ラテックスアレルギーの診断及び治療のための試薬、及びその調製方法
本発明は、ラテックスアレルギー又はフルーツアレルギーを診断及び／又は治療するための試薬、及び該試薬を調製する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラテックスアレルギー又はフルーツアレルギーの診断及び／又は治療のための試薬、及び該試薬の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然ゴムラテックス（ＮＲＬ）に対する1型アレルギーは、20世紀の最後の20年間に増大する健康問題として新たに発生し、その職業環境及び医療の安全性の双方に関して患者にとって甚大な結果をもたらしている。ラテックスの「感作」又は「感受性」とは、個体の血清中にラテックスアレルゲンに対する特異的ＩｇＥ抗体が存在することと定義される。ラテックス「アレルギー」とは、ラテックス又はラテックス製品と接触することによって、感作された個体内で即時型アレルギー症候群が惹起されることを意味する。
【０００３】
世界中の天然ゴムの大半は、ゴムの木であるＨｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓのラテックスから得られる。天然ゴムラテックスの組成は、かなり複雑であり、水、ゴム(シス-１，４-ポリイソプレン)、タンパク質、樹脂、糖類、灰分、及びステロール配糖体などの種々の物質を含む。工業ゴム製品として、新鮮なラテックスは、凝固を回避するため、最終濃度が２００ｍｍｏｌ/Ｌになるようにアンモニアと混合されるのであって、そのためにアンモニア処理ラテックス（ＡＮ）と称される。一方、非アンモニア処理ラテックス（ＮＡＬ）を高速遠心分離することによって、三つの異なるフラクションが得られる；即ち、（ｉ）上部における白色クリーム状層、（ｉｉ）主として液胞様ルトイド（ｖａｃｕｏｌｏ−ｌｉｋｅ ｌｕｔｏｉｄｓ）から成る下部分画（Ｂ−漿液）、及び（ｉｉｉ）ラテックス導管の細胞に由来する細胞質ゾルを含む、中間の黄色味がかったＣ−漿液である。
【０００４】
ＮＲＬに対する1型アレルギーの診断における第一段階は、ＮＲＬに対するアレルギー症状の広範な病歴を記録することである。第二段階においては、必要な種々の確認試験を行って感作状態を同定・確認する。最も一般的に用いられる確認試験は、皮膚プリック試験（ｓｋｉｎ ｐｒｉｃｋ ｔｅｓｔ）(ＳＰＴ)およびラテックス特異的ＩｇＥ抗体ための血清試験である。従って標準化されたＳＰＴ抽出物及びＩｇＥ測定・定量のための充分に特性化されたアレルゲン混合物とが、ラテックスアレルギーを診断するための重要な必要条件となる。
【０００５】
皮膚でのアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の検出は、迅速であり且つ感度が高いため魅力的な方法であって、皮膚内部又は個体体内において臨床上観察可能で且つ生物学的な関連応答を含む。１９９５年及び１９９６年に、カナダで製造された未加工ＡＬ製品を使用したＢｅｎｃａｒｄラテックス試薬を用いて皮膚プリック試験が行われた。研究者らは、喘息及びアレルギー診療科の入院患者においてラテックス皮膚試験陽性応答の内有病率が４．２％であること、及びＳＰＴ応答の大きさとラテックス誘発症状の重篤度との間に正の相関関係が成り立つことを報告している(参考文献２)。第Ｉ／ＩＩ相初期臨床試験において、三種のラテックス源候補物質―即ち、ＡＮ、ＮＡＬ及び粉末散布ラテックス手袋の抽出物―について、相対的な安全性及び診断の正確さが測定・決定された。その結果、ＮＡＬが、その安定性と品質管理の容易さの故に、更なる開発のための最も魅力的な候補ラテックスと報告された(参考文献３)。Ｅｂｏらは(Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ Ｎｏｖ；１００（５）：６１８−２３)、ＳＰＴを含む、ＩｇＥ抗体検出方法について比較検討を行った。 彼らは、ＮＡＬ抽出物（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐ社製）を用いたが、その感受性は６８％でありまた特異性は１００％であった。フィンランドにおける研究では、スタレルジーン（Ｓｔａｌｌｅｒｇｅｎｅｓ，Ｆｒｅｓｎｎｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）社のＮＡＬのラテックスＣ−漿液を使用したＳＰＴ試薬の診断性能が検討、調査された（参考文献４）。診断感受性は９３％であり、特異性は１００％であると報告された。これが、今日ヨーロッパにおいて入手可能である唯一規格化・標準化された市販天然ゴムラテックス抽出物である。多施設第ＩＩＩ相臨床試験が、治験用Ｇｒｅｅｒ試薬(Ｇｒｅｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｌｅｎｏｉｒ，ＮＣ)とＮＡＬを用いた抽出物について実施された (参考文献５)。この試験において、診断感受性は９５％であり、特異性は１００％であった。データの再分析を行った結果、Ｇｒｅｅｒ ＮＡＬ ＳＰＴ試薬の総合的な感受性は７０％乃至７５％に変わった（参考文献６）。
【０００６】
更には、利用可能なＮＡＬのＣ−漿液を使用したまた別のＳＰＴ抽出物が、ＡＬＫ−Ａｂｅｌｌｏ（Ｈｏｅｒｓｈｏｌｍ、デンマーク）から入手可能である。市販されている製品のほかに、皮膚診断試験を行うことを希望するアレルギー専門医は、手袋から独自の自家製ラテックス抽出物を調製することが可能であって、特に対応する医薬品承認機関(例えばＦＤＡ)によって承認された、規格・標準化されたラテックス皮膚試験試薬が全くない各国、例えば米国においてはそうである。
【０００７】
血清中の天然のラテックス特異的ＩｇＥのｉｎ ｖｉｔｒｏ測定法を行うため最も頻繁に用いられる方法は、放射標識アレルギー吸着定量測定法（Ｒａｄｉｏａｌｌｅｒｇｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ （ＲＡＳＴ））及びエリザ法（ＥＬＩＳＡ；酵素結合免疫吸着定量測定法）である。いくつかの放射標識アレルギー吸着試験薬が市販されている。天然ゴムラテックス特異的ＩｇＥ抗体の検出について、三種類のｉｎ ｖｉｔｒｏ定量測定法（ＤＰＣ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｌａｓｔａｔ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＣＡＰ ｓｙｓｔｅｍ ＦＥＩＡ、及びＨｙｃｏｒ ＨＹＴＥＣＨ）を比較検討した(参考文献７)。Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＣＡＰ Ｓｙｓｔｅｍ及びＤＰＣ’ｓ Ａｌａｓｔａｔのラテックス皮膚試験は、Ｇｒｅｅｒ実験用ラテックス試薬を用いたラテックス皮膚試験と比較した場合、それぞれ診断特異性は９７％であり又診断感受性は７６と７３％であった。これら定量測定法のいずれも、ラテックス感作症例の内のほぼ２５％をラテックス特異的ＩｇＥ抗体について擬陰性であると誤って分類した。性能に関するまた別の研究において、双方の定量測定法が示した診断感受性及び特異性は、上記の研究におけるものと同等であった（参考文献８）。第一の研究において、ＨＹＴＥＣＨアッセイは特異性７３％を示したが、このことが、皮膚試験と比較したときに２７％の擬陽性という結果を生み出したことを示している (参考文献７)。これまでに推測されてきたことは、ＣＡＰ及びＡｌａＳＴＡＴ定量測定法において診断感受性が低い理由は、これらの定量測定法で用いられたアレルゲン含有試薬においてアレルゲンが不十分に代表されたこと及び／又は変性を受けたことに関連づけられ得るとするものであった (参照非特許文献６)。天然ゴムラテックス全体に由来する試薬を用いた定量測定法の正確さと信頼性は、アレルゲンの利用可能性とアレルゲンがＩｇＥ抗体を基準として過剰モルで存在することに依存して異なる旨結論づけられている。
【０００８】
最も汎用されているＲＡＳＴキットは、恐らくＰｈａｒｍａｃｉａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製のラテックスＲＡＳＴ ｋ８２及びその酵素結合免疫吸着定量測定法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＣＡＰ ｓｙｓｔｅｍ）であろう。さらに新しいＰｈａｍａｃｉａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製のラテックスＲＡＳＴは、ｋ８２を使用したものであるが、組換え型Ｈｅｖ ｂ ５（ｒＨｅｖ ｂ ５）分子とスパイクする。さらに、組換え型ラテックスアレルゲンを用いたＲＡＳＴが入手可能である。組換え型 Ｈｅｖ ｂ １、２、３、６．０１、６．０２、８、９、及び１１は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質、又はＭＢＰを含まないｒ（組換え型）Ｈｅｖ ｂ ５との融合タンパク質として入手可能である。
【０００９】
２０００年にＹｉｐらは、組換え型ラテックスアレルゲンは臨床上反応性があり、標準化された方法で製造することが出来、潜在的にラテックスアレルギーの診断に感受性と特異性を有する試薬となり得ることを示した（参考文献９）。にもかかわらず、組換え型タンパク質の診断能力は、天然タンパク質との等価性に依存して決まるのである。天然型Ｈｅｖ ｂ ２を用いたＳＰＴの結果、このアレルゲンは主要なラテックスアレルゲン一つであることが判明した(参考文献１０)。Ｒａｕｌｆ Ｈｅｉｍｓｏｔｈらは、ｒＨｅｖ ｂ ２と天然型Ｈｅｖ ２のＩｇＥ反応性との間には相関関係が低いことを報告している（参考文献１１）。彼らは、自ら作成したｒＨｅｖ ｂ ２に対してはＩｇＥ反応性がほとんどないことを観察している。かかる知見は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生物の誤った折り畳みに因るのであるか又はＩｇＥ結合性エピトープ(参考文献１２)となるものの、大腸菌内で発現される組換え型タンパク質上には存在しないＨｅｖ ｂ ２の炭水化物残基に基因する可能性がある。
【００１０】
今日までに、十三（１３）のラテックスアレルゲンが、国際免疫学会連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ）によって承認されている。Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓの木由来の天然ゴムラテックスは、２５０以上のポリペプチドを含み、その内の少なくとも６０は、ＩｇＥ結合特性を明確に示す旨報告されている(参考文献１３)。従って、１３の組換え型の又は精製されたアレルゲンを用いたラテックスアレルギーの診断は、充分でないように思われる。加えて主要なラテックスアレルゲンの内いくつかは、Ｂ−漿液に由来するもである。しかしながら、ＮＡＬ由来の市販されているラテックス抽出物の全ては、専らラテックスＣ−漿液から派生するものである。
【００１１】
ＥＰ７０４４５７は、Ｈｅｖ ｂ ＩＶ、Ｈｅｖ ｂ ＩＩ又はＨｅｖ ｂ ＩＩＩと称されるアレルギー誘発性タンパク質を記載している。ＷＯ ０１／６１３０５は、ゴム伸長因子(ｒｕｂｂｅｒ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ；ＲＥＦ又は Ｈｅｖ ｂ １)、ゴム粒子関連タンパク質（Ｈｅｖ ｂ ３）、酸性１６ＫＤタンパク質（Ｈｅｖ ｂ ５）およびヘベイン（ｈｅｖｅｉｎ）（Ｈｅｖ ｂ ６．０２）から選択されるラテックスアレルゲンを記載している。
【００１２】
新鮮なラテックスは、約１〜２％のタンパク質を含み、高速遠心分離によって次の三つの主な画分に分離することが出来る。即ち、（ｉ）ゴム粒子の白色の上層、（ｉｉ）ラテックス導管の細胞由来の原形質を含む水性層(Ｃ−漿液)、及び(ｉｉｉ)主として液胞様ルトイドから成る下部画分（Ｂ−漿液）である。
【００１３】
更には、市販されているラテックスアレルギー試験手順の比較を行ったところ、得られた結果に広汎なバラツキがあることが明らかとなり、評価対象とした如何なる方法も、報告された１型ラテックスアレルギー症状と相関関係づけることが出来なかった (参考文献１８参照)。現在用いられている試験法の主な欠点は、現時点ではｉｎ ｖｉｔｒｏ方法の数種類が、ラテックスに対するＩｇＥ感作を検出するのに必要であるということである（参考文献１９）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、本発明の根底となっている技術上の問題・課題は、ラテックスとこれに関連するアレルギーの診断及び治療のための改良された試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記の技術上の問題・課題の解決法は、請求項において特徴づけられる実施態様によって提供される。
【００１６】
具体的には本発明は、ＮＲＬ由来の一種以上のタンパク質画分又は一種以上のその抽出物を分画沈殿及び／又はクロマトグラフィー分離によって調製する工程を含んで成る、天然ゴムラテックス（ＮＲＬ）の事実上全ての天然ヒトＩｇＥ結合性タンパク質を含む組成物の調製方法を提供する。
【００１７】
本明細書において使用する「組成物」なる用語は、一般的にはＮＲＬに由来する一種以上のタンパク質画分(又はいずれの抽出物又はその画分)を包含する。
【００１８】
「天然ゴムラテックス」なる用語は、あらゆる天然の供給源から入手可能である全てのゴムラテックスを意味する。生ラテックスにおいては、タンパク質量とその分子量の分布が、異なる原材料の供給採取源如何で大幅に変動するが、その原因は、種々の要因、例えば採取源、生育や成熟・成長の諸条件(気候、季節、土壌)によることが知見されている(参考文献１４，１５)。しかしながら、ＮＲＬが、特定のＨｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓの木のクローン(例えば、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ Ｒｕｂｂｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｌａｙｓｉａ ｃｌｏｎｅ ＲＲＩＭ ６００)ら採集される場合、標準化された製造手順によって、タンパク質含有量と特異性は均一で再現性がよくなるのである(参考文献１６)。従って、Ｈ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来のＮＲＬが好ましい。ＮＲＬは、非アンモニア処理ラテックス（ＮＡＬ）であるのが好ましい。
【００１９】
「天然ゴムラテックスの天然ヒトＩｇＥ結合性タンパク質」なる用語は、ヒト体内でアレルゲンとして作用・機能し、従ってラテックスアレルギー又は少なくとも感作の原因となる、ラテックス中に存在する全てのタンパク質を意味する。本明細書において記載する方法によって得られる組成物には、天然ゴムラテックスに存在し得る全ての天然のアレルゲンを包含することは、本発明の重要な一つの局面である。従って、該組成物は、単独のアレルゲンのみならず天然ラテックスゴム中に存在する全てのアレルゲンを包含する。
【００２０】
「ＮＲＬの抽出物」なる表現は、該抽出物が上記の定義に従った全ての天然ラテックスアレルゲンを含有する限り、ＮＲＬに由来する如何なる画分、又は変性液又は懸濁液若しくは乳化液をも含む。
【００２１】
特に好ましいＮＲＬの抽出物は、特にＮＡＬは、遠心分離、好ましくは高速遠心分離して上記の画分（ｉ）ゴム粒子の白いクリーム状の層（ｉｉ）Ｂ−漿液(下部)(ｉｉｉ)(ｉ)と(ｉｉ)の間のＣ−漿液を生成させることよって得られる。本発明の目的のために好ましいＮＡＬ抽出物は、Ｂ−漿液とＣ−漿液である。
【００２２】
本発明の実施態様の一つにおいては、標準化された製造操作により採取されたＮＲＬの異なる幾つかのバッチを分画化することによって、組成が極めて類似したタンパク質抽出物が得られるのである。
【００２３】
即ち、本発明の方法は好ましくは、下記する工程を含んで成る。
（ａ）ＮＲＬの一以上のタンパク質又はその抽出物の画分を分画沈殿によって調製する工程、及び、
（ｂ）工程（ａ）で得られたタンパク質画分をクロマトグラフィー分離に供する工程。
【００２４】
「分画沈殿（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）」なる用語は、タンパク質が溶媒の中でｐＨ、イオン強度、及び温度に関して摂動を起こすことによって沈殿させることが出来ることを意味する。沈殿物は、好ましくは通常用いられる遠心分離工程で回収される。溶媒の性質はまた、高濃度の幾つかの塩又は混和可能な有機溶媒を添加することによって変性させることが出来る。生理食塩水を基準としてイオン強度が低い溶液状の塩類は、幾つかのタンパク質を溶媒から沈殿させる摂動となり得る可能性がある。一方、塩類は、生体組織媒体よりもはるかに強いイオン強度を有する、極めて高濃度状態においては、多くのタンパク質の沈殿を引き起こすことになろう。沈殿は、かかる塩の表面電荷を中和することによって、またタンパク質の化学的活性を低下させることによってまた水の有効濃度を減少させることによって生起する。このことは、タンパク質の「塩析」と称される。どんな塩でも特定のタンパク質の沈殿を引き起こすのに必要な濃度は、タンパク質表面の電荷及び非イオン性極性基の数及び分布とに関連づけられ、また電荷が中和されるに応じて曝露され且つ数的に優位になる疎水性残基の数及び分布にも関連づけられる。かかるタンパク質の大きさ及び形状もまた、沈殿可能性の相対的容易さの原因となる。硫酸アンモニウムは、タンパク質の塩析に最も頻繁に使われる沈殿剤である。その主要な利点は、（１）飽和状態で、大半のタンパク質の沈殿を引き起こすに十分に高いモル濃度を有すること、（２）溶解熱が大きくないこと、（３）飽和溶液であっても、遠心分離によって沈殿したタンパク質のほとんどの沈殿に干渉するほど密度が高くないこと、(４)高濃度液でも、大半の細菌の増殖を防止又は制約すること、及び（５）液状にあって、大半のタンパク質を変性から保護すること、である。
【００２５】
従って、第一工程において、ラテックスＣ−漿液及びＢ−漿液のタンパク質が、異なる濃度の硫酸アンモニウムで分画されることも本発明の一部である。
本発明の好ましい実施態様においては、第二工程として、画分のタンパク質が、更にイオン交換クロマトグラフィーで分離されるのである。
【００２６】
従って、本発明の方法は好ましくは、下記する工程を含んで成る：
（ｉ）ＮＡＬのＣ−漿液の一種以上のタンパク質画分を分画沈殿により調製する工程、
（ｉｉ）工程（ａ）で得られた一種以上のタンパク質画分をクロマトグラフィー分離に付する工程、及び
（ｉｉｉ）ＮＡＬ Ｂ−漿液をクロマトグラフィー分離に付する工程。
【００２７】
クロマトグラフィー分離としては、好ましくはラテックスアレルゲン特異的免疫グロブリンを用いる、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、及び／又はアフィニティークロマトグラフィーがあげられる。
【００２８】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）は、本発明の好ましいクロマトグラフィー技法である。ＩＥＣは、特にイオン性の又はイオン化可能の組成物を分離出来る。ＩＥＣは、固定相が、イオン化可能の官能基を運び、固定相に化学結合で固定する点において他の型式の液体クロマトグラフィーとは異なる。電気的中性となるための必要条件を満たすために、これら固定された電荷は、反対符号の対イオンを帯びる。この対イオンは、固定されることはなく、置換される。ＩＥＣには、２つの別個の事象が含まれる。まず第一は、固定された電荷にタンパク質が結合すること、第二は、該タンパク質よりも固定電荷に対するアフィニティーが大きい新しい対イオンによって、タンパク質が固定された電荷から溶出すること又は置換することである。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＮＲＬ抽出物又はそのタンパク質画分、例えば好ましくはＮＲＬ（例えば、ＮＡＬ）、ＮＡＬ Ｂ−漿液又はＮＡＬ Ｃ−漿液を分別沈殿すること、好ましくは硫酸アンモニウムを用いて塩析することによって得られるＮＡＬ、ＮＡＬ Ｂ−漿液又はＮＡＬ Ｃ−漿液をクロマトグフィーにより分離するのに用いられる。
【００２９】
好ましい一つの実施態様において、ＭｏｎｏＢｅａｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ， スウェーデン）が、イオン媒体として用いられるが、これは１０μｍのビーズ状の疎水性ポリスチレン／ジビニルベンゼン樹脂を使用したものである。ビーズは好ましくは、第４級アミンで置換されて、強いイオン交換体であるＭｏｎｏＱとする。ＭｏｎｏＢｅａｄｓマトリックスは安定性が高いため、制御合成とカラム充填手順と併せて、長期にわたり且つ異なるカラム間での再現性の高い分離が確保される。
【００３０】
もちろん、他のクロマトグラフィー用樹脂、特にイオン交換樹脂も同様に適している。例えば、アガロース、セファロース、セファデックス、セファクリル、セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）が挙げられる。
【００３１】
例えばＭｏｎｏＱでの陰イオン交換クロマトグラフィーの好ましい態様は、１０乃至５０ｍＭの緩衝液において、好ましくはｐＨ７乃至７．８，好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５であり、１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリスーＨＣｌにおいて０乃至１ＭのＮａＣｌの直線溶出勾配として実行される。もちろん、他の型式の勾配(例えば、段階的勾配)又は直線勾配及び段階的勾配の組み合わせ、他の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）及び溶出塩(例えば、ＫＣｌ)を用いることも可能である。
【００３２】
上記にて既述したように、分画沈殿は、ＮＲＬ又はその抽出物のｐＨ及び／又はイオン強度を変化させることによって、及び／又は変性剤及び／又は塩を導入することによって実行される。分画沈殿を行うためには、塩の添加が最も好ましい。適当な塩としては、硫酸アンモニウム、ＮａＣｌ、及び／又はＮａ２ＳＯ４が挙げられる。又はその代わりに、エタノールやアセトンといった有機溶媒を（塩の代わりに）用いてもよい。上記のタンパク質沈殿の議論について言及すると、硫酸アンモニウムが、本発明において使用可能な最も好ましい塩である。
【００３３】
本発明の方法としてさらに好ましい態様については、
分画沈殿は、以下によって行われる：即ち、
（１）ＮＲＬ又はその抽出物に硫酸アンモニウムを添加して、飽和率として１５乃至３５％、好ましくは２０乃至３０％、より好ましくは２２乃至２８％、特に２５％の濃度にすること、
（２）第一の沈殿及び第一の上澄み液を遠心分離によって回収すること、
（３）第一の上澄み液に硫酸アンモニウムを添加して、飽和率として４０乃至６０％、好ましくは４５乃至５５％、より好ましくは４７乃至５３％、特に５０％の濃度にすること、
（４）第二の沈殿及び第二の上澄み液を遠心分離によって回収すること、
（５）第二の上澄み液に硫酸アンモニウムを添加して、飽和率として６５乃至８５％、好ましくは７０乃至８０％、より好ましくは７２乃至７８％、特に７５％の濃度にすること、及び
（６）第三の沈殿と第三の上澄み液を遠心分離によって回収すること。
【００３４】
この場合ＮＲＬの好ましい抽出物は、ＮＡＬ Ｃ−漿液である。しかし、上記の分画沈殿は、如何なるＮＲＬ（例えばＮＡＬ）又はＮＲＬに由来する如何なる他の抽出物にも適用することが出来る。
【００３５】
天然ゴムラテックス（ＮＲＬ）の、実質的に全ての天然ヒトＩｇＥ結合性タンパク質を含む組成物が、関連する全てのアレルゲンを含むことは、重要である。従って、これらの精製法によって得られる異なる画分は、好ましくはラテックスに対してアレルギー反応を示す患者から得られた血清について試験され、アレルゲンの存在が確認される。
【００３６】
本発明の一つの好ましい態様において、分画沈殿及び／又はクロマトグラフィー分離によって得られる単一画分は、ラテックスアレルギー被験者の血清と反応させる。該単一画分は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され得るが、ニトロセルロースでブロットされた画分は、ラテックスアレルギー被験者から得られた血清プール又はラテックスアレルギー被験者の個々の血清と共にインキュベートされる。ＩｇＥ抗体は、当業者に公知である放射性成分、酵素又は色素で標識された抗ＩｇＥ抗体（好ましくは動物より得られた）で同定される。更に、対照レーンが分離ゲル上に設けられる。この方法により、ヒトＩｇＥ抗体が結合する可能性がある天然ゴムラテックス中に自然に存在するタンパク質を含むこれら全ての画分を同定することが出来る。ＩｇＥ抗体を含む血清は、ラテックスに対するアレルギー患者又は実験動物から得られる。
【００３７】
ラテックスに対するアレルギー患者から得られる幾つかの個々の血清を用いることによって、アレルギー患者のＩｇＥ抗体が最もよく結合するタンパク質を最も高い含有量で含む画分が全て、同定される。適切な画分を選択することによっては、アレルギー患者のＩｇＥ抗体が最もよく結合するタンパク質とＩｇＥ抗体が結合しないタンパク質との最適比を選択することが出来る。
【００３８】
種々の精製方法、特に分画沈殿及び／又はクロマトグラフィー分離とこのような精製法で得られる画分のモニタリングとを組み合わせることによって、ヒトＩｇＥ抗体が結合する、天然ゴムラテックス中の全てのタンパク質を含む組成物が得られる。
【００３９】
最終工程として、分画沈殿及び／又はクロマトグラフィー分離によって得られる異なるタンパク質画分を組み合わせて、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を検出するのに十分な濃度で全てのラテックスアレルゲンを含有する単一の組成物を得るのである。
【００４０】
上記で定義された方法により得られる組成物は特に、ＮＲＬのアレルギータンパク質を原料物質（ＮＲＬそれ自身又は例えばＮＡＬ Ｂ−漿液やＮＡＬ Ｃ−漿液など、その抽出物）としてより高い濃度で含む。
【００４１】
本発明の方法は好ましくは、ラテックス感作又はアレルギーのｉｎ ｖｉｔｒｏ診断及び／又は治療（又は診断薬及び／又は医薬化合物（薬剤）の調剤）に成功裏に使用されるタンパク質組成物を提供する。
【００４２】
このように、本発明の更なる一つの態様は、上記で定義された方法により得られる天然ゴムラテックス中の実質的に全ての天然ヒトＩｇＥ結合性タンパク質を含む組成物に関する。
【００４３】
該組成物は好ましくは、以下によって調製されるタンパク質画分を含む：
（Ａ）ＮＡＬ Ｃ−漿液のタンパク質画分を分画沈殿により調製すること、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたタンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィーに付すること、及び
（Ｃ）ＮＡＬ Ｂ−漿液を陰イオン交換クロマトグラフィーに付すこと。
【００４４】
これに関連して、本発明の方法について上記にて詳記された説明及び好ましい態様を具体的に述べる。
【００４５】
より好ましくは、分画沈殿は、下記する工程を含んで成る：
（１）ＮＡＬ Ｃ−漿液に硫酸アンモニウムを添加して、飽和率として１５乃至３５％、好ましくは２０乃至３０％、より好ましくは２２乃至２８％特に２５％の濃度にすること、
（２）第一の沈殿物及び第一の上澄み液を遠心分離によって回収すること、
（３）第一の上澄み液に硫酸アンモニウムを添加して、飽和率として４０乃至６０％、好ましくは４５乃至５５％、より好ましくは４７乃至５３％特に５０％の濃度にすること、
（４）第二の沈殿物及び第二の上澄み液を遠心分離によって回収すること、
（５）第二の上澄み液を硫酸アンモニウムに添加して、飽和率として６５乃至８５％、好ましくは７０乃至８０％、より好ましくは７２乃至７８％、特に７５％の濃度にすること、及び
（６）第三の沈殿物及び第三の上澄み液を遠心分離によって回収すること。
【００４６】
さらに好ましい一つの態様において、該組成物は、下記するタンパク質画分を含む（又は該組成物の単一又は複数は、以下のタンパク質画分によって代表される）。
・ 第二の沈殿物をｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸中で１２０ｍＭ乃至２３０ｍＭ、好ましくは１４０乃至２１０ｍＭ、特に１５０乃至２００ｍＭのＮａＣｌで溶出する、陰イオン交換クロマトグラフィーによって得られるタンパク質画分；
・ 第二の沈殿物をｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸中で２７０ｍＭ乃至５３０ｍＭ、好ましくは２９０乃至５１０ｍＭ、特に３００乃至５００ｍＭのＮａＣｌで溶出する、陰イオン交換クロマトグラフィーによって得られるタンパク質画分；
・ 第三の沈殿物をｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸中で２７０乃至４８０ｍＭ、好ましくは２９０乃至４６０ｍＭ、特に３００乃至４５０ｍＭのＮａＣｌで溶出する、陰イオン交換クロマトグラフィーによって得られるタンパク質画分；
・ 第三の沈殿物をｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸中で４２０乃至５８０ｍＭ、好ましくは４４０乃至５６０ｍＭ、特に４５０乃至５５０ｍＭのＮａＣｌで溶出する、陰イオン交換クロマトグラフィーによって得られるタンパク質画分；
・ ＮＡＬ Ｂ−漿液をｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸中で１２０乃至２８０ｍＭ、好ましくは１４０乃至２６０ｍＭ、特に１５０乃至２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出する、陰イオン交換クロマトグラフィーによって得られるタンパク質画分；及び
・ ＮＡＬ Ｂ−漿液をｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸中で非吸着流出分として溶出する、陰イオン交換クロマトグラフィーによって得られるタンパク質画分。
【００４７】
本発明の更なる実施態様に従えば、組成物又はタンパク質画分は、固体担体上に固定され、相当する担体タンパク質複合体が得られる。
【００４８】
当該組成物は、本発明の担体タンパク質複合体中の担体上に被覆されるか又は結合されることが好ましい。担体はビーズ、膜、計深棒及びガラスチップからなる群から選択すればよい。本発明の複合体は、ヒトのラテックスアレルギーや感作の検出といった診断用途に特に有用である。
【００４９】
従って、本発明はまた、該組成物及び／又は上記で定義された複合体を、ヒトＩｇＥ抗体の検出のために通常使用される試薬又は手段と組み合わせて含んで成る診断キットに係る。
【００５０】
本発明の診断キットは、ヒトＩｇＥ抗体の検出のための全ての公知の形態であり得る。その例としては、患者の断片に存在するタンパク質に対するアレルギー反応を測定する皮膚プリック試験（Ｓｋｉｎ Ｐｒｉｃｋ Ｔｅｓｔ））などのｉｎ ｖｉｖｏ試験又は、免疫ＣＡＰ定量測定法（Ｉｍｍｕｎｏ ＣＡＰ ａｓｓａｙ）、ラスト定量測定法（ＲＡＳＴ ａｓｓａｙｓ）、エリザ法（ＥＬＩＳＡ）、ヒスタミン放出試験法など被験患者の血清中の抗ラテックスタンパク質ＩｇＥ抗体の存在を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験が挙げられるが、これらに制限されることはない。
【００５１】
該診断用キットは特に、（ラテックス）アレルゲン特異的ＩｇＥ（特にヒトにおける）の検出に有用である。
【００５２】
従って、本発明は更には、本発明の該組成物及び／又は該複合体を体液（例えば、血液又は血清などその画分）と接触させる工程を含んで成る、（ラテックス）アレルゲン特異的ＩｇＥ（例えばヒトにおける）の検出のための診断方法を提供する。体液との接触はまた、例えば皮膚プリック試験（ＳＰＴ）によって本発明の組成物を皮下又は皮内に注射することを含む。本発明による診断方法はまた、免疫ＣＡＰ定量測定法、ラスト法、エリザ法などとして行われることが出来る。
【００５３】
本発明の方法により提供される試薬、特に該組成物はまた、医薬として有用である(又はその製造に有用である)。好ましくは、該発明の組成物は、ラテックスアレルギー又はラテックスフルーツ症候群の予防又は治療に用い得る。該医薬又は医薬組成物は、通常用いられる又は製薬学的に許容される一つ又はそれ以上の担体、基材、及び／又は希釈剤を含んでもよい。
【００５４】
本発明はまた、本発明の組成物又は薬剤をヒト患者、特にラテックスアレルギー若しくは感作及び／又はフルーツアレルギーに罹患しているヒト患者に投与する段階を含んで成る、上記の徴候を予防又は治療する方法に係る。好ましい投与方法としては、筋肉内経路を介した注射又は例えば舌下経路を介した粘膜適用が挙げられる。本発明の予防／治療法は、脱感作療法のプロトコールの形式で実行されるのが好ましい。該プロトコールとしては、アレルゲン抽出物の濃度を一定期間増加させて投与することが挙げられる。
【００５５】
本発明の利点は、Ｈｅｖｅａラテックスからの少数の画分を用いて広範な診断がなされ得ることである。本特許出願においては、これらの画分の調製法を詳細に説明する。なお本発明とは対照的に、ラテックスアレルギーのために実用化されている診断法は、目下のところ全抽出物を用いて行われている。
【００５６】
本発明を下記する制限的ではない実施例によって更に説明する。
【実施例】
【００５７】
実施例１：ラテックス画分の生成・調製
ラテックスＢ−漿液及びＣ−漿液
【００５８】
新鮮なＨｅｖｅａラテックスをゴムの木（Ｈ． ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ， ｃｌｏｎｅ ＲＲＩＭ ６００）から採集した。このラテックスは、４４０００ｇにて４℃で１時間遠心分離し、三つの主要画分に分離した。即ち、ゴム粒子を含む上部画分、水相、即ちＣ−漿液、及びルトイド（ｌｕｔｏｉｄｓ）を含む「重い」下部画分である。水相を集め、次いで遠心分離を繰り返した。得られた透明な水性のＣ−漿液を凍結乾燥し、−２０℃で保存した。ルトイドを含む下部画分は、０．４ｍｏｌ/Ｌのマンニトール中に再懸濁させ、再沈殿させて、交互に凍結と解凍を反復繰り返しして、ルトイドを破壊した。ルトイドの液体、即ちＢ−漿液は、次に遠心分離によって回収した(参考文献１７)。
【００５９】
硫酸アンモニウムによるラテックスＣ−漿液の分画
１００ミリグラムの凍結乾燥ラテックスＣ−漿液を２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）に溶解した。(ＮＨ４)２ＳＯ４を２５％の飽和率にまで添加して、３０分間４℃で攪拌した。沈殿物質は、１２０００ｇにて４℃で２０分間遠心分離した。次に上澄み液中のタンパク質を、(ＮＨ４)２ＳＯ４を５０％飽和率まで添加することによって沈殿させた。沈殿したタンパク質は、遠心分離と(ＮＨ４)２ＳＯ４を上澄み液に７５％飽和率にまで添加することによって回収した。溶液を再度遠心分離し、三回の沈殿工程を経て得たタンパク質を−２０℃で保存した。
【００６０】
陰イオン交換クロマトグラフィー
硫酸アンモニウム分画を行って得た沈殿物を２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）に溶解し、ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を通過させることによって脱塩処理した。それぞれの画分を、ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５カラム(Ｐｈａｒｍａｃｉａ)にかけた。同様に、１００ミリグラムの凍結乾燥ラテックスＢ−漿液をｐＨ７．５の２０ｍＭトリス塩酸に溶解し、ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５カラムにかけた。非吸着タンパク質は、カラムから同じ緩衝液で溶出し、吸着タンパク質は、ｐＨ７．５の２０ｍＭトリス塩酸中において０乃至１ＭのＮａＣｌの直線勾配を用いて溶出した。
【００６１】
異なるＮａＣｌ濃度で溶出させた幾つかのピーク群を集めて、Ｃ１乃至Ｃ４画分とした。Ｃ１画分は、１５０乃至２００ｍＭ ＮａＣｌで溶出されたタンパク質を含み、Ｃ２画分は、３００乃至５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出されたタンパク質を含むが、両者はいずれも、７５％ (ＮＨ４)２ＳＯ４沈殿物に由来するものであった。かかる操作全体は、異なる二つのバッチのラテックスＣ−漿液について行った。それぞれの画分の５μｇを１２％のＰＡＧＥで分離し、クーマッシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕ）で染色した(図１を参照)。タンパク質のパターンは、極めて類似しているように見えたが、幾つかのタンパク質の濃度は若干の差異があった（図１、レーン１及びレーン２参照）。
【００６２】
ラテックスＢ−漿液を直接陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて、二つの画分を得た。Ｂ１画分は、非吸着タンパク質を含み、Ｂ２画分タンパク質は、１５０乃至２５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。
【００６３】
実施例２：ラテックスＣ−漿液及びＢ−漿液に対するＩｇＥの反応性
レーン当たり１０マイクログラムのタンパク質抽出物又は１マイクログラムの遺伝子組換え型タンパク質を１２％ ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、ドイツ）でブロットした。膜を切断してストリップ片にし、ブロッキング溶液 (４０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、 ７ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ｗ／ｖ アジ化ナトリウム、０．５％ｗ／ｖ トウエーン−２０、ｐＨ７．５)で３０分間処理した。このストリップ片は、次いでブロッキング溶液の中で患者の血清で１：５に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。三つの洗浄工程を経た後で、ブロットを１２５Ｉ標識―抗（ヒトＩｇＥ）Ｉｇ(ＩＢＬ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ)で一晩インキュベートした。患者のＩｇＥがタンパク質に結合する様子は、ＢｉｏｍａｘＴＭ ＭＳフィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、アメリカ）にて可視化した。家屋塵ダニ類に対するＩｇＥ濃度が高いが、皮膚プリック試験には陰性で、ラテックスに対するＣＡＰの結果が陰性である７人の健康なアトピー罹患個人から採取した血清プールをネガティブコントロールとして用いた。
【００６４】
ラテックスＣ−漿液中のタンパク質に対するＩｇＥ反応性が、プール１、２、及び４について観察された（図２ａ、ブロットＣ−漿液参照）。これら血清プールのＩｇＥ反応は、ラテックスＣ−漿液画分において、特に４０乃至８０ｋＤａの範囲のたんぱく質に対して増加した(図２ａ、ブロットＣ１乃至Ｃ４、レーン１、２、及び４を参照)。血清プール３は、ラテックスＣ−漿液中の唯一つのタンパク質のみに対して弱いＩｇＥ反応性を示し（図２ａ、ブロットＣ−漿液、レーン３参照）、少なくとも六種類の異なるタンパク質に対するＩｇＥ反応が、ラテック漿液中で測定可能となった。ラテックスＣ−漿液中のタンパク質に対するＩｇＥ反応は、血清プール５では全く測定出来なかったが、少なくとも四種類のタンパク質が、ラテックスＣ−漿液中において血清プール５によって認識された（図２ａ、ブロットＣ１乃至Ｃ４、レーン５を参照）。七人の家屋塵ダニ類アレルギー被験者の血清プール及び緩衝液対照者は、ラテックスＣ−漿液及び何れのその画分においてもＩｇＥ反応性を全く示さなかった(図２ａ、ブロットＣ−漿液及びＣ１乃至Ｃ４、レーンＮ及びＰを参照)。
【００６５】
ラテックスＢ−漿液中のタンパク質に対するＩｇＥ反応は、漿液プール１、２、３、及び４について測定可能であった（図２ｂ、ブロットＢ−漿液、レーン１乃至４を参照）。ラテックスＢ−漿液画分においては、ＩｇＥ反応性タンパク質の全数が明確に増加することは、これらの血清プールについては全く検出不能であったが、特に３３乃至３５ｋＤａの範囲におけるいくつかのタンパク質の濃度が高くなったことが、測定可能であった（図２ｂ、ブロットＢ１及びＢ２、レーン１乃至４を参照）。血清プール５は、ラテックスＢ−漿液に対して全くＩｇＥ反応性を示さなかったが、Ｂ１画分においては、およそ３３ｋＤａのタンパク質バンドが検出可能であった（図２ｂ、ブロットＢ−漿液、Ｂ１、及びＢ２、レーン５を参照）。７人の家屋塵ダニ類アレルギー被験者及び緩衝液対照者は、ラテックスＢ−漿液及びその何れの画分においても全くＩｇＥ反応性を示さなかった（図２ｂ、ブロットＢ−漿液、Ｂ１、及びＢ２、レーンＮ及びＰを参照）。
【００６６】
実施例３：重要なラテックスアレルゲンの存在
本発明のラテックス画分は、重要なラテックスアレルゲンであるＨｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６、及びＨｅｖ ｂ ８を含む。組換え型Ｈｅｖ ｂ ５、ｒＨｅｖ ｂ ６、及びｒＨｅｖ ｂ ８を１２％ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース上でブロットした。膜切片は、試験してそれぞれのアレルゲンに対するＩｇＥの存在を示す三つの血清からそれぞれ成る血清プールと共にインキュベートした。阻害試験として、これらの血清を５０μｇのタンパク質抽出物と共にプレインキュベートした。阻害するために、Ｈｅｖ ｂ ５血清プールはＣ３画分と共に、Ｈｅｖ ｂ ６血清プールはＢ２と共に、またＨｅｖ ｂ ８血清プールはＣ１と共に、それぞれプレインキュベートした。血清プールをこれらの画分と共にプレインキュベーションした結果、ＩｇＥの組換え型アレルゲンとの結合が減少するか又は完全に消滅した(図３)。
【００６７】
[参考文献]
1. Hadjiliadis D, Khan K, Tarlo SM. Skin test responses to latex in an allergy and asthma clinic. J Allergy Clin Immunol 1995; 96:431-2.
2. Hadjiliadis D, Banks DE, Tarlo SM. The relationship between latex skin prick test responses and clinical allergic responses. J Allergy Clin Immunol 1996; 97:1202-6.
3. Hamilton RG, Adkinson NF, Jr. Natural rubber latex skin testing reagents: safety and diagnostic accuracy of nonammoniated latex, ammoniated latex, and latex rubber glove extracts. J Allergy Clin Immunol 1996; 98:872-83.
4. Turjanmaa K, Palosuo T, Alenius H, Leynadier F, Autegarden JE, Andre C, et al. Latex allergy diagnosis: in vivo and in vitro standardization of a natural rubber latex extract. Allergy 1997; 52:41-50.
5. Hamilton RG, Adkinson NF, Jr. Diagnosis of natural rubber latex allergy: multicenter latex skin testing efficacy study. Multicenter Latex Skin Testing Study Task Force. J Allergy Clin Immunol 1998; 102:482-90.
6. Hamilton RG, Peterson EL, Ownby DR. Clinical and laboratory-based methods in the diagnosis of natural rubber latex allergy. J Allergy Clin Immunol 2002; 110:S47-56.
7. Hamilton RG, Biagini RE, Krieg EF. Diagnostic performance of Food and Drug Administration-cleared serologic assays for natural rubber latex-specific IgE antibody. The Multi-Center Latex Skin Testing Study Task Force. J Allergy Clin Immunol 1999; 103:925-30.
8. Ownby DR, Magera B, Williams PB. A blinded, multi-center evaluation of two commercial in vitro tests for latex-specific IgE antibodies. Ann Allergy Asthma Immunol 2000; 84:193-6.
9. Yip L, Hickey V, Wagner B, Liss G, Slater J, Breiteneder H, et al. Skin prick test reactivity to recombinant latex allergens. Int Arch Allergy Immunol 2000; 121:292-9.
10. Bernstein DI, Biagini RE, Karnani R, Hamilton R, Murphy K, Bernstein C, et al. In vivo sensitization to purified Hevea brasiliensis proteins in health care workers sensitized to natural rubber latex. J Allergy Clin Immunol 2003; 111:610-6.
11. Raulf-Heimsoth M, Rihs HP, Bruning T. Latex: a new target for standardization. Arb Paul Ehrlich Inst Bundesamt Sera Impfstoffe Frankf A M 2003:107-15.
12. Yagami T, Osuna H, Kouno M, Haishima Y, Nakamura A, Ikezawa Z. Significance of carbohydrate epitopes in a latex allergen with beta-1,3-glucanase activity. Int Arch Allergy Immunol 2002; 129:27-37.
13. Posch A, Chen Z, Dunn MJ, Wheeler CH, Petersen A, Leubner-Metzger G, et al. Latex allergen database. Electrophoresis 1997; 18:2803-10.
14. Arreguin B, Lara P, Rodriguez R. Comparative study of electrophoretic patterns of latex proteins from clones of Hevea brasiliensis. Electrophoresis 1988; 9:323-6.
15. Dennis MS, Light DR. Rubber elongation factor from Hevea brasiliensis. Identification, characterization, and role in rubber biosynthesis. J Biol Chem 1989; 264:18608-17.
16. Tomazic-Jezic VJ, Lucas AD. Protein and allergen assays for natural rubber latex products. J Allergy Clin Immunol 2002; 110:S40-6.
17. Sunderasan E, Hamzah S, Hamid S, Ward MA, Yeang HY, Cardosa MJ. Latex B-B-serum-1,3-glucanase (Hev b 2) and a component of the microhelix (Hev b 4) are major latex allergens. J. Nat. Rubber Res. 1996; 10:82-99.
18. Pridgeon et al. Clin. Exp. Allergy 2000, 301444-1449.
19. Nielson et al. Ann. Allergy Asthma ＆ Immunol. 2000, 85:489-494.
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ラテックスＣ−漿液から得られた四つの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ラテックスＣ−漿液の二つの異なるバッチを使用し、タンパク質含有量を比較した。
【図２】それぞれａ）ラテックスＣ−漿液と四つのラテックスＣ画分及びｂ）ラテックスＣ−漿液と二つのラテックスＢ画分に対するラテックスアレルギー被験者の五つの血清から成る五種類の血清プールのＩｇＥ反応性を示す。ニトロセルロースでブロットされた画分を、これらの血清プールとともにインキュベートし、結合したＩｇＥを１２５Ｉで標識した抗ヒトＩｇＥ抗体で検出した（レーン１から５）。レーンＰ及びＮは、緩衝液対照者及び対照血清プールを示す。分子量マーカーは、表示した通りである。
【図３】Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６、及びＨｅｖ ｂ ８がラテックス抽出物中に存在することを示している。ニトロセルロースでブロットされたｒＨｅｖ ｂ ５、ｒＨｅｖ ｂ ６及びｒＨｅｖ ｂ ８は、各アレルゲンに対してアレルギーを持つ被験者の三つの血清から成る血清プールと共にインキュベートした。Ｈｅｖ ｂ ５に対する血清プールは、Ｃ３の画分と共に、Ｈｅｖ ｂ ６血清プールは、Ｂ２の画分と共に、またＨｅｖ ｂ ８血清プールはＣ１と共にプレインキュベートした。結合したＩｇＥは、１２５Ｉで標識された抗ヒトＩｇＥ抗体で検出した（レーン１から５）。レーンＰ及びＮは、緩衝液対照者及び対照血清プールを示す。分子量マーカーは、表示した通りである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラテックスアレルギー又はフルーツアレルギーの診断及び／又は治療のための試薬、及び該試薬の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然ゴムラテックス（ＮＲＬ）に対する1型アレルギーは、20世紀の最後の20年間に増大する健康問題として新たに発生し、その職業環境及び医療の安全性の双方に関して患者にとって甚大な結果をもたらしている。ラテックスの「感作」又は「感受性」とは、個体の血清中にラテックスアレルゲンに対する特異的ＩｇＥ抗体が存在することと定義される。ラテックス「アレルギー」とは、ラテックス又はラテックス製品と接触することによって、感作された個体内で即時型アレルギー症候群が惹起されることを意味する。
【０００３】
世界中の天然ゴムの大半は、ゴムの木であるＨｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓのラテックスから得られる。天然ゴムラテックスの組成は、かなり複雑であり、水、ゴム(シス-１，４-ポリイソプレン)、タンパク質、樹脂、糖類、灰分、及びステロール配糖体などの種々の物質を含む。工業ゴム製品として、新鮮なラテックスは、凝固を回避するため、最終濃度が２００ｍｍｏｌ/Ｌになるようにアンモニアと混合されるのであって、そのためにアンモニア処理ラテックス（ＡＮ）と称される。一方、非アンモニア処理ラテックス（ＮＡＬ）を高速遠心分離することによって、三つの異なるフラクションが得られる；即ち、（ｉ）上部における白色クリーム状層、（ｉｉ）主として液胞様ルトイド（ｖａｃｕｏｌｏ−ｌｉｋｅ ｌｕｔｏｉｄｓ）から成る下部分画（Ｂ−漿液）、及び（ｉｉｉ）ラテックス導管の細胞に由来する細胞質ゾルを含む、中間の黄色味がかったＣ−漿液である。
【０００４】
ＮＲＬに対する1型アレルギーの診断における第一段階は、ＮＲＬに対するアレルギー症状の広範な病歴を記録することである。第二段階においては、必要な種々の確認試験を行って感作状態を同定・確認する。最も一般的に用いられる確認試験は、皮膚プリック試験（ｓｋｉｎ ｐｒｉｃｋ ｔｅｓｔ）(ＳＰＴ)およびラテックス特異的ＩｇＥ抗体ための血清試験である。従って標準化されたＳＰＴ抽出物及びＩｇＥ測定・定量のための充分に特性化されたアレルゲン混合物とが、ラテックスアレルギーを診断するための重要な必要条件となる。
【０００５】
皮膚でのアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の検出は、迅速であり且つ感度が高いため魅力的な方法であって、皮膚内部又は個体体内において臨床上観察可能で且つ生物学的な関連応答を含む。１９９５年及び１９９６年に、カナダで製造された未加工ＡＬ製品を使用したＢｅｎｃａｒｄラテックス試薬を用いて皮膚プリック試験が行われた。研究者らは、喘息及びアレルギー診療科の入院患者においてラテックス皮膚試験陽性応答の内有病率が４．２％であること、及びＳＰＴ応答の大きさとラテックス誘発症状の重篤度との間に正の相関関係が成り立つことを報告している(参考文献２)。第Ｉ／ＩＩ相初期臨床試験において、三種のラテックス源候補物質―即ち、ＡＮ、ＮＡＬ及び粉末散布ラテックス手袋の抽出物―について、相対的な安全性及び診断の正確さが測定・決定された。その結果、ＮＡＬが、その安定性と品質管理の容易さの故に、更なる開発のための最も魅力的な候補ラテックスと報告された(参考文献３)。Ｅｂｏらは(Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ Ｎｏｖ；１００（５）：６１８−２３)、ＳＰＴを含む、ＩｇＥ抗体検出方法について比較検討を行った。 彼らは、ＮＡＬ抽出物（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐ社製）を用いたが、その感受性は６８％でありまた特異性は１００％であった。フィンランドにおける研究では、スタレルジーン（Ｓｔａｌｌｅｒｇｅｎｅｓ，Ｆｒｅｓｎｎｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）社のＮＡＬのラテックスＣ−漿液を使用したＳＰＴ試薬の診断性能が検討、調査された（参考文献４）。診断感受性は９３％であり、特異性は１００％であると報告された。これが、今日ヨーロッパにおいて入手可能である唯一規格化・標準化された市販天然ゴムラテックス抽出物である。多施設第ＩＩＩ相臨床試験が、治験用Ｇｒｅｅｒ試薬(Ｇｒｅｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｌｅｎｏｉｒ，ＮＣ)とＮＡＬを用いた抽出物について実施された (参考文献５)。この試験において、診断感受性は９５％であり、特異性は１００％であった。データの再分析を行った結果、Ｇｒｅｅｒ ＮＡＬ ＳＰＴ試薬の総合的な感受性は７０％乃至７５％に変わった（参考文献６）。
【０００６】
更には、利用可能なＮＡＬのＣ−漿液を使用したまた別のＳＰＴ抽出物が、ＡＬＫ−Ａｂｅｌｌｏ（Ｈｏｅｒｓｈｏｌｍ、デンマーク）から入手可能である。市販されている製品のほかに、皮膚診断試験を行うことを希望するアレルギー専門医は、手袋から独自の自家製ラテックス抽出物を調製することが可能であって、特に対応する医薬品承認機関(例えばＦＤＡ)によって承認された、規格・標準化されたラテックス皮膚試験試薬が全くない各国、例えば米国においてはそうである。
【０００７】
血清中の天然のラテックス特異的ＩｇＥのｉｎ ｖｉｔｒｏ測定法を行うため最も頻繁に用いられる方法は、放射標識アレルギー吸着定量測定法（Ｒａｄｉｏａｌｌｅｒｇｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ （ＲＡＳＴ））及びエリザ法（ＥＬＩＳＡ；酵素結合免疫吸着定量測定法）である。いくつかの放射標識アレルギー吸着試験薬が市販されている。天然ゴムラテックス特異的ＩｇＥ抗体の検出について、三種類のｉｎ ｖｉｔｒｏ定量測定法（ＤＰＣ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｌａｓｔａｔ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＣＡＰ ｓｙｓｔｅｍ ＦＥＩＡ、及びＨｙｃｏｒ ＨＹＴＥＣＨ）を比較検討した(参考文献７)。Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＣＡＰ Ｓｙｓｔｅｍ及びＤＰＣ’ｓ Ａｌａｓｔａｔのラテックス皮膚試験は、Ｇｒｅｅｒ実験用ラテックス試薬を用いたラテックス皮膚試験と比較した場合、それぞれ診断特異性は９７％であり又診断感受性は７６と７３％であった。これら定量測定法のいずれも、ラテックス感作症例の内のほぼ２５％をラテックス特異的ＩｇＥ抗体について擬陰性であると誤って分類した。性能に関するまた別の研究において、双方の定量測定法が示した診断感受性及び特異性は、上記の研究におけるものと同等であった（参考文献８）。第一の研究において、ＨＹＴＥＣＨアッセイは特異性７３％を示したが、このことが、皮膚試験と比較したときに２７％の擬陽性という結果を生み出したことを示している (参考文献７)。これまでに推測されてきたことは、ＣＡＰ及びＡｌａＳＴＡＴ定量測定法において診断感受性が低い理由は、これらの定量測定法で用いられたアレルゲン含有試薬においてアレルゲンが不十分に代表されたこと及び／又は変性を受けたことに関連づけられ得るとするものであった (参照非特許文献６)。天然ゴムラテックス全体に由来する試薬を用いた定量測定法の正確さと信頼性は、アレルゲンの利用可能性とアレルゲンがＩｇＥ抗体を基準として過剰モルで存在することに依存して異なる旨結論づけられている。
【０００８】
最も汎用されているＲＡＳＴキットは、恐らくＰｈａｒｍａｃｉａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製のラテックスＲＡＳＴ ｋ８２及びその酵素結合免疫吸着定量測定法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＣＡＰ ｓｙｓｔｅｍ）であろう。さらに新しいＰｈａｍａｃｉａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製のラテックスＲＡＳＴは、ｋ８２を使用したものであるが、組換え型Ｈｅｖ ｂ ５（ｒＨｅｖ ｂ ５）分子とスパイクする。さらに、組換え型ラテックスアレルゲンを用いたＲＡＳＴが入手可能である。組換え型 Ｈｅｖ ｂ １、２、３、６．０１、６．０２、８、９、及び１１は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質、又はＭＢＰを含まないｒ（組換え型）Ｈｅｖ ｂ ５との融合タンパク質として入手可能である。
【０００９】
２０００年にＹｉｐらは、組換え型ラテックスアレルゲンは臨床上反応性があり、標準化された方法で製造することが出来、潜在的にラテックスアレルギーの診断に感受性と特異性を有する試薬となり得ることを示した（参考文献９）。にもかかわらず、組換え型タンパク質の診断能力は、天然タンパク質との等価性に依存して決まるのである。天然型Ｈｅｖ ｂ ２を用いたＳＰＴの結果、このアレルゲンは主要なラテックスアレルゲン一つであることが判明した(参考文献１０)。Ｒａｕｌｆ Ｈｅｉｍｓｏｔｈらは、ｒＨｅｖ ｂ ２と天然型Ｈｅｖ ２のＩｇＥ反応性との間には相関関係が低いことを報告している（参考文献１１）。彼らは、自ら作成したｒＨｅｖ ｂ ２に対してはＩｇＥ反応性がほとんどないことを観察している。かかる知見は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生物の誤った折り畳みに因るのであるか又はＩｇＥ結合性エピトープ(参考文献１２)となるものの、大腸菌内で発現される組換え型タンパク質上には存在しないＨｅｖ ｂ ２の炭水化物残基に基因する可能性がある。
【００１０】
今日までに、十三（１３）のラテックスアレルゲンが、国際免疫学会連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ）によって承認されている。Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓの木由来の天然ゴムラテックスは、２５０以上のポリペプチドを含み、その内の少なくとも６０は、ＩｇＥ結合特性を明確に示す旨報告されている(参考文献１３)。従って、１３の組換え型の又は精製されたアレルゲンを用いたラテックスアレルギーの診断は、充分でないように思われる。加えて主要なラテックスアレルゲンの内いくつかは、Ｂ−漿液に由来するもである。しかしながら、ＮＡＬ由来の市販されているラテックス抽出物の全ては、専らラテックスＣ−漿液から派生するものである。
【００１１】
ＥＰ７０４４５７は、Ｈｅｖ ｂ ＩＶ、Ｈｅｖ ｂ ＩＩ又はＨｅｖ ｂ ＩＩＩと称されるアレルギー誘発性タンパク質を記載している。ＷＯ ０１／６１３０５は、ゴム伸長因子(ｒｕｂｂｅｒ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ；ＲＥＦ又は Ｈｅｖ ｂ １)、ゴム粒子関連タンパク質（Ｈｅｖ ｂ ３）、酸性１６ＫＤタンパク質（Ｈｅｖ ｂ ５）およびヘベイン（ｈｅｖｅｉｎ）（Ｈｅｖ ｂ ６．０２）から選択されるラテックスアレルゲンを記載している。
【００１２】
新鮮なラテックスは、約１〜２％のタンパク質を含み、高速遠心分離によって次の三つの主な画分に分離することが出来る。即ち、（ｉ）ゴム粒子の白色の上層、（ｉｉ）ラテックス導管の細胞由来の原形質を含む水性層(Ｃ−漿液)、及び(ｉｉｉ)主として液胞様ルトイドから成る下部画分（Ｂ−漿液）である。
【００１３】
更には、市販されているラテックスアレルギー試験手順の比較を行ったところ、得られた結果に広汎なバラツキがあることが明らかとなり、評価対象とした如何なる方法も、報告された１型ラテックスアレルギー症状と相関関係づけることが出来なかった (参考文献１８参照)。現在用いられている試験法の主な欠点は、現時点ではｉｎ ｖｉｔｒｏ方法の数種類が、ラテックスに対するＩｇＥ感作を検出するのに必要であるということである（参考文献１９）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、本発明の根底となっている技術上の問題・課題は、ラテックスとこれに関連するアレルギーの診断及び治療のための改良された試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記の技術上の問題・課題の解決法は、請求項において特徴づけられる実施態様によって提供される。
【００１６】
具体的には本発明は、ＮＲＬ由来の一種以上のタンパク質画分又は一種以上のその抽出物を分画沈殿及び／又はクロマトグラフィー分離によって調製する工程を含んで成る、天然ゴムラテックス（ＮＲＬ）の事実上全ての天然ヒトＩｇＥ結合性タンパク質を含む組成物の調製方法を提供する。
【００１７】
本明細書において使用する「組成物」なる用語は、一般的にはＮＲＬに由来する一種以上のタンパク質画分(又はいずれの抽出物又はその画分)を包含する。
【００１８】
「天然ゴムラテックス」なる用語は、あらゆる天然の供給源から入手可能である全てのゴムラテックスを意味する。生ラテックスにおいては、タンパク質量とその分子量の分布が、異なる原材料の供給採取源如何で大幅に変動するが、その原因は、種々の要因、例えば採取源、生育や成熟・成長の諸条件(気候、季節、土壌)によることが知見されている(参考文献１４，１５)。しかしながら、ＮＲＬが、特定のＨｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓの木のクローン(例えば、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ Ｒｕｂｂｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｌａｙｓｉａ ｃｌｏｎｅ ＲＲＩＭ ６００)ら採集される場合、標準化された製造手順によって、タンパク質含有量と特異性は均一で再現性がよくなるのである(参考文献１６)。従って、Ｈ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来のＮＲＬが好ましい。ＮＲＬは、非アンモニア処理ラテックス（ＮＡＬ）であるのが好ましい。
【００１９】
「天然ゴムラテックスの天然ヒトＩｇＥ結合性タンパク質」なる用語は、ヒト体内でアレルゲンとして作用・機能し、従ってラテックスアレルギー又は少なくとも感作の原因となる、ラテックス中に存在する全てのタンパク質を意味する。本明細書において記載する方法によって得られる組成物には、天然ゴムラテックスに存在し得る全ての天然のアレルゲンを包含することは、本発明の重要な一つの局面である。従って、該組成物は、単独のアレルゲンのみならず天然ラテックスゴム中に存在する全てのアレルゲンを包含する。
【００２０】
「ＮＲＬの抽出物」なる表現は、該抽出物が上記の定義に従った全ての天然ラテックスアレルゲンを含有する限り、ＮＲＬに由来する如何なる画分、又は変性液又は懸濁液若しくは乳化液をも含む。
【００２１】
特に好ましいＮＲＬの抽出物は、特にＮＡＬは、遠心分離、好ましくは高速遠心分離して上記の画分（ｉ）ゴム粒子の白いクリーム状の層（ｉｉ）Ｂ−漿液(下部)(ｉｉｉ)(ｉ)と(ｉｉ)の間のＣ−漿液を生成させることよって得られる。本発明の目的のために好ましいＮＡＬ抽出物は、Ｂ−漿液とＣ−漿液である。
【００２２】
本発明の実施態様の一つにおいては、標準化された製造操作により採取されたＮＲＬの異なる幾つかのバッチを分画化することによって、組成が極めて類似したタンパク質抽出物が得られるのである。
【００２３】
即ち、本発明の方法は好ましくは、下記する工程を含んで成る。
（ａ）ＮＲＬの一以上のタンパク質又はその抽出物の画分を分画沈殿によって調製する工程、及び、
（ｂ）工程（ａ）で得られたタンパク質画分をクロマトグラフィー分離に供する工程。
【００２４】
「分画沈殿（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）」なる用語は、タンパク質が溶媒の中でｐＨ、イオン強度、及び温度に関して摂動を起こすことによって沈殿させることが出来ることを意味する。沈殿物は、好ましくは通常用いられる遠心分離工程で回収される。溶媒の性質はまた、高濃度の幾つかの塩又は混和可能な有機溶媒を添加することによって変性させることが出来る。生理食塩水を基準としてイオン強度が低い溶液状の塩類は、幾つかのタンパク質を溶媒から沈殿させる摂動となり得る可能性がある。一方、塩類は、生体組織媒体よりもはるかに強いイオン強度を有する、極めて高濃度状態においては、多くのタンパク質の沈殿を引き起こすことになろう。沈殿は、かかる塩の表面電荷を中和することによって、またタンパク質の化学的活性を低下させることによってまた水の有効濃度を減少させることによって生起する。このことは、タンパク質の「塩析」と称される。どんな塩でも特定のタンパク質の沈殿を引き起こすのに必要な濃度は、タンパク質表面の電荷及び非イオン性極性基の数及び分布とに関連づけられ、また電荷が中和されるに応じて曝露され且つ数的に優位になる疎水性残基の数及び分布にも関連づけられる。かかるタンパク質の大きさ及び形状もまた、沈殿可能性の相対的容易さの原因となる。硫酸アンモニウムは、タンパク質の塩析に最も頻繁に使われる沈殿剤である。その主要な利点は、（１）飽和状態で、大半のタンパク質の沈殿を引き起こすに十分に高いモル濃度を有すること、（２）溶解熱が大きくないこと、（３）飽和溶液であっても、遠心分離によって沈殿したタンパク質のほとんどの沈殿に干渉するほど密度が高くないこと、(４)高濃度液でも、大半の細菌の増殖を防止又は制約すること、及び（５）液状にあって、大半のタンパク質を変性から保護すること、である。
【００２５】
従って、第一工程において、ラテックスＣ−漿液及びＢ−漿液のタンパク質が、異なる濃度の硫酸アンモニウムで分画されることも本発明の一部である。
本発明の好ましい実施態様においては、第二工程として、画分のタンパク質が、更にイオン交換クロマトグラフィーで分離されるのである。
【００２６】
従って、本発明の方法は好ましくは、下記する工程を含んで成る：
（ｉ）ＮＡＬのＣ−漿液の一種以上のタンパク質画分を分画沈殿により調製する工程、
（ｉｉ）工程（ａ）で得られた一種以上のタンパク質画分をクロマトグラフィー分離に付する工程、及び
（ｉｉｉ）ＮＡＬ Ｂ−漿液をクロマトグラフィー分離に付する工程。
【００２７】
クロマトグラフィー分離としては、好ましくはラテックスアレルゲン特異的免疫グロブリンを用いる、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、及び／又はアフィニティークロマトグラフィーがあげられる。
【００２８】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）は、本発明の好ましいクロマトグラフィー技法である。ＩＥＣは、特にイオン性の又はイオン化可能の組成物を分離出来る。ＩＥＣは、固定相が、イオン化可能の官能基を運び、固定相に化学結合で固定する点において他の型式の液体クロマトグラフィーとは異なる。電気的中性となるための必要条件を満たすために、これら固定された電荷は、反対符号の対イオンを帯びる。この対イオンは、固定されることはなく、置換される。ＩＥＣには、２つの別個の事象が含まれる。まず第一は、固定された電荷にタンパク質が結合すること、第二は、該タンパク質よりも固定電荷に対するアフィニティーが大きい新しい対イオンによって、タンパク質が固定された電荷から溶出すること又は置換することである。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＮＲＬ抽出物又はそのタンパク質画分、例えば好ましくはＮＲＬ（例えば、ＮＡＬ）、ＮＡＬ Ｂ−漿液又はＮＡＬ Ｃ−漿液を分別沈殿すること、好ましくは硫酸アンモニウムを用いて塩析することによって得られるＮＡＬ、ＮＡＬ Ｂ−漿液又はＮＡＬ Ｃ−漿液をクロマトグフィーにより分離するのに用いられる。
【００２９】
好ましい一つの実施態様において、ＭｏｎｏＢｅａｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ， スウェーデン）が、イオン媒体として用いられるが、これは１０μｍのビーズ状の疎水性ポリスチレン／ジビニルベンゼン樹脂を使用したものである。ビーズは好ましくは、第４級アミンで置換されて、強いイオン交換体であるＭｏｎｏＱとする。ＭｏｎｏＢｅａｄｓマトリックスは安定性が高いため、制御合成とカラム充填手順と併せて、長期にわたり且つ異なるカラム間での再現性の高い分離が確保される。
【００３０】
もちろん、他のクロマトグラフィー用樹脂、特にイオン交換樹脂も同様に適している。例えば、アガロース、セファロース、セファデックス、セファクリル、セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）が挙げられる。
【００３１】
例えばＭｏｎｏＱでの陰イオン交換クロマトグラフィーの好ましい態様は、１０乃至５０ｍＭの緩衝液において、好ましくはｐＨ７乃至７．８，好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５であり、１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリスーＨＣｌにおいて０乃至１ＭのＮａＣｌの直線溶出勾配として実行される。もちろん、他の型式の勾配(例えば、段階的勾配)又は直線勾配及び段階的勾配の組み合わせ、他の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）及び溶出塩(例えば、ＫＣｌ)を用いることも可能である。
【００３２】
上記にて既述したように、分画沈殿は、ＮＲＬ又はその抽出物のｐＨ及び／又はイオン強度を変化させることによって、及び／又は変性剤及び／又は塩を導入することによって実行される。分画沈殿を行うためには、塩の添加が最も好ましい。適当な塩としては、硫酸アンモニウム、ＮａＣｌ、及び／又はＮａ２ＳＯ４が挙げられる。又はその代わりに、エタノールやアセトンといった有機溶媒を（塩の代わりに）用いてもよい。上記のタンパク質沈殿の議論について言及すると、硫酸アンモニウムが、本発明において使用可能な最も好ましい塩である。
【００３３】
本発明の方法としてさらに好ましい態様については、
分画沈殿は、以下によって行われる：即ち、
（１）ＮＲＬ又はその抽出物に硫酸アンモニウムを添加して、飽和率として１５乃至３５％、好ましくは２０乃至３０％、より好ましくは２２乃至２８％、特に２５％の濃度にすること、
（２）第一の沈殿及び第一の上澄み液を遠心分離によって回収すること、
（３）第一の上澄み液に硫酸アンモニウムを添加して、飽和率として４０乃至６０％、好ましくは４５乃至５５％、より好ましくは４７乃至５３％、特に５０％の濃度にすること、
（４）第二の沈殿及び第二の上澄み液を遠心分離によって回収すること、
（５）第二の上澄み液に硫酸アンモニウムを添加して、飽和率として６５乃至８５％、好ましくは７０乃至８０％、より好ましくは７２乃至７８％、特に７５％の濃度にすること、及び
（６）第三の沈殿と第三の上澄み液を遠心分離によって回収すること。
【００３４】
この場合ＮＲＬの好ましい抽出物は、ＮＡＬ Ｃ−漿液である。しかし、上記の分画沈殿は、如何なるＮＲＬ（例えばＮＡＬ）又はＮＲＬに由来する如何なる他の抽出物にも適用することが出来る。
【００３５】
天然ゴムラテックス（ＮＲＬ）の、実質的に全ての天然ヒトＩｇＥ結合性タンパク質を含む組成物が、関連する全てのアレルゲンを含むことは、重要である。従って、これらの精製法によって得られる異なる画分は、好ましくはラテックスに対してアレルギー反応を示す患者から得られた血清について試験され、アレルゲンの存在が確認される。
【００３６】
本発明の一つの好ましい態様において、分画沈殿及び／又はクロマトグラフィー分離によって得られる単一画分は、ラテックスアレルギー被験者の血清と反応させる。該単一画分は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され得るが、ニトロセルロースでブロットされた画分は、ラテックスアレルギー被験者から得られた血清プール又はラテックスアレルギー被験者の個々の血清と共にインキュベートされる。ＩｇＥ抗体は、当業者に公知である放射性成分、酵素又は色素で標識された抗ＩｇＥ抗体（好ましくは動物より得られた）で同定される。更に、対照レーンが分離ゲル上に設けられる。この方法により、ヒトＩｇＥ抗体が結合する可能性がある天然ゴムラテックス中に自然に存在するタンパク質を含むこれら全ての画分を同定することが出来る。ＩｇＥ抗体を含む血清は、ラテックスに対するアレルギー患者又は実験動物から得られる。
【００３７】
ラテックスに対するアレルギー患者から得られる幾つかの個々の血清を用いることによって、アレルギー患者のＩｇＥ抗体が最もよく結合するタンパク質を最も高い含有量で含む画分が全て、同定される。適切な画分を選択することによっては、アレルギー患者のＩｇＥ抗体が最もよく結合するタンパク質とＩｇＥ抗体が結合しないタンパク質との最適比を選択することが出来る。
【００３８】
種々の精製方法、特に分画沈殿及び／又はクロマトグラフィー分離とこのような精製法で得られる画分のモニタリングとを組み合わせることによって、ヒトＩｇＥ抗体が結合する、天然ゴムラテックス中の全てのタンパク質を含む組成物が得られる。
【００３９】
最終工程として、分画沈殿及び／又はクロマトグラフィー分離によって得られる異なるタンパク質画分を組み合わせて、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を検出するのに十分な濃度で全てのラテックスアレルゲンを含有する単一の組成物を得るのである。
【００４０】
上記で定義された方法により得られる組成物は特に、ＮＲＬのアレルギータンパク質を原料物質（ＮＲＬそれ自身又は例えばＮＡＬ Ｂ−漿液やＮＡＬ Ｃ−漿液など、その抽出物）としてより高い濃度で含む。
【００４１】
本発明の方法は好ましくは、ラテックス感作又はアレルギーのｉｎ ｖｉｔｒｏ診断及び／又は治療（又は診断薬及び／又は医薬化合物（薬剤）の調剤）に成功裏に使用されるタンパク質組成物を提供する。
【００４２】
このように、本発明の更なる一つの態様は、上記で定義された方法により得られる天然ゴムラテックス中の実質的に全ての天然ヒトＩｇＥ結合性タンパク質を含む組成物に関する。
【００４３】
該組成物は好ましくは、以下によって調製されるタンパク質画分を含む：
（Ａ）ＮＡＬ Ｃ−漿液のタンパク質画分を分画沈殿により調製すること、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたタンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィーに付すること、及び
（Ｃ）ＮＡＬ Ｂ−漿液を陰イオン交換クロマトグラフィーに付すこと。
【００４４】
これに関連して、本発明の方法について上記にて詳記された説明及び好ましい態様を具体的に述べる。
【００４５】
より好ましくは、分画沈殿は、下記する工程を含んで成る：
（１）ＮＡＬ Ｃ−漿液に硫酸アンモニウムを添加して、飽和率として１５乃至３５％、好ましくは２０乃至３０％、より好ましくは２２乃至２８％特に２５％の濃度にすること、
（２）第一の沈殿物及び第一の上澄み液を遠心分離によって回収すること、
（３）第一の上澄み液に硫酸アンモニウムを添加して、飽和率として４０乃至６０％、好ましくは４５乃至５５％、より好ましくは４７乃至５３％特に５０％の濃度にすること、
（４）第二の沈殿物及び第二の上澄み液を遠心分離によって回収すること、
（５）第二の上澄み液を硫酸アンモニウムに添加して、飽和率として６５乃至８５％、好ましくは７０乃至８０％、より好ましくは７２乃至７８％、特に７５％の濃度にすること、及び
（６）第三の沈殿物及び第三の上澄み液を遠心分離によって回収すること。
【００４６】
さらに好ましい一つの態様において、該組成物は、下記するタンパク質画分を含む（又は該組成物の単一又は複数は、以下のタンパク質画分によって代表される）。
・ 第二の沈殿物をｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸中で１２０ｍＭ乃至２３０ｍＭ、好ましくは１４０乃至２１０ｍＭ、特に１５０乃至２００ｍＭのＮａＣｌで溶出する、陰イオン交換クロマトグラフィーによって得られるタンパク質画分；
・ 第二の沈殿物をｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸中で２７０ｍＭ乃至５３０ｍＭ、好ましくは２９０乃至５１０ｍＭ、特に３００乃至５００ｍＭのＮａＣｌで溶出する、陰イオン交換クロマトグラフィーによって得られるタンパク質画分；
・ 第三の沈殿物をｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸中で２７０乃至４８０ｍＭ、好ましくは２９０乃至４６０ｍＭ、特に３００乃至４５０ｍＭのＮａＣｌで溶出する、陰イオン交換クロマトグラフィーによって得られるタンパク質画分；
・ 第三の沈殿物をｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸中で４２０乃至５８０ｍＭ、好ましくは４４０乃至５６０ｍＭ、特に４５０乃至５５０ｍＭのＮａＣｌで溶出する、陰イオン交換クロマトグラフィーによって得られるタンパク質画分；
・ ＮＡＬ Ｂ−漿液をｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸中で１２０乃至２８０ｍＭ、好ましくは１４０乃至２６０ｍＭ、特に１５０乃至２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出する、陰イオン交換クロマトグラフィーによって得られるタンパク質画分；及び
・ ＮＡＬ Ｂ−漿液をｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸中で非吸着流出分として溶出する、陰イオン交換クロマトグラフィーによって得られるタンパク質画分。
【００４７】
本発明の更なる実施態様に従えば、組成物又はタンパク質画分は、固体担体上に固定され、相当する担体タンパク質複合体が得られる。
【００４８】
当該組成物は、本発明の担体タンパク質複合体中の担体上に被覆されるか又は結合されることが好ましい。担体はビーズ、膜、計深棒及びガラスチップからなる群から選択すればよい。本発明の複合体は、ヒトのラテックスアレルギーや感作の検出といった診断用途に特に有用である。
【００４９】
従って、本発明はまた、該組成物及び／又は上記で定義された複合体を、ヒトＩｇＥ抗体の検出のために通常使用される試薬又は手段と組み合わせて含んで成る診断キットに係る。
【００５０】
本発明の診断キットは、ヒトＩｇＥ抗体の検出のための全ての公知の形態であり得る。その例としては、患者の断片に存在するタンパク質に対するアレルギー反応を測定する皮膚プリック試験（Ｓｋｉｎ Ｐｒｉｃｋ Ｔｅｓｔ））などのｉｎ ｖｉｖｏ試験又は、免疫ＣＡＰ定量測定法（Ｉｍｍｕｎｏ ＣＡＰ ａｓｓａｙ）、ラスト定量測定法（ＲＡＳＴ ａｓｓａｙｓ）、エリザ法（ＥＬＩＳＡ）、ヒスタミン放出試験法など被験患者の血清中の抗ラテックスタンパク質ＩｇＥ抗体の存在を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験が挙げられるが、これらに制限されることはない。
【００５１】
該診断用キットは特に、（ラテックス）アレルゲン特異的ＩｇＥ（特にヒトにおける）の検出に有用である。
【００５２】
従って、本発明は更には、本発明の該組成物及び／又は該複合体を体液（例えば、血液又は血清などその画分）と接触させる工程を含んで成る、（ラテックス）アレルゲン特異的ＩｇＥ（例えばヒトにおける）の検出のための診断方法を提供する。体液との接触はまた、例えば皮膚プリック試験（ＳＰＴ）によって本発明の組成物を皮下又は皮内に注射することを含む。本発明による診断方法はまた、免疫ＣＡＰ定量測定法、ラスト法、エリザ法などとして行われることが出来る。
【００５３】
本発明の方法により提供される試薬、特に該組成物はまた、医薬として有用である(又はその製造に有用である)。好ましくは、該発明の組成物は、ラテックスアレルギー又はラテックスフルーツ症候群の予防又は治療に用い得る。該医薬又は医薬組成物は、通常用いられる又は製薬学的に許容される一つ又はそれ以上の担体、基材、及び／又は希釈剤を含んでもよい。
【００５４】
本発明はまた、本発明の組成物又は薬剤をヒト患者、特にラテックスアレルギー若しくは感作及び／又はフルーツアレルギーに罹患しているヒト患者に投与する段階を含んで成る、上記の徴候を予防又は治療する方法に係る。好ましい投与方法としては、筋肉内経路を介した注射又は例えば舌下経路を介した粘膜適用が挙げられる。本発明の予防／治療法は、脱感作療法のプロトコールの形式で実行されるのが好ましい。該プロトコールとしては、アレルゲン抽出物の濃度を一定期間増加させて投与することが挙げられる。
【００５５】
本発明の利点は、Ｈｅｖｅａラテックスからの少数の画分を用いて広範な診断がなされ得ることである。本特許出願においては、これらの画分の調製法を詳細に説明する。なお本発明とは対照的に、ラテックスアレルギーのために実用化されている診断法は、目下のところ全抽出物を用いて行われている。
【００５６】
本発明を下記する制限的ではない実施例によって更に説明する。
【実施例】
【００５７】
実施例１：ラテックス画分の生成・調製
ラテックスＢ−漿液及びＣ−漿液
【００５８】
新鮮なＨｅｖｅａラテックスをゴムの木（Ｈ． ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ， ｃｌｏｎｅ ＲＲＩＭ ６００）から採集した。このラテックスは、４４０００ｇにて４℃で１時間遠心分離し、三つの主要画分に分離した。即ち、ゴム粒子を含む上部画分、水相、即ちＣ−漿液、及びルトイド（ｌｕｔｏｉｄｓ）を含む「重い」下部画分である。水相を集め、次いで遠心分離を繰り返した。得られた透明な水性のＣ−漿液を凍結乾燥し、−２０℃で保存した。ルトイドを含む下部画分は、０．４ｍｏｌ/Ｌのマンニトール中に再懸濁させ、再沈殿させて、交互に凍結と解凍を反復繰り返しして、ルトイドを破壊した。ルトイドの液体、即ちＢ−漿液は、次に遠心分離によって回収した(参考文献１７)。
【００５９】
硫酸アンモニウムによるラテックスＣ−漿液の分画
１００ミリグラムの凍結乾燥ラテックスＣ−漿液を２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）に溶解した。(ＮＨ４)２ＳＯ４を２５％の飽和率にまで添加して、３０分間４℃で攪拌した。沈殿物質は、１２０００ｇにて４℃で２０分間遠心分離した。次に上澄み液中のタンパク質を、(ＮＨ４)２ＳＯ４を５０％飽和率まで添加することによって沈殿させた。沈殿したタンパク質は、遠心分離と(ＮＨ４)２ＳＯ４を上澄み液に７５％飽和率にまで添加することによって回収した。溶液を再度遠心分離し、三回の沈殿工程を経て得たタンパク質を−２０℃で保存した。
【００６０】
陰イオン交換クロマトグラフィー
硫酸アンモニウム分画を行って得た沈殿物を２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）に溶解し、ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を通過させることによって脱塩処理した。それぞれの画分を、ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５カラム(Ｐｈａｒｍａｃｉａ)にかけた。同様に、１００ミリグラムの凍結乾燥ラテックスＢ−漿液をｐＨ７．５の２０ｍＭトリス塩酸に溶解し、ＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５カラムにかけた。非吸着タンパク質は、カラムから同じ緩衝液で溶出し、吸着タンパク質は、ｐＨ７．５の２０ｍＭトリス塩酸中において０乃至１ＭのＮａＣｌの直線勾配を用いて溶出した。
【００６１】
異なるＮａＣｌ濃度で溶出させた幾つかのピーク群を集めて、Ｃ１乃至Ｃ４画分とした。Ｃ１画分は、１５０乃至２００ｍＭ ＮａＣｌで溶出されたタンパク質を含み、Ｃ２画分は、３００乃至５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出されたタンパク質を含むが、両者はいずれも、７５％ (ＮＨ４)２ＳＯ４沈殿物に由来するものであった。かかる操作全体は、異なる二つのバッチのラテックスＣ−漿液について行った。それぞれの画分の５μｇを１２％のＰＡＧＥで分離し、クーマッシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕ）で染色した(図１を参照)。タンパク質のパターンは、極めて類似しているように見えたが、幾つかのタンパク質の濃度は若干の差異があった（図１、レーン１及びレーン２参照）。
【００６２】
ラテックスＢ−漿液を直接陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて、二つの画分を得た。Ｂ１画分は、非吸着タンパク質を含み、Ｂ２画分タンパク質は、１５０乃至２５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。
【００６３】
実施例２：ラテックスＣ−漿液及びＢ−漿液に対するＩｇＥの反応性
レーン当たり１０マイクログラムのタンパク質抽出物又は１マイクログラムの遺伝子組換え型タンパク質を１２％ ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、ドイツ）でブロットした。膜を切断してストリップ片にし、ブロッキング溶液 (４０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、 ７ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ｗ／ｖ アジ化ナトリウム、０．５％ｗ／ｖ トウエーン−２０、ｐＨ７．５)で３０分間処理した。このストリップ片は、次いでブロッキング溶液の中で患者の血清で１：５に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。三つの洗浄工程を経た後で、ブロットを１２５Ｉ標識―抗（ヒトＩｇＥ）Ｉｇ(ＩＢＬ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ)で一晩インキュベートした。患者のＩｇＥがタンパク質に結合する様子は、ＢｉｏｍａｘＴＭ ＭＳフィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、アメリカ）にて可視化した。家屋塵ダニ類に対するＩｇＥ濃度が高いが、皮膚プリック試験には陰性で、ラテックスに対するＣＡＰの結果が陰性である７人の健康なアトピー罹患個人から採取した血清プールをネガティブコントロールとして用いた。
【００６４】
ラテックスＣ−漿液中のタンパク質に対するＩｇＥ反応性が、プール１、２、及び４について観察された（図２ａ、ブロットＣ−漿液参照）。これら血清プールのＩｇＥ反応は、ラテックスＣ−漿液画分において、特に４０乃至８０ｋＤａの範囲のたんぱく質に対して増加した(図２ａ、ブロットＣ１乃至Ｃ４、レーン１、２、及び４を参照)。血清プール３は、ラテックスＣ−漿液中の唯一つのタンパク質のみに対して弱いＩｇＥ反応性を示し（図２ａ、ブロットＣ−漿液、レーン３参照）、少なくとも六種類の異なるタンパク質に対するＩｇＥ反応が、ラテック漿液中で測定可能となった。ラテックスＣ−漿液中のタンパク質に対するＩｇＥ反応は、血清プール５では全く測定出来なかったが、少なくとも四種類のタンパク質が、ラテックスＣ−漿液中において血清プール５によって認識された（図２ａ、ブロットＣ１乃至Ｃ４、レーン５を参照）。七人の家屋塵ダニ類アレルギー被験者の血清プール及び緩衝液対照者は、ラテックスＣ−漿液及び何れのその画分においてもＩｇＥ反応性を全く示さなかった(図２ａ、ブロットＣ−漿液及びＣ１乃至Ｃ４、レーンＮ及びＰを参照)。
【００６５】
ラテックスＢ−漿液中のタンパク質に対するＩｇＥ反応は、漿液プール１、２、３、及び４について測定可能であった（図２ｂ、ブロットＢ−漿液、レーン１乃至４を参照）。ラテックスＢ−漿液画分においては、ＩｇＥ反応性タンパク質の全数が明確に増加することは、これらの血清プールについては全く検出不能であったが、特に３３乃至３５ｋＤａの範囲におけるいくつかのタンパク質の濃度が高くなったことが、測定可能であった（図２ｂ、ブロットＢ１及びＢ２、レーン１乃至４を参照）。血清プール５は、ラテックスＢ−漿液に対して全くＩｇＥ反応性を示さなかったが、Ｂ１画分においては、およそ３３ｋＤａのタンパク質バンドが検出可能であった（図２ｂ、ブロットＢ−漿液、Ｂ１、及びＢ２、レーン５を参照）。７人の家屋塵ダニ類アレルギー被験者及び緩衝液対照者は、ラテックスＢ−漿液及びその何れの画分においても全くＩｇＥ反応性を示さなかった（図２ｂ、ブロットＢ−漿液、Ｂ１、及びＢ２、レーンＮ及びＰを参照）。
【００６６】
実施例３：重要なラテックスアレルゲンの存在
本発明のラテックス画分は、重要なラテックスアレルゲンであるＨｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６、及びＨｅｖ ｂ ８を含む。組換え型Ｈｅｖ ｂ ５、ｒＨｅｖ ｂ ６、及びｒＨｅｖ ｂ ８を１２％ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース上でブロットした。膜切片は、試験してそれぞれのアレルゲンに対するＩｇＥの存在を示す三つの血清からそれぞれ成る血清プールと共にインキュベートした。阻害試験として、これらの血清を５０μｇのタンパク質抽出物と共にプレインキュベートした。阻害するために、Ｈｅｖ ｂ ５血清プールはＣ３画分と共に、Ｈｅｖ ｂ ６血清プールはＢ２と共に、またＨｅｖ ｂ ８血清プールはＣ１と共に、それぞれプレインキュベートした。血清プールをこれらの画分と共にプレインキュベーションした結果、ＩｇＥの組換え型アレルゲンとの結合が減少するか又は完全に消滅した(図３)。
【００６７】
[参考文献]
1. Hadjiliadis D, Khan K, Tarlo SM. Skin test responses to latex in an allergy and asthma clinic. J Allergy Clin Immunol 1995; 96:431-2.
2. Hadjiliadis D, Banks DE, Tarlo SM. The relationship between latex skin prick test responses and clinical allergic responses. J Allergy Clin Immunol 1996; 97:1202-6.
3. Hamilton RG, Adkinson NF, Jr. Natural rubber latex skin testing reagents: safety and diagnostic accuracy of nonammoniated latex, ammoniated latex, and latex rubber glove extracts. J Allergy Clin Immunol 1996; 98:872-83.
4. Turjanmaa K, Palosuo T, Alenius H, Leynadier F, Autegarden JE, Andre C, et al. Latex allergy diagnosis: in vivo and in vitro standardization of a natural rubber latex extract. Allergy 1997; 52:41-50.
5. Hamilton RG, Adkinson NF, Jr. Diagnosis of natural rubber latex allergy: multicenter latex skin testing efficacy study. Multicenter Latex Skin Testing Study Task Force. J Allergy Clin Immunol 1998; 102:482-90.
6. Hamilton RG, Peterson EL, Ownby DR. Clinical and laboratory-based methods in the diagnosis of natural rubber latex allergy. J Allergy Clin Immunol 2002; 110:S47-56.
7. Hamilton RG, Biagini RE, Krieg EF. Diagnostic performance of Food and Drug Administration-cleared serologic assays for natural rubber latex-specific IgE antibody. The Multi-Center Latex Skin Testing Study Task Force. J Allergy Clin Immunol 1999; 103:925-30.
8. Ownby DR, Magera B, Williams PB. A blinded, multi-center evaluation of two commercial in vitro tests for latex-specific IgE antibodies. Ann Allergy Asthma Immunol 2000; 84:193-6.
9. Yip L, Hickey V, Wagner B, Liss G, Slater J, Breiteneder H, et al. Skin prick test reactivity to recombinant latex allergens. Int Arch Allergy Immunol 2000; 121:292-9.
10. Bernstein DI, Biagini RE, Karnani R, Hamilton R, Murphy K, Bernstein C, et al. In vivo sensitization to purified Hevea brasiliensis proteins in health care workers sensitized to natural rubber latex. J Allergy Clin Immunol 2003; 111:610-6.
11. Raulf-Heimsoth M, Rihs HP, Bruning T. Latex: a new target for standardization. Arb Paul Ehrlich Inst Bundesamt Sera Impfstoffe Frankf A M 2003:107-15.
12. Yagami T, Osuna H, Kouno M, Haishima Y, Nakamura A, Ikezawa Z. Significance of carbohydrate epitopes in a latex allergen with beta-1,3-glucanase activity. Int Arch Allergy Immunol 2002; 129:27-37.
13. Posch A, Chen Z, Dunn MJ, Wheeler CH, Petersen A, Leubner-Metzger G, et al. Latex allergen database. Electrophoresis 1997; 18:2803-10.
14. Arreguin B, Lara P, Rodriguez R. Comparative study of electrophoretic patterns of latex proteins from clones of Hevea brasiliensis. Electrophoresis 1988; 9:323-6.
15. Dennis MS, Light DR. Rubber elongation factor from Hevea brasiliensis. Identification, characterization, and role in rubber biosynthesis. J Biol Chem 1989; 264:18608-17.
16. Tomazic-Jezic VJ, Lucas AD. Protein and allergen assays for natural rubber latex products. J Allergy Clin Immunol 2002; 110:S40-6.
17. Sunderasan E, Hamzah S, Hamid S, Ward MA, Yeang HY, Cardosa MJ. Latex B-B-serum-1,3-glucanase (Hev b 2) and a component of the microhelix (Hev b 4) are major latex allergens. J. Nat. Rubber Res. 1996; 10:82-99.
18. Pridgeon et al. Clin. Exp. Allergy 2000, 301444-1449.
19. Nielson et al. Ann. Allergy Asthma ＆ Immunol. 2000, 85:489-494.
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ラテックスＣ−漿液から得られた四つの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ラテックスＣ−漿液の二つの異なるバッチを使用し、タンパク質含有量を比較した。
【図２】それぞれａ）ラテックスＣ−漿液と四つのラテックスＣ画分及びｂ）ラテックスＣ−漿液と二つのラテックスＢ画分に対するラテックスアレルギー被験者の五つの血清から成る五種類の血清プールのＩｇＥ反応性を示す。ニトロセルロースでブロットされた画分を、これらの血清プールとともにインキュベートし、結合したＩｇＥを１２５Ｉで標識した抗ヒトＩｇＥ抗体で検出した（レーン１から５）。レーンＰ及びＮは、緩衝液対照者及び対照血清プールを示す。分子量マーカーは、表示した通りである。
【図３】Ｈｅｖ ｂ ５、Ｈｅｖ ｂ ６、及びＨｅｖ ｂ ８がラテックス抽出物中に存在することを示している。ニトロセルロースでブロットされたｒＨｅｖ ｂ ５、ｒＨｅｖ ｂ ６及びｒＨｅｖ ｂ ８は、各アレルゲンに対してアレルギーを持つ被験者の三つの血清から成る血清プールと共にインキュベートした。Ｈｅｖ ｂ ５に対する血清プールは、Ｃ３の画分と共に、Ｈｅｖ ｂ ６血清プールは、Ｂ２の画分と共に、またＨｅｖ ｂ ８血清プールはＣ１と共にプレインキュベートした。結合したＩｇＥは、１２５Ｉで標識された抗ヒトＩｇＥ抗体で検出した（レーン１から５）。レーンＰ及びＮは、緩衝液対照者及び対照血清プールを示す。分子量マーカーは、表示した通りである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然ゴムラテックス（ＮＲＬ）由来の一種以上のタンパク質画分又は一種以上のその抽出物を分画沈殿及び/又はクロマトグラフィー分離によって調製する工程を含んで成る、ＮＲＬの天然ヒトＩｇＥ結合性タンパク質を実質的に全て含む組成物を製造する方法。
【請求項２】
下記工程を含んで成る、請求項１に記載の方法：
（ａ）ＮＲＬの一種以上のタンパク質画分又はその抽出物を分画沈殿によって調製する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）で得られたタンパク質画分をクロマトグラフィー分離に付する工程。
【請求項３】
分画沈殿及び/又はクロマトグラフィー分離によって得られたＮＲＬの少なくとも一つの画分が、天然ゴムラテックスのタンパク質に結合するＩｇＥ抗体を含む少なくとも一種の漿液を用いて試験され、ＩｇＥ抗体が結合するタンパク質の有無を確認する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分画沈殿及び／又はクロマトグラフィー分離により得られたＮＲＬの一つの画分が、分析方法、具体的にはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって更に分離され、次いで分析によって分離されたタンパク質が、ラテックスアレルギー患者から得られた少なくとも一つの血清との反応に供され、次いで結合したＩｇＥ抗体が、検出される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＮＲＬが、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓに由来する、請求項１乃至４に記載の方法。
【請求項６】
ＮＲＬが、非アンモニア処理ラテックス（ＮＡＬ）である、請求項１乃至５の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＮＡＬの抽出物が、遠心分離によって得られるものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＮＡＬの該抽出物が、Ｃ-漿液及び／又はＢー漿液である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
下記する工程を含んで成る、請求項８記載の方法：
（ｉ）ＮＡＬのＣー漿液の一種以上のタンパク質画分を分画沈殿により調製する工程、
（ｉｉ）工程（ａ）において得られた一種以上のタンパク質画分をクロマトグラフィー分離に付する工程、及び
（ｉｉｉ）ＮＡＬのＢ−漿液をクロマトグラフィー分離に付す工程。
【請求項１０】
分画沈殿が、ＮＲＬ又はその抽出物のｐＨ及び／又はイオン強度を変化させること及び/又は一種の変性剤及び/又は塩を導入・混入することによって行われる、請求項１乃至９の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
分画沈殿が、塩又は有機溶媒を添加することによって行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該塩が、硫酸アンモニウム、ＮａＣｌ及びＮａ２ＳＯ４からなる群から選ばれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該分画沈殿法が、下記によって行われる、請求項１２に記載の方法。
（１）ＮＲＬ又はその抽出物に飽和率として１５乃至３５％、好ましくは２０乃至３０％、より好ましくは２２乃至２８％、特に２５％の濃度になるように硫酸アンモニウムを添加すること、
（２）第一の沈殿及び第一の上澄み液を遠心分離によって回収すること、
（３）第一の上澄み液に、飽和率として４０乃至６０％、好ましくは４５乃至５５％、より好ましくは４７乃至５３％、特に５０％の濃度になるように硫酸アンモニウムを添加すること、
（４）第二の沈殿及び第二の上澄み液を遠心分離によって回収すること、
（５）第二の上澄み液に飽和率として６５乃至８５％、好ましくは７０乃至８０％、より好ましくは７２乃至７８％、特に７５％の濃度になるように硫酸アンモニウムを添加すること、並びに
（６）第三の沈殿及び第三の上澄み液を遠心分離によって回収すること
【請求項１４】
該抽出物が、ＮＡＬのＣー漿液である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
クロマトグラフィー分離が、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー及び/又はラテックスアレルゲン特異的免疫グロブリンとのアフィニティークロマトグラフィーである、請求項１乃至１４の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
イオン交換クロマトグラフィーが、陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
陰イオン交換クロマトグラフィーが、ＭｏｎｏＱ及びＤＥＡＥからなる群から選択される樹脂を用いて行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
陰イオン交換クロマトグラフィーが、ｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸の緩衝液において直線溶出勾配を０乃至１Ｍ ＮａＣｌとして行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１乃至１８の内のいずれか一項に記載の方法によって得られる、天然ゴムラテックス（ＮＲＬ）の天然ヒトＩｇＥ結合性タンパク質の実質的に全てを含む組成物。
【請求項２０】
下記によって調製されるタンパク質画分を含む、請求項１９に記載の組成物。
（Ａ）ＮＡＬ Ｃ−漿液のタンパク質画分を分画沈殿により調製すること、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたタンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィーに付すること、及び
（Ｃ）ＮＡＬのＢ―漿液を陰イオン交換クロマトグラフィーに付すこと。
【請求項２１】
分画沈殿が、下記する工程を含んで成る、請求項２０に記載の組成物。
（１）ＮＡＬのＣ―漿液に、飽和率として１５乃至３５％、好ましくは２０乃至３０％、より好ましくは２２乃至２８％特に２５％の濃度になるように硫酸アンモニウムを添加する工程、
（２）第一の沈殿物及び第一の上澄み液を遠心分離によって回収する工程、
（３）第一の上澄み液に、飽和率として４０乃至６０％、好ましくは４５乃至５５％、より好ましくは４７乃至５３％特に５０％の濃度になるように硫酸アンモニウムを添加する工程、
（４）第二の沈殿物及び第二の上澄み液を遠心分離によって回収する工程、
（５）第二の上澄み液に、飽和率として６５乃至８５％、好ましくは７０乃至８０％、より好ましくは７２乃至７８％、特に７５％の濃度になるように硫酸アンモニウムを添加する工程、及び
（６）第三の沈殿物及び第三の上澄み液を遠心分離によって回収する工程。
【請求項２２】
以下を含む、請求項２１に記載の組成物。
― ｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸において第二の沈殿物を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、次いで１２０ｍＭ乃至２３０ｍＭ、好ましくは１４０乃至２１０ｍＭ、特に１５０乃至２００ｍＭのＮａＣｌで溶出することによって得られるタンパク質画分；
― ｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸において第二の沈殿物を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、２７０ｍＭ乃至５３０ｍＭ、好ましくは２９０乃至５１０ｍＭ、特に３００乃至５００ｍＭのＮａＣｌで溶出することによって得られるタンパク質画分；
― ｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸において第三の沈殿物を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、２７０乃至４８０ｍＭ、好ましくは２９０乃至４６０ｍＭ、特に３００乃至４５０ｍＭのＮａＣｌで溶出することよって得られるタンパク質画分；
― ｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸において第三の沈殿物を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、４２０乃至５８０ｍＭ、好ましくは４４０乃至５６０ｍＭ、特に４５０乃至５５０ｍＭのＮａＣｌで溶出することよって得られるタンパク質画分；
― ｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸においてＮＡＬのＢ−漿液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、１２０乃至２８０ｍＭ、好ましくは１４０乃至２６０ｍＭ、特に１５０乃至２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出することによって得られるタンパク質画分；及び、
― ｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸においてＮＡＬのＢ−漿液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、非吸着流出分として溶出することによって得られるタンパク質画分。
【請求項２３】
陰イオン交換クロマトグラフィーが、ＭｏｎｏＱ又はＤＥＡＥで行われる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１９乃至２３の内のいずれか一項に記載の化合物が、固体担体上に固定される、担体―タンパク質複合体。
【請求項２５】
担体が、該組成物で被覆されるか又は該組成物に結合される、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２６】
担体がビーズ、膜、計深棒及びガラスチップからなる群から選択される、請求項２４又は２５に記載の複合体。
【請求項２７】
請求項１９乃至２３のうちのいずれか一項に記載の組成物及び／又は請求項２４乃至２６のうちのいずれか一項に記載の複合体を、ヒトＩｇＥ抗体検出のために通常用いられる試薬と組み合わせて含んで成る診断キット。
【請求項２８】
請求項１９乃至２３の内のいずれか一項に記載の組成物の、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体のインビトロ検出のためへの使用。
【請求項２９】
請求項１９乃至２３の内のいずれか一項に記載の組成物の、ラテックスアレルギー又はラテックスフルーツ症候群の予防又は治療用の薬剤を製造するためへの使用。
【請求項１】
天然ゴムラテックス（ＮＲＬ）由来の一種以上のタンパク質画分又は一種以上のその抽出物を分画沈殿及び/又はクロマトグラフィー分離によって調製する工程を含んで成る、ＮＲＬの天然ヒトＩｇＥ結合性タンパク質を実質的に全て含む組成物を製造する方法。
【請求項２】
下記工程を含んで成る、請求項１に記載の方法：
（ａ）ＮＲＬの一種以上のタンパク質画分又はその抽出物を分画沈殿によって調製する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）で得られたタンパク質画分をクロマトグラフィー分離に付する工程。
【請求項３】
分画沈殿及び/又はクロマトグラフィー分離によって得られたＮＲＬの少なくとも一つの画分が、天然ゴムラテックスのタンパク質に結合するＩｇＥ抗体を含む少なくとも一種の漿液を用いて試験され、ＩｇＥ抗体が結合するタンパク質の有無を確認する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分画沈殿及び／又はクロマトグラフィー分離により得られたＮＲＬの一つの画分が、分析方法、具体的にはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって更に分離され、次いで分析によって分離されたタンパク質が、ラテックスアレルギー患者から得られた少なくとも一つの血清との反応に供され、次いで結合したＩｇＥ抗体が、検出される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＮＲＬが、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓに由来する、請求項１乃至４に記載の方法。
【請求項６】
ＮＲＬが、非アンモニア処理ラテックス（ＮＡＬ）である、請求項１乃至５の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＮＡＬの抽出物が、遠心分離によって得られるものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＮＡＬの該抽出物が、Ｃ-漿液及び／又はＢー漿液である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
下記する工程を含んで成る、請求項８記載の方法：
（ｉ）ＮＡＬのＣー漿液の一種以上のタンパク質画分を分画沈殿により調製する工程、
（ｉｉ）工程（ａ）において得られた一種以上のタンパク質画分をクロマトグラフィー分離に付する工程、及び
（ｉｉｉ）ＮＡＬのＢ−漿液をクロマトグラフィー分離に付す工程。
【請求項１０】
分画沈殿が、ＮＲＬ又はその抽出物のｐＨ及び／又はイオン強度を変化させること及び/又は一種の変性剤及び/又は塩を導入・混入することによって行われる、請求項１乃至９の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
分画沈殿が、塩又は有機溶媒を添加することによって行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該塩が、硫酸アンモニウム、ＮａＣｌ及びＮａ２ＳＯ４からなる群から選ばれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該分画沈殿法が、下記によって行われる、請求項１２に記載の方法。
（１）ＮＲＬ又はその抽出物に飽和率として１５乃至３５％、好ましくは２０乃至３０％、より好ましくは２２乃至２８％、特に２５％の濃度になるように硫酸アンモニウムを添加すること、
（２）第一の沈殿及び第一の上澄み液を遠心分離によって回収すること、
（３）第一の上澄み液に、飽和率として４０乃至６０％、好ましくは４５乃至５５％、より好ましくは４７乃至５３％、特に５０％の濃度になるように硫酸アンモニウムを添加すること、
（４）第二の沈殿及び第二の上澄み液を遠心分離によって回収すること、
（５）第二の上澄み液に飽和率として６５乃至８５％、好ましくは７０乃至８０％、より好ましくは７２乃至７８％、特に７５％の濃度になるように硫酸アンモニウムを添加すること、並びに
（６）第三の沈殿及び第三の上澄み液を遠心分離によって回収すること
【請求項１４】
該抽出物が、ＮＡＬのＣー漿液である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
クロマトグラフィー分離が、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー及び/又はラテックスアレルゲン特異的免疫グロブリンとのアフィニティークロマトグラフィーである、請求項１乃至１４の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
イオン交換クロマトグラフィーが、陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
陰イオン交換クロマトグラフィーが、ＭｏｎｏＱ及びＤＥＡＥからなる群から選択される樹脂を用いて行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
陰イオン交換クロマトグラフィーが、ｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸の緩衝液において直線溶出勾配を０乃至１Ｍ ＮａＣｌとして行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１乃至１８の内のいずれか一項に記載の方法によって得られる、天然ゴムラテックス（ＮＲＬ）の天然ヒトＩｇＥ結合性タンパク質の実質的に全てを含む組成物。
【請求項２０】
下記によって調製されるタンパク質画分を含む、請求項１９に記載の組成物。
（Ａ）ＮＡＬ Ｃ−漿液のタンパク質画分を分画沈殿により調製すること、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られたタンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィーに付すること、及び
（Ｃ）ＮＡＬのＢ―漿液を陰イオン交換クロマトグラフィーに付すこと。
【請求項２１】
分画沈殿が、下記する工程を含んで成る、請求項２０に記載の組成物。
（１）ＮＡＬのＣ―漿液に、飽和率として１５乃至３５％、好ましくは２０乃至３０％、より好ましくは２２乃至２８％特に２５％の濃度になるように硫酸アンモニウムを添加する工程、
（２）第一の沈殿物及び第一の上澄み液を遠心分離によって回収する工程、
（３）第一の上澄み液に、飽和率として４０乃至６０％、好ましくは４５乃至５５％、より好ましくは４７乃至５３％特に５０％の濃度になるように硫酸アンモニウムを添加する工程、
（４）第二の沈殿物及び第二の上澄み液を遠心分離によって回収する工程、
（５）第二の上澄み液に、飽和率として６５乃至８５％、好ましくは７０乃至８０％、より好ましくは７２乃至７８％、特に７５％の濃度になるように硫酸アンモニウムを添加する工程、及び
（６）第三の沈殿物及び第三の上澄み液を遠心分離によって回収する工程。
【請求項２２】
以下を含む、請求項２１に記載の組成物。
― ｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸において第二の沈殿物を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、次いで１２０ｍＭ乃至２３０ｍＭ、好ましくは１４０乃至２１０ｍＭ、特に１５０乃至２００ｍＭのＮａＣｌで溶出することによって得られるタンパク質画分；
― ｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸において第二の沈殿物を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、２７０ｍＭ乃至５３０ｍＭ、好ましくは２９０乃至５１０ｍＭ、特に３００乃至５００ｍＭのＮａＣｌで溶出することによって得られるタンパク質画分；
― ｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸において第三の沈殿物を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、２７０乃至４８０ｍＭ、好ましくは２９０乃至４６０ｍＭ、特に３００乃至４５０ｍＭのＮａＣｌで溶出することよって得られるタンパク質画分；
― ｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸において第三の沈殿物を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、４２０乃至５８０ｍＭ、好ましくは４４０乃至５６０ｍＭ、特に４５０乃至５５０ｍＭのＮａＣｌで溶出することよって得られるタンパク質画分；
― ｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸においてＮＡＬのＢ−漿液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、１２０乃至２８０ｍＭ、好ましくは１４０乃至２６０ｍＭ、特に１５０乃至２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出することによって得られるタンパク質画分；及び、
― ｐＨ７乃至７．８、好ましくは７．３乃至７．６、特に７．５である、１０乃至５０ｍＭ、好ましくは１５乃至３０ｍＭ、特に２０ｍＭのトリス塩酸においてＮＡＬのＢ−漿液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、非吸着流出分として溶出することによって得られるタンパク質画分。
【請求項２３】
陰イオン交換クロマトグラフィーが、ＭｏｎｏＱ又はＤＥＡＥで行われる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１９乃至２３の内のいずれか一項に記載の化合物が、固体担体上に固定される、担体―タンパク質複合体。
【請求項２５】
担体が、該組成物で被覆されるか又は該組成物に結合される、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２６】
担体がビーズ、膜、計深棒及びガラスチップからなる群から選択される、請求項２４又は２５に記載の複合体。
【請求項２７】
請求項１９乃至２３のうちのいずれか一項に記載の組成物及び／又は請求項２４乃至２６のうちのいずれか一項に記載の複合体を、ヒトＩｇＥ抗体検出のために通常用いられる試薬と組み合わせて含んで成る診断キット。
【請求項２８】
請求項１９乃至２３の内のいずれか一項に記載の組成物の、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体のインビトロ検出のためへの使用。
【請求項２９】
請求項１９乃至２３の内のいずれか一項に記載の組成物の、ラテックスアレルギー又はラテックスフルーツ症候群の予防又は治療用の薬剤を製造するためへの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００８−５０５９５４（Ｐ２００８−５０５９５４Ａ）
【公表日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２０７２４（Ｐ２００７−５２０７２４）
【出願日】平成１７年７月８日（２００５．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００７４０５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００５５３５
【国際公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【出願人】（５０４４４６４８９）バイオメイ プロダクションズ−ウント ハンデルス−アクツェンゲゼルシャフト (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月２８日（２００８．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月８日（２００５．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００７４０５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００５５３５
【国際公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【出願人】（５０４４４６４８９）バイオメイ プロダクションズ−ウント ハンデルス−アクツェンゲゼルシャフト (4)
【Ｆターム（参考）】
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