リポソーム
本発明によれば、リポソームの内腔に水溶性物質が封入され、リポソームの粒径が３００ｎｍ以下であるリポソームを容易に作製することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソームの内腔に水溶性物質が封入され、リポソームの粒径が３００ｎｍ以下であって、トリグリセロールを含有するリポソームに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、脂質２重膜の閉鎖小胞であり、リポソーム内腔の水層に水溶性物質を保持し、脂質膜中に脂溶性物質を保持することができる。また、数１０nm程度の小さい一枚膜リポソーム（SUV）、数１００nm程度の大きい一枚膜リポソーム（LUV）または多重層リポソーム（MLV）等種々の形態および粒径のリポソームを用途に応じて作製することができる。
【０００３】
リポソームは生体由来の生分解性脂質で構成されていることから、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）への応用が提唱されている。近年においては、リポソーム表面をポリエチレングリコールで修飾することにより生体内安定性を改善したリポソームの研究や、抗体等のリガンドを結合したリポソームの研究もなされている。
【０００４】
リポソームのＤＤＳへの実用化を考える場合には、内腔に封入する水溶性物質のリポソーム化効率（リポソームへの水溶性物質の封入率をいう。以下「封入率」と記載することがある）、リポソームの形態および粒径を考慮することが重要である。
【０００５】
高い封入率を得る方法としては、シュナイダーのダブルエマルジョンを介した方法（W/O/W法）が挙げられる（特許文献１）。具体的には、水と不混和性の有機溶媒に、リン脂質あるいはリン脂質とコレステロールを溶解し、これに薬剤水溶液を混和し、この混合液を乳化することでwater in oil（W/O）エマルジョンを形成させる（１次乳化）。さらに、このエマルジョンを水相に移すことでwater in oil in water（W/O/W）エマルジョンを形成させる（２次乳化）。このW/O/Wエマルジョンから有機溶媒を除去し、リポソームを形成する。この方法に従うとインシュリン、トリプシン、アクチノマイシンＤ、アラビノースシトシン等を５０〜８０％という高い封入率でリポソーム化することができると考えられている。
【０００６】
しかしながら、シスプラチンに代表されるような水溶性物質をW/O/W法に従って、リポソームの内腔に封入したところ内容物が漏れ出すという問題が生じた。
【０００７】
W/O/W法において使用できる脂質として、上記特許文献１には、レシチン、フォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン等のリン脂質、コレステロール等のステロールに加え、ステアリルアミン等リンを含有しない脂質、ポリエトキシレート化された脂肪酸アミド等に加え複合脂質、グリセライド、セライド、エストライドが列挙されている。
【０００８】
Ｋｉｍらは、グリセライドの一種であるトリオレインをリポソームの構成成分として用い、通常のリポソームに比べて、粒径の大きいリポソーム（非特許文献１）や、巨大なリポソームが多くの小区画に分かれたマルチコンパートメントリポソーム（非特許文献２）を得ている。
【０００９】
リポソームをＤＤＳに応用する場合においては、リポソームの粒径が機能に大きな影響を与えることが知られている。例えば癌組織の血管は、正常組織の血管と異なりサブミクロンサイズのポアを有しており（非特許文献３）、リポソームが癌組織に選択的に到達するためには、リポソームの粒径が、正常組織の血管のポアサイズよりも大きく、癌組織の血管のポアサイズよりも小さい必要がある。血管内に各種サイズのリポソームを投与して癌組織への到達性を比較した実験（非特許文献４）では粒径が２００ｎｍ以下のリポソームで良好な癌組織集積性を認めた。また、リポソーム等の経口吸収に関する研究においては、Janiら（非特許文献５）は、消化管粘膜から取り込まれる微粒子の割合は粒径に依存していることを示した。小さな粒子ほど消化管粘膜から吸収されやすく、リポソームの粒径が３００ｎｍ以下になると経口投与したリポソームが血液中にも観察された。
【００１０】
このように、リポソームをＤＤＳに応用する為には、その用途に合わせて粒径をコントロールすることが重要である。
【００１１】
しかしながら従来技術では、リポソームの粒径を３００ｎｍ以下にコントロールすることは困難であった。
【特許文献１】米国特許第４２２４１７９号明細書
【非特許文献１】Biochim Biophys Acta, 646,1 (1981)
【非特許文献２】Biochim Biophys Acta, 728,339 (1983)
【非特許文献３】Proc.Natl.Acac.Sci.USA 95 (1998) 4607-4612
【非特許文献４】Inter.J.Pharm. 190 (1999)49-56
【非特許文献５】J.Pharm.Pharmacol 42(1990)821-826, Inter.J.Pharm. 86 (1992)239-246
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、リポソームの内腔に水溶性物質が封入され、リポソームの粒径が３００ｎｍ以下であるリポソームを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願発明者らは、従来の問題点を解決する為に誠意検討した結果、驚くべきことに、リポソーム作製時に少量のトリグリセロールを加えることで粒径が３００ｎｍ以下であるリポソームを容易に作製できることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）水溶性物質を内腔に封入し、粒径が３００ｎｍ以下およびトリグリセロールを含有したリポソーム。
（２）水溶性物質を内腔に封入し、粒径が２００ｎｍ以下およびトリグリセロールを含有したリポソーム。
（３）水溶性化合物の内腔への封入率が６０％以上である上記１または２に記載のリポソーム。
（４）水溶性化合物の内腔への封入率が７０％以上である上記１または２に記載のリポソーム。
（５）水溶性物質が、水溶性低分子化合物、蛋白質、核酸類、多糖類および／または指示薬である上記１から４のいずれかに記載のリポソーム。
（６）水溶性物質が、水溶性低分子化合物および多糖類である上記１から４のいずれかに記載のリポソーム。
（７）水溶性物質が、水溶性低分子化合物である上記1から４のいずれかに記載のリポソーム。
（８）水溶性低分子化合物がネダプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビンまたはAra-Cである上記５から７のいずれかに記載のリポソーム。
（９）多糖類がキトサン誘導体またはカルボキシル基を有する多糖類である上記５または６に記載のリポソーム。
（１０）カルボキシル基を有する多糖類がカルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸である上記９に記載のリポソーム。
（１１）トリグリセロールがトリオレインである上記１から１０のいずれかに記載のリポソーム。
（１２）リガンドおよび／または水溶性合成高分子を有する上記１から１１のいずれかに記載のリポソーム。
（１３）リガンドを有する上記１から１１のいずれかに記載のリポソーム。
（１４）リガンドがターゲット細胞またはターゲット分子に結合するものである上記１２または１３に記載のリポソーム。
（１５）リガンドが抗体または抗体のフラグメントである上記１２から１４のいずれかに記載のリポソーム。
（１６）水溶性合成高分子が、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドン、ビニルピロリドンと無水マレイン酸との共重合体から選ばれる上記１２に記載のリポソーム。
（１７）水溶性合成高分子が、ポリアルキレングリコールである上記１２または１６に記載のリポソーム。
（１８）ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである上記１６または１７に記載のリポソーム。
（１９）リガンドおよび／または水溶性合成高分子がリポソームの外部表面のみに結合している上記１２から１８に記載のリポソーム。
（２０）上記１から１９のいずれかに記載のリポソームを含有する医薬組成物。
（２１）上記１から１９のいずれかに記載のリポソームを含有する癌の診断および／または治療剤。
【発明の効果】
【００１５】
上記のようにリポソームの形成脂質として少量のトリグリセロールを加えることによって、粒径が３００ｎｍ以下のリポソームを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、透過型電子顕微鏡（ネガティブ染色）で観察した、蛍光物質封入リポソームの形態を示す写真である。Ａ：トリオレイン含有リポソームを示す。Ｂ：トリオレイン不含有リポソームを示す。
【図２】図２は、リポソームの粒径および封入率に及ぼすトリオレイン量の影響を示す図である。Ａ：縦軸はリポソームの封入率、横軸はトリオレインの添加量を総脂質に対するmol%として示す。Ｂ：縦軸はリポソームの粒径、横軸はトリオレインの添加量を総脂質に対するmol%として示す。ここで、リポソームの粒径は、動的光散乱法により測定した平均粒径を示す。
【図３】図３は、蛍光物質を封入したリポソームと細胞の反応性をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す図である。図３中、１はリポソームを添加しない細胞の蛍光量のシフトを示す。図３中、２から５は、脂質量1.0 mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/mlからなる各リポソームと細胞を反応して得られた蛍光量のシフトを示す。Ａ：蛍光物質を封入したTAT結合リポソームとヒト肺癌細胞との反応性を測定した結果を示す。Ｂ：TATを結合していない蛍光物質を封入したリポソームとヒト肺癌細胞との反応性を測定した結果を示す。
【図４】図４はネダプラチン封入TAT結合PEGリポソーム（▲）およびネダプラチン封入PEGリポソーム（■）のヒト肺癌細胞に対する抗腫瘍効果を示す図である。横軸はネダプラチンの濃度を示す。縦軸は対照（薬剤濃度０）の細胞数を１００％とした生細胞率を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明における水溶性物質としては、水溶性低分子化合物、蛋白質、核酸類、多糖類または指示薬が挙げられる。水溶性低分子化合物としては、医薬品、診断薬が挙げられる。医薬品としては、ジクロフェナクナトリウム、ドブラマイシン等の抗炎症薬、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、レボフロキサシン、シプロフロキサシン等の抗菌薬、アシクロビル、３TC、AZT等の抗ウイルス薬、サララシン、テノーミン、塩酸アモスラロール等の降圧薬、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ゲムシタビン、Ara-C等の抗腫瘍薬が挙げられる。蛋白質としては、アルブミン、サイトカイン類、腫瘍抗原類または毒素類が挙げられる。サイトカイン類としてはTNF、インターフェロンまたはインターロイキン等が挙げられ、腫瘍抗原類としてはHer-2、CEAまたはAFP等が挙げられ、毒素類としてはジフテリアトキシンまたはリシンA鎖等が挙げられる。核酸としては、TNFなどのサイトカインをコードしたDNA類、ｐ53などの腫瘍抑制遺伝子類をコードしたDNA類、チミジンキナーゼなどの自殺遺伝子類をコードしたDNA類、アンチセンスRNAまたはRNAi（RNA interference）作用を有するRNA類等が挙げられる。
【００１８】
本発明における多糖類としては、キトサン誘導体またはカルボキシル基を有する多糖類等が挙げられる。カルボキシル基を有する多糖類としては、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸が挙げられ、好ましくはカルボキシメチルセルロースが挙げられる。
【００１９】
本発明における指示薬としては、蛍光色素や放射性元素が挙げられ、具体的にはインジウム、テクネシウムのイメ−ジング薬剤やホ−スラディシュパ−オキシダ−ゼ、アルカリフォスファタ−ゼ等の酵素、ガドリニュ−ムを含有するＭＲＩ造影剤、ヨ−ソを含有するＸ線造影剤、ＣＯ２等の超音波造影剤、ユ−ロピウム誘導体、カルボキシフルオレッセイン等の蛍光体またはＮ−メチルアクリジウム誘導体等の発光体が挙げられる。
【００２０】
また、水溶性低分子化合物、蛋白質、核酸類、多糖類または指示薬をそれぞれ単独でリポソームに封入しても良く、これらを組み合わせてリポソームに封入しても良い。例えば、水溶性低分子化合物および多糖類を組み合わせてリポソームに封入することが挙げられる。
【００２１】
本発明における粒径としては、リポソームの平均粒径が３００ｎｍ以下が挙げられ、好ましくは２００ｎｍ以下が挙げられる。
【００２２】
さらに、本発明におけるリポソームとしては、粒径が１μｍ以上のリポソームが５％以上混入しないもの、１μｍ以上のリポソームが１％以上混入しないもの、好ましくは１μｍ以上のリポソームが混入しないものが挙げられる。
【００２３】
または、粒径が３５０ｎｍ以上のリポソームが２０％以上混入しないもの、粒径が３５０ｎｍ以上のリポソームが１０％以上混入しないもの、より好ましくは粒径が３５０ｎｍ以上のリポソームが混入しないものが挙げられる。
【００２４】
さらに、粒径が２５０ｎｍ以上のリポソームが１０％以上混入しないもの、最も好ましくは粒径が２５０ｎｍ以上のリポソームが混入しないものが挙げられる。
【００２５】
リポソーム粒径の測定法としては、例えば、動的光散乱法が挙げられる（Liposome Technology, 2nd Edition Vol.1 Chapter 15 p254-269 (1993); CRC Press, Edited by Gregory Gregoriadis ）。
【００２６】
リポソームの粒径が著しく不均一である場合は、大粒径リポソームの混入が正確に反映されないため、動的光散乱法で測定するのは困難である。そのため、リポソームの粒径が著しく不均一である場合は、例えば、透過型電子顕微鏡を用いたネガティブ染色法(Biochimica et Biophysica Acta, 601(1980)559-571)、凍結電子顕微鏡撮影（Liposome Technology, 2nd Edition Vol.2 Chapter 14 p250-252 (1993); CRC Press, Edited by Gregory Gregoriadis）または原子間力顕微鏡（Thin solid films 273 (1996) 297-303）により観察することが好ましい。
【００２７】
本発明におけるリポソームの形態としては、例えば、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）、大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）、または多重層リポソーム（ＭＬＶ）等が挙げられ、好ましくはＳＵＶまたはＬＵＶが挙げられる。
【００２８】
本発明におけるトリグリセロールとしては、トリカプロイン（Tricaproin）、トリカプリリン（Tricaprylin）、トリカプリン（Tricaprin）、トリミリステイン（Trimyristin）、トリパルミチン（Tripalmitin）、トリリノレイン（Trilinolein）、トリオレイン（Triolein）が挙げられるが、好ましくはトリオレイン（Triolein）が挙げられる。トリグリセロールの添加量としては、総脂質の１〜１５mol%が挙げられ、好ましくは２〜７mol%であり、さらに好ましくは３〜６mol%である。
【００２９】
また、本発明におけるリポソームを形成し得る脂質としては、例えば、天然フォスファチジルコリン、合成フォスファチジルコリン、天然フォスファチジルエタノールアミン、合成フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジン酸等のリン脂質、スフィンゴ糖脂質またはグリセロ糖脂質等の糖脂質等が挙げられる。また、天然フォスファチジルコリンとしては、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）または大豆ホスファチジルコリンが挙げられ、合成フォスファチジルコリンとしては、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）またはジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）等が挙げられ、天然フォスファチジルエタノールアミンとしては、卵黄ホスファチジルエタノールアミン等が挙げられ、合成フォスファチジルエタノールアミンとしては、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン等が挙げられ、フォスファチジルグリセロールとしては、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール等が挙げられる。これらの脂質は単独または２種以上、あるいはこれらの脂質とコレステロール等の非極性物質と組み合わせて用いられることもある。また、リン脂質とコレステロールを組み合わせて用いる場合はそのモル比は２：１から１：１程度が好ましいが、比率はこれに限定されない。さらに、本発明におけるリポソームには、上記の脂質成分に加え、必要に応じて乳化剤を混合することができる。乳化剤としては、オクチルグルコシドまたはコール酸等が挙げられる。
【００３０】
また、本発明におけるリポソームの作製方法としては、本発明の目的が達成されるものであれば、いかなる既知の作製方法を用いても良いが、好ましくはエマルジョンを介した方法が挙げられる。具体的には、逆相蒸発法またはダブルエマルジョンを介した方法（Ｗ／Ｏ／Ｗ法）を用いることができる。例えば、Ｗ／Ｏ／Ｗ法においては、水と不混和性の有機溶媒に、リン脂質およびトリグリセロール、あるいはリン脂質とコレステロールおよびおよびトリグリセロールを溶解し、その後、薬剤水溶液と混合する。この混合液を乳化するとwater in oil（W/O）エマルジョンを形成し（１次乳化）、さらにこのW/Oエマルジョンを水相に移すことでwater in oil in water（W/O/W）エマルジョンが形成される（２次乳化）。さらに、２段階の乳化で得られたW/O/Wエマルジョンから有機溶媒を除去するとリポソームを形成することができる。
【００３１】
また、ダブルエマルジョンを作製しリポソーム化する別の方法としては、転相乳化法（J.Colloid Interface Sci., 94, 362 (1983)）が挙げられる。その他、１段階乳化法（特開昭５９−１９３９０１）により得られたダブルエマルジョンからリポソームを作製しても良い。好ましくは２段階乳化で得られたダブルエマルジョンからリポソームを作製する方法等が挙げられる。
【００３２】
ここで、２段階乳化のダブルエマルジョンからリポソームを作製する場合を例に挙げ、詳細に説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
【００３３】
２段階乳化のダブルエマルジョンからリポソームを作製する場合においては、まず、一次乳化に用いる有機溶媒に、リポソームを形成しうる脂質、必要に応じたリガンド結合用脂質および／または乳化剤を加えた有機溶媒相を調整した後に、封入すべき水溶性物質を含む水相を添加する。
【００３４】
一次乳化に用いる有機溶媒としては水と混和しない、または、混和しにくい有機溶媒を用いることができ、例えばクロロホルム、ヘキサン、エーテル類、ベンゼン、エステル類、フロン類、超臨界状態のＣＯ２、ジクロロメタン、四塩化炭素等が挙げられる。これらの有機溶媒は単独または組み合わせて用いることができる。有機溶媒を組み合わせる場合には、有機溶媒相の比重がリポソームに封入すべき水溶液の比重に近いように混合比を調整することが望ましい。
【００３５】
一次乳化の水相にリポソームに封入すべき物質を溶解する。この水相にはリン酸緩衝液のような緩衝液を用いることができる。また、緩衝液には必要に応じて塩化ナトリウムや低分子の糖（ショ糖、トレハロース、乳糖等）を加えて浸透圧および比重を調整したものを使用することができるが、１０％程度の二糖類を加えた緩衝液を用いることが好ましく、１０％程度のトレハロースを含有した中性の緩衝液を使用することがさらに好ましい。
【００３６】
有機溶媒相と水相を混合する際には、水相は有機溶媒相より少ないことが必要である。好ましくは有機溶媒１容に対して０．０１容から０．９容以下、より好ましくは０．０１容から０．５容以下、さらに好ましくは０．１容から０．４容、最も好ましくは０．２容から０．３容を用いる。
【００３７】
次に、これらの混合液を乳化しＷ／Ｏエマルジョンを作製する（一次乳化）。乳化はいかなる乳化技術を用いて行なっても良いが、例えば、超音波照射による乳化、激しい攪拌、ホモジナイザーあるいは高圧乳化装置を用いて行なうことができる。超音波照射はバス型のものやプローブ型あるいは連続型を用いることができる。また高圧乳化装置はナノマイザー（吉田機械興業）あるいはマイクロフルイダイザー（みずほ工業）の名称で市販されており、これらの装置を用いることができ、好ましくは超音波照射が挙げられ、より好ましくは高圧乳化装置が挙げられる。
【００３８】
一次乳化により得られるＷ／Ｏエマルジョンのサイズとしては、好ましくは１０ｎｍから１５０ｎｍであることが挙げられ、より好ましくは３０ｎｍから１００ｎｍであることが挙げられ、最も好ましくは４０ｎｍから８０ｎｍであることが挙げられる。
【００３９】
また、一次乳化においては、乳化する温度をリポソームを形成しうる脂質の相転移温度より高い温度で行なうことが望ましい。例えばリン脂質としてＤＰＰＣを用いる場合は４２℃以上で行なうことが望ましい。
【００４０】
次に、得られたＷ／Ｏエマルジョンを攪拌しながら第二の水相に添加することによってダブルエマルジョン（Ｗ／Ｏ／Ｗ）を形成する。
【００４１】
第二の水相としては、純水または緩衝液を用いることができる。緩衝液には必要に応じて塩化ナトリウムや低分子の糖（ショ糖、トレハロース、乳糖等）を加えて浸透圧および比重を調整したものを使用することができるが、１０％程度の二糖類を加えた緩衝液を用いることが好ましく、１０％程度のトレハロースを含有した中性の緩衝液を使用することがさらに好ましい。このとき、塩化ナトリウムや低分子の糖は、リポソームの内部水相および／または外部水相に存在してもよい。好ましくは、塩化ナトリウムや低分子の糖が、リポソームの内部水相および外部水相に存在していることが挙げられる。
【００４２】
得られたダブルエマルジョンをさらに攪拌しながら、有機溶媒を除去することでリポソームを形成する。
【００４３】
有機溶媒の除去は、ダブルエマルジョンに空気、窒素ガスやアルゴンガスのような不活性ガスを吹きつけることによって行なうことができるが、より好ましくは不活性ガスを吹きつけながら減圧することによって行なう。必要に応じて溶液の温度を４０℃〜６０℃にして行なうこともできる。このようにして得られたリポソーム溶液はそのまま、あるいは限外濾過膜やゲル濾過により精製して用いることができる。
【００４４】
本発明において水溶性物質の内腔への封入率としては、６０％以上であることが挙げられ、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、最も好ましくは８０％以上であることが挙げられる。
【００４５】
また、本発明においては、リガンドや水溶性合成高分子をリポソーム表面に結合させて使用することも可能である。
【００４６】
本発明のリガンドとしては、ターゲット細胞またはターゲット分子に結合するものが挙げられ、例えば、単糖、オリゴ糖、多糖などの糖類、ペプチド、各種抗体、線維芽細胞成長因子（FGF）、上皮細胞成長因子（EGF）等の成長因子または増殖因子等のタンパク質が挙げられるが、好ましくは抗体が挙げられる。本発明における抗体としては、抗体自体および抗体フラグメントのほか、誘導体化または修飾した抗体などを包含しており、最も広義に解釈しなければならない。
【００４７】
また、抗体としては各種動物のポリクロ−ナル抗体、マウスモノクロ−ナル抗体、ヒト−マウスキメラ抗体またはヒト型モノクロ−ナル抗体およびヒトモノクローナル抗体が挙げられるが、好ましくはヒトモノクロ−ナル抗体が挙げられる。さらに好ましくは癌反応性のヒトモノクロ−ナル抗体が挙げられる。
【００４８】
ここでターゲット細胞とは、リポソームを用いて封入した物質を送達させようとする細胞であり、例えば癌細胞、癌組織の血管内皮細胞、癌組織の間質細胞等が挙げられる。ターゲット分子とは、ターゲット細胞の細胞質内の分子、核内の分子、あるいは細胞表面の分子等いかなる分子でも良いが、好ましくは細胞表面の分子である。ターゲット分子の別の形態として、細胞から放出された分子が挙げられる。例えば、癌細胞や癌組織の間質細胞の分泌物や構築物であってもが挙げられ、具体的には腫瘍マーカーや細胞間の構造物等が挙げられる。
【００４９】
本発明における水溶性合成高分子としては、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドン、ビニルピロリドンと無水マレイン酸との共重合体が挙げられる。ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール等が挙げられ、好ましくはポリエチレングリコールが挙げられる。ここで、ポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量が２，０００〜７，０００ダルトン程度のものが挙げられ、好ましくは約５，０００ダルトン程度のものが挙げられる。
【００５０】
水溶性合成高分子は、リポソームの内部および／または外部のいずれに結合していてもよいが、好ましくはリポソームの外部のみに結合している場合が挙げられる。
【００５１】
リポソームにリガンドを結合する際には、公知あるいは今後考案されるいかなる方法を用いてリガンドを結合しても良い。
【００５２】
例えば、リポソームを形成しうる脂質として、マレイミド基やスクシンイミド基等の官能基を有する脂質と、他のリポソームを形成しうる脂質を用いてリポソームを作製した後、当該官能基と結合しうるチオール基やアミノ基等の反応性部分を有するリガンドを添加することにより、リガンド結合リポソームを作製することができる。リポソームを形成しうる脂質の官能基とリガンドの反応性部分の組み合わせとしては、リポソームとリガンドの結合を達成しうる如何なる組み合わせを用いても良く、限定されるものではないが、マレイミド基とチオール基、スクシンイミド基とアミノ基、アミノオキシ基またはヒドラジド基とアルデヒド基等の組み合わせを挙げることができる。好ましくはマレイミド基とチオール基の組み合わせが挙げられる。
【００５３】
限定されるものではないが、官能基を有する脂質としてε―マレイミドカプロイルジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンのようなマレイミド基を有する脂質によりリポソームを作製する場合は、反応性部分としてチオール基を有するリガンドを中性ｐH付近で反応させることで容易にリガンド結合リポソームを作製することができる。
【００５４】
ここで、リガンドに反応性部分としてチオール基を導入する方法としては、本発明の目的が達成されるものであればいかなる方法を用いてもよいが、本発明のリガンドがペプチドの場合はペプチド配列の一部にシステインを挿入する方法が挙げられる。
【００５５】
リガンドが抗体の場合は、抗体にイミノチオランを反応させチオール基を導入する方法、S-アセチルチオグリコール酸N-ヒドロキシスクシンイミドを反応させた後、ヒドロキシルアミンで処理することによりチオール基を導入する方法、抗体を酵素処理した後、還元することでFab’フラグメントを作製し、抗体の内在性チオール基を利用する方法等が挙げられる。
【００５６】
また、別の実施形態として、先にリガンドを結合させたリガンド結合脂質を合成し、これと他のリポソームを形成しうる脂質を用いてリポソームを作製することで、リガンド結合リポソームを作製する方法が挙げられる。
【００５７】
さらに別の形態として、リポソームとリガンドの間に水溶生合成高分子を結合させる方法が挙げられる。水溶性合成高分子のうちPEGを用いる場合は、FEBS letter ４１３（１９９７）１７７―１８０、Biochemistry３６（１９９７）６６―７５、Biochimica Et Biophysica Acta 1513（2001）207-216、欧州特許第0903152号明細書等に記載の方法に従い作製することができる。
【００５８】
本発明においては、リガンドを単独でリポソームに結合しても良く、リガンドおよび水溶性合成高分子の両方をリポソームに結合しても良く、あるいは水溶性合成高分子のみをリポソームに結合しても良いが、リガンドと水溶性合成高分子の両方を結合したリポソームが好ましい。
【００５９】
ここでリガンドおよび／または水溶性合成高分子をリポソームに結合させる方法や順番は特に限定されるものではないが、好ましくは欧州特許第0903152号明細書等に記載の方法に従うことが挙げられる。
【００６０】
リポソームに水溶性合成高分子を結合させる方法としては、水溶性合成高分子に脂質部分を導入した誘導体を作製し、これを他のリポソームを形成しうる脂質と共に用いてリポソームを作製する方法（FEBS letters 268（１９９０）235-237）、あるいは上述したチオール基やアミノ基等の反応性部分を導入した水溶性合成高分子を、リポソームと反応させる方法等を用いることができるが、好ましくは、反応性部分を導入した水溶性合成高分子をリポソームと反応させる方法が挙げられる。
【００６１】
例えばポリエチレングリコールを例に挙げて説明すると、欧州特許出願公開第５２６７００号明細書に記載のチオール基を有するＰＥＧを、ε―マレイミドカプロイルジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンを有するリポソームと結合することで容易にＰＥＧ化リポソームを作製することができる。
【００６２】
本発明で得られたリポソームは、例えば、欧州特許出願公開第５２６７００号明細書または欧州特許出願公開第５２０４９９号明細書に記載の方法により製剤化することができ、該複合体を、癌等の各種疾患の治療のために、血管内投与、膀胱投与、腹腔内投与、局所投与等の方法で患者に投与することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００６４】
実施例１
卵黄ホスファチジルコリン（EPC）およびコレステロールは、日本油脂社より入手した。トリオレイン（Triolein）および5 (6)-カルボキシフルオレセイン（５（６）
-Carboxyfluorescein）はシグマ社より購入した。
【００６５】
W/O emulsionの調製（１次乳化）
EPC 59.7 mg（81.4μmol）、コレステロール15.75 mg（40.7μmol）およびトリオレイン4.1μmolをジクロロメタンに溶解後、窒素気流下に乾燥し乾燥脂質混合物を調整した。
【００６６】
調製した脂質乾固物を、クロロホルム/ヘキサン (1:1、V/V)混液1mLに溶解した。この脂質溶液に5 (6)-
Carboxy fluorescein(CF)溶液（PBSに溶解した８ｍM CF２００μLに７０％シュクロース３３μLを加えたもの：シュクロースの終濃度１０％）２３３μLを添加した。これを55℃の湯浴で温めながら、ホモジナイザー（ポリトロン; KINEMATICA GmbH, PCU1, Ser nr 5239）を用いて、出力５で20分間予備乳化を行なった。次に、プローブ型ソニケーター(Branson Sonifier 450)を用いてPower= 1; cycle= 50 %で３０分間超音波照射することで１次乳化を行なった。
【００６７】
W/O/W emulsionの調製（２次乳化）
バイアルビンに、分散相となるリン酸緩衝シュクロース水溶液（９ｍＭ リン酸、0.13Ｍ ＮａＣｌ、１０％ショ糖溶液（ｐＨ７．４））を入れて55℃に合わせ、撹拌しながら、一次乳化サンプルを10分間かけて滴下した。W/O emulsionが分散相の中に全部出たところで、窒素を15mL/minでふきつけながら真空ポンプで減圧することにより、溶媒を除去した。サンプルの透明度が増加した時点で、さらに100mmHgまで減圧し、有機溶媒のトレースを除去した。生成したリポソームサンプルは、15 mLのポリプロピレン製のチューブに移し氷上で保管した。
【００６８】
封入率の算出
蛍光色素の封入率を下記のように算出した。すなわち、リポソーム原液50 μLに4% SDS/PBS溶液を50 μL加え、55℃で2分加温後、バス型ソニケーターで30秒間の超音波処理を二回繰り返した。軽く遠心し溶液を集めた後、2％ SDS/PBSを900μL加え、同様に超音波処理を2度繰り返した。可溶化したリポソームサンプルを20℃、15,000rpmで20分間遠心して、上清の492nmの吸光度を測定した。この値をCFの検量線から定量し全CF濃度（[ALL]）を算出した。
【００６９】
非封入CF量は限外濾過装置を用いて測定した。すなわち、PBSで適宜希釈したリポソーム溶液300μLをスピンカラム（Ultrafree(登録商標)-0.5 Biomax-100、ミリポア社）に入れて、0℃、5000 rpmで遠心することにより、限外濾過液約200μLを分離した。得られた濾過液100μLに4% SDS/PBSを100μL加え、さらに2% SDS/PBSを800μL加えてよく混合し、492nmにおける吸光度を測定した。検量線から算出したCF濃度と希釈率から、リポソームに封入されなかったCF量（[Pass]）を算出した。
【００７０】
封入率（％）は（[ALL]-[PASS]）x100/[ALL] で算出した。
【００７１】
動的光散乱法による粒径測定
リポソーム溶液をPBSで希釈し、動的光散乱法（Photal ELS-800 大塚電子）により粒径を測定した。粒径はキュムラント法により算出された平均粒径（以下、単に粒径と記す場合がある）で表示した。
【００７２】
上述のようにトリオレインを含有する脂質を用いて、ダブルエマルジョンを介する方法によりリポソームを形成させた結果、リポソームの動的光散乱法による平均粒径は１８１ｎｍであり、封入率は６９％であった。
【００７３】
実施例２
ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＭＣ−ＤＰＰＥ（モル比18:10:0.5）からなる脂質混合物PL -M1 （日本油脂社）75mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol,MC-DPPE:2.1μmol）に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリオレインを添加した脂質混合物を用い、超音波照射時間を２０分にすること以外は、実施例１と同様にしてリポソームを形成し、リポソームの粒径と封入率を測定した。
【００７４】
その結果、リポソームの平均粒径は１７４nm でありCFの封入率は７３％であった。
【００７５】
さらに電子顕微鏡による観察を行なった。コロジオン膜付メッシュにリポソーム試料を接触させた後、脱塩水で希釈し、ろ紙で水分を吸着した。直ちに２％酢酸ウラニル染色液に接触し（約１０秒）、再度ろ紙で水分を吸収した。自然乾燥させた後、透過型電子顕微鏡（日立H−９０００NA、１００ｋV、対物絞り３）で観察したところ、図１のＡに見られるように小粒径のリポソームが観察され、３５０ｎｍ以上のリポソームの混在は認められなかった。
【００７６】
対照例１
実施例２の対照例としてトリオレインを含有しない脂質組成で同様にリポソームを作製した。
【００７７】
その結果、リポソームの平均粒径は２３９nm でありCFの封入率は５５％であった。さらに電子顕微鏡で形態を観察したところ、図１のＢに見られるように３５０ｎｍ以上のリポソームの混在が認められた。実施例２および対照例１の結果より、トリオレインを添加することにより、高い封入率でサイズの小さなリポソームが得られることが示された。
【００７８】
実施例３
75mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリカプリリン（Tricaprylin：シグマ社）を添加した脂質混合物を用い、実施例２と同様にしてリポソームを形成し、リポソームの粒径と封入率を測定した。
【００７９】
その結果、粒径は１７８．５nm でありCFの封入率が６５％のリポソームが得られた。
【００８０】
実施例４
75mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリカプリン（Tricaprin：シグマ社）を添加した脂質混合物を用い、実施例２と同様にしてリポソームを形成し、リポソームの粒径と封入率を測定した。
【００８１】
その結果、粒径は１６９．７ nm でありCFの封入率が６５％のリポソームが得られた。
【００８２】
実施例５
75 mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリミリスチン（Trimyristin：シグマ社）を添加した脂質混合物を用い、実施例２と同様にしてリポソームを形成し、リポソームの粒径と封入率を測定した。
【００８３】
その結果、粒径は１７０．５ nm でありCFの封入率が６０％のリポソームが得られた。
【００８４】
実施例６
75 mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリパルミチン（Tripalmitin：シグマ社）を添加した脂質混合物を用い、実施例２と同様にしてリポソームを形成し、リポソームの粒径と封入率を測定した。
【００８５】
その結果、粒径は１７０．５ nm でありCFの封入率が６５％のリポソームが得られた。
【００８６】
実施例７
75 mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol）のPL-M1にトリオレインを総脂質のmol％として0、 1.8、 3.6、7.0、14.0（コレステロールに対するmol％としては0、5.0、10.0、20.0、40.0）混合し、実施例２と同様にしてCF封入リポソームを作成した。得られたリポソームの粒径と封入率を同様に測定した。
【００８７】
その結果を図２に示す。CFの封入率はトリオレインの添加量が総脂質の1.8mol%（コレステロールの５mol％）程度から向上し、総脂質の3.6mol%（コレステロールの10mol%）程度で70%を超えほぼプラトーに達した。リポソームの粒径に関しても総脂質の1.8mol%から14mol％まで200nm未満であった。
【００８８】
この結果より、封入率および粒径の点からトリオレイン量が脂質総量の3.6mol％から7.0mol％が効果を発揮するのに良好であると考えられた。
【００８９】
実施例８
リポソーム構成脂質として、DPPC／コレステロール／MC-DPPE／トリオレイン（１．８：１：０．０５：０．１ モル比）からなる脂質混合物30、45、60、75、90、105 mgを用い実施例１と同様にしてCF封入リポソームを作製した。その結果、CFの封入率は脂質量の増加に従い増加し、７５ｍｇの脂質量まで急激に封入率が増加し、その後の脂質量の増加では封入率の増加の程度はゆるやかであった。脂質量75mg以上では封入率>70%が得られた。一方、トリオレイン不含で同様にして作製したリポソームの場合は、使用する脂質量に従い封入率の増加が見られたものの、トリオレイン含有のものより封入率は低く、脂質量75mgでの封入率は約55％であった。
【００９０】
この結果より、本スケールでの脂質混合物の量は75mgが適していることが明らかとなった。
【００９１】
実施例９
75 mg（総脂質122.6 μmol、DPPC:78.8 μmol,Chol:43.8μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリオレインを添加した脂質混合物を用い、封入する水溶液をシスプラチン水溶液（1.5 mg/mLでPBSに溶解）に変更した以外は実施例1と同様にしてリポソームを作製し、リポソームの粒径を測定した。作製したリポソームとフリーのシスプラチンをNAP-5カラム(Amersham社)により分画した。元のリポソームとリポソーム画分内のシスプラチンの含有量をICP-AES法で、脂質の量をHPLC法（L-Column, THF:AcCN:H2O = 2:1:2 0.1% TFA, 215 nm, 1 mL/min）により定量し、単位脂質当たりのシスプラチンの量を算出することにより封入率を求めた。
【００９２】
その結果、粒径は１３４ nm でありシスプラチンの封入率が７０％のリポソームが得られた。
【００９３】
実施例１０
75 mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリオレインを添加した脂質混合物を用い、封入する水溶液をアラビノースシトシン水溶液（100 mg/mLでPBSに溶解）に変更した以外は実施例1と同様にしてリポソームを作製し、リポソームの粒径を測定した。実施例１と同様にして、フリーのアラビノースシトシンとリポソームを分けた。
【００９４】
アラビノースシトシンの量は、サンプルをSDSで可溶化した後、２７０ nmにおける吸光度を測定することで行なった。また脂質量はリン脂質定量キット（和光純薬）により定量した。
【００９５】
その結果、粒径が１７０ nmで封入率が８０％のリポソームが得られた。
【００９６】
実施例１１
75 mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリオレインを添加した脂質混合物を用い、封入する水溶液をブルーデキストラン水溶液（100mg/mLでPBSに溶解、Pharmacia社）に変更した以外は実施例1と同様にしてリポソームを作製し、リポソームの粒径を測定した。作製したリポソームサンプルをPBSで等倍希釈し、４℃、１５，０００ rpmで一時間遠心した。この遠心後のサンプルの上澄みと元のサンプル内に含まれるブルーデキストランの量を比較することにより封入率を算出した。
【００９７】
その結果、粒径は２３２ nmで、封入率は７２.３％のリポソームが得られた。
【００９８】
実施例１２
1.5 g（総脂質2442μmol、DPPC:1544 μmol, Chol:858 μmol, MC-DPPE 40 μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する86 μmolのトリオレインを添加した脂質混合物を20 mLのクロロホルム/ヘキサン 1:1混液に溶解した。この脂質溶液にカルセイン（Calcein）溶液（PBSに溶解した10 ｍM Calcein 4000μLに７０％シュクロース666μLを加えたもの：シュクロースの終濃度１０％）4666mlを添加した。これを55℃の湯浴で温めながら、ホモジナイザーを用いて、出力５で20分間予備乳化を行なった。次に高圧乳化機 (超微粒化卓上実験装置 YSNM-1500-0005、吉田機械興業株式会社)を用いて、吐出圧が30 MPaぐらいになるように調節しながら衝突型ジェネレーターを４回、６回または８回通すことによって一次乳化を行った。
【００９９】
一次乳化産物1 mLずつをサンプリングし、実施例１と同様にしてリポソームの調製を行い、リポソームの粒径と封入率を測定した。4回、6回、8回の処理それぞれにおいて、粒径は117.3 nm、118.8 nm、121.7 nmで、封入率は８２％、72.9％、74.3％のリポソームが得られた。
【０１００】
実施例１３
EPC 4.0mmolとコレステロール2.0mmolおよびトリオレイン0.2mmolをジクロロメタンに溶解後、窒素気流下に乾燥し乾燥脂質混合物を調整した。
【０１０１】
調製した脂質乾固物を、クロロホルム/ヘキサン (1:1、V/V)混液５０mLに溶解した。この脂質溶液に実施例１と同様にして調整したショ糖を含有したCF溶液 11.7ｍｌを添加した。混合した後、高圧乳化機（貫通型ジェネレーター装着ナノマイザー、吉田機械興業製）に３回通すことで１次乳化を行なった。
【０１０２】
その一部を用い、実施例１と同様に２次乳化およびリポソーム化を行なった。
【０１０３】
得られたリポソームの粒径を動的光散乱法により測定したところ１６１．３ｎｍであった。また封入率は７３．４％であった。
【０１０４】
実施例１４
実施例1２で作製したリポソームの10.2 μmol（総脂質量、マレイミド量としては178.2 nmol）にアミノ酸配列GRKKRRQRRRPPQCからなるペプチド（以下TATペプチドと記載する）11.1 nmolを加えて一晩反応させた後、セファロースCL4B（登録商標）カラム（アマシャムバイオサイエンス社）を用いてリポソーム画分を精製した。得られたリポソームの脂質量をリン脂質定量キット（和光純薬）を用いて定量した。リポソームサンプルをDMEM/F12培地で希釈し（脂質濃度として0.125, 0.25, 0.5, 1.0 mg/ml）、ヒト肺癌細胞株（HLC）と37℃で1.5時間インキュベートした。細胞を洗浄後、フローサイトメター（FCM）および共焦点蛍光顕微鏡で細胞を観察した。FCM解析結果を図３に示す。TATを結合していないリポソームは細胞と反応しなかったが、TATを結合したリポソームは細胞と反応していることが確認された。また、同様に共焦点蛍光顕微鏡観察でもTAT非結合リポソームに比べTATリポソームで明らかな細胞との結合が観察され、一部の細胞はTATリポソームを細胞内に取り込んでいる様子が観察された。
【０１０５】
実施例１５
ＣＦに換えて８．６ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン溶液１１．７ｍｌ（リン酸緩衝シュクロース水溶液に溶解）を用いること以外は、実施例１３と同様にしてリポソームを作製した。得られたリポソームは、セファロースＣＬ６Ｂ（登録商標）カラム（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて精製することで非封入のアルブミンを除いた。得られたリポソームの粒径を動的光散乱法で測定したところ平均粒径は１８３ｎｍであった。また、リポソームの一部をＳＤＳ電気泳動に供しＣＢＢで染色した。同様に既知量のアルブミンを電気泳動し検量線を作成し、アルブミン量を定量した。また、脂質量はリン脂質定量キット（和光純薬）を用い定量した。
【０１０６】
その結果、リポソームへの封入率は６９％であった。
【０１０７】
実施例１６
DPPC 1.58mmol、コレステロール878 μmolおよびトリオレイン 88 μmolを添加した脂質混合物を30 mLのクロロホルム/ヘキサン１：１混液に溶解した。
カルボキシメチルセルロース（ICN Biomedicals Inc、Low viscosity）（12.5mg/mlのPBS溶液）６ｍｌにシスプラチン６０ｍｇを添加して加温し溶解した。このシスプラチン/カルボキシメチルセルロース溶液４ｍｌに70％シュクロース666μLを加え薬剤溶液とした。この薬剤溶液を上記脂質溶液に添加し予備乳化を行った後、実施例１２と同様にナノマイザーに６回通すことで一次乳化を行った。得られたエマルジョン用いて、実施例１と同様に２次乳化およびリポソーム化を行った。
【０１０８】
その結果、得られたリポソームの粒径を動的光散乱法により測定したところ163.8 nmであった。また封入率は77.6％であった。
【０１０９】
実施例１７
DPPC ５８ｍｇ、コレステロール１７ｍｇおよびトリオレイン３．９μLにジイソプロピルエーテル１ｍｌを加えた。これにカルセイン溶液２３３μLを添加した。これを６０℃の湯浴で温めながら、実施例１と同様にプローブ型ソニケーター(Branson Sonifier 450)を用いてPower= 1; cycle= 50 %で２０分間超音波照射することで１次乳化を行なった。さらに実施例１と同様に、２次乳化を行ないポソーム形成後、封入率およびリポソームサイズを測定した。
【０１１０】
その結果、封入率は７１％、リポソームサイズは１５６nmであった。
【０１１１】
実施例１８
溶媒をジイソプロピルエーテルとヘキサンの混合溶液（ジイソプロピルエーテル1.5ｍLおよびヘキサン0.2mL）に換えること以外は実施例１７と同様にしてリポソームを作製した。
【０１１２】
その結果、封入率は７７％、リポソームサイズが２３９ｎｍであった。
【０１１３】
実施例１９
溶媒を、ジイソプロピルエーテルにし、高圧乳化装置に5回通すこと以外は実施例１２と同様にしてカルセイン封入リポソームを作製した。
【０１１４】
その結果、得られたリポソームのカルセイン封入率は７０％、サイズは１７５ｎｍであった。
【０１１５】
実施例２０
ネダプラチン（シオノギ製薬：アクプラR）溶液（20 mg/mL：９ｍＭ リン酸、0.13Ｍ ＮａＣｌ、１０％トレハロース溶液（ｐＨ７．４））を用い、高圧乳化装置に5回通すこと以外は実施例１２と同様にして１次乳化を行なった。得られたW／Oエマルジョン１０ｍLを５６ｍＬのリン酸緩衝液（９ｍＭ リン酸、0.13Ｍ ＮａＣｌ、１０％トレハロース溶液（ｐＨ７．４））に加え、乳化した後、５５℃で減圧下に窒素ガスを吹き付けることでリポソームを形成した。
【０１１６】
その結果、得られたリポソームのネダプラチン封入率は７７％、サイズは１３６ｎｍであった。
【０１１７】
実施例２１
分子量５０００のポリエチレングリコールの一方の末端にマレイミド基を、他方の末端にジステアリルフォスファチジルエタノールアミンを結合した化合物（DSPE-050MA）を日本油脂から入手した。DSPE-050MAおよび等モルのTAT（実施例１４に記載）を、１ｍM EDTAを含有した１００ｍMリン酸緩衝液（ｐH6.0）中で反応した。反応液をTLCプレートで展開し（クロロホルム：メタノール ３：１、ヨウ素発色）、マレイミド基にTATが結合した目的物（TAT-PEG-DSPE）がほぼ定量的に生成していることを確認した。TATに換えてシステインを用いることで、同様にマレイミド基にシスチンが結合した目的物（Cys-PEG―DSPE）を作製した。
【０１１８】
実施例２０と同様にして作製したネダプラチン封入リポソームに、TAT-PEG-DSPEあるいはCys-PEG―DSPEを添加し（総脂質の０．０５mol％）、60℃で10分間の加熱を二回繰り返すことでリポソームに組み込んだ。このリポソームに、総脂質の3.4mol％に相当するチオール基を有するＰＥＧ（欧州特許出願公開第５２６７００号明細書に記載）を添加し４℃で一晩反応した。得られたリポソームをセファロースCL-4B（アマシャムバイオサイエンス社）を充填したカラムで精製してネダプラチン封入TAT結合PEGリポソームあるいはネダプラチン封入PEGリポソームを得た。
【０１１９】
両リポソームに対する抗腫瘍活性をヒト肺癌細胞（HLC-1）
を用いて比較した。HLC-1を96 ウェルプレートに播種し、５％牛胎児血清含有培地（DMEM/F-12）で一日培養した後、各リポソームを0.635μＭ、1.25μＭ、2.5μＭ、5μＭ、10μＭ、20μＭのネダプラチン濃度（図４参照）となるように添加した。翌日ネダプラチン入り培地を除去し、ネダプラチンを含有しない培地でさらに５日間培養後MTTアッセイにより生細胞率（％）を測定した。
【０１２０】
その結果、ネダプラチン封入TAT結合PEGリポソームは、ネダプラチン封入PEGリポソームに比べてより強い増殖抑制活性を示すことが明らかになった。
【０１２１】
実施例２２
カルボキシメチルデキストラン（CMD-D40、五徳薬品）（10 mg/mlのPBS溶液）5 ｍｌにシスプラチン50 ｍｇを添加して加温し溶解した。このシスプラチン/カルボキシメチルデキストラン溶液４ｍｌに70％シュクロース666μLを加え薬剤溶液とした。この薬剤溶液を脂質溶液（DPPC 1.58 mmol、コレステロール878 μmol、トリオレイン 88 μmolを30 mLのクロロホルム/ヘキサン１：１混液に溶解）に添加し予備乳化を行った後、実施例２０と同様にリポソーム化を行った。
【０１２２】
その結果、得られたリポソームのシスプラチン封入率は87.9％、サイズは152.4 nmであった。
【０１２３】
実施例２３
1.19 gのＥＰＣ、0.31ｇのコレステロールおよび72μＬのトリオレインに、ジエチルエーテル１５ｍｌおよびジクロロフルオロエタン１５ｍＬを加えた。この脂質溶液に胸腺由来のDNA溶液（Calf Thymas DNA、R&D systems社）（Tris-EDTA (pH 7.4)を溶解した1.0 mg/mL DNA水溶液4ｍLに７０％シュクロース666μLを加え、シュクロースの終濃度を１０％にしたもの）を添加した。室温でバス型ソニケーターを用い軽く超音波処理した後、高圧乳化機を用いて、一次乳化を行った。その内１０ｍＬを５６ｍＬのリン酸緩衝シュクロース水溶液に加え、乳化した後、室温で減圧下に窒素ガスを吹き付けることでリポソームを形成した。その結果、得られたDNAの封入率は67.1 ％、サイズは198.2ｎｍであった。
【０１２４】
これらの結果より、トリオレインを含有するリポソームは、トリオレインを含有しないリポソームに比べて、リポソームの粒径のコントロールが容易であり、リポソーム内腔への水溶性物質の封入率も高いことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明によれば、水溶性物質をリポソームの内腔に封入し、リポソームの粒径が３００ｎｍ以下であるリポソームを提供することができる。
【０１２６】
なお、本出願は、日本特許出願 特願２００３−４００９８６号を優先権主張して出願されたものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソームの内腔に水溶性物質が封入され、リポソームの粒径が３００ｎｍ以下であって、トリグリセロールを含有するリポソームに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、脂質２重膜の閉鎖小胞であり、リポソーム内腔の水層に水溶性物質を保持し、脂質膜中に脂溶性物質を保持することができる。また、数１０nm程度の小さい一枚膜リポソーム（SUV）、数１００nm程度の大きい一枚膜リポソーム（LUV）または多重層リポソーム（MLV）等種々の形態および粒径のリポソームを用途に応じて作製することができる。
【０００３】
リポソームは生体由来の生分解性脂質で構成されていることから、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）への応用が提唱されている。近年においては、リポソーム表面をポリエチレングリコールで修飾することにより生体内安定性を改善したリポソームの研究や、抗体等のリガンドを結合したリポソームの研究もなされている。
【０００４】
リポソームのＤＤＳへの実用化を考える場合には、内腔に封入する水溶性物質のリポソーム化効率（リポソームへの水溶性物質の封入率をいう。以下「封入率」と記載することがある）、リポソームの形態および粒径を考慮することが重要である。
【０００５】
高い封入率を得る方法としては、シュナイダーのダブルエマルジョンを介した方法（W/O/W法）が挙げられる（特許文献１）。具体的には、水と不混和性の有機溶媒に、リン脂質あるいはリン脂質とコレステロールを溶解し、これに薬剤水溶液を混和し、この混合液を乳化することでwater in oil（W/O）エマルジョンを形成させる（１次乳化）。さらに、このエマルジョンを水相に移すことでwater in oil in water（W/O/W）エマルジョンを形成させる（２次乳化）。このW/O/Wエマルジョンから有機溶媒を除去し、リポソームを形成する。この方法に従うとインシュリン、トリプシン、アクチノマイシンＤ、アラビノースシトシン等を５０〜８０％という高い封入率でリポソーム化することができると考えられている。
【０００６】
しかしながら、シスプラチンに代表されるような水溶性物質をW/O/W法に従って、リポソームの内腔に封入したところ内容物が漏れ出すという問題が生じた。
【０００７】
W/O/W法において使用できる脂質として、上記特許文献１には、レシチン、フォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン等のリン脂質、コレステロール等のステロールに加え、ステアリルアミン等リンを含有しない脂質、ポリエトキシレート化された脂肪酸アミド等に加え複合脂質、グリセライド、セライド、エストライドが列挙されている。
【０００８】
Ｋｉｍらは、グリセライドの一種であるトリオレインをリポソームの構成成分として用い、通常のリポソームに比べて、粒径の大きいリポソーム（非特許文献１）や、巨大なリポソームが多くの小区画に分かれたマルチコンパートメントリポソーム（非特許文献２）を得ている。
【０００９】
リポソームをＤＤＳに応用する場合においては、リポソームの粒径が機能に大きな影響を与えることが知られている。例えば癌組織の血管は、正常組織の血管と異なりサブミクロンサイズのポアを有しており（非特許文献３）、リポソームが癌組織に選択的に到達するためには、リポソームの粒径が、正常組織の血管のポアサイズよりも大きく、癌組織の血管のポアサイズよりも小さい必要がある。血管内に各種サイズのリポソームを投与して癌組織への到達性を比較した実験（非特許文献４）では粒径が２００ｎｍ以下のリポソームで良好な癌組織集積性を認めた。また、リポソーム等の経口吸収に関する研究においては、Janiら（非特許文献５）は、消化管粘膜から取り込まれる微粒子の割合は粒径に依存していることを示した。小さな粒子ほど消化管粘膜から吸収されやすく、リポソームの粒径が３００ｎｍ以下になると経口投与したリポソームが血液中にも観察された。
【００１０】
このように、リポソームをＤＤＳに応用する為には、その用途に合わせて粒径をコントロールすることが重要である。
【００１１】
しかしながら従来技術では、リポソームの粒径を３００ｎｍ以下にコントロールすることは困難であった。
【特許文献１】米国特許第４２２４１７９号明細書
【非特許文献１】Biochim Biophys Acta, 646,1 (1981)
【非特許文献２】Biochim Biophys Acta, 728,339 (1983)
【非特許文献３】Proc.Natl.Acac.Sci.USA 95 (1998) 4607-4612
【非特許文献４】Inter.J.Pharm. 190 (1999)49-56
【非特許文献５】J.Pharm.Pharmacol 42(1990)821-826, Inter.J.Pharm. 86 (1992)239-246
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、リポソームの内腔に水溶性物質が封入され、リポソームの粒径が３００ｎｍ以下であるリポソームを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願発明者らは、従来の問題点を解決する為に誠意検討した結果、驚くべきことに、リポソーム作製時に少量のトリグリセロールを加えることで粒径が３００ｎｍ以下であるリポソームを容易に作製できることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）水溶性物質を内腔に封入し、粒径が３００ｎｍ以下およびトリグリセロールを含有したリポソーム。
（２）水溶性物質を内腔に封入し、粒径が２００ｎｍ以下およびトリグリセロールを含有したリポソーム。
（３）水溶性化合物の内腔への封入率が６０％以上である上記１または２に記載のリポソーム。
（４）水溶性化合物の内腔への封入率が７０％以上である上記１または２に記載のリポソーム。
（５）水溶性物質が、水溶性低分子化合物、蛋白質、核酸類、多糖類および／または指示薬である上記１から４のいずれかに記載のリポソーム。
（６）水溶性物質が、水溶性低分子化合物および多糖類である上記１から４のいずれかに記載のリポソーム。
（７）水溶性物質が、水溶性低分子化合物である上記1から４のいずれかに記載のリポソーム。
（８）水溶性低分子化合物がネダプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビンまたはAra-Cである上記５から７のいずれかに記載のリポソーム。
（９）多糖類がキトサン誘導体またはカルボキシル基を有する多糖類である上記５または６に記載のリポソーム。
（１０）カルボキシル基を有する多糖類がカルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸である上記９に記載のリポソーム。
（１１）トリグリセロールがトリオレインである上記１から１０のいずれかに記載のリポソーム。
（１２）リガンドおよび／または水溶性合成高分子を有する上記１から１１のいずれかに記載のリポソーム。
（１３）リガンドを有する上記１から１１のいずれかに記載のリポソーム。
（１４）リガンドがターゲット細胞またはターゲット分子に結合するものである上記１２または１３に記載のリポソーム。
（１５）リガンドが抗体または抗体のフラグメントである上記１２から１４のいずれかに記載のリポソーム。
（１６）水溶性合成高分子が、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドン、ビニルピロリドンと無水マレイン酸との共重合体から選ばれる上記１２に記載のリポソーム。
（１７）水溶性合成高分子が、ポリアルキレングリコールである上記１２または１６に記載のリポソーム。
（１８）ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである上記１６または１７に記載のリポソーム。
（１９）リガンドおよび／または水溶性合成高分子がリポソームの外部表面のみに結合している上記１２から１８に記載のリポソーム。
（２０）上記１から１９のいずれかに記載のリポソームを含有する医薬組成物。
（２１）上記１から１９のいずれかに記載のリポソームを含有する癌の診断および／または治療剤。
【発明の効果】
【００１５】
上記のようにリポソームの形成脂質として少量のトリグリセロールを加えることによって、粒径が３００ｎｍ以下のリポソームを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、透過型電子顕微鏡（ネガティブ染色）で観察した、蛍光物質封入リポソームの形態を示す写真である。Ａ：トリオレイン含有リポソームを示す。Ｂ：トリオレイン不含有リポソームを示す。
【図２】図２は、リポソームの粒径および封入率に及ぼすトリオレイン量の影響を示す図である。Ａ：縦軸はリポソームの封入率、横軸はトリオレインの添加量を総脂質に対するmol%として示す。Ｂ：縦軸はリポソームの粒径、横軸はトリオレインの添加量を総脂質に対するmol%として示す。ここで、リポソームの粒径は、動的光散乱法により測定した平均粒径を示す。
【図３】図３は、蛍光物質を封入したリポソームと細胞の反応性をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す図である。図３中、１はリポソームを添加しない細胞の蛍光量のシフトを示す。図３中、２から５は、脂質量1.0 mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/mlからなる各リポソームと細胞を反応して得られた蛍光量のシフトを示す。Ａ：蛍光物質を封入したTAT結合リポソームとヒト肺癌細胞との反応性を測定した結果を示す。Ｂ：TATを結合していない蛍光物質を封入したリポソームとヒト肺癌細胞との反応性を測定した結果を示す。
【図４】図４はネダプラチン封入TAT結合PEGリポソーム（▲）およびネダプラチン封入PEGリポソーム（■）のヒト肺癌細胞に対する抗腫瘍効果を示す図である。横軸はネダプラチンの濃度を示す。縦軸は対照（薬剤濃度０）の細胞数を１００％とした生細胞率を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明における水溶性物質としては、水溶性低分子化合物、蛋白質、核酸類、多糖類または指示薬が挙げられる。水溶性低分子化合物としては、医薬品、診断薬が挙げられる。医薬品としては、ジクロフェナクナトリウム、ドブラマイシン等の抗炎症薬、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、レボフロキサシン、シプロフロキサシン等の抗菌薬、アシクロビル、３TC、AZT等の抗ウイルス薬、サララシン、テノーミン、塩酸アモスラロール等の降圧薬、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ゲムシタビン、Ara-C等の抗腫瘍薬が挙げられる。蛋白質としては、アルブミン、サイトカイン類、腫瘍抗原類または毒素類が挙げられる。サイトカイン類としてはTNF、インターフェロンまたはインターロイキン等が挙げられ、腫瘍抗原類としてはHer-2、CEAまたはAFP等が挙げられ、毒素類としてはジフテリアトキシンまたはリシンA鎖等が挙げられる。核酸としては、TNFなどのサイトカインをコードしたDNA類、ｐ53などの腫瘍抑制遺伝子類をコードしたDNA類、チミジンキナーゼなどの自殺遺伝子類をコードしたDNA類、アンチセンスRNAまたはRNAi（RNA interference）作用を有するRNA類等が挙げられる。
【００１８】
本発明における多糖類としては、キトサン誘導体またはカルボキシル基を有する多糖類等が挙げられる。カルボキシル基を有する多糖類としては、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸が挙げられ、好ましくはカルボキシメチルセルロースが挙げられる。
【００１９】
本発明における指示薬としては、蛍光色素や放射性元素が挙げられ、具体的にはインジウム、テクネシウムのイメ−ジング薬剤やホ−スラディシュパ−オキシダ−ゼ、アルカリフォスファタ−ゼ等の酵素、ガドリニュ−ムを含有するＭＲＩ造影剤、ヨ−ソを含有するＸ線造影剤、ＣＯ２等の超音波造影剤、ユ−ロピウム誘導体、カルボキシフルオレッセイン等の蛍光体またはＮ−メチルアクリジウム誘導体等の発光体が挙げられる。
【００２０】
また、水溶性低分子化合物、蛋白質、核酸類、多糖類または指示薬をそれぞれ単独でリポソームに封入しても良く、これらを組み合わせてリポソームに封入しても良い。例えば、水溶性低分子化合物および多糖類を組み合わせてリポソームに封入することが挙げられる。
【００２１】
本発明における粒径としては、リポソームの平均粒径が３００ｎｍ以下が挙げられ、好ましくは２００ｎｍ以下が挙げられる。
【００２２】
さらに、本発明におけるリポソームとしては、粒径が１μｍ以上のリポソームが５％以上混入しないもの、１μｍ以上のリポソームが１％以上混入しないもの、好ましくは１μｍ以上のリポソームが混入しないものが挙げられる。
【００２３】
または、粒径が３５０ｎｍ以上のリポソームが２０％以上混入しないもの、粒径が３５０ｎｍ以上のリポソームが１０％以上混入しないもの、より好ましくは粒径が３５０ｎｍ以上のリポソームが混入しないものが挙げられる。
【００２４】
さらに、粒径が２５０ｎｍ以上のリポソームが１０％以上混入しないもの、最も好ましくは粒径が２５０ｎｍ以上のリポソームが混入しないものが挙げられる。
【００２５】
リポソーム粒径の測定法としては、例えば、動的光散乱法が挙げられる（Liposome Technology, 2nd Edition Vol.1 Chapter 15 p254-269 (1993); CRC Press, Edited by Gregory Gregoriadis ）。
【００２６】
リポソームの粒径が著しく不均一である場合は、大粒径リポソームの混入が正確に反映されないため、動的光散乱法で測定するのは困難である。そのため、リポソームの粒径が著しく不均一である場合は、例えば、透過型電子顕微鏡を用いたネガティブ染色法(Biochimica et Biophysica Acta, 601(1980)559-571)、凍結電子顕微鏡撮影（Liposome Technology, 2nd Edition Vol.2 Chapter 14 p250-252 (1993); CRC Press, Edited by Gregory Gregoriadis）または原子間力顕微鏡（Thin solid films 273 (1996) 297-303）により観察することが好ましい。
【００２７】
本発明におけるリポソームの形態としては、例えば、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）、大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）、または多重層リポソーム（ＭＬＶ）等が挙げられ、好ましくはＳＵＶまたはＬＵＶが挙げられる。
【００２８】
本発明におけるトリグリセロールとしては、トリカプロイン（Tricaproin）、トリカプリリン（Tricaprylin）、トリカプリン（Tricaprin）、トリミリステイン（Trimyristin）、トリパルミチン（Tripalmitin）、トリリノレイン（Trilinolein）、トリオレイン（Triolein）が挙げられるが、好ましくはトリオレイン（Triolein）が挙げられる。トリグリセロールの添加量としては、総脂質の１〜１５mol%が挙げられ、好ましくは２〜７mol%であり、さらに好ましくは３〜６mol%である。
【００２９】
また、本発明におけるリポソームを形成し得る脂質としては、例えば、天然フォスファチジルコリン、合成フォスファチジルコリン、天然フォスファチジルエタノールアミン、合成フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジン酸等のリン脂質、スフィンゴ糖脂質またはグリセロ糖脂質等の糖脂質等が挙げられる。また、天然フォスファチジルコリンとしては、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）または大豆ホスファチジルコリンが挙げられ、合成フォスファチジルコリンとしては、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）またはジオレオイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）等が挙げられ、天然フォスファチジルエタノールアミンとしては、卵黄ホスファチジルエタノールアミン等が挙げられ、合成フォスファチジルエタノールアミンとしては、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン等が挙げられ、フォスファチジルグリセロールとしては、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール等が挙げられる。これらの脂質は単独または２種以上、あるいはこれらの脂質とコレステロール等の非極性物質と組み合わせて用いられることもある。また、リン脂質とコレステロールを組み合わせて用いる場合はそのモル比は２：１から１：１程度が好ましいが、比率はこれに限定されない。さらに、本発明におけるリポソームには、上記の脂質成分に加え、必要に応じて乳化剤を混合することができる。乳化剤としては、オクチルグルコシドまたはコール酸等が挙げられる。
【００３０】
また、本発明におけるリポソームの作製方法としては、本発明の目的が達成されるものであれば、いかなる既知の作製方法を用いても良いが、好ましくはエマルジョンを介した方法が挙げられる。具体的には、逆相蒸発法またはダブルエマルジョンを介した方法（Ｗ／Ｏ／Ｗ法）を用いることができる。例えば、Ｗ／Ｏ／Ｗ法においては、水と不混和性の有機溶媒に、リン脂質およびトリグリセロール、あるいはリン脂質とコレステロールおよびおよびトリグリセロールを溶解し、その後、薬剤水溶液と混合する。この混合液を乳化するとwater in oil（W/O）エマルジョンを形成し（１次乳化）、さらにこのW/Oエマルジョンを水相に移すことでwater in oil in water（W/O/W）エマルジョンが形成される（２次乳化）。さらに、２段階の乳化で得られたW/O/Wエマルジョンから有機溶媒を除去するとリポソームを形成することができる。
【００３１】
また、ダブルエマルジョンを作製しリポソーム化する別の方法としては、転相乳化法（J.Colloid Interface Sci., 94, 362 (1983)）が挙げられる。その他、１段階乳化法（特開昭５９−１９３９０１）により得られたダブルエマルジョンからリポソームを作製しても良い。好ましくは２段階乳化で得られたダブルエマルジョンからリポソームを作製する方法等が挙げられる。
【００３２】
ここで、２段階乳化のダブルエマルジョンからリポソームを作製する場合を例に挙げ、詳細に説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
【００３３】
２段階乳化のダブルエマルジョンからリポソームを作製する場合においては、まず、一次乳化に用いる有機溶媒に、リポソームを形成しうる脂質、必要に応じたリガンド結合用脂質および／または乳化剤を加えた有機溶媒相を調整した後に、封入すべき水溶性物質を含む水相を添加する。
【００３４】
一次乳化に用いる有機溶媒としては水と混和しない、または、混和しにくい有機溶媒を用いることができ、例えばクロロホルム、ヘキサン、エーテル類、ベンゼン、エステル類、フロン類、超臨界状態のＣＯ２、ジクロロメタン、四塩化炭素等が挙げられる。これらの有機溶媒は単独または組み合わせて用いることができる。有機溶媒を組み合わせる場合には、有機溶媒相の比重がリポソームに封入すべき水溶液の比重に近いように混合比を調整することが望ましい。
【００３５】
一次乳化の水相にリポソームに封入すべき物質を溶解する。この水相にはリン酸緩衝液のような緩衝液を用いることができる。また、緩衝液には必要に応じて塩化ナトリウムや低分子の糖（ショ糖、トレハロース、乳糖等）を加えて浸透圧および比重を調整したものを使用することができるが、１０％程度の二糖類を加えた緩衝液を用いることが好ましく、１０％程度のトレハロースを含有した中性の緩衝液を使用することがさらに好ましい。
【００３６】
有機溶媒相と水相を混合する際には、水相は有機溶媒相より少ないことが必要である。好ましくは有機溶媒１容に対して０．０１容から０．９容以下、より好ましくは０．０１容から０．５容以下、さらに好ましくは０．１容から０．４容、最も好ましくは０．２容から０．３容を用いる。
【００３７】
次に、これらの混合液を乳化しＷ／Ｏエマルジョンを作製する（一次乳化）。乳化はいかなる乳化技術を用いて行なっても良いが、例えば、超音波照射による乳化、激しい攪拌、ホモジナイザーあるいは高圧乳化装置を用いて行なうことができる。超音波照射はバス型のものやプローブ型あるいは連続型を用いることができる。また高圧乳化装置はナノマイザー（吉田機械興業）あるいはマイクロフルイダイザー（みずほ工業）の名称で市販されており、これらの装置を用いることができ、好ましくは超音波照射が挙げられ、より好ましくは高圧乳化装置が挙げられる。
【００３８】
一次乳化により得られるＷ／Ｏエマルジョンのサイズとしては、好ましくは１０ｎｍから１５０ｎｍであることが挙げられ、より好ましくは３０ｎｍから１００ｎｍであることが挙げられ、最も好ましくは４０ｎｍから８０ｎｍであることが挙げられる。
【００３９】
また、一次乳化においては、乳化する温度をリポソームを形成しうる脂質の相転移温度より高い温度で行なうことが望ましい。例えばリン脂質としてＤＰＰＣを用いる場合は４２℃以上で行なうことが望ましい。
【００４０】
次に、得られたＷ／Ｏエマルジョンを攪拌しながら第二の水相に添加することによってダブルエマルジョン（Ｗ／Ｏ／Ｗ）を形成する。
【００４１】
第二の水相としては、純水または緩衝液を用いることができる。緩衝液には必要に応じて塩化ナトリウムや低分子の糖（ショ糖、トレハロース、乳糖等）を加えて浸透圧および比重を調整したものを使用することができるが、１０％程度の二糖類を加えた緩衝液を用いることが好ましく、１０％程度のトレハロースを含有した中性の緩衝液を使用することがさらに好ましい。このとき、塩化ナトリウムや低分子の糖は、リポソームの内部水相および／または外部水相に存在してもよい。好ましくは、塩化ナトリウムや低分子の糖が、リポソームの内部水相および外部水相に存在していることが挙げられる。
【００４２】
得られたダブルエマルジョンをさらに攪拌しながら、有機溶媒を除去することでリポソームを形成する。
【００４３】
有機溶媒の除去は、ダブルエマルジョンに空気、窒素ガスやアルゴンガスのような不活性ガスを吹きつけることによって行なうことができるが、より好ましくは不活性ガスを吹きつけながら減圧することによって行なう。必要に応じて溶液の温度を４０℃〜６０℃にして行なうこともできる。このようにして得られたリポソーム溶液はそのまま、あるいは限外濾過膜やゲル濾過により精製して用いることができる。
【００４４】
本発明において水溶性物質の内腔への封入率としては、６０％以上であることが挙げられ、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、最も好ましくは８０％以上であることが挙げられる。
【００４５】
また、本発明においては、リガンドや水溶性合成高分子をリポソーム表面に結合させて使用することも可能である。
【００４６】
本発明のリガンドとしては、ターゲット細胞またはターゲット分子に結合するものが挙げられ、例えば、単糖、オリゴ糖、多糖などの糖類、ペプチド、各種抗体、線維芽細胞成長因子（FGF）、上皮細胞成長因子（EGF）等の成長因子または増殖因子等のタンパク質が挙げられるが、好ましくは抗体が挙げられる。本発明における抗体としては、抗体自体および抗体フラグメントのほか、誘導体化または修飾した抗体などを包含しており、最も広義に解釈しなければならない。
【００４７】
また、抗体としては各種動物のポリクロ−ナル抗体、マウスモノクロ−ナル抗体、ヒト−マウスキメラ抗体またはヒト型モノクロ−ナル抗体およびヒトモノクローナル抗体が挙げられるが、好ましくはヒトモノクロ−ナル抗体が挙げられる。さらに好ましくは癌反応性のヒトモノクロ−ナル抗体が挙げられる。
【００４８】
ここでターゲット細胞とは、リポソームを用いて封入した物質を送達させようとする細胞であり、例えば癌細胞、癌組織の血管内皮細胞、癌組織の間質細胞等が挙げられる。ターゲット分子とは、ターゲット細胞の細胞質内の分子、核内の分子、あるいは細胞表面の分子等いかなる分子でも良いが、好ましくは細胞表面の分子である。ターゲット分子の別の形態として、細胞から放出された分子が挙げられる。例えば、癌細胞や癌組織の間質細胞の分泌物や構築物であってもが挙げられ、具体的には腫瘍マーカーや細胞間の構造物等が挙げられる。
【００４９】
本発明における水溶性合成高分子としては、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドン、ビニルピロリドンと無水マレイン酸との共重合体が挙げられる。ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール等が挙げられ、好ましくはポリエチレングリコールが挙げられる。ここで、ポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量が２，０００〜７，０００ダルトン程度のものが挙げられ、好ましくは約５，０００ダルトン程度のものが挙げられる。
【００５０】
水溶性合成高分子は、リポソームの内部および／または外部のいずれに結合していてもよいが、好ましくはリポソームの外部のみに結合している場合が挙げられる。
【００５１】
リポソームにリガンドを結合する際には、公知あるいは今後考案されるいかなる方法を用いてリガンドを結合しても良い。
【００５２】
例えば、リポソームを形成しうる脂質として、マレイミド基やスクシンイミド基等の官能基を有する脂質と、他のリポソームを形成しうる脂質を用いてリポソームを作製した後、当該官能基と結合しうるチオール基やアミノ基等の反応性部分を有するリガンドを添加することにより、リガンド結合リポソームを作製することができる。リポソームを形成しうる脂質の官能基とリガンドの反応性部分の組み合わせとしては、リポソームとリガンドの結合を達成しうる如何なる組み合わせを用いても良く、限定されるものではないが、マレイミド基とチオール基、スクシンイミド基とアミノ基、アミノオキシ基またはヒドラジド基とアルデヒド基等の組み合わせを挙げることができる。好ましくはマレイミド基とチオール基の組み合わせが挙げられる。
【００５３】
限定されるものではないが、官能基を有する脂質としてε―マレイミドカプロイルジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンのようなマレイミド基を有する脂質によりリポソームを作製する場合は、反応性部分としてチオール基を有するリガンドを中性ｐH付近で反応させることで容易にリガンド結合リポソームを作製することができる。
【００５４】
ここで、リガンドに反応性部分としてチオール基を導入する方法としては、本発明の目的が達成されるものであればいかなる方法を用いてもよいが、本発明のリガンドがペプチドの場合はペプチド配列の一部にシステインを挿入する方法が挙げられる。
【００５５】
リガンドが抗体の場合は、抗体にイミノチオランを反応させチオール基を導入する方法、S-アセチルチオグリコール酸N-ヒドロキシスクシンイミドを反応させた後、ヒドロキシルアミンで処理することによりチオール基を導入する方法、抗体を酵素処理した後、還元することでFab’フラグメントを作製し、抗体の内在性チオール基を利用する方法等が挙げられる。
【００５６】
また、別の実施形態として、先にリガンドを結合させたリガンド結合脂質を合成し、これと他のリポソームを形成しうる脂質を用いてリポソームを作製することで、リガンド結合リポソームを作製する方法が挙げられる。
【００５７】
さらに別の形態として、リポソームとリガンドの間に水溶生合成高分子を結合させる方法が挙げられる。水溶性合成高分子のうちPEGを用いる場合は、FEBS letter ４１３（１９９７）１７７―１８０、Biochemistry３６（１９９７）６６―７５、Biochimica Et Biophysica Acta 1513（2001）207-216、欧州特許第0903152号明細書等に記載の方法に従い作製することができる。
【００５８】
本発明においては、リガンドを単独でリポソームに結合しても良く、リガンドおよび水溶性合成高分子の両方をリポソームに結合しても良く、あるいは水溶性合成高分子のみをリポソームに結合しても良いが、リガンドと水溶性合成高分子の両方を結合したリポソームが好ましい。
【００５９】
ここでリガンドおよび／または水溶性合成高分子をリポソームに結合させる方法や順番は特に限定されるものではないが、好ましくは欧州特許第0903152号明細書等に記載の方法に従うことが挙げられる。
【００６０】
リポソームに水溶性合成高分子を結合させる方法としては、水溶性合成高分子に脂質部分を導入した誘導体を作製し、これを他のリポソームを形成しうる脂質と共に用いてリポソームを作製する方法（FEBS letters 268（１９９０）235-237）、あるいは上述したチオール基やアミノ基等の反応性部分を導入した水溶性合成高分子を、リポソームと反応させる方法等を用いることができるが、好ましくは、反応性部分を導入した水溶性合成高分子をリポソームと反応させる方法が挙げられる。
【００６１】
例えばポリエチレングリコールを例に挙げて説明すると、欧州特許出願公開第５２６７００号明細書に記載のチオール基を有するＰＥＧを、ε―マレイミドカプロイルジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンを有するリポソームと結合することで容易にＰＥＧ化リポソームを作製することができる。
【００６２】
本発明で得られたリポソームは、例えば、欧州特許出願公開第５２６７００号明細書または欧州特許出願公開第５２０４９９号明細書に記載の方法により製剤化することができ、該複合体を、癌等の各種疾患の治療のために、血管内投与、膀胱投与、腹腔内投与、局所投与等の方法で患者に投与することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００６４】
実施例１
卵黄ホスファチジルコリン（EPC）およびコレステロールは、日本油脂社より入手した。トリオレイン（Triolein）および5 (6)-カルボキシフルオレセイン（５（６）
-Carboxyfluorescein）はシグマ社より購入した。
【００６５】
W/O emulsionの調製（１次乳化）
EPC 59.7 mg（81.4μmol）、コレステロール15.75 mg（40.7μmol）およびトリオレイン4.1μmolをジクロロメタンに溶解後、窒素気流下に乾燥し乾燥脂質混合物を調整した。
【００６６】
調製した脂質乾固物を、クロロホルム/ヘキサン (1:1、V/V)混液1mLに溶解した。この脂質溶液に5 (6)-
Carboxy fluorescein(CF)溶液（PBSに溶解した８ｍM CF２００μLに７０％シュクロース３３μLを加えたもの：シュクロースの終濃度１０％）２３３μLを添加した。これを55℃の湯浴で温めながら、ホモジナイザー（ポリトロン; KINEMATICA GmbH, PCU1, Ser nr 5239）を用いて、出力５で20分間予備乳化を行なった。次に、プローブ型ソニケーター(Branson Sonifier 450)を用いてPower= 1; cycle= 50 %で３０分間超音波照射することで１次乳化を行なった。
【００６７】
W/O/W emulsionの調製（２次乳化）
バイアルビンに、分散相となるリン酸緩衝シュクロース水溶液（９ｍＭ リン酸、0.13Ｍ ＮａＣｌ、１０％ショ糖溶液（ｐＨ７．４））を入れて55℃に合わせ、撹拌しながら、一次乳化サンプルを10分間かけて滴下した。W/O emulsionが分散相の中に全部出たところで、窒素を15mL/minでふきつけながら真空ポンプで減圧することにより、溶媒を除去した。サンプルの透明度が増加した時点で、さらに100mmHgまで減圧し、有機溶媒のトレースを除去した。生成したリポソームサンプルは、15 mLのポリプロピレン製のチューブに移し氷上で保管した。
【００６８】
封入率の算出
蛍光色素の封入率を下記のように算出した。すなわち、リポソーム原液50 μLに4% SDS/PBS溶液を50 μL加え、55℃で2分加温後、バス型ソニケーターで30秒間の超音波処理を二回繰り返した。軽く遠心し溶液を集めた後、2％ SDS/PBSを900μL加え、同様に超音波処理を2度繰り返した。可溶化したリポソームサンプルを20℃、15,000rpmで20分間遠心して、上清の492nmの吸光度を測定した。この値をCFの検量線から定量し全CF濃度（[ALL]）を算出した。
【００６９】
非封入CF量は限外濾過装置を用いて測定した。すなわち、PBSで適宜希釈したリポソーム溶液300μLをスピンカラム（Ultrafree(登録商標)-0.5 Biomax-100、ミリポア社）に入れて、0℃、5000 rpmで遠心することにより、限外濾過液約200μLを分離した。得られた濾過液100μLに4% SDS/PBSを100μL加え、さらに2% SDS/PBSを800μL加えてよく混合し、492nmにおける吸光度を測定した。検量線から算出したCF濃度と希釈率から、リポソームに封入されなかったCF量（[Pass]）を算出した。
【００７０】
封入率（％）は（[ALL]-[PASS]）x100/[ALL] で算出した。
【００７１】
動的光散乱法による粒径測定
リポソーム溶液をPBSで希釈し、動的光散乱法（Photal ELS-800 大塚電子）により粒径を測定した。粒径はキュムラント法により算出された平均粒径（以下、単に粒径と記す場合がある）で表示した。
【００７２】
上述のようにトリオレインを含有する脂質を用いて、ダブルエマルジョンを介する方法によりリポソームを形成させた結果、リポソームの動的光散乱法による平均粒径は１８１ｎｍであり、封入率は６９％であった。
【００７３】
実施例２
ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＭＣ−ＤＰＰＥ（モル比18:10:0.5）からなる脂質混合物PL -M1 （日本油脂社）75mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol,MC-DPPE:2.1μmol）に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリオレインを添加した脂質混合物を用い、超音波照射時間を２０分にすること以外は、実施例１と同様にしてリポソームを形成し、リポソームの粒径と封入率を測定した。
【００７４】
その結果、リポソームの平均粒径は１７４nm でありCFの封入率は７３％であった。
【００７５】
さらに電子顕微鏡による観察を行なった。コロジオン膜付メッシュにリポソーム試料を接触させた後、脱塩水で希釈し、ろ紙で水分を吸着した。直ちに２％酢酸ウラニル染色液に接触し（約１０秒）、再度ろ紙で水分を吸収した。自然乾燥させた後、透過型電子顕微鏡（日立H−９０００NA、１００ｋV、対物絞り３）で観察したところ、図１のＡに見られるように小粒径のリポソームが観察され、３５０ｎｍ以上のリポソームの混在は認められなかった。
【００７６】
対照例１
実施例２の対照例としてトリオレインを含有しない脂質組成で同様にリポソームを作製した。
【００７７】
その結果、リポソームの平均粒径は２３９nm でありCFの封入率は５５％であった。さらに電子顕微鏡で形態を観察したところ、図１のＢに見られるように３５０ｎｍ以上のリポソームの混在が認められた。実施例２および対照例１の結果より、トリオレインを添加することにより、高い封入率でサイズの小さなリポソームが得られることが示された。
【００７８】
実施例３
75mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリカプリリン（Tricaprylin：シグマ社）を添加した脂質混合物を用い、実施例２と同様にしてリポソームを形成し、リポソームの粒径と封入率を測定した。
【００７９】
その結果、粒径は１７８．５nm でありCFの封入率が６５％のリポソームが得られた。
【００８０】
実施例４
75mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリカプリン（Tricaprin：シグマ社）を添加した脂質混合物を用い、実施例２と同様にしてリポソームを形成し、リポソームの粒径と封入率を測定した。
【００８１】
その結果、粒径は１６９．７ nm でありCFの封入率が６５％のリポソームが得られた。
【００８２】
実施例５
75 mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリミリスチン（Trimyristin：シグマ社）を添加した脂質混合物を用い、実施例２と同様にしてリポソームを形成し、リポソームの粒径と封入率を測定した。
【００８３】
その結果、粒径は１７０．５ nm でありCFの封入率が６０％のリポソームが得られた。
【００８４】
実施例６
75 mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリパルミチン（Tripalmitin：シグマ社）を添加した脂質混合物を用い、実施例２と同様にしてリポソームを形成し、リポソームの粒径と封入率を測定した。
【００８５】
その結果、粒径は１７０．５ nm でありCFの封入率が６５％のリポソームが得られた。
【００８６】
実施例７
75 mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol）のPL-M1にトリオレインを総脂質のmol％として0、 1.8、 3.6、7.0、14.0（コレステロールに対するmol％としては0、5.0、10.0、20.0、40.0）混合し、実施例２と同様にしてCF封入リポソームを作成した。得られたリポソームの粒径と封入率を同様に測定した。
【００８７】
その結果を図２に示す。CFの封入率はトリオレインの添加量が総脂質の1.8mol%（コレステロールの５mol％）程度から向上し、総脂質の3.6mol%（コレステロールの10mol%）程度で70%を超えほぼプラトーに達した。リポソームの粒径に関しても総脂質の1.8mol%から14mol％まで200nm未満であった。
【００８８】
この結果より、封入率および粒径の点からトリオレイン量が脂質総量の3.6mol％から7.0mol％が効果を発揮するのに良好であると考えられた。
【００８９】
実施例８
リポソーム構成脂質として、DPPC／コレステロール／MC-DPPE／トリオレイン（１．８：１：０．０５：０．１ モル比）からなる脂質混合物30、45、60、75、90、105 mgを用い実施例１と同様にしてCF封入リポソームを作製した。その結果、CFの封入率は脂質量の増加に従い増加し、７５ｍｇの脂質量まで急激に封入率が増加し、その後の脂質量の増加では封入率の増加の程度はゆるやかであった。脂質量75mg以上では封入率>70%が得られた。一方、トリオレイン不含で同様にして作製したリポソームの場合は、使用する脂質量に従い封入率の増加が見られたものの、トリオレイン含有のものより封入率は低く、脂質量75mgでの封入率は約55％であった。
【００９０】
この結果より、本スケールでの脂質混合物の量は75mgが適していることが明らかとなった。
【００９１】
実施例９
75 mg（総脂質122.6 μmol、DPPC:78.8 μmol,Chol:43.8μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリオレインを添加した脂質混合物を用い、封入する水溶液をシスプラチン水溶液（1.5 mg/mLでPBSに溶解）に変更した以外は実施例1と同様にしてリポソームを作製し、リポソームの粒径を測定した。作製したリポソームとフリーのシスプラチンをNAP-5カラム(Amersham社)により分画した。元のリポソームとリポソーム画分内のシスプラチンの含有量をICP-AES法で、脂質の量をHPLC法（L-Column, THF:AcCN:H2O = 2:1:2 0.1% TFA, 215 nm, 1 mL/min）により定量し、単位脂質当たりのシスプラチンの量を算出することにより封入率を求めた。
【００９２】
その結果、粒径は１３４ nm でありシスプラチンの封入率が７０％のリポソームが得られた。
【００９３】
実施例１０
75 mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリオレインを添加した脂質混合物を用い、封入する水溶液をアラビノースシトシン水溶液（100 mg/mLでPBSに溶解）に変更した以外は実施例1と同様にしてリポソームを作製し、リポソームの粒径を測定した。実施例１と同様にして、フリーのアラビノースシトシンとリポソームを分けた。
【００９４】
アラビノースシトシンの量は、サンプルをSDSで可溶化した後、２７０ nmにおける吸光度を測定することで行なった。また脂質量はリン脂質定量キット（和光純薬）により定量した。
【００９５】
その結果、粒径が１７０ nmで封入率が８０％のリポソームが得られた。
【００９６】
実施例１１
75 mg（総脂質122.1μmol、DPPC:77.2μmol,Chol:42.9μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する4.3μmolのトリオレインを添加した脂質混合物を用い、封入する水溶液をブルーデキストラン水溶液（100mg/mLでPBSに溶解、Pharmacia社）に変更した以外は実施例1と同様にしてリポソームを作製し、リポソームの粒径を測定した。作製したリポソームサンプルをPBSで等倍希釈し、４℃、１５，０００ rpmで一時間遠心した。この遠心後のサンプルの上澄みと元のサンプル内に含まれるブルーデキストランの量を比較することにより封入率を算出した。
【００９７】
その結果、粒径は２３２ nmで、封入率は７２.３％のリポソームが得られた。
【００９８】
実施例１２
1.5 g（総脂質2442μmol、DPPC:1544 μmol, Chol:858 μmol, MC-DPPE 40 μmol）のPL-M1に、コレステロールの10mol%に相当する86 μmolのトリオレインを添加した脂質混合物を20 mLのクロロホルム/ヘキサン 1:1混液に溶解した。この脂質溶液にカルセイン（Calcein）溶液（PBSに溶解した10 ｍM Calcein 4000μLに７０％シュクロース666μLを加えたもの：シュクロースの終濃度１０％）4666mlを添加した。これを55℃の湯浴で温めながら、ホモジナイザーを用いて、出力５で20分間予備乳化を行なった。次に高圧乳化機 (超微粒化卓上実験装置 YSNM-1500-0005、吉田機械興業株式会社)を用いて、吐出圧が30 MPaぐらいになるように調節しながら衝突型ジェネレーターを４回、６回または８回通すことによって一次乳化を行った。
【００９９】
一次乳化産物1 mLずつをサンプリングし、実施例１と同様にしてリポソームの調製を行い、リポソームの粒径と封入率を測定した。4回、6回、8回の処理それぞれにおいて、粒径は117.3 nm、118.8 nm、121.7 nmで、封入率は８２％、72.9％、74.3％のリポソームが得られた。
【０１００】
実施例１３
EPC 4.0mmolとコレステロール2.0mmolおよびトリオレイン0.2mmolをジクロロメタンに溶解後、窒素気流下に乾燥し乾燥脂質混合物を調整した。
【０１０１】
調製した脂質乾固物を、クロロホルム/ヘキサン (1:1、V/V)混液５０mLに溶解した。この脂質溶液に実施例１と同様にして調整したショ糖を含有したCF溶液 11.7ｍｌを添加した。混合した後、高圧乳化機（貫通型ジェネレーター装着ナノマイザー、吉田機械興業製）に３回通すことで１次乳化を行なった。
【０１０２】
その一部を用い、実施例１と同様に２次乳化およびリポソーム化を行なった。
【０１０３】
得られたリポソームの粒径を動的光散乱法により測定したところ１６１．３ｎｍであった。また封入率は７３．４％であった。
【０１０４】
実施例１４
実施例1２で作製したリポソームの10.2 μmol（総脂質量、マレイミド量としては178.2 nmol）にアミノ酸配列GRKKRRQRRRPPQCからなるペプチド（以下TATペプチドと記載する）11.1 nmolを加えて一晩反応させた後、セファロースCL4B（登録商標）カラム（アマシャムバイオサイエンス社）を用いてリポソーム画分を精製した。得られたリポソームの脂質量をリン脂質定量キット（和光純薬）を用いて定量した。リポソームサンプルをDMEM/F12培地で希釈し（脂質濃度として0.125, 0.25, 0.5, 1.0 mg/ml）、ヒト肺癌細胞株（HLC）と37℃で1.5時間インキュベートした。細胞を洗浄後、フローサイトメター（FCM）および共焦点蛍光顕微鏡で細胞を観察した。FCM解析結果を図３に示す。TATを結合していないリポソームは細胞と反応しなかったが、TATを結合したリポソームは細胞と反応していることが確認された。また、同様に共焦点蛍光顕微鏡観察でもTAT非結合リポソームに比べTATリポソームで明らかな細胞との結合が観察され、一部の細胞はTATリポソームを細胞内に取り込んでいる様子が観察された。
【０１０５】
実施例１５
ＣＦに換えて８．６ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン溶液１１．７ｍｌ（リン酸緩衝シュクロース水溶液に溶解）を用いること以外は、実施例１３と同様にしてリポソームを作製した。得られたリポソームは、セファロースＣＬ６Ｂ（登録商標）カラム（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて精製することで非封入のアルブミンを除いた。得られたリポソームの粒径を動的光散乱法で測定したところ平均粒径は１８３ｎｍであった。また、リポソームの一部をＳＤＳ電気泳動に供しＣＢＢで染色した。同様に既知量のアルブミンを電気泳動し検量線を作成し、アルブミン量を定量した。また、脂質量はリン脂質定量キット（和光純薬）を用い定量した。
【０１０６】
その結果、リポソームへの封入率は６９％であった。
【０１０７】
実施例１６
DPPC 1.58mmol、コレステロール878 μmolおよびトリオレイン 88 μmolを添加した脂質混合物を30 mLのクロロホルム/ヘキサン１：１混液に溶解した。
カルボキシメチルセルロース（ICN Biomedicals Inc、Low viscosity）（12.5mg/mlのPBS溶液）６ｍｌにシスプラチン６０ｍｇを添加して加温し溶解した。このシスプラチン/カルボキシメチルセルロース溶液４ｍｌに70％シュクロース666μLを加え薬剤溶液とした。この薬剤溶液を上記脂質溶液に添加し予備乳化を行った後、実施例１２と同様にナノマイザーに６回通すことで一次乳化を行った。得られたエマルジョン用いて、実施例１と同様に２次乳化およびリポソーム化を行った。
【０１０８】
その結果、得られたリポソームの粒径を動的光散乱法により測定したところ163.8 nmであった。また封入率は77.6％であった。
【０１０９】
実施例１７
DPPC ５８ｍｇ、コレステロール１７ｍｇおよびトリオレイン３．９μLにジイソプロピルエーテル１ｍｌを加えた。これにカルセイン溶液２３３μLを添加した。これを６０℃の湯浴で温めながら、実施例１と同様にプローブ型ソニケーター(Branson Sonifier 450)を用いてPower= 1; cycle= 50 %で２０分間超音波照射することで１次乳化を行なった。さらに実施例１と同様に、２次乳化を行ないポソーム形成後、封入率およびリポソームサイズを測定した。
【０１１０】
その結果、封入率は７１％、リポソームサイズは１５６nmであった。
【０１１１】
実施例１８
溶媒をジイソプロピルエーテルとヘキサンの混合溶液（ジイソプロピルエーテル1.5ｍLおよびヘキサン0.2mL）に換えること以外は実施例１７と同様にしてリポソームを作製した。
【０１１２】
その結果、封入率は７７％、リポソームサイズが２３９ｎｍであった。
【０１１３】
実施例１９
溶媒を、ジイソプロピルエーテルにし、高圧乳化装置に5回通すこと以外は実施例１２と同様にしてカルセイン封入リポソームを作製した。
【０１１４】
その結果、得られたリポソームのカルセイン封入率は７０％、サイズは１７５ｎｍであった。
【０１１５】
実施例２０
ネダプラチン（シオノギ製薬：アクプラR）溶液（20 mg/mL：９ｍＭ リン酸、0.13Ｍ ＮａＣｌ、１０％トレハロース溶液（ｐＨ７．４））を用い、高圧乳化装置に5回通すこと以外は実施例１２と同様にして１次乳化を行なった。得られたW／Oエマルジョン１０ｍLを５６ｍＬのリン酸緩衝液（９ｍＭ リン酸、0.13Ｍ ＮａＣｌ、１０％トレハロース溶液（ｐＨ７．４））に加え、乳化した後、５５℃で減圧下に窒素ガスを吹き付けることでリポソームを形成した。
【０１１６】
その結果、得られたリポソームのネダプラチン封入率は７７％、サイズは１３６ｎｍであった。
【０１１７】
実施例２１
分子量５０００のポリエチレングリコールの一方の末端にマレイミド基を、他方の末端にジステアリルフォスファチジルエタノールアミンを結合した化合物（DSPE-050MA）を日本油脂から入手した。DSPE-050MAおよび等モルのTAT（実施例１４に記載）を、１ｍM EDTAを含有した１００ｍMリン酸緩衝液（ｐH6.0）中で反応した。反応液をTLCプレートで展開し（クロロホルム：メタノール ３：１、ヨウ素発色）、マレイミド基にTATが結合した目的物（TAT-PEG-DSPE）がほぼ定量的に生成していることを確認した。TATに換えてシステインを用いることで、同様にマレイミド基にシスチンが結合した目的物（Cys-PEG―DSPE）を作製した。
【０１１８】
実施例２０と同様にして作製したネダプラチン封入リポソームに、TAT-PEG-DSPEあるいはCys-PEG―DSPEを添加し（総脂質の０．０５mol％）、60℃で10分間の加熱を二回繰り返すことでリポソームに組み込んだ。このリポソームに、総脂質の3.4mol％に相当するチオール基を有するＰＥＧ（欧州特許出願公開第５２６７００号明細書に記載）を添加し４℃で一晩反応した。得られたリポソームをセファロースCL-4B（アマシャムバイオサイエンス社）を充填したカラムで精製してネダプラチン封入TAT結合PEGリポソームあるいはネダプラチン封入PEGリポソームを得た。
【０１１９】
両リポソームに対する抗腫瘍活性をヒト肺癌細胞（HLC-1）
を用いて比較した。HLC-1を96 ウェルプレートに播種し、５％牛胎児血清含有培地（DMEM/F-12）で一日培養した後、各リポソームを0.635μＭ、1.25μＭ、2.5μＭ、5μＭ、10μＭ、20μＭのネダプラチン濃度（図４参照）となるように添加した。翌日ネダプラチン入り培地を除去し、ネダプラチンを含有しない培地でさらに５日間培養後MTTアッセイにより生細胞率（％）を測定した。
【０１２０】
その結果、ネダプラチン封入TAT結合PEGリポソームは、ネダプラチン封入PEGリポソームに比べてより強い増殖抑制活性を示すことが明らかになった。
【０１２１】
実施例２２
カルボキシメチルデキストラン（CMD-D40、五徳薬品）（10 mg/mlのPBS溶液）5 ｍｌにシスプラチン50 ｍｇを添加して加温し溶解した。このシスプラチン/カルボキシメチルデキストラン溶液４ｍｌに70％シュクロース666μLを加え薬剤溶液とした。この薬剤溶液を脂質溶液（DPPC 1.58 mmol、コレステロール878 μmol、トリオレイン 88 μmolを30 mLのクロロホルム/ヘキサン１：１混液に溶解）に添加し予備乳化を行った後、実施例２０と同様にリポソーム化を行った。
【０１２２】
その結果、得られたリポソームのシスプラチン封入率は87.9％、サイズは152.4 nmであった。
【０１２３】
実施例２３
1.19 gのＥＰＣ、0.31ｇのコレステロールおよび72μＬのトリオレインに、ジエチルエーテル１５ｍｌおよびジクロロフルオロエタン１５ｍＬを加えた。この脂質溶液に胸腺由来のDNA溶液（Calf Thymas DNA、R&D systems社）（Tris-EDTA (pH 7.4)を溶解した1.0 mg/mL DNA水溶液4ｍLに７０％シュクロース666μLを加え、シュクロースの終濃度を１０％にしたもの）を添加した。室温でバス型ソニケーターを用い軽く超音波処理した後、高圧乳化機を用いて、一次乳化を行った。その内１０ｍＬを５６ｍＬのリン酸緩衝シュクロース水溶液に加え、乳化した後、室温で減圧下に窒素ガスを吹き付けることでリポソームを形成した。その結果、得られたDNAの封入率は67.1 ％、サイズは198.2ｎｍであった。
【０１２４】
これらの結果より、トリオレインを含有するリポソームは、トリオレインを含有しないリポソームに比べて、リポソームの粒径のコントロールが容易であり、リポソーム内腔への水溶性物質の封入率も高いことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明によれば、水溶性物質をリポソームの内腔に封入し、リポソームの粒径が３００ｎｍ以下であるリポソームを提供することができる。
【０１２６】
なお、本出願は、日本特許出願 特願２００３−４００９８６号を優先権主張して出願されたものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性物質を内腔に封入し、粒径が３００ｎｍ以下およびトリグリセロールを含有したリポソーム。
【請求項２】
水溶性物質を内腔に封入し、粒径が２００ｎｍ以下およびトリグリセロールを含有したリポソーム。
【請求項３】
水溶性化合物の内腔への封入率が６０％以上である請求の範囲１または２に記載のリポソーム。
【請求項４】
水溶性化合物の内腔への封入率が７０％以上である請求の範囲１または２に記載のリポソーム。
【請求項５】
水溶性物質が、水溶性低分子化合物、蛋白質、核酸類、多糖類および／または指示薬である請求の範囲１から４のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項６】
水溶性物質が、水溶性低分子化合物および多糖類である請求の範囲１から４のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項７】
水溶性物質が、水溶性低分子化合物である請求の範囲1から４のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項８】
水溶性低分子化合物がネダプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビンまたはAra-Cである請求の範囲５から７のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項９】
多糖類がキトサン誘導体またはカルボキシル基を有する多糖類である請求の範囲５または６に記載のリポソーム。
【請求項１０】
カルボキシル基を有する多糖類がカルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸である請求の範囲９に記載のリポソーム。
【請求項１１】
トリグリセロールがトリオレインである請求の範囲１から１０のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項１２】
リガンドおよび／または水溶性合成高分子を有する請求の範囲１から１１のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項１３】
リガンドを有する請求の範囲１から１１のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項１４】
リガンドがターゲット細胞またはターゲット分子に結合するものである請求の範囲１２または１３に記載のリポソーム。
【請求項１５】
リガンドが抗体または抗体のフラグメントである請求の範囲１２から１４のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項１６】
水溶性合成高分子が、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドン、ビニルピロリドンと無水マレイン酸との共重合体から選ばれる請求の範囲１２に記載のリポソーム。
【請求項１７】
水溶性合成高分子が、ポリアルキレングリコールである請求の範囲１２または１６に記載のリポソーム。
【請求項１８】
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求の範囲１６または１７に記載のリポソーム。
【請求項１９】
リガンドおよび／または水溶性合成高分子がリポソームの外部表面のみに結合している請求の範囲１２から１８に記載のリポソーム。
【請求項２０】
請求の範囲１から１９のいずれかに記載のリポソームを含有する医薬組成物。
【請求項２１】
請求の範囲１から１９のいずれかに記載のリポソームを含有する癌の診断および／または治療剤。
【請求項１】
水溶性物質を内腔に封入し、粒径が３００ｎｍ以下およびトリグリセロールを含有したリポソーム。
【請求項２】
水溶性物質を内腔に封入し、粒径が２００ｎｍ以下およびトリグリセロールを含有したリポソーム。
【請求項３】
水溶性化合物の内腔への封入率が６０％以上である請求の範囲１または２に記載のリポソーム。
【請求項４】
水溶性化合物の内腔への封入率が７０％以上である請求の範囲１または２に記載のリポソーム。
【請求項５】
水溶性物質が、水溶性低分子化合物、蛋白質、核酸類、多糖類および／または指示薬である請求の範囲１から４のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項６】
水溶性物質が、水溶性低分子化合物および多糖類である請求の範囲１から４のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項７】
水溶性物質が、水溶性低分子化合物である請求の範囲1から４のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項８】
水溶性低分子化合物がネダプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビンまたはAra-Cである請求の範囲５から７のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項９】
多糖類がキトサン誘導体またはカルボキシル基を有する多糖類である請求の範囲５または６に記載のリポソーム。
【請求項１０】
カルボキシル基を有する多糖類がカルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸である請求の範囲９に記載のリポソーム。
【請求項１１】
トリグリセロールがトリオレインである請求の範囲１から１０のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項１２】
リガンドおよび／または水溶性合成高分子を有する請求の範囲１から１１のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項１３】
リガンドを有する請求の範囲１から１１のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項１４】
リガンドがターゲット細胞またはターゲット分子に結合するものである請求の範囲１２または１３に記載のリポソーム。
【請求項１５】
リガンドが抗体または抗体のフラグメントである請求の範囲１２から１４のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項１６】
水溶性合成高分子が、ポリアルキレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドン、ビニルピロリドンと無水マレイン酸との共重合体から選ばれる請求の範囲１２に記載のリポソーム。
【請求項１７】
水溶性合成高分子が、ポリアルキレングリコールである請求の範囲１２または１６に記載のリポソーム。
【請求項１８】
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求の範囲１６または１７に記載のリポソーム。
【請求項１９】
リガンドおよび／または水溶性合成高分子がリポソームの外部表面のみに結合している請求の範囲１２から１８に記載のリポソーム。
【請求項２０】
請求の範囲１から１９のいずれかに記載のリポソームを含有する医薬組成物。
【請求項２１】
請求の範囲１から１９のいずれかに記載のリポソームを含有する癌の診断および／または治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５３６４３
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【発行日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５９１８（Ｐ２００５−５１５９１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７６９４
【国際出願日】平成１６年１１月２９日（２００４．１１．２９）
【出願人】（０００００６７２５）三菱ウェルファーマ株式会社 (92)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【発行日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１７６９４
【国際出願日】平成１６年１１月２９日（２００４．１１．２９）
【出願人】（０００００６７２５）三菱ウェルファーマ株式会社 (92)
【Ｆターム（参考）】
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