リウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［Ｇ］キナゾリン誘導体
Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕジペプチド基を含有する式（Ｉ）のシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体であって：式中：Ｒ１は、アミノ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ヒドロキシアルキル、Ｃ１−４フルオロアルキル又はメトキシ−Ｃ１−４アルキルであり；Ｒ２は、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−４アルケニル、Ｃ３−４アルキニル、Ｃ２−４ヒドロキシアルキル Ｃ２−４ハロゲノアルキル又はＣ１−４シアノアルキルであり；そしてＡｒは、フェニレン、チオフェンジイル、チアゾールジイル、ピリジンジイル又はピリミジンジイルであり、これらは、ハロゲノ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、トリフルオ−ロメチル、Ｃ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシから選択される一つ又は二つの置換基を所望により保有することができる。化合物（Ｉ）は、所望により医薬的に受容可能な塩又はエステルの形態であってもよく；リウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のために使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体の使用に関する。更に特定的には、これは、リウマチ様関節炎（ＲＡ）及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）を阻害するその能力、そして、更に各種の細胞系に対するその抗癌活性、の両方に関して良好なレベルの活性を示すシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体が開発されている。
【０００３】
ＷＯ９４／１１３５４Ａ１（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、以下の式：
【０００４】
【化１】
【０００５】
の三環式化合物を開示し、式中、Ｒ１は、水素、アミノ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４ヒドロキシアルキル又はＣ１−４フルオロアルキルであり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−４アルケニル、Ｃ３−４アルキニル、Ｃ２−４ヒドロキシアルキル Ｃ２−４ハロゲノアルキル又はＣ１−４シアノアルキルであり；
Ａｒは、フェニレン、チオフェンジイル、チアゾールジイル、ピリジンジイル又はピリミジンジイルであり、これらは、ハロゲノ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、Ｃ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシから選択される一つ又は二つの置換基を所望により保有することができ；そして
Ｒ３は、以下の式：
−ＮＨＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−Ａ１−Ｙ１
−ＮＨ−Ａ３−Ｙ３
の基の一つであるか、
或いはＲ３は、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−フェニルアラニンからなる群から選択されるＮ−連結の天然に存在するアミノ酸である。化合物の中で、開示されているものは、Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ化合物ＣＢ３００６３８であり、更にＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９９（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）ａｔ ＃５６６（Ｔｈｅｔｉ ｅｔ ａｌ．）及びＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４１，Ｍａｒｃｈ ２０００ ａｔ ＃３３（Ｊａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ）、並びにＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０００，４３，１９１０−１９２６中で記述され、ここでこれは、１９２３頁に化合物７ｂとして開示されている。
【０００６】
ＷＯ９５／３０６７３Ａ１（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、以下の式：
【０００７】
【化２】
【０００８】
のシクロペンタ−［ｇ］キナゾリンを開示し、式中、Ｒ１は、水素、アミノ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４ヒドロキシアルキル又はＣ１−４フルオロアルキルであり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−４アルケニル、Ｃ３−４アルキニル、Ｃ２−４ヒドロキシアルキル、Ｃ２−４ハロゲノアルキル又はＣ１−４シアノアルキルであり；
Ａｒ１は、フェニレン、チオフェンジイル、チアゾールジイル、ピリジンジイル又はピリミジンジイルであり、これらは、ハロゲノ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、Ｃ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシから選択される一つ又は二つの置換基を所望により保有することができ；そして
Ｒ３は、以下の式：
−Ａ１−Ａｒ２−Ａ２−Ｙ１
−Ａ５−ＣＯＮ（Ｒ）ＣＨ（Ｙ４）Ｙ５
−Ａ８−Ｘ−Ａｒ４
の基の一つである。
【０００９】
葉酸受容体のα−アイソフォーム（α−ＦＲ、膜結合性葉酸結合タンパク質）は、グリコシルホスファチジルイノシトールにより繋留された細胞膜タンパク質であり、これは、葉酸に対して、そして更に生物学的に関連する還元された葉酸塩に対して非常に強い親和性を有する（Ｋｄ約０．１ｎＭ）。葉酸塩の内部移行の機構は、受容体依存性エンドサイトーシスである。α−ＦＲは、多くの細胞腫、特に卵巣起源のものにおいて過剰発現し、ここでこれは、９０%の場合において、高度に、そして均質に過剰発現する；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１，５３２９−５３３８，１９９１（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ，１９９１）を参照されたい。更に、高いα−ＦＲの発現は、侵襲性の白金耐性疾病及び不良な予後に関係する−Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７４，１９３−１９８，１９９７及びＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７９，１２１−１２６，１９９８（両方ともＴｏｆｆｏｌｉ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。β−アイソフォームは、上皮性及び非上皮性起源の腫瘍において広く発現し、発現レベルは、一般的にそれぞれ低／中及び高であり、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５，５８７−６２７，１９９８（Ｒｅｄｄｙ ａｎｄ Ｌｏｗ）中で概説されている。
【００１０】
葉酸受容体（α及びβ）は、幾つかの成人の正常な組織において発現する（低ないし中程度の発現）。シクロペンタ−［ｇ］キナゾリンの一般的な群のある種の化合物は、α−葉酸受容体を発現しているヒト腫瘍細胞系において、ＲＦＣ（還元型葉酸キャリアー）に対する親和性に対して高いレベルの選択性を有することが報告されている。このような化合物は、ＷＯ０３／０２０３００Ａ１、ＷＯ０３／０２０７０６Ａ１及びＷＯ０３／０２０７４８Ａ１（ＢＴＧ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ）中で開示されている。化合物中で、開示されているものは、Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ化合物ＣＢ３００９４５であり、更にＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６３（７），１２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００７，１５３７−１５４３（Ｂａｖｅｔｓｉａｓ ｅｔ ａｌ．）及びＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６５，１５ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００５，１１７２１−１１７２８（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ）中で記述されている。
【００１１】
ＦＲ−βは、通常胎盤組織及び造血細胞中に見出され、ここでこれは、骨髄単球性の系統中で発現し、そして特に好中球の熟成中、或いは単球又はマクロファージの活性化中に増加する。然しながら、正常な造血細胞におけるＦＲ−βの発現は、例えば活性化されたマクロファージの場合とは異なり、これが葉酸塩と結合し、そして内部移入することができないことにおいて非機能性である。ＦＲ−βは、慢性の骨髄性白血病（ＣＭＬ）を持つ患者からの悪性細胞、及びＡＭＬを持つ患者の概略７０％からの悪性細胞上に発現する。
【００１２】
ＷＯ０３／０７２０９１−Ａ１（Ｔｈｅ Ｏｈｉｏ．Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）は、ＦＲ−βの発現が、骨髄性白血病の患者からの悪性細胞上で、ＦＲ−β誘導因子によって増加しているという発見を使用している。骨髄性白血病細胞、好ましくはＡＭＬ細胞中で発現するＦＲ−βは、非機能的である正常な造血細胞の殆んどにおいて発現するＦＲ−βとは異なり、葉酸塩と結合し、そして内部移行することにおいて機能的である。このような機能性のＦＲ−βは、葉酸複合化治療剤の標的である。
【００１３】
Ｊａｎｓｅｎは、１３ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｔｅｒｉｄｉｎｅｓ ＆ Ｆｏｌａｔｅｓ ｅｎｔｉｔｌｅｄ“Ａｎｔｉｆｏｌａｔｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｗｈａｔ ｃａｎ ｗｅ ｌｅａｒｎ ｆｒｏｍ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｖｉｃｅ ｖｅｒｓａ，”Ｐｔｅｒｉ−ｄｉｎｅｓ，１６：４６，２００５から要約中で、メトトレキセート（ＭＴＸ）が、リウマチ様関節炎を持つ患者のための治療管理における主力薬物であることを示している。彼は、更にシクロペンタ［ｇ］キナゾリンベースのＴＳ阻害剤が、葉酸に近い結合親和性を示し、そして従って癌、並びに炎症性疾病の治療における興味あるＦＲ標的薬物であることができることを推測している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際特許出願公開ＷＯ９４／１１３５４Ａ１（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ）
【特許文献２】ＷＯ９５／３０６７３Ａ１（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ）
【特許文献３】ＷＯ０３／０２０３００Ａ１（ＢＴＧ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ）
【特許文献４】ＷＯ０３／０２０７０６Ａ１（ＢＴＧ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ）
【特許文献５】ＷＯ０３／０２０７４８Ａ１（ＢＴＧ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ）
【特許文献６】ＷＯ０３／０７２０９１−Ａ１（Ｔｈｅ Ｏｈｉｏ．Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９９（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）ａｔ ＃５６６（Ｔｈｅｔｉ ｅｔ ａｌ．）
【非特許文献２】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４１，Ｍａｒｃｈ ２０００ ａｔ ＃３３（Ｊａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ）
【非特許文献３】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０００，４３，１９１０−１９２６
【非特許文献４】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１，５３２９−５３３８，１９９１（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ，１９９１）
【非特許文献５】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７４，１９３−１９８，１９９７（Ｔｏｆｆｏｌｉ ｅｔ ａｌ）
【非特許文献６】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７９，１２１−１２６，１９９８（Ｔｏｆｆｏｌｉ ｅｔ ａｌ）
【非特許文献７】Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５，５８７−６２７，１９９８（Ｒｅｄｄｙ ａｎｄ Ｌｏｗ）
【非特許文献８】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６３（７），１２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００７，１５３７−１５４３（Ｂａｖｅｔｓｉａｓ ｅｔ ａｌ．）
【非特許文献９】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６５，１５ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００５，１１７２１−１１７２８（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ）
【非特許文献１０】Ａｂｓｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ １３ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｔｅｒｉｄｉｎｅｓ ＆ Ｆｏｌａｔｅｓ ｅｎｔｉｔｌｅｄ“Ａｎｔｉｆｏｌａｔｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｗｈａｔ ｃａｎ ｗｅ ｌｅａｒｎ ｆｒｏｍ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｖｉｃｅ ｖｅｒｓａ，”Ｐｔｅｒｉ−ｄｉｎｅｓ，１６：４６，２００５。
【発明の概要】
【００１６】
本出願人等は、シクロペンタ［ｇ］キナゾリンの一般的群のある種の化合物が、β葉酸受容体を発現する細胞系に対して予期せぬほど高いレベルの選択性を有することをいまや見出した。このような化合物は、二つの構造的特徴、即ち、いわゆる三環式構造、及び葉酸と比較した場合のグルタミン酸側鎖に対する修飾を有する。従って、本発明は、以下の式（Ｉ）：
【００１７】
【化３】
【００１８】
のＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕジペプチド基を含有するシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体を含んでなり、式中：
Ｒ１は、アミノ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ヒドロキシアルキル、Ｃ１−４フルオロアルキル又はメトキシ−Ｃ１−４アルキルであり；
Ｒ２は、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−４アルケニル、Ｃ３−４アルキニル、Ｃ２−４ヒドロキシアルキル Ｃ２−４ハロゲノ−アルキル又はＣ１−４シアノアルキルであり；そして
Ａｒは、フェニレン、チオフェンジイル、チアゾールジイル、ピリジンジイル又はピリミジンジイルであり、これらは、ハロゲノ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、Ｃ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシから選択される一つ又は二つの置換基を所望により保有することができる。
【００１９】
化合物（Ｉ）は、所望により、
リウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のための
医薬的に受容可能な塩又はエステルの形態であってもよい。
【００２０】
本発明の化合物は、一つ又はそれより多い以下の利益を示す：
１． 生理学的濃度の葉酸塩中で増殖し、そしてＲＦＣの正常な発現を保有する場合の、β−ＦＲを過剰発現している細胞に対する高い選択性；
２． 強力なＴＳ阻害、ＲＦＣに対する低親和性、及びβ−ＦＲに対する中ないし高親和性；
３． ＴＳ特異的活性、そしてｉｎ ｖｉｖｏのヒドロラーゼに対して耐性である；並びに
４． 中程度のβ−ＦＲ発現を伴う一次チャイニーズハムスター卵巣細胞系のスクリーニングにおける選択的活性。
【００２１】
本明細書中で、用語アルキル、アルケニル及びアルキニルは、直鎖及び分枝鎖の両方を含むが、しかしプロピルのような個々のアルキル基に対する言及は、直鎖基に対してのみ特定的である。類似な慣例は、他の一般的用語に対して適用される。更に、シクロペンタ［ｇ］キナゾリン核に対して使用される番号付け系は、以下の式：
【００２２】
【化４】
【００２３】
に示すような慣用的なものである。
アミノ酸残基は、本明細書中では標準的な方法（Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７４，４０，３１７及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８４，１３８，９）で命名される。従って、例えば、γ−グルタミルは、文脈によってＨ２ＮＣＨ（ＣＯ２Ｈ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−又は−ＮＨＣＨ（ＣＯ２Ｈ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−基を意味し、これらの基の炭素原子は、位置１としてのα−カルボキシル基の炭素原子から番号付けされる。
【００２４】
本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンが少なくとも三つの不斉炭素原子［−Ｎ（Ｒ２）−基の三環系への接続の点、及びＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ基のα−炭素原子等として存在する］を含有し、そして従ってラセミの及び光学的に活性な形態で存在することができることが観察されるものである。本発明が、ラセミの及び光学的に活性な形態の両方を包含することは理解されることであり、このような光学的に活性な形態が立体特異的合成によって、又は異性体化合物の分離によって、如何にして得ることができるかは、普通の一般的知識の問題である。一つの異性体が、これが示す活性の特質のために、又はより優れた物理的特性、例えば水に対する溶解度のために、他方より更に興味深いものであることができることは認識されるものである。
【００２５】
式（Ｉ）のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンが、互変異性の現象を示し、そして本明細書中に示された式が、可能な互変異性の形態の一つのみを表すことができることも更に理解されることである。
【００２６】
式（Ｉ）のある種のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンが、例えば水和された形態のような溶媒和された、並びに溶媒和されていない形態で存在することができることも更に理解されることである。
【００２７】
Ｒ１又はＲ２のための、それがＣ１−４アルキルである場合の、或いはそれがＡｒ上に存在することができるＣ１−４アルキル置換基のための適した意義は、例えば、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルである。
【００２８】
Ａｒ上に存在することができるＣ１−４アルコキシ置換基のための適した意義は、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ又はブトキシである。
Ａｒ上に存在することができるハロゲノ置換基のための適した意義は、例えば、フルオロ、クロロ又はブロモである。
【００２９】
Ｒ２のための、それがＣ３−４アルケニルである場合の適した意義は、例えば、プロパ−２−エニル、ブタ−２−エニル、ブタ−３−エニル又は２−メチルプロパ−２−エニルであり；そしてそれがＣ３−４アルキニルである場合は、例えば、プロパ−２−イニル又はブタ−３−イニルである。
【００３０】
Ｒ２のための、それがＣ２−４ヒドロキシアルキルである場合の適した意義は、例えば、２−ヒドロキシエチル又は３−ヒドロキシプロピルであり；それがＣ２−４ハロゲノアルキルである場合は、例えば、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、２−ブロモエチル、３−フルオロプロピル、３−クロロプロピル又は３−ブロモプロピルであり；そしてそれがＣ１−４シアノアルキルである場合は、例えば、シアノメチル、２−シアノエチル又は３−シアノプロピルである。
【００３１】
Ａｒのための、それがフェニレンである場合の適した意義は、例えば、１，３−又は１，４−フェニレン、特に１，４−フェニレンである。
Ａｒのための、それがチオフェンジイルである場合の適した意義は、例えば、チオフェン−２，４−ジイル又はチオフェン−２，５−ジイルであり；それがチアゾールジイルである場合は、例えば、チアゾール−２，４−ジイル又はチアゾール−２，５−ジイルであり；それがピリジンジイルである場合は、例えば、ピリジン−２，４−ジイル、ピリジン−２，５−ジイル、ピリジン−２，６−ジイル又はピリジン−３，５−ジイルであり；そしてそれがピリミジンジイルである場合は、例えば、ピリミジン−２，４−ジイル、ピリミジン−２，５−ジイル又はピリミジン−４，６−ジイルである。
【００３２】
示したように、Ａｒは、一つ又は二つの置換基を保持することができる。Ａｒにおける好ましい置換のレベルは、置換が存在する場合、二つの置換基又は特に一つの置換基のいずれかであり；そしてこの一つ又は二つの置換基は、好都合には−ＣＯ−Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ基に結合する原子に隣接する位置にあることができ、フルオロのようなハロゲノ置換基が好ましい。
【００３３】
本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンの適した医薬的に受容可能な塩の形態は、例えば、無機又は有機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、トリフルオロ酢酸又はマレイン酸との酸付加塩；或いはアルカリ金属、例えばナトリウム、アルカリ土類金属、例えばカルシウム、又はアンモニウム、例えばテトラ（２−ヒドロキシエチル）アンモニウム塩である。
【００３４】
本発明のシクロペンタ［ｇ］キナ−ゾリンの適した医薬的に受容可能なエステルの形態は、例えば、６個までの炭素原子の脂肪族アルコールとのエステル、例えばメチル、エチル又はｔｅｒｔ−ブチルエステルである。
【００３５】
化合物は、三つのカルボキシル基を含有する。塩又はエステルは、一酸−二塩又は−エステル、二酸−一塩又は−エステル或いは三塩又は−エステルでさえあることができる。
好ましくはＲ１は、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４ヒドロキシアルキルである。更に好ましくは、Ｒ１は、メチル、又は特に、ヒドロキシメチルである。
【００３６】
好ましくは、Ｒ２は、メチル、エチル、プロピル、プロパ−２−エニル、プロパ−２−イニル、２−ヒドロキシ−エチル、２−フルオロエチル、２−ブロモエチル又は２−シアノエチルである。更に好ましくは、Ｒ２は、メチル、又は特に、プロパ−２−イニルである。
【００３７】
好ましくは、Ａｒは、クロロ及び特にフルオロからなる群から選択される一つ又は二つの置換基を所望により保有してもよい１，４−フェニレン、チオフェン−２，５−ジイル、チアゾール−２，５−ジイル、或いはピリジン−２，５−ジイルである。更に好ましくは、Ａｒは、１，４−フェニレン又は２，６−ジフルオロ−１，４−フェニレン若しくは特に２−フルオロ−１，４−フェニレンのように２−フルオロ置換基を有する１，４−フェニレンであるか、或いはピリジン２，５−ジイルである。最も好ましくはＡｒは、１，４−フェニレン又は２−フルオロ−１，４−フェニレンである。
【００３８】
好ましい本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、
Ｒ１が、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４ヒドロキシアルキル、特にヒドロキシメチルであり；
Ｒ２は、メチル、エチル、プロピル、プロパ−２−エニル、プロパ−２−イニル、２−ヒドロキシエチル、２−フルオロエチル、２−ブロモエチル又は２−シアノエチルであり；そして
Ａｒは、クロロ及び特にフルオロからなる群から選択される一つ又は二つの置換基を所望により保有してもよい１，４−フェニレン、チオフェン−２，５−ジイル、チアゾール−２，５−ジイル或いはピリジン−２，５−ジイルである；
式（Ｉ）を有する。
【００３９】
更に好ましい本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、
Ｒ１が、メチル又はヒドロキシメチルであり；
Ｒ２は、メチル又はプロパ−２−イニルであり；そして
Ａｒは、１，４−フェニレン、又は２，６−ジフルオロ−１，４−フェニレン若しくは特に２−フルオロ−１，４−フェニレンのように２−フルオロ置換基を有する１，４−フェニレンであるか、或いはピリジン２，５−ジイルである；
式（Ｉ）を有する。
【００４０】
特に好ましい本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、
Ｒ１が、メチル又はヒドロキシメチルであり；
Ｒ２は、メチル又は好ましくはプロパ−２−イニルであり；そして
Ａｒは、１，４−フェニレン又は２−フルオロ−１，４−フェニレンである；
式（Ｉ）を有する。
【００４１】
具体的な特に好ましい本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは：
Ｎ−｛Ｎ−｛４−［Ｎ−（２−メチル−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロパ−２−イニル）アミノ］ベンゾイル｝−Ｌ−γ−グルタミル｝−Ｄ−グルタミン酸；又は
Ｎ−｛Ｎ−｛４−［Ｎ−（２−ヒドロキシメチル−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ｇ］−キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロパ−２−イニル）アミノ］ベンゾイル｝−Ｌ−γ−グルタミル｝−Ｄ−グルタミン酸；或いは医薬的に受容可能なこれらの塩又はエステル；
並びにこれら二つの化合物の６Ｓ異性体；
である。
【００４２】
本発明の化合物は、立体異性体の混合物として存在することができるが、これらが、一つの光学的に活性な異性体の形態に分割されることが好ましい。このような要求は、化合物の合成を複雑にし、そして従ってこれらが、所望の活性を達成することに一致しながら、可能な限り僅かな不斉炭素原子を成分として含有することが好ましい。
【００４３】
然しながら先に示したように、本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、少なくとも三つの不斉炭素原子を含有する。これらの中で、環系の６位におけるものは、好ましくは６Ｒよりはむしろ６Ｓ配向を有する。従って本明細書中で先に記載した好ましい化合物は、この不斉炭素原子においてこのような立体配置を有するか、或いは好ましくはないが、これらの不斉炭素原子の一つ又は両方が分割されていない混合物である。
【００４４】
本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、化学的に関係する化合物の調製に適用可能ないずれもの既知の方法によって調製することができる。
本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、それ自体活性であることができるか、又はｉｎ ｖｉｖｏで活性な化合物に転換されるプロドラッグであることができる。本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、シクロペンタ［ｇ］キナゾリンを医薬的に受容可能な希釈剤又は担体と共に含んでなる医薬組成物の形態で、ヒトを含む温血動物に投与することができる。
【００４５】
組成物は、経口使用、例えば錠剤、カプセル、水性又は油性溶液、懸濁液或いは乳液；局所使用、例えばクリーム、軟膏、ゲル或いは水性若しくは油性溶液又は懸濁液；鼻腔使用、例えば嗅ぎ薬、鼻腔噴霧剤又は鼻腔点滴剤；膣又は直腸使用、例えば座薬；吸入による投与、例えば乾燥粉末のような微細に分割された粉末、微結晶の形態又は液体エアゾール；舌下又は頬側使用、例えば錠剤又はカプセル；或いは非経口使用（静脈内、皮下、筋肉内、血管内又は注入使用を含む）、例えば滅菌水性又は油性溶液、乳液或いは懸濁液のために適した形態であることができる。一般的に、上記の組成物は、慣用的な賦形剤を使用して慣用的な方法で調製することができる。
【００４６】
シクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、通常温血動物に動物の身体面積の平方メートル当り５０−２５０００、特に５０−５０００ｍｇ、即ち概略１５００、特に１−１００ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で投与されるものである。然しながら、所望する場合、この範囲外の投与量を使用することができ、そして特に、皮下への注入を含む好ましい投与のモードが使用される場合、投与量の範囲を、１−１０００ｍｇ／ｋｇに増加することができる。好ましくは、１０−２５０ｍｇ／ｋｇ、特に３０−１５０ｍｇ／ｋｇの範囲の日量が使用される。然しながら、日量は、治療される宿主、投与の特定の経路、及び治療される病気の重篤度によって必然的に変化するものである。従って、最適投与量は、いずれもの特定の患者を治療している医師によって決定されることができる。
【００４７】
従って、本発明は、更にリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病を治療するための、このような治療を必要とする患者における方法を含み、これは、前記患者に有効な量の本明細書中で先に定義したとおりのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体を投与することを含んでなる。
【００４８】
化合物は、通常動物の身体面積の平方メートル当り５−２５０００ｍｇ、特に５−５００ｍｇ、即ち概略０．１−５００、特に０．１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で投与されるものである。然しながら、所望する場合、この範囲外の投与量を使用することができる。本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンの局所投与を使用することができる。従って、例えば、局所投与において、例えば０．１ないし１０ｍｇ／ｋｇの範囲の日量を使用することができる。
【００４９】
キナゾリンを含有する組成物は、単位剤形、即ちそれぞれが単位投与量或いは単位投与量の倍数又は約数を含んでなる分離した部分の形態、例えば錠剤或いはカプセルとして処方することができる。このような単位剤形は、例えば、１−２５０又は１−５００ｍｇの範囲の量のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンを含有することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、ＲＡ−滑膜組織の免疫組織化学的検査：（Ａ）ウサギアイソタイプ染色、（Ｂ）ＦＲ−β染色及び（Ｃ）マクロファージ染色（３Ａ５）の光学顕微鏡観察である。（Ｄ）ＦＲ−β、（Ｅ）ＣＤ−６８（マクロファージ）並びに（Ｆ）Ｄ及びＥの混合の免疫蛍光（二重）染色。注記：核は青に染色（Ｄａｐｉ染色）されている。
【図２】図２は、（Ａ）ＭＴＸ治療前のＲＡ患者（ｎ＝１５）の滑膜組織中の３Ａ５（マクロファージ）及びＦＲ−β活動性細胞／ｍｍ２間の相関である。滑膜の下部ライニング層中の活動性細胞数の中位値／ｍｍ２は、ＦＲ−βに対して１２６（範囲：９−６３０）であり、そして３Ａ５に対して２１９（範囲：１１−６２２）であった。直線回帰：Ｒ＝０．６４、ｐ＝０．０４。（Ｂ）ＭＴＸによる４ヶ月の治療後のＤＡＳ２８の改良（ΔＤＡＳ２８）及びマクロファージ上のＦＲ−β発現間の相関（活動性細胞／ｍｍ２）である（Ｒ＝０．３１；ｐ＝０．１１）。
【図３】図３は、滑膜組織及びｅｘ ｖｉｖｏで培養されたＲＡ末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中のＦＲ−βのｍＲＮＡ発現である。ＦＲ−βのｍＲＮＡ発現の中位値は、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ；ｎ＝９）、単球（ｎ＝９）、ｅｘ ｖｉｖｏ培養マクロファージ（ｎ＝２５）、ｅｘ ｖｉｖｏ活性化Ｔ−細胞（ｎ＝２２）及びＲＡ患者の滑膜組織（ｎ＝７）中で決定した。これらの試料中のＦＲ−β発現は、ＣＨＯ−β細胞（ＦＲ−βで形質移入したチャイニーズハムスター卵巣細胞；これらの細胞中の発現を１．００と設定した）中の発現のパーセントとして示している。
【図４】図４は、新規な世代の葉酸アンタゴニストに対するＦＲ−α（白色の棒）及びＦＲ−β（灰色の棒）の相対的結合親和性である。薬物のＦＲ−α及びＦＲ−βの結合親和性は、材料及び方法の部において記載されるような、ＦＲαを発現しているＫＢ細胞及びＦＲβで形質移入されたＣＨＯ−β細胞の［３Ｈ］−葉酸置換によって決定した。結合親和性は、葉酸結合親和性に対するパーセントとして与えられる。結果は、３−５回の別個の実験の平均±ＳＤである（ＳＤ＜３０％）。比較のために、葉酸アンタゴニストに対するＲＦＣの親和性は、以前に刊行されたデータに基づき：＋＋＋＋（高親和性）、＋＋＋（中親和性）、＋＋（低親和性）、＋（不良な親和性）、＋／−（非常に不良な親和性）として与えられている。
【図５】図５は、１μＭの葉酸を伴う又は伴わないＢＧＣ９４５（Ａ）、ＣＢ３００６３５（Ｂ）、及び葉酸（１μＭ）又はロイコボリン（２０ｎＭ）の補充を伴う又は伴わないＡＧ２０３４（Ｃ／Ｄ）によるＣＨＯ／ＷＴ及びＣＨＯ／ＦＲ−β細胞の増殖の阻害である。結果は三つの実験の平均である（ＳＤ＜２０％）。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５１】
実施例１：リウマチ様関節炎の患者の滑膜組織中の活性化されたマクロファージに対する、新規な世代の葉酸アンタゴニストのための潜在的な放出経路としての葉酸受容体−βの開発。
【００５２】
序論
葉酸アンタゴニストのメトトレキセート（ＭＴＸ）は、リウマチ様関節炎（ＲＡ）を持つ患者の治療において最も広く適用されている疾患修飾性抗リウマチ剤（ＤＭＡＲＤ）の主力薬物である。これは、単一の薬剤として、又は他のＤＭＡＲＤ（例えばスルファサラジン及びヒドロキシクロロキン）との組合せのいずれかとして使用され、そしてＭＴＸの使用は、生物学的薬剤（抗−ＴＮＦα又は−ＣＤ２０モノクローナル抗体）に関係する殆どの治療戦略において必須である。
【００５３】
ＭＴＸの細胞薬理学における第１の中心的段階は、少なくとも三つの異なった経路；還元型葉酸キャリヤー（ＲＦＣ）、膜結合型葉酸受容体（ＭＦＲ）、又はプロトン結合（低ｐＨ）葉酸輸送体（ＰＣＦＴ）によって仲介することができる、その細胞への進入である。後者の輸送体は、主として腸管内の葉酸塩取込みに関係している。他の輸送経路は、天然の還元型葉酸補助因子及びＭＴＸのような葉酸アンタゴニストの取込みを促進することによって、免疫コンピテント細胞に対する生理学的及び薬理学的関連性を抱える。ＲＦＣ及びＭＦＲは、（抗）葉酸取込みの機構（膜貫通型キャリヤー対エンドサイトーシス／ポトサイトーシス）、基質特異性（低親和性葉酸／高親和性ＭＴＸ対高親和性葉酸／低親和性ＭＴＸ）及び組織特異性（常在型対制限発現）においてかなり異なる。
【００５４】
ＭＦＲに対して、三つのアイソフォーム（α、β及びγ）が同定されている。ＭＦＲのα−アイソフォームは、癌の特異的型（卵巣癌）において過剰発現し、一方γ−アイソフォームは、造血細胞から分泌されるタンパク質である。ＦＲ−βアイソフォームの選択的発現は、ＲＡの患者及び関節炎の動物モデルの炎症性滑膜流体中の活性化されたマクロファージについて記載されている。その後、ＦＲ−βは、関節炎の画像化のために、そして治療的には、毒素及び他の小／大分子の、選択的抗体誘導又は葉酸複合体誘導放出のために魅力ある標的として認識された。これまで、葉酸アンタゴニストを伴うＦＲの標的化は、癌細胞／ＦＲαを過剰発現している組織においてのみ調査されていた。
【００５５】
過去数十年にわたって、第二世代の葉酸アンタゴニストが設計され、そしてＲＦＣによる輸送障害、ポリグルタミル化障害、標的酵素ＤＨＦＲの活性の増加及び／又は薬物流出の亢進を含むＭＴＸに対する耐性の通常の機構を回避する観点から、臨床的に評価されてきた。この背景に基づき、第二世代の抗葉酸剤は、ＲＦＣによってより効率的に輸送される、更に効率的にポリグルタミル化される、又はポリグルタミル化とは独立の、或いはＤＨＦＲ以外の葉酸代謝における他の主要酵素、例えばチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）又はグリシンアミドリボヌクレオチドトランスフォーミラーゼを標的とする化合物を含んでいた。本研究において、本出願人等は、個別の第二世代の抗葉酸剤が滑膜組織中のＦＲ−βを発現している細胞及び／又はＲＡ患者の免疫コンピテント細胞に対する選択的標的薬物として作用するか否かを研究することを設定した。本出願人等は、ＴＳ阻害剤であるＢＧＣ９４５を、高ＦＲ−β結合親和性及び低ＲＦＣ親和性の判定基準を満足し、これによってＦＲ−βを発現している細胞中の選択的薬物取込みを可能にする、プロトタイプの抗葉酸薬物として規定した。
【００５６】
材料及び方法
薬物
葉酸は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから、Ｌ−ロイコボリンは、Ｍｅｒｃｋ Ｅｐｒｏｖａ，Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから、メトトレキセートは、Ｐｈａｒｍａｃｈｅｍｉｅ，Ｈａａｒｌｅｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから、そしてペメトレキセド／ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）は、ＶＵｍｃ薬品部から入手した。以下の葉酸アンタゴニスト薬物は、示した会社／研究所から入手した；ラルチトレキセド／Ｔｏｍｕｄｅｘ（登録商標）／ＺＤ１６９４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，ＵＫ）、ＰＴ５２３及びＰＴ６４４（Ｄｒ．Ａ．Ｒｏｓｏｗｓｋｙ，Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、ＧＷ１８４３（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｃｏｍｅ，ＵＳＡ）、ＣＢ３００６３５（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｕｔｔｏｎ，ＵＫ）、ＢＧＣ９３３１及びＢＧＣ９４５（６ＲＳ及び６Ｓ）（ＢＴＧ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）、５，１０−ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、及びＡＧ２０３４（Ａｇｏｕｒｏｎ／Ｐｆｉｚｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。これらの葉酸アンタゴニストの化学構造を、表２及び表３に示す。［３’，５’，７，９−３Ｈ］葉酸（２０−４０Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＭＴ７８３）は、Ｍｏｒａｖｅｋ，Ｂｒｅａ，ＣＡから購入した。
【００５７】
細胞系
野生型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−ＷＴ）細胞、ＦＲ−βで形質移入したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＦＲ−β）及びＦＲ−αを発現しているヒト上咽頭類表皮ＫＢ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％の胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１５ｍｇ／ｍｌのプロリン並びに１００単位／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシンで補充された葉酸を含まないＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で増殖した。ＣＨＯ−ＦＲ−β及びＫＢ細胞の［２Ｈ］葉酸結合能力は、それぞれ０．５−１ｐｍｏｌ／１０６細胞及び２０−４０ｐｍｏｌ／１０６細胞であった。ヒト単球−マクロファージＴＨＰ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％の胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１５ｍｇ／ｍｌのプロリン並びに１００単位／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシンで補充された、２．２μＭの葉酸を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で増殖させた。全ての細胞系を、３７℃で５％のＣＯ２を含有する加湿された雰囲気中に保った。
【００５８】
滑膜組織試料
本研究において、本出願人等は、治療前、及びＭＴＸによる４ヶ月の治療（ＭＴＸの出発時投与量：７．５ｍｇ／週；１５ｍｇ／週で１２週かけて段階的に増加）後の活動性疾患を持つ１５人のＲＡ患者の膝関節由来の滑膜組織生検体を分析した。活動性疾患は、≧６の関節膨張又は関節疼痛、並びに医師及び患者の評価による中程度又はそれより悪いレベルの疾患活動性（疾患活動性スコア−２８；ＤＡＳ−２８）と定義した。全ての患者は少なくとも１箇所の臨床的に関係する膝関節を有していた。低投与量のプレドニゾン（＜１０ｍｇ／日）及び併用の安定した非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）の投与の治療は許可された。いずれの患者も研究に登録する前にＭＴＸを使用したことはなかった。他のＤＭＡＲＤを摂取していた患者において、２８日間の休薬期間後、治療は中止された。関節鏡検査法が、Ｌｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）及びＬｅｅｄｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ（ＵＫ）のＭｅｄｉｃａｌ Ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓによって認可された関節研究の一部として、以前に記述されているように行われた。Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２００２；４６（８）：２０３４−２０３８及び２０００；４３（８）：１８２０−１８３０（両方ともＫｒａａｎ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。
【００５９】
非炎症性の対照滑膜組織として、本出願人等は、Ｄｒ．Ｂ．Ｊ．ｖａｎ Ｒｏｙｅｎ，ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ，ＶＵ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって提供された機械的関節損傷を持つ患者からの七つの試料を含めた。末梢血試料の収集のために、全ての患者はインフォームドコンセントの書式にサインし、そして‘ＤＭＡＲＤ耐性’の研究は、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ ＶＵ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって許可された。
【００６０】
ＦＲ−βの免疫組織化学的検査
ＲＡ患者及び対照からの滑膜組織生検体のクライオスタット切片（４μｍ）の免疫組織化学的染色は、以前に記述されているような３段階の免疫ペルオキシダーゼ法を使用して行った。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１；６１（８）：３４５８−３４６４（Ｍａｌｉｅｐａａｒｄ ｅｔ ａｌ．）及び２０００；６０（１８）：５２６９−５２７７（Ｓｃｈｅｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。切片を、ＦＲ−βに対する特異的抗体（希釈１：３０００）、アイソタイプ対照：正常なウサギ血清）で染色した。マクロファージ及びＴ−細胞を、３Ａ５（希釈１：１００）及び抗−ＣＤ３−ＰＥ（希釈１：２５；Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒａｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）モノクローナル抗体（アイソタイプ対照：マウス免疫グロブリン）でそれぞれ染色した。ピオチニル化ブタ抗−ウサギＩｇＧ（Ｄａｋｏ；希釈１：２００）及びウサギ抗−マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ；希釈１：３００）を、二次抗体として使用した。０．４ｍｇ／ｍｌのＡＥＣ（アミノエチルカルバゾール）を使用して、色の展開を行った。ヘマトキシリンによる対比染色後、スライドを設置した。染色部分を以前に記述されているように、デジタル画像分析によってＦＲ−β、３Ａ５及びＣＤ３発現に対して分析した。Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．２００５；７（４）：Ｒ８６２−Ｒ８６７（Ｈａｒｉｎｇｍａｎ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。簡単には、それぞれのマーカーのために、代表的領域を４００×の倍率を使用して画像獲得のために使用した。これらの領域を、３ピクセル重複させて６個の高倍率視野（ｈｐｆｓ）に分割した。活動性の細胞を、１８の連続したｈｐｆｓを分析し、ｍｍ２当りの内膜ライニング層及び滑膜下部ライニング中の活性な細胞の数を記録することによって評価した。
【００６１】
二重標識免疫蛍光検査法
ＦＲ−βを、ブタ−抗−ウサギＨＲＰ−標識抗体（希釈１：２００；Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって検出し、そして展開は、製造業者の説明書によってローダミン／チラミン（ｔｈｙｒａｍｉｎ）（赤色蛍光）（希釈１：１０００）によった。ＣＤ６８は、ヤギ−抗−マウスビオチニル化抗体（希釈１：１００；Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって、ストレプトアビジンＡｌｅｘ−４８８を基質として使用して（希釈１：７５０；緑色蛍光；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）検出した。スライドを、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを含有する（核の染色のため）Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を伴って設置した。細胞を、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＲＢ，Ｒｉｊｓｗｉｊｋ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して試験した。
【００６２】
ＲＡ患者の末梢血細胞の単離及び培養条件
末梢血単核細胞を、新しく得た血液試料からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）の勾配遠心（４００×ｇにおいて３５分）によって単離した。遠心後、界面を注意深く収集し、そして１％ＢＳＡで補充したリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）を使用して三回洗浄した。リンパ球画分を数え、そして１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン並びに１００μｇ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシンを含有するＩＭＤＭ培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｒｅｄａ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中に再懸濁した。単球を、培養フラスコ中の３７℃における２時間のインキュベーション後、付着によって単離し、続いて単球を、１０ｎｇ／ｍｌのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）（Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在中で７日間培養することによって、ＲＮＡを抽出するか、又はマクロファージを分化した。
【００６３】
単球の付着後の懸濁液中に残った末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、ＲＮＡ単離のために収集するか、又はこれらを、１×１０６細胞／ｍｌの密度で、モノクローナル抗−ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ、ＣＬＢ−ＣＤ２８／１，Ｓａｎｑｕｉｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）及び抗−ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ、ＣＬＢ−Ｔ３／４．Ｅ，Ｓａｎｑｕｉｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で、ヤギ抗−マウス（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で被覆された２４ウェルプレート中でインキュベートすることによる、Ｔ−細胞の活性化のために使用した。４８時間の刺激後、活性化されたＴ−細胞をＲＮＡ単離のために収集し、そして活性化状態を、流動細胞計測法（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、ＣＤ２５発現を測定することによって決定した。
【００６４】
ＲＡ患者の滑膜組織及び末梢血細胞中のＦＲ−βのｍＲＮＡ発現
ＲＡ患者からの滑膜組織（ｎ＝７）、ＰＢＬ（ｎ＝９）、単球（ｎ＝９）、マクロファージ（ｎ＝２５）、及び活性化されたＴ−細胞（ｎ＝２２）からのＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、製造業者によって提供された説明書に従って単離した。ＲＮＡの単離に先だって、冷凍した滑膜組織を、液体窒素で予備冷却した乳鉢中で粉砕してこれを粉末化し、その後、ＲＰＥ緩衝液を加えた。全ＲＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ−１０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌ−ｍｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）を使用して決定した。以前に記述されているようなリアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法を、ＦＲ−β及びグリセルアルデヒド−３−リン酸（参照遺伝子）に対するｍＲＮＡレベルを同時に測定するために使用した。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６；６６（１１）：５８７５−５８８２（Ｑｉ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。
【００６５】
逆転写段階は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）からのＴａｑｍａｎ逆転写試薬を使用して、製造業者のプロトコルに従って行った。簡単には、４００ｎｇの全ＲＮＡを、ランダムヘキサマープライマー（５０μｍｏｌ／Ｌ）、ＲＮアーゼ阻害剤（１単位／μＬ）、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（５単位／μＬ）、及びデオキシヌクレオシド三リン酸混合物（それぞれ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）と逆転写緩衝液中で混合した。１０μＬの反応混合物を、まず２５℃で１０分間、次いで４８℃で３０分間、そして最後に９５℃で５分間インキュベートした。
【００６６】
その後のＦＲ−βに対するリアルタイムＰＲＣ段階は、１２．５μＬのＰＲＣ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、それぞれ０．５μＬの順方向及び逆方向プライマー（ＣＴＧＧＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧ−ＡＧＴＴＣ、’ＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＴＴＡＴＣＣＡ）並びに０．５μＬのＴａｑｍａｎプローブ（６ＦＡＭ−ＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＴＣＡＧＣ−ＴＡＭＥＲＡ）の存在中で行った。対照のＧＡＰＤＨ遺伝子のためのプライマー及びＴａｑｍａｎプローブを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＰＣＲ条件は、５０℃で２分間、次いで９５℃で１０分間、続いて９５℃でそれぞれ１５秒間の４０サイクル、そして最後に６０℃で１分間であった。発生した蛍光データを、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ５７００配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によってモニター及び記録した。全ての試料を三重で設定し、そしてＧＡＰＤＨ値に正規化した。
【００６７】
新規な世代の葉酸アンタゴニストに対するＦＲ−β／ＦＲ−α及びＲＦＣ結合親和性の分析
［３Ｈ］−葉酸並びに新規な抗葉酸薬物の、ＦＲ−β及びＦＲ−αへの競合的結合に対するインタクトな細胞の結合アッセイを、本質的に以前に記述されているように行った。Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９５；４８：４５９−４７及びＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９５；５５（１７）：３７９５−３８０２（両方ともＷｅｓｔｅｒｈｏｆ ｅｔ ａｌを参照されたい。簡単には、ＣＨＯ−β細胞（ＦＲ−βで形質移入されたチャイニーズハムスター卵巣細胞）及びＫＢ細胞（ＦＲ−αを発現している細胞）を、ＰＢＳ＋１ｍＭのＥＤＴＡ中のインキュベーションによって剥離した。剥離した細胞を、氷冷のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（１４０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、６ｍＭのＤ−グルコース、ＮａＯＨでｐＨ７．４）中に、それぞれ３×１０６及び１×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁した。１ｍｌの細胞懸濁液を１００ｐｍの［３Ｈ］−葉酸（比放射能：２，０００ｄｐｍ／ｐｍｏｌ）を含有する一連のエッペンドルフ試験管に、天然の葉酸塩又は葉酸アンタゴニストの、非存在或いは増加する濃度の存在中で加えた。４℃で１０分後、細胞をエッペンドルフ遠心機（３０秒、１０，０００ｒｐｍ）中で遠心し、上清を吸引し、そして細胞ペレットを２００μｌの水中に再懸濁し、そして放射能を分析した（Ｏｐｔｉｍａ Ｇｏｌｄ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｆｌｕｉｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｃｋａｒｄ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）。［３Ｈ］の非特異的結合（通常、特異的結合の＜２％）を、１０００倍ｍｏｌ過剰の非標識葉酸の存在中で細胞に伴った放射能を測定することによって決定した。ＦＲ−β及びＦＲ−αからの［３Ｈ］葉酸の５０％を置換するために必要な天然の葉酸塩及び選択された葉酸アンタゴニストの濃度を決定し、そして葉酸に対する結合親和性として示した。比較として、天然の葉酸塩及び葉酸アンタゴニストに対するＲＦＣの親和性のデータを、以前の研究から示す。Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９５；４８：４５９−４７１ Ｗｅｓｔｅｒｈｏｆ ｅｔ ａｌ．）及びＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５；６５（２４）：１１７２１−１１７２８（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。
【００６８】
細胞増殖阻害アッセイ ＣＨＯ−ＷＴ及びＣＨＯ−ＦＲβ細胞を、２４ウェルの細胞培養プレートの個々のウェルに１×１０４／ｃｍ２の密度で播種した。２４時間後、８種の濃度（２．５倍の増加で）の葉酸アンタゴニスト薬物を、１μＭの葉酸の非存在又は存在（ＦＲを遮断）中で加えた。７２時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン化によって回収し、そして以前に記述されているように細胞の生存率を数えた。Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９；５５（４）：７６１−７６９（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。
【００６９】
他の実験において、ヒト単球−マクロファージＴＨＰ１を、葉酸アンタゴニストの抗増殖効果に対して試験した。この目的のために、１．２５×１０５細胞を含有する１ｍｌの細胞懸濁液を、２４ウェルの組織培養プレートの個々のウェルに入れ、そして８種の濃度（２．５倍の増加で）の葉酸アンタゴニスト薬物と共にインキュベートした。７２時間の薬物暴露後、血球計算器で細胞の計数を行い、そして生存率をトリパンブルー排除によって確認した。
【００７０】
結果
滑膜組織のＦＲ−βの免疫組織化学的検査
全てのＲＡの滑膜組織の免疫組織化学的染色は、内膜のライニング層並びに滑膜下部ライニング中のＦＲ−βの高い発現を示した。ＦＲ−βに対する染色パターンは、３Ａ５（マクロファージ）染色と一致し、一方Ｔ−細胞領域は、染色を示さなかった（図１Ａ−Ｃ）。事実、更に詳細な蛍光顕微鏡分析は、滑膜組織の浸潤性マクロファージ及び内膜マクロファージの細胞膜上の、ＦＲ−β及びＣＤ６８（マクロファージマーカー）の共局在を証明した（図１Ｄ−Ｆ）。対照の整形外科の非炎症性滑膜組織におけるＦＲ−βに対する染色は、マクロファージの低い数と一致して、観察されなかった（示していない）。
【００７１】
染色の結果を、コンピュータ支援のデジタル画像分析によって分析した。有意な相関が滑膜下部ライニング層中の３Ａ５及びＦＲ−β発現間に見出された（細胞数／ｍｍ２）（ｐ＝０．０４）（図２Ａ）。活動性細胞数の中位値／ｍｍ２は、ＦＲ−βに対して１２６（範囲９−６３０）及び３Ａ５に対して２１９（範囲１１−６２２）であった。マクロファージの中位数は、ＭＴＸによる４ヶ月の治療によって減少した（滑膜下部ライニング層の活動性細胞数は２１９から１１９／ｍｍ２へ、ｐ＝０．１４）。ＭＴＸによる４ヶ月の治療後のＦＲ−βの発現は、ＤＡＳ２８の改良（△ＤＡＳ２８）と正に相関した（ｒ＝０．３１）が、統計的有意には達しなかった（ｐ＝０．１１）（図２Ｂ）。
【００７２】
ＲＡ患者のＲＡ滑膜細胞及び末梢血細胞中のＦＲ−βのｍＲＮＡの発現
滑膜組織中のＦＲ−βの発現差異を更に確認するために、ＦＲ−βのｍＲＮＡレベルを、リンパ球、ｅｘ ｖｉｖｏで活性化されたＴ−細胞、及び末梢血単球、並びにｅｘ ｖｉｖｏで単球由来のマクロファージを含むＲＡ患者の末梢血細胞のものと比較するように滑膜組織生検体中のＰＣＲ分析によって決定した。ＦＲ−βのｍＲＮＡレベルをＣＨＯ−ＦＲ−β細胞（１００％に設定）と比較して示す。ＦＲ−βのｍＲＮＡ発現の順位は、ＲＡ−滑膜組織において最高（ＣＨＯ−β細胞と比較して１７％の中位値）であり＞ｅｘ ｖｉｖｏの単球由来のマクロファージ（ＣＨＯ−β細胞と比較して３％）＞末梢血リンパ球（ＰＢＬ）（０．７％）＞＞単球（０．０２％）、そしてｅｘ ｖｉｖｏで活性化されたＴ−細胞（＜０．００１％）であった（図３）。
【００７３】
葉酸アンタゴニストに対するＦＲ−β対ＦＲ−αの結合親和性
選択された葉酸アンタゴニストに対するＦＲ−αの結合親和性は、Ｗｅｓｔｅｒｈｏｆ ｅｔ ａｌによって以前に報告されていたが、しかしこれらが、ＦＲ−βアイソフォームとどの程度重複し又は異なっているかは確立されていなかった。この目的のために、ＤＨＦＲ、ＴＳ、及びＧＡＲＴＦアーゼの一連の葉酸ベース阻害剤に対するＦＲ−βによる結合親和性対ＦＲ−αを決定し、そして図４に示した。葉酸に関しては、ＦＲ−β及びＦＲ−αの両方は、ＤＨＦＲの葉酸アンタゴニスト阻害剤の群に対してやや低い親和性を示した。ＭＴＸに対するＦＲ−βの親和性は、葉酸に対するものより概略５０倍低い。ＰＴ５２３に対する結合親和性は、ＭＴＸに対するものより顕著に低く（葉酸の０．３％）、一方ＰＴ５２３の５−メチル類似体であるＰＴ６４４は、ＭＴＸに対比する親和性を示した。注目すべきは、ＦＲ−αは、全ての試験された葉酸ベースのＴＳ阻害剤に対して良好な親和性を示すが、しかしペメトレキセド、ラルチトレキセド及びＢＧＣ９３３１に対するＦＲ−βの結合親和性は、ＦＲ−αより顕著に低かった（１６−３０倍）。ＦＲ−βの高い結合親和性の保持は、ＴＳ阻害剤ＣＢ３００６３５（葉酸の１６１％）及び（６ＲＳ）−ＢＧＣ９４５（葉酸の８９％）並びに（６Ｓ）−ＢＧＣ９４５（葉酸の４６％）に対して観察された。ＦＲ−βは、更にＧＡＲＴＦアーゼ阻害剤ＤＤＡＴＨＦ（葉酸の２７％）、及びＡＧ２０３４（葉酸の５４％）に対して熟達した結合親和性を示したが、ＦＲ−αのこれらの化合物に対する親和性は２．５倍高かった。まとめれば、これらの結果は、葉酸アンタゴニストに対するＦＲ−βの結合親和性における幅広い差を証明し、これらの中で、幾つかの葉酸アンタゴニストはＭＴＸに対するより顕著に高い結合親和性を明らかにした。
【００７４】
ＦＲ−βを発現している細胞の葉酸アンタゴニスト誘導の増殖阻害
現在の研究において使用される葉酸アンタゴニストが、マクロファージ様型の細胞に対して潜在的な増殖阻害効果をすべて伝達するものであるか否かを研究するために、このパラメータをヒト単球−マクロファージＴＨＰ１細胞に対して研究した（表１）。ＴＨＰ１細胞の主要な輸送経路としてのＲＦＣと一致して、強力な増殖阻害効果が、ＲＦＣに対して不良な親和性を有する二つの化合物ＣＢ３００６３５及びＢＧＣ９４５を除く、全ての葉酸アンタゴニストに対して観察された。ＴＨＰ１細胞系はＦＲ−陰性であるため（活性化された滑膜マクロファージとは対照的に）、ＦＲ−βが最高の結合親和性を示した三つの葉酸アンタゴニスト（ＣＢ３００６３５、ＡＧ２０３４及びＢＧＣ９４５）を、ＣＨＯ−ＦＲ−β細胞の細胞増殖阻害を誘発することによって、ＦＲ−βを標的とするその効力に対して評価した。ＣＨＯ／ＷＴ細胞に対して、ＢＧＣ９４５のみが＞１０００ｎＭの細胞外濃度において増殖阻害を誘導した（図５Ａ）。顕著なことは、ＣＨＯ／ＦＲ−β細胞の増殖阻害は、ＢＧＣ９４５の顕著に低い濃度（１０−５０ｎＭ）において誘導された。これらの細胞培養物への葉酸の添加は、ＦＲの遮断と一致して、ＢＧＣ９４５の活性を完全に抑制した。ＦＲ−βに対して最高の結合親和性を示したにもかかわらず、ＣＢ３００６３５は、ＣＨＯ／ＦＲ−β細胞の増殖阻害を誘導することにおいて顕著に強力ではない（図５Ｂ）。葉酸の同時投与がＣＢ３００６３５の活性を抑制する概念は、ＦＲ−βが、この化合物の細胞内取込みに関係することを示唆している。最後にＡＧ２０３４は、細胞への進入のための経路として恒常的に発現するＲＦＣ及びＦＲの両方を使用することができる（図５）。このように、ＡＧ２０３４は、ＣＨＯ／ＷＴ細胞に、そして広い範囲のＣＨＯ／ＦＲ−β細胞に対して増殖阻害の潜在性を示す（図５Ｃ／Ｄ）。同時に、ＦＲ−β遮断（葉酸で）及びＲＦＣ遮断（ＬＶで）によるＡＧ２０３４の増殖阻害効果の抑制は、部分的のみである（図５Ｃ／Ｄ）。
【００７５】
考察
ＭＴＸがＲＡの治療のための多くの治療管理における主力薬物であるために、ＭＴＸに対する治療反応を予想及び／又は改良することにおいて援助することができる遺伝子的、生化学的及び代謝的パラメーターの説明は、少なからぬ最近の興味を受けている。本研究は、活性化された滑膜のマクロファージにおいて、葉酸受容体βアイソフォームによって主として仲介される、ＭＴＸの細胞膜輸送の役割に特異的に焦点を当てている。ＦＲと恒常的に発現するＲＦＣの分子並びに機能的特質が少なからず異なっているという概念を仮定すれば、ＦＲ−βの特質のよりよい理解は、ＲＦＣよりもＦＲ−βを選択的に標的化することによってよりよい治療手段（ａ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）を促進するかもしれない。
【００７６】
本明細書において、本出願人等は、ＦＲ−β発現が主としてＲＡ患者の内膜ライニング層及び滑膜下部ライニング中にマクロファージと共局在し、そして従って葉酸アンタゴニストに対して魅力ある標的であることができることを示した。その幾つかは証明された抗癌活性を持つ一連の第二世代の葉酸アンタゴニストの結合親和性に対するスクリーニングにより、ＤＨＦＲ阻害剤の群が全てやや低いＦＲ−β親和性を有することが明らかにされた。これは、ＦＲのαアイソフォームが、以前に報告された２，４−ＮＨ２−ベースの構造を持つ葉酸アンタゴニストに対して低い親和性を有することを証明する、構造と活性の関係と一致する（表２参照）。興味あることには、ＦＲαがチミジル酸シンターゼの全ての試験された葉酸ベース阻害剤に対する比較的高い結合親和性を証明したが、一方ＦＲ−βに対して、これは、３環構造及び／又はグルタミン酸側鎖修飾の共通の化学的特質を共有する三つの化合物（ＣＢ３００６３５、ＧＷ１８４３及びＢＧＣ９４５）に対してのみ保持された（表２及び３参照）。後者の修飾は、更にＲＦＣによって輸送されるその能力を顕著に抑制し、そして従って、より大きいＦＲの選択性に寄与する。事実、ＢＧＣ９４５によるＦＲ−αに対する、そしてＲＦＣではない選択的標的化は、ＦＲαを過剰発現している細胞系において証明された。葉酸ベースＴＳ阻害剤に加えて、ＦＲ−βも、葉酸ベースＧＡＲＴＦアーゼ阻害剤（ＡＧ２０３４及びＤＤＡＴＨＥ）に対して中ないし高結合親和性を示し、これは、これらを、ＲＦＣ及びＦＲの両方によって輸送されることができる葉酸アンタゴニスト薬物として分類する。
【００７７】
ＦＲ−βで形質移入されたＣＨＯ細胞を、抗増殖効果を伝達することによる葉酸アンタゴニストのＦＲ−βで仲介される細胞取込みの効率を評価するためのモデル系として使用した。この細胞系モデルは、［３Ｈ］−葉酸結合レベル及びＲＡ患者の滑膜組織中のＦＲ−βのｍＲＮＡレベルと適合性であるＦＲ−βのｍＲＮＡレベルに基づき、臨床的に典型的であることができる（図４）。対照の（ＲＦＣを発現している）ＣＨＯ細胞とＦＲ−βで形質移入された細胞との間の活性の最大の差は、ＲＦＣによる輸送に対する不良な親和性及び高いＦＲ−β結合親和性と一致して、ＢＧＣ９４５に対して観察される。ＢＧＣ９４５のＦＲ−βで仲介される取込みは、過剰の葉酸による受容体の遮断によって阻害することができ、滑膜組織／血漿中を循環する天然の葉酸塩が、受容体占有／競合又は受容体下方制御のいずれかによって、ｉｎ ｖｉｖｏのＢＧＣ９４５の潜在的活性を減弱することができることを暗示した。
【００７８】
実施例２：本発明の化合物
表３は、本発明の以下の化合物の構造を示す：
・ＣＢ３００６３８（ＢＧＣ６３８） ・ＣＢ３００９４４
・（６Ｓ）−ＣＢ３００６３８ ・ＣＢ３００９４５（ＢＧＣ９４５）
・ＣＢ３００９３５ ・（６Ｓ）−ＣＢ３００９４５
・ＣＢ３００９３６ ・ＣＢ３００９４７
・ＣＢ３００９４０ ・ＣＢ３００９５１。
【００７９】
これらは、ＷＯ９４／１１３５４Ａ１、ＷＯ０３／０２０３００Ａ１、ＷＯ０３／０２０７０６Ａ１、ＷＯ０３／０２０７４８Ａ１、Ｊ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０００，４３，１９１０−１９２６、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６３（７），２００７，１５３７−１５４３（Ｂａｖｅｔｓｉａｓ ｅｔ ａｌ．）及びＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６５，２００５，１１７２１−１１７２８（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ）中に与えられた方法によって調製した。
【００８０】
実施例３：製剤
以下は、式（Ｉ）のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンを、特に医薬的に受容可能な塩の形態で含有する、ヒトにおける治療的又は予防的使用のための代表的な医薬的剤形を例示する：
（ａ）錠剤Ｉ ｍｇ／錠剤
シクロペンタ［ｇ］キナゾリン塩 １００
ラクトース 欧州局方 １８２．７５
クロスカルメロースナトリウム １２．０
トウモロコシデンプンペースト（５重量／容量％のペースト）２．２５
ステアリン酸マグネシウム ３．０。
【００８１】
（ｂ）錠剤ＩＩ ｍｇ／錠剤
シクロペンタ［ｇ］キナゾリン塩 ５０
ラクトース 欧州局方 ２２３．７５
クロスカルメロースナトリウム ６．０
トウモロコシデンプン １５．０
ポリビニルピロリドン（５重量／容量％のペースト） ２．２５
ステアリン酸マグネシウム ３．０。
【００８２】
（ｃ）錠剤ＩＩＩ ｍｇ／錠剤
シクロペンタ［ｇ］キナゾリン塩 １．０
ラクトース 欧州局方 ９３．２５
クロスカルメロースナトリウム ４．０
トウモロコシデンプンペースト（５重量／容量％のペースト）０．７５
ステアリン酸マグネシウム １．０。
【００８３】
（ｄ）カプセル ｍｇ／カプセル
シクロペンタ［ｇ］キナゾリン塩 １０．０
ラクトース 欧州局方 ４８８．５
ステアリン酸マグネシウム １．５。
【００８４】
（ｅ）注射I （５０ｍｇ／ｍｌ）
シクロペンタ［ｇ］キナゾリン塩 ５．０重量／容量％
１Ｍ水酸化ナトリウム溶液 １５．０容量／容量％
０．１Ｍ塩酸 （ｐＨを７．６に調節）
ポリエチレングリコール４００ ４．５重量／容量％
注射用水 １００％まで。
【００８５】
（ｆ）注射ＩＩ （１０ｍｇ／ｍｌ）
シクロペンタ［ｇ］キナゾリン塩 １．０重量／容量％
リン酸ナトリウムＢＰ ３．６重量／容量％
０．１Ｍ塩酸溶液 １５．０容量／容量％
注射用水 １００％まで。
【００８６】
（ｇ）注射ＩＩＩ （１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ６に緩衝）
シクロペンタ［ｇ］キナゾリン塩 ０．１重量／容量％
リン酸ナトリウムＢＰ ２．２６重量／容量％
クエン酸 ０．３８重量／容量％
ポリエチレングリコール４００ ３．５重量／容量％
注射用水 １００％まで。
【００８７】
上記の製剤は、製薬技術において公知の慣用的な方法によって調製することができる。錠剤（ａ）ないし（ｃ）は、慣用的な手段によって、例えば酢酸フタル酸セルロースの被覆で腸溶被覆することができる。
【００８８】
表１．ヒト単球−マクロファージＴＨＰ１細胞＃に対する葉酸アンタゴニストの増殖阻害効果
【００８９】
【表１】
【００９０】
＃ＴＨＰ１細胞は、２．２μＭの葉酸（これはいずれものＦＲ活性を遮断するものである）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖した。
薬物暴露時間；７２時間。結果は三つの別個の実験の平均±Ｓ．Ｄ．である。
【００９１】
表２．比較化合物の構造
【００９２】
【表２−１】
【００９３】
【表２−２】
【００９４】
表３．本発明の化合物の構造
【００９５】
【表３−１】
【００９６】
【表３−２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体の使用に関する。更に特定的には、これは、リウマチ様関節炎（ＲＡ）及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）を阻害するその能力、そして、更に各種の細胞系に対するその抗癌活性、の両方に関して良好なレベルの活性を示すシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体が開発されている。
【０００３】
ＷＯ９４／１１３５４Ａ１（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、以下の式：
【０００４】
【化１】
【０００５】
の三環式化合物を開示し、式中、Ｒ１は、水素、アミノ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４ヒドロキシアルキル又はＣ１−４フルオロアルキルであり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−４アルケニル、Ｃ３−４アルキニル、Ｃ２−４ヒドロキシアルキル Ｃ２−４ハロゲノアルキル又はＣ１−４シアノアルキルであり；
Ａｒは、フェニレン、チオフェンジイル、チアゾールジイル、ピリジンジイル又はピリミジンジイルであり、これらは、ハロゲノ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、Ｃ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシから選択される一つ又は二つの置換基を所望により保有することができ；そして
Ｒ３は、以下の式：
−ＮＨＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−Ａ１−Ｙ１
−ＮＨ−Ａ３−Ｙ３
の基の一つであるか、
或いはＲ３は、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−フェニルアラニンからなる群から選択されるＮ−連結の天然に存在するアミノ酸である。化合物の中で、開示されているものは、Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ化合物ＣＢ３００６３８であり、更にＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９９（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）ａｔ ＃５６６（Ｔｈｅｔｉ ｅｔ ａｌ．）及びＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４１，Ｍａｒｃｈ ２０００ ａｔ ＃３３（Ｊａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ）、並びにＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０００，４３，１９１０−１９２６中で記述され、ここでこれは、１９２３頁に化合物７ｂとして開示されている。
【０００６】
ＷＯ９５／３０６７３Ａ１（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、以下の式：
【０００７】
【化２】
【０００８】
のシクロペンタ−［ｇ］キナゾリンを開示し、式中、Ｒ１は、水素、アミノ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４ヒドロキシアルキル又はＣ１−４フルオロアルキルであり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−４アルケニル、Ｃ３−４アルキニル、Ｃ２−４ヒドロキシアルキル、Ｃ２−４ハロゲノアルキル又はＣ１−４シアノアルキルであり；
Ａｒ１は、フェニレン、チオフェンジイル、チアゾールジイル、ピリジンジイル又はピリミジンジイルであり、これらは、ハロゲノ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、Ｃ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシから選択される一つ又は二つの置換基を所望により保有することができ；そして
Ｒ３は、以下の式：
−Ａ１−Ａｒ２−Ａ２−Ｙ１
−Ａ５−ＣＯＮ（Ｒ）ＣＨ（Ｙ４）Ｙ５
−Ａ８−Ｘ−Ａｒ４
の基の一つである。
【０００９】
葉酸受容体のα−アイソフォーム（α−ＦＲ、膜結合性葉酸結合タンパク質）は、グリコシルホスファチジルイノシトールにより繋留された細胞膜タンパク質であり、これは、葉酸に対して、そして更に生物学的に関連する還元された葉酸塩に対して非常に強い親和性を有する（Ｋｄ約０．１ｎＭ）。葉酸塩の内部移行の機構は、受容体依存性エンドサイトーシスである。α−ＦＲは、多くの細胞腫、特に卵巣起源のものにおいて過剰発現し、ここでこれは、９０%の場合において、高度に、そして均質に過剰発現する；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１，５３２９−５３３８，１９９１（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ，１９９１）を参照されたい。更に、高いα−ＦＲの発現は、侵襲性の白金耐性疾病及び不良な予後に関係する−Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７４，１９３−１９８，１９９７及びＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７９，１２１−１２６，１９９８（両方ともＴｏｆｆｏｌｉ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。β−アイソフォームは、上皮性及び非上皮性起源の腫瘍において広く発現し、発現レベルは、一般的にそれぞれ低／中及び高であり、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５，５８７−６２７，１９９８（Ｒｅｄｄｙ ａｎｄ Ｌｏｗ）中で概説されている。
【００１０】
葉酸受容体（α及びβ）は、幾つかの成人の正常な組織において発現する（低ないし中程度の発現）。シクロペンタ−［ｇ］キナゾリンの一般的な群のある種の化合物は、α−葉酸受容体を発現しているヒト腫瘍細胞系において、ＲＦＣ（還元型葉酸キャリアー）に対する親和性に対して高いレベルの選択性を有することが報告されている。このような化合物は、ＷＯ０３／０２０３００Ａ１、ＷＯ０３／０２０７０６Ａ１及びＷＯ０３／０２０７４８Ａ１（ＢＴＧ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ）中で開示されている。化合物中で、開示されているものは、Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ化合物ＣＢ３００９４５であり、更にＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６３（７），１２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００７，１５３７−１５４３（Ｂａｖｅｔｓｉａｓ ｅｔ ａｌ．）及びＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６５，１５ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００５，１１７２１−１１７２８（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ）中で記述されている。
【００１１】
ＦＲ−βは、通常胎盤組織及び造血細胞中に見出され、ここでこれは、骨髄単球性の系統中で発現し、そして特に好中球の熟成中、或いは単球又はマクロファージの活性化中に増加する。然しながら、正常な造血細胞におけるＦＲ−βの発現は、例えば活性化されたマクロファージの場合とは異なり、これが葉酸塩と結合し、そして内部移入することができないことにおいて非機能性である。ＦＲ−βは、慢性の骨髄性白血病（ＣＭＬ）を持つ患者からの悪性細胞、及びＡＭＬを持つ患者の概略７０％からの悪性細胞上に発現する。
【００１２】
ＷＯ０３／０７２０９１−Ａ１（Ｔｈｅ Ｏｈｉｏ．Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）は、ＦＲ−βの発現が、骨髄性白血病の患者からの悪性細胞上で、ＦＲ−β誘導因子によって増加しているという発見を使用している。骨髄性白血病細胞、好ましくはＡＭＬ細胞中で発現するＦＲ−βは、非機能的である正常な造血細胞の殆んどにおいて発現するＦＲ−βとは異なり、葉酸塩と結合し、そして内部移行することにおいて機能的である。このような機能性のＦＲ−βは、葉酸複合化治療剤の標的である。
【００１３】
Ｊａｎｓｅｎは、１３ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｔｅｒｉｄｉｎｅｓ ＆ Ｆｏｌａｔｅｓ ｅｎｔｉｔｌｅｄ“Ａｎｔｉｆｏｌａｔｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｗｈａｔ ｃａｎ ｗｅ ｌｅａｒｎ ｆｒｏｍ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｖｉｃｅ ｖｅｒｓａ，”Ｐｔｅｒｉ−ｄｉｎｅｓ，１６：４６，２００５から要約中で、メトトレキセート（ＭＴＸ）が、リウマチ様関節炎を持つ患者のための治療管理における主力薬物であることを示している。彼は、更にシクロペンタ［ｇ］キナゾリンベースのＴＳ阻害剤が、葉酸に近い結合親和性を示し、そして従って癌、並びに炎症性疾病の治療における興味あるＦＲ標的薬物であることができることを推測している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際特許出願公開ＷＯ９４／１１３５４Ａ１（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ）
【特許文献２】ＷＯ９５／３０６７３Ａ１（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ）
【特許文献３】ＷＯ０３／０２０３００Ａ１（ＢＴＧ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ）
【特許文献４】ＷＯ０３／０２０７０６Ａ１（ＢＴＧ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ）
【特許文献５】ＷＯ０３／０２０７４８Ａ１（ＢＴＧ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ）
【特許文献６】ＷＯ０３／０７２０９１−Ａ１（Ｔｈｅ Ｏｈｉｏ．Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９９（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）ａｔ ＃５６６（Ｔｈｅｔｉ ｅｔ ａｌ．）
【非特許文献２】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４１，Ｍａｒｃｈ ２０００ ａｔ ＃３３（Ｊａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ）
【非特許文献３】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０００，４３，１９１０−１９２６
【非特許文献４】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１，５３２９−５３３８，１９９１（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ，１９９１）
【非特許文献５】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７４，１９３−１９８，１９９７（Ｔｏｆｆｏｌｉ ｅｔ ａｌ）
【非特許文献６】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７９，１２１−１２６，１９９８（Ｔｏｆｆｏｌｉ ｅｔ ａｌ）
【非特許文献７】Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５，５８７−６２７，１９９８（Ｒｅｄｄｙ ａｎｄ Ｌｏｗ）
【非特許文献８】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６３（７），１２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００７，１５３７−１５４３（Ｂａｖｅｔｓｉａｓ ｅｔ ａｌ．）
【非特許文献９】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６５，１５ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００５，１１７２１−１１７２８（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ）
【非特許文献１０】Ａｂｓｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ １３ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｔｅｒｉｄｉｎｅｓ ＆ Ｆｏｌａｔｅｓ ｅｎｔｉｔｌｅｄ“Ａｎｔｉｆｏｌａｔｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｗｈａｔ ｃａｎ ｗｅ ｌｅａｒｎ ｆｒｏｍ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｖｉｃｅ ｖｅｒｓａ，”Ｐｔｅｒｉ−ｄｉｎｅｓ，１６：４６，２００５。
【発明の概要】
【００１６】
本出願人等は、シクロペンタ［ｇ］キナゾリンの一般的群のある種の化合物が、β葉酸受容体を発現する細胞系に対して予期せぬほど高いレベルの選択性を有することをいまや見出した。このような化合物は、二つの構造的特徴、即ち、いわゆる三環式構造、及び葉酸と比較した場合のグルタミン酸側鎖に対する修飾を有する。従って、本発明は、以下の式（Ｉ）：
【００１７】
【化３】
【００１８】
のＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕジペプチド基を含有するシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体を含んでなり、式中：
Ｒ１は、アミノ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ヒドロキシアルキル、Ｃ１−４フルオロアルキル又はメトキシ−Ｃ１−４アルキルであり；
Ｒ２は、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−４アルケニル、Ｃ３−４アルキニル、Ｃ２−４ヒドロキシアルキル Ｃ２−４ハロゲノ−アルキル又はＣ１−４シアノアルキルであり；そして
Ａｒは、フェニレン、チオフェンジイル、チアゾールジイル、ピリジンジイル又はピリミジンジイルであり、これらは、ハロゲノ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、Ｃ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシから選択される一つ又は二つの置換基を所望により保有することができる。
【００１９】
化合物（Ｉ）は、所望により、
リウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のための
医薬的に受容可能な塩又はエステルの形態であってもよい。
【００２０】
本発明の化合物は、一つ又はそれより多い以下の利益を示す：
１． 生理学的濃度の葉酸塩中で増殖し、そしてＲＦＣの正常な発現を保有する場合の、β−ＦＲを過剰発現している細胞に対する高い選択性；
２． 強力なＴＳ阻害、ＲＦＣに対する低親和性、及びβ−ＦＲに対する中ないし高親和性；
３． ＴＳ特異的活性、そしてｉｎ ｖｉｖｏのヒドロラーゼに対して耐性である；並びに
４． 中程度のβ−ＦＲ発現を伴う一次チャイニーズハムスター卵巣細胞系のスクリーニングにおける選択的活性。
【００２１】
本明細書中で、用語アルキル、アルケニル及びアルキニルは、直鎖及び分枝鎖の両方を含むが、しかしプロピルのような個々のアルキル基に対する言及は、直鎖基に対してのみ特定的である。類似な慣例は、他の一般的用語に対して適用される。更に、シクロペンタ［ｇ］キナゾリン核に対して使用される番号付け系は、以下の式：
【００２２】
【化４】
【００２３】
に示すような慣用的なものである。
アミノ酸残基は、本明細書中では標準的な方法（Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７４，４０，３１７及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８４，１３８，９）で命名される。従って、例えば、γ−グルタミルは、文脈によってＨ２ＮＣＨ（ＣＯ２Ｈ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−又は−ＮＨＣＨ（ＣＯ２Ｈ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−基を意味し、これらの基の炭素原子は、位置１としてのα−カルボキシル基の炭素原子から番号付けされる。
【００２４】
本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンが少なくとも三つの不斉炭素原子［−Ｎ（Ｒ２）−基の三環系への接続の点、及びＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ基のα−炭素原子等として存在する］を含有し、そして従ってラセミの及び光学的に活性な形態で存在することができることが観察されるものである。本発明が、ラセミの及び光学的に活性な形態の両方を包含することは理解されることであり、このような光学的に活性な形態が立体特異的合成によって、又は異性体化合物の分離によって、如何にして得ることができるかは、普通の一般的知識の問題である。一つの異性体が、これが示す活性の特質のために、又はより優れた物理的特性、例えば水に対する溶解度のために、他方より更に興味深いものであることができることは認識されるものである。
【００２５】
式（Ｉ）のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンが、互変異性の現象を示し、そして本明細書中に示された式が、可能な互変異性の形態の一つのみを表すことができることも更に理解されることである。
【００２６】
式（Ｉ）のある種のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンが、例えば水和された形態のような溶媒和された、並びに溶媒和されていない形態で存在することができることも更に理解されることである。
【００２７】
Ｒ１又はＲ２のための、それがＣ１−４アルキルである場合の、或いはそれがＡｒ上に存在することができるＣ１−４アルキル置換基のための適した意義は、例えば、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルである。
【００２８】
Ａｒ上に存在することができるＣ１−４アルコキシ置換基のための適した意義は、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ又はブトキシである。
Ａｒ上に存在することができるハロゲノ置換基のための適した意義は、例えば、フルオロ、クロロ又はブロモである。
【００２９】
Ｒ２のための、それがＣ３−４アルケニルである場合の適した意義は、例えば、プロパ−２−エニル、ブタ−２−エニル、ブタ−３−エニル又は２−メチルプロパ−２−エニルであり；そしてそれがＣ３−４アルキニルである場合は、例えば、プロパ−２−イニル又はブタ−３−イニルである。
【００３０】
Ｒ２のための、それがＣ２−４ヒドロキシアルキルである場合の適した意義は、例えば、２−ヒドロキシエチル又は３−ヒドロキシプロピルであり；それがＣ２−４ハロゲノアルキルである場合は、例えば、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、２−ブロモエチル、３−フルオロプロピル、３−クロロプロピル又は３−ブロモプロピルであり；そしてそれがＣ１−４シアノアルキルである場合は、例えば、シアノメチル、２−シアノエチル又は３−シアノプロピルである。
【００３１】
Ａｒのための、それがフェニレンである場合の適した意義は、例えば、１，３−又は１，４−フェニレン、特に１，４−フェニレンである。
Ａｒのための、それがチオフェンジイルである場合の適した意義は、例えば、チオフェン−２，４−ジイル又はチオフェン−２，５−ジイルであり；それがチアゾールジイルである場合は、例えば、チアゾール−２，４−ジイル又はチアゾール−２，５−ジイルであり；それがピリジンジイルである場合は、例えば、ピリジン−２，４−ジイル、ピリジン−２，５−ジイル、ピリジン−２，６−ジイル又はピリジン−３，５−ジイルであり；そしてそれがピリミジンジイルである場合は、例えば、ピリミジン−２，４−ジイル、ピリミジン−２，５−ジイル又はピリミジン−４，６−ジイルである。
【００３２】
示したように、Ａｒは、一つ又は二つの置換基を保持することができる。Ａｒにおける好ましい置換のレベルは、置換が存在する場合、二つの置換基又は特に一つの置換基のいずれかであり；そしてこの一つ又は二つの置換基は、好都合には−ＣＯ−Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ基に結合する原子に隣接する位置にあることができ、フルオロのようなハロゲノ置換基が好ましい。
【００３３】
本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンの適した医薬的に受容可能な塩の形態は、例えば、無機又は有機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、トリフルオロ酢酸又はマレイン酸との酸付加塩；或いはアルカリ金属、例えばナトリウム、アルカリ土類金属、例えばカルシウム、又はアンモニウム、例えばテトラ（２−ヒドロキシエチル）アンモニウム塩である。
【００３４】
本発明のシクロペンタ［ｇ］キナ−ゾリンの適した医薬的に受容可能なエステルの形態は、例えば、６個までの炭素原子の脂肪族アルコールとのエステル、例えばメチル、エチル又はｔｅｒｔ−ブチルエステルである。
【００３５】
化合物は、三つのカルボキシル基を含有する。塩又はエステルは、一酸−二塩又は−エステル、二酸−一塩又は−エステル或いは三塩又は−エステルでさえあることができる。
好ましくはＲ１は、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４ヒドロキシアルキルである。更に好ましくは、Ｒ１は、メチル、又は特に、ヒドロキシメチルである。
【００３６】
好ましくは、Ｒ２は、メチル、エチル、プロピル、プロパ−２−エニル、プロパ−２−イニル、２−ヒドロキシ−エチル、２−フルオロエチル、２−ブロモエチル又は２−シアノエチルである。更に好ましくは、Ｒ２は、メチル、又は特に、プロパ−２−イニルである。
【００３７】
好ましくは、Ａｒは、クロロ及び特にフルオロからなる群から選択される一つ又は二つの置換基を所望により保有してもよい１，４−フェニレン、チオフェン−２，５−ジイル、チアゾール−２，５−ジイル、或いはピリジン−２，５−ジイルである。更に好ましくは、Ａｒは、１，４−フェニレン又は２，６−ジフルオロ−１，４−フェニレン若しくは特に２−フルオロ−１，４−フェニレンのように２−フルオロ置換基を有する１，４−フェニレンであるか、或いはピリジン２，５−ジイルである。最も好ましくはＡｒは、１，４−フェニレン又は２−フルオロ−１，４−フェニレンである。
【００３８】
好ましい本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、
Ｒ１が、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４ヒドロキシアルキル、特にヒドロキシメチルであり；
Ｒ２は、メチル、エチル、プロピル、プロパ−２−エニル、プロパ−２−イニル、２−ヒドロキシエチル、２−フルオロエチル、２−ブロモエチル又は２−シアノエチルであり；そして
Ａｒは、クロロ及び特にフルオロからなる群から選択される一つ又は二つの置換基を所望により保有してもよい１，４−フェニレン、チオフェン−２，５−ジイル、チアゾール−２，５−ジイル或いはピリジン−２，５−ジイルである；
式（Ｉ）を有する。
【００３９】
更に好ましい本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、
Ｒ１が、メチル又はヒドロキシメチルであり；
Ｒ２は、メチル又はプロパ−２−イニルであり；そして
Ａｒは、１，４−フェニレン、又は２，６−ジフルオロ−１，４−フェニレン若しくは特に２−フルオロ−１，４−フェニレンのように２−フルオロ置換基を有する１，４−フェニレンであるか、或いはピリジン２，５−ジイルである；
式（Ｉ）を有する。
【００４０】
特に好ましい本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、
Ｒ１が、メチル又はヒドロキシメチルであり；
Ｒ２は、メチル又は好ましくはプロパ−２−イニルであり；そして
Ａｒは、１，４−フェニレン又は２−フルオロ−１，４−フェニレンである；
式（Ｉ）を有する。
【００４１】
具体的な特に好ましい本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは：
Ｎ−｛Ｎ−｛４−［Ｎ−（２−メチル−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロパ−２−イニル）アミノ］ベンゾイル｝−Ｌ−γ−グルタミル｝−Ｄ−グルタミン酸；又は
Ｎ−｛Ｎ−｛４−［Ｎ−（２−ヒドロキシメチル−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ｇ］−キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロパ−２−イニル）アミノ］ベンゾイル｝−Ｌ−γ−グルタミル｝−Ｄ−グルタミン酸；或いは医薬的に受容可能なこれらの塩又はエステル；
並びにこれら二つの化合物の６Ｓ異性体；
である。
【００４２】
本発明の化合物は、立体異性体の混合物として存在することができるが、これらが、一つの光学的に活性な異性体の形態に分割されることが好ましい。このような要求は、化合物の合成を複雑にし、そして従ってこれらが、所望の活性を達成することに一致しながら、可能な限り僅かな不斉炭素原子を成分として含有することが好ましい。
【００４３】
然しながら先に示したように、本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、少なくとも三つの不斉炭素原子を含有する。これらの中で、環系の６位におけるものは、好ましくは６Ｒよりはむしろ６Ｓ配向を有する。従って本明細書中で先に記載した好ましい化合物は、この不斉炭素原子においてこのような立体配置を有するか、或いは好ましくはないが、これらの不斉炭素原子の一つ又は両方が分割されていない混合物である。
【００４４】
本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、化学的に関係する化合物の調製に適用可能ないずれもの既知の方法によって調製することができる。
本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、それ自体活性であることができるか、又はｉｎ ｖｉｖｏで活性な化合物に転換されるプロドラッグであることができる。本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、シクロペンタ［ｇ］キナゾリンを医薬的に受容可能な希釈剤又は担体と共に含んでなる医薬組成物の形態で、ヒトを含む温血動物に投与することができる。
【００４５】
組成物は、経口使用、例えば錠剤、カプセル、水性又は油性溶液、懸濁液或いは乳液；局所使用、例えばクリーム、軟膏、ゲル或いは水性若しくは油性溶液又は懸濁液；鼻腔使用、例えば嗅ぎ薬、鼻腔噴霧剤又は鼻腔点滴剤；膣又は直腸使用、例えば座薬；吸入による投与、例えば乾燥粉末のような微細に分割された粉末、微結晶の形態又は液体エアゾール；舌下又は頬側使用、例えば錠剤又はカプセル；或いは非経口使用（静脈内、皮下、筋肉内、血管内又は注入使用を含む）、例えば滅菌水性又は油性溶液、乳液或いは懸濁液のために適した形態であることができる。一般的に、上記の組成物は、慣用的な賦形剤を使用して慣用的な方法で調製することができる。
【００４６】
シクロペンタ［ｇ］キナゾリンは、通常温血動物に動物の身体面積の平方メートル当り５０−２５０００、特に５０−５０００ｍｇ、即ち概略１５００、特に１−１００ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で投与されるものである。然しながら、所望する場合、この範囲外の投与量を使用することができ、そして特に、皮下への注入を含む好ましい投与のモードが使用される場合、投与量の範囲を、１−１０００ｍｇ／ｋｇに増加することができる。好ましくは、１０−２５０ｍｇ／ｋｇ、特に３０−１５０ｍｇ／ｋｇの範囲の日量が使用される。然しながら、日量は、治療される宿主、投与の特定の経路、及び治療される病気の重篤度によって必然的に変化するものである。従って、最適投与量は、いずれもの特定の患者を治療している医師によって決定されることができる。
【００４７】
従って、本発明は、更にリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病を治療するための、このような治療を必要とする患者における方法を含み、これは、前記患者に有効な量の本明細書中で先に定義したとおりのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体を投与することを含んでなる。
【００４８】
化合物は、通常動物の身体面積の平方メートル当り５−２５０００ｍｇ、特に５−５００ｍｇ、即ち概略０．１−５００、特に０．１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で投与されるものである。然しながら、所望する場合、この範囲外の投与量を使用することができる。本発明のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンの局所投与を使用することができる。従って、例えば、局所投与において、例えば０．１ないし１０ｍｇ／ｋｇの範囲の日量を使用することができる。
【００４９】
キナゾリンを含有する組成物は、単位剤形、即ちそれぞれが単位投与量或いは単位投与量の倍数又は約数を含んでなる分離した部分の形態、例えば錠剤或いはカプセルとして処方することができる。このような単位剤形は、例えば、１−２５０又は１−５００ｍｇの範囲の量のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンを含有することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、ＲＡ−滑膜組織の免疫組織化学的検査：（Ａ）ウサギアイソタイプ染色、（Ｂ）ＦＲ−β染色及び（Ｃ）マクロファージ染色（３Ａ５）の光学顕微鏡観察である。（Ｄ）ＦＲ−β、（Ｅ）ＣＤ−６８（マクロファージ）並びに（Ｆ）Ｄ及びＥの混合の免疫蛍光（二重）染色。注記：核は青に染色（Ｄａｐｉ染色）されている。
【図２】図２は、（Ａ）ＭＴＸ治療前のＲＡ患者（ｎ＝１５）の滑膜組織中の３Ａ５（マクロファージ）及びＦＲ−β活動性細胞／ｍｍ２間の相関である。滑膜の下部ライニング層中の活動性細胞数の中位値／ｍｍ２は、ＦＲ−βに対して１２６（範囲：９−６３０）であり、そして３Ａ５に対して２１９（範囲：１１−６２２）であった。直線回帰：Ｒ＝０．６４、ｐ＝０．０４。（Ｂ）ＭＴＸによる４ヶ月の治療後のＤＡＳ２８の改良（ΔＤＡＳ２８）及びマクロファージ上のＦＲ−β発現間の相関（活動性細胞／ｍｍ２）である（Ｒ＝０．３１；ｐ＝０．１１）。
【図３】図３は、滑膜組織及びｅｘ ｖｉｖｏで培養されたＲＡ末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中のＦＲ−βのｍＲＮＡ発現である。ＦＲ−βのｍＲＮＡ発現の中位値は、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ；ｎ＝９）、単球（ｎ＝９）、ｅｘ ｖｉｖｏ培養マクロファージ（ｎ＝２５）、ｅｘ ｖｉｖｏ活性化Ｔ−細胞（ｎ＝２２）及びＲＡ患者の滑膜組織（ｎ＝７）中で決定した。これらの試料中のＦＲ−β発現は、ＣＨＯ−β細胞（ＦＲ−βで形質移入したチャイニーズハムスター卵巣細胞；これらの細胞中の発現を１．００と設定した）中の発現のパーセントとして示している。
【図４】図４は、新規な世代の葉酸アンタゴニストに対するＦＲ−α（白色の棒）及びＦＲ−β（灰色の棒）の相対的結合親和性である。薬物のＦＲ−α及びＦＲ−βの結合親和性は、材料及び方法の部において記載されるような、ＦＲαを発現しているＫＢ細胞及びＦＲβで形質移入されたＣＨＯ−β細胞の［３Ｈ］−葉酸置換によって決定した。結合親和性は、葉酸結合親和性に対するパーセントとして与えられる。結果は、３−５回の別個の実験の平均±ＳＤである（ＳＤ＜３０％）。比較のために、葉酸アンタゴニストに対するＲＦＣの親和性は、以前に刊行されたデータに基づき：＋＋＋＋（高親和性）、＋＋＋（中親和性）、＋＋（低親和性）、＋（不良な親和性）、＋／−（非常に不良な親和性）として与えられている。
【図５】図５は、１μＭの葉酸を伴う又は伴わないＢＧＣ９４５（Ａ）、ＣＢ３００６３５（Ｂ）、及び葉酸（１μＭ）又はロイコボリン（２０ｎＭ）の補充を伴う又は伴わないＡＧ２０３４（Ｃ／Ｄ）によるＣＨＯ／ＷＴ及びＣＨＯ／ＦＲ−β細胞の増殖の阻害である。結果は三つの実験の平均である（ＳＤ＜２０％）。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５１】
実施例１：リウマチ様関節炎の患者の滑膜組織中の活性化されたマクロファージに対する、新規な世代の葉酸アンタゴニストのための潜在的な放出経路としての葉酸受容体−βの開発。
【００５２】
序論
葉酸アンタゴニストのメトトレキセート（ＭＴＸ）は、リウマチ様関節炎（ＲＡ）を持つ患者の治療において最も広く適用されている疾患修飾性抗リウマチ剤（ＤＭＡＲＤ）の主力薬物である。これは、単一の薬剤として、又は他のＤＭＡＲＤ（例えばスルファサラジン及びヒドロキシクロロキン）との組合せのいずれかとして使用され、そしてＭＴＸの使用は、生物学的薬剤（抗−ＴＮＦα又は−ＣＤ２０モノクローナル抗体）に関係する殆どの治療戦略において必須である。
【００５３】
ＭＴＸの細胞薬理学における第１の中心的段階は、少なくとも三つの異なった経路；還元型葉酸キャリヤー（ＲＦＣ）、膜結合型葉酸受容体（ＭＦＲ）、又はプロトン結合（低ｐＨ）葉酸輸送体（ＰＣＦＴ）によって仲介することができる、その細胞への進入である。後者の輸送体は、主として腸管内の葉酸塩取込みに関係している。他の輸送経路は、天然の還元型葉酸補助因子及びＭＴＸのような葉酸アンタゴニストの取込みを促進することによって、免疫コンピテント細胞に対する生理学的及び薬理学的関連性を抱える。ＲＦＣ及びＭＦＲは、（抗）葉酸取込みの機構（膜貫通型キャリヤー対エンドサイトーシス／ポトサイトーシス）、基質特異性（低親和性葉酸／高親和性ＭＴＸ対高親和性葉酸／低親和性ＭＴＸ）及び組織特異性（常在型対制限発現）においてかなり異なる。
【００５４】
ＭＦＲに対して、三つのアイソフォーム（α、β及びγ）が同定されている。ＭＦＲのα−アイソフォームは、癌の特異的型（卵巣癌）において過剰発現し、一方γ−アイソフォームは、造血細胞から分泌されるタンパク質である。ＦＲ−βアイソフォームの選択的発現は、ＲＡの患者及び関節炎の動物モデルの炎症性滑膜流体中の活性化されたマクロファージについて記載されている。その後、ＦＲ−βは、関節炎の画像化のために、そして治療的には、毒素及び他の小／大分子の、選択的抗体誘導又は葉酸複合体誘導放出のために魅力ある標的として認識された。これまで、葉酸アンタゴニストを伴うＦＲの標的化は、癌細胞／ＦＲαを過剰発現している組織においてのみ調査されていた。
【００５５】
過去数十年にわたって、第二世代の葉酸アンタゴニストが設計され、そしてＲＦＣによる輸送障害、ポリグルタミル化障害、標的酵素ＤＨＦＲの活性の増加及び／又は薬物流出の亢進を含むＭＴＸに対する耐性の通常の機構を回避する観点から、臨床的に評価されてきた。この背景に基づき、第二世代の抗葉酸剤は、ＲＦＣによってより効率的に輸送される、更に効率的にポリグルタミル化される、又はポリグルタミル化とは独立の、或いはＤＨＦＲ以外の葉酸代謝における他の主要酵素、例えばチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）又はグリシンアミドリボヌクレオチドトランスフォーミラーゼを標的とする化合物を含んでいた。本研究において、本出願人等は、個別の第二世代の抗葉酸剤が滑膜組織中のＦＲ−βを発現している細胞及び／又はＲＡ患者の免疫コンピテント細胞に対する選択的標的薬物として作用するか否かを研究することを設定した。本出願人等は、ＴＳ阻害剤であるＢＧＣ９４５を、高ＦＲ−β結合親和性及び低ＲＦＣ親和性の判定基準を満足し、これによってＦＲ−βを発現している細胞中の選択的薬物取込みを可能にする、プロトタイプの抗葉酸薬物として規定した。
【００５６】
材料及び方法
薬物
葉酸は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから、Ｌ−ロイコボリンは、Ｍｅｒｃｋ Ｅｐｒｏｖａ，Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから、メトトレキセートは、Ｐｈａｒｍａｃｈｅｍｉｅ，Ｈａａｒｌｅｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから、そしてペメトレキセド／ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）は、ＶＵｍｃ薬品部から入手した。以下の葉酸アンタゴニスト薬物は、示した会社／研究所から入手した；ラルチトレキセド／Ｔｏｍｕｄｅｘ（登録商標）／ＺＤ１６９４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，ＵＫ）、ＰＴ５２３及びＰＴ６４４（Ｄｒ．Ａ．Ｒｏｓｏｗｓｋｙ，Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、ＧＷ１８４３（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｃｏｍｅ，ＵＳＡ）、ＣＢ３００６３５（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｕｔｔｏｎ，ＵＫ）、ＢＧＣ９３３１及びＢＧＣ９４５（６ＲＳ及び６Ｓ）（ＢＴＧ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）、５，１０−ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、及びＡＧ２０３４（Ａｇｏｕｒｏｎ／Ｐｆｉｚｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。これらの葉酸アンタゴニストの化学構造を、表２及び表３に示す。［３’，５’，７，９−３Ｈ］葉酸（２０−４０Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＭＴ７８３）は、Ｍｏｒａｖｅｋ，Ｂｒｅａ，ＣＡから購入した。
【００５７】
細胞系
野生型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−ＷＴ）細胞、ＦＲ−βで形質移入したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＦＲ−β）及びＦＲ−αを発現しているヒト上咽頭類表皮ＫＢ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％の胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１５ｍｇ／ｍｌのプロリン並びに１００単位／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシンで補充された葉酸を含まないＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で増殖した。ＣＨＯ−ＦＲ−β及びＫＢ細胞の［２Ｈ］葉酸結合能力は、それぞれ０．５−１ｐｍｏｌ／１０６細胞及び２０−４０ｐｍｏｌ／１０６細胞であった。ヒト単球−マクロファージＴＨＰ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％の胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１５ｍｇ／ｍｌのプロリン並びに１００単位／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシンで補充された、２．２μＭの葉酸を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で増殖させた。全ての細胞系を、３７℃で５％のＣＯ２を含有する加湿された雰囲気中に保った。
【００５８】
滑膜組織試料
本研究において、本出願人等は、治療前、及びＭＴＸによる４ヶ月の治療（ＭＴＸの出発時投与量：７．５ｍｇ／週；１５ｍｇ／週で１２週かけて段階的に増加）後の活動性疾患を持つ１５人のＲＡ患者の膝関節由来の滑膜組織生検体を分析した。活動性疾患は、≧６の関節膨張又は関節疼痛、並びに医師及び患者の評価による中程度又はそれより悪いレベルの疾患活動性（疾患活動性スコア−２８；ＤＡＳ−２８）と定義した。全ての患者は少なくとも１箇所の臨床的に関係する膝関節を有していた。低投与量のプレドニゾン（＜１０ｍｇ／日）及び併用の安定した非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）の投与の治療は許可された。いずれの患者も研究に登録する前にＭＴＸを使用したことはなかった。他のＤＭＡＲＤを摂取していた患者において、２８日間の休薬期間後、治療は中止された。関節鏡検査法が、Ｌｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）及びＬｅｅｄｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ（ＵＫ）のＭｅｄｉｃａｌ Ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓによって認可された関節研究の一部として、以前に記述されているように行われた。Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２００２；４６（８）：２０３４−２０３８及び２０００；４３（８）：１８２０−１８３０（両方ともＫｒａａｎ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。
【００５９】
非炎症性の対照滑膜組織として、本出願人等は、Ｄｒ．Ｂ．Ｊ．ｖａｎ Ｒｏｙｅｎ，ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ，ＶＵ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって提供された機械的関節損傷を持つ患者からの七つの試料を含めた。末梢血試料の収集のために、全ての患者はインフォームドコンセントの書式にサインし、そして‘ＤＭＡＲＤ耐性’の研究は、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ ＶＵ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって許可された。
【００６０】
ＦＲ−βの免疫組織化学的検査
ＲＡ患者及び対照からの滑膜組織生検体のクライオスタット切片（４μｍ）の免疫組織化学的染色は、以前に記述されているような３段階の免疫ペルオキシダーゼ法を使用して行った。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１；６１（８）：３４５８−３４６４（Ｍａｌｉｅｐａａｒｄ ｅｔ ａｌ．）及び２０００；６０（１８）：５２６９−５２７７（Ｓｃｈｅｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。切片を、ＦＲ−βに対する特異的抗体（希釈１：３０００）、アイソタイプ対照：正常なウサギ血清）で染色した。マクロファージ及びＴ−細胞を、３Ａ５（希釈１：１００）及び抗−ＣＤ３−ＰＥ（希釈１：２５；Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒａｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）モノクローナル抗体（アイソタイプ対照：マウス免疫グロブリン）でそれぞれ染色した。ピオチニル化ブタ抗−ウサギＩｇＧ（Ｄａｋｏ；希釈１：２００）及びウサギ抗−マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ；希釈１：３００）を、二次抗体として使用した。０．４ｍｇ／ｍｌのＡＥＣ（アミノエチルカルバゾール）を使用して、色の展開を行った。ヘマトキシリンによる対比染色後、スライドを設置した。染色部分を以前に記述されているように、デジタル画像分析によってＦＲ−β、３Ａ５及びＣＤ３発現に対して分析した。Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．２００５；７（４）：Ｒ８６２−Ｒ８６７（Ｈａｒｉｎｇｍａｎ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。簡単には、それぞれのマーカーのために、代表的領域を４００×の倍率を使用して画像獲得のために使用した。これらの領域を、３ピクセル重複させて６個の高倍率視野（ｈｐｆｓ）に分割した。活動性の細胞を、１８の連続したｈｐｆｓを分析し、ｍｍ２当りの内膜ライニング層及び滑膜下部ライニング中の活性な細胞の数を記録することによって評価した。
【００６１】
二重標識免疫蛍光検査法
ＦＲ−βを、ブタ−抗−ウサギＨＲＰ−標識抗体（希釈１：２００；Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって検出し、そして展開は、製造業者の説明書によってローダミン／チラミン（ｔｈｙｒａｍｉｎ）（赤色蛍光）（希釈１：１０００）によった。ＣＤ６８は、ヤギ−抗−マウスビオチニル化抗体（希釈１：１００；Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって、ストレプトアビジンＡｌｅｘ−４８８を基質として使用して（希釈１：７５０；緑色蛍光；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）検出した。スライドを、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを含有する（核の染色のため）Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を伴って設置した。細胞を、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＲＢ，Ｒｉｊｓｗｉｊｋ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して試験した。
【００６２】
ＲＡ患者の末梢血細胞の単離及び培養条件
末梢血単核細胞を、新しく得た血液試料からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）の勾配遠心（４００×ｇにおいて３５分）によって単離した。遠心後、界面を注意深く収集し、そして１％ＢＳＡで補充したリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）を使用して三回洗浄した。リンパ球画分を数え、そして１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン並びに１００μｇ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシンを含有するＩＭＤＭ培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｒｅｄａ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中に再懸濁した。単球を、培養フラスコ中の３７℃における２時間のインキュベーション後、付着によって単離し、続いて単球を、１０ｎｇ／ｍｌのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）（Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在中で７日間培養することによって、ＲＮＡを抽出するか、又はマクロファージを分化した。
【００６３】
単球の付着後の懸濁液中に残った末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、ＲＮＡ単離のために収集するか、又はこれらを、１×１０６細胞／ｍｌの密度で、モノクローナル抗−ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ、ＣＬＢ−ＣＤ２８／１，Ｓａｎｑｕｉｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）及び抗−ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ、ＣＬＢ−Ｔ３／４．Ｅ，Ｓａｎｑｕｉｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で、ヤギ抗−マウス（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で被覆された２４ウェルプレート中でインキュベートすることによる、Ｔ−細胞の活性化のために使用した。４８時間の刺激後、活性化されたＴ−細胞をＲＮＡ単離のために収集し、そして活性化状態を、流動細胞計測法（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、ＣＤ２５発現を測定することによって決定した。
【００６４】
ＲＡ患者の滑膜組織及び末梢血細胞中のＦＲ−βのｍＲＮＡ発現
ＲＡ患者からの滑膜組織（ｎ＝７）、ＰＢＬ（ｎ＝９）、単球（ｎ＝９）、マクロファージ（ｎ＝２５）、及び活性化されたＴ−細胞（ｎ＝２２）からのＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、製造業者によって提供された説明書に従って単離した。ＲＮＡの単離に先だって、冷凍した滑膜組織を、液体窒素で予備冷却した乳鉢中で粉砕してこれを粉末化し、その後、ＲＰＥ緩衝液を加えた。全ＲＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ−１０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌ−ｍｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）を使用して決定した。以前に記述されているようなリアルタイム逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法を、ＦＲ−β及びグリセルアルデヒド−３−リン酸（参照遺伝子）に対するｍＲＮＡレベルを同時に測定するために使用した。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６；６６（１１）：５８７５−５８８２（Ｑｉ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。
【００６５】
逆転写段階は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）からのＴａｑｍａｎ逆転写試薬を使用して、製造業者のプロトコルに従って行った。簡単には、４００ｎｇの全ＲＮＡを、ランダムヘキサマープライマー（５０μｍｏｌ／Ｌ）、ＲＮアーゼ阻害剤（１単位／μＬ）、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（５単位／μＬ）、及びデオキシヌクレオシド三リン酸混合物（それぞれ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）と逆転写緩衝液中で混合した。１０μＬの反応混合物を、まず２５℃で１０分間、次いで４８℃で３０分間、そして最後に９５℃で５分間インキュベートした。
【００６６】
その後のＦＲ−βに対するリアルタイムＰＲＣ段階は、１２．５μＬのＰＲＣ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、それぞれ０．５μＬの順方向及び逆方向プライマー（ＣＴＧＧＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧ−ＡＧＴＴＣ、’ＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＴＴＡＴＣＣＡ）並びに０．５μＬのＴａｑｍａｎプローブ（６ＦＡＭ−ＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＴＣＡＧＣ−ＴＡＭＥＲＡ）の存在中で行った。対照のＧＡＰＤＨ遺伝子のためのプライマー及びＴａｑｍａｎプローブを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＰＣＲ条件は、５０℃で２分間、次いで９５℃で１０分間、続いて９５℃でそれぞれ１５秒間の４０サイクル、そして最後に６０℃で１分間であった。発生した蛍光データを、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ５７００配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によってモニター及び記録した。全ての試料を三重で設定し、そしてＧＡＰＤＨ値に正規化した。
【００６７】
新規な世代の葉酸アンタゴニストに対するＦＲ−β／ＦＲ−α及びＲＦＣ結合親和性の分析
［３Ｈ］−葉酸並びに新規な抗葉酸薬物の、ＦＲ−β及びＦＲ−αへの競合的結合に対するインタクトな細胞の結合アッセイを、本質的に以前に記述されているように行った。Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９５；４８：４５９−４７及びＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９５；５５（１７）：３７９５−３８０２（両方ともＷｅｓｔｅｒｈｏｆ ｅｔ ａｌを参照されたい。簡単には、ＣＨＯ−β細胞（ＦＲ−βで形質移入されたチャイニーズハムスター卵巣細胞）及びＫＢ細胞（ＦＲ−αを発現している細胞）を、ＰＢＳ＋１ｍＭのＥＤＴＡ中のインキュベーションによって剥離した。剥離した細胞を、氷冷のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（１４０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、６ｍＭのＤ−グルコース、ＮａＯＨでｐＨ７．４）中に、それぞれ３×１０６及び１×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁した。１ｍｌの細胞懸濁液を１００ｐｍの［３Ｈ］−葉酸（比放射能：２，０００ｄｐｍ／ｐｍｏｌ）を含有する一連のエッペンドルフ試験管に、天然の葉酸塩又は葉酸アンタゴニストの、非存在或いは増加する濃度の存在中で加えた。４℃で１０分後、細胞をエッペンドルフ遠心機（３０秒、１０，０００ｒｐｍ）中で遠心し、上清を吸引し、そして細胞ペレットを２００μｌの水中に再懸濁し、そして放射能を分析した（Ｏｐｔｉｍａ Ｇｏｌｄ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｆｌｕｉｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｃｋａｒｄ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）。［３Ｈ］の非特異的結合（通常、特異的結合の＜２％）を、１０００倍ｍｏｌ過剰の非標識葉酸の存在中で細胞に伴った放射能を測定することによって決定した。ＦＲ−β及びＦＲ−αからの［３Ｈ］葉酸の５０％を置換するために必要な天然の葉酸塩及び選択された葉酸アンタゴニストの濃度を決定し、そして葉酸に対する結合親和性として示した。比較として、天然の葉酸塩及び葉酸アンタゴニストに対するＲＦＣの親和性のデータを、以前の研究から示す。Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９５；４８：４５９−４７１ Ｗｅｓｔｅｒｈｏｆ ｅｔ ａｌ．）及びＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５；６５（２４）：１１７２１−１１７２８（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。
【００６８】
細胞増殖阻害アッセイ ＣＨＯ−ＷＴ及びＣＨＯ−ＦＲβ細胞を、２４ウェルの細胞培養プレートの個々のウェルに１×１０４／ｃｍ２の密度で播種した。２４時間後、８種の濃度（２．５倍の増加で）の葉酸アンタゴニスト薬物を、１μＭの葉酸の非存在又は存在（ＦＲを遮断）中で加えた。７２時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン化によって回収し、そして以前に記述されているように細胞の生存率を数えた。Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９；５５（４）：７６１−７６９（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。
【００６９】
他の実験において、ヒト単球−マクロファージＴＨＰ１を、葉酸アンタゴニストの抗増殖効果に対して試験した。この目的のために、１．２５×１０５細胞を含有する１ｍｌの細胞懸濁液を、２４ウェルの組織培養プレートの個々のウェルに入れ、そして８種の濃度（２．５倍の増加で）の葉酸アンタゴニスト薬物と共にインキュベートした。７２時間の薬物暴露後、血球計算器で細胞の計数を行い、そして生存率をトリパンブルー排除によって確認した。
【００７０】
結果
滑膜組織のＦＲ−βの免疫組織化学的検査
全てのＲＡの滑膜組織の免疫組織化学的染色は、内膜のライニング層並びに滑膜下部ライニング中のＦＲ−βの高い発現を示した。ＦＲ−βに対する染色パターンは、３Ａ５（マクロファージ）染色と一致し、一方Ｔ−細胞領域は、染色を示さなかった（図１Ａ−Ｃ）。事実、更に詳細な蛍光顕微鏡分析は、滑膜組織の浸潤性マクロファージ及び内膜マクロファージの細胞膜上の、ＦＲ−β及びＣＤ６８（マクロファージマーカー）の共局在を証明した（図１Ｄ−Ｆ）。対照の整形外科の非炎症性滑膜組織におけるＦＲ−βに対する染色は、マクロファージの低い数と一致して、観察されなかった（示していない）。
【００７１】
染色の結果を、コンピュータ支援のデジタル画像分析によって分析した。有意な相関が滑膜下部ライニング層中の３Ａ５及びＦＲ−β発現間に見出された（細胞数／ｍｍ２）（ｐ＝０．０４）（図２Ａ）。活動性細胞数の中位値／ｍｍ２は、ＦＲ−βに対して１２６（範囲９−６３０）及び３Ａ５に対して２１９（範囲１１−６２２）であった。マクロファージの中位数は、ＭＴＸによる４ヶ月の治療によって減少した（滑膜下部ライニング層の活動性細胞数は２１９から１１９／ｍｍ２へ、ｐ＝０．１４）。ＭＴＸによる４ヶ月の治療後のＦＲ−βの発現は、ＤＡＳ２８の改良（△ＤＡＳ２８）と正に相関した（ｒ＝０．３１）が、統計的有意には達しなかった（ｐ＝０．１１）（図２Ｂ）。
【００７２】
ＲＡ患者のＲＡ滑膜細胞及び末梢血細胞中のＦＲ−βのｍＲＮＡの発現
滑膜組織中のＦＲ−βの発現差異を更に確認するために、ＦＲ−βのｍＲＮＡレベルを、リンパ球、ｅｘ ｖｉｖｏで活性化されたＴ−細胞、及び末梢血単球、並びにｅｘ ｖｉｖｏで単球由来のマクロファージを含むＲＡ患者の末梢血細胞のものと比較するように滑膜組織生検体中のＰＣＲ分析によって決定した。ＦＲ−βのｍＲＮＡレベルをＣＨＯ−ＦＲ−β細胞（１００％に設定）と比較して示す。ＦＲ−βのｍＲＮＡ発現の順位は、ＲＡ−滑膜組織において最高（ＣＨＯ−β細胞と比較して１７％の中位値）であり＞ｅｘ ｖｉｖｏの単球由来のマクロファージ（ＣＨＯ−β細胞と比較して３％）＞末梢血リンパ球（ＰＢＬ）（０．７％）＞＞単球（０．０２％）、そしてｅｘ ｖｉｖｏで活性化されたＴ−細胞（＜０．００１％）であった（図３）。
【００７３】
葉酸アンタゴニストに対するＦＲ−β対ＦＲ−αの結合親和性
選択された葉酸アンタゴニストに対するＦＲ−αの結合親和性は、Ｗｅｓｔｅｒｈｏｆ ｅｔ ａｌによって以前に報告されていたが、しかしこれらが、ＦＲ−βアイソフォームとどの程度重複し又は異なっているかは確立されていなかった。この目的のために、ＤＨＦＲ、ＴＳ、及びＧＡＲＴＦアーゼの一連の葉酸ベース阻害剤に対するＦＲ−βによる結合親和性対ＦＲ−αを決定し、そして図４に示した。葉酸に関しては、ＦＲ−β及びＦＲ−αの両方は、ＤＨＦＲの葉酸アンタゴニスト阻害剤の群に対してやや低い親和性を示した。ＭＴＸに対するＦＲ−βの親和性は、葉酸に対するものより概略５０倍低い。ＰＴ５２３に対する結合親和性は、ＭＴＸに対するものより顕著に低く（葉酸の０．３％）、一方ＰＴ５２３の５−メチル類似体であるＰＴ６４４は、ＭＴＸに対比する親和性を示した。注目すべきは、ＦＲ−αは、全ての試験された葉酸ベースのＴＳ阻害剤に対して良好な親和性を示すが、しかしペメトレキセド、ラルチトレキセド及びＢＧＣ９３３１に対するＦＲ−βの結合親和性は、ＦＲ−αより顕著に低かった（１６−３０倍）。ＦＲ−βの高い結合親和性の保持は、ＴＳ阻害剤ＣＢ３００６３５（葉酸の１６１％）及び（６ＲＳ）−ＢＧＣ９４５（葉酸の８９％）並びに（６Ｓ）−ＢＧＣ９４５（葉酸の４６％）に対して観察された。ＦＲ−βは、更にＧＡＲＴＦアーゼ阻害剤ＤＤＡＴＨＦ（葉酸の２７％）、及びＡＧ２０３４（葉酸の５４％）に対して熟達した結合親和性を示したが、ＦＲ−αのこれらの化合物に対する親和性は２．５倍高かった。まとめれば、これらの結果は、葉酸アンタゴニストに対するＦＲ−βの結合親和性における幅広い差を証明し、これらの中で、幾つかの葉酸アンタゴニストはＭＴＸに対するより顕著に高い結合親和性を明らかにした。
【００７４】
ＦＲ−βを発現している細胞の葉酸アンタゴニスト誘導の増殖阻害
現在の研究において使用される葉酸アンタゴニストが、マクロファージ様型の細胞に対して潜在的な増殖阻害効果をすべて伝達するものであるか否かを研究するために、このパラメータをヒト単球−マクロファージＴＨＰ１細胞に対して研究した（表１）。ＴＨＰ１細胞の主要な輸送経路としてのＲＦＣと一致して、強力な増殖阻害効果が、ＲＦＣに対して不良な親和性を有する二つの化合物ＣＢ３００６３５及びＢＧＣ９４５を除く、全ての葉酸アンタゴニストに対して観察された。ＴＨＰ１細胞系はＦＲ−陰性であるため（活性化された滑膜マクロファージとは対照的に）、ＦＲ−βが最高の結合親和性を示した三つの葉酸アンタゴニスト（ＣＢ３００６３５、ＡＧ２０３４及びＢＧＣ９４５）を、ＣＨＯ−ＦＲ−β細胞の細胞増殖阻害を誘発することによって、ＦＲ−βを標的とするその効力に対して評価した。ＣＨＯ／ＷＴ細胞に対して、ＢＧＣ９４５のみが＞１０００ｎＭの細胞外濃度において増殖阻害を誘導した（図５Ａ）。顕著なことは、ＣＨＯ／ＦＲ−β細胞の増殖阻害は、ＢＧＣ９４５の顕著に低い濃度（１０−５０ｎＭ）において誘導された。これらの細胞培養物への葉酸の添加は、ＦＲの遮断と一致して、ＢＧＣ９４５の活性を完全に抑制した。ＦＲ−βに対して最高の結合親和性を示したにもかかわらず、ＣＢ３００６３５は、ＣＨＯ／ＦＲ−β細胞の増殖阻害を誘導することにおいて顕著に強力ではない（図５Ｂ）。葉酸の同時投与がＣＢ３００６３５の活性を抑制する概念は、ＦＲ−βが、この化合物の細胞内取込みに関係することを示唆している。最後にＡＧ２０３４は、細胞への進入のための経路として恒常的に発現するＲＦＣ及びＦＲの両方を使用することができる（図５）。このように、ＡＧ２０３４は、ＣＨＯ／ＷＴ細胞に、そして広い範囲のＣＨＯ／ＦＲ−β細胞に対して増殖阻害の潜在性を示す（図５Ｃ／Ｄ）。同時に、ＦＲ−β遮断（葉酸で）及びＲＦＣ遮断（ＬＶで）によるＡＧ２０３４の増殖阻害効果の抑制は、部分的のみである（図５Ｃ／Ｄ）。
【００７５】
考察
ＭＴＸがＲＡの治療のための多くの治療管理における主力薬物であるために、ＭＴＸに対する治療反応を予想及び／又は改良することにおいて援助することができる遺伝子的、生化学的及び代謝的パラメーターの説明は、少なからぬ最近の興味を受けている。本研究は、活性化された滑膜のマクロファージにおいて、葉酸受容体βアイソフォームによって主として仲介される、ＭＴＸの細胞膜輸送の役割に特異的に焦点を当てている。ＦＲと恒常的に発現するＲＦＣの分子並びに機能的特質が少なからず異なっているという概念を仮定すれば、ＦＲ−βの特質のよりよい理解は、ＲＦＣよりもＦＲ−βを選択的に標的化することによってよりよい治療手段（ａ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）を促進するかもしれない。
【００７６】
本明細書において、本出願人等は、ＦＲ−β発現が主としてＲＡ患者の内膜ライニング層及び滑膜下部ライニング中にマクロファージと共局在し、そして従って葉酸アンタゴニストに対して魅力ある標的であることができることを示した。その幾つかは証明された抗癌活性を持つ一連の第二世代の葉酸アンタゴニストの結合親和性に対するスクリーニングにより、ＤＨＦＲ阻害剤の群が全てやや低いＦＲ−β親和性を有することが明らかにされた。これは、ＦＲのαアイソフォームが、以前に報告された２，４−ＮＨ２−ベースの構造を持つ葉酸アンタゴニストに対して低い親和性を有することを証明する、構造と活性の関係と一致する（表２参照）。興味あることには、ＦＲαがチミジル酸シンターゼの全ての試験された葉酸ベース阻害剤に対する比較的高い結合親和性を証明したが、一方ＦＲ−βに対して、これは、３環構造及び／又はグルタミン酸側鎖修飾の共通の化学的特質を共有する三つの化合物（ＣＢ３００６３５、ＧＷ１８４３及びＢＧＣ９４５）に対してのみ保持された（表２及び３参照）。後者の修飾は、更にＲＦＣによって輸送されるその能力を顕著に抑制し、そして従って、より大きいＦＲの選択性に寄与する。事実、ＢＧＣ９４５によるＦＲ−αに対する、そしてＲＦＣではない選択的標的化は、ＦＲαを過剰発現している細胞系において証明された。葉酸ベースＴＳ阻害剤に加えて、ＦＲ−βも、葉酸ベースＧＡＲＴＦアーゼ阻害剤（ＡＧ２０３４及びＤＤＡＴＨＥ）に対して中ないし高結合親和性を示し、これは、これらを、ＲＦＣ及びＦＲの両方によって輸送されることができる葉酸アンタゴニスト薬物として分類する。
【００７７】
ＦＲ−βで形質移入されたＣＨＯ細胞を、抗増殖効果を伝達することによる葉酸アンタゴニストのＦＲ−βで仲介される細胞取込みの効率を評価するためのモデル系として使用した。この細胞系モデルは、［３Ｈ］−葉酸結合レベル及びＲＡ患者の滑膜組織中のＦＲ−βのｍＲＮＡレベルと適合性であるＦＲ−βのｍＲＮＡレベルに基づき、臨床的に典型的であることができる（図４）。対照の（ＲＦＣを発現している）ＣＨＯ細胞とＦＲ−βで形質移入された細胞との間の活性の最大の差は、ＲＦＣによる輸送に対する不良な親和性及び高いＦＲ−β結合親和性と一致して、ＢＧＣ９４５に対して観察される。ＢＧＣ９４５のＦＲ−βで仲介される取込みは、過剰の葉酸による受容体の遮断によって阻害することができ、滑膜組織／血漿中を循環する天然の葉酸塩が、受容体占有／競合又は受容体下方制御のいずれかによって、ｉｎ ｖｉｖｏのＢＧＣ９４５の潜在的活性を減弱することができることを暗示した。
【００７８】
実施例２：本発明の化合物
表３は、本発明の以下の化合物の構造を示す：
・ＣＢ３００６３８（ＢＧＣ６３８） ・ＣＢ３００９４４
・（６Ｓ）−ＣＢ３００６３８ ・ＣＢ３００９４５（ＢＧＣ９４５）
・ＣＢ３００９３５ ・（６Ｓ）−ＣＢ３００９４５
・ＣＢ３００９３６ ・ＣＢ３００９４７
・ＣＢ３００９４０ ・ＣＢ３００９５１。
【００７９】
これらは、ＷＯ９４／１１３５４Ａ１、ＷＯ０３／０２０３００Ａ１、ＷＯ０３／０２０７０６Ａ１、ＷＯ０３／０２０７４８Ａ１、Ｊ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０００，４３，１９１０−１９２６、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６３（７），２００７，１５３７−１５４３（Ｂａｖｅｔｓｉａｓ ｅｔ ａｌ．）及びＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６５，２００５，１１７２１−１１７２８（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ）中に与えられた方法によって調製した。
【００８０】
実施例３：製剤
以下は、式（Ｉ）のシクロペンタ［ｇ］キナゾリンを、特に医薬的に受容可能な塩の形態で含有する、ヒトにおける治療的又は予防的使用のための代表的な医薬的剤形を例示する：
（ａ）錠剤Ｉ ｍｇ／錠剤
シクロペンタ［ｇ］キナゾリン塩 １００
ラクトース 欧州局方 １８２．７５
クロスカルメロースナトリウム １２．０
トウモロコシデンプンペースト（５重量／容量％のペースト）２．２５
ステアリン酸マグネシウム ３．０。
【００８１】
（ｂ）錠剤ＩＩ ｍｇ／錠剤
シクロペンタ［ｇ］キナゾリン塩 ５０
ラクトース 欧州局方 ２２３．７５
クロスカルメロースナトリウム ６．０
トウモロコシデンプン １５．０
ポリビニルピロリドン（５重量／容量％のペースト） ２．２５
ステアリン酸マグネシウム ３．０。
【００８２】
（ｃ）錠剤ＩＩＩ ｍｇ／錠剤
シクロペンタ［ｇ］キナゾリン塩 １．０
ラクトース 欧州局方 ９３．２５
クロスカルメロースナトリウム ４．０
トウモロコシデンプンペースト（５重量／容量％のペースト）０．７５
ステアリン酸マグネシウム １．０。
【００８３】
（ｄ）カプセル ｍｇ／カプセル
シクロペンタ［ｇ］キナゾリン塩 １０．０
ラクトース 欧州局方 ４８８．５
ステアリン酸マグネシウム １．５。
【００８４】
（ｅ）注射I （５０ｍｇ／ｍｌ）
シクロペンタ［ｇ］キナゾリン塩 ５．０重量／容量％
１Ｍ水酸化ナトリウム溶液 １５．０容量／容量％
０．１Ｍ塩酸 （ｐＨを７．６に調節）
ポリエチレングリコール４００ ４．５重量／容量％
注射用水 １００％まで。
【００８５】
（ｆ）注射ＩＩ （１０ｍｇ／ｍｌ）
シクロペンタ［ｇ］キナゾリン塩 １．０重量／容量％
リン酸ナトリウムＢＰ ３．６重量／容量％
０．１Ｍ塩酸溶液 １５．０容量／容量％
注射用水 １００％まで。
【００８６】
（ｇ）注射ＩＩＩ （１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ６に緩衝）
シクロペンタ［ｇ］キナゾリン塩 ０．１重量／容量％
リン酸ナトリウムＢＰ ２．２６重量／容量％
クエン酸 ０．３８重量／容量％
ポリエチレングリコール４００ ３．５重量／容量％
注射用水 １００％まで。
【００８７】
上記の製剤は、製薬技術において公知の慣用的な方法によって調製することができる。錠剤（ａ）ないし（ｃ）は、慣用的な手段によって、例えば酢酸フタル酸セルロースの被覆で腸溶被覆することができる。
【００８８】
表１．ヒト単球−マクロファージＴＨＰ１細胞＃に対する葉酸アンタゴニストの増殖阻害効果
【００８９】
【表１】
【００９０】
＃ＴＨＰ１細胞は、２．２μＭの葉酸（これはいずれものＦＲ活性を遮断するものである）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖した。
薬物暴露時間；７２時間。結果は三つの別個の実験の平均±Ｓ．Ｄ．である。
【００９１】
表２．比較化合物の構造
【００９２】
【表２−１】
【００９３】
【表２−２】
【００９４】
表３．本発明の化合物の構造
【００９５】
【表３−１】
【００９６】
【表３−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のための以下の式（Ｉ）：
【化１】
［式中：
Ｒ１は、アミノ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ヒドロキシアルキル、Ｃ１−４フルオロアルキル又はメトキシ−Ｃ１−４アルキルであり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−４アルケニル、Ｃ３−４アルキニル、Ｃ２−４ヒドロキシアルキル Ｃ２−４ハロゲノ−アルキル又はＣ１−４シアノアルキルであり；そして
Ａｒは、フェニレン、チオフェンジイル、チアゾールジイル、ピリジンジイル又はピリミジンジイルであり、これらは、ハロゲノ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、Ｃ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシから選択される一つ又は二つの置換基を所望により保有することができる。］
のＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕジペプチド基を含有するシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体であって、化合物（Ｉ）は、所望により医薬的に受容可能な塩又はエステルであってもよい；前記化合物。
【請求項２】
Ｒ１が、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４ヒドロキシアルキルである、請求項１に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項３】
Ｒ１が、メチル又はヒドロキシメチルである、請求項２に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項４】
Ｒ２が、メチル、エチル、プロピル、プロパ−２−エニル、プロパ−２−イニル、２−ヒドロキシエチル、２−フルオロエチル、２−ブロモエチル又は２−シアノエチルである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項５】
Ｒ２が、メチル又はプロパ−２−イニルである、請求項４に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項６】
Ａｒが、クロロ及び特にフルオロからなる群から選択される一つ又は二つの置換基を所望により保有してもよい１，４−フェニレン、チオフェン−２，５−ジイル、チアゾール−２，５−ジイル或いはピリジン−２，５−ジイルである、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項７】
Ａｒが、１，４−フェニレン、一つの２−フルオロ置換基を有する１，４−フェニレン又はピリジン−２，５−ジイルである、請求項６に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項８】
Ａｒが、１，４−フェニレン又は２−フルオロ−１，４−フェニレンである、請求項７に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項９】
前記シクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体が：
Ｎ−｛Ｎ−｛４−［Ｎ−（２−メチル−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロパ−２−イニル）アミノ］ベンゾイル｝−Ｌ−γ−グルタミル｝−Ｄ−グルタミン酸；又は
Ｎ−｛Ｎ−｛４−［Ｎ−（２−ヒドロキシメチル−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ｇ］−キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロパ−２−イニル）アミノ］ベンゾイル｝−Ｌ−γ−グルタミル｝−Ｄ−グルタミン酸；
或いは医薬的に受容可能なこれらの塩又はエステル；
を含んでなる、請求項１に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項１０】
前記シクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体が、その６Ｓ異性体として存在する、請求項９に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項１１】
前記シクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体が、医薬的に受容可能な希釈剤又は担体と一緒に投与される、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項１２】
リウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のための、このような治療を必要とする患者において、有効な量の請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体を、前記患者に投与することを含んでなる方法。
【請求項１】
リウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のための以下の式（Ｉ）：
【化１】
［式中：
Ｒ１は、アミノ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ヒドロキシアルキル、Ｃ１−４フルオロアルキル又はメトキシ−Ｃ１−４アルキルであり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ３−４アルケニル、Ｃ３−４アルキニル、Ｃ２−４ヒドロキシアルキル Ｃ２−４ハロゲノ−アルキル又はＣ１−４シアノアルキルであり；そして
Ａｒは、フェニレン、チオフェンジイル、チアゾールジイル、ピリジンジイル又はピリミジンジイルであり、これらは、ハロゲノ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、Ｃ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシから選択される一つ又は二つの置換基を所望により保有することができる。］
のＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕジペプチド基を含有するシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体であって、化合物（Ｉ）は、所望により医薬的に受容可能な塩又はエステルであってもよい；前記化合物。
【請求項２】
Ｒ１が、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４ヒドロキシアルキルである、請求項１に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項３】
Ｒ１が、メチル又はヒドロキシメチルである、請求項２に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項４】
Ｒ２が、メチル、エチル、プロピル、プロパ−２−エニル、プロパ−２−イニル、２−ヒドロキシエチル、２−フルオロエチル、２−ブロモエチル又は２−シアノエチルである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項５】
Ｒ２が、メチル又はプロパ−２−イニルである、請求項４に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項６】
Ａｒが、クロロ及び特にフルオロからなる群から選択される一つ又は二つの置換基を所望により保有してもよい１，４−フェニレン、チオフェン−２，５−ジイル、チアゾール−２，５−ジイル或いはピリジン−２，５−ジイルである、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項７】
Ａｒが、１，４−フェニレン、一つの２−フルオロ置換基を有する１，４−フェニレン又はピリジン−２，５−ジイルである、請求項６に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項８】
Ａｒが、１，４−フェニレン又は２−フルオロ−１，４−フェニレンである、請求項７に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項９】
前記シクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体が：
Ｎ−｛Ｎ−｛４−［Ｎ−（２−メチル−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロパ−２−イニル）アミノ］ベンゾイル｝−Ｌ−γ−グルタミル｝−Ｄ−グルタミン酸；又は
Ｎ−｛Ｎ−｛４−［Ｎ−（２−ヒドロキシメチル−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−６Ｈ−シクロペンタ［ｇ］−キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロパ−２−イニル）アミノ］ベンゾイル｝−Ｌ−γ−グルタミル｝−Ｄ−グルタミン酸；
或いは医薬的に受容可能なこれらの塩又はエステル；
を含んでなる、請求項１に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項１０】
前記シクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体が、その６Ｓ異性体として存在する、請求項９に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項１１】
前記シクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体が、医薬的に受容可能な希釈剤又は担体と一緒に投与される、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のリウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のためのシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体。
【請求項１２】
リウマチ様関節炎又は急性骨髄性白血病の治療のための、このような治療を必要とする患者において、有効な量の請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のシクロペンタ［ｇ］キナゾリン誘導体を、前記患者に投与することを含んでなる方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１１−５１５３８４（Ｐ２０１１−５１５３８４Ａ）
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５００２８２（Ｐ２０１１−５００２８２）
【出願日】平成２１年３月１３日（２００９．３．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００６８７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１５７７６
【国際公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【出願人】（５００４３１５０８）ビーティージー・インターナショナル・リミテッド (41)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１３日（２００９．３．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００６８７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１５７７６
【国際公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【出願人】（５００４３１５０８）ビーティージー・インターナショナル・リミテッド (41)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]