ボルレリジン−製造ポリケチドシンターゼ、及びその使用
【課題】なし
【解決手段】
本発明は、ポリケチドシンターゼをコードしている核酸のクローニングからのポリケチド、及び誘導体の生合成、及び該ポリケチドボレリジンの合成に関与した、他の関連タンパク質に関するものである。ボレリジン及び類似体を含むポリケチド、及びその誘導体の調製用の、酵素システム、核酸、ベクター、及び細胞を含む、物質及び方法を提供する。
【解決手段】
本発明は、ポリケチドシンターゼをコードしている核酸のクローニングからのポリケチド、及び誘導体の生合成、及び該ポリケチドボレリジンの合成に関与した、他の関連タンパク質に関するものである。ボレリジン及び類似体を含むポリケチド、及びその誘導体の調製用の、酵素システム、核酸、ベクター、及び細胞を含む、物質及び方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離、又は組換え型核酸分子であって：（a）配列番号：１に示すヌクレオチド配列；（b）配列番号：１の相補体であるヌクレオチド配列；（c）配列番号：１の縮重したヌクレオチド配列；（d）、（a）、（b）、又は（c）に対して、又は配列番号：１、又はその相補体から誘導されたハイブリダイゼーションプローブに対して、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；（e）配列番号：１と、配列が少なくとも80％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；（f）少なくとも10個のヌクレオチド長さである、前記の（a）、（b）、（c）、（d）、又は（e）の断片を含む、前記核酸分子。
【請求項２】
ボルレリジン生合成遺伝子クラスター、又はそのドメインの読み取り枠によりコードされたポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドが、配列番号：２〜４３、及び１１３からなる群から選択されたアミノ酸配列、又はそれと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
AT0、及びACP0から選択された、PKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：２の第322〜664番目、及び第694〜763番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
【請求項４】
配列番号：１の第17147〜18175番目、及び第18263〜18472番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項３記載の核酸。
【請求項５】
KS1、AT1、KR1、及びACP1から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：３の第34〜459番目、第557〜885番目、第1136〜1379番目、及び第1419〜1486番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
【請求項６】
配列番号：１の第18974〜20251番目、第20543〜21529番目、第22280〜23011番目、及び第23129〜23332番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項５記載の核酸。
【請求項７】
KS2、AT2、DH2、KR2、ACP2、KS3、AT3、DH3、KR3、及びACP3から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：４の第34〜459番目、第559〜887番目、第903〜1050番目、第1354〜1597番目、第1628〜1694番目、第1724〜2149番目、第2245〜2576番目、第2593〜2734番目、第3060〜3307番目、及び第3340〜3406番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
【請求項８】
配列番号：１の第23785〜25062番目、第25360〜26346番目、第26392〜26835番目、第27745〜28476番目、第28567〜28767番目、第28855〜30132番目、第30418〜31413番目、第31462〜31887番目、第32863〜33606番目、及び第33703〜33903番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項７記載の核酸。
【請求項９】
KS4、AT4、KR4、及びACP4から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：５の第34〜459番目、第555〜886番目、第1179〜1423番目、及び第1459〜1525番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
【請求項１０】
配列番号：１の第34284〜35561番目、第35847〜36842番目、第37719〜38453番目、及び第38559〜38759番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項９記載の核酸。
【請求項１１】
KS5、AT5、DH5、ER5、KR5、及びACP5から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：６の第34〜457番目、第553〜888番目、第905〜1046番目、第1401〜1690番目、第1696〜1942番目、及び第1975〜2041番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
【請求項１２】
配列番号：１の第39221〜40492番目、第40778〜41785番目、第41834〜42259番目、第43322〜44191番目、第44207〜44947番目、及び第45044〜45244番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項１１記載の核酸。
【請求項１３】
KS6、AT6、KR6、ACP6、及びTEから選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：７の第37〜457番目、第555〜883番目、第1101〜1335番目、第1371〜1437番目、及び第1461〜1708番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
【請求項１４】
配列番号：１の第45622〜46884番目、第47176〜48162番目、第48814〜49518番目、第49624〜49824番目、及び第49894〜50637番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項１３記載の核酸。
【請求項１５】
PKSモジュールをコードしている配列を含み、前記モジュールが、それぞれ、配列番号：２の第322〜763番目、配列番号：３の第34〜1486番目、配列番号：４の34〜1694番目、配列番号：４の第1724〜3406番目、配列番号：５の第34〜1525番目、配列番号：６の第34〜2041番目、及び配列番号：７の第37〜1437番目又は1708番目のアミノ酸からなる群から選択された、請求項１、又は２記載の核酸。
【請求項１６】
配列番号：１の第17147〜18472番目、第18974〜23332番目、第23785〜28767番目、第28855〜33903番目、第34284〜38759番目、第39221〜45244番目、第45622〜49824番目、又は第50637番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項１５記載の核酸。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項記載の単離された、又は組換え型核酸であって：前記核酸配列が、下記からなる遺伝子群から選択された核酸；borA1（配列番号：１の第16184〜18814番目）、borA2（配列番号：１の第18875〜23590番目）、borA3（配列番号：１の第23686〜34188番目）、borA4（配列番号：１の第34185〜39047番目）、borA5（配列番号：１の第39122〜45514番目）、borA6（配列番号：１の第45514〜50742番目）、borB（配列番号：１の相補鎖の第7603〜8397番目）、borC（配列番号：１の相補鎖の第8397〜9194番目）、borD（配列番号：１の相補鎖の第9244〜9996番目）、borE（配列番号：１の相補鎖の第9993〜11165番目）、borF（配列番号：１の相補鎖の第11162〜11980番目）、borG（配列番号：１の相補鎖の第11992〜13611番目）、borH（配列番号：１の相補鎖の第13608〜15659番目）、borI（配列番号：１の第50739〜52019番目）、borJ（配列番号：１の第52113〜53477番目）、borK（配列番号：１の第53486〜54466番目）、borL（配列番号：１の第54506〜56176番目）、borM（配列番号：１の第56181〜57098番目）、borN（配列番号：１の第57112〜57858番目）、borO（配列番号：１の第57939〜59966番目）、orfB1（配列番号：１の第2〜313番目）、orfB2（配列番号：１の第501〜3107番目）、orfB3（配列番号：１の相補鎖の第3172〜3810番目）、orfB4（配列番号：１の相補鎖の第3935〜4924番目）、orfB5（配列番号：１の第5123〜5953番目）、orfB6（配列番号：１の相補鎖の第5961〜6518番目）、orfB7（配列番号：１の第6564〜7538番目）、orfB8（配列番号：１の相補鎖の第60153〜60533番目）、orfB9（配列番号：１の第60620〜61003番目）、orfB10（配列番号：１の第61188〜61436番目）、orfB11（配列番号：１の第61526〜61738番目）、orfB12（配列番号：１の相補鎖の第61767〜62285番目）、orfB13a（配列番号：１の相補鎖の第62750〜63067番目）、orfB13b（配列番号：１の相補鎖の第62586〜62858番目）、orfB14（配列番号：１の相補鎖の第63155〜65071番目）、orfB15（配列番号：１の65374〜65871）、orfB16（配列番号：１の相補鎖の第65942〜68305番目）、orfB17（配列番号：１の相補鎖の第68290〜68910番目）、orfB18（配列番号：１の第69681〜70436番目）、orfB19（配列番号：１の第70445〜71848番目）、orfB20（配列番号：１の第71851〜72957番目）、orfB21（配列番号：１の第73037〜73942番目）、及びorfB22（配列番号：１の相補鎖の第73995〜74534番目）。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の核酸配列によりコードされた、単離ポリペプチド。
【請求項１９】
宿主細胞内に、ボルレリジンポリケチドシンターゼ、又はその誘導体由来のドメインをコードしている核酸を導入することを含む、親ポリケチドシンターゼの改質方法であって、該宿主細胞が、前記親ポリケチドシンターゼをコードしている核酸を含み、その結果、発現した場合、該ドメインが前記親ポリケチドシンターゼ内に組込まれる、前記方法。
【請求項２０】
該親PKSの天然ドメインに加えて、該ボルレリジンPKSドメインを挿入する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該親PKSの天然ドメインの代わりに、該ボルレリジンPKSドメインを挿入する、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
該本願ポリケチドシンターゼのドメインを不活性化、除去、又は変更する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記ボルレリジンポリケチドシンターゼ、又はその誘導体由来のモジュールをコードしている核酸を、前記宿主細胞内に導入することを含む、請求項１９〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
前記モジュールが、少なくともACP、AT、及びKSドメインを含む、伸長モジュールである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
さらに、前記モジュールが、KRドメインを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
さらに、前記モジュールが、DHドメインを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
さらに、前記モジュールが、ERドメインを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
さらに、前記モジュールが、TEドメインを含む、請求項２４〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
宿主細胞内に、ドナーポリケチドシンターゼ由来のドメインをコードしている核酸を導入することを含む、親ボルレリジンポリケチドシンターゼの改質方法であって、該宿主細胞が、前記親ボルレリジンポリケチドシンターゼをコードしている核酸を含み、その結果、発現した場合、該ドメインが前記親ボルレリジンポリケチドシンターゼ内に組込まれる、前記方法。
【請求項３０】
該親ボルレリジンPKSの天然ドメインに加えて、該ドナーPKSドメインを挿入する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
該親ボルレリジンPKSの天然ドメインの代わりに、該ドナーPKSドメインを挿入する、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
該ドナーPKSドメインが、O-メチルトランスフェラーゼドメイン、C-メチルトランスフェラーゼドメイン、エピマー化ドメイン、モノオキシゲナーゼドメイン、デヒドロゲナーゼドメイン、アミノトランスフェラーゼドメイン、又は非リボソーム型ペプチドシンテターゼドメインからなる群から選択される、請求項２９〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
前記ドナーポリケチドシンターゼ、又はその誘導体由来のモジュールをコードしている核酸を、宿主細胞内に導入することを含む、請求項２９〜３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
前記モジュールが、少なくともACP、AT、及びKSドメインを含む、伸長モジュールである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記モジュールが、さらに、KRドメインを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記モジュールが、さらに、DHドメインを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記モジュールが、さらに、ERドメインを含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記モジュールが、さらに、TEドメインを含む、請求項３３〜３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
該ドナーPKSが、ボルレリジンPKSである、請求項２９〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
ボルレリジンPKSの少なくとも１のドメインをコードしている、少なくとも１の第一核酸部位、及び前記ボルレリジンPKSと非相同的である、少なくとも１のI型PKSドメインをコードしている、第二核酸の１部位、又は複数部位を含む、核酸構造体。
【請求項４１】
ハイブリッドポリケチドシンターゼ遺伝子、ボルレリジンPKSの少なくとも１のドメインをコードしている前記遺伝子、及び前記ボルレリジンPKSと非相同的である、少なくとも１のI型PKSドメインを含む、請求項４０記載の構造体。
【請求項４２】
ポリケチドシンターゼを発現する宿主細胞において、ボルレリジン、又はボルレリジン誘導体又は類似体を製造する宿主細胞の能力を増強する方法であって、前記細胞内の該ボルレリジン開始単位の製造に伴う、ボルレリジン生合成遺伝子を上方制御することを含む、前記方法。
【請求項４３】
前記遺伝子が、borC、borD、borE、borF、borH、borK、borL、borM、及びborNからなる群から選択される、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該遺伝子が、borE、又はborLである、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞内の上方制御されるべき該遺伝子をコードしている核酸の導入工程を含む、請求項４２〜４４いずれか１項記載の方法。
【請求項４６】
ボルレリジン、又はボルレリジン誘導体又は類似体を製造する能力を増強するために、ボルレリジン、又は前記誘導体又は類似体のポリケチドシンターゼを発現することができる宿主細胞を改質する方法であって、前記細胞内の該ボルレリジン開始単位の製造を伴う、ボルレリジン生合成遺伝子を除去し、破壊し、又は他の不活性化をすることを含み、該遺伝子が、borGである、前記方法。
【請求項４７】
該得られた細胞を発酵すること、及び外来のカルボン酸を供給することを含む、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
該外来のカルボン酸が、トランス-シクロブタン-1,2-ジカルボン酸、2,3-ジメチルコハク酸、2-メチルコハク酸、及びトランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸からなる群から選択される、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
さらに、一以上のボルレリジン生合成遺伝子、又はボルレリジンポリケチドシンターゼドメイン又はモジュールを、除去、改質、又は置換することを含む、請求項４４〜４８のいずれか１項記載の方法。
【請求項５０】
ボルレリジン、又はその誘導体のためのPKSを発現する宿主細胞内において、改質ボルレリジンポリケチド、又はその誘導体を製造する方法であって、ボルレリジンのC12でのニトリル官能基形成に関与する遺伝子の除去、又は不活性化を含む、前記方法。
【請求項５１】
前記宿主細胞内に、一以上の非相同的遺伝子をコードしている核酸を導入することを含み、全ての堆積した生合成中間体、又は分路代謝産物の別の合成を可能にする、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の核酸分子、又は請求項４０、又は４１記載の構造体を含む、ベクター。
【請求項５３】
請求項５２のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５４】
放線菌である、請求項５３記載の宿主細胞。
【請求項５５】
ストレプトマイセートである、請求項５３記載の宿主細胞。
【請求項５６】
下記からなる群から選択された、請求項５５記載の宿主細胞：サッカロポリスポラ エリスラエア、ストレプトマイセス コエリカラー、ストレプトマイセス アベルミチリス、ストレプトマイセス グリセオフスクス、ストレプトマイセス キンナモネンシス、ミクロモノスポラ グリセオルビダ、ストレプトマイセス ハイグロスコピカス、ストレプトマイセス フラジアエ、ストレプトマイセス ロンギスポロフラブス、ストレプトマイセス ラサリエンシス、ストレプトマイセス ツクバエンシス、ストレプトマイセス グリセウス、ストレプトマイセス ベネズエラエ、ストレプトマイセス アンチバイオチクス、ストレプトマイセス リビダンス、ストレプトマイセス リモスス、及びストレプトマイセス アルブス．ストレプトマイセス ロケイ ATCC23956、ストレプトマイセス パルブルス Tue113。
【請求項５７】
請求項５３〜５６のいずれか１項の宿主細胞を培養することを含む、ポリケチドの合成方法。
【請求項５８】
下記式１の化合物、又はその医薬として許容し得る塩、又は一以上の該ケチド単位の酸化状態において、該対応する“天然”化合物とは異なる類似体であって（すなわち、下記群からの代替の選択：-CO-、-CH（OH）-、=CH-、及び-CH2-）：
【化１】
（式中、R1は、変化する大きさの（n=１〜２）、及び下に示すように置換されたシクロアルキル基であり；
【化２】
また、式中、R1を、一以上のハロ原子、又は一以上のC1〜C3アルキル基で、任意に置換することができ；R2、R3、R6、R7、R8、R9、又はR11は、それぞれ独立して、H、OCH3、CH3、又はCH2CH3であり；R4は、CN、CO2H、CHO、CH3、CONH2、CHNHであり、R5、R10は、OHである。）、但し、前記化合物は、図１に示す、ボルレリジン（1）、12-デスニトリル-12-カルボキシルボルレリジン（2）、10-デスメチルボルレリジン（3）、11-エピボルレリジン（4）、又はC14,C15-シスボルレリジン類似体（5）ではない、前記化合物。
【請求項５９】
下記式２の化合物、又はその医薬として許容し得る塩、又は一以上の該ポリケチド単位の酸化状態において、該対応する“天然”化合物とは異なる類似体であって（すなわち、下記群からの代替の選択：-CO-、-CH（OH）-、=CH-、及び-CH2-）：
【化３】
（式中、R2、R3、R6、R7、R8、R9、又はR11、それぞれ独立して、H、OCH3、CH3、又はCH2CH3であり；R4は、CN、CO2H、CHO、CH3、CONH2、CHNHであり、R5、R10は、OHであり；かつR12、及びR13は、それぞれ独立して、H、又はOH、F、Cl、SHで任意に置換され得るC1〜C4アルキル基である。）、但し、R12、及びR13は、同時にHではないとする、前記化合物。
【請求項６０】
R7、R8、及びR9が、すべてCH3である、請求項５８、又は請求項５９記載の化合物、又は塩。
【請求項６１】
R4が、CH3、又はCOOHである、請求項５８、又は５９記載の化合物、又は塩。
【請求項６２】
R4が、CH3、又はCOOHである、請求項６０記載の化合物、又は塩。
【請求項６３】
R4が、CNである、請求項５８、又は５９記載の化合物、又は塩。
【請求項６４】
R4が、CNである、請求項６０記載の化合物、又は塩。
【請求項６５】
R1が、シクロブタン-1'-カルボキシラートである、請求項５８記載の化合物、又は塩。
【請求項６６】
R1が、シクロブタン-1'-カルボキシラートである、請求項６０記載の化合物、又は塩。
【請求項６７】
R4が、CH3、又はCOOHである、請求項６６記載の化合物、又は塩。
【請求項６８】
R6、R7、R8、及びR9が、すべてCH3であり、R2、及びR11がHであり、R5、及びR10がOHであり、R4がCH3、COOH、又はCNのどれかであり、かつR1がシクロペンタン-1’-カルボキシラート、又はシクロブタン-1'-カルボキシラートである、請求項５８記載の化合物、又は塩。
【請求項６９】
R12、及びR13が、独立して、CH3、又はHである、請求項５９記載の化合物、又は塩。
【請求項７０】
R12、及びR13が、独立して、CH3、又はHである、請求項６０記載の化合物、又は塩。
【請求項７１】
R4が、CH3、又はCOOHである、請求項７０記載の化合物、又は塩。
【請求項７２】
R6、R7、R8、及びR9が、すべてCH3であり、R2、及びR11が、Hであり、R5、及びR10が、OHであり、R4が、CH3、COOH、又はCNのどれかであり、かつR12、及びR13が、独立して、CH3、又はHである、請求項５９記載の化合物、又は塩。
【請求項７３】
R6、R7、R8、及びR9が、すべてCH3であり、R2、及びR11が、Hであり、R5、及びR10が、OHであり、R4が、CH3、COOH、又はCNのどれかであり、かつR12、及びR13が、双方ともCH3である、請求項５９記載の化合物、又は塩。
【請求項１】
単離、又は組換え型核酸分子であって：（a）配列番号：１に示すヌクレオチド配列；（b）配列番号：１の相補体であるヌクレオチド配列；（c）配列番号：１の縮重したヌクレオチド配列；（d）、（a）、（b）、又は（c）に対して、又は配列番号：１、又はその相補体から誘導されたハイブリダイゼーションプローブに対して、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；（e）配列番号：１と、配列が少なくとも80％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；（f）少なくとも10個のヌクレオチド長さである、前記の（a）、（b）、（c）、（d）、又は（e）の断片を含む、前記核酸分子。
【請求項２】
ボルレリジン生合成遺伝子クラスター、又はそのドメインの読み取り枠によりコードされたポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドが、配列番号：２〜４３、及び１１３からなる群から選択されたアミノ酸配列、又はそれと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
AT0、及びACP0から選択された、PKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：２の第322〜664番目、及び第694〜763番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
【請求項４】
配列番号：１の第17147〜18175番目、及び第18263〜18472番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項３記載の核酸。
【請求項５】
KS1、AT1、KR1、及びACP1から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：３の第34〜459番目、第557〜885番目、第1136〜1379番目、及び第1419〜1486番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
【請求項６】
配列番号：１の第18974〜20251番目、第20543〜21529番目、第22280〜23011番目、及び第23129〜23332番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項５記載の核酸。
【請求項７】
KS2、AT2、DH2、KR2、ACP2、KS3、AT3、DH3、KR3、及びACP3から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：４の第34〜459番目、第559〜887番目、第903〜1050番目、第1354〜1597番目、第1628〜1694番目、第1724〜2149番目、第2245〜2576番目、第2593〜2734番目、第3060〜3307番目、及び第3340〜3406番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
【請求項８】
配列番号：１の第23785〜25062番目、第25360〜26346番目、第26392〜26835番目、第27745〜28476番目、第28567〜28767番目、第28855〜30132番目、第30418〜31413番目、第31462〜31887番目、第32863〜33606番目、及び第33703〜33903番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項７記載の核酸。
【請求項９】
KS4、AT4、KR4、及びACP4から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：５の第34〜459番目、第555〜886番目、第1179〜1423番目、及び第1459〜1525番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
【請求項１０】
配列番号：１の第34284〜35561番目、第35847〜36842番目、第37719〜38453番目、及び第38559〜38759番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項９記載の核酸。
【請求項１１】
KS5、AT5、DH5、ER5、KR5、及びACP5から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：６の第34〜457番目、第553〜888番目、第905〜1046番目、第1401〜1690番目、第1696〜1942番目、及び第1975〜2041番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
【請求項１２】
配列番号：１の第39221〜40492番目、第40778〜41785番目、第41834〜42259番目、第43322〜44191番目、第44207〜44947番目、及び第45044〜45244番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項１１記載の核酸。
【請求項１３】
KS6、AT6、KR6、ACP6、及びTEから選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：７の第37〜457番目、第555〜883番目、第1101〜1335番目、第1371〜1437番目、及び第1461〜1708番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
【請求項１４】
配列番号：１の第45622〜46884番目、第47176〜48162番目、第48814〜49518番目、第49624〜49824番目、及び第49894〜50637番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項１３記載の核酸。
【請求項１５】
PKSモジュールをコードしている配列を含み、前記モジュールが、それぞれ、配列番号：２の第322〜763番目、配列番号：３の第34〜1486番目、配列番号：４の34〜1694番目、配列番号：４の第1724〜3406番目、配列番号：５の第34〜1525番目、配列番号：６の第34〜2041番目、及び配列番号：７の第37〜1437番目又は1708番目のアミノ酸からなる群から選択された、請求項１、又は２記載の核酸。
【請求項１６】
配列番号：１の第17147〜18472番目、第18974〜23332番目、第23785〜28767番目、第28855〜33903番目、第34284〜38759番目、第39221〜45244番目、第45622〜49824番目、又は第50637番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項１５記載の核酸。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項記載の単離された、又は組換え型核酸であって：前記核酸配列が、下記からなる遺伝子群から選択された核酸；borA1（配列番号：１の第16184〜18814番目）、borA2（配列番号：１の第18875〜23590番目）、borA3（配列番号：１の第23686〜34188番目）、borA4（配列番号：１の第34185〜39047番目）、borA5（配列番号：１の第39122〜45514番目）、borA6（配列番号：１の第45514〜50742番目）、borB（配列番号：１の相補鎖の第7603〜8397番目）、borC（配列番号：１の相補鎖の第8397〜9194番目）、borD（配列番号：１の相補鎖の第9244〜9996番目）、borE（配列番号：１の相補鎖の第9993〜11165番目）、borF（配列番号：１の相補鎖の第11162〜11980番目）、borG（配列番号：１の相補鎖の第11992〜13611番目）、borH（配列番号：１の相補鎖の第13608〜15659番目）、borI（配列番号：１の第50739〜52019番目）、borJ（配列番号：１の第52113〜53477番目）、borK（配列番号：１の第53486〜54466番目）、borL（配列番号：１の第54506〜56176番目）、borM（配列番号：１の第56181〜57098番目）、borN（配列番号：１の第57112〜57858番目）、borO（配列番号：１の第57939〜59966番目）、orfB1（配列番号：１の第2〜313番目）、orfB2（配列番号：１の第501〜3107番目）、orfB3（配列番号：１の相補鎖の第3172〜3810番目）、orfB4（配列番号：１の相補鎖の第3935〜4924番目）、orfB5（配列番号：１の第5123〜5953番目）、orfB6（配列番号：１の相補鎖の第5961〜6518番目）、orfB7（配列番号：１の第6564〜7538番目）、orfB8（配列番号：１の相補鎖の第60153〜60533番目）、orfB9（配列番号：１の第60620〜61003番目）、orfB10（配列番号：１の第61188〜61436番目）、orfB11（配列番号：１の第61526〜61738番目）、orfB12（配列番号：１の相補鎖の第61767〜62285番目）、orfB13a（配列番号：１の相補鎖の第62750〜63067番目）、orfB13b（配列番号：１の相補鎖の第62586〜62858番目）、orfB14（配列番号：１の相補鎖の第63155〜65071番目）、orfB15（配列番号：１の65374〜65871）、orfB16（配列番号：１の相補鎖の第65942〜68305番目）、orfB17（配列番号：１の相補鎖の第68290〜68910番目）、orfB18（配列番号：１の第69681〜70436番目）、orfB19（配列番号：１の第70445〜71848番目）、orfB20（配列番号：１の第71851〜72957番目）、orfB21（配列番号：１の第73037〜73942番目）、及びorfB22（配列番号：１の相補鎖の第73995〜74534番目）。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の核酸配列によりコードされた、単離ポリペプチド。
【請求項１９】
宿主細胞内に、ボルレリジンポリケチドシンターゼ、又はその誘導体由来のドメインをコードしている核酸を導入することを含む、親ポリケチドシンターゼの改質方法であって、該宿主細胞が、前記親ポリケチドシンターゼをコードしている核酸を含み、その結果、発現した場合、該ドメインが前記親ポリケチドシンターゼ内に組込まれる、前記方法。
【請求項２０】
該親PKSの天然ドメインに加えて、該ボルレリジンPKSドメインを挿入する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該親PKSの天然ドメインの代わりに、該ボルレリジンPKSドメインを挿入する、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
該本願ポリケチドシンターゼのドメインを不活性化、除去、又は変更する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記ボルレリジンポリケチドシンターゼ、又はその誘導体由来のモジュールをコードしている核酸を、前記宿主細胞内に導入することを含む、請求項１９〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
前記モジュールが、少なくともACP、AT、及びKSドメインを含む、伸長モジュールである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
さらに、前記モジュールが、KRドメインを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
さらに、前記モジュールが、DHドメインを含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
さらに、前記モジュールが、ERドメインを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
さらに、前記モジュールが、TEドメインを含む、請求項２４〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
宿主細胞内に、ドナーポリケチドシンターゼ由来のドメインをコードしている核酸を導入することを含む、親ボルレリジンポリケチドシンターゼの改質方法であって、該宿主細胞が、前記親ボルレリジンポリケチドシンターゼをコードしている核酸を含み、その結果、発現した場合、該ドメインが前記親ボルレリジンポリケチドシンターゼ内に組込まれる、前記方法。
【請求項３０】
該親ボルレリジンPKSの天然ドメインに加えて、該ドナーPKSドメインを挿入する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
該親ボルレリジンPKSの天然ドメインの代わりに、該ドナーPKSドメインを挿入する、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
該ドナーPKSドメインが、O-メチルトランスフェラーゼドメイン、C-メチルトランスフェラーゼドメイン、エピマー化ドメイン、モノオキシゲナーゼドメイン、デヒドロゲナーゼドメイン、アミノトランスフェラーゼドメイン、又は非リボソーム型ペプチドシンテターゼドメインからなる群から選択される、請求項２９〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
前記ドナーポリケチドシンターゼ、又はその誘導体由来のモジュールをコードしている核酸を、宿主細胞内に導入することを含む、請求項２９〜３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
前記モジュールが、少なくともACP、AT、及びKSドメインを含む、伸長モジュールである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記モジュールが、さらに、KRドメインを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記モジュールが、さらに、DHドメインを含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記モジュールが、さらに、ERドメインを含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記モジュールが、さらに、TEドメインを含む、請求項３３〜３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
該ドナーPKSが、ボルレリジンPKSである、請求項２９〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
ボルレリジンPKSの少なくとも１のドメインをコードしている、少なくとも１の第一核酸部位、及び前記ボルレリジンPKSと非相同的である、少なくとも１のI型PKSドメインをコードしている、第二核酸の１部位、又は複数部位を含む、核酸構造体。
【請求項４１】
ハイブリッドポリケチドシンターゼ遺伝子、ボルレリジンPKSの少なくとも１のドメインをコードしている前記遺伝子、及び前記ボルレリジンPKSと非相同的である、少なくとも１のI型PKSドメインを含む、請求項４０記載の構造体。
【請求項４２】
ポリケチドシンターゼを発現する宿主細胞において、ボルレリジン、又はボルレリジン誘導体又は類似体を製造する宿主細胞の能力を増強する方法であって、前記細胞内の該ボルレリジン開始単位の製造に伴う、ボルレリジン生合成遺伝子を上方制御することを含む、前記方法。
【請求項４３】
前記遺伝子が、borC、borD、borE、borF、borH、borK、borL、borM、及びborNからなる群から選択される、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該遺伝子が、borE、又はborLである、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞内の上方制御されるべき該遺伝子をコードしている核酸の導入工程を含む、請求項４２〜４４いずれか１項記載の方法。
【請求項４６】
ボルレリジン、又はボルレリジン誘導体又は類似体を製造する能力を増強するために、ボルレリジン、又は前記誘導体又は類似体のポリケチドシンターゼを発現することができる宿主細胞を改質する方法であって、前記細胞内の該ボルレリジン開始単位の製造を伴う、ボルレリジン生合成遺伝子を除去し、破壊し、又は他の不活性化をすることを含み、該遺伝子が、borGである、前記方法。
【請求項４７】
該得られた細胞を発酵すること、及び外来のカルボン酸を供給することを含む、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
該外来のカルボン酸が、トランス-シクロブタン-1,2-ジカルボン酸、2,3-ジメチルコハク酸、2-メチルコハク酸、及びトランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸からなる群から選択される、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
さらに、一以上のボルレリジン生合成遺伝子、又はボルレリジンポリケチドシンターゼドメイン又はモジュールを、除去、改質、又は置換することを含む、請求項４４〜４８のいずれか１項記載の方法。
【請求項５０】
ボルレリジン、又はその誘導体のためのPKSを発現する宿主細胞内において、改質ボルレリジンポリケチド、又はその誘導体を製造する方法であって、ボルレリジンのC12でのニトリル官能基形成に関与する遺伝子の除去、又は不活性化を含む、前記方法。
【請求項５１】
前記宿主細胞内に、一以上の非相同的遺伝子をコードしている核酸を導入することを含み、全ての堆積した生合成中間体、又は分路代謝産物の別の合成を可能にする、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の核酸分子、又は請求項４０、又は４１記載の構造体を含む、ベクター。
【請求項５３】
請求項５２のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５４】
放線菌である、請求項５３記載の宿主細胞。
【請求項５５】
ストレプトマイセートである、請求項５３記載の宿主細胞。
【請求項５６】
下記からなる群から選択された、請求項５５記載の宿主細胞：サッカロポリスポラ エリスラエア、ストレプトマイセス コエリカラー、ストレプトマイセス アベルミチリス、ストレプトマイセス グリセオフスクス、ストレプトマイセス キンナモネンシス、ミクロモノスポラ グリセオルビダ、ストレプトマイセス ハイグロスコピカス、ストレプトマイセス フラジアエ、ストレプトマイセス ロンギスポロフラブス、ストレプトマイセス ラサリエンシス、ストレプトマイセス ツクバエンシス、ストレプトマイセス グリセウス、ストレプトマイセス ベネズエラエ、ストレプトマイセス アンチバイオチクス、ストレプトマイセス リビダンス、ストレプトマイセス リモスス、及びストレプトマイセス アルブス．ストレプトマイセス ロケイ ATCC23956、ストレプトマイセス パルブルス Tue113。
【請求項５７】
請求項５３〜５６のいずれか１項の宿主細胞を培養することを含む、ポリケチドの合成方法。
【請求項５８】
下記式１の化合物、又はその医薬として許容し得る塩、又は一以上の該ケチド単位の酸化状態において、該対応する“天然”化合物とは異なる類似体であって（すなわち、下記群からの代替の選択：-CO-、-CH（OH）-、=CH-、及び-CH2-）：
【化１】
（式中、R1は、変化する大きさの（n=１〜２）、及び下に示すように置換されたシクロアルキル基であり；
【化２】
また、式中、R1を、一以上のハロ原子、又は一以上のC1〜C3アルキル基で、任意に置換することができ；R2、R3、R6、R7、R8、R9、又はR11は、それぞれ独立して、H、OCH3、CH3、又はCH2CH3であり；R4は、CN、CO2H、CHO、CH3、CONH2、CHNHであり、R5、R10は、OHである。）、但し、前記化合物は、図１に示す、ボルレリジン（1）、12-デスニトリル-12-カルボキシルボルレリジン（2）、10-デスメチルボルレリジン（3）、11-エピボルレリジン（4）、又はC14,C15-シスボルレリジン類似体（5）ではない、前記化合物。
【請求項５９】
下記式２の化合物、又はその医薬として許容し得る塩、又は一以上の該ポリケチド単位の酸化状態において、該対応する“天然”化合物とは異なる類似体であって（すなわち、下記群からの代替の選択：-CO-、-CH（OH）-、=CH-、及び-CH2-）：
【化３】
（式中、R2、R3、R6、R7、R8、R9、又はR11、それぞれ独立して、H、OCH3、CH3、又はCH2CH3であり；R4は、CN、CO2H、CHO、CH3、CONH2、CHNHであり、R5、R10は、OHであり；かつR12、及びR13は、それぞれ独立して、H、又はOH、F、Cl、SHで任意に置換され得るC1〜C4アルキル基である。）、但し、R12、及びR13は、同時にHではないとする、前記化合物。
【請求項６０】
R7、R8、及びR9が、すべてCH3である、請求項５８、又は請求項５９記載の化合物、又は塩。
【請求項６１】
R4が、CH3、又はCOOHである、請求項５８、又は５９記載の化合物、又は塩。
【請求項６２】
R4が、CH3、又はCOOHである、請求項６０記載の化合物、又は塩。
【請求項６３】
R4が、CNである、請求項５８、又は５９記載の化合物、又は塩。
【請求項６４】
R4が、CNである、請求項６０記載の化合物、又は塩。
【請求項６５】
R1が、シクロブタン-1'-カルボキシラートである、請求項５８記載の化合物、又は塩。
【請求項６６】
R1が、シクロブタン-1'-カルボキシラートである、請求項６０記載の化合物、又は塩。
【請求項６７】
R4が、CH3、又はCOOHである、請求項６６記載の化合物、又は塩。
【請求項６８】
R6、R7、R8、及びR9が、すべてCH3であり、R2、及びR11がHであり、R5、及びR10がOHであり、R4がCH3、COOH、又はCNのどれかであり、かつR1がシクロペンタン-1’-カルボキシラート、又はシクロブタン-1'-カルボキシラートである、請求項５８記載の化合物、又は塩。
【請求項６９】
R12、及びR13が、独立して、CH3、又はHである、請求項５９記載の化合物、又は塩。
【請求項７０】
R12、及びR13が、独立して、CH3、又はHである、請求項６０記載の化合物、又は塩。
【請求項７１】
R4が、CH3、又はCOOHである、請求項７０記載の化合物、又は塩。
【請求項７２】
R6、R7、R8、及びR9が、すべてCH3であり、R2、及びR11が、Hであり、R5、及びR10が、OHであり、R4が、CH3、COOH、又はCNのどれかであり、かつR12、及びR13が、独立して、CH3、又はHである、請求項５９記載の化合物、又は塩。
【請求項７３】
R6、R7、R8、及びR9が、すべてCH3であり、R2、及びR11が、Hであり、R5、及びR10が、OHであり、R4が、CH3、COOH、又はCNのどれかであり、かつR12、及びR13が、双方ともCH3である、請求項５９記載の化合物、又は塩。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００６−５１４５４８（Ｐ２００６−５１４５４８Ａ）
【公表日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６３３８２（Ｐ２００４−５６３３８２）
【出願日】平成１５年１２月２４日（２００３．１２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００５７０４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５８９７６
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（５０５０１２９７７）バイオチカ テクノロジー リミテッド (14)
【出願人】（５０５２０５５５７）ザ ユニバーシティ オブ オビエド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月２４日（２００３．１２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００５７０４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５８９７６
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（５０５０１２９７７）バイオチカ テクノロジー リミテッド (14)
【出願人】（５０５２０５５５７）ザ ユニバーシティ オブ オビエド (1)
【Ｆターム（参考）】
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