マクロラクチンＡ及びその誘導体を有効成分として含有する抗炎症性組成物
本発明は、新規なバチルス菌株バチルス・ポリファーメンチカス ＫＪＳ−２（Bacillus polyfermenticus KJS-2、ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株から生産されるマクロラクチンＡ、７−Ｏ−マロニルマクロラクチンＡ、７−Ｏ−スクシニルマクロラクチンＡなどのマクロラクチン化合物の抗炎症的使用に関する。
本発明が提供するマクロラクチン化合物は、炎症媒介因子の形成に関連するタンパク質である誘導型酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）及びシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現及び形成を強力に抑制すること、及び従ってタンパク質の代謝産物である酸化窒素（ＮＯ）及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の形成を阻害することを確認した。また、炎症促進性サイトカイン(pro-inflammatory cytokine)である腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β)、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び顆粒球マクロファージコロニー-刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の形成阻害に対する優れた効果を有することを確認した。
従って、本発明のバチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株から生産されるマクロラクチン化合物は優れた抗炎症剤を提供することができる。
本発明が提供するマクロラクチン化合物は、炎症媒介因子の形成に関連するタンパク質である誘導型酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）及びシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現及び形成を強力に抑制すること、及び従ってタンパク質の代謝産物である酸化窒素（ＮＯ）及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の形成を阻害することを確認した。また、炎症促進性サイトカイン(pro-inflammatory cytokine)である腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β)、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び顆粒球マクロファージコロニー-刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の形成阻害に対する優れた効果を有することを確認した。
従って、本発明のバチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株から生産されるマクロラクチン化合物は優れた抗炎症剤を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２（Bacillus Polyfermenticus KJS-2,；ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）から生産されるマクロラクチンＡ（以下、「ＭＡ」と称す）、７−Ｏ−マロニルマクロラクチンＡ（以下、「ＭＭＡ」と称す）及び７−Ｏ−スクシニルマクロラクチンＡ（以下、「ＳＭＡ」と称す）などのマクロラクチン化合物の抗炎症的使用に関する。具体的には、本発明は、誘導型酸化窒素合成酵素（以下、「ｉＮＯＳ」と称す）、シクロオキシゲナーゼ−２（以下、「ＣＯＸ−２」と称す）、及び炎症促進性サイトカインである腫瘍壊死因子−α（以下、「ＴＮＦ−α」と称す）、インターロイキン−１β（以下、「ＩＬ−１β」と称す）、インターロイキン−６（以下、「ＩＬ−６」と称す）及び顆粒球マクロファージコロニー−刺激因子（以下、「ＧＭ−ＣＳＦ」と称す）の形成を抑制することによって、優れた抗炎症活性を有する前記マクロラクチン化合物の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マクロラクチン化合物は、２４−員ラクトン環を有するマクロライド系抗生物質である（非特許文献１）。前記化合物は分類されていない海洋バクテリア、放線菌、及びバチルス菌株から生産されると報告されており、２１種類が同定されている。これらのマクロラクチン化合物は様々な薬理活性を有している。マクロラクチン化合物の薬理活性に対する先の研究は以下の通りである。
【０００３】
１９８９年、Willam Fenical は、単純ヘルペスウイルスとＨＩＶに対するＭＡの抗ウイルス活性を開示した。１９９７年、Ick-Dong Yooは、アクチノマヅラ属（Actinomadura sp.）株からＭＡを得て、ＭＡを用いてグルタメート（glutamate）に由来する神経細胞の保護に関する研究を行った。２００１年に、Hiroshi Sano は、バチルス属（Bacillus sp.）ＰＰ１９−Ｈ３株からＭＡを単離して、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＩＦＯ１２７３２とバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）ＩＦＯ３１３４株に対するＭＡの抗菌活性をに関する研究を行った。２００３年、Sung-Won Choi はストレプトミセス属（Streptomyces sp.）ＹＢ−４０１株からＭＡを得て、コレステロール生合成に対するＭＡの阻害効果を開示した。２００４年には、Keun-Hyung Park は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＣＨＯ１０４株からＭＡを分離して、黄色ブドウ球菌ＫＣＴＣ１９２８、エシュリキア・コリＫＣＴＣ２５９３、及びボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）に対するＭＡの抗菌活性を研究した。２００５年には、Joo-Won Suh はバチルス属ｓｕｎｈｕａ株からＭＡを得て、ＭＡを用いてジャガイモそうか病を誘発するストレプトミセス疥癬(scabies)の阻害を研究した。２００６年に、Gabriella Molinari はバチルス・ズブティリス（Bacillus subtilis）ＤＳＭ１６６９６株からＭＡ、ＭＭＡ、及びＳＭＡを単離して、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）（vancomycim-resistant Enterococci）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)、及び バーク（バルク）ホルデリア・セパシア （Burkholderia cepacia）に対するそれぞれの化合物の抗菌活性を研究した。この研究では、ＭＭＡとＳＭＡは試験菌に対する優れた抗菌活性を有していた反面、ＭＡは単に、ＭＲＳＡに対してのみ抗菌活性を示したことが報告された。
【０００４】
マクロラクチン化合物は様々な薬理活性を有しているが、マクロラクチン化合物の抗炎症活性に関する研究は現在まで全く報告されていない。
【０００５】
炎症は、生体の患部に生じた損傷に対する防御的応答である。即ち、炎症応答は、有害な刺激に応答して、刺激による損傷を除去することによって元の状態に回復しようという防御的応答である。
【０００６】
炎症を誘発する物質の一つである酸化窒素（以下、「ＮＯ」と称す）は、正常状態では内皮細胞やマクロファージで生産される。血管拡張、血小板接着及び凝集、神経伝達、消化器系の運動、勃起などに関与する媒介物質であるＮＯは、炎症細胞及び非免疫細胞で生成され、微生物感染に対する防御作用も果たす。リポ多糖体（以下、「ＬＰＳ」と称す）、炎症誘発因子及び放射線照射などに起因する刺激は、特に、細胞内のｉＮＯＳタンパク質の発現を誘導し、ＮＯを継続生成して、炎症疾患を誘発する。
【０００７】
別の炎症誘発物質であるプロスタグランジンＥ２（以下、「ＰＧＥ２」と称す）は、アラキドン酸由来のホルモンの一種であり、様々な生理活性に関与する。ＰＧＥ２はＣＯＸ−２タンパク質の発現により生成される。ＣＯＸ−２の発現を抑制する薬物は、炎症病巣におけるＰＧＥ２生成の阻害によって、鎮痛、抗浮腫、解熱、抗炎症及び抗凝固活性を有するので、これらは血栓、浮腫、梗塞、発作及び脳血管疾患の予防及び治療に使用できる。
【０００８】
前記２種類の炎症誘発物質であるｉＮＯＳとＣＯＸ−２は、互いに密接に関連している。例えば、過剰に生成されたＮＯは、ＣＯＸ−２の発現に影響を与えることがある。従って、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２活性の阻害剤は、ＮＯ及びＰＧＥ２代謝産物の過剰生成に起因する様々な疾患（例えば、炎症疾患）を予防または治療する薬物として開発するための高い可能性を有すると考えられている。
【０００９】
現在まで、ステロイド及び非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）は、急性及び慢性炎症疾患の治療に適宜使用されてきた。しかし、従来の抗炎症剤は、特に長期間使用すると、かなりの副作用をもたらす。従って、副作用が殆ど無い新しい抗炎症剤を開発することが切に求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc., 1989,111, 7519-7524
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来の抗炎症剤の上記問題点を考慮した、本発明の目的は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株から生産される、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡのようなマクロラクチン化合物の抗炎症的使用を提供することである。特に本発明は、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２の形成を阻害することによって優れた抗炎症活性を有するマクロラクチン化合物の使用を提供する。
【００１２】
また、本発明の目的は、前記マクロラクチン化合物を有効成分として含有する、炎症疾患の予防及び治療のための医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様では、本発明は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株から生産される式（１）のＭＡ、式（２）のＭＭＡ及び式（３）のＳＭＡの抗炎症的使用を提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡのような前記マクロラクチン化合物のｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２タンパク質、及び炎症性サイトカインの形成を阻害するための抗炎症的使用を提供する。
【００１５】
更に別の態様では、本発明は、前記マクロラクチン化合物を含有する炎症疾患の予防及び治療のための医薬組成物を提供する。
【００１６】
【化１】
【００１７】
【化２】
【００１８】
【化３】
【００１９】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
【００２０】
式（１）のＭＡと式（２）のＭＭＡを得るために、本発明者らによって分離されたバチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株を、ＭＡ培地中で発酵する。発酵液を酢酸エチルで抽出して、抽出液を濃縮する。実施例１の方法に従って、目的の生成物を分離して、精製する。
【００２１】
式（３）のＳＭＡを得るために、前記株を、ＨＰ−２０樹脂を含むトリプトソイ（ＴＳＢ）培地で発酵する。実施例１の方法に従って、目的の生成物を分離して、精製する。
【００２２】
精製した生成物の構造を、ＬＣ／Ｍａｓｓと核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって解析した。
【００２３】
前記マクロラクチン化合物、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの抗炎症効果についての研究は、現在まで報告されていない。
【００２４】
本発明者らは、前記マクロラクチン化合物の抗炎症効果を確認して、本発明を完成させた。抗炎症効果を調べるために、精製したそれぞれの化合物で処理したマウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞株をＬＰＳ（０．１μｇ／ｍＬ又は１．０μｇ／ｍＬ、シグマ社製）で刺激し、次いで炎症誘発物質である、１）ＮＯと２）ＰＧＥ２の形成及びそれらの形成に関連する酵素の発現を分析した。同様の方法で、３）炎症促進性サイトカイン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＧＭ−ＣＳＦの形成も分析した。
【００２５】
１）ＮＯ形成の抑制は、グリース反応（Griess recation）によって確認した。その結果、ＬＰＳ単独で処理した対照群に比べて、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡ全てがＮＯ形成を強力に阻害することを確認した。マクロラクチン化合物のＮＯ形成における阻害効果は、特にヒドロコルチゾン（hydrocortisone）のそれに匹敵していたか、または優れていた。
【００２６】
ＮＯ形成はｉＮＯＳタンパク質と関連している。ｉＮＯＳ活性が誘発されると、長時間にわたって多量のＮＯが形成される。ＮＯは、病理的な血管拡張、細胞毒性、組織損傷などの生体系に対する副作用が知られていて、且つ炎症状態では血管透過性、浮腫などの炎症応答を促進させ、炎症媒介因子の生合成を促進して炎症を深刻化することも知られている。
【００２７】
ＮＯ形成を抑制する作用機構を調べるために、それぞれのマクロラクチン化合物で処理したマウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７をＬＰＳで刺激してｉＮＯＳの形成を誘導した後、各化合物におけるｉＮＯＳ形成の抑制程度をリアルタイムＰＣＲ及びウェスタンブロットによって確認した。
【００２８】
その結果、リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現において、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの全てがｉＮＯＳ ｍＲＮＡの発現を強力に抑制して、その抑制効果はヒドロコルチゾンのそれに匹敵していたか、または優れていた。ウェスタンブロット法により確認したタンパク質発現レベルでも、本発明のマクロラクチン化合物はＬＰＳ単独で処理した対照群に比べて、強い抑制効果を示した。
【００２９】
前記結果から、本発明のマクロラクチン化合物は、ｉＮＯＳタンパク質の発現を抑制する作用によって、ＮＯ形成を抑制すると考えられる。
【００３０】
２）別の炎症媒介因子であるＰＧＥ２の抑制を、酵素免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）キットを用いて確認した。その結果、ＬＰＳ単独で処理した対照群に比べてＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの全てがＰＧＥ２の形成を強力に阻害することを確認した。特に、マクロラクチン化合物のＰＧＥ２形成の阻害効果はヒドロコルチゾンのそれに匹敵していたか、または優れていた。多くの抗炎症薬物はＰＧＥ２合成を抑制する作用機構を有しており、これはＣＯＸ−２タンパク質の形成及び活性を阻害することに起因している。ＣＯＸ−２によって合成されたＰＧＥ２は炎症応答を媒介する。ＣＯＸ−２タンパク質により生成されたＰＧＥ２は炎症応答、免疫応答、及び脈管形成を刺激して、癌の発生にも関与していることが知られている。ＰＧＥ２合成の抑制とＣＯＸ−２タンパク質合成の抑制との関連性を調べるために、それぞれのマクロラクチン化合物で処理したマウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７をＬＰＳで刺激してＣＯＸ−２形成を誘導した後、各化合物におけるＣＯＸ−２タンパク質形成の抑制程度をリアルタイムＰＣＲ及びウェスタンブロットによって確認した。その結果、本発明のマクロラクチン化合物はＣＯＸ−２ｍＲＮＡの発現を強く抑制し、その抑制活性はヒドロコルチゾンのそれに匹敵していたか、または優れていた。ウェスタンブロットで確認したＣＯＸ−２タンパク質の発現においても、本発明のマクロラクチン化合物はＬＰＳ単独で処理した対照群に比べて強い抑制効果を示した。
【００３１】
前記結果により、本発明のマクロラクチン化合物は、ＣＯＸ−２タンパク質の発現を抑制することによって、ＰＧＥ２形成を強力に阻害すると考えられる。
【００３２】
上記の結果から、本発明のマクロラクチン化合物は、ｉＮＯＳとＣＯＸ−２タンパク質の形成を抑制する作用によって、ＮＯとＰＧＥ２の形成を強力に阻害したことを確認した。
【００３３】
３）本発明のマクロラクチン化合物による炎症促進性サイトカインの抑制を、マウス ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（KOMA Biotech社製）を用いて確認した。
【００３４】
ＴＮＦ−α測定の結果、ＬＰＳ単独で処理した対照群に比べて、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの全てがＴＮＦ−αの形成を阻害した。また、マクロラクチン化合物のＴＮＦ−αの形成に対する阻害効果はヒドロコルチゾンのそれに匹敵していたか、または優れていた。特に、ＭＡは他の対照物質と比較して優れたＴＮＦ−α形成の阻害効果を有している。
【００３５】
ＩＬ−１β測定の結果、ＭＡとＳＭＡのそれぞれがＩＬ−１βの形成を強力に阻害して、特に、マクロラクチン化合物のＩＬ−１β形成に対する阻害効果はヒドロコルチゾンのそれに匹敵していたか、または、優れていたと確認された。
【００３６】
ＩＬ−６測定の結果、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの全てはＩＬ−６の形成を強力に阻害したことを確認した。マクロラクチン化合物のＩＬ−１β形成に対する阻害効果はヒドロコルチゾンのそれより優れてはいなかった。
【００３７】
ＧＭ−ＣＳＦ測定の結果、ＭＡとＳＭＡのそれぞれがＧＭ−ＣＳＦの形成を強力に阻害したことを確認した。マクロラクチン化合物のＧＭ−ＣＳＦ形成に対する阻害効果はヒドロコルチゾンのそれより優れていた。
【００３８】
前記結果により、本発明のマクロラクチン化合物は、急性炎症と慢性炎症の両方に関与している炎症促進性サイトカインを強力に阻害すると考えられる。
【００３９】
また、本発明のマクロラクチン化合物と、抗炎症剤として一般的に用いられているヒドロコルチゾンがマウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７に及ぼす細胞毒性を チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（以下、「ＭＴＴ」と称す）分析によって確認した。その結果、本発明のマクロラクチン化合物の細胞毒性はヒドロコルチゾンのそれより低かった。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株の発酵液抽出物のＭＰＬＣクロマトグラム（MPLC chromatgram）である。
【図２】図２は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株の培養液抽出物のＭＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】図３は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株により生産されたマクロラクチンＡのＬＣ／Ｍａｓｓ分析の結果であり、ａ）２６２ｎｍで測定したＬＣクロマトグラム、ｂ）紫外線スペクトル、そしてｃ）エレクトロスプレーイオン化スペクトル（ＥＳＩ−スペクトル）である。
【図４】図４は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株により生産された７−Ｏ−マロニルマクロラクチンＡのＬＣ／Ｍａｓｓ分析の結果であり、ａ）２６２ｎｍで測定したＬＣクロマトグラム、ｂ）紫外線スペクトル、そしてｃ）ＥＳＩ−スペクトルである。
【図５】図５は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株により生産された７−Ｏ−スクシニルマクロラクチンＡのＬＣ／Ｍａｓｓ分析の結果であり、ａ）２６２ｎｍで測定したＬＣクロマトグラム、ｂ）紫外線スペクトル、ｃ）ＥＳＩ−スペクトルである。
【図６】図６は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＮＯ形成に対する阻害効果を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＰＧＥ２形成に対する阻害効果を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるｉＮＯＳｍＲＮＡ発現に対する阻害効果を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＯＸ−２ｍＲＮＡ発現に対する阻害効果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるｉＮＯＳとＣＯＸ−２タンパク質生成に対する阻害効果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞における細胞毒性を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＴＮＦ−α形成に対する阻害効果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＩＬ−１β形成に対する阻害効果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＩＬ−６形成に対する阻害効果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ形成に対する阻害効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下の実施例により本発明をより詳細にに説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を説明することのみを目的としていて、本発明の範囲はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４２】
実施例１：バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株からのマクロラクチンＡ、７−Ｏ−マロニルマクロラクチンＡ、及び７−Ｏ−スクシニルマクロラクチンＡの生産、分離及びそれらの構造解析
【００４３】
［工程１：バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株からのマクロラクチンＡ及び７−Ｏ−マロニルマクロラクチンＡの生産及びそれらの分離］
ＭＡとＭＭＡを得るために、本発明者により単離されたバチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株を用いる発酵工程を、ＭＡ培地中で実施した。
【００４４】
ＭＡ培地の組成は次の通りである。
栄養培養液（Nutrient broth）（Difco社製）１６ｇ／Ｌ、
スキムミルク１０ｇ／Ｌ、
２．５μＭのＦｅＳＯ４、
５００μＭのＣａＣｌ２、
１ｍＭのＭｇＳＯ４、
１３ｍＭのＫＣｌ．
【００４５】
発酵工程は、空気流入量０．１４３ｖｖｍ、回転数２００ｒｐｍ、温度３０℃、及び１ＮのＨＣｌと３ＮのＮａＯＨでｐＨ６．８に保持した条件下で実施した。発酵液を酢酸エチルで抽出した後、濃縮した。濃縮液をメタノールに溶解して、中圧液体クロマトグラフィー（以下、ＭＰＬＣと称す）用の試料を作成した。Ｂｕｃｈｉ ＭＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｕｃｈｉ ｐｕｍｐ Ｃ−６０５、ｃｏｌｕｍｎ１．５×２３ｃｍ、Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ Ｂｕｃｈｉ Ｃ−６６０）を使用して、カラム内にはＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ Ｃ−１８（４０〜６３μｍ、メルク社製）を充填した。２６２ｎｍで検出を行い、移動相は流速１５ｍＬ／ｍｉｎの４０％アセトニトリルである。発酵液抽出物をＭＰＬＣカラム内に注入した後、図１に記載の第１のピークと第２のピークに該当する画分を濃縮して、次の分析のための試料を作成した。
【００４６】
［工程２：バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株からの７−Ｏ−スクシニルマクロラクチンＡの生産及びその分離］
本発明者らによって単離されたバチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株をＨＰ−２０樹脂（三菱化学社製）１０％を含むトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）培地に接種して、３０℃、２００ｒｐｍで２．５日間培養した。培養後、ＨＰ−２０樹脂を回収し、水で洗浄した。メタノールを用いて結合した物質を溶出した。メタノール溶出液を濃縮して、ＭＰＬＣ用の試料を作成した。
【００４７】
ＭＰＬＣの操作条件は前述と同様であった。図２に示されているピークに該当する画分を濃縮して、次の分析のための試料を作成した。
【００４８】
［工程３：分析の条件及び構造の解明］
工程１及び２で精製した各物質を下記の装置及び条件で分析した。Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８カラム（粒径５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）を備えたアジレント（agilent）１１００シリーズＬＣ／Ｍａｓｓを用いて質量分析を行った。ＬＣの移動相は、アセトニトリルと０．１％ギ酸含有水であり、ＬＣ分析条件は、流速１ｍＬ／分で２０分間、アセトニトリル０％から１００％の勾配溶媒を用いて、２６２ｎｍで検出した。質量分析の条件は、乾燥ガス流１３Ｌ／分、蒸気圧５０ｐｓｉ、及び乾燥ガス温度３５０℃を用いるＡＰ−ＥＳＩ（Atmosphere pressure-Electro spray ionization）モードであった。毛細管電圧はカチオンモードで４０００Ｖ、アニオンモードで３５００Ｖであり、質量範囲は１００ｍ／ｚ〜１０００ｍ／ｚであり、そしてフラグメント電圧（fragment voltage）１５０Ｖであった。前記条件下で工程１及び２で精製した各物質を分析して、図３、４及び５にその結果を示した。各化合物の質量分析の結果は以下の通りでる。
【００４９】
図１、第１の画分は、［Ｍ＋Ｎａ］＋４２５．４ｍ／ｚ、［Ｍ＋Ｋ］＋４４１．４ｍ／ｚ、最大吸光度（λｍａｘ）２６２ｎｍ、純度９８．３％であると、そして第２の画分は［Ｍ＋Ｎａ］＋５１１．７ｍ／ｚ、最大吸光度（λｍａｘ)２５８ｎｍ、純度８４．８８％であると確認した。図２の画分は、［Ｍ＋Ｎａ］＋５２６．０ｍ／ｚ、［Ｍ−Ｈ］−５０２．０ｍ／ｚ、最大吸光度（λｍａｘ）２５８ｎｍ、純度９７．０２％であると確認した。
【００５０】
精製したそれぞれの物質の約３０ｍｇをＤＭＳＯ−ｄ６溶液に溶解した後、ＮＭＲ分析によってそれらの化学構造を特定した。特定するために、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ−９０、ＤＥＰＴ−１３５、Ｈｏｍｏ ＣＯＺＹ、ＨＭＱＣ、及びＨＭＢＣなどの多種のＮＭＲ技術を用い、そして１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの問題を解決するために、プロトンデカップリング方法も用いた。
【００５１】
ＮＭＲ分析の結果、図１及び図３の第１画分はＭＡと同定された。その結果を表１及び表４に示す。旋光計（ポラックス−Ｄ、アタゴ社製）で測定した物質の比旋光度は、１７℃で、−１０（ｃ＝４．０、メタノール）であり、これにより物質が式（１）と同じ化合物、ＭＡであることを確認した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
ＮＭＲ分析の結果、図１及び図４の第２の画分はＭＭＡと同定された。その結果を表２及び表４に示す。旋光計（ポラックス−Ｄ、アタゴ社製）で測定した物質の比旋光度は１７℃で−５(ｃ＝４．０、メタノール）であり、これにより物質が式（２）と同じ化合物、ＭＭＡであることを確認した。
【００５４】
【表２】
【００５５】
ＮＭＲ分析の結果、図２及び図４の画分はＳＭＡと同定された。その結果を表３及び表４に示す。旋光計（ポラックス−Ｄ、アタゴ社製）で測定した物質の比旋光度は１７℃で−１５(ｃ＝４．０、メタノール）であり、これにより物質が式（３）と同じ化合物、ＳＭＡであることを確認した。
【００５６】
【表３】
【００５７】
表４は、本発明で調査したバチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株から生産したＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの生産方法、収率、純度及び特性を示す（表４に記載した）。
【００５８】
【表４】
【００５９】
実施例２：ネズミのマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞株に対するマクロラクチン化合物の抗炎症活性の検討
ネズミマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７は、韓国細胞株銀行(Korean Cell Line Bank；ＫＣＬＢ)から入手した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；LONZA社製）と１％ペニシリン／ストレプトマイシン(Sigma社製）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；LONZA社製）中、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で培養して、細胞密度が８０％に達したときに、継代培養を行った。ＲＡＷ２６４．７細胞を２４時間培養した後、ＭＡ（１〜１００μＭ）、ＭＭＡ（１０μＭ）、ＳＭＡ（１０μＭ）及び抗炎症活性を有している公知物質である、ヒドロコルチゾン（１０μＭ）を加えた。添加の１時間後に、ＬＰＳ（０．１又は１．０μｍ／ｍＬ、シグマ社製）を混合物に加え、次いで８時間又は１６時間培養した。陰性対照としてジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」）を使用し、陽性対照としてマクロラクチン化合物を添加しない状態のＬＰＳ（０．１又は１．０μｍ／ｍＬ、シグマ社製）を使用した。
【００６０】
実験例１：ＮＯ形成に対する阻害効果
細胞培養液内のＮＯの濃度は、硝酸／亜硝酸比色アッセイキット（Cayman社製）を使用して測定した。１×１０５細胞／ウェルに調整したネズミマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞を、６ウェルプレート中、実施例２に記載した条件下で２４時間培養して、本発明のマクロラクチン化合物とＬＰＳ（０．１μｇ／ｍＬ、シグマ社製）で処理した後、１６時間さらに培養した。培養培地を製造会社から提供された９６ウェルプレート中でグリース試薬Ｒ１（スルファニルアミド）で、次いでグリース試薬Ｒ２（Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンジアミン）で処理し、次いで亜硝酸塩からの紫色のアゾ基の形成を検出した。製造会社から提供された標準溶液によってＵＶスペクトルメータにおける５４０ｎｍの吸光度で作成した検量線を用いて、ＮＯ生成量を算出した。
【００６１】
その結果、ＭＡとヒドロコルチゾンの両方がＮＯ形成を強力に阻害したのに対して、ＭＭＡとＳＭＡは低い阻害活性を示した（図６を参照されたい）。
【００６２】
実験例２：ＰＧＥ２形成に対する阻害効果
細胞内の炎症性因子である、ＰＧＥ２の形成量は、アマシャムプロスタグランジンＥ２ ｂｉｏｔｒａｋ エンザイムイムノアッセイ（Amersham prostaglandin E2 biotrak Enzymeimmunoassay；ＥＩＡ）システムキット（GE Healthcare社製）を用いて測定した。９６ウェルプレート中、２×１０４細胞／ウェルに調整したネズミマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞を、実施例２に記載した条件下で２４時間培養し、次いで、本発明のマクロラクチン化合物とＬＰＳ（０．１μｇ／ｍＬ、Sigma社製）で処理した後、１６時間さらに培養した。製造会社から提供された標準溶液によって、ＵＶスペクトルメータにおける４５０ｎｍの吸光度で作成した検量線を用いて、ＰＧＥ２生成量を算出した。標準物質に対する検量線のｒ２値は０.９９以上であった。
【００６３】
その結果、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡは全て、ＰＧＥ２形成を強力に阻害しており、阻害活性はヒドロコルチゾンのそれと類似していたか、または匹敵していた（図７を参照されたい）。
【００６４】
実験例３：ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２ｍＲＮＡの発現に対する効果
細胞内の炎症性因子である、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２ｍＲＮＡの発現に対する本発明のマクロラクチン化合物の効果を検討した。６ウェルプレート中、１Ｘ１０５細胞／ウェルに調整したネズミマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞を、実施例２に記載した条件下で２４時間培養し、次いで本発明のマクロラクチン化合物とＬＰＳ（０．１μｇ／ｍＬ、シグマ社製）で処理した後、１６時間さらに培養した。培養細胞の全てのＲＮＡをＲＮａｓｅ無しの条件下でＴｒｉｚｏｌ試薬（シグマ社製）によって単離した。分離した全てのＲＮＡを用いるＰＣＲ用のテンプレートを得るために、ｃＤＮＡ合成キット（タカラ社製）を使用した。Ｏｌｉｇｏ ｄＴ Ｐｒｉｍｅｒ（５０μＭ）１μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ１０ｍＭ）１μＬ、及びテンプレートＲＮＡ２μｇの混合物にＲＮａｓｅを含んでいないｄＨ２Ｏを添加して、総体積を１０μＬに調整した。混合物を６５℃に５分間、次いで氷に入れて２分間保持した。混合液１０μＬ、５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）緩衝液４μＬ、ＲＮａｓｅ阻害剤（４０Ｕ／μＬ）０．５μＬ、及びＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴａｓｅ（２００Ｕ／μＬ）０．５μＬの混合物にＲＮａｓｅを含まないｄＨ２Ｏを加えて総体積を２０μＬに調整した。混合物を４２℃で３０分間反応してｃＤＮＡを合成した。
【００６５】
合成したｃＤＮＡ２５〜５０ｎｇ、ｓｅｎｓｉＭｉｘＰｌｕｓ ＳＹＢＲ ２Ｘ緩衝液（Quantance社製）５μＬ、表５に示したプライマーをそれぞれ０．２５ｐｍｏｌの混合物に蒸留水を加えて総体積を１０μＬに調整した。混合物のｉＮＯＳとＣＯＸ−２ｍＲＮＡ発現の程度を、リアルタイム遺伝子増幅器（Corbett life science Rotor-gene 6000）を使用して測定した。リアルタイム遺伝子増幅器の操作条件は次の通りである。初期変性は９５℃で５分間から始めて、９４℃で３０秒、５７℃で３０秒、そして７２℃で３０秒間５０回繰り返した。試料のｍＲＮＡ発現を互いに比較する時は、ハウスキーピング遺伝子も同時に測定して相対量を求めた。ハウスキーピング遺伝子の測定値で、ＲＮＡ量を補正することによって各試料のｍＲＮＡ生成量をＣｔ（Threshold cycle）値で算出した。
【００６６】
その結果、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡは全て、ｉＮＯＳとＣＯＸ−２ｍＲＮＡ発現を強力に阻害して、阻害活性はヒドロコルチゾンのそれと類似していたか、または匹敵していた（図８及び図９を参照されたい）。
【００６７】
【表５】
【００６８】
実験例４：ｉＮＯＳとＣＯＸ−２タンパク質形成に対する効果
細胞内の炎症性因子である、ｉＮＯＳとＣＯＸ−２タンパク質形成に対する、本発明のマクロラクチン化合物の効果を検討した。１００ｍｍｄｉｓｈ中、１×１０６細胞／ｄｉｓｈに調整したネズミマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞を実施例２に記載した条件下で２４時間培養し、次いで本発明のマクロラクチン化合物とＬＰＳ（０．１μｇ／ｍＬ、シグマ社製）で処理した後、１６時間さらに培養した。細胞を冷却したＰＢＳで２〜３回洗浄し、次いで採取した。採取した細胞に５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５（０．１ＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのＰＭＳＦ）１００μＬを添加して、液体窒素を使用して溶解した。この溶解物を４℃で１０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離して上清を採取した。タンパク質はＢｒａｄｆｏｒｄ法で定量分析した。５０μｇのタンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを電圧５０Ｖで２時間、ニトロセルロース膜（Amersham社製）に転写した。１×トリス緩衝食塩液（ＴＢＳ；０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ）でニトロセルロース膜を２回洗浄し、そこに非特異的タンパク質反応を遮断するために３％ゼラチン溶液を添加し、次いで室温で１時間反応した。３％ゼラチン溶液を除去した後、１×トリス緩衝食塩液−Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳ−Ｔ；０．１ＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）をそこに添加した。ｉＮＯＳとＣＯＸ−２のタンパク質発現を調べるために、抗マウス（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ）ｉＮＯＳ（Cell Signaling社製）、抗マウス（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ）ＣＯＸ−２（Cell Signaling社製）、及び抗マウス（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ）ＧＡＰＤＨ（Cell Signaling社製）を、１×ＴＢＳ−Ｔで１：１０００に希釈して室温で１時間反応した。反応物を１×ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄し、次いで第２次抗体アルカリホスファターゼを結合した抗ウサギ（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ）ＩｇＧ（Sigma社製）と反応して、１×ＴＢＳ−Ｔで、１：５０００の比に１時間かけて希釈した。反応物を１×ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄して、抗体に対応するタンパク質バンドをＢＣＩＰ／ＮＢＴ Ｃｏｌｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム、Promega社製）を用いて同定した。
【００６９】
その結果、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの全てが、ｉＮＯＳとＣＯＸ−２タンパク質の形成を強力に阻害して、阻害活性はヒドロコルチゾンのそれと類似していたか、または匹敵していた（図１０を参照されたい）。
【００７０】
実験例５：細胞毒性に対する効果
本発明のマクロラクチン化合物のネズミマクロファージＲＡＷ２６４．７に対する細胞毒性効果を調べるために、ＭＴＴ分析法を使用した。４×１０４細胞／ウェルに調整した細胞を９６ウェルプレートで、実施例２に記載した条件下で２４時間培養し、次いで本発明のマクロラクチン化合物で処理した後、さらに１６時間培養した。培地を除去した後、ＭＴＴ溶液（２ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ）１００μＬを添加し、次いで混合物を３７℃、５％ＣＯ２恒温器で４時間培養した。ＭＴＴ溶液を除去した後、ＤＭＳＯ１００μＬを添加し、次いで混合物を３０分間、暗所でしん盪培養した。培養後、遊離ホルマザンの量を５４０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダを使用して測定した。
【００７１】
その結果、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡは全て、ヒドロコルチゾンのそれと比較して、より低い細胞毒性を有していたことが確認された（図１１を参照されたい）。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、バチルス・ポリファーメンチカス ＫＪＳ−２（Bacillus polyfermenticus KJS-2（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ））株から生産する、３種類のマクロラクチン化合物、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡを提供する。炎症媒介因子の形成に関連するタンパク質である誘導型酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）及びシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現及び形成を直接的に抑制して、その代謝産物であるＮＯ及びＰＧＥ２の形成を阻害するので、これらは代謝産物の過剰生成に起因する様々な疾患（例、炎症疾患）を予防及び治療するために使用できる。また、マクロラクチン化合物は従来の抗炎症剤のそれと比べて低い細胞毒性を有している。従って、本発明のマクロラクチン化合物は、従来の抗炎症剤に起因する副作用の問題を解消できると期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２（Bacillus Polyfermenticus KJS-2,；ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）から生産されるマクロラクチンＡ（以下、「ＭＡ」と称す）、７−Ｏ−マロニルマクロラクチンＡ（以下、「ＭＭＡ」と称す）及び７−Ｏ−スクシニルマクロラクチンＡ（以下、「ＳＭＡ」と称す）などのマクロラクチン化合物の抗炎症的使用に関する。具体的には、本発明は、誘導型酸化窒素合成酵素（以下、「ｉＮＯＳ」と称す）、シクロオキシゲナーゼ−２（以下、「ＣＯＸ−２」と称す）、及び炎症促進性サイトカインである腫瘍壊死因子−α（以下、「ＴＮＦ−α」と称す）、インターロイキン−１β（以下、「ＩＬ−１β」と称す）、インターロイキン−６（以下、「ＩＬ−６」と称す）及び顆粒球マクロファージコロニー−刺激因子（以下、「ＧＭ−ＣＳＦ」と称す）の形成を抑制することによって、優れた抗炎症活性を有する前記マクロラクチン化合物の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マクロラクチン化合物は、２４−員ラクトン環を有するマクロライド系抗生物質である（非特許文献１）。前記化合物は分類されていない海洋バクテリア、放線菌、及びバチルス菌株から生産されると報告されており、２１種類が同定されている。これらのマクロラクチン化合物は様々な薬理活性を有している。マクロラクチン化合物の薬理活性に対する先の研究は以下の通りである。
【０００３】
１９８９年、Willam Fenical は、単純ヘルペスウイルスとＨＩＶに対するＭＡの抗ウイルス活性を開示した。１９９７年、Ick-Dong Yooは、アクチノマヅラ属（Actinomadura sp.）株からＭＡを得て、ＭＡを用いてグルタメート（glutamate）に由来する神経細胞の保護に関する研究を行った。２００１年に、Hiroshi Sano は、バチルス属（Bacillus sp.）ＰＰ１９−Ｈ３株からＭＡを単離して、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＩＦＯ１２７３２とバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）ＩＦＯ３１３４株に対するＭＡの抗菌活性をに関する研究を行った。２００３年、Sung-Won Choi はストレプトミセス属（Streptomyces sp.）ＹＢ−４０１株からＭＡを得て、コレステロール生合成に対するＭＡの阻害効果を開示した。２００４年には、Keun-Hyung Park は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）ＣＨＯ１０４株からＭＡを分離して、黄色ブドウ球菌ＫＣＴＣ１９２８、エシュリキア・コリＫＣＴＣ２５９３、及びボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）に対するＭＡの抗菌活性を研究した。２００５年には、Joo-Won Suh はバチルス属ｓｕｎｈｕａ株からＭＡを得て、ＭＡを用いてジャガイモそうか病を誘発するストレプトミセス疥癬(scabies)の阻害を研究した。２００６年に、Gabriella Molinari はバチルス・ズブティリス（Bacillus subtilis）ＤＳＭ１６６９６株からＭＡ、ＭＭＡ、及びＳＭＡを単離して、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）（vancomycim-resistant Enterococci）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)、及び バーク（バルク）ホルデリア・セパシア （Burkholderia cepacia）に対するそれぞれの化合物の抗菌活性を研究した。この研究では、ＭＭＡとＳＭＡは試験菌に対する優れた抗菌活性を有していた反面、ＭＡは単に、ＭＲＳＡに対してのみ抗菌活性を示したことが報告された。
【０００４】
マクロラクチン化合物は様々な薬理活性を有しているが、マクロラクチン化合物の抗炎症活性に関する研究は現在まで全く報告されていない。
【０００５】
炎症は、生体の患部に生じた損傷に対する防御的応答である。即ち、炎症応答は、有害な刺激に応答して、刺激による損傷を除去することによって元の状態に回復しようという防御的応答である。
【０００６】
炎症を誘発する物質の一つである酸化窒素（以下、「ＮＯ」と称す）は、正常状態では内皮細胞やマクロファージで生産される。血管拡張、血小板接着及び凝集、神経伝達、消化器系の運動、勃起などに関与する媒介物質であるＮＯは、炎症細胞及び非免疫細胞で生成され、微生物感染に対する防御作用も果たす。リポ多糖体（以下、「ＬＰＳ」と称す）、炎症誘発因子及び放射線照射などに起因する刺激は、特に、細胞内のｉＮＯＳタンパク質の発現を誘導し、ＮＯを継続生成して、炎症疾患を誘発する。
【０００７】
別の炎症誘発物質であるプロスタグランジンＥ２（以下、「ＰＧＥ２」と称す）は、アラキドン酸由来のホルモンの一種であり、様々な生理活性に関与する。ＰＧＥ２はＣＯＸ−２タンパク質の発現により生成される。ＣＯＸ−２の発現を抑制する薬物は、炎症病巣におけるＰＧＥ２生成の阻害によって、鎮痛、抗浮腫、解熱、抗炎症及び抗凝固活性を有するので、これらは血栓、浮腫、梗塞、発作及び脳血管疾患の予防及び治療に使用できる。
【０００８】
前記２種類の炎症誘発物質であるｉＮＯＳとＣＯＸ−２は、互いに密接に関連している。例えば、過剰に生成されたＮＯは、ＣＯＸ−２の発現に影響を与えることがある。従って、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２活性の阻害剤は、ＮＯ及びＰＧＥ２代謝産物の過剰生成に起因する様々な疾患（例えば、炎症疾患）を予防または治療する薬物として開発するための高い可能性を有すると考えられている。
【０００９】
現在まで、ステロイド及び非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）は、急性及び慢性炎症疾患の治療に適宜使用されてきた。しかし、従来の抗炎症剤は、特に長期間使用すると、かなりの副作用をもたらす。従って、副作用が殆ど無い新しい抗炎症剤を開発することが切に求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc., 1989,111, 7519-7524
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来の抗炎症剤の上記問題点を考慮した、本発明の目的は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株から生産される、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡのようなマクロラクチン化合物の抗炎症的使用を提供することである。特に本発明は、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２の形成を阻害することによって優れた抗炎症活性を有するマクロラクチン化合物の使用を提供する。
【００１２】
また、本発明の目的は、前記マクロラクチン化合物を有効成分として含有する、炎症疾患の予防及び治療のための医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様では、本発明は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株から生産される式（１）のＭＡ、式（２）のＭＭＡ及び式（３）のＳＭＡの抗炎症的使用を提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡのような前記マクロラクチン化合物のｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２タンパク質、及び炎症性サイトカインの形成を阻害するための抗炎症的使用を提供する。
【００１５】
更に別の態様では、本発明は、前記マクロラクチン化合物を含有する炎症疾患の予防及び治療のための医薬組成物を提供する。
【００１６】
【化１】
【００１７】
【化２】
【００１８】
【化３】
【００１９】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
【００２０】
式（１）のＭＡと式（２）のＭＭＡを得るために、本発明者らによって分離されたバチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株を、ＭＡ培地中で発酵する。発酵液を酢酸エチルで抽出して、抽出液を濃縮する。実施例１の方法に従って、目的の生成物を分離して、精製する。
【００２１】
式（３）のＳＭＡを得るために、前記株を、ＨＰ−２０樹脂を含むトリプトソイ（ＴＳＢ）培地で発酵する。実施例１の方法に従って、目的の生成物を分離して、精製する。
【００２２】
精製した生成物の構造を、ＬＣ／Ｍａｓｓと核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって解析した。
【００２３】
前記マクロラクチン化合物、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの抗炎症効果についての研究は、現在まで報告されていない。
【００２４】
本発明者らは、前記マクロラクチン化合物の抗炎症効果を確認して、本発明を完成させた。抗炎症効果を調べるために、精製したそれぞれの化合物で処理したマウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞株をＬＰＳ（０．１μｇ／ｍＬ又は１．０μｇ／ｍＬ、シグマ社製）で刺激し、次いで炎症誘発物質である、１）ＮＯと２）ＰＧＥ２の形成及びそれらの形成に関連する酵素の発現を分析した。同様の方法で、３）炎症促進性サイトカイン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＧＭ−ＣＳＦの形成も分析した。
【００２５】
１）ＮＯ形成の抑制は、グリース反応（Griess recation）によって確認した。その結果、ＬＰＳ単独で処理した対照群に比べて、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡ全てがＮＯ形成を強力に阻害することを確認した。マクロラクチン化合物のＮＯ形成における阻害効果は、特にヒドロコルチゾン（hydrocortisone）のそれに匹敵していたか、または優れていた。
【００２６】
ＮＯ形成はｉＮＯＳタンパク質と関連している。ｉＮＯＳ活性が誘発されると、長時間にわたって多量のＮＯが形成される。ＮＯは、病理的な血管拡張、細胞毒性、組織損傷などの生体系に対する副作用が知られていて、且つ炎症状態では血管透過性、浮腫などの炎症応答を促進させ、炎症媒介因子の生合成を促進して炎症を深刻化することも知られている。
【００２７】
ＮＯ形成を抑制する作用機構を調べるために、それぞれのマクロラクチン化合物で処理したマウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７をＬＰＳで刺激してｉＮＯＳの形成を誘導した後、各化合物におけるｉＮＯＳ形成の抑制程度をリアルタイムＰＣＲ及びウェスタンブロットによって確認した。
【００２８】
その結果、リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現において、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの全てがｉＮＯＳ ｍＲＮＡの発現を強力に抑制して、その抑制効果はヒドロコルチゾンのそれに匹敵していたか、または優れていた。ウェスタンブロット法により確認したタンパク質発現レベルでも、本発明のマクロラクチン化合物はＬＰＳ単独で処理した対照群に比べて、強い抑制効果を示した。
【００２９】
前記結果から、本発明のマクロラクチン化合物は、ｉＮＯＳタンパク質の発現を抑制する作用によって、ＮＯ形成を抑制すると考えられる。
【００３０】
２）別の炎症媒介因子であるＰＧＥ２の抑制を、酵素免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）キットを用いて確認した。その結果、ＬＰＳ単独で処理した対照群に比べてＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの全てがＰＧＥ２の形成を強力に阻害することを確認した。特に、マクロラクチン化合物のＰＧＥ２形成の阻害効果はヒドロコルチゾンのそれに匹敵していたか、または優れていた。多くの抗炎症薬物はＰＧＥ２合成を抑制する作用機構を有しており、これはＣＯＸ−２タンパク質の形成及び活性を阻害することに起因している。ＣＯＸ−２によって合成されたＰＧＥ２は炎症応答を媒介する。ＣＯＸ−２タンパク質により生成されたＰＧＥ２は炎症応答、免疫応答、及び脈管形成を刺激して、癌の発生にも関与していることが知られている。ＰＧＥ２合成の抑制とＣＯＸ−２タンパク質合成の抑制との関連性を調べるために、それぞれのマクロラクチン化合物で処理したマウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７をＬＰＳで刺激してＣＯＸ−２形成を誘導した後、各化合物におけるＣＯＸ−２タンパク質形成の抑制程度をリアルタイムＰＣＲ及びウェスタンブロットによって確認した。その結果、本発明のマクロラクチン化合物はＣＯＸ−２ｍＲＮＡの発現を強く抑制し、その抑制活性はヒドロコルチゾンのそれに匹敵していたか、または優れていた。ウェスタンブロットで確認したＣＯＸ−２タンパク質の発現においても、本発明のマクロラクチン化合物はＬＰＳ単独で処理した対照群に比べて強い抑制効果を示した。
【００３１】
前記結果により、本発明のマクロラクチン化合物は、ＣＯＸ−２タンパク質の発現を抑制することによって、ＰＧＥ２形成を強力に阻害すると考えられる。
【００３２】
上記の結果から、本発明のマクロラクチン化合物は、ｉＮＯＳとＣＯＸ−２タンパク質の形成を抑制する作用によって、ＮＯとＰＧＥ２の形成を強力に阻害したことを確認した。
【００３３】
３）本発明のマクロラクチン化合物による炎症促進性サイトカインの抑制を、マウス ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（KOMA Biotech社製）を用いて確認した。
【００３４】
ＴＮＦ−α測定の結果、ＬＰＳ単独で処理した対照群に比べて、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの全てがＴＮＦ−αの形成を阻害した。また、マクロラクチン化合物のＴＮＦ−αの形成に対する阻害効果はヒドロコルチゾンのそれに匹敵していたか、または優れていた。特に、ＭＡは他の対照物質と比較して優れたＴＮＦ−α形成の阻害効果を有している。
【００３５】
ＩＬ−１β測定の結果、ＭＡとＳＭＡのそれぞれがＩＬ−１βの形成を強力に阻害して、特に、マクロラクチン化合物のＩＬ−１β形成に対する阻害効果はヒドロコルチゾンのそれに匹敵していたか、または、優れていたと確認された。
【００３６】
ＩＬ−６測定の結果、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの全てはＩＬ−６の形成を強力に阻害したことを確認した。マクロラクチン化合物のＩＬ−１β形成に対する阻害効果はヒドロコルチゾンのそれより優れてはいなかった。
【００３７】
ＧＭ−ＣＳＦ測定の結果、ＭＡとＳＭＡのそれぞれがＧＭ−ＣＳＦの形成を強力に阻害したことを確認した。マクロラクチン化合物のＧＭ−ＣＳＦ形成に対する阻害効果はヒドロコルチゾンのそれより優れていた。
【００３８】
前記結果により、本発明のマクロラクチン化合物は、急性炎症と慢性炎症の両方に関与している炎症促進性サイトカインを強力に阻害すると考えられる。
【００３９】
また、本発明のマクロラクチン化合物と、抗炎症剤として一般的に用いられているヒドロコルチゾンがマウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７に及ぼす細胞毒性を チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（以下、「ＭＴＴ」と称す）分析によって確認した。その結果、本発明のマクロラクチン化合物の細胞毒性はヒドロコルチゾンのそれより低かった。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株の発酵液抽出物のＭＰＬＣクロマトグラム（MPLC chromatgram）である。
【図２】図２は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株の培養液抽出物のＭＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】図３は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株により生産されたマクロラクチンＡのＬＣ／Ｍａｓｓ分析の結果であり、ａ）２６２ｎｍで測定したＬＣクロマトグラム、ｂ）紫外線スペクトル、そしてｃ）エレクトロスプレーイオン化スペクトル（ＥＳＩ−スペクトル）である。
【図４】図４は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株により生産された７−Ｏ−マロニルマクロラクチンＡのＬＣ／Ｍａｓｓ分析の結果であり、ａ）２６２ｎｍで測定したＬＣクロマトグラム、ｂ）紫外線スペクトル、そしてｃ）ＥＳＩ−スペクトルである。
【図５】図５は、バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株により生産された７−Ｏ−スクシニルマクロラクチンＡのＬＣ／Ｍａｓｓ分析の結果であり、ａ）２６２ｎｍで測定したＬＣクロマトグラム、ｂ）紫外線スペクトル、ｃ）ＥＳＩ−スペクトルである。
【図６】図６は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＮＯ形成に対する阻害効果を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＰＧＥ２形成に対する阻害効果を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるｉＮＯＳｍＲＮＡ発現に対する阻害効果を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＯＸ−２ｍＲＮＡ発現に対する阻害効果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるｉＮＯＳとＣＯＸ−２タンパク質生成に対する阻害効果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞における細胞毒性を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＴＮＦ−α形成に対する阻害効果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＩＬ−１β形成に対する阻害効果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＩＬ−６形成に対する阻害効果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明のマクロラクチン化合物によるＲＡＷ２６４．７細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ形成に対する阻害効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下の実施例により本発明をより詳細にに説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を説明することのみを目的としていて、本発明の範囲はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４２】
実施例１：バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株からのマクロラクチンＡ、７−Ｏ−マロニルマクロラクチンＡ、及び７−Ｏ−スクシニルマクロラクチンＡの生産、分離及びそれらの構造解析
【００４３】
［工程１：バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株からのマクロラクチンＡ及び７−Ｏ−マロニルマクロラクチンＡの生産及びそれらの分離］
ＭＡとＭＭＡを得るために、本発明者により単離されたバチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株を用いる発酵工程を、ＭＡ培地中で実施した。
【００４４】
ＭＡ培地の組成は次の通りである。
栄養培養液（Nutrient broth）（Difco社製）１６ｇ／Ｌ、
スキムミルク１０ｇ／Ｌ、
２．５μＭのＦｅＳＯ４、
５００μＭのＣａＣｌ２、
１ｍＭのＭｇＳＯ４、
１３ｍＭのＫＣｌ．
【００４５】
発酵工程は、空気流入量０．１４３ｖｖｍ、回転数２００ｒｐｍ、温度３０℃、及び１ＮのＨＣｌと３ＮのＮａＯＨでｐＨ６．８に保持した条件下で実施した。発酵液を酢酸エチルで抽出した後、濃縮した。濃縮液をメタノールに溶解して、中圧液体クロマトグラフィー（以下、ＭＰＬＣと称す）用の試料を作成した。Ｂｕｃｈｉ ＭＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｕｃｈｉ ｐｕｍｐ Ｃ−６０５、ｃｏｌｕｍｎ１．５×２３ｃｍ、Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ Ｂｕｃｈｉ Ｃ−６６０）を使用して、カラム内にはＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ Ｃ−１８（４０〜６３μｍ、メルク社製）を充填した。２６２ｎｍで検出を行い、移動相は流速１５ｍＬ／ｍｉｎの４０％アセトニトリルである。発酵液抽出物をＭＰＬＣカラム内に注入した後、図１に記載の第１のピークと第２のピークに該当する画分を濃縮して、次の分析のための試料を作成した。
【００４６】
［工程２：バチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株からの７−Ｏ−スクシニルマクロラクチンＡの生産及びその分離］
本発明者らによって単離されたバチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株をＨＰ−２０樹脂（三菱化学社製）１０％を含むトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）培地に接種して、３０℃、２００ｒｐｍで２．５日間培養した。培養後、ＨＰ−２０樹脂を回収し、水で洗浄した。メタノールを用いて結合した物質を溶出した。メタノール溶出液を濃縮して、ＭＰＬＣ用の試料を作成した。
【００４７】
ＭＰＬＣの操作条件は前述と同様であった。図２に示されているピークに該当する画分を濃縮して、次の分析のための試料を作成した。
【００４８】
［工程３：分析の条件及び構造の解明］
工程１及び２で精製した各物質を下記の装置及び条件で分析した。Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８カラム（粒径５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）を備えたアジレント（agilent）１１００シリーズＬＣ／Ｍａｓｓを用いて質量分析を行った。ＬＣの移動相は、アセトニトリルと０．１％ギ酸含有水であり、ＬＣ分析条件は、流速１ｍＬ／分で２０分間、アセトニトリル０％から１００％の勾配溶媒を用いて、２６２ｎｍで検出した。質量分析の条件は、乾燥ガス流１３Ｌ／分、蒸気圧５０ｐｓｉ、及び乾燥ガス温度３５０℃を用いるＡＰ−ＥＳＩ（Atmosphere pressure-Electro spray ionization）モードであった。毛細管電圧はカチオンモードで４０００Ｖ、アニオンモードで３５００Ｖであり、質量範囲は１００ｍ／ｚ〜１０００ｍ／ｚであり、そしてフラグメント電圧（fragment voltage）１５０Ｖであった。前記条件下で工程１及び２で精製した各物質を分析して、図３、４及び５にその結果を示した。各化合物の質量分析の結果は以下の通りでる。
【００４９】
図１、第１の画分は、［Ｍ＋Ｎａ］＋４２５．４ｍ／ｚ、［Ｍ＋Ｋ］＋４４１．４ｍ／ｚ、最大吸光度（λｍａｘ）２６２ｎｍ、純度９８．３％であると、そして第２の画分は［Ｍ＋Ｎａ］＋５１１．７ｍ／ｚ、最大吸光度（λｍａｘ)２５８ｎｍ、純度８４．８８％であると確認した。図２の画分は、［Ｍ＋Ｎａ］＋５２６．０ｍ／ｚ、［Ｍ−Ｈ］−５０２．０ｍ／ｚ、最大吸光度（λｍａｘ）２５８ｎｍ、純度９７．０２％であると確認した。
【００５０】
精製したそれぞれの物質の約３０ｍｇをＤＭＳＯ−ｄ６溶液に溶解した後、ＮＭＲ分析によってそれらの化学構造を特定した。特定するために、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ−９０、ＤＥＰＴ−１３５、Ｈｏｍｏ ＣＯＺＹ、ＨＭＱＣ、及びＨＭＢＣなどの多種のＮＭＲ技術を用い、そして１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの問題を解決するために、プロトンデカップリング方法も用いた。
【００５１】
ＮＭＲ分析の結果、図１及び図３の第１画分はＭＡと同定された。その結果を表１及び表４に示す。旋光計（ポラックス−Ｄ、アタゴ社製）で測定した物質の比旋光度は、１７℃で、−１０（ｃ＝４．０、メタノール）であり、これにより物質が式（１）と同じ化合物、ＭＡであることを確認した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
ＮＭＲ分析の結果、図１及び図４の第２の画分はＭＭＡと同定された。その結果を表２及び表４に示す。旋光計（ポラックス−Ｄ、アタゴ社製）で測定した物質の比旋光度は１７℃で−５(ｃ＝４．０、メタノール）であり、これにより物質が式（２）と同じ化合物、ＭＭＡであることを確認した。
【００５４】
【表２】
【００５５】
ＮＭＲ分析の結果、図２及び図４の画分はＳＭＡと同定された。その結果を表３及び表４に示す。旋光計（ポラックス−Ｄ、アタゴ社製）で測定した物質の比旋光度は１７℃で−１５(ｃ＝４．０、メタノール）であり、これにより物質が式（３）と同じ化合物、ＳＭＡであることを確認した。
【００５６】
【表３】
【００５７】
表４は、本発明で調査したバチルス・ポリファーメンチカスＫＪＳ−２株から生産したＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの生産方法、収率、純度及び特性を示す（表４に記載した）。
【００５８】
【表４】
【００５９】
実施例２：ネズミのマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞株に対するマクロラクチン化合物の抗炎症活性の検討
ネズミマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７は、韓国細胞株銀行(Korean Cell Line Bank；ＫＣＬＢ)から入手した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；LONZA社製）と１％ペニシリン／ストレプトマイシン(Sigma社製）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；LONZA社製）中、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で培養して、細胞密度が８０％に達したときに、継代培養を行った。ＲＡＷ２６４．７細胞を２４時間培養した後、ＭＡ（１〜１００μＭ）、ＭＭＡ（１０μＭ）、ＳＭＡ（１０μＭ）及び抗炎症活性を有している公知物質である、ヒドロコルチゾン（１０μＭ）を加えた。添加の１時間後に、ＬＰＳ（０．１又は１．０μｍ／ｍＬ、シグマ社製）を混合物に加え、次いで８時間又は１６時間培養した。陰性対照としてジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」）を使用し、陽性対照としてマクロラクチン化合物を添加しない状態のＬＰＳ（０．１又は１．０μｍ／ｍＬ、シグマ社製）を使用した。
【００６０】
実験例１：ＮＯ形成に対する阻害効果
細胞培養液内のＮＯの濃度は、硝酸／亜硝酸比色アッセイキット（Cayman社製）を使用して測定した。１×１０５細胞／ウェルに調整したネズミマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞を、６ウェルプレート中、実施例２に記載した条件下で２４時間培養して、本発明のマクロラクチン化合物とＬＰＳ（０．１μｇ／ｍＬ、シグマ社製）で処理した後、１６時間さらに培養した。培養培地を製造会社から提供された９６ウェルプレート中でグリース試薬Ｒ１（スルファニルアミド）で、次いでグリース試薬Ｒ２（Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンジアミン）で処理し、次いで亜硝酸塩からの紫色のアゾ基の形成を検出した。製造会社から提供された標準溶液によってＵＶスペクトルメータにおける５４０ｎｍの吸光度で作成した検量線を用いて、ＮＯ生成量を算出した。
【００６１】
その結果、ＭＡとヒドロコルチゾンの両方がＮＯ形成を強力に阻害したのに対して、ＭＭＡとＳＭＡは低い阻害活性を示した（図６を参照されたい）。
【００６２】
実験例２：ＰＧＥ２形成に対する阻害効果
細胞内の炎症性因子である、ＰＧＥ２の形成量は、アマシャムプロスタグランジンＥ２ ｂｉｏｔｒａｋ エンザイムイムノアッセイ（Amersham prostaglandin E2 biotrak Enzymeimmunoassay；ＥＩＡ）システムキット（GE Healthcare社製）を用いて測定した。９６ウェルプレート中、２×１０４細胞／ウェルに調整したネズミマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞を、実施例２に記載した条件下で２４時間培養し、次いで、本発明のマクロラクチン化合物とＬＰＳ（０．１μｇ／ｍＬ、Sigma社製）で処理した後、１６時間さらに培養した。製造会社から提供された標準溶液によって、ＵＶスペクトルメータにおける４５０ｎｍの吸光度で作成した検量線を用いて、ＰＧＥ２生成量を算出した。標準物質に対する検量線のｒ２値は０.９９以上であった。
【００６３】
その結果、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡは全て、ＰＧＥ２形成を強力に阻害しており、阻害活性はヒドロコルチゾンのそれと類似していたか、または匹敵していた（図７を参照されたい）。
【００６４】
実験例３：ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２ｍＲＮＡの発現に対する効果
細胞内の炎症性因子である、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２ｍＲＮＡの発現に対する本発明のマクロラクチン化合物の効果を検討した。６ウェルプレート中、１Ｘ１０５細胞／ウェルに調整したネズミマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞を、実施例２に記載した条件下で２４時間培養し、次いで本発明のマクロラクチン化合物とＬＰＳ（０．１μｇ／ｍＬ、シグマ社製）で処理した後、１６時間さらに培養した。培養細胞の全てのＲＮＡをＲＮａｓｅ無しの条件下でＴｒｉｚｏｌ試薬（シグマ社製）によって単離した。分離した全てのＲＮＡを用いるＰＣＲ用のテンプレートを得るために、ｃＤＮＡ合成キット（タカラ社製）を使用した。Ｏｌｉｇｏ ｄＴ Ｐｒｉｍｅｒ（５０μＭ）１μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（それぞれ１０ｍＭ）１μＬ、及びテンプレートＲＮＡ２μｇの混合物にＲＮａｓｅを含んでいないｄＨ２Ｏを添加して、総体積を１０μＬに調整した。混合物を６５℃に５分間、次いで氷に入れて２分間保持した。混合液１０μＬ、５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）緩衝液４μＬ、ＲＮａｓｅ阻害剤（４０Ｕ／μＬ）０．５μＬ、及びＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴａｓｅ（２００Ｕ／μＬ）０．５μＬの混合物にＲＮａｓｅを含まないｄＨ２Ｏを加えて総体積を２０μＬに調整した。混合物を４２℃で３０分間反応してｃＤＮＡを合成した。
【００６５】
合成したｃＤＮＡ２５〜５０ｎｇ、ｓｅｎｓｉＭｉｘＰｌｕｓ ＳＹＢＲ ２Ｘ緩衝液（Quantance社製）５μＬ、表５に示したプライマーをそれぞれ０．２５ｐｍｏｌの混合物に蒸留水を加えて総体積を１０μＬに調整した。混合物のｉＮＯＳとＣＯＸ−２ｍＲＮＡ発現の程度を、リアルタイム遺伝子増幅器（Corbett life science Rotor-gene 6000）を使用して測定した。リアルタイム遺伝子増幅器の操作条件は次の通りである。初期変性は９５℃で５分間から始めて、９４℃で３０秒、５７℃で３０秒、そして７２℃で３０秒間５０回繰り返した。試料のｍＲＮＡ発現を互いに比較する時は、ハウスキーピング遺伝子も同時に測定して相対量を求めた。ハウスキーピング遺伝子の測定値で、ＲＮＡ量を補正することによって各試料のｍＲＮＡ生成量をＣｔ（Threshold cycle）値で算出した。
【００６６】
その結果、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡは全て、ｉＮＯＳとＣＯＸ−２ｍＲＮＡ発現を強力に阻害して、阻害活性はヒドロコルチゾンのそれと類似していたか、または匹敵していた（図８及び図９を参照されたい）。
【００６７】
【表５】
【００６８】
実験例４：ｉＮＯＳとＣＯＸ−２タンパク質形成に対する効果
細胞内の炎症性因子である、ｉＮＯＳとＣＯＸ−２タンパク質形成に対する、本発明のマクロラクチン化合物の効果を検討した。１００ｍｍｄｉｓｈ中、１×１０６細胞／ｄｉｓｈに調整したネズミマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞を実施例２に記載した条件下で２４時間培養し、次いで本発明のマクロラクチン化合物とＬＰＳ（０．１μｇ／ｍＬ、シグマ社製）で処理した後、１６時間さらに培養した。細胞を冷却したＰＢＳで２〜３回洗浄し、次いで採取した。採取した細胞に５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５（０．１ＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのＰＭＳＦ）１００μＬを添加して、液体窒素を使用して溶解した。この溶解物を４℃で１０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離して上清を採取した。タンパク質はＢｒａｄｆｏｒｄ法で定量分析した。５０μｇのタンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを電圧５０Ｖで２時間、ニトロセルロース膜（Amersham社製）に転写した。１×トリス緩衝食塩液（ＴＢＳ；０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ）でニトロセルロース膜を２回洗浄し、そこに非特異的タンパク質反応を遮断するために３％ゼラチン溶液を添加し、次いで室温で１時間反応した。３％ゼラチン溶液を除去した後、１×トリス緩衝食塩液−Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳ−Ｔ；０．１ＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）をそこに添加した。ｉＮＯＳとＣＯＸ−２のタンパク質発現を調べるために、抗マウス（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ）ｉＮＯＳ（Cell Signaling社製）、抗マウス（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ）ＣＯＸ−２（Cell Signaling社製）、及び抗マウス（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ）ＧＡＰＤＨ（Cell Signaling社製）を、１×ＴＢＳ−Ｔで１：１０００に希釈して室温で１時間反応した。反応物を１×ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄し、次いで第２次抗体アルカリホスファターゼを結合した抗ウサギ（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ）ＩｇＧ（Sigma社製）と反応して、１×ＴＢＳ−Ｔで、１：５０００の比に１時間かけて希釈した。反応物を１×ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄して、抗体に対応するタンパク質バンドをＢＣＩＰ／ＮＢＴ Ｃｏｌｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム、Promega社製）を用いて同定した。
【００６９】
その結果、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡの全てが、ｉＮＯＳとＣＯＸ−２タンパク質の形成を強力に阻害して、阻害活性はヒドロコルチゾンのそれと類似していたか、または匹敵していた（図１０を参照されたい）。
【００７０】
実験例５：細胞毒性に対する効果
本発明のマクロラクチン化合物のネズミマクロファージＲＡＷ２６４．７に対する細胞毒性効果を調べるために、ＭＴＴ分析法を使用した。４×１０４細胞／ウェルに調整した細胞を９６ウェルプレートで、実施例２に記載した条件下で２４時間培養し、次いで本発明のマクロラクチン化合物で処理した後、さらに１６時間培養した。培地を除去した後、ＭＴＴ溶液（２ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ）１００μＬを添加し、次いで混合物を３７℃、５％ＣＯ２恒温器で４時間培養した。ＭＴＴ溶液を除去した後、ＤＭＳＯ１００μＬを添加し、次いで混合物を３０分間、暗所でしん盪培養した。培養後、遊離ホルマザンの量を５４０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダを使用して測定した。
【００７１】
その結果、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡは全て、ヒドロコルチゾンのそれと比較して、より低い細胞毒性を有していたことが確認された（図１１を参照されたい）。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、バチルス・ポリファーメンチカス ＫＪＳ−２（Bacillus polyfermenticus KJS-2（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ））株から生産する、３種類のマクロラクチン化合物、ＭＡ、ＭＭＡ及びＳＭＡを提供する。炎症媒介因子の形成に関連するタンパク質である誘導型酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）及びシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現及び形成を直接的に抑制して、その代謝産物であるＮＯ及びＰＧＥ２の形成を阻害するので、これらは代謝産物の過剰生成に起因する様々な疾患（例、炎症疾患）を予防及び治療するために使用できる。また、マクロラクチン化合物は従来の抗炎症剤のそれと比べて低い細胞毒性を有している。従って、本発明のマクロラクチン化合物は、従来の抗炎症剤に起因する副作用の問題を解消できると期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・ポリファーメンチカス ＫＪＳ−２（Bacillus polyfermenticus KJS-2, ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株から生産されるマクロラクチンＡを有効成分として含有してなる、抗炎症性組成物。
【請求項２】
バチルス・ポリファーメンチカス ＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株から生産される７−Ｏ−マロニルマクロラクチンＡを有効成分として含有してなる、抗炎症性組成物。
【請求項３】
バチルス・ポリファーメンチカス ＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株から生産される７−Ｏ−スクシニルマクロラクチンＡを有効成分として含有してなる抗炎症性組成物。
【請求項４】
抗炎症活性が、炎症媒介因子である酸化窒素（ＮＯ）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び顆粒球マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の形成の阻害に起因している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
抗炎症活性が、誘導型酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）及びシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性の阻害に起因している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１】
バチルス・ポリファーメンチカス ＫＪＳ−２（Bacillus polyfermenticus KJS-2, ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株から生産されるマクロラクチンＡを有効成分として含有してなる、抗炎症性組成物。
【請求項２】
バチルス・ポリファーメンチカス ＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株から生産される７−Ｏ−マロニルマクロラクチンＡを有効成分として含有してなる、抗炎症性組成物。
【請求項３】
バチルス・ポリファーメンチカス ＫＪＳ−２（ＫＣＣＭ１０７６９Ｐ）株から生産される７−Ｏ−スクシニルマクロラクチンＡを有効成分として含有してなる抗炎症性組成物。
【請求項４】
抗炎症活性が、炎症媒介因子である酸化窒素（ＮＯ）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び顆粒球マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の形成の阻害に起因している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
抗炎症活性が、誘導型酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）及びシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性の阻害に起因している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１２−５２７４５２（Ｐ２０１２−５２７４５２Ａ）
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１１７６８（Ｐ２０１２−５１１７６８）
【出願日】平成２２年５月２４日（２０１０．５．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００３２３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３４７９０
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５１１２８２４１６）ダエウー ファーマシューティカル インダストリー カンパニー リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＥＷＯＯ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＩＮＤ． ＣＯ．， ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月２４日（２０１０．５．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００３２３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３４７９０
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５１１２８２４１６）ダエウー ファーマシューティカル インダストリー カンパニー リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＥＷＯＯ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＩＮＤ． ＣＯ．， ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
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