リパーゼ活性の回復方法
【課題】低下したリパーゼ活性を回復させることができる方法を提供すること。
【解決手段】担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径1μｍ以上で300μｍ未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後、トリアシルグリセロールで洗浄することを含むリパーゼ活性の回復方法。
【解決手段】担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径1μｍ以上で300μｍ未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後、トリアシルグリセロールで洗浄することを含むリパーゼ活性の回復方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物の各種エステル化能やエステル交換能などのリパーゼ活性を回復させる方法及び回復させた固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物を用いるエステル化反応や油脂のエステル交換方法などに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼは、脂肪酸などの各種カルボン酸とモノアルコールや多価アルコールなどのアルコール類とのエステル化反応、複数のカルボン酸エステル間のエステル交換反応などに幅広く使用されている。このうち、エステル交換反応は動植物油脂類の改質をはじめ、各種脂肪酸のエステル、糖エステルやステロイドの製造法として重要な技術である。これらの反応の触媒として、油脂加水分解酵素であるリパーゼを用いると、室温ないし約７０℃程度の温和な条件下でエステル交換反応を行うことができ、従来の化学反応に比べ、副反応の抑制やエネルギーコストが低減化されるだけでなく、触媒としてのリパーゼが天然物であることから安全性も高い。また、その基質特異性や位置特異性により目的物を効率良く生産することができる。ところが、一般的にリパーゼ粉末をそのままエステル交換反応に用いても活性が十分に発現しないばかりか、元来が水溶性のリパーゼを油性原料中に均一に分散させることは困難であり、その回収も困難である。このため、従来はリパーゼを何らかの担体、たとえば陰イオン交換樹脂（特許文献１）、フェノール吸着樹脂（特許文献２）、疎水性担体（特許文献３）、陽イオン交換樹脂（特許文献４）、キレート樹脂（特許文献５）等に固定化してエステル化やエステル交換反応などに用いることが一般的である。
【０００３】
しかしながら、リパーゼを担体に固定化すると、リパーゼ活性が低下してしまうので、リパーゼ粉末を用いた各種技術が開発されてきた。
具体的には、不活性有機溶媒の存在下または非存在下、エステル交換反応時に分散リパーゼ粉末粒子の９０％以上を１〜１００μｍの範囲の粒子径に保つように、エステルを含有する原料にリパーゼ粉末を分散させてエステル交換反応を行う方法が提案されている（特許文献６）。又、リン脂質および脂溶性ビタミンを含む酵素溶液を乾燥して得た酵素粉末を用いることが提案されている（特許文献７）。
一方、酵素であるリパーゼは高価であるため、反応終了後回収して繰り返し使用し、リパーゼ活性がかなり低下した場合に初めて廃棄されている。しかしながら、低下したリパーゼ活性を回復させることができれば、リパーゼの使用効率が格段に向上するので、工業的見地から、リパーゼ活性を回復させる有効な方法の開発が望まれている。
【０００４】
【特許文献１】特開昭６０−９８９８４号公報
【特許文献２】特開昭６１−２０２６８８号公報
【特許文献３】特開平２−１３８９８６号公報
【特許文献４】特開平３−６１４８５号公報
【特許文献５】特開平１−２６２７９５号公報
【特許文献６】特許第２６６８１８７号公報
【特許文献７】特開２０００−１０６８７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、低下したリパーゼ活性を回復させることができる方法を提供することを目的とする。
本発明は、又、回復したリパーゼ活性を有する固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物を用いるエステル化方法及びエステル交換方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、特定の固定化リパーゼ又は該固定化リパーゼの粉砕物をろ過助剤と併用してなるリパーゼ粉末組成物について、リパーゼ活性が低下したものをトリアシルグリセロールで洗浄すると、初期のリパーゼ活性を回復させることができるとの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径1μｍ以上で300μｍ未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後、トリアシルグリセロールで洗浄することを特徴とするリパーゼ活性の回復方法を提供する。
本発明は、又、担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径1μｍ以上で300μｍ未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後、反応系から分離し、トリアシルグリセロールで洗浄してリパーゼ活性を回復させた後、この固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物を用いてエステル化反応又はエステル交換反応を行うことを特徴とするエステル化反応又はエステル交換反応方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、リパーゼを各種反応に用いることにより低下したものについては、これまで廃棄されてきたが、本発明の方法により、リパーゼ活性を回復させることができるので、リパーゼの使用寿命を延ばすことができ、リパーゼを用いて製造される製品のコストを低下させることができるので、本発明は工業的見地から大きなメリットを有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明で用いるリパーゼは、サーモマイセス属(Thermomyces sp.)由来のものであって、担体、好ましくはシリカ担体に固定化されたリパーゼである。本発明ではこれをそのまま使用するか、又は該リパーゼを1μｍ以上で300μｍ未満の平均粒子径に粉砕したものを使用することができる。ここで、シリカ担体に固定化された該リパーゼの平均粒子径は300〜1000μｍ程度であるのが好ましい。このような固定化リパーゼは、例えば、ノボザイムズA/S社からリポザイムTL-IMとして入手することができる。
このような固定化リパーゼを粉砕品とするには、通常の粉砕機を用いて、1μｍ以上で300μｍ未満の平均粒子径、好ましくは平均粒子径1〜200μｍ、より好ましくは平均粒子径1〜100μｍ、特に好ましくは平均粒子径20〜100μｍとなるように粉砕するのがよい。ここで、粉砕機としては、乳鉢、せん断摩擦式粉砕機、カッター式粉砕機、石臼（マイコロイダー、マスコロイダー）、コーヒーミル、パワーミル、ピンミル、衝撃式粉砕機（ハンマーミル、ボールミル）、ロール式粉砕機及び気流式粉砕機、ホモジナイザー、超音波破砕機などがあげられる。
【０００９】
本発明で対象とするリパーゼが上記粉砕品である場合、ろ過助剤と組み合わせて用いるのが好ましい。ろ過助剤としてはセライトなどの無機ろ過助剤及びセルロースなどの繊維やその粉砕物などの有機ろ過助剤があげられる。これのうち、有機ろ過助剤、特に有機高分子ろ過助剤が好ましく、なかでもセルロースなどが好ましく、日本製紙ケミカル（株）から商品名ＫＣフロックで発売されているもの等が好ましいものとしてあげられる。ろ過助剤も粉状であるのが好ましく、平均粒子径10〜90μｍであるのが好ましい。
上記リパーゼ粉砕品とろ過助剤との質量比は、１/１０〜１０/１であるのが好ましく、特に1/7〜2/1であるのが好ましい。
【００１０】
本発明で用いる上記固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物は、そのまま油脂のエステル交換反応やエステル化反応に用いることができるが、長鎖脂肪酸トリグリセリドと中鎖脂肪酸トリグリセリドとを接触させ、次いで採取することにより、精製することができ、同時にリパーゼ活性を向上させることができる。
ここで用いる長鎖脂肪酸トリグリセリド及び中鎖脂肪酸トリグリセリドとしては、後述の固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物の洗浄の項に記載のものを用いるのが好ましい。
長鎖脂肪酸トリグリセリドと中鎖脂肪酸トリグリセリドとを、質量比にして、95：5〜50：50の割合で使用するのが好ましく、リパーゼの全質量に対して２倍〜100倍の質量のトリグリセリドを接触させるのが好ましい。
上記固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物を用いるエステル化反応としては、該固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物の存在下に、油脂のエステル化反応を行い、次いで固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物を回収しリサイクルするのが好ましい。
【００１１】
特に、上記リパーゼ粉末組成物は、リパーゼ活性が向上しており、かつエステル化反応やエステル交換反応における使用しやすさ（操作性）が向上し、リサイクルしてこれらの反応に使用することができるので、工業的規模での油脂のエステル交換などによる油脂の改質に好適に用いることができる。
しかしながら、このようなリパーゼ粉末組成物や固定化リパーゼを、リサイクルして何回もエステル化反応やエステル交換反応に使用すると、使用回数に応じて、エステル化能やエステル交換能といったリパーゼ活性が低下する。
本発明は、このようなリパーゼ活性が低下した固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物を特定の条件で洗浄すると、リパーゼ活性が回復し、又、上記リパーゼ粉末組成物については、向上したリパーゼ活性と使用しやすさ（操作性）とを長い期間利用し続けることを可能とするものである。
本発明で対象とする固定化リパーゼやリパーゼ活性が低下したリパーゼ粉末組成物としては、初期の活性に対して少しでも低下したものを対象とすることができるが、工業的見地から、初期の活性（１００％）が７０〜５０％に低下したものを対象とするのが好ましい。
【００１２】
ここで、固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物を洗浄するために用いるトリアシルグリセロールとしては、室温で液状であるのが好ましい。特に、上述したリパーゼ粉末組成物を精製するのに用いる長鎖脂肪酸トリグリセリドと中鎖脂肪酸トリグリセリドの混合物を用いるのが好ましい。
ここで用いる長鎖脂肪酸トリグリセリドとしては、構成脂肪酸の炭素数が14〜24のトリグリセリドであるのが好ましく、特に菜種油、大豆油、ヒマワリ油、紅花油、コーン油からなる群から選ばれる植物油であるのが好ましい。
中鎖脂肪酸トリグリセリドとしては、構成脂肪酸の炭素数が6〜12のトリグリセリドであるのが好ましい。このような脂肪酸トリグリセリドは、公知の製法で製造することもできるし、市販品を使用することもできる。市販品としては、例えば日清オイリオグループ（株）から商品名ＯＤＯで販売されている。
長鎖脂肪酸トリグリセリドと中鎖脂肪酸トリグリセリドとを、質量比にして、95：5〜50：50の割合で使用するのが好ましく、リパーゼの全質量に対して好ましくは２倍〜100倍、より好ましくは５〜５０倍の質量のトリグリセリドを接触させるのがよい。
特に、洗浄に用いるトリアシルグリセロールとしては、エステル交換をするための原料油であるのが好ましい。
【００１３】
洗浄は、固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物中のリパーゼが、上記トリアシルグリセロールに十分接触するようにして行うのが好ましく、具体的には、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後の固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物をトリアシルグリセロール中に攪拌して分散させ、次でトリアシルグリセロールから分離することにより行うのが好ましい。
接触、具体的には、攪拌は１０〜４５℃が好ましく、特に好ましくは室温で、好ましくは２時間以上、より好ましくは１０時間以上、特に好ましくは１２時間〜４８時間行うのがよい。尚、所望により４８時間以上行ってもよい。
攪拌を行うのに用いる攪拌機は特に限定されないが、羽根攪拌機、マグネチックスターラー、スリーワンモーターなどを用いるのが好ましい。
このようにして、固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物中のリパーゼをトリアシルグリセロールに十分接触させた後、常法によりろ過してトリアシルグリセロールから固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物を分離し、再度エステル化やエステル交換反応に使用する。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
【実施例】
【００１４】
実施例１
(1)ノボザイムズA/S社製リポザイムTL-IM(平均粒子径８００μｍ) 1Kgをホソカワミクロン（株）社製のピンミル（ファインインパクトミル100UPZ）を用い、17600rpmにて粉砕した。粉砕したリパーゼ粒子径を堀場製作所社製の粒度分布計LA-500を用いて測定したところ、平均粒子径は13.8μｍであった。この粉末にろ過助剤としてセルロースパウダー（日本製紙ケミカル：平均粒子径30μｍ）を1ｋｇ加えてリパーゼ粉末組成物とした。
(2)このようにして得られたリパーゼ組成物５ｇに対して菜種脱色油90ｇおよびODO（日清オイリオグループ（株）社製:中鎖脂肪酸トリグリセリド）10ｇを添加して室温で、24時間攪拌した後、ろ過してリパーゼ組成物を回収した。このリパーゼ組成物のエステル交換活性を下記の方法で測定したところ、粉砕前のリポザイムTL-IMの活性を１００とした場合の相対活性は７１４であった。
【００１５】
リパーゼ活性の測定方法
トリオレインとトリカプリリンを１：１（ｗ）の割合で混合した油に、リパーゼ組成物を添加し60℃で反応させた。経時的に10μｌをサンプリングし、ヘキサン1.5ｍｌで希釈後、リパーゼ組成物をろ過した溶液をガスクロマトグラフフィー（GC）用サンプルとした。GC(カラム：DB-１ht)で分析し下式より反応率を求めた。GC条件は、カラム温度：初期150℃、昇温：15℃/分、最終370℃である。
反応率（％）＝{C34area/(C24area+C34area)}×100
式中、C24はトリカプリリン、C34はトリカプリリンの１つの脂肪酸がオレイン酸に置き換わったものを示し、areaはそれらのエリア面積である。各時間における反応率の基づき、解析ソフト（origin ver.6.1）により反応速度定数ｋ値を求めた。
リパーゼ活性はリポザイムTL-IMのｋ値を100とした時の相対活性で表した。
(3)菜種脱色油（日清オイリオグループ（株）社製）85ｇ、およびODO（日清オイリオグループ（株）社製）15ｇに上記(2)で得られたリパーゼ組成物１質量％を添加して60℃で、19時間攪拌しエステル交換反応を行った。エステル交換率を経時的に求め、反応の進行を確認した。尚、エステル交換反応は、ガスクロマトグラフィーを用いてグリセリド組成を分析し、測定試料中におけるエステル交換反応物の比率を算出して求めた。
反応後リパーゼ組成物をろ過して回収し、その回収したリパーゼ組成物を繰り返しエステル交換反応に用いた。繰り返し反応を数回行い、相対比で反応率の変化を確認したものを図1に示す。
図１に示されている結果から、合計反応時間が約８２時間に達すると、リパーゼ組成物のリパーゼ活性が約６０％に低下することがわかる。
【００１６】
(4)上記(3)において、相対活性が約６０％に低下したリパーゼ組成物をろ過して回収し、その回収したリパーゼ組成物に菜種脱色油（日清オイリオグループ（株）社製）18ｇ、およびODO（日清オイリオグループ（株）社製）2ｇに添加して室温で、マグネチックスターラーを用いて24時間攪拌した。ろ過によりリパーゼ組成物を回収後、再び上記(3)と同様に繰り返しエステル交換反応を行った。相対比で反応率の変化を確認した結果を図2に示す。
図２に示されている結果から、活性が低下したリパーゼ組成物を攪拌洗浄することにより、リパーゼ活性が当初の１００％に回復し、リパーゼ組成物をリサイクルして何回も使用できることがわかる。
【００１７】
実施例２
(2-1)実施例１の(1)で得られたリパーゼ組成物５ｇに対して菜種脱色油90ｇおよびODO（日清オイリオグループ（株）社製）10ｇを添加して60℃、2時間攪拌した後、ろ過してリパーゼ組成物を回収した。このリパーゼ組成物のエステル交換活性を実施例１と同様の方法で測定したところ、相対活性は５５７であった。
(2-2)大豆油100ｇ、および大豆極度硬化油（横関油脂工業（株）社製）25ｇに、上記(2-1)で得たリパーゼ組成物1.2質量％添加し、７０℃にて１２０時間反応させた後、ろ過にてリパーゼ組成物を回収した。回収したリパーゼ組成物の一部を実施例１と同様にリパーゼ活性を測定した（2-2a）。先に回収したリパーゼ組成物をアセトンに分散させろ過後、そのろ過ケーキを再び回収し、菜種脱色油：ODO（日清オイリオグループ（株）社製）＝9：1（ｗ）の混合油50ｇに分散後、室温にてろ過することにより）洗浄・置換しリパーゼ組成物を回収した。このリパーゼ組成物のエステル交換活性を実施例１と同様の方法で測定し（2-2b）、得られた活性を相対値で表１に示す。
【００１８】
表１
リパーゼ製剤質量当たりの
相対エステル交換活性
粉砕前 （TL-IM） 100
(2-1) 557
(2-2a) 11
(2-2b) 200
【００１９】
実施例３
菜種脱色油（日清オイリオグループ（株）社製）85ｇ、およびODO（日清オイリオグループ（株）社製）15ｇにリポザイムTL-IM（固定化リパーゼ：ノボザイムズA/S社製）5質量％添加して60℃で、19時間攪拌しエステル交換反応を行った。エステル交換率を経時的に求め、反応の進行を確認した。尚、エステル交換反応は、ガスクロマトグラフィーを用いてグリセリド組成を分析し、測定試料中におけるエステル交換反応物の比率を算出して求めた。
反応後上記固定化リパーゼをろ過して回収し、その回収した固定化リパーゼを繰り返しエステル交換反応に用いた。繰り返し反応を数回行い、相対比で反応率の変化を確認したものを図３（3-1）に示す。
相対活性が60％程度に低下した上記固定化リパーゼをろ過して回収し、その回収した固定化リパーゼに菜種脱色油（日清オイリオグループ（株）社製）18ｇ、およびODO（日清オイリオグループ（株）社製）2ｇに添加して室温で24時間攪拌した。ろ過により固定化リパーゼを回収後、再び上記操作(3-1)を繰り返しエステル交換反応を行った。相対比で反応率の経時変化を確認したものを図３（3-2）に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】リパーゼ粉末組成物を用いてエステル交換反応を行った場合の経時によるエステル交換活性の低下を示す（実施例１(3)）。
【図２】エステル交換活性が低下したリパーゼ粉末組成物を本発明により洗浄することによりエステル交換活性が回復することを示す（実施例１(4)）。
【図３】エステル交換活性が低下した固定化リパーゼを本発明により洗浄することによりエステル交換活性が回復することを示す（実施例３(3-2)）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物の各種エステル化能やエステル交換能などのリパーゼ活性を回復させる方法及び回復させた固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物を用いるエステル化反応や油脂のエステル交換方法などに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼは、脂肪酸などの各種カルボン酸とモノアルコールや多価アルコールなどのアルコール類とのエステル化反応、複数のカルボン酸エステル間のエステル交換反応などに幅広く使用されている。このうち、エステル交換反応は動植物油脂類の改質をはじめ、各種脂肪酸のエステル、糖エステルやステロイドの製造法として重要な技術である。これらの反応の触媒として、油脂加水分解酵素であるリパーゼを用いると、室温ないし約７０℃程度の温和な条件下でエステル交換反応を行うことができ、従来の化学反応に比べ、副反応の抑制やエネルギーコストが低減化されるだけでなく、触媒としてのリパーゼが天然物であることから安全性も高い。また、その基質特異性や位置特異性により目的物を効率良く生産することができる。ところが、一般的にリパーゼ粉末をそのままエステル交換反応に用いても活性が十分に発現しないばかりか、元来が水溶性のリパーゼを油性原料中に均一に分散させることは困難であり、その回収も困難である。このため、従来はリパーゼを何らかの担体、たとえば陰イオン交換樹脂（特許文献１）、フェノール吸着樹脂（特許文献２）、疎水性担体（特許文献３）、陽イオン交換樹脂（特許文献４）、キレート樹脂（特許文献５）等に固定化してエステル化やエステル交換反応などに用いることが一般的である。
【０００３】
しかしながら、リパーゼを担体に固定化すると、リパーゼ活性が低下してしまうので、リパーゼ粉末を用いた各種技術が開発されてきた。
具体的には、不活性有機溶媒の存在下または非存在下、エステル交換反応時に分散リパーゼ粉末粒子の９０％以上を１〜１００μｍの範囲の粒子径に保つように、エステルを含有する原料にリパーゼ粉末を分散させてエステル交換反応を行う方法が提案されている（特許文献６）。又、リン脂質および脂溶性ビタミンを含む酵素溶液を乾燥して得た酵素粉末を用いることが提案されている（特許文献７）。
一方、酵素であるリパーゼは高価であるため、反応終了後回収して繰り返し使用し、リパーゼ活性がかなり低下した場合に初めて廃棄されている。しかしながら、低下したリパーゼ活性を回復させることができれば、リパーゼの使用効率が格段に向上するので、工業的見地から、リパーゼ活性を回復させる有効な方法の開発が望まれている。
【０００４】
【特許文献１】特開昭６０−９８９８４号公報
【特許文献２】特開昭６１−２０２６８８号公報
【特許文献３】特開平２−１３８９８６号公報
【特許文献４】特開平３−６１４８５号公報
【特許文献５】特開平１−２６２７９５号公報
【特許文献６】特許第２６６８１８７号公報
【特許文献７】特開２０００−１０６８７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、低下したリパーゼ活性を回復させることができる方法を提供することを目的とする。
本発明は、又、回復したリパーゼ活性を有する固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物を用いるエステル化方法及びエステル交換方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、特定の固定化リパーゼ又は該固定化リパーゼの粉砕物をろ過助剤と併用してなるリパーゼ粉末組成物について、リパーゼ活性が低下したものをトリアシルグリセロールで洗浄すると、初期のリパーゼ活性を回復させることができるとの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径1μｍ以上で300μｍ未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後、トリアシルグリセロールで洗浄することを特徴とするリパーゼ活性の回復方法を提供する。
本発明は、又、担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径1μｍ以上で300μｍ未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後、反応系から分離し、トリアシルグリセロールで洗浄してリパーゼ活性を回復させた後、この固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物を用いてエステル化反応又はエステル交換反応を行うことを特徴とするエステル化反応又はエステル交換反応方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、リパーゼを各種反応に用いることにより低下したものについては、これまで廃棄されてきたが、本発明の方法により、リパーゼ活性を回復させることができるので、リパーゼの使用寿命を延ばすことができ、リパーゼを用いて製造される製品のコストを低下させることができるので、本発明は工業的見地から大きなメリットを有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明で用いるリパーゼは、サーモマイセス属(Thermomyces sp.)由来のものであって、担体、好ましくはシリカ担体に固定化されたリパーゼである。本発明ではこれをそのまま使用するか、又は該リパーゼを1μｍ以上で300μｍ未満の平均粒子径に粉砕したものを使用することができる。ここで、シリカ担体に固定化された該リパーゼの平均粒子径は300〜1000μｍ程度であるのが好ましい。このような固定化リパーゼは、例えば、ノボザイムズA/S社からリポザイムTL-IMとして入手することができる。
このような固定化リパーゼを粉砕品とするには、通常の粉砕機を用いて、1μｍ以上で300μｍ未満の平均粒子径、好ましくは平均粒子径1〜200μｍ、より好ましくは平均粒子径1〜100μｍ、特に好ましくは平均粒子径20〜100μｍとなるように粉砕するのがよい。ここで、粉砕機としては、乳鉢、せん断摩擦式粉砕機、カッター式粉砕機、石臼（マイコロイダー、マスコロイダー）、コーヒーミル、パワーミル、ピンミル、衝撃式粉砕機（ハンマーミル、ボールミル）、ロール式粉砕機及び気流式粉砕機、ホモジナイザー、超音波破砕機などがあげられる。
【０００９】
本発明で対象とするリパーゼが上記粉砕品である場合、ろ過助剤と組み合わせて用いるのが好ましい。ろ過助剤としてはセライトなどの無機ろ過助剤及びセルロースなどの繊維やその粉砕物などの有機ろ過助剤があげられる。これのうち、有機ろ過助剤、特に有機高分子ろ過助剤が好ましく、なかでもセルロースなどが好ましく、日本製紙ケミカル（株）から商品名ＫＣフロックで発売されているもの等が好ましいものとしてあげられる。ろ過助剤も粉状であるのが好ましく、平均粒子径10〜90μｍであるのが好ましい。
上記リパーゼ粉砕品とろ過助剤との質量比は、１/１０〜１０/１であるのが好ましく、特に1/7〜2/1であるのが好ましい。
【００１０】
本発明で用いる上記固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物は、そのまま油脂のエステル交換反応やエステル化反応に用いることができるが、長鎖脂肪酸トリグリセリドと中鎖脂肪酸トリグリセリドとを接触させ、次いで採取することにより、精製することができ、同時にリパーゼ活性を向上させることができる。
ここで用いる長鎖脂肪酸トリグリセリド及び中鎖脂肪酸トリグリセリドとしては、後述の固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物の洗浄の項に記載のものを用いるのが好ましい。
長鎖脂肪酸トリグリセリドと中鎖脂肪酸トリグリセリドとを、質量比にして、95：5〜50：50の割合で使用するのが好ましく、リパーゼの全質量に対して２倍〜100倍の質量のトリグリセリドを接触させるのが好ましい。
上記固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物を用いるエステル化反応としては、該固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物の存在下に、油脂のエステル化反応を行い、次いで固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物を回収しリサイクルするのが好ましい。
【００１１】
特に、上記リパーゼ粉末組成物は、リパーゼ活性が向上しており、かつエステル化反応やエステル交換反応における使用しやすさ（操作性）が向上し、リサイクルしてこれらの反応に使用することができるので、工業的規模での油脂のエステル交換などによる油脂の改質に好適に用いることができる。
しかしながら、このようなリパーゼ粉末組成物や固定化リパーゼを、リサイクルして何回もエステル化反応やエステル交換反応に使用すると、使用回数に応じて、エステル化能やエステル交換能といったリパーゼ活性が低下する。
本発明は、このようなリパーゼ活性が低下した固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物を特定の条件で洗浄すると、リパーゼ活性が回復し、又、上記リパーゼ粉末組成物については、向上したリパーゼ活性と使用しやすさ（操作性）とを長い期間利用し続けることを可能とするものである。
本発明で対象とする固定化リパーゼやリパーゼ活性が低下したリパーゼ粉末組成物としては、初期の活性に対して少しでも低下したものを対象とすることができるが、工業的見地から、初期の活性（１００％）が７０〜５０％に低下したものを対象とするのが好ましい。
【００１２】
ここで、固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物を洗浄するために用いるトリアシルグリセロールとしては、室温で液状であるのが好ましい。特に、上述したリパーゼ粉末組成物を精製するのに用いる長鎖脂肪酸トリグリセリドと中鎖脂肪酸トリグリセリドの混合物を用いるのが好ましい。
ここで用いる長鎖脂肪酸トリグリセリドとしては、構成脂肪酸の炭素数が14〜24のトリグリセリドであるのが好ましく、特に菜種油、大豆油、ヒマワリ油、紅花油、コーン油からなる群から選ばれる植物油であるのが好ましい。
中鎖脂肪酸トリグリセリドとしては、構成脂肪酸の炭素数が6〜12のトリグリセリドであるのが好ましい。このような脂肪酸トリグリセリドは、公知の製法で製造することもできるし、市販品を使用することもできる。市販品としては、例えば日清オイリオグループ（株）から商品名ＯＤＯで販売されている。
長鎖脂肪酸トリグリセリドと中鎖脂肪酸トリグリセリドとを、質量比にして、95：5〜50：50の割合で使用するのが好ましく、リパーゼの全質量に対して好ましくは２倍〜100倍、より好ましくは５〜５０倍の質量のトリグリセリドを接触させるのがよい。
特に、洗浄に用いるトリアシルグリセロールとしては、エステル交換をするための原料油であるのが好ましい。
【００１３】
洗浄は、固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物中のリパーゼが、上記トリアシルグリセロールに十分接触するようにして行うのが好ましく、具体的には、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後の固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物をトリアシルグリセロール中に攪拌して分散させ、次でトリアシルグリセロールから分離することにより行うのが好ましい。
接触、具体的には、攪拌は１０〜４５℃が好ましく、特に好ましくは室温で、好ましくは２時間以上、より好ましくは１０時間以上、特に好ましくは１２時間〜４８時間行うのがよい。尚、所望により４８時間以上行ってもよい。
攪拌を行うのに用いる攪拌機は特に限定されないが、羽根攪拌機、マグネチックスターラー、スリーワンモーターなどを用いるのが好ましい。
このようにして、固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物中のリパーゼをトリアシルグリセロールに十分接触させた後、常法によりろ過してトリアシルグリセロールから固定化リパーゼやリパーゼ粉末組成物を分離し、再度エステル化やエステル交換反応に使用する。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
【実施例】
【００１４】
実施例１
(1)ノボザイムズA/S社製リポザイムTL-IM(平均粒子径８００μｍ) 1Kgをホソカワミクロン（株）社製のピンミル（ファインインパクトミル100UPZ）を用い、17600rpmにて粉砕した。粉砕したリパーゼ粒子径を堀場製作所社製の粒度分布計LA-500を用いて測定したところ、平均粒子径は13.8μｍであった。この粉末にろ過助剤としてセルロースパウダー（日本製紙ケミカル：平均粒子径30μｍ）を1ｋｇ加えてリパーゼ粉末組成物とした。
(2)このようにして得られたリパーゼ組成物５ｇに対して菜種脱色油90ｇおよびODO（日清オイリオグループ（株）社製:中鎖脂肪酸トリグリセリド）10ｇを添加して室温で、24時間攪拌した後、ろ過してリパーゼ組成物を回収した。このリパーゼ組成物のエステル交換活性を下記の方法で測定したところ、粉砕前のリポザイムTL-IMの活性を１００とした場合の相対活性は７１４であった。
【００１５】
リパーゼ活性の測定方法
トリオレインとトリカプリリンを１：１（ｗ）の割合で混合した油に、リパーゼ組成物を添加し60℃で反応させた。経時的に10μｌをサンプリングし、ヘキサン1.5ｍｌで希釈後、リパーゼ組成物をろ過した溶液をガスクロマトグラフフィー（GC）用サンプルとした。GC(カラム：DB-１ht)で分析し下式より反応率を求めた。GC条件は、カラム温度：初期150℃、昇温：15℃/分、最終370℃である。
反応率（％）＝{C34area/(C24area+C34area)}×100
式中、C24はトリカプリリン、C34はトリカプリリンの１つの脂肪酸がオレイン酸に置き換わったものを示し、areaはそれらのエリア面積である。各時間における反応率の基づき、解析ソフト（origin ver.6.1）により反応速度定数ｋ値を求めた。
リパーゼ活性はリポザイムTL-IMのｋ値を100とした時の相対活性で表した。
(3)菜種脱色油（日清オイリオグループ（株）社製）85ｇ、およびODO（日清オイリオグループ（株）社製）15ｇに上記(2)で得られたリパーゼ組成物１質量％を添加して60℃で、19時間攪拌しエステル交換反応を行った。エステル交換率を経時的に求め、反応の進行を確認した。尚、エステル交換反応は、ガスクロマトグラフィーを用いてグリセリド組成を分析し、測定試料中におけるエステル交換反応物の比率を算出して求めた。
反応後リパーゼ組成物をろ過して回収し、その回収したリパーゼ組成物を繰り返しエステル交換反応に用いた。繰り返し反応を数回行い、相対比で反応率の変化を確認したものを図1に示す。
図１に示されている結果から、合計反応時間が約８２時間に達すると、リパーゼ組成物のリパーゼ活性が約６０％に低下することがわかる。
【００１６】
(4)上記(3)において、相対活性が約６０％に低下したリパーゼ組成物をろ過して回収し、その回収したリパーゼ組成物に菜種脱色油（日清オイリオグループ（株）社製）18ｇ、およびODO（日清オイリオグループ（株）社製）2ｇに添加して室温で、マグネチックスターラーを用いて24時間攪拌した。ろ過によりリパーゼ組成物を回収後、再び上記(3)と同様に繰り返しエステル交換反応を行った。相対比で反応率の変化を確認した結果を図2に示す。
図２に示されている結果から、活性が低下したリパーゼ組成物を攪拌洗浄することにより、リパーゼ活性が当初の１００％に回復し、リパーゼ組成物をリサイクルして何回も使用できることがわかる。
【００１７】
実施例２
(2-1)実施例１の(1)で得られたリパーゼ組成物５ｇに対して菜種脱色油90ｇおよびODO（日清オイリオグループ（株）社製）10ｇを添加して60℃、2時間攪拌した後、ろ過してリパーゼ組成物を回収した。このリパーゼ組成物のエステル交換活性を実施例１と同様の方法で測定したところ、相対活性は５５７であった。
(2-2)大豆油100ｇ、および大豆極度硬化油（横関油脂工業（株）社製）25ｇに、上記(2-1)で得たリパーゼ組成物1.2質量％添加し、７０℃にて１２０時間反応させた後、ろ過にてリパーゼ組成物を回収した。回収したリパーゼ組成物の一部を実施例１と同様にリパーゼ活性を測定した（2-2a）。先に回収したリパーゼ組成物をアセトンに分散させろ過後、そのろ過ケーキを再び回収し、菜種脱色油：ODO（日清オイリオグループ（株）社製）＝9：1（ｗ）の混合油50ｇに分散後、室温にてろ過することにより）洗浄・置換しリパーゼ組成物を回収した。このリパーゼ組成物のエステル交換活性を実施例１と同様の方法で測定し（2-2b）、得られた活性を相対値で表１に示す。
【００１８】
表１
リパーゼ製剤質量当たりの
相対エステル交換活性
粉砕前 （TL-IM） 100
(2-1) 557
(2-2a) 11
(2-2b) 200
【００１９】
実施例３
菜種脱色油（日清オイリオグループ（株）社製）85ｇ、およびODO（日清オイリオグループ（株）社製）15ｇにリポザイムTL-IM（固定化リパーゼ：ノボザイムズA/S社製）5質量％添加して60℃で、19時間攪拌しエステル交換反応を行った。エステル交換率を経時的に求め、反応の進行を確認した。尚、エステル交換反応は、ガスクロマトグラフィーを用いてグリセリド組成を分析し、測定試料中におけるエステル交換反応物の比率を算出して求めた。
反応後上記固定化リパーゼをろ過して回収し、その回収した固定化リパーゼを繰り返しエステル交換反応に用いた。繰り返し反応を数回行い、相対比で反応率の変化を確認したものを図３（3-1）に示す。
相対活性が60％程度に低下した上記固定化リパーゼをろ過して回収し、その回収した固定化リパーゼに菜種脱色油（日清オイリオグループ（株）社製）18ｇ、およびODO（日清オイリオグループ（株）社製）2ｇに添加して室温で24時間攪拌した。ろ過により固定化リパーゼを回収後、再び上記操作(3-1)を繰り返しエステル交換反応を行った。相対比で反応率の経時変化を確認したものを図３（3-2）に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】リパーゼ粉末組成物を用いてエステル交換反応を行った場合の経時によるエステル交換活性の低下を示す（実施例１(3)）。
【図２】エステル交換活性が低下したリパーゼ粉末組成物を本発明により洗浄することによりエステル交換活性が回復することを示す（実施例１(4)）。
【図３】エステル交換活性が低下した固定化リパーゼを本発明により洗浄することによりエステル交換活性が回復することを示す（実施例３(3-2)）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径1μｍ以上で300μｍ未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後、トリアシルグリセロールで洗浄することを特徴とするリパーゼ活性の回復方法。
【請求項２】
トリアシルグリセロールが室温で液状である請求項１記載の方法。
【請求項３】
トリアシルグリセロールが中鎖脂肪酸トリグリセリドを含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
トリアシルグリセロールが、エステル交換をするための原料油である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
洗浄を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後の固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物をトリアシルグリセロール中に攪拌して分散させ、次でトリアシルグリセロールから分離することにより行う請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
担体がシリカである請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
粉砕品の平均粒子径が1〜200μｍである請求項１〜６のいずれか１項の方法。
【請求項８】
ろ過助剤がセルロースである請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ろ過助剤が平均粒子径10〜90μｍの粉状である請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径1μｍ以上で300μｍ未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後、反応系から分離し、トリアシルグリセロールで洗浄してリパーゼ活性を回復させた後、この固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物を用いてエステル化反応又はエステル交換反応を行うことを特徴とするエステル化反応又はエステル交換反応方法。
【請求項１】
担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径1μｍ以上で300μｍ未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後、トリアシルグリセロールで洗浄することを特徴とするリパーゼ活性の回復方法。
【請求項２】
トリアシルグリセロールが室温で液状である請求項１記載の方法。
【請求項３】
トリアシルグリセロールが中鎖脂肪酸トリグリセリドを含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
トリアシルグリセロールが、エステル交換をするための原料油である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
洗浄を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後の固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物をトリアシルグリセロール中に攪拌して分散させ、次でトリアシルグリセロールから分離することにより行う請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
担体がシリカである請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
粉砕品の平均粒子径が1〜200μｍである請求項１〜６のいずれか１項の方法。
【請求項８】
ろ過助剤がセルロースである請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ろ過助剤が平均粒子径10〜90μｍの粉状である請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼ、又は担体に固定化されたサーモマイセス属由来のリパーゼの平均粒子径1μｍ以上で300μｍ未満の粉砕品及びろ過助剤を含有するリパーゼ粉末組成物を、エステル化反応又はエステル交換反応に用いた後、反応系から分離し、トリアシルグリセロールで洗浄してリパーゼ活性を回復させた後、この固定化リパーゼ又はリパーゼ粉末組成物を用いてエステル化反応又はエステル交換反応を行うことを特徴とするエステル化反応又はエステル交換反応方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−３００８５５（Ｐ２００７−３００８５５Ａ）
【公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１３２６３９（Ｐ２００６−１３２６３９）
【出願日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【出願人】（０００２２７００９）日清オイリオグループ株式会社 (251)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【出願人】（０００２２７００９）日清オイリオグループ株式会社 (251)
【Ｆターム（参考）】
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