リグノセルロース系バイオマスを用いた糖化液の製造方法
【課題】リグノセルロース系バイオマスから、効率よく糖化液を製造することを目的とする。
【解決手段】本発明は、リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程と、得られた粉砕物を加水分解酵素を用いて加水分解する工程とを含む、糖化液の製造方法である。また、該糖化液を含む培地で微生物を培養することによる、微生物代謝産物の製造方法を提供する。
【解決手段】本発明は、リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程と、得られた粉砕物を加水分解酵素を用いて加水分解する工程とを含む、糖化液の製造方法である。また、該糖化液を含む培地で微生物を培養することによる、微生物代謝産物の製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグノセルロース系バイオマスを用いた糖化液の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業革命以来、燃料や化学品の原料として、化石燃料、特に石油が大量に消費されてきた。その結果、今日、二酸化炭素などの温室効果ガスによる地球温暖化は、もはや一刻の猶予もないほど深刻化しており、さらに、石油の可採年数が数十年との予測もなされている。そこで、石油に取って替わる、地球に優しい新たな資源の確保が急務となっている。
【０００３】
これらの問題の一つの解決策として、バイオマス（再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたもの）から燃料や化学品の原料を生産しようとする、バイオリファイナリーの研究・開発が世界各地で進められている。
【０００４】
こうしたバイオリファイナリー技術の中でも、バイオマスエタノール（以下、「バイオエタノール」とも称する）は、近年、実用化の段階にまで差し掛かってきており、トウモロコシやサトウキビなどの可食部に含まれるデンプン質または糖質を用いたエタノール生産が、米国やブラジルなどで大規模に行われている。しかしながら、これらの食糧資源をバイオエタノールの原料とすることで、食糧価格の高騰や、発展途上国での深刻な食糧不足を引き起こすことが懸念されている。本発明者は、こうした状況を鑑みて、作物の非可食部である葉や茎など（ソフトバイオマス）、あるいは木材など（ハードバイオマス）に含まれるリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオリファイナリー技術の開発に取り組んできた。
【０００５】
一般に、バイオリファイナリーにおいては、まずバイオマスに含まれる多糖類を加水分解（以下、「糖化」とも称する）することによって、単糖類を含む糖化液を得る。そしてこの単糖類から微生物を用いた発酵等により、各種化学品を得る。しかしながら、作物の葉や茎または木材のようなリグノセルロース系バイオマスは、構造性多糖であるセルロースに芳香族化合物の重合体であるリグニンおよびヘミセルロースが強固に結合する構造を有しており、デンプン質や糖質を主成分とするデンプン系バイオマスや糖質系バイオマスと比較して、加水分解反応の効率が著しく低いことが知られている。
【０００６】
これらの理由から、従来のリグノセルロース系バイオマスの加水分解反応においては、酸またはアルカリを用いた化学的な加水分解法が用いられていた（例えば、非特許文献１〜４参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】大深正徳 他、「デンプン・セルロース系混合原料の酸糖化液のエタノール発酵特性」、寒地土木研究所月報、２００７年、６５１、ｐ．１９−２０
【非特許文献２】Ｈａｊｉｍｅ Ｍｉｎａｔｏ、“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｉｃｅ Ｓｔｒａｗ ｏｎ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｄｒｙ Ｍａｔｔｅｒ”、Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ、（１９７７）、７０、ｐ．６１−６６
【非特許文献３】Ｅ．Ｙｕ Ｖａｌｅｎｓｃｏ、Ｈ．Ｄｉｎｇ、Ｊ．Ｍ．Ｌａｂａｖｉｔｃｈ、ａｎｄ Ｓ．Ｐ．Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ Ｒｉｃｅ Ｓｔｒａｗ”、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９９７）、５、ｐ．１０９−１１９
【非特許文献４】Ｎｉｃｏｌｅｔｔａ Ｃｕｒｒｅｊｉ、Ｍａｒｉｏ Ａｇｅｌｌｉ、Ｂｒｕｎｅｌｌａ Ｐｉｓｕ、Ａｎｔｏｎｉｏ Ｒｅｃｉｇｎｏ、Ｅｎｒｉｃｏ Ｓａｎｊｕｓｔ、ａｎｄ Ａｕｇｕｓｔｏ Ｒｉｎａｌｄｉ、“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｗｈｅａｔ Ｓｔｒａｗ”、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（２００２）、３７、ｐ．９３７−９４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、かような化学的加水分解法では、リグノセルロース系バイオマスを強酸性または強アルカリ性条件下で加水分解する必要があるため、大量の酸またはアルカリ試薬を要する。このような化学的加水分解法を工業的規模で行うとすると、環境汚染の観点からも好ましくない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の問題を解決すべく、リグノセルロース系バイオマスから、効率よく糖化液を製造するため、鋭意研究を行った。その結果、リグノセルロース系バイオマスを粉砕し、該粉砕物を加水分解酵素を用いて加水分解することによって、高効率で加水分解反応が進行することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程と、得られた粉砕物を加水分解酵素を用いて加水分解する工程とを含む、糖化液の製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、リグノセルロース系バイオマスから、効率よく糖化液を製造することができる。該製造方法は、従来のように酸またはアルカリといった化学薬品を大量に使用しないため、環境に優しいバイオリファイナリー技術の構築に貢献しうる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の好ましい実施形態を説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、以下の形態のみに制限されない。
【００１３】
本実施形態は、リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程と、得られた粉砕物を加水分解酵素を用いて加水分解する工程とを含む、糖化液の製造方法に関する。
【００１４】
［糖化液の製造方法］
まず、リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程について説明する。
【００１５】
本発明において、「リグノセルロース系バイオマス」とは、セルロース、ヘミセルロース、およびリグニンを主成分とするバイオマスを意味する。リグノセルロース系バイオマスとしては、上記成分を主成分として含むバイオマスであれば特に制限なく用いることができるが、具体例としては、稲わら、籾殻、麦わら、バガス、ヤシ殻、コーンコブ、雑草、木材、パルプ、および紙などが挙げられる。さらに、食品産業、建築業、家庭から排出される廃棄物なども含まれうる。これらのリグノセルロース系バイオマスは、従来、そのほとんどが焼却によって廃棄処理されてきたが、本発明により、これらのリグノセルロース系バイオマスを資源として有効利用することができる。
【００１６】
リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程において、粉砕としては、湿式粉砕および乾式粉砕などの従来公知の方法を適宜用いることができる。このうち、より高い糖化率が達成可能な、乾式粉砕であることが好ましい。乾式粉砕に用いる装置としては、例えば、ボールミル、タワーミルなどの媒体ミル、ハンマーミル、ピンミルなどの衝撃式ミル、ジェットミルなどが挙げられる。また、湿式粉砕に用いる装置としては、例えば、ホモジナイザー、パールミル、マスコロイダーなどが挙げられる。これらの粉砕装置は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、効率よく粉砕するために、リグノセルロース系バイオマスを予め１〜５ｃｍ程度に裁断、あるいは１〜１０ｍｍ程度に粗粉砕しておくことが好ましい。
【００１７】
リグノセルロース系バイオマスを粉砕した粉砕物の粒度は、特に制限はないが、好ましくは０．０１〜１．０ｍｍであり、より好ましくは０．１〜１．０ｍｍである。リグノセルロース系バイオマスをかような粒度に粉砕することによって、続く加水分解反応の効率が著しく向上する。粒度の下限値は特に制限はないが、取り扱いの容易さの観点からは０．０１ｍｍ以上であることが好ましい。同じく、加水分解反応の効率化の観点から、粉砕物の粒度は可能な限り均一であることが好ましいが、工業的に大量のリグノセルロース系バイオマスを粉砕することを考慮すると、粉砕物の全質量（乾燥質量換算）に対して、５０質量％以上、好ましくは７０質量％以上、より好ましくは８０質量％以上、さらに好ましくは９０質量％以上、特に好ましくは９８質量％以上の粉砕物の粒度が１．０ｍｍ未満となるように粉砕する。なお、本発明において「粒度」とは、下記実施例で用いた方法によって測定した値を採用する。
【００１８】
続いて、上記粉砕物を加水分解酵素（以下、単に「酵素」とも称する）を用いて加水分解する工程について説明する。
【００１９】
本発明において、加水分解酵素は、リグノセルロース系バイオマスに含まれる多糖類（オリゴ糖を含む）のグリコシド結合を切断して単糖類へと加水分解する役割を果たす。加水分解酵素は、様々な形態のものが使用できる。例えば、微生物などの生体内で産生される加水分解酵素を該生体内から分離した酵素製剤の形態であってもよいし、生体内に含まれたままの状態で微生物などを培養することによって酵素反応を行わせるものであってもよい。
【００２０】
リグノセルロース系バイオマスには、セルロース、ヘミセルロース、およびデンプンなどの多糖類（オリゴ糖を含む）が含まれる。セルロースはグルコースがβ−１，４−グリコシド結合により重合した直鎖状の多糖類である。ヘミセルロースはセルロースと共に植物細胞壁を構成するセルロース以外の多糖類であって、ホモ多糖類およびヘテロ多糖類の総称をいう。ヘミセルロースとしては、例えば、マンナン、グルコマンナン、グルコキシラン、ガラクタン、キシラン、アラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、ペクチン、キチン、ガラクトグルコマンナン、クロノキシラン、キシログルカンなどが挙げられる。デンプンは、グルコースがα−１，４−グリコシド結合および／またはα−１，６−グリコシド結合により重合した、らせん状または網目状構造を有する多糖類である。上記のリグノセルロース系バイオマスに含まれる多糖類を加水分解することによって得られる単糖類としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、キシロース、およびアラビノースなどの単糖類、ガラクツロン酸、グルクロン酸などのウロン酸、水酸基がエステル化されたエステル誘導体、水酸基がメチル基などで誘導体化されたアルキル誘導体が生成される。
【００２１】
リグノセルロース系バイオマスに含まれる多糖類としては、上述のように、セルロース、ヘミセルロース、およびデンプンなどが挙げられる。セルロースの加水分解酵素（セルラーゼ）としては、セルロースのβ−１，４−グリコシド結合を切断できる酵素であれば特に制限はないが、例えば、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エキソ−β−１，４ーグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、およびカルボキシメチルセルラーゼが挙げられる。ヘミセルロースの加水分解酵素（ヘミセルラーゼ）としては、ヘミセルロースのグリコシド結合を切断できる酵素であれば特に制限なく用いることができるが、例えば、β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、マンノシダーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチナーゼなどが挙げられる。デンプンの加水分解酵素（アミラーゼ）としては、デンプンのグリコシド結合を切断できる酵素であれば特に制限なく用いることができるが、例えば、α−１，４−グリコシド結合および／またはα−１，６−グリコシド結合を切断できるα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、およびプルラナーゼなどが挙げられる。これらの加水分解酵素は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよいが、リグノセルロース系バイオマスには上述のように様々なグリコシド結合を有する多糖類が含まれているので、反応性の異なる加水分解酵素を２種以上組み合わせて用いることが好ましい。
【００２２】
上記加水分解酵素は、リグノセルロース系バイオマスを加水分解可能な微生物などの生体中で産生されうる。後述の微生物代謝産物を産生する微生物と区別するために、以下、リグノセルロース系バイオマスを加水分解可能な微生物を「加水分解酵素産生微生物」とも称する。通常、加水分解酵素産生微生物は、上記の反応性の異なる数種の加水分解酵素を産生するので、加水分解反応には、この数種の加水分解酵素を含む酵素群が用いられる。酵素群に含まれる各加水分解酵素成分の組成は、産生する加水分解酵素産生微生物の種類により異なることが知られている。リグノセルロース系バイオマスに含まれる各種グリコシド結合の加水分解反応は、その各種グリコシド結合を切断可能な加水分解酵素の組成に左右されるので、リグノセルロース系バイオマスに含まれる種々のグリコシド結合を効率よく切断できるような酵素組成を有する酵素群を用いることが好ましい。上記の加水分解酵素を産生する酵素産生微生物としては、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、シゾゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、およびテルモモノスポラ属（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）に属する微生物が知られている。このうち、高いリグノセルロース系バイオマス分解能を有する加水分解酵素を産生する、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アクレモニウム・テルモフィルム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ），トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、アスペルギルス・アクレタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・フミガータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギウス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、フサリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、シゾフィラム・コムネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）、クロストリジウム・テルモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）、およびテルモモノスポラ・クルバタ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｒｖａｔａ）からなる群から選択される加水分解酵素産生微生物が産生する加水分解酵素を用いることが好ましい。なお、リグノセルロース系バイオマス分解能に悪影響を及ぼさない範囲において、これらの加水分解酵素産生微生物の変異体が産生する加水分解酵素も用いることができる。
【００２３】
本発明における加水分解酵素は、上記の加水分解酵素産生微生物が産生した酵素を、微生物の生体内から分離した、酵素製剤の形態であってもよく、あるいは、固定化酵素の形態であってもよい。上記加水分解酵素産生微生物から分離された加水分解酵素としては、メイセラーゼ（明治製菓株式会社製）、スミチームＣ（新日本化学工業株式会社製）、スミチームＸ（新日本化学工業株式会社製）、ヘミセルラーゼ「アマノ」９０（天野エンザイム株式会社製）、グリンドアミルＨ（ダニスコ ジャパン株式会社製）、およびペントパン（ノボザイムズ ジャパン株式会社製）などが挙げられる。このうち、特に高い加水分解能を有する、メイセラーゼ、およびスミチームＣを用いることが好ましい。
【００２４】
本発明おける加水分解反応は、従来公知の方法を適宜採用して行うことができる。まず、上記のリグノセルロース系バイオマスの粉砕物を水性媒体に懸濁して懸濁液を調製する。水性媒体は加水分解酵素が失活しない範囲においては特に制限はないが、水、緩衝液、酸性水溶液、またはアルカリ性水溶液を用いることが好ましい。懸濁液中に含まれるリグノセルロース系バイオマスの粉砕物の濃度は、水性媒体に対して、通常、５０〜３００ｇ／Ｌであり、好ましくは１００〜２００ｇ／Ｌである。例えば、加水分解酵素産生微生物を培養することによって糖化液を製造する場合においては、ｐＨは通常３〜９であり、好ましくは４〜７である。また、培養温度は通常２０〜５０℃であり、好ましくは３０〜３７℃である。培養時間は通常１２〜１４４時間であり、好ましくは２４〜７２時間である。また、加水分解反応は、リグノセルロース系バイオマスの粉砕物の懸濁液中に加水分解酵素を添加し、該懸濁液をインキュベートすることによっても行われうる。懸濁液に添加する酵素量は、懸濁するリグノセルロース系バイオマスの粉砕物の質量に対し、好ましくは０．１〜１質量％である。かような量の酵素を用いることによって、通常１２〜１４４時間、好ましくは２４〜７２時間で加水分解反応が完了しうる。また、加水分解条件は、用いる酵素の至適条件を用いることが好ましい。ｐＨは通常３〜８であり、好ましくは４〜６である。また、反応温度は通常３０〜６０℃であり、好ましくは４０〜５０℃である。
【００２５】
加水分解反応終了後の糖化液は、糖化液中の不溶物を適宜ろ過してもよいし、そのままの状態で次の微生物代謝産物の製造に供しても構わない。撹拌効率および収率向上の観点の観点からは糖化液中の不溶物を予めろ過することが好ましい。
【００２６】
また、リグノセルロース系バイオマスの粉砕物は、反応効率向上の観点から、加水分解反応に供する前に蒸煮処理を行うことが好ましい。蒸煮処理は、従来公知の方法を用いることができる。さらに、加水分解反応の前に適宜酸またはアルカリ処理を行ってもよい。
【００２７】
上記製造方法によって製造される糖化液に含まれる単糖の質量（以下、「全糖量」とも称する）は、加水分解反応に供したリグノセルロース系バイオマスの粉砕物の全質量に対して、好ましくは１０〜９０質量％であり、より好ましくは、２０〜８０質量％であり、さらに好ましくは、３０〜７０質量％である。本製造方法によると、下記実施例でも示したが、６０％以上の高い糖化率で、リグノセルロース系バイオマスから単糖を得ることができる。
【００２８】
［微生物代謝産物の製造方法］
次に、上記製造方法によって製造された糖化液を含む培地で微生物を培養する工程を含む、微生物代謝産物の製造方法について説明する。
【００２９】
本発明で用いる培地は、上記の製造方法によって製造された糖化液を含む。培地は、一般的には、炭素源、窒素源、および無機塩を含むが、上記糖化液中に培養に必要なこれらの栄養源が十分に含まれている場合には、適宜濃度を調節した上記糖化液のみを用いることもできるし、必要によって、糖化液のほかに栄養源を添加することによって培地を調製してもよい。
【００３０】
培地に添加する炭素源としては、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース、およびキシロースなどの単糖、マルトース、ラクトース、およびスクロースなどの二糖、グリセリンおよびキシリトールなどの糖アルコールといった糖類が挙げられ、これらを単独であるいは２種以上を組み合わせて使用できる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、尿素、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、あるいは尿酸などの無機あるいは有機の窒素化合物が使用できる。さらに、窒素源としては、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、コーンスティープリカーなどの窒素含有天然物を使用してもよい。これらのうち、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、尿酸などの無機あるいは有機窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなの窒素含有天然物が好ましい。これらの窒素源は、単独であるいは２種以上を組み合わせて使用できる。無機物としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウムなどの、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄および亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩および酢酸塩などが用いられる。そのほか、チアミン、ビオチンなどのビタミン類、さらに必要に応じて、アデニン、ウラシルなどの核酸関連物質が使用されてもよい。これらの無機物は、単独であるいは２種以上を組み合わせて使用できる。
【００３１】
本発明では、上記培地に、微生物代謝産物を産生しうる微生物を添加し、培養することによって微生物代謝産物を生産する。本発明において、「微生物代謝産物」とは、微生物が生命維持のために外界から摂取した有機物あるいは無機物を、生命機能を利用して変換した物質を意味する。微生物代謝産物は、化学品またはその原料として用いることができるものであれば特に制限はないが、例えば、有機酸、アミノ酸、アルコール、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸塩基、脂質、飽和および不飽和脂肪酸、炭水化物、芳香族化合物、ビタミン、ならびに酵素などが挙げられる。このうち、有機酸は、酸性を示す有機化合物であれば特に制限はないが、酸性基としてカルボキシル基を有する化合物であることが好ましい。かような有機酸としては、具体的には、乳酸、フマル酸、イタコン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、グルタル酸、レブリン酸、プロピオン酸、グルコン酸、およびアコニット酸などが挙げられる。これらの有機酸のうち、乳酸、フマル酸、イタコン酸、リンゴ酸、またはピルビン酸であることが好ましい。乳酸は、生分解プラスチック原料、医薬品原料、食品添加物、飼料用添加物としても有用である。フマル酸は、ポリエステル樹脂原料、サイズ剤の原料、香料の原料、食品添加物、飼料用添加物として用いられうる。イタコン酸は、合成樹脂およびラテックスなどの改質剤、塗料原料、食品添加物として用いられうる。リンゴ酸は、飲料や食品の酸味料、ｐＨ調整剤、および乳化剤などに用いられうる。ピルビン酸は、香料、化粧品、および農薬等の原料として用いられうる。アルコールとしては、分子中に１〜６個のヒドロキシ基を有する化合物であれば特に制限はないが、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エタンジオール、プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、およびアラビニトールなどが挙げられる。これらのアルコールのうち、エタノールおよびキシリトールであることが好ましい。エタノールは、次世代の自動車燃料として期待されている。キシリトールは、う蝕抑制効果のある甘味料および糖尿病患者用の甘味料として用いられうる。この他にも、アミノ酸としては、リシン、グルタミン酸、メチオニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、およびトレオニン；ヌクレオチドとしては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）；不飽和脂肪酸としては、γ−リノレン酸、アラキドン酸、およびドコサヘキサエン酸；炭水化物としては、ヒアルロン酸およびトレハロース；芳香族化合物としては、芳香族アミン、バニリン、およびインジゴ；ビタミンとしては、アスコルビン酸、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、およびリボフラビン；酵素としては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼ等が挙げられる。
【００３２】
上記微生物代謝産物はこれらを産生しうる微生物を培養することによって製造されうる。これらの微生物としては、例えば、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｕ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシビヤ属（Ａｓｈｂｙａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナエロビオスピリルム属（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）に属する微生物が挙げられるが、これらに制限されるものではない。具体的には、パチソレン・タンノフィルス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アルペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、トルロプシス・グラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ・ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、アシビヤ・ゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｓ ｏｒｙｚａｅ）、アルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ）、アナエロビオスピリルム・スクシニプロデューセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、アクチノバチルス・スクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・レイクマニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・アラビノーサム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｒａｂｉｎｏｓｕｍ）、プロピオニバクテリウム・シャーマニー（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃｈｅｒｍａｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・フローデンレイチー（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、クロストリジウム・プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｌｉｃｕｍ）などが挙げられる。なかでも、乳酸を産生するＲｉｚｏｐｕｓ属、イタコン酸を生産するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、エタノールを産生するＰａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ、フマル酸を産生するＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、リンゴ酸を産生するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、ピルビン酸を産生するＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ、キシリトールを産生するＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、セルラーゼを産生するＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｕ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍからなる群から選択される少なくとも１種を用いることが好ましい。
【００３３】
培養条件は、本発明の微生物の増殖が実質的に阻害されず、微生物代謝産物を生産できる範囲であれば、特に制限なく当業者によって適宜調整されうるが、培養温度は、通常は２０〜４０℃、好ましくは３０〜３５℃である。また、培地のｐＨは、通常は４〜７であるが、滅菌後の培地における雑菌の増殖を抑えるためには、４〜５であることが好ましい。培養前または培養中にｐＨが４未満となる場合は、アンモニアなどを用いてｐＨ制御を行うことが好ましく、逆にｐＨが１０以上となる場合は、硫酸や塩酸などを用いてｐＨ制御をすることが好ましい。
【００３４】
培養方法は、微生物の種類によって異なるが、嫌気的条件および好気的条件のいずれかの培養方法を適宜採用することができる。培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができるが、微生物代謝産物の生産速度の向上のためには、撹拌装置を備えた培養槽を用いることが好ましい。かような培養装置としては、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、充填床培養槽、および流動床培養槽などが挙げられる。
【００３５】
以上の説明では、糖化液を製造する段階と、微生物代謝産物を製造する段階とを別々の段階として行うことによる微生物代謝産物の製造方法について説明してきたが、本発明によると、リグノセルロース系バイオマスの加水分解反応と微生物代謝産物を一段階で行うことも可能である。例えば、リグノセルロース系バイオマスの粉砕物を含む懸濁液に、加水分解酵素産生微生物および微生物代謝産物を産生する微生物を同時に添加し、混合培養を行うことによっても、微生物代謝産物を製造することができる。
【００３６】
上記の培養終了後、微生物代謝産物を含む培地から従来公知の手法により所望の微生物代謝産物を分離することができる。分離方法としては、例えば、カラムクロマトグラフィー、蒸留、および晶析などが挙げられる。これらの分離方法は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせても勿論よい。
【実施例】
【００３７】
本発明の作用効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
【００３８】
＜稲わらの粉砕＞
［製造例１］
脱穀した後、約２ヶ月屋内倉庫に保管した稲わらを、家庭用はさみで１〜５ｃｍ程度に裁断し、家庭用ミキサーで５分間粗く粉砕して、粉砕物Ａを得た。
【００３９】
［製造例２］
製造例１で調製した粉砕物Ａを、さらに、ボールミル（ＡＮＺ−６０Ｓ、日陶科学株式会社製）で１２時間微粉化して、粉砕物Ｂを得た。
【００４０】
［製造例３］
製造例１で調製した粉砕物Ａを、さらに、一旦水道水に懸濁し、これをホモジナイザー（ポリトロン ＰＴ２１００、ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ ＡＧ社）で１分間湿式粉砕して、粉砕物Ｃとした。
【００４１】
（粉砕物の粒度分布の測定）
製造例１および２で調製した粉砕物ＡおよびＢの粒度分布を２種類の試験用ふるい（呼び寸法１．０ｍｍおよび０．１ｍｍ、ＳＡＮＰＯ社製）を用いて測定した。具体的には、１．０ｍｍおよび０．１ｍｍの２種類のふるいを上から順番に重ね、最上部にサンプル５ｇ入れて間歇的に５分間ふるい、それぞれの段に残存した粉の質量を、サンプル５ｇに対する質量百分率（％）で示した。なお、製造例３の粉砕物Ｃは水中に懸濁しているために測定は不可能であった。結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
＜稲わら粉砕物の粒度の糖化への影響＞
［実施例１］
製造例２で調製した粉砕物Ｂ １．０ｇ、水道水１０ｍＬを１００ｍＬ三角フラスコ中で懸濁し、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ４．５に調整した。該懸濁液に加水分解酵素としてメイセラーゼ（明治製菓株式会社製、以下同じ）を粉砕物Ｂに対して１質量％添加し、ロータリーシェーカー（ＭＭＳ−１１０、東京理化学器械株式会社製）上で、５０℃で２４時間振盪（２００ｒｐｍ）して糖化を行った。
【００４４】
［比較例１］
粉砕物Ｂに換えて、製造例３で調製した粉砕物Ｃを用いたことを除いては、実施例１と同様の方法で糖化を行った。なお、粉砕物Ｃは十分に乾燥させて、乾燥質量として秤量した。
【００４５】
［比較例２］
粉砕物Ｂに換えて、製造例１で調製した粉砕物Ａを用いたことを除いては、実施例１と同様の方法で糖化を行った。
【００４６】
（全糖の定量）
全糖の定量は、中村道徳編、貝沼圭二編、「生物化学実験法（２５）澱粉・関連糖質酵素実験法」、学会出版センター版、１９８９年１０月発行、２０６頁に記載の硫酸フェノール法に準じて行った。
【００４７】
（グルコースの定量）
グルコースの定量は、和光純薬工業株式会社製、グルコースＣＩＩテストワコーを用いて行った。
【００４８】
全糖濃度、グルコース濃度、糖化率（稲わら粉砕物の乾燥質量に対する全糖量の質量百分率）の結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
＜加水分解酵素の影響＞
［実施例２］
製造例２で調製した粉砕物Ｂ ２．０ｇ、水道水１０ｍＬを１００ｍＬ三角フラスコ中で懸濁し、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ４．５に調整した。該懸濁液に加水分解酵素としてメイセラーゼを粉砕物Ｂに対して１質量％添加し、ロータリーシェーカー上で、５０℃で２４時間振盪（２００ｒｐｍ）して糖化を行った。
【００５１】
［実施例３］
加水分解酵素として、メイセラーゼに換えて、スミチームＣ（新日本化学工業株式会社製）を用いたことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００５２】
［実施例４］
加水分解酵素として、メイセラーゼ１質量％に換えて、液剤セルラーゼ（ＸＬ−５２２、ナガセケムテックス株式会社製）を粉砕物Ｂの質量に対して１．０％（ｖ／ｗ）を用いたことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００５３】
［実施例５］
加水分解酵素として、メイセラーゼに換えて、ヘミセルラーゼ「アマノ」９０（天野エンザイム株式会社製）を用いたことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００５４】
［比較例３］
加水分解酵素に換えて、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ１．０に調整してオートクレーブ１２１℃で３０分間処理することによって、硫酸加水分解を行い、その後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加することによりｐＨ４．５に調整したことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。なお、反応後の糖化液は黒褐色に着色していた。
【００５５】
実施例２〜５および比較例３の全糖濃度、グルコース濃度、糖化率の結果を表３に示す。
【００５６】
【表３】
【００５７】
＜加水分解酵素添加量の影響＞
［実施例６］
製造例２で調製した粉砕物Ｂ ２．０ｇ、水道水１０ｍＬを１００ｍＬ三角フラスコ中で懸濁し、１Ｎ塩酸を添加することによりｐＨ４．５に調整した。該懸濁液に加水分解酵素としてメイセラーゼを粉砕物Ｂに対して１質量％添加し、ロータリーシェーカー上で、５０℃で２４時間振盪（２００ｒｐｍ）して糖化を行った。
【００５８】
［実施例７］
メイセラーゼの添加量を０．５質量％としたことを除いては、実施例６と同様の方法で糖化を行った。
【００５９】
［実施例８］
メイセラーゼの添加量を０．２５質量％としたことを除いては、実施例６と同様の方法で糖化を行った。
【００６０】
実施例６〜８の全糖濃度、グルコース濃度、糖化率の結果を表４に示す。
【００６１】
【表４】
【００６２】
＜前処理条件の影響＞
［実施例９］
上記実施例２において、前処理として、粉砕物Ｂを水道水に懸濁し、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ４．５に調整し、オートクレーブ（ＨＶ−５０、株式会社平山製作所製）で１２１℃、２０分間蒸煮した後に、該懸濁液にメイセラーゼを添加したことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００６３】
［実施例１０］
上記実施例２において、前処理として、粉砕物Ｂを水道水に懸濁し、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ１．０４に調整し、１２１℃で２０分間蒸煮した後に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加することによりｐＨ４．５に調整し、該懸濁液にメイセラーゼを添加したことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００６４】
［実施例１１］
上記実施例２において、前処理として、粉砕物Ｂを水道水に懸濁し、１Ｎアンモニア水を添加することによりｐＨ１０．１に調整し、１２１℃で２０分間蒸煮した後に、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ４．５に調整し、該懸濁液にメイセラーゼを添加したことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００６５】
［実施例１２］
上記実施例２において、前処理として、粉砕物Ｂを水道水に懸濁し、１Ｎアンモニア水を添加することによりｐＨ１０．５に調整し、１２１℃で２０分間蒸煮した後に、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ４．５に調整し、該懸濁液にメイセラーゼを添加したことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００６６】
［実施例１３］
上記実施例２において、前処理として、粉砕物Ｂを水道水に懸濁し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加することによりｐＨ１０．５に調整し、１２１℃で２０分間蒸煮した後に、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ４．５に調整し、該懸濁液にメイセラーゼを添加したことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００６７】
実施例２および９〜１３の全糖濃度、グルコース濃度、糖化率の結果を表５に示す。
【００６８】
【表５】
【００６９】
＜糖化における初発のｐＨの影響＞
［実施例１４〜２２］
製造例２で調製した粉砕物Ｂ １．０ｇ、水道水１０ｍＬを１００ｍＬ三角フラスコ中で懸濁し、表６に示すように１Ｎ硫酸または１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加することによりｐＨを調整した。該懸濁液に加水分解酵素としてメイセラーゼを粉砕物Ｂに対して１質量％添加し、ロータリーシェーカー上で、５０℃で２４時間振盪（２００ｒｐｍ）して糖化を行った。
【００７０】
実施例１４〜２２の全糖濃度、グルコース濃度、糖化率の結果を表６に示す。
【００７１】
【表６】
【００７２】
＜乳酸製造用培地の最適化＞
［実施例２３］
製造例２で調製した粉砕物Ｂを水道水に対して３００ｇ／Ｌとなるように懸濁し、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨを４．５に調整した。該懸濁液に加水分解酵素としてメイセラーゼを粉砕物Ｂに対して１質量％添加し、ロータリーシェーカー上で、５０℃で２４時間振盪（２００ｒｐｍ）して糖化を行った（得られた糖化液を、「糖化液Ａ」と称する）。糖化液Ａに含まれる全糖の濃度は、１２０ｇ／Ｌであった。乳酸製造用培地として、糖化液Ａ６０ｍＬを３００ｍＬ三角フラスコに入れ、オートクレーブを用いて１２１℃で２５分滅菌して、培地を調製した。該培地に、予め前培養培地ａ（グルコース５０ｇ／Ｌ、コーンスターチ（日本コーンスターチ株式会社製、以下同じ）５０ｇ／Ｌ、硫安１．３５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．２５ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．０４ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム１ｇ／Ｌ、オートクレーブにて１２１℃で２５分間滅菌）で前培養（ロータリーシェーカーにて１７０ｒｐｍ、３０℃で２４時間培養）したＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）を３ｍＬ添加し、ロータリーシェーカー上で、３０℃で９６時間振盪（１７０ｒｐｍ）して乳酸発酵を行った。なお、乳酸発酵中のｐＨ調整のために、別途殺菌した炭酸カルシウム１ｇを添加した。
【００７３】
［実施例２４］
糖化液Ａに、酵母エキス（２１２７５０、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）を３ｇ／Ｌとなるように添加したものを乳酸製造用培地として用いた以外は、実施例２３と同様の方法で乳酸発酵を行った。
【００７４】
［実施例２５］
糖化液Ａに、コーンスティープリカー（ＣＬＳ）（０３４−１６７７５、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）を３ｇ／Ｌとなるように添加したものを乳酸製造用培地として用いた以外は、実施例２３と同様の方法で乳酸発酵を行った。
【００７５】
［実施例２６］
糖化液Ａに、硫安を３ｇ／Ｌとなるように添加したものを乳酸製造用培地として用いた以外は、実施例２３と同様の方法で乳酸発酵を行った。
【００７６】
［実施例２７］
糖化液Ａに、硝安を３ｇ／Ｌとなるように添加したものを乳酸製造用培地として用いた以外は、実施例２３と同様の方法で乳酸発酵を行った。
【００７７】
［比較例４］
培地１Ｌに対して、グルコース１２０ｇ、硫安１．３５ｇ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．２５ｇ、硫酸亜鉛七水和物０．０４ｇとなるように添加した培地（標準培地Ｘ）を乳酸製造用培地として用いた以外は、実施例２３と同様の方法で乳酸発酵を行った。
【００７８】
実施例２３〜２７および比較例４の結果を表７に示す。なお、全ての実施例および比較例において、乳酸発酵終了後の培地に含まれる残糖は極微量であった。
【００７９】
【表７】
【００８０】
表７の結果より、本発明の糖化液の製造方法によると、微量の窒素源を添加するのみで、標準培地Ｘと同等のＬ−乳酸が製造できることが示された。
【００８１】
＜稲わら糖化液を用いたＬ−乳酸の製造＞
［実施例２８］
３Ｌジャーファーメンター（３ＭＤＬ、株式会社丸菱バイオエンジ製、以下同じ）に水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら上記製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物２００ｇを加えて懸濁し、これに１Ｎ硫酸を添加してｐＨを４．５に調整した。該懸濁液にメイセラーゼを稲わら粉砕物に対して１．０質量％添加して、５０℃で７２時間糖化を行った。糖化反応中の糖化液の全糖濃度、グルコース濃度、および糖化率を測定した。結果を表８に示す。
【００８２】
【表８】
【００８３】
得られた糖化液をヌチェでろ過することによって不溶成分を取り除き、水道水を加えて液量を１．５Ｌに調整して、続く乳酸発酵に供した。該糖化液に、リン酸二水素カリウムを０．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウムを０．２５ｇ／Ｌとなるように添加し、オートクレーブを用いて１２１℃で１０分間滅菌して、培地を調製した。該培地に、予め前培養培地ａで前培養（ロータリーシェーカーにて１７０ｒｐｍ、３０℃で２４時間培養）したＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）を１００ｍＬを添加し、３００ｒｐｍ、通気量０．５ｖｖｍ、培養温度３０℃で７２時間培養した。培養中、培地のｐＨをｐＨセンサー（ＧＳ−８４０５、東亜ディーケーケー株式会社製）で随時モニタリングし、２５％アンモニア水を加えることによってｐＨを６．０に維持した。培養開始後の乳酸濃度、全糖濃度、およびグルコース濃度の経時変化を表９に示す。なお、全糖に対するＬ−乳酸の収率は６７質量％であり、使用した稲わら粉砕物に対するＬ−乳酸の収率は４７質量％であった。
【００８４】
【表９】
【００８５】
［比較例５］
３Ｌジャーファーメンターに水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物２００ｇを加えて懸濁し、さらに水道水を加えることによって懸濁液の総容積を１．５Ｌとした。これに１Ｎ硫酸を添加してｐＨを１．５に調整し、オートクレーブにて１２１℃、２時間加圧して酸糖化を行った。得られた糖化液の全糖濃度は４０．２ｇ／Ｌ、グルコース濃度は２３．５ｇ／Ｌであった。該糖化液に、別に殺菌したリン酸二水素カリウムを０．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウムを０．２５ｇ／Ｌとなるように添加した後、ｐＨセンサーでモニタリングしながら、同じく殺菌した２５％アンモニア水でｐＨを６．０に戻した。該培地に、予め前培養培地ａで前培養（ロータリーシェーカーにて１７０ｒｐｍ、３０℃で２４時間培養）したＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）を添加し、３００ｒｐｍ、通気量０．５ｖｖｍ、培養温度３０℃ので４８時間培養した。培養中、培地のｐＨをｐＨセンサーで随時モニタリングし、２５％アンモニア水を加えることによってｐＨを６．０に維持した。培養中の乳酸濃度、全糖濃度、およびグルコース濃度の経時変化を表１０に示す。
【００８６】
【表１０】
【００８７】
表１０を参照すると、４８時間で１８．７ｇ／ＬのＬ−乳酸が生産されており、収率を算出すると、全糖に対しては４７質量％、稲わら粉砕物に対しては１４質量％となった。これらの収率は、酵素を用いた糖化液を用いた上記実施例２８と比較して、著しく低く、また得られたＬ−乳酸培養液が黒褐色に着色していたため、精製回収が非常に困難であると考えられた。
【００８８】
＜混合培養によるＬ−乳酸の製造＞
［実施例２９］
グルコース３０ｇ／Ｌ、アルボセル（三木産業製）１０ｇ／Ｌ、大豆粉（豊年製油）６０ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム３．２ｇ／Ｌを含む培地６０ｍＬを３００ｍＬ三角フラスコに入れ、１２１℃で２５分殺菌した。該培地に、スラント（ＹＰＤ寒天培地）上のＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｕ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ ２４６２２を一白金耳接種し、ロータリーシェーカー（２００ｒｐｍ）を用いて３０℃で７２時間培養した。一方、製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物を１００ｇ／Ｌ、硫安を１．３５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウムを０．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物を０．２５ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物を０．０４ｇ／Ｌとなるように添加し、水道水で１Ｌとして３Ｌジャーファーメンターに入れオートクレーブを用いて１２１℃で２５分間殺菌した。この培地に上記Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍの培養液６０ｍＬを添加し、撹拌しながら３５℃で２４時間培養した。Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍの増殖を顕微鏡で確認後、該培養液に、別途上記前培養培地ａ ６０ｍＬを入れた３００ｍＬ三角フラスコでロータリーシェーカーを用いて３０℃で２４時間振盪培養したＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）を全量添加し、３５℃でＡ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍとＲ．ｓｐ．ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）による混合培養を行った。通気量は０．５ｖｖｍとし、溶存酸素（ＤＯ）濃度はＤＯセンサー（ＯＸ−２５００、丸菱バイオエンジ株式会社製）でモニタリングしながら２０％以上に維持した。また、２５％アンモニウム水を用いてｐＨを６．０に維持した。培養中のＡ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍおよびＲ．ｓｐ．ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の生菌数、全糖濃度、グルコース濃度および乳酸濃度の経時変化を表１１に示す。なお、稲わら粉砕物に対するＬ−乳酸の収率は２５質量％であった。
【００８９】
【表１１】
【００９０】
以上の結果より、Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍとＲ．ｓｐ．ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の混合培養によって同時に糖化および乳酸発酵を行えることが示された。
【００９１】
＜稲わら糖化液を用いたエタノールの製造＞
［実施例３０］
３Ｌジャーファーメンターに水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物２００ｇを加えて懸濁し、さらに水道水を加えて液量を１．５Ｌとした。次に、該懸濁液に２５％塩酸を加えてｐＨを４．５に調整し、メイセラーゼを稲わら粉砕物に対して１質量％加えて、５０℃で２４時間糖化を行った。得られた糖化液に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨを６．０に調整した。該糖化液をオートクレーブを用いて、１２１℃で１５分間滅菌して培地とした。これとは別に、ＹＰＤ培地（グルコース２０ｇ／Ｌ、ポリペプトン（３９４−００１５、日本製薬株式会社製、以下同じ）２０ｇ／Ｌ、酵母エキス（２１２７５０、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）１０ｇ／Ｌ）に予め３０℃で２日間往復振盪培養したＰａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ ＮＢＲＣ １００７を１００ｍＬ添加し、溶存酸素濃度を２０％に維持しながら、培養温度３０℃で通気撹拌培養を行った。培養の経過変化を表１２に示す。
【００９２】
【表１２】
【００９３】
表１２に示すように、該エタノール産生菌は、培養開始後２４時間でグルコースを全て消費した。その後、キシロースなどのグルコース以外の糖類が消費され、最終的には培養開始後１４４時間で資化可能な糖類はほぼ全て消費された。エタノールの収率は、全糖に対して３９．８質量％であり、稲わら粉砕物に対して２６質量％であった。
【００９４】
＜稲わら糖化液を用いたイタコン酸の製造＞
［実施例３１］
３Ｌジャーファーメンターに水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物２００ｇを加えて懸濁し、該懸濁液に１Ｎ硫酸を添加してｐＨを４．５に調整した。これにメイセラーゼを稲わら粉砕物に対して１質量％加えて、５０℃で２４時間糖化を行った。得られた糖化液に２０％硝酸を添加してｐＨを２．０に調整した。該糖化液をオートクレーブで１２１℃、５分間滅菌して、イタコン酸生産培地とした。これとは別に、前培養培地ｂ（グルコース５５．５ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー（０３４−１６７７５、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）３ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物１．８ｇ／Ｌ）を用いて予め３０℃で２日間往復振盪培養したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ＴＮ−４８４（Ｙａｈｉｒｏ，Ｋ．， Ｔａｋａｈａｍａ， Ｔ．， Ｔ． Ｐａｒｋ， Ｙ．Ｓ．， Ｏｋａｂｅ Ｍ．， “Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｍｕｔａｎｔ ＴＮ−４８４ ｆｏｒ ｉｔａｃｏｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ．” Ｊ． Ｆｅｒｍｅｎｔ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ７９， ５０６〜５０８ （１９９５））を１００ｍＬ添加し、溶存酸素濃度をＤＯセンサーでモニタリングしながら２０％に維持し、培養温度３０℃で通気撹拌培養を行った。なお、イタコン酸濃度は、Ｃａｐｃｅｌｌ ＰａＫ Ｃ１８ ＭＧ Ｌｏｔ． ＢＳ１４カラム（株式会社資生堂製）を装着したＨＰＬＣ（ＬＣ−１０Ａ、株式会社島津製作所製）で分析した。７０％アセトニトリルを移動相とし、１ｍＬ／ｍｉｎの速度で溶出し、２５７ｎｍで検出することによって測定した。また、菌体質量は、菌体を０．８５％生理食塩水で洗浄し、１０５℃で２時間乾燥後秤量することによって測定した。培養の経時変化を表１３に示す。
【００９５】
【表１３】
【００９６】
表１３に示すように、培養開始と同時にグルコースが消費され、培養開始９６時間後にほぼ全て消費された。最終的に、培養開始１４４時間後のイタコン酸の収率は、全糖に対しては４１質量％（理論収率は７２％）であり、稲わら粉砕物に対しては３２質量％であった。
【００９７】
＜稲わら糖化液を用いたフマル酸の製造＞
［実施例３２］
３Ｌジャーファーメンターに水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物２５０ｇを加えて懸濁し、該懸濁液に１Ｎ硫酸を添加してｐＨを４．５に調整した。これにメイセラーゼを稲わら粉砕物に対して１質量％加えて、５０℃で２４時間糖化を行った。該糖化液を３Ｌジャーファーメンターに入れ、これに硫安を１．３５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウムを０．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物を０．２５ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物を０．０４ｇ／Ｌとなるように添加した。該糖化液に１Ｎ硫酸を添加してｐＨを４．５に調整し、さらに水道水を加えて液量を１．５Ｌとした後、オートクレーブにて１２１℃、２５分間殺菌を行い、フマル酸生産培地とした。これとは別に、滅菌済みの５００ｍＬ容三角フラスコに、前培養培地ｃ（グルコース５５．５ｇ／Ｌ、硫安１．３５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．２５ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．０４ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム１５ｇ／Ｌ）を９０ｍＬ分注した。Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＮＢＲＣ ４７０７(ＩＦＯ ４７０７)を培養するスラントに、滅菌した０．８５％生理食塩水を１０ｍＬ入れて胞子を懸濁した。そして、上記前培養培地に該懸濁液を植菌し、ロータリーシェーカー上で２２０ｒｐｍ、３２℃で、１８時間往復振盪培養を行った。該前培養液１００ｍＬを上記フマル酸生産培地１．５Ｌに添加後、温度３２℃、回転数３００ｒｐｍ、通気量０．５ｖｖｍで培養を行った。培養中のｐＨをｐＨセンサーを用いてモニタリングしながら、１２．５％アンモニア水でｐＨを６．０に維持した。なお、培養液中のフマル酸濃度および菌体濃度の測定は、以下の方法を用いて行った。培養の経時変化を表１４に示す。
【００９８】
（フマル酸濃度の測定）
フマル酸濃度は、ＨＰＬＣ（ＣＬ−１０Ａ、株式会社島津製作所製）を用いて測定した。液体クロマトグラフＬＣ−１０Ａ、カラムオーブンＣＴＯ−６Ａ、紫外線検出器ＳＰＤ−６Ａ、クロマトパックＣ−Ｒ６Ａ（株式会社島津製作所製）を用いて行った。カラムはＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ）、ガードカラムはＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（４．６ｍｍφ×３５ｍｍ）（株式会社資生堂製）を用いた。移動相は２．５％高速液体クロマトグラフ用アセトニトリル（和光純薬工業）と０．１％Ｈ３ＰＯ３（和光純薬工業）の混合液を０．４５μｍのメンブレンフィルター（ＪＨ、日本ミリポア株式会社製）でろ過した。カラム温度３５℃、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎに設定した。紫外線で検出を行い、検出波長は２１０ｎｍとした。
【００９９】
（菌体濃度の測定）
菌体濃度は、乾燥菌体重量法（Ｄｒｙ Ｃｅｌｌ Ｗｅｉｇｈｔ）を用いて菌体質量を求めた後、これを濃度に換算することによって求めた。菌体質量の測定は、具体的には以下の方法で行った。まず、シャーレにろ紙（アドバンテック東洋株式会社製）を入れ、１０５℃のオーブンで２時間乾熱後、デシケーター内で放冷し、ろ紙を定量した。このろ紙を用いて、培養液１０ｍＬを吸引ろ過し、蒸留水でよく洗浄した後、１０５℃のオーブンで２時間乾熱した。デシケーターで放冷後、秤量し、菌体質量を求めた。
【０１００】
【表１４】
【０１０１】
表１４に示すように、９６時間後のフマル酸の収率は、全糖に対して２９質量％であり、稲わら粉砕物に対して１７質量％であった。
【０１０２】
＜稲わら糖化液を用いたリンゴ酸の製造＞
［実施例３３］
３Ｌジャーファーメンターに水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物３５０ｇを加えて懸濁し、該懸濁液に１Ｎ硫酸を添加してｐＨを４．５に調整した。これにメイセラーゼを稲わら粉砕物に対して１質量％加えて、５０℃で２４時間糖化を行った。得られた糖化液を、全糖濃度が１２０ｇ／Ｌとなるように希釈し、硫安を１．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウムを０．０３５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウムを０．０３５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウムを０．１ｇ／Ｌ、硫酸鉄を０．０６ｇ／Ｌ、塩化カルシウムを０．１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウムを０．００５ｇ／Ｌ、炭酸カルシウムを９０ｇ／Ｌとなるように添加した。この糖化液を２．５Ｌをジャーファーメンター（５ＭＤＬ、丸菱バイオエンジ株式会社）に入れ、オートクレーブにて１２１℃、２５分間滅菌して、リンゴ酸生産培地とした。これとは別に、滅菌済みの５００ｍＬ容三角フラスコに、前培養培地ｄ（グルコース１２０ｇ／Ｌ、硫安４ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．７５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．７５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．１ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．００５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．００５ｇ／Ｌ）を９０ｍＬ分注した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ＡＴＣＣ１３６９７を培養するスラントに、滅菌した０．８５％生理食塩水を１０ｍＬ入れて胞子を懸濁した。そして、上記前培養培地に該懸濁液を植菌し、ロータリーシェーカー上で２２０ｒｐｍ、３２℃で、１８時間往復振盪培養を行った。上記リンゴ酸生産培地に対して１０体積％の量の前培養培地を、リンゴ酸生産培地に植菌し、温度３２℃、回転数３００ｒｐｍ、通気量０，５ｖｖｍで２６４時間培養を行った。なお、培養液中のリンゴ酸濃度は実施例３２のフマル酸濃度の測定に準じて行った。また、菌体濃度の測定は、実施例３２と同様の方法で行った。培養の経時変化を表１５に示す。
【０１０３】
【表１５】
【０１０４】
表１５に示すように、２６４時間後のＬ−リンゴ酸の収率は、全糖に対して７２質量％であり、稲わら粉砕物に対して２９質量％であった。
【０１０５】
＜稲わら糖化液を用いたピルビン酸の製造＞
［実施例３４］
３Ｌジャーファーメンターに水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物３００ｇを加えて懸濁し、該懸濁液に１Ｎ硫酸を添加してｐＨを４．５に調整した。これにメイセラーゼを稲わら粉砕物に対して１質量％加えて、５０℃で２４時間糖化を行った。得られた糖化液を、全糖濃度が５０ｇ／Ｌとなるように希釈し、コーンスティープリカーを１５ｇ／Ｌ、硫安を６ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウムを１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウムを０．５ｇ／Ｌ、ニコチン酸（１４２−０１２３２３、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）を０．４ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩（１６８−２００３１、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）を０．２ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩（２０３−００８５１、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）を０．０２ｇ／Ｌ、ビオチン（０２３−０８７１１、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）を０．００５ｍｇ／Ｌとなるように添加した。そして、１Ｎ硫酸を添加してｐＨを５．０に調整した。該培地を３Ｌジャーファーメンターに入れ、オートクレーブにて１２１℃で２５分間滅菌して、ピルビン酸生産培地とした。これとは別に、前培養培地ｅ（グルコース５０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー１５ｇ／Ｌ、硫安６ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、ニコチン酸０．４ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩０．２ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．０２ｇ／Ｌ、ビオチン０．００５ｍｇ／Ｌ）で予め３０℃で２日間往復振盪培養したＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ ＮＢＲＣ ０００５（ＩＦＯ ０００５）の前培養液１００ｍＬを、上記ピルビン酸生産培地に添加し、溶存酸素濃度を２０％に維持しながら、培養温度３０℃で通気撹拌培養を行った。なお、培養液中のピルビン酸濃度は実施例３２のフマル酸濃度の測定に準じて行った。また、菌体濃度の測定は、実施例３２と同様の方法で行った。培養の経時変化を表１６に示す。
【０１０６】
【表１６】
【０１０７】
表１６に示すように、培養開始３６時間後でピルビン酸の濃度は４４．６ｇ／Ｌに達し、その後徐々に減少した。８４時間後のピルビン酸の収率は、全糖に対して３１質量％であり、稲わら粉砕物に対しては１９質量％であった。
【０１０８】
＜稲わら糖化液を用いたキシリトールの製造＞
［実施例３５］
３Ｌジャーファーメンターに水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物２２０ｇを加えて懸濁し、該懸濁液に１Ｎ硫酸を添加してｐＨを４．５に調整した。これにメイセラーゼを稲わら粉砕物に対して１質量％加えて、５０℃で２４時間糖化を行った。得られた糖化液をＤ−キシロース濃度が６％となるように希釈し、酵母エキスを１％、リン酸水素二カリウムを１．５％、硫安を０．３％、硫酸マグネシウム七水和物を０．３％となるように添加した。そして、１Ｎ硫酸を添加してｐＨを５．０に調整した。該培地を３Ｌジャーファーメンターに入れ、オートクレーブにて１２１℃で２５分間滅菌して、キシリトール生産培地とした。これとは別に、前培養培地ｆ（Ｄ−キシロース６％、酵母エキス１％、リン酸水素二カリウム１．５％、硫安０．３％、硫酸マグネシウム七水和物０．３％）で予め３０℃で２日間往復振盪培養したＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ ０６１８（ＩＦＯ ０６１８）の前培養液１００ｍＬを、上記キシリトール生産培地に添加し、溶存酸素濃度を２０％に維持しながら、培養温度３０℃、回転数３００ｒｐｍ、通気寮０．５ｖｖｍで通気撹拌培養を行った。なお、培養液中のキシリトール濃度は、Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２ｐ−５０ ４Ｅカラムを装着したＨＰＬＣ（ＬＣ−１０Ａ、株式会社島津製作所製）で分析した。アセトニトリル／水＝７０／３０（ｖ／ｖ）を移動相とし、１ｍＬ／ｍｉｎの速度で溶出し、２５７ｎｍで検出することによって測定した。また、菌体濃度の測定は、実施例３２と同様の方法で行った。培養の経時変化を表１７に示す。
【０１０９】
【表１７】
【０１１０】
表１７に示すように、培養開始７２時間後のキシリトールの収率は、全糖に対して５６．８質量％であり、稲わら粉砕物に対しては３９質量％であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグノセルロース系バイオマスを用いた糖化液の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業革命以来、燃料や化学品の原料として、化石燃料、特に石油が大量に消費されてきた。その結果、今日、二酸化炭素などの温室効果ガスによる地球温暖化は、もはや一刻の猶予もないほど深刻化しており、さらに、石油の可採年数が数十年との予測もなされている。そこで、石油に取って替わる、地球に優しい新たな資源の確保が急務となっている。
【０００３】
これらの問題の一つの解決策として、バイオマス（再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたもの）から燃料や化学品の原料を生産しようとする、バイオリファイナリーの研究・開発が世界各地で進められている。
【０００４】
こうしたバイオリファイナリー技術の中でも、バイオマスエタノール（以下、「バイオエタノール」とも称する）は、近年、実用化の段階にまで差し掛かってきており、トウモロコシやサトウキビなどの可食部に含まれるデンプン質または糖質を用いたエタノール生産が、米国やブラジルなどで大規模に行われている。しかしながら、これらの食糧資源をバイオエタノールの原料とすることで、食糧価格の高騰や、発展途上国での深刻な食糧不足を引き起こすことが懸念されている。本発明者は、こうした状況を鑑みて、作物の非可食部である葉や茎など（ソフトバイオマス）、あるいは木材など（ハードバイオマス）に含まれるリグノセルロース系バイオマスを原料とするバイオリファイナリー技術の開発に取り組んできた。
【０００５】
一般に、バイオリファイナリーにおいては、まずバイオマスに含まれる多糖類を加水分解（以下、「糖化」とも称する）することによって、単糖類を含む糖化液を得る。そしてこの単糖類から微生物を用いた発酵等により、各種化学品を得る。しかしながら、作物の葉や茎または木材のようなリグノセルロース系バイオマスは、構造性多糖であるセルロースに芳香族化合物の重合体であるリグニンおよびヘミセルロースが強固に結合する構造を有しており、デンプン質や糖質を主成分とするデンプン系バイオマスや糖質系バイオマスと比較して、加水分解反応の効率が著しく低いことが知られている。
【０００６】
これらの理由から、従来のリグノセルロース系バイオマスの加水分解反応においては、酸またはアルカリを用いた化学的な加水分解法が用いられていた（例えば、非特許文献１〜４参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】大深正徳 他、「デンプン・セルロース系混合原料の酸糖化液のエタノール発酵特性」、寒地土木研究所月報、２００７年、６５１、ｐ．１９−２０
【非特許文献２】Ｈａｊｉｍｅ Ｍｉｎａｔｏ、“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｉｃｅ Ｓｔｒａｗ ｏｎ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｄｒｙ Ｍａｔｔｅｒ”、Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ、（１９７７）、７０、ｐ．６１−６６
【非特許文献３】Ｅ．Ｙｕ Ｖａｌｅｎｓｃｏ、Ｈ．Ｄｉｎｇ、Ｊ．Ｍ．Ｌａｂａｖｉｔｃｈ、ａｎｄ Ｓ．Ｐ．Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ Ｒｉｃｅ Ｓｔｒａｗ”、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９９７）、５、ｐ．１０９−１１９
【非特許文献４】Ｎｉｃｏｌｅｔｔａ Ｃｕｒｒｅｊｉ、Ｍａｒｉｏ Ａｇｅｌｌｉ、Ｂｒｕｎｅｌｌａ Ｐｉｓｕ、Ａｎｔｏｎｉｏ Ｒｅｃｉｇｎｏ、Ｅｎｒｉｃｏ Ｓａｎｊｕｓｔ、ａｎｄ Ａｕｇｕｓｔｏ Ｒｉｎａｌｄｉ、“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｗｈｅａｔ Ｓｔｒａｗ”、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（２００２）、３７、ｐ．９３７−９４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、かような化学的加水分解法では、リグノセルロース系バイオマスを強酸性または強アルカリ性条件下で加水分解する必要があるため、大量の酸またはアルカリ試薬を要する。このような化学的加水分解法を工業的規模で行うとすると、環境汚染の観点からも好ましくない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の問題を解決すべく、リグノセルロース系バイオマスから、効率よく糖化液を製造するため、鋭意研究を行った。その結果、リグノセルロース系バイオマスを粉砕し、該粉砕物を加水分解酵素を用いて加水分解することによって、高効率で加水分解反応が進行することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程と、得られた粉砕物を加水分解酵素を用いて加水分解する工程とを含む、糖化液の製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、リグノセルロース系バイオマスから、効率よく糖化液を製造することができる。該製造方法は、従来のように酸またはアルカリといった化学薬品を大量に使用しないため、環境に優しいバイオリファイナリー技術の構築に貢献しうる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の好ましい実施形態を説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、以下の形態のみに制限されない。
【００１３】
本実施形態は、リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程と、得られた粉砕物を加水分解酵素を用いて加水分解する工程とを含む、糖化液の製造方法に関する。
【００１４】
［糖化液の製造方法］
まず、リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程について説明する。
【００１５】
本発明において、「リグノセルロース系バイオマス」とは、セルロース、ヘミセルロース、およびリグニンを主成分とするバイオマスを意味する。リグノセルロース系バイオマスとしては、上記成分を主成分として含むバイオマスであれば特に制限なく用いることができるが、具体例としては、稲わら、籾殻、麦わら、バガス、ヤシ殻、コーンコブ、雑草、木材、パルプ、および紙などが挙げられる。さらに、食品産業、建築業、家庭から排出される廃棄物なども含まれうる。これらのリグノセルロース系バイオマスは、従来、そのほとんどが焼却によって廃棄処理されてきたが、本発明により、これらのリグノセルロース系バイオマスを資源として有効利用することができる。
【００１６】
リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程において、粉砕としては、湿式粉砕および乾式粉砕などの従来公知の方法を適宜用いることができる。このうち、より高い糖化率が達成可能な、乾式粉砕であることが好ましい。乾式粉砕に用いる装置としては、例えば、ボールミル、タワーミルなどの媒体ミル、ハンマーミル、ピンミルなどの衝撃式ミル、ジェットミルなどが挙げられる。また、湿式粉砕に用いる装置としては、例えば、ホモジナイザー、パールミル、マスコロイダーなどが挙げられる。これらの粉砕装置は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、効率よく粉砕するために、リグノセルロース系バイオマスを予め１〜５ｃｍ程度に裁断、あるいは１〜１０ｍｍ程度に粗粉砕しておくことが好ましい。
【００１７】
リグノセルロース系バイオマスを粉砕した粉砕物の粒度は、特に制限はないが、好ましくは０．０１〜１．０ｍｍであり、より好ましくは０．１〜１．０ｍｍである。リグノセルロース系バイオマスをかような粒度に粉砕することによって、続く加水分解反応の効率が著しく向上する。粒度の下限値は特に制限はないが、取り扱いの容易さの観点からは０．０１ｍｍ以上であることが好ましい。同じく、加水分解反応の効率化の観点から、粉砕物の粒度は可能な限り均一であることが好ましいが、工業的に大量のリグノセルロース系バイオマスを粉砕することを考慮すると、粉砕物の全質量（乾燥質量換算）に対して、５０質量％以上、好ましくは７０質量％以上、より好ましくは８０質量％以上、さらに好ましくは９０質量％以上、特に好ましくは９８質量％以上の粉砕物の粒度が１．０ｍｍ未満となるように粉砕する。なお、本発明において「粒度」とは、下記実施例で用いた方法によって測定した値を採用する。
【００１８】
続いて、上記粉砕物を加水分解酵素（以下、単に「酵素」とも称する）を用いて加水分解する工程について説明する。
【００１９】
本発明において、加水分解酵素は、リグノセルロース系バイオマスに含まれる多糖類（オリゴ糖を含む）のグリコシド結合を切断して単糖類へと加水分解する役割を果たす。加水分解酵素は、様々な形態のものが使用できる。例えば、微生物などの生体内で産生される加水分解酵素を該生体内から分離した酵素製剤の形態であってもよいし、生体内に含まれたままの状態で微生物などを培養することによって酵素反応を行わせるものであってもよい。
【００２０】
リグノセルロース系バイオマスには、セルロース、ヘミセルロース、およびデンプンなどの多糖類（オリゴ糖を含む）が含まれる。セルロースはグルコースがβ−１，４−グリコシド結合により重合した直鎖状の多糖類である。ヘミセルロースはセルロースと共に植物細胞壁を構成するセルロース以外の多糖類であって、ホモ多糖類およびヘテロ多糖類の総称をいう。ヘミセルロースとしては、例えば、マンナン、グルコマンナン、グルコキシラン、ガラクタン、キシラン、アラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、ペクチン、キチン、ガラクトグルコマンナン、クロノキシラン、キシログルカンなどが挙げられる。デンプンは、グルコースがα−１，４−グリコシド結合および／またはα−１，６−グリコシド結合により重合した、らせん状または網目状構造を有する多糖類である。上記のリグノセルロース系バイオマスに含まれる多糖類を加水分解することによって得られる単糖類としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、キシロース、およびアラビノースなどの単糖類、ガラクツロン酸、グルクロン酸などのウロン酸、水酸基がエステル化されたエステル誘導体、水酸基がメチル基などで誘導体化されたアルキル誘導体が生成される。
【００２１】
リグノセルロース系バイオマスに含まれる多糖類としては、上述のように、セルロース、ヘミセルロース、およびデンプンなどが挙げられる。セルロースの加水分解酵素（セルラーゼ）としては、セルロースのβ−１，４−グリコシド結合を切断できる酵素であれば特に制限はないが、例えば、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エキソ−β−１，４ーグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、およびカルボキシメチルセルラーゼが挙げられる。ヘミセルロースの加水分解酵素（ヘミセルラーゼ）としては、ヘミセルロースのグリコシド結合を切断できる酵素であれば特に制限なく用いることができるが、例えば、β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、マンノシダーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチナーゼなどが挙げられる。デンプンの加水分解酵素（アミラーゼ）としては、デンプンのグリコシド結合を切断できる酵素であれば特に制限なく用いることができるが、例えば、α−１，４−グリコシド結合および／またはα−１，６−グリコシド結合を切断できるα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、およびプルラナーゼなどが挙げられる。これらの加水分解酵素は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよいが、リグノセルロース系バイオマスには上述のように様々なグリコシド結合を有する多糖類が含まれているので、反応性の異なる加水分解酵素を２種以上組み合わせて用いることが好ましい。
【００２２】
上記加水分解酵素は、リグノセルロース系バイオマスを加水分解可能な微生物などの生体中で産生されうる。後述の微生物代謝産物を産生する微生物と区別するために、以下、リグノセルロース系バイオマスを加水分解可能な微生物を「加水分解酵素産生微生物」とも称する。通常、加水分解酵素産生微生物は、上記の反応性の異なる数種の加水分解酵素を産生するので、加水分解反応には、この数種の加水分解酵素を含む酵素群が用いられる。酵素群に含まれる各加水分解酵素成分の組成は、産生する加水分解酵素産生微生物の種類により異なることが知られている。リグノセルロース系バイオマスに含まれる各種グリコシド結合の加水分解反応は、その各種グリコシド結合を切断可能な加水分解酵素の組成に左右されるので、リグノセルロース系バイオマスに含まれる種々のグリコシド結合を効率よく切断できるような酵素組成を有する酵素群を用いることが好ましい。上記の加水分解酵素を産生する酵素産生微生物としては、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、シゾゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、およびテルモモノスポラ属（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）に属する微生物が知られている。このうち、高いリグノセルロース系バイオマス分解能を有する加水分解酵素を産生する、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アクレモニウム・テルモフィルム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ），トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、アスペルギルス・アクレタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・フミガータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギウス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、フサリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、シゾフィラム・コムネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）、クロストリジウム・テルモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）、およびテルモモノスポラ・クルバタ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｒｖａｔａ）からなる群から選択される加水分解酵素産生微生物が産生する加水分解酵素を用いることが好ましい。なお、リグノセルロース系バイオマス分解能に悪影響を及ぼさない範囲において、これらの加水分解酵素産生微生物の変異体が産生する加水分解酵素も用いることができる。
【００２３】
本発明における加水分解酵素は、上記の加水分解酵素産生微生物が産生した酵素を、微生物の生体内から分離した、酵素製剤の形態であってもよく、あるいは、固定化酵素の形態であってもよい。上記加水分解酵素産生微生物から分離された加水分解酵素としては、メイセラーゼ（明治製菓株式会社製）、スミチームＣ（新日本化学工業株式会社製）、スミチームＸ（新日本化学工業株式会社製）、ヘミセルラーゼ「アマノ」９０（天野エンザイム株式会社製）、グリンドアミルＨ（ダニスコ ジャパン株式会社製）、およびペントパン（ノボザイムズ ジャパン株式会社製）などが挙げられる。このうち、特に高い加水分解能を有する、メイセラーゼ、およびスミチームＣを用いることが好ましい。
【００２４】
本発明おける加水分解反応は、従来公知の方法を適宜採用して行うことができる。まず、上記のリグノセルロース系バイオマスの粉砕物を水性媒体に懸濁して懸濁液を調製する。水性媒体は加水分解酵素が失活しない範囲においては特に制限はないが、水、緩衝液、酸性水溶液、またはアルカリ性水溶液を用いることが好ましい。懸濁液中に含まれるリグノセルロース系バイオマスの粉砕物の濃度は、水性媒体に対して、通常、５０〜３００ｇ／Ｌであり、好ましくは１００〜２００ｇ／Ｌである。例えば、加水分解酵素産生微生物を培養することによって糖化液を製造する場合においては、ｐＨは通常３〜９であり、好ましくは４〜７である。また、培養温度は通常２０〜５０℃であり、好ましくは３０〜３７℃である。培養時間は通常１２〜１４４時間であり、好ましくは２４〜７２時間である。また、加水分解反応は、リグノセルロース系バイオマスの粉砕物の懸濁液中に加水分解酵素を添加し、該懸濁液をインキュベートすることによっても行われうる。懸濁液に添加する酵素量は、懸濁するリグノセルロース系バイオマスの粉砕物の質量に対し、好ましくは０．１〜１質量％である。かような量の酵素を用いることによって、通常１２〜１４４時間、好ましくは２４〜７２時間で加水分解反応が完了しうる。また、加水分解条件は、用いる酵素の至適条件を用いることが好ましい。ｐＨは通常３〜８であり、好ましくは４〜６である。また、反応温度は通常３０〜６０℃であり、好ましくは４０〜５０℃である。
【００２５】
加水分解反応終了後の糖化液は、糖化液中の不溶物を適宜ろ過してもよいし、そのままの状態で次の微生物代謝産物の製造に供しても構わない。撹拌効率および収率向上の観点の観点からは糖化液中の不溶物を予めろ過することが好ましい。
【００２６】
また、リグノセルロース系バイオマスの粉砕物は、反応効率向上の観点から、加水分解反応に供する前に蒸煮処理を行うことが好ましい。蒸煮処理は、従来公知の方法を用いることができる。さらに、加水分解反応の前に適宜酸またはアルカリ処理を行ってもよい。
【００２７】
上記製造方法によって製造される糖化液に含まれる単糖の質量（以下、「全糖量」とも称する）は、加水分解反応に供したリグノセルロース系バイオマスの粉砕物の全質量に対して、好ましくは１０〜９０質量％であり、より好ましくは、２０〜８０質量％であり、さらに好ましくは、３０〜７０質量％である。本製造方法によると、下記実施例でも示したが、６０％以上の高い糖化率で、リグノセルロース系バイオマスから単糖を得ることができる。
【００２８】
［微生物代謝産物の製造方法］
次に、上記製造方法によって製造された糖化液を含む培地で微生物を培養する工程を含む、微生物代謝産物の製造方法について説明する。
【００２９】
本発明で用いる培地は、上記の製造方法によって製造された糖化液を含む。培地は、一般的には、炭素源、窒素源、および無機塩を含むが、上記糖化液中に培養に必要なこれらの栄養源が十分に含まれている場合には、適宜濃度を調節した上記糖化液のみを用いることもできるし、必要によって、糖化液のほかに栄養源を添加することによって培地を調製してもよい。
【００３０】
培地に添加する炭素源としては、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース、およびキシロースなどの単糖、マルトース、ラクトース、およびスクロースなどの二糖、グリセリンおよびキシリトールなどの糖アルコールといった糖類が挙げられ、これらを単独であるいは２種以上を組み合わせて使用できる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、尿素、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、あるいは尿酸などの無機あるいは有機の窒素化合物が使用できる。さらに、窒素源としては、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、コーンスティープリカーなどの窒素含有天然物を使用してもよい。これらのうち、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、Ｌ−グルタミン酸などのアミノ酸類、尿酸などの無機あるいは有機窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなの窒素含有天然物が好ましい。これらの窒素源は、単独であるいは２種以上を組み合わせて使用できる。無機物としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウムなどの、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄および亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩および酢酸塩などが用いられる。そのほか、チアミン、ビオチンなどのビタミン類、さらに必要に応じて、アデニン、ウラシルなどの核酸関連物質が使用されてもよい。これらの無機物は、単独であるいは２種以上を組み合わせて使用できる。
【００３１】
本発明では、上記培地に、微生物代謝産物を産生しうる微生物を添加し、培養することによって微生物代謝産物を生産する。本発明において、「微生物代謝産物」とは、微生物が生命維持のために外界から摂取した有機物あるいは無機物を、生命機能を利用して変換した物質を意味する。微生物代謝産物は、化学品またはその原料として用いることができるものであれば特に制限はないが、例えば、有機酸、アミノ酸、アルコール、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸塩基、脂質、飽和および不飽和脂肪酸、炭水化物、芳香族化合物、ビタミン、ならびに酵素などが挙げられる。このうち、有機酸は、酸性を示す有機化合物であれば特に制限はないが、酸性基としてカルボキシル基を有する化合物であることが好ましい。かような有機酸としては、具体的には、乳酸、フマル酸、イタコン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、グルタル酸、レブリン酸、プロピオン酸、グルコン酸、およびアコニット酸などが挙げられる。これらの有機酸のうち、乳酸、フマル酸、イタコン酸、リンゴ酸、またはピルビン酸であることが好ましい。乳酸は、生分解プラスチック原料、医薬品原料、食品添加物、飼料用添加物としても有用である。フマル酸は、ポリエステル樹脂原料、サイズ剤の原料、香料の原料、食品添加物、飼料用添加物として用いられうる。イタコン酸は、合成樹脂およびラテックスなどの改質剤、塗料原料、食品添加物として用いられうる。リンゴ酸は、飲料や食品の酸味料、ｐＨ調整剤、および乳化剤などに用いられうる。ピルビン酸は、香料、化粧品、および農薬等の原料として用いられうる。アルコールとしては、分子中に１〜６個のヒドロキシ基を有する化合物であれば特に制限はないが、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エタンジオール、プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、およびアラビニトールなどが挙げられる。これらのアルコールのうち、エタノールおよびキシリトールであることが好ましい。エタノールは、次世代の自動車燃料として期待されている。キシリトールは、う蝕抑制効果のある甘味料および糖尿病患者用の甘味料として用いられうる。この他にも、アミノ酸としては、リシン、グルタミン酸、メチオニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、およびトレオニン；ヌクレオチドとしては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）；不飽和脂肪酸としては、γ−リノレン酸、アラキドン酸、およびドコサヘキサエン酸；炭水化物としては、ヒアルロン酸およびトレハロース；芳香族化合物としては、芳香族アミン、バニリン、およびインジゴ；ビタミンとしては、アスコルビン酸、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、およびリボフラビン；酵素としては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼ等が挙げられる。
【００３２】
上記微生物代謝産物はこれらを産生しうる微生物を培養することによって製造されうる。これらの微生物としては、例えば、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｕ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシビヤ属（Ａｓｈｂｙａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナエロビオスピリルム属（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）に属する微生物が挙げられるが、これらに制限されるものではない。具体的には、パチソレン・タンノフィルス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アルペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、トルロプシス・グラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ・ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、アシビヤ・ゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｓ ｏｒｙｚａｅ）、アルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ）、アナエロビオスピリルム・スクシニプロデューセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、アクチノバチルス・スクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・レイクマニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・アラビノーサム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｒａｂｉｎｏｓｕｍ）、プロピオニバクテリウム・シャーマニー（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃｈｅｒｍａｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・フローデンレイチー（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、クロストリジウム・プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｌｉｃｕｍ）などが挙げられる。なかでも、乳酸を産生するＲｉｚｏｐｕｓ属、イタコン酸を生産するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、エタノールを産生するＰａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ、フマル酸を産生するＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、リンゴ酸を産生するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、ピルビン酸を産生するＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ、キシリトールを産生するＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、セルラーゼを産生するＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｕ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍからなる群から選択される少なくとも１種を用いることが好ましい。
【００３３】
培養条件は、本発明の微生物の増殖が実質的に阻害されず、微生物代謝産物を生産できる範囲であれば、特に制限なく当業者によって適宜調整されうるが、培養温度は、通常は２０〜４０℃、好ましくは３０〜３５℃である。また、培地のｐＨは、通常は４〜７であるが、滅菌後の培地における雑菌の増殖を抑えるためには、４〜５であることが好ましい。培養前または培養中にｐＨが４未満となる場合は、アンモニアなどを用いてｐＨ制御を行うことが好ましく、逆にｐＨが１０以上となる場合は、硫酸や塩酸などを用いてｐＨ制御をすることが好ましい。
【００３４】
培養方法は、微生物の種類によって異なるが、嫌気的条件および好気的条件のいずれかの培養方法を適宜採用することができる。培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができるが、微生物代謝産物の生産速度の向上のためには、撹拌装置を備えた培養槽を用いることが好ましい。かような培養装置としては、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、充填床培養槽、および流動床培養槽などが挙げられる。
【００３５】
以上の説明では、糖化液を製造する段階と、微生物代謝産物を製造する段階とを別々の段階として行うことによる微生物代謝産物の製造方法について説明してきたが、本発明によると、リグノセルロース系バイオマスの加水分解反応と微生物代謝産物を一段階で行うことも可能である。例えば、リグノセルロース系バイオマスの粉砕物を含む懸濁液に、加水分解酵素産生微生物および微生物代謝産物を産生する微生物を同時に添加し、混合培養を行うことによっても、微生物代謝産物を製造することができる。
【００３６】
上記の培養終了後、微生物代謝産物を含む培地から従来公知の手法により所望の微生物代謝産物を分離することができる。分離方法としては、例えば、カラムクロマトグラフィー、蒸留、および晶析などが挙げられる。これらの分離方法は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせても勿論よい。
【実施例】
【００３７】
本発明の作用効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
【００３８】
＜稲わらの粉砕＞
［製造例１］
脱穀した後、約２ヶ月屋内倉庫に保管した稲わらを、家庭用はさみで１〜５ｃｍ程度に裁断し、家庭用ミキサーで５分間粗く粉砕して、粉砕物Ａを得た。
【００３９】
［製造例２］
製造例１で調製した粉砕物Ａを、さらに、ボールミル（ＡＮＺ−６０Ｓ、日陶科学株式会社製）で１２時間微粉化して、粉砕物Ｂを得た。
【００４０】
［製造例３］
製造例１で調製した粉砕物Ａを、さらに、一旦水道水に懸濁し、これをホモジナイザー（ポリトロン ＰＴ２１００、ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ ＡＧ社）で１分間湿式粉砕して、粉砕物Ｃとした。
【００４１】
（粉砕物の粒度分布の測定）
製造例１および２で調製した粉砕物ＡおよびＢの粒度分布を２種類の試験用ふるい（呼び寸法１．０ｍｍおよび０．１ｍｍ、ＳＡＮＰＯ社製）を用いて測定した。具体的には、１．０ｍｍおよび０．１ｍｍの２種類のふるいを上から順番に重ね、最上部にサンプル５ｇ入れて間歇的に５分間ふるい、それぞれの段に残存した粉の質量を、サンプル５ｇに対する質量百分率（％）で示した。なお、製造例３の粉砕物Ｃは水中に懸濁しているために測定は不可能であった。結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
＜稲わら粉砕物の粒度の糖化への影響＞
［実施例１］
製造例２で調製した粉砕物Ｂ １．０ｇ、水道水１０ｍＬを１００ｍＬ三角フラスコ中で懸濁し、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ４．５に調整した。該懸濁液に加水分解酵素としてメイセラーゼ（明治製菓株式会社製、以下同じ）を粉砕物Ｂに対して１質量％添加し、ロータリーシェーカー（ＭＭＳ−１１０、東京理化学器械株式会社製）上で、５０℃で２４時間振盪（２００ｒｐｍ）して糖化を行った。
【００４４】
［比較例１］
粉砕物Ｂに換えて、製造例３で調製した粉砕物Ｃを用いたことを除いては、実施例１と同様の方法で糖化を行った。なお、粉砕物Ｃは十分に乾燥させて、乾燥質量として秤量した。
【００４５】
［比較例２］
粉砕物Ｂに換えて、製造例１で調製した粉砕物Ａを用いたことを除いては、実施例１と同様の方法で糖化を行った。
【００４６】
（全糖の定量）
全糖の定量は、中村道徳編、貝沼圭二編、「生物化学実験法（２５）澱粉・関連糖質酵素実験法」、学会出版センター版、１９８９年１０月発行、２０６頁に記載の硫酸フェノール法に準じて行った。
【００４７】
（グルコースの定量）
グルコースの定量は、和光純薬工業株式会社製、グルコースＣＩＩテストワコーを用いて行った。
【００４８】
全糖濃度、グルコース濃度、糖化率（稲わら粉砕物の乾燥質量に対する全糖量の質量百分率）の結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
＜加水分解酵素の影響＞
［実施例２］
製造例２で調製した粉砕物Ｂ ２．０ｇ、水道水１０ｍＬを１００ｍＬ三角フラスコ中で懸濁し、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ４．５に調整した。該懸濁液に加水分解酵素としてメイセラーゼを粉砕物Ｂに対して１質量％添加し、ロータリーシェーカー上で、５０℃で２４時間振盪（２００ｒｐｍ）して糖化を行った。
【００５１】
［実施例３］
加水分解酵素として、メイセラーゼに換えて、スミチームＣ（新日本化学工業株式会社製）を用いたことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００５２】
［実施例４］
加水分解酵素として、メイセラーゼ１質量％に換えて、液剤セルラーゼ（ＸＬ−５２２、ナガセケムテックス株式会社製）を粉砕物Ｂの質量に対して１．０％（ｖ／ｗ）を用いたことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００５３】
［実施例５］
加水分解酵素として、メイセラーゼに換えて、ヘミセルラーゼ「アマノ」９０（天野エンザイム株式会社製）を用いたことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００５４】
［比較例３］
加水分解酵素に換えて、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ１．０に調整してオートクレーブ１２１℃で３０分間処理することによって、硫酸加水分解を行い、その後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加することによりｐＨ４．５に調整したことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。なお、反応後の糖化液は黒褐色に着色していた。
【００５５】
実施例２〜５および比較例３の全糖濃度、グルコース濃度、糖化率の結果を表３に示す。
【００５６】
【表３】
【００５７】
＜加水分解酵素添加量の影響＞
［実施例６］
製造例２で調製した粉砕物Ｂ ２．０ｇ、水道水１０ｍＬを１００ｍＬ三角フラスコ中で懸濁し、１Ｎ塩酸を添加することによりｐＨ４．５に調整した。該懸濁液に加水分解酵素としてメイセラーゼを粉砕物Ｂに対して１質量％添加し、ロータリーシェーカー上で、５０℃で２４時間振盪（２００ｒｐｍ）して糖化を行った。
【００５８】
［実施例７］
メイセラーゼの添加量を０．５質量％としたことを除いては、実施例６と同様の方法で糖化を行った。
【００５９】
［実施例８］
メイセラーゼの添加量を０．２５質量％としたことを除いては、実施例６と同様の方法で糖化を行った。
【００６０】
実施例６〜８の全糖濃度、グルコース濃度、糖化率の結果を表４に示す。
【００６１】
【表４】
【００６２】
＜前処理条件の影響＞
［実施例９］
上記実施例２において、前処理として、粉砕物Ｂを水道水に懸濁し、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ４．５に調整し、オートクレーブ（ＨＶ−５０、株式会社平山製作所製）で１２１℃、２０分間蒸煮した後に、該懸濁液にメイセラーゼを添加したことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００６３】
［実施例１０］
上記実施例２において、前処理として、粉砕物Ｂを水道水に懸濁し、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ１．０４に調整し、１２１℃で２０分間蒸煮した後に、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加することによりｐＨ４．５に調整し、該懸濁液にメイセラーゼを添加したことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００６４】
［実施例１１］
上記実施例２において、前処理として、粉砕物Ｂを水道水に懸濁し、１Ｎアンモニア水を添加することによりｐＨ１０．１に調整し、１２１℃で２０分間蒸煮した後に、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ４．５に調整し、該懸濁液にメイセラーゼを添加したことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００６５】
［実施例１２］
上記実施例２において、前処理として、粉砕物Ｂを水道水に懸濁し、１Ｎアンモニア水を添加することによりｐＨ１０．５に調整し、１２１℃で２０分間蒸煮した後に、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ４．５に調整し、該懸濁液にメイセラーゼを添加したことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００６６】
［実施例１３］
上記実施例２において、前処理として、粉砕物Ｂを水道水に懸濁し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加することによりｐＨ１０．５に調整し、１２１℃で２０分間蒸煮した後に、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨ４．５に調整し、該懸濁液にメイセラーゼを添加したことを除いては、実施例２と同様の方法で糖化を行った。
【００６７】
実施例２および９〜１３の全糖濃度、グルコース濃度、糖化率の結果を表５に示す。
【００６８】
【表５】
【００６９】
＜糖化における初発のｐＨの影響＞
［実施例１４〜２２］
製造例２で調製した粉砕物Ｂ １．０ｇ、水道水１０ｍＬを１００ｍＬ三角フラスコ中で懸濁し、表６に示すように１Ｎ硫酸または１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加することによりｐＨを調整した。該懸濁液に加水分解酵素としてメイセラーゼを粉砕物Ｂに対して１質量％添加し、ロータリーシェーカー上で、５０℃で２４時間振盪（２００ｒｐｍ）して糖化を行った。
【００７０】
実施例１４〜２２の全糖濃度、グルコース濃度、糖化率の結果を表６に示す。
【００７１】
【表６】
【００７２】
＜乳酸製造用培地の最適化＞
［実施例２３］
製造例２で調製した粉砕物Ｂを水道水に対して３００ｇ／Ｌとなるように懸濁し、１Ｎ硫酸を添加することによりｐＨを４．５に調整した。該懸濁液に加水分解酵素としてメイセラーゼを粉砕物Ｂに対して１質量％添加し、ロータリーシェーカー上で、５０℃で２４時間振盪（２００ｒｐｍ）して糖化を行った（得られた糖化液を、「糖化液Ａ」と称する）。糖化液Ａに含まれる全糖の濃度は、１２０ｇ／Ｌであった。乳酸製造用培地として、糖化液Ａ６０ｍＬを３００ｍＬ三角フラスコに入れ、オートクレーブを用いて１２１℃で２５分滅菌して、培地を調製した。該培地に、予め前培養培地ａ（グルコース５０ｇ／Ｌ、コーンスターチ（日本コーンスターチ株式会社製、以下同じ）５０ｇ／Ｌ、硫安１．３５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．２５ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．０４ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム１ｇ／Ｌ、オートクレーブにて１２１℃で２５分間滅菌）で前培養（ロータリーシェーカーにて１７０ｒｐｍ、３０℃で２４時間培養）したＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）を３ｍＬ添加し、ロータリーシェーカー上で、３０℃で９６時間振盪（１７０ｒｐｍ）して乳酸発酵を行った。なお、乳酸発酵中のｐＨ調整のために、別途殺菌した炭酸カルシウム１ｇを添加した。
【００７３】
［実施例２４］
糖化液Ａに、酵母エキス（２１２７５０、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）を３ｇ／Ｌとなるように添加したものを乳酸製造用培地として用いた以外は、実施例２３と同様の方法で乳酸発酵を行った。
【００７４】
［実施例２５］
糖化液Ａに、コーンスティープリカー（ＣＬＳ）（０３４−１６７７５、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）を３ｇ／Ｌとなるように添加したものを乳酸製造用培地として用いた以外は、実施例２３と同様の方法で乳酸発酵を行った。
【００７５】
［実施例２６］
糖化液Ａに、硫安を３ｇ／Ｌとなるように添加したものを乳酸製造用培地として用いた以外は、実施例２３と同様の方法で乳酸発酵を行った。
【００７６】
［実施例２７］
糖化液Ａに、硝安を３ｇ／Ｌとなるように添加したものを乳酸製造用培地として用いた以外は、実施例２３と同様の方法で乳酸発酵を行った。
【００７７】
［比較例４］
培地１Ｌに対して、グルコース１２０ｇ、硫安１．３５ｇ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．２５ｇ、硫酸亜鉛七水和物０．０４ｇとなるように添加した培地（標準培地Ｘ）を乳酸製造用培地として用いた以外は、実施例２３と同様の方法で乳酸発酵を行った。
【００７８】
実施例２３〜２７および比較例４の結果を表７に示す。なお、全ての実施例および比較例において、乳酸発酵終了後の培地に含まれる残糖は極微量であった。
【００７９】
【表７】
【００８０】
表７の結果より、本発明の糖化液の製造方法によると、微量の窒素源を添加するのみで、標準培地Ｘと同等のＬ−乳酸が製造できることが示された。
【００８１】
＜稲わら糖化液を用いたＬ−乳酸の製造＞
［実施例２８］
３Ｌジャーファーメンター（３ＭＤＬ、株式会社丸菱バイオエンジ製、以下同じ）に水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら上記製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物２００ｇを加えて懸濁し、これに１Ｎ硫酸を添加してｐＨを４．５に調整した。該懸濁液にメイセラーゼを稲わら粉砕物に対して１．０質量％添加して、５０℃で７２時間糖化を行った。糖化反応中の糖化液の全糖濃度、グルコース濃度、および糖化率を測定した。結果を表８に示す。
【００８２】
【表８】
【００８３】
得られた糖化液をヌチェでろ過することによって不溶成分を取り除き、水道水を加えて液量を１．５Ｌに調整して、続く乳酸発酵に供した。該糖化液に、リン酸二水素カリウムを０．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウムを０．２５ｇ／Ｌとなるように添加し、オートクレーブを用いて１２１℃で１０分間滅菌して、培地を調製した。該培地に、予め前培養培地ａで前培養（ロータリーシェーカーにて１７０ｒｐｍ、３０℃で２４時間培養）したＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）を１００ｍＬを添加し、３００ｒｐｍ、通気量０．５ｖｖｍ、培養温度３０℃で７２時間培養した。培養中、培地のｐＨをｐＨセンサー（ＧＳ−８４０５、東亜ディーケーケー株式会社製）で随時モニタリングし、２５％アンモニア水を加えることによってｐＨを６．０に維持した。培養開始後の乳酸濃度、全糖濃度、およびグルコース濃度の経時変化を表９に示す。なお、全糖に対するＬ−乳酸の収率は６７質量％であり、使用した稲わら粉砕物に対するＬ−乳酸の収率は４７質量％であった。
【００８４】
【表９】
【００８５】
［比較例５］
３Ｌジャーファーメンターに水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物２００ｇを加えて懸濁し、さらに水道水を加えることによって懸濁液の総容積を１．５Ｌとした。これに１Ｎ硫酸を添加してｐＨを１．５に調整し、オートクレーブにて１２１℃、２時間加圧して酸糖化を行った。得られた糖化液の全糖濃度は４０．２ｇ／Ｌ、グルコース濃度は２３．５ｇ／Ｌであった。該糖化液に、別に殺菌したリン酸二水素カリウムを０．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウムを０．２５ｇ／Ｌとなるように添加した後、ｐＨセンサーでモニタリングしながら、同じく殺菌した２５％アンモニア水でｐＨを６．０に戻した。該培地に、予め前培養培地ａで前培養（ロータリーシェーカーにて１７０ｒｐｍ、３０℃で２４時間培養）したＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）を添加し、３００ｒｐｍ、通気量０．５ｖｖｍ、培養温度３０℃ので４８時間培養した。培養中、培地のｐＨをｐＨセンサーで随時モニタリングし、２５％アンモニア水を加えることによってｐＨを６．０に維持した。培養中の乳酸濃度、全糖濃度、およびグルコース濃度の経時変化を表１０に示す。
【００８６】
【表１０】
【００８７】
表１０を参照すると、４８時間で１８．７ｇ／ＬのＬ−乳酸が生産されており、収率を算出すると、全糖に対しては４７質量％、稲わら粉砕物に対しては１４質量％となった。これらの収率は、酵素を用いた糖化液を用いた上記実施例２８と比較して、著しく低く、また得られたＬ−乳酸培養液が黒褐色に着色していたため、精製回収が非常に困難であると考えられた。
【００８８】
＜混合培養によるＬ−乳酸の製造＞
［実施例２９］
グルコース３０ｇ／Ｌ、アルボセル（三木産業製）１０ｇ／Ｌ、大豆粉（豊年製油）６０ｇ／Ｌ、硝酸アンモニウム３．２ｇ／Ｌを含む培地６０ｍＬを３００ｍＬ三角フラスコに入れ、１２１℃で２５分殺菌した。該培地に、スラント（ＹＰＤ寒天培地）上のＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｕ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ ２４６２２を一白金耳接種し、ロータリーシェーカー（２００ｒｐｍ）を用いて３０℃で７２時間培養した。一方、製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物を１００ｇ／Ｌ、硫安を１．３５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウムを０．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物を０．２５ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物を０．０４ｇ／Ｌとなるように添加し、水道水で１Ｌとして３Ｌジャーファーメンターに入れオートクレーブを用いて１２１℃で２５分間殺菌した。この培地に上記Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍの培養液６０ｍＬを添加し、撹拌しながら３５℃で２４時間培養した。Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍの増殖を顕微鏡で確認後、該培養液に、別途上記前培養培地ａ ６０ｍＬを入れた３００ｍＬ三角フラスコでロータリーシェーカーを用いて３０℃で２４時間振盪培養したＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）を全量添加し、３５℃でＡ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍとＲ．ｓｐ．ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）による混合培養を行った。通気量は０．５ｖｖｍとし、溶存酸素（ＤＯ）濃度はＤＯセンサー（ＯＸ−２５００、丸菱バイオエンジ株式会社製）でモニタリングしながら２０％以上に維持した。また、２５％アンモニウム水を用いてｐＨを６．０に維持した。培養中のＡ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍおよびＲ．ｓｐ．ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の生菌数、全糖濃度、グルコース濃度および乳酸濃度の経時変化を表１１に示す。なお、稲わら粉砕物に対するＬ−乳酸の収率は２５質量％であった。
【００８９】
【表１１】
【００９０】
以上の結果より、Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍとＲ．ｓｐ．ＭＫ９６−１１５６（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７７７）の混合培養によって同時に糖化および乳酸発酵を行えることが示された。
【００９１】
＜稲わら糖化液を用いたエタノールの製造＞
［実施例３０］
３Ｌジャーファーメンターに水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物２００ｇを加えて懸濁し、さらに水道水を加えて液量を１．５Ｌとした。次に、該懸濁液に２５％塩酸を加えてｐＨを４．５に調整し、メイセラーゼを稲わら粉砕物に対して１質量％加えて、５０℃で２４時間糖化を行った。得られた糖化液に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨを６．０に調整した。該糖化液をオートクレーブを用いて、１２１℃で１５分間滅菌して培地とした。これとは別に、ＹＰＤ培地（グルコース２０ｇ／Ｌ、ポリペプトン（３９４−００１５、日本製薬株式会社製、以下同じ）２０ｇ／Ｌ、酵母エキス（２１２７５０、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）１０ｇ／Ｌ）に予め３０℃で２日間往復振盪培養したＰａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ ＮＢＲＣ １００７を１００ｍＬ添加し、溶存酸素濃度を２０％に維持しながら、培養温度３０℃で通気撹拌培養を行った。培養の経過変化を表１２に示す。
【００９２】
【表１２】
【００９３】
表１２に示すように、該エタノール産生菌は、培養開始後２４時間でグルコースを全て消費した。その後、キシロースなどのグルコース以外の糖類が消費され、最終的には培養開始後１４４時間で資化可能な糖類はほぼ全て消費された。エタノールの収率は、全糖に対して３９．８質量％であり、稲わら粉砕物に対して２６質量％であった。
【００９４】
＜稲わら糖化液を用いたイタコン酸の製造＞
［実施例３１］
３Ｌジャーファーメンターに水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物２００ｇを加えて懸濁し、該懸濁液に１Ｎ硫酸を添加してｐＨを４．５に調整した。これにメイセラーゼを稲わら粉砕物に対して１質量％加えて、５０℃で２４時間糖化を行った。得られた糖化液に２０％硝酸を添加してｐＨを２．０に調整した。該糖化液をオートクレーブで１２１℃、５分間滅菌して、イタコン酸生産培地とした。これとは別に、前培養培地ｂ（グルコース５５．５ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー（０３４−１６７７５、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）３ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物１．８ｇ／Ｌ）を用いて予め３０℃で２日間往復振盪培養したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ＴＮ−４８４（Ｙａｈｉｒｏ，Ｋ．， Ｔａｋａｈａｍａ， Ｔ．， Ｔ． Ｐａｒｋ， Ｙ．Ｓ．， Ｏｋａｂｅ Ｍ．， “Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｍｕｔａｎｔ ＴＮ−４８４ ｆｏｒ ｉｔａｃｏｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ．” Ｊ． Ｆｅｒｍｅｎｔ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ７９， ５０６〜５０８ （１９９５））を１００ｍＬ添加し、溶存酸素濃度をＤＯセンサーでモニタリングしながら２０％に維持し、培養温度３０℃で通気撹拌培養を行った。なお、イタコン酸濃度は、Ｃａｐｃｅｌｌ ＰａＫ Ｃ１８ ＭＧ Ｌｏｔ． ＢＳ１４カラム（株式会社資生堂製）を装着したＨＰＬＣ（ＬＣ−１０Ａ、株式会社島津製作所製）で分析した。７０％アセトニトリルを移動相とし、１ｍＬ／ｍｉｎの速度で溶出し、２５７ｎｍで検出することによって測定した。また、菌体質量は、菌体を０．８５％生理食塩水で洗浄し、１０５℃で２時間乾燥後秤量することによって測定した。培養の経時変化を表１３に示す。
【００９５】
【表１３】
【００９６】
表１３に示すように、培養開始と同時にグルコースが消費され、培養開始９６時間後にほぼ全て消費された。最終的に、培養開始１４４時間後のイタコン酸の収率は、全糖に対しては４１質量％（理論収率は７２％）であり、稲わら粉砕物に対しては３２質量％であった。
【００９７】
＜稲わら糖化液を用いたフマル酸の製造＞
［実施例３２］
３Ｌジャーファーメンターに水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物２５０ｇを加えて懸濁し、該懸濁液に１Ｎ硫酸を添加してｐＨを４．５に調整した。これにメイセラーゼを稲わら粉砕物に対して１質量％加えて、５０℃で２４時間糖化を行った。該糖化液を３Ｌジャーファーメンターに入れ、これに硫安を１．３５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウムを０．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物を０．２５ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物を０．０４ｇ／Ｌとなるように添加した。該糖化液に１Ｎ硫酸を添加してｐＨを４．５に調整し、さらに水道水を加えて液量を１．５Ｌとした後、オートクレーブにて１２１℃、２５分間殺菌を行い、フマル酸生産培地とした。これとは別に、滅菌済みの５００ｍＬ容三角フラスコに、前培養培地ｃ（グルコース５５．５ｇ／Ｌ、硫安１．３５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．２５ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．０４ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム１５ｇ／Ｌ）を９０ｍＬ分注した。Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＮＢＲＣ ４７０７(ＩＦＯ ４７０７)を培養するスラントに、滅菌した０．８５％生理食塩水を１０ｍＬ入れて胞子を懸濁した。そして、上記前培養培地に該懸濁液を植菌し、ロータリーシェーカー上で２２０ｒｐｍ、３２℃で、１８時間往復振盪培養を行った。該前培養液１００ｍＬを上記フマル酸生産培地１．５Ｌに添加後、温度３２℃、回転数３００ｒｐｍ、通気量０．５ｖｖｍで培養を行った。培養中のｐＨをｐＨセンサーを用いてモニタリングしながら、１２．５％アンモニア水でｐＨを６．０に維持した。なお、培養液中のフマル酸濃度および菌体濃度の測定は、以下の方法を用いて行った。培養の経時変化を表１４に示す。
【００９８】
（フマル酸濃度の測定）
フマル酸濃度は、ＨＰＬＣ（ＣＬ−１０Ａ、株式会社島津製作所製）を用いて測定した。液体クロマトグラフＬＣ−１０Ａ、カラムオーブンＣＴＯ−６Ａ、紫外線検出器ＳＰＤ−６Ａ、クロマトパックＣ−Ｒ６Ａ（株式会社島津製作所製）を用いて行った。カラムはＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ）、ガードカラムはＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（４．６ｍｍφ×３５ｍｍ）（株式会社資生堂製）を用いた。移動相は２．５％高速液体クロマトグラフ用アセトニトリル（和光純薬工業）と０．１％Ｈ３ＰＯ３（和光純薬工業）の混合液を０．４５μｍのメンブレンフィルター（ＪＨ、日本ミリポア株式会社製）でろ過した。カラム温度３５℃、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎに設定した。紫外線で検出を行い、検出波長は２１０ｎｍとした。
【００９９】
（菌体濃度の測定）
菌体濃度は、乾燥菌体重量法（Ｄｒｙ Ｃｅｌｌ Ｗｅｉｇｈｔ）を用いて菌体質量を求めた後、これを濃度に換算することによって求めた。菌体質量の測定は、具体的には以下の方法で行った。まず、シャーレにろ紙（アドバンテック東洋株式会社製）を入れ、１０５℃のオーブンで２時間乾熱後、デシケーター内で放冷し、ろ紙を定量した。このろ紙を用いて、培養液１０ｍＬを吸引ろ過し、蒸留水でよく洗浄した後、１０５℃のオーブンで２時間乾熱した。デシケーターで放冷後、秤量し、菌体質量を求めた。
【０１００】
【表１４】
【０１０１】
表１４に示すように、９６時間後のフマル酸の収率は、全糖に対して２９質量％であり、稲わら粉砕物に対して１７質量％であった。
【０１０２】
＜稲わら糖化液を用いたリンゴ酸の製造＞
［実施例３３］
３Ｌジャーファーメンターに水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物３５０ｇを加えて懸濁し、該懸濁液に１Ｎ硫酸を添加してｐＨを４．５に調整した。これにメイセラーゼを稲わら粉砕物に対して１質量％加えて、５０℃で２４時間糖化を行った。得られた糖化液を、全糖濃度が１２０ｇ／Ｌとなるように希釈し、硫安を１．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウムを０．０３５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウムを０．０３５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウムを０．１ｇ／Ｌ、硫酸鉄を０．０６ｇ／Ｌ、塩化カルシウムを０．１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウムを０．００５ｇ／Ｌ、炭酸カルシウムを９０ｇ／Ｌとなるように添加した。この糖化液を２．５Ｌをジャーファーメンター（５ＭＤＬ、丸菱バイオエンジ株式会社）に入れ、オートクレーブにて１２１℃、２５分間滅菌して、リンゴ酸生産培地とした。これとは別に、滅菌済みの５００ｍＬ容三角フラスコに、前培養培地ｄ（グルコース１２０ｇ／Ｌ、硫安４ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．７５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．７５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．１ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．００５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．００５ｇ／Ｌ）を９０ｍＬ分注した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ＡＴＣＣ１３６９７を培養するスラントに、滅菌した０．８５％生理食塩水を１０ｍＬ入れて胞子を懸濁した。そして、上記前培養培地に該懸濁液を植菌し、ロータリーシェーカー上で２２０ｒｐｍ、３２℃で、１８時間往復振盪培養を行った。上記リンゴ酸生産培地に対して１０体積％の量の前培養培地を、リンゴ酸生産培地に植菌し、温度３２℃、回転数３００ｒｐｍ、通気量０，５ｖｖｍで２６４時間培養を行った。なお、培養液中のリンゴ酸濃度は実施例３２のフマル酸濃度の測定に準じて行った。また、菌体濃度の測定は、実施例３２と同様の方法で行った。培養の経時変化を表１５に示す。
【０１０３】
【表１５】
【０１０４】
表１５に示すように、２６４時間後のＬ−リンゴ酸の収率は、全糖に対して７２質量％であり、稲わら粉砕物に対して２９質量％であった。
【０１０５】
＜稲わら糖化液を用いたピルビン酸の製造＞
［実施例３４］
３Ｌジャーファーメンターに水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物３００ｇを加えて懸濁し、該懸濁液に１Ｎ硫酸を添加してｐＨを４．５に調整した。これにメイセラーゼを稲わら粉砕物に対して１質量％加えて、５０℃で２４時間糖化を行った。得られた糖化液を、全糖濃度が５０ｇ／Ｌとなるように希釈し、コーンスティープリカーを１５ｇ／Ｌ、硫安を６ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウムを１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウムを０．５ｇ／Ｌ、ニコチン酸（１４２−０１２３２３、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）を０．４ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩（１６８−２００３１、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）を０．２ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩（２０３−００８５１、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）を０．０２ｇ／Ｌ、ビオチン（０２３−０８７１１、和光純薬工業株式会社製、以下同じ）を０．００５ｍｇ／Ｌとなるように添加した。そして、１Ｎ硫酸を添加してｐＨを５．０に調整した。該培地を３Ｌジャーファーメンターに入れ、オートクレーブにて１２１℃で２５分間滅菌して、ピルビン酸生産培地とした。これとは別に、前培養培地ｅ（グルコース５０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー１５ｇ／Ｌ、硫安６ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、ニコチン酸０．４ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩０．２ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．０２ｇ／Ｌ、ビオチン０．００５ｍｇ／Ｌ）で予め３０℃で２日間往復振盪培養したＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ ＮＢＲＣ ０００５（ＩＦＯ ０００５）の前培養液１００ｍＬを、上記ピルビン酸生産培地に添加し、溶存酸素濃度を２０％に維持しながら、培養温度３０℃で通気撹拌培養を行った。なお、培養液中のピルビン酸濃度は実施例３２のフマル酸濃度の測定に準じて行った。また、菌体濃度の測定は、実施例３２と同様の方法で行った。培養の経時変化を表１６に示す。
【０１０６】
【表１６】
【０１０７】
表１６に示すように、培養開始３６時間後でピルビン酸の濃度は４４．６ｇ／Ｌに達し、その後徐々に減少した。８４時間後のピルビン酸の収率は、全糖に対して３１質量％であり、稲わら粉砕物に対しては１９質量％であった。
【０１０８】
＜稲わら糖化液を用いたキシリトールの製造＞
［実施例３５］
３Ｌジャーファーメンターに水道水１．０Ｌを入れ、撹拌しながら製造例２と同様の方法で得た稲わら粉砕物２２０ｇを加えて懸濁し、該懸濁液に１Ｎ硫酸を添加してｐＨを４．５に調整した。これにメイセラーゼを稲わら粉砕物に対して１質量％加えて、５０℃で２４時間糖化を行った。得られた糖化液をＤ−キシロース濃度が６％となるように希釈し、酵母エキスを１％、リン酸水素二カリウムを１．５％、硫安を０．３％、硫酸マグネシウム七水和物を０．３％となるように添加した。そして、１Ｎ硫酸を添加してｐＨを５．０に調整した。該培地を３Ｌジャーファーメンターに入れ、オートクレーブにて１２１℃で２５分間滅菌して、キシリトール生産培地とした。これとは別に、前培養培地ｆ（Ｄ−キシロース６％、酵母エキス１％、リン酸水素二カリウム１．５％、硫安０．３％、硫酸マグネシウム七水和物０．３％）で予め３０℃で２日間往復振盪培養したＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ＮＢＲＣ ０６１８（ＩＦＯ ０６１８）の前培養液１００ｍＬを、上記キシリトール生産培地に添加し、溶存酸素濃度を２０％に維持しながら、培養温度３０℃、回転数３００ｒｐｍ、通気寮０．５ｖｖｍで通気撹拌培養を行った。なお、培養液中のキシリトール濃度は、Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２ｐ−５０ ４Ｅカラムを装着したＨＰＬＣ（ＬＣ−１０Ａ、株式会社島津製作所製）で分析した。アセトニトリル／水＝７０／３０（ｖ／ｖ）を移動相とし、１ｍＬ／ｍｉｎの速度で溶出し、２５７ｎｍで検出することによって測定した。また、菌体濃度の測定は、実施例３２と同様の方法で行った。培養の経時変化を表１７に示す。
【０１０９】
【表１７】
【０１１０】
表１７に示すように、培養開始７２時間後のキシリトールの収率は、全糖に対して５６．８質量％であり、稲わら粉砕物に対しては３９質量％であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程と、得られた粉砕物を加水分解酵素を用いて加水分解する工程とを含む、糖化液の製造方法。
【請求項２】
前記粉砕物の全質量（乾燥質量換算）に対して５０質量％以上の粉砕物の粒度が、１．０ｍｍ未満である、請求項１に記載の糖化液の製造方法。
【請求項３】
前記粉砕が、乾式粉砕である、請求項１または２に記載の糖化液の製造方法。
【請求項４】
前記リグノセルロース系バイオマスが、稲わら、籾殻、麦わら、バガス、ヤシ殻、コーンコブ、雑草、木材、パルプ、および紙からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖化液の製造方法。
【請求項５】
前記加水分解酵素が、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、およびアミラーゼからなる群から選択される少なくとも１種を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖化液の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によって製造された糖化液を含む培地で微生物を培養する工程を含む、微生物代謝産物の製造方法。
【請求項７】
前記微生物代謝産物が、乳酸、エタノール、イタコン酸、フマル酸、リンゴ酸、ピルビン酸、およびキシリトールからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項６に記載の微生物代謝産物の製造方法。
【請求項８】
前記微生物が、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、およびアクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｕ）に属する微生物からなる群から選択させる少なくとも１種に属する、請求項６または７に記載の微生物代謝産物の製造方法。
【請求項９】
リグノセルロース系バイオマスの粉砕物を含む培地で、加水分解酵素産生微生物および微生物を培養する工程を含む、微生物代謝産物の製造方法。
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程と、得られた粉砕物を加水分解酵素を用いて加水分解する工程とを含む、糖化液の製造方法。
【請求項２】
前記粉砕物の全質量（乾燥質量換算）に対して５０質量％以上の粉砕物の粒度が、１．０ｍｍ未満である、請求項１に記載の糖化液の製造方法。
【請求項３】
前記粉砕が、乾式粉砕である、請求項１または２に記載の糖化液の製造方法。
【請求項４】
前記リグノセルロース系バイオマスが、稲わら、籾殻、麦わら、バガス、ヤシ殻、コーンコブ、雑草、木材、パルプ、および紙からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖化液の製造方法。
【請求項５】
前記加水分解酵素が、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、およびアミラーゼからなる群から選択される少なくとも１種を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖化液の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によって製造された糖化液を含む培地で微生物を培養する工程を含む、微生物代謝産物の製造方法。
【請求項７】
前記微生物代謝産物が、乳酸、エタノール、イタコン酸、フマル酸、リンゴ酸、ピルビン酸、およびキシリトールからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項６に記載の微生物代謝産物の製造方法。
【請求項８】
前記微生物が、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、およびアクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｕ）に属する微生物からなる群から選択させる少なくとも１種に属する、請求項６または７に記載の微生物代謝産物の製造方法。
【請求項９】
リグノセルロース系バイオマスの粉砕物を含む培地で、加水分解酵素産生微生物および微生物を培養する工程を含む、微生物代謝産物の製造方法。
【公開番号】特開２０１０−１０４３６１（Ｐ２０１０−１０４３６１Ａ）
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０４９４４（Ｐ２００９−２０４９４４）
【出願日】平成２１年９月４日（２００９．９．４）
【出願人】（３９００２２３０１）株式会社武蔵野化学研究所 (63)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月４日（２００９．９．４）
【出願人】（３９００２２３０１）株式会社武蔵野化学研究所 (63)
【Ｆターム（参考）】
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