マイコプラズマスイスの予防接種および検出のための抗原
本発明は、マイコプラズマスイス（Ｍ． ｓｕｉｓ）および関連する赤血球付着性マイコプラズマ種の予防接種および検出のための抗原に関する。さらに、本発明はかかる抗原をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む宿主細胞、ならびにＭ． ｓｕｉｓや関連する病原体による感染症の治療方法および予防接種の方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、マイコプラズマスイス（Ｍ． ｓｕｉｓ）および関連する赤血球付着性マイコプラズマ種の予防接種および検出のための抗原に関する。さらに、本発明はかかる抗原をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む宿主細胞、ならびにＭ． ｓｕｉｓや関連する病原体による感染症の治療方法および予防接種の方法に関する。
【０００２】
Ｍ． ｓｕｉｓ（以前はエペリスロゾーンスイス）は、赤血球付着性バクテリアのグループに属する。Ｍ． ｓｕｉｓは、ブタの赤血球に付着してその変形や損傷を引き起こすエピセルラーヘモパラサイトである。その結果として生じる病気は、伝統的にブタエペリスロゾーン症（ＰＥ）と呼ばれるが、世界中で報告され、低い罹患率と高い死亡率の熱性急性黄疸性貧血として現れる、家畜のブタの問題と考えられている。慢性の軽度のＭ． ｓｕｉｓ感染症は、無症状の感染から、（ｉ）貧血、軽度の黄疸、および新生児における全般的に丈夫でないこと、（ｉｉ）家畜のブタにおける成長遅延、および（ｉｉｉ）雌ブタにおける低い繁殖成績を含む臨床症状の範囲まで様々である。さらに、Ｍ．ｓｕｉｓは、宿主の免疫反応を抑制し、ブタの呼吸器および腸の病気の他の感染体にかかりやすくすると思われている。
【０００３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養系の欠如は、Ｍ． ｓｕｉｓの生態を系統的に解析することや、例えばブタ集団におけるＭ． ｓｕｉｓの有病率や重大性を正確に評価するための有益な診断方法を開発することの重大な障壁である。これまではＭ． ｓｕｉｓの検査診断は、化学的に染色された末梢血の塗抹標本の顕微鏡試験によっており、赤血球に付着した微生物を直接視覚化する。急性疾患の発症に関連する、すぐに同定できるけれども短期間である菌血症が慢性感染において欠けているため、顕微鏡の欠点は特異性および感受性の両方の問題を含む。
【０００４】
Ｍ． ｓｕｉｓが引き起こすブタのエペリスロゾーン症を制御する有効な方法は、感染したキャリア動物を検出し除去することによって感染を根絶することである。これらの目的のために、血清学的アッセイが未だに最適な方法である。規定されたＭ． ｓｕｉｓ抗原に基づく特異的で感受性の高い血清学的アッセイは、広範囲な有病率の研究を可能とし、診断検査室における日常のこととして適用される。しかし、Ｍ． ｓｕｉｓに対するブタの体液性免疫反応を解析する試みは、補体結合テスト（ＣＦＴ）、間接赤血球凝集アッセイ（ＩＨＡ）、および酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む、現在の抗体アッセイの低い感受性および特異性により阻害されていた。今まで記載されている血清診断アッセイは、実験的に感染させたブタの末梢血から得た複雑で定義されていないＭ． ｓｕｉｓ抗原を採用するという本質的な欠点を有する。ブタの集団を慢性のＭ． ｓｕｉｓ感染について試験するための優れた標準と現在考えることができる唯一のアッセイは、脾臓を摘出することにより急性の病気を誘発し、顕微鏡を用いてブタの菌血症を確認することである（Ｈｅｉｎｒｉｔｚｉ， １９８４ Ｔｉｅｒａｒｚｔｌ． Ｐｒａｘ． １２： ４５１−４５４）。
【０００５】
しかしながら、ブタの脾臓摘出は日常の診断には適さない。最近、ＤＮＡハイブリダイゼーションやＰＣＲアッセイなどのような分子的な方法が開発され、低レベルの菌血症を伴う慢性ＰＥの顕微鏡による診断における低感受性に関連する問題は解決された。しかし、日常の検査室で使用されうる標準的な方法が存在しない。
【０００６】
Ｍ． ｓｕｉｓはテトラサイクリンを用いて薬学的に治療される。この治療法を行う場合、ＰＥの発作中の臨床症状から感染したブタを治療することができるが、感染したブタからＭ． ｓｕｉｓを排除することはできない。したがって、持続性で臨床的に不顕性の感染したブタは、集団内または集団間におけるＭ． ｓｕｉｓの伝染のホットスポットであるキャリア動物のままである。
【０００７】
Ｍ． ｓｕｉｓをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養できないため、予防接種は開発されていない。したがって、潜在的なワクチン候補は、臨床的に急性の病気のブタのブタ血液に由来し、それは、ｉ）ワクチンが、副作用、すなわち同種抗原に対する免疫反応（同種免疫）につながると考えられるブタ血液の成分を含むこと、ｉｉ）Ｍ． ｓｕｉｓ分離株が完全に毒性が強く、これらの分離株を、例えば培養継代により弱毒化する可能性がないことという２つの主要な制限につながる。さらに、今まで、適したワクチンコンストラクト選択の基礎とすることができるＭ． ｓｕｉｓの免疫原性の構造およびＰＥの免疫反応についての情報は入手できていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明の根底にある技術的な課題は、信頼できる診断（血清学、分子）のための新しい化合物および方法、ならびにＭ． ｓｕｉｓや関連するバクテリアによる予防接種および治療の提供である。
【０００９】
上記の技術的な課題の解決法は、請求項に定義されたように、本発明の実施態様により提供される。
【００１０】
本発明は特に、Ｍ． ｓｕｉｓの抗原構造および遺伝子構造についての研究を可能とする、実験的に感染させたブタにおいて作られた大量のＭ． ｓｕｉｓバクテリアの利用に基づく。この事実によって、詳細な一次元および二次元ウェスタンブロット解析を行うこと、およびＭ． ｓｕｉｓのゲノムＤＮＡライブラリーを構築することが可能となった。さらに、このブタモデルは、Ｍ． ｓｕｉｓの使用における免疫反応の性質および動力学の解析を可能とした。
【００１１】
よって、第一の形態にしたがって、本発明は赤血球付着性マイコプラズマ種、特にＭ． ｓｕｉｓに対するワクチンに関するものであって、該ワクチンは、Ｍ． ｓｕｉｓのタンパク質から選択されたタンパク質の少なくとも一の抗原決定基を含んでいる、少なくとも一のぺプチドまたはポリペプチドを含むものであって、該Ｍ． ｓｕｉｓのタンパク質は、０．０２５Ｍ トリス／０．１９２Ｍ グリシン／０．１％ＳＤＳ水溶液の連続的な１２％ポリアクリルアミドゲル中で約３３ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５７ｋＤａ、６１ｋＤａ、７０ｋＤａ、７３ｋＤａ、および８３ｋＤａの見かけの分子量を有し、Ｍ． ｓｕｉｓ陽性動物、特にＭ． ｓｕｉｓに感染したブタ由来の血清に対して反応する。
【００１２】
好ましい実施態様によれば、ワクチンは少なくとも一のタンパク質の抗原決定基を含んでいる少なくとも一のペプチドまたはポリペプチドを含み、そのタンパク質は上記の実験条件で判定するとき４０ｋＤａの見かけの分子量を有する。
【００１３】
したがって、本発明による上記抗原は、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ （１９７０） Ｎａｔｕｒｅ ２２７、 ６８９参照）および（例えば、前述のように、脾臓の摘出および顕微鏡による菌血症の確認等のようなこれまでの通常のＭ． ｓｕｉｓの検出方法によって）Ｍ． ｓｕｉｓに感染したことがわかっている一以上のブタ由来の血清を用いたウエスタンブロッティングにより判定されたように、上記Ｍ． ｓｕｉｓ由来のタンパク質の少なくとも一のエピトープ（抗原決定基）を含む。
【００１４】
上記のようなＭ． ｓｕｉｓタンパク質の源は、Ｍ． ｓｕｉｓおよびこの病原体に由来する物質が発見されうる任意の試料または検査サンプルとしてもよい。特に、Ｍ． ｓｕｉｓの物質の源は好ましくは感染した個体、特にブタ由来の、臓器組織および体液（例えば、脾臓組織、血液およびその一部、例えば血清、脳脊髄液、滑液、リンパ液など）のような検査サンプルである。Ｍ． ｓｕｉｓ細胞は、Ｈｏｅｌｚｌｅ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９３： １８５−１９６に記載されているような源から精製されてもよい。
【００１５】
さらに、精製は一以上の遠心分離の工程を含んでもよい。Ｍ． ｓｕｉｓの試料は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に使用するまで保存されてもよい。電気泳動のために、Ｍ． ｓｕｉｓ細胞は、当業者に知られている溶解バッファーに都合よく溶解される。Ｍ． ｓｕｉｓ細胞の溶解後、溶解液は上記Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７９）により記載された方法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられる。分離されたタンパク質の見かけの分子量を決定するために、Ｍｗ スタンダード（例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙから市販）は同じゲル上に流される。電気泳動後、ゲルはウェスタンブロッティングにかけられる。例えばセミドライブロッティング装置（例えば、Ｈｏｅｆｅｒ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから市販）において、ＳＤＳゲル中で分離されたタンパク質をメンブレン（例えばニトロセルロース、ＰＶＤＦ）上に固定する。上記Ｍ． ｓｕｉｓ由来の抗原タンパク質は、Ｍ． ｓｕｉｓに感染した動物由来の血清とのインキュベーションと、その後、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、ビオチン、放射活性ヨウ素等の適したマーカーでラベルされたヤギ抗ブタＩｇＧのような二次抗体の使用により同定される。その後、ブロットは通常、感染していない動物の体液由来のネガティブコントロールの抗原と比較される。さらに、上記のＭ． ｓｕｉｓ由来の抗原タンパク質の同定方法は、タンパク質をＳＤＳゲルから得て、そのまま本発明のワクチン中の抗原として使用する、またはタンパク質はさらに精製され、および／または抗原決定基を含む適したペプチド断片に断片化されることができるように、調製用の、またはマイクロ調製用のスケールに適合させてもよい。
【００１６】
本発明によると、“ペプチド”および“ポリペプチド”の語は同意語として使用される、つまり上記の語は、酸アミドの方法でのペプチド結合により互いに結合しているアミノ酸の任意の縮合産物を含む。かかるペプチドまたはポリペプチドのさらに必要な特徴は、それぞれの化学的実体が、Ｍ． ｓｕｉｓまたは関連する種由来の“抗原決定基”を含むことのみである。
【００１７】
ここで用いられる場合、“抗原決定基”は、免疫反応、特に、抗原決定基（エピトープ）に抗原結合領域を介して特異的に結合できる抗体が産生されるような免疫反応を誘導することができる抗原表面上の３次元構造を意味する。抗原決定基は、アミノ酸、糖、または脂質を含んでもよい。本発明のタンパク質上に存在する抗原決定基は、通常、少なくとも５、より好ましくは少なくとも７アミノ酸により形成される。抗原決定基は連続的な配列に存在するアミノ酸により形成されてもよく（連続的な、または配列決定因子）、またはポリペプチドのフォールディングによりエピトープに集まるアミノ酸によって形成されてもよい（非連続的な、またはコンフォメーションの決定因子）。
【００１８】
抗原決定基はタンパク質またはタンパク質自体の断片上に存在してもよく、または適したハプテンと結合してもよい。
【００１９】
本発明のワクチンの好ましいさらなる成分は、抗原決定基に対する免疫反応を向上させるアジュバントである。典型的なアジュバントは、不活性化したバクテリアと一緒にまたはなしで適用されるアルミニウム化合物、特に水酸化アルミニウムおよびミネラルオイルである。もっともよく知られたアジュバントは、通常ミネラルオイル、乳化剤（ラノリン）および不活性化したマイコバクテリアの懸濁液を含む完全なフロイントアジュバントである。不完全なフロイントアジュバントは、マイコバクテリアを含まない。適したワクチンアジュバントは、先行技術に開示されている；例えばＨａｃｋｅｔｔ （２００３） Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ： Ｔｏｐｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ参照。
【００２０】
さらに本発明は、赤血球付着性マイコプラズマに特異的な診断、検出、予防接種、および治療のために特に有用なタンパク質の抗原決定基の特異的な配列を提供する。
【００２１】
したがって、本発明のさらなる一形態は、図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されているアミノ酸配列の少なくとも一の抗原決定基（エピトープ）を含むアミノ酸配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドである。
【００２２】
好ましい実施態様によると、本発明は、図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されている配列中に含まれる連続した抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されているアミノ酸配列の少なくとも５、好ましくは少なくとも７の連続したアミノ酸と、少なくとも８０％、好ましくは９０％、特には少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列をコードしている配列を含む。
【００２３】
より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されている配列と、少なくとも８０％、好ましくは９０％、特には少なくとも９５％の相同性を有するタンパク質をコードする配列、または抗原断片、変異体、突然変異体、または前記配列の類似体を含む。
【００２４】
“相同性”の語は、当該タンパク質配列がそれらのアミノ酸残基のあるパーセンテージを共通して有することである。したがって、５０％の相同性とは、配列中の１００のアミノ酸の位置の５０が同じものであることを意味する。
【００２５】
本発明に従うポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または一以上の改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでもよい。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖の形であってもよい。ＤＮＡ、特に二本鎖ＤＮＡの形がとりわけ好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、化学合成または酵素合成により生産されうる（Ｇａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ： Ｖｅｒｌ． Ｃｈｅｍｉｅ １９８２参照）。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトは、組換え遺伝子技術により作られる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９参照）。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの“抗原フラグメント”は、完全なポリペプチドの一部または領域であり、特に動物またはヒト、とりわけ赤血球付着性マイコプラズマ種による感染を疑われる動物またはヒトにおいて免疫反応を誘導することができるフラグメントである。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの“変異体”は、そのほかの種、特に赤血球付着性マイコプラズマ種に由来する元のポリペプチドの機能的若しくは非機能的な等価物、または、選択的スプライシングまたは翻訳後プロセシングにより生じる元のポリペプチドの機能的若しくは非機能的な誘導体であるが、変異体は少なくとも抗原断片について上記のような抗原の機能は保持する。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの“突然変異体”は、一以上のアミノ酸残基の挿入、置換、付加、および／または欠失により自然に生じたタンパク質に由来する。アミノ酸置換は、保存されてもよく、保存されなくてもよい。保存されたアミノ酸置換は、置換されたアミノ酸残基の化学的な特徴（例えば大きさ、疎水性／親水性の性質、電荷、脂肪族／芳香族の性質等）が実質的に変化しない置換である。保存されたアミノ酸置換の例は、Ｖａｌ／Ａｌａ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、およびＳｅｒ／Ｔｈｒ置換である。
【００２８】
本発明の特に好ましいポリヌクレオチドは、図４Ａに示される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）、最も好ましくはその１３９７から２４０７のヌクレオチド、または図５Ａに示される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、最も好ましくはその１７９２から３６２１のヌクレオチド、または前記配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、特に９５％の相同性を有する配列、ならびに標準的なハイブリダイゼーション条件下で、前記配列およびその相補配列とハイブリダイズする配列である。
【００２９】
核酸の種類によって、標準的なハイブリダイゼーション条件は、約０．１から５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）間の水性バッファー中、任意に約５０％ホルムアミドの存在下で、約４２から約５８℃の間の温度により表される。例えば、５ｘＳＳＣで４２℃、５０％ホルムアミド。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイズのための好ましいハイブリダイゼーション条件は、約２０から４５℃の間の温度の０．１ｘＳＳＣであり、より好ましくは約３０から４５℃の間の温度である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイズのための好ましいハイブリダイゼーション条件は、約３０から５５℃の間の温度の０．１ｘＳＳＣであり、より好ましくは約４５から５５℃の間の温度である。上記のハイブリダイゼーション温度は、ホルムアミド非存在下、約１００のヌクレオチド長で５０％のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸のために計算された融点の例である。ＤＮＡハイブリダイゼーションのための実験条件は、先行技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８９）に記載され、当業者は核酸の長さ、ハイブリットの型、およびＧ＋Ｃ含有量によって個々の条件を計算することができる。核酸ハイブリダイゼーションについてのさらなる情報は、次の引用により提供される：Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ）、１９８５、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（ｅｄｓ）、１９８５、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ； Ｂｒｏｗｎ（ｅｄ）、１９９１、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドは、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）および５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示された配列のフラグメント、変異体、突然変異体、ならびに類似体、特に図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示された１３９７から２４０７のヌクレオチド、または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示された１７９２から３２６１のヌクレオチドの配列のフラグメント、変異体、突然変異体、ならびに類似体を含む。上記配列の“フラグメント”とは、元の配列の一部または領域である。“変異体”とは、元の配列と比較して異なる種において発見される配列であり、または元のヌクレオチド配列がコードするポリペプチドのスプライシングバリアント若しくは翻訳後にプロセシングされたバージョンをコードしてもよい。本発明によるポリヌクレオチドの特定の変異体は、例えばＭ． ｗｅｎｙｏｎｉｉ、Ｍ． ｈａｅｍｏｆｅｌｉｓおよびＭ． ｈａｅｍｏｃａｎｉｓ等のようなＭ． ｓｕｉｓ以外の赤血球付着性マイコプラズマ種において発見される。
【００３１】
ポリヌクレオチドの“突然変異体”は、一以上のヌクレオチドの挿入、置換、付加、逆位、および／または欠失により、親ポリヌクレオチドから得られる。図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）および５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される配列の特定の突然変異体は、赤血球付着性マイコプラズマ種において見られるコドン使用に比べて異なるコドン使用により得られる。特に好ましい変異体は、例えば対応するポリペプチドを生成するための大腸菌などのような、適した宿主細胞のコドン使用を利用するように設計される。特に、ＴＧＡは標準的なコドン使用において終止コドンであるにもかかかわらず、Ｔｒｐをコードする；ＮＣＢＩの分類学データベースの翻訳表４； Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８： １５−１８； Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８： １０−１４参照。
【００３２】
ポリヌクレオチドの“類似体”は、ポリヌクレオチドの機能的な等価物をコードするが、一以上の天然に生じないヌクレオチドを含む。類似体の修飾は、天然のヌクレオチドと比較して核酸構成要素の塩基ならびに糖および／またはリン酸部分において起こりうる。ヌクレオチド類似体の具体例は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ペプチド核酸（すなわち、ポリヌクレオチドは少なくとも一部においてペプチド結合の主鎖により特徴付けられ、したがってＰＮＡを表す）、メチルホスホネート、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシンおよびイノシンである。
【００３３】
本発明は、上記で規定された本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を制御することができるヌクレオチド配列にも関する。かかる制御配列は、本発明のポリペプチドのコード配列を含む遺伝子に由来する。好ましいヌクレオチド配列は、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示される１から１３９６までのヌクレオチド、および／または２４０８から２６０７までのヌクレオチド、および／または５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される１から１７９１までのヌクレオチド、および／または３６２２から４３５０までのヌクレオチド、または前記配列の機能的に活性のあるフラグメント、変異体、突然変異体、若しくは類似体である。
【００３４】
図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または前記アミノ酸配列に由来するポリペプチドの発現を制御するために好ましい配列は、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示される１から１３９６のヌクレオチド、および／または２４０８から２６０７のヌクレオチドに由来する。図５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または前記アミノ酸配列に由来するポリペプチドの発現を制御するために好ましい配列は、図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される１から１７９１のヌクレオチド、および／または３６２２から４３５０のヌクレオチドに由来する。
【００３５】
本発明のさらなる実施態様は、上記ポリヌクレオチドに対するアンチセンス核酸である。
【００３６】
アンチセンス核酸は、少なくとも一部はターゲット配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する。本発明のアンチセンス核酸は、一本鎖または二本鎖の核酸であり、その核酸は少なくとも一部は図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示される１３９７から２４０７までのヌクレオチド配列または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される１７９２から３６２１までのヌクレオチド配列の少なくとも８、好ましくは少なくとも１０の連続したヌクレオチドに相補的である。本発明に従う好ましいアンチセンス核酸は、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示される１３９７から２４０７の、または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される１７９２から３６２１のヌクレオチドの全長または部分配列を有するポリヌクレオチドに結合できる分子である。
【００３７】
本発明によると、“アンチセンス核酸”の語は、核酸塩基を結合するペプチド主鎖によって特徴付けられるペプチド核酸（ＰＮＡ）も含む。本発明において使用するさらに好ましいアンチセンス核酸は、リボザイム、特にハンマーヘッドリボザイム、またはＤＮＡエンザイム、特に１０−２３型のもの等のような触媒的な核酸の部分である。リボザイムは触媒として活性なＲＮＡであり、ＤＮＡエンザイムは触媒として活性なＤＮＡである。
【００３８】
本発明との関連で有用なアンチセンス核酸は、通常、修飾されていないまたは修飾されたヌクレオチドを含む、またはそのようなヌクレオチドからなるＤＮＡまたはＲＮＡ種である。特に、アンチセンスＲＮＡ分子の場合、リボヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性を増大させるため、天然に生じるヌクレオチドの少なくとも一の類似体を組み込むことが好ましい。これは、細胞のＲＮＡ分解酵素は、天然に生じるヌクレオチドを好んで認識する、という事実によるものである。したがって、ＲＮＡに核酸類似体を組み込むことによって、ＲＮＡの分解をうまく減少させることができる。
【００３９】
本発明に従うポリヌクレオチドの類似体についてすでに述べた通り、天然のヌクレオチドに比べて類似体の修飾は、核酸構成要素の塩基ならびに糖および／またはリン酸部分において起こりうる。ヌクレオチド類似体の具体例は、前記で言及される。
【００４０】
好ましい実施態様によると、本発明のアンチセンス核酸は、本発明のポリヌクレオチドの発現を実質的に阻害することができ、例えば、赤血球付着性マイコプラズマ種、特にＭ． ｓｕｉｓにおいて見られる通常のまたは天然に生じる発現レベルに比べて、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、またはより一層の差である。
【００４１】
さらに本発明は、上記の、ポリヌクレオチドおよび／またはアンチセンス核酸を含むベクターに関連する。
【００４２】
本発明に従うベクターは、直鎖状のまたは環状の核酸分子であり、好ましくは適した宿主においてポリヌクレオチドまたはアンチセンス核酸を導入、および増幅／複製することができるプラスミド、ウイルス、ファージ、若しくはコスミド、または他の人工的な核酸コンストラクトに由来するものである。本発明のベクターは好ましくは宿主において自律的に複製されることができる。したがって、ベクターは通常、少なくとも一の複製の起点（Ｏｒｉ）、一以上の他とは異なる制限酵素認識部位（ＭＣＳ、多重クローニング部位）、うまく形質転換された宿主細胞を選択するため、例えば、カナマイシン、アンピシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等の抗生物質耐性遺伝子等のような一以上のマーカー遺伝子、といった成分を含む。本発明の特に好ましいベクターは、好ましくは転写に適したプロモーター、オペレーター、および転写終結配列、ならびに対応するｍＲＮＡの翻訳を開始するためのリボソーム侵入部位の配列を含む発現ベクターである。
【００４３】
したがって、好ましい実施態様によると、本発明のベクターは、ポリヌクレオチドおよび／またはアンチセンス配列に作用可能なように結合し、それゆえに前記ポリヌクレオチド／アンチセンス核酸の発現を制御することができる、少なくとも一のプロモーター配列を含む。本発明のコンストラクトにおいて適したプロモーターは、例えば、ｌａｃプロモーターやその誘導体等のような一般的なバクテリアのプロモーター、例えばＩＰＴＧの添加により誘導することができるｔａｃである。他の好ましい誘導できるバクテリアのプロモーターは、ＡｒａＣ／ｐＢＡＤシステムである。さらに、本発明のベクターは、バクテリアのシステムにおいて発現させるためのファージプロモーターを含んでもよい。ファージプロモーターの好ましい例は、Ｔ７、ラムダＰＬおよびＳＰ６プロモーターである。本発明のベクター中に存在しうるさらに好ましい要素は、転写の終了のための配列（転写終結配列）、ならびに、例えばエンハンサーおよび／またはリプレッサー配列等のような、ポリヌクレオチドおよび／またはアンチセンス核酸の発現を制御する配列である。本発明のベクターは、好ましくは本発明のポリペプチドをコードする遺伝子に由来する制御配列を含む。特に好ましい制御配列は前に記載される。
【００４４】
本発明に従う特に好ましいベクターは、バクテリアの発現ベクターであって、ポリヌクレオチドは、コンストラクトの検出および／または精製を促進するためのマーカーまたはタグとして働くペプチド／ポリペプチドをコードする一以上の配列中にインフレームでクローン化されることができる。かかるタグまたはマーカーは、発現したポリペプチド上のＮ末端および／またはＣ末端に存在しうる。具体例は、ヒスチジンタグ、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）、ＧＦＰ、ＹＦＰ等の蛍光マーカーを提供するタンパク質をコードする配列である。
【００４５】
本発明のさらなる形態は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはアンチセンス核酸、および／またはベクターを含む宿主細胞である。通常、宿主細胞は、（かかる媒介物が使用される場合）ポリヌクレオチド／アンチセンス核酸の伝播／発現のために選択されたベクターにしたがって選択される。
【００４６】
好ましい宿主細胞は、例えばバクテリア、特に大腸菌および赤血球付着性マイコプラズマ種、とりわけＭ． ｓｕｉｓ、Ｍ． ｗｅｎｙｏｎｉｉ、Ｍ． ｈａｅｍｏｆｅｌｉｓ、およびＭ． ｈａｅｍｏｃａｎｉｓなどのような原核生物の宿主から選択される。他の有用な宿主細胞は、真核生物の宿主細胞、例えばＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母細胞である。
【００４７】
さらに本発明は、上記のように、ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドに関する。したがって、本発明によるポリペプチドは、ＭＳＧ１（図４Ｂに従うアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２））またはＭＳＡ１（図５Ｂに従うアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４））の少なくとも一の抗原決定基を含む。本発明に従うポリペプチドの好ましい実施態様は、図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）若しくは図５Ｂに示されたアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）、または前記配列の抗原性のフラグメント、変異体、類似体、若しくは突然変異体を含むアミノ酸配列を含む。
【００４８】
本発明は、上記のポリペプチドに対する抗体にも関連する。“抗体”の語は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、遺伝子工学により合成された、例えばヒト化抗体を含み、それらは結合したまたは溶解した形で存在しうる。さらに、本発明に従う“抗体”は、前述の種のフラグメントまたは誘導体としてもよい。かかる抗体または抗体フラグメントは、組換え型分子として、例えば他の（タンパク質性の）成分との融合タンパク質として存在してもよい。抗体フラグメントは、通常、酵素消化、タンパク質合成により、または当業者に知られている組換え技術により生産される。したがって、本発明において使用するための抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒトの若しくはヒト化された若しくは組換え型の抗体、またはそれらのフラグメント、および一本鎖抗体、例えばｓｃＦｖ−コンストラクト、または合成抗体である。
【００４９】
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物の血清から生産された抗体分子の不均一な混合物である。本発明は、抗体混合物の精製により（例えば、特異的なエピトープのペプチドを持つカラムを用いたクロマトグラフィーを通して）得られるポリクローナルの単一特異性抗体もある。モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに特異的な抗体の均一な集合を表す。モノクローナル抗体は、先行技術に記載された方法にしたがって調製することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５−３９７，（１９７５）； 米国特許４３７６１１０号； Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ， Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ）， １９９８， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。言及した資料の開示は、引用により本発明に全て組み込まれる。
【００５０】
本発明において使用するための遺伝子工学により合成された抗体は、上記の参考文献において記載されているような方法に従って生産されてもよい。つまり、抗体産生細胞は十分な吸光度まで培養され、全ＲＮＡは、グアニジウムチオシアネートを用いた細胞の溶解、酢酸ナトリウムを用いた酸性化、フェノール、クロロホルム／イソアミルアルコールを用いた抽出、イソプロパノールを用いた沈殿、およびエタノールを用いた洗浄により調製される。ｍＲＮＡは通常、オリゴｄＴを結合した樹脂（例えばセファロース）を用いたクロマトグラフィーまたはバッチ吸収によって、全ＲＮＡから単離される。ｃＤＮＡは、逆転写によりｍＲＮＡから調製される。このようにして得たｃＤＮＡを、適したベクター（動物、真菌、バクテリア、またはウイルスに由来するもの）にすぐに、または“部位特異的突然変異誘発”（一以上の塩基対の挿入、逆位、欠失、または置換を導く）による遺伝子操作後に挿入することができ、対応する宿主生物中で発現させることができる。適したベクターおよび宿主生物は、当業者によく知られている。ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８／１９、ｐＡＣＹＣ１８４、ラムダ、または酵母ミューベクター等のようなバクテリアまたは酵母に由来するベクターは、好ましい例として挙げられてもよい。かかるベクターは、対応する遺伝子のクローニングおよび大腸菌等のバクテリア若しくはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母中での発現のためにうまく使用される。
【００５１】
本発明において使用するための抗体は、次の免疫グロブリンクラスのいずれかに属することができる：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤ、および前記クラスのサブクラス、例えばＩｇＧクラスのサブクラスを適用できる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧＭ等のようなＩｇＧおよびそのサブクラスが好ましい。ＩｇＧサブタイプのＩｇＧ１／ｋまたはＩｇＧ２ｂ／ｋは、特に好ましい。本発明において使用するためのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはｉｎ ｖｉｖｏで培養することができる。高力価のモノクローナル抗体は、好ましくはｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕで産生される。
【００５２】
キメラ抗体は、異なる起源の成分を含んでいる種である（例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびブタ免疫グロブリンに由来する定常領域を含んでいる抗体）。キメラ抗体は、患者に投与する際に種の免疫原生を減少させるため、および産生収率を向上させるために採用される。例えば、ハイブリドーマ細胞系と比較して、マウスモノクローナル抗体は高い収率を与える。しかし、それは非マウス、例えばブタの患者において、より高い免疫原生を引き起こす。したがって、キメラの非マウス（特にブタ）／マウス抗体が、好ましくは使用される。マウスモノクローナル抗体の超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）が、非マウス、好ましくはブタの抗体のさらなる抗体領域と結合するモノクローナル抗体は、なおさら好ましい。キメラ抗体およびその製造方法は、先行技術に記載されている（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ３２７３−３２７７（１９８４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ６８５１−６８５５（１９８４）； Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３１２ ６４３−６４６（１９８４）； Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ−Ａ−１２５０２３； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ２６８−２７０（１９８５）； Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ−Ａ−１７１４９６； Ｍｏｒｒｉｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ−Ａ−１７３４９４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ８６／０１５５３； Ｋｕｄｏ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ−Ａ−１８４１８７； Ｓａｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７： １０６６−１０７４（１９８６）； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ８７／０２６７１； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ３４３９−３４４３（１９８７）； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ２１４２１８（１９８７）； Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０： １０４１−１０４３（１９８８）およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 上記）。前述の資料の開示内容は、引用により本明細書中に組み込まれる。
【００５３】
本発明によると、“抗体”の語は、完全な抗体分子およびＭＳＧ１またはＭＳＡ１に結合することができるそれらのフラグメント、またはそれらのフラグメント、誘導体、類似体および他の血球付着性マイコプラズマ種に由来する関連するタンパク質を含む。抗体フラグメントは、抗原への一または二の結合部位、すなわちＭＳＧ１またはＭＳＡ１または関連する分子の一以上のエピトープを有する任意の欠失したまたは誘導体化された抗体部分を含む。かかる抗体フラグメントの具体例は、Ｆｖ、Ｆａｂ若しくはＦ（ａｂ’）２フラグメントまたはｓｃＦｖ等のような一本鎖フラグメントである。Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等のような二本鎖フラグメントが好ましい。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、原型の抗体に含まれるＦｃフラグメントを持たない。有益な結果として、かかるフラグメントは、完全な抗体種に比較して、循環器系においてより速く運ばれ、より少ない非特異的な組織結合を示す。かかるフラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）もしくはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）等のようなプロテアーゼを用いたタンパク質分解、または化学的酸化によって原型の抗体から産生されてもよい。
【００５４】
好ましくは、抗体フラグメントまたは抗体コンストラクトは、対応する抗体遺伝子の遺伝子操作を経て産生される。組換え抗体コンストラクトは、通常、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖｓ、〜３０ｋＤａの大きさ）を含み、そこにおいてＶＨおよびＶＬドメインはポリペプチドリンカーを介して一緒に連結され、発現およびフォールディング効率が改善される。機能的な親和性（結合活性）を向上させるため、および大きさを増大させてそれにより血液クリアランス率を減少させるため、単量体のｓｃＦｖフラグメントは、接着タンパク質ドメインまたはペプチドリンカーを用いて、二量体、三量体、またはより大きな凝集体を形成することができる。二価のｓｃＦｖ二量体のかかるコンストラクトの一例は、６０ｋＤａのダイアボディであり、各ｓｃＦｖのＶＨ−とＶＬドメイン間の短い、例えば５残基のリンカーは、Ｖ−ドメインの配置が単一のＦｖモジュールとなるのを妨げ、その代わりに二つのｓｃＦｖ分子の会合を生じる。ダイアボディは、２つの機能的な抗原結合部位を有する。リンカーは３残基未満に減らすこともでき、これはダイアボディの形成を阻害し、代わりにｓｃＦｖ３分子が３つの機能的な抗原結合部位で三量体（三重特異性抗体９０ｋＤａ）に会合するように導く。４つのｓｃＦｖの四価の四重特異性抗体への会合も可能である。本発明における使用のためにさらに好ましい抗体コンストラクトは、ｓｃＦｖ−ＣＨ３融合タンパク質の二量体である（８０ｋＤａ；いわゆる“ミニボディ”）。
【００５５】
本発明によると、ここに記載された一以上のアンチセンス核酸、ベクター（特にアンチセンス核酸を発現することができるもの）、および／または抗体は、通常、前記のような活性成分や、薬学的に許容される賦形剤、添加剤および／または担体（例えば可溶化剤も）を含む医薬組成物に含まれる。したがって、本発明は、前記のような活性成分、および少なくとも一の薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または添加剤の組み合わせを開示する。本発明の医薬組成物を処方する対応する方法は、例えば本発明の開示の一部である“Ｒｅｍｉｎｇｓｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９８０）において開示される。非経口投与のための担体の例は、例えば、滅菌水、無菌の塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、および特に生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーである。本発明に従うかかる組成物は、Ｍ． ｓｕｉｓおよび関連する赤血球付着性マイコプラズマ種による感染症の治療のために想定される。さらに、本発明に従う組成物は、ラクトース、マンニトール等のような充てん剤若しくは物質、例えばポリエチレングリコール等のようなポリマーを本発明において開示されるようなポリペプチド、抗体、および誘導体、もしくはそれらのフラグメントに共有結合するための基質、金属イオンと複合体を形成するための基質、またはポリマー化合物の特別な製剤、例えばポリアセテート、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、またはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層若しくは多層のベシクル、赤血球フラグメントまたはスフェロプラスト等の中に材料を封入するための基質を含んでもよい。組成物の具体例は、物理的な挙動、例えば溶解性、安定性、バイオアベイラビリティ、または分解性により選択される。組成物中の本発明の活性基質の制御放出または定常放出は、脂溶性デポーに基づく製剤も含む（例えば脂肪酸、ワックス、またはオイル）。本発明との関連で、かかる基質を含む本発明に従う基質または組成物のコーティング、つまりポリマーでのコーティングも開示される（例えばポリオキサマー、またはポリオキサミン）。さらに、本発明に従う基質または組成物は、プロテアーゼ阻害剤または浸透性増幅剤等の保護用のコーティングを含んでもよい。前記任意の含有物は、本発明のワクチン中に含まれてもよい。
【００５６】
原則として、本発明との関連で、本発明に従う基質または組成物（ワクチン、薬剤）のための、先行技術において知られている全ての投与経路は、開示される。好ましくは、前記Ｍ． ｓｕｉｓまたは関連する種による感染症の治療または予防それぞれのための薬剤またはワクチンの投与は、非経口の、つまり、例えば、皮下、筋肉内、もしくは静脈内、経口、または鼻腔内の投与経路を介して行われる。本発明のポリペプチドを含むワクチンは、通常、皮下に投与される。遺伝子ワクチンの場合、筋肉注射が好ましい投与経路である。通常、本発明に従う医薬組成物およびワクチンは、製剤の型によって固体、液体、またはエアロゾル（例えばスプレー）の形とする。
【００５７】
Ｍ． ｓｕｉｓおよび関連する赤血球付着性マイコプラズマ種（例えばＭ． ｗｅｎｙｏｎｉｉ、Ｍ． ｈａｅｍｏｆｅｉｌｓおよびＭ． ｈａｅｍｏｃａｎｉｓ）による感染症の治療およびそれに対する予防接種のスケジュールは、治療される個人、感染症の重症度、および分子の型次第である。本発明の通常の医薬／ワクチン組成物は、有効成分を１から１０００μｇ含む。本発明のワクチンは、複数回患者に投与され（上記のような経路を介して）、免疫される。通常、本発明のワクチンは、例えば１：１０から１０：１まで、好ましくは１：２から２：１まで、とりわけ１：１の一以上のアジュバントとの混合物として、一次免疫において投与され、一次免疫は通常一週間以上隔てた一以上のさらなる投与により追加免疫することができる。適したスケジュールは、０、１４、２１、および／または２８日目における投与である。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、感染した個体における病原体が少なくとも実質的に減少、好ましくは根絶するのに有効な期間にわたって、毎日一回以上投与されてもよい。
【００５９】
したがって、本発明の上記実施態様、つまりポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド、および／または抗体は、Ｍ． ｓｕｉｓによる感染症の治療および／または予防に有用である。
【００６０】
本発明のさらなる実施態様は、上記のようにポリペプチドの製造に関連し、
（ａ）本発明の宿主細胞および適した培養液を、ポリペプチドを発現させることができる条件下で培養する工程；および
（ｂ）培養液および／または宿主細胞からポリペプチドを回収する工程
を含む。
【００６１】
好ましくは、工程（ａ）に従って培養される宿主細胞は、適した宿主を形質転換することによって、例えば大腸菌等のような適した細菌のエレクトロポレーション、または化学的なトランスフェクションによって、生産される。
【００６２】
本発明に従うポリペプチドの製造方法の工程（ｂ）は、通常、便利なタンパク質精製工程を含む。特に、宿主細胞は普通、遠心分離により回収され（または所望の発現産物を含んでいる培養液から除去され）、凍結／解凍サイクル、ソニケーション、および／または高圧力の適用により破壊されてもよい。細胞溶解液（ポリペプチドが細胞から回収される場合）は、ろ過され、および／または遠心分離されてもよい。ポリペプチドを含んでいる細胞溶解液または培養液は、トリス、リン酸バッファー等を主原料としうる適した精製バッファーに対して透析されてもよい。さらなる精製工程は、分画された塩化アンモニウム沈殿を含んでもよい。さらなる精製方法は、例えばデキストラン（例えばセファデックス）、アガロース（例えばセファロース）、ポリアクリルアミド（例えばセファクリル）、またはセルロースを主原料とした適した樹脂を用いた交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、および／またはアフィニティクロマトグラフィーによるクロマトグラフィー分画工程を含む。特に、興味あるポリペプチドが適したタグ、例えばヒスチジンタグをつけられた場合、通常の精製スキームは、アフィニティクロマトグラフィー、特にキレート基を介して適した樹脂に連結したＮｉ２＋またはＺｎ２＋イオンを用いた金属キレートクロマトグラフィーを含む。すべてのクロマトグラフィーの工程は、ＦＰＬＣまたはＨＰＬＣ装置に適応されうる。一般に、当業者は、使用される発現系の源によって、および、興味あるタンパク質の性質（特にアミノ酸配列）によって、容易に精製スキームを立ち上げて実行することができる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ， １９９３； Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（ｅｄ．）， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． １８２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ， １９９０参照）。
【００６３】
本発明の実施態様に基づいて、かかる感染顆粒により引き起こされると考えられる病気の全ての病期における、ウシにおけるＭ． ｗｅｎｙｏｎｉｉ、ネコにおけるＭ． ｈｅｍｏｆｅｌｉｓ、イヌにおけるＭ． ｈａｅｍｏｃａｎｉｓ、および特にブタにおけるＭ． ｓｕｉｓなどのような赤血球付着性マイコプラズマ種による感染症の検出方法、特にＥＬＩＳＡ、免疫ブロット等の診断アッセイを確立することができる。特に、かかる検出方法は、キャリア動物を検出するのに有用である。例えば、血清は、血清有病率の研究および群れの診断のそれぞれを実行するために、臨床的に疑われる動物（血清同等者）から、またはブタの群れのような動物の群れの中の代表する数の動物から採取してもよい。血清は、例えば、溶液希釈の後、既知のポジティブおよびネガティブコントロール血清と比較して、本発明のポリペプチドに対する反応性が調査される。
【００６４】
感染症が検出により示され、感染したキャリア動物から除去されうるので、本発明の診断アッセイは、有用なＰＥの制御手段を提供する。
【００６５】
したがって、一般に、本発明は、前記の通り前記実施態様の検出手段、つまりポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチドおよび／または抗体とともに用いられる、ポリヌクレオチドおよび／またはアンチセンス核酸および／またはポリペプチドおよび／または抗体を含む診断キットに関連する。
【００６６】
上記分子の“検出手段”は、通常、直接または間接にポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチド、および／または抗体を用いて取り付けられうる分子マーカーである。かかるマーカーまたはラベルは、例えば特徴的な光吸収、発光（特に蛍光）、放射活性等のような直接または間接に測定することができるシグナルを提供する多様な適した化合物または化学基から選択されうる。具体例は、放射活性マーカー、蛍光マーカー、色素、およびビオチン／ストレプトアビジン等のような特定の結合ペアの要素である。
【００６７】
好ましくは、ポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチド、および／または抗体は、メンブレン（例えば、核酸分子のためのニトロセルロース、またはペプチド若しくはポリペプチドのためのＰＶＤＦ）、樹脂、マイクロビーズ、培養皿、マイクロタイタープレートのウェル、マイクロアレイ等のような固定担体に結合される。
【００６８】
本発明の診断キットのさらなる実施態様は、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示される配列、好ましくは１３９７から２４０７までのヌクレオチド配列、または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される配列、好ましくは１７９２から３６２１までのヌクレオチド配列、またはプライマーペアが関連する配列とうまくハイブリダイズできるように一定の相同性を有する関連する配列、特にＭ． ｓｕｉｓ以外の赤血球付着性マイコプラズマ種に由来する配列の部分、フラグメント、または領域を増幅するためのプライマーペアを含む。好ましい実施態様によると、本発明の診断キットは少なくとも一のオリゴヌクレオチドペアを含むものであって、一のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示される配列、好ましくは１３９７から２４０７までのヌクレオチド配列、または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される配列、好ましくは１７９２から３６２１までのヌクレオチド配列に相補的な、少なくとも９、好ましくは１２、より好ましくは１５ヌクレオチドの配列を含み、他のオリゴヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチド）はそれぞれ図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示される配列、好ましくは１３９７から２４０７までのヌクレオチド配列、または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される配列、好ましくは１７９２から３６２１までのヌクレオチド配列の少なくとも９、好ましくは１２、より好ましくは１５ヌクレオチドの配列を含むものであって、センスオリゴヌクレオチドの配列における最も３’側のヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列における最も３’側のヌクレオチドから上流に少なくとも２０、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドである。
【００６９】
本発明にしたがう診断キットの構成要素は、Ｍ． ｓｕｉｓおよび関連する種の検出のため、特に、感染しやすい動物、例えばブタ、ウシ、ネコ、イヌ、ウマ、およびヒトにおける対応する感染症の検出においてうまく用いられうる。
【００７０】
本発明の好ましい実施態様によると、Ｍ． ｓｕｉｓおよび関連する種を検出する方法は、
（ａ）Ｍ． ｓｕｉｓ（または関連する種）を含んでいると思われる試料、またはそれらに由来する材料を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）の試料を、ここに開示された好ましい実施態様、すなわち上記のようなポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチド、および／または抗体の少なくとも一と、前記ポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチド、および／または抗体が試料／それらに由来する材料中に存在する成分と結合できる条件下で接触させる工程；
（ｃ）非結合性ポリヌクレオチド、抗体、および／またはアンチセンス核酸を除去するために一回以上洗浄する工程；および
（ｄ）工程（ｂ）において結合した前記ポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、および／または抗体の存在を検出する工程
を含む。
【００７１】
上記のＭ． ｓｕｉｓなどの赤血球付着性マイコプラズマ種の検出方法は、感染顆粒／特定の成分の検出のために使用される特定の分子次第で、異なる形式に適用することができる。
【００７２】
したがって、本発明のポリヌクレオチドおよびアンチセンス核酸の使用は、通常、テストする試料中に存在する相補的な配列（少なくとも一部は相補的な配列）とのハイブリダイゼーションに依存する。したがって、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはアンチセンス核酸が用いられる場合、本検出方法は通常、サザンブロットまたはノーザンブロットの形をとる。かかるブロッティング技術の詳しい実験装置は、当業者によく知られている；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， 上記参照。
【００７３】
本発明に従うポリペプチドは、通常感染した個体中でＭ． ｓｕｉｓ または関連する種に対して作られる、試料中に存在する免疫グロブリン、特に抗体により認識される。言い換えると、本発明の抗体は、抗体が特異的である抗原決定基（エピトープ）を認識することにより試料中で成分に結合する。
【００７４】
ここに開示されたように、本発明に従うポリペプチドまたは抗体がＭ． ｓｕｉｓ（または関連する種）に由来する成分の検出のために使用される場合、上記検出方法はウエスタンブロット実験の形をとるが、通常、酵素免疫アッセイ、特に酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）として設計される。実験装置および試薬（二次抗体、カップリングの化学反応等）は、当業者に知られている（例えば、Ａｎａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ． １， １３４−１４４（１９９３）、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、またはＣｒｏｗｔｈｅｒ， Ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ４９， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＹ， ＵＳＡ（２０００））。もちろん、上記に該当する他の検出方法を想定することもできる。酵素免疫アッセイ以外の具体例は、ラジオイムノアッセイ型のアッセイである。適した技術は、例えばＬｅｆｋｏｖｉｔｚ（Ｅｄ．）， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ， Ｖｏｌ． １−４， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７、およびＣｈａｒｄ， Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ １９９５に開示される。
【００７５】
検出方法のために使用される試料は、Ｍ． ｓｕｉｓまたは関連する種を含む可能性がある検査サンプルまたは試料であってもよい。好ましい試料は、問題の病原体の少なくとも一による感染が疑われる個体（動物、ヒト）に由来する。試料は、Ｍ． ｓｕｉｓまたは関連する種による感染が疑われる個体に由来する任意の組織（例えば脾臓）または体液でもよい。好ましい体液は、血液および血液産物、特に血清、リンパ液、脳脊髄液、滑液などである。
【００７６】
赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓの検出方法または対応する診断方法のさらに好ましい実施態様は、ここに開示したように、少なくとも一の対応するプライマーペアを用いた、配列をコードする赤血球付着性マイコプラズマ特異的抗原の増幅に依存する。
【００７７】
したがって、本発明は対応する検出方法または診断方法に関連するものであって、該方法は
（ａ）Ｍ． ｓｕｉｓ（または関連する種）を含んでいると思われる試料、またはそれらに由来する材料を得る工程（詳細例はすでに前述）；
（ｂ）図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）若しくは５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に開示された配列、または関連する配列に特異的な、少なくとも一のプライマーペアを提供する工程；
（ｃ）テンプレートとして工程（ａ）における試料を使用し、工程（ｂ）に従うプライマーペアを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を行う工程；および
（ｄ）工程（ｃ）において生産された増幅産物を解析する工程
を含む。
【００７８】
好ましくは、上記方法のプライマーペアは、上記診断キットの記載に従って規定される。すなわち、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に開示される配列の少なくとも一部、好ましくはその１３９７から２４０７までのヌクレオチド配列、または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に開示される配列の一部、好ましくは１７９２から３６２１までのヌクレオチド配列、または関連する配列のＰＣＲ増幅のためのプライマーとして働くことができるオリゴヌクレオチドペアである。もちろん、ここに開示されたような配列または関連する配列に基づいて、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法を確立することも可能である。当業者に知られているように、ＲＴ−ＰＣＲ法は、配列特異的プライマーを一つだけ使用してもよく、一方で他のプライマーは、ランダムヘキサプライマーやオリゴｄＴプライマー等のような非特異的なプライマーから選択されてもよい。対応するＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲキット、ならびに他の製品は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ ＵＳＡ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）等のようなさまざまな製造業者から市販される。ＰＣＲ法は、当業者に知られており、特有の実験装置は、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．）， ＰＣＲ２， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９５； Ｒｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９４； Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ２６， ３０１−３３４（１９９１）等のような、さまざまな実践的および理論的な参考文献から導き出すことができる。
【００７９】
Ｍ． ｓｕｉｓおよび関連する種の検出、またはかかる細菌による感染症の診断のための増幅方法の特に好ましい実施態様は、ＰＣＲの方法論により提供され、その方法論は増幅が完了した後（終点決定）、または増幅サイクル中に同時に（リアルタイムＰＣＲ）、作り出されたＰＣＲ産物を定量化することができるものである。リアルタイムＰＣＲ増幅のプロトコルは、検査試料中に存在する元のテンプレートの量を定量化することができる。リアルタイムＰＣＲ法の概論および特有の実験装置は、例えばhttp://dorakmt.tripot.com/genetics/realtime.htmlおよびこのＵＲＬで引用される参考文献； Ｆｅｎｏｌｌａｒ ａｎｄ Ｒａｏｕｌｔ， ２００４ ＡＰＭＩＳ １１２： ７８５−８０７に、概説される。したがって、本発明に基づいて、リアルタイムＰＣＲアッセイを利用することができ、そのアッセイはＭ． ｓｕｉｓまたは他の赤血球付着性マイコプラズマ種による感染症が疑われる個体に由来する血液、および器官の検査サンプル中のＭ． ｓｕｉｓまたは関連する種の定量的な検出に適している。ここに開示される赤血球付着性マイコプラズマ種に特異的な特有のコード配列に由来するプライマーターゲットを使用して、本発明のＰＣＲアッセイは、リボソームのターゲット配列に基づくアッセイに比較して、優れた特異性を提供するという利点がある。さらに、ＰＣＲ，特にリアルタイムＰＣＲ技術の標準化および自動化の容易性、ならびにかかる分析装置における混入の効果的な防止は、ありふれた検査室において相対的な条件下での本発明のアッセイの使用を可能とする。したがって、異なる国の異なる検査室において得られた結果の有益な比較を利用することができる。
【００８０】
本発明に従うベクターおよびポリペプチドは、Ｍ． ｓｕｉｓまたは関連する種による感染症に対する予防接種に特に有用である。したがって、本発明は、本発明のベクターおよび／または本発明のポリペプチドを含むワクチンにも関連する。
【００８１】
本発明に従う少なくとも一のポリペプチドを含むワクチンは、したがって、図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）および／または図５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）において開示される配列により規定されるタンパク質の少なくとも一の抗原決定基を含む。本発明に従うワクチンは、図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）および／または図５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されるアミノ酸配列に由来する複数の配列フラグメントを含むポリタンパク質を含んでもよい。好ましくは、本発明に従うワクチンは、一以上のアジュバントおよび／または他の免疫刺激剤を含む。適したワクチン、特にフロイントの不完全なまたは完全なアジュバントは、前述されている。
【００８２】
本発明に従うワクチンのさらなる実施態様は、遺伝子ワクチンによって代表される。本発明に従う遺伝子ワクチンは、例えばＲＮＡまたはＤＮＡに基づくベクターにより代表される、本発明に従うポリペプチドの発現によく適合する、前記のようなベクターを含む。したがって、本発明の遺伝子ワクチンは、好ましくは図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）および５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示される配列の一方または両方に含まれる一以上の抗原決定基の発現に適したベクターを含む。もちろん、本発明に従う遺伝子ワクチン中に含まれるベクターは、ここに開示された配列に含まれる複数のエピトープをコードするポリジーンを含んでもよい。適した遺伝子ワクチンは、例えばＩｖｏｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２， １７に概説されるよく知られた原理に従って設計してもよい。したがって、本発明の遺伝子ワクチンの使用によるＴ細胞の誘導は、感染した個体、特にブタ、ウシ、ネコ、およびイヌ等のような動物から、病原体（Ｍ． ｓｕｉｓまたは関連する種）を除去するための戦略を提供する。
【００８３】
本発明のさらなる実施態様は、したがって、Ｍ． ｓｕｉｓまたは関連する種による感染症の予防方法に関連し、その方法は、本発明のワクチンの有効量を、上記のように、対応する病原体による感染症が疑われる動物に投与することを含む。
【００８４】
前述したように、本発明の実施態様は、Ｍ． ｓｕｉｓおよび関連する病原体による感染症の治療に有用である。したがって、本発明に従う医薬組成物は、本発明に従う治療効果のある量のアンチセンス核酸、および／またはベクター、および／または抗体を、少なくとも一の薬学的に受け入れられる担体、賦形剤、および／または添加剤と一緒に含む。
【００８５】
したがって、本発明の医薬組成物中のアンチセンス核酸は、ここに記載されたポリペプチドの発現を阻害し、それゆえに病原体を除去、または少なくとも制御する。さらに、ここに記載したようなアンチセンス核酸を発現することができるベクターは、一般に同じ方法で機能する。本発明に従う抗体は、抗体の投与後、病原体が顕著に減少または除去までされるように、Ｍ． ｓｕｉｓおよび関連する種に由来する免疫優性のポリペプチドに結合することができる。
【００８６】
図１は、１０％ラエムリゲルの一次元ウェスタンブロットの写真を示し、これは、感染したブタの全血から得たＭ． ｓｕｉｓ抽出物中に存在する、８つのＭ． ｓｕｉｓ特異的抗原の検出を説明する。パネル（Ａ）は、Ｍ． ｓｕｉｓ陽性ブタから得た血清とインキュベートされたブロットを示す。Ｍ． ｓｕｉｓ陽性血清と特異的に反応しているバンドは、それぞれ分子量により表示される。免疫優性タンパク質（ｐ４０，ｐ４５およびｐ７０）は、アスタリスクでマークされている。Ｍ． ｓｕｉｓ陰性血清および抗ブタＩｇ複合体によっても検出された非特異的なバンドは、長方形でマークされている（パネル（Ｂ）および（Ｃ）参照、それぞれ：ｐ２６、ｐ５６、およびｐ７７）。パネル（Ｂ）は、Ｍ． ｓｕｉｓ陰性血清とインキュベートされた後の対応する対照ブロットを示し、パネル（Ｃ）は、抗ブタＩｇ複合体とインキュベートされた後の対照ブロットを示す。各ブロットにおけるレーンは左から右に：左のレーン：分子量マーカー；中央のレーン：感染したブタの全血から得たＭ． ｓｕｉｓ抽出物；右のレーン：感染していないブタ由来の全血抽出物である。
【００８７】
図２は、（Ａ）感染したブタの全血から得たＭ． ｓｕｉｓ抽出物の、（Ｂ）健康な対照動物から得た全血の、三通りの二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（分画電気泳動／ラエムリ）の写真を示す。
【００８８】
図３は、感染したブタの血清中の免疫優性Ｍ． ｓｕｉｓポリペプチドの同定を明示する、二次元ウエスタンブロットの写真を示す。パネル（Ａ）は、実験的に感染させたブタの全血から得られたＭ． ｓｕｉｓ抽出物の、クマジー染色した２次元ＰＶＤＦブロットを示す。パネル（Ｂ）は、Ｍ． ｓｕｉｓに感染したブタ由来の血清とインキュベートした後の、同じ２次元ブロットを示す。パネル（Ｃ）は、健康な対照動物から得た血清とインキュベートされた対照ブロットを示す。パネル（Ｄ）は、二次（抗ブタ）抗体のみとインキュベートされた対照ブロットを示す。Ｍ． ｓｕｉｓ陽性血清と反応する点は、文字でマークされている。点ａ、ｅ、ｆ、ｇ、およびｋは、（Ｃ）も同様にＭ． ｓｕｉｓ陰性血清によって認識されたので、Ｍ． ｓｕｉｓ特異的ではなかった。一見Ｍ． ｓｕｉｓ陽性血清によって認識されているが、正しく指定することができなかった点を、（Ｂ）において疑問符で示す。
【００８９】
図４（Ａ）は、遺伝子ｍｓｇ１の部分的なヌクレオチド配列を示す。このゲノムフラグメントは、Ｍ． ｓｕｉｓの免疫優性タンパク質（分子量、約４０ｋＤａ）をコードする１３９７から２４０７ヌクレオチドまでの翻訳領域（ＯＲＦ）を含む。開始コドンおよび終止コドンは、太字でマークされている。（Ｂ）は、（Ａ）に由来するタンパク質（ＭＳＧ１）の推定アミノ酸配列を示す。
【００９０】
図５（Ａ）は、Ｍ． ｓｕｉｓのさらなる免疫優性タンパク質（分子量、約７０ｋＤａ）をコードする１７９２から３６２７ヌクレオチドまでのＯＲＦを含む、遺伝子ｍｓａ１の部分的なヌクレオチド配列を示す。開始コドンおよび終止コドンは、太字でマークされている。（Ｂ）は、（Ａ）に由来するタンパク質（ＭＳＡ１）の推定アミノ酸配列を示す。
【００９１】
本発明は、以下の限定しない実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【００９２】
Ｍ． ｓｕｉｓ特異的な抗原の同定
【００９３】
マイコプラズマスイス抗原の調製
Ｍ． ｓｕｉｓ感染性の全血は、実験的に感染させた血液ドナー動物から、臨床的に急性のＰＥの菌血症が最大の時に得た。２００ｍｌの末梢全血は、２００ｍｌのアルセバー溶液中に１：１の比で採取された。Ｍ． ｓｕｉｓ細胞は、すでに記載されている通りに精製された（Ｈｏｅｌｚｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｖｅｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９３： １８５−１９６）。Ｍ． ｓｕｉｓ細胞を宿主細胞成分からさらに精製するために、結果として生じたＭ． ｓｕｉｓペレットは、無菌のＰＢＳ中に再懸濁され、２０％ジアトロゾートメグルミンナトリウムおよびジアトロゾートナトリウム（Ｕｒｏｇｒａｆｉｎ ７６％、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を通した２５０００ｘ ｇで１時間４℃の遠心によって、宿主細胞成分からさらに精製された（Ａｌｌｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３７： １４７４−１４７９）。最終ペレットは１．０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁され、使用するまで−８０℃で保存された（Ｍ． ｓｕｉｓ、（Ｍｓ）抗原）。ネガティブコントロール抗原は、前記のようにＭ． ｓｕｉｓがないことが確認された３頭の感染していない動物の抗凝固血液から、同様の方法で調製された。
【００９４】
一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット解析
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、標準的な手順に従って行われた（Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０） Ｎａｔｕｒｅ ２２７： ６８０−６８５）。つまり、分子量マーカーおよびネガティブコントロール抗原は、６２．５ｍＭ トリス（ｐＨ６．８）、２．０％（ｗｔ／ｖｏｌ） ドデシル硫酸ナトリウム、２５．０％ グリセロール、５．０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ） β−メルカプトエタノール、および０．００１２５％ ブロモフェノルブルーを含んでいる試料バッファー中で１０分間煮沸された。抗原は１０．０％ ポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ， Ｒｅｉｎａｃｈ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ， Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ ＩＩＩ；アクリルアミド／ビスアクリルアミドの比、３７．５：１）上で、トラックあたり８．０μｇのタンパク質ローディング濃度で分離された。電気泳動は、２００ｖの定常電圧下で、色素の最前部がゲルの下部に到達するまで（〜４０分）行われた。分離されたタンパク質は、ニトロセルロースのメンブレン（細孔の大きさ４５μｍ； ＢＡ８５、 Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｒｉｅｃｈｅｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に、セミドライ電気泳動トランスファーセル（Ｔｒａｎｓ Ｂｌｏｔ， ＢｉｏＲａｄ）、トランスファーバッファー（２５．０ｍＭ トリス、０．２Ｍ グリシン、２０．０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ） メタノール）、および３０分間の１０Ｖの定常電圧を用いて転写された。メンブレンはトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ、０．０１Ｍトリス、０．１５Ｍ食塩、ｐＨ８．５）３．０％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳液で、１時間ブロッキングされた。その後、メンブレンは３７℃にて２時間、ブロッキング溶液中に１：１００で希釈された実験用子豚由来の血清存在下でインキュベートされた。スロットブロット装置（マルチスクリーン装置、ＢｉｏＲａｄ）を適用して、８頭の実験的に感染させたブタの連続した血清試料が解析された。
【００９５】
メンブレンを、ＴＢＳで１０分間、２回洗浄した。西洋わさびペルオキシダーゼでラベルされたヤギ抗ブタＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ鎖特異的、Ｓｉｇｍａ）、ヤギ抗ブタＩｇＧ（γ鎖特異的、ＫＰＬ−Ｂｉｏｒｅｂａ、Ｒｅｉｎａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、およびヤギ抗ブタＩｇＭ（μ鎖特異的、ＫＰＬ）を、それぞれ二次抗体として用いた。全ての二次抗体は１：２０００でブロッキング溶液に希釈された。ブロットは、Ｈ２Ｏ２および４−クロロ−１−ナフトールを発色試薬（ＢｉｏＲａｄ）として用いて、発色させた。酵素反応は、蒸留水中でブロットを洗浄することにより止められた。タンパク質のバンドは、コンピューターを利用したバイオイメージシステム（ＢｉｏＰｒｏｆｉｌ ３．１、ＬＴＦ、Ｗａｓｓｅｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、分子量マーカーレーン（着色分子量サイズスタンダード、６．５から１７５ｋＤａまで、Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を参照することにより大きさが決められた。
【００９６】
結果
実験的に感染させた動物由来の血清を用いた１次元ウエスタンブロッティングは、３つの主要な結果を明らかとした：
ｉ）Ｍ． ｓｕｉｓ特異的抗原に対するＩｇＧ免疫反応は、感染中に見られる、
ｉｉ）少なくとも８のつのＭ． ｓｕｉｓ特異的抗原（ラエムリにしたがった１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように、３３ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５７ｋＤａ、６１ｋＤａ、７０ｋＤａ、７３ｋＤａ、および８３ｋＤａ）がある（図１Ａ）、および
ｉｉｉ）免疫グロブリン（ＩｇＧおよびＩｇＭ）は、ブタの血液由来のＭ． ｓｕｉｓと同時精製される（図１Ｂ、１Ｃ）。
【００９７】
Ｍ． ｓｕｉｓ抗原調製物の構成成分として同時精製された免疫グロブリンの存在は、同時精製されたタンパク質が、一次抗体により検出されたタンパク質と二次抗体により検出されたタンパク質を区別することができないＥＬＩＳＡ等のような間接的な血清学アッセイを困難なものとするので、Ｍ．ｓｕｉｓに特異的な血清学の検査が今のところ利用できないということを明らかにした。
【００９８】
免疫グロブリンを除去することによるＭ． ｓｕｉｓ抗原のさらなる精製は、免疫ブロットやＥＬＩＳＡによる免疫反応動力学の詳しい研究を可能とした。
【００９９】
３つのＭ． ｓｕｉｓ特異的なタンパク質は、免疫優性である（４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、７０ｋＤａ；図１Ａ参照）。全てのＭ． ｓｕｉｓに感染した動物は、３つの免疫優性タンパク質の少なくとも１つと、遅くとも感染の２週間目の間および実験の終了まで（１８週間）、血清反応性を示した。したがって、これらの３つのＭ． ｓｕｉｓ抗原は、特に血清診断および予防接種に有用である。
【０１００】
先行研究に反して、Ｍ． ｓｕｉｓ特異的な体液性免疫反応が波状の経過を示さず、バクテリアに対する古典的な免疫反応の速度論、つまり抗体の最初の存在は感染の約８−１０日後、最初の臨床症状より前に、およびＭ． ｓｕｉｓ特異的な抗体の何ヶ月もの持続に基本的に従うということが明らかになった。
【０１０１】
２次元ウェスタンブロッティング／ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるＭ． ｓｕｉｓ特異的な抗原の部分的な特徴づけ
【０１０２】
免疫反応性Ｍ． ｓｕｉｓタンパク質の性質および遺伝学をさらに同定するために、患者の血清プールを用いて、２次元免疫ブロッティングを行った（免疫プロテオミクス）。免疫反応性タンパク質の点は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いたペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）によってさらに解析された。
【０１０３】
２次元ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング
抗原試料（７５０μ Ｍ． ｓｕｉｓ抗原およびネガティブコントロール抗原それぞれ）は、スピンカラム（Ｖｉｖａｓｐｉｎ、１０ｋＤａ ＶＳ０１０１）を４０００ｘｇ１０℃で用いて、最終体積２００μｌに濃縮された。その後、試料は５００μｌの溶解バッファー（７Ｍ 尿素、２Ｍ チオ尿素、４％ ＣＨＡＰＳ、２％ ＤＴＴ、１％［ｖ／ｖ］ ファルマライト ｐＨ３−１０）で希釈された。２０℃で３０分間振とうした後、試料は１６０００ｘｇ２０℃で５分間遠心された。透明な上清の一定分量のタンパク質含有量は、ブラッドフォード法（ｘ−テスト、ＢｉｏＲａｄ）により決定され、試料は解析まで一定分量で−８０℃にて保存された。二次元ゲルには、全タンパク質の３００μｇがロードされた。最初の次元（等電点電気泳動）において、タンパク質は、ｐＨ３から１０にわたるｐＨ勾配を持った１８ｃｍのＩＰＧ（固定されたｐＨ勾配）条片中に分離された（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍｕｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。各試料の５つのゲルは、同一の実行条件で行われた（３０ｋＶｈ／ＩＰＧ条片）。定常状態に着目した後、Ｇｏｒｇ ｅｔ ａｌ（２０００） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１： １０３７−５３に従って、条片はＳＤＳでロードされ、ＤＴＴおよびロダセタミド中で平衡化された。二番目の次元において、ラエムリバッファー系が使用された（Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０） Ｎａｔｕｒｅ ２２７， ６８９）。タンパク質は、Ｈｏｅｆｅｒ ＩＳＯ − Ｓａｌｔチャンバー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で１０個のゲルで平行して垂直に流される標準的な連続した１２％ＳＤＳゲルで、分離された。一般に、１８００Ｖｈから２０００Ｖｈの間が適用される。ブロモフェノールブルーの最前部がゲルから消えたとき、ＳＤＳ ＰＡＧＥを停止した。
【０１０４】
電気泳動後、ゲルはガラス板から取り外され、製造業者のプロトコールに従ってＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（Ｒｏｔｈ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色された。ウエスタンブロッティングのために、セミドライブロッティング装置（Ｈｏｅｆｅｒ、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、染色されていない二次元ゲルをＰＶＤＦメンブレンで挟んで使用された。トランスファーバッファーは５０ｍＭ トリス、５０ｍＭ ホウ酸、および１０％メタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含み；１．５ｍＡ／ｃｍ２が３時間適用された。
【０１０５】
クマジー染色した２次元ゲルは、ペプチドマスフィンガープリントによるタンパク質の同定のために使用され、クマジー染色されたＰＶＤＦブロットは免疫学的染色のために使用された。さらに、クマジー染色されたマイクロ調製ゲルは、少量の点の同定のために、ゲルあたり５００μｇのタンパク質がロードされて行われた。
【０１０６】
ネガティブコントロール抗原と比較するＭ． ｓｕｉｓ抗原の２次元電気泳動の解析は、Ｐｒｏｔｅｏｍ Ｗｅａｖｅｒソフトウェアを用いて行われた（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ、ＰｒｏｔｅｏｍＷｅａｖｅｒ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１．１）。
【０１０７】
タンパク質の同定
タンパク質の点は、ペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析により同定された。点はクマジー染色された調製されたゲルから切り出され、１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、３０％ アセトニトリル（ＡＣＮ）を用いた３回の洗浄により脱色された。５μｌのトリプシンバッファー（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３に溶解された２５ｎｇ／μｌ トリプシン（Ｒｏｃｈｅ）、ｐＨ８）中、３７℃で一晩分解された後、試料は２５℃で２０分間、ソニケーションバス中に置かれた。上清が取り除かれ、スピードバック濃縮機を用いて濃縮された。脱塩のため、濃縮された溶液はＣ１８逆相ＺｉｐＴｉｐカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して処理され、０．１％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と８０％ ＡＣＮを用いて溶出された。溶出されたペプチドは、ターゲット上に置かれ、ジヒドロキシ安息香酸（１μｌ）を用いて共結晶化される。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＳＴＲ）は、リフレクターモードで７００から４０００ダルトンのペプチド範囲において実行された。得られたスペクトルは、ＮＣＢＩのデータベースに一致し、ＰｒｏＦｏｕｎｄソフトウェア（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖ． ２００３）を用いて対応するタンパク質が同定された。
【０１０８】
結果
前記Ｍ． ｓｕｉｓ抗原の６つのデータが得られ、それを表１に示す（図２も参照）。
【０１０９】
【表１】
【０１１０】
免疫優性Ｍ． ｓｕｉｓ特異的抗原のクローニング
【０１１１】
実験的に感染させたブタを使用して、Ｍ． ｓｕｉｓのゲノムライブラリーが構築された。ハイブリダイゼーションとショットガン配列決定法によるライブラリーのスクリーニングは、２つの免疫優性抗原（ＭＳＧ１、４０ｋＤａ； ＭＳＡ１、７０ｋＤａ）をコードする全長ヌクレオチド配列を明らかにした。クローンｍｓｇ１のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）は図４Ａに示され、それは１３９７ヌクレオチドから２４０７ヌクレオチドまでのＯＲＦを含む。タンパク質ＭＳＧ１の推定アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）は、図４Ｂに示される。クローンｍｓａ１のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）は、図５Ａに示され、それは１７９２ヌクレオチドから３２６１ヌクレオチドまでのＯＲＦを含む。タンパク質ＭＳＡ１の推定アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）は、図５Ｂに示される。
【０１１２】
２つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、これらの遺伝子において発見されたコドン使用によってエペリスロゾーンスイスをマイコプラズマ属へ再分類することが正当であるとする理由を提供する（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：１５−１８、Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：１０−１４参照）。
【０１１３】
免疫優性Ｍ． ｓｕｉｓ特異的抗原の組換え発現
【０１１４】
２つの免疫優性抗原ＭＳＧ１およびＭＳＡ１は、大腸菌中に、合成遺伝子工学によりマイコプラズマのコドン使用を大腸菌のそれに変更した後、組み換えて発現された。
【０１１５】
組換え発現のために、合成遺伝子ｍｓｇ１およびｍｓａ１のコード配列はｐＢＡＤＭｙｃＨｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の中に連結された。連結混合物を使用して、プラスミドＤＮＡの単離のためにコンピテント大腸菌系統ＴＯＰ１０に、タンパク質発現のためにコンピテント大腸菌系統ＬＭＧ１９４に形質転換された。形質転換体は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）アガープレートから選択された。導入されたフラグメントの正しい位置およびヌクレオチド含有量は、配列決定により検査された。発現条件は、各プラスミドコンストラクトに最適化された。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２００ｍｌのＲＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、大腸菌ＬＭＧ１９４形質転換体の単一のコロニーに由来する２ｍｌの新鮮な一晩培養したものを植菌され、約１０８細胞／ｍｌに相当する６００ｎｍにおいて０．６の吸光度（ＯＤ）となるまで３７℃で培養された。０．２％ アラビノースはＭＳＧ１およびＭＳＡ１の発現を誘導するために加えられ、培養物はさらに１−４時間インキュベートされた。バクテリアは遠心（５０００ｘｇ、１５分）により回収され、タンパク質精製が行われた。
【０１１６】
大腸菌形質転換体の細胞質タンパク質凝集体からのＭＳＧ１およびＭＳＡ１の精製は、Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行われた。バクテリアのペレットは、２０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁され、細胞は氷上でのウルトラソニケーション（３５Ｗ、３ｘ１０秒）により溶解された。不溶物は遠心（２８０００ｘｇ、３０分）により除去された。上清を１ｍｌのＮｉ２＋−ＮＴＡアガロースと混合した。チューブは、Ｈｉｓタグタンパク質が最大に結合できるように、穏やかに攪拌されながらインキュベートされた（１２０分、３７℃）。遠心（３０００ｘｇ、１０分）後、タンパク質を積んでいるＮｉ２＋−ＮＴＡアガロースは、１０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳで２回洗浄され（３０００ｘｇ、１０分）、その後ＭＳＧ１およびＭＳＡ１は、４００ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ０．５ｍｌで３回溶出された。精製されたタンパク質は−７０℃にて保存された。
【０１１７】
組換えＭ． ｓｕｉｓ特異的抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン免疫ブロッティング
【０１１８】
組換えタンパク質の免疫原性は、免疫したウサギおよびブタにより試験された。血清学的アッセイにおける組換えタンパク質の抗原としての有用性は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングにより確認できた。
【０１１９】
５００ｎｇの量の精製されたＭＳＧ１およびＭＳＡ１ならびにネガティブコントロール（大腸菌ＬＭＧ１９４）から得たタンパク質は、５ｘ試料バッファー[６２．５ｍＭ トリス ｐＨ６．８、１０％（ｖ／ｖ） グリセロール、５％（ｖ／ｖ） ２−メルカプトエタノール、２．０％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．００１％ブロモフェノルブルー]中で１０分間煮沸された後、ラエムリバッファーシステム（Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０） Ｎａｔｕｒｅ ２２７： ６８０−６８５）を用いて、２００Ｖの定常電圧にて、２．４％ポリアクリルアミドスタッキングゲルおよび１０％ポリアクリルアミド分離ゲルに通して電気泳動された。ゲルは、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｅｉｎａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、硝酸銀で染色された。免疫ブロッティングのために、タンパク質は、２５ｍＭ トリス、１９２ｍＭ グリシン、２０％（ｖ／ｖ） メタノール中で、電気泳動的に０．４５μ細孔サイズのニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｒｉｅｃｈｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にトランスファーされた。メンブレンは室温で６０分間、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｗｔ／ｖｏｌ）を含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ； １０ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中でブロッキングされた。メンブレンは３７℃で２時間、ブタ免疫血清またはウサギ免疫血清（ＴＢＳ ３％ ＢＳＡに１：２５０で希釈）とインキュベートされた。免疫前の血清、および挿入のないｐＢＡＤＭｙｃＨｉｓプラスミドを含んでいる大腸菌ＬＭＧ１９４形質転換体に対して生じた抗血清が、コントロールとして使用された。メンブレンはＴＢＳで１０分間、２回洗浄された。西洋わさびペルオキシダーゼでラベルされたウサギ抗ブタまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、ＴＢＳ ３％ ＢＳＡに１：１０００で希釈）が、二次抗体として使用された。抗原抗体反応は、Ｈ２Ｏ２および４−クロロ−１−ナフトールを発色試薬（ＢｉｏＲａｄ）として用いて視覚化された。酵素反応は、蒸留水中でブロットを洗浄することにより終了した。
【０１２０】
組換えＭ． ｓｕｉｓ特異的抗原を用いたＥＬＩＳＡ
【０１２１】
マイクロタイタープレート（Ｍｉｃｒｏｌｏｎ、Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｎｕｒｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、炭酸塩−炭酸水素塩バッファー（１５．０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３４．９ｍＭ ＮａＨＣＯ３、３．１ｍＭ ＮａＮ３、ｐＨ９．６）中にウェルあたり１００μｌの抗原（精製された組換えＭＳＧ１、ＭＳＡ１、または大腸菌ＬＭＧ１９４由来のコントロール抗原；ｆ．ｃ． ４００ｎｇ／ｍｌ）を用いて、４℃にて一晩コートされた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ； １３６．９ｍＭ ＮａＣｌ、１．４６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）が、洗浄およびインキュベーション希釈液として使用された。コーティングの後、プレートは自動プレート洗浄機（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いることにより３回洗浄された。ウェルは２００μｌのブロッキングバッファー[０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）プロテオースペプトンを含むＰＢＳ； Ｄｉｆｃｏ−Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ]でブロッキングされた。残っている洗浄およびインキュベーション工程は、ウェルあたり１００μｌの量で行われ、ウェルはインキュベーション工程間で３回洗浄された。マイクロタイター振とう機上で１５分一定の攪拌から始まるインキュベーションは、室温にて１時間行われた。プレートは、各試料の２倍の希釈範囲（１：２００から１：１０２４００；ウサギ、ブタ）でインキュベートされた。各ウェルはその後、所定の濃度の西洋わさびペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧまたはウサギ抗ブタＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ鎖特異的、Ｓｉｇｍａ）を受け取った。抗原抗体反応は、使用する直前の２ｍＭ Ｈ２Ｏ２の添加により活性化された、０．１Ｍ クエン酸リン酸バッファーｐＨ４．２５中０．７３ｍＭ ２，２’−アジノビス[３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸]（ＡＢＴＳ）を用いて可視化された。色は２０−３０分間発色することができた。ＯＤ値は、コンピューターを利用したマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）によって４０５ｎｍにおいて記録された。
【０１２２】
リアルタイムＰＣＲによるＭ． ｓｕｉｓ感染症の発病の診断および研究
【０１２３】
ｍｓｇ１遺伝子（約４０ｋＤａのタンパク質ＭＳＧ１をコードする）のヌクレオチド配列に基づいて、Ｍ． ｓｕｉｓ感染症の発病を診断および研究するためのリアルタイムＰＣＲを確立することができた。
【０１２４】
ＰＣＲ増幅のため、全ての血液試料（実験的に感染させたブタ、健康なコントロールブタ）は、次の通りに調製された：２００μｌの全抗凝固血は等量の溶解バッファー（１０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３２Ｍ スクロース、１％[ｖ／ｖ] Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）と混合され、遠心された（８０００ｘｇ、２２℃、６０秒）。ペレットは、４００μｌの溶解バッファー中に再懸濁され、再び遠心された。この工程をもう一度繰り返した後、ペレットは４００μｌのＰＢＳ中に再懸濁された。ＤＮＡは、フェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコールを使用した標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）に従って、またはＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ｃｏｍｐａｃｔ装置（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて抽出された。ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ Ｃｏｍｐａｃｔ核酸単離キットＩは、製造業者の使用説明書に従って使用された。
【０１２５】
Ｍ． ｓｕｉｓＤＮＡは、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒシステム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検出され、定量された。プライマーおよびハイブリダイゼーションプローブは、ｍｓｇ１中に規定されるが、それは以下の通りであった：ｍｓｇ１ｆ（センス）、５’−ＡＣＡＡＣＴＡＡＴＧＣＡＣＴＡＧＣＴＣＣＴＡＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）およびｍｓｇ１ｒ（アンチセンス）、５’−ＧＣＴＣＣＴＧＴＡＧＴＴＧＴＡＧＧＡＡＴＡＡＴＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）。
【０１２６】
プローブは：ＬＣ Ｒｅｄ ６４０−５’−ＣＡＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＴＡＡＧＡＡＧＡＧＣ−リン酸−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）および５’−ＴＴＣＡＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣ−３’−フルオレッセイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）である。
【０１２７】
増幅産物の大きさは１７８塩基対だった。リアルタイムＰＣＲはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｆａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ＭａｓｔｅｒＰＬＵＳハイブリダイゼーションプローブ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて実行された。抽出されたＤＮＡ（５μｌ）は、４μｌのＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（５ｘ濃度）、２μｌのＰｒｉｍｅｒ−Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘ（１０ｘ濃度、終濃度が０．５μＭの各プライマーと０．２μＭの各プローブを含む）、および９μｌの水（ＰＣＲグレード）を含む１５μｌのＰＣＲ混合物に添加された。ＰＣＲ条件は次の通り：１５分９５℃にて１サイクルの最初の変性、続いて１５秒９５℃、２０秒６０℃、および１０秒７２℃の４０サイクル。反応、データ収集、および解析は、すべてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置を用いることによって行われた。
【０１２８】
要約すれば、前記実施例は次のこと：
−Ｍ． ｓｕｉｓ特異的抗原の検出
−Ｍ． ｓｕｉｓ感染症におけるＩｇＧ免疫反応の検出
−診断および予防接種に有益な手段である、３つの免疫優性Ｍ． ｓｕｉｓ特異的抗原の検出
−免疫優性Ｍ． ｓｕｉｓタンパク質の構造および機能の検出
−免疫優性Ｍ． ｓｕｉｓタンパク質をコードしている遺伝子の解明
−赤血球付着性マイコプラズマ種のメンバーに由来する免疫反応性タンパク質の組換え発現
−本発明に開示された抗原に基づくＭ． ｓｕｉｓ血清学のためのテスト抗原の組換え産生は、動物実験に置き換えることができ、テスト抗原の高い標準化および均一化が可能である
−Ｍ． ｓｕｉｓ特異的組換え血清学的診断アッセイの確立
−Ｍ． ｓｕｉｓ特異的リアルタイムＰＣＲアッセイの確立
を示す。
【０１２９】
本発明の実施態様は、Ｍ． ｓｕｉｓ以外の赤血球付着性マイコプラズマ種、例えばウシでのＭ． ｗｅｎｙｏｎｉｉ、ネコでのＭ． ｈａｅｍｏｆｅｌｉｓ、イヌでのＭ． ｈａｅｍｏｃａｎｉｓによる感染症の診断および予防接種を可能とする。全赤血球付着性マイコプラズマ特異的診断アッセイの確立は、ヒトにおけるかかるマイコプラズマ微生物の重要性についてさらなる見識を与える。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１Ａ】１０％ラエムリゲルの一次元ウェスタンブロットの写真を示す。
【図１Ｂ】１０％ラエムリゲルの一次元ウェスタンブロットの写真を示す。
【図１Ｃ】１０％ラエムリゲルの一次元ウェスタンブロットの写真を示す。
【図２Ａ】三通りの二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（分画電気泳動／ラエムリ）の写真を示す。
【図２Ｂ】三通りの二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（分画電気泳動／ラエムリ）の写真を示す。
【図３Ａ】二次元ウエスタンブロットの写真を示す。
【図３Ｂ】二次元ウエスタンブロットの写真を示す。
【図３Ｃ】二次元ウエスタンブロットの写真を示す。
【図３Ｄ】二次元ウエスタンブロットの写真を示す。
【図４Ａ】遺伝子ｍｓｇ１の部分的なヌクレオチド配列およびそれに由来するタンパク質（ＭＳＧ１）の推定アミノ酸配列を示す。
【図４Ｂ】遺伝子ｍｓｇ１の部分的なヌクレオチド配列およびそれに由来するタンパク質（ＭＳＧ１）の推定アミノ酸配列を示す。
【図５Ａ−１】遺伝子ｍｓａ１の部分的なヌクレオチド配列およびそれに由来するタンパク質（ＭＳＡ１）の推定アミノ酸配列を示す。
【図５Ａ−２】遺伝子ｍｓａ１の部分的なヌクレオチド配列およびそれに由来するタンパク質（ＭＳＡ１）の推定アミノ酸配列を示す。
【図５Ｂ】遺伝子ｍｓａ１の部分的なヌクレオチド配列およびそれに由来するタンパク質（ＭＳＡ１）の推定アミノ酸配列を示す。
【背景技術】
【０００１】
本発明は、マイコプラズマスイス（Ｍ． ｓｕｉｓ）および関連する赤血球付着性マイコプラズマ種の予防接種および検出のための抗原に関する。さらに、本発明はかかる抗原をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む宿主細胞、ならびにＭ． ｓｕｉｓや関連する病原体による感染症の治療方法および予防接種の方法に関する。
【０００２】
Ｍ． ｓｕｉｓ（以前はエペリスロゾーンスイス）は、赤血球付着性バクテリアのグループに属する。Ｍ． ｓｕｉｓは、ブタの赤血球に付着してその変形や損傷を引き起こすエピセルラーヘモパラサイトである。その結果として生じる病気は、伝統的にブタエペリスロゾーン症（ＰＥ）と呼ばれるが、世界中で報告され、低い罹患率と高い死亡率の熱性急性黄疸性貧血として現れる、家畜のブタの問題と考えられている。慢性の軽度のＭ． ｓｕｉｓ感染症は、無症状の感染から、（ｉ）貧血、軽度の黄疸、および新生児における全般的に丈夫でないこと、（ｉｉ）家畜のブタにおける成長遅延、および（ｉｉｉ）雌ブタにおける低い繁殖成績を含む臨床症状の範囲まで様々である。さらに、Ｍ．ｓｕｉｓは、宿主の免疫反応を抑制し、ブタの呼吸器および腸の病気の他の感染体にかかりやすくすると思われている。
【０００３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養系の欠如は、Ｍ． ｓｕｉｓの生態を系統的に解析することや、例えばブタ集団におけるＭ． ｓｕｉｓの有病率や重大性を正確に評価するための有益な診断方法を開発することの重大な障壁である。これまではＭ． ｓｕｉｓの検査診断は、化学的に染色された末梢血の塗抹標本の顕微鏡試験によっており、赤血球に付着した微生物を直接視覚化する。急性疾患の発症に関連する、すぐに同定できるけれども短期間である菌血症が慢性感染において欠けているため、顕微鏡の欠点は特異性および感受性の両方の問題を含む。
【０００４】
Ｍ． ｓｕｉｓが引き起こすブタのエペリスロゾーン症を制御する有効な方法は、感染したキャリア動物を検出し除去することによって感染を根絶することである。これらの目的のために、血清学的アッセイが未だに最適な方法である。規定されたＭ． ｓｕｉｓ抗原に基づく特異的で感受性の高い血清学的アッセイは、広範囲な有病率の研究を可能とし、診断検査室における日常のこととして適用される。しかし、Ｍ． ｓｕｉｓに対するブタの体液性免疫反応を解析する試みは、補体結合テスト（ＣＦＴ）、間接赤血球凝集アッセイ（ＩＨＡ）、および酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む、現在の抗体アッセイの低い感受性および特異性により阻害されていた。今まで記載されている血清診断アッセイは、実験的に感染させたブタの末梢血から得た複雑で定義されていないＭ． ｓｕｉｓ抗原を採用するという本質的な欠点を有する。ブタの集団を慢性のＭ． ｓｕｉｓ感染について試験するための優れた標準と現在考えることができる唯一のアッセイは、脾臓を摘出することにより急性の病気を誘発し、顕微鏡を用いてブタの菌血症を確認することである（Ｈｅｉｎｒｉｔｚｉ， １９８４ Ｔｉｅｒａｒｚｔｌ． Ｐｒａｘ． １２： ４５１−４５４）。
【０００５】
しかしながら、ブタの脾臓摘出は日常の診断には適さない。最近、ＤＮＡハイブリダイゼーションやＰＣＲアッセイなどのような分子的な方法が開発され、低レベルの菌血症を伴う慢性ＰＥの顕微鏡による診断における低感受性に関連する問題は解決された。しかし、日常の検査室で使用されうる標準的な方法が存在しない。
【０００６】
Ｍ． ｓｕｉｓはテトラサイクリンを用いて薬学的に治療される。この治療法を行う場合、ＰＥの発作中の臨床症状から感染したブタを治療することができるが、感染したブタからＭ． ｓｕｉｓを排除することはできない。したがって、持続性で臨床的に不顕性の感染したブタは、集団内または集団間におけるＭ． ｓｕｉｓの伝染のホットスポットであるキャリア動物のままである。
【０００７】
Ｍ． ｓｕｉｓをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養できないため、予防接種は開発されていない。したがって、潜在的なワクチン候補は、臨床的に急性の病気のブタのブタ血液に由来し、それは、ｉ）ワクチンが、副作用、すなわち同種抗原に対する免疫反応（同種免疫）につながると考えられるブタ血液の成分を含むこと、ｉｉ）Ｍ． ｓｕｉｓ分離株が完全に毒性が強く、これらの分離株を、例えば培養継代により弱毒化する可能性がないことという２つの主要な制限につながる。さらに、今まで、適したワクチンコンストラクト選択の基礎とすることができるＭ． ｓｕｉｓの免疫原性の構造およびＰＥの免疫反応についての情報は入手できていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明の根底にある技術的な課題は、信頼できる診断（血清学、分子）のための新しい化合物および方法、ならびにＭ． ｓｕｉｓや関連するバクテリアによる予防接種および治療の提供である。
【０００９】
上記の技術的な課題の解決法は、請求項に定義されたように、本発明の実施態様により提供される。
【００１０】
本発明は特に、Ｍ． ｓｕｉｓの抗原構造および遺伝子構造についての研究を可能とする、実験的に感染させたブタにおいて作られた大量のＭ． ｓｕｉｓバクテリアの利用に基づく。この事実によって、詳細な一次元および二次元ウェスタンブロット解析を行うこと、およびＭ． ｓｕｉｓのゲノムＤＮＡライブラリーを構築することが可能となった。さらに、このブタモデルは、Ｍ． ｓｕｉｓの使用における免疫反応の性質および動力学の解析を可能とした。
【００１１】
よって、第一の形態にしたがって、本発明は赤血球付着性マイコプラズマ種、特にＭ． ｓｕｉｓに対するワクチンに関するものであって、該ワクチンは、Ｍ． ｓｕｉｓのタンパク質から選択されたタンパク質の少なくとも一の抗原決定基を含んでいる、少なくとも一のぺプチドまたはポリペプチドを含むものであって、該Ｍ． ｓｕｉｓのタンパク質は、０．０２５Ｍ トリス／０．１９２Ｍ グリシン／０．１％ＳＤＳ水溶液の連続的な１２％ポリアクリルアミドゲル中で約３３ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５７ｋＤａ、６１ｋＤａ、７０ｋＤａ、７３ｋＤａ、および８３ｋＤａの見かけの分子量を有し、Ｍ． ｓｕｉｓ陽性動物、特にＭ． ｓｕｉｓに感染したブタ由来の血清に対して反応する。
【００１２】
好ましい実施態様によれば、ワクチンは少なくとも一のタンパク質の抗原決定基を含んでいる少なくとも一のペプチドまたはポリペプチドを含み、そのタンパク質は上記の実験条件で判定するとき４０ｋＤａの見かけの分子量を有する。
【００１３】
したがって、本発明による上記抗原は、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ （１９７０） Ｎａｔｕｒｅ ２２７、 ６８９参照）および（例えば、前述のように、脾臓の摘出および顕微鏡による菌血症の確認等のようなこれまでの通常のＭ． ｓｕｉｓの検出方法によって）Ｍ． ｓｕｉｓに感染したことがわかっている一以上のブタ由来の血清を用いたウエスタンブロッティングにより判定されたように、上記Ｍ． ｓｕｉｓ由来のタンパク質の少なくとも一のエピトープ（抗原決定基）を含む。
【００１４】
上記のようなＭ． ｓｕｉｓタンパク質の源は、Ｍ． ｓｕｉｓおよびこの病原体に由来する物質が発見されうる任意の試料または検査サンプルとしてもよい。特に、Ｍ． ｓｕｉｓの物質の源は好ましくは感染した個体、特にブタ由来の、臓器組織および体液（例えば、脾臓組織、血液およびその一部、例えば血清、脳脊髄液、滑液、リンパ液など）のような検査サンプルである。Ｍ． ｓｕｉｓ細胞は、Ｈｏｅｌｚｌｅ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９３： １８５−１９６に記載されているような源から精製されてもよい。
【００１５】
さらに、精製は一以上の遠心分離の工程を含んでもよい。Ｍ． ｓｕｉｓの試料は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に使用するまで保存されてもよい。電気泳動のために、Ｍ． ｓｕｉｓ細胞は、当業者に知られている溶解バッファーに都合よく溶解される。Ｍ． ｓｕｉｓ細胞の溶解後、溶解液は上記Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７９）により記載された方法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられる。分離されたタンパク質の見かけの分子量を決定するために、Ｍｗ スタンダード（例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙから市販）は同じゲル上に流される。電気泳動後、ゲルはウェスタンブロッティングにかけられる。例えばセミドライブロッティング装置（例えば、Ｈｏｅｆｅｒ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから市販）において、ＳＤＳゲル中で分離されたタンパク質をメンブレン（例えばニトロセルロース、ＰＶＤＦ）上に固定する。上記Ｍ． ｓｕｉｓ由来の抗原タンパク質は、Ｍ． ｓｕｉｓに感染した動物由来の血清とのインキュベーションと、その後、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、ビオチン、放射活性ヨウ素等の適したマーカーでラベルされたヤギ抗ブタＩｇＧのような二次抗体の使用により同定される。その後、ブロットは通常、感染していない動物の体液由来のネガティブコントロールの抗原と比較される。さらに、上記のＭ． ｓｕｉｓ由来の抗原タンパク質の同定方法は、タンパク質をＳＤＳゲルから得て、そのまま本発明のワクチン中の抗原として使用する、またはタンパク質はさらに精製され、および／または抗原決定基を含む適したペプチド断片に断片化されることができるように、調製用の、またはマイクロ調製用のスケールに適合させてもよい。
【００１６】
本発明によると、“ペプチド”および“ポリペプチド”の語は同意語として使用される、つまり上記の語は、酸アミドの方法でのペプチド結合により互いに結合しているアミノ酸の任意の縮合産物を含む。かかるペプチドまたはポリペプチドのさらに必要な特徴は、それぞれの化学的実体が、Ｍ． ｓｕｉｓまたは関連する種由来の“抗原決定基”を含むことのみである。
【００１７】
ここで用いられる場合、“抗原決定基”は、免疫反応、特に、抗原決定基（エピトープ）に抗原結合領域を介して特異的に結合できる抗体が産生されるような免疫反応を誘導することができる抗原表面上の３次元構造を意味する。抗原決定基は、アミノ酸、糖、または脂質を含んでもよい。本発明のタンパク質上に存在する抗原決定基は、通常、少なくとも５、より好ましくは少なくとも７アミノ酸により形成される。抗原決定基は連続的な配列に存在するアミノ酸により形成されてもよく（連続的な、または配列決定因子）、またはポリペプチドのフォールディングによりエピトープに集まるアミノ酸によって形成されてもよい（非連続的な、またはコンフォメーションの決定因子）。
【００１８】
抗原決定基はタンパク質またはタンパク質自体の断片上に存在してもよく、または適したハプテンと結合してもよい。
【００１９】
本発明のワクチンの好ましいさらなる成分は、抗原決定基に対する免疫反応を向上させるアジュバントである。典型的なアジュバントは、不活性化したバクテリアと一緒にまたはなしで適用されるアルミニウム化合物、特に水酸化アルミニウムおよびミネラルオイルである。もっともよく知られたアジュバントは、通常ミネラルオイル、乳化剤（ラノリン）および不活性化したマイコバクテリアの懸濁液を含む完全なフロイントアジュバントである。不完全なフロイントアジュバントは、マイコバクテリアを含まない。適したワクチンアジュバントは、先行技術に開示されている；例えばＨａｃｋｅｔｔ （２００３） Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ： Ｔｏｐｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ参照。
【００２０】
さらに本発明は、赤血球付着性マイコプラズマに特異的な診断、検出、予防接種、および治療のために特に有用なタンパク質の抗原決定基の特異的な配列を提供する。
【００２１】
したがって、本発明のさらなる一形態は、図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されているアミノ酸配列の少なくとも一の抗原決定基（エピトープ）を含むアミノ酸配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドである。
【００２２】
好ましい実施態様によると、本発明は、図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されている配列中に含まれる連続した抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されているアミノ酸配列の少なくとも５、好ましくは少なくとも７の連続したアミノ酸と、少なくとも８０％、好ましくは９０％、特には少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列をコードしている配列を含む。
【００２３】
より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されている配列と、少なくとも８０％、好ましくは９０％、特には少なくとも９５％の相同性を有するタンパク質をコードする配列、または抗原断片、変異体、突然変異体、または前記配列の類似体を含む。
【００２４】
“相同性”の語は、当該タンパク質配列がそれらのアミノ酸残基のあるパーセンテージを共通して有することである。したがって、５０％の相同性とは、配列中の１００のアミノ酸の位置の５０が同じものであることを意味する。
【００２５】
本発明に従うポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または一以上の改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでもよい。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖の形であってもよい。ＤＮＡ、特に二本鎖ＤＮＡの形がとりわけ好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、化学合成または酵素合成により生産されうる（Ｇａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ： Ｖｅｒｌ． Ｃｈｅｍｉｅ １９８２参照）。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトは、組換え遺伝子技術により作られる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９参照）。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの“抗原フラグメント”は、完全なポリペプチドの一部または領域であり、特に動物またはヒト、とりわけ赤血球付着性マイコプラズマ種による感染を疑われる動物またはヒトにおいて免疫反応を誘導することができるフラグメントである。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの“変異体”は、そのほかの種、特に赤血球付着性マイコプラズマ種に由来する元のポリペプチドの機能的若しくは非機能的な等価物、または、選択的スプライシングまたは翻訳後プロセシングにより生じる元のポリペプチドの機能的若しくは非機能的な誘導体であるが、変異体は少なくとも抗原断片について上記のような抗原の機能は保持する。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの“突然変異体”は、一以上のアミノ酸残基の挿入、置換、付加、および／または欠失により自然に生じたタンパク質に由来する。アミノ酸置換は、保存されてもよく、保存されなくてもよい。保存されたアミノ酸置換は、置換されたアミノ酸残基の化学的な特徴（例えば大きさ、疎水性／親水性の性質、電荷、脂肪族／芳香族の性質等）が実質的に変化しない置換である。保存されたアミノ酸置換の例は、Ｖａｌ／Ａｌａ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、およびＳｅｒ／Ｔｈｒ置換である。
【００２８】
本発明の特に好ましいポリヌクレオチドは、図４Ａに示される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）、最も好ましくはその１３９７から２４０７のヌクレオチド、または図５Ａに示される配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、最も好ましくはその１７９２から３６２１のヌクレオチド、または前記配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、特に９５％の相同性を有する配列、ならびに標準的なハイブリダイゼーション条件下で、前記配列およびその相補配列とハイブリダイズする配列である。
【００２９】
核酸の種類によって、標準的なハイブリダイゼーション条件は、約０．１から５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）間の水性バッファー中、任意に約５０％ホルムアミドの存在下で、約４２から約５８℃の間の温度により表される。例えば、５ｘＳＳＣで４２℃、５０％ホルムアミド。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイズのための好ましいハイブリダイゼーション条件は、約２０から４５℃の間の温度の０．１ｘＳＳＣであり、より好ましくは約３０から４５℃の間の温度である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイズのための好ましいハイブリダイゼーション条件は、約３０から５５℃の間の温度の０．１ｘＳＳＣであり、より好ましくは約４５から５５℃の間の温度である。上記のハイブリダイゼーション温度は、ホルムアミド非存在下、約１００のヌクレオチド長で５０％のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸のために計算された融点の例である。ＤＮＡハイブリダイゼーションのための実験条件は、先行技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８９）に記載され、当業者は核酸の長さ、ハイブリットの型、およびＧ＋Ｃ含有量によって個々の条件を計算することができる。核酸ハイブリダイゼーションについてのさらなる情報は、次の引用により提供される：Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ）、１９８５、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（ｅｄｓ）、１９８５、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ； Ｂｒｏｗｎ（ｅｄ）、１９９１、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドは、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）および５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示された配列のフラグメント、変異体、突然変異体、ならびに類似体、特に図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示された１３９７から２４０７のヌクレオチド、または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示された１７９２から３２６１のヌクレオチドの配列のフラグメント、変異体、突然変異体、ならびに類似体を含む。上記配列の“フラグメント”とは、元の配列の一部または領域である。“変異体”とは、元の配列と比較して異なる種において発見される配列であり、または元のヌクレオチド配列がコードするポリペプチドのスプライシングバリアント若しくは翻訳後にプロセシングされたバージョンをコードしてもよい。本発明によるポリヌクレオチドの特定の変異体は、例えばＭ． ｗｅｎｙｏｎｉｉ、Ｍ． ｈａｅｍｏｆｅｌｉｓおよびＭ． ｈａｅｍｏｃａｎｉｓ等のようなＭ． ｓｕｉｓ以外の赤血球付着性マイコプラズマ種において発見される。
【００３１】
ポリヌクレオチドの“突然変異体”は、一以上のヌクレオチドの挿入、置換、付加、逆位、および／または欠失により、親ポリヌクレオチドから得られる。図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）および５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される配列の特定の突然変異体は、赤血球付着性マイコプラズマ種において見られるコドン使用に比べて異なるコドン使用により得られる。特に好ましい変異体は、例えば対応するポリペプチドを生成するための大腸菌などのような、適した宿主細胞のコドン使用を利用するように設計される。特に、ＴＧＡは標準的なコドン使用において終止コドンであるにもかかかわらず、Ｔｒｐをコードする；ＮＣＢＩの分類学データベースの翻訳表４； Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８： １５−１８； Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８： １０−１４参照。
【００３２】
ポリヌクレオチドの“類似体”は、ポリヌクレオチドの機能的な等価物をコードするが、一以上の天然に生じないヌクレオチドを含む。類似体の修飾は、天然のヌクレオチドと比較して核酸構成要素の塩基ならびに糖および／またはリン酸部分において起こりうる。ヌクレオチド類似体の具体例は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ペプチド核酸（すなわち、ポリヌクレオチドは少なくとも一部においてペプチド結合の主鎖により特徴付けられ、したがってＰＮＡを表す）、メチルホスホネート、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシンおよびイノシンである。
【００３３】
本発明は、上記で規定された本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を制御することができるヌクレオチド配列にも関する。かかる制御配列は、本発明のポリペプチドのコード配列を含む遺伝子に由来する。好ましいヌクレオチド配列は、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示される１から１３９６までのヌクレオチド、および／または２４０８から２６０７までのヌクレオチド、および／または５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される１から１７９１までのヌクレオチド、および／または３６２２から４３５０までのヌクレオチド、または前記配列の機能的に活性のあるフラグメント、変異体、突然変異体、若しくは類似体である。
【００３４】
図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または前記アミノ酸配列に由来するポリペプチドの発現を制御するために好ましい配列は、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示される１から１３９６のヌクレオチド、および／または２４０８から２６０７のヌクレオチドに由来する。図５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または前記アミノ酸配列に由来するポリペプチドの発現を制御するために好ましい配列は、図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される１から１７９１のヌクレオチド、および／または３６２２から４３５０のヌクレオチドに由来する。
【００３５】
本発明のさらなる実施態様は、上記ポリヌクレオチドに対するアンチセンス核酸である。
【００３６】
アンチセンス核酸は、少なくとも一部はターゲット配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する。本発明のアンチセンス核酸は、一本鎖または二本鎖の核酸であり、その核酸は少なくとも一部は図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示される１３９７から２４０７までのヌクレオチド配列または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される１７９２から３６２１までのヌクレオチド配列の少なくとも８、好ましくは少なくとも１０の連続したヌクレオチドに相補的である。本発明に従う好ましいアンチセンス核酸は、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示される１３９７から２４０７の、または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される１７９２から３６２１のヌクレオチドの全長または部分配列を有するポリヌクレオチドに結合できる分子である。
【００３７】
本発明によると、“アンチセンス核酸”の語は、核酸塩基を結合するペプチド主鎖によって特徴付けられるペプチド核酸（ＰＮＡ）も含む。本発明において使用するさらに好ましいアンチセンス核酸は、リボザイム、特にハンマーヘッドリボザイム、またはＤＮＡエンザイム、特に１０−２３型のもの等のような触媒的な核酸の部分である。リボザイムは触媒として活性なＲＮＡであり、ＤＮＡエンザイムは触媒として活性なＤＮＡである。
【００３８】
本発明との関連で有用なアンチセンス核酸は、通常、修飾されていないまたは修飾されたヌクレオチドを含む、またはそのようなヌクレオチドからなるＤＮＡまたはＲＮＡ種である。特に、アンチセンスＲＮＡ分子の場合、リボヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性を増大させるため、天然に生じるヌクレオチドの少なくとも一の類似体を組み込むことが好ましい。これは、細胞のＲＮＡ分解酵素は、天然に生じるヌクレオチドを好んで認識する、という事実によるものである。したがって、ＲＮＡに核酸類似体を組み込むことによって、ＲＮＡの分解をうまく減少させることができる。
【００３９】
本発明に従うポリヌクレオチドの類似体についてすでに述べた通り、天然のヌクレオチドに比べて類似体の修飾は、核酸構成要素の塩基ならびに糖および／またはリン酸部分において起こりうる。ヌクレオチド類似体の具体例は、前記で言及される。
【００４０】
好ましい実施態様によると、本発明のアンチセンス核酸は、本発明のポリヌクレオチドの発現を実質的に阻害することができ、例えば、赤血球付着性マイコプラズマ種、特にＭ． ｓｕｉｓにおいて見られる通常のまたは天然に生じる発現レベルに比べて、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、またはより一層の差である。
【００４１】
さらに本発明は、上記の、ポリヌクレオチドおよび／またはアンチセンス核酸を含むベクターに関連する。
【００４２】
本発明に従うベクターは、直鎖状のまたは環状の核酸分子であり、好ましくは適した宿主においてポリヌクレオチドまたはアンチセンス核酸を導入、および増幅／複製することができるプラスミド、ウイルス、ファージ、若しくはコスミド、または他の人工的な核酸コンストラクトに由来するものである。本発明のベクターは好ましくは宿主において自律的に複製されることができる。したがって、ベクターは通常、少なくとも一の複製の起点（Ｏｒｉ）、一以上の他とは異なる制限酵素認識部位（ＭＣＳ、多重クローニング部位）、うまく形質転換された宿主細胞を選択するため、例えば、カナマイシン、アンピシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等の抗生物質耐性遺伝子等のような一以上のマーカー遺伝子、といった成分を含む。本発明の特に好ましいベクターは、好ましくは転写に適したプロモーター、オペレーター、および転写終結配列、ならびに対応するｍＲＮＡの翻訳を開始するためのリボソーム侵入部位の配列を含む発現ベクターである。
【００４３】
したがって、好ましい実施態様によると、本発明のベクターは、ポリヌクレオチドおよび／またはアンチセンス配列に作用可能なように結合し、それゆえに前記ポリヌクレオチド／アンチセンス核酸の発現を制御することができる、少なくとも一のプロモーター配列を含む。本発明のコンストラクトにおいて適したプロモーターは、例えば、ｌａｃプロモーターやその誘導体等のような一般的なバクテリアのプロモーター、例えばＩＰＴＧの添加により誘導することができるｔａｃである。他の好ましい誘導できるバクテリアのプロモーターは、ＡｒａＣ／ｐＢＡＤシステムである。さらに、本発明のベクターは、バクテリアのシステムにおいて発現させるためのファージプロモーターを含んでもよい。ファージプロモーターの好ましい例は、Ｔ７、ラムダＰＬおよびＳＰ６プロモーターである。本発明のベクター中に存在しうるさらに好ましい要素は、転写の終了のための配列（転写終結配列）、ならびに、例えばエンハンサーおよび／またはリプレッサー配列等のような、ポリヌクレオチドおよび／またはアンチセンス核酸の発現を制御する配列である。本発明のベクターは、好ましくは本発明のポリペプチドをコードする遺伝子に由来する制御配列を含む。特に好ましい制御配列は前に記載される。
【００４４】
本発明に従う特に好ましいベクターは、バクテリアの発現ベクターであって、ポリヌクレオチドは、コンストラクトの検出および／または精製を促進するためのマーカーまたはタグとして働くペプチド／ポリペプチドをコードする一以上の配列中にインフレームでクローン化されることができる。かかるタグまたはマーカーは、発現したポリペプチド上のＮ末端および／またはＣ末端に存在しうる。具体例は、ヒスチジンタグ、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）、ＧＦＰ、ＹＦＰ等の蛍光マーカーを提供するタンパク質をコードする配列である。
【００４５】
本発明のさらなる形態は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはアンチセンス核酸、および／またはベクターを含む宿主細胞である。通常、宿主細胞は、（かかる媒介物が使用される場合）ポリヌクレオチド／アンチセンス核酸の伝播／発現のために選択されたベクターにしたがって選択される。
【００４６】
好ましい宿主細胞は、例えばバクテリア、特に大腸菌および赤血球付着性マイコプラズマ種、とりわけＭ． ｓｕｉｓ、Ｍ． ｗｅｎｙｏｎｉｉ、Ｍ． ｈａｅｍｏｆｅｌｉｓ、およびＭ． ｈａｅｍｏｃａｎｉｓなどのような原核生物の宿主から選択される。他の有用な宿主細胞は、真核生物の宿主細胞、例えばＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母細胞である。
【００４７】
さらに本発明は、上記のように、ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドに関する。したがって、本発明によるポリペプチドは、ＭＳＧ１（図４Ｂに従うアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２））またはＭＳＡ１（図５Ｂに従うアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４））の少なくとも一の抗原決定基を含む。本発明に従うポリペプチドの好ましい実施態様は、図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）若しくは図５Ｂに示されたアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）、または前記配列の抗原性のフラグメント、変異体、類似体、若しくは突然変異体を含むアミノ酸配列を含む。
【００４８】
本発明は、上記のポリペプチドに対する抗体にも関連する。“抗体”の語は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、遺伝子工学により合成された、例えばヒト化抗体を含み、それらは結合したまたは溶解した形で存在しうる。さらに、本発明に従う“抗体”は、前述の種のフラグメントまたは誘導体としてもよい。かかる抗体または抗体フラグメントは、組換え型分子として、例えば他の（タンパク質性の）成分との融合タンパク質として存在してもよい。抗体フラグメントは、通常、酵素消化、タンパク質合成により、または当業者に知られている組換え技術により生産される。したがって、本発明において使用するための抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒトの若しくはヒト化された若しくは組換え型の抗体、またはそれらのフラグメント、および一本鎖抗体、例えばｓｃＦｖ−コンストラクト、または合成抗体である。
【００４９】
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物の血清から生産された抗体分子の不均一な混合物である。本発明は、抗体混合物の精製により（例えば、特異的なエピトープのペプチドを持つカラムを用いたクロマトグラフィーを通して）得られるポリクローナルの単一特異性抗体もある。モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに特異的な抗体の均一な集合を表す。モノクローナル抗体は、先行技術に記載された方法にしたがって調製することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５−３９７，（１９７５）； 米国特許４３７６１１０号； Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ， Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ）， １９９８， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。言及した資料の開示は、引用により本発明に全て組み込まれる。
【００５０】
本発明において使用するための遺伝子工学により合成された抗体は、上記の参考文献において記載されているような方法に従って生産されてもよい。つまり、抗体産生細胞は十分な吸光度まで培養され、全ＲＮＡは、グアニジウムチオシアネートを用いた細胞の溶解、酢酸ナトリウムを用いた酸性化、フェノール、クロロホルム／イソアミルアルコールを用いた抽出、イソプロパノールを用いた沈殿、およびエタノールを用いた洗浄により調製される。ｍＲＮＡは通常、オリゴｄＴを結合した樹脂（例えばセファロース）を用いたクロマトグラフィーまたはバッチ吸収によって、全ＲＮＡから単離される。ｃＤＮＡは、逆転写によりｍＲＮＡから調製される。このようにして得たｃＤＮＡを、適したベクター（動物、真菌、バクテリア、またはウイルスに由来するもの）にすぐに、または“部位特異的突然変異誘発”（一以上の塩基対の挿入、逆位、欠失、または置換を導く）による遺伝子操作後に挿入することができ、対応する宿主生物中で発現させることができる。適したベクターおよび宿主生物は、当業者によく知られている。ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８／１９、ｐＡＣＹＣ１８４、ラムダ、または酵母ミューベクター等のようなバクテリアまたは酵母に由来するベクターは、好ましい例として挙げられてもよい。かかるベクターは、対応する遺伝子のクローニングおよび大腸菌等のバクテリア若しくはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母中での発現のためにうまく使用される。
【００５１】
本発明において使用するための抗体は、次の免疫グロブリンクラスのいずれかに属することができる：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤ、および前記クラスのサブクラス、例えばＩｇＧクラスのサブクラスを適用できる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧＭ等のようなＩｇＧおよびそのサブクラスが好ましい。ＩｇＧサブタイプのＩｇＧ１／ｋまたはＩｇＧ２ｂ／ｋは、特に好ましい。本発明において使用するためのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはｉｎ ｖｉｖｏで培養することができる。高力価のモノクローナル抗体は、好ましくはｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕで産生される。
【００５２】
キメラ抗体は、異なる起源の成分を含んでいる種である（例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびブタ免疫グロブリンに由来する定常領域を含んでいる抗体）。キメラ抗体は、患者に投与する際に種の免疫原生を減少させるため、および産生収率を向上させるために採用される。例えば、ハイブリドーマ細胞系と比較して、マウスモノクローナル抗体は高い収率を与える。しかし、それは非マウス、例えばブタの患者において、より高い免疫原生を引き起こす。したがって、キメラの非マウス（特にブタ）／マウス抗体が、好ましくは使用される。マウスモノクローナル抗体の超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）が、非マウス、好ましくはブタの抗体のさらなる抗体領域と結合するモノクローナル抗体は、なおさら好ましい。キメラ抗体およびその製造方法は、先行技術に記載されている（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ３２７３−３２７７（１９８４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ６８５１−６８５５（１９８４）； Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３１２ ６４３−６４６（１９８４）； Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ−Ａ−１２５０２３； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ２６８−２７０（１９８５）； Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ−Ａ−１７１４９６； Ｍｏｒｒｉｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ−Ａ−１７３４９４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ８６／０１５５３； Ｋｕｄｏ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ−Ａ−１８４１８７； Ｓａｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７： １０６６−１０７４（１９８６）； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ８７／０２６７１； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ３４３９−３４４３（１９８７）； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ２１４２１８（１９８７）； Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０： １０４１−１０４３（１９８８）およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 上記）。前述の資料の開示内容は、引用により本明細書中に組み込まれる。
【００５３】
本発明によると、“抗体”の語は、完全な抗体分子およびＭＳＧ１またはＭＳＡ１に結合することができるそれらのフラグメント、またはそれらのフラグメント、誘導体、類似体および他の血球付着性マイコプラズマ種に由来する関連するタンパク質を含む。抗体フラグメントは、抗原への一または二の結合部位、すなわちＭＳＧ１またはＭＳＡ１または関連する分子の一以上のエピトープを有する任意の欠失したまたは誘導体化された抗体部分を含む。かかる抗体フラグメントの具体例は、Ｆｖ、Ｆａｂ若しくはＦ（ａｂ’）２フラグメントまたはｓｃＦｖ等のような一本鎖フラグメントである。Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等のような二本鎖フラグメントが好ましい。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、原型の抗体に含まれるＦｃフラグメントを持たない。有益な結果として、かかるフラグメントは、完全な抗体種に比較して、循環器系においてより速く運ばれ、より少ない非特異的な組織結合を示す。かかるフラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）もしくはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）等のようなプロテアーゼを用いたタンパク質分解、または化学的酸化によって原型の抗体から産生されてもよい。
【００５４】
好ましくは、抗体フラグメントまたは抗体コンストラクトは、対応する抗体遺伝子の遺伝子操作を経て産生される。組換え抗体コンストラクトは、通常、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖｓ、〜３０ｋＤａの大きさ）を含み、そこにおいてＶＨおよびＶＬドメインはポリペプチドリンカーを介して一緒に連結され、発現およびフォールディング効率が改善される。機能的な親和性（結合活性）を向上させるため、および大きさを増大させてそれにより血液クリアランス率を減少させるため、単量体のｓｃＦｖフラグメントは、接着タンパク質ドメインまたはペプチドリンカーを用いて、二量体、三量体、またはより大きな凝集体を形成することができる。二価のｓｃＦｖ二量体のかかるコンストラクトの一例は、６０ｋＤａのダイアボディであり、各ｓｃＦｖのＶＨ−とＶＬドメイン間の短い、例えば５残基のリンカーは、Ｖ−ドメインの配置が単一のＦｖモジュールとなるのを妨げ、その代わりに二つのｓｃＦｖ分子の会合を生じる。ダイアボディは、２つの機能的な抗原結合部位を有する。リンカーは３残基未満に減らすこともでき、これはダイアボディの形成を阻害し、代わりにｓｃＦｖ３分子が３つの機能的な抗原結合部位で三量体（三重特異性抗体９０ｋＤａ）に会合するように導く。４つのｓｃＦｖの四価の四重特異性抗体への会合も可能である。本発明における使用のためにさらに好ましい抗体コンストラクトは、ｓｃＦｖ−ＣＨ３融合タンパク質の二量体である（８０ｋＤａ；いわゆる“ミニボディ”）。
【００５５】
本発明によると、ここに記載された一以上のアンチセンス核酸、ベクター（特にアンチセンス核酸を発現することができるもの）、および／または抗体は、通常、前記のような活性成分や、薬学的に許容される賦形剤、添加剤および／または担体（例えば可溶化剤も）を含む医薬組成物に含まれる。したがって、本発明は、前記のような活性成分、および少なくとも一の薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または添加剤の組み合わせを開示する。本発明の医薬組成物を処方する対応する方法は、例えば本発明の開示の一部である“Ｒｅｍｉｎｇｓｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９８０）において開示される。非経口投与のための担体の例は、例えば、滅菌水、無菌の塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、および特に生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーである。本発明に従うかかる組成物は、Ｍ． ｓｕｉｓおよび関連する赤血球付着性マイコプラズマ種による感染症の治療のために想定される。さらに、本発明に従う組成物は、ラクトース、マンニトール等のような充てん剤若しくは物質、例えばポリエチレングリコール等のようなポリマーを本発明において開示されるようなポリペプチド、抗体、および誘導体、もしくはそれらのフラグメントに共有結合するための基質、金属イオンと複合体を形成するための基質、またはポリマー化合物の特別な製剤、例えばポリアセテート、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、またはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層若しくは多層のベシクル、赤血球フラグメントまたはスフェロプラスト等の中に材料を封入するための基質を含んでもよい。組成物の具体例は、物理的な挙動、例えば溶解性、安定性、バイオアベイラビリティ、または分解性により選択される。組成物中の本発明の活性基質の制御放出または定常放出は、脂溶性デポーに基づく製剤も含む（例えば脂肪酸、ワックス、またはオイル）。本発明との関連で、かかる基質を含む本発明に従う基質または組成物のコーティング、つまりポリマーでのコーティングも開示される（例えばポリオキサマー、またはポリオキサミン）。さらに、本発明に従う基質または組成物は、プロテアーゼ阻害剤または浸透性増幅剤等の保護用のコーティングを含んでもよい。前記任意の含有物は、本発明のワクチン中に含まれてもよい。
【００５６】
原則として、本発明との関連で、本発明に従う基質または組成物（ワクチン、薬剤）のための、先行技術において知られている全ての投与経路は、開示される。好ましくは、前記Ｍ． ｓｕｉｓまたは関連する種による感染症の治療または予防それぞれのための薬剤またはワクチンの投与は、非経口の、つまり、例えば、皮下、筋肉内、もしくは静脈内、経口、または鼻腔内の投与経路を介して行われる。本発明のポリペプチドを含むワクチンは、通常、皮下に投与される。遺伝子ワクチンの場合、筋肉注射が好ましい投与経路である。通常、本発明に従う医薬組成物およびワクチンは、製剤の型によって固体、液体、またはエアロゾル（例えばスプレー）の形とする。
【００５７】
Ｍ． ｓｕｉｓおよび関連する赤血球付着性マイコプラズマ種（例えばＭ． ｗｅｎｙｏｎｉｉ、Ｍ． ｈａｅｍｏｆｅｉｌｓおよびＭ． ｈａｅｍｏｃａｎｉｓ）による感染症の治療およびそれに対する予防接種のスケジュールは、治療される個人、感染症の重症度、および分子の型次第である。本発明の通常の医薬／ワクチン組成物は、有効成分を１から１０００μｇ含む。本発明のワクチンは、複数回患者に投与され（上記のような経路を介して）、免疫される。通常、本発明のワクチンは、例えば１：１０から１０：１まで、好ましくは１：２から２：１まで、とりわけ１：１の一以上のアジュバントとの混合物として、一次免疫において投与され、一次免疫は通常一週間以上隔てた一以上のさらなる投与により追加免疫することができる。適したスケジュールは、０、１４、２１、および／または２８日目における投与である。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、感染した個体における病原体が少なくとも実質的に減少、好ましくは根絶するのに有効な期間にわたって、毎日一回以上投与されてもよい。
【００５９】
したがって、本発明の上記実施態様、つまりポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド、および／または抗体は、Ｍ． ｓｕｉｓによる感染症の治療および／または予防に有用である。
【００６０】
本発明のさらなる実施態様は、上記のようにポリペプチドの製造に関連し、
（ａ）本発明の宿主細胞および適した培養液を、ポリペプチドを発現させることができる条件下で培養する工程；および
（ｂ）培養液および／または宿主細胞からポリペプチドを回収する工程
を含む。
【００６１】
好ましくは、工程（ａ）に従って培養される宿主細胞は、適した宿主を形質転換することによって、例えば大腸菌等のような適した細菌のエレクトロポレーション、または化学的なトランスフェクションによって、生産される。
【００６２】
本発明に従うポリペプチドの製造方法の工程（ｂ）は、通常、便利なタンパク質精製工程を含む。特に、宿主細胞は普通、遠心分離により回収され（または所望の発現産物を含んでいる培養液から除去され）、凍結／解凍サイクル、ソニケーション、および／または高圧力の適用により破壊されてもよい。細胞溶解液（ポリペプチドが細胞から回収される場合）は、ろ過され、および／または遠心分離されてもよい。ポリペプチドを含んでいる細胞溶解液または培養液は、トリス、リン酸バッファー等を主原料としうる適した精製バッファーに対して透析されてもよい。さらなる精製工程は、分画された塩化アンモニウム沈殿を含んでもよい。さらなる精製方法は、例えばデキストラン（例えばセファデックス）、アガロース（例えばセファロース）、ポリアクリルアミド（例えばセファクリル）、またはセルロースを主原料とした適した樹脂を用いた交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、および／またはアフィニティクロマトグラフィーによるクロマトグラフィー分画工程を含む。特に、興味あるポリペプチドが適したタグ、例えばヒスチジンタグをつけられた場合、通常の精製スキームは、アフィニティクロマトグラフィー、特にキレート基を介して適した樹脂に連結したＮｉ２＋またはＺｎ２＋イオンを用いた金属キレートクロマトグラフィーを含む。すべてのクロマトグラフィーの工程は、ＦＰＬＣまたはＨＰＬＣ装置に適応されうる。一般に、当業者は、使用される発現系の源によって、および、興味あるタンパク質の性質（特にアミノ酸配列）によって、容易に精製スキームを立ち上げて実行することができる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ， １９９３； Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（ｅｄ．）， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． １８２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ， １９９０参照）。
【００６３】
本発明の実施態様に基づいて、かかる感染顆粒により引き起こされると考えられる病気の全ての病期における、ウシにおけるＭ． ｗｅｎｙｏｎｉｉ、ネコにおけるＭ． ｈｅｍｏｆｅｌｉｓ、イヌにおけるＭ． ｈａｅｍｏｃａｎｉｓ、および特にブタにおけるＭ． ｓｕｉｓなどのような赤血球付着性マイコプラズマ種による感染症の検出方法、特にＥＬＩＳＡ、免疫ブロット等の診断アッセイを確立することができる。特に、かかる検出方法は、キャリア動物を検出するのに有用である。例えば、血清は、血清有病率の研究および群れの診断のそれぞれを実行するために、臨床的に疑われる動物（血清同等者）から、またはブタの群れのような動物の群れの中の代表する数の動物から採取してもよい。血清は、例えば、溶液希釈の後、既知のポジティブおよびネガティブコントロール血清と比較して、本発明のポリペプチドに対する反応性が調査される。
【００６４】
感染症が検出により示され、感染したキャリア動物から除去されうるので、本発明の診断アッセイは、有用なＰＥの制御手段を提供する。
【００６５】
したがって、一般に、本発明は、前記の通り前記実施態様の検出手段、つまりポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチドおよび／または抗体とともに用いられる、ポリヌクレオチドおよび／またはアンチセンス核酸および／またはポリペプチドおよび／または抗体を含む診断キットに関連する。
【００６６】
上記分子の“検出手段”は、通常、直接または間接にポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチド、および／または抗体を用いて取り付けられうる分子マーカーである。かかるマーカーまたはラベルは、例えば特徴的な光吸収、発光（特に蛍光）、放射活性等のような直接または間接に測定することができるシグナルを提供する多様な適した化合物または化学基から選択されうる。具体例は、放射活性マーカー、蛍光マーカー、色素、およびビオチン／ストレプトアビジン等のような特定の結合ペアの要素である。
【００６７】
好ましくは、ポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチド、および／または抗体は、メンブレン（例えば、核酸分子のためのニトロセルロース、またはペプチド若しくはポリペプチドのためのＰＶＤＦ）、樹脂、マイクロビーズ、培養皿、マイクロタイタープレートのウェル、マイクロアレイ等のような固定担体に結合される。
【００６８】
本発明の診断キットのさらなる実施態様は、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示される配列、好ましくは１３９７から２４０７までのヌクレオチド配列、または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される配列、好ましくは１７９２から３６２１までのヌクレオチド配列、またはプライマーペアが関連する配列とうまくハイブリダイズできるように一定の相同性を有する関連する配列、特にＭ． ｓｕｉｓ以外の赤血球付着性マイコプラズマ種に由来する配列の部分、フラグメント、または領域を増幅するためのプライマーペアを含む。好ましい実施態様によると、本発明の診断キットは少なくとも一のオリゴヌクレオチドペアを含むものであって、一のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示される配列、好ましくは１３９７から２４０７までのヌクレオチド配列、または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される配列、好ましくは１７９２から３６２１までのヌクレオチド配列に相補的な、少なくとも９、好ましくは１２、より好ましくは１５ヌクレオチドの配列を含み、他のオリゴヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチド）はそれぞれ図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に示される配列、好ましくは１３９７から２４０７までのヌクレオチド配列、または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に示される配列、好ましくは１７９２から３６２１までのヌクレオチド配列の少なくとも９、好ましくは１２、より好ましくは１５ヌクレオチドの配列を含むものであって、センスオリゴヌクレオチドの配列における最も３’側のヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列における最も３’側のヌクレオチドから上流に少なくとも２０、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドである。
【００６９】
本発明にしたがう診断キットの構成要素は、Ｍ． ｓｕｉｓおよび関連する種の検出のため、特に、感染しやすい動物、例えばブタ、ウシ、ネコ、イヌ、ウマ、およびヒトにおける対応する感染症の検出においてうまく用いられうる。
【００７０】
本発明の好ましい実施態様によると、Ｍ． ｓｕｉｓおよび関連する種を検出する方法は、
（ａ）Ｍ． ｓｕｉｓ（または関連する種）を含んでいると思われる試料、またはそれらに由来する材料を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）の試料を、ここに開示された好ましい実施態様、すなわち上記のようなポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチド、および／または抗体の少なくとも一と、前記ポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチド、および／または抗体が試料／それらに由来する材料中に存在する成分と結合できる条件下で接触させる工程；
（ｃ）非結合性ポリヌクレオチド、抗体、および／またはアンチセンス核酸を除去するために一回以上洗浄する工程；および
（ｄ）工程（ｂ）において結合した前記ポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、および／または抗体の存在を検出する工程
を含む。
【００７１】
上記のＭ． ｓｕｉｓなどの赤血球付着性マイコプラズマ種の検出方法は、感染顆粒／特定の成分の検出のために使用される特定の分子次第で、異なる形式に適用することができる。
【００７２】
したがって、本発明のポリヌクレオチドおよびアンチセンス核酸の使用は、通常、テストする試料中に存在する相補的な配列（少なくとも一部は相補的な配列）とのハイブリダイゼーションに依存する。したがって、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはアンチセンス核酸が用いられる場合、本検出方法は通常、サザンブロットまたはノーザンブロットの形をとる。かかるブロッティング技術の詳しい実験装置は、当業者によく知られている；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， 上記参照。
【００７３】
本発明に従うポリペプチドは、通常感染した個体中でＭ． ｓｕｉｓ または関連する種に対して作られる、試料中に存在する免疫グロブリン、特に抗体により認識される。言い換えると、本発明の抗体は、抗体が特異的である抗原決定基（エピトープ）を認識することにより試料中で成分に結合する。
【００７４】
ここに開示されたように、本発明に従うポリペプチドまたは抗体がＭ． ｓｕｉｓ（または関連する種）に由来する成分の検出のために使用される場合、上記検出方法はウエスタンブロット実験の形をとるが、通常、酵素免疫アッセイ、特に酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）として設計される。実験装置および試薬（二次抗体、カップリングの化学反応等）は、当業者に知られている（例えば、Ａｎａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ． １， １３４−１４４（１９９３）、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、またはＣｒｏｗｔｈｅｒ， Ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ４９， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＹ， ＵＳＡ（２０００））。もちろん、上記に該当する他の検出方法を想定することもできる。酵素免疫アッセイ以外の具体例は、ラジオイムノアッセイ型のアッセイである。適した技術は、例えばＬｅｆｋｏｖｉｔｚ（Ｅｄ．）， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ， Ｖｏｌ． １−４， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７、およびＣｈａｒｄ， Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ １９９５に開示される。
【００７５】
検出方法のために使用される試料は、Ｍ． ｓｕｉｓまたは関連する種を含む可能性がある検査サンプルまたは試料であってもよい。好ましい試料は、問題の病原体の少なくとも一による感染が疑われる個体（動物、ヒト）に由来する。試料は、Ｍ． ｓｕｉｓまたは関連する種による感染が疑われる個体に由来する任意の組織（例えば脾臓）または体液でもよい。好ましい体液は、血液および血液産物、特に血清、リンパ液、脳脊髄液、滑液などである。
【００７６】
赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓの検出方法または対応する診断方法のさらに好ましい実施態様は、ここに開示したように、少なくとも一の対応するプライマーペアを用いた、配列をコードする赤血球付着性マイコプラズマ特異的抗原の増幅に依存する。
【００７７】
したがって、本発明は対応する検出方法または診断方法に関連するものであって、該方法は
（ａ）Ｍ． ｓｕｉｓ（または関連する種）を含んでいると思われる試料、またはそれらに由来する材料を得る工程（詳細例はすでに前述）；
（ｂ）図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）若しくは５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に開示された配列、または関連する配列に特異的な、少なくとも一のプライマーペアを提供する工程；
（ｃ）テンプレートとして工程（ａ）における試料を使用し、工程（ｂ）に従うプライマーペアを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を行う工程；および
（ｄ）工程（ｃ）において生産された増幅産物を解析する工程
を含む。
【００７８】
好ましくは、上記方法のプライマーペアは、上記診断キットの記載に従って規定される。すなわち、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に開示される配列の少なくとも一部、好ましくはその１３９７から２４０７までのヌクレオチド配列、または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）に開示される配列の一部、好ましくは１７９２から３６２１までのヌクレオチド配列、または関連する配列のＰＣＲ増幅のためのプライマーとして働くことができるオリゴヌクレオチドペアである。もちろん、ここに開示されたような配列または関連する配列に基づいて、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法を確立することも可能である。当業者に知られているように、ＲＴ−ＰＣＲ法は、配列特異的プライマーを一つだけ使用してもよく、一方で他のプライマーは、ランダムヘキサプライマーやオリゴｄＴプライマー等のような非特異的なプライマーから選択されてもよい。対応するＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲキット、ならびに他の製品は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ ＵＳＡ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）等のようなさまざまな製造業者から市販される。ＰＣＲ法は、当業者に知られており、特有の実験装置は、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．）， ＰＣＲ２， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９５； Ｒｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９４； Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ２６， ３０１−３３４（１９９１）等のような、さまざまな実践的および理論的な参考文献から導き出すことができる。
【００７９】
Ｍ． ｓｕｉｓおよび関連する種の検出、またはかかる細菌による感染症の診断のための増幅方法の特に好ましい実施態様は、ＰＣＲの方法論により提供され、その方法論は増幅が完了した後（終点決定）、または増幅サイクル中に同時に（リアルタイムＰＣＲ）、作り出されたＰＣＲ産物を定量化することができるものである。リアルタイムＰＣＲ増幅のプロトコルは、検査試料中に存在する元のテンプレートの量を定量化することができる。リアルタイムＰＣＲ法の概論および特有の実験装置は、例えばhttp://dorakmt.tripot.com/genetics/realtime.htmlおよびこのＵＲＬで引用される参考文献； Ｆｅｎｏｌｌａｒ ａｎｄ Ｒａｏｕｌｔ， ２００４ ＡＰＭＩＳ １１２： ７８５−８０７に、概説される。したがって、本発明に基づいて、リアルタイムＰＣＲアッセイを利用することができ、そのアッセイはＭ． ｓｕｉｓまたは他の赤血球付着性マイコプラズマ種による感染症が疑われる個体に由来する血液、および器官の検査サンプル中のＭ． ｓｕｉｓまたは関連する種の定量的な検出に適している。ここに開示される赤血球付着性マイコプラズマ種に特異的な特有のコード配列に由来するプライマーターゲットを使用して、本発明のＰＣＲアッセイは、リボソームのターゲット配列に基づくアッセイに比較して、優れた特異性を提供するという利点がある。さらに、ＰＣＲ，特にリアルタイムＰＣＲ技術の標準化および自動化の容易性、ならびにかかる分析装置における混入の効果的な防止は、ありふれた検査室において相対的な条件下での本発明のアッセイの使用を可能とする。したがって、異なる国の異なる検査室において得られた結果の有益な比較を利用することができる。
【００８０】
本発明に従うベクターおよびポリペプチドは、Ｍ． ｓｕｉｓまたは関連する種による感染症に対する予防接種に特に有用である。したがって、本発明は、本発明のベクターおよび／または本発明のポリペプチドを含むワクチンにも関連する。
【００８１】
本発明に従う少なくとも一のポリペプチドを含むワクチンは、したがって、図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）および／または図５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）において開示される配列により規定されるタンパク質の少なくとも一の抗原決定基を含む。本発明に従うワクチンは、図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）および／または図５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されるアミノ酸配列に由来する複数の配列フラグメントを含むポリタンパク質を含んでもよい。好ましくは、本発明に従うワクチンは、一以上のアジュバントおよび／または他の免疫刺激剤を含む。適したワクチン、特にフロイントの不完全なまたは完全なアジュバントは、前述されている。
【００８２】
本発明に従うワクチンのさらなる実施態様は、遺伝子ワクチンによって代表される。本発明に従う遺伝子ワクチンは、例えばＲＮＡまたはＤＮＡに基づくベクターにより代表される、本発明に従うポリペプチドの発現によく適合する、前記のようなベクターを含む。したがって、本発明の遺伝子ワクチンは、好ましくは図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）および５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示される配列の一方または両方に含まれる一以上の抗原決定基の発現に適したベクターを含む。もちろん、本発明に従う遺伝子ワクチン中に含まれるベクターは、ここに開示された配列に含まれる複数のエピトープをコードするポリジーンを含んでもよい。適した遺伝子ワクチンは、例えばＩｖｏｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２， １７に概説されるよく知られた原理に従って設計してもよい。したがって、本発明の遺伝子ワクチンの使用によるＴ細胞の誘導は、感染した個体、特にブタ、ウシ、ネコ、およびイヌ等のような動物から、病原体（Ｍ． ｓｕｉｓまたは関連する種）を除去するための戦略を提供する。
【００８３】
本発明のさらなる実施態様は、したがって、Ｍ． ｓｕｉｓまたは関連する種による感染症の予防方法に関連し、その方法は、本発明のワクチンの有効量を、上記のように、対応する病原体による感染症が疑われる動物に投与することを含む。
【００８４】
前述したように、本発明の実施態様は、Ｍ． ｓｕｉｓおよび関連する病原体による感染症の治療に有用である。したがって、本発明に従う医薬組成物は、本発明に従う治療効果のある量のアンチセンス核酸、および／またはベクター、および／または抗体を、少なくとも一の薬学的に受け入れられる担体、賦形剤、および／または添加剤と一緒に含む。
【００８５】
したがって、本発明の医薬組成物中のアンチセンス核酸は、ここに記載されたポリペプチドの発現を阻害し、それゆえに病原体を除去、または少なくとも制御する。さらに、ここに記載したようなアンチセンス核酸を発現することができるベクターは、一般に同じ方法で機能する。本発明に従う抗体は、抗体の投与後、病原体が顕著に減少または除去までされるように、Ｍ． ｓｕｉｓおよび関連する種に由来する免疫優性のポリペプチドに結合することができる。
【００８６】
図１は、１０％ラエムリゲルの一次元ウェスタンブロットの写真を示し、これは、感染したブタの全血から得たＭ． ｓｕｉｓ抽出物中に存在する、８つのＭ． ｓｕｉｓ特異的抗原の検出を説明する。パネル（Ａ）は、Ｍ． ｓｕｉｓ陽性ブタから得た血清とインキュベートされたブロットを示す。Ｍ． ｓｕｉｓ陽性血清と特異的に反応しているバンドは、それぞれ分子量により表示される。免疫優性タンパク質（ｐ４０，ｐ４５およびｐ７０）は、アスタリスクでマークされている。Ｍ． ｓｕｉｓ陰性血清および抗ブタＩｇ複合体によっても検出された非特異的なバンドは、長方形でマークされている（パネル（Ｂ）および（Ｃ）参照、それぞれ：ｐ２６、ｐ５６、およびｐ７７）。パネル（Ｂ）は、Ｍ． ｓｕｉｓ陰性血清とインキュベートされた後の対応する対照ブロットを示し、パネル（Ｃ）は、抗ブタＩｇ複合体とインキュベートされた後の対照ブロットを示す。各ブロットにおけるレーンは左から右に：左のレーン：分子量マーカー；中央のレーン：感染したブタの全血から得たＭ． ｓｕｉｓ抽出物；右のレーン：感染していないブタ由来の全血抽出物である。
【００８７】
図２は、（Ａ）感染したブタの全血から得たＭ． ｓｕｉｓ抽出物の、（Ｂ）健康な対照動物から得た全血の、三通りの二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（分画電気泳動／ラエムリ）の写真を示す。
【００８８】
図３は、感染したブタの血清中の免疫優性Ｍ． ｓｕｉｓポリペプチドの同定を明示する、二次元ウエスタンブロットの写真を示す。パネル（Ａ）は、実験的に感染させたブタの全血から得られたＭ． ｓｕｉｓ抽出物の、クマジー染色した２次元ＰＶＤＦブロットを示す。パネル（Ｂ）は、Ｍ． ｓｕｉｓに感染したブタ由来の血清とインキュベートした後の、同じ２次元ブロットを示す。パネル（Ｃ）は、健康な対照動物から得た血清とインキュベートされた対照ブロットを示す。パネル（Ｄ）は、二次（抗ブタ）抗体のみとインキュベートされた対照ブロットを示す。Ｍ． ｓｕｉｓ陽性血清と反応する点は、文字でマークされている。点ａ、ｅ、ｆ、ｇ、およびｋは、（Ｃ）も同様にＭ． ｓｕｉｓ陰性血清によって認識されたので、Ｍ． ｓｕｉｓ特異的ではなかった。一見Ｍ． ｓｕｉｓ陽性血清によって認識されているが、正しく指定することができなかった点を、（Ｂ）において疑問符で示す。
【００８９】
図４（Ａ）は、遺伝子ｍｓｇ１の部分的なヌクレオチド配列を示す。このゲノムフラグメントは、Ｍ． ｓｕｉｓの免疫優性タンパク質（分子量、約４０ｋＤａ）をコードする１３９７から２４０７ヌクレオチドまでの翻訳領域（ＯＲＦ）を含む。開始コドンおよび終止コドンは、太字でマークされている。（Ｂ）は、（Ａ）に由来するタンパク質（ＭＳＧ１）の推定アミノ酸配列を示す。
【００９０】
図５（Ａ）は、Ｍ． ｓｕｉｓのさらなる免疫優性タンパク質（分子量、約７０ｋＤａ）をコードする１７９２から３６２７ヌクレオチドまでのＯＲＦを含む、遺伝子ｍｓａ１の部分的なヌクレオチド配列を示す。開始コドンおよび終止コドンは、太字でマークされている。（Ｂ）は、（Ａ）に由来するタンパク質（ＭＳＡ１）の推定アミノ酸配列を示す。
【００９１】
本発明は、以下の限定しない実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【００９２】
Ｍ． ｓｕｉｓ特異的な抗原の同定
【００９３】
マイコプラズマスイス抗原の調製
Ｍ． ｓｕｉｓ感染性の全血は、実験的に感染させた血液ドナー動物から、臨床的に急性のＰＥの菌血症が最大の時に得た。２００ｍｌの末梢全血は、２００ｍｌのアルセバー溶液中に１：１の比で採取された。Ｍ． ｓｕｉｓ細胞は、すでに記載されている通りに精製された（Ｈｏｅｌｚｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｖｅｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９３： １８５−１９６）。Ｍ． ｓｕｉｓ細胞を宿主細胞成分からさらに精製するために、結果として生じたＭ． ｓｕｉｓペレットは、無菌のＰＢＳ中に再懸濁され、２０％ジアトロゾートメグルミンナトリウムおよびジアトロゾートナトリウム（Ｕｒｏｇｒａｆｉｎ ７６％、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を通した２５０００ｘ ｇで１時間４℃の遠心によって、宿主細胞成分からさらに精製された（Ａｌｌｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３７： １４７４−１４７９）。最終ペレットは１．０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁され、使用するまで−８０℃で保存された（Ｍ． ｓｕｉｓ、（Ｍｓ）抗原）。ネガティブコントロール抗原は、前記のようにＭ． ｓｕｉｓがないことが確認された３頭の感染していない動物の抗凝固血液から、同様の方法で調製された。
【００９４】
一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット解析
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、標準的な手順に従って行われた（Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０） Ｎａｔｕｒｅ ２２７： ６８０−６８５）。つまり、分子量マーカーおよびネガティブコントロール抗原は、６２．５ｍＭ トリス（ｐＨ６．８）、２．０％（ｗｔ／ｖｏｌ） ドデシル硫酸ナトリウム、２５．０％ グリセロール、５．０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ） β−メルカプトエタノール、および０．００１２５％ ブロモフェノルブルーを含んでいる試料バッファー中で１０分間煮沸された。抗原は１０．０％ ポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ， Ｒｅｉｎａｃｈ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ， Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ ＩＩＩ；アクリルアミド／ビスアクリルアミドの比、３７．５：１）上で、トラックあたり８．０μｇのタンパク質ローディング濃度で分離された。電気泳動は、２００ｖの定常電圧下で、色素の最前部がゲルの下部に到達するまで（〜４０分）行われた。分離されたタンパク質は、ニトロセルロースのメンブレン（細孔の大きさ４５μｍ； ＢＡ８５、 Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｒｉｅｃｈｅｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に、セミドライ電気泳動トランスファーセル（Ｔｒａｎｓ Ｂｌｏｔ， ＢｉｏＲａｄ）、トランスファーバッファー（２５．０ｍＭ トリス、０．２Ｍ グリシン、２０．０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ） メタノール）、および３０分間の１０Ｖの定常電圧を用いて転写された。メンブレンはトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ、０．０１Ｍトリス、０．１５Ｍ食塩、ｐＨ８．５）３．０％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳液で、１時間ブロッキングされた。その後、メンブレンは３７℃にて２時間、ブロッキング溶液中に１：１００で希釈された実験用子豚由来の血清存在下でインキュベートされた。スロットブロット装置（マルチスクリーン装置、ＢｉｏＲａｄ）を適用して、８頭の実験的に感染させたブタの連続した血清試料が解析された。
【００９５】
メンブレンを、ＴＢＳで１０分間、２回洗浄した。西洋わさびペルオキシダーゼでラベルされたヤギ抗ブタＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ鎖特異的、Ｓｉｇｍａ）、ヤギ抗ブタＩｇＧ（γ鎖特異的、ＫＰＬ−Ｂｉｏｒｅｂａ、Ｒｅｉｎａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、およびヤギ抗ブタＩｇＭ（μ鎖特異的、ＫＰＬ）を、それぞれ二次抗体として用いた。全ての二次抗体は１：２０００でブロッキング溶液に希釈された。ブロットは、Ｈ２Ｏ２および４−クロロ−１−ナフトールを発色試薬（ＢｉｏＲａｄ）として用いて、発色させた。酵素反応は、蒸留水中でブロットを洗浄することにより止められた。タンパク質のバンドは、コンピューターを利用したバイオイメージシステム（ＢｉｏＰｒｏｆｉｌ ３．１、ＬＴＦ、Ｗａｓｓｅｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、分子量マーカーレーン（着色分子量サイズスタンダード、６．５から１７５ｋＤａまで、Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を参照することにより大きさが決められた。
【００９６】
結果
実験的に感染させた動物由来の血清を用いた１次元ウエスタンブロッティングは、３つの主要な結果を明らかとした：
ｉ）Ｍ． ｓｕｉｓ特異的抗原に対するＩｇＧ免疫反応は、感染中に見られる、
ｉｉ）少なくとも８のつのＭ． ｓｕｉｓ特異的抗原（ラエムリにしたがった１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように、３３ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５７ｋＤａ、６１ｋＤａ、７０ｋＤａ、７３ｋＤａ、および８３ｋＤａ）がある（図１Ａ）、および
ｉｉｉ）免疫グロブリン（ＩｇＧおよびＩｇＭ）は、ブタの血液由来のＭ． ｓｕｉｓと同時精製される（図１Ｂ、１Ｃ）。
【００９７】
Ｍ． ｓｕｉｓ抗原調製物の構成成分として同時精製された免疫グロブリンの存在は、同時精製されたタンパク質が、一次抗体により検出されたタンパク質と二次抗体により検出されたタンパク質を区別することができないＥＬＩＳＡ等のような間接的な血清学アッセイを困難なものとするので、Ｍ．ｓｕｉｓに特異的な血清学の検査が今のところ利用できないということを明らかにした。
【００９８】
免疫グロブリンを除去することによるＭ． ｓｕｉｓ抗原のさらなる精製は、免疫ブロットやＥＬＩＳＡによる免疫反応動力学の詳しい研究を可能とした。
【００９９】
３つのＭ． ｓｕｉｓ特異的なタンパク質は、免疫優性である（４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、７０ｋＤａ；図１Ａ参照）。全てのＭ． ｓｕｉｓに感染した動物は、３つの免疫優性タンパク質の少なくとも１つと、遅くとも感染の２週間目の間および実験の終了まで（１８週間）、血清反応性を示した。したがって、これらの３つのＭ． ｓｕｉｓ抗原は、特に血清診断および予防接種に有用である。
【０１００】
先行研究に反して、Ｍ． ｓｕｉｓ特異的な体液性免疫反応が波状の経過を示さず、バクテリアに対する古典的な免疫反応の速度論、つまり抗体の最初の存在は感染の約８−１０日後、最初の臨床症状より前に、およびＭ． ｓｕｉｓ特異的な抗体の何ヶ月もの持続に基本的に従うということが明らかになった。
【０１０１】
２次元ウェスタンブロッティング／ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるＭ． ｓｕｉｓ特異的な抗原の部分的な特徴づけ
【０１０２】
免疫反応性Ｍ． ｓｕｉｓタンパク質の性質および遺伝学をさらに同定するために、患者の血清プールを用いて、２次元免疫ブロッティングを行った（免疫プロテオミクス）。免疫反応性タンパク質の点は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いたペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）によってさらに解析された。
【０１０３】
２次元ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング
抗原試料（７５０μ Ｍ． ｓｕｉｓ抗原およびネガティブコントロール抗原それぞれ）は、スピンカラム（Ｖｉｖａｓｐｉｎ、１０ｋＤａ ＶＳ０１０１）を４０００ｘｇ１０℃で用いて、最終体積２００μｌに濃縮された。その後、試料は５００μｌの溶解バッファー（７Ｍ 尿素、２Ｍ チオ尿素、４％ ＣＨＡＰＳ、２％ ＤＴＴ、１％［ｖ／ｖ］ ファルマライト ｐＨ３−１０）で希釈された。２０℃で３０分間振とうした後、試料は１６０００ｘｇ２０℃で５分間遠心された。透明な上清の一定分量のタンパク質含有量は、ブラッドフォード法（ｘ−テスト、ＢｉｏＲａｄ）により決定され、試料は解析まで一定分量で−８０℃にて保存された。二次元ゲルには、全タンパク質の３００μｇがロードされた。最初の次元（等電点電気泳動）において、タンパク質は、ｐＨ３から１０にわたるｐＨ勾配を持った１８ｃｍのＩＰＧ（固定されたｐＨ勾配）条片中に分離された（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍｕｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。各試料の５つのゲルは、同一の実行条件で行われた（３０ｋＶｈ／ＩＰＧ条片）。定常状態に着目した後、Ｇｏｒｇ ｅｔ ａｌ（２０００） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１： １０３７−５３に従って、条片はＳＤＳでロードされ、ＤＴＴおよびロダセタミド中で平衡化された。二番目の次元において、ラエムリバッファー系が使用された（Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０） Ｎａｔｕｒｅ ２２７， ６８９）。タンパク質は、Ｈｏｅｆｅｒ ＩＳＯ − Ｓａｌｔチャンバー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で１０個のゲルで平行して垂直に流される標準的な連続した１２％ＳＤＳゲルで、分離された。一般に、１８００Ｖｈから２０００Ｖｈの間が適用される。ブロモフェノールブルーの最前部がゲルから消えたとき、ＳＤＳ ＰＡＧＥを停止した。
【０１０４】
電気泳動後、ゲルはガラス板から取り外され、製造業者のプロトコールに従ってＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（Ｒｏｔｈ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色された。ウエスタンブロッティングのために、セミドライブロッティング装置（Ｈｏｅｆｅｒ、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、染色されていない二次元ゲルをＰＶＤＦメンブレンで挟んで使用された。トランスファーバッファーは５０ｍＭ トリス、５０ｍＭ ホウ酸、および１０％メタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含み；１．５ｍＡ／ｃｍ２が３時間適用された。
【０１０５】
クマジー染色した２次元ゲルは、ペプチドマスフィンガープリントによるタンパク質の同定のために使用され、クマジー染色されたＰＶＤＦブロットは免疫学的染色のために使用された。さらに、クマジー染色されたマイクロ調製ゲルは、少量の点の同定のために、ゲルあたり５００μｇのタンパク質がロードされて行われた。
【０１０６】
ネガティブコントロール抗原と比較するＭ． ｓｕｉｓ抗原の２次元電気泳動の解析は、Ｐｒｏｔｅｏｍ Ｗｅａｖｅｒソフトウェアを用いて行われた（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ、ＰｒｏｔｅｏｍＷｅａｖｅｒ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１．１）。
【０１０７】
タンパク質の同定
タンパク質の点は、ペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析により同定された。点はクマジー染色された調製されたゲルから切り出され、１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、３０％ アセトニトリル（ＡＣＮ）を用いた３回の洗浄により脱色された。５μｌのトリプシンバッファー（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３に溶解された２５ｎｇ／μｌ トリプシン（Ｒｏｃｈｅ）、ｐＨ８）中、３７℃で一晩分解された後、試料は２５℃で２０分間、ソニケーションバス中に置かれた。上清が取り除かれ、スピードバック濃縮機を用いて濃縮された。脱塩のため、濃縮された溶液はＣ１８逆相ＺｉｐＴｉｐカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して処理され、０．１％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と８０％ ＡＣＮを用いて溶出された。溶出されたペプチドは、ターゲット上に置かれ、ジヒドロキシ安息香酸（１μｌ）を用いて共結晶化される。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＳＴＲ）は、リフレクターモードで７００から４０００ダルトンのペプチド範囲において実行された。得られたスペクトルは、ＮＣＢＩのデータベースに一致し、ＰｒｏＦｏｕｎｄソフトウェア（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖ． ２００３）を用いて対応するタンパク質が同定された。
【０１０８】
結果
前記Ｍ． ｓｕｉｓ抗原の６つのデータが得られ、それを表１に示す（図２も参照）。
【０１０９】
【表１】
【０１１０】
免疫優性Ｍ． ｓｕｉｓ特異的抗原のクローニング
【０１１１】
実験的に感染させたブタを使用して、Ｍ． ｓｕｉｓのゲノムライブラリーが構築された。ハイブリダイゼーションとショットガン配列決定法によるライブラリーのスクリーニングは、２つの免疫優性抗原（ＭＳＧ１、４０ｋＤａ； ＭＳＡ１、７０ｋＤａ）をコードする全長ヌクレオチド配列を明らかにした。クローンｍｓｇ１のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）は図４Ａに示され、それは１３９７ヌクレオチドから２４０７ヌクレオチドまでのＯＲＦを含む。タンパク質ＭＳＧ１の推定アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）は、図４Ｂに示される。クローンｍｓａ１のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）は、図５Ａに示され、それは１７９２ヌクレオチドから３２６１ヌクレオチドまでのＯＲＦを含む。タンパク質ＭＳＡ１の推定アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）は、図５Ｂに示される。
【０１１２】
２つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、これらの遺伝子において発見されたコドン使用によってエペリスロゾーンスイスをマイコプラズマ属へ再分類することが正当であるとする理由を提供する（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：１５−１８、Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：１０−１４参照）。
【０１１３】
免疫優性Ｍ． ｓｕｉｓ特異的抗原の組換え発現
【０１１４】
２つの免疫優性抗原ＭＳＧ１およびＭＳＡ１は、大腸菌中に、合成遺伝子工学によりマイコプラズマのコドン使用を大腸菌のそれに変更した後、組み換えて発現された。
【０１１５】
組換え発現のために、合成遺伝子ｍｓｇ１およびｍｓａ１のコード配列はｐＢＡＤＭｙｃＨｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の中に連結された。連結混合物を使用して、プラスミドＤＮＡの単離のためにコンピテント大腸菌系統ＴＯＰ１０に、タンパク質発現のためにコンピテント大腸菌系統ＬＭＧ１９４に形質転換された。形質転換体は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）アガープレートから選択された。導入されたフラグメントの正しい位置およびヌクレオチド含有量は、配列決定により検査された。発現条件は、各プラスミドコンストラクトに最適化された。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２００ｍｌのＲＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、大腸菌ＬＭＧ１９４形質転換体の単一のコロニーに由来する２ｍｌの新鮮な一晩培養したものを植菌され、約１０８細胞／ｍｌに相当する６００ｎｍにおいて０．６の吸光度（ＯＤ）となるまで３７℃で培養された。０．２％ アラビノースはＭＳＧ１およびＭＳＡ１の発現を誘導するために加えられ、培養物はさらに１−４時間インキュベートされた。バクテリアは遠心（５０００ｘｇ、１５分）により回収され、タンパク質精製が行われた。
【０１１６】
大腸菌形質転換体の細胞質タンパク質凝集体からのＭＳＧ１およびＭＳＡ１の精製は、Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行われた。バクテリアのペレットは、２０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁され、細胞は氷上でのウルトラソニケーション（３５Ｗ、３ｘ１０秒）により溶解された。不溶物は遠心（２８０００ｘｇ、３０分）により除去された。上清を１ｍｌのＮｉ２＋−ＮＴＡアガロースと混合した。チューブは、Ｈｉｓタグタンパク質が最大に結合できるように、穏やかに攪拌されながらインキュベートされた（１２０分、３７℃）。遠心（３０００ｘｇ、１０分）後、タンパク質を積んでいるＮｉ２＋−ＮＴＡアガロースは、１０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳで２回洗浄され（３０００ｘｇ、１０分）、その後ＭＳＧ１およびＭＳＡ１は、４００ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ０．５ｍｌで３回溶出された。精製されたタンパク質は−７０℃にて保存された。
【０１１７】
組換えＭ． ｓｕｉｓ特異的抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン免疫ブロッティング
【０１１８】
組換えタンパク質の免疫原性は、免疫したウサギおよびブタにより試験された。血清学的アッセイにおける組換えタンパク質の抗原としての有用性は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングにより確認できた。
【０１１９】
５００ｎｇの量の精製されたＭＳＧ１およびＭＳＡ１ならびにネガティブコントロール（大腸菌ＬＭＧ１９４）から得たタンパク質は、５ｘ試料バッファー[６２．５ｍＭ トリス ｐＨ６．８、１０％（ｖ／ｖ） グリセロール、５％（ｖ／ｖ） ２−メルカプトエタノール、２．０％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．００１％ブロモフェノルブルー]中で１０分間煮沸された後、ラエムリバッファーシステム（Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０） Ｎａｔｕｒｅ ２２７： ６８０−６８５）を用いて、２００Ｖの定常電圧にて、２．４％ポリアクリルアミドスタッキングゲルおよび１０％ポリアクリルアミド分離ゲルに通して電気泳動された。ゲルは、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｅｉｎａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、硝酸銀で染色された。免疫ブロッティングのために、タンパク質は、２５ｍＭ トリス、１９２ｍＭ グリシン、２０％（ｖ／ｖ） メタノール中で、電気泳動的に０．４５μ細孔サイズのニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｒｉｅｃｈｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にトランスファーされた。メンブレンは室温で６０分間、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｗｔ／ｖｏｌ）を含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ； １０ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中でブロッキングされた。メンブレンは３７℃で２時間、ブタ免疫血清またはウサギ免疫血清（ＴＢＳ ３％ ＢＳＡに１：２５０で希釈）とインキュベートされた。免疫前の血清、および挿入のないｐＢＡＤＭｙｃＨｉｓプラスミドを含んでいる大腸菌ＬＭＧ１９４形質転換体に対して生じた抗血清が、コントロールとして使用された。メンブレンはＴＢＳで１０分間、２回洗浄された。西洋わさびペルオキシダーゼでラベルされたウサギ抗ブタまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、ＴＢＳ ３％ ＢＳＡに１：１０００で希釈）が、二次抗体として使用された。抗原抗体反応は、Ｈ２Ｏ２および４−クロロ−１−ナフトールを発色試薬（ＢｉｏＲａｄ）として用いて視覚化された。酵素反応は、蒸留水中でブロットを洗浄することにより終了した。
【０１２０】
組換えＭ． ｓｕｉｓ特異的抗原を用いたＥＬＩＳＡ
【０１２１】
マイクロタイタープレート（Ｍｉｃｒｏｌｏｎ、Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｎｕｒｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、炭酸塩−炭酸水素塩バッファー（１５．０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３４．９ｍＭ ＮａＨＣＯ３、３．１ｍＭ ＮａＮ３、ｐＨ９．６）中にウェルあたり１００μｌの抗原（精製された組換えＭＳＧ１、ＭＳＡ１、または大腸菌ＬＭＧ１９４由来のコントロール抗原；ｆ．ｃ． ４００ｎｇ／ｍｌ）を用いて、４℃にて一晩コートされた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ； １３６．９ｍＭ ＮａＣｌ、１．４６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）が、洗浄およびインキュベーション希釈液として使用された。コーティングの後、プレートは自動プレート洗浄機（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いることにより３回洗浄された。ウェルは２００μｌのブロッキングバッファー[０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）プロテオースペプトンを含むＰＢＳ； Ｄｉｆｃｏ−Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ]でブロッキングされた。残っている洗浄およびインキュベーション工程は、ウェルあたり１００μｌの量で行われ、ウェルはインキュベーション工程間で３回洗浄された。マイクロタイター振とう機上で１５分一定の攪拌から始まるインキュベーションは、室温にて１時間行われた。プレートは、各試料の２倍の希釈範囲（１：２００から１：１０２４００；ウサギ、ブタ）でインキュベートされた。各ウェルはその後、所定の濃度の西洋わさびペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧまたはウサギ抗ブタＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ鎖特異的、Ｓｉｇｍａ）を受け取った。抗原抗体反応は、使用する直前の２ｍＭ Ｈ２Ｏ２の添加により活性化された、０．１Ｍ クエン酸リン酸バッファーｐＨ４．２５中０．７３ｍＭ ２，２’−アジノビス[３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸]（ＡＢＴＳ）を用いて可視化された。色は２０−３０分間発色することができた。ＯＤ値は、コンピューターを利用したマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）によって４０５ｎｍにおいて記録された。
【０１２２】
リアルタイムＰＣＲによるＭ． ｓｕｉｓ感染症の発病の診断および研究
【０１２３】
ｍｓｇ１遺伝子（約４０ｋＤａのタンパク質ＭＳＧ１をコードする）のヌクレオチド配列に基づいて、Ｍ． ｓｕｉｓ感染症の発病を診断および研究するためのリアルタイムＰＣＲを確立することができた。
【０１２４】
ＰＣＲ増幅のため、全ての血液試料（実験的に感染させたブタ、健康なコントロールブタ）は、次の通りに調製された：２００μｌの全抗凝固血は等量の溶解バッファー（１０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３２Ｍ スクロース、１％[ｖ／ｖ] Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）と混合され、遠心された（８０００ｘｇ、２２℃、６０秒）。ペレットは、４００μｌの溶解バッファー中に再懸濁され、再び遠心された。この工程をもう一度繰り返した後、ペレットは４００μｌのＰＢＳ中に再懸濁された。ＤＮＡは、フェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコールを使用した標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）に従って、またはＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ｃｏｍｐａｃｔ装置（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて抽出された。ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ Ｃｏｍｐａｃｔ核酸単離キットＩは、製造業者の使用説明書に従って使用された。
【０１２５】
Ｍ． ｓｕｉｓＤＮＡは、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒシステム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検出され、定量された。プライマーおよびハイブリダイゼーションプローブは、ｍｓｇ１中に規定されるが、それは以下の通りであった：ｍｓｇ１ｆ（センス）、５’−ＡＣＡＡＣＴＡＡＴＧＣＡＣＴＡＧＣＴＣＣＴＡＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）およびｍｓｇ１ｒ（アンチセンス）、５’−ＧＣＴＣＣＴＧＴＡＧＴＴＧＴＡＧＧＡＡＴＡＡＴＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）。
【０１２６】
プローブは：ＬＣ Ｒｅｄ ６４０−５’−ＣＡＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＴＡＡＧＡＡＧＡＧＣ−リン酸−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）および５’−ＴＴＣＡＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣ−３’−フルオレッセイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）である。
【０１２７】
増幅産物の大きさは１７８塩基対だった。リアルタイムＰＣＲはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｆａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ＭａｓｔｅｒＰＬＵＳハイブリダイゼーションプローブ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて実行された。抽出されたＤＮＡ（５μｌ）は、４μｌのＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（５ｘ濃度）、２μｌのＰｒｉｍｅｒ−Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｘ（１０ｘ濃度、終濃度が０．５μＭの各プライマーと０．２μＭの各プローブを含む）、および９μｌの水（ＰＣＲグレード）を含む１５μｌのＰＣＲ混合物に添加された。ＰＣＲ条件は次の通り：１５分９５℃にて１サイクルの最初の変性、続いて１５秒９５℃、２０秒６０℃、および１０秒７２℃の４０サイクル。反応、データ収集、および解析は、すべてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置を用いることによって行われた。
【０１２８】
要約すれば、前記実施例は次のこと：
−Ｍ． ｓｕｉｓ特異的抗原の検出
−Ｍ． ｓｕｉｓ感染症におけるＩｇＧ免疫反応の検出
−診断および予防接種に有益な手段である、３つの免疫優性Ｍ． ｓｕｉｓ特異的抗原の検出
−免疫優性Ｍ． ｓｕｉｓタンパク質の構造および機能の検出
−免疫優性Ｍ． ｓｕｉｓタンパク質をコードしている遺伝子の解明
−赤血球付着性マイコプラズマ種のメンバーに由来する免疫反応性タンパク質の組換え発現
−本発明に開示された抗原に基づくＭ． ｓｕｉｓ血清学のためのテスト抗原の組換え産生は、動物実験に置き換えることができ、テスト抗原の高い標準化および均一化が可能である
−Ｍ． ｓｕｉｓ特異的組換え血清学的診断アッセイの確立
−Ｍ． ｓｕｉｓ特異的リアルタイムＰＣＲアッセイの確立
を示す。
【０１２９】
本発明の実施態様は、Ｍ． ｓｕｉｓ以外の赤血球付着性マイコプラズマ種、例えばウシでのＭ． ｗｅｎｙｏｎｉｉ、ネコでのＭ． ｈａｅｍｏｆｅｌｉｓ、イヌでのＭ． ｈａｅｍｏｃａｎｉｓによる感染症の診断および予防接種を可能とする。全赤血球付着性マイコプラズマ特異的診断アッセイの確立は、ヒトにおけるかかるマイコプラズマ微生物の重要性についてさらなる見識を与える。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１Ａ】１０％ラエムリゲルの一次元ウェスタンブロットの写真を示す。
【図１Ｂ】１０％ラエムリゲルの一次元ウェスタンブロットの写真を示す。
【図１Ｃ】１０％ラエムリゲルの一次元ウェスタンブロットの写真を示す。
【図２Ａ】三通りの二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（分画電気泳動／ラエムリ）の写真を示す。
【図２Ｂ】三通りの二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（分画電気泳動／ラエムリ）の写真を示す。
【図３Ａ】二次元ウエスタンブロットの写真を示す。
【図３Ｂ】二次元ウエスタンブロットの写真を示す。
【図３Ｃ】二次元ウエスタンブロットの写真を示す。
【図３Ｄ】二次元ウエスタンブロットの写真を示す。
【図４Ａ】遺伝子ｍｓｇ１の部分的なヌクレオチド配列およびそれに由来するタンパク質（ＭＳＧ１）の推定アミノ酸配列を示す。
【図４Ｂ】遺伝子ｍｓｇ１の部分的なヌクレオチド配列およびそれに由来するタンパク質（ＭＳＧ１）の推定アミノ酸配列を示す。
【図５Ａ−１】遺伝子ｍｓａ１の部分的なヌクレオチド配列およびそれに由来するタンパク質（ＭＳＡ１）の推定アミノ酸配列を示す。
【図５Ａ−２】遺伝子ｍｓａ１の部分的なヌクレオチド配列およびそれに由来するタンパク質（ＭＳＡ１）の推定アミノ酸配列を示す。
【図５Ｂ】遺伝子ｍｓａ１の部分的なヌクレオチド配列およびそれに由来するタンパク質（ＭＳＡ１）の推定アミノ酸配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはマイコプラズマスイスによる感染症に対するワクチンであって、０．０２５Ｍ トリス／０．１９２Ｍ グリシン／０．１％ ＳＤＳ水溶液の連続的な１２％ポリアクリルアミドゲル中で約３３ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５７ｋＤａ、６１ｋＤａ、７０ｋＤａ、７３ｋＤａ、および８３ｋＤａの見かけの分子量を有し、Ｍ． ｓｕｉｓ陽性動物由来の血清に対して反応するＭ． ｓｕｉｓタンパク質から選択されるタンパク質の少なくとも一の抗原決定基を含むペプチドまたはポリペプチドを含む該ワクチン。
【請求項２】
前記タンパク質が約４０ｋＤａの見かけの分子量を有する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも一の抗原決定基をコードする配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示された配列の少なくとも５の連続したアミノ酸と、少なくとも８０％、好ましくは９０％、特には少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列をコードしている配列を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示された配列の少なくとも７の連続したアミノ酸と、少なくとも８０％、好ましくは９０％、特には少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列をコードしている配列を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）若しくは５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそれらの抗原性フラグメント、誘導体、若しくは変異体をコードする配列を含む、請求項３ないし５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）または５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に示された配列を含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）に示された１３９７から２４０７のヌクレオチド配列、または５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に示された１７９２から３２６１のヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンス核酸。
【請求項１０】
請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項９に記載のアンチセンス核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項９に記載のアンチセンス核酸、および／または請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
【請求項１３】
図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されたアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１５】
（ａ）ポリペプチドの発現が可能な条件下、適した培養液中で、請求項１１に記載の宿主細胞を培養する工程；および
（ｂ）培養液および／または宿主細胞からポリペプチドを回収する工程
を含む、請求項１２または１３に記載のポリペプチドを生産する方法。
【請求項１６】
Ｍ． ｓｕｉｓによる感染症の治療および／または予防に使用するための、請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項９に記載のアンチセンス核酸、および／または請求項１０に記載のベクター、および／または請求項１１に記載の宿主細胞、および／または請求項１２または１３に記載のポリペプチド、および／または請求項１４に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項９に記載のアンチセンス核酸、および／または請求項１２または１３に記載のポリペプチド、および／または請求項１４に記載の抗体と、前記ポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチド、および／または抗体を検出するための手段を一緒に含む診断キット。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチドおよび／または抗体が固体の担体に結合されている、請求項１７に記載の診断キット。
【請求項１９】
図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）または５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に示された配列の少なくとも一部をポリメラーゼ連鎖反応により増幅するためのプライマーとしてはたらくことができる、少なくとも一のオリゴヌクレオチドペアを含む、診断キット。
【請求項２０】
前記少なくとも一のオリゴヌクレオチドペアが、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）に示された１３９７から２４０７のヌクレオチド配列、または５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に示された１７９２から３２６１のヌクレオチド配列の少なくとも一部を増幅するためのプライマーとして働くことができる、請求項１９に記載の診断キット。
【請求項２１】
治療的に有効な量の請求項９に記載のアンチセンス核酸、および／または請求項１０に記載のベクター、および／または請求項１４に記載の抗体と、少なくとも一の薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または添加剤を一緒に含む、医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１０に記載のベクター、および／または請求項１２または１３に記載のポリペプチドを含むワクチン。
【請求項２３】
赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓの検出方法であって、
（ａ）赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓ、またはそれらに由来の物質を含むと思われる試料を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得た試料を、請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項９に記載のアンチセンス核酸、および／または請求項１２または１３に記載のポリペプチド、および／または請求項１４に記載の抗体と、前記ポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチド、および／または抗体が試料中の成分に結合することができる条件下で、接触させる工程；
（ｃ）一回以上の洗浄を行う工程；および
（ｄ）工程（ｂ）において結合した前記ポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチド、および／または抗体の存在を検出する工程
を含む、該検出方法。
【請求項２４】
赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓの検出方法であって、
（ａ）赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓ、またはそれらに由来する物質を含むと思われる試料を得る工程；
（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）または５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に示された配列の少なくとも一部を増幅するためのプライマーとしてはたらくことができる、少なくとも一のオリゴヌクレオチドペアを提供する工程；
（ｃ）工程（ａ）において得た試料をテンプレートとして、そして工程（ｂ）において提供された少なくとも一のオリゴヌクレオチドペアをプライマーとして使用して、ＰＣＲを行う工程；および
（ｄ）工程（ｃ）において生産された増幅産物を解析する工程
を含む、該検出方法。
【請求項２５】
少なくとも一のオリゴヌクレオチドペアが、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）に示された１３９７から２４０７のヌクレオチド配列、または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に示された１７９２から３６２１のヌクレオチド配列の少なくとも一部を増幅するためのプライマーとしてはたらくことができる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｄ）において、工程（ｃ）において生産された産物が、増幅中に定量化される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２１に記載の医薬組成物を、赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓにより感染した動物に投与する工程を含む、赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓによる感染症の治療方法。
【請求項２８】
請求項１若しくは２に記載のワクチン、および／または請求項２２に記載のワクチンの有効量を、赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓによる感染が疑われる動物に投与する工程を含む、赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓによる感染症の予防方法。
【請求項２９】
赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓによる感染症の治療用医薬組成物を調製するための請求項９に記載のアンチセンス核酸、および／または請求項１０に記載のベクター、および／または請求項１４に記載の抗体の使用。
【請求項３０】
赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓによる感染症の予防用ワクチンを調製するための請求項１０に記載のベクター、および／または請求項１２または１３に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３１】
赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓによる感染症を検出するための請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項９に記載のアンチセンス核酸、および／または請求項１２または１３に記載のポリペプチド、および／または請求項１４に記載の抗体の使用。
【請求項１】
赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはマイコプラズマスイスによる感染症に対するワクチンであって、０．０２５Ｍ トリス／０．１９２Ｍ グリシン／０．１％ ＳＤＳ水溶液の連続的な１２％ポリアクリルアミドゲル中で約３３ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５７ｋＤａ、６１ｋＤａ、７０ｋＤａ、７３ｋＤａ、および８３ｋＤａの見かけの分子量を有し、Ｍ． ｓｕｉｓ陽性動物由来の血清に対して反応するＭ． ｓｕｉｓタンパク質から選択されるタンパク質の少なくとも一の抗原決定基を含むペプチドまたはポリペプチドを含む該ワクチン。
【請求項２】
前記タンパク質が約４０ｋＤａの見かけの分子量を有する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも一の抗原決定基をコードする配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示された配列の少なくとも５の連続したアミノ酸と、少なくとも８０％、好ましくは９０％、特には少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列をコードしている配列を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示された配列の少なくとも７の連続したアミノ酸と、少なくとも８０％、好ましくは９０％、特には少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列をコードしている配列を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）若しくは５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそれらの抗原性フラグメント、誘導体、若しくは変異体をコードする配列を含む、請求項３ないし５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）または５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に示された配列を含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）に示された１３９７から２４０７のヌクレオチド配列、または５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に示された１７９２から３２６１のヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンス核酸。
【請求項１０】
請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項９に記載のアンチセンス核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項９に記載のアンチセンス核酸、および／または請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
【請求項１３】
図４Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）または５Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示されたアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１５】
（ａ）ポリペプチドの発現が可能な条件下、適した培養液中で、請求項１１に記載の宿主細胞を培養する工程；および
（ｂ）培養液および／または宿主細胞からポリペプチドを回収する工程
を含む、請求項１２または１３に記載のポリペプチドを生産する方法。
【請求項１６】
Ｍ． ｓｕｉｓによる感染症の治療および／または予防に使用するための、請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項９に記載のアンチセンス核酸、および／または請求項１０に記載のベクター、および／または請求項１１に記載の宿主細胞、および／または請求項１２または１３に記載のポリペプチド、および／または請求項１４に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項９に記載のアンチセンス核酸、および／または請求項１２または１３に記載のポリペプチド、および／または請求項１４に記載の抗体と、前記ポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチド、および／または抗体を検出するための手段を一緒に含む診断キット。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチドおよび／または抗体が固体の担体に結合されている、請求項１７に記載の診断キット。
【請求項１９】
図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）または５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に示された配列の少なくとも一部をポリメラーゼ連鎖反応により増幅するためのプライマーとしてはたらくことができる、少なくとも一のオリゴヌクレオチドペアを含む、診断キット。
【請求項２０】
前記少なくとも一のオリゴヌクレオチドペアが、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）に示された１３９７から２４０７のヌクレオチド配列、または５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に示された１７９２から３２６１のヌクレオチド配列の少なくとも一部を増幅するためのプライマーとして働くことができる、請求項１９に記載の診断キット。
【請求項２１】
治療的に有効な量の請求項９に記載のアンチセンス核酸、および／または請求項１０に記載のベクター、および／または請求項１４に記載の抗体と、少なくとも一の薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または添加剤を一緒に含む、医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１０に記載のベクター、および／または請求項１２または１３に記載のポリペプチドを含むワクチン。
【請求項２３】
赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓの検出方法であって、
（ａ）赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓ、またはそれらに由来の物質を含むと思われる試料を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）において得た試料を、請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項９に記載のアンチセンス核酸、および／または請求項１２または１３に記載のポリペプチド、および／または請求項１４に記載の抗体と、前記ポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチド、および／または抗体が試料中の成分に結合することができる条件下で、接触させる工程；
（ｃ）一回以上の洗浄を行う工程；および
（ｄ）工程（ｂ）において結合した前記ポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ポリペプチド、および／または抗体の存在を検出する工程
を含む、該検出方法。
【請求項２４】
赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓの検出方法であって、
（ａ）赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓ、またはそれらに由来する物質を含むと思われる試料を得る工程；
（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）または５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に示された配列の少なくとも一部を増幅するためのプライマーとしてはたらくことができる、少なくとも一のオリゴヌクレオチドペアを提供する工程；
（ｃ）工程（ａ）において得た試料をテンプレートとして、そして工程（ｂ）において提供された少なくとも一のオリゴヌクレオチドペアをプライマーとして使用して、ＰＣＲを行う工程；および
（ｄ）工程（ｃ）において生産された増幅産物を解析する工程
を含む、該検出方法。
【請求項２５】
少なくとも一のオリゴヌクレオチドペアが、図４Ａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）に示された１３９７から２４０７のヌクレオチド配列、または図５Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に示された１７９２から３６２１のヌクレオチド配列の少なくとも一部を増幅するためのプライマーとしてはたらくことができる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｄ）において、工程（ｃ）において生産された産物が、増幅中に定量化される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２１に記載の医薬組成物を、赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓにより感染した動物に投与する工程を含む、赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓによる感染症の治療方法。
【請求項２８】
請求項１若しくは２に記載のワクチン、および／または請求項２２に記載のワクチンの有効量を、赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓによる感染が疑われる動物に投与する工程を含む、赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓによる感染症の予防方法。
【請求項２９】
赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓによる感染症の治療用医薬組成物を調製するための請求項９に記載のアンチセンス核酸、および／または請求項１０に記載のベクター、および／または請求項１４に記載の抗体の使用。
【請求項３０】
赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓによる感染症の予防用ワクチンを調製するための請求項１０に記載のベクター、および／または請求項１２または１３に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３１】
赤血球付着性マイコプラズマ種、好ましくはＭ． ｓｕｉｓによる感染症を検出するための請求項３ないし８のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項９に記載のアンチセンス核酸、および／または請求項１２または１３に記載のポリペプチド、および／または請求項１４に記載の抗体の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ−１】
【図５Ａ−２】
【図５Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ−１】
【図５Ａ−２】
【図５Ｂ】
【公表番号】特表２００９−５０６７７９（Ｐ２００９−５０６７７９Ａ）
【公表日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２９４４３（Ｐ２００８−５２９４４３）
【出願日】平成１８年８月８日（２００６．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＨ２００６／０００４１７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２８２５９
【国際公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【出願人】（５０８０７２２９１）ウニベルジテート チューリッヒ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月８日（２００６．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＨ２００６／０００４１７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２８２５９
【国際公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【出願人】（５０８０７２２９１）ウニベルジテート チューリッヒ (2)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]