グルコース、トリプトファン、インドール−３−乳酸、インドール−３−ピルビン酸および２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸より、モナチンまたはその塩を産生するために使用可能である方法および組成物を提供する。インドール−３−ピルビン酸および２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸中間体を産生するための方法も開示されている。提供される組成物には、核酸分子、ポリペプチド、化学構造物および細胞が含まれる。方法には、インビトロおよびインビボ工程が含まれ、インビトロ方法には、化学的反応が含まれる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
モナチンまたはその塩の製造方法であって、以下：
（ａ）培養培地中で微生物を培養するステップ、ここで、前記微生物は、アルドラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸、およびアミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含む；および
（ｂ）前記培養培地または前記培養微生物から、モナチンまたはその塩を抽出するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記アルドラーゼポリペプチドが、ＰｒｏＡアルドラーゼ（４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ、ＥＣ４．１．３．１７）およびＫＨＧアルドラーゼ（４−ヒドロキシ−２−オキソグルタレートグリオキシレート−リアーゼ、ＥＣ４．１．３．１６）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が、シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、シュードモナス・ストラミネア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒａｍｉｎｅａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地が、非イオン性界面活性剤、ペニシリン、ペニシリン誘導体、またはその組み合わせを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記非イオン性界面活性剤が、ツィーン、トリトンＸ−１００および酢酸ドデシルアンモニウムから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地が、５μｇ／Ｌ未満の濃度でビオチンを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ペニシリン誘導体が、アンピシリンである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）での培養培地のｐＨが、微生物を培養する前に、約ｐＨ７〜約ｐＨ８である、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養培地が、モラッセ、コーンスティープリカーまたはその組み合わせを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が大腸菌であり、前記培養培地が、Ｔｒｐ−１およびグルコース培地を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物が増殖のためにフェニルアラニンおよびチロシンを要求し、かつ前記培養培地がフェニルアラニンおよびチロシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物が、ａｓｐＣおよびｐｒｏＡ遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記コリネバクテリウム・グルタミカムが、グルタミン酸を製造しかつ分泌する、コリネバクテリウム・グルタミカム株である、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養培地が、非イオン性界面活性剤、ペニシリン、ペニシリン誘導体、またはその組み合わせを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
モナチンまたはその塩が、コリネバクテリウム・グルタミカムから分泌される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
モナチンまたはその塩の製造方法であって、以下：
（ａ）培養培地中で、コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０５８）を培養するステップ；および
（ｂ）前記培養培地または前記培養微生物から、モナチンまたはその塩を抽出するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１９】
前記培養培地が、ツィーン、ペニシリン、ペニシリン誘導体、またはその組み合わせを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養培地が、トリプトファン、ピルビン酸、非イオン性界面活性剤、ペニシリン、ペニシリン誘導体またはその組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記非イオン性界面活性剤が、ツィーンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記培養培地が、ピルビン酸、ツィーンおよびペニシリン誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
アミノトランスフェラーゼポリペプチドが、トリプトファンアミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．２７）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．１）、芳香族アミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．５）およびＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．２１）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記微生物が、モナチンまたはその塩を分泌する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記微生物が、発酵漕中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
アルドラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸と、アミノトランスフェラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含む微生物であって、前記核酸が、外来核酸、組換え体核酸およびその組み合わせから選択され、そしてモナチンまたはその塩を製造する、前記微生物。
【請求項２７】
前記アルドラーゼポリペプチドが、ＰｒｏＡアルドラーゼ（４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタレートアルドラーゼ、ＥＣ４．１．３．１７）およびＫＨＧアルドラーゼ（４−ヒドロキシ−２−オキソグルタレートグリオキシレート−リアーゼ、ＥＣ４．１．３．１６）から選択される、請求項２６に記載の微生物。
【請求項２８】
前記アミノトランスフェラーゼポリペプチドが、トリプトファンアミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．２７）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．１）、芳香族アミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．５）およびＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼポリペプチド（ＥＣ２．６．１．２１）から選択される、請求項２６に記載の微生物。
【請求項２９】
前記微生物が、ピルビン酸を過剰生産する、請求項２６に記載の微生物。
【請求項３０】
前記微生物が、チアミン栄養要求株である、請求項２９に記載の微生物。
【請求項３１】
前記微生物が、フェニルアラニンおよびチロシン栄養要求株である、請求項２６に記載の微生物。
【請求項３２】
前記微生物が、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、トリホスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、請求項２９に記載の微生物。
【請求項３３】
前記微生物が、リポ酸栄養要求株である、請求項２９に記載の微生物。
【請求項３４】
前記微生物が、ａｓｐＣおよびｐｒｏＡ遺伝子を含む、請求項３３に記載の微生物。
【請求項３５】
前記微生物が、ａｓｐＣおよびｐｒｏＡ遺伝子、および少なくとも１つのトリプトファンオペロン遺伝子を含む、請求項３３に記載の微生物。
【請求項３６】
前記微生物が大腸菌である、請求項３３に記載の微生物。
【請求項３７】
前記微生物が、不備Ｆ１^-ＡＴＰアーゼ遺伝子を含む、請求項２９に記載の微生物。
【請求項３８】
前記微生物が、内因性ｌｉｐＡ遺伝子における崩壊を含む、請求項３３に記載の微生物。
【請求項３９】
前記微生物が、トリプトファンを過剰生産する、請求項２６に記載の微生物。
【請求項４０】
前記微生物が、１つ以上のトリプトファン生合成遺伝子の、２以上のコピーを含む、請求項２６に記載の微生物。
【請求項４１】
前記微生物が、崩壊したｐｈｅＡ遺伝子を含む、請求項３９に記載の微生物。
【請求項４２】
前記微生物が、崩壊内因性トリプトファナーゼ（ｔｎａ）遺伝子を含む、請求項３９に記載の微生物。
【請求項４３】
前記微生物が、ｐｐｓＡ遺伝子を過剰発現する、請求項３９に記載の微生物。
【請求項４４】
前記微生物が、大腸菌またはコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項３９に記載の微生物。
【請求項４５】
前記微生物が、相当する対照微生物に比べて、多量の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘパチュロソニック７−リン酸（ＤＡＨＰ）シンターゼ活性を持つ、請求項４４に記載の微生物。
【請求項４６】
前記微生物が、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）シンターゼ活性を持つポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、前記核酸が、外来核酸、組換え体核酸およびその組み合わせから選択される、請求項２６に記載の微生物。
【請求項４７】
前記微生物がｔｋｔ遺伝子をさらに含む、請求項４６に記載の微生物。
【請求項４８】
前記微生物が、トリプトファナーゼ活性を持つポリペプチドをコードする外来核酸をさらに含む、請求項２６に記載の微生物。
【請求項４９】
前記微生物が、モナチンまたはその塩を分泌する、請求項２６に記載の微生物。
【請求項５０】
前記微生物が、脂肪酸栄養要求株である、請求項４９に記載の微生物。
【請求項５１】
前記微生物が、アルドラーゼを発現する核酸を含む細菌の株であり、核酸より発現する前記アルドラーゼが、立体異性体的に過剰のモナチンの混合物を製造することができる、請求項２６に記載の微生物。
【請求項５２】
前記立体異性体的に過剰のモナチンの混合物は、大部分が、Ｓ，Ｓモナチンまたはその塩である、請求項５１に記載の微生物。
【請求項５３】
前記立体異性体的に過剰のモナチンの混合物は、大部分が、Ｒ，Ｒモナチンまたはその塩である、請求項５１に記載の微生物。
【請求項５４】
前記微生物が、トリプトファン取り込みポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸を過剰発現する、請求項２６に記載の微生物。
【請求項５５】
モナチンまたはその塩の製造方法であって、以下：
（ａ）モナチンまたはその塩が製造される条件下で、培養培地中で、モナチンまたはその塩を製造する微生物を培養するステップ；および
（ｂ）培養培地または培養微生物から、モナチンまたはその塩を得るステップ、
を含む、前記方法。
【請求項５６】
前記微生物が、モナチンまたはその塩を分泌する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記微生物が、脂肪酸栄養要求株である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
モナチンまたはその塩を合成することができる細胞を同定するための方法であって、以下：
（ａ）モナチンまたはその塩、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸またはその塩、モナチンの類似体またはその塩、２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸の類似体またはその塩、およびその組み合わせから選択される、炭素／エネルギー供給源の存在下で、細胞を培養するステップ；および、
（ｂ）細胞の増殖に関して試験するステップ、ここで、細胞の増殖が、細胞が、炭素／エネルギー供給源をピルビン酸に変換することを示唆し、それによって、細胞が、モナチンまたはその塩を合成することができることを示唆する、
を含む、前記方法。
【請求項５９】
前記細胞がピルビン酸栄養要求株であり、そしてピルビン酸が、炭素／エネルギー供給源の代謝によって細胞内に製造される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞が、ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ遺伝子中での崩壊を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
モナチンまたはその塩、または２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケト−グルタル酸またはその塩、またはその組み合わせを、トリプトファンから合成することができる細胞を同定するための方法であって、以下：
（ａ）トリプトファンの不在下、およびモナチンまたはその塩、２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケト−グルタル酸またはその塩、またはその組み合わせの存在下、トリプトファン栄養要求株である細胞を培養するステップ；および
（ｂ）トリプトファン栄養要求株である細胞の増殖を試験するステップ、ここで、細胞の増殖が、細胞が、モナチンまたはその塩、２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケト−グルタル酸またはその塩、またはその組み合わせからトリプトファンを合成することを示唆し、それによって、細胞が、モナチンまたはその塩、２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケト−グルタル酸またはその塩、またはその組み合わせを、トリプトファンから合成することができることを示唆する、
を含む、前記方法。
【請求項６２】
モナチンまたはその塩の製造方法であって、以下：
（ａ）培養培地中で微生物を培養するステップ、ここで、前記微生物が、シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、シュードモナス・ストラミネア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒａｍｉｎｅａ）、およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）から選択される；および、
（ｂ）培養培地または培養微生物から、モナチンまたはその塩を抽出するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項６３】
前記微生物が遺伝的に改変されていない、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記培養培地がＰＨＢ培地を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記培養培地が、トリプトファン、ピルビン酸、非イオン性界面活性剤、ペニシリン、ペニシリン誘導体またはその組み合わせをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記微生物が、シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、またはコマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記微生物がコマモナス・テストステロニであり、そして前記培養培地がトリプトファンおよびピルビン酸をさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記培養培地がＴＹ培地を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
前記培養培地が、トリプトファン、ピルビン酸またはその組み合わせをさらに含む、請求項６８に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図８】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【公表番号】特表２００７−５０８８４０（Ｐ２００７−５０８８４０Ａ）
【公表日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３６７１４（Ｐ２００６−５３６７１４）
【出願日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３４５５８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４２７５６
【国際公開日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【出願人】（５０５０４００６２）カーギル，インコーポレイティド (23)
【Ｆターム（参考）】