６】
反応により得られるペンタメチレンジアミンの分離・精製の方法は特に限定されず、それ自体既知の何れの方法を用いても良いが、ペンタメチレンジアン炭酸塩を熱分解し、得られる粗ペンタメチレンジアミンを蒸留により精製するのが好ましい。熱分解により発生する炭酸ガスは、リジン炭酸塩水溶液の調製に用いることができる。
【００４７】
次に、反応溶液からのペンタメチレンジアミンの分離・精製について、さらに詳細に説明する。
ペンタメチレンジアミン炭酸塩は、上記のとおり、加熱することにより熱分解する。そのため、熱分解は、加熱を伴う濃縮、還流、脱水蒸留、蒸留等のいずれの行程においても起こり得る。従って、本願における熱分解温度は、加熱を伴う全行程における温度と等しい。
【００４８】
ペンタメチレンジアミン炭酸塩の熱分解温度は、通常１１０℃以上、好ましくは１２０℃以上、さらに好ましくは１３０℃以上、特に好ましくは１５０℃以上であり、また上限は、通常３００℃以下、好ましくは２５０℃以下、さらに好ましくは２２０℃以下、特に好ましくは２００℃以下である。
ペンタメチレンジアミン炭酸塩の加熱温度が過度に低いと、ペンタメチレンジアミン炭酸塩の分解が進行せず、その後に行われる蒸留操作による収率が低下する傾向がある。また、加熱温度が過度に高いと、ペンタメチレンジアミンが分解する可能性がある。
ペンタメチレンジアミン炭酸塩の加熱時間は、特に限定されないが、通常１時間以上、好ましくは２時間以上、さらに好ましくは３時間以上である。
【００４９】
ペンタメチレンジアミン炭酸塩を含む反応溶液は、通常、水溶液として得られる。この場合、加熱処理により蒸発する水の蒸発潜熱のため、そのまま加熱した場合、水溶液の温度が上昇しにくい。このため、ペンタメチレンジアミン炭酸塩の熱分解が進行せずに、脱水後にペンタメチレンジアミン炭酸塩が析出する可能性がある。
このため、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液を、必要に応じて濃縮操作を施し、所定の濃度に調製した後、水溶液を還流等の操作により、水溶液中に含まれる大部分のペンタメチレンジアミン炭酸塩を分解し、その後、脱水蒸留等を行うことが好ましい。
【００５０】
還流の温度は水溶液中の水分により異なり、水分濃度が低い場合はより高温での還流が可能である。還流温度は、通常１００℃〜１８０℃の範囲であり、又還流時間は通常１時間以上、好ましくは２時間以上、さらに好ましくは３時間以上である。
【００５１】
また、同様な効果が得られる操作として、水溶液に含まれるペンタメチレンジアミン炭酸塩が析出しない条件で、脱水蒸留を行いながら大部分のペンタメチレンジアミン炭酸塩を分解することが好ましい。この場合、バッチ式では、先ず、１００℃〜１２０℃で脱水蒸留を行う。水分量の減少と共に内温が上昇し、１６０℃〜１８０℃付近になるとペンタメチレンジアミンが留去し始め、脱水はほぼ完了する。また、その時の温度はペンタメチレンジアミン炭酸塩の分解に十分な温度に到達しており、粗ペンタメチレンジアミンが得られる。
【００５２】
なお、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液の熱分解を、連続運転装置を使用して行う場合、熱分解に必要な温度に保たれた反応槽に、所定量のペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液を供給し、脱水を行いながら分解する方法が好ましい。
【００５３】
また、連続運転装置を使用する場合は、ペンタメチレンジアミン炭酸塩の分解を効率よく行うために、次のような２つのステージが考えられる。
第１ステージとして、先ず、蒸留塔にて減圧下、加熱により、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液の脱水を行う。水分が少なく、さらに脱水条件下での加熱によりペンタメチレンジアミン炭酸塩の一部が分解した缶出部の溶液を、次の第２ステージへ移送する。
第２ステージとして、第１ステージから移送された溶液を、各種条件を制御して加熱分解させる。このとき、ペンタメチレンジアミン炭酸塩をほぼ完全に分解することが好ましい。次に、缶出部より得られた粗ペンタメチレンジアミンを、減圧下、蒸留してペンタメチレンジアミンを得る。
【００５４】
さらに、上記の方法とは別に、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液の脱水や熱分解、ペンタメチレンジアミンの蒸留を１つの装置で行うこともできる。例えば、多段蒸留塔等を使用し、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液を蒸留塔の中央付近より供給し、蒸留塔の缶出部を高温にすることにより、ペンタメチレンジアミン炭酸塩がほぼ完全に分解する。蒸留塔の最上部からは、水と二酸化炭素を回収し、蒸留塔中段からは蒸留したペンタメチレンジアミンを回収する。
【００５５】
上述した熱分解により、水溶液中のペンタメチレンジアミン炭酸塩が、ペンタメチレンジアミンと二酸化炭素とに分解する。熱分解処理後の水溶液に含まれるペンタメチレンジアミンの濃度は、ペンタメチレンジアミンと分解せずに残存するペンタメチレンジアミン炭酸塩との合計濃度を１００ｍｏｌ％として、通常７５ｍｏｌ％以上、好ましくは９０ｍｏｌ％以上、さらに好ましくは９５ｍｏｌ％以上、特に好ましくは９９ｍｏｌ％以上である。
水溶液中に残存するペンタメチレンジアミン炭酸塩量が過度に多いと、蒸留によりペンタメチレンジアミンを精製する際、蒸留塔ボトムに炭酸塩として析出し、収率が低下する場合がある。
【００５６】
上記熱分解や、後述する蒸留精製にかける前に、遠心分離、膜分離等により、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液から、微生物（菌体）等に由来する固形分を除き、必要に応じて濃縮しておくことが好ましい。さらに、濃縮前に脱炭酸を行うと濃縮中の発泡が抑えられて効率的である。
また、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液には、通常、未反応のリジン、ＬＤＣ反応により副生するアルギニン酸等のアミノ酸や、りんご酸、クエン酸等の有機酸、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子物質等の不純物が含まれている。このような不純物が残存した状態で、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液の加熱、蒸留操作を行うと、蒸留塔の塔底等に不純物が原因と考えられる高粘度物質が堆積し、伝熱低下等の諸種のトラブルの原因となる可能性がある。
このため、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液中の不純物を、少なくとも後述する蒸留精製の前に、好ましくは熱分解処理を行う前に、予め低減させることが好ましい。
【００５７】
ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液中に存在するアミノ酸や有機酸は、ＬＤＣとして用いる微生物（菌体）に由来する。このため、リジンのＬＤＣ反応時に使用する菌体の量を所定範囲内に抑えることによりこれら不純物を低減することができる。さらにリジンは、ＬＤＣ反応の転化率が約１００％になるまでＬＤＣ反応を行うことにより、リジン濃度を検出限界以下にすることが可能である。
上述した操作により、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液中に含まれるアミノ酸や有機酸の合計含有量を、水溶液に含まれるペンタメチレンジアミンに対するモル比率で、通常０．００３以下、好ましくは０．００２５以下、さらに好ましくは０．００２以下、特に好ましくは０．００１５以下に低減する。
【００５８】
ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液中に存在する高分子物質は、通常、水溶液中に吸着剤を添加して吸着させる方法、水溶液を所定のサイズの膜により濾過する方法等により、除去することができる。中でも簡便性と除去効果の観点から、水溶液を限外濾過膜（ＵＦ膜）で処理する方法が好ましい。
【００５９】
水溶液をＵＦ膜で処理することにより、水溶液中に含まれる分子量１２，０００以上、好ましくは分子量５，０００以上、特に好ましくは分子量１，０００以上の高分子不純物を除去する。
ＵＦ膜の材質は、例えば、酢酸セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、アクリロニトリル共重合体、ポリアミド１２等が挙げられる。中でもアクリロニトリル共重合体が好ましい。
ＵＦ膜の膜形状は、平膜、中空糸、板、管、スパイラル巻き等が挙げられる。中でも中空糸が好ましい。また、種々のＵＦ膜モジュールが各社から販売されており、操作のしやすさからモジュール化したものが好ましい。
【００６０】
熱分解により得られる粗ペンタメチレンジアミンを、蒸留により、さらに高純度に精製することができる。
蒸留に際し、水溶液中に含まれるペンタメチレンジアミンの濃度は、ペンタメチレンジアミンと分解せずに残存するペンタメチレンジアミン炭酸塩との合計を１００ｍｏｌ％として、７５ｍｏｌ％以上、好ましくは９０ｍｏｌ％以上、さらに好ましくは９５ｍｏｌ％以上、特に好ましくは９９ｍｏｌ％以上である。
蒸留温度は、通常５０℃〜１８０℃、好ましくは６０℃〜１５０℃、さらに好ましくは７０℃〜１２０℃である。蒸留圧は、通常５Ｔｏｒｒ（０．７ｋＰａ）〜７６０Ｔｏｒｒ（１０１ｋＰａ）、好ましくは１０Ｔｏｒｒ（１．３ｋＰａ）〜４００Ｔｏｒｒ（５３ｋＰａ）、さらに好ましくは１５Ｔｏｒｒ（２ｋＰａ）〜１００Ｔｏｒｒ（１３．３ｋＰａ）である。
なお、蒸留により得られる精製ペンタメチレンジアミンには、一部、ペンタメチレンジアミン炭酸塩が含まれる可能性がある。しかし、この炭酸塩は容易にジカルボン酸と塩交換をするため、ポリアミドの製造に供する単量体として問題なく使用することができる。
【００６１】
かくして得られるペンタメチレンジアミンとジカルボン酸とを単量体成分とし、これらを重縮合触媒の存在下に重縮合させることによりポリアミドを製造することができる。
単量体成分として用い得るジカルボン酸としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカン二酸、ドデカン二酸、ブラシリン酸、テトラデカン二酸、ペンタデカン二酸、オクタデカン二酸等の脂肪族ジカルボン酸；シクロヘキサンジカルボン酸等の脂環式ジカルボン酸；フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸等の芳香族ジカルボン酸が挙げられる。
これらのジカルボン酸の中でも、脂肪族ジカルボン酸が好ましく、アジピン酸が特に好ましい。また、ジカルボン酸としてアジピン酸を用いる場合、ジカルボン酸中のアジピン酸の濃度は、通常９０重量％以上、好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは１００重量％である。
さらに、ポリアミド樹脂としての特性を損なわない程度において、それ自体既知の他の単量体成分を併用して重縮合することもできる。
【００６２】
ペンタメチレンジアミンとジカルボン酸との重縮合方法は特に限定されず、従来公知の方法から適宜選択することができる。また、重縮合触媒は、従来公知のものの中から適宜選択して使用することができ、特に限定されない。一般的なポリアミド樹脂の製造方法としては、例えば、「ポリアミド樹脂ハンドブック」（日刊工業株式会社出版：福本修編）等に開示されている。
重縮合方法の一例としては、例えば、ペンタメチレンジアミン及びジカルボン酸を含む水溶液を高温高圧下で、脱水反応を進行させる加熱重縮合法が挙げられる。ここで、加熱重縮合法において、重縮合反応の最高温度は２００℃以上、通常３００℃以下である。重縮合方式には、特に制限は無く、回分式または連続方式が採用できる。
なお、加熱重縮合法により得られたポリアミド樹脂を、例えば、真空中または不活性ガス中で１００℃以上、融点以下の温度で加熱することにより、ポリアミドの分子量を高くすることができる。
また、ペンタメチレンジアミン及びジカルボン酸を高温高圧下で重縮合して得られたオリゴマーを高分子量化する方法、ペンタメチレンジアミンを溶解した水溶液とジカルボン酸塩を水性溶媒又は有機溶媒に溶解させた溶液とを接触させ、これらの界面で重縮合反応させる界面重縮合法等が挙げられる。
【００６３】
ペンタメチレンジアミン及びジカルボン酸の重縮合により得られるポリアミドの分子量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択される。実用性の観点から、通常、ポリアミド樹脂の２５℃における９８％硫酸溶液（ポリアミド樹脂濃度：０．０１ｇ／ｍｌ）の相対粘度の下限が、通常１．５、好ましくは１．８、特に好ましくは２．２であり、上限は、通常８．０、好ましくは５．５、特に好ましくは３．５である。相対粘度が過度に小さいと実用的強度が得られない傾向がある。相対粘度が過度に大きいと、ポリアミド樹脂の流動性が低下し、成形加工性が損なわれる傾向がある。
【００６４】
本発明の方法で得られるポリアミドは、必要に応じて各種の添加剤や他の樹脂と配合し、ポリアミド樹脂組成物として用いることができる。
本発明の方法で得られるポリアミドやその組成物は、所望の形状に成形し、各種の用途に使用することができる。
【実施例】
【００６５】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【００６６】
［リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ遺伝子）増強株の作製］
ｃａｄＡ遺伝子増強株を次のとおり作製した。
（Ａ）大腸菌ＤＮＡの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、大腸菌（E. coli）ＪＭ１０９株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。
【００６７】
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【００６８】
（Ｂ）ｃａｄＡ遺伝子のクローニング
大腸菌ｃａｄＡ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該遺伝子の配列（GenBank Database Accession No.U00096）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。
【００６９】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ １μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２．５分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は１０分とした。
【００７０】
ＰＣＲ反応終了後、増幅産物をエタノール沈殿により精製した後、制限酵素ＫｐｎＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断後した。このＤＮＡ標品を、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することによりｃａｄＡを含む約２．６ｋｂの断片を検出し、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて目的ＤＮＡ断片の回収を行った。
【００７１】
回収したＤＮＡ断片を、大腸菌プラスミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造社製）を制限酵素ＫｐｎＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡ断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌（ＪＭ１０９株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリン、０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）および５０μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００７２】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断することにより、約２．５ｋｂの挿入断片が認められることを確認し、このプラスミドをｐＣＡＤ１と命名し、ｐＣＡＤ１を含む大腸菌株をＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１と命名した。
プラスミドｐＣＡＤ１の構築方法とその物理地図を図１に示す。
【００７３】
［リジンの測定］
反応中の溶液におけるリジンの残存濃度の測定は、王子計測機器社製ＢＦ−５バイオセンサにＬ−リジン測定用酵素電極を取り付け、フローインジェクション方式により行なった。反応用液中のリジン残存濃度からペンタメチレンジアミンの転換率（％）を求めた。
【００７４】
実施例１
（１）ｃａｄＡ遺伝子増幅株の培養
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ1株をＬＢ培地入りフラスコで前培養した後、５ｍｌの培養液を５００ｍＬのＬＢ培地が入った１Ｌ容ジャーファーメンターに接種し、通気量０．５ｖｖｍ、３５℃、６００ｒｐｍで通気攪拌培養を行った。培養４時間目に、滅菌したＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度で０．５ｍＭになるように添加し、その後１４時間培養を継続した。これを１００００ｇの１０分で遠心分離し、１０倍に濃縮し、酵素液とした。
【００７５】
（２）リジン炭酸塩の製造
３０％（ｗ／ｖ）リジンベース（リジン塩基）溶液５００ｍＬを１Ｌ容ジャーファーメンターにいれ、炭酸ガス０．５ｖｖｍ、３５℃、６００ｒｐｍでｐＨの調整を行った。ｐＨは炭酸ガスの通気とともに低下し６時間後に７．２まで低下した。これを反応に用いるリジン炭酸塩水溶液とした。
【００７６】
（３）ペンタメチレンジアミンの製造
リジン炭酸塩水溶液にピリドキサル燐酸を０．１ｍＭになるように加え、さらに酵素液を５ｍｌ添加し（反応液１ＬあたりのＬＤＣ添加量：５０００Ｕ）、反応を開始した。３７℃、３００ｒｐｍ（攪拌動力：０．２８Ｗ／Ｌ）、常圧の条件で反応を行った。反応開始とともにｐＨは上昇したが、ｐＨ８を超えることは無かった。２４時間後には９８％のリジンがペンタメチレンジアミンに転換されていた。このとき、反応溶液はｐＨ７．８であった。
【００７７】
実施例２
実施例１で攪拌数を１００ｒｐｍ（攪拌動力：０．０９Ｗ／Ｌ）にした以外は実施例１と同様に実施した。その結果、２４時間後には９９％のリジンがペンタメチレンジアミンに転換されていた。このとき、反応溶液はｐＨ７．７であった。
【００７８】
比較例１
実施例１で攪拌数を８００ｒｐｍ（攪拌動力：７Ｗ／Ｌ）にした以外は実施例１と同様に実施した。その結果、２４時間後には９０％のリジンがペンタメチレンジアミンに転換されていた。さらに反応を４時間続けたが転換率はほとんど変わらず、反応が完結しなかった。このとき、反応溶液はｐＨ８．７であった。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明より、ペンタメチレンジアミンの製造において生成する副生塩を削減し、ペンタメチレンジアミンを効率的かつ安価に提供することが可能となる。また、本発明で得られるペンタメチレンジアミンを用いてポリアミドの製造が可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペンタメチレンジアミンの製造方法、該方法により得られるペンタメチレンジアミンを原料として用いるポリアミドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、プラスチックの原料としては、主にナフサ等の化石原料が用いられている。しかし、プラスチックを廃棄する場合、再生利用する場合を除くと、焼却等の手法で廃棄せざるを得ないが、これは炭酸ガスの放出を招くこととなる。そこで、地球温暖化防止及び循環型社会の形成に向けて、プラスチックの製造原料をバイオマス由来の原料に置き換えることが嘱望されている。このようなニーズは、フィルム、自動車部品、電気・電子部品、機械部品等の射出成型品、繊維、モノフィラメント等、多岐にわたる。
【０００３】
プラスチックの中でも、ポリアミド樹脂は、機械的強度、耐熱性、耐薬品性等に優れており、いわゆるエンジニアリングプラスチックスの１つとして多くの分野で用いられている。中でもフィルムは、二軸延伸ポリプロピレンフィルムや二軸延伸ポリエステルフィルム等に比べ、優れた機械的特性、耐熱性、透明性、ガスバリア性などの特徴を有しており、食品、医薬品、雑貨などの包装用フィルムとして広く利用されている。
【０００４】
バイオマス由来の原料を使用して製造されるポリアミド樹脂としては、ペンタメチレンジアミン及びジカルボン酸からなる塩（ペンタメチレンジアミン・ジカルボン酸塩）を原料とし、これらを重合させて得られるものが知られている。例えば、５，６−ナイロンは、ペンタメチレンジアミン及びアジピン酸からなる塩（ペンタメチレンジアミン・アジピン酸塩）を重合することにより製造される。
【０００５】
ポリアミド樹脂の原料となるペンタメチレンジアミン及び／又はペンタメチレンジアミン塩（ペンタメチレンジアミン類）を製造する方法として、例えば、特許文献１〜３には、リジン及び／又はリジン塩（リジン類）の溶液を原料とし、これにリジン脱炭酸酵素（Lysine Decarboxylase：ＬＤＣ）を作用させ、酵素的脱炭酸反応をさせることにより、ペンタメチレンジアミン類の溶液を得る方法が開示されている。リジン脱炭酸酵素としては、微生物由来のものが用いられる。
【０００６】
ここで、リジンの酵素的脱炭酸の至適ｐＨは中性付近にあり、このｐＨに反応溶液を維持するように酸を中和剤として添加しながら、脱炭酸反応を行う方法が知られている。しかしながら、無機酸や有機酸を中和剤として用いる場合、ペンタメチレンジアミンを精製する際に添加した酸由来の塩が副生する等の問題があった。
【０００７】
これを解決する方法としてポリアミド樹脂の原料であるアジピン酸で中和する方法がある（特許文献４）。この場合は精製工程における副生塩の削減は可能であるが、晶析による精製になるため、高純度にするためには収率を下げるか、有機溶媒等を用いる必要があった。また、中和に炭酸ガスを用いる方法もある。この場合も副生塩を削減は可能であるが、反応中に炭酸ガスを通気しているため、多くの炭酸ガスを必要とする問題があった（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２２３７７０号公報
【特許文献２】特開２００２−２２３７７１号公報
【特許文献３】特開２００４−１１４号公報
【特許文献４】特開２００５−００６６５０号公報
【特許文献５】ＷＯ２００６／１２３７７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、製造工程で副生塩がほとんど無く、安価な製品が供給可能なペンタメチレンジアミンの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、リジン炭酸塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させる際に、攪拌、温度、圧力を調整して反応により生成する炭酸ガスを反応系内に可能な限りとどめれば、反応溶液のｐＨを反応に適した値に維持でき、反応溶液中に無機酸、有機酸、炭酸ガス等の中和剤を添加しなくても精製の容易なペンタメチレンジアミン炭酸塩が製造できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【００１１】
即ち、本発明の要旨は、下記［１］〜［６］に存する。
［１］リジン水溶液に炭酸ガスを吹き込むことによりリジン炭酸塩水溶液を調製し、該リジン炭酸塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させて、該酵素の反応によりペンタメチレンジアミン炭酸塩を生成させることを含むペンタメチレンジアミンの製造方法であって、反応溶液の攪拌動力、温度および圧力から選ばれる少なくとも一つの条件を調節することにより、反応溶液に中和剤を添加せずに、反応が完結するまで該酵素の反応に適したｐＨに維持することを特徴とするペンタメチレンジアミンの製造方法。
［２］反応に適したｐＨが、ｐＨ６．５〜８．５の範囲内である、上記［１］に記載の方法。
［３］攪拌動力が１ｗ／Ｌ以下である、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］反応溶液からペンタメチレンジアミン炭酸塩を分離し、分離したペンタメチレンジアミン炭酸塩を熱分解することによりペンタメチレンジアミンを得る、上記［１］ないし［３］のいずれかに記載の方法。
［５］熱分解により発生する炭酸ガスを、リジン炭酸塩水溶液の調製に用いる、上記［４］に記載の方法。
［６］上記［１］ないし［５］のいずれかに記載の方法で得られるペンタメチレンジアミンとジカルボン酸とを重縮合させることを特徴とするポリアミドの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、無機酸、有機酸、炭酸ガス等の中和剤を反応溶液中に添加することなくペンタメチレンジアミンを製造することができるので、生成する副生塩の削減が可能となり、安価なペンタメチレンジアミンを効率的に供給することができる。さらにバイオマス由来の原料を用いることが可能であるため、地球温暖化の防止や循環型社会を形成する上で極めて有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例で用いたｃａｄ遺伝子増幅株が有するプラスミドｐＣＡＤ１の構築方法とその物理地図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の代表例であり、これらの内容に本発明は限定されるものではない。
【００１５】
本発明のペンタメチレンジアミンの製造方法は、リジン水溶液に炭酸ガスを吹き込むことによりリジン炭酸塩水溶液を調製し、該リジン炭酸塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させて、該酵素の反応によりペンタメチレンジアミン炭酸塩を生成させることを含む方法であって、反応溶液の攪拌動力、温度および圧力から選ばれる少なくとも一つの条件を調節することにより、反応溶液に中和剤を添加せずに、反応が完結するまで該酵素の反応に適したｐＨに維持することに特徴をもつものである。
【００１６】
反応に用いるリジン炭酸塩は、１００％の炭酸塩である必要は無く、部分的に他のリジン塩、具体的にはリジン塩酸塩、リジン硫酸塩等を含んでいても良い。
【００１７】
リジン炭酸塩はリジン水溶液に炭酸ガスを吹き込むことで調製される。この炭酸ガスとして、後述するペンタメチレンジアミン炭酸塩の熱分解で発生する炭酸ガスを利用することが好ましい。
炭酸ガスの吹き込みは、加圧下で行っても良い。これにより、溶液をより低いｐＨとすることができる。
【００１８】
反応に用いるリジン炭酸塩の溶液は、酵素的脱炭酸反応に際し、それに適したｐＨとなるように調整する。具体的には、ｐＨとしては、通常６．０以上、好ましくは６．５以上、より好ましくは７．０以上であり、上限は、通常８．５以下、好ましくは８．０以下、より好ましくは７．５以下である。
【００１９】
リジンの酵素的脱炭酸によりペンタメチレンジアミンを生成する反応は、例えば、上記のようにして中和されたリジン溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素（以下これを「ＬＤＣ」と略称することがある）を添加することによって行うことができる。
【００２０】
ＬＤＣとしては、リジンに作用してペンタメチレンジアミンを生成し得るものであれば特に制限はない。ＬＤＣとしてはＬＤＣを産生する微生物、植物細胞又は動物細胞等の細胞を用いてもよい。ＬＤＣ又はそれを産生する細胞は、１種でもよく、２種以上の混合物であってもよい。また、細胞をそのまま用いてもよく、ＬＤＣを含む細胞処理物を用いてもよい。細胞処理物としては、細胞破砕液、及びその分画物が挙げられる。また、精製された酵素であっても構わない。
【００２１】
前記微生物としては、大腸菌（E. coli）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス（Bacillus subtills）等のバチルス属細菌等の細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の真核細胞が挙げられる。これらの中では細菌、特に大腸菌（E. coli）が好ましい。
【００２２】
前記微生物は、ＬＤＣを産生する限り、野生株でもよく、変異株であってもよい。また、ＬＤＣ活性が上昇するように改変された組換え株であってもよい。植物細胞又は昆虫細胞等の動物細胞も、ＬＤＣ活性が上昇するように改変された組換え細胞として用いることができる。
【００２３】
次に、ＬＤＣ活性が上昇するように微生物や細胞を改変する方法について説明する。
ＬＤＣ活性は、遺伝子のコピー数を高めること、遺伝子の転写調節領域の改良などによって上昇させることができる。これらの手法は単独、あるいは組み合わせて行うことができる。
【００２４】
ＬＤＣをコードする遺伝子（ＬＤＣ遺伝子）のコピー数を高めることは、ＬＤＣ遺伝子を多コピー型のベクターと連結して、該遺伝子を宿主細胞に導入して形質転換すうことにより達成できる。また、ＬＤＣ遺伝子のコピー数を高めるには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体ＤＮＡ上に遺伝子を多コピー存在させるには、相同組換え用プラスミド等を用いることにより達成できる。
【００２５】
転写調節領域の改良によるＬＤＣ活性の上昇は、遺伝子の転写量を増加させる改変を加えることである。例えば、宿主内で強力に発現するプロモーターを導入しても良く、大腸菌においては、例えばｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐ等のプロモーターの導入が好適である。また、プロモーターに変異を導入することによってプロモーター強化を行い、下流にある遺伝子の転写量を増加させることもできる。
【００２６】
ＬＤＣ遺伝子としては、コードされるＬＤＣが、リジンの脱炭酸反応に有効利用できるものであれば特に制限されないが、大腸菌（E. coli）等の細菌や、特開２００２−２２３７７０号公報に記載の微生物のＬＤＣ遺伝子が挙げられる。
【００２７】
大腸菌（E. coli）のＬＤＣ遺伝子としては、ｃａｄＡ遺伝子及びｌｄｃ遺伝子（米国特許第５，８２７，６９８号）が知られている。これらの中ではｃａｄＡ遺伝子が好ましい。大腸菌（E. coli）のｃａｄＡ遺伝子は既に配列が知られている（N. Watson et al., Journal of bacteriology (1992), vo.174, p.530-540; S. Y. Meng et al., Journal of bacteriology (1992) vo.174, p.2659-2668; GenBank accession No.M76411）、その配列に基づいて作成したプライマーを用いてＰＣＲにより遺伝子を増幅させることにより、大腸菌（E. coli）染色体ＤＮＡから単離することができる。このようなプライマーとしては、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
【００２８】
ＬＤＣ遺伝子は、野生型であってもよいし、変異型であってもよい。変異部位はＬＤＣ活性が保存されていれば良い。遺伝子に変異を生じさせるには、当該遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法以外に、部位特異的変異法(Kramer,W. and Frita,H.J., Methods in Enzymology, vol.154,P.350(1987))リコンビナントＰＣＲ法(PCR Technology, Stockton Press(1989))等がある。
【００２９】
前記ＬＤＣを産生する微生物や細胞、好ましくはＬＤＣ活性が上昇するように改変された微生物又は細胞を、それら微生物又は細胞の特性に応じて、それ自体既知のＬＤＣの産生に適した方法で培養することにより、本発明で用いるＬ−リジン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）を調製することができる。
【００３０】
培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地でよい。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の加水分解物等の糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトール等のアルコール類、グルコン酸、フマール酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン、大豆加水分解物等の有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。これらの他に、必要に応じて、リン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００３１】
培養条件も制限は無く、例えば大腸菌（E. coli）の場合は、好気的条件下で１６〜７２時間程度実施するのがよく、培養温度は３０〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。ｐＨ調整には無機或いは有機の酸性又はアルカリ性物質、更にアンモニア等を使用することができる。
【００３２】
なお、ＬＤＣ遺伝子が、誘導可能なプロモーターによって発現が調節されている場合には、誘導剤を培地に添加すると効果的である。
【００３３】
培養後、細胞は、遠心分離機や膜分離を用いて、培養液から回収することができる。回収した細胞は、そのまま用いてもよいが、破砕抽出物を用いても良い。ＬＤＣを含む破砕抽出物は、細胞を、超音波、フレンチプレス、ダイナミル又は酵素処理することにより得ることができる。また、破砕抽出物から定法に従って精製した酵素を用いることもできる。
【００３４】
本発明においては、上記のとおり、リジン炭酸塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）を作用させて、該酵素の反応により、リジンを脱炭酸させてペンタメチレンジアミンを生成させる。このとき、水溶液（反応溶液）中に存在する炭酸が対イオンとなり、ペンタメチレンジアミン炭酸塩が生成する。
【００３５】
ここで、リジン脱炭酸反応の際には、生産速度および反応収率向上のため、反応溶液にピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサルおよびピリドキサルリン酸から選ばれる少なくとも１種のビタミンＢ６を添加することが好ましく、なかでもピリドキサルリン酸を添加することが特に好ましい。ビタミンＢ６を添加する方法には特に制限はなく、反応中に適宜添加すれば良い。
【００３６】
酵素の添加量を多くすれば生産速度は速くなるが、酵素作成のコストが高くなる。また、多量の酵素添加により、酵素たんぱく質由来の不純物がペンタメチレンジアミンとジカルボン酸の重縮合を阻害する場合がある。このため、酵素の添加量は、反応が良好に進む範囲内でできるだけ少量にすることが好ましい。具体的には、１Ｌあたりの酵素量は通常１００〜５０，０００Ｕであり、より好ましくは５００〜３０，０００Ｕである。なお、Ｕは酵素（ＬＤＣ）活性の単位、即ちｐＨ６．５、温度３７度の条件で１分間に１マイクロモルのリジンをペンタメチレンジアミンに変換することができる酵素量である。
【００３７】
リジン炭酸塩の溶液にＬＤＣを添加して反応を開始した後は、反応の進行に伴い、リジンから遊離される炭酸ガスが反応溶液から放出され、ｐＨが上昇する。従って、反応溶液のｐＨがＬＤＣによる脱炭酸反応に適したｐＨに維持可能なように、温度、圧力および攪拌から選ばれる少なくとも一つの条件を調節して生成する炭酸ガスをできる限り系内にとどめておく必要がある。
【００３８】
温度は低いほど炭酸ガスが溶液中に溶解するため好ましいが、低くなるほど反応速度が低下し、また冷却コストがかかることになる。具体的には、通常３０℃〜４５℃であり、より好ましくは３５〜４０℃である。
【００３９】
攪拌はしないほうが好ましいが、菌体等の固体を含んだ反応の場合は、均一な混合状態となる程度に攪拌することが好ましい。攪拌はＬＤＣによる脱炭酸反応に適したｐＨに保持されればよい。単位体積当たりの攪拌動力に特に限定は無いが、通常０．０１Ｗ／Ｌ以上であり、またその上限は、通常７Ｗ／Ｌ未満、好ましくは１Ｗ／Ｌ以下である。
【００４０】
ここで、溶液の撹拌にともない撹拌翼の軸に負荷トルクが生ずる。トルクとは軸中心からの距離［ｍ］と接線方向の力の積であり、その慣用単位は力に重量キログラムを用いた［ｋｇｆ・ｍ］である。負荷トルクＴ［ｋｇｆ・ｍ］が求まると、撹拌の動力Ｐ’［ｋｇｆ・ｍ／ｓ］＝２πＮＴ／６０で求めることができる（Ｎ：軸回転速度［ｒ．ｐ．ｍ．］）。これをＰ［Ｗ］単位に換算（１ｋｇｆ・ｍ／ｓ＝９．８０×１０-6Ｗ）し、反応液１Ｌあたりの値を、本発明における撹拌動力とする。
【００４１】
攪拌翼、反応槽、邪魔板の形状などはほぼ均一な混合状態ができれば特に限定されないが、攪拌翼は低粘性流体の混合に適したタービンやマリンプロペラ翼が好ましい。また、低回転でも十分な混合を得るために、攪拌翼の直径は、通常、反応槽直径の３分の一以上にすること、また、攪拌翼を高さの異なる位置に複数枚をとりつけることが好ましい。
【００４２】
圧力は常圧でも構わないが、高いほうが炭酸ガスの溶液中に溶解するため好ましい。
特に攪拌動力を多く必要な場合は圧力が高いほうがｐＨを維持するために有利である。具体的には、通常、大気圧（９８ｋＰａ）〜１ＭＰａであり、より好ましくは大気圧（９８ｋＰａ）〜０．３ＭＰａである。
【００４３】
ｐＨは、反応が進行する範囲、すなわち酵素の反応に適した範囲であれば特に限定されないが、反応中のｐＨは炭酸ガスの形態と酵素の至摘ｐＨによって決定される。反応に適したｐＨは、通常６．０〜８．５の範囲内、好ましくは６．５〜８．５の範囲内、より好ましくは７．０〜８．５の範囲内である。なお、ｐＨ６．０程度の反応溶液を調製するためには、加圧下で炭酸ガスを吹き込む必要がある。
【００４４】
本発明において、反応の完結は、反応溶液中のリジン残存量で決められる。リジンの残存量が少ないほど好ましく、リジン残存量が通常１０％未満、好ましくは２％以下となった時を反応の完結と見なす。
ここで、反応溶液中のリジン残存量は、アミノ酸分析計や酵素電極を利用したリジン分析計で分析できる。
【００４５】
本発明において、反応溶液のｐＨは、上記のとおり、反応溶液に中和剤を添加することなく、反応の完結まで酵素の反応に適したｐＨに維持される。
【００４６】
反応により得られるペンタメチレンジアミンの分離・精製の方法は特に限定されず、それ自体既知の何れの方法を用いても良いが、ペンタメチレンジアン炭酸塩を熱分解し、得られる粗ペンタメチレンジアミンを蒸留により精製するのが好ましい。熱分解により発生する炭酸ガスは、リジン炭酸塩水溶液の調製に用いることができる。
【００４７】
次に、反応溶液からのペンタメチレンジアミンの分離・精製について、さらに詳細に説明する。
ペンタメチレンジアミン炭酸塩は、上記のとおり、加熱することにより熱分解する。そのため、熱分解は、加熱を伴う濃縮、還流、脱水蒸留、蒸留等のいずれの行程においても起こり得る。従って、本願における熱分解温度は、加熱を伴う全行程における温度と等しい。
【００４８】
ペンタメチレンジアミン炭酸塩の熱分解温度は、通常１１０℃以上、好ましくは１２０℃以上、さらに好ましくは１３０℃以上、特に好ましくは１５０℃以上であり、また上限は、通常３００℃以下、好ましくは２５０℃以下、さらに好ましくは２２０℃以下、特に好ましくは２００℃以下である。
ペンタメチレンジアミン炭酸塩の加熱温度が過度に低いと、ペンタメチレンジアミン炭酸塩の分解が進行せず、その後に行われる蒸留操作による収率が低下する傾向がある。また、加熱温度が過度に高いと、ペンタメチレンジアミンが分解する可能性がある。
ペンタメチレンジアミン炭酸塩の加熱時間は、特に限定されないが、通常１時間以上、好ましくは２時間以上、さらに好ましくは３時間以上である。
【００４９】
ペンタメチレンジアミン炭酸塩を含む反応溶液は、通常、水溶液として得られる。この場合、加熱処理により蒸発する水の蒸発潜熱のため、そのまま加熱した場合、水溶液の温度が上昇しにくい。このため、ペンタメチレンジアミン炭酸塩の熱分解が進行せずに、脱水後にペンタメチレンジアミン炭酸塩が析出する可能性がある。
このため、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液を、必要に応じて濃縮操作を施し、所定の濃度に調製した後、水溶液を還流等の操作により、水溶液中に含まれる大部分のペンタメチレンジアミン炭酸塩を分解し、その後、脱水蒸留等を行うことが好ましい。
【００５０】
還流の温度は水溶液中の水分により異なり、水分濃度が低い場合はより高温での還流が可能である。還流温度は、通常１００℃〜１８０℃の範囲であり、又還流時間は通常１時間以上、好ましくは２時間以上、さらに好ましくは３時間以上である。
【００５１】
また、同様な効果が得られる操作として、水溶液に含まれるペンタメチレンジアミン炭酸塩が析出しない条件で、脱水蒸留を行いながら大部分のペンタメチレンジアミン炭酸塩を分解することが好ましい。この場合、バッチ式では、先ず、１００℃〜１２０℃で脱水蒸留を行う。水分量の減少と共に内温が上昇し、１６０℃〜１８０℃付近になるとペンタメチレンジアミンが留去し始め、脱水はほぼ完了する。また、その時の温度はペンタメチレンジアミン炭酸塩の分解に十分な温度に到達しており、粗ペンタメチレンジアミンが得られる。
【００５２】
なお、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液の熱分解を、連続運転装置を使用して行う場合、熱分解に必要な温度に保たれた反応槽に、所定量のペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液を供給し、脱水を行いながら分解する方法が好ましい。
【００５３】
また、連続運転装置を使用する場合は、ペンタメチレンジアミン炭酸塩の分解を効率よく行うために、次のような２つのステージが考えられる。
第１ステージとして、先ず、蒸留塔にて減圧下、加熱により、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液の脱水を行う。水分が少なく、さらに脱水条件下での加熱によりペンタメチレンジアミン炭酸塩の一部が分解した缶出部の溶液を、次の第２ステージへ移送する。
第２ステージとして、第１ステージから移送された溶液を、各種条件を制御して加熱分解させる。このとき、ペンタメチレンジアミン炭酸塩をほぼ完全に分解することが好ましい。次に、缶出部より得られた粗ペンタメチレンジアミンを、減圧下、蒸留してペンタメチレンジアミンを得る。
【００５４】
さらに、上記の方法とは別に、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液の脱水や熱分解、ペンタメチレンジアミンの蒸留を１つの装置で行うこともできる。例えば、多段蒸留塔等を使用し、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液を蒸留塔の中央付近より供給し、蒸留塔の缶出部を高温にすることにより、ペンタメチレンジアミン炭酸塩がほぼ完全に分解する。蒸留塔の最上部からは、水と二酸化炭素を回収し、蒸留塔中段からは蒸留したペンタメチレンジアミンを回収する。
【００５５】
上述した熱分解により、水溶液中のペンタメチレンジアミン炭酸塩が、ペンタメチレンジアミンと二酸化炭素とに分解する。熱分解処理後の水溶液に含まれるペンタメチレンジアミンの濃度は、ペンタメチレンジアミンと分解せずに残存するペンタメチレンジアミン炭酸塩との合計濃度を１００ｍｏｌ％として、通常７５ｍｏｌ％以上、好ましくは９０ｍｏｌ％以上、さらに好ましくは９５ｍｏｌ％以上、特に好ましくは９９ｍｏｌ％以上である。
水溶液中に残存するペンタメチレンジアミン炭酸塩量が過度に多いと、蒸留によりペンタメチレンジアミンを精製する際、蒸留塔ボトムに炭酸塩として析出し、収率が低下する場合がある。
【００５６】
上記熱分解や、後述する蒸留精製にかける前に、遠心分離、膜分離等により、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液から、微生物（菌体）等に由来する固形分を除き、必要に応じて濃縮しておくことが好ましい。さらに、濃縮前に脱炭酸を行うと濃縮中の発泡が抑えられて効率的である。
また、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液には、通常、未反応のリジン、ＬＤＣ反応により副生するアルギニン酸等のアミノ酸や、りんご酸、クエン酸等の有機酸、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子物質等の不純物が含まれている。このような不純物が残存した状態で、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液の加熱、蒸留操作を行うと、蒸留塔の塔底等に不純物が原因と考えられる高粘度物質が堆積し、伝熱低下等の諸種のトラブルの原因となる可能性がある。
このため、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液中の不純物を、少なくとも後述する蒸留精製の前に、好ましくは熱分解処理を行う前に、予め低減させることが好ましい。
【００５７】
ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液中に存在するアミノ酸や有機酸は、ＬＤＣとして用いる微生物（菌体）に由来する。このため、リジンのＬＤＣ反応時に使用する菌体の量を所定範囲内に抑えることによりこれら不純物を低減することができる。さらにリジンは、ＬＤＣ反応の転化率が約１００％になるまでＬＤＣ反応を行うことにより、リジン濃度を検出限界以下にすることが可能である。
上述した操作により、ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液中に含まれるアミノ酸や有機酸の合計含有量を、水溶液に含まれるペンタメチレンジアミンに対するモル比率で、通常０．００３以下、好ましくは０．００２５以下、さらに好ましくは０．００２以下、特に好ましくは０．００１５以下に低減する。
【００５８】
ペンタメチレンジアミン炭酸塩水溶液中に存在する高分子物質は、通常、水溶液中に吸着剤を添加して吸着させる方法、水溶液を所定のサイズの膜により濾過する方法等により、除去することができる。中でも簡便性と除去効果の観点から、水溶液を限外濾過膜（ＵＦ膜）で処理する方法が好ましい。
【００５９】
水溶液をＵＦ膜で処理することにより、水溶液中に含まれる分子量１２，０００以上、好ましくは分子量５，０００以上、特に好ましくは分子量１，０００以上の高分子不純物を除去する。
ＵＦ膜の材質は、例えば、酢酸セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、アクリロニトリル共重合体、ポリアミド１２等が挙げられる。中でもアクリロニトリル共重合体が好ましい。
ＵＦ膜の膜形状は、平膜、中空糸、板、管、スパイラル巻き等が挙げられる。中でも中空糸が好ましい。また、種々のＵＦ膜モジュールが各社から販売されており、操作のしやすさからモジュール化したものが好ましい。
【００６０】
熱分解により得られる粗ペンタメチレンジアミンを、蒸留により、さらに高純度に精製することができる。
蒸留に際し、水溶液中に含まれるペンタメチレンジアミンの濃度は、ペンタメチレンジアミンと分解せずに残存するペンタメチレンジアミン炭酸塩との合計を１００ｍｏｌ％として、７５ｍｏｌ％以上、好ましくは９０ｍｏｌ％以上、さらに好ましくは９５ｍｏｌ％以上、特に好ましくは９９ｍｏｌ％以上である。
蒸留温度は、通常５０℃〜１８０℃、好ましくは６０℃〜１５０℃、さらに好ましくは７０℃〜１２０℃である。蒸留圧は、通常５Ｔｏｒｒ（０．７ｋＰａ）〜７６０Ｔｏｒｒ（１０１ｋＰａ）、好ましくは１０Ｔｏｒｒ（１．３ｋＰａ）〜４００Ｔｏｒｒ（５３ｋＰａ）、さらに好ましくは１５Ｔｏｒｒ（２ｋＰａ）〜１００Ｔｏｒｒ（１３．３ｋＰａ）である。
なお、蒸留により得られる精製ペンタメチレンジアミンには、一部、ペンタメチレンジアミン炭酸塩が含まれる可能性がある。しかし、この炭酸塩は容易にジカルボン酸と塩交換をするため、ポリアミドの製造に供する単量体として問題なく使用することができる。
【００６１】
かくして得られるペンタメチレンジアミンとジカルボン酸とを単量体成分とし、これらを重縮合触媒の存在下に重縮合させることによりポリアミドを製造することができる。
単量体成分として用い得るジカルボン酸としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカン二酸、ドデカン二酸、ブラシリン酸、テトラデカン二酸、ペンタデカン二酸、オクタデカン二酸等の脂肪族ジカルボン酸；シクロヘキサンジカルボン酸等の脂環式ジカルボン酸；フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸等の芳香族ジカルボン酸が挙げられる。
これらのジカルボン酸の中でも、脂肪族ジカルボン酸が好ましく、アジピン酸が特に好ましい。また、ジカルボン酸としてアジピン酸を用いる場合、ジカルボン酸中のアジピン酸の濃度は、通常９０重量％以上、好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは１００重量％である。
さらに、ポリアミド樹脂としての特性を損なわない程度において、それ自体既知の他の単量体成分を併用して重縮合することもできる。
【００６２】
ペンタメチレンジアミンとジカルボン酸との重縮合方法は特に限定されず、従来公知の方法から適宜選択することができる。また、重縮合触媒は、従来公知のものの中から適宜選択して使用することができ、特に限定されない。一般的なポリアミド樹脂の製造方法としては、例えば、「ポリアミド樹脂ハンドブック」（日刊工業株式会社出版：福本修編）等に開示されている。
重縮合方法の一例としては、例えば、ペンタメチレンジアミン及びジカルボン酸を含む水溶液を高温高圧下で、脱水反応を進行させる加熱重縮合法が挙げられる。ここで、加熱重縮合法において、重縮合反応の最高温度は２００℃以上、通常３００℃以下である。重縮合方式には、特に制限は無く、回分式または連続方式が採用できる。
なお、加熱重縮合法により得られたポリアミド樹脂を、例えば、真空中または不活性ガス中で１００℃以上、融点以下の温度で加熱することにより、ポリアミドの分子量を高くすることができる。
また、ペンタメチレンジアミン及びジカルボン酸を高温高圧下で重縮合して得られたオリゴマーを高分子量化する方法、ペンタメチレンジアミンを溶解した水溶液とジカルボン酸塩を水性溶媒又は有機溶媒に溶解させた溶液とを接触させ、これらの界面で重縮合反応させる界面重縮合法等が挙げられる。
【００６３】
ペンタメチレンジアミン及びジカルボン酸の重縮合により得られるポリアミドの分子量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択される。実用性の観点から、通常、ポリアミド樹脂の２５℃における９８％硫酸溶液（ポリアミド樹脂濃度：０．０１ｇ／ｍｌ）の相対粘度の下限が、通常１．５、好ましくは１．８、特に好ましくは２．２であり、上限は、通常８．０、好ましくは５．５、特に好ましくは３．５である。相対粘度が過度に小さいと実用的強度が得られない傾向がある。相対粘度が過度に大きいと、ポリアミド樹脂の流動性が低下し、成形加工性が損なわれる傾向がある。
【００６４】
本発明の方法で得られるポリアミドは、必要に応じて各種の添加剤や他の樹脂と配合し、ポリアミド樹脂組成物として用いることができる。
本発明の方法で得られるポリアミドやその組成物は、所望の形状に成形し、各種の用途に使用することができる。
【実施例】
【００６５】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【００６６】
［リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ遺伝子）増強株の作製］
ｃａｄＡ遺伝子増強株を次のとおり作製した。
（Ａ）大腸菌ＤＮＡの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、大腸菌（E. coli）ＪＭ１０９株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。
【００６７】
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【００６８】
（Ｂ）ｃａｄＡ遺伝子のクローニング
大腸菌ｃａｄＡ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該遺伝子の配列（GenBank Database Accession No.U00096）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。
【００６９】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ １μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２．５分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は１０分とした。
【００７０】
ＰＣＲ反応終了後、増幅産物をエタノール沈殿により精製した後、制限酵素ＫｐｎＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断後した。このＤＮＡ標品を、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することによりｃａｄＡを含む約２．６ｋｂの断片を検出し、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて目的ＤＮＡ断片の回収を行った。
【００７１】
回収したＤＮＡ断片を、大腸菌プラスミドベクターｐＵＣ１８（宝酒造社製）を制限酵素ＫｐｎＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡ断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌（ＪＭ１０９株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリン、０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）および５０μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００７２】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断することにより、約２．５ｋｂの挿入断片が認められることを確認し、このプラスミドをｐＣＡＤ１と命名し、ｐＣＡＤ１を含む大腸菌株をＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１と命名した。
プラスミドｐＣＡＤ１の構築方法とその物理地図を図１に示す。
【００７３】
［リジンの測定］
反応中の溶液におけるリジンの残存濃度の測定は、王子計測機器社製ＢＦ−５バイオセンサにＬ−リジン測定用酵素電極を取り付け、フローインジェクション方式により行なった。反応用液中のリジン残存濃度からペンタメチレンジアミンの転換率（％）を求めた。
【００７４】
実施例１
（１）ｃａｄＡ遺伝子増幅株の培養
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ1株をＬＢ培地入りフラスコで前培養した後、５ｍｌの培養液を５００ｍＬのＬＢ培地が入った１Ｌ容ジャーファーメンターに接種し、通気量０．５ｖｖｍ、３５℃、６００ｒｐｍで通気攪拌培養を行った。培養４時間目に、滅菌したＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度で０．５ｍＭになるように添加し、その後１４時間培養を継続した。これを１００００ｇの１０分で遠心分離し、１０倍に濃縮し、酵素液とした。
【００７５】
（２）リジン炭酸塩の製造
３０％（ｗ／ｖ）リジンベース（リジン塩基）溶液５００ｍＬを１Ｌ容ジャーファーメンターにいれ、炭酸ガス０．５ｖｖｍ、３５℃、６００ｒｐｍでｐＨの調整を行った。ｐＨは炭酸ガスの通気とともに低下し６時間後に７．２まで低下した。これを反応に用いるリジン炭酸塩水溶液とした。
【００７６】
（３）ペンタメチレンジアミンの製造
リジン炭酸塩水溶液にピリドキサル燐酸を０．１ｍＭになるように加え、さらに酵素液を５ｍｌ添加し（反応液１ＬあたりのＬＤＣ添加量：５０００Ｕ）、反応を開始した。３７℃、３００ｒｐｍ（攪拌動力：０．２８Ｗ／Ｌ）、常圧の条件で反応を行った。反応開始とともにｐＨは上昇したが、ｐＨ８を超えることは無かった。２４時間後には９８％のリジンがペンタメチレンジアミンに転換されていた。このとき、反応溶液はｐＨ７．８であった。
【００７７】
実施例２
実施例１で攪拌数を１００ｒｐｍ（攪拌動力：０．０９Ｗ／Ｌ）にした以外は実施例１と同様に実施した。その結果、２４時間後には９９％のリジンがペンタメチレンジアミンに転換されていた。このとき、反応溶液はｐＨ７．７であった。
【００７８】
比較例１
実施例１で攪拌数を８００ｒｐｍ（攪拌動力：７Ｗ／Ｌ）にした以外は実施例１と同様に実施した。その結果、２４時間後には９０％のリジンがペンタメチレンジアミンに転換されていた。さらに反応を４時間続けたが転換率はほとんど変わらず、反応が完結しなかった。このとき、反応溶液はｐＨ８．７であった。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明より、ペンタメチレンジアミンの製造において生成する副生塩を削減し、ペンタメチレンジアミンを効率的かつ安価に提供することが可能となる。また、本発明で得られるペンタメチレンジアミンを用いてポリアミドの製造が可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リジン水溶液に炭酸ガスを吹き込むことによりリジン炭酸塩水溶液を調製し、該リジン炭酸塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させて、該酵素の反応によりペンタメチレンジアミン炭酸塩を生成させることを含むペンタメチレンジアミンの製造方法であって、反応溶液の攪拌動力、温度および圧力から選ばれる少なくとも一つの条件を調節することにより、反応溶液に中和剤を添加せずに、反応が完結するまで該酵素の反応に適したｐＨに維持することを特徴とするペンタメチレンジアミンの製造方法。
【請求項２】
反応に適したｐＨが、ｐＨ６．５〜８．５の範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
攪拌動力が１ｗ／Ｌ以下である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
反応溶液からペンタメチレンジアミン炭酸塩を分離し、分離したペンタメチレンジアミン炭酸塩を熱分解することによりペンタメチレンジアミンを得る、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
熱分解により発生する炭酸ガスを、リジン炭酸塩水溶液の調製に用いる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法で得られるペンタメチレンジアミンとジカルボン酸とを重縮合させることを特徴とするポリアミドの製造方法。
【請求項１】
リジン水溶液に炭酸ガスを吹き込むことによりリジン炭酸塩水溶液を調製し、該リジン炭酸塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させて、該酵素の反応によりペンタメチレンジアミン炭酸塩を生成させることを含むペンタメチレンジアミンの製造方法であって、反応溶液の攪拌動力、温度および圧力から選ばれる少なくとも一つの条件を調節することにより、反応溶液に中和剤を添加せずに、反応が完結するまで該酵素の反応に適したｐＨに維持することを特徴とするペンタメチレンジアミンの製造方法。
【請求項２】
反応に適したｐＨが、ｐＨ６．５〜８．５の範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
攪拌動力が１ｗ／Ｌ以下である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
反応溶液からペンタメチレンジアミン炭酸塩を分離し、分離したペンタメチレンジアミン炭酸塩を熱分解することによりペンタメチレンジアミンを得る、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
熱分解により発生する炭酸ガスを、リジン炭酸塩水溶液の調製に用いる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法で得られるペンタメチレンジアミンとジカルボン酸とを重縮合させることを特徴とするポリアミドの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−１７８６７２（Ｐ２０１０−１７８６７２Ａ）
【公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５０２１（Ｐ２００９−２５０２１）
【出願日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
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