マイクロアレイハイブリダイゼーション装置
標的溶液の、より大きな度合いの内部混合を実現することによる、マイクロアレイハイブリダイゼーション反応の効率および一貫性を改善する新規なハイブリダイゼーション装置（１１）。この装置は、溶液混合が、多数の超微粒気泡の生成によって実現される、ガスケットおよびカバーのタイプのチャンバ（２５）を提供する。チャンバを画定する内壁（３３）の１つまたは複数は、チャンバ内に延びかつ尖ったエッジ（４３）で終わる気泡破砕要素（４１）を含有する。これらは典型的な場合、長方形のチャンバの両側に位置付けられ、気泡の移動方向とは反対の方向を指し示す。これらが、より大きい気泡に干渉すると、その大きい気泡は超微粒気泡に破砕され、外部からの撹拌によってそれらが別々の全く異なる経路を移動し、それによって、基板に結合されたプローブ分子へ標的分子の均一な分布が得られるような、改善された溶液混合が提供される。ハイブリダイゼーション反応の感度および一貫性は、著しく増大する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、比較的少ない量の標的溶液を使用して、マイクロアッセイのハイブリダイゼーションを効果的にかつ効率的に実施するための装置に関し、より詳細には、一般に、ガスケットタイプまたはガスケット付きのハイブリダイゼーションチャンバと呼ばれるタイプの改善された装置であって、マイクロアッセイを含むそのようなチャンバ内で、わずか５０または数百マイクロリットルの標的溶液との完全な混合が実現されるよう設計された装置に関する。
【０００２】
マイクロアレイのハイブリダイゼーションは、顕微鏡用スライド表面に結合させた「プローブ」分子を「標的」分子の溶液に曝すことによって、しばしば実施される。現在のところ、この一般的な方法によってマイクロアレイをハイブリダイズするための、主流となる４つの方法があり、これらはカバースリップ、ガスケット付きハイブリダイゼーションチャンバ、顕微鏡用スライドメイラー、および自動ハイブリダイゼーション機器と呼ばれている。どの方法を実施するかという選択は、プローブおよび／または標的の利用可能性、試薬およびハードウェアのコスト、性能要件、およびユーザの専門知識などの要因に、しばしば左右される。
【０００３】
カバースリップ法は、スライド当たりの標的体積が数マイクロリットルに限定されているときに使用する。数滴の標的をスライド上に堆積し、薄いガラスまたはプラスチックのカバースリップを、標的の上部に配置する。カバースリップとスライドとの間の毛管作用によって、標的溶液の薄膜が捕えられる。
【０００４】
中間の体積を取り扱うときは、Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓｃｈｌｅｉｄｅｒ ａｎｄ Ｓｈｕｅｌ、またはＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈから市販されているものの１つなど、ガスケットタイプのハイブリダイゼーションチャンバをしばしば使用する。カバーおよびガスケットが設けられるが、このガスケットの厚さは、カバースリップ法の液体被膜よりも厚いものである。ガスケットは、通常、これが保持する接着剤によってスライドに取着される。標的溶液注入口と共に、または標的溶液注入口無しで形成された透明カバーを、ガスケットの上面に取着する。これらのハイブリダイゼーションチャンバは、通常、５０μｌから８００μｌの体積を収容するが、これに限定するものではない。これらのガスケットタイプチャンバでのハイブリダイゼーションは、標的溶液を撹拌しながら（動的に）または撹拌せずに（静的）、行うことができる。
【０００５】
体積１ｍｌ以上のマイクロアレイのハイブリダイゼーションは、メイラー、染色ジャー、または同様の製品でしばしば行う。この方法では、両面でスライド全体を覆うのに十分な標的溶液が入っている容器内に、スライドを配置する。次いでこの容器を、ハイブリダイゼーション反応中に撹拌し、または静置することができる。
【０００６】
自動ハイブリダイゼーション機は、様々な種々のデザイン、容量、および撹拌機構を有するが、これらは、どの機械においても、スライド温度、体積、撹拌、およびハイブリダイゼーションステップと洗浄ステップの順序が前もってプログラムされており、ユーザの最小限の介入しか必要としない点が、類似している。
【背景技術】
【０００７】
マイクロアレイ技術は、ゲノミックスおよびプロテオミックスを含めた数多くの分野における研究の進展を促進させるため、現在使用されている有意なツールである。この技術は、生命科学の研究、医薬品およびバイオテクノロジーの研究開発、分子および臨床診断に、広範な用途がある。核酸（またはその他の生物学的部分）同士のハイブリダイゼーション反応は、マイクロアレイの適用分野に欠かせないものである。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応は、通常、固体支持体に結合された生物学的プローブ（オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ペプチド、タンパク質など）と、溶液中の遊離標的（オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ペプチド、タンパク質など）との間で生ずることになる。プローブおよび標的は、それらの性質とは無関係に、互いに相補的であり特異的である。例えば、オリゴヌクレオチド１本鎖プローブの場合、その標的は、相補的な１本鎖配列である。タンパク質アレイの場合、標的をタンパク質にすることができ（抗原）、そのプローブは、標的特異的抗体にすることができる。核酸ベースのマイクロアレイは、単一塩基のミスマッチがハイブリダイゼーション効率を著しく低下させることになるような、相補配列における特異的な誤りを検出することも可能である。
【０００８】
マイクロアレイのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション標的溶液を外部から撹拌することなく、静的条件下で実施することができる。このような条件下、拡散は、対流に限定され、標的の力学的特性（サイズ、移動度、溶液温度）およびハイブリダイゼーション溶液の粘度の影響を受ける。一般に、静的条件下でのハイブリダイゼーション動態は遅く、得られるハイブリダイゼーションは、時間がかかり予測不可能である。この場合の拡散は、完全に信頼性あるプロセスではなく、アレイの感受性および特異性に低下が生ずる可能性がある。マイクロアレイハイブリダイゼーションプロセスにおける別の矛盾は、アレイの加熱および向きのばらつきによって生ずる可能性がある。
【０００９】
カバースリップ法は、カバースリップによって生成される毛管作用がいかなる対流溶液運動も防ぐので、一般に、静的条件と共に常に使用される。この方法は、標的溶液の量が限られているときに好ましい。この方法では、数マイクロリットルの非常に高い濃度の標的溶液をマイクロアレイ上に配置し、この標的の上部に、ガラスまたはプラスチックのカバースリップを直接配置する。次いで標的溶液を、カバースリップとスライドとの間に毛管作用を介して薄層に広げる。カバースリップとスライドとの間に得られるような限られたスペースでは、流体が少しでもある場合にはその流体の動きを被膜層そのものに制限することが可能になる。さらに、標的溶液の蒸発が生じ、標的が乾燥しスライド上に沈殿することがわかっており、そのため走査上のアーチファクトと同様に別の矛盾も生ずる可能性がある。最も信頼性があり一貫しているマイクロアレイ測定では、環境条件および温度を、ハイブリダイゼーション中に非常に厳密に制御しなければならない。
【００１０】
大きい標的体積が利用可能であるときは、メイラー、染色ジャー、または円錐形遠心管も使用して、ハイブリダイゼーションを実施することができる。これらの容器に入っている液体ボリュームの効率的な撹拌は、揺動、振盪などによって実現することができる。適正に行うと、マイクロアレイの端から端まで標的溶液が完全に移動し、スライドの表面全体にわたり均一なハイブリダイゼーションが行われる。メイラーでのハイブリダイゼーションは、適正に行った場合、通常は効率的でありかつ一貫しているが、この方法は、大量の（おそらくは高価な）標的溶液を消費する必要がある。
【００１１】
カスケットベースのハイブリダイゼーションチャンバ実験は、典型的な場合、比較的少ない標的溶液体積（５０〜８００μｌ）を用いて実施される。このタイプのハイブリダイゼーションチャンバの１つの欠点は、スライドおよびハイブリダイゼーションチャンバの運動（回転、振盪など）を介した標的溶液の撹拌が、これらハイブリダイゼーションチャンバに固有の毛管作用の力を打ち消すのにしばしば不十分であることであり、したがって、マイクロアレイ全体を通してハイブリダイゼーションの一貫性が得られるような十分な混合は、しばしば実現されない。チャンバ内の撹拌を改善するための方法は、標的溶液への気泡の注入を利用する（例えば、特許文献１（２００３年９月２日）参照）。次いで引き続き行われるハイブリダイゼーション中のスライドおよびチャンバの運動は、気泡の運動により溶液を移動させ、その結果、ハイブリダイゼーションチャンバ全体にわたってより良好な混合がなされる。そのような気泡のメカニズムは、内部混合を行うが、残念ながらそのような混合は、スライド表面の端から端まで非常にしばしば均一ではない。装置をシェーカ（ボルテクサ）に取着した場合、気泡はチャンバの一端で捕捉される可能性がある。揺動機または軌道回転機（スライドが風車のような動作で動く）に取着された装置は、均一性に関する問題に直面する可能性もある。揺動機では、気泡が、マイクロアレイを保持するスライドの表面を上下に移動するが、一般に１つの特定の経路を辿り、軌道回転機では、気泡が、ハイブリダイゼーションチャンバの内縁に沿って移動するが、この場合もやはり、１つの特定の経路をしばしば辿り、スライドの中央領域では効率的に溶液を混合しない。そのような問題を克服しようとする試みが、文献に記載されている（例えば、特許文献２、３、および４参照）。
【００１２】
そのような反応において、ハイブリダイゼーション溶液を激しく撹拌する最後の方法は、自動ハイブリダイゼーションステーションの使用によるものである。商用とし提供されるもののデザイン、容量、撹拌機構は、様々である。しかしそのようなハイブリダイゼーションステーションは、典型的な場合に３万ドルから６万ドルかかり、これはしばしば法外なコストである。
【００１３】
これらの問題は、２次元（２Ｄ）マイクロアレイに比べ、３次元（３Ｄ）マイクロアレイのハイブリダイゼーションにおいて、さらに厄介な感じがする。そのような３Ｄマイクロアレイでのプローブは、３次元ヒドロゲルポリマーの液滴（９０〜９８％溶媒）内に固定化し、これを順に固体支持体に取着する。典型的な場合、支持体は、化学的に機能するガラスの顕微鏡用スライドであるが、任意のその他のタイプの固体または半固体材料、例えばプラスチック、シリコン、膜、または金属でもよい。プローブ含有スポットの数は、１から１００００までのどの範囲でもよい。次いでマイクロアレイを構成する複数のプローブスポットを、液体緩衝剤中に希釈した標的材料に曝して、ハイブリダイゼーションを検出する。ハイブリダイゼーション中、標的は、その相補的プローブに到達するように、各スポットまで、かつ各スポット内に拡散しなければならない。２Ｄアレイの場合でも、標的は、表面のプローブの部位に送達されなければならず、非結合標的は、全ての非相補的プローブから運び去る必要がある。したがって、標的溶液の適切な撹拌は、マイクロアレイハイブリダイゼーション反応の効率および一貫性に極めて重要である。ハイブリダイゼーションの温度、標的およびプローブの濃度、固定化したプローブへの、および固定化したプローブからの標的送達速度を含めた実験条件も、重要である。この最後の要素は、ハイブリダイゼーション反応中に標的溶液を混合する程度に、大きく影響される。十分混合した溶液は、一貫したハイブリダイゼーション結果をもたらすのに対し、不十分に混合された溶液は、再生不可能であると同時に、おそらくはアーチファクトが導入され易くなる。
【００１４】
ハイブリダイゼーションが終了した後、マイクロアレイは通常、洗浄ステップにかけられ、次いで乾燥され、データ収集装置を使用して走査される。これらの装置は、一般に、共焦点レーザスキャナ、ＣＣＤ（電荷結合素子）カメラシステム、または蛍光顕微鏡である。スキャナは単色光線を放出し、それによって、マイクロアレイに結合している蛍光体を励起する。次いで得られる発光をフィルタにかけ、光電子増倍管（ＰＭＴ）で収集し、強度数値に変換する。信号強度が大きくなるほど、その特定のプローブ／標的系に関するハイブリダイゼーションの程度は大きくなる。しばしば、マイクロアレイの結果は、マイクロアレイ上の筋、斑点、または高バックグラウンドによって悪影響を受け、または台無しにもなる可能性がある。これらのアーチファクトは、典型的な場合、ハイブリダイゼーション前の不適切な遮断、ハイブリダイゼーション中の不適切な溶液混合、またはハイブリダイゼーション後の不適正な洗浄によって引き起こされる。
【００１５】
【特許文献１】米国特許第６６１３５２９号明細書
【特許文献２】米国特許第６４８５９１８号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００２／１９２７０１号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／８７２９２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上述の問題を未然に防ぐため、改善されたハイブリダイゼーション装置に関する調査を継続した。
【００１７】
ハイブリダイゼーションチャンバ内で、少量の標的溶液の、十分なかつ一貫した混合を引き起こすための、新規な手法が開発されてきた。１個または数個の比較的大きい気泡を利用する、従来の気泡による方法とは異なって、この手法は、数多くのずっと小さい気泡を利用し、それによって、混合の程度、および全マイクロアレイ表面の端から端に至るハイブリダイゼーション反応の均一性を、大幅に増大させる。コストは、その他のガスケットベースのハイブリダイゼーションチャンバに等しく、ハイブリダイゼーションチャンバ内で使用される標的溶液の体積も、同様である。
【００１８】
これらの改善された装置では、ハイブリダイゼーションチャンバの内部ボリュームに横方向に突き出した、または突出した歯状突起の形をとることができる、気泡破砕要素の使用によって、超微粒気泡を発生させる。装置を操作すると、大きな気泡がその経路内の気泡破砕要素にぶつかるときに、超微粒気泡へと破砕される。そのような超微粒気泡の生成の結果、装置の動きによって、気泡が辿るために可能なはるかに大きな数の経路が存在し、それが、マイクロアレイの表面の端から端までの、より良好な溶液混合に繋がる。複数の経路、すなわちこれらの超微粒気泡がこの経路に沿って移動するその複数の経路は、典型的な場合、５０μｌから８００μｌの体積の標的溶液が入っているチャンバ内での完全なハイブリダイゼーションに望ましい標的溶液の内部撹拌の量を、確実にすると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
ある特定の態様では、反応性部分のマイクロアレイを取着することができる表面を有する平らな基板と、前記マイクロアレイが内部に位置付けられているチャンバが生成されるよう、前記表面に並列に配置されている液体障壁手段と、前記チャンバを閉じる手段とを含み、したがって、その内部に含まれる気泡以外、前記チャンバを満たす液体標的溶液を失うことなく操作することができるマイクロアレイハイブリダイゼーション装置であって、前記障壁手段は、前記チャンバに隣接して内側に向いている面を有し、この面は、前記チャンバ内に横方向に延びる複数の気泡破砕要素で形成されており、したがって、前記チャンバ内の液体標的溶液が前記面に沿って前記チャンバの１つの境界から別の境界へと移動するように前記装置が動作するときに、前記チャンバ内の当初の気泡が複数の超微粒気泡に破裂するようになされており、次いで前記超微粒気泡の運動によって推進される、マイクロアレイ全体の端から端に至る前記チャンバ中の液体標的溶液の非常に効果的な分布が、確実に行われる。
【００２０】
別の特定の態様では、プローブと標的溶液との間でハイブリダイゼーションを行う方法であって、この方法は、反応性プローブ部分のマイクロアレイが取着される表面を有する平らな基板を提供するステップと、前記マイクロアレイが内部に位置付けられているチャンバが生成されるよう、前記表面に周界液体障壁を並列に配置し、前記チャンバを閉じ、したがって、液体標的溶液を失うことなく前記基板を操作することができるようになされたステップと、前記チャンバに、標的溶液および気泡を充填するステップと、標的溶液が前記チャンバの１つの境界から別の境界へと移動するように前記基板を移動させるステップとを含み、この場合、少なくとも１つのそのような境界は、そのような移動の結果、前記チャンバ内の気泡が複数の超微粒気泡に破裂し、次いでその後に続くそのような超微粒気泡の運動によって推進される、マイクロアレイ全体の端から端に至る液体標的溶液の非常に効果的な分布が確実になるようになされている。
【００２１】
さらに別の特定の態様では、表面にマイクロアレイを有する基板を備えたマイクロアレイハイブリダイゼーション装置を形成するためのカバーおよびガスケットのサブアセンブリであって、このサブアセンブリは、上面および下面を有する平らなカバーと、前記カバーの前記下面に添着された長方形の周界障壁と、前記マイクロアレイを取り囲むように、前記基板の表面に前記カバーを取着するための、前記周界障壁の下面にある感圧性接着剤と、前記接着剤を覆う剥離シートとを含み、前記障壁は、前記チャンバに隣接する内側に向いた面を有し、この面は、前記チャンバ内に横方向に延びる複数の気泡破砕要素で形成され、したがって、前記チャンバ内の液体標的溶液が前記面に沿って前記チャンバの１つの境界から別の境界へと移動するように前記装置が動作するときに、前記チャンバ内の当初の気泡が複数の超微粒気泡に破裂するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
図１から３には、本発明の様々な特徴を具体化したマイクロアレイハイブリダイゼーション装置１１の例が、示されている。密閉したハイブリダイゼーションチャンバを生成するためにスライドガラス１５などに結合される、カバーおよびガスケットのサブアセンブリ１３の、構成要素が示されており、このサブアセンブリは、平らなカバー１７と周辺ガスケット１９とを含む。
【００２３】
スライドガラス１５は、その上にマイクロアレイを取着することができる平らな基板を提供する。基板１５は、標準的な実験室用スライドガラスでよいが、生体サンプルを担持するのに適切と考えられる任意のその他の平らな表面提供物質を、使用してもよい。例えば、ガラスの代わりにポリマー材料で、あるいは、プローブ担持マイクロドットを付着させることができる任意のその他の適切な不浸透性材料で作製してもよい。標準的な実験室用スライド１５の形は、寸法が１×３インチの長方形である。当然ながら、その他のサイズおよび／または形状を使用してもよいが、マイクロアッセイハイブリダイゼーションの反応には、規格に合ったものが望ましい。一般に、基板の厚さは、表面が不透過性である限り重要ではない。
【００２４】
サブアセンブリのカバー１７は、ハイブリダイゼーションチャンバ用の平らな上面を提供する液体不透過性材料の長方形シートでよく、その面には、周界または周辺ガスケット１９が固着される。ガスケットは、カバーと同じ外部寸法を有することができ、したがって、その縁部は本質的に同一平面になる。カバー−ガスケットのサブアセンブリは、製造を経済的に行うために単一の部品にすることができるが、後で、接着剤、溶媒結合、ヒートシールなどの任意の適切な手段を用い、一緒に適切に接合される個別の部品として作製することが好ましい。例えば、カバー１７とガスケット１９との両方をポリマー材料で作製し、高強度接着剤によって適切に接合することができる。
【００２５】
例えばカバーは、サブアセンブリがスライドガラスまたはその他の基板にいったん接合したら、形成されたチャンバに注入されたハイブリダイゼーション標的水溶液を引き付けないように、ポリカーボネート、またはポリプロピレン、またはポリエチレン、または好ましくは疎水性である何らかのその他のポリマー材料のシートから、単に切断することができる。カバーは透明でよく、いくつかの用途では、光学的に透明であることが好ましい。しかし、その他の用途では、例えば感光性の場合には、カバーを、好ましくは不透明にすることができる。
【００２６】
ガスケット１９は、適切なシート材料から単にダイカットすることができ、または射出成型によって大量に成型することができる。また、ポリマー材料から作製してもよく、ハイブリダイゼーションインキュベーション反応を行うことができる液密タイプのチャンバが提供されるように、その材料が液体不透過性である限り、カバーと同じポリマーまたは適合性あるポリマーから形成することもできる。また、疎水性材料で形成することも好ましい。例えばガスケット１９は、カバー１７の下面に容易に重ね合わせることができるよう、またはその他の方法でカバー１７の下面に固着することができるよう、一方の面に高強度感圧性接着剤を有する独立気泡ポリマーフォーム材料から、ダイカットすることができる。
【００２７】
サブアセンブリは、好ましくは引き続き、マイクロアレイを担持する平らな基板に接着接合するように、かつそのような接合を容易にするように設計され、ガスケット１９の下面には、感圧性接着剤の層が設けられ、剥離層２１によって覆われることが好ましい。剥離層２１は、ガスケット１９の接着面を覆うだけのものでよく、またはその形状を長方形にすることができ、本質的にはカバーと同じ寸法にすることができ、したがってチャンバの全面が密封され、確実に清浄にする。前者の配置構成では、ガスケット１９をストック材料からダイカットすると同時にダイカットすることができる。カバー１７は、剛性でよく、または柔軟性を有することができ、ガスケット１９の材料も同様の特徴を有するものでよい。ほとんどのハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイを洗浄し次いで処理または分析を行うことができるようにガスケット付きカバーを除去することが望ましくなるので、カバー１７は、その基板からの剥離が容易になるように柔軟性を持つことが好ましい。
【００２８】
操作中、マイクロアレイ２３をいったんスライドガラス１５の上面に付着した後は、ハイブリダイゼーションインキュベーション装置の生成のためにサブアセンブリ１３を取着する用意ができる。したがって剥離層２１を、接着剤を持つガスケット１９の下面から単に慎重に剥離し、ガスケット付きカバーは、図２の示す装置が生成されるよう一般に３つの縁部と面とを位置合わせすることによって、スライドに慎重に接合し、これにより、スライドガラスの上面１６、カバー１７の下面、およびガスケット１９の壁の内面で範囲が画定された反応チャンバ２５が形成され、このときガスケットは、対向する平らな基板１６とカバー１７とを密封する。次いでマイクロアレイ２３が位置付けられている液密チャンバ２５に、液体標的溶液を充填する。
【００２９】
ガスケット１９についてより厳密に試験すると、このガスケット１９は、サブアセンブリ１３をスライドガラス１９に重ね合わせた後に長方形の反応チャンバを形成する２つの平行な長い壁面３１、およびこれらに対して直角な２つの短い壁面３３の形をした周辺障壁として、働くことがわかる。カバー１７は、好ましくはチャンバの両端付近に位置付けられた１対のアパーチャまたは開口３５を含み、それによって、一方のアパーチャ３５を通してチャンバに充填すること、および対向する端部のもう一方のアパーチャ３５を通して空気を逃がすことが容易になる。カバー１７は、インキュベーション期間が終了した後に、スライドからこのカバー１７を剥がすのを容易にするタブ３９を担持することが好ましい。タブは、ガスケット１９越しに延びる１つの縁部の延長部として、またはカバーの縁部の残りから外向きに延びるダイカットされた突起として、カバー１７に一体化した部品にすることができるが、図２に示すようにカバーの下面に添着し、マイクロアレイが位置付けられていないスライドガラスの端部に沿って延びることが好ましい。これは、剛性または柔軟性を持つ材料で作製し、接着剤、熱または溶媒結合などによってしっかりと取着することができる。カバー１７およびタブ３９は、インキュベーションの後の剥離が容易になるように、共に柔軟性があることが好ましい。この装置は、気泡が残るように、ハイブリダイゼーション標的溶液をチャンバに不完全に充填することによって使用されるよう設計され、その目的は、ハイブリダイゼーション反応を起こしながら、装置の動作中に混合を促進させることである。充填がいったん終了したら、単にアパーチャの全面に適合し、いかなる漏れも防止する、栓または接着封止材３７を付着させることによって、任意の適切な手法でアパーチャ３５を閉じる。
【００３０】
前に述べたように、反応チャンバ内の大きな気泡の運動は、混合をいくらか促進させるが真に効果的とは考えられず、ガスケットまたは周辺障壁１９は、より短い１対の壁面３３の表面から反応チャンバ２５内に延びる複数の気泡破砕要素４１と共に構成される。これらの気泡破砕要素４１は、疎水性であることが好ましく、尖ったエッジ４３を先端に有する三角形の指片として形成され、この要素４１は、水溶液中の気泡に接触すると、その気泡をより小さい体積の２つの個別の気泡に分割する。その結果、標的溶液を充填した装置の連続操作を、例えば数時間にわたって継続するにつれ、当初の気泡およびその後にできる気泡は、何度も繰り返し分割され、水溶液中に多数の超微粒気泡を生成し、これらの超微粒気泡は、装置を以下に述べるように操作したときに端部から端部まで移動するように、反応チャンバの内部の幅の端から端まで本質的に均一に広がる。
【００３１】
尖ったエッジ４３は、スライドガラス１５とカバー１７の、２つの対向する平らな面の間に延び、そこに本質的に垂直に並べられる。ポケット領域４５は、気泡破砕要素４１の間に位置付けられ、これらは超微粒気泡の形成に順応し、かつそのような形成を促進させる。充填された装置をどのように回転させるかに応じて、気泡がより短い壁面３３に接近したときにその気泡がチャンバ内を上昇する一般的な方向を気泡破砕要素４１が指し示すように、その気泡破砕要素４１を構成し、またその狙い定めることが望ましいと考えられる。壁面３３に対して本質的に垂直な方向で、気泡がその壁面３３に接近するような操作である場合、気泡破砕要素４１は、内壁面から直接外に向けることができる。図示される配置構成では、破砕要素は隣接する壁面に対して約４５℃の角度を向いており、またはその角度に位置合わせされており、より長い壁面３１のより低い内壁面を指し示しており、それに対して装置をスライドガラス自体の平面内で回転させたときに気泡が上昇することができ、そのような配置構成が好ましいと考えられる。気泡破砕要素４１が、気泡の上昇流を指し示すような向きでは、気泡が尖ったエッジ４３に接触したときに分割するという、より大きな傾向がある。
【００３２】
図４には、例えば６〜１８時間に及ぶ可能性のあるインキュベーション中に、標的溶液を充填した装置を連続的に回転させまたは操作するのに使用することができる、１つのタイプの装置例が示されている。そこに示されているのは、ほぼ水平な軸５３に支持されている支持ホイール５１であり、かつこのホイール５１は、所望の速度で、好ましくは約２〜２０ｒｐｍの間、例えば約８ｒｐｍの速度で軸およびホイールの回転を引き起こす、電気モータを含んだ支持ベース５５によって駆動されるものである。ホイールの片面または両面は、標的溶液を充填したハイブリダイゼーション装置１１を複数含んだカートリッジ５９を受容するよう設計された複数の支持体５７を含み、したがって、多数の試験サンプルのインキュベーションを一度に行うのを容易にする。当然ながら、同じホイール表面のその他の支持体は、望む場合には、カートリッジ５９内に支持されない個々の装置を受容するよう構成することができる。配置構成は、装置１１がその平面内でゆっくり回転し、したがって気泡が、一般にチャンバの高いほうにある１つの長い壁面３１に沿って、上昇する傾向を持つものであることが好ましい。
【００３３】
本発明について、本発明を実施するのに現在のところ知られている最良の形態を構成する、ある特定の好ましい実施形態に関して述べてきたが、添付される特許請求の範囲に定義された本発明の範囲から逸脱することなく、当業者に明らかな様々な修正および変更を加えることができることを、理解すべきである。本発明の特定の特徴を、以下の特許請求の範囲で明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の、様々な特徴を有するマイクロアレイハイブリダイゼーション装置を構成するよう設計された、カバーおよびガスケットのサブアセンブリと組み合わせたスライドガラスを示す、分解斜視図である。
【図２】図１の構成要素から組み立てられたマイクロアレイハイブリダイゼーション装置を示す、サイズを拡大した側面図である。
【図３】図１に示すガスケットの断面の、拡大部分平面図である。
【図４】ハイブリダイゼーションインキュベーション中の、請求項２に記載の充填された装置を操作するための装置の、概略図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、比較的少ない量の標的溶液を使用して、マイクロアッセイのハイブリダイゼーションを効果的にかつ効率的に実施するための装置に関し、より詳細には、一般に、ガスケットタイプまたはガスケット付きのハイブリダイゼーションチャンバと呼ばれるタイプの改善された装置であって、マイクロアッセイを含むそのようなチャンバ内で、わずか５０または数百マイクロリットルの標的溶液との完全な混合が実現されるよう設計された装置に関する。
【０００２】
マイクロアレイのハイブリダイゼーションは、顕微鏡用スライド表面に結合させた「プローブ」分子を「標的」分子の溶液に曝すことによって、しばしば実施される。現在のところ、この一般的な方法によってマイクロアレイをハイブリダイズするための、主流となる４つの方法があり、これらはカバースリップ、ガスケット付きハイブリダイゼーションチャンバ、顕微鏡用スライドメイラー、および自動ハイブリダイゼーション機器と呼ばれている。どの方法を実施するかという選択は、プローブおよび／または標的の利用可能性、試薬およびハードウェアのコスト、性能要件、およびユーザの専門知識などの要因に、しばしば左右される。
【０００３】
カバースリップ法は、スライド当たりの標的体積が数マイクロリットルに限定されているときに使用する。数滴の標的をスライド上に堆積し、薄いガラスまたはプラスチックのカバースリップを、標的の上部に配置する。カバースリップとスライドとの間の毛管作用によって、標的溶液の薄膜が捕えられる。
【０００４】
中間の体積を取り扱うときは、Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓｃｈｌｅｉｄｅｒ ａｎｄ Ｓｈｕｅｌ、またはＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈから市販されているものの１つなど、ガスケットタイプのハイブリダイゼーションチャンバをしばしば使用する。カバーおよびガスケットが設けられるが、このガスケットの厚さは、カバースリップ法の液体被膜よりも厚いものである。ガスケットは、通常、これが保持する接着剤によってスライドに取着される。標的溶液注入口と共に、または標的溶液注入口無しで形成された透明カバーを、ガスケットの上面に取着する。これらのハイブリダイゼーションチャンバは、通常、５０μｌから８００μｌの体積を収容するが、これに限定するものではない。これらのガスケットタイプチャンバでのハイブリダイゼーションは、標的溶液を撹拌しながら（動的に）または撹拌せずに（静的）、行うことができる。
【０００５】
体積１ｍｌ以上のマイクロアレイのハイブリダイゼーションは、メイラー、染色ジャー、または同様の製品でしばしば行う。この方法では、両面でスライド全体を覆うのに十分な標的溶液が入っている容器内に、スライドを配置する。次いでこの容器を、ハイブリダイゼーション反応中に撹拌し、または静置することができる。
【０００６】
自動ハイブリダイゼーション機は、様々な種々のデザイン、容量、および撹拌機構を有するが、これらは、どの機械においても、スライド温度、体積、撹拌、およびハイブリダイゼーションステップと洗浄ステップの順序が前もってプログラムされており、ユーザの最小限の介入しか必要としない点が、類似している。
【背景技術】
【０００７】
マイクロアレイ技術は、ゲノミックスおよびプロテオミックスを含めた数多くの分野における研究の進展を促進させるため、現在使用されている有意なツールである。この技術は、生命科学の研究、医薬品およびバイオテクノロジーの研究開発、分子および臨床診断に、広範な用途がある。核酸（またはその他の生物学的部分）同士のハイブリダイゼーション反応は、マイクロアレイの適用分野に欠かせないものである。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応は、通常、固体支持体に結合された生物学的プローブ（オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ペプチド、タンパク質など）と、溶液中の遊離標的（オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ペプチド、タンパク質など）との間で生ずることになる。プローブおよび標的は、それらの性質とは無関係に、互いに相補的であり特異的である。例えば、オリゴヌクレオチド１本鎖プローブの場合、その標的は、相補的な１本鎖配列である。タンパク質アレイの場合、標的をタンパク質にすることができ（抗原）、そのプローブは、標的特異的抗体にすることができる。核酸ベースのマイクロアレイは、単一塩基のミスマッチがハイブリダイゼーション効率を著しく低下させることになるような、相補配列における特異的な誤りを検出することも可能である。
【０００８】
マイクロアレイのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション標的溶液を外部から撹拌することなく、静的条件下で実施することができる。このような条件下、拡散は、対流に限定され、標的の力学的特性（サイズ、移動度、溶液温度）およびハイブリダイゼーション溶液の粘度の影響を受ける。一般に、静的条件下でのハイブリダイゼーション動態は遅く、得られるハイブリダイゼーションは、時間がかかり予測不可能である。この場合の拡散は、完全に信頼性あるプロセスではなく、アレイの感受性および特異性に低下が生ずる可能性がある。マイクロアレイハイブリダイゼーションプロセスにおける別の矛盾は、アレイの加熱および向きのばらつきによって生ずる可能性がある。
【０００９】
カバースリップ法は、カバースリップによって生成される毛管作用がいかなる対流溶液運動も防ぐので、一般に、静的条件と共に常に使用される。この方法は、標的溶液の量が限られているときに好ましい。この方法では、数マイクロリットルの非常に高い濃度の標的溶液をマイクロアレイ上に配置し、この標的の上部に、ガラスまたはプラスチックのカバースリップを直接配置する。次いで標的溶液を、カバースリップとスライドとの間に毛管作用を介して薄層に広げる。カバースリップとスライドとの間に得られるような限られたスペースでは、流体が少しでもある場合にはその流体の動きを被膜層そのものに制限することが可能になる。さらに、標的溶液の蒸発が生じ、標的が乾燥しスライド上に沈殿することがわかっており、そのため走査上のアーチファクトと同様に別の矛盾も生ずる可能性がある。最も信頼性があり一貫しているマイクロアレイ測定では、環境条件および温度を、ハイブリダイゼーション中に非常に厳密に制御しなければならない。
【００１０】
大きい標的体積が利用可能であるときは、メイラー、染色ジャー、または円錐形遠心管も使用して、ハイブリダイゼーションを実施することができる。これらの容器に入っている液体ボリュームの効率的な撹拌は、揺動、振盪などによって実現することができる。適正に行うと、マイクロアレイの端から端まで標的溶液が完全に移動し、スライドの表面全体にわたり均一なハイブリダイゼーションが行われる。メイラーでのハイブリダイゼーションは、適正に行った場合、通常は効率的でありかつ一貫しているが、この方法は、大量の（おそらくは高価な）標的溶液を消費する必要がある。
【００１１】
カスケットベースのハイブリダイゼーションチャンバ実験は、典型的な場合、比較的少ない標的溶液体積（５０〜８００μｌ）を用いて実施される。このタイプのハイブリダイゼーションチャンバの１つの欠点は、スライドおよびハイブリダイゼーションチャンバの運動（回転、振盪など）を介した標的溶液の撹拌が、これらハイブリダイゼーションチャンバに固有の毛管作用の力を打ち消すのにしばしば不十分であることであり、したがって、マイクロアレイ全体を通してハイブリダイゼーションの一貫性が得られるような十分な混合は、しばしば実現されない。チャンバ内の撹拌を改善するための方法は、標的溶液への気泡の注入を利用する（例えば、特許文献１（２００３年９月２日）参照）。次いで引き続き行われるハイブリダイゼーション中のスライドおよびチャンバの運動は、気泡の運動により溶液を移動させ、その結果、ハイブリダイゼーションチャンバ全体にわたってより良好な混合がなされる。そのような気泡のメカニズムは、内部混合を行うが、残念ながらそのような混合は、スライド表面の端から端まで非常にしばしば均一ではない。装置をシェーカ（ボルテクサ）に取着した場合、気泡はチャンバの一端で捕捉される可能性がある。揺動機または軌道回転機（スライドが風車のような動作で動く）に取着された装置は、均一性に関する問題に直面する可能性もある。揺動機では、気泡が、マイクロアレイを保持するスライドの表面を上下に移動するが、一般に１つの特定の経路を辿り、軌道回転機では、気泡が、ハイブリダイゼーションチャンバの内縁に沿って移動するが、この場合もやはり、１つの特定の経路をしばしば辿り、スライドの中央領域では効率的に溶液を混合しない。そのような問題を克服しようとする試みが、文献に記載されている（例えば、特許文献２、３、および４参照）。
【００１２】
そのような反応において、ハイブリダイゼーション溶液を激しく撹拌する最後の方法は、自動ハイブリダイゼーションステーションの使用によるものである。商用とし提供されるもののデザイン、容量、撹拌機構は、様々である。しかしそのようなハイブリダイゼーションステーションは、典型的な場合に３万ドルから６万ドルかかり、これはしばしば法外なコストである。
【００１３】
これらの問題は、２次元（２Ｄ）マイクロアレイに比べ、３次元（３Ｄ）マイクロアレイのハイブリダイゼーションにおいて、さらに厄介な感じがする。そのような３Ｄマイクロアレイでのプローブは、３次元ヒドロゲルポリマーの液滴（９０〜９８％溶媒）内に固定化し、これを順に固体支持体に取着する。典型的な場合、支持体は、化学的に機能するガラスの顕微鏡用スライドであるが、任意のその他のタイプの固体または半固体材料、例えばプラスチック、シリコン、膜、または金属でもよい。プローブ含有スポットの数は、１から１００００までのどの範囲でもよい。次いでマイクロアレイを構成する複数のプローブスポットを、液体緩衝剤中に希釈した標的材料に曝して、ハイブリダイゼーションを検出する。ハイブリダイゼーション中、標的は、その相補的プローブに到達するように、各スポットまで、かつ各スポット内に拡散しなければならない。２Ｄアレイの場合でも、標的は、表面のプローブの部位に送達されなければならず、非結合標的は、全ての非相補的プローブから運び去る必要がある。したがって、標的溶液の適切な撹拌は、マイクロアレイハイブリダイゼーション反応の効率および一貫性に極めて重要である。ハイブリダイゼーションの温度、標的およびプローブの濃度、固定化したプローブへの、および固定化したプローブからの標的送達速度を含めた実験条件も、重要である。この最後の要素は、ハイブリダイゼーション反応中に標的溶液を混合する程度に、大きく影響される。十分混合した溶液は、一貫したハイブリダイゼーション結果をもたらすのに対し、不十分に混合された溶液は、再生不可能であると同時に、おそらくはアーチファクトが導入され易くなる。
【００１４】
ハイブリダイゼーションが終了した後、マイクロアレイは通常、洗浄ステップにかけられ、次いで乾燥され、データ収集装置を使用して走査される。これらの装置は、一般に、共焦点レーザスキャナ、ＣＣＤ（電荷結合素子）カメラシステム、または蛍光顕微鏡である。スキャナは単色光線を放出し、それによって、マイクロアレイに結合している蛍光体を励起する。次いで得られる発光をフィルタにかけ、光電子増倍管（ＰＭＴ）で収集し、強度数値に変換する。信号強度が大きくなるほど、その特定のプローブ／標的系に関するハイブリダイゼーションの程度は大きくなる。しばしば、マイクロアレイの結果は、マイクロアレイ上の筋、斑点、または高バックグラウンドによって悪影響を受け、または台無しにもなる可能性がある。これらのアーチファクトは、典型的な場合、ハイブリダイゼーション前の不適切な遮断、ハイブリダイゼーション中の不適切な溶液混合、またはハイブリダイゼーション後の不適正な洗浄によって引き起こされる。
【００１５】
【特許文献１】米国特許第６６１３５２９号明細書
【特許文献２】米国特許第６４８５９１８号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００２／１９２７０１号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／８７２９２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上述の問題を未然に防ぐため、改善されたハイブリダイゼーション装置に関する調査を継続した。
【００１７】
ハイブリダイゼーションチャンバ内で、少量の標的溶液の、十分なかつ一貫した混合を引き起こすための、新規な手法が開発されてきた。１個または数個の比較的大きい気泡を利用する、従来の気泡による方法とは異なって、この手法は、数多くのずっと小さい気泡を利用し、それによって、混合の程度、および全マイクロアレイ表面の端から端に至るハイブリダイゼーション反応の均一性を、大幅に増大させる。コストは、その他のガスケットベースのハイブリダイゼーションチャンバに等しく、ハイブリダイゼーションチャンバ内で使用される標的溶液の体積も、同様である。
【００１８】
これらの改善された装置では、ハイブリダイゼーションチャンバの内部ボリュームに横方向に突き出した、または突出した歯状突起の形をとることができる、気泡破砕要素の使用によって、超微粒気泡を発生させる。装置を操作すると、大きな気泡がその経路内の気泡破砕要素にぶつかるときに、超微粒気泡へと破砕される。そのような超微粒気泡の生成の結果、装置の動きによって、気泡が辿るために可能なはるかに大きな数の経路が存在し、それが、マイクロアレイの表面の端から端までの、より良好な溶液混合に繋がる。複数の経路、すなわちこれらの超微粒気泡がこの経路に沿って移動するその複数の経路は、典型的な場合、５０μｌから８００μｌの体積の標的溶液が入っているチャンバ内での完全なハイブリダイゼーションに望ましい標的溶液の内部撹拌の量を、確実にすると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
ある特定の態様では、反応性部分のマイクロアレイを取着することができる表面を有する平らな基板と、前記マイクロアレイが内部に位置付けられているチャンバが生成されるよう、前記表面に並列に配置されている液体障壁手段と、前記チャンバを閉じる手段とを含み、したがって、その内部に含まれる気泡以外、前記チャンバを満たす液体標的溶液を失うことなく操作することができるマイクロアレイハイブリダイゼーション装置であって、前記障壁手段は、前記チャンバに隣接して内側に向いている面を有し、この面は、前記チャンバ内に横方向に延びる複数の気泡破砕要素で形成されており、したがって、前記チャンバ内の液体標的溶液が前記面に沿って前記チャンバの１つの境界から別の境界へと移動するように前記装置が動作するときに、前記チャンバ内の当初の気泡が複数の超微粒気泡に破裂するようになされており、次いで前記超微粒気泡の運動によって推進される、マイクロアレイ全体の端から端に至る前記チャンバ中の液体標的溶液の非常に効果的な分布が、確実に行われる。
【００２０】
別の特定の態様では、プローブと標的溶液との間でハイブリダイゼーションを行う方法であって、この方法は、反応性プローブ部分のマイクロアレイが取着される表面を有する平らな基板を提供するステップと、前記マイクロアレイが内部に位置付けられているチャンバが生成されるよう、前記表面に周界液体障壁を並列に配置し、前記チャンバを閉じ、したがって、液体標的溶液を失うことなく前記基板を操作することができるようになされたステップと、前記チャンバに、標的溶液および気泡を充填するステップと、標的溶液が前記チャンバの１つの境界から別の境界へと移動するように前記基板を移動させるステップとを含み、この場合、少なくとも１つのそのような境界は、そのような移動の結果、前記チャンバ内の気泡が複数の超微粒気泡に破裂し、次いでその後に続くそのような超微粒気泡の運動によって推進される、マイクロアレイ全体の端から端に至る液体標的溶液の非常に効果的な分布が確実になるようになされている。
【００２１】
さらに別の特定の態様では、表面にマイクロアレイを有する基板を備えたマイクロアレイハイブリダイゼーション装置を形成するためのカバーおよびガスケットのサブアセンブリであって、このサブアセンブリは、上面および下面を有する平らなカバーと、前記カバーの前記下面に添着された長方形の周界障壁と、前記マイクロアレイを取り囲むように、前記基板の表面に前記カバーを取着するための、前記周界障壁の下面にある感圧性接着剤と、前記接着剤を覆う剥離シートとを含み、前記障壁は、前記チャンバに隣接する内側に向いた面を有し、この面は、前記チャンバ内に横方向に延びる複数の気泡破砕要素で形成され、したがって、前記チャンバ内の液体標的溶液が前記面に沿って前記チャンバの１つの境界から別の境界へと移動するように前記装置が動作するときに、前記チャンバ内の当初の気泡が複数の超微粒気泡に破裂するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
図１から３には、本発明の様々な特徴を具体化したマイクロアレイハイブリダイゼーション装置１１の例が、示されている。密閉したハイブリダイゼーションチャンバを生成するためにスライドガラス１５などに結合される、カバーおよびガスケットのサブアセンブリ１３の、構成要素が示されており、このサブアセンブリは、平らなカバー１７と周辺ガスケット１９とを含む。
【００２３】
スライドガラス１５は、その上にマイクロアレイを取着することができる平らな基板を提供する。基板１５は、標準的な実験室用スライドガラスでよいが、生体サンプルを担持するのに適切と考えられる任意のその他の平らな表面提供物質を、使用してもよい。例えば、ガラスの代わりにポリマー材料で、あるいは、プローブ担持マイクロドットを付着させることができる任意のその他の適切な不浸透性材料で作製してもよい。標準的な実験室用スライド１５の形は、寸法が１×３インチの長方形である。当然ながら、その他のサイズおよび／または形状を使用してもよいが、マイクロアッセイハイブリダイゼーションの反応には、規格に合ったものが望ましい。一般に、基板の厚さは、表面が不透過性である限り重要ではない。
【００２４】
サブアセンブリのカバー１７は、ハイブリダイゼーションチャンバ用の平らな上面を提供する液体不透過性材料の長方形シートでよく、その面には、周界または周辺ガスケット１９が固着される。ガスケットは、カバーと同じ外部寸法を有することができ、したがって、その縁部は本質的に同一平面になる。カバー−ガスケットのサブアセンブリは、製造を経済的に行うために単一の部品にすることができるが、後で、接着剤、溶媒結合、ヒートシールなどの任意の適切な手段を用い、一緒に適切に接合される個別の部品として作製することが好ましい。例えば、カバー１７とガスケット１９との両方をポリマー材料で作製し、高強度接着剤によって適切に接合することができる。
【００２５】
例えばカバーは、サブアセンブリがスライドガラスまたはその他の基板にいったん接合したら、形成されたチャンバに注入されたハイブリダイゼーション標的水溶液を引き付けないように、ポリカーボネート、またはポリプロピレン、またはポリエチレン、または好ましくは疎水性である何らかのその他のポリマー材料のシートから、単に切断することができる。カバーは透明でよく、いくつかの用途では、光学的に透明であることが好ましい。しかし、その他の用途では、例えば感光性の場合には、カバーを、好ましくは不透明にすることができる。
【００２６】
ガスケット１９は、適切なシート材料から単にダイカットすることができ、または射出成型によって大量に成型することができる。また、ポリマー材料から作製してもよく、ハイブリダイゼーションインキュベーション反応を行うことができる液密タイプのチャンバが提供されるように、その材料が液体不透過性である限り、カバーと同じポリマーまたは適合性あるポリマーから形成することもできる。また、疎水性材料で形成することも好ましい。例えばガスケット１９は、カバー１７の下面に容易に重ね合わせることができるよう、またはその他の方法でカバー１７の下面に固着することができるよう、一方の面に高強度感圧性接着剤を有する独立気泡ポリマーフォーム材料から、ダイカットすることができる。
【００２７】
サブアセンブリは、好ましくは引き続き、マイクロアレイを担持する平らな基板に接着接合するように、かつそのような接合を容易にするように設計され、ガスケット１９の下面には、感圧性接着剤の層が設けられ、剥離層２１によって覆われることが好ましい。剥離層２１は、ガスケット１９の接着面を覆うだけのものでよく、またはその形状を長方形にすることができ、本質的にはカバーと同じ寸法にすることができ、したがってチャンバの全面が密封され、確実に清浄にする。前者の配置構成では、ガスケット１９をストック材料からダイカットすると同時にダイカットすることができる。カバー１７は、剛性でよく、または柔軟性を有することができ、ガスケット１９の材料も同様の特徴を有するものでよい。ほとんどのハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイを洗浄し次いで処理または分析を行うことができるようにガスケット付きカバーを除去することが望ましくなるので、カバー１７は、その基板からの剥離が容易になるように柔軟性を持つことが好ましい。
【００２８】
操作中、マイクロアレイ２３をいったんスライドガラス１５の上面に付着した後は、ハイブリダイゼーションインキュベーション装置の生成のためにサブアセンブリ１３を取着する用意ができる。したがって剥離層２１を、接着剤を持つガスケット１９の下面から単に慎重に剥離し、ガスケット付きカバーは、図２の示す装置が生成されるよう一般に３つの縁部と面とを位置合わせすることによって、スライドに慎重に接合し、これにより、スライドガラスの上面１６、カバー１７の下面、およびガスケット１９の壁の内面で範囲が画定された反応チャンバ２５が形成され、このときガスケットは、対向する平らな基板１６とカバー１７とを密封する。次いでマイクロアレイ２３が位置付けられている液密チャンバ２５に、液体標的溶液を充填する。
【００２９】
ガスケット１９についてより厳密に試験すると、このガスケット１９は、サブアセンブリ１３をスライドガラス１９に重ね合わせた後に長方形の反応チャンバを形成する２つの平行な長い壁面３１、およびこれらに対して直角な２つの短い壁面３３の形をした周辺障壁として、働くことがわかる。カバー１７は、好ましくはチャンバの両端付近に位置付けられた１対のアパーチャまたは開口３５を含み、それによって、一方のアパーチャ３５を通してチャンバに充填すること、および対向する端部のもう一方のアパーチャ３５を通して空気を逃がすことが容易になる。カバー１７は、インキュベーション期間が終了した後に、スライドからこのカバー１７を剥がすのを容易にするタブ３９を担持することが好ましい。タブは、ガスケット１９越しに延びる１つの縁部の延長部として、またはカバーの縁部の残りから外向きに延びるダイカットされた突起として、カバー１７に一体化した部品にすることができるが、図２に示すようにカバーの下面に添着し、マイクロアレイが位置付けられていないスライドガラスの端部に沿って延びることが好ましい。これは、剛性または柔軟性を持つ材料で作製し、接着剤、熱または溶媒結合などによってしっかりと取着することができる。カバー１７およびタブ３９は、インキュベーションの後の剥離が容易になるように、共に柔軟性があることが好ましい。この装置は、気泡が残るように、ハイブリダイゼーション標的溶液をチャンバに不完全に充填することによって使用されるよう設計され、その目的は、ハイブリダイゼーション反応を起こしながら、装置の動作中に混合を促進させることである。充填がいったん終了したら、単にアパーチャの全面に適合し、いかなる漏れも防止する、栓または接着封止材３７を付着させることによって、任意の適切な手法でアパーチャ３５を閉じる。
【００３０】
前に述べたように、反応チャンバ内の大きな気泡の運動は、混合をいくらか促進させるが真に効果的とは考えられず、ガスケットまたは周辺障壁１９は、より短い１対の壁面３３の表面から反応チャンバ２５内に延びる複数の気泡破砕要素４１と共に構成される。これらの気泡破砕要素４１は、疎水性であることが好ましく、尖ったエッジ４３を先端に有する三角形の指片として形成され、この要素４１は、水溶液中の気泡に接触すると、その気泡をより小さい体積の２つの個別の気泡に分割する。その結果、標的溶液を充填した装置の連続操作を、例えば数時間にわたって継続するにつれ、当初の気泡およびその後にできる気泡は、何度も繰り返し分割され、水溶液中に多数の超微粒気泡を生成し、これらの超微粒気泡は、装置を以下に述べるように操作したときに端部から端部まで移動するように、反応チャンバの内部の幅の端から端まで本質的に均一に広がる。
【００３１】
尖ったエッジ４３は、スライドガラス１５とカバー１７の、２つの対向する平らな面の間に延び、そこに本質的に垂直に並べられる。ポケット領域４５は、気泡破砕要素４１の間に位置付けられ、これらは超微粒気泡の形成に順応し、かつそのような形成を促進させる。充填された装置をどのように回転させるかに応じて、気泡がより短い壁面３３に接近したときにその気泡がチャンバ内を上昇する一般的な方向を気泡破砕要素４１が指し示すように、その気泡破砕要素４１を構成し、またその狙い定めることが望ましいと考えられる。壁面３３に対して本質的に垂直な方向で、気泡がその壁面３３に接近するような操作である場合、気泡破砕要素４１は、内壁面から直接外に向けることができる。図示される配置構成では、破砕要素は隣接する壁面に対して約４５℃の角度を向いており、またはその角度に位置合わせされており、より長い壁面３１のより低い内壁面を指し示しており、それに対して装置をスライドガラス自体の平面内で回転させたときに気泡が上昇することができ、そのような配置構成が好ましいと考えられる。気泡破砕要素４１が、気泡の上昇流を指し示すような向きでは、気泡が尖ったエッジ４３に接触したときに分割するという、より大きな傾向がある。
【００３２】
図４には、例えば６〜１８時間に及ぶ可能性のあるインキュベーション中に、標的溶液を充填した装置を連続的に回転させまたは操作するのに使用することができる、１つのタイプの装置例が示されている。そこに示されているのは、ほぼ水平な軸５３に支持されている支持ホイール５１であり、かつこのホイール５１は、所望の速度で、好ましくは約２〜２０ｒｐｍの間、例えば約８ｒｐｍの速度で軸およびホイールの回転を引き起こす、電気モータを含んだ支持ベース５５によって駆動されるものである。ホイールの片面または両面は、標的溶液を充填したハイブリダイゼーション装置１１を複数含んだカートリッジ５９を受容するよう設計された複数の支持体５７を含み、したがって、多数の試験サンプルのインキュベーションを一度に行うのを容易にする。当然ながら、同じホイール表面のその他の支持体は、望む場合には、カートリッジ５９内に支持されない個々の装置を受容するよう構成することができる。配置構成は、装置１１がその平面内でゆっくり回転し、したがって気泡が、一般にチャンバの高いほうにある１つの長い壁面３１に沿って、上昇する傾向を持つものであることが好ましい。
【００３３】
本発明について、本発明を実施するのに現在のところ知られている最良の形態を構成する、ある特定の好ましい実施形態に関して述べてきたが、添付される特許請求の範囲に定義された本発明の範囲から逸脱することなく、当業者に明らかな様々な修正および変更を加えることができることを、理解すべきである。本発明の特定の特徴を、以下の特許請求の範囲で明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の、様々な特徴を有するマイクロアレイハイブリダイゼーション装置を構成するよう設計された、カバーおよびガスケットのサブアセンブリと組み合わせたスライドガラスを示す、分解斜視図である。
【図２】図１の構成要素から組み立てられたマイクロアレイハイブリダイゼーション装置を示す、サイズを拡大した側面図である。
【図３】図１に示すガスケットの断面の、拡大部分平面図である。
【図４】ハイブリダイゼーションインキュベーション中の、請求項２に記載の充填された装置を操作するための装置の、概略図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応性部分のマイクロアレイを取着することができる表面を有する平らな基板と、
前記マイクロアレイが内部に位置付けられているチャンバが生成されるよう、前記表面に並列に配置されている液体障壁手段と、
前記チャンバを閉じるカバーとを含み、したがって、内部に含まれる気泡以外、前記チャンバを満たす液体標的溶液を失うことなく操作することができるマイクロアレイハイブリダイゼーション装置であって、
前記障壁手段は、前記チャンバに隣接して内側に向いている面を有し、前記面は、前記チャンバ内に横方向に延びる複数の気泡破砕要素で形成されており、したがって、前記チャンバ内の液体標的溶液が前記面に沿って前記チャンバの１つの境界から別の境界へと移動するように前記装置が動作するときに、前記チャンバ内の当初の気泡が複数の超微粒気泡に破裂するようになされており、次いで前記超微粒気泡の運動によって推進される、マイクロアレイ全体の端から端に至る前記チャンバ内の前記液体標的溶液の非常に効果的な分布が、確実に行われることを特徴とするマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項２】
前記カバーは平らであり、前記障壁手段によって前記表面から均一に間隔を空けて設けられていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項３】
前記障壁手段は、前記チャンバの略長方形の周界を形成し、前記障壁手段の４つの壁面の１つまたは複数は、前記マイクロアレイが取着される前記表面に実質的に垂直に並べられた尖ったエッジを含み、前記エッジは、ポケットによって間隔を空けて配置され、前記気泡破砕要素として機能することを特徴とする請求項２に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項４】
前記気泡破砕要素は、前記長方形周界障壁の２つの対向する境界壁に沿って配置され、境界壁から前記チャンバ内に突出しかつその先端に前記尖ったエッジを有する複数の略三角形指片によって形成され、前記ポケットは前記気泡破砕要素の間に位置付けられていることを特徴とする請求項３に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項５】
前記長方形周界は、２つのより長い壁と、２つのより短い壁とを含み、前記気泡破砕要素は、前記２つのより短い壁の一部として形成されていることを特徴とする請求項３に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項６】
前記２つのより短い壁にある前記三角形指片は、ハイブリダイゼーション中に前記装置が動作しているときに、前記チャンバ内の前記標的溶液中の気泡がそれぞれの壁に垂直に接近するようになる方向に、突出するように並べられていることを特徴とする請求項５に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項７】
前記カバーは、実質的に剛性の透明な材料で作製されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項８】
前記障壁手段は、前記カバーを、前記表面から約０．２および約２ｍｍの間隔を空けて配置するような高さを有することを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項９】
前記気泡破砕要素は、疎水性材料で形成されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項１０】
前記カバーは、不透明な疎水性材料で作製され、マイクロアレイが配置されている前記チャンバ内に前記液体標的溶液を供給することができる少なくとも１つの充填口を含むことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項１１】
上面を有する平らな基板と、
前記上面に取着される、反応性部分のマイクロアレイと、
前記マイクロアレイが内部に位置付けられているチャンバが生成されるよう、前記面に並列に配置されている液体周界障壁と、
前記チャンバを閉じるよう、前記障壁に並列に配置されたカバーとを含み、したがって、内部に含まれる気泡以外、前記チャンバを満たす液体標的溶液を失うことなく操作することができるマイクロアレイハイブリダイゼーション装置であって、
前記周界障壁は、前記チャンバに隣接して内側に向いている壁面を有し、前記壁面は、前記チャンバ内に横方向に延びる複数の気泡破砕要素で形成されており、したがって、前記マイクロアレイが位置付けられる前記面に沿って前記液体標的溶液が移動するように前記装置が動作するときに、前記チャンバ内の当初の気泡が複数の超微粒気泡に破裂するようになされており、前記超微粒気泡の運動によって推進される、マイクロアレイ全体の端から端に至る前記チャンバ内の液体標的溶液の非常に効果的な分布が、確実に行われることを特徴とするマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項１２】
前記カバーは平らであり、実質的に剛性の透明な材料で作製され、前記周界障壁によって前記面から約０．２ｍｍおよび約２ｍｍに均一に間隔を空けて設けられていることを特徴とする請求項１１に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項１３】
前記周界障壁は、略長方形チャンバを形成し、その４つの壁面の１つまたは複数は、前記マイクロアレイが位置付けられる前記面に実質的に垂直に並べられた尖ったエッジを有する突起を含み、前記突起は、ポケットによって間隔を空けて配置され、前記気泡破砕要素として機能することを特徴とする請求項１１または１２のいずれかに記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項１４】
前記カバーは、前記チャンバに前記液体標的溶液を供給することができる少なくとも１つの充填口を含み、前記マイクロアレイは、前記上面に取着されてそこから少なくとも約２０μｍ上向きに延びる複数の３Ｄスポットを含み、前記３Ｄスポットは前記反応性部分を担持することを特徴とする請求項１１または１２のいずれかに記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項１５】
基板を備え、その表面にマイクロアレイを有するマイクロアレイハイブリダイゼーション装置を形成するための、カバーおよびガスケットのサブアセンブリであって、
上面および下面を有する平らなカバーと、
前記カバーの前記下面に添着された長方形の周界障壁と、
前記マイクロアレイを取り囲むように、前記基板の表面に前記カバーを取着するための、前記周界障壁の下面にある感圧接着剤と、
前記接着剤を覆う剥離シートと
を含み、
前記障壁は、前記チャンバに隣接する内側に向いた面を有し、前記面は、前記チャンバ内に横方向に延びる複数の気泡破砕要素で形成され、したがって、前記チャンバ内の液体標的溶液が前記面に沿って前記チャンバの１つの境界から別の境界へと移動するように前記装置が動作するときに、前記チャンバ内の当初の気泡が複数の超微粒気泡に破裂するようになされていることを特徴とするサブアセンブリ。
【請求項１６】
除去タブは、前記平らなカバーの前記上面に添着され、前記基板からの除去を容易にすることを特徴とする請求項１５に記載のサブアセンブリ。
【請求項１７】
前記カバーおよび前記タブは、柔軟な材料で作製されることを特徴とする請求項１６に記載のサブアセンブリ。
【請求項１８】
プローブと標的溶液との間でハイブリダイゼーションを行う方法であって、
反応性プローブ部分のマイクロアレイが取着される表面を有する平らな基板を提供するステップと、
前記マイクロアレイが内部に位置付けられているチャンバが生成されるよう、前記表面に周界液体障壁を並列に配置し、前記チャンバを閉じ、したがって、液体標的溶液を失うことなく前記基板を操作することができるようになされたステップと、
前記チャンバに、標的溶液および気泡を充填するステップと、
前記標的溶液が前記チャンバの１つの境界から別の境界へと移動するように前記基板を移動させるステップとを含み、少なくとも１つのそのような境界は、そのような移動の結果、前記チャンバ内の前記気泡が複数の超微粒気泡に破裂し、次いでその後に続くそのような超微粒気泡の運動によって推進される、マイクロアレイ全体の端から端に至る前記液体標的溶液の非常に効果的な分布が確実に行われるようになされていることを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記チャンバは、平らなカバーと、前記カバーを前記面から均一に間隔を空けて配置する、付随する周界ガスケットとによって形成され、かつ閉じられることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ガスケットは、２つの対向するより短い壁面を有する前記チャンバの略長方形周界を形成し、前記超微粒気泡は、通常運動中に前記壁面のそれぞれに気泡が接近する方向で、前記２つの対向するより短い壁面から前記チャンバ内に突出する尖ったエッジ状の突起によって生成されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的溶液は、後に密封される前記カバーの少なくとも１つの充填口を通して導入されることを特徴とする請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記基板は、実質的に水平な軸を中心に回転することによって移動し、前記チャンバは、前記より短い壁面が、前記回転軸から半径方向に延びる線にほぼ垂直になるように並べられることを特徴とする請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
反応性部分のマイクロアレイを取着することができる表面を有する平らな基板と、
前記マイクロアレイが内部に位置付けられているチャンバが生成されるよう、前記表面に並列に配置されている液体障壁手段と、
前記チャンバを閉じるカバーとを含み、したがって、内部に含まれる気泡以外、前記チャンバを満たす液体標的溶液を失うことなく操作することができるマイクロアレイハイブリダイゼーション装置であって、
前記障壁手段は、前記チャンバに隣接して内側に向いている面を有し、前記面は、前記チャンバ内に横方向に延びる複数の気泡破砕要素で形成されており、したがって、前記チャンバ内の液体標的溶液が前記面に沿って前記チャンバの１つの境界から別の境界へと移動するように前記装置が動作するときに、前記チャンバ内の当初の気泡が複数の超微粒気泡に破裂するようになされており、次いで前記超微粒気泡の運動によって推進される、マイクロアレイ全体の端から端に至る前記チャンバ内の前記液体標的溶液の非常に効果的な分布が、確実に行われることを特徴とするマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項２】
前記カバーは平らであり、前記障壁手段によって前記表面から均一に間隔を空けて設けられていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項３】
前記障壁手段は、前記チャンバの略長方形の周界を形成し、前記障壁手段の４つの壁面の１つまたは複数は、前記マイクロアレイが取着される前記表面に実質的に垂直に並べられた尖ったエッジを含み、前記エッジは、ポケットによって間隔を空けて配置され、前記気泡破砕要素として機能することを特徴とする請求項２に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項４】
前記気泡破砕要素は、前記長方形周界障壁の２つの対向する境界壁に沿って配置され、境界壁から前記チャンバ内に突出しかつその先端に前記尖ったエッジを有する複数の略三角形指片によって形成され、前記ポケットは前記気泡破砕要素の間に位置付けられていることを特徴とする請求項３に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項５】
前記長方形周界は、２つのより長い壁と、２つのより短い壁とを含み、前記気泡破砕要素は、前記２つのより短い壁の一部として形成されていることを特徴とする請求項３に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項６】
前記２つのより短い壁にある前記三角形指片は、ハイブリダイゼーション中に前記装置が動作しているときに、前記チャンバ内の前記標的溶液中の気泡がそれぞれの壁に垂直に接近するようになる方向に、突出するように並べられていることを特徴とする請求項５に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項７】
前記カバーは、実質的に剛性の透明な材料で作製されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項８】
前記障壁手段は、前記カバーを、前記表面から約０．２および約２ｍｍの間隔を空けて配置するような高さを有することを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項９】
前記気泡破砕要素は、疎水性材料で形成されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項１０】
前記カバーは、不透明な疎水性材料で作製され、マイクロアレイが配置されている前記チャンバ内に前記液体標的溶液を供給することができる少なくとも１つの充填口を含むことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項１１】
上面を有する平らな基板と、
前記上面に取着される、反応性部分のマイクロアレイと、
前記マイクロアレイが内部に位置付けられているチャンバが生成されるよう、前記面に並列に配置されている液体周界障壁と、
前記チャンバを閉じるよう、前記障壁に並列に配置されたカバーとを含み、したがって、内部に含まれる気泡以外、前記チャンバを満たす液体標的溶液を失うことなく操作することができるマイクロアレイハイブリダイゼーション装置であって、
前記周界障壁は、前記チャンバに隣接して内側に向いている壁面を有し、前記壁面は、前記チャンバ内に横方向に延びる複数の気泡破砕要素で形成されており、したがって、前記マイクロアレイが位置付けられる前記面に沿って前記液体標的溶液が移動するように前記装置が動作するときに、前記チャンバ内の当初の気泡が複数の超微粒気泡に破裂するようになされており、前記超微粒気泡の運動によって推進される、マイクロアレイ全体の端から端に至る前記チャンバ内の液体標的溶液の非常に効果的な分布が、確実に行われることを特徴とするマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項１２】
前記カバーは平らであり、実質的に剛性の透明な材料で作製され、前記周界障壁によって前記面から約０．２ｍｍおよび約２ｍｍに均一に間隔を空けて設けられていることを特徴とする請求項１１に記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項１３】
前記周界障壁は、略長方形チャンバを形成し、その４つの壁面の１つまたは複数は、前記マイクロアレイが位置付けられる前記面に実質的に垂直に並べられた尖ったエッジを有する突起を含み、前記突起は、ポケットによって間隔を空けて配置され、前記気泡破砕要素として機能することを特徴とする請求項１１または１２のいずれかに記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項１４】
前記カバーは、前記チャンバに前記液体標的溶液を供給することができる少なくとも１つの充填口を含み、前記マイクロアレイは、前記上面に取着されてそこから少なくとも約２０μｍ上向きに延びる複数の３Ｄスポットを含み、前記３Ｄスポットは前記反応性部分を担持することを特徴とする請求項１１または１２のいずれかに記載のマイクロアレイハイブリダイゼーション装置。
【請求項１５】
基板を備え、その表面にマイクロアレイを有するマイクロアレイハイブリダイゼーション装置を形成するための、カバーおよびガスケットのサブアセンブリであって、
上面および下面を有する平らなカバーと、
前記カバーの前記下面に添着された長方形の周界障壁と、
前記マイクロアレイを取り囲むように、前記基板の表面に前記カバーを取着するための、前記周界障壁の下面にある感圧接着剤と、
前記接着剤を覆う剥離シートと
を含み、
前記障壁は、前記チャンバに隣接する内側に向いた面を有し、前記面は、前記チャンバ内に横方向に延びる複数の気泡破砕要素で形成され、したがって、前記チャンバ内の液体標的溶液が前記面に沿って前記チャンバの１つの境界から別の境界へと移動するように前記装置が動作するときに、前記チャンバ内の当初の気泡が複数の超微粒気泡に破裂するようになされていることを特徴とするサブアセンブリ。
【請求項１６】
除去タブは、前記平らなカバーの前記上面に添着され、前記基板からの除去を容易にすることを特徴とする請求項１５に記載のサブアセンブリ。
【請求項１７】
前記カバーおよび前記タブは、柔軟な材料で作製されることを特徴とする請求項１６に記載のサブアセンブリ。
【請求項１８】
プローブと標的溶液との間でハイブリダイゼーションを行う方法であって、
反応性プローブ部分のマイクロアレイが取着される表面を有する平らな基板を提供するステップと、
前記マイクロアレイが内部に位置付けられているチャンバが生成されるよう、前記表面に周界液体障壁を並列に配置し、前記チャンバを閉じ、したがって、液体標的溶液を失うことなく前記基板を操作することができるようになされたステップと、
前記チャンバに、標的溶液および気泡を充填するステップと、
前記標的溶液が前記チャンバの１つの境界から別の境界へと移動するように前記基板を移動させるステップとを含み、少なくとも１つのそのような境界は、そのような移動の結果、前記チャンバ内の前記気泡が複数の超微粒気泡に破裂し、次いでその後に続くそのような超微粒気泡の運動によって推進される、マイクロアレイ全体の端から端に至る前記液体標的溶液の非常に効果的な分布が確実に行われるようになされていることを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記チャンバは、平らなカバーと、前記カバーを前記面から均一に間隔を空けて配置する、付随する周界ガスケットとによって形成され、かつ閉じられることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ガスケットは、２つの対向するより短い壁面を有する前記チャンバの略長方形周界を形成し、前記超微粒気泡は、通常運動中に前記壁面のそれぞれに気泡が接近する方向で、前記２つの対向するより短い壁面から前記チャンバ内に突出する尖ったエッジ状の突起によって生成されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的溶液は、後に密封される前記カバーの少なくとも１つの充填口を通して導入されることを特徴とする請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記基板は、実質的に水平な軸を中心に回転することによって移動し、前記チャンバは、前記より短い壁面が、前記回転軸から半径方向に延びる線にほぼ垂直になるように並べられることを特徴とする請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００７−５１５６２７（Ｐ２００７−５１５６２７Ａ）
【公表日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４１２１６（Ｐ２００６−５４１２１６）
【出願日】平成１６年１１月３日（２００４．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３６４７５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５３８２７
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５０１４１８９９３）バイオセプト インコーポレイテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月３日（２００４．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３６４７５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５３８２７
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５０１４１８９９３）バイオセプト インコーポレイテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
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