ラン科植物の製造方法およびＰＬＢ増殖用蛍光体
【課題】植物ホルモンを用いずともラン科植物を効率よく製造できる方法を提供する。また、ＰＬＢの増殖を促進することができる、ＰＬＢ増殖用の蛍光体を提供する。
【解決手段】多環系フェナジン化合物または多環系オキサゾール化合物を色素として含む蛍光体による波長変換光をラン科植物のＰＬＢに照射することによりＰＬＢを増殖させＰＬＢから根等を誘導して苗条としさらに成長させるラン科植物の製造方法。
【解決手段】多環系フェナジン化合物または多環系オキサゾール化合物を色素として含む蛍光体による波長変換光をラン科植物のＰＬＢに照射することによりＰＬＢを増殖させＰＬＢから根等を誘導して苗条としさらに成長させるラン科植物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラン科植物を製造するための方法と、当該方法で用いるＰＬＢ増殖用蛍光体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
通常、植物体は種子から成長し、一個の種子からは一個の植物体が成長する。しかしラン科植物の場合、生長点にＰＬＢ（プロトコーム様小球体）という細胞塊が形成される。このＰＬＢは、分化までにさらに増殖させることが可能であり、増殖した個々のＰＬＢが一個の植物体に成長し得る。よって、ラン科植物を製造する場合には、ＰＬＢを増殖させた後、個々のＰＬＢを分化させて多数のクローン苗を得るのが効率的である。
【０００３】
ＰＬＢを増殖させるには、特許文献１に記載の技術のように、培地中に合成植物ホルモンであるナフタレン酢酸とベンジルアデニンを添加することが一般的である。
【０００４】
しかし、合成植物ホルモンは環境に悪影響を与えるおそれがあるため、安易に廃棄することができない。また、合成植物ホルモンを使用する場合、ＰＬＢに形態的な異常が生じるばかりでなく、遺伝的な変異が多発する。従って、合成植物ホルモンを使わずにＰＬＢを増殖させる技術が求められている。
【０００５】
ところで、植物は光合成によりエネルギーを産生して成長し、また、光形態形成という光応答反応により、その生長や分化が制御されている。これらの光反応には、それぞれ有効な波長の光がある。よって、各光反応に有効な波長の光を照射することにより植物の成長を促進する技術が種々検討されている。例えば特許文献２には、発光ピークが４２０〜５３０ｎｍまたは６００〜７００ｎｍにある蛍光顔料を含有する農業用フィルムが開示されている。また、特許文献３には、波長領域が６３０〜６８０ｎｍの赤色ＬＥＤと波長領域が３８０〜４８０ｎｍの青色ＬＥＤを有する植物栽培用ＬＥＤ光源が記載されている。
【０００６】
しかしながら、ＰＬＢは黄緑色から黄色、場合によっては黄色から白色を呈し、葉緑素を十分に有しているものではない。また、ＰＬＢを増殖せしめるには、単にＰＬＢの細胞増殖を促すのみでは不十分であり、新たなＰＬＢの形成を促進しなければならない。よって、光合成反応に有効な光をＰＬＢへ照射したとしても、ＰＬＢの増殖が促進されるとは限らない。
【０００７】
上述したような植物の育成技術とは関係なく、本発明者の一人はかねてより蛍光色素について研究しており、例えば特許文献４〜６のとおり、優れた蛍光色素を開発している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平７−１０７８７１号公報
【特許文献２】特開平５−２２７８４９号公報
【特許文献３】特開平９−２５２６５１号公報
【特許文献４】特開２００７−２１１１８５号公報
【特許文献５】特開２００８−１９５７４９号公報
【特許文献６】国際公開第２００５／０７８０２４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述した様に、ラン科植物を効率的に製造するためには、まずＰＬＢを増殖させてから、各ＰＬＢから根等を誘導して苗条とし、さらに成長させることが望ましいが、従来方法では、ＰＬＢの増殖のために合成植物ホルモンを使用していた。しかし、合成植物ホルモンは環境に悪影響を与えるだけでなく、異常ＰＬＢの発生率を高めるという問題がある。
【００１０】
そこで本発明が解決すべき課題は、植物ホルモンを用いずともラン科植物を効率に製造できる方法を提供することにある。また、本発明は、ＰＬＢの増殖を促進することができる、ＰＬＢ増殖用の蛍光体を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた。その結果、本発明者の一人が開発していた多環系フェナジン化合物と多環系オキサゾール化合物のうち特定なものが発する蛍光をＰＬＢに照射したところ、ＰＬＢの増殖が促進され、且つ植物ホルモンを用いた場合よりも異常ＰＬＢの発生率を抑制できることを見出して、本発明を完成した。
【００１２】
本発明に係るラン科植物の製造方法は、下記式（Ｉ1）、式（Ｉ2）または（Ｉ3）で表される多環化合物を色素として含む蛍光体による波長変換光を照射することによりＰＬＢを増殖させる工程を含むことを特徴とする。
【００１３】
【化１】
【００１４】
［式（Ｉ1）中、
Ｒ1は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ8、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ8、ハロゲン基またはシアノ基を示し；
Ｒ2とＲ3は一緒になって−Ｘ1−を形成し且つＲ4とＲ5は共に水素原子を示すか、またはＲ2とＲ3は共に水素原子を示し且つＲ4とＲ5は一緒になって−Ｘ1−を形成し；
Ｒ6とＲ7は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｒ8は、水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ1は、−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ9）−基を示し；
Ｒ9は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
式（Ｉ2）中、
Ｒ10とＲ11は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｒ12とＲ13は一緒になって−Ｘ2−を形成し且つＲ14とＲ15は共に水素原子を示すか、またはＲ12とＲ13は共に水素原子を示し且つＲ14とＲ15は一緒になって−Ｘ2−を形成し；
Ｒ16とＲ17は一緒になって−Ｘ3−を形成し且つＲ18とＲ19は共に水素原子を示すか、またはＲ16とＲ17は共に水素原子を示し且つＲ18とＲ19は一緒になって−Ｘ3−を形成し；
Ｒ20とＲ21は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ2とＸ3は、それぞれ独立して−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ22）−基を示し；
Ｒ22は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
式（Ｉ3）中、
Ｒ23は、置換基を有していてもよいＣ6-20芳香族炭化水素基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示し；
Ｒ24とＲ25は一緒になって−Ｘ4−を形成し且つＲ26とＲ27は共に水素原子を示すか、またはＲ24とＲ25は共に水素原子を示し且つＲ26とＲ27は一緒になって−Ｘ4−を形成し；
Ｒ28とＲ29は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ4は、−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ30）−基を示し；
Ｒ30は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
芳香族炭化水素基またはヘテロアリール基の置換基は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、水酸基、ハロゲン基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基およびシアノ基からなる群より選択される１以上の基を示す］
【００１５】
上記方法においては、さらに、ＰＬＢにＮ−アセチルグルコサミンを作用させることが好ましい。Ｎ−アセチルグルコサミンはキチンやキトサンから得られる天然成分であり、合成ホルモンと異なり安全である上に、蛍光体から放出される光とＮ−アセチルグルコサミンとの作用により、ＰＬＢ数が相乗的に増加することが実験的に確認されている。
【００１６】
上記蛍光体としては、マトリクス樹脂としてポリスチレンを含むものが好適である。マトリクス樹脂としてのポリスチレンに上記多環系フェナジン化合物または多環系オキサゾール化合物が分散している蛍光体は、特にＰＬＢの増殖を促進するのみならず、上記化合物の発光性や耐光性も向上するからである。
【００１７】
また、上記蛍光体としては、エンボス加工された蛍光フィルムが好適である。無処理の蛍光透明フィルムの場合、上記化合物由来の蛍光が側面から漏れ出してしまうことがあるが、エンボス加工によりかかる漏出はなくなり、ＰＬＢへ効率的に蛍光を照射することが可能になる。また、反射光を利用する場合にも、おそらく光の利用効率が高まることによると考えられるが、エンボス加工された蛍光フィルムを用いるとより良好な結果が得られる。
【００１８】
上記蛍光体としては、さらにジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルを含むものが好適である。ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルにより、蛍光体の耐光性はより一層向上する。
【００１９】
本発明に係るＰＬＢ増殖用蛍光体は、上記化合物を色素として含むことを特徴とする。
【００２０】
また、マトリクス樹脂としてポリスチレンを含むものや、エンボス加工されているもの、ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルを含むものが好適であることは、上述したとおりである。
【００２１】
本発明において「ハロゲン基」としては、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードが挙げられる。
【００２２】
「Ｃ1-8アルキル基」とは、炭素数が１〜８の直鎖状または分枝鎖状の１価脂肪族炭化水素基を意味する。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等である。Ｒ6〜Ｒ7、Ｒ10〜Ｒ11、Ｒ20〜Ｒ21およびＲ28〜Ｒ29としては、Ｃ3-6アルキル基がより好ましく、Ｃ4-5アルキル基がさらに好ましい。Ｒ8としてはＣ1-4アルキル基がより好ましく、Ｃ2-4アルキル基がさらに好ましい。また、「Ｃ1-6アルキル基」とは、Ｃ1-8アルキル基のうち炭素数が１〜６の１価脂肪族炭化水素基を意味する。Ｒ9、Ｒ22および芳香族炭化水素基またはヘテロアリール基の置換基としては、Ｃ1-4アルキル基がより好ましく、Ｃ1-2アルキル基がさらに好ましく、メチルが特に好ましい。
【００２３】
「Ｃ6-20芳香族炭化水素基」とは、炭素数が６〜２０の芳香族炭化水素基を意味する。例えば、フェニル、ナフチル、ビフェニル、フェナンスレニル、アントラセニル、ピレニル、クリセニル、ナフタセニル、ペリレニル等を挙げることができる。
【００２４】
「ヘテロアリール基」は、窒素原子、酸素原子または硫黄原子等のヘテロ原子を少なくとも１個有する５員芳香族ヘテロシクリル基、６員環芳香族ヘテロシクリル基または縮合芳香族ヘテロシクリル基を意味する。「ヘテロアリール基」としては、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チエニル、フリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾール等の５員環ヘテロアリール基；ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル等の６員環ヘテロアリール基；インドリル、イソインドリル、インダゾリル、プリニル、キノリジニル、イソキノリジニル、キノリニル、クロメリル、チアンスレニル、フェノキサゾール、フェノチアゾールなどの縮合ヘテロアリールが含まれる。好ましくは窒素原子を含むヘテロアリールであり、より好ましくはピリジニルである。
【００２５】
「Ｃ1-6アルコキシ基」は、炭素数１〜６の直鎖状または分枝鎖状の脂肪族炭化水素オキシ基を意味する。例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ等を挙げることができる。好ましくはＣ1-4アルコキシであり、より好ましくはＣ1-2アルコキシであり、特に好ましくはメトキシである。
【００２６】
「アルコキシカルボニル基」は、上記Ｃ1-6アルコキシ基に置換されたカルボニル基を意味する。
【００２７】
「アルキルアミノ基」とは、アミノ基に１個のＣ1-6アルキル基が結合している基をいう。例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、イソブチルアミノ、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ、ペンチルアミノ、イソアミルアミノ、ヘキシルアミノ等である。当該基としては、Ｃ1-4アルキルアミノ基が好ましく、Ｃ1-2アルキルアミノ基がより好ましく、特にメチルアミノ基が好ましい。
【００２８】
「ジアルキルアミノ基」とは、アミノ基に２個のＣ1-6アルキル基が結合している基をいう。例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジ（ｎ−ブチル）アミノ、イソブチルメチルアミノ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルアミノ、ジペンチルアミノ、イソアミルメチルアミノ、ジヘキシルアミノ等である。当該基としては、ジ（Ｃ1-4アルキル）アミノ基が好ましく、ジ（Ｃ1-2アルキル）アミノ基がより好ましく、特にジメチルアミノ基が好ましい。
【００２９】
芳香族炭化水素基またはヘテロアリール基が置換基を有する場合、置換基数は特に制限されないが、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、植物ホルモンを用いることなくＰＬＢの増殖を促進できるのみならず、異常ＰＬＢの発生率を低減することができる。よって本発明方法と、本発明方法で使用できる蛍光体は、ラン科植物の製造のために極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例で使用した各多環系フェナジン化合物および多環系アントラキノン化合物の吸収スペクトルと蛍光スペクトルである。（１）は吸収スペクトルであり、（２）は蛍光スペクトルである。
【図２】ＰＬＢに各フィルムの透過光を照射した場合における、生じたＰＬＢの総数の経時的な変化を示すグラフである。
【図３】ＰＬＢに、本発明フィルムの透過光と反射光を照射した場合における、生じたＰＬＢの総数の経時的な変化を示すグラフである。
【図４】本発明に係るＮＢ−ＰＳフィルムとＮＢ−ＰＭＭＡフィルムの耐光性試験の結果を示すグラフである。
【図５】本発明に係るＢＤ−ＰＳフィルムとＢＤ−ＰＣフィルムの耐光性試験の結果を示すグラフである。
【図６】実施例で使用した各多環系オキサゾール化合物の吸収スペクトルと蛍光スペクトルである。（１）は吸収スペクトルであり、（２）は蛍光スペクトルである。
【図７】本発明に係るＢＢ−ＰＳフィルムとＢＰ−ＰＣフィルムの耐光性試験の結果を示すグラフである。
【図８】実施例で使用した各多環系フェナジン化合物の吸収スペクトルと蛍光スペクトルである。（１）は吸収スペクトルであり、（２）は蛍光スペクトルである。
【図９】本発明に係るＢＸ−ＰＳフィルム、ＦＸ−ＰＳフィルムおよびＸＸ−ＰＳフィルムの耐光性試験の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例で使用した各多環系オキサゾール化合物の吸収スペクトルと蛍光スペクトルである。（１）は吸収スペクトルであり、（２）は蛍光スペクトルである。
【図１１】本発明に係るＢＥ−ＰＳフィルム、ＰＰ−ＰＳフィルムおよびＸＨ−ＰＳフィルムの耐光性試験の結果を示すグラフである。
【図１２】ＰＬＢに本発明に係る蛍光体から発せられる蛍光を照射した場合における、生じたＰＬＢの総数の経時的な変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明に係る多環系フェナジン化合物（Ｉ1）は、特許文献５（特開２００８−１９５７４９号公報）に記載の方法により、下記式のとおり製造することができる。
【００３３】
【化２】
【００３４】
上記合成スキーム中、Ｒ1〜Ｒ7は前述したものと同義を示す。
【００３５】
より具体的には、キノン化合物（ＩＩ）とジアミン化合物（ＩＩＩ）を溶媒に溶解し、加熱すればよい。ジアミン化合物（ＩＩＩ）が塩酸塩などの塩である場合には、特に触媒を添加する必要はないが、塩を用いない場合には酢酸等の酸を添加するか、溶媒自体を酢酸等の酸とすればよい。
【００３６】
使用できる溶媒としては、メタノールやエタノールなどのアルコール；ジエチルエーテルやＴＨＦなどのエーテルなどを例示することができる。
【００３７】
上記溶液において、キノン化合物（ＩＩ）とジアミン化合物（ＩＩＩ）は等モルまたは略等モル用いればよいが、一方が他方よりも合成が容易であったり安価である場合には、その一方のモル数を高くしてもよい。当該溶液の濃度は特に制限されないが、化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＩＩ）の合計で０．５〜１０質量％程度にすればよい。
【００３８】
本反応の反応温度は適宜調節すればよいが、例えば６０℃から還流条件程度とすればよい。反応時間も特に制限されず、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）などで原料化合物である化合物（ＩＩ）または化合物（ＩＩＩ）の消費を確認できるまでとすればよいが、通常は３０分〜１２時間程度とする。
【００３９】
反応終了後は、当業者公知の方法により化合物（Ｉ1）を精製すればよい。例えば、反応混合液を大量の水に注ぎ、生じた析出物を濾取してからジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチルなど溶解性の高い溶媒で抽出し、抽出液を水や食塩水などで洗浄した後に乾燥し、溶媒を留去して残渣をクロマトグラフィなどにより精製する。
【００４０】
本発明に係る多環系フェナジン化合物（Ｉ2）は、上記方法を応用して、下記式のとおり製造することができる。
【００４１】
【化３】
【００４２】
上記合成スキーム中、Ｒ10〜Ｒ21は前述したものと同義を示す。
【００４３】
上記合成スキームの原料化合物であるジアミン化合物（Ｖ）は、キノン化合物（ＶＩ）から下記合成スキームにより製造することができる。
【００４４】
【化４】
【００４５】
上記合成スキームの反応は、当業者公知の官能基変換反応である。即ち、キノン化合物のカルボニル基をヒドロキシアンモニウム塩酸塩によりオキシム基に変換し、さらに塩化スズ−塩酸などの触媒によりオキシム基をアミノ基に還元する。具体的な反応条件は、当業者公知のものを採用するか、或いは当業者公知の条件に変更を加えたものとすることができる。
【００４６】
また、多環系フェナジン化合物（Ｉ2）において、−ＮＲ10Ｒ11基と−ＮＲ20Ｒ21基、および対応するＲ12〜Ｒ15とＲ16〜Ｒ19がそれぞれ同一である場合には、特許文献４（特開２００７−２１１１８５号公報）に記載の方法により、下記式のとおり製造することができる。
【００４７】
【化５】
【００４８】
上記合成スキーム中、Ｒ10〜Ｒ15は前述したものと同義を示す。
【００４９】
より具体的には、キノン化合物（ＩＶ'）の酢酸溶液を加熱しながら大過剰の酢酸アンモニウムを小量ずつ加えて反応させればよい。通常酢酸アンモニウムは、キノン化合物（ＩＶ'）に対して１０〜２０倍モル程度使用する。
【００５０】
本反応の反応温度は適宜調節すればよいが、例えば６０℃から還流条件程度とすればよい。反応時間も特に制限されず、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）などで原料化合物である化合物（ＩＶ'）の消費を確認できるまでとすればよいが、通常は１〜１２時間程度とする。
【００５１】
反応終了後は、酢酸を減圧除去した後、当業者公知の方法により化合物（Ｉ2'）を精製すればよい。例えば、残渣をジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチルなど溶解性の高い溶媒に溶解して、水や食塩水などで洗浄した後に乾燥し、溶媒を留去して残渣をクロマトグラフィなどにより精製する。
【００５２】
本発明に係る多環系フェナジン化合物（Ｉ1）および（Ｉ2）は、特定の光を吸収して特定の光を発する。特に赤色光を発するが、赤色以外の光がＰＬＢの増殖に関与している可能性がある。
【００５３】
本発明に係る多環系オキサゾール化合物（Ｉ3）は、特許文献６（国際公開第２００５／０７８０２４号パンフレット）に記載の方法により、下記式のとおり製造することができる。
【００５４】
【化６】
【００５５】
上記合成スキーム中、Ｒ23〜Ｒ29は前述したものと同義を示す。
【００５６】
より具体的には、酢酸などの適当な溶媒中において、キノン化合物（ＶＩＩＩ）と、若干過剰のアルデヒド化合物（ＩＸ）と、大過剰の酢酸アンモニウムを５０〜１００℃程度の温度で反応させればよい。反応時間は特に制限されず、薄層クロマトグラフィなどで原料化合物である化合物（ＶＩＩＩ）の消費を確認できるまでとすればよいが、通常は１〜５時間程度とする。
【００５７】
反応終了後は、当業者公知の方法により化合物（Ｉ3）を精製すればよい。例えば、反応混合液を大量の水に注ぎ、生じた析出物を濾取してからジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチルなど溶解性の高い溶媒で抽出し、抽出液を水や食塩水などで洗浄した後に乾燥し、溶媒を留去して残渣をクロマトグラフィなどにより精製する。
【００５８】
本発明に係る多環系オキサゾール化合物（Ｉ3）は、特定の光を吸収して特定の光を発する。特に青色光〜黄色光を発するが、青色光〜黄色光以外の光がＰＬＢの増殖に関与している可能性がある。
【００５９】
本発明に係る蛍光体は、上記多環系フェナジン化合物（Ｉ1）もしくは（Ｉ2）または上記多環系オキサゾール化合物（Ｉ3）を色素として含む。当該蛍光体の形状は、発光をＰＬＢに照射できるものであれば特に問わない。例えば、フィルム、ペレット、粒状、粉末、筒状等とすることができる。また、透明であってもよいし、不透明であってもよい。透明であれば透過光をＰＬＢに照射すればよいし、不透明であれば反射光をＰＬＢに照射すればよい。
【００６０】
本発明の蛍光体を構成するマトリクス樹脂の種類は特に制限されず、例えば、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリエチレンやポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、エチレン−酢酸ビニル共重合体などの熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００６１】
本発明の蛍光体に含まれる色素化合物が同一であっても、マトリクス樹脂の種類によりＰＬＢの増殖効率が異なったり、また、色素化合物の耐光性が変化することが本発明者らにより明らかにされている。よってマトリクス樹脂は、ラン科植物の種類などに応じて、予備実験などにより適宜決定すればよいが、発光効率と色素耐光性に優れることからポリスチレンが好適である。
【００６２】
なお、本発明において透明とは、可視光、例えば波長３８０〜７８０ｎｍの光の透過率が６０％以上であることをいう。より好ましくは、当該光透過率が８０％以上であることをいう。かかる光透過率を有する蛍光体であれば、透過光をＰＬＢへ照射することができる。また、当該光透過率が低い場合には、反射光をＰＬＢへ照射すればよい。この光透過率は、紫外可視近赤外分光光度計（例えば、日本分光社製の製品名「Ｖ−６７０」など）または瞬間マルチ測光システム（例えば、大塚電子社製の製品名「ＭＣＰＤ−３０００」など）により測定することができる。
【００６３】
本発明に係るＰＬＢ増殖用蛍光体は、多環系フェナジン化合物（Ｉ1）、（Ｉ2）または多環系オキサゾール化合物（Ｉ3）を含むが、これら色素化合物を１種のみ含んでいてもよいし、２種以上含んでいてもよい。
【００６４】
本発明に係る蛍光体へは、マトリクス樹脂と色素化合物の他、ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルを添加することが好ましい。ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルを添加すると、蛍光体の耐光性を向上させることができる。ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルにおける２つのＣ1-6アルキルは、同一であっても異なっていてもよい。当該Ｃ1-6アルキルとしては、Ｃ2-5アルキルが好ましく、Ｃ3-4アルキルがより好ましい。好適には、ジブチルジチオカルバミン酸ニッケルを用いる。
【００６５】
ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルの添加量は適宜調整すればよいが、通常、色素化合物に対して０．１倍モル比以上、５倍モル比以下が好ましく、０．５倍モル比以上、２倍モル比以下がより好ましい。ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルは、用量依存的に色素化合物の耐光性を向上させ、色素化合物に対して１倍モル比程度添加すれば当該耐光性は格段に改善されるが、多過ぎると用量ほどの効果は期待できないので、５倍モル比以下程度にとどめておくことが好ましい。
【００６６】
本発明に係る蛍光フィルムを溶融法で作製する場合には、先ずマトリクス樹脂と色素化合物をバッチミキサーで溶融混練し、マスターバッチを作成する。その後、マトリクス樹脂とマスターバッチを溶融混練し、二軸押し出し機を用いてフィルム状に成形すればよい。また、キャスト法で作製する場合には、マトリクス樹脂と色素化合物を適切な溶媒に溶解または分散させた上で、金属板上にキャストし、乾燥すればよい。その他の形状の蛍光体を製造する場合は、マトリクス樹脂と色素化合物とを含むペレット等を溶融成形すればよい。また、粒状蛍光体や粉末蛍光体を製造する場合には、各種蛍光体を所望の粒度まで粉砕すればよい。
【００６７】
特に本発明の蛍光体を溶融法で作製する場合には、色素化合物を事前に十分に粉砕しておくことが好ましい。なお、本発明に係る色素化合物は、上記マトリクス樹脂や有機溶媒に対して十分な可溶性を示す。
【００６８】
マトリクス樹脂に対する色素化合物の割合は、適宜調整すればよいが、０．０１質量％以上、０．１質量％以下程度とすることが好ましい。当該割合が０．０１質量％未満であると、蛍光体の発光量が少なくなってＰＬＢの増殖効果が十分に得られないおそれがある一方で、当該割合が０．１質量％を超えると蛍光体の強度が確保できなくなる場合があり得る。より好ましくは、０．０５質量％程度にすればよい。また、蛍光フィルムの膜厚も適宜調製すればよいが、通常、８０μｍ以上、１５０μｍ以下とすればよい。
【００６９】
本発明の蛍光フィルムは、エンボス加工することが好ましい。無処理の蛍光透明フィルムの場合、上記多環系フェナジン化合物由来の蛍光が側面から漏れ出してしまうことがあるが、エンボス加工によりかかる漏出はなくなり、ＰＬＢへ効率的に蛍光を照射することが可能になる。また、エンボス加工された不透明の蛍光フィルムは、照射光を効率的に反射できることから、ＰＬＢへ効果的に反射光を照射することができる。
【００７０】
エンボス加工は、片面のみに施してもよいし、両面に施してもよい。また、その形状は特に制限されないが、例えば、上から見た形状が０．５〜３ｍｍ程度の円、楕円、四角形などであり、高さが０．１〜１ｍｍ程度の凸部または凹部を、０．５〜５ｍｍ程度の間隔で形成すればよい。エンボス加工は常法で行うことができ、例えば、蛍光フィルムをエンボスロール間に通せばよい。
【００７１】
本発明方法においては、上記蛍光体による波長変換光をＰＬＢに照射する。
【００７２】
ＰＬＢは、ラン科植物の生長点に形成されたものを採取し、そのまま用いればよい。採取したＰＬＢは、ＭＳ培地など適切な培地上に植え付ける。
【００７３】
蛍光体による波長変換光とは、上記蛍光体へ照射された光を上記色素化合物が吸収することにより、さらに当該色素化合物から発せられる蛍光をいう。ここで、色素化合物は特定の波長の光を吸収して特定の波長の光を発する性質を有し、吸収光の波長と発せられる蛍光の波長は異なることから、色素化合物から発せられる蛍光を波長変換光という。この波長変換光には、上記蛍光体の透過光や反射光がある。
【００７４】
本発明者らによる実験的知見により、ラン科植物の種類によって、ＰＬＢの増殖等に適した色素化合物が異なり得ることが明らかにされている。よって、予備実験などにより、製造すべきラン科植物の種類に応じて、適切な色素化合物を選択することが好ましい。
【００７５】
蛍光体に光を照射する光源としては、色素化合物が選択的に吸収する波長の光を含むものを用い、好ましくは当該光を多く放射できるものを用いる。例えば、白色蛍光灯や擬似太陽光などを用いればよい。また、本発明者らによる実験的知見によれば、ラン科植物の種類により、より好ましい光源があり得る。よって、予備実験などにより、製造すべきラン科植物の種類に応じて、適切な光源を選択することが好ましい。
【００７６】
ＰＬＢに上記蛍光透明フィルムの透過光を照射する場合には、ＰＬＢと光源との間に上記蛍光透明フィルムを配置する。例えば、光源を蛍光透明フィルムで覆ったり、単に中間部に配置したり、或いはＰＬＢの培養瓶などを蛍光透明フィルムで被覆してもよい。
【００７７】
反射光を照射する場合には、透明な蛍光フィルムや蛍光粉末等の層の下および側面あるいはその両方に、例えば白色の高反射材を敷き、下からおよび側面からの反射光を遮らないような培地や容器を使用することが望ましい。不透明な蛍光フィルム等を用いる場合には、反射光をＰＬＢに照射すればよい。
【００７８】
また、粒状蛍光体や粉末状蛍光体は、培地に添加してもよい。
【００７９】
さらに、ＰＬＢにＮ−アセチルグルコサミンを作用させるのも好適な態様である。Ｎ−アセチルグルコサミンを作用させれば、蛍光体から放出される光との相乗作用により、ＰＬＢ数が増加する。Ｎ−アセチルグルコサミンは、ＰＬＢの培地へ添加すればよい。Ｎ−アセチルグルコサミンの使用量は、適宜調整すればよいが、例えば、培地に対して１ｍｇ／Ｌ以上、２０ｍｇ／Ｌ以下程度とすることができる。
【００８０】
波長変換光の照射時間は適宜調整すればよいが、通常、培養期間中において、１０日以上、５０日以下程度とする。また、蛍光灯などの人工光源を用いる場合には、太陽光の場合と同様に、１日当たりの光照射時間を１２時間以上、１６時間以下程度にすることが好ましい。
【００８１】
波長変換光の照射時における温度は特に制限されず、ＰＬＢの増殖に適した温度に調整すればよい。具体的には、常温でもよいし、また、外気温が低過ぎる場合には２０〜３０℃程度に温度調節してもよい。
【００８２】
ＰＬＢ増殖のための最適な光環境は、ラン科植物の種類により大きく変化し得るが、具体的な波長変換光の照射条件は、安価な白色蛍光灯と本発明に係る蛍光体を組合わせた予備実験により簡便に決定することができる。
【００８３】
本発明に係る蛍光体による波長変換光を照射すると、単なる細胞増殖によりＰＬＢの重量が増大するのみならず、１個のＰＬＢから複数の新たなＰＬＢが瘤状に形成される。これらＰＬＢは、それぞれ一個の植物体になり得る。
【００８４】
増殖したＰＬＢは、正常なものを選択して切り離し、新しい培地に植え付ければよい。また、新たに植え付けたＰＬＢを再び上記で説明した工程に付し、さらにＰＬＢを増殖させることもできる。
【００８５】
本発明方法で増殖させたＰＬＢは、本発明に係る蛍光体による波長変換光を照射し続けることで、根や葉茎が形成されることがある。根や葉茎が形成されない場合には、ショート形成培地に移し、根や葉茎の形成を促進してもよい。根や葉茎が形成された幼植物体は、培養容器から出して外環境にならす順化を行った上で、そのまま出荷することも可能である。
【００８６】
本発明方法によれば、ラン科植物のＰＬＢを顕著に増殖することができる。上記で説明した工程を繰り返すことにより、一個のラン科植物より得られるＰＬＢを数万個に増やすことも可能である。各ＰＬＢはそれぞれ一個の植物体になり得ることから、本発明によれば、ラン科植物を極めて効率的に製造することができる。
【００８７】
なお、本発明におけるラン科植物とは、花を有しているもののみならず、根および葉茎を有する苗条（シュート）など、水や肥料の投与など通常の方法で生育するものも含むものとする。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００８９】
実施例１ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
特開２００８−１９５７４９号公報に記載の実施例１〜３の方法に従って、下記多環系フェナジン化合物を合成した。以下、下記多環系フェナジン化合物を「ＮＢ」という。
【００９０】
【化７】
【００９１】
バッチミキサーにポリスチレン（６８．６ｇ）と蛍光色素ＮＢ（１．４ｇ）を入れ、１９０℃で溶融混練するという操作を２回繰り返すことによって、マスターバッチ（１４０ｇ）を作成した。当該マスターバッチ（１００ｇ）とポリスチレン（３９００ｇ）を同様に溶融混練した後、Ｔダイ二軸押し出し機を用いてフィルム状に成形した。この時、Ｔダイ二軸押し出し機のスクリュー回転速度は３０〜６０ｒｐｍとし、温度はポリスチレンの溶融温度に対応させた。
【００９２】
得られたフィルムの吸収スペクトルを紫外可視近赤外分光光度計（日本分光社製，製品名「Ｖ−６７０」）で測定し、また、蛍光スペクトルを分光蛍光光度計（日本分光社製，製品名「ＦＰ−６６００」）で測定した。なお、３００ｎｍ未満の光はフィルム自体に吸収されてしまうため、測定していない。結果を図１に示す。
【００９３】
実施例２ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系フェナジン化合物を合成した。
【００９４】
【化８】
【００９５】
原料化合物であるナフトキノン化合物は、特開２００８−１９５７４９号公報に記載の実施例１−２の方法に従って合成することができる。また、１，２−ジアミノ化合物は、当該ナフトキノン化合物のケト基をヒドロキシアンモニウム塩酸塩でオキシム化した後、塩化スズ−塩酸で還元することにより合成することができる。
【００９６】
上記ナフトキノン化合物（０．４６４ｇ）と１，２−ジアミノ化合物（０．４６２ｇ）をエタノール（５０ｍＬ）に溶解し、８０℃で１２時間加熱還流した。反応終了後、反応混合液を大量の水（５００ｍＬ）に注ぎ、生じた析出物を濾別した。濾別した析出物をジクロロメタンに溶解し、当該溶液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：キシレン／ｎ−ヘキサン＝２／１）を用いて精製することにより、トランス型多環系フェナジン化合物（０．４５８ｇ，収率：５２％）を得た。以下、上記多環系フェナジン化合物を「ＢＤ」という。
【００９７】
当該トランス型多環系フェナジン化合物を用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図１に示す。
【００９８】
実施例３ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
上記実施例１において、ポリスチレンの代わりにポリメチルメタクリレート（三菱レイヨン社製，Ｖ００１）を用いた以外は同様にして、本発明フィルムを製造した。
【００９９】
比較例１ 蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、アントラキノン化合物を合成した。
【０１００】
【化９】
【０１０１】
上記ジメチルアミノフェニルプロペナール化合物（３．６８ｇ）と酢酸銅（４．１９ｇ）を酢酸（２００ｍＬ）に溶解させた反応溶液に、酢酸（２００ｍＬ）に溶解させた上記アントラキノン化合物（５．０ｇ）を加え、９０℃で１時間半加熱還流した。反応終了後、反応混合液を減圧濃縮し、水で洗浄後、ジクロロメタンで抽出し、抽出溶液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：ジクロロメタン／酢酸エチル＝２０／１）を用いて精製することにより、多環系アントラキノン化合物（６．１ｇ，収率：７４％）を得た。以下、上記多環系アントラキノン化合物を「ＩＤ」という。
【０１０２】
当該アントラキノン化合物を用いた以外は上記実施例１と同様にして、蛍光透明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図１に示す。
【０１０３】
実施例４ ＰＬＢの増殖実験
シンビジウム（C．finlaysonianum）の直径：約３ｍｍのＰＬＢを取得した。別途、ショ糖を２０ｇ／Ｌとゲルライトを２ｇ／Ｌを含み、且つ硝酸アンモニウム量を１／４に、硝酸カリウム量を１／２に低減した修正ＭＳ培地を、直径：約６２ｍｍ、高さ：１０９ｍｍのガラス瓶に作製した。当該ガラス瓶１個につき、ＰＬＢを１０個ずつ植え付けた。
【０１０４】
上記ガラス瓶を４個ずつインキュベータに入れ、各インキュベータ中の全てのガラス瓶の上部を、上記実施例１〜３または比較例１で製造した蛍光透明フィルム一枚で覆った。比較のために、色素を含まないポリスチレンフィルムを作製し、同様にガラス瓶を覆った。インキュベータ中の冷陰極蛍光ランプと蛍光透明フィルムとの距離が１５ｃｍとなるように、蛍光透明フィルムの位置を調節した。インキュベータの温度は２５℃とし、ＰＬＢには約２，０００ｌｕｘの光が１日当たり１６時間照射されるようにした。
【０１０５】
４０日後、各ＰＬＢの重量、各ＰＬＢから生じたＰＬＢの総数と正常なＰＬＢの数を計測した。また、ＰＬＢの色を、１：緑，２：黄緑，３：黄，４：白，５：黒の５段階で評価した。それぞれの結果の平均値を表１に示す。また、１個のＰＬＢから生じたＰＬＢの総数の経時的な変化を、図２に示す。なお、表１中、異なるアルファベット間にはＴｕｋｅｙの多重検定において、５％レベルで有意差があることを示す。例えば、ａ−ｂ間には有意差がある。その一方で、ａ−ａｂ間およびａｂ−ｂ間には有意差はない。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
上記結果のとおり、本発明に係る蛍光透明フィルムの変換光をラン科植物のＰＬＢに照射すれば、コントロールや他の色素を含む蛍光透明フィルムを用いた場合に比して、ＰＬＢの総数や正常数が顕著に向上することが明らかになった。
【０１０８】
実施例５ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
上記実施例２において、ポリスチレンの代わりにポリカーボネート（三菱エンジニアリングプラスチック社製，Ｅ−２０００）を用いた以外は同様にして、本発明フィルムを製造した。
【０１０９】
実施例６ ＰＬＢの増殖実験
上記実施例４において、C.finlaysonianumの代わりにC.insigneのＰＬＢを用い、ＰＬＢの増殖実験を行った。なお、当実験では４０日にわたる光照射後において、ＰＬＢ数等のみならず、各ＰＬＢの根の形成率と葉茎の形成率も求めた。結果を表２に示す。
【０１１０】
【表２】
【０１１１】
上記結果のとおり、本発明に係る蛍光透明フィルムの変換光をラン科植物のＰＬＢに照射すれば、コントロールよりもＰＬＢの総数が向上し、さらに、特別な処理をしなくとも、各ＰＬＢにおいて根や葉茎の形成を促進できることが明らかになった。
【０１１２】
実施例７ ＰＬＢの増殖実験
実施例１で製造したＮＢ−ＰＳフィルムと、実施例３で製造したＮＢ−ＰＭＭＡフィルムをエンボス加工した。具体的には、各フィルムの片側表面に、長径：１ｍｍの円形凸部を、縦横方向間隔：２ｍｍ、斜め方向の間隔：１ｍｍで形成した。得られたフィルムを用い、上記実施例４と同様の条件により、ＰＬＢの増殖実験を行った。結果を表３に示す。表３中、異なるアルファベット間にはＴｕｋｅｙの多重検定において、５％レベルで有意差があることを示す。
【０１１３】
【表３】
【０１１４】
上記結果のとおり、本発明に係る蛍光透明フィルムの変換光をラン科植物のＰＬＢに照射すれば、コントロールに比して、ＰＬＢの総数や正常数が顕著に向上する。さらにフィルムにエンボス加工を施した場合、特にＮＢ−ＰＳフィルムにエンボス加工を施した場合には、ＰＬＢ数が一層有意に向上することが分かった。
【０１１５】
実施例８ ＰＬＢの増殖実験
実施例１のＮＢ−ＰＳフィルムと実施例３のＮＢ−ＰＭＭＡフィルムに加え、上記実施例７で用いたエンボスＮＢ−ＰＳフィルムとエンボスＮＢ−ＰＭＭＡフィルムを各インキュベータの底に敷き、反射光がＰＬＢに照射されるようにした以外は上記実施例４と同様にして、ＰＬＢの増殖実験を行った。エンボス加工を施さないＮＢ−ＰＳフィルムとＮＢ−ＰＭＭＡフィルムの透過光をＰＬＢに照射した実験結果と合わせて、当実験の結果を図３に示す。
【０１１６】
図３のとおり、本発明フィルムによる反射光および透過光のいずれを照射した場合であっても、ＰＬＢの総数はコントロールよりも明らかに増加している。また、おしなべていえば、反射光を照射した場合の方がＰＬＢ数は増加している。よって、本発明フィルムの変換光の照射手段によってもＰＬＢ数は変わってくる場合があるので、予備実験等により、照射手段を検討することも重要であることが明らかにされた。
【０１１７】
実施例９ ＰＬＢの増殖実験 − 植物ホルモンとの比較
上記実施例４で用いた修正ＭＳ培地中に、植物ホルモンであるナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を１ｍｇ／Ｌとベンジルアデニン（ＢＡ）を２ｍｇ／Ｌ添加した。当該培地と、植物ホルモンを添加しない修正ＭＳ培地を用い、上記実施例４と同様の条件で、無色ＰＳフィルムを用いたコントロール、本発明に係るＮＢ−ＰＳフィルムを用いた場合、植物ホルモンを用いた場合、本発明フィルムと植物ホルモンを併用した場合の比較を行った。結果を表４に示す。表４中、異なるアルファベット間にはＴｕｋｅｙの多重検定において、５％レベルで有意差があることを示す。
【０１１８】
【表４】
【０１１９】
上記結果のとおり、本発明フィルムのみ用いた場合、植物ホルモンのみ用いた場合、本発明フィルムと植物ホルモンを併用した場合のいずれも、コントロールより有意にＰＬＢ数を増やすことができた。また、植物ホルモンのみ用いた場合の方が本発明フィルムのみ用いた場合よりもＰＬＢ総数は多かったが、正常なＰＬＢの割合が少なく、決して効率的ではないことが分かった。さらに、上記結果では、本発明フィルムと植物ホルモンを併用した場合の結果が最も良好であった。
【０１２０】
実施例１０ ＰＬＢの増殖実験 − 植物ホルモンとの比較
上記実施例９において、C.finlaysonianumの代わりにC.insigneのＰＬＢを用いた以外は同様にして、ＰＬＢの増殖実験を行った。また、４０日にわたる光照射後において、ＰＬＢ数等のみならず、各ＰＬＢの根の形成率と葉茎の形成率も求めた。結果を表５に示す。
【０１２１】
【表５】
【０１２２】
上記結果のとおり、本発明フィルムのみ用いた場合、植物ホルモンのみ用いた場合、本発明フィルムと植物ホルモンを併用した場合のいずれも、コントロールに比べて有意とはいえないまでもＰＬＢ重量や数が増加することが分かった。また、植物ホルモンを用いた場合、根や葉茎の形成が阻害され、その理由は必ずしも明らかではないが、本発明フィルムと植物ホルモンを併用した場合では根と葉茎の両方が形成されたＰＬＢは皆無であった。一方、本発明フィルムのみを用いた場合では、根や葉茎が良好に形成されている。
【０１２３】
従って、本発明フィルムを用いれば、植物ホルモンを用いずともＰＬＢの増殖を促進することができる上に、根や葉茎の形成も阻害しないことが実証された。
【０１２４】
実施例１１ 耐光性試験
実用上、農業用フィルムの耐光性は重要であるので、本発明に係る蛍光透明フィルムの耐光性につき試験した。具体的には、実施例１のＮＢ−ＰＳフィルムと実施例３のＮＢ−ＰＭＭＡフィルムをキセノン促進耐候性試験機（Ｑ−Ｌａｂ社製，製品名「Ｑ−Ｓｕｎ Ｘｅ−１型」）内に設置し、３４０ｎｍの波長照度：０．５１Ｗ／ｍ2、温度：４５℃となる条件でキセノン光を２時間ずつ、合計１０時間照射した。次いで、各フィルムの蛍光強度を測定し、キセノン光照射前に対する蛍光強度保持率を算出した。結果を表６と図４に示す。
【０１２５】
【表６】
【０１２６】
表６と図４の結果のとおり、キセノン光という強力光を強制的に照射した場合、マトリクス樹脂としてポリメチルメタクリレートを含む実施例３のフィルムでは、１０時間後における蛍光強度が４０％まで低下してしまった。それに対してポリスチレンを含む実施例１のフィルムでは、同一の色素であってもその含量は９０％に維持されていた。
【０１２７】
以上の結果から、本発明方法を実施するに当たり、フィルムによっては適時交換する必要があり、また、マトリクス樹脂としてポリスチレンを含むフィルムは、本発明色素の分解等を抑制することができ、耐光性に優れることが明らかになった。
【０１２８】
実施例１２ 耐光性試験
上記実施例１１において、蛍光透明フィルムを実施例２のＢＤ−ＰＳフィルムと実施例５のＢＤ−ＰＣフィルムに変えて、同様の実験を行った。結果を図５に示す。
【０１２９】
図５のとおり、キセノン光という強力光を強制的に照射した場合、マトリクス樹脂としてポリカーボネートを含む実施例５のフィルムでは、１０時間後における蛍光強度が約５０％まで低下してしまった。それに対してポリスチレンを含む実施例２のフィルムでは、同一の色素であってもその含量は約９０％に維持されていた。よって、マトリクス樹脂としてポリスチレンを含むフィルムの耐光性の高さが実証された。
【０１３０】
実施例１３ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系オキサゾール化合物を合成した。
【０１３１】
【化１０】
【０１３２】
上記ナフトキノン化合物（１．０ｇ）とｐ−ｔ−ブチルベンズアルデヒド（０．６５ｇ）をエタノール（６５ｍＬ）に溶解し、これに酢酸アンモニウム（３．２８ｇ）を加えて８０℃で２時間加熱攪拌した。反応終了後、反応混合液を水（５００ｍＬ）に注ぎ、生じた析出物を濾別した。濾別した析出物をジクロロメタンに溶解し、当該溶液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：キシレン／酢酸＝２０／１）を用いて分離精製することにより、多環系オキサゾール化合物（０．６ｇ，収率：４３．５％）を得た。以下、上記多環系オキサゾール化合物を「ＢＢ」という。
【０１３３】
当該多環系オキサゾール化合物「ＢＢ」を用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図６に示す。
【０１３４】
実施例１４ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系オキサゾール化合物を合成した。
【０１３５】
【化１１】
【０１３６】
上記ナフトキノン化合物（０．８ｇ）と１−ピレンカルバルデヒド（０．９８ｇ）をエタノール（１５０ｍＬ）に溶解し、これに酢酸アンモニウム（６．５７ｇ）を加えて８０℃で１．５時間加熱攪拌した。反応終了後、反応混合液を水（５００ｍＬ）に注ぎ、生じた析出物を濾別した。濾別した析出物をジクロロメタンに溶解し、当該溶液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：キシレン／酢酸＝２０／１）を用いて分離精製することにより、多環系オキサゾール化合物（１．１２ｇ，収率：４９．４％）を得た。以下、上記多環系オキサゾール化合物を「ＢＰ」という。
【０１３７】
当該多環系オキサゾール化合物「ＢＰ」を用い且つポリスチレンの代わりにポリカーボネートを用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図６に示す。
【０１３８】
実施例１５ 耐光性試験
上記実施例１１において、蛍光透明フィルムを実施例１３のＢＢ−ＰＳフィルムと実施例１４のＢＰ−ＰＣフィルムに変えて、同様の実験を行った。結果を図７に示す。
【０１３９】
図７のとおり、キセノン光という強力光を１０時間にわたり照射した場合、マトリクス樹脂としてポリスチレンまたはポリカーボネートを含むフィルムでは、蛍光色素を約６０％に維持することができた。
【０１４０】
実施例１６ 耐光性試験
実施例１のＮＢ−ＰＳフィルム、実施例２のＢＤ−ＰＳフィルム、実施例１３のＢＢ−ＰＳフィルム、実施例１４のＢＰ−ＰＣフィルム、および比較例１のＩＤ−ＰＳフィルムを、擬似太陽光（Light source社製，ＶＩＴＡ ＬＩＴＥ）から１５ｃｍ離した位置に設置し、光強度が１５００〜１８００ｌｕｘとなる条件で擬似太陽光を３０日間照射した後、各フィルムの蛍光強度を測定し、擬似太陽光照射前に対する蛍光強度保持率を算出した。結果を表７に示す。
【０１４１】
【表７】
【０１４２】
上記結果のとおり、マトリクス樹脂としてポリスチレンを含む蛍光透明フィルムは、おしなべて耐光性に優れることが実証された。
【０１４３】
実施例１７ ＰＬＢの増殖実験
上記実施例４において、蛍光透明フィルムとして上記実施例１３のＢＢ−ＰＳフィルムを用い、光強度が１５００〜１８００ｌｕｘの擬似太陽光（Light source社製，ＶＩＴＡ ＬＩＴＥ）を用い、且つ波長変換光の照射期間を４２日間とした以外は同様にして、ＰＬＢの増殖実験を行った。結果を表８に示す。なお、表８中、「＊」はｔ検定により５％の危険率で有意差があることを示す。
【０１４４】
【表８】
【０１４５】
上記結果のとおり、蛍光色素として多環系オキサゾール化合物を含む蛍光透明フィルムを用いた場合には、色素を含まないコントロールフィルムに比べて、ＰＬＢの総数と正常数が有意に増加した。よって、蛍光色素として多環系オキサゾール化合物を含む蛍光透明フィルムも、ＰＬＢの増殖に有用であることが分かった。
【０１４６】
実施例１８ ＰＬＢの増殖実験
上記実施例４において、蛍光透明フィルムとして上記実施例１４のＢＰ−ＰＣフィルムを用い、光強度が１５００〜１８００ｌｕｘの擬似太陽光（Ｄｕｒｏ−Ｔｅｓｔ Ｌｉｇｈｔｉｈｇ社製，ＶＩＴＡ ＬＩＴＥ）を用い、且つ波長変換光の照射期間を４２日間とした以外は同様にして、ＰＬＢの増殖実験を行った。結果を表９に示す。なお、表９中、「＊」はｔ検定により５％の危険率で有意差があることを示す。
【０１４７】
【表９】
【０１４８】
上記結果のとおり、蛍光透明フィルムとしてＢＰ−ＰＣを用いた場合には、正常ＰＬＢ数で有意差はないものの、ＢＢ−ＰＳを用いた場合とほぼ同様の結果が得られた。よって、蛍光色素として多環系オキサゾール化合物を含む蛍光透明フィルムも、ＰＬＢの増殖に有用であることが分かった。
【０１４９】
実施例１９ ＰＬＢの増殖実験
上記実施例１８において、C.finlaysonianumの代わりにC.insigneのＰＬＢを用いた以外は同様にして、ＰＬＢの増殖実験を行った。結果を表１０に示す。なお、表１０中、「＊」はｔ検定により５％の危険率で有意差があることを示す。
【０１５０】
【表１０】
【０１５１】
上記結果のとおり、蛍光透明フィルムとしてＢＰ−ＰＣを用いた場合、根や葉茎の形成率はコントロールに比べてやや低下したものの、ＰＬＢの数は有意に増加した。よって、蛍光色素として多環系オキサゾール化合物を含む蛍光透明フィルムも、ＰＬＢの増殖に有用であることが分かった。
【０１５２】
実施例２０ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
特開２００８−１９５７４９号公報に記載の実施例４〜５の方法に従って、下記多環系フェナジン化合物を合成した。以下、下記多環系フェナジン化合物を「ＢＸ」という。
【０１５３】
【化１２】
【０１５４】
当該多環系フェナジン化合物ＢＸを用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図８に示す。
【０１５５】
実施例２１ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系フェナジン化合物を合成した。
【０１５６】
【化１３】
【０１５７】
原料化合物であるナフトキノン化合物は、特開２００８−１９５７４９号公報に記載の実施例１−２の方法に従って合成することができる。
【０１５８】
上記ナフトキノン化合物（０．９２ｇ）と１，２−ジアミノ化合物（０．９２ｇ）をエタノール（６０ｍＬ）に溶解し、８０℃で４時間加熱還流した。反応終了後、反応液を減圧濃縮した。得られた残渣をジクロロメタンで抽出し、当該抽出液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：ジクロロメタン／酢酸エチル＝１０／１）を用いて精製した後、再度シリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：キシレン）で精製することにより、トランス型多環系フェナジン化合物（１．００ｇ，収率：５７％）を得た。以下、上記多環系フェナジン化合物を「ＦＸ」という。
【０１５９】
当該トランス型多環系フェナジン化合物を用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図８に示す。
【０１６０】
実施例２２ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系フェナジン化合物を合成した。
【０１６１】
【化１４】
【０１６２】
原料化合物であるナフトキノン化合物は、特開２００８−１９５７４９号公報に記載の実施例１−２の方法に従って合成することができる。また、１，２−ジアミノ化合物は、当該ナフトキノン化合物のカルボニル基をヒドロキシアンモニウム塩酸塩でオキシム化した後、塩化スズ−塩酸で還元することにより合成することができる。
【０１６３】
上記ナフトキノン化合物（０．３７０ｇ）と１，２−ジアミノ化合物（０．３７０ｇ）をエタノール（３０ｍＬ）に溶解し、８０℃で１０時間加熱還流した。反応終了後、反応混合液を大量の水（５００ｍＬ）に注ぎ、生じた析出物を濾別した。濾別した析出物をジクロロメタンに溶解し、当該溶液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：ジクロロメタン）を用いて精製することにより、赤色粉末結晶であるトランス型多環系フェナジン化合物（０．３２３ｇ，収率：４６％）を得た。以下、上記多環系フェナジン化合物を「ＸＸ」という。
【０１６４】
当該トランス型多環系フェナジン化合物を用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図８に示す。
【０１６５】
実施例２３ 耐光性試験
上記実施例１１と同様の条件で、実施例２０のＢＸ−ＰＳフィルム、実施例２１のＦＸ−ＰＳフィルムおよび実施例２２のＸＸ−ＰＳフィルムの耐光性を試験した。結果を表１１と図９に示す。
【０１６６】
【表１１】
【０１６７】
上記結果のとおり、実施例２０〜２２の本発明フィルムにおいては、キセノン光という強力光を合計１０時間照射した後においても、色素顔料は８０％以上に維持されており、本発明フィルムの優れた耐光性が実証された。また、吸収波長領域と発光波長領域から分かるように、これら本発明フィルムは、青色光は吸収せずに透過させ、近紫外光と緑〜黄色光を吸収して赤色光に変換することができる。さらに、相対蛍光強度からしめされるように、発光強度は、ＢＸ−ＰＳ＜ＦＸ−ＰＳ＜ＸＸ−ＰＳの順に増大した。
【０１６８】
以上の結果から、マトリクス樹脂としてポリスチレンを含むフィルムは、本発明色素の分解等を抑制することができ、耐光性に優れることが明らかになった。
【０１６９】
実施例２４ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系オキサゾール化合物を合成した。
【０１７０】
【化１５】
【０１７１】
上記ナフトキノン化合物（２．０ｇ）とｐ−ホルミル安息香酸（０．８０ｇ）を酢酸（３０ｍＬ）に溶解し、これに酢酸アンモニウム（８．１９ｇ）を加えて９０℃で５時間加熱攪拌した。反応終了後、反応混合液を水（３００ｍＬ）に注ぎ、生じた析出物を濾別し、少量のジクロロメタンで洗浄することにより黄色粉末を得た。得られた黄色粉末、１−ヨードブタン（１．９５ｇ）および炭酸ナトリウム（１．４２ｇ）をジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）に溶解し、１００℃で１時間加熱攪拌した。反応終了後、反応混合液を水（３５０ｍＬ）に注ぎ、生じた析出物を濾別した。得られた析出物をジクロロメタンに溶解した。当該溶液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：トルエン／酢酸＝１０／１）を用いて分離精製することにより、多環系オキサゾール化合物（２．４９ｇ，収率：８３％）を得た。以下、上記多環系オキサゾール化合物を「ＢＥ」という。
【０１７２】
当該多環系オキサゾール化合物ＢＥを用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図１０に示す。
【０１７３】
実施例２５ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系オキサゾール化合物を合成した。
【０１７４】
【化１６】
【０１７５】
上記ナフトキノン化合物（２．０ｇ）と４−ピリジンカルバルデヒド（０．６７ｇ）を酢酸（１４０ｍＬ）に溶解し、これに酢酸アンモニウム（２．０６ｇ）を加えて９０℃で４時間加熱攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去して除去した後に水（１０００ｍＬ）を注ぎ、生じた析出物を濾別した。析出物をジクロロメタンに溶解し、当該溶液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：ジクロロメタン／テトラヒドロフラン＝３／１）を用いて分離精製することにより、多環系オキサゾール化合物（１．１７ｇ，収率：４７．２％）を得た。以下、上記多環系オキサゾール化合物を「ＰＰ」という。
【０１７６】
当該多環系オキサゾール化合物ＰＰを用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図１０に示す。
【０１７７】
実施例２６ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系オキサゾール化合物を合成した。
【０１７８】
【化１７】
【０１７９】
上記ナフトキノン化合物（１．０ｇ）とサリチルアルデヒド（０．３９１ｇ）を酢酸（３０ｍＬ）に溶解し、これに酢酸アンモニウム（４．１１ｇ）を加えて９０℃で５時間加熱攪拌した。反応終了後、反応混合液を水（２００ｍＬ）に注ぎ、生じた析出物を濾別した。析出物をジクロロメタンに溶解し、当該溶液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：ジクロロメタン／ヘキサン＝１０／１）を用いて分離精製することにより、多環系オキサゾール化合物（０．７６ｇ，収率：５９．７％）を得た。以下、上記多環系オキサゾール化合物を「ＸＨ」という。
【０１８０】
当該多環系オキサゾール化合物ＸＨを用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図１０に示す。
【０１８１】
実施例２７ 耐光性試験
上記実施例１１と同様の条件で、実施例２４のＢＥ−ＰＳフィルム、実施例２５のＰＰ−ＰＳフィルムおよび実施例２６のＸＨ−ＰＳフィルムの耐光性を試験した。結果を図１１に示す。
【０１８２】
図１１のとおり、キセノン光という強力光を合計１０時間にわたり照射した場合であっても、マトリクス樹脂としてポリスチレンを含むフィルムでは、色素を約７０％以上に維持することができた。特にＢＥ−ＰＳフィルムとＰＰ−ＰＳフィルムでは、蛍光保持率が約８０％以上と優れた耐光性を示した。
【０１８３】
実施例２８ ジブチルジチオカルバミン酸ニッケルによる耐光性向上効果の実証
ポリスチレン（２．０ｇ）、実施例１の蛍光色素であるＮＢまたは実施例２のＢＤ（ポリスチレンに対して０．０５質量％）およびジブチルジチオカルバミン酸ニッケル（蛍光色素に対して１倍モル比または５倍モル比）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、キャスト法によりＮＢ−ＰＳフィルムまたはＢＤ−ＰＳフィルムを作製した。当該フィルムを用い、実施例１１と同様の条件で耐光性試験を行った。結果を表１２に示す。
【０１８４】
【表１２】
【０１８５】
上記結果の通り、ジブチルジチオカルバミン酸ニッケルが添加されたＮＢ−ＰＳフィルムおよびＢＤ−ＰＳフィルムでは、添加物無しのフィルムよりも初期蛍光強度が増大した。また、キセノン光を１０時間照射した後における蛍光保持率は、ジブチルジチオカルバミン酸ニッケルの添加量による差はほとんど見られず、添加量が少なくても十分な耐光性向上効果が認められた。５０時間照射後では、添加量による差が認められ、蛍光色素に対して５倍モル比添加した方が耐光性は良好であったものの、１倍モル比でも十分に効果はあった。以上のとおり、ジブチルジチオカルバミン酸ニッケルの添加により、本発明フィルムの耐光性は一層向上することが明らかとなった。
【０１８６】
実施例２９ Ｎ−アセチルグルコサミンによるＰＬＢ増殖効果実験
上記実施例４において、修正ＭＳ培地中にＮ−アセチルグルコサミンを１０ｍｇ／Ｌ添加し、C．finlaysonianumの代わりにC．Waltz‘Idol’を用いた以外は同様にして、ＰＬＢの増殖実験を行った。本発明に係る蛍光フィルムとしてはＮＢ−ＰＳフィルムを用い、比較のために無色ＰＳフィルムを用いた。結果を表１３に示す。表１３中、異なるアルファベット間にはＴｕｋｅｙの多重検定において、５％レベルで有意差があることを示す。
【０１８７】
【表１３】
【０１８８】
上記結果のとおり、蛍光色素を用いない場合であっても、Ｎ−アセチルグルコサミンを培地に添加すればＰＬＢの重量や正常ＰＬＢ数等は増加するが、有意差は無い。それに対して、本発明に係る蛍光フィルムとＮ−アセチルグルコサミンとを併用したところ、器官形成率は低下した一方で、ＰＬＢの重量と正常ＰＬＢ数は増加し、特に正常ＰＬＢ数は有意に増加した。よって、本発明に係る蛍光フィルムとＮ−アセチルグルコサミンとを併用すれば、正常なＰＬＢをより一層増加できることが分かった。
【０１８９】
実施例３０ ＰＬＢ増殖実験
実施例１で製造したＮＢ−ＰＳフィルムを粉砕機で２分間粉砕し、粉末状の蛍光体を作製した。当該粉末状蛍光体を修正ＭＳ培地５０ｍＬ当たり２ｇ混合した以外は上記実施例４と同様にして、ＰＬＢの増殖実験を行った。ＰＬＢ数の経時的な変化を図１２に、実験開始から４２日後におけるＰＬＢ数等を表１４に示す。表１４中、＊はｔ検定において５％レベルで有意差があることを示し、＊＊は１％レベルで有意差があることを示す。
【０１９０】
【表１４】
【０１９１】
上記結果のとおり、本発明に係る蛍光透明フィルムの透過光をＰＬＢに照射する以外にも、本発明に係る粉末状を培地に添加してその蛍光をＰＬＢに照射しても、ＰＬＢ総数や正常なＰＬＢ数は有意に増加することが明らかになった。
【０１９２】
実施例３１ ＰＬＢ増殖実験
上記実施例３０において、本発明に係る粉末状蛍光体の添加量を修正ＭＳ培地３０ｍＬ当たり３ｇとした以外は同様にして、C．tracyanumとC．Luna SongにつきＰＬＢの増殖実験を行った。結果を表１５に示す。
【０１９３】
【表１５】
【０１９４】
また、修正ＭＳ培地からゲルライトを除いた液体培地に関しても、同様に実験を行った。結果を表１６に示す。
【０１９５】
【表１６】
【０１９６】
上記結果のとおり、本発明に係る粉末状蛍光体は、C．finlaysonianum以外にもC．tracyanumとC．Luna Songに対して効果を発揮し、特にC．Luna Songに対する効果が高かった。また、本発明に係る粉末状蛍光体は、固体培地でも液体培地でも効果を示すことが明らかとなった。
【０１９７】
実施例３２ ＰＬＢ増殖実験
上記実施例４において、ＮＢ−ＰＳフィルムの代わりに上記実施例２１で製造したＦＸ−ＰＳフィルムを用い、C．finlaysonianumとC．insigneに対するＰＬＢ増殖効果を試験した。ＮＢ−ＰＳの結果と共に、結果を表１７に示す。
【０１９８】
【表１７】
【０１９９】
上記結果のとおり、ＦＸ−ＰＳフィルムを用いた場合でも、コントロールに比べてＰＬＢの重量や数が増加することが実証された。
【０２００】
実施例３３ ＰＬＢ増殖実験
上記実施例４において、ＮＢ−ＰＳフィルムの代わりに上記実施例２５で製造したＰＰ−ＰＳフィルム、または当該ＰＰ−ＰＳフィルムを上記実施例７と同様にエンボス加工したエンボスＰＰ−ＰＳフィルムを用い、Gramatophyllum scriptum‘Hihimanu’に対するＰＬＢ増殖効果を試験した。結果を表１８に示す。
【０２０１】
【表１８】
【０２０２】
上記結果のとおり、ＰＰ−ＰＳフィルムを用いた場合でも、コントロールに比べてＰＬＢの重量や数が増加し、かかる効果は、フィルムをエンボス加工することにより一層向上することが実証された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラン科植物を製造するための方法と、当該方法で用いるＰＬＢ増殖用蛍光体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
通常、植物体は種子から成長し、一個の種子からは一個の植物体が成長する。しかしラン科植物の場合、生長点にＰＬＢ（プロトコーム様小球体）という細胞塊が形成される。このＰＬＢは、分化までにさらに増殖させることが可能であり、増殖した個々のＰＬＢが一個の植物体に成長し得る。よって、ラン科植物を製造する場合には、ＰＬＢを増殖させた後、個々のＰＬＢを分化させて多数のクローン苗を得るのが効率的である。
【０００３】
ＰＬＢを増殖させるには、特許文献１に記載の技術のように、培地中に合成植物ホルモンであるナフタレン酢酸とベンジルアデニンを添加することが一般的である。
【０００４】
しかし、合成植物ホルモンは環境に悪影響を与えるおそれがあるため、安易に廃棄することができない。また、合成植物ホルモンを使用する場合、ＰＬＢに形態的な異常が生じるばかりでなく、遺伝的な変異が多発する。従って、合成植物ホルモンを使わずにＰＬＢを増殖させる技術が求められている。
【０００５】
ところで、植物は光合成によりエネルギーを産生して成長し、また、光形態形成という光応答反応により、その生長や分化が制御されている。これらの光反応には、それぞれ有効な波長の光がある。よって、各光反応に有効な波長の光を照射することにより植物の成長を促進する技術が種々検討されている。例えば特許文献２には、発光ピークが４２０〜５３０ｎｍまたは６００〜７００ｎｍにある蛍光顔料を含有する農業用フィルムが開示されている。また、特許文献３には、波長領域が６３０〜６８０ｎｍの赤色ＬＥＤと波長領域が３８０〜４８０ｎｍの青色ＬＥＤを有する植物栽培用ＬＥＤ光源が記載されている。
【０００６】
しかしながら、ＰＬＢは黄緑色から黄色、場合によっては黄色から白色を呈し、葉緑素を十分に有しているものではない。また、ＰＬＢを増殖せしめるには、単にＰＬＢの細胞増殖を促すのみでは不十分であり、新たなＰＬＢの形成を促進しなければならない。よって、光合成反応に有効な光をＰＬＢへ照射したとしても、ＰＬＢの増殖が促進されるとは限らない。
【０００７】
上述したような植物の育成技術とは関係なく、本発明者の一人はかねてより蛍光色素について研究しており、例えば特許文献４〜６のとおり、優れた蛍光色素を開発している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平７−１０７８７１号公報
【特許文献２】特開平５−２２７８４９号公報
【特許文献３】特開平９−２５２６５１号公報
【特許文献４】特開２００７−２１１１８５号公報
【特許文献５】特開２００８−１９５７４９号公報
【特許文献６】国際公開第２００５／０７８０２４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述した様に、ラン科植物を効率的に製造するためには、まずＰＬＢを増殖させてから、各ＰＬＢから根等を誘導して苗条とし、さらに成長させることが望ましいが、従来方法では、ＰＬＢの増殖のために合成植物ホルモンを使用していた。しかし、合成植物ホルモンは環境に悪影響を与えるだけでなく、異常ＰＬＢの発生率を高めるという問題がある。
【００１０】
そこで本発明が解決すべき課題は、植物ホルモンを用いずともラン科植物を効率に製造できる方法を提供することにある。また、本発明は、ＰＬＢの増殖を促進することができる、ＰＬＢ増殖用の蛍光体を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた。その結果、本発明者の一人が開発していた多環系フェナジン化合物と多環系オキサゾール化合物のうち特定なものが発する蛍光をＰＬＢに照射したところ、ＰＬＢの増殖が促進され、且つ植物ホルモンを用いた場合よりも異常ＰＬＢの発生率を抑制できることを見出して、本発明を完成した。
【００１２】
本発明に係るラン科植物の製造方法は、下記式（Ｉ1）、式（Ｉ2）または（Ｉ3）で表される多環化合物を色素として含む蛍光体による波長変換光を照射することによりＰＬＢを増殖させる工程を含むことを特徴とする。
【００１３】
【化１】
【００１４】
［式（Ｉ1）中、
Ｒ1は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ8、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ8、ハロゲン基またはシアノ基を示し；
Ｒ2とＲ3は一緒になって−Ｘ1−を形成し且つＲ4とＲ5は共に水素原子を示すか、またはＲ2とＲ3は共に水素原子を示し且つＲ4とＲ5は一緒になって−Ｘ1−を形成し；
Ｒ6とＲ7は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｒ8は、水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ1は、−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ9）−基を示し；
Ｒ9は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
式（Ｉ2）中、
Ｒ10とＲ11は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｒ12とＲ13は一緒になって−Ｘ2−を形成し且つＲ14とＲ15は共に水素原子を示すか、またはＲ12とＲ13は共に水素原子を示し且つＲ14とＲ15は一緒になって−Ｘ2−を形成し；
Ｒ16とＲ17は一緒になって−Ｘ3−を形成し且つＲ18とＲ19は共に水素原子を示すか、またはＲ16とＲ17は共に水素原子を示し且つＲ18とＲ19は一緒になって−Ｘ3−を形成し；
Ｒ20とＲ21は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ2とＸ3は、それぞれ独立して−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ22）−基を示し；
Ｒ22は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
式（Ｉ3）中、
Ｒ23は、置換基を有していてもよいＣ6-20芳香族炭化水素基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示し；
Ｒ24とＲ25は一緒になって−Ｘ4−を形成し且つＲ26とＲ27は共に水素原子を示すか、またはＲ24とＲ25は共に水素原子を示し且つＲ26とＲ27は一緒になって−Ｘ4−を形成し；
Ｒ28とＲ29は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ4は、−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ30）−基を示し；
Ｒ30は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
芳香族炭化水素基またはヘテロアリール基の置換基は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、水酸基、ハロゲン基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基およびシアノ基からなる群より選択される１以上の基を示す］
【００１５】
上記方法においては、さらに、ＰＬＢにＮ−アセチルグルコサミンを作用させることが好ましい。Ｎ−アセチルグルコサミンはキチンやキトサンから得られる天然成分であり、合成ホルモンと異なり安全である上に、蛍光体から放出される光とＮ−アセチルグルコサミンとの作用により、ＰＬＢ数が相乗的に増加することが実験的に確認されている。
【００１６】
上記蛍光体としては、マトリクス樹脂としてポリスチレンを含むものが好適である。マトリクス樹脂としてのポリスチレンに上記多環系フェナジン化合物または多環系オキサゾール化合物が分散している蛍光体は、特にＰＬＢの増殖を促進するのみならず、上記化合物の発光性や耐光性も向上するからである。
【００１７】
また、上記蛍光体としては、エンボス加工された蛍光フィルムが好適である。無処理の蛍光透明フィルムの場合、上記化合物由来の蛍光が側面から漏れ出してしまうことがあるが、エンボス加工によりかかる漏出はなくなり、ＰＬＢへ効率的に蛍光を照射することが可能になる。また、反射光を利用する場合にも、おそらく光の利用効率が高まることによると考えられるが、エンボス加工された蛍光フィルムを用いるとより良好な結果が得られる。
【００１８】
上記蛍光体としては、さらにジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルを含むものが好適である。ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルにより、蛍光体の耐光性はより一層向上する。
【００１９】
本発明に係るＰＬＢ増殖用蛍光体は、上記化合物を色素として含むことを特徴とする。
【００２０】
また、マトリクス樹脂としてポリスチレンを含むものや、エンボス加工されているもの、ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルを含むものが好適であることは、上述したとおりである。
【００２１】
本発明において「ハロゲン基」としては、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードが挙げられる。
【００２２】
「Ｃ1-8アルキル基」とは、炭素数が１〜８の直鎖状または分枝鎖状の１価脂肪族炭化水素基を意味する。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等である。Ｒ6〜Ｒ7、Ｒ10〜Ｒ11、Ｒ20〜Ｒ21およびＲ28〜Ｒ29としては、Ｃ3-6アルキル基がより好ましく、Ｃ4-5アルキル基がさらに好ましい。Ｒ8としてはＣ1-4アルキル基がより好ましく、Ｃ2-4アルキル基がさらに好ましい。また、「Ｃ1-6アルキル基」とは、Ｃ1-8アルキル基のうち炭素数が１〜６の１価脂肪族炭化水素基を意味する。Ｒ9、Ｒ22および芳香族炭化水素基またはヘテロアリール基の置換基としては、Ｃ1-4アルキル基がより好ましく、Ｃ1-2アルキル基がさらに好ましく、メチルが特に好ましい。
【００２３】
「Ｃ6-20芳香族炭化水素基」とは、炭素数が６〜２０の芳香族炭化水素基を意味する。例えば、フェニル、ナフチル、ビフェニル、フェナンスレニル、アントラセニル、ピレニル、クリセニル、ナフタセニル、ペリレニル等を挙げることができる。
【００２４】
「ヘテロアリール基」は、窒素原子、酸素原子または硫黄原子等のヘテロ原子を少なくとも１個有する５員芳香族ヘテロシクリル基、６員環芳香族ヘテロシクリル基または縮合芳香族ヘテロシクリル基を意味する。「ヘテロアリール基」としては、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チエニル、フリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾール等の５員環ヘテロアリール基；ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル等の６員環ヘテロアリール基；インドリル、イソインドリル、インダゾリル、プリニル、キノリジニル、イソキノリジニル、キノリニル、クロメリル、チアンスレニル、フェノキサゾール、フェノチアゾールなどの縮合ヘテロアリールが含まれる。好ましくは窒素原子を含むヘテロアリールであり、より好ましくはピリジニルである。
【００２５】
「Ｃ1-6アルコキシ基」は、炭素数１〜６の直鎖状または分枝鎖状の脂肪族炭化水素オキシ基を意味する。例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ等を挙げることができる。好ましくはＣ1-4アルコキシであり、より好ましくはＣ1-2アルコキシであり、特に好ましくはメトキシである。
【００２６】
「アルコキシカルボニル基」は、上記Ｃ1-6アルコキシ基に置換されたカルボニル基を意味する。
【００２７】
「アルキルアミノ基」とは、アミノ基に１個のＣ1-6アルキル基が結合している基をいう。例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、イソブチルアミノ、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ、ペンチルアミノ、イソアミルアミノ、ヘキシルアミノ等である。当該基としては、Ｃ1-4アルキルアミノ基が好ましく、Ｃ1-2アルキルアミノ基がより好ましく、特にメチルアミノ基が好ましい。
【００２８】
「ジアルキルアミノ基」とは、アミノ基に２個のＣ1-6アルキル基が結合している基をいう。例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジ（ｎ−ブチル）アミノ、イソブチルメチルアミノ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルアミノ、ジペンチルアミノ、イソアミルメチルアミノ、ジヘキシルアミノ等である。当該基としては、ジ（Ｃ1-4アルキル）アミノ基が好ましく、ジ（Ｃ1-2アルキル）アミノ基がより好ましく、特にジメチルアミノ基が好ましい。
【００２９】
芳香族炭化水素基またはヘテロアリール基が置換基を有する場合、置換基数は特に制限されないが、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、植物ホルモンを用いることなくＰＬＢの増殖を促進できるのみならず、異常ＰＬＢの発生率を低減することができる。よって本発明方法と、本発明方法で使用できる蛍光体は、ラン科植物の製造のために極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例で使用した各多環系フェナジン化合物および多環系アントラキノン化合物の吸収スペクトルと蛍光スペクトルである。（１）は吸収スペクトルであり、（２）は蛍光スペクトルである。
【図２】ＰＬＢに各フィルムの透過光を照射した場合における、生じたＰＬＢの総数の経時的な変化を示すグラフである。
【図３】ＰＬＢに、本発明フィルムの透過光と反射光を照射した場合における、生じたＰＬＢの総数の経時的な変化を示すグラフである。
【図４】本発明に係るＮＢ−ＰＳフィルムとＮＢ−ＰＭＭＡフィルムの耐光性試験の結果を示すグラフである。
【図５】本発明に係るＢＤ−ＰＳフィルムとＢＤ−ＰＣフィルムの耐光性試験の結果を示すグラフである。
【図６】実施例で使用した各多環系オキサゾール化合物の吸収スペクトルと蛍光スペクトルである。（１）は吸収スペクトルであり、（２）は蛍光スペクトルである。
【図７】本発明に係るＢＢ−ＰＳフィルムとＢＰ−ＰＣフィルムの耐光性試験の結果を示すグラフである。
【図８】実施例で使用した各多環系フェナジン化合物の吸収スペクトルと蛍光スペクトルである。（１）は吸収スペクトルであり、（２）は蛍光スペクトルである。
【図９】本発明に係るＢＸ−ＰＳフィルム、ＦＸ−ＰＳフィルムおよびＸＸ−ＰＳフィルムの耐光性試験の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例で使用した各多環系オキサゾール化合物の吸収スペクトルと蛍光スペクトルである。（１）は吸収スペクトルであり、（２）は蛍光スペクトルである。
【図１１】本発明に係るＢＥ−ＰＳフィルム、ＰＰ−ＰＳフィルムおよびＸＨ−ＰＳフィルムの耐光性試験の結果を示すグラフである。
【図１２】ＰＬＢに本発明に係る蛍光体から発せられる蛍光を照射した場合における、生じたＰＬＢの総数の経時的な変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明に係る多環系フェナジン化合物（Ｉ1）は、特許文献５（特開２００８−１９５７４９号公報）に記載の方法により、下記式のとおり製造することができる。
【００３３】
【化２】
【００３４】
上記合成スキーム中、Ｒ1〜Ｒ7は前述したものと同義を示す。
【００３５】
より具体的には、キノン化合物（ＩＩ）とジアミン化合物（ＩＩＩ）を溶媒に溶解し、加熱すればよい。ジアミン化合物（ＩＩＩ）が塩酸塩などの塩である場合には、特に触媒を添加する必要はないが、塩を用いない場合には酢酸等の酸を添加するか、溶媒自体を酢酸等の酸とすればよい。
【００３６】
使用できる溶媒としては、メタノールやエタノールなどのアルコール；ジエチルエーテルやＴＨＦなどのエーテルなどを例示することができる。
【００３７】
上記溶液において、キノン化合物（ＩＩ）とジアミン化合物（ＩＩＩ）は等モルまたは略等モル用いればよいが、一方が他方よりも合成が容易であったり安価である場合には、その一方のモル数を高くしてもよい。当該溶液の濃度は特に制限されないが、化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＩＩ）の合計で０．５〜１０質量％程度にすればよい。
【００３８】
本反応の反応温度は適宜調節すればよいが、例えば６０℃から還流条件程度とすればよい。反応時間も特に制限されず、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）などで原料化合物である化合物（ＩＩ）または化合物（ＩＩＩ）の消費を確認できるまでとすればよいが、通常は３０分〜１２時間程度とする。
【００３９】
反応終了後は、当業者公知の方法により化合物（Ｉ1）を精製すればよい。例えば、反応混合液を大量の水に注ぎ、生じた析出物を濾取してからジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチルなど溶解性の高い溶媒で抽出し、抽出液を水や食塩水などで洗浄した後に乾燥し、溶媒を留去して残渣をクロマトグラフィなどにより精製する。
【００４０】
本発明に係る多環系フェナジン化合物（Ｉ2）は、上記方法を応用して、下記式のとおり製造することができる。
【００４１】
【化３】
【００４２】
上記合成スキーム中、Ｒ10〜Ｒ21は前述したものと同義を示す。
【００４３】
上記合成スキームの原料化合物であるジアミン化合物（Ｖ）は、キノン化合物（ＶＩ）から下記合成スキームにより製造することができる。
【００４４】
【化４】
【００４５】
上記合成スキームの反応は、当業者公知の官能基変換反応である。即ち、キノン化合物のカルボニル基をヒドロキシアンモニウム塩酸塩によりオキシム基に変換し、さらに塩化スズ−塩酸などの触媒によりオキシム基をアミノ基に還元する。具体的な反応条件は、当業者公知のものを採用するか、或いは当業者公知の条件に変更を加えたものとすることができる。
【００４６】
また、多環系フェナジン化合物（Ｉ2）において、−ＮＲ10Ｒ11基と−ＮＲ20Ｒ21基、および対応するＲ12〜Ｒ15とＲ16〜Ｒ19がそれぞれ同一である場合には、特許文献４（特開２００７−２１１１８５号公報）に記載の方法により、下記式のとおり製造することができる。
【００４７】
【化５】
【００４８】
上記合成スキーム中、Ｒ10〜Ｒ15は前述したものと同義を示す。
【００４９】
より具体的には、キノン化合物（ＩＶ'）の酢酸溶液を加熱しながら大過剰の酢酸アンモニウムを小量ずつ加えて反応させればよい。通常酢酸アンモニウムは、キノン化合物（ＩＶ'）に対して１０〜２０倍モル程度使用する。
【００５０】
本反応の反応温度は適宜調節すればよいが、例えば６０℃から還流条件程度とすればよい。反応時間も特に制限されず、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）などで原料化合物である化合物（ＩＶ'）の消費を確認できるまでとすればよいが、通常は１〜１２時間程度とする。
【００５１】
反応終了後は、酢酸を減圧除去した後、当業者公知の方法により化合物（Ｉ2'）を精製すればよい。例えば、残渣をジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチルなど溶解性の高い溶媒に溶解して、水や食塩水などで洗浄した後に乾燥し、溶媒を留去して残渣をクロマトグラフィなどにより精製する。
【００５２】
本発明に係る多環系フェナジン化合物（Ｉ1）および（Ｉ2）は、特定の光を吸収して特定の光を発する。特に赤色光を発するが、赤色以外の光がＰＬＢの増殖に関与している可能性がある。
【００５３】
本発明に係る多環系オキサゾール化合物（Ｉ3）は、特許文献６（国際公開第２００５／０７８０２４号パンフレット）に記載の方法により、下記式のとおり製造することができる。
【００５４】
【化６】
【００５５】
上記合成スキーム中、Ｒ23〜Ｒ29は前述したものと同義を示す。
【００５６】
より具体的には、酢酸などの適当な溶媒中において、キノン化合物（ＶＩＩＩ）と、若干過剰のアルデヒド化合物（ＩＸ）と、大過剰の酢酸アンモニウムを５０〜１００℃程度の温度で反応させればよい。反応時間は特に制限されず、薄層クロマトグラフィなどで原料化合物である化合物（ＶＩＩＩ）の消費を確認できるまでとすればよいが、通常は１〜５時間程度とする。
【００５７】
反応終了後は、当業者公知の方法により化合物（Ｉ3）を精製すればよい。例えば、反応混合液を大量の水に注ぎ、生じた析出物を濾取してからジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチルなど溶解性の高い溶媒で抽出し、抽出液を水や食塩水などで洗浄した後に乾燥し、溶媒を留去して残渣をクロマトグラフィなどにより精製する。
【００５８】
本発明に係る多環系オキサゾール化合物（Ｉ3）は、特定の光を吸収して特定の光を発する。特に青色光〜黄色光を発するが、青色光〜黄色光以外の光がＰＬＢの増殖に関与している可能性がある。
【００５９】
本発明に係る蛍光体は、上記多環系フェナジン化合物（Ｉ1）もしくは（Ｉ2）または上記多環系オキサゾール化合物（Ｉ3）を色素として含む。当該蛍光体の形状は、発光をＰＬＢに照射できるものであれば特に問わない。例えば、フィルム、ペレット、粒状、粉末、筒状等とすることができる。また、透明であってもよいし、不透明であってもよい。透明であれば透過光をＰＬＢに照射すればよいし、不透明であれば反射光をＰＬＢに照射すればよい。
【００６０】
本発明の蛍光体を構成するマトリクス樹脂の種類は特に制限されず、例えば、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリエチレンやポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、エチレン−酢酸ビニル共重合体などの熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００６１】
本発明の蛍光体に含まれる色素化合物が同一であっても、マトリクス樹脂の種類によりＰＬＢの増殖効率が異なったり、また、色素化合物の耐光性が変化することが本発明者らにより明らかにされている。よってマトリクス樹脂は、ラン科植物の種類などに応じて、予備実験などにより適宜決定すればよいが、発光効率と色素耐光性に優れることからポリスチレンが好適である。
【００６２】
なお、本発明において透明とは、可視光、例えば波長３８０〜７８０ｎｍの光の透過率が６０％以上であることをいう。より好ましくは、当該光透過率が８０％以上であることをいう。かかる光透過率を有する蛍光体であれば、透過光をＰＬＢへ照射することができる。また、当該光透過率が低い場合には、反射光をＰＬＢへ照射すればよい。この光透過率は、紫外可視近赤外分光光度計（例えば、日本分光社製の製品名「Ｖ−６７０」など）または瞬間マルチ測光システム（例えば、大塚電子社製の製品名「ＭＣＰＤ−３０００」など）により測定することができる。
【００６３】
本発明に係るＰＬＢ増殖用蛍光体は、多環系フェナジン化合物（Ｉ1）、（Ｉ2）または多環系オキサゾール化合物（Ｉ3）を含むが、これら色素化合物を１種のみ含んでいてもよいし、２種以上含んでいてもよい。
【００６４】
本発明に係る蛍光体へは、マトリクス樹脂と色素化合物の他、ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルを添加することが好ましい。ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルを添加すると、蛍光体の耐光性を向上させることができる。ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルにおける２つのＣ1-6アルキルは、同一であっても異なっていてもよい。当該Ｃ1-6アルキルとしては、Ｃ2-5アルキルが好ましく、Ｃ3-4アルキルがより好ましい。好適には、ジブチルジチオカルバミン酸ニッケルを用いる。
【００６５】
ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルの添加量は適宜調整すればよいが、通常、色素化合物に対して０．１倍モル比以上、５倍モル比以下が好ましく、０．５倍モル比以上、２倍モル比以下がより好ましい。ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルは、用量依存的に色素化合物の耐光性を向上させ、色素化合物に対して１倍モル比程度添加すれば当該耐光性は格段に改善されるが、多過ぎると用量ほどの効果は期待できないので、５倍モル比以下程度にとどめておくことが好ましい。
【００６６】
本発明に係る蛍光フィルムを溶融法で作製する場合には、先ずマトリクス樹脂と色素化合物をバッチミキサーで溶融混練し、マスターバッチを作成する。その後、マトリクス樹脂とマスターバッチを溶融混練し、二軸押し出し機を用いてフィルム状に成形すればよい。また、キャスト法で作製する場合には、マトリクス樹脂と色素化合物を適切な溶媒に溶解または分散させた上で、金属板上にキャストし、乾燥すればよい。その他の形状の蛍光体を製造する場合は、マトリクス樹脂と色素化合物とを含むペレット等を溶融成形すればよい。また、粒状蛍光体や粉末蛍光体を製造する場合には、各種蛍光体を所望の粒度まで粉砕すればよい。
【００６７】
特に本発明の蛍光体を溶融法で作製する場合には、色素化合物を事前に十分に粉砕しておくことが好ましい。なお、本発明に係る色素化合物は、上記マトリクス樹脂や有機溶媒に対して十分な可溶性を示す。
【００６８】
マトリクス樹脂に対する色素化合物の割合は、適宜調整すればよいが、０．０１質量％以上、０．１質量％以下程度とすることが好ましい。当該割合が０．０１質量％未満であると、蛍光体の発光量が少なくなってＰＬＢの増殖効果が十分に得られないおそれがある一方で、当該割合が０．１質量％を超えると蛍光体の強度が確保できなくなる場合があり得る。より好ましくは、０．０５質量％程度にすればよい。また、蛍光フィルムの膜厚も適宜調製すればよいが、通常、８０μｍ以上、１５０μｍ以下とすればよい。
【００６９】
本発明の蛍光フィルムは、エンボス加工することが好ましい。無処理の蛍光透明フィルムの場合、上記多環系フェナジン化合物由来の蛍光が側面から漏れ出してしまうことがあるが、エンボス加工によりかかる漏出はなくなり、ＰＬＢへ効率的に蛍光を照射することが可能になる。また、エンボス加工された不透明の蛍光フィルムは、照射光を効率的に反射できることから、ＰＬＢへ効果的に反射光を照射することができる。
【００７０】
エンボス加工は、片面のみに施してもよいし、両面に施してもよい。また、その形状は特に制限されないが、例えば、上から見た形状が０．５〜３ｍｍ程度の円、楕円、四角形などであり、高さが０．１〜１ｍｍ程度の凸部または凹部を、０．５〜５ｍｍ程度の間隔で形成すればよい。エンボス加工は常法で行うことができ、例えば、蛍光フィルムをエンボスロール間に通せばよい。
【００７１】
本発明方法においては、上記蛍光体による波長変換光をＰＬＢに照射する。
【００７２】
ＰＬＢは、ラン科植物の生長点に形成されたものを採取し、そのまま用いればよい。採取したＰＬＢは、ＭＳ培地など適切な培地上に植え付ける。
【００７３】
蛍光体による波長変換光とは、上記蛍光体へ照射された光を上記色素化合物が吸収することにより、さらに当該色素化合物から発せられる蛍光をいう。ここで、色素化合物は特定の波長の光を吸収して特定の波長の光を発する性質を有し、吸収光の波長と発せられる蛍光の波長は異なることから、色素化合物から発せられる蛍光を波長変換光という。この波長変換光には、上記蛍光体の透過光や反射光がある。
【００７４】
本発明者らによる実験的知見により、ラン科植物の種類によって、ＰＬＢの増殖等に適した色素化合物が異なり得ることが明らかにされている。よって、予備実験などにより、製造すべきラン科植物の種類に応じて、適切な色素化合物を選択することが好ましい。
【００７５】
蛍光体に光を照射する光源としては、色素化合物が選択的に吸収する波長の光を含むものを用い、好ましくは当該光を多く放射できるものを用いる。例えば、白色蛍光灯や擬似太陽光などを用いればよい。また、本発明者らによる実験的知見によれば、ラン科植物の種類により、より好ましい光源があり得る。よって、予備実験などにより、製造すべきラン科植物の種類に応じて、適切な光源を選択することが好ましい。
【００７６】
ＰＬＢに上記蛍光透明フィルムの透過光を照射する場合には、ＰＬＢと光源との間に上記蛍光透明フィルムを配置する。例えば、光源を蛍光透明フィルムで覆ったり、単に中間部に配置したり、或いはＰＬＢの培養瓶などを蛍光透明フィルムで被覆してもよい。
【００７７】
反射光を照射する場合には、透明な蛍光フィルムや蛍光粉末等の層の下および側面あるいはその両方に、例えば白色の高反射材を敷き、下からおよび側面からの反射光を遮らないような培地や容器を使用することが望ましい。不透明な蛍光フィルム等を用いる場合には、反射光をＰＬＢに照射すればよい。
【００７８】
また、粒状蛍光体や粉末状蛍光体は、培地に添加してもよい。
【００７９】
さらに、ＰＬＢにＮ−アセチルグルコサミンを作用させるのも好適な態様である。Ｎ−アセチルグルコサミンを作用させれば、蛍光体から放出される光との相乗作用により、ＰＬＢ数が増加する。Ｎ−アセチルグルコサミンは、ＰＬＢの培地へ添加すればよい。Ｎ−アセチルグルコサミンの使用量は、適宜調整すればよいが、例えば、培地に対して１ｍｇ／Ｌ以上、２０ｍｇ／Ｌ以下程度とすることができる。
【００８０】
波長変換光の照射時間は適宜調整すればよいが、通常、培養期間中において、１０日以上、５０日以下程度とする。また、蛍光灯などの人工光源を用いる場合には、太陽光の場合と同様に、１日当たりの光照射時間を１２時間以上、１６時間以下程度にすることが好ましい。
【００８１】
波長変換光の照射時における温度は特に制限されず、ＰＬＢの増殖に適した温度に調整すればよい。具体的には、常温でもよいし、また、外気温が低過ぎる場合には２０〜３０℃程度に温度調節してもよい。
【００８２】
ＰＬＢ増殖のための最適な光環境は、ラン科植物の種類により大きく変化し得るが、具体的な波長変換光の照射条件は、安価な白色蛍光灯と本発明に係る蛍光体を組合わせた予備実験により簡便に決定することができる。
【００８３】
本発明に係る蛍光体による波長変換光を照射すると、単なる細胞増殖によりＰＬＢの重量が増大するのみならず、１個のＰＬＢから複数の新たなＰＬＢが瘤状に形成される。これらＰＬＢは、それぞれ一個の植物体になり得る。
【００８４】
増殖したＰＬＢは、正常なものを選択して切り離し、新しい培地に植え付ければよい。また、新たに植え付けたＰＬＢを再び上記で説明した工程に付し、さらにＰＬＢを増殖させることもできる。
【００８５】
本発明方法で増殖させたＰＬＢは、本発明に係る蛍光体による波長変換光を照射し続けることで、根や葉茎が形成されることがある。根や葉茎が形成されない場合には、ショート形成培地に移し、根や葉茎の形成を促進してもよい。根や葉茎が形成された幼植物体は、培養容器から出して外環境にならす順化を行った上で、そのまま出荷することも可能である。
【００８６】
本発明方法によれば、ラン科植物のＰＬＢを顕著に増殖することができる。上記で説明した工程を繰り返すことにより、一個のラン科植物より得られるＰＬＢを数万個に増やすことも可能である。各ＰＬＢはそれぞれ一個の植物体になり得ることから、本発明によれば、ラン科植物を極めて効率的に製造することができる。
【００８７】
なお、本発明におけるラン科植物とは、花を有しているもののみならず、根および葉茎を有する苗条（シュート）など、水や肥料の投与など通常の方法で生育するものも含むものとする。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００８９】
実施例１ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
特開２００８−１９５７４９号公報に記載の実施例１〜３の方法に従って、下記多環系フェナジン化合物を合成した。以下、下記多環系フェナジン化合物を「ＮＢ」という。
【００９０】
【化７】
【００９１】
バッチミキサーにポリスチレン（６８．６ｇ）と蛍光色素ＮＢ（１．４ｇ）を入れ、１９０℃で溶融混練するという操作を２回繰り返すことによって、マスターバッチ（１４０ｇ）を作成した。当該マスターバッチ（１００ｇ）とポリスチレン（３９００ｇ）を同様に溶融混練した後、Ｔダイ二軸押し出し機を用いてフィルム状に成形した。この時、Ｔダイ二軸押し出し機のスクリュー回転速度は３０〜６０ｒｐｍとし、温度はポリスチレンの溶融温度に対応させた。
【００９２】
得られたフィルムの吸収スペクトルを紫外可視近赤外分光光度計（日本分光社製，製品名「Ｖ−６７０」）で測定し、また、蛍光スペクトルを分光蛍光光度計（日本分光社製，製品名「ＦＰ−６６００」）で測定した。なお、３００ｎｍ未満の光はフィルム自体に吸収されてしまうため、測定していない。結果を図１に示す。
【００９３】
実施例２ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系フェナジン化合物を合成した。
【００９４】
【化８】
【００９５】
原料化合物であるナフトキノン化合物は、特開２００８−１９５７４９号公報に記載の実施例１−２の方法に従って合成することができる。また、１，２−ジアミノ化合物は、当該ナフトキノン化合物のケト基をヒドロキシアンモニウム塩酸塩でオキシム化した後、塩化スズ−塩酸で還元することにより合成することができる。
【００９６】
上記ナフトキノン化合物（０．４６４ｇ）と１，２−ジアミノ化合物（０．４６２ｇ）をエタノール（５０ｍＬ）に溶解し、８０℃で１２時間加熱還流した。反応終了後、反応混合液を大量の水（５００ｍＬ）に注ぎ、生じた析出物を濾別した。濾別した析出物をジクロロメタンに溶解し、当該溶液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：キシレン／ｎ−ヘキサン＝２／１）を用いて精製することにより、トランス型多環系フェナジン化合物（０．４５８ｇ，収率：５２％）を得た。以下、上記多環系フェナジン化合物を「ＢＤ」という。
【００９７】
当該トランス型多環系フェナジン化合物を用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図１に示す。
【００９８】
実施例３ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
上記実施例１において、ポリスチレンの代わりにポリメチルメタクリレート（三菱レイヨン社製，Ｖ００１）を用いた以外は同様にして、本発明フィルムを製造した。
【００９９】
比較例１ 蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、アントラキノン化合物を合成した。
【０１００】
【化９】
【０１０１】
上記ジメチルアミノフェニルプロペナール化合物（３．６８ｇ）と酢酸銅（４．１９ｇ）を酢酸（２００ｍＬ）に溶解させた反応溶液に、酢酸（２００ｍＬ）に溶解させた上記アントラキノン化合物（５．０ｇ）を加え、９０℃で１時間半加熱還流した。反応終了後、反応混合液を減圧濃縮し、水で洗浄後、ジクロロメタンで抽出し、抽出溶液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：ジクロロメタン／酢酸エチル＝２０／１）を用いて精製することにより、多環系アントラキノン化合物（６．１ｇ，収率：７４％）を得た。以下、上記多環系アントラキノン化合物を「ＩＤ」という。
【０１０２】
当該アントラキノン化合物を用いた以外は上記実施例１と同様にして、蛍光透明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図１に示す。
【０１０３】
実施例４ ＰＬＢの増殖実験
シンビジウム（C．finlaysonianum）の直径：約３ｍｍのＰＬＢを取得した。別途、ショ糖を２０ｇ／Ｌとゲルライトを２ｇ／Ｌを含み、且つ硝酸アンモニウム量を１／４に、硝酸カリウム量を１／２に低減した修正ＭＳ培地を、直径：約６２ｍｍ、高さ：１０９ｍｍのガラス瓶に作製した。当該ガラス瓶１個につき、ＰＬＢを１０個ずつ植え付けた。
【０１０４】
上記ガラス瓶を４個ずつインキュベータに入れ、各インキュベータ中の全てのガラス瓶の上部を、上記実施例１〜３または比較例１で製造した蛍光透明フィルム一枚で覆った。比較のために、色素を含まないポリスチレンフィルムを作製し、同様にガラス瓶を覆った。インキュベータ中の冷陰極蛍光ランプと蛍光透明フィルムとの距離が１５ｃｍとなるように、蛍光透明フィルムの位置を調節した。インキュベータの温度は２５℃とし、ＰＬＢには約２，０００ｌｕｘの光が１日当たり１６時間照射されるようにした。
【０１０５】
４０日後、各ＰＬＢの重量、各ＰＬＢから生じたＰＬＢの総数と正常なＰＬＢの数を計測した。また、ＰＬＢの色を、１：緑，２：黄緑，３：黄，４：白，５：黒の５段階で評価した。それぞれの結果の平均値を表１に示す。また、１個のＰＬＢから生じたＰＬＢの総数の経時的な変化を、図２に示す。なお、表１中、異なるアルファベット間にはＴｕｋｅｙの多重検定において、５％レベルで有意差があることを示す。例えば、ａ−ｂ間には有意差がある。その一方で、ａ−ａｂ間およびａｂ−ｂ間には有意差はない。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
上記結果のとおり、本発明に係る蛍光透明フィルムの変換光をラン科植物のＰＬＢに照射すれば、コントロールや他の色素を含む蛍光透明フィルムを用いた場合に比して、ＰＬＢの総数や正常数が顕著に向上することが明らかになった。
【０１０８】
実施例５ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
上記実施例２において、ポリスチレンの代わりにポリカーボネート（三菱エンジニアリングプラスチック社製，Ｅ−２０００）を用いた以外は同様にして、本発明フィルムを製造した。
【０１０９】
実施例６ ＰＬＢの増殖実験
上記実施例４において、C.finlaysonianumの代わりにC.insigneのＰＬＢを用い、ＰＬＢの増殖実験を行った。なお、当実験では４０日にわたる光照射後において、ＰＬＢ数等のみならず、各ＰＬＢの根の形成率と葉茎の形成率も求めた。結果を表２に示す。
【０１１０】
【表２】
【０１１１】
上記結果のとおり、本発明に係る蛍光透明フィルムの変換光をラン科植物のＰＬＢに照射すれば、コントロールよりもＰＬＢの総数が向上し、さらに、特別な処理をしなくとも、各ＰＬＢにおいて根や葉茎の形成を促進できることが明らかになった。
【０１１２】
実施例７ ＰＬＢの増殖実験
実施例１で製造したＮＢ−ＰＳフィルムと、実施例３で製造したＮＢ−ＰＭＭＡフィルムをエンボス加工した。具体的には、各フィルムの片側表面に、長径：１ｍｍの円形凸部を、縦横方向間隔：２ｍｍ、斜め方向の間隔：１ｍｍで形成した。得られたフィルムを用い、上記実施例４と同様の条件により、ＰＬＢの増殖実験を行った。結果を表３に示す。表３中、異なるアルファベット間にはＴｕｋｅｙの多重検定において、５％レベルで有意差があることを示す。
【０１１３】
【表３】
【０１１４】
上記結果のとおり、本発明に係る蛍光透明フィルムの変換光をラン科植物のＰＬＢに照射すれば、コントロールに比して、ＰＬＢの総数や正常数が顕著に向上する。さらにフィルムにエンボス加工を施した場合、特にＮＢ−ＰＳフィルムにエンボス加工を施した場合には、ＰＬＢ数が一層有意に向上することが分かった。
【０１１５】
実施例８ ＰＬＢの増殖実験
実施例１のＮＢ−ＰＳフィルムと実施例３のＮＢ−ＰＭＭＡフィルムに加え、上記実施例７で用いたエンボスＮＢ−ＰＳフィルムとエンボスＮＢ−ＰＭＭＡフィルムを各インキュベータの底に敷き、反射光がＰＬＢに照射されるようにした以外は上記実施例４と同様にして、ＰＬＢの増殖実験を行った。エンボス加工を施さないＮＢ−ＰＳフィルムとＮＢ−ＰＭＭＡフィルムの透過光をＰＬＢに照射した実験結果と合わせて、当実験の結果を図３に示す。
【０１１６】
図３のとおり、本発明フィルムによる反射光および透過光のいずれを照射した場合であっても、ＰＬＢの総数はコントロールよりも明らかに増加している。また、おしなべていえば、反射光を照射した場合の方がＰＬＢ数は増加している。よって、本発明フィルムの変換光の照射手段によってもＰＬＢ数は変わってくる場合があるので、予備実験等により、照射手段を検討することも重要であることが明らかにされた。
【０１１７】
実施例９ ＰＬＢの増殖実験 − 植物ホルモンとの比較
上記実施例４で用いた修正ＭＳ培地中に、植物ホルモンであるナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を１ｍｇ／Ｌとベンジルアデニン（ＢＡ）を２ｍｇ／Ｌ添加した。当該培地と、植物ホルモンを添加しない修正ＭＳ培地を用い、上記実施例４と同様の条件で、無色ＰＳフィルムを用いたコントロール、本発明に係るＮＢ−ＰＳフィルムを用いた場合、植物ホルモンを用いた場合、本発明フィルムと植物ホルモンを併用した場合の比較を行った。結果を表４に示す。表４中、異なるアルファベット間にはＴｕｋｅｙの多重検定において、５％レベルで有意差があることを示す。
【０１１８】
【表４】
【０１１９】
上記結果のとおり、本発明フィルムのみ用いた場合、植物ホルモンのみ用いた場合、本発明フィルムと植物ホルモンを併用した場合のいずれも、コントロールより有意にＰＬＢ数を増やすことができた。また、植物ホルモンのみ用いた場合の方が本発明フィルムのみ用いた場合よりもＰＬＢ総数は多かったが、正常なＰＬＢの割合が少なく、決して効率的ではないことが分かった。さらに、上記結果では、本発明フィルムと植物ホルモンを併用した場合の結果が最も良好であった。
【０１２０】
実施例１０ ＰＬＢの増殖実験 − 植物ホルモンとの比較
上記実施例９において、C.finlaysonianumの代わりにC.insigneのＰＬＢを用いた以外は同様にして、ＰＬＢの増殖実験を行った。また、４０日にわたる光照射後において、ＰＬＢ数等のみならず、各ＰＬＢの根の形成率と葉茎の形成率も求めた。結果を表５に示す。
【０１２１】
【表５】
【０１２２】
上記結果のとおり、本発明フィルムのみ用いた場合、植物ホルモンのみ用いた場合、本発明フィルムと植物ホルモンを併用した場合のいずれも、コントロールに比べて有意とはいえないまでもＰＬＢ重量や数が増加することが分かった。また、植物ホルモンを用いた場合、根や葉茎の形成が阻害され、その理由は必ずしも明らかではないが、本発明フィルムと植物ホルモンを併用した場合では根と葉茎の両方が形成されたＰＬＢは皆無であった。一方、本発明フィルムのみを用いた場合では、根や葉茎が良好に形成されている。
【０１２３】
従って、本発明フィルムを用いれば、植物ホルモンを用いずともＰＬＢの増殖を促進することができる上に、根や葉茎の形成も阻害しないことが実証された。
【０１２４】
実施例１１ 耐光性試験
実用上、農業用フィルムの耐光性は重要であるので、本発明に係る蛍光透明フィルムの耐光性につき試験した。具体的には、実施例１のＮＢ−ＰＳフィルムと実施例３のＮＢ−ＰＭＭＡフィルムをキセノン促進耐候性試験機（Ｑ−Ｌａｂ社製，製品名「Ｑ−Ｓｕｎ Ｘｅ−１型」）内に設置し、３４０ｎｍの波長照度：０．５１Ｗ／ｍ2、温度：４５℃となる条件でキセノン光を２時間ずつ、合計１０時間照射した。次いで、各フィルムの蛍光強度を測定し、キセノン光照射前に対する蛍光強度保持率を算出した。結果を表６と図４に示す。
【０１２５】
【表６】
【０１２６】
表６と図４の結果のとおり、キセノン光という強力光を強制的に照射した場合、マトリクス樹脂としてポリメチルメタクリレートを含む実施例３のフィルムでは、１０時間後における蛍光強度が４０％まで低下してしまった。それに対してポリスチレンを含む実施例１のフィルムでは、同一の色素であってもその含量は９０％に維持されていた。
【０１２７】
以上の結果から、本発明方法を実施するに当たり、フィルムによっては適時交換する必要があり、また、マトリクス樹脂としてポリスチレンを含むフィルムは、本発明色素の分解等を抑制することができ、耐光性に優れることが明らかになった。
【０１２８】
実施例１２ 耐光性試験
上記実施例１１において、蛍光透明フィルムを実施例２のＢＤ−ＰＳフィルムと実施例５のＢＤ−ＰＣフィルムに変えて、同様の実験を行った。結果を図５に示す。
【０１２９】
図５のとおり、キセノン光という強力光を強制的に照射した場合、マトリクス樹脂としてポリカーボネートを含む実施例５のフィルムでは、１０時間後における蛍光強度が約５０％まで低下してしまった。それに対してポリスチレンを含む実施例２のフィルムでは、同一の色素であってもその含量は約９０％に維持されていた。よって、マトリクス樹脂としてポリスチレンを含むフィルムの耐光性の高さが実証された。
【０１３０】
実施例１３ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系オキサゾール化合物を合成した。
【０１３１】
【化１０】
【０１３２】
上記ナフトキノン化合物（１．０ｇ）とｐ−ｔ−ブチルベンズアルデヒド（０．６５ｇ）をエタノール（６５ｍＬ）に溶解し、これに酢酸アンモニウム（３．２８ｇ）を加えて８０℃で２時間加熱攪拌した。反応終了後、反応混合液を水（５００ｍＬ）に注ぎ、生じた析出物を濾別した。濾別した析出物をジクロロメタンに溶解し、当該溶液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：キシレン／酢酸＝２０／１）を用いて分離精製することにより、多環系オキサゾール化合物（０．６ｇ，収率：４３．５％）を得た。以下、上記多環系オキサゾール化合物を「ＢＢ」という。
【０１３３】
当該多環系オキサゾール化合物「ＢＢ」を用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図６に示す。
【０１３４】
実施例１４ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系オキサゾール化合物を合成した。
【０１３５】
【化１１】
【０１３６】
上記ナフトキノン化合物（０．８ｇ）と１−ピレンカルバルデヒド（０．９８ｇ）をエタノール（１５０ｍＬ）に溶解し、これに酢酸アンモニウム（６．５７ｇ）を加えて８０℃で１．５時間加熱攪拌した。反応終了後、反応混合液を水（５００ｍＬ）に注ぎ、生じた析出物を濾別した。濾別した析出物をジクロロメタンに溶解し、当該溶液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：キシレン／酢酸＝２０／１）を用いて分離精製することにより、多環系オキサゾール化合物（１．１２ｇ，収率：４９．４％）を得た。以下、上記多環系オキサゾール化合物を「ＢＰ」という。
【０１３７】
当該多環系オキサゾール化合物「ＢＰ」を用い且つポリスチレンの代わりにポリカーボネートを用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図６に示す。
【０１３８】
実施例１５ 耐光性試験
上記実施例１１において、蛍光透明フィルムを実施例１３のＢＢ−ＰＳフィルムと実施例１４のＢＰ−ＰＣフィルムに変えて、同様の実験を行った。結果を図７に示す。
【０１３９】
図７のとおり、キセノン光という強力光を１０時間にわたり照射した場合、マトリクス樹脂としてポリスチレンまたはポリカーボネートを含むフィルムでは、蛍光色素を約６０％に維持することができた。
【０１４０】
実施例１６ 耐光性試験
実施例１のＮＢ−ＰＳフィルム、実施例２のＢＤ−ＰＳフィルム、実施例１３のＢＢ−ＰＳフィルム、実施例１４のＢＰ−ＰＣフィルム、および比較例１のＩＤ−ＰＳフィルムを、擬似太陽光（Light source社製，ＶＩＴＡ ＬＩＴＥ）から１５ｃｍ離した位置に設置し、光強度が１５００〜１８００ｌｕｘとなる条件で擬似太陽光を３０日間照射した後、各フィルムの蛍光強度を測定し、擬似太陽光照射前に対する蛍光強度保持率を算出した。結果を表７に示す。
【０１４１】
【表７】
【０１４２】
上記結果のとおり、マトリクス樹脂としてポリスチレンを含む蛍光透明フィルムは、おしなべて耐光性に優れることが実証された。
【０１４３】
実施例１７ ＰＬＢの増殖実験
上記実施例４において、蛍光透明フィルムとして上記実施例１３のＢＢ−ＰＳフィルムを用い、光強度が１５００〜１８００ｌｕｘの擬似太陽光（Light source社製，ＶＩＴＡ ＬＩＴＥ）を用い、且つ波長変換光の照射期間を４２日間とした以外は同様にして、ＰＬＢの増殖実験を行った。結果を表８に示す。なお、表８中、「＊」はｔ検定により５％の危険率で有意差があることを示す。
【０１４４】
【表８】
【０１４５】
上記結果のとおり、蛍光色素として多環系オキサゾール化合物を含む蛍光透明フィルムを用いた場合には、色素を含まないコントロールフィルムに比べて、ＰＬＢの総数と正常数が有意に増加した。よって、蛍光色素として多環系オキサゾール化合物を含む蛍光透明フィルムも、ＰＬＢの増殖に有用であることが分かった。
【０１４６】
実施例１８ ＰＬＢの増殖実験
上記実施例４において、蛍光透明フィルムとして上記実施例１４のＢＰ−ＰＣフィルムを用い、光強度が１５００〜１８００ｌｕｘの擬似太陽光（Ｄｕｒｏ−Ｔｅｓｔ Ｌｉｇｈｔｉｈｇ社製，ＶＩＴＡ ＬＩＴＥ）を用い、且つ波長変換光の照射期間を４２日間とした以外は同様にして、ＰＬＢの増殖実験を行った。結果を表９に示す。なお、表９中、「＊」はｔ検定により５％の危険率で有意差があることを示す。
【０１４７】
【表９】
【０１４８】
上記結果のとおり、蛍光透明フィルムとしてＢＰ−ＰＣを用いた場合には、正常ＰＬＢ数で有意差はないものの、ＢＢ−ＰＳを用いた場合とほぼ同様の結果が得られた。よって、蛍光色素として多環系オキサゾール化合物を含む蛍光透明フィルムも、ＰＬＢの増殖に有用であることが分かった。
【０１４９】
実施例１９ ＰＬＢの増殖実験
上記実施例１８において、C.finlaysonianumの代わりにC.insigneのＰＬＢを用いた以外は同様にして、ＰＬＢの増殖実験を行った。結果を表１０に示す。なお、表１０中、「＊」はｔ検定により５％の危険率で有意差があることを示す。
【０１５０】
【表１０】
【０１５１】
上記結果のとおり、蛍光透明フィルムとしてＢＰ−ＰＣを用いた場合、根や葉茎の形成率はコントロールに比べてやや低下したものの、ＰＬＢの数は有意に増加した。よって、蛍光色素として多環系オキサゾール化合物を含む蛍光透明フィルムも、ＰＬＢの増殖に有用であることが分かった。
【０１５２】
実施例２０ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
特開２００８−１９５７４９号公報に記載の実施例４〜５の方法に従って、下記多環系フェナジン化合物を合成した。以下、下記多環系フェナジン化合物を「ＢＸ」という。
【０１５３】
【化１２】
【０１５４】
当該多環系フェナジン化合物ＢＸを用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図８に示す。
【０１５５】
実施例２１ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系フェナジン化合物を合成した。
【０１５６】
【化１３】
【０１５７】
原料化合物であるナフトキノン化合物は、特開２００８−１９５７４９号公報に記載の実施例１−２の方法に従って合成することができる。
【０１５８】
上記ナフトキノン化合物（０．９２ｇ）と１，２−ジアミノ化合物（０．９２ｇ）をエタノール（６０ｍＬ）に溶解し、８０℃で４時間加熱還流した。反応終了後、反応液を減圧濃縮した。得られた残渣をジクロロメタンで抽出し、当該抽出液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：ジクロロメタン／酢酸エチル＝１０／１）を用いて精製した後、再度シリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：キシレン）で精製することにより、トランス型多環系フェナジン化合物（１．００ｇ，収率：５７％）を得た。以下、上記多環系フェナジン化合物を「ＦＸ」という。
【０１５９】
当該トランス型多環系フェナジン化合物を用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図８に示す。
【０１６０】
実施例２２ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系フェナジン化合物を合成した。
【０１６１】
【化１４】
【０１６２】
原料化合物であるナフトキノン化合物は、特開２００８−１９５７４９号公報に記載の実施例１−２の方法に従って合成することができる。また、１，２−ジアミノ化合物は、当該ナフトキノン化合物のカルボニル基をヒドロキシアンモニウム塩酸塩でオキシム化した後、塩化スズ−塩酸で還元することにより合成することができる。
【０１６３】
上記ナフトキノン化合物（０．３７０ｇ）と１，２−ジアミノ化合物（０．３７０ｇ）をエタノール（３０ｍＬ）に溶解し、８０℃で１０時間加熱還流した。反応終了後、反応混合液を大量の水（５００ｍＬ）に注ぎ、生じた析出物を濾別した。濾別した析出物をジクロロメタンに溶解し、当該溶液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：ジクロロメタン）を用いて精製することにより、赤色粉末結晶であるトランス型多環系フェナジン化合物（０．３２３ｇ，収率：４６％）を得た。以下、上記多環系フェナジン化合物を「ＸＸ」という。
【０１６４】
当該トランス型多環系フェナジン化合物を用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図８に示す。
【０１６５】
実施例２３ 耐光性試験
上記実施例１１と同様の条件で、実施例２０のＢＸ−ＰＳフィルム、実施例２１のＦＸ−ＰＳフィルムおよび実施例２２のＸＸ−ＰＳフィルムの耐光性を試験した。結果を表１１と図９に示す。
【０１６６】
【表１１】
【０１６７】
上記結果のとおり、実施例２０〜２２の本発明フィルムにおいては、キセノン光という強力光を合計１０時間照射した後においても、色素顔料は８０％以上に維持されており、本発明フィルムの優れた耐光性が実証された。また、吸収波長領域と発光波長領域から分かるように、これら本発明フィルムは、青色光は吸収せずに透過させ、近紫外光と緑〜黄色光を吸収して赤色光に変換することができる。さらに、相対蛍光強度からしめされるように、発光強度は、ＢＸ−ＰＳ＜ＦＸ−ＰＳ＜ＸＸ−ＰＳの順に増大した。
【０１６８】
以上の結果から、マトリクス樹脂としてポリスチレンを含むフィルムは、本発明色素の分解等を抑制することができ、耐光性に優れることが明らかになった。
【０１６９】
実施例２４ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系オキサゾール化合物を合成した。
【０１７０】
【化１５】
【０１７１】
上記ナフトキノン化合物（２．０ｇ）とｐ−ホルミル安息香酸（０．８０ｇ）を酢酸（３０ｍＬ）に溶解し、これに酢酸アンモニウム（８．１９ｇ）を加えて９０℃で５時間加熱攪拌した。反応終了後、反応混合液を水（３００ｍＬ）に注ぎ、生じた析出物を濾別し、少量のジクロロメタンで洗浄することにより黄色粉末を得た。得られた黄色粉末、１−ヨードブタン（１．９５ｇ）および炭酸ナトリウム（１．４２ｇ）をジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）に溶解し、１００℃で１時間加熱攪拌した。反応終了後、反応混合液を水（３５０ｍＬ）に注ぎ、生じた析出物を濾別した。得られた析出物をジクロロメタンに溶解した。当該溶液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：トルエン／酢酸＝１０／１）を用いて分離精製することにより、多環系オキサゾール化合物（２．４９ｇ，収率：８３％）を得た。以下、上記多環系オキサゾール化合物を「ＢＥ」という。
【０１７２】
当該多環系オキサゾール化合物ＢＥを用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図１０に示す。
【０１７３】
実施例２５ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系オキサゾール化合物を合成した。
【０１７４】
【化１６】
【０１７５】
上記ナフトキノン化合物（２．０ｇ）と４−ピリジンカルバルデヒド（０．６７ｇ）を酢酸（１４０ｍＬ）に溶解し、これに酢酸アンモニウム（２．０６ｇ）を加えて９０℃で４時間加熱攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去して除去した後に水（１０００ｍＬ）を注ぎ、生じた析出物を濾別した。析出物をジクロロメタンに溶解し、当該溶液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：ジクロロメタン／テトラヒドロフラン＝３／１）を用いて分離精製することにより、多環系オキサゾール化合物（１．１７ｇ，収率：４７．２％）を得た。以下、上記多環系オキサゾール化合物を「ＰＰ」という。
【０１７６】
当該多環系オキサゾール化合物ＰＰを用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図１０に示す。
【０１７７】
実施例２６ 本発明に係る蛍光透明フィルムの製造
下記スキームに従って、多環系オキサゾール化合物を合成した。
【０１７８】
【化１７】
【０１７９】
上記ナフトキノン化合物（１．０ｇ）とサリチルアルデヒド（０．３９１ｇ）を酢酸（３０ｍＬ）に溶解し、これに酢酸アンモニウム（４．１１ｇ）を加えて９０℃で５時間加熱攪拌した。反応終了後、反応混合液を水（２００ｍＬ）に注ぎ、生じた析出物を濾別した。析出物をジクロロメタンに溶解し、当該溶液を水で洗浄した後に減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開溶媒：ジクロロメタン／ヘキサン＝１０／１）を用いて分離精製することにより、多環系オキサゾール化合物（０．７６ｇ，収率：５９．７％）を得た。以下、上記多環系オキサゾール化合物を「ＸＨ」という。
【０１８０】
当該多環系オキサゾール化合物ＸＨを用いた以外は上記実施例１と同様にして、本発明フィルムを製造した。また、上記実施例１と同様に、吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。結果を図１０に示す。
【０１８１】
実施例２７ 耐光性試験
上記実施例１１と同様の条件で、実施例２４のＢＥ−ＰＳフィルム、実施例２５のＰＰ−ＰＳフィルムおよび実施例２６のＸＨ−ＰＳフィルムの耐光性を試験した。結果を図１１に示す。
【０１８２】
図１１のとおり、キセノン光という強力光を合計１０時間にわたり照射した場合であっても、マトリクス樹脂としてポリスチレンを含むフィルムでは、色素を約７０％以上に維持することができた。特にＢＥ−ＰＳフィルムとＰＰ−ＰＳフィルムでは、蛍光保持率が約８０％以上と優れた耐光性を示した。
【０１８３】
実施例２８ ジブチルジチオカルバミン酸ニッケルによる耐光性向上効果の実証
ポリスチレン（２．０ｇ）、実施例１の蛍光色素であるＮＢまたは実施例２のＢＤ（ポリスチレンに対して０．０５質量％）およびジブチルジチオカルバミン酸ニッケル（蛍光色素に対して１倍モル比または５倍モル比）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、キャスト法によりＮＢ−ＰＳフィルムまたはＢＤ−ＰＳフィルムを作製した。当該フィルムを用い、実施例１１と同様の条件で耐光性試験を行った。結果を表１２に示す。
【０１８４】
【表１２】
【０１８５】
上記結果の通り、ジブチルジチオカルバミン酸ニッケルが添加されたＮＢ−ＰＳフィルムおよびＢＤ−ＰＳフィルムでは、添加物無しのフィルムよりも初期蛍光強度が増大した。また、キセノン光を１０時間照射した後における蛍光保持率は、ジブチルジチオカルバミン酸ニッケルの添加量による差はほとんど見られず、添加量が少なくても十分な耐光性向上効果が認められた。５０時間照射後では、添加量による差が認められ、蛍光色素に対して５倍モル比添加した方が耐光性は良好であったものの、１倍モル比でも十分に効果はあった。以上のとおり、ジブチルジチオカルバミン酸ニッケルの添加により、本発明フィルムの耐光性は一層向上することが明らかとなった。
【０１８６】
実施例２９ Ｎ−アセチルグルコサミンによるＰＬＢ増殖効果実験
上記実施例４において、修正ＭＳ培地中にＮ−アセチルグルコサミンを１０ｍｇ／Ｌ添加し、C．finlaysonianumの代わりにC．Waltz‘Idol’を用いた以外は同様にして、ＰＬＢの増殖実験を行った。本発明に係る蛍光フィルムとしてはＮＢ−ＰＳフィルムを用い、比較のために無色ＰＳフィルムを用いた。結果を表１３に示す。表１３中、異なるアルファベット間にはＴｕｋｅｙの多重検定において、５％レベルで有意差があることを示す。
【０１８７】
【表１３】
【０１８８】
上記結果のとおり、蛍光色素を用いない場合であっても、Ｎ−アセチルグルコサミンを培地に添加すればＰＬＢの重量や正常ＰＬＢ数等は増加するが、有意差は無い。それに対して、本発明に係る蛍光フィルムとＮ−アセチルグルコサミンとを併用したところ、器官形成率は低下した一方で、ＰＬＢの重量と正常ＰＬＢ数は増加し、特に正常ＰＬＢ数は有意に増加した。よって、本発明に係る蛍光フィルムとＮ−アセチルグルコサミンとを併用すれば、正常なＰＬＢをより一層増加できることが分かった。
【０１８９】
実施例３０ ＰＬＢ増殖実験
実施例１で製造したＮＢ−ＰＳフィルムを粉砕機で２分間粉砕し、粉末状の蛍光体を作製した。当該粉末状蛍光体を修正ＭＳ培地５０ｍＬ当たり２ｇ混合した以外は上記実施例４と同様にして、ＰＬＢの増殖実験を行った。ＰＬＢ数の経時的な変化を図１２に、実験開始から４２日後におけるＰＬＢ数等を表１４に示す。表１４中、＊はｔ検定において５％レベルで有意差があることを示し、＊＊は１％レベルで有意差があることを示す。
【０１９０】
【表１４】
【０１９１】
上記結果のとおり、本発明に係る蛍光透明フィルムの透過光をＰＬＢに照射する以外にも、本発明に係る粉末状を培地に添加してその蛍光をＰＬＢに照射しても、ＰＬＢ総数や正常なＰＬＢ数は有意に増加することが明らかになった。
【０１９２】
実施例３１ ＰＬＢ増殖実験
上記実施例３０において、本発明に係る粉末状蛍光体の添加量を修正ＭＳ培地３０ｍＬ当たり３ｇとした以外は同様にして、C．tracyanumとC．Luna SongにつきＰＬＢの増殖実験を行った。結果を表１５に示す。
【０１９３】
【表１５】
【０１９４】
また、修正ＭＳ培地からゲルライトを除いた液体培地に関しても、同様に実験を行った。結果を表１６に示す。
【０１９５】
【表１６】
【０１９６】
上記結果のとおり、本発明に係る粉末状蛍光体は、C．finlaysonianum以外にもC．tracyanumとC．Luna Songに対して効果を発揮し、特にC．Luna Songに対する効果が高かった。また、本発明に係る粉末状蛍光体は、固体培地でも液体培地でも効果を示すことが明らかとなった。
【０１９７】
実施例３２ ＰＬＢ増殖実験
上記実施例４において、ＮＢ−ＰＳフィルムの代わりに上記実施例２１で製造したＦＸ−ＰＳフィルムを用い、C．finlaysonianumとC．insigneに対するＰＬＢ増殖効果を試験した。ＮＢ−ＰＳの結果と共に、結果を表１７に示す。
【０１９８】
【表１７】
【０１９９】
上記結果のとおり、ＦＸ−ＰＳフィルムを用いた場合でも、コントロールに比べてＰＬＢの重量や数が増加することが実証された。
【０２００】
実施例３３ ＰＬＢ増殖実験
上記実施例４において、ＮＢ−ＰＳフィルムの代わりに上記実施例２５で製造したＰＰ−ＰＳフィルム、または当該ＰＰ−ＰＳフィルムを上記実施例７と同様にエンボス加工したエンボスＰＰ−ＰＳフィルムを用い、Gramatophyllum scriptum‘Hihimanu’に対するＰＬＢ増殖効果を試験した。結果を表１８に示す。
【０２０１】
【表１８】
【０２０２】
上記結果のとおり、ＰＰ−ＰＳフィルムを用いた場合でも、コントロールに比べてＰＬＢの重量や数が増加し、かかる効果は、フィルムをエンボス加工することにより一層向上することが実証された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ1）、式（Ｉ2）または（Ｉ3）で表される多環化合物を色素として含む蛍光体による波長変換光を照射することによりＰＬＢを増殖させる工程を含むことを特徴とするラン科植物の製造方法。
【化１】
［式（Ｉ1）中、
Ｒ1は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ8、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ8、ハロゲン基またはシアノ基を示し；
Ｒ2とＲ3は一緒になって−Ｘ1−を形成し且つＲ4とＲ5は共に水素原子を示すか、またはＲ2とＲ3は共に水素原子を示し且つＲ4とＲ5は一緒になって−Ｘ1−を形成し；
Ｒ6とＲ7は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｒ8は、水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ1は、−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ9）−基を示し；
Ｒ9は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
式（Ｉ2）中、
Ｒ10とＲ11は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｒ12とＲ13は一緒になって−Ｘ2−を形成し且つＲ14とＲ15は共に水素原子を示すか、またはＲ12とＲ13は共に水素原子を示し且つＲ14とＲ15は一緒になって−Ｘ2−を形成し；
Ｒ16とＲ17は一緒になって−Ｘ3−を形成し且つＲ18とＲ19は共に水素原子を示すか、またはＲ16とＲ17は共に水素原子を示し且つＲ18とＲ19は一緒になって−Ｘ3−を形成し；
Ｒ20とＲ21は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ2とＸ3は、それぞれ独立して−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ22）−基を示し；
Ｒ22は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
式（Ｉ3）中、
Ｒ23は、置換基を有していてもよいＣ6-20芳香族炭化水素基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示し；
Ｒ24とＲ25は一緒になって−Ｘ4−を形成し且つＲ26とＲ27は共に水素原子を示すか、またはＲ24とＲ25は共に水素原子を示し且つＲ26とＲ27は一緒になって−Ｘ4−を形成し；
Ｒ28とＲ29は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ4は、−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ30）−基を示し；
Ｒ30は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
芳香族炭化水素基またはヘテロアリール基の置換基は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、水酸基、ハロゲン基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基およびシアノ基からなる群より選択される１以上の基を示す］
【請求項２】
さらに、ＰＬＢにＮ−アセチルグルコサミンを作用させる請求項１に記載のラン科植物の製造方法。
【請求項３】
マトリクス樹脂としてポリスチレンを含む蛍光体を用いる請求項１または２に記載のラン科植物の製造方法。
【請求項４】
蛍光体として、エンボス加工された蛍光フィルムを用いる請求項１〜３のいずれかに記載のラン科植物の製造方法。
【請求項５】
蛍光体へさらにジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルを添加する請求項１〜４のいずれかに記載のラン科植物の製造方法。
【請求項６】
下記式（Ｉ1）、式（Ｉ2）または（Ｉ3）で表される多環化合物を色素として含むことを特徴とするＰＬＢ増殖用蛍光体。
【化２】
［式（Ｉ1）中、
Ｒ1は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ8、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ8、ハロゲン基またはシアノ基を示し；
Ｒ2とＲ3は一緒になって−Ｘ1−を形成し且つＲ4とＲ5は共に水素原子を示すか、またはＲ2とＲ3は共に水素原子を示し且つＲ4とＲ5は一緒になって−Ｘ1−を形成し；
Ｒ6とＲ7は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｒ8は、水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ1は、−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ9）−基を示し；
Ｒ9は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
式（Ｉ2）中、
Ｒ10とＲ11は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｒ12とＲ13は一緒になって−Ｘ2−を形成し且つＲ14とＲ15は共に水素原子を示すか、またはＲ12とＲ13は共に水素原子を示し且つＲ14とＲ15は一緒になって−Ｘ2−を形成し；
Ｒ16とＲ17は一緒になって−Ｘ3−を形成し且つＲ18とＲ19は共に水素原子を示すか、またはＲ16とＲ17は共に水素原子を示し且つＲ18とＲ19は一緒になって−Ｘ3−を形成し；
Ｒ20とＲ21は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ2とＸ3は、それぞれ独立して−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ22）−基を示し；
Ｒ22は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
式（Ｉ3）中、
Ｒ23は、置換基を有していてもよいＣ6-20芳香族炭化水素基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示し；
Ｒ24とＲ25は一緒になって−Ｘ4−を形成し且つＲ26とＲ27は共に水素原子を示すか、またはＲ24とＲ25は共に水素原子を示し且つＲ26とＲ27は一緒になって−Ｘ4−を形成し；
Ｒ28とＲ29は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ4は、−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ30）−基を示し；
Ｒ30は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
芳香族炭化水素基またはヘテロアリール基の置換基は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、水酸基、ハロゲン基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基およびシアノ基からなる群より選択される１以上の基を示す］
【請求項７】
マトリクス樹脂としてポリスチレンを含む請求項６に記載のＰＬＢ増殖用蛍光体。
【請求項８】
エンボス加工されているフィルム状のものである請求項６または７に記載のＰＬＢ増殖用蛍光体。
【請求項９】
ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルを含む請求項６〜８のいずれかに記載のＰＬＢ増殖用蛍光体。
【請求項１】
下記式（Ｉ1）、式（Ｉ2）または（Ｉ3）で表される多環化合物を色素として含む蛍光体による波長変換光を照射することによりＰＬＢを増殖させる工程を含むことを特徴とするラン科植物の製造方法。
【化１】
［式（Ｉ1）中、
Ｒ1は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ8、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ8、ハロゲン基またはシアノ基を示し；
Ｒ2とＲ3は一緒になって−Ｘ1−を形成し且つＲ4とＲ5は共に水素原子を示すか、またはＲ2とＲ3は共に水素原子を示し且つＲ4とＲ5は一緒になって−Ｘ1−を形成し；
Ｒ6とＲ7は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｒ8は、水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ1は、−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ9）−基を示し；
Ｒ9は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
式（Ｉ2）中、
Ｒ10とＲ11は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｒ12とＲ13は一緒になって−Ｘ2−を形成し且つＲ14とＲ15は共に水素原子を示すか、またはＲ12とＲ13は共に水素原子を示し且つＲ14とＲ15は一緒になって−Ｘ2−を形成し；
Ｒ16とＲ17は一緒になって−Ｘ3−を形成し且つＲ18とＲ19は共に水素原子を示すか、またはＲ16とＲ17は共に水素原子を示し且つＲ18とＲ19は一緒になって−Ｘ3−を形成し；
Ｒ20とＲ21は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ2とＸ3は、それぞれ独立して−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ22）−基を示し；
Ｒ22は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
式（Ｉ3）中、
Ｒ23は、置換基を有していてもよいＣ6-20芳香族炭化水素基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示し；
Ｒ24とＲ25は一緒になって−Ｘ4−を形成し且つＲ26とＲ27は共に水素原子を示すか、またはＲ24とＲ25は共に水素原子を示し且つＲ26とＲ27は一緒になって−Ｘ4−を形成し；
Ｒ28とＲ29は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ4は、−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ30）−基を示し；
Ｒ30は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
芳香族炭化水素基またはヘテロアリール基の置換基は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、水酸基、ハロゲン基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基およびシアノ基からなる群より選択される１以上の基を示す］
【請求項２】
さらに、ＰＬＢにＮ−アセチルグルコサミンを作用させる請求項１に記載のラン科植物の製造方法。
【請求項３】
マトリクス樹脂としてポリスチレンを含む蛍光体を用いる請求項１または２に記載のラン科植物の製造方法。
【請求項４】
蛍光体として、エンボス加工された蛍光フィルムを用いる請求項１〜３のいずれかに記載のラン科植物の製造方法。
【請求項５】
蛍光体へさらにジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルを添加する請求項１〜４のいずれかに記載のラン科植物の製造方法。
【請求項６】
下記式（Ｉ1）、式（Ｉ2）または（Ｉ3）で表される多環化合物を色素として含むことを特徴とするＰＬＢ増殖用蛍光体。
【化２】
［式（Ｉ1）中、
Ｒ1は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ8、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ8、ハロゲン基またはシアノ基を示し；
Ｒ2とＲ3は一緒になって−Ｘ1−を形成し且つＲ4とＲ5は共に水素原子を示すか、またはＲ2とＲ3は共に水素原子を示し且つＲ4とＲ5は一緒になって−Ｘ1−を形成し；
Ｒ6とＲ7は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｒ8は、水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ1は、−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ9）−基を示し；
Ｒ9は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
式（Ｉ2）中、
Ｒ10とＲ11は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｒ12とＲ13は一緒になって−Ｘ2−を形成し且つＲ14とＲ15は共に水素原子を示すか、またはＲ12とＲ13は共に水素原子を示し且つＲ14とＲ15は一緒になって−Ｘ2−を形成し；
Ｒ16とＲ17は一緒になって−Ｘ3−を形成し且つＲ18とＲ19は共に水素原子を示すか、またはＲ16とＲ17は共に水素原子を示し且つＲ18とＲ19は一緒になって−Ｘ3−を形成し；
Ｒ20とＲ21は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ2とＸ3は、それぞれ独立して−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ22）−基を示し；
Ｒ22は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
式（Ｉ3）中、
Ｒ23は、置換基を有していてもよいＣ6-20芳香族炭化水素基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示し；
Ｒ24とＲ25は一緒になって−Ｘ4−を形成し且つＲ26とＲ27は共に水素原子を示すか、またはＲ24とＲ25は共に水素原子を示し且つＲ26とＲ27は一緒になって−Ｘ4−を形成し；
Ｒ28とＲ29は、それぞれ独立して水素原子基またはＣ1-8アルキル基を示し；
Ｘ4は、−Ｏ−基、−Ｓ−基または−Ｎ（Ｒ30）−基を示し；
Ｒ30は、水素原子基またはＣ1-6アルキル基を示し；
芳香族炭化水素基またはヘテロアリール基の置換基は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、水酸基、ハロゲン基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基およびシアノ基からなる群より選択される１以上の基を示す］
【請求項７】
マトリクス樹脂としてポリスチレンを含む請求項６に記載のＰＬＢ増殖用蛍光体。
【請求項８】
エンボス加工されているフィルム状のものである請求項６または７に記載のＰＬＢ増殖用蛍光体。
【請求項９】
ジ（Ｃ1-6アルキル）ジチオカルバミン酸ニッケルを含む請求項６〜８のいずれかに記載のＰＬＢ増殖用蛍光体。
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図１２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図１２】
【公開番号】特開２０１０−８８４２０（Ｐ２０１０−８８４２０Ａ）
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１１５３３（Ｐ２００９−１１１５３３）
【出願日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００９年３月１９日に園芸学会発行の「園芸学研究 第８巻 別冊１ −２００９−」ならびに園芸学会主催の「園芸学会平成２１年度春季大会」において発表
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、独立行政法人科学技術振興機構、地域イノベーション創出総合支援事業育成研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００９年３月１９日に園芸学会発行の「園芸学研究 第８巻 別冊１ −２００９−」ならびに園芸学会主催の「園芸学会平成２１年度春季大会」において発表
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、独立行政法人科学技術振興機構、地域イノベーション創出総合支援事業育成研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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