リポタンパク質中のコレステロールの定量方法及びリポタンパク質中のコレステロール定量装置。
【課題】途中発生する定量を省略し、より少ない工程の定量を行うことが可能なコレステロールの定量方法を提供すること。
【解決手段】上記課題を解決するため、振動反応を利用してなるリポタンパク質中のコレステロールの定量方法とする。なお、この場合において、振動反応は、過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液を、半透膜を介して混合させることにより行う反応であることが好ましい。
【解決手段】上記課題を解決するため、振動反応を利用してなるリポタンパク質中のコレステロールの定量方法とする。なお、この場合において、振動反応は、過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液を、半透膜を介して混合させることにより行う反応であることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコレステロールの定量方法及びその定量をする装置に関し、特にリポタンパク中のコレステロールの定量方法及び定量装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは、血清中ではアポタンパク質と結合し、リポタンパク質として存在している。リポタンパク質は物理的な形状の違いなどにより、カイロミクロン、低密度リポタンパク質（以下「ＬＤＬ」という。）、高密度リポタンパク質（以下「ＨＤＬ」という。）などに分類されている。ＬＤＬは動脈硬化を引き起こす物質の一つとして、一方ＨＤＬは抗動脈硬化作用を示す物質として注目されている。
【０００３】
これまでの各リポタンパク質中のコレステロールの定量として、超遠心法、電気泳動法、換算法、分画沈殿法などがある。しかしながらこれらは簡便な方法としては適当ではない。
【０００４】
一方、コレステロールオキシダーゼ等の酵素を用いた定量法もあり、例えば、コレステロールオキシダーゼを用いてコレステロールを酸化した際に生成する過酸化水素を定量し、それに基づいてコレステロールを定量する方法が下記特許文献１、２に記載されている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−２２４３９７号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１１８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記いずれの技術においても、コレステロールを酸化した際に生成する過酸化水素を定量し、それからコレステロールを定量するという２段階以上の操作が必要となる。
【０００７】
以上本発明は、上記を鑑みコレステロールの定量方法において、途中発生する定量を省略し、より少ない工程の定量を行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は具体的に以下の手段を採用する。
【０００９】
即ち、第一の手段として、本発明に係るリポタンパク質中のコレステロールの定量方法は、振動反応を利用してなることを特徴の一つとする。これまでのコレステロールオキシダーゼを利用した方法では、生成した過酸化水素をカタラーゼで分解させ生成した酸素量を測定するなど最低２段階の操作を必要とした。しかし振動反応を利用したこの方法では酸素量の振動を測定するだけで定量化が可能となる。また少量の試料で測定が可能であるという利点もある。
【００１０】
また、限定されるわけではないが、この手段において、振動反応は、過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液を、半透膜を介して混合させることにより行う反応であることは好ましい態様である。
【００１１】
また、限定されるわけではないが、この手段において、半透膜は、透析膜又はミリポアフィルターであることが好ましい。
【００１２】
また、限定されるわけではないが、本手段において、第一の溶液は、過酸化水素水を０．５重量％以上２．０重量％以下の範囲で含むことが好ましく、第二の溶液は、カタラーゼを０．０１ｍｇ／ｍｌ以上２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含むこと、コレステロールオキシダーゼを０．００００００２ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含むことが好ましい。なお、第一の溶液において、コレステロールは、０．０００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれることが好ましい。これにより、もともと非線型現象である振動反応を直線関係により近似させ、定量化の精度をより高めることができる。
【００１３】
また、限定されるわけではないが、本手段において、コレステロールは、高密度リポタンパク質及び低密度リポタンパク質の少なくとも一方であることが好ましい。
【００１４】
また、第二の手段として、本発明に係るリポタンパク質中のコレステロールの定量方法は、過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液と、を半透膜を介して混合させ、第二の溶液における溶存酸素の濃度変化に基づいて、前記第二の溶液における前記リポタンパク質中に含まれるコレステロールの濃度を算出することを特徴とする。
【００１５】
また、限定されるわけではないが、本手段において半透膜は、透析膜又はミリポアフィルターであることが好ましい。また、本手段においてコレステロールは、高密度リポタンパク及び低密度リポタンパクの少なくとも一方であることが好ましい。
【００１６】
また、限定されるわけではないが、本手段において第一の溶液は、過酸化水素水を０．５重量％以上２．０重量％以下の範囲で含むことが好ましく、コレステロールは、０．０００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれることが好ましい。また、限定されるわけではないが、第二の溶液は、カタラーゼを０．０１ｍｇ／ｍｌ以上２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含むことが好ましく、コレステロールオキシダーゼを０．００００００２ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれることが好ましい。これにより、もともと非線型現象である振動反応を直線関係により近似させ、定量化の精度をより高めることができる。
【００１７】
また、第三の手段として、本発明に係るリポタンパク質中のコレステロールを定量する方法は、過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液を保持する第一の容器と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液を保持すると第二の容器と、第一の容器と第二の容器との間に配置され、前記第一の溶液を前記第二の溶液に浸透させる半透膜と、第二の溶液に浸されるよう配置される酸素電極と、酸素電極に接続される溶存酸素計と、溶存酸素計に接続される情報処理装置と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
以上本発明によると、振動反応を用いて、その溶存酸素濃度を測ることで簡単にコレステロールの定量を行うことができるため、その他途中発生する定量を省略し、より少ない工程の定量を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について図面を用いて説明するが、本発明は多くの異なる態様による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例に限定されるものではない。
【００２０】
本実施形態に係るリポタンパク質中のコレステロールの定量方法は（以下「本定量方法」ともいう。）は、振動反応を利用してなることを特徴の一つとする。具体的に説明すると、本定量方法は、過酸化水素水及びリポタンパク質を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びコレステロール酸オキシダーゼを含む第二の溶液を、半透膜を介して浸透、混合させる方法であることが好ましい。コレステロールはリポタンパク中に存在し、限定されるわけではないが、ＬＤＬであってもＨＤＬであってもよい。
【００２１】
図１に、本実施形態における定量方法の振動反応について説明するための図を示す。図１で示すとおり、半透膜により区切られた容器内の空間の一方に過酸化水素水とリポタンパク質を含む第一の溶液を入れ、他方にカタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを入れた第二の溶液を入れる。すると、第一の溶液における過酸化水素水はゆっくりと半透膜を透過して第二の溶液側に移動する。第二の溶液側では過酸化水素水がカタラーゼと反応し、酸素を発生させる。そして酸素が発生するとコレステロールオキシダーゼがこの酸素を用いてコレステロールを酸化し、過酸化水素水を発生させる。すなわち、この一連の流れが循環過程となり、その過酸化水素水の濃度が振動する振動反応となる。そしてこの場合、第二の溶液中に溶存している酸素（以下「溶存酸素」という。）の濃度を測定すると、溶存酸素の濃度は周期的な振動を示している。特に、カタラーゼ等溶液中に存在する物質の濃度が好ましい範囲にある場合、振動周期がコレステロールの濃度と直線関係となり、この関係を用いてコレステロールの精度良い定量が可能となる。
【００２２】
本定量方法は、第一の溶液と第二の溶液との反応が十分進行し、周期的な振動となった期間における周期を測定し、あらかじめ求めてある周期−コレステロール濃度の関係に基づきコレステロール濃度を求めることで実現できる。周期については、様々な方法で求めることができ、限定されるわけではないが、本実施形態における反応においては周期的に溶存酸素のピークが現れるため（たとえば後述する実験例の図５参照。）、このピークの間隔がほぼ一定になったと思われる期間の周期又はその近傍の期間の平均を算出することで求めることができる。また、周期−コレステロール濃度の関係は、周期とグルタミン酸濃度を対応させたものであり、周期がわかればコレステロールの濃度が分かるものであれば限定されるわけではないが、たとえば検量線であってもよく、データのテーブルであってもよい。また、限定されるわけではないが、周期−コレステロール濃度の関係は、第一および第二の溶液におけるカタラーゼ、コレステロールオキシダーゼの濃度の少なくともいずれかに応じて複数設けられていることが精度を向上させる点においてより好ましい。
【００２３】
第一の溶液において、過酸化水素水の濃度は、０．５重量％以上２．０重量％以下の範囲で含むことが好ましい。この範囲内にすることで、振動反応の周期をより規則的にすることができるとともに、一般的な溶存酸素計の測定可能範囲に収めることができる。また、コレステロールの濃度は、測定対象であって、限定されるわけではないが、概ね、０．０００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれていることが好ましく、より好ましくは０．０００００５ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内である。仮に、測定時において測定対象となるコレステロールの濃度測定の結果において疑問が生じる場合、第一の溶液における溶媒の増量または減量を行って希釈又は濃縮し、コレステロールの濃度を変化させ、測定後この補正を行うことが好ましい。なおここで第一の溶液における溶媒としては、限定されるわけではないが水であることが好ましい。
【００２４】
第二の溶液において、カタラーゼの濃度は、限定されるわけではないが、０．０１ｍｇ／ｍｌ以上２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれていることが好ましく、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌ以上１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲である。また第二の溶液におけるコレステロールオキシダーゼの濃度は、０．００００００２ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲であることが好ましい。カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの濃度を上記望ましい範囲とすると、通常非線形的な反応である振動反応がコレステロールの濃度と直線関係となるため精度が向上する。なお、第二の溶液における溶媒としては、振動反応が可能である限りにおいて限定されるわけではないが水であることが好ましい。
【００２５】
ここで図２に、本実施形態に係るコレステロールの定量方法を実現する定量装置（以下「定量装置」という。）の概略図を示す。図２で示すとおり、本定量装置は、第一の容器１と、第二の容器２と、第一および第二の容器を接続する接続管３と、第一の容器及び第二の容器を仕切る半透膜４とを有している。また、本定量装置は、第一の容器１及び第二の容器２に第一の溶液及び第二の溶液がそれぞれ充填され、振動反応が開始された場合にこの振動反応において存在する溶存酸素を測定するための酸素電極５及びこの酸素電極５に接続された溶存酸素計６と、溶存酸素計に接続された情報処理装置７と、を有して構成されている。
【００２６】
本実施形態における第一の容器１、第二の容器２としては、第一および第二の溶液それぞれとは反応せず、それぞれ安定に保持することができる限りにおいて限定されないが、たとえばガラスであることが好ましい。なお、本実施形態においては、第一の容器１と第二の容器２とを別の容器とし、接続管３で接続する構成としているが、たとえば図３で示すような構成とすることも可能である。図３では、一つの容器を穴のあいた仕切り板で仕切り、仕切り板の穴を半透膜４で覆う構成としている。この結果、図３における定量装置においても第一の容器１と、第二の容器２と、第一および第二の容器を仕切る半透膜４と、を有すると表現することができる。
【００２７】
半透膜４は、溶液における一部の成分は通すが他の成分は通さない性質を有する膜であって、限定されるわけではないが、透析膜、ミリポアフィルターの少なくともいずれかであることが好ましい。なお透析膜の場合、限定されるわけではないがセルロースが好ましい。
【００２８】
酸素電極５は、溶存酸素を測定するために用いられるものであり、第二の溶液側に配置される。酸素電極５は、この電極上で溶存酸素が還元されて水になるときに発生する電子の量に応じ電位を発生させる。酸素電極５の構成は特に限定されず、一般に市販されている周知の酸素電極を用いることができる。
【００２９】
溶存酸素計６は、酸素電極５からの電位の発生を受け、溶存酸素の量を算出するものであり、この機能を有する限りにおいて限定はなく、一般に市販されている周知のものを採用することができる。
【００３０】
情報処理装置７は、溶存酸素計６からの出力を受け、その出力から振動反応の周期を求め、この周期とあらかじめ求めてある周期−コレステロール濃度の関係とを参照し、コレステロールの濃度を算出（定量）する。
【００３１】
情報処理装置７としては、上記機能を奏する限りにおいて限定されるわけではないが、コンピュータのハードディスクなどの記録媒体に記録されたプログラムを実行することで実現できる。図４に、プログラムが実行された場合における情報処理装置７の機能ブロック図を示す。
【００３２】
図４で示すとおり、本情報処理装置７は、プログラムの実行により、溶存酸素計が測定する溶存酸素の濃度に対するデータ（以下「溶存酸素濃度データ」という。）を、その濃度を示した時刻のデータ（以下「時刻データ」という。）とともに順次記録していく溶存酸素データ取得手段７０１と、時刻データと溶存酸素濃度データとの関係に基づいて振動反応の周期を判断する周期判断手段７０２と、コレステロールの濃度と振動反応の周期との関係をあらかじめ記憶してある周期−コレステロール濃度関係記憶手段７０３と、振動反応の周期とコレステロールの濃度と振動反応の周期との関係に基づいてコレステロールの定量を行うコレステロール定量手段７０４と、して機能する。なおこの場合において、上述のように、コレステロールの濃度と振動反応の周期は、カタラーゼやコレステロールオキシダーゼの濃度等によって直線の傾きや直線関係を示す範囲が異なってくるため、周期−コレステロール濃度関係記憶手段７０３は、測定における条件の入力を受付、記憶する機能も有すること、更には、その入力に対応する条件に合致した振動の周期とコレステロールの濃度との関係を読み出せるようにすることが望ましい（もちろん、予め当該条件における関係を記憶しておくことが必要である）。これにより、情報処理装置７は、コレステロール定量装置となる。
【００３３】
以上、本実施形態に係る方法により、より簡便にコレステロールを定量することができる。なお、リポタンパク質中のコレステロールの濃度の定量が可能であり、尿中、血清中の総コレステロール量の定量も可能となる。
【００３４】
（実験例１）
ここで、実際に検量線の作成を行い、上記実施形態に係る方法の有用性について確認した。以下、詳細に説明する。
【００３５】
まず、図２で示す装置を用いた。第一の容器１、第二の容器２及び接続管３はいずれもガラス製の円筒状のものを用い、第一の容器１及び第二の容器２の内径は３ｃｍ、接続管３の内径は１ｃｍとした。半透膜４としては、αセルロース（分画分子量１２，０００〜１４，０００）の透析膜を用いた。
【００３６】
そして、上記第一の容器１には、０．６重量％の過酸化水素水を２０ｍｌ、コレステロールを含む溶液を０．１ｍｌを入れ、第二の容器には、カタラーゼ２．５ｍｇ、コレステロールオキシダーゼ０．００１ｍｇを含む水溶液２５ｍｌを入れた。なお、本実験例ではコレステロールの濃度を調整し、以下の表１に示す４種類の溶液を用意し、そのそれぞれについて測定を行った。なおこの測定では、含まれているコレステロール量がわかっている高密度リポタンパク（ＨＤＬ）を使用した。
【表１】
【００３７】
この結果の振動反応の周期を表１に、図５に、表１における試料溶液番号２の溶存酸素量の時間変化を示す。なお図５中、横軸は時間（時間）を、縦軸は溶存酸素量（ｍｇ／ｌ）をそれぞれ示す。また、図６に、コレステロールの濃度に対する周期の関係を示す。図６中、横軸はコレステロールの濃度を、縦軸は振動の周期を示す。
【００３８】
この結果、振動の周期とコレステロールの濃度との関係は直線によって非常によく説明することができた。特に、本実験例ではコレステロールの濃度は０．００００４ｍｇ／ｍｌ以上０．０００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で非常によく説明できており、この値から概ね０．００００２ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲であれば十分直線によって近似することができると考えられる。
【００３９】
以上、本実験例により所定のカタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの濃度下における周期とコレステロール濃度との関係を予めデータとして記憶しておき、上記所定のカタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの濃度の下で振動反応を行わせ、その周期を求めることで、コレステロールの濃度を定量することができる。
（実験例２）
【００４０】
本実験例では、実験例１と同様の装置を用いた。第一の容器には、コレステロールを含む０．１ｍｌと、１重量％の過酸化水素水２０ｍｌを入れた。また第二の容器には０．００１ｍｇのコレステロールオキシダーゼとカタラーゼ２．５ｍｇのカタラーゼを含む溶液２５ｍｌを入れた。なお、本実験例ではコレステロールの濃度を調整し、以下の表２に示す４種類の溶液を用意し、そのそれぞれについて測定を行った。なおこの測定では、含まれているコレステロール量がわかっている低密度リポタンパク（ＬＤＬ）を使用した。
【表２】
【００４１】
この結果の振動反応の周期を表２に、図７に、表２における試料溶液番号７の溶存酸素量の時間変化を示す。なお図７中、横軸は時間（時間）を、縦軸は溶存酸素量（ｍｇ／ｌ）をそれぞれ示す。また、図８に、コレステロールの濃度に対する周期の関係を示す。図８中、横軸はコレステロールの濃度を、縦軸は振動の周期を示す。
【００４２】
この結果、振動の周期とコレステロールの濃度との関係は直線によって非常によく説明することができた。特に、本実験例ではコレステロールの濃度は０．００００９ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で非常によく説明できており、この値から概ね０．００００５ｍｇ／ｍｌ以上０．０００５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲であれば十分直線によって近似することができると考えられる。
【００４３】
以上、本実験例により所定のカタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの濃度下における周期とコレステロール濃度との関係を予めデータとして記憶しておき、上記所定のカタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの濃度の下で振動反応を行わせ、その周期を求めることで、コレステロールの濃度を定量することができる。
【００４４】
（実験例３）
本実験例は、第二の容器側に蓋をし、過酸化水素水の濃度を１重量％とした以外は実験例１と同じ条件で行った。下記表３に溶液に溶かしたコレステロールの量、濃度及び振動反応の周期を記載する。
【表３】
【００４５】
表３の結果に対し、コレステロールの濃度に対する周期を求めたものを図９に示す。横軸はコレステロールの濃度を、縦軸は振動の周期を示す。この結果、容器に蓋をし、振動の周期とＨＤＬコレステロールの濃度との関係は直線によって非常によく説明することができた。特に、本実施例ではコレステロールの濃度は０．００００４ｍｇ／ｍｌ以上０．０００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で非常によく説明できており、この値から概ね０．００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌの範囲であれば十分直線によって近似することができると考えられる。
【００４６】
（実験例４）
本実験例は、第二の容器側に蓋をした以外実施例２と同じとした。下記表４に、溶液に溶かしたコレステロールの量、濃度及び振動反応の周期を記載する。表４の結果に対し、コレステロールの濃度に対する周期を示したものを図１０に示す。
【表４】
【００４７】
この結果、蓋をし、ＬＤＬを用いた場合であっても振動の周期とＬＤＬコレステロールの濃度との関係は直線によって非常によく説明することができた。特に、０．００００９ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌ以下の本実施例の範囲では非常によい直線性を有しているため、概ね０．００００５ｍｇ／ｍｌ以上０．０００５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲においても、直線性を保つことができると考えられる。
【００４８】
（実験例５）
ここでは、実際の血清を用いて、その量と振動の周期との間に直線性が成り立つかどうか調べた。この測定において、市販のＨｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ（Ｍａｌｅ）を溶かした５種類の試料を用意し、そのそれぞれに対して測定を行った。第１の容器には下記表１で示す血清を含む０．１ｍｌの水溶液と、０．６重量％の過酸化水素水２０ｍｌを加え、第二の容器にはコレステロールオキシダーゼ０．０００１ｍｇを、カタラーゼ２．５ｍｇを含む水溶液２５ｍｌを加えた。表５に溶液に溶かした血清の量及び振動反応の周期を記載する。また図１１に血清の量と周期との関係を図にしたものを示す。
【表５】
【００４９】
この結果、すべてのリポタンパクを含む血清においてもその量が２μｌ以上９μｌ以下の範囲内であれば、周期と量の関係が直線となり、コレステロールの全量が測定可能であることがわかった。
【００５０】
（実験例６）
本実験例では、接続管の内径１ｃｍのガラスセルを用いた以外は実験例１と同様の装置を用いた。第一の容器には、１重量％の過酸化水素水１０ｍｌとコレステロールを含む試料溶液０．１ｍｌを加えた。また第二の容器にはコレステロールオキシダーゼ０．００００１ｍｇ及びカタラーゼ１．０ｍｇを含む水溶液１０ｍｌを加えた。また、本実験例ではコレステロールの濃度を調整し、以下の表６に示す４種類の溶液を用意し、そのそれぞれについて測定を行った。なおこの測定では、含まれているコレステロール量がわかっている高密度リポタンパク（ＨＤＬ）を使用した。なお、この結果、コレステロールの濃度に対する周期を求めたものを図１２に示す。横軸はコレステロールの濃度を、縦軸は振動の周期を示す。
【表６】
【００５１】
この結果、振動の周期とコレステロールの濃度との関係は直線によって非常によく説明することができた。特に、本実施例ではコレステロールの濃度は０．００００００４ｍｇ／ｍｌ以上０．０００００１６ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で非常によく説明できることがわかり、この値から概ね０．００００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．０００００２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲であれば十分よく説明できると考えられる。また内径３ｃｍのセルを用いた場合に比べて周期が短くなることがわかった。
【００５２】
（実施例７）
第一の容器に１重量％の過酸化水素水１０ｍｌ、コレステロールを含む試料溶液０．１ｍｌを加え、第二の容器にコレステロールオキシダーゼ０．００００１ｍｇ及びカタラーゼ１．０ｍｇを含む水溶液１０ｍｌを加えた。また、本実験例ではコレステロールの濃度を調整し、以下の表７に示す４種類の溶液を用意し、そのそれぞれについて測定を行った。なおこの測定では、含まれているコレステロール量がわかっている低密度リポタンパク（ＬＤＬ）を使用した。なおこの結果コレステロールの濃度に対する周期を求めたものを図１３に示す。横軸はコレステロールの濃度を、縦軸は振動の周期を示す。
【表７】
【００５３】
この結果、振動の周期とコレステロールの濃度との関係は直線によって非常によく説明することができた。特に、本実施例ではコレステロールの濃度は０．０００００１８ｍｇ／ｍｌ以上０．０００００４５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で非常によく説明できることがわかり、この値から概ね０．０００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．００００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲であれば十分よく説明できると考えられる。またこの場合にも内径３ｃｍのセルを用いた場合に比べて周期が短くなることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】振動反応の反応機構を示す図。
【図２】コレステロールの定量装置の概略図。
【図３】コレステロール定量装置の他の一例の概略図。
【図４】コレステロール定量装置における情報処理装置の機能ブロック図。
【図５】実験例１における振動反応における溶存酸素量の時間変化を示す図。
【図６】実験例１におけるコレステロール濃度と周期との関係を示す図。
【図７】実験例２における振動反応における溶存酸素量の時間変化を示す図。
【図８】実験例２におけるコレステロール濃度と周期との関係を示す図。
【図９】実験例３におけるコレステロール濃度と周期との関係を示す図。
【図１０】実験例４におけるコレステロール濃度と周期との関係を示す図。
【図１１】実施例５における血清の量と周期との関係を示す図。
【図１２】実施例６におけるコレステロール濃度と周期との関係を示す図。
【図１３】実施例７におけるコレステロール濃度と周期との関係を示す図。
【符号の説明】
【００５５】
１…第一の容器、２…第二の容器、３…連絡管、４…半透膜、５…酸素電極、６…溶存酸素計、７…情報処理装置
【技術分野】
【０００１】
本発明はコレステロールの定量方法及びその定量をする装置に関し、特にリポタンパク中のコレステロールの定量方法及び定量装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは、血清中ではアポタンパク質と結合し、リポタンパク質として存在している。リポタンパク質は物理的な形状の違いなどにより、カイロミクロン、低密度リポタンパク質（以下「ＬＤＬ」という。）、高密度リポタンパク質（以下「ＨＤＬ」という。）などに分類されている。ＬＤＬは動脈硬化を引き起こす物質の一つとして、一方ＨＤＬは抗動脈硬化作用を示す物質として注目されている。
【０００３】
これまでの各リポタンパク質中のコレステロールの定量として、超遠心法、電気泳動法、換算法、分画沈殿法などがある。しかしながらこれらは簡便な方法としては適当ではない。
【０００４】
一方、コレステロールオキシダーゼ等の酵素を用いた定量法もあり、例えば、コレステロールオキシダーゼを用いてコレステロールを酸化した際に生成する過酸化水素を定量し、それに基づいてコレステロールを定量する方法が下記特許文献１、２に記載されている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−２２４３９７号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１１８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記いずれの技術においても、コレステロールを酸化した際に生成する過酸化水素を定量し、それからコレステロールを定量するという２段階以上の操作が必要となる。
【０００７】
以上本発明は、上記を鑑みコレステロールの定量方法において、途中発生する定量を省略し、より少ない工程の定量を行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は具体的に以下の手段を採用する。
【０００９】
即ち、第一の手段として、本発明に係るリポタンパク質中のコレステロールの定量方法は、振動反応を利用してなることを特徴の一つとする。これまでのコレステロールオキシダーゼを利用した方法では、生成した過酸化水素をカタラーゼで分解させ生成した酸素量を測定するなど最低２段階の操作を必要とした。しかし振動反応を利用したこの方法では酸素量の振動を測定するだけで定量化が可能となる。また少量の試料で測定が可能であるという利点もある。
【００１０】
また、限定されるわけではないが、この手段において、振動反応は、過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液を、半透膜を介して混合させることにより行う反応であることは好ましい態様である。
【００１１】
また、限定されるわけではないが、この手段において、半透膜は、透析膜又はミリポアフィルターであることが好ましい。
【００１２】
また、限定されるわけではないが、本手段において、第一の溶液は、過酸化水素水を０．５重量％以上２．０重量％以下の範囲で含むことが好ましく、第二の溶液は、カタラーゼを０．０１ｍｇ／ｍｌ以上２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含むこと、コレステロールオキシダーゼを０．００００００２ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含むことが好ましい。なお、第一の溶液において、コレステロールは、０．０００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれることが好ましい。これにより、もともと非線型現象である振動反応を直線関係により近似させ、定量化の精度をより高めることができる。
【００１３】
また、限定されるわけではないが、本手段において、コレステロールは、高密度リポタンパク質及び低密度リポタンパク質の少なくとも一方であることが好ましい。
【００１４】
また、第二の手段として、本発明に係るリポタンパク質中のコレステロールの定量方法は、過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液と、を半透膜を介して混合させ、第二の溶液における溶存酸素の濃度変化に基づいて、前記第二の溶液における前記リポタンパク質中に含まれるコレステロールの濃度を算出することを特徴とする。
【００１５】
また、限定されるわけではないが、本手段において半透膜は、透析膜又はミリポアフィルターであることが好ましい。また、本手段においてコレステロールは、高密度リポタンパク及び低密度リポタンパクの少なくとも一方であることが好ましい。
【００１６】
また、限定されるわけではないが、本手段において第一の溶液は、過酸化水素水を０．５重量％以上２．０重量％以下の範囲で含むことが好ましく、コレステロールは、０．０００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれることが好ましい。また、限定されるわけではないが、第二の溶液は、カタラーゼを０．０１ｍｇ／ｍｌ以上２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含むことが好ましく、コレステロールオキシダーゼを０．００００００２ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれることが好ましい。これにより、もともと非線型現象である振動反応を直線関係により近似させ、定量化の精度をより高めることができる。
【００１７】
また、第三の手段として、本発明に係るリポタンパク質中のコレステロールを定量する方法は、過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液を保持する第一の容器と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液を保持すると第二の容器と、第一の容器と第二の容器との間に配置され、前記第一の溶液を前記第二の溶液に浸透させる半透膜と、第二の溶液に浸されるよう配置される酸素電極と、酸素電極に接続される溶存酸素計と、溶存酸素計に接続される情報処理装置と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
以上本発明によると、振動反応を用いて、その溶存酸素濃度を測ることで簡単にコレステロールの定量を行うことができるため、その他途中発生する定量を省略し、より少ない工程の定量を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について図面を用いて説明するが、本発明は多くの異なる態様による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例に限定されるものではない。
【００２０】
本実施形態に係るリポタンパク質中のコレステロールの定量方法は（以下「本定量方法」ともいう。）は、振動反応を利用してなることを特徴の一つとする。具体的に説明すると、本定量方法は、過酸化水素水及びリポタンパク質を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びコレステロール酸オキシダーゼを含む第二の溶液を、半透膜を介して浸透、混合させる方法であることが好ましい。コレステロールはリポタンパク中に存在し、限定されるわけではないが、ＬＤＬであってもＨＤＬであってもよい。
【００２１】
図１に、本実施形態における定量方法の振動反応について説明するための図を示す。図１で示すとおり、半透膜により区切られた容器内の空間の一方に過酸化水素水とリポタンパク質を含む第一の溶液を入れ、他方にカタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを入れた第二の溶液を入れる。すると、第一の溶液における過酸化水素水はゆっくりと半透膜を透過して第二の溶液側に移動する。第二の溶液側では過酸化水素水がカタラーゼと反応し、酸素を発生させる。そして酸素が発生するとコレステロールオキシダーゼがこの酸素を用いてコレステロールを酸化し、過酸化水素水を発生させる。すなわち、この一連の流れが循環過程となり、その過酸化水素水の濃度が振動する振動反応となる。そしてこの場合、第二の溶液中に溶存している酸素（以下「溶存酸素」という。）の濃度を測定すると、溶存酸素の濃度は周期的な振動を示している。特に、カタラーゼ等溶液中に存在する物質の濃度が好ましい範囲にある場合、振動周期がコレステロールの濃度と直線関係となり、この関係を用いてコレステロールの精度良い定量が可能となる。
【００２２】
本定量方法は、第一の溶液と第二の溶液との反応が十分進行し、周期的な振動となった期間における周期を測定し、あらかじめ求めてある周期−コレステロール濃度の関係に基づきコレステロール濃度を求めることで実現できる。周期については、様々な方法で求めることができ、限定されるわけではないが、本実施形態における反応においては周期的に溶存酸素のピークが現れるため（たとえば後述する実験例の図５参照。）、このピークの間隔がほぼ一定になったと思われる期間の周期又はその近傍の期間の平均を算出することで求めることができる。また、周期−コレステロール濃度の関係は、周期とグルタミン酸濃度を対応させたものであり、周期がわかればコレステロールの濃度が分かるものであれば限定されるわけではないが、たとえば検量線であってもよく、データのテーブルであってもよい。また、限定されるわけではないが、周期−コレステロール濃度の関係は、第一および第二の溶液におけるカタラーゼ、コレステロールオキシダーゼの濃度の少なくともいずれかに応じて複数設けられていることが精度を向上させる点においてより好ましい。
【００２３】
第一の溶液において、過酸化水素水の濃度は、０．５重量％以上２．０重量％以下の範囲で含むことが好ましい。この範囲内にすることで、振動反応の周期をより規則的にすることができるとともに、一般的な溶存酸素計の測定可能範囲に収めることができる。また、コレステロールの濃度は、測定対象であって、限定されるわけではないが、概ね、０．０００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれていることが好ましく、より好ましくは０．０００００５ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内である。仮に、測定時において測定対象となるコレステロールの濃度測定の結果において疑問が生じる場合、第一の溶液における溶媒の増量または減量を行って希釈又は濃縮し、コレステロールの濃度を変化させ、測定後この補正を行うことが好ましい。なおここで第一の溶液における溶媒としては、限定されるわけではないが水であることが好ましい。
【００２４】
第二の溶液において、カタラーゼの濃度は、限定されるわけではないが、０．０１ｍｇ／ｍｌ以上２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれていることが好ましく、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌ以上１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲である。また第二の溶液におけるコレステロールオキシダーゼの濃度は、０．００００００２ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲であることが好ましい。カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの濃度を上記望ましい範囲とすると、通常非線形的な反応である振動反応がコレステロールの濃度と直線関係となるため精度が向上する。なお、第二の溶液における溶媒としては、振動反応が可能である限りにおいて限定されるわけではないが水であることが好ましい。
【００２５】
ここで図２に、本実施形態に係るコレステロールの定量方法を実現する定量装置（以下「定量装置」という。）の概略図を示す。図２で示すとおり、本定量装置は、第一の容器１と、第二の容器２と、第一および第二の容器を接続する接続管３と、第一の容器及び第二の容器を仕切る半透膜４とを有している。また、本定量装置は、第一の容器１及び第二の容器２に第一の溶液及び第二の溶液がそれぞれ充填され、振動反応が開始された場合にこの振動反応において存在する溶存酸素を測定するための酸素電極５及びこの酸素電極５に接続された溶存酸素計６と、溶存酸素計に接続された情報処理装置７と、を有して構成されている。
【００２６】
本実施形態における第一の容器１、第二の容器２としては、第一および第二の溶液それぞれとは反応せず、それぞれ安定に保持することができる限りにおいて限定されないが、たとえばガラスであることが好ましい。なお、本実施形態においては、第一の容器１と第二の容器２とを別の容器とし、接続管３で接続する構成としているが、たとえば図３で示すような構成とすることも可能である。図３では、一つの容器を穴のあいた仕切り板で仕切り、仕切り板の穴を半透膜４で覆う構成としている。この結果、図３における定量装置においても第一の容器１と、第二の容器２と、第一および第二の容器を仕切る半透膜４と、を有すると表現することができる。
【００２７】
半透膜４は、溶液における一部の成分は通すが他の成分は通さない性質を有する膜であって、限定されるわけではないが、透析膜、ミリポアフィルターの少なくともいずれかであることが好ましい。なお透析膜の場合、限定されるわけではないがセルロースが好ましい。
【００２８】
酸素電極５は、溶存酸素を測定するために用いられるものであり、第二の溶液側に配置される。酸素電極５は、この電極上で溶存酸素が還元されて水になるときに発生する電子の量に応じ電位を発生させる。酸素電極５の構成は特に限定されず、一般に市販されている周知の酸素電極を用いることができる。
【００２９】
溶存酸素計６は、酸素電極５からの電位の発生を受け、溶存酸素の量を算出するものであり、この機能を有する限りにおいて限定はなく、一般に市販されている周知のものを採用することができる。
【００３０】
情報処理装置７は、溶存酸素計６からの出力を受け、その出力から振動反応の周期を求め、この周期とあらかじめ求めてある周期−コレステロール濃度の関係とを参照し、コレステロールの濃度を算出（定量）する。
【００３１】
情報処理装置７としては、上記機能を奏する限りにおいて限定されるわけではないが、コンピュータのハードディスクなどの記録媒体に記録されたプログラムを実行することで実現できる。図４に、プログラムが実行された場合における情報処理装置７の機能ブロック図を示す。
【００３２】
図４で示すとおり、本情報処理装置７は、プログラムの実行により、溶存酸素計が測定する溶存酸素の濃度に対するデータ（以下「溶存酸素濃度データ」という。）を、その濃度を示した時刻のデータ（以下「時刻データ」という。）とともに順次記録していく溶存酸素データ取得手段７０１と、時刻データと溶存酸素濃度データとの関係に基づいて振動反応の周期を判断する周期判断手段７０２と、コレステロールの濃度と振動反応の周期との関係をあらかじめ記憶してある周期−コレステロール濃度関係記憶手段７０３と、振動反応の周期とコレステロールの濃度と振動反応の周期との関係に基づいてコレステロールの定量を行うコレステロール定量手段７０４と、して機能する。なおこの場合において、上述のように、コレステロールの濃度と振動反応の周期は、カタラーゼやコレステロールオキシダーゼの濃度等によって直線の傾きや直線関係を示す範囲が異なってくるため、周期−コレステロール濃度関係記憶手段７０３は、測定における条件の入力を受付、記憶する機能も有すること、更には、その入力に対応する条件に合致した振動の周期とコレステロールの濃度との関係を読み出せるようにすることが望ましい（もちろん、予め当該条件における関係を記憶しておくことが必要である）。これにより、情報処理装置７は、コレステロール定量装置となる。
【００３３】
以上、本実施形態に係る方法により、より簡便にコレステロールを定量することができる。なお、リポタンパク質中のコレステロールの濃度の定量が可能であり、尿中、血清中の総コレステロール量の定量も可能となる。
【００３４】
（実験例１）
ここで、実際に検量線の作成を行い、上記実施形態に係る方法の有用性について確認した。以下、詳細に説明する。
【００３５】
まず、図２で示す装置を用いた。第一の容器１、第二の容器２及び接続管３はいずれもガラス製の円筒状のものを用い、第一の容器１及び第二の容器２の内径は３ｃｍ、接続管３の内径は１ｃｍとした。半透膜４としては、αセルロース（分画分子量１２，０００〜１４，０００）の透析膜を用いた。
【００３６】
そして、上記第一の容器１には、０．６重量％の過酸化水素水を２０ｍｌ、コレステロールを含む溶液を０．１ｍｌを入れ、第二の容器には、カタラーゼ２．５ｍｇ、コレステロールオキシダーゼ０．００１ｍｇを含む水溶液２５ｍｌを入れた。なお、本実験例ではコレステロールの濃度を調整し、以下の表１に示す４種類の溶液を用意し、そのそれぞれについて測定を行った。なおこの測定では、含まれているコレステロール量がわかっている高密度リポタンパク（ＨＤＬ）を使用した。
【表１】
【００３７】
この結果の振動反応の周期を表１に、図５に、表１における試料溶液番号２の溶存酸素量の時間変化を示す。なお図５中、横軸は時間（時間）を、縦軸は溶存酸素量（ｍｇ／ｌ）をそれぞれ示す。また、図６に、コレステロールの濃度に対する周期の関係を示す。図６中、横軸はコレステロールの濃度を、縦軸は振動の周期を示す。
【００３８】
この結果、振動の周期とコレステロールの濃度との関係は直線によって非常によく説明することができた。特に、本実験例ではコレステロールの濃度は０．００００４ｍｇ／ｍｌ以上０．０００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で非常によく説明できており、この値から概ね０．００００２ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲であれば十分直線によって近似することができると考えられる。
【００３９】
以上、本実験例により所定のカタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの濃度下における周期とコレステロール濃度との関係を予めデータとして記憶しておき、上記所定のカタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの濃度の下で振動反応を行わせ、その周期を求めることで、コレステロールの濃度を定量することができる。
（実験例２）
【００４０】
本実験例では、実験例１と同様の装置を用いた。第一の容器には、コレステロールを含む０．１ｍｌと、１重量％の過酸化水素水２０ｍｌを入れた。また第二の容器には０．００１ｍｇのコレステロールオキシダーゼとカタラーゼ２．５ｍｇのカタラーゼを含む溶液２５ｍｌを入れた。なお、本実験例ではコレステロールの濃度を調整し、以下の表２に示す４種類の溶液を用意し、そのそれぞれについて測定を行った。なおこの測定では、含まれているコレステロール量がわかっている低密度リポタンパク（ＬＤＬ）を使用した。
【表２】
【００４１】
この結果の振動反応の周期を表２に、図７に、表２における試料溶液番号７の溶存酸素量の時間変化を示す。なお図７中、横軸は時間（時間）を、縦軸は溶存酸素量（ｍｇ／ｌ）をそれぞれ示す。また、図８に、コレステロールの濃度に対する周期の関係を示す。図８中、横軸はコレステロールの濃度を、縦軸は振動の周期を示す。
【００４２】
この結果、振動の周期とコレステロールの濃度との関係は直線によって非常によく説明することができた。特に、本実験例ではコレステロールの濃度は０．００００９ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で非常によく説明できており、この値から概ね０．００００５ｍｇ／ｍｌ以上０．０００５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲であれば十分直線によって近似することができると考えられる。
【００４３】
以上、本実験例により所定のカタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの濃度下における周期とコレステロール濃度との関係を予めデータとして記憶しておき、上記所定のカタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの濃度の下で振動反応を行わせ、その周期を求めることで、コレステロールの濃度を定量することができる。
【００４４】
（実験例３）
本実験例は、第二の容器側に蓋をし、過酸化水素水の濃度を１重量％とした以外は実験例１と同じ条件で行った。下記表３に溶液に溶かしたコレステロールの量、濃度及び振動反応の周期を記載する。
【表３】
【００４５】
表３の結果に対し、コレステロールの濃度に対する周期を求めたものを図９に示す。横軸はコレステロールの濃度を、縦軸は振動の周期を示す。この結果、容器に蓋をし、振動の周期とＨＤＬコレステロールの濃度との関係は直線によって非常によく説明することができた。特に、本実施例ではコレステロールの濃度は０．００００４ｍｇ／ｍｌ以上０．０００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で非常によく説明できており、この値から概ね０．００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌの範囲であれば十分直線によって近似することができると考えられる。
【００４６】
（実験例４）
本実験例は、第二の容器側に蓋をした以外実施例２と同じとした。下記表４に、溶液に溶かしたコレステロールの量、濃度及び振動反応の周期を記載する。表４の結果に対し、コレステロールの濃度に対する周期を示したものを図１０に示す。
【表４】
【００４７】
この結果、蓋をし、ＬＤＬを用いた場合であっても振動の周期とＬＤＬコレステロールの濃度との関係は直線によって非常によく説明することができた。特に、０．００００９ｍｇ／ｍｌ以上０．０００２ｍｇ／ｍｌ以下の本実施例の範囲では非常によい直線性を有しているため、概ね０．００００５ｍｇ／ｍｌ以上０．０００５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲においても、直線性を保つことができると考えられる。
【００４８】
（実験例５）
ここでは、実際の血清を用いて、その量と振動の周期との間に直線性が成り立つかどうか調べた。この測定において、市販のＨｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ（Ｍａｌｅ）を溶かした５種類の試料を用意し、そのそれぞれに対して測定を行った。第１の容器には下記表１で示す血清を含む０．１ｍｌの水溶液と、０．６重量％の過酸化水素水２０ｍｌを加え、第二の容器にはコレステロールオキシダーゼ０．０００１ｍｇを、カタラーゼ２．５ｍｇを含む水溶液２５ｍｌを加えた。表５に溶液に溶かした血清の量及び振動反応の周期を記載する。また図１１に血清の量と周期との関係を図にしたものを示す。
【表５】
【００４９】
この結果、すべてのリポタンパクを含む血清においてもその量が２μｌ以上９μｌ以下の範囲内であれば、周期と量の関係が直線となり、コレステロールの全量が測定可能であることがわかった。
【００５０】
（実験例６）
本実験例では、接続管の内径１ｃｍのガラスセルを用いた以外は実験例１と同様の装置を用いた。第一の容器には、１重量％の過酸化水素水１０ｍｌとコレステロールを含む試料溶液０．１ｍｌを加えた。また第二の容器にはコレステロールオキシダーゼ０．００００１ｍｇ及びカタラーゼ１．０ｍｇを含む水溶液１０ｍｌを加えた。また、本実験例ではコレステロールの濃度を調整し、以下の表６に示す４種類の溶液を用意し、そのそれぞれについて測定を行った。なおこの測定では、含まれているコレステロール量がわかっている高密度リポタンパク（ＨＤＬ）を使用した。なお、この結果、コレステロールの濃度に対する周期を求めたものを図１２に示す。横軸はコレステロールの濃度を、縦軸は振動の周期を示す。
【表６】
【００５１】
この結果、振動の周期とコレステロールの濃度との関係は直線によって非常によく説明することができた。特に、本実施例ではコレステロールの濃度は０．００００００４ｍｇ／ｍｌ以上０．０００００１６ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で非常によく説明できることがわかり、この値から概ね０．００００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．０００００２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲であれば十分よく説明できると考えられる。また内径３ｃｍのセルを用いた場合に比べて周期が短くなることがわかった。
【００５２】
（実施例７）
第一の容器に１重量％の過酸化水素水１０ｍｌ、コレステロールを含む試料溶液０．１ｍｌを加え、第二の容器にコレステロールオキシダーゼ０．００００１ｍｇ及びカタラーゼ１．０ｍｇを含む水溶液１０ｍｌを加えた。また、本実験例ではコレステロールの濃度を調整し、以下の表７に示す４種類の溶液を用意し、そのそれぞれについて測定を行った。なおこの測定では、含まれているコレステロール量がわかっている低密度リポタンパク（ＬＤＬ）を使用した。なおこの結果コレステロールの濃度に対する周期を求めたものを図１３に示す。横軸はコレステロールの濃度を、縦軸は振動の周期を示す。
【表７】
【００５３】
この結果、振動の周期とコレステロールの濃度との関係は直線によって非常によく説明することができた。特に、本実施例ではコレステロールの濃度は０．０００００１８ｍｇ／ｍｌ以上０．０００００４５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で非常によく説明できることがわかり、この値から概ね０．０００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．００００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲であれば十分よく説明できると考えられる。またこの場合にも内径３ｃｍのセルを用いた場合に比べて周期が短くなることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】振動反応の反応機構を示す図。
【図２】コレステロールの定量装置の概略図。
【図３】コレステロール定量装置の他の一例の概略図。
【図４】コレステロール定量装置における情報処理装置の機能ブロック図。
【図５】実験例１における振動反応における溶存酸素量の時間変化を示す図。
【図６】実験例１におけるコレステロール濃度と周期との関係を示す図。
【図７】実験例２における振動反応における溶存酸素量の時間変化を示す図。
【図８】実験例２におけるコレステロール濃度と周期との関係を示す図。
【図９】実験例３におけるコレステロール濃度と周期との関係を示す図。
【図１０】実験例４におけるコレステロール濃度と周期との関係を示す図。
【図１１】実施例５における血清の量と周期との関係を示す図。
【図１２】実施例６におけるコレステロール濃度と周期との関係を示す図。
【図１３】実施例７におけるコレステロール濃度と周期との関係を示す図。
【符号の説明】
【００５５】
１…第一の容器、２…第二の容器、３…連絡管、４…半透膜、５…酸素電極、６…溶存酸素計、７…情報処理装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
振動反応を利用してなるリポタンパク質中のコレステロールの定量方法。
【請求項２】
前記振動反応は、過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液を、半透膜を介して混合させることにより行う反応である請求項１記載のコレステロールの定量方法。
【請求項３】
前記半透膜は、透析膜又はミリポアフィルターである請求項２記載のコレステロールの定量方法。
【請求項４】
前記第一の溶液は、前記過酸化水素水を０．５重量％以上２．０重量％以下の範囲で含む請求項２記載のコレステロールの定量方法。
【請求項５】
前記第二の溶液は、前記カタラーゼを０．０１ｍｇ／ｍｌ以上２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含む請求項２記載のコレステロールの定量方法。
【請求項６】
前記第二の溶液は、前記コレステロールオキシダーゼを０．００００００２ｍｇ／ｍｌ以上０．０００５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含む請求項２記載のコレステロールの定量方法。
【請求項７】
前記コレステロールは、高密度リポタンパク質及び低密度リポタンパク質の少なくとも一方である請求項１記載のコレステロールの定量方法。
【請求項８】
前記第一の溶液において、前記コレステロールは、０．０００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれる請求項２記載のコレステロールの定量方法。
【請求項９】
過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液と、を半透膜を介して混合させ、
前記第二の溶液における溶存酸素の濃度変化に基づいて、前記第二の溶液における前記リポタンパク質中に含まれるコレステロールの濃度を算出するコレステロールの定量方法。
【請求項１０】
前記半透膜は、透析膜又はミリポアフィルターである請求項９記載のコレステロールの定量方法。
【請求項１１】
前記第一の溶液は、前記過酸化水素水を０．５重量％以上２．０重量％以下の範囲で含む請求項９記載のコレステロールの定量方法。
【請求項１２】
前記第二の溶液は、前記カタラーゼを０．０１ｍｇ／ｍｌ以上２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含む請求項９記載のコレステロールの定量方法。
【請求項１３】
前記第二の溶液は、前記コレステロールオキシダーゼを０．００００００２ｍｇ／ｍｌ以上０．０００５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含む請求項９記載のコレステロールの定量方法。
【請求項１４】
前記コレステロールは、高密度リポタンパク及び低密度リポタンパクの少なくとも一方である請求項９記載のコレステロールの定量方法。
【請求項１５】
前記第一の溶液において、前記コレステロールは、０．０００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれる請求項９記載のコレステロールの定量方法。
【請求項１６】
過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液を保持する第一の容器と、
カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液を保持すると第二の容器と、
前記第一の容器と第二の容器との間に配置され、前記第一の溶液を前記第二の溶液に浸透させる半透膜と、
前記第二の溶液に浸されるよう配置される酸素電極と、
前記酸素電極に接続される溶存酸素計と、
前記溶存酸素計に接続される情報処理装置と、を有するリポタンパク質中のコレステロールを定量する装置。
【請求項１】
振動反応を利用してなるリポタンパク質中のコレステロールの定量方法。
【請求項２】
前記振動反応は、過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液を、半透膜を介して混合させることにより行う反応である請求項１記載のコレステロールの定量方法。
【請求項３】
前記半透膜は、透析膜又はミリポアフィルターである請求項２記載のコレステロールの定量方法。
【請求項４】
前記第一の溶液は、前記過酸化水素水を０．５重量％以上２．０重量％以下の範囲で含む請求項２記載のコレステロールの定量方法。
【請求項５】
前記第二の溶液は、前記カタラーゼを０．０１ｍｇ／ｍｌ以上２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含む請求項２記載のコレステロールの定量方法。
【請求項６】
前記第二の溶液は、前記コレステロールオキシダーゼを０．００００００２ｍｇ／ｍｌ以上０．０００５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含む請求項２記載のコレステロールの定量方法。
【請求項７】
前記コレステロールは、高密度リポタンパク質及び低密度リポタンパク質の少なくとも一方である請求項１記載のコレステロールの定量方法。
【請求項８】
前記第一の溶液において、前記コレステロールは、０．０００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれる請求項２記載のコレステロールの定量方法。
【請求項９】
過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液と、を半透膜を介して混合させ、
前記第二の溶液における溶存酸素の濃度変化に基づいて、前記第二の溶液における前記リポタンパク質中に含まれるコレステロールの濃度を算出するコレステロールの定量方法。
【請求項１０】
前記半透膜は、透析膜又はミリポアフィルターである請求項９記載のコレステロールの定量方法。
【請求項１１】
前記第一の溶液は、前記過酸化水素水を０．５重量％以上２．０重量％以下の範囲で含む請求項９記載のコレステロールの定量方法。
【請求項１２】
前記第二の溶液は、前記カタラーゼを０．０１ｍｇ／ｍｌ以上２ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含む請求項９記載のコレステロールの定量方法。
【請求項１３】
前記第二の溶液は、前記コレステロールオキシダーゼを０．００００００２ｍｇ／ｍｌ以上０．０００５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含む請求項９記載のコレステロールの定量方法。
【請求項１４】
前記コレステロールは、高密度リポタンパク及び低密度リポタンパクの少なくとも一方である請求項９記載のコレステロールの定量方法。
【請求項１５】
前記第一の溶液において、前記コレステロールは、０．０００００１ｍｇ／ｍｌ以上０．００１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で含まれる請求項９記載のコレステロールの定量方法。
【請求項１６】
過酸化水素及びリポタンパク質を含む第一の溶液を保持する第一の容器と、
カタラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む第二の溶液を保持すると第二の容器と、
前記第一の容器と第二の容器との間に配置され、前記第一の溶液を前記第二の溶液に浸透させる半透膜と、
前記第二の溶液に浸されるよう配置される酸素電極と、
前記酸素電極に接続される溶存酸素計と、
前記溶存酸素計に接続される情報処理装置と、を有するリポタンパク質中のコレステロールを定量する装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００８−２５９４２７（Ｐ２００８−２５９４２７Ａ）
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１０２３７１（Ｐ２００７−１０２３７１）
【出願日】平成１９年４月１０日（２００７．４．１０）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１０日（２００７．４．１０）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
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