リポソームおよびそれを含む処置用の組成物
【課題】リポソーム膜の構成成分を調整することにより、標的臓器に選択的に到達することができるリポソームを提供する。また、有効成分を含むリポソームを調整することにより、該有効成分を皮膚内に選択的に到達させることができる処置用組成物を提供すること。
【解決手段】下記一般式（I）で示されるセラミドをリポソーム膜に含むことを特徴とするリポソーム、ならびに当該リポソームを含む処置用組成物。
（一般式（I）において、Ｒ1は炭素数１〜８のアルキル基を表し、Ｒ2は炭素数１１〜２１の水酸基を有しても良いアルキル基またはアルケニル基を表す。）
【解決手段】下記一般式（I）で示されるセラミドをリポソーム膜に含むことを特徴とするリポソーム、ならびに当該リポソームを含む処置用組成物。
（一般式（I）において、Ｒ1は炭素数１〜８のアルキル基を表し、Ｒ2は炭素数１１〜２１の水酸基を有しても良いアルキル基またはアルケニル基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はセラミドをリポソーム膜に含有するリポソームに関する。さらに詳細には、生体に投与されることにより標的臓器に選択的に到達することができるリポソームに関する。さらに本発明は、前記リポソームを含有する処置用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームはリン脂質などを含有する脂質二重膜で構成された小胞であり、該小胞内部には水性成分が保持されている。このためリポソームを生体中に投与すると、小胞の内部に保持された成分は、酵素などの生体成分に触れることなく生体中を移動することができる。更に、リポソーム膜を構成する脂質二重膜は生体臓器の細胞壁との親和性を有するので、臓器に到達したリポソームは細胞壁を通過して臓器中に取り込まれやすい性質を有するといわれている。これらの性質を利用して、リポソームはターゲッティング製剤の開発などに応用されている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００３】
臓器構成成分で構成されるリポソーム膜を有するリポソームの小胞の内部に保持された成分（「リポソームに内包された成分」ともいう）は、標的臓器に対するリリース性が向上され得ると報告されている（例えば、非特許文献１を参照）。リポソーム膜を構成する該臓器構成成分としてセラミドが知られており、特定の構造を有するセラミドをリポソーム膜の構成成分としたリポソームが報告されている（例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４を参照）。しかしながら、このようなセラミドをリポソーム膜の構成成分とするリポソームは、標的臓器へ到達しにくいという問題があった。
【０００４】
【特許文献１】特再２０００／０６１１１４号公報
【特許文献２】特表平０８−５０２９６１号公報
【特許文献３】特開平１０−０５９８４０号公報
【特許文献４】特開２００４−２３０１７３号公報
【非特許文献１】M. Kirjavainen et.al.,Biochim Biophys Acta. 1996 ;1304(3):179-89
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、標的臓器（好ましくは皮膚の表皮・真皮）に選択的に到達することができるリポソームを求めて鋭意検討した。具体的には、リポソーム膜の構成成分を調整することにより、リポソームを標的臓器へ到達させやすくすることを検討した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、下記一般式（Ｉ）に表されるセラミドをリポソーム膜に含むリポソームは、投与（例えば皮膚投与）されると、皮膚の表皮・真皮に選択的に到達することができることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は以下に示す通りである。
［１］ 下記一般式（I）で示されるセラミドをリポソーム膜に含むことを特徴とする、リポソーム。
【０００８】
【化１】
（一般式（I）において、Ｒ1は炭素数１〜８のアルキル基を表し、Ｒ2は炭素数１１〜２１の水酸基を有しても良いアルキル基またはアルケニル基を表す。）
【０００９】
［２］ 前記一般式（I）において、Ｒ1がメチル基またはヘプチル基を表し、Ｒ2がα−ペンタデセニル基を表すことを特徴とする、［１］に記載のリポソーム。
［３］ 前記セラミドの含有量が、リポソーム膜の全質量に対して３０〜６０質量％であることを特徴とする、［１］または［２］に記載のリポソーム。
［４］ 前記リポソーム膜が、コレステロール、脂肪酸、コレステロール硫酸、およびリン脂質、ならびにこれらの塩からなる群から選択される一種または二種以上をさらに含有することを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか一つに記載のリポソーム。
［５］ 前記リポソーム膜が形成する小胞の内部及び／又は小胞脂質膜中に、有効成分を含有する溶液または分散液が含まれていることを特徴とする、［１］〜［４］のいずれか一つに記載のリポソーム。
［６］ 前記有効成分は、カルセインおよびその塩、ＦＩＴＣ−デキストラン、リドカインおよびその塩、ビダラビン、ビタミンＤ３、ならびにウルソール酸エステルからなる群から選択される一種または二種以上であることを特徴とする、［５］に記載のリポソーム。
［７］ ［１］〜［６］のいずれか一つに記載のリポソームを含有する処置用組成物。
［８］ 皮膚外用剤であることを特徴とする、［７］に記載の処置用組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のリポソームは、投与（例えば皮膚投与）されることにより標的臓器（例えば皮膚の表皮・真皮）に選択的に到達することができる。従って、有効成分を含む本発明のリポソームを用いることにより、標的臓器における該有効成分の作用を効果的に奏させることができる。さらに、有効成分を含む本発明のリポソームは、有効成分の種類に応じて、種々の処置用組成物の成分として用いられることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
＜本発明のリポソーム＞
本発明のリポソームは下記一般式（Ｉ）に表されるセラミドをリポソーム膜に含有することを特徴とする。
【００１２】
【化２】
（一般式（I）において、Ｒ1は炭素数１〜８のアルキル基を表し、Ｒ2は炭素数１１〜２１の水酸基を有しても良いアルキル基またはアルケニル基を表す。）
【００１３】
一般的にリポソームのリポソーム膜は脂質二重膜で構成されるが、その脂質二重膜は多重の同心球（多重層）を形成している場合と、単層を形成している場合とがある。本発明のリポソームのリポソーム膜は単層または多重層の何れでも良いが、好ましくは多重層である。
【００１４】
本発明のリポソームのリポソーム膜は少なくともセラミドを含有することを特徴とするが、リン脂質やその他の成分をさらに含有していてもよい。
一般的にセラミドとはスフィンゴシンまたはその類似体の、Ｎ−アシル誘導体の総称である。セラミドはその特徴部分であるＮ−アシル基の構造などによって、タイプ１〜タイプ７に大別されることがある（例えば、Robson KJ, Stewart ME, Michelsen S, Lazo ND,
Downing DT.: 6-Hydroxy-4-sphingenine in human epidermal ceramides. J Lipid Res.
1994 Nov;35(11):2060-8を参照）。そのタイプによって、生体内における臓器分布が異なっているといわれている。本発明のリポソームに含まれるセラミドは特に限定されるわけではないが、前記７つのタイプのうちタイプ２に属するものと考えられている。
【００１５】
本発明のリポソームのリポソーム膜に含まれるセラミドは、下記一般式（Ｉ）で表されるセラミドであることが好ましい。
一般式（Ｉ）において、Ｒ1は好ましくは炭素数１〜８のアルキル基を示す。Ｒ1で示される基の具体的な例には、メチル基、プロピル基、ペンチル基、ヘプチル基などが含まれ、特に好ましくはメチル基またはヘプチル基などである。
一般式（Ｉ）において、Ｒ2は好ましくは炭素数１１〜２１の水酸基を有していてもよいアルキル基またはアルケニル基を示す。Ｒ2で示されるアルキル基の具体的な例には、１−ヒドロキシペンタデカニル（1-hydroxy-pentadecanyl）基などが含まれる。また、Ｒ2で示されるアルケニル基の具体的な例には、α−ペンタデセニル（α-pentadecenyl）基および２−ヒドロキシ−α−ペンタデセニル（2-hydroxy-α-pentadecenyl）基などが含まれる。Ｒ2の特に好ましい例には、α−ペンタデセニル基などが含まれる。
【００１６】
【化３】
（一般式（I）において、Ｒ1は炭素数１〜８のアルキル基を表し、Ｒ2は炭素数１１〜２１の水酸基を有しても良いアルキル基またはアルケニル基を表す。）
【００１７】
一般式（Ｉ）で表されるセラミドの具体的な例には、Ｎ−アセトイル−Ｄ−エリスロスフィンゴシン（N-Acetoyl-D-erythro-Sphingosine）またはＮ−オクタノイル−Ｄ−エリスロスフィンゴシン（N-Octanoyl-D-erythro-Sphingosine）などが含まれる。
【００１８】
一般式（Ｉ）に表される化合物は、既知の化合物またはその類似体であるので、公知の製造方法やそれに準じた方法で製造することができる。また、一般式（Ｉ）で表される化合物の中には市販されている化合物もある。市販されている化合物の例には、Ｎ−アセトイル−Ｄ−エリスロスフィンゴシン（N-Acetoyl-D-erythro-Sphingosine）やＮ−オクタノイル−Ｄ−エリスロスフィンゴシン（N-Octanoyl-D-erythro-Sphingosine）などが含ま
れ、これらはアバンティ・ポーラー・リピッド社（Avanti Polar Lipids Inc.）より販売されている。
【００１９】
本発明のリポソームのリポソーム膜における、一般式（Ｉ）で表されるセラミドの含有量は、リポソームが溶液中で安定に存在することができるように調整される。前記セラミドの含有量は、具体的にはリポソーム膜の全質量に対して、３０〜６０質量％であることが好ましく、３５〜５５質量％であることがより好ましい。前記セラミドの含有量がこの範囲から大きくずれると、リポソームが形成されない場合がある。
【００２０】
前述の通り本発明のリポソームは、一般式（Ｉ）で表されるセラミド以外にリン脂質を含有することができる。リン脂質としては、通常リポソーム膜を構成するリン脂質であれば、特段の限定無く適用することができる。
リン脂質の好ましい例には、レシチンの主成分である、ホスファチジルコリン、ホスファチジル酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、およびホスファチジルグリセロール、ならびにこれらのリゾ体が含まれる。これらは大豆や卵黄から抽出したレシチンの形態で、あるいはこれらを水素添加した水添レシチンの形態であってもよい。本発明のリポソームのリポソーム膜は、かかるリン脂質の一種を単独で含有することもできるし、二種以上を組み合わせて含有することもできる。
リポソーム膜におけるリン脂質の総含有量は、リポソーム膜の総質量に対して、５０質量％以下であることが好ましく、４５質量％以下であることがより好ましい。リン脂質の量が多すぎると、必須成分であるセラミドの含有量を適切に調整することが困難になる場合がある。
【００２１】
本発明のリポソームのリポソーム膜は、リン脂質以外の脂質を含有することができる。該脂質の例にはコレステロール類や脂肪酸が含まれる。
【００２２】
本発明のリポソームのリポソーム膜に含まれ得るコレステロール類の好ましい例には、コレステロールそのもの、ならびにコレステロールの脂肪酸エステル、硫酸エステルおよびリン酸エステルなどが含まれる。特に好ましい例には、コレステロールそのもの、およびコレステロール硫酸エステルが含まれる。本発明のリポソームのリポソーム膜は、これらのコレステロール類の唯一種を含有することもできるし、二種以上を組み合わせて含有することもできる。
リポソーム膜におけるコレステロール類の好ましい総含有量は、リポソーム膜の総質量に対して５０質量％以下であり、より好ましくは４５質量％以下である。コレステロール類の量が多すぎると、必須成分であるセラミドの含有量を適切に制御することが困難になる場合がある。
【００２３】
本発明のリポソームのリポソーム膜に含まれ得る脂肪酸は、炭素数１０〜３０の脂肪酸であることが好ましい。脂肪酸は飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれでもよい。脂肪酸の好ましい例には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレイン酸、イソステアリン酸、オクチルドデカン酸などが含まれる。特に好ましい脂肪酸は不飽和脂肪酸であり、オレイン酸、リノール酸およびリノレイン酸から選択される。本発明のリポソームのリポソーム膜はこれらの脂肪酸の唯一種を含有することもできるし、二種以上を組み合わせて含有することもできる。
リポソーム膜における脂肪酸の総含有量は、リポソーム膜の総質量に対して５０質量％以下であることが好ましく、４５質量％以下であることがより好ましい。脂肪酸の量が多すぎると、必須成分であるセラミドの含有量を適切に制御することが困難である場合がある。
【００２４】
本発明のリポソームのリポソーム膜は、前述した成分以外に通常リポソームを構成する
成分を、本発明の効果を損なわない範囲において任意に含有することができる。このような任意成分の例には、１，３−ブタンジオール、プロピレングリコールなどの多価アルコール類；ＰＯＥ脂肪酸エステルやＰＯＥアルキルエーテルのような非イオン界面活性剤類；ポリ（メタ）アクリル酸エステルなどのような高分子類などが含まれる。
【００２５】
本発明のリポソームのリポソーム膜は、一般式（Ｉ）で表されるセラミドに加えて、リン脂質、コレステロール、コレステロールの硫酸エステルおよび脂肪酸を組み合わせて含有することが特に好ましい。リポソーム膜におけるこれらの成分の好ましい質量比としては、セラミドの質量に対して、リン脂質の質量比が０〜１５０％（より好ましくは０〜１００％）であり、脂肪酸の質量比が０〜５０％（より好ましくは０〜１５％）であり、コレステロールの質量比が０〜５０％（より好ましくは０〜１５％）であり、コレステロール硫酸エステルの質量比が０〜１００％（より好ましくは５０〜１００％）である。
【００２６】
前述の通り本発明のリポソームは多重層リポソームであっても単層リポソームであってもよいが、好ましくは多重層リポソームである。したがって、リポソームの粒径は、１００ｎｍ〜１０μｍであることが好ましい。
本発明のリポソームは小胞内部または脂質二重膜同士の間に水性溶液を含む。その溶液の容量は、特に限定されないが０．１〜１００μｌであると考えられる。
【００２７】
本発明のリポソームは、有効成分を含む溶液または分散液を、リポソーム膜が形成する小胞の内部および／又は小胞脂質膜内に含むことが好ましい。「小胞の内部に含む」とは脂質二重膜と脂質二重膜の間に存在する水性溶液に溶解されている状態を含む。また「小胞脂質膜中に含まれる」とは、脂質二重膜の間にはめ込まれている状態を含む。
【００２８】
前記有効成分は、生体に対して生理作用を発揮するもの、或いは、医学的に有用に作用するものであれば特段の限定はない。医学的に有用とは、薬物の到達を確認するなどのトレーサー機能など、医学治療、医学的研究に有用である作用が好適に例示できる。有効成分としては、カルセイン、フルオレセインデキストラン（平均分子量4000）などの蛍光マーカー；リドカインなどの局部麻酔薬；ビダラビンなどの抗ウイルス剤；ビタミンＤ３などのビタミンＤの活性化体；ウルソール酸エステルなど（ウルソール酸ベンジル、ウルソール酸メチル、ウルソール酸ヘキシル、ウルソール酸ステアリル、ウルソール酸オレイルなど）の抗シワ剤或いは光老化防止剤：４−ｎ−ブチルレゾルシノール、プラセンターエキス、エラグ酸、アスコルビン酸およびその誘導体（アスコルビン酸グルコシドを含む）、トラネキサム酸、コウジ酸、アルブチンなどの美白成分；ならびにこれらの塩などが含まれる。皮膚外用剤の有効成分は、光老化防止剤、美白成分がより好ましい。
【００２９】
また、有効成分は微粒子に担持されていてもよい。例えば、必要に応じて抗体や酵素または抗がん剤などの蛋白質または薬剤を担持したラテックス小球などの固体微粒子が溶媒に分散された分散液を、リポソーム膜が形成する小胞の内部および／又は小胞脂質膜内に含むことができる。前記固体微粒子の平均粒径は、２０〜５０ｎｍであることが好ましい。
【００３０】
本発明のリポソームは、リポソーム膜が形成する小胞の内部および／又は小胞脂質膜内に、前記有効成分の唯一種を含むこともできるし、二種以上を組み合わせて含むこともできる。
【００３１】
前記有効成分を含む溶液または分散液の溶媒または分散媒としては、水性溶媒が好ましい。該水性溶媒としては、リン酸緩衝生理食塩水や、リンゲル氏液などが含まれる。その水性溶媒のｐＨは、有効成分が安定に存在できるｐＨであればよい。強酸性・強アルカリ性では脂質分子自体が変化してリポソーム形態を取れなくなる。好ましいｐＨは４〜１０
である。
前記有効成分を含む溶液または分散液における、有効成分の含有濃度は、１〜５０ｍＭであることが好ましい。
【００３２】
本発明のリポソームは、例えば薄膜法（１９６５）にしたがって製造することができる。薄膜法とは、例えばBangham, A.D., Standish, M.M. and Watkins, J.C. "Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids."(1965) J. Mol. Biol. 13,238-252に記載される方法である。
具体的には、以下の手順に従って製造することができるが、これらの記載により本発明のリポソームの製造方法が特に限定されるわけではない。
１） リポソーム膜を構成する成分（一般式（Ｉ）で示されるセラミドを含む）を有機溶媒に溶解又は懸濁させる。ここで有機溶媒は、脂質を溶解することができ、かつ沸点が低いことが好ましい。有機溶媒の具体例には、クロロホルム、メタノール、エタノール、アセトンなどが含まれる。
２） １）で得られた溶液または懸濁液から溶媒を除去することにより、リポソーム構成成分の薄膜を形成させる。溶媒の除去は減圧下で行うことが好ましい。
３） ２）で得られた薄膜に水性溶媒（好ましくは緩衝液）を添加して攪拌することにより、水性溶媒中に懸濁されたリポソームを得ることができる。
【００３３】
また、有効成分を含む本発明のリポソームを得るには、１）で得られた溶液または懸濁液に、有効成分および／又はその塩を含む溶液または分散液を添加して、上記２）および３）に従う。ここで溶液の溶媒は、脂質を溶解することができ、かつ沸点が低いことが好ましい。この溶媒の例には、メタノール、クロロホルム、エタノール、アセトンなどが含まれる。
【００３４】
上記で得られたリポソームを含む水性溶媒(懸濁液)を、さらにフィルターに通すことにより、リポソームの粒径を揃えることができる。リポソームの粒径は１００〜５００ｎｍに揃えられることが好ましく、１５０〜３００ｎｍに揃えられることが特に好ましい。
またリポソームを含む水溶性溶媒を超遠心処理することにより、沈殿物としてリポソームを分離することができる。分離されたリポソームは必要に応じて洗浄されることもできる。
【００３５】
＜本発明の処置用組成物＞
本発明の処置用組成物は、前述した本発明のリポソームを含むことを特徴とする。
本発明の処置用組成物としては、本発明のリポソームの効果が奏されれば特に制限はなく、皮膚外用剤、経口剤、注射剤などが含まれる。本発明の処置用組成物は、好ましくは皮膚外用剤である。
【００３６】
本発明の処置用組成物におけるリポソームの含有量は、処置用組成物全質量に対して、０．１〜１０質量％であることが好ましく、０．５〜５質量％であることがより好ましい。本発明の処置用組成物においてリポソームは、懸濁もしくは分散されていてもよく、または溶解されていてもよいが、好ましくは分散されている。
また、本発明の処置用組成物における有効成分および／又はその塩の含有量は、処置用組成物全質量に対して０．０１〜５質量％であることが好ましく、０．１〜１質量％であることがより好ましい。
【００３７】
前述の通り本発明の処置用組成物は必須成分である本発明のリポソーム以外に、通常処置用組成物で使用される任意成分を含有することができる。任意成分の例には、オイルもしくはワックス、炭化水素類、高級脂肪酸類、アルコール類、油剤、界面活性剤、多価ア
ルコール類、保湿成分、増粘剤、防腐剤、粉体類、無機顔料類、パール剤、有機色素、紫外線吸収剤、ビタミン類、ｐＨ調整剤などが含まれる。
【００３８】
オイルもしくはワックスの例には、マカデミアナッツ油、アボガド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等が含まれる。
炭化水素類の例には、流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等が含まれる。
高級脂肪酸類の例には、オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等が含まれる。
【００３９】
アルコール類の例には、エタノール、イソプロパノールセチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、オクチルドデカノール、ミリスチルアルコール、セトステアリルアルコール等が含まれる。
油剤の例には、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン、アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等のシリコーン油等が含まれる。
【００４０】
界面活性剤は、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤のいずれでもよい。
アニオン界面活性剤の例には、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等が含まれる。
カチオン界面活性剤の例には、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等が含まれる。
両性界面活性剤の例には、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等が含まれる。
非イオン界面活性剤の例には、イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット等の脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）ソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニ
ルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等が含まれる。
【００４１】
多価アルコール類の例には、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２−メチル２，４−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール等が含まれる。
【００４２】
保湿成分の例には、ポリメタクリロイルオキシエトキシホスホリルコリン、ポリグリコシルエトキシメタクリレート、ポリグルコシルエトキシメタクリレート、ポリメタクリロイルリジン等の、ポリアクリル酸またはポリメタクリル酸を基体とし、側鎖に親水性基を導入したポリマーまたはコポリマー、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等が含まれる。
【００４３】
増粘剤の例には、グアガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、アラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、キサンタンガム、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、トラガントガム、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ムコイチン硫酸、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラン、ケラト硫酸、ローカストビーンガム、サクシノグルカン、カロニン酸、キチン、キトサン、カルボキシメチルキチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ベントナイト等が含まれる。
【００４４】
粉体類は、無機粉体でも有機粉体でもよい。
無機粉体の例には、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等が含まれる。粉体類は表面を処理されていてもよい。
有機粉体の例には、ポリエチレン粉末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等が含まれる。
【００４５】
無機顔料類の例には、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛等が含まれる。無機顔料類は、表面処理されていてもよい。
パール剤の例には、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等が含まれる。パール剤は、表面処理されていてもよい。
有機色素類の例には、赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等が含まれる。有機色素類は、レーキ化されていてもよい。
【００４６】
防腐剤の例には、フェノキシエタノールなどが含まれる。
紫外線吸収剤の例には、パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、桂皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４’−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等が含まれる。
【００４７】
ビタミン類の例には、ビタミンＡまたはその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩、ビタミンＢ６トリパルミテート、ビタミンＢ６ジオクタノエート、ビタミンＢ２またはその誘導体、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１５またはその誘導体などのビタミンＢ類、α−トコフェロール，β−トコフェロール，γ−トコフェロール等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノンなどが含まれる。
ｐＨ調整剤の例には、リン酸およびその塩（ナトリウム塩など）が含まれる。
【００４８】
本発明の処置用組成物の剤型は特に制限されないが、ローション剤型、クリーム剤型、ハイドロゲル剤型、貼布剤型等の皮膚外用剤形、或いはリポソーム分散経口投与医薬などの経口投与医薬剤形、リポソーム分散注射薬などの注射薬剤形などが例示される。特に好ましいものは、皮膚外用剤形である。
【００４９】
本発明の処置用組成物は剤型に応じて、前述のリポソームと任意成分とを常法に従って処理することにより製造することができる。
本発明の処置用組成物の製造において用いられるリポソームは、溶液または懸濁液に含まれた状態で配合されてもよく、あるいは必要に応じて溶媒から分離された状態または洗浄された単離された状態で配合されてもよい。
【００５０】
本発明の処置用組成物が皮膚投与（例えば経皮投与）されると、それに含まれるリポソームは標的臓器（例えば皮膚の表皮・真皮）に選択的に到達することができる。これは、リポソームが角層間脂質への高い融合能を有するためであると推察される。
また、有効成分を含む本発明のリポソームを用いることにより、標的臓器に該有効成分の作用を効果的に奏させることができる。
【実施例】
【００５１】
以下に、実施例を挙げて、本発明について、更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。
【００５２】
＜実施例１＞
［リポソームの作製（１）］
リポソームをＢａｎｇｈａｍらの報告した薄膜法（１９６５）に従って作製した。
以下の表１に示される脂質１５ｍｇを、ナスフラスコ内のクロロホルム（１５ｍｌ）に加えて懸濁した。エバポレーターにて溶媒を減圧除去して、フラスコの内壁に薄膜を形成した。薄膜が形成されたフラスコ中にカルセインＮａ １０ｍＭ／ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩）を６ｍｌ添加した。ウォーターバスにて６０℃に温めながらボルテックスにかけて、フラスコの内壁から膜を剥離し、リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液を、エクストルーダーに装着された２００ｎｍのメンブレンフィルターに１０回通し、リポソーム液に含まれるリポソームの粒径を約２００ｎｍに揃えた。
さらに、得られたリポソーム液をＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ７５を装填したカラムに通し、リポソームに内封されていないカルセインＮａを除去した。このリポソーム液を、超遠心処理（２６７０００ｇ， ６０ｍｉｎ）して生じた沈殿物を回収した。回収された沈殿物を、約１．５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁した。（以下、単に懸濁液という場合がある。）
得られた懸濁液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）により希釈し、カルセインＮａ濃度を１００μＭとした。カルセインＮａ濃度は蛍光測定機により測定した。得られたリポソーム液をリポソーム液１と称する。
【００５３】
【表１】
【００５４】
【化４】
【００５５】
＜実施例２＞
実施例１における脂質組成物を、以下の表２に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例１と同様にしてリポソーム液２を得た。
【００５６】
【表２】
【００５７】
【化５】
【００５８】
＜実施例３＞
実施例１における脂質組成物を、以下の表３に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例１と同様にしてリポソーム液３を得た。
【００５９】
【表３】
【００６０】
＜実施例４＞
実施例１における脂質組成物を、以下の表４に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例１と同様にしてリポソーム液４を得た。
【００６１】
【表４】
【００６２】
＜比較例１＞
実施例１における脂質組成物を、以下の表５に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例１と同様にしてリポソーム液５を得た。リポソーム液５はＳＣＬＬ（Stratum corneum lipid liposome）と称されることがある。
【００６３】
【表５】
【００６４】
【化６】
【００６５】
＜比較例２＞
実施例１における脂質組成物を、以下の表６に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例１と同様にしてリポソーム液６を得た。
【００６６】
【表６】
【００６７】
＜比較例３＞
リポソーム液１,２,３,４,５,６と同濃度１００μＭのカルセインＮａ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（比較溶液１）を調製した。
【００６８】
［in vitro 皮膚透過試験（１）］
実施例１,２,３,４、比較例１,２および３で得られたリポソーム液１,２,３,４,５,６、および比較溶液１について、以下の手順でin vitro皮膚透過試験を行った。リポソーム液１,２,３,４,５,６、および比較溶液１それぞれについて、３つの皮膚透過試験用拡散セルを用いて試験を行った。
【００６９】
ヘアレス・ラット（Ｈａｉｒｌｅｓｓ ｒａｔ ７週齢オス）から採取した背部皮膚の裏面の脂肪組織を除去した。脂肪組織が除去された皮膚を、直径１．５ｃｍのパンチにて丸くくり抜いた。くり抜かれた皮膚を、皮膚外面側を上にして皮膚透過試験用Ｆｒａｎｔｚセルにセットした。
Ｆｒａｎｔｚセルのレシーバー（皮膚内面側）にＰＢＳ（ｐＨ７．４）を満たし（４．５ｍｌ）、レシーバー内のＰＢＳをスティアラーにて攪拌しながら３２℃に保持した。（このラットから皮膚を採取し、セルにセットし、レシーバーにＰＢＳを保持する工程を準備工程とする。）
【００７０】
その後、セルのドナー（皮膚外面側）にリポソーム液１,２,３,４,５,６、および比較溶液１（各４００μｌ）をそれぞれ入れた。
２４時間後にＦｒａｎｔｚセルのレシーバー溶液を２００μｌ採取した。採取したレシーバー溶液の蛍光強度を測定し、レシーバー溶液内に含まれるカルセインＮａ量を求め、アプライしたカルセインＮａ量に対する重量％を計算した。
また、Ｆｒａｎｔｚセルから皮膚を回収した。回収した皮膚をビーカー内のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸して、３０回揺らして皮膚表面に付着しているカルセインＮａを除去した。皮膚のうちドナー溶液が接していた部分（直径１．５ｃｍ）のみを鋏で丸く切り出し、切り出された皮膚を細かく切断した。切断された皮膚をバイアル瓶中のメタノール５ｍｌに浸した。各バイアル瓶に対しバス型超音波を６０分間照射後、バイアルビン中の溶液２００μｌを採取した。採取した溶液の蛍光強度を測定し、皮膚内に含まれるカルセインＮａ量を求め、アプライしたカルセインＮａ量に対する重量％を計算した。
（この２４時間後のレシーバー溶液内に含まれるカルセインＮａ量の測定および算出、ならびに皮膚内に含まれるカルセインＮａ量の測定および算出する工程を算出工程とする。）
【００７１】
算出された結果を図１および２に示す。図１は皮膚内カルセインNa量、図２はレシーバー内カルセインNa量を示す。図１に示されたように、リポソーム液１,２,３,４（一般式（Ｉ’）のセラミドまたは一般式（Ｉ’’）のセラミドを含むリポソーム）が、選択的に皮膚内に到達していることが明確に分かる。また、図１，２よりリポソーム液１,２,３,４（一般式（Ｉ’）のセラミドまたは一般式（Ｉ’’）のセラミドを含むリポソーム）は比較例（リポソーム液５，６および比較溶液１）に比べて皮膚を透過せず、選択的に皮膚内に取り込まれていることがわかる。カルセインナトリウムは蛍光を有し、本発明のリポ
ソームによれば、該蛍光により、リポソームが皮膚内に到達し、内包成分を放出したことを知るトレーサーとしての有効性が判る。
【００７２】
＜実施例５＞
［リポソームの作製（２）］
リポソームをＢａｎｇｈａｍらの報告した薄膜法（１９６５）に従って作製した。
以下の表７に示される脂質１５ｍｇを、ナスフラスコ内のクロロホルム（１５ｍｌ）に加えて懸濁した。エバポレーターにて溶媒を減圧除去して、フラスコの内壁に薄膜を形成した。薄膜が形成されたフラスコ中にＦＩＴＣデキストラン（分子量４０００）４０ｍＭ／ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を１．５ｍｌ添加した。ウォーターバスにて６０℃に温めながらボルテックスにかけて、フラスコの内壁から膜を剥離し、リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液を、エクストルーダーに装着された２００ｎｍのメンブレンフィルターに１０回通し、リポソーム液に含まれるリポソームの粒径を約２００ｎｍに揃えた。
さらに、得られたリポソーム液をＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ７５を装填したカラムに通し、リポソームに内封されていないＦＩＴＣデキストランを除去した。このリポソーム液を、超遠心処理（２６７０００ｇ， ６０ｍｉｎ）して生じた沈殿物を回収した。回収された沈殿物を、約１．５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁した。（以下、単に懸濁液という場合がある。）
得られた懸濁液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）により希釈し、ＦＩＴＣデキストラン濃度を３００ｎＭとした。ＦＩＴＣデキストラン濃度は蛍光測定機により測定した。得られたリポソーム液をリポソーム液７と称する。
【００７３】
【表７】
【００７４】
＜比較例４＞
実施例５における脂質組成物を、以下の表８に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例５と同様にしてリポソーム液８を得た。
【００７５】
【表８】
【００７６】
＜比較例５＞
リポソーム液７,８および同濃度３００ｎＭのＦＩＴＣデキストラン／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（比較溶液２）を調製した。
【００７７】
［in vitro 皮膚透過試験（２）］
実施例５、比較例４および比較例５で得られたリポソーム液７，８および比較溶液２について、以下の手順でin vitro皮膚透過試験を行った。リポソーム液７，８および比較溶液２それぞれについて、３つの皮膚透過試験用拡散セルを用いて試験を行った。
【００７８】
実施例１と同様の準備工程後、セルのドナー（皮膚外面側）にリポソーム液７，８および比較溶液２（各４００μｌ）をそれぞれ入れた。
２４時間後にＦｒａｎｔｚセルから皮膚を回収した。回収した皮膚をビーカー内のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸して、３０回揺らして皮膚表面に付着しているＦＩＴＣデキストランを除去した。皮膚のうちドナー溶液が接していた部分（直径１．５ｃｍ）のみを鋏で丸く切り出し、切り出された皮膚を細かく切断した。切断された皮膚をバイアル瓶中のTriton0.08%／ＰＢＳ５ｍｌに浸した。各バイアル瓶に対しバス型超音波を６０分間照射後、バイアルビン中の溶液２００μｌを採取した。採取した溶液の蛍光強度を測定し、皮膚内に含まれるＦＩＴＣデキストラン量を求め、アプライしたＦＩＴＣデキストラン量に対する重量％を計算した。
【００７９】
算出された結果を図３に示す。図３は皮膚内ＦＩＴＣデキストラン（ＦＤ４）量を示す。図３に示されたように、リポソーム液７（一般式（Ｉ’）のセラミドを含むリポソーム）が、選択的に皮膚内に到達していることが明確に分かる。
【００８０】
＜実施例６＞
［リポソームの作製（３）］
リポソームをＢａｎｇｈａｍらの報告した薄膜法（１９６５）に従って作製した。
以下の表９に示される脂質１５ｍｇを、ナスフラスコ内のクロロホルム（１５ｍｌ）に加えて懸濁した。メタノール（１ｍｌ）に溶解したビタミンＤ３ ３ｍｇを添加した。エバポレーターにて溶媒を減圧除去して、フラスコの内壁に薄膜を形成した。薄膜が形成されたフラスコ中にＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を６ｍｌ添加した。ウォーターバスにて６０℃に温めながらボルテックスにかけて、フラスコの内壁から膜を剥離し、リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液を、エクストルーダーに装着された２００ｎｍのメンブレンフィルターに１０回通し、リポソーム液に含まれるリポソームの粒径を約２００ｎｍに揃えた。
さらにリポソーム液を、超遠心処理（２６７０００ｇ， ６０ｍｉｎ）して生じた沈殿物を回収した。回収された沈殿物を、約１．５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁した。（以下、単に懸濁液という場合がある。）
得られた懸濁液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）により希釈し、ビタミンＤ３濃度を０．０６重量％とした。ビタミンＤ３濃度はＨＰＬＣにより測定した。得られたリポソーム液をリポソーム液９と称する。
【００８１】
【表９】
【００８２】
＜比較例６＞
実施例６における脂質組成物を、以下の表１０に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例６と同様にしてリポソーム液１０を得た。
【００８３】
【表１０】
【００８４】
＜比較例７＞
リポソーム液９,１０と同濃度０．０６重量％のビタミンＤ３／白色ワセリン（比較ワセリン）を調製した。
【００８５】
［in vitro 皮膚透過試験（３）］
実施例６、比較例６および比較例７で得られたリポソーム液９,１０および比較ワセリンについて、以下の手順でin vitro皮膚透過試験を行った。リポソーム液９,１０および比較ワセリンそれぞれについて、３つの皮膚透過試験用拡散セルを用いて試験を行った。
【００８６】
実施例１と同様の準備工程後、セルのドナー（皮膚外面側）にリポソーム液９,１０および比較ワセリン（各４００μｌ）をそれぞれ入れた。
２４時間後にＦｒａｎｔｚセルから皮膚を回収した。回収した皮膚をビーカー内のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸して、３０回揺らして皮膚表面に付着しているビタミンＤ３を除去した。皮膚のうちドナー溶液が接していた部分（直径１．５ｃｍ）のみを鋏で丸く切り出し、切り出された皮膚を細かく切断した。切断された皮膚をバイアル瓶中のメタノール５ｍｌに浸した。各バイアル瓶に対しバス型超音波を６０分間照射後、バイアルビン中の溶液２００μｌを採取した。採取した溶液のＨＰＬＣを測定し、皮膚内に含まれるビタミンＤ３量を求め、アプライしたビタミンＤ３量に対する重量％を計算した。
【００８７】
算出された結果を図４に示す。図４は皮膚内ビタミンＤ３（ＶｉｔＤ３）量を示す。図４に示されたように、リポソーム液９（一般式（Ｉ’）のセラミドを含むリポソーム）が、選択的に皮膚内に到達していることが明確に分かる。
【００８８】
＜実施例７＞
［リポソームの作製（４）］
リポソームをＢａｎｇｈａｍらの報告した薄膜法（１９６５）に従って作製した。
以下の表１１に示される脂質１５０ｍｇを、ナスフラスコ内のクロロホルム（４０ｍｌ）に加えて懸濁した。さらにビダラビン ３０ｍｇを添加した。エバポレーターにて溶媒を減圧除去して、フラスコの内壁に薄膜を形成した。薄膜が形成されたフラスコ中にＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を６ｍｌ添加した。ウォーターバスにて６０℃に温めながらボルテックスにかけて、フラスコの内壁から膜を剥離し、リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液を、エクストルーダーに装着された２００ｎｍのメンブレンフィルターに５回通し、リポソーム液に含まれるリポソームの粒径を約２００ｎｍに揃えた。
さらにリポソーム液を、超遠心処理（２６７０００ｇ， ６０ｍｉｎ）して生じた沈殿物を回収した。回収された沈殿物を、約１．５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁した。（以下、単に懸濁液という場合がある。）
得られた懸濁液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）により希釈し、ビダラビン濃度を０．６７５重量％とした。ビダラビン濃度はＨＰＬＣにより測定した。得られたリポソーム液をリポソーム液１１と称する。
【００８９】
【表１１】
【００９０】
＜比較例８＞
実施例７における脂質組成物を、以下の表１２に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例７と同様にしてリポソーム液１２を得た。
【００９１】
【表１２】
【００９２】
＜比較例９＞
実施例７における脂質組成物を、以下の表１３に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例７と同様にしてリポソーム液１３を得た。
【００９３】
【表１３】
【００９４】
＜比較例１０＞
リポソーム液１１，１２，１３と同濃度０．６７５重量％のビダラビン（市販クリーム剤型）（比較クリーム）を調製した。
【００９５】
［in vitro 皮膚透過試験（４）］
実施例７、比較例８,９，１０で得られたリポソーム液１１，１２，１３および比較クリームについて、以下の手順でin vitro皮膚透過試験を行った。リポソーム液１１，１２，１３および比較クリームそれぞれについて、３つの皮膚透過試験用拡散セルを用いて試験を行った。
【００９６】
実施例１と同様の準備工程後、セルのドナー（皮膚外面側）にリポソーム液１１，１２、１３および比較クリーム（各４００μｌ）をそれぞれ入れた。
２４時間後にＦｒａｎｔｚセルから皮膚を回収した。回収した皮膚をビーカー内のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸して、３０回揺らして皮膚表面に付着しているビダラビンを除去し
た。皮膚のうちドナー溶液が接していた部分（直径１．５ｃｍ）のみを鋏で丸く切り出し、切り出された皮膚を細かく切断した。切断された皮膚をバイアル瓶中のメタノール５ｍｌに浸した。各バイアル瓶に対しバス型超音波を６０分間照射後、バイアルビン中の溶液２００μｌを採取した。採取した溶液のＨＰＬＣを測定し、皮膚内に含まれるビダラビン量を求め、アプライしたビダラビン量に対する重量％を計算した。
【００９７】
算出された結果を図５に示す。図５は皮膚内ビタミンＤ３量を示す。図５に示されたように、リポソーム液１１（一般式（Ｉ’）のセラミドを含むリポソーム）が、選択的に皮膚内に到達していることが明確に分かる。
【００９８】
＜実施例８＞
［リポソームの作製（５）］
リポソームをＢａｎｇｈａｍらの報告した薄膜法（１９６５）に従って作製した。
以下の表１４に示される脂質１５ｍｇを、ナスフラスコ内のクロロホルム（１５ｍｌ）に加えて懸濁した。さらにリドカイン３ｍｇを添加した。エバポレーターにて溶媒を減圧除去して、フラスコの内壁に薄膜を形成した。薄膜が形成されたフラスコ中にＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を６ｍｌ添加した。ウォーターバスにて６０℃に温めながらボルテックスにかけて、フラスコの内壁から膜を剥離し、リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液を、エクストルーダーに装着された２００ｎｍのメンブレンフィルターに１０回通し、リポソーム液に含まれるリポソームの粒径を約２００ｎｍに揃えた。
さらにリポソーム液を、超遠心処理（２６７０００ｇ， ６０ｍｉｎ）して生じた沈殿物を回収した。回収された沈殿物を、約１．５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁した。（以下、単に懸濁液という場合がある。）
得られた懸濁液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）により希釈し、リドカイン濃度を０．２重量％とした。リドカイン濃度はＨＰＬＣにより測定した。得られたリポソーム液をリポソーム液１４と称する。
【００９９】
【表１４】
【０１００】
＜比較例１１＞
実施例８における脂質組成物を、以下の表１５に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例８と同様にしてリポソーム液１５を得た。
【０１０１】
【表１５】
【０１０２】
［in vitro 皮膚透過試験（５）］
実施例８および比較例１１で得られたリポソーム液１４および１５について、以下の手順でin vitro皮膚透過試験を行った。リポソーム液１４および１５それぞれについて、３つの皮膚透過試験用拡散セルを用いて試験を行った。
【０１０３】
実施例１と同様の準備工程後、セルのドナー（皮膚外面側）にリポソーム液１４および１５（各４００μｌ）をそれぞれ入れた。
２４時間後にＦｒａｎｔｚセルから皮膚を回収した。回収した皮膚をビーカー内のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸して、３０回揺らして皮膚表面に付着しているリドカインを除去した。皮膚のうちドナー溶液が接していた部分（直径１．５ｃｍ）のみを鋏で丸く切り出し、切り出された皮膚を細かく切断した。切断された皮膚をバイアル瓶中のメタノール５ｍｌに浸した。各バイアル瓶に対しバス型超音波を６０分間照射後、バイアルビン中の溶液２００μｌを採取した。採取した溶液のＨＰＬＣを測定し、皮膚内に含まれるリドカイン量を求め、アプライしたリドカイン量に対する重量％を計算した。
【０１０４】
算出された結果を図６に示す。図６は皮膚内リドカイン量を示す。図６に示されたように、リポソーム液１４（一般式（Ｉ’）のセラミドを含むリポソーム）が、選択的に皮膚内に到達していることが明確に分かる。
【０１０５】
＜実施例９＞
［リポソームの作製（６）］
リポソームをＢａｎｇｈａｍらの報告した薄膜法（１９６５）に従って作製した。
以下の表１６に示される脂質１５ｍｇを、ナスフラスコ内のクロロホルム（１５ｍｌ）に加えて懸濁した。さらにウルソール酸ベンジル ３ｍｇを添加した。エバポレーターにて溶媒を減圧除去して、フラスコの内壁に薄膜を形成した。薄膜が形成されたフラスコ中にＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を６ｍｌ添加した。ウォーターバスにて６０℃に温めながらボルテックスにかけて、フラスコの内壁から膜を剥離し、リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液を、エクストルーダーに装着された２００ｎｍのメンブレンフィルターに１０回通し、リポソーム液に含まれるリポソームの粒径を約２００ｎｍに揃えた。
さらにリポソーム液を、超遠心処理（２６７０００ｇ， ６０ｍｉｎ）して生じた沈殿物を回収した。回収された沈殿物を、約１．５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁した。（以下、単に懸濁液という場合がある。）
得られた懸濁液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）により希釈し、ウルソール酸ベンジル濃度を０．２重量％とした。ウルソール酸ベンジル濃度はＨＰＬＣにより測定した。得られたリポソーム液をリポソーム液１６と称する。
【０１０６】
【表１６】
【０１０７】
＜比較例１２＞
実施例９における脂質組成物を、以下の表１７に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例９と同様にしてリポソーム液１７を得た。
【０１０８】
【表１７】
【０１０９】
［in vitro 皮膚透過試験（６）］
実施例９および比較例１２で得られたリポソーム液１６および１７について、以下の手順でin vitro皮膚透過試験を行った。リポソーム液１６および１７それぞれについて、３つの皮膚透過試験用拡散セルを用いて試験を行った。
【０１１０】
実施例１と同様の準備工程後、セルのドナー（皮膚外面側）にリポソーム液１６および１７（各４００μｌ）をそれぞれ入れた。
２４時間後にＦｒａｎｔｚセルから皮膚を回収した。回収した皮膚をビーカー内のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸して、３０回揺らして皮膚表面に付着しているリドカインを除去した。皮膚のうちドナー溶液が接していた部分（直径１．５ｃｍ）のみを鋏で丸く切り出し、切り出された皮膚を細かく切断した。切断された皮膚をバイアル瓶中のメタノール５ｍｌに浸した。各バイアル瓶に対しバス型超音波を６０分間照射後、バイアルビン中の溶液２００μｌを採取した。採取した溶液のＨＰＬＣを測定し、皮膚内に含まれるウルソール酸ベンジル量を求め、アプライしたウルソール酸ベンジル量に対する重量％を計算した。
【０１１１】
算出された結果を図７に示す。図７は皮膚内ウルソール酸ベンジル（ＵＡＢ）量を示す。図７に示されたように、リポソーム液１６（一般式（Ｉ’）のセラミドを含むリポソーム）が、選択的に皮膚内に到達していることが明確に分かる。
【０１１２】
＜実施例１０＞
［リポソームの作製（７）］
リポソームをＢａｎｇｈａｍらの報告した薄膜法（１９６５）に従って作製した。
以下の表１８に示される脂質１５ｍｇを、ナスフラスコ内のクロロホルム（１５ｍｌ）に加えて懸濁した。エバポレーターにて溶媒を減圧除去して、フラスコの内壁に薄膜を形成した。薄膜が形成されたフラスコ中に、蛍光ラテックスビーズ懸濁水溶液（ポリサイエンス社製、カルボキシル基修飾、粒子径50nm）６ｍｌを添加した。ウォーターバスにて６０℃に温めながらボルテックスにかけて、フラスコの内壁から膜を剥離し、リポソーム液を得た。得られたリポソーム液を液体窒素中で冷却し、６０℃のお湯にて融解する作業を５回以上実施した。本作業によってリポソームへのラテックスビーズ溶液の内包効率が上がる。ショ糖密度勾配遠心処理（２６７０００ｇ， ３０ｍｉｎ）にて、リポソーム画分を得た。
さらに得られたリポソーム画分を蒸留水で希釈し、超遠心処理（２６７０００ｇ， ６０ｍｉｎ）して生じた沈殿物を回収した。回収された沈殿物を、約１．５ｍｌの蒸留水に懸濁した。（以下、単に懸濁液という場合がある。）
得られた懸濁液の蛍光強度を蛍光測定機により測定し、適宜蒸留水にて希釈した。得られたリポソーム液をリポソーム液１８と称する。
【０１１３】
【表１８】
【０１１４】
＜比較例１３＞
実施例１０における脂質組成物を、以下の表１９に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例１０と同様にしてリポソーム液１９を得た。蒸留水を用いて希釈し、リポソーム液１８と蛍光強度が等しくなるように揃えた。
【０１１５】
【表１９】
【０１１６】
＜比較例１４＞
蛍光ラテックスビーズ水溶液（比較溶液３）を調製した。蒸留水を用いて希釈し、リポソーム液１８およびリポソーム液１９と蛍光強度が等しくなるように揃えた。
【０１１７】
［in vitro 皮膚透過試験（７）］
実施例１０および比較例１３,１４で得られたリポソーム液１８および１９、比較溶液３について、以下の手順でin vitro皮膚透過試験を行った。リポソーム液１８および１９、比較溶液３それぞれについて、３つの皮膚透過試験用拡散セルを用いて試験を行った。
【０１１８】
実施例１と同様の準備工程後、セルのドナー（皮膚外面側）にリポソーム液１８および１９、比較溶液３（各４００μｌ）をそれぞれ入れた。
２４時間後にＦｒａｎｔｚセルから皮膚を回収した。回収した皮膚をビーカー内のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸して、３０回揺らして皮膚表面に付着している蛍光ラテックスビーズを除去した。皮膚のうちドナー溶液が接していた部分（直径１．５ｃｍ）のみを鋏で丸く切り出し、切り出された皮膚を細かく切断した。切断された皮膚をバイアル瓶中のメタノール５ｍｌに浸した。各バイアル瓶に対しバス型超音波を６０分間照射後、バイアルビン中の溶液２００μｌを採取した。採取した溶液の蛍光強度を測定し、皮膚内に含まれる蛍光量を求め、アプライしたラテックスビーズ蛍光量に対する重量％を計算した。
【０１１９】
算出された結果を図８に示す。図８は皮膚内蛍光ラテックスビーズ量を示す。図８に示されたように、リポソーム液１８（一般式（Ｉ’）のセラミドを含むリポソーム）が、選択的に皮膚内に到達していることが明確に分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明は、標的臓器への到達率が高い皮膚外用剤に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】実施例１,２,３,４、比較例１,２および比較例３の皮膚内のカルセインＮａの量の比較を表す図である。
【図２】実施例１,２,３,４、比較例１,２および比較例３のレシーバー内のカルセインＮａの量の比較を表す図である。
【図３】実施例５、比較例４および比較例５の皮膚内のＦＩＴＣデキストランの量の比較を表す図である。
【図４】実施例６、比較例６および比較例７の皮膚内のビタミンＤ３量の比較を表す図である。
【図５】実施例７、比較例８,９および比較例１０の皮膚内のビダラビン量の比較を表す図である。
【図６】実施例８、比較例１１の皮膚内のビダラビン量の比較を表す図である。
【図７】実施例９、比較例１２の皮膚内のウルソール酸ベンジル量の比較を表す図である。
【図８】実施例１０、比較例１３および比較例１４の皮膚内の蛍光ラテックスビーズ量の比較を表す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はセラミドをリポソーム膜に含有するリポソームに関する。さらに詳細には、生体に投与されることにより標的臓器に選択的に到達することができるリポソームに関する。さらに本発明は、前記リポソームを含有する処置用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームはリン脂質などを含有する脂質二重膜で構成された小胞であり、該小胞内部には水性成分が保持されている。このためリポソームを生体中に投与すると、小胞の内部に保持された成分は、酵素などの生体成分に触れることなく生体中を移動することができる。更に、リポソーム膜を構成する脂質二重膜は生体臓器の細胞壁との親和性を有するので、臓器に到達したリポソームは細胞壁を通過して臓器中に取り込まれやすい性質を有するといわれている。これらの性質を利用して、リポソームはターゲッティング製剤の開発などに応用されている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００３】
臓器構成成分で構成されるリポソーム膜を有するリポソームの小胞の内部に保持された成分（「リポソームに内包された成分」ともいう）は、標的臓器に対するリリース性が向上され得ると報告されている（例えば、非特許文献１を参照）。リポソーム膜を構成する該臓器構成成分としてセラミドが知られており、特定の構造を有するセラミドをリポソーム膜の構成成分としたリポソームが報告されている（例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４を参照）。しかしながら、このようなセラミドをリポソーム膜の構成成分とするリポソームは、標的臓器へ到達しにくいという問題があった。
【０００４】
【特許文献１】特再２０００／０６１１１４号公報
【特許文献２】特表平０８−５０２９６１号公報
【特許文献３】特開平１０−０５９８４０号公報
【特許文献４】特開２００４−２３０１７３号公報
【非特許文献１】M. Kirjavainen et.al.,Biochim Biophys Acta. 1996 ;1304(3):179-89
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、標的臓器（好ましくは皮膚の表皮・真皮）に選択的に到達することができるリポソームを求めて鋭意検討した。具体的には、リポソーム膜の構成成分を調整することにより、リポソームを標的臓器へ到達させやすくすることを検討した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、下記一般式（Ｉ）に表されるセラミドをリポソーム膜に含むリポソームは、投与（例えば皮膚投与）されると、皮膚の表皮・真皮に選択的に到達することができることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は以下に示す通りである。
［１］ 下記一般式（I）で示されるセラミドをリポソーム膜に含むことを特徴とする、リポソーム。
【０００８】
【化１】
（一般式（I）において、Ｒ1は炭素数１〜８のアルキル基を表し、Ｒ2は炭素数１１〜２１の水酸基を有しても良いアルキル基またはアルケニル基を表す。）
【０００９】
［２］ 前記一般式（I）において、Ｒ1がメチル基またはヘプチル基を表し、Ｒ2がα−ペンタデセニル基を表すことを特徴とする、［１］に記載のリポソーム。
［３］ 前記セラミドの含有量が、リポソーム膜の全質量に対して３０〜６０質量％であることを特徴とする、［１］または［２］に記載のリポソーム。
［４］ 前記リポソーム膜が、コレステロール、脂肪酸、コレステロール硫酸、およびリン脂質、ならびにこれらの塩からなる群から選択される一種または二種以上をさらに含有することを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか一つに記載のリポソーム。
［５］ 前記リポソーム膜が形成する小胞の内部及び／又は小胞脂質膜中に、有効成分を含有する溶液または分散液が含まれていることを特徴とする、［１］〜［４］のいずれか一つに記載のリポソーム。
［６］ 前記有効成分は、カルセインおよびその塩、ＦＩＴＣ−デキストラン、リドカインおよびその塩、ビダラビン、ビタミンＤ３、ならびにウルソール酸エステルからなる群から選択される一種または二種以上であることを特徴とする、［５］に記載のリポソーム。
［７］ ［１］〜［６］のいずれか一つに記載のリポソームを含有する処置用組成物。
［８］ 皮膚外用剤であることを特徴とする、［７］に記載の処置用組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のリポソームは、投与（例えば皮膚投与）されることにより標的臓器（例えば皮膚の表皮・真皮）に選択的に到達することができる。従って、有効成分を含む本発明のリポソームを用いることにより、標的臓器における該有効成分の作用を効果的に奏させることができる。さらに、有効成分を含む本発明のリポソームは、有効成分の種類に応じて、種々の処置用組成物の成分として用いられることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
＜本発明のリポソーム＞
本発明のリポソームは下記一般式（Ｉ）に表されるセラミドをリポソーム膜に含有することを特徴とする。
【００１２】
【化２】
（一般式（I）において、Ｒ1は炭素数１〜８のアルキル基を表し、Ｒ2は炭素数１１〜２１の水酸基を有しても良いアルキル基またはアルケニル基を表す。）
【００１３】
一般的にリポソームのリポソーム膜は脂質二重膜で構成されるが、その脂質二重膜は多重の同心球（多重層）を形成している場合と、単層を形成している場合とがある。本発明のリポソームのリポソーム膜は単層または多重層の何れでも良いが、好ましくは多重層である。
【００１４】
本発明のリポソームのリポソーム膜は少なくともセラミドを含有することを特徴とするが、リン脂質やその他の成分をさらに含有していてもよい。
一般的にセラミドとはスフィンゴシンまたはその類似体の、Ｎ−アシル誘導体の総称である。セラミドはその特徴部分であるＮ−アシル基の構造などによって、タイプ１〜タイプ７に大別されることがある（例えば、Robson KJ, Stewart ME, Michelsen S, Lazo ND,
Downing DT.: 6-Hydroxy-4-sphingenine in human epidermal ceramides. J Lipid Res.
1994 Nov;35(11):2060-8を参照）。そのタイプによって、生体内における臓器分布が異なっているといわれている。本発明のリポソームに含まれるセラミドは特に限定されるわけではないが、前記７つのタイプのうちタイプ２に属するものと考えられている。
【００１５】
本発明のリポソームのリポソーム膜に含まれるセラミドは、下記一般式（Ｉ）で表されるセラミドであることが好ましい。
一般式（Ｉ）において、Ｒ1は好ましくは炭素数１〜８のアルキル基を示す。Ｒ1で示される基の具体的な例には、メチル基、プロピル基、ペンチル基、ヘプチル基などが含まれ、特に好ましくはメチル基またはヘプチル基などである。
一般式（Ｉ）において、Ｒ2は好ましくは炭素数１１〜２１の水酸基を有していてもよいアルキル基またはアルケニル基を示す。Ｒ2で示されるアルキル基の具体的な例には、１−ヒドロキシペンタデカニル（1-hydroxy-pentadecanyl）基などが含まれる。また、Ｒ2で示されるアルケニル基の具体的な例には、α−ペンタデセニル（α-pentadecenyl）基および２−ヒドロキシ−α−ペンタデセニル（2-hydroxy-α-pentadecenyl）基などが含まれる。Ｒ2の特に好ましい例には、α−ペンタデセニル基などが含まれる。
【００１６】
【化３】
（一般式（I）において、Ｒ1は炭素数１〜８のアルキル基を表し、Ｒ2は炭素数１１〜２１の水酸基を有しても良いアルキル基またはアルケニル基を表す。）
【００１７】
一般式（Ｉ）で表されるセラミドの具体的な例には、Ｎ−アセトイル−Ｄ−エリスロスフィンゴシン（N-Acetoyl-D-erythro-Sphingosine）またはＮ−オクタノイル−Ｄ−エリスロスフィンゴシン（N-Octanoyl-D-erythro-Sphingosine）などが含まれる。
【００１８】
一般式（Ｉ）に表される化合物は、既知の化合物またはその類似体であるので、公知の製造方法やそれに準じた方法で製造することができる。また、一般式（Ｉ）で表される化合物の中には市販されている化合物もある。市販されている化合物の例には、Ｎ−アセトイル−Ｄ−エリスロスフィンゴシン（N-Acetoyl-D-erythro-Sphingosine）やＮ−オクタノイル−Ｄ−エリスロスフィンゴシン（N-Octanoyl-D-erythro-Sphingosine）などが含ま
れ、これらはアバンティ・ポーラー・リピッド社（Avanti Polar Lipids Inc.）より販売されている。
【００１９】
本発明のリポソームのリポソーム膜における、一般式（Ｉ）で表されるセラミドの含有量は、リポソームが溶液中で安定に存在することができるように調整される。前記セラミドの含有量は、具体的にはリポソーム膜の全質量に対して、３０〜６０質量％であることが好ましく、３５〜５５質量％であることがより好ましい。前記セラミドの含有量がこの範囲から大きくずれると、リポソームが形成されない場合がある。
【００２０】
前述の通り本発明のリポソームは、一般式（Ｉ）で表されるセラミド以外にリン脂質を含有することができる。リン脂質としては、通常リポソーム膜を構成するリン脂質であれば、特段の限定無く適用することができる。
リン脂質の好ましい例には、レシチンの主成分である、ホスファチジルコリン、ホスファチジル酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、およびホスファチジルグリセロール、ならびにこれらのリゾ体が含まれる。これらは大豆や卵黄から抽出したレシチンの形態で、あるいはこれらを水素添加した水添レシチンの形態であってもよい。本発明のリポソームのリポソーム膜は、かかるリン脂質の一種を単独で含有することもできるし、二種以上を組み合わせて含有することもできる。
リポソーム膜におけるリン脂質の総含有量は、リポソーム膜の総質量に対して、５０質量％以下であることが好ましく、４５質量％以下であることがより好ましい。リン脂質の量が多すぎると、必須成分であるセラミドの含有量を適切に調整することが困難になる場合がある。
【００２１】
本発明のリポソームのリポソーム膜は、リン脂質以外の脂質を含有することができる。該脂質の例にはコレステロール類や脂肪酸が含まれる。
【００２２】
本発明のリポソームのリポソーム膜に含まれ得るコレステロール類の好ましい例には、コレステロールそのもの、ならびにコレステロールの脂肪酸エステル、硫酸エステルおよびリン酸エステルなどが含まれる。特に好ましい例には、コレステロールそのもの、およびコレステロール硫酸エステルが含まれる。本発明のリポソームのリポソーム膜は、これらのコレステロール類の唯一種を含有することもできるし、二種以上を組み合わせて含有することもできる。
リポソーム膜におけるコレステロール類の好ましい総含有量は、リポソーム膜の総質量に対して５０質量％以下であり、より好ましくは４５質量％以下である。コレステロール類の量が多すぎると、必須成分であるセラミドの含有量を適切に制御することが困難になる場合がある。
【００２３】
本発明のリポソームのリポソーム膜に含まれ得る脂肪酸は、炭素数１０〜３０の脂肪酸であることが好ましい。脂肪酸は飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれでもよい。脂肪酸の好ましい例には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレイン酸、イソステアリン酸、オクチルドデカン酸などが含まれる。特に好ましい脂肪酸は不飽和脂肪酸であり、オレイン酸、リノール酸およびリノレイン酸から選択される。本発明のリポソームのリポソーム膜はこれらの脂肪酸の唯一種を含有することもできるし、二種以上を組み合わせて含有することもできる。
リポソーム膜における脂肪酸の総含有量は、リポソーム膜の総質量に対して５０質量％以下であることが好ましく、４５質量％以下であることがより好ましい。脂肪酸の量が多すぎると、必須成分であるセラミドの含有量を適切に制御することが困難である場合がある。
【００２４】
本発明のリポソームのリポソーム膜は、前述した成分以外に通常リポソームを構成する
成分を、本発明の効果を損なわない範囲において任意に含有することができる。このような任意成分の例には、１，３−ブタンジオール、プロピレングリコールなどの多価アルコール類；ＰＯＥ脂肪酸エステルやＰＯＥアルキルエーテルのような非イオン界面活性剤類；ポリ（メタ）アクリル酸エステルなどのような高分子類などが含まれる。
【００２５】
本発明のリポソームのリポソーム膜は、一般式（Ｉ）で表されるセラミドに加えて、リン脂質、コレステロール、コレステロールの硫酸エステルおよび脂肪酸を組み合わせて含有することが特に好ましい。リポソーム膜におけるこれらの成分の好ましい質量比としては、セラミドの質量に対して、リン脂質の質量比が０〜１５０％（より好ましくは０〜１００％）であり、脂肪酸の質量比が０〜５０％（より好ましくは０〜１５％）であり、コレステロールの質量比が０〜５０％（より好ましくは０〜１５％）であり、コレステロール硫酸エステルの質量比が０〜１００％（より好ましくは５０〜１００％）である。
【００２６】
前述の通り本発明のリポソームは多重層リポソームであっても単層リポソームであってもよいが、好ましくは多重層リポソームである。したがって、リポソームの粒径は、１００ｎｍ〜１０μｍであることが好ましい。
本発明のリポソームは小胞内部または脂質二重膜同士の間に水性溶液を含む。その溶液の容量は、特に限定されないが０．１〜１００μｌであると考えられる。
【００２７】
本発明のリポソームは、有効成分を含む溶液または分散液を、リポソーム膜が形成する小胞の内部および／又は小胞脂質膜内に含むことが好ましい。「小胞の内部に含む」とは脂質二重膜と脂質二重膜の間に存在する水性溶液に溶解されている状態を含む。また「小胞脂質膜中に含まれる」とは、脂質二重膜の間にはめ込まれている状態を含む。
【００２８】
前記有効成分は、生体に対して生理作用を発揮するもの、或いは、医学的に有用に作用するものであれば特段の限定はない。医学的に有用とは、薬物の到達を確認するなどのトレーサー機能など、医学治療、医学的研究に有用である作用が好適に例示できる。有効成分としては、カルセイン、フルオレセインデキストラン（平均分子量4000）などの蛍光マーカー；リドカインなどの局部麻酔薬；ビダラビンなどの抗ウイルス剤；ビタミンＤ３などのビタミンＤの活性化体；ウルソール酸エステルなど（ウルソール酸ベンジル、ウルソール酸メチル、ウルソール酸ヘキシル、ウルソール酸ステアリル、ウルソール酸オレイルなど）の抗シワ剤或いは光老化防止剤：４−ｎ−ブチルレゾルシノール、プラセンターエキス、エラグ酸、アスコルビン酸およびその誘導体（アスコルビン酸グルコシドを含む）、トラネキサム酸、コウジ酸、アルブチンなどの美白成分；ならびにこれらの塩などが含まれる。皮膚外用剤の有効成分は、光老化防止剤、美白成分がより好ましい。
【００２９】
また、有効成分は微粒子に担持されていてもよい。例えば、必要に応じて抗体や酵素または抗がん剤などの蛋白質または薬剤を担持したラテックス小球などの固体微粒子が溶媒に分散された分散液を、リポソーム膜が形成する小胞の内部および／又は小胞脂質膜内に含むことができる。前記固体微粒子の平均粒径は、２０〜５０ｎｍであることが好ましい。
【００３０】
本発明のリポソームは、リポソーム膜が形成する小胞の内部および／又は小胞脂質膜内に、前記有効成分の唯一種を含むこともできるし、二種以上を組み合わせて含むこともできる。
【００３１】
前記有効成分を含む溶液または分散液の溶媒または分散媒としては、水性溶媒が好ましい。該水性溶媒としては、リン酸緩衝生理食塩水や、リンゲル氏液などが含まれる。その水性溶媒のｐＨは、有効成分が安定に存在できるｐＨであればよい。強酸性・強アルカリ性では脂質分子自体が変化してリポソーム形態を取れなくなる。好ましいｐＨは４〜１０
である。
前記有効成分を含む溶液または分散液における、有効成分の含有濃度は、１〜５０ｍＭであることが好ましい。
【００３２】
本発明のリポソームは、例えば薄膜法（１９６５）にしたがって製造することができる。薄膜法とは、例えばBangham, A.D., Standish, M.M. and Watkins, J.C. "Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids."(1965) J. Mol. Biol. 13,238-252に記載される方法である。
具体的には、以下の手順に従って製造することができるが、これらの記載により本発明のリポソームの製造方法が特に限定されるわけではない。
１） リポソーム膜を構成する成分（一般式（Ｉ）で示されるセラミドを含む）を有機溶媒に溶解又は懸濁させる。ここで有機溶媒は、脂質を溶解することができ、かつ沸点が低いことが好ましい。有機溶媒の具体例には、クロロホルム、メタノール、エタノール、アセトンなどが含まれる。
２） １）で得られた溶液または懸濁液から溶媒を除去することにより、リポソーム構成成分の薄膜を形成させる。溶媒の除去は減圧下で行うことが好ましい。
３） ２）で得られた薄膜に水性溶媒（好ましくは緩衝液）を添加して攪拌することにより、水性溶媒中に懸濁されたリポソームを得ることができる。
【００３３】
また、有効成分を含む本発明のリポソームを得るには、１）で得られた溶液または懸濁液に、有効成分および／又はその塩を含む溶液または分散液を添加して、上記２）および３）に従う。ここで溶液の溶媒は、脂質を溶解することができ、かつ沸点が低いことが好ましい。この溶媒の例には、メタノール、クロロホルム、エタノール、アセトンなどが含まれる。
【００３４】
上記で得られたリポソームを含む水性溶媒(懸濁液)を、さらにフィルターに通すことにより、リポソームの粒径を揃えることができる。リポソームの粒径は１００〜５００ｎｍに揃えられることが好ましく、１５０〜３００ｎｍに揃えられることが特に好ましい。
またリポソームを含む水溶性溶媒を超遠心処理することにより、沈殿物としてリポソームを分離することができる。分離されたリポソームは必要に応じて洗浄されることもできる。
【００３５】
＜本発明の処置用組成物＞
本発明の処置用組成物は、前述した本発明のリポソームを含むことを特徴とする。
本発明の処置用組成物としては、本発明のリポソームの効果が奏されれば特に制限はなく、皮膚外用剤、経口剤、注射剤などが含まれる。本発明の処置用組成物は、好ましくは皮膚外用剤である。
【００３６】
本発明の処置用組成物におけるリポソームの含有量は、処置用組成物全質量に対して、０．１〜１０質量％であることが好ましく、０．５〜５質量％であることがより好ましい。本発明の処置用組成物においてリポソームは、懸濁もしくは分散されていてもよく、または溶解されていてもよいが、好ましくは分散されている。
また、本発明の処置用組成物における有効成分および／又はその塩の含有量は、処置用組成物全質量に対して０．０１〜５質量％であることが好ましく、０．１〜１質量％であることがより好ましい。
【００３７】
前述の通り本発明の処置用組成物は必須成分である本発明のリポソーム以外に、通常処置用組成物で使用される任意成分を含有することができる。任意成分の例には、オイルもしくはワックス、炭化水素類、高級脂肪酸類、アルコール類、油剤、界面活性剤、多価ア
ルコール類、保湿成分、増粘剤、防腐剤、粉体類、無機顔料類、パール剤、有機色素、紫外線吸収剤、ビタミン類、ｐＨ調整剤などが含まれる。
【００３８】
オイルもしくはワックスの例には、マカデミアナッツ油、アボガド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等が含まれる。
炭化水素類の例には、流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等が含まれる。
高級脂肪酸類の例には、オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等が含まれる。
【００３９】
アルコール類の例には、エタノール、イソプロパノールセチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、オクチルドデカノール、ミリスチルアルコール、セトステアリルアルコール等が含まれる。
油剤の例には、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン、アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等のシリコーン油等が含まれる。
【００４０】
界面活性剤は、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤のいずれでもよい。
アニオン界面活性剤の例には、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等が含まれる。
カチオン界面活性剤の例には、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等が含まれる。
両性界面活性剤の例には、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等が含まれる。
非イオン界面活性剤の例には、イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット等の脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）ソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニ
ルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等が含まれる。
【００４１】
多価アルコール類の例には、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２−メチル２，４−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール等が含まれる。
【００４２】
保湿成分の例には、ポリメタクリロイルオキシエトキシホスホリルコリン、ポリグリコシルエトキシメタクリレート、ポリグルコシルエトキシメタクリレート、ポリメタクリロイルリジン等の、ポリアクリル酸またはポリメタクリル酸を基体とし、側鎖に親水性基を導入したポリマーまたはコポリマー、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等が含まれる。
【００４３】
増粘剤の例には、グアガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、アラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、キサンタンガム、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、トラガントガム、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ムコイチン硫酸、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラン、ケラト硫酸、ローカストビーンガム、サクシノグルカン、カロニン酸、キチン、キトサン、カルボキシメチルキチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ベントナイト等が含まれる。
【００４４】
粉体類は、無機粉体でも有機粉体でもよい。
無機粉体の例には、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等が含まれる。粉体類は表面を処理されていてもよい。
有機粉体の例には、ポリエチレン粉末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等が含まれる。
【００４５】
無機顔料類の例には、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛等が含まれる。無機顔料類は、表面処理されていてもよい。
パール剤の例には、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等が含まれる。パール剤は、表面処理されていてもよい。
有機色素類の例には、赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等が含まれる。有機色素類は、レーキ化されていてもよい。
【００４６】
防腐剤の例には、フェノキシエタノールなどが含まれる。
紫外線吸収剤の例には、パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、桂皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４’−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等が含まれる。
【００４７】
ビタミン類の例には、ビタミンＡまたはその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩、ビタミンＢ６トリパルミテート、ビタミンＢ６ジオクタノエート、ビタミンＢ２またはその誘導体、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１５またはその誘導体などのビタミンＢ類、α−トコフェロール，β−トコフェロール，γ−トコフェロール等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノンなどが含まれる。
ｐＨ調整剤の例には、リン酸およびその塩（ナトリウム塩など）が含まれる。
【００４８】
本発明の処置用組成物の剤型は特に制限されないが、ローション剤型、クリーム剤型、ハイドロゲル剤型、貼布剤型等の皮膚外用剤形、或いはリポソーム分散経口投与医薬などの経口投与医薬剤形、リポソーム分散注射薬などの注射薬剤形などが例示される。特に好ましいものは、皮膚外用剤形である。
【００４９】
本発明の処置用組成物は剤型に応じて、前述のリポソームと任意成分とを常法に従って処理することにより製造することができる。
本発明の処置用組成物の製造において用いられるリポソームは、溶液または懸濁液に含まれた状態で配合されてもよく、あるいは必要に応じて溶媒から分離された状態または洗浄された単離された状態で配合されてもよい。
【００５０】
本発明の処置用組成物が皮膚投与（例えば経皮投与）されると、それに含まれるリポソームは標的臓器（例えば皮膚の表皮・真皮）に選択的に到達することができる。これは、リポソームが角層間脂質への高い融合能を有するためであると推察される。
また、有効成分を含む本発明のリポソームを用いることにより、標的臓器に該有効成分の作用を効果的に奏させることができる。
【実施例】
【００５１】
以下に、実施例を挙げて、本発明について、更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。
【００５２】
＜実施例１＞
［リポソームの作製（１）］
リポソームをＢａｎｇｈａｍらの報告した薄膜法（１９６５）に従って作製した。
以下の表１に示される脂質１５ｍｇを、ナスフラスコ内のクロロホルム（１５ｍｌ）に加えて懸濁した。エバポレーターにて溶媒を減圧除去して、フラスコの内壁に薄膜を形成した。薄膜が形成されたフラスコ中にカルセインＮａ １０ｍＭ／ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩）を６ｍｌ添加した。ウォーターバスにて６０℃に温めながらボルテックスにかけて、フラスコの内壁から膜を剥離し、リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液を、エクストルーダーに装着された２００ｎｍのメンブレンフィルターに１０回通し、リポソーム液に含まれるリポソームの粒径を約２００ｎｍに揃えた。
さらに、得られたリポソーム液をＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ７５を装填したカラムに通し、リポソームに内封されていないカルセインＮａを除去した。このリポソーム液を、超遠心処理（２６７０００ｇ， ６０ｍｉｎ）して生じた沈殿物を回収した。回収された沈殿物を、約１．５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁した。（以下、単に懸濁液という場合がある。）
得られた懸濁液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）により希釈し、カルセインＮａ濃度を１００μＭとした。カルセインＮａ濃度は蛍光測定機により測定した。得られたリポソーム液をリポソーム液１と称する。
【００５３】
【表１】
【００５４】
【化４】
【００５５】
＜実施例２＞
実施例１における脂質組成物を、以下の表２に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例１と同様にしてリポソーム液２を得た。
【００５６】
【表２】
【００５７】
【化５】
【００５８】
＜実施例３＞
実施例１における脂質組成物を、以下の表３に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例１と同様にしてリポソーム液３を得た。
【００５９】
【表３】
【００６０】
＜実施例４＞
実施例１における脂質組成物を、以下の表４に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例１と同様にしてリポソーム液４を得た。
【００６１】
【表４】
【００６２】
＜比較例１＞
実施例１における脂質組成物を、以下の表５に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例１と同様にしてリポソーム液５を得た。リポソーム液５はＳＣＬＬ（Stratum corneum lipid liposome）と称されることがある。
【００６３】
【表５】
【００６４】
【化６】
【００６５】
＜比較例２＞
実施例１における脂質組成物を、以下の表６に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例１と同様にしてリポソーム液６を得た。
【００６６】
【表６】
【００６７】
＜比較例３＞
リポソーム液１,２,３,４,５,６と同濃度１００μＭのカルセインＮａ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（比較溶液１）を調製した。
【００６８】
［in vitro 皮膚透過試験（１）］
実施例１,２,３,４、比較例１,２および３で得られたリポソーム液１,２,３,４,５,６、および比較溶液１について、以下の手順でin vitro皮膚透過試験を行った。リポソーム液１,２,３,４,５,６、および比較溶液１それぞれについて、３つの皮膚透過試験用拡散セルを用いて試験を行った。
【００６９】
ヘアレス・ラット（Ｈａｉｒｌｅｓｓ ｒａｔ ７週齢オス）から採取した背部皮膚の裏面の脂肪組織を除去した。脂肪組織が除去された皮膚を、直径１．５ｃｍのパンチにて丸くくり抜いた。くり抜かれた皮膚を、皮膚外面側を上にして皮膚透過試験用Ｆｒａｎｔｚセルにセットした。
Ｆｒａｎｔｚセルのレシーバー（皮膚内面側）にＰＢＳ（ｐＨ７．４）を満たし（４．５ｍｌ）、レシーバー内のＰＢＳをスティアラーにて攪拌しながら３２℃に保持した。（このラットから皮膚を採取し、セルにセットし、レシーバーにＰＢＳを保持する工程を準備工程とする。）
【００７０】
その後、セルのドナー（皮膚外面側）にリポソーム液１,２,３,４,５,６、および比較溶液１（各４００μｌ）をそれぞれ入れた。
２４時間後にＦｒａｎｔｚセルのレシーバー溶液を２００μｌ採取した。採取したレシーバー溶液の蛍光強度を測定し、レシーバー溶液内に含まれるカルセインＮａ量を求め、アプライしたカルセインＮａ量に対する重量％を計算した。
また、Ｆｒａｎｔｚセルから皮膚を回収した。回収した皮膚をビーカー内のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸して、３０回揺らして皮膚表面に付着しているカルセインＮａを除去した。皮膚のうちドナー溶液が接していた部分（直径１．５ｃｍ）のみを鋏で丸く切り出し、切り出された皮膚を細かく切断した。切断された皮膚をバイアル瓶中のメタノール５ｍｌに浸した。各バイアル瓶に対しバス型超音波を６０分間照射後、バイアルビン中の溶液２００μｌを採取した。採取した溶液の蛍光強度を測定し、皮膚内に含まれるカルセインＮａ量を求め、アプライしたカルセインＮａ量に対する重量％を計算した。
（この２４時間後のレシーバー溶液内に含まれるカルセインＮａ量の測定および算出、ならびに皮膚内に含まれるカルセインＮａ量の測定および算出する工程を算出工程とする。）
【００７１】
算出された結果を図１および２に示す。図１は皮膚内カルセインNa量、図２はレシーバー内カルセインNa量を示す。図１に示されたように、リポソーム液１,２,３,４（一般式（Ｉ’）のセラミドまたは一般式（Ｉ’’）のセラミドを含むリポソーム）が、選択的に皮膚内に到達していることが明確に分かる。また、図１，２よりリポソーム液１,２,３,４（一般式（Ｉ’）のセラミドまたは一般式（Ｉ’’）のセラミドを含むリポソーム）は比較例（リポソーム液５，６および比較溶液１）に比べて皮膚を透過せず、選択的に皮膚内に取り込まれていることがわかる。カルセインナトリウムは蛍光を有し、本発明のリポ
ソームによれば、該蛍光により、リポソームが皮膚内に到達し、内包成分を放出したことを知るトレーサーとしての有効性が判る。
【００７２】
＜実施例５＞
［リポソームの作製（２）］
リポソームをＢａｎｇｈａｍらの報告した薄膜法（１９６５）に従って作製した。
以下の表７に示される脂質１５ｍｇを、ナスフラスコ内のクロロホルム（１５ｍｌ）に加えて懸濁した。エバポレーターにて溶媒を減圧除去して、フラスコの内壁に薄膜を形成した。薄膜が形成されたフラスコ中にＦＩＴＣデキストラン（分子量４０００）４０ｍＭ／ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を１．５ｍｌ添加した。ウォーターバスにて６０℃に温めながらボルテックスにかけて、フラスコの内壁から膜を剥離し、リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液を、エクストルーダーに装着された２００ｎｍのメンブレンフィルターに１０回通し、リポソーム液に含まれるリポソームの粒径を約２００ｎｍに揃えた。
さらに、得られたリポソーム液をＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ７５を装填したカラムに通し、リポソームに内封されていないＦＩＴＣデキストランを除去した。このリポソーム液を、超遠心処理（２６７０００ｇ， ６０ｍｉｎ）して生じた沈殿物を回収した。回収された沈殿物を、約１．５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁した。（以下、単に懸濁液という場合がある。）
得られた懸濁液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）により希釈し、ＦＩＴＣデキストラン濃度を３００ｎＭとした。ＦＩＴＣデキストラン濃度は蛍光測定機により測定した。得られたリポソーム液をリポソーム液７と称する。
【００７３】
【表７】
【００７４】
＜比較例４＞
実施例５における脂質組成物を、以下の表８に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例５と同様にしてリポソーム液８を得た。
【００７５】
【表８】
【００７６】
＜比較例５＞
リポソーム液７,８および同濃度３００ｎＭのＦＩＴＣデキストラン／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（比較溶液２）を調製した。
【００７７】
［in vitro 皮膚透過試験（２）］
実施例５、比較例４および比較例５で得られたリポソーム液７，８および比較溶液２について、以下の手順でin vitro皮膚透過試験を行った。リポソーム液７，８および比較溶液２それぞれについて、３つの皮膚透過試験用拡散セルを用いて試験を行った。
【００７８】
実施例１と同様の準備工程後、セルのドナー（皮膚外面側）にリポソーム液７，８および比較溶液２（各４００μｌ）をそれぞれ入れた。
２４時間後にＦｒａｎｔｚセルから皮膚を回収した。回収した皮膚をビーカー内のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸して、３０回揺らして皮膚表面に付着しているＦＩＴＣデキストランを除去した。皮膚のうちドナー溶液が接していた部分（直径１．５ｃｍ）のみを鋏で丸く切り出し、切り出された皮膚を細かく切断した。切断された皮膚をバイアル瓶中のTriton0.08%／ＰＢＳ５ｍｌに浸した。各バイアル瓶に対しバス型超音波を６０分間照射後、バイアルビン中の溶液２００μｌを採取した。採取した溶液の蛍光強度を測定し、皮膚内に含まれるＦＩＴＣデキストラン量を求め、アプライしたＦＩＴＣデキストラン量に対する重量％を計算した。
【００７９】
算出された結果を図３に示す。図３は皮膚内ＦＩＴＣデキストラン（ＦＤ４）量を示す。図３に示されたように、リポソーム液７（一般式（Ｉ’）のセラミドを含むリポソーム）が、選択的に皮膚内に到達していることが明確に分かる。
【００８０】
＜実施例６＞
［リポソームの作製（３）］
リポソームをＢａｎｇｈａｍらの報告した薄膜法（１９６５）に従って作製した。
以下の表９に示される脂質１５ｍｇを、ナスフラスコ内のクロロホルム（１５ｍｌ）に加えて懸濁した。メタノール（１ｍｌ）に溶解したビタミンＤ３ ３ｍｇを添加した。エバポレーターにて溶媒を減圧除去して、フラスコの内壁に薄膜を形成した。薄膜が形成されたフラスコ中にＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を６ｍｌ添加した。ウォーターバスにて６０℃に温めながらボルテックスにかけて、フラスコの内壁から膜を剥離し、リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液を、エクストルーダーに装着された２００ｎｍのメンブレンフィルターに１０回通し、リポソーム液に含まれるリポソームの粒径を約２００ｎｍに揃えた。
さらにリポソーム液を、超遠心処理（２６７０００ｇ， ６０ｍｉｎ）して生じた沈殿物を回収した。回収された沈殿物を、約１．５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁した。（以下、単に懸濁液という場合がある。）
得られた懸濁液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）により希釈し、ビタミンＤ３濃度を０．０６重量％とした。ビタミンＤ３濃度はＨＰＬＣにより測定した。得られたリポソーム液をリポソーム液９と称する。
【００８１】
【表９】
【００８２】
＜比較例６＞
実施例６における脂質組成物を、以下の表１０に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例６と同様にしてリポソーム液１０を得た。
【００８３】
【表１０】
【００８４】
＜比較例７＞
リポソーム液９,１０と同濃度０．０６重量％のビタミンＤ３／白色ワセリン（比較ワセリン）を調製した。
【００８５】
［in vitro 皮膚透過試験（３）］
実施例６、比較例６および比較例７で得られたリポソーム液９,１０および比較ワセリンについて、以下の手順でin vitro皮膚透過試験を行った。リポソーム液９,１０および比較ワセリンそれぞれについて、３つの皮膚透過試験用拡散セルを用いて試験を行った。
【００８６】
実施例１と同様の準備工程後、セルのドナー（皮膚外面側）にリポソーム液９,１０および比較ワセリン（各４００μｌ）をそれぞれ入れた。
２４時間後にＦｒａｎｔｚセルから皮膚を回収した。回収した皮膚をビーカー内のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸して、３０回揺らして皮膚表面に付着しているビタミンＤ３を除去した。皮膚のうちドナー溶液が接していた部分（直径１．５ｃｍ）のみを鋏で丸く切り出し、切り出された皮膚を細かく切断した。切断された皮膚をバイアル瓶中のメタノール５ｍｌに浸した。各バイアル瓶に対しバス型超音波を６０分間照射後、バイアルビン中の溶液２００μｌを採取した。採取した溶液のＨＰＬＣを測定し、皮膚内に含まれるビタミンＤ３量を求め、アプライしたビタミンＤ３量に対する重量％を計算した。
【００８７】
算出された結果を図４に示す。図４は皮膚内ビタミンＤ３（ＶｉｔＤ３）量を示す。図４に示されたように、リポソーム液９（一般式（Ｉ’）のセラミドを含むリポソーム）が、選択的に皮膚内に到達していることが明確に分かる。
【００８８】
＜実施例７＞
［リポソームの作製（４）］
リポソームをＢａｎｇｈａｍらの報告した薄膜法（１９６５）に従って作製した。
以下の表１１に示される脂質１５０ｍｇを、ナスフラスコ内のクロロホルム（４０ｍｌ）に加えて懸濁した。さらにビダラビン ３０ｍｇを添加した。エバポレーターにて溶媒を減圧除去して、フラスコの内壁に薄膜を形成した。薄膜が形成されたフラスコ中にＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を６ｍｌ添加した。ウォーターバスにて６０℃に温めながらボルテックスにかけて、フラスコの内壁から膜を剥離し、リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液を、エクストルーダーに装着された２００ｎｍのメンブレンフィルターに５回通し、リポソーム液に含まれるリポソームの粒径を約２００ｎｍに揃えた。
さらにリポソーム液を、超遠心処理（２６７０００ｇ， ６０ｍｉｎ）して生じた沈殿物を回収した。回収された沈殿物を、約１．５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁した。（以下、単に懸濁液という場合がある。）
得られた懸濁液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）により希釈し、ビダラビン濃度を０．６７５重量％とした。ビダラビン濃度はＨＰＬＣにより測定した。得られたリポソーム液をリポソーム液１１と称する。
【００８９】
【表１１】
【００９０】
＜比較例８＞
実施例７における脂質組成物を、以下の表１２に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例７と同様にしてリポソーム液１２を得た。
【００９１】
【表１２】
【００９２】
＜比較例９＞
実施例７における脂質組成物を、以下の表１３に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例７と同様にしてリポソーム液１３を得た。
【００９３】
【表１３】
【００９４】
＜比較例１０＞
リポソーム液１１，１２，１３と同濃度０．６７５重量％のビダラビン（市販クリーム剤型）（比較クリーム）を調製した。
【００９５】
［in vitro 皮膚透過試験（４）］
実施例７、比較例８,９，１０で得られたリポソーム液１１，１２，１３および比較クリームについて、以下の手順でin vitro皮膚透過試験を行った。リポソーム液１１，１２，１３および比較クリームそれぞれについて、３つの皮膚透過試験用拡散セルを用いて試験を行った。
【００９６】
実施例１と同様の準備工程後、セルのドナー（皮膚外面側）にリポソーム液１１，１２、１３および比較クリーム（各４００μｌ）をそれぞれ入れた。
２４時間後にＦｒａｎｔｚセルから皮膚を回収した。回収した皮膚をビーカー内のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸して、３０回揺らして皮膚表面に付着しているビダラビンを除去し
た。皮膚のうちドナー溶液が接していた部分（直径１．５ｃｍ）のみを鋏で丸く切り出し、切り出された皮膚を細かく切断した。切断された皮膚をバイアル瓶中のメタノール５ｍｌに浸した。各バイアル瓶に対しバス型超音波を６０分間照射後、バイアルビン中の溶液２００μｌを採取した。採取した溶液のＨＰＬＣを測定し、皮膚内に含まれるビダラビン量を求め、アプライしたビダラビン量に対する重量％を計算した。
【００９７】
算出された結果を図５に示す。図５は皮膚内ビタミンＤ３量を示す。図５に示されたように、リポソーム液１１（一般式（Ｉ’）のセラミドを含むリポソーム）が、選択的に皮膚内に到達していることが明確に分かる。
【００９８】
＜実施例８＞
［リポソームの作製（５）］
リポソームをＢａｎｇｈａｍらの報告した薄膜法（１９６５）に従って作製した。
以下の表１４に示される脂質１５ｍｇを、ナスフラスコ内のクロロホルム（１５ｍｌ）に加えて懸濁した。さらにリドカイン３ｍｇを添加した。エバポレーターにて溶媒を減圧除去して、フラスコの内壁に薄膜を形成した。薄膜が形成されたフラスコ中にＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を６ｍｌ添加した。ウォーターバスにて６０℃に温めながらボルテックスにかけて、フラスコの内壁から膜を剥離し、リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液を、エクストルーダーに装着された２００ｎｍのメンブレンフィルターに１０回通し、リポソーム液に含まれるリポソームの粒径を約２００ｎｍに揃えた。
さらにリポソーム液を、超遠心処理（２６７０００ｇ， ６０ｍｉｎ）して生じた沈殿物を回収した。回収された沈殿物を、約１．５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁した。（以下、単に懸濁液という場合がある。）
得られた懸濁液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）により希釈し、リドカイン濃度を０．２重量％とした。リドカイン濃度はＨＰＬＣにより測定した。得られたリポソーム液をリポソーム液１４と称する。
【００９９】
【表１４】
【０１００】
＜比較例１１＞
実施例８における脂質組成物を、以下の表１５に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例８と同様にしてリポソーム液１５を得た。
【０１０１】
【表１５】
【０１０２】
［in vitro 皮膚透過試験（５）］
実施例８および比較例１１で得られたリポソーム液１４および１５について、以下の手順でin vitro皮膚透過試験を行った。リポソーム液１４および１５それぞれについて、３つの皮膚透過試験用拡散セルを用いて試験を行った。
【０１０３】
実施例１と同様の準備工程後、セルのドナー（皮膚外面側）にリポソーム液１４および１５（各４００μｌ）をそれぞれ入れた。
２４時間後にＦｒａｎｔｚセルから皮膚を回収した。回収した皮膚をビーカー内のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸して、３０回揺らして皮膚表面に付着しているリドカインを除去した。皮膚のうちドナー溶液が接していた部分（直径１．５ｃｍ）のみを鋏で丸く切り出し、切り出された皮膚を細かく切断した。切断された皮膚をバイアル瓶中のメタノール５ｍｌに浸した。各バイアル瓶に対しバス型超音波を６０分間照射後、バイアルビン中の溶液２００μｌを採取した。採取した溶液のＨＰＬＣを測定し、皮膚内に含まれるリドカイン量を求め、アプライしたリドカイン量に対する重量％を計算した。
【０１０４】
算出された結果を図６に示す。図６は皮膚内リドカイン量を示す。図６に示されたように、リポソーム液１４（一般式（Ｉ’）のセラミドを含むリポソーム）が、選択的に皮膚内に到達していることが明確に分かる。
【０１０５】
＜実施例９＞
［リポソームの作製（６）］
リポソームをＢａｎｇｈａｍらの報告した薄膜法（１９６５）に従って作製した。
以下の表１６に示される脂質１５ｍｇを、ナスフラスコ内のクロロホルム（１５ｍｌ）に加えて懸濁した。さらにウルソール酸ベンジル ３ｍｇを添加した。エバポレーターにて溶媒を減圧除去して、フラスコの内壁に薄膜を形成した。薄膜が形成されたフラスコ中にＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を６ｍｌ添加した。ウォーターバスにて６０℃に温めながらボルテックスにかけて、フラスコの内壁から膜を剥離し、リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液を、エクストルーダーに装着された２００ｎｍのメンブレンフィルターに１０回通し、リポソーム液に含まれるリポソームの粒径を約２００ｎｍに揃えた。
さらにリポソーム液を、超遠心処理（２６７０００ｇ， ６０ｍｉｎ）して生じた沈殿物を回収した。回収された沈殿物を、約１．５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁した。（以下、単に懸濁液という場合がある。）
得られた懸濁液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）により希釈し、ウルソール酸ベンジル濃度を０．２重量％とした。ウルソール酸ベンジル濃度はＨＰＬＣにより測定した。得られたリポソーム液をリポソーム液１６と称する。
【０１０６】
【表１６】
【０１０７】
＜比較例１２＞
実施例９における脂質組成物を、以下の表１７に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例９と同様にしてリポソーム液１７を得た。
【０１０８】
【表１７】
【０１０９】
［in vitro 皮膚透過試験（６）］
実施例９および比較例１２で得られたリポソーム液１６および１７について、以下の手順でin vitro皮膚透過試験を行った。リポソーム液１６および１７それぞれについて、３つの皮膚透過試験用拡散セルを用いて試験を行った。
【０１１０】
実施例１と同様の準備工程後、セルのドナー（皮膚外面側）にリポソーム液１６および１７（各４００μｌ）をそれぞれ入れた。
２４時間後にＦｒａｎｔｚセルから皮膚を回収した。回収した皮膚をビーカー内のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸して、３０回揺らして皮膚表面に付着しているリドカインを除去した。皮膚のうちドナー溶液が接していた部分（直径１．５ｃｍ）のみを鋏で丸く切り出し、切り出された皮膚を細かく切断した。切断された皮膚をバイアル瓶中のメタノール５ｍｌに浸した。各バイアル瓶に対しバス型超音波を６０分間照射後、バイアルビン中の溶液２００μｌを採取した。採取した溶液のＨＰＬＣを測定し、皮膚内に含まれるウルソール酸ベンジル量を求め、アプライしたウルソール酸ベンジル量に対する重量％を計算した。
【０１１１】
算出された結果を図７に示す。図７は皮膚内ウルソール酸ベンジル（ＵＡＢ）量を示す。図７に示されたように、リポソーム液１６（一般式（Ｉ’）のセラミドを含むリポソーム）が、選択的に皮膚内に到達していることが明確に分かる。
【０１１２】
＜実施例１０＞
［リポソームの作製（７）］
リポソームをＢａｎｇｈａｍらの報告した薄膜法（１９６５）に従って作製した。
以下の表１８に示される脂質１５ｍｇを、ナスフラスコ内のクロロホルム（１５ｍｌ）に加えて懸濁した。エバポレーターにて溶媒を減圧除去して、フラスコの内壁に薄膜を形成した。薄膜が形成されたフラスコ中に、蛍光ラテックスビーズ懸濁水溶液（ポリサイエンス社製、カルボキシル基修飾、粒子径50nm）６ｍｌを添加した。ウォーターバスにて６０℃に温めながらボルテックスにかけて、フラスコの内壁から膜を剥離し、リポソーム液を得た。得られたリポソーム液を液体窒素中で冷却し、６０℃のお湯にて融解する作業を５回以上実施した。本作業によってリポソームへのラテックスビーズ溶液の内包効率が上がる。ショ糖密度勾配遠心処理（２６７０００ｇ， ３０ｍｉｎ）にて、リポソーム画分を得た。
さらに得られたリポソーム画分を蒸留水で希釈し、超遠心処理（２６７０００ｇ， ６０ｍｉｎ）して生じた沈殿物を回収した。回収された沈殿物を、約１．５ｍｌの蒸留水に懸濁した。（以下、単に懸濁液という場合がある。）
得られた懸濁液の蛍光強度を蛍光測定機により測定し、適宜蒸留水にて希釈した。得られたリポソーム液をリポソーム液１８と称する。
【０１１３】
【表１８】
【０１１４】
＜比較例１３＞
実施例１０における脂質組成物を、以下の表１９に示される脂質組成物に変更すること以外は、実施例１０と同様にしてリポソーム液１９を得た。蒸留水を用いて希釈し、リポソーム液１８と蛍光強度が等しくなるように揃えた。
【０１１５】
【表１９】
【０１１６】
＜比較例１４＞
蛍光ラテックスビーズ水溶液（比較溶液３）を調製した。蒸留水を用いて希釈し、リポソーム液１８およびリポソーム液１９と蛍光強度が等しくなるように揃えた。
【０１１７】
［in vitro 皮膚透過試験（７）］
実施例１０および比較例１３,１４で得られたリポソーム液１８および１９、比較溶液３について、以下の手順でin vitro皮膚透過試験を行った。リポソーム液１８および１９、比較溶液３それぞれについて、３つの皮膚透過試験用拡散セルを用いて試験を行った。
【０１１８】
実施例１と同様の準備工程後、セルのドナー（皮膚外面側）にリポソーム液１８および１９、比較溶液３（各４００μｌ）をそれぞれ入れた。
２４時間後にＦｒａｎｔｚセルから皮膚を回収した。回収した皮膚をビーカー内のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸して、３０回揺らして皮膚表面に付着している蛍光ラテックスビーズを除去した。皮膚のうちドナー溶液が接していた部分（直径１．５ｃｍ）のみを鋏で丸く切り出し、切り出された皮膚を細かく切断した。切断された皮膚をバイアル瓶中のメタノール５ｍｌに浸した。各バイアル瓶に対しバス型超音波を６０分間照射後、バイアルビン中の溶液２００μｌを採取した。採取した溶液の蛍光強度を測定し、皮膚内に含まれる蛍光量を求め、アプライしたラテックスビーズ蛍光量に対する重量％を計算した。
【０１１９】
算出された結果を図８に示す。図８は皮膚内蛍光ラテックスビーズ量を示す。図８に示されたように、リポソーム液１８（一般式（Ｉ’）のセラミドを含むリポソーム）が、選択的に皮膚内に到達していることが明確に分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明は、標的臓器への到達率が高い皮膚外用剤に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】実施例１,２,３,４、比較例１,２および比較例３の皮膚内のカルセインＮａの量の比較を表す図である。
【図２】実施例１,２,３,４、比較例１,２および比較例３のレシーバー内のカルセインＮａの量の比較を表す図である。
【図３】実施例５、比較例４および比較例５の皮膚内のＦＩＴＣデキストランの量の比較を表す図である。
【図４】実施例６、比較例６および比較例７の皮膚内のビタミンＤ３量の比較を表す図である。
【図５】実施例７、比較例８,９および比較例１０の皮膚内のビダラビン量の比較を表す図である。
【図６】実施例８、比較例１１の皮膚内のビダラビン量の比較を表す図である。
【図７】実施例９、比較例１２の皮膚内のウルソール酸ベンジル量の比較を表す図である。
【図８】実施例１０、比較例１３および比較例１４の皮膚内の蛍光ラテックスビーズ量の比較を表す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（I）で示されるセラミドをリポソーム膜に含むことを特徴とする、リポソーム。
【化１】
（一般式（I）において、
Ｒ1は炭素数１〜８のアルキル基を表し、
Ｒ2は炭素数１１〜２１の水酸基を有しても良いアルキル基またはアルケニル基を表す。）
【請求項２】
前記一般式（I）において、
Ｒ1がメチル基またはヘプチル基を表し、Ｒ2がα−ペンタデセニル基を表すことを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記セラミドの含有量が、リポソーム膜の全質量に対して３０〜６０質量％であることを特徴とする、請求項１または２に記載のリポソーム。
【請求項４】
前記リポソーム膜が、コレステロール、脂肪酸、コレステロール硫酸、およびリン脂質、ならびにこれらの塩からなる群から選択される一種または二種以上をさらに含有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項５】
前記リポソーム膜が形成する小胞の内部および／又は小胞脂質膜中に、有効成分を含有する溶液または分散液が含まれていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項６】
前記有効成分は、カルセインおよびその塩、ＦＩＴＣ−デキストラン、リドカインおよびその塩、ビダラビン、ビタミンＤ３、ならびにウルソール酸エステルからなる群から選択される一種または二種以上であることを特徴とする、請求項５に記載のリポソーム。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のリポソームを含有する処置用組成物。
【請求項８】
皮膚外用剤であることを特徴とする、請求項７に記載の処置用組成物。
【請求項１】
下記一般式（I）で示されるセラミドをリポソーム膜に含むことを特徴とする、リポソーム。
【化１】
（一般式（I）において、
Ｒ1は炭素数１〜８のアルキル基を表し、
Ｒ2は炭素数１１〜２１の水酸基を有しても良いアルキル基またはアルケニル基を表す。）
【請求項２】
前記一般式（I）において、
Ｒ1がメチル基またはヘプチル基を表し、Ｒ2がα−ペンタデセニル基を表すことを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記セラミドの含有量が、リポソーム膜の全質量に対して３０〜６０質量％であることを特徴とする、請求項１または２に記載のリポソーム。
【請求項４】
前記リポソーム膜が、コレステロール、脂肪酸、コレステロール硫酸、およびリン脂質、ならびにこれらの塩からなる群から選択される一種または二種以上をさらに含有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項５】
前記リポソーム膜が形成する小胞の内部および／又は小胞脂質膜中に、有効成分を含有する溶液または分散液が含まれていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項６】
前記有効成分は、カルセインおよびその塩、ＦＩＴＣ−デキストラン、リドカインおよびその塩、ビダラビン、ビタミンＤ３、ならびにウルソール酸エステルからなる群から選択される一種または二種以上であることを特徴とする、請求項５に記載のリポソーム。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のリポソームを含有する処置用組成物。
【請求項８】
皮膚外用剤であることを特徴とする、請求項７に記載の処置用組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−３３５６５１（Ｐ２００６−３３５６５１Ａ）
【公開日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１５８８１８（Ｐ２００５−１５８８１８）
【出願日】平成１７年５月３１日（２００５．５．３１）
【出願人】（０００１１３４７０）ポーラ化成工業株式会社 (717)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月１４日（２００６．１２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月３１日（２００５．５．３１）
【出願人】（０００１１３４７０）ポーラ化成工業株式会社 (717)
【Ｆターム（参考）】
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