リンカー
サイトカインレセプターに結合することのできる少なくとも２つのドメインを含む治療用のポリペプチドを開示し、当該ドメインはペプチドリンカーによって連結されており、当該リンカーは任意に堅固なアルファ螺旋領域を含んでいてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも２つのサイトカインレセプターに結合することのできるドメインを含み、当該ドメインがペプチドリンカー分子によって連結されているポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインと呼ばれる成長因子のグループは、多くの様々な細胞性機能に関係している。これらは、非限定的に例示すると、免疫系の変調、エネルギー代謝の調節及び成長及び発達を含む。サイトカインは、標的細胞の細胞表面に表現されたレセプターを介して、それらの効果を仲介する。サイトカインレセプターは、３つの異なるサブグループに分けることができる。タイプ１（成長ホルモン（ＧＨ）ファミリー）レセプターは、それらの細胞外ドメインの末端部分における４つの保存されたシステイン残基、及びＣ末端部分における保存されたＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒモチーフによって特徴づけられる。繰り返されるＣｙｓモチーフは、タイプ２（インターフェロンファミリー）及びタイプＩＩＩ（腫瘍壊死因子ファミリー）にも存在する。
【０００３】
多くのサイトカインドメインが、それらの同族レセプターと、特定の部位を介して相互作用することが知られている。幾つかのサイトカインレセプターは、高親和性ドメイン結合部位及び低親和性結合部位の両方を有する。
【０００４】
例えば、ＧＨの単一分子が２つのレセプター分子（ＧＨＲ）と関係することが知られている（Cuningham等、1991 ; de Vos等、1992; Sundstrom等、1996; Clackson等、1998）。これは、ＧＨ上の２つの独特なレセプター結合部位及び２つのレセプターの細胞外ドメイン上の共通する結合ポケットを介して起こる。ＧＨ分子上の部位１は、部位２より高い結合性を持ち、ＧＨ上の部位１への１つのレセプター結合の後に部位２への第２のレセプターのリクルートが連続するレセプターの二量体化が起こると考えられる。ＧＨＲの細胞外ドメインは、各々が約１００アミノ酸である２つの連結したドメインとして存在する。三量体複合体ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲの形成を伴うホルモン結合で起こるのは、これら２つのドメインにおける構造変化である。ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲ複合体の内在化の後にリサイクル段階が続き、それによりレセプター分子が再生されて、細胞内での更なる用途に供される。
【０００５】
サイトカイン及び他のドメインは、結合時にしばしばレセプター−ドメイン複合体を形成する。複合体形成に関係するレセプターは、同種でも異種でもよい。例えば、エリスロポエチン及びＧＨは、三量体のレセプター−ホルモン−レセプター複合体を形成する。インターロイキン−４は、三量体のレセプター−ホルモン−異なるレセプターの複合体を形成する。腫瘍壊死因子は、細胞膜貫通腫瘍壊死因子レセプター；ＴＮＦ−１／ｐ５５又はＴＮＦ−２／ｐ７５の同型三量体の形成を介してシグナル伝達する。他のサイトカイン、例えばレプチン及びＧＣＳＦは、四量体のレセプター−ホルモン−ホルモン−レセプター複合体を形成し、他のもの（例えば、インターロイキン６）は、２つの可溶性レセプター分子、２つの膜貫通レセプター分子及び２つのサイトカイン分子の六量体の複合体を形成すると思われる。何れの場合も、サイトカインをレセプター複合体に配置させる主要な高親和性結合部位、及び構造の変化又は他の分子のリクルートにおいて二次的な役割を果たすことによりシグナル伝達を開始させる付加的な結合部位が存在する。
【０００６】
サイトカインのＴＮＦスーパーファミリーは、リンパ系、乳房、神経系及び外胚葉組織の発生、組織化及び恒常性を調節する細胞生存、死亡及び分化のためのシグナル伝達を活性化する。ＴＮＦは、宿主保護において実証された役割を有し、そのような役割は、例えば、脾臓細胞分化、完全なＩｇＧ応答及びアイソタイプスイッチング、マクロファージの活性化、一酸化窒素及び活性酸素ラジカルの生成を含む。しかし、ＴＮＦは、過剰発現された場合には病原にも関与している。そのような関与の証拠は、次の病状において見いだされている：即ち、細菌性敗血症、移植片対宿主疾患、脳マラリア、関節リウマチ、円形脱毛症、喘息、癌、クローン病、糖尿病、肥満症、乾癬及び乾癬性関節炎、サルコイドーシス、強皮症及び毒性ショック症候群である。これらの病状は、抗−ＴＮＦ薬の適用に関して確立された及び／又は可能性のある病状として認められている。
【０００７】
サイトカインの過剰発現は、一連のヒト疾患、例えば、末端肥大症；巨人症；ＧＨ欠乏症；ターナー症候群；腎不全；骨粗鬆症；骨関節炎；真性糖尿病；癌；肥満；インシュリン抵抗性；高脂血症；高血圧症；貧血；自己免疫性及び感染性疾患；関節リウマチを含む炎症性疾患の原因となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
サイトカイン、例えばＧＨ、プロラクチン又はＴＮＦの作用を阻害する方法は、アンタゴニストの投与である。
【０００９】
ＧＨアンタゴニストの一例はペグヴィソマント(Pegvisomant)であり、それはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に被覆された修飾されたＧＨ分子である。ペグヴィソマントは、幾つかの有利な効果を有し、それは例えば、有効分子量の増大による糸球体濾過速度の低下を含み、それにより所望の効果を生ずるために必要な投与量が低減される［（Abuchowski等, J. Biol. Chem. 252, 3578-3581, (1977)参照］。しかしながら、ＰＥＧ化(pegylation)の結果、修飾されたＧＨ分子のＧＨＲへの親和性が低下する。
【００１０】
プロラクチンアンタゴニストに例はＷＯ０３／０５７７２９に開示されている（その全体、より詳細には前記プロラクチンアンタゴニストをコードするヌクレオチド及びタンパク質配列を、参考として取り入れるものとする）。プロラクチンアンタゴニストは、ヒトのプロラクチンアミノ酸配列に対する修飾を含み、それは位置１２９のグリシン残基のアルギニン残基での置換である。修飾されたプロラクチンタンパク質は、プロラクチンレセプター活性化の阻害剤として作用する。
【００１１】
ＴＮＦを阻害するための多くの治療的戦略が、ｉ）（例えば、阻害性サイトカイン、ＩＬ−１０；サリドマイド、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ；アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた）ＴＮＦ合成の阻害；ｉｉ）ＴＮＦプロセシングの阻害（例えば、メタロプロテアーゼ（ＴＡＣＥ）阻害剤）；ｉｉｉ）（例えば、可溶性ＴＮＦレセプター又はＴＮＦの抗体を用いて）ＴＮＦの中和ができることに基づいて開発されている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
我々は、サイトカインレセプターの複数のリガンド結合ドメインを含むポリペプチド及びサイトカイン活性化に媒介されるレセプターの改変におけるそれらの使用を記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の一態様によると、サイトカインレセプターに結合することができる少なくとも２つのサイトカイン結合ドメインを含み、前記ドメインが不撓性の螺旋領域を含むペプチドリンカー分子によって連結されたポリペプチドが提供される。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは、前記サイトカインレセプター（類）アンタゴニストとして作用する。あるいは、前記ポリペプチドはアゴニストとして作用する。好ましくは、ポリペプチドは、直列（タンデム：tandem)に配列したドメインを含む。好ましい実施態様では、ポリペプチドは、直列に配列した２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の結合ドメインを含む。
【００１５】
本発明のさらに好ましい実施態様では、ポリペプチドは、直列に配列した１０を超えるドメインを含む。
好ましくは、不撓性の螺旋領域は、モチーフＡ(ＥＡＡＡＫ)ＸＡ又はその機能的変異体のコピーを少なくとも１つ含む。好ましくは、ペプチドリンカー分子は、モチーフＥＡＡＡＫの2つのコピーを含み、ペプチドリンカー分子の長さは、少なくとも１つのアミノ酸の増加的付加によって延長可能である。
【００１６】
「機能的変異体」とは、１又はそれ以上の置換、付加、欠失、によってアミノ酸配列が相違していてもよいが、実質的に螺旋又は非−螺旋構造を保持しているリンカー分子である。好ましい変異体は、保存的アミノ酸置換によって参照アミノ酸配列から変化したものである。そのような置換は、与えられたアミノ酸を、特徴の類似した他のアミノ酸で置換するものである。次の非限定的なアミノ酸のリストは保存的置換（類似）と考えられる：ａ）アラニン、セリン、及びスレオニン；ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；ｃ）アスパラギン及びグルタミン；ｄ）アルギニン、リジン及びヒスチジン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニン及びバリン；及びｆ）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン。最も好ましいのは、可撓性又は不撓性螺旋リンカー領域を実質的に維持するアミノ酸置換である。
【００１７】
本発明の更に好ましい実施態様では、リンカー分子は、少なくとも１つの可撓性の非螺旋領域を含む。
不撓性の螺旋領域を与えることにより、上記したように、ドメインの空間的な離間が維持されるが、可撓性の非螺旋領域を与えることにより、ドメインがサイトカインレセプター（類）の結合部位に配向することが可能になる。
【００１８】
本発明の一実施態様では、可撓性の非螺旋領域が、ペプチドリンカー分子のアミノ末端又はその近傍に位置しており、それにより、ペプチドリンカー分子のアミノ末端に位置する結合ドメインが、その同族のレセプターに関して配向することが可能となる。
本発明の更なる実施態様では、可撓性の非螺旋領域が、ペプチドリンカー分子のカルボキシル末端又はその近傍に位置しており、それにより、ペプチドリンカー分子のカルボキシル末端に位置する結合ドメインが、その同族のレセプターに関して配向することが可能となる。
【００１９】
本発明の更に別の実施態様では、可撓性の非螺旋領域が、ペプチドリンカー分子のアミノ及びカルボキシル末端又はその近傍に位置しており、それにより、ペプチドリンカー分子のアミノ及びカルボキシル末端に各々位置する結合ドメインが、その同族のレセプターに関して配向することが可能となる。
好ましくは、可撓性の非螺旋領域は、結合ドメインの少なくとも１つに隣接して位置している。より好ましくは、可撓性の非螺旋領域は、結合ドメインと不撓性螺旋領域との間の連結部を形成する。
更により好ましくは、不撓性の螺旋領域は、モチーフＡ(ＥＡＡＡＫ)ＸＡのコピーを少なくとも１つ含む。不撓性の非螺旋領域の長さは、このモチーフＡ(ＥＡＡＡＫ)ＸＡの繰り返し数の増加によって延長可能である。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様では、Ａ(ＥＡＡＡＫ)ＸＡにおけるｘは１０コピー未満である。更により好ましくは、ｘは５コピー未満である。更により好ましくは、ｘは１、２、３、４又は５コピーから選択される。
本発明の好ましい実施態様では、堅固なアルファ螺旋リンカーと結合ドメインとの間に可撓性の結合は無く、前記結合ドメインは不撓性のアルファ螺旋リンカーによって直接連結される。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様では、前記結合ドメインは、不撓性アルファ螺旋からなる連結分子によって連結されている。
本発明の好ましい実施態様では、前記螺旋分子は、１つの結合ドメインのカルボキシル末端を第２の結合ドメインのアミノ末端と連結する。
【００２２】
本発明のこの実施態様において、螺旋リンカーは、第１の第一のサイトカイン分子のＣ末端螺旋と第２のサイトカイン分子のＮ末端螺旋との間で連続しており、それにより２つのサイトカイン結合ドメインを実質的に固定された方向で堅固に連結している。例えば、このことは、第１のサイトカインドメインからの短いＮ末端及び螺旋後Ｃ末端領域、及び、第２のサイトカインからの短い螺旋前Ｎ末端領域の欠失を含む（即ち、第１のサイトカインからの残基１８２−１９０、及び第２のサイトカインからの残基１−５であり、これらは、第１のサイトカインにおけるＣ末端螺旋（例えば、図１Ｂにおける螺旋４）の後、及び第２のサイトカインのＮ末端螺旋（図１Ｂにおける螺旋１’）の前のランダムコイル構造の短い領域だからである）。
【００２３】
異なる構造において、この固定された方向（並進及び回転の両方で）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の付加的アミノ酸の挿入、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のアミノ酸の欠失により変化させ、新規な特性、例えばアンタゴニスト特性を持つ分子を生成させることができる。余分なアミノ酸の付加は、２つのドメインの約１．５Åまでの相対的並進、及び螺旋軸周囲での２つのドメインの約＋１００°の回転を生じさせる。典型的には、リンカーは、２つのＥＡＡＡＫユニットで始まり、Ａ、ＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡＡＡ、ＥＡＡＡＡ及びＥＡＡＡＡＫ配列の付加によって伸長する。
【００２４】
本発明の更に好ましい実施態様では、ポリペプチドの結合ドメインは互いに同一又は類似である。
本発明の更にまた好ましい実施態様では、ポリペプチドは、成長ホルモン；レプチン；エリスロポエチン；プロラクチン；インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のサブユニットｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；カージオトロフィン(cardiotrophin)（ＣＴ−１）；白血球阻害因子（ＬＩＦ）；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターフェロン、ＩＦＮα及びＩＮＦβ；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α及びＴＮＦβ、及びＲＡＮＫリガンドからなる群から選択されるサイトカインの結合ドメインを含む。
【００２５】
本発明の更に好ましい実施態様では、ドメインの少なくとも１つが、成長ホルモン結合ドメインを含む。
本発明の更に好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは、少なくとも２つの成長ホルモン、又は成長ホルモン変異体ポリペプチドの結合ドメインを含む。
【００２６】
修飾したＧＨ変異体は、米国特許第５,８４９,５３５号に開示されており、それを参考として取り入れるものとする。ＧＨに対する修飾は、部位１及び部位２の結合部位である。部位１への修飾は、野生型ＧＨに比較して高いＧＨＲに対する親和性を持つＧＨ分子を生成する。これらの修飾ＧＨ分子はアゴニストとして作用する。部位２の修飾も開示されており、それはＧＨアンタゴニストの生成をもたらす。部位１についてのＧＨの結合親和性を変化させる修飾の更なる例は、米国特許第５,８５４,０２６号；米国特許第６,００４,９３１号；米国特許第６,０２２,７１１号；及び米国特許第６,１３６,５６３号に開示されており、それら各々を参考として取り入れるものとする。部位２の修飾も開示されており、特にＧＨにおけるアミノ酸残基Ｇ１２０が、アルギニン、リジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、又はグルタミン酸に修飾されると、アンタゴニスト特性を持つＧＨ分子が生成される。
【００２７】
我々の係属中の出願ＷＯ０３／０７０７６５において、参考として取り入れるが、我々は、ＧＨレセプター活性化に対してアンタゴニスト活性を持つＧＨ変異体の融合を記載した。ＧＨ変異体を、成長ホルモンレセプターの細胞外ドメインに可撓性リンカーを介して融合した。このキメラポリペプチドは、遅いクリアランス及びアンタゴニスト活性を示した。類似のキメラポリペプチドであるが、不撓性又は部分的可撓性のリンカーのものの提供も、本明細書に開示する本発明の範囲内にある。
【００２８】
これに代わる本発明の好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは、少なくとも２つのプロラクチン、又はプロラクチン変異体の結合ドメインを含む。
本発明の好ましい実施態様では、前記プロラクチン変異体ポリペプチドはアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列はヒトプロラクチンの位置１２９で修飾されている。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様では、前記修飾はアミノ酸置換である。好ましくは、前記置換は、グリシンアミノ酸残基をアルギニンアミノ酸残基で置き換えるものである。好ましくは、前記修飾は、少なくとも９、１０、１１、１２、１３又は１４末端アミノ酸残基の欠失を更に含む。
これに代わる本発明の実施態様では、ポリペプチドの結合ドメインは互いに類似していない。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは、成長ホルモン結合ドメインである第１の結合ドメイン及びプロラクチン結合ドメインである第２の結合ドメインを含む。
好ましくは、前記ポリペプチドは、成長ホルモン結合ドメイン及びプロラクチン結合ドメインからなる。
【００３１】
これに代わる本発明の好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは、修飾された成長ホルモン結合ドメインである第１の結合ドメイン及び修飾されたプロラクチン結合ドメインである第２の結合ドメインを含む。
好ましくは、前記ポリペプチドは、修飾された成長ホルモン結合ドメイン及び修飾されたプロラクチン結合ドメインからなる。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様では、前記修飾された成長ホルモン結合ドメインは、グリシン１２０のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。好ましくは、前記修飾は、グリシン１２０の、アルギニン、リジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、又はグルタミン酸から選択されるアミノ酸での置換である。
本発明の好ましい実施態様では、前記修飾は、グリシン１２０のアルギニンアミノ酸残基での置換である。
【００３３】
本発明の更に好ましい実施態様では、前記修飾されたプロラクチン結合ドメインは、グリシン１２９の修飾を含む。好ましくは、前記修飾は、グリシン１２９のアルギニンアミノ酸残基での置換である。好ましくは、前記修飾は、９、１０、１１、１２、１３又は１４アミノ末端アミノ酸残基の欠失を更に含む。
【００３４】
本発明の更に好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは、サイトカインレセプターのリガンド結合ドメインを更に含む。好ましくは、前記レセプターは成長ホルモンレセプターである。これに代わる本発明の好ましい実施態様では、前記レセプターはプロラクチンレセプターである。
本発明の好ましい実施態様では、前記リガンド結合ドメインは、不撓性の螺旋領域を含む又はそれからなるリンカーによって、前記サイトカイン結合ドメインに連結されてもよい。
【００３５】
本発明の更なる態様では、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。
本発明の好ましい実施態様では、前記核酸分子は、前記ポリペプチドの発現のために適合されたベクターである。
典型的には、その適合は、細胞／組織特異的発現を媒介する転写調節配列（プロモータ配列）の提供を含む。これらのプロモータは、細胞／組織特異的、誘導性又は構造性であってよい。
【００３６】
プロモータは、この分野で認められた用語であり、明確にするために以下の特徴を含むが、これらは例示するためだけに与えるものである。エンハンサー要素はｃｉｓ作用性核酸配列であり、遺伝子の転写開始部位の５’に多く見られる（エンハンサーは、遺伝子配列の３’にも見られ、又は隣接配列に位置することもある、従って位置独立的である）。エンハンサーは、エンハンサーが結合した遺伝子の転写速度を向上させるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサー要素に特異的に結合することが示されたｔｒａｎｓ作用性転写因子（ポリペプチド）に依存する。転写因子（David S LatchmanによるEukaryotic Transcription Factors, Academic Press Ltd, San Diego参照）の結合性／活性は、環境的合図の数に依存し、それは、例えば、中間的代謝物（例えばグルコース）、環境的エフェクター（例えば熱）を含む。
【００３７】
またプロモータ要素は、いわゆるＴＡＴＡボックス及びＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列を含み、それは転写開始の部位を選択するよう機能する。これらの配列は、ポリペプチドにも結合し、それは、中でも、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を促進するように機能する。
適合は、選択可能なマーカー及び自律的複製配列の提供を含み、それらは共に真核ま原核細胞におけるベクターの維持を促進する。自律的に維持されるベクターは、エピソーマルベクターと呼ばれる。
【００３８】
ベクターにコードされる遺伝子の発現を促進する適合は、転写停止／ポリアデニル化配列の提供を含む。これはまた、２又は多−シストロン発現カセットに配列されたベクターにコードされる遺伝子の発現を最大化するように機能する内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）の提供を含む。
【００３９】
これらの適合は、当該分野で良く知られている。発現ベクター構築及び組換えＤＮＡ技術一般に関するかなりの数の文献が出版されている。Sambrook等, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY 及びそれらの参考文献；Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol III IRL Press, Oxford UK； DNA Cloning: F M Ausbel等, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照されたい。
【００４０】
本発明のベクターが、遺伝子治療ベクターでありうることは当業者には明らかであろう。遺伝子治療ベクターは、典型的にはウイルスベクターである。多くのウイルスが、外来遺伝子の輸送のためのベクターとして共通して使用されている。共通して使用されるベクターは、組換え的に修飾されたエンベロープ又は非エンベロープＤＮＡ及びＲＮＡウイルスを含み、好ましくはバキュロウイルス、パルボウイルス、ピコルノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、又はピコルナウイルスから選択される。キメラベクターも用いることができ、それらは親ベクターの各特性の有利な要素を活かしている（例えば、Feng, 等 (1997) Nature Biotechnology 15: 866-870参照）。それらのベクターは、野生型でも、組換えＤＮＡ技術により修飾され、複製不全、条件的複製又は複製コンピテントとされていてもよい。
【００４１】
好ましいベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びレトロウイルスゲノムから誘導される。本発明の最も好まし実施形態では、ベクターは、ヒトアデノウイルスゲノムから誘導される。特に好ましいベクターは、ヒトアデノウイルスの血清型２又は５から誘導される。そのようなベクターの複製能力は、Ｅ１ａ及び／又はＥ１ｂコード化領域のおける修飾又は欠失によって（「複製不全」と考えられる点まで）弱めてよい。特別な発現特性を達成し、又は複製管理又は低免疫反応を許容するためのウイルスゲノムに対する他の修飾は好ましい。
【００４２】
あるいは、ウイルスベクターは、条件的複製又は複製コンピテントであってよい。条件的複製ウイルスベクターは、不都合な広い範囲の感染を回避して特定の細胞型における選択的発現を達成するために使用される。条件的複製ベクターの例は、Pennisi,E. (1996) Science 274: 342-343; Russel, and S.J. (1994) Eur. J. of Cancer 30A(8): 1165-1171に記載されている。選択的複製ベクターの他の例は、ウイルスの複製に必要な遺伝子がプロモータの制御下にあり、そのプロモータが特定の細胞型又は細胞状態においてのみ活性であるため、そのような遺伝子の発現が無ければウイルスが複製されないベクターを含む。そのようなベクターの例は、１９９７年１２月１６日発行のHenderson等, 米国特許第５,６９８４４３号、１９９９年２月１６日発行のHenderson等, 米国特許第５,８７１,７２６号に記載されており、それらの全教示を参考として本明細書に取り入れるものとする。
【００４３】
さらに、ウイルスゲノムは、或る条件下でのみ複製又は発現を達成する誘導プロモータを含むように修飾してもよい。誘導プロモータの例は、化学文献（例えば、Yoshida及びHamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230: 426-430; Iida等 (1996) J. Virol. 70(9): 6054-6059; Hwang等 (1997) J. Virol 71(9): 7128-7131; Lee等 (1997) Mol. Cell Biol. 17(9): 5097-5105;及びDreher等 (1997) J. Biol. Chem. 272(46); 29364-29371）において知られている。
【００４４】
また、ベクターは非−ウイルス性でもよく、当業者が容易に利用できる多くの商業的供給源から入手可能である。例えば、ベクターはエピソーマル又はインテグレーティングであるプラスミドであってもよい。
【００４５】
本発明の更なる態様では、本発明の核酸又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされた細胞が提供される。
本発明の好ましい実施態様では、前記細胞は真核細胞である。
好ましくは、前記真核細胞は、真菌細胞、例えば、Saccharomyces cervisiae, Pichia spp；粘菌（例えば、Dictyostelium spp）；昆虫細胞（例えば、Spodoptera frugiperda）；植物細胞、又は哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）からなる群から選択される。
これに代わる本発明の好ましい実施態様では、前記細胞は原核細胞である。
【００４６】
本発明の更なる態様では、本発明のポリペプチドを製造する方法が提供され、前記方法は、
ｉ）本発明の細胞を、本発明のポリペプチドの製造を導く条件下で成長させる工程、及び、
ｉｉ）細胞、又は成長環境からポリペプチドを単離する工程を含む。
【００４７】
本発明の好ましい方法では、前記ポリペプチドは、親和性タグとともに提供される。
親和性タグは、当該分野で知られており、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、カルモジュリン結合タンパク質、及びポリヒスチジントラックのタンパク質への加工を含み、それは次いでニッケル含有マトリクス上での親和性精製によって精製される。多くの場合、商業的に入手可能なベクター及び／又はキットは、対象とするタンパク質を適切な親和性タグに融合するために使用でき、それは次いで発現、それに続く親和性マトリクスでの抽出及び精製のために宿主細胞にトランスフェクトされる。
【００４８】
我々の係属中の出願、ＷＯ０３／０３４２７５において、その内容を参考として取り入れるが、我々は、ポリペプチドへのグリコシルホスファチジルイノシトールの付加を制御するシグナル配列を含むドメインをル要するポリペプチドのための新規な親和性タグを記載している。グリコシルホスファチジルイノシトールタグを含むポリペプチドは、優先的に脂質膜に挿入され、サイトカインレセプター活性化に対してアンタゴニスト的な効果を有する。従って、本明細書に開示される本発明は、結合したグリコシルホスファチジルイノシトール分子を持つポリペプチドを含む。
【００４９】
本発明の更なる態様では、第２のサイトカイン結合ドメインに連結された第１のサイトカイン結合ドメインを含むポリペプチドが提供され、前記ポリペプチドはサイトカインレセプターの細胞外ドメインを更に含む。
本発明の好ましい実施態様では、前記第１及び第２の結合ドメインは、可撓性のリンカー分子で連結されている。
【００５０】
これに代わる本発明の実施態様では、前記第１及び第２の結合ドメインは、不撓性の螺旋領域を含むペプチドリンカー分子で連結されている。
本発明の好ましい実施態様では、前記第１及び第２の結合ドメインは、不撓性の螺旋領域及び可撓性の非螺旋領域を含むペプチドリンカー分子で連結されている。
【００５１】
不撓性の螺旋領域及び不撓性螺旋領域と可撓性非螺旋領域の組み合わせを含むペプチドリンカーは上記で既に記載しており、既に特定したようにサイトカイン及びサイトカインレセプターである場合、本発明のこの実施態様に適用可能である。
本発明の好ましい実施態様では、サイトカインレセプターの細胞外ドメインが、リンカー分子を介して第１間第２のサイトカイン結合ドメインに連結される。好ましくは、前記リンカー分子は、不撓性の螺旋領域を含む。
【００５２】
これに代わる本発明の好ましい実施態様では、前記リンカー分子は可撓性である。
好ましくは、前記リンカー分子は、不撓性の螺旋領域及び可撓性の非螺旋領域を含む。
本発明の好ましい実施態様では、前記サイトカイン結合ドメインは、成長ホルモン、又はその成長ホルモン変異体であり、前記細胞外ドメインは、成長ホルモン細胞外ドメインである。好ましくは、前記ドメインはヒトである。
【００５３】
本発明のポリペプチドは２つの機能を示す。第一に、サイトカイン又はその一部を含む第１及び第２のドメインは、好ましくは不撓性螺旋領域を含むペプチドリンカー分子によって連結されており、細胞表面サイトカインレセプターに結合することができ、これらのレセプターの結合をレセプター複合体で立体的に妨害するため、下流の細胞シグナル伝達を防止する。第二に、サイトカインレセプター又はその一部を含む第３のドメインを提供することは、可溶性レセプターとして機能することが可能であり、よって、それが細胞表面レセプターに結合する前に、任意のサイトカインを連結する。この第３のドメインは、好ましくは第１又は第２のドメインと、不撓性螺旋領域を含むペプチドリンカー分子によって連結される。これに代わる本発明の実施態様では、第３のドメインは、好ましくは第１又は第２のドメインと、可撓性の非螺旋領域を含むペプチドリンカーによって連結される。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様では、前記ペプチドリンカー分子は、タンパク質分解的解裂に感受性のアミノ酸配列を更に含む。
本発明の更なる態様では、本発明のポリペプチド又は核酸分子の医薬としての使用が提供される。
好ましくは、本発明のポリペプチド又は核酸分子を含む医薬組成物が提供される。好ましくは、前記医薬組成物は、キャリア、賦形剤、及び／又は希釈剤を含む。
【００５５】
投与されるとき、本発明の治療用組成物は、製薬的に許容される製剤で投与される。「製薬的に許容される」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害しない非毒性の材料を意味する。そのような製剤は、通常、塩、緩衝剤、適合性キャリア、防腐剤及び任意の他の治療剤を含む。
【００５６】
医薬において使用される場合、塩は製薬的に許容されなけらばならないが、非製薬的に許容される塩を、便宜的に製薬的に許容される塩の調製に使用してもよく、本発明の範囲から除外されるものではない。薬理学的及び製薬的に許容される塩は、限定されないが、以下の三から調製されるものを含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、等。また、製薬的に許容される塩は、ナトリウム、カリウム又はカルシウム塩などの、アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩として調製することもできる。
【００５７】
医薬組成物は、適切な緩衝剤を含有してもよく、酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、及びリン酸塩を含む。
組成物は、所望される場合は、製薬的に許容されるキャリアと混合してもよい。「製薬的に許容されるキャリア」という用語は、本明細書において、ヒトへの投与に適した１又はそれ以上の適合性固体又は液体フィラー、希釈剤又はカプセル化物質を意味する。「キャリア」という用語は、適用性を向上させるために活性成分と混合される、有機又は無機の、天然又は合成の成分を示す。また医薬組成物の成分は、本発明の分子と、そして互いに、所望の医薬的有効性を実質的に損なう相互作用が無いような方法で混合することができる。
【００５８】
医薬組成物は、単位投与形態で提供してもよく、製薬業で良く知られた任意の方法で調整してもよい。全ての方法は、活性成分を１又はそれ以上の補足成分からなるキャリアと混合する工程を含む。一般的に、組成物は均一かつ緊密に調製され、活性化合物が、液体キャリア、微細化された固体キャリア、又はその両方と混合され、次いで必要ならば製品に成形される。
また医薬組成物は、任意に、適切な防腐剤、例えば、塩化ベンズアルコニウム、クロロブタノール、パラベン及びチメロサールを含んでいてもよい。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、注入を含む任意の従来の経路によって投与しても、又は長時間徐々に注入してもよい。投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、又は経皮であってよい。
経口投与に適した組成物は、各々が所定量の活性化合物を含有するカプセル、錠剤、トローチ剤などの別々の単位として提供してもよい。他の組成は、水性液体、シロップなどの非水性液体、エリキシル剤又はエマルジョンを含む。
【００６０】
本発明の組成物は有効量で投与される。「有効量」とは、単独で、又は更なる投薬とともに、所望の応答を生ずる組成物の量である。癌などの特定の疾患を治療する場合、所望の応答とは疾患の進行を阻害することである。これは、疾患の進行を一時的に遅延させることのみを含み得るが、より好ましくは、疾患の進行を永久に停止させることを含む。これは、常套的な方法で監視することができる。
【００６１】
そのような量は、当然のことながら、治療すべき特定の病状、病状の重篤さ、個々の患者のパラメータ、例えば、年齢、身体条件、大きさ及び重さ、治療の継続時間、併用療法（ある場合には）、特定の投与経路、及び健康実務者の知識及び技量の範囲内にある類似の要因に依存する。これらの要因は、当業者に良く知られており、日常的な実験を超えることなく対処できる。一般的には、各成分又はそれらの組み合わせの最大投与量、即ち、正常な医学的判断に従った最高の安全投与量を使用するのが好ましい。しかしながら、当業者は、患者が、医学的理由、生理学的理由、又は事実上他の任意の理由により、より低い投与量又は我慢できる投与量を主張しうることを理解するであろう。
【００６２】
本発明の更なる態様では、本発明のポリペプチド又は核酸分子の、末端肥大症；巨人症；ＧＨ欠乏症；ターナー症候群；腎不全；骨粗鬆症；骨関節炎；真性糖尿病；癌（例えば、前立腺癌、子宮頚癌、乳癌、黒色腫、ヘパトーマ、腎臓癌、神経膠腫、膀胱癌、肺癌、神経癌、卵巣癌、睾丸癌、膵臓癌、消化管癌、リンパ腫）；肥満；インシュリン抵抗性；高脂血症；高血圧症；貧血；自己免疫性及び感染性疾患；関節リウマチを含む炎症性疾患からなる群から選択される疾患治療のための医薬の製造のための使用が提供される。
【００６３】
また本発明は、有効量のポリペプチド、核酸分子、医薬組成物又は医薬を患者に投与することを含むヒト又は動物患者を治療する方法も提供する。
【００６４】
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通じて、「含む」という語及びその語の変形、例えば、「含んでいる」は、「含むが限定されない」ことを意味しており、他の部分、添加物、成分、整数又は工程を排除することを意図しない。
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通じて、単数形は、前後関係で特に要求しなければ複数形も包含する。特に、制限のない記載が用いられている場合、本明細書は、前後関係で特に要求しなければ複数並びに単数を考慮していると解される。
本発明の特定の態様、実施態様又は実施例とともに記載される特徴、整数、特性、化合物、化学的部分及び基は、矛盾がなければ、本明細書に記載された他の全ての態様、実施態様又は実施例に適用可能であると解される。
本発明の実施態様が、例示するためだけに、添付の図面を参照して記載される。
【００６５】
材料及び方法
ＧＨタンデムにおけるリンカーの修飾は、発現されたタンパク質のＮ末端から突出した３０アミノ酸を除去するよう修正されたＧＨ−(Ｇ４Ｓ)−ＧＨ分子（χ１Ｃ１）に対する遺伝子から開始され、また遺伝子は、修正されたｐＥＴ２１（＋）ベクターにサブクローニングされてｐＥＴ２１：χ１Ｃ１ｂが生成された（図３）。
可撓性末端を持つ螺旋状リンカーを持つ構築物のために、リンカーは、相補的なオリゴヌクレオチドを互いに連結することにより構築され；これらのオリゴヌクレオチドは、所望のリンカーをコードし、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化されたベクターｐＥＴ：χ１Ｃ１ｂに結合する末端を有するように設計された。これらのリンカーの総括を図４に示す。
【００６６】
ＧＨドメイン間の堅固なリンカーのために、ＧＨドメインは、それらのＣ末端（ＧＨ１）及びＮ末端（ＧＨ２）を切り取って、ドメインが螺旋の末端で終端するようにしなければならなかった。次いで、縮重コドン法を利用して、制限部位が設計され、それにより新たなリンカーが、２つのドメイン間に形成される螺旋を妨害することなく導入される（図５Ａ）。プライマーは、これらの修飾をＧＨタンデムのＧＨドメインに実行するように設計された（図５Ｂ）。得られた構築物は、χ１Ｃ５と呼ばれる（図６）。相補的なオリゴヌクレオチドが、ＮｏｔＩ及びＮｒｕＩに隣接するリンカー領域を生成するために使用され、これらは次いで、ＮｏｔＩ及びＮｒｕＩで消化されたｐＥＴ：χ１Ｃ５にライゲートされた。これらのリンカーの概略を図７に示す。
【００６７】
構築物の発現は、第一にｐＥＴ発現ベクターを発現株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓＲＩＰＬにトランスフォームすることにより実施した。発現は多くの条件下で実施でき、それは異なるインキュベーション温度（例えば、室温、３７℃）、異なる媒体（例えば、ＬＢ、２ＹＴ、５ＹＴ、等）、異なる誘導点（即ち、培地が誘導されるＯＤ６００）、培地を誘導するために使用される異なるＩＰＴＧ（又は他のインデューサ）濃度、及び誘導後に細胞が収集される時間を含む。
【００６８】
構築物のＣ末端にＨｉｓ−タグを付加することができ、それは固定化金属イオンクロマトグラフィ（Ｎｉ２＋又はＣｏ２＋カラム）を用いた精製を促進する。Ｈｉｓ−タグを持たない構築物は、種々の手段、例えばイオン交換クロマトグラフィ、疎水性カラム及びサイズ排除クロマトグラフィを用いて精製されうる。適切な純度のタンパク質を生成するためにこれらの精製技術の１又はそれ以上が必要な場合もある。
【００６９】
χ１Ｃ５の構築
修飾したＧＨドメインは、ＰＣＲ及び関連するプライマーを用いて生成された。ＧＨ１はＤｉＧＨＮｃｏＧＦ及びＧＨ［ＡＥＡ３］ＮｏｔＲを用いて修飾され、ＧＨ２はＥｃｏＩ−（Ｎｒｕ）ＧＨ−Ｆ及びＧＨＤ*−ＨＲを用いて修飾された。ＰＣＲ反応は、１ｍｌの １００ｐｍｏｌ／ｍｌ フォワードプライマー、１ｍｌの１００ｐｍｏｌ／ｍｌ リバースプライマー、１ｍｌの ｐＴｒｃＨｉｓＧＨｓｔｏｐ（希釈）、１ｍｌの１０ｍＭｄＮＴＰｓ、５ｍｌの１０ｘ 増幅バッファー、１ｍｌの５０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．５ｍｌのＰｆｘ ポリメラーゼ、３９．５ｍｌの無菌水からなる。ＰＣＲは、これらの反応混合物に対して、以下の温度プロフィールで実施した；９５℃で５分間；１５ ｘ （９５℃で４５秒間、５５℃で ４５秒間、７２℃で４５秒間）；７２℃で５分間。ＰＣＲ産物は、アガロースゲルを用いて確認し、所望のＰＣＲ産物を精製した。修飾したＧＨ１を、ｐＥＴ２１：χ１Ｃ１ｂに、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ部位の間にライゲートして、ｐＥＴ２１：χ１Ｃ４を得た。修飾したＧＨ２は、ｐＥＴ２１：χ１Ｃ４に、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にライゲートして、ｐＥＴ２１：χ１Ｃ５を得た。このプロセスの概略を図８に示す。
【００７０】
リンカー変性物
プライマーのリン酸化
リンカーを生成するために２又はそれ以上のプライマー二本鎖が必要な場合は、内部５’末端を含むプライマーを第一にリン酸化した。リン酸化すべき各プライマーのために以下の反応混合物を作成した：２ｍｌの１００ｐｍｏｌ／ｍｌ オリゴヌクレオチド、２ｍｌの１０ｘ キナーゼバッファー、２ｍｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、１３ｍｌの無菌水、１ｍｌのＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／ｍｌ）。これらを、３７℃で３０分間、次いで７０℃で１０分間インキュベートした。次いで、サンプルを、アニーリングバッファー （１０ｍＭ ＴＲＩＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５−８．０）を用いて１：１０に希釈し、０．１ｐｍｏｌ／ｍｌの溶液を得た。これらは、次いで、以下のアニーリング反応に使用できた。
【００７１】
プライマー二本鎖のアニーリング
プライマーを、アニーリングバッファー（１０ｍＭ ＴＲＩＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５−８．０）を用いて０．１ｐｍｏｌ／ｍｌに希釈した。１０ｍｌの相補的プライマーを新鮮なチューブ内で混合した。チューブを９５℃で２分間インキュベートし、温度を４０−６０分間の時間で３０℃まで低下させた。
１を超えるプライマー二本鎖が必要な場合は、等量のプライマー二本鎖を混合して、所望の隣家を形成するのに必要な全ての二本鎖を含有する溶液を得た。溶液は、次いで氷上に保存した。
【００７２】
ライゲーション及びトランスフォーメーション
関連する制限酵素で消化したベクター（例えば、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化したｐＥＴ２１：χ１Ｃ１ｂ又はＮｏｔＩ及びＮｒｕＩで消化したｐＥＴ２１：χ１Ｃ５）の約２００ｎｇを４ｍｌのアニールしたプライマー、１ｍｌのリガーゼバッファー、２ｍｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼととみインキュベートし、反応物を無菌水で１０ｍｌにした。これらを氷のビーカーで終夜インキュベートし、その間に解凍させた。５ｍｌの終夜ライゲーションさせたものを、次いで、５０ｍｌの化学的コンピテントなＥ．ｃｏｌｉＳＵＲＥ細胞に添加した。これを氷上で１時間インキュベートし、次いで、４２℃で３０秒間熱衝撃を与えた。細胞に４５０ｍｌのＬＢ媒体を添加し、次いでサンプルを３７℃で３０分間インキュベートした。次に、ミニーカルチャーを４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られたペレットを５０ｍｌのＬＢ媒体中に再懸濁させ、次いで、カルベニシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１０ｍｇ／ｍｌ）及びグルコース（０．３％ ｗ／ｖ）を含むＬＢプレートにプレーティングした。これを３７℃で終夜インキュベートした。
得られたコロニーをスクリーニングし、リンカーの変性が成功したことをチェックした。
【００７３】
一般的方法の修正
ｐＥＴ２１：χ１Ｃ５を消化するための制限酵素ＮｏｔＩ及びＮｒｕＩを用いた堅固なリンカーを持つ構築物の生成は、トランスフィーめーション後にネガティブコントロールプレート（ライゲーション反応にプライマー二本鎖が無い）上に多くのコロニーを生成させ、従って、ポジティブコントロールをスクリーニングするのが困難であった。これは、消化されたベクターの脱リン酸化を反映しており；１５μｌのＮｏｔＩ及びＮｒｕＩで消化されたｐＥＴ２１：χ１Ｃ５を、２ｍｌ ＣＩＡＰ １０ｘ ｂｕｆｆｅｒ、１ｍｌ ＣＩＡＰ（コウシ腸アルカリホスファターゼ）（１０Ｕ／ｍｌ）及び２ｍｌ無菌水と混合した。これを、３７℃で１時間、次いで８０℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＤＮＡを精製キット（例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて溶液から精製した。プライマー二本鎖を作成するために使用した全てのプライマーは、上記の方法を用いてリン酸化した。リン酸化したプライマー二本鎖は、次いで上記のように脱リン酸化されたベクターにライゲートした。
【００７４】
χ１Ｌ１のクローニング及び発現
成長ホルモンＧＨの２つのドメインからなるχ１Ｌ１は、単一の細胞外成長ホルモンドメインに続き、これらのドメイン各々は、現在は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ４）リンカーで連結されている（図８）。χ１Ｌ１のヌクレオチド配列を図９に示し、アミノ酸配列を図１０に示す。
χ１Ｌ１は、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ部位に隣接するｈＧＨ遺伝子を、χ１Ｅ２（ＧＨＲａ−ＧＨＧＨＲｂ）に連結することにより構築し、これはχ１Ｋ１を与えた。ＧＨＲドメインは、次いでχ１Ｋ１に、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間で連結し、χ１Ｌ１を与えた。この手法の模式図を図１１に示す。
【００７５】
χ１Ｌ１遺伝子をシーケンスによってチェックし、正しいことが確認された。発現は、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓＲＩＰＬ細胞内の修飾したｐＥＴ２１（＋）ベクターを用いて実施した。１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）と０．５−０．６のＯＤ６００で４時間インキュベートした後にＬＢ媒体中に発現されたタンパク質は、部分的に可溶性であり、ＧＨに対してプローブされたウエスタンブロットにおいて多重のＭｗバンドが観察された（図１２）。
χ１Ｌ１のＣ末端Ｈｉｓ−タグバージョンは、Ｃｏ２＋カラムを用いて精製した（図１３）。タンパク質調製物中に混入した多くのタンパク質及び多重のバンドが得いす単ブロットにおいて未だ観察された。このタンパク質の調製物の予備的バイオアッセイは、それが有意なアゴニスト活性を持つことを示した（図１４）。
【００７６】
プロラクチンタンデム及びプロラクチン：成長ホルモンタンデムの構築
ＰＲＬ及びＧＨタンデムは、標準的なＰＣＲ技術、次いで調製されたベクターのライゲーション及びトランスフォーメーションを用いて生成した。リンカーは、アニールしたオリゴヌクレオチド対を調製したベクターにライゲーション及びトランスフォーメーションすることにより変化させられる。ＰＲＬ及びＧＨタンデムについての３つの例示的方法を以下に示す。
【００７７】
方法１
ＰＲＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＰＲＬの生成
１．ＰＲＬのＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ部位の間でのＰＣＲ（フォワードプライマー＝ａｔａｔｃｃａｔｇｇｇｃＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＣ；リバースプライマー＝ａｔａｔａｔａｔａｔａｔｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃＧＣＡＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＧＧ）。
２．ＰＣＲ産物のＮｃｏＩ及びＮｏｔＩでの消化。
３．複製ベクターのＮｃｏＩ及びＮｏｔＩでの消化→ｐＥＴ２１（ｍ）χ１Ｃ１ｂ（即ち、ＧＨ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨ）。
４．ＰＣＲ産物のベクターへのライゲーション；ｐＥＴ２１（ｍ）ＰＲＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨを与える。
５．ＰＲＬのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩＩ部位間でのＰＣＲ（フォワードプライマー＝ａｔａｔｇａａｔｔｃＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＣ； リバースプライマー＝ａｔａｔａａｇｃｔｔＧＣＡＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＧＧ）。
６．ＰＣＲ産物のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでの消化。
７．複製ベクターのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでの消化→ｐＥＴ２１（ｍ）ＰＲＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨ。
８．ＰＣＲ酸靴のベクターへのライゲーション；ｐＥＴ２１（ｍ）ＰＲＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＰＲＬを与える。
【００７８】
方法２
ＰＲＬ−Ａ（ＥＡ３Ｋ）２Ａ−ＧＨの生成
１ ＰＲＬのＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ部位間でのＰＣＲ（フォワードプライマー＝ａｔａｔｃｃａｔｇｇｇｃＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＣ； リバースプライマー＝ａｔａｔａｔａｔａｔａｔｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃＧＣＡＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＧＧ）。
２ ＰＣＲ産物のＮｃｏＩ及びＮｏｔＩでの消化。
３ 複製ベクターのＮｃｏＩ及びＮｏｔＩでの消化→ｐＥＴ２１（ｍ）Ｔ１ａＥＡＫ２ （即ち、ＧＨ−Ａ（ＥＡ３Ｋ）２Ａ−ＧＨ）。
４ ＰＣＲ産物のベクターへのライゲーション；ＰＲＬ−Ａ（ＥＡ３Ｋ）２Ａ−ＧＨを与える。
【００７９】
方法３
ＰＲＬ−Ａ（ＥＡ３Ｋ）４Ａ−ＰＲＬの生成
１． Ａ（ＥＡ３Ｋ）４Ａリンカーの生成のためのプライマーのアニール。
２． 複製ベクターのＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩでの消化→ｐＥＴ２１（ｍ）ＰＲＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＰＲＬ（上記例１から）。
３．オリゴヌクレオチドダイマーのベクターへのライゲーション；ＰＲＬ−Ａ（ＥＡ３Ｋ）４Ａ−ＰＲＬを与える。
上記の方法は、図２４に例示してある。
【００８０】
実施例１
半堅固タンデム
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＰＬ細胞を、カルベニシリン、テトラサイクリン及びコラムフェニコール(choramphenicol)を添加した１０ｍｌのＬＢ媒体中で成長させた。細胞は、３７℃で振とうさせながら成長させた。培地を、０．４−０．７のＯＤ６００において１ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧを用いて誘導した。細胞を、リゾチーム、デオキシコール酸ｍ及び超音波処理を組み合わせて溶解させた。次いで可溶性画分を遠心分離で単離した。クマシー染色したＰＡＧＥゲルにより、タンデムの発現の明確なバンドが示された。
【００８１】
可溶性画分をＥＬＩＳＡにより決定し、４０ｎｇ／ウェルのタンデムを１２％ＰＡＧＥゲル上に負荷した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ウサギ抗−ＧＨ Ａｂ（一次）及び抗−ウサギ−ＨＲＰ Ａｂ（二次）を用いてウエスタンブロットした；図１６ｄ参照。半堅固リンカーを持つＧＨタンデムの生物活性を図１６ｅに示す。
【００８２】
実施例２
堅固タンデム
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＰＬ細胞を、カルベニシリン、テトラサイクリン及びコラムフェニコール(choramphenicol)を添加した１０ｍｌのＬＢ媒体中で成長させた。細胞は、３７℃で振とうさせながら成長させた。培地を、０．４−０．７のＯＤ６００において１ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧを用いて誘導した。培地を更に４時間成長させた後に収集した。
【００８３】
細胞を、リゾチーム、デオキシコール酸及び超音波処理を組み合わせて溶解させた。次いで可溶性画分を遠心分離で単離した。クマシー染色したＰＡＧＥゲルにより、タンデムの発現の明確なバンドが示された。
可溶性画分をＥＬＩＳＡにより決定し、４０ｎｇ／ウェルのタンデムを１２％ＰＡＧＥゲル上に負荷した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ウサギ抗−ＧＨ Ａｂ（一次）及び抗−ウサギ−ＨＲＰ Ａｂ（二次）を用いてウエスタンブロットした；図１７ｄ参照。堅固リンカーを持つＧＨタンデムの生物活性を図１７ｅに示す。
【００８４】
実施例３
タンデムの精製
構築物Ｔ１ｃＥＡＫ２＋３Ｈｉｓ及びＴ１ｃＥＡＫ２＋４Ｈｉｓを、バイオアッセイにおける初期超最大活性(initial supra-maximal activities) に基づいて更に実験するためにショートリストに載せた。発現プラスミドを Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｏｄｏｎｐｌｕｓ ＲＩＰＬ細胞にトランスフォームし、ＩＬバッチ培地中で発現を実施した。可溶性タンパク質画分に対して、Ｎｉ−キレート固定化金属イオンクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）及びイオン交換クロマトグラフィの組み合わせを用いて精製を実施した。ＩＭＡＣは最初の精製工程であり、ｐＨ勾配（ｐＨからｐＨ３）を用いて初期溶離がなされる；しかしながら、カラム洗浄において多くのタンパク質が失われたことがわかった。従って、我々は精製方法における戦略を変更し、イミダゾール溶離（０から５０Ｍのイミダゾール）を用いることに戻り、＞７０％の純度を達成した。次いで、イオン交換カラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ）を＞９０％の更なる精製に使用した。これを図１８に例示する。
【００８５】
ＥＬＩＳＡに基づく定量化の結果：
Ｔ１ｃＥＡＫ２＋３Ｈｉｓ（ＲＱ１３／４） ＝ ２１５μｇ／ｍｌ；
Ｔ１ｃＥＡＫ２＋３Ｈｉｓ（ＲＱ１４／４） ＝ １７７μｇ／ｍｌ
各々１ｍｌを得たので、全収量は３９２μｇである。これは、２リットルの培地から得た→１リットルあたりの収量 ＝ 〜２００μｇ。
Ｔ１ｃＥＡＫ２＋３−Ｈｉｓの活性は、より高いタンパク質濃度において、ｒｈＧＨより高い折り畳みの誘導に到達した。同様の結果はタンデムをモルベースで試験した場合に得られた、図１８Ｂ及び図１８Ｃ参照。Ｔ１ｃＥＡＫ２＋４Ｈｉｓに対して同様の分析を行った。精製及び生物活性を図１８Ｄ、１８Ｅ及び１８Ｆに示す。
【００８６】
Ｔ１ｃＥＡＫ２＋４Ｈｉｓ（ＲＱ１３／４）ＥＬＩＳＡに基づく定量化の結果 ＝ ５５０μｇ／ｍｌ。各々１ｍｌを得たので、全収量は５５０μｇである。これは、２リットルの培地から得た→１リットルあたりの収量 ＝ 〜２７５μｇ。Ｔ１ｃＥＡＫ２＋３−Ｈｉｓの活性は、より高いタンパク質濃度において、ｒｈＧＨより高い折り畳みの誘導に到達した。同様の結果はタンデムをモルベースで試験した場合に得られた。
【００８７】
実施例４
χ１Ｃ３の濃度は、ブラッドフォード(Bradford)アッセイを用いて測定した。ｒｈGH（１ｍｇ／ｍｌにおいて）を平行して測定し、ブラッドフォードアッセイから得られたデータの正しさを確認した。次いでχ１Ｃ３を用いて、ＧＨバイオアッセイのＧＨ標準を直接置換し、タンデム標準曲線を得た。純粋及び不純なタンデムサンプル及びｒｈＧＨを、ＧＨ標準曲線及びタンデム標準曲線に対して測定し、次いでタンパク質濃度を各ＥＬＩＳＡプレートから測定した。ＧＨのＥＬＩＳＡは、これらのＥＬＩＳＡによる測定した場合のタンデムの実測値の約２倍を与えた。これを図１９に例示する。
【００８８】
実施例５
プロラクチン／ＧＨタンデム
対応するアゴニスト的変異を持つ又は持たないプロラクチン及び／又はＧＨのタンデムは、タンデム遺伝子へのライゲーションを可能にするような遺伝子の何れかの末端への適切な制限部位に対するＰＣＲを用いて合成できる。
【００８９】
可撓性タンデム
タンデム遺伝子は、２つのタンパク質ドメインを（Ｇ４Ｓ）ｎに基づいて可撓性リンカーで連結することにより構築した；タンパク質ドメイン及びリンカーの各末端に独特の制限部位がある（図２０）。
従って、タンデムにおける２つのタンパク質ドメインは、異なるドメインで連結することにより変化させることができる。例えば、プロラクチン（ＰＲＬ）、プロラクチン１−１４アミノ酸欠失Ｇ１２９Ｒ変異体（Δ１−１４ＰＲＬ．Ｇ１２９Ｒ）、成長ホルモン（ＧＨ）及び成長ホルモンＧ１２０Ｒアンタゴニスト変異体（ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ）は、様々な方法でタンデム遺伝子に結合させることができる（図Ｂ）。図２２及び２３は、これらのドメインのヌクレオチド配列及びタンパク質配列を示している。
【００９０】
適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接する所望のタンパク質ドメインの遺伝子を精製するために標準ＰＣＲを使用することができる。ＰＣＲ産物及び複製ベクターをこれらの制限エンドヌクレアーゼで消化し、ライゲーション及びトランスフォームをすることにより、所望のタンパク質ドメインを持つタンデムが生成される。このプロセスは、タンパク質ドメイン又はリンカーの何れかに実施され（図２４）、既に記載したオリゴクレオチドダイマーを用いて置換される。
【００９１】
半堅固タンデム
タンデム遺伝子は、２つのタンパク質ドメインを配列Ａ（ＥＡ３Ｋ）ｎＡに基づいて螺旋リンカーで連結することにより構築した；タンパク質ドメイン及びリンカーの各末端に独特の制限部位がある（図２０）。
従って、タンデムにおける２つのタンパク質ドメインは、異なるドメインで連結することにより変化させることができる。例えば、プロラクチン（ＰＲＬ）、プロラクチン１−１４アミノ酸欠失Ｇ１２９Ｒ変異体（Δ１−１４ＰＲＬ．Ｇ１２９Ｒ）、成長ホルモン（ＧＨ）及び成長ホルモンＧ１２０Ｒアンタゴニスト変異体（ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ）は、様々な方法でタンデム遺伝子に結合させることができる（図２１）。図２２及び２３は、これらのドメインのヌクレオチド配列及びタンパク質配列を示している。
【００９２】
適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接する所望のタンパク質ドメインの遺伝子を精製するために標準ＰＣＲを使用することができる。ＰＣＲ産物及び複製ベクターをこれらの制限エンドヌクレアーゼで消化し、ライゲーション及びトランスフォームをすることにより、所望のタンパク質ドメインを持つタンデムが生成される。このプロセスは、タンパク質ドメイン又はリンカーの何れかに実施され（図２４）、既に記載したオリゴクレオチドダイマーを用いて置換される。
【００９３】
堅固タンデム
タンデムの２つのドメインは、ドメインＡのＣ末端α螺旋と末端ＢのＮ末端α螺旋を介して直接連結される必要がある。従って、タンパク質の遺伝子（図２２及び２３）はドメインＡ及びＢにおいて切断され、これらの螺旋に螺旋リンカー［Ａ［ＥＡ３Ｋ）ｎＡ］が直接結合されるようにしなければならない。
従って：
【００９４】
タンデム遺伝子は、２つのタンパク質ドメインを配列Ａ（ＥＡ３Ｋ）ｎＡに基づいて螺旋リンカーで連結することにより構築した；タンパク質ドメイン及びリンカーの各末端に独特の制限部位がある（図２０）。独特なＮｏｔＩ部位はリンカー領域のＮ末端に加工され、独特なＮｒｕＩ部位はＧＨのＣ末端に加工され（図５及び６）；これにより、リンカー領域をＧＨタンデムに変化させることが可能になる。
ＮｏｔＩを含むＮ末端リンカー配列は、ドメインＡ位置においてＰＲＬ遺伝子に付加され、構築すべきテンプレートＰＲＬ−リンカーＧＨに基づく構築を可能にする（図２５）。しかしながら、ドメインＢがＰＲＬである場合は、独特な制限部位は、リンカーとドメインＢとの境界に導入されなければならない（図２５）。
【００９５】
従って、タンデムにおける２つのタンパク質ドメインは、異なる切断されたドメインで連結することにより変化させることができる。例えば、プロラクチン（ＰＲＬ）、プロラクチン１−１４アミノ酸欠失Ｇ１２９Ｒ変異体（Δ１−１４ＰＲＬ．Ｇ１２９Ｒ）、成長ホルモン（ＧＨ）及び成長ホルモンＧ１２０Ｒアンタゴニスト変異体（ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ）は、様々な方法でタンデム遺伝子に結合させることができる（図２１）。ドメインＡ又はドメインＢにおけるそれらの位置に依存して、タンパク質ドメインは上記のように切断されなければならない。
【００９６】
適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接する所望のタンパク質ドメインの遺伝子を精製するために標準ＰＣＲを使用することができる。ＰＣＲ産物及び複製ベクターをこれらの制限エンドヌクレアーゼで消化し、ライゲーション及びトランスフォームをすることにより、所望のタンパク質ドメインを持つタンデムが生成される。このプロセスは、タンパク質ドメイン又はリンカーの何れかに実施され、可撓性及び半堅固リンカーに対して使用された方法論と同様である（図２４）。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１Ａでは、サイトカインドメイン（楕円形）が、アルファ螺旋（影付き長方形）によって連結されている。可撓性リンカー（曲がった矢印）が、第１のサイトカインドメインを螺旋に、螺旋を第２のサイトカインドメインに結合させている。図１Ｂでは、サイトカインドメインはアルファ螺旋によって連結されている。可撓性リンカーが、第１のサイトカインドメインを螺旋リンカーに、螺旋リンカーを第２のサイトカインドメインに結合させている。
【図２】螺旋リンカーは可撓性のコネクタを持たず、その代わりに、サイトカイン１のＣ末端螺旋（４）に連続し、それをサイトカイン２のＮ末端螺旋（１’）と繋いで、単一の長い螺旋４−リンカー螺旋−１’によって連結された堅固なタンデムを形成している。従って、２つのサイトカインドメインの相対的な方向は固定されている。しかしながら、リンカーにアミノ酸を付加する又はアミノ酸を除去することにより異なる構造とすることによって、ドメインが異なる配向をした一連の堅固なタンデムを生成することができる。
【図３】構築物χ１Ｃ１ｂのマップ及びヌクレオチド／アミノ酸配列を示す。
【図４】可撓性末端を持つ螺旋リンカーを有するタンデムを生成するために使用したリンカーデザイン及びプライマーを示す。
【図５】Ａ）中断されない螺旋リンカーを作成するためのプライマー二本鎖のライゲーションを可能にするＧＨドメインとリンカーとの間の境界領域のデザインを示す。Ｂ）χ１Ｃ５を生成するためのχ１Ｃ１ｂの修飾に使用されたプライマーを示す。
【図６】構築物χ１Ｃ５のマップ及びリンカー領域の配列を示す。
【図７】リンカーデザイン及び堅固な螺旋リンカーを生成するために使用したプライマーの概要を示す。
【図８】χ１L1を構築するための方法を示す模式図である。
【図９】χ１L1のヌクレオチド配列を示す。ＧＨドメインは灰色で示し、ＧＨＲドメインは太字で示し、リンカーは下線を施した。
【図１０】χ１Ｌ１のアミノ酸配列を示す。ＧＨドメインは灰色で示し、ＧＨＲドメインは太字で示し、リンカーは下線を施した。
【図１１】χ１Ｌ１を構築するためのクローニング方法を示す模式図である。
【図１２】χ１L1の発現を示す。
【図１３】χ１Ｌ１−ＨＩＳの一次精製を示す。χ１Ｌ１−ＨＩＳはＣｏ２＋カラムを用いて精製された。
【図１４】χ１L1がアゴニスト活性を示すことを示すグラフである。
【図１５】堅固又は半堅固ＧＨ構築物に対して使用した命名法の概要を示す。
【図１６−１】ａ）半堅固リンカー配列を含むＧＨタンデムの核酸配列である。ｂ）半堅固リンカー配列を含むＧＨタンデムのアミノ酸配列である。
【図１６−２】ｃ）ＧＨタンデムの構築に使用された半堅固リンカーの例を示す。ｄ）半堅固リンカーを含むＧＨタンデムの細菌発現を例示する。ｅ）半堅固リンカーを含むＧＨタンデムの生物活性を例示する。
【図１７−１】ａ）堅固リンカー配列を含むＧＨタンデムの核酸配列である。ｂ）堅固リンカー配列を含むＧＨタンデムのアミノ酸配列である。
【図１７−２】ｃ）ＧＨタンデムの構築に使用された堅固リンカーの例を示す。
【図１７−３】ｄ）堅固リンカーを含むＧＨタンデムの細菌発現を例示する。ｅ）堅固リンカーを含むＧＨタンデムの生物活性を例示する。
【図１８−１】図１８Ａは、Ｔ１ｃＥＡＫ２＋３Ｈｉｓの精製及びクマシー染色及びウエスタンブロットによる分析を示す。
【図１８−２】図１８Ｂ及び１８Ｃは、Ｔ１ｃＥＡＫ２＋３Ｈｉｓの生物活性を示す。
【図１８−３】図１８Ｄは、Ｔ１ｃＥＡＫ２＋４Ｈｉｓの精製及びクマシー染色及びウエスタンブロットによる分析を示す。
【図１８−４】図１８Ｅ及び１８Ｆは、Ｔ１ｃＥＡＫ２＋４Ｈｉｓの生物活性を示す。
【図１９】成長ホルモンタンデムの検出のためのＥＬＩＳＡを例示する。
【図２０】可撓性、半堅固及び堅固リンカーによって連結された成長ホルモンタンデムの模式図である。
【図２１】プロラクチン（ＰＲＬ）、成長ホルモン（ＧＨ）及びそれらのアンタゴニスト的変異体の可能な組み合わせを例示する。
【図２２】プロラクチン及びそのアンタゴニスト的形態の一つ、１−１４アミノ酸切断Ｇ１２９Ｒ変異体（下線）を例示する。
【図２３】成長ホルモン及びそのアンタゴニスト的形態の一つ、Ｇ１２０Ｒ変異体（下線）を例示する。
【図２４】プロラクチンタンデムの模式図である。
【図２５】（Ａ）加工された制限部位、ＮｏｔＩ及びＮｒｕＩを持つＧＨ堅固タンデム構築物の模式図であり、リンカーが隣接するドメインの末端螺旋に直接結合することを可能にし、リンカーの変化を促進もしている。（Ｂ）加工された制限部位、ＮｏｔＩ及びＮｒｕＩを持つＰＲＬ−リンカー−ＧＨ堅固構築物の模式図であり、（Ａ）と類似する機能を有し、ＮｏｔＩ部位がリンカー領域にあるので、ドメインＡの切断されたＰＲＬ遺伝子にちょうど付加される。（Ｃ）ＰＲＬ堅固タンデムの模式図であり、独特な制限部位は、縮重したアミノ酸コードを用いて、リンカーとドメインＢのＰＲＬとの間の境界において加工され、タンデム遺伝子の合成及び修飾を容易にする必要がある。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも２つのサイトカインレセプターに結合することのできるドメインを含み、当該ドメインがペプチドリンカー分子によって連結されているポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインと呼ばれる成長因子のグループは、多くの様々な細胞性機能に関係している。これらは、非限定的に例示すると、免疫系の変調、エネルギー代謝の調節及び成長及び発達を含む。サイトカインは、標的細胞の細胞表面に表現されたレセプターを介して、それらの効果を仲介する。サイトカインレセプターは、３つの異なるサブグループに分けることができる。タイプ１（成長ホルモン（ＧＨ）ファミリー）レセプターは、それらの細胞外ドメインの末端部分における４つの保存されたシステイン残基、及びＣ末端部分における保存されたＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒモチーフによって特徴づけられる。繰り返されるＣｙｓモチーフは、タイプ２（インターフェロンファミリー）及びタイプＩＩＩ（腫瘍壊死因子ファミリー）にも存在する。
【０００３】
多くのサイトカインドメインが、それらの同族レセプターと、特定の部位を介して相互作用することが知られている。幾つかのサイトカインレセプターは、高親和性ドメイン結合部位及び低親和性結合部位の両方を有する。
【０００４】
例えば、ＧＨの単一分子が２つのレセプター分子（ＧＨＲ）と関係することが知られている（Cuningham等、1991 ; de Vos等、1992; Sundstrom等、1996; Clackson等、1998）。これは、ＧＨ上の２つの独特なレセプター結合部位及び２つのレセプターの細胞外ドメイン上の共通する結合ポケットを介して起こる。ＧＨ分子上の部位１は、部位２より高い結合性を持ち、ＧＨ上の部位１への１つのレセプター結合の後に部位２への第２のレセプターのリクルートが連続するレセプターの二量体化が起こると考えられる。ＧＨＲの細胞外ドメインは、各々が約１００アミノ酸である２つの連結したドメインとして存在する。三量体複合体ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲの形成を伴うホルモン結合で起こるのは、これら２つのドメインにおける構造変化である。ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲ複合体の内在化の後にリサイクル段階が続き、それによりレセプター分子が再生されて、細胞内での更なる用途に供される。
【０００５】
サイトカイン及び他のドメインは、結合時にしばしばレセプター−ドメイン複合体を形成する。複合体形成に関係するレセプターは、同種でも異種でもよい。例えば、エリスロポエチン及びＧＨは、三量体のレセプター−ホルモン−レセプター複合体を形成する。インターロイキン−４は、三量体のレセプター−ホルモン−異なるレセプターの複合体を形成する。腫瘍壊死因子は、細胞膜貫通腫瘍壊死因子レセプター；ＴＮＦ−１／ｐ５５又はＴＮＦ−２／ｐ７５の同型三量体の形成を介してシグナル伝達する。他のサイトカイン、例えばレプチン及びＧＣＳＦは、四量体のレセプター−ホルモン−ホルモン−レセプター複合体を形成し、他のもの（例えば、インターロイキン６）は、２つの可溶性レセプター分子、２つの膜貫通レセプター分子及び２つのサイトカイン分子の六量体の複合体を形成すると思われる。何れの場合も、サイトカインをレセプター複合体に配置させる主要な高親和性結合部位、及び構造の変化又は他の分子のリクルートにおいて二次的な役割を果たすことによりシグナル伝達を開始させる付加的な結合部位が存在する。
【０００６】
サイトカインのＴＮＦスーパーファミリーは、リンパ系、乳房、神経系及び外胚葉組織の発生、組織化及び恒常性を調節する細胞生存、死亡及び分化のためのシグナル伝達を活性化する。ＴＮＦは、宿主保護において実証された役割を有し、そのような役割は、例えば、脾臓細胞分化、完全なＩｇＧ応答及びアイソタイプスイッチング、マクロファージの活性化、一酸化窒素及び活性酸素ラジカルの生成を含む。しかし、ＴＮＦは、過剰発現された場合には病原にも関与している。そのような関与の証拠は、次の病状において見いだされている：即ち、細菌性敗血症、移植片対宿主疾患、脳マラリア、関節リウマチ、円形脱毛症、喘息、癌、クローン病、糖尿病、肥満症、乾癬及び乾癬性関節炎、サルコイドーシス、強皮症及び毒性ショック症候群である。これらの病状は、抗−ＴＮＦ薬の適用に関して確立された及び／又は可能性のある病状として認められている。
【０００７】
サイトカインの過剰発現は、一連のヒト疾患、例えば、末端肥大症；巨人症；ＧＨ欠乏症；ターナー症候群；腎不全；骨粗鬆症；骨関節炎；真性糖尿病；癌；肥満；インシュリン抵抗性；高脂血症；高血圧症；貧血；自己免疫性及び感染性疾患；関節リウマチを含む炎症性疾患の原因となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
サイトカイン、例えばＧＨ、プロラクチン又はＴＮＦの作用を阻害する方法は、アンタゴニストの投与である。
【０００９】
ＧＨアンタゴニストの一例はペグヴィソマント(Pegvisomant)であり、それはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に被覆された修飾されたＧＨ分子である。ペグヴィソマントは、幾つかの有利な効果を有し、それは例えば、有効分子量の増大による糸球体濾過速度の低下を含み、それにより所望の効果を生ずるために必要な投与量が低減される［（Abuchowski等, J. Biol. Chem. 252, 3578-3581, (1977)参照］。しかしながら、ＰＥＧ化(pegylation)の結果、修飾されたＧＨ分子のＧＨＲへの親和性が低下する。
【００１０】
プロラクチンアンタゴニストに例はＷＯ０３／０５７７２９に開示されている（その全体、より詳細には前記プロラクチンアンタゴニストをコードするヌクレオチド及びタンパク質配列を、参考として取り入れるものとする）。プロラクチンアンタゴニストは、ヒトのプロラクチンアミノ酸配列に対する修飾を含み、それは位置１２９のグリシン残基のアルギニン残基での置換である。修飾されたプロラクチンタンパク質は、プロラクチンレセプター活性化の阻害剤として作用する。
【００１１】
ＴＮＦを阻害するための多くの治療的戦略が、ｉ）（例えば、阻害性サイトカイン、ＩＬ−１０；サリドマイド、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ；アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた）ＴＮＦ合成の阻害；ｉｉ）ＴＮＦプロセシングの阻害（例えば、メタロプロテアーゼ（ＴＡＣＥ）阻害剤）；ｉｉｉ）（例えば、可溶性ＴＮＦレセプター又はＴＮＦの抗体を用いて）ＴＮＦの中和ができることに基づいて開発されている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
我々は、サイトカインレセプターの複数のリガンド結合ドメインを含むポリペプチド及びサイトカイン活性化に媒介されるレセプターの改変におけるそれらの使用を記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の一態様によると、サイトカインレセプターに結合することができる少なくとも２つのサイトカイン結合ドメインを含み、前記ドメインが不撓性の螺旋領域を含むペプチドリンカー分子によって連結されたポリペプチドが提供される。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは、前記サイトカインレセプター（類）アンタゴニストとして作用する。あるいは、前記ポリペプチドはアゴニストとして作用する。好ましくは、ポリペプチドは、直列（タンデム：tandem)に配列したドメインを含む。好ましい実施態様では、ポリペプチドは、直列に配列した２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の結合ドメインを含む。
【００１５】
本発明のさらに好ましい実施態様では、ポリペプチドは、直列に配列した１０を超えるドメインを含む。
好ましくは、不撓性の螺旋領域は、モチーフＡ(ＥＡＡＡＫ)ＸＡ又はその機能的変異体のコピーを少なくとも１つ含む。好ましくは、ペプチドリンカー分子は、モチーフＥＡＡＡＫの2つのコピーを含み、ペプチドリンカー分子の長さは、少なくとも１つのアミノ酸の増加的付加によって延長可能である。
【００１６】
「機能的変異体」とは、１又はそれ以上の置換、付加、欠失、によってアミノ酸配列が相違していてもよいが、実質的に螺旋又は非−螺旋構造を保持しているリンカー分子である。好ましい変異体は、保存的アミノ酸置換によって参照アミノ酸配列から変化したものである。そのような置換は、与えられたアミノ酸を、特徴の類似した他のアミノ酸で置換するものである。次の非限定的なアミノ酸のリストは保存的置換（類似）と考えられる：ａ）アラニン、セリン、及びスレオニン；ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；ｃ）アスパラギン及びグルタミン；ｄ）アルギニン、リジン及びヒスチジン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニン及びバリン；及びｆ）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン。最も好ましいのは、可撓性又は不撓性螺旋リンカー領域を実質的に維持するアミノ酸置換である。
【００１７】
本発明の更に好ましい実施態様では、リンカー分子は、少なくとも１つの可撓性の非螺旋領域を含む。
不撓性の螺旋領域を与えることにより、上記したように、ドメインの空間的な離間が維持されるが、可撓性の非螺旋領域を与えることにより、ドメインがサイトカインレセプター（類）の結合部位に配向することが可能になる。
【００１８】
本発明の一実施態様では、可撓性の非螺旋領域が、ペプチドリンカー分子のアミノ末端又はその近傍に位置しており、それにより、ペプチドリンカー分子のアミノ末端に位置する結合ドメインが、その同族のレセプターに関して配向することが可能となる。
本発明の更なる実施態様では、可撓性の非螺旋領域が、ペプチドリンカー分子のカルボキシル末端又はその近傍に位置しており、それにより、ペプチドリンカー分子のカルボキシル末端に位置する結合ドメインが、その同族のレセプターに関して配向することが可能となる。
【００１９】
本発明の更に別の実施態様では、可撓性の非螺旋領域が、ペプチドリンカー分子のアミノ及びカルボキシル末端又はその近傍に位置しており、それにより、ペプチドリンカー分子のアミノ及びカルボキシル末端に各々位置する結合ドメインが、その同族のレセプターに関して配向することが可能となる。
好ましくは、可撓性の非螺旋領域は、結合ドメインの少なくとも１つに隣接して位置している。より好ましくは、可撓性の非螺旋領域は、結合ドメインと不撓性螺旋領域との間の連結部を形成する。
更により好ましくは、不撓性の螺旋領域は、モチーフＡ(ＥＡＡＡＫ)ＸＡのコピーを少なくとも１つ含む。不撓性の非螺旋領域の長さは、このモチーフＡ(ＥＡＡＡＫ)ＸＡの繰り返し数の増加によって延長可能である。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様では、Ａ(ＥＡＡＡＫ)ＸＡにおけるｘは１０コピー未満である。更により好ましくは、ｘは５コピー未満である。更により好ましくは、ｘは１、２、３、４又は５コピーから選択される。
本発明の好ましい実施態様では、堅固なアルファ螺旋リンカーと結合ドメインとの間に可撓性の結合は無く、前記結合ドメインは不撓性のアルファ螺旋リンカーによって直接連結される。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様では、前記結合ドメインは、不撓性アルファ螺旋からなる連結分子によって連結されている。
本発明の好ましい実施態様では、前記螺旋分子は、１つの結合ドメインのカルボキシル末端を第２の結合ドメインのアミノ末端と連結する。
【００２２】
本発明のこの実施態様において、螺旋リンカーは、第１の第一のサイトカイン分子のＣ末端螺旋と第２のサイトカイン分子のＮ末端螺旋との間で連続しており、それにより２つのサイトカイン結合ドメインを実質的に固定された方向で堅固に連結している。例えば、このことは、第１のサイトカインドメインからの短いＮ末端及び螺旋後Ｃ末端領域、及び、第２のサイトカインからの短い螺旋前Ｎ末端領域の欠失を含む（即ち、第１のサイトカインからの残基１８２−１９０、及び第２のサイトカインからの残基１−５であり、これらは、第１のサイトカインにおけるＣ末端螺旋（例えば、図１Ｂにおける螺旋４）の後、及び第２のサイトカインのＮ末端螺旋（図１Ｂにおける螺旋１’）の前のランダムコイル構造の短い領域だからである）。
【００２３】
異なる構造において、この固定された方向（並進及び回転の両方で）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の付加的アミノ酸の挿入、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のアミノ酸の欠失により変化させ、新規な特性、例えばアンタゴニスト特性を持つ分子を生成させることができる。余分なアミノ酸の付加は、２つのドメインの約１．５Åまでの相対的並進、及び螺旋軸周囲での２つのドメインの約＋１００°の回転を生じさせる。典型的には、リンカーは、２つのＥＡＡＡＫユニットで始まり、Ａ、ＡＡ、ＡＡＡ、ＡＡＡＡ、ＥＡＡＡＡ及びＥＡＡＡＡＫ配列の付加によって伸長する。
【００２４】
本発明の更に好ましい実施態様では、ポリペプチドの結合ドメインは互いに同一又は類似である。
本発明の更にまた好ましい実施態様では、ポリペプチドは、成長ホルモン；レプチン；エリスロポエチン；プロラクチン；インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のサブユニットｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；カージオトロフィン(cardiotrophin)（ＣＴ−１）；白血球阻害因子（ＬＩＦ）；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターフェロン、ＩＦＮα及びＩＮＦβ；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α及びＴＮＦβ、及びＲＡＮＫリガンドからなる群から選択されるサイトカインの結合ドメインを含む。
【００２５】
本発明の更に好ましい実施態様では、ドメインの少なくとも１つが、成長ホルモン結合ドメインを含む。
本発明の更に好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは、少なくとも２つの成長ホルモン、又は成長ホルモン変異体ポリペプチドの結合ドメインを含む。
【００２６】
修飾したＧＨ変異体は、米国特許第５,８４９,５３５号に開示されており、それを参考として取り入れるものとする。ＧＨに対する修飾は、部位１及び部位２の結合部位である。部位１への修飾は、野生型ＧＨに比較して高いＧＨＲに対する親和性を持つＧＨ分子を生成する。これらの修飾ＧＨ分子はアゴニストとして作用する。部位２の修飾も開示されており、それはＧＨアンタゴニストの生成をもたらす。部位１についてのＧＨの結合親和性を変化させる修飾の更なる例は、米国特許第５,８５４,０２６号；米国特許第６,００４,９３１号；米国特許第６,０２２,７１１号；及び米国特許第６,１３６,５６３号に開示されており、それら各々を参考として取り入れるものとする。部位２の修飾も開示されており、特にＧＨにおけるアミノ酸残基Ｇ１２０が、アルギニン、リジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、又はグルタミン酸に修飾されると、アンタゴニスト特性を持つＧＨ分子が生成される。
【００２７】
我々の係属中の出願ＷＯ０３／０７０７６５において、参考として取り入れるが、我々は、ＧＨレセプター活性化に対してアンタゴニスト活性を持つＧＨ変異体の融合を記載した。ＧＨ変異体を、成長ホルモンレセプターの細胞外ドメインに可撓性リンカーを介して融合した。このキメラポリペプチドは、遅いクリアランス及びアンタゴニスト活性を示した。類似のキメラポリペプチドであるが、不撓性又は部分的可撓性のリンカーのものの提供も、本明細書に開示する本発明の範囲内にある。
【００２８】
これに代わる本発明の好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは、少なくとも２つのプロラクチン、又はプロラクチン変異体の結合ドメインを含む。
本発明の好ましい実施態様では、前記プロラクチン変異体ポリペプチドはアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列はヒトプロラクチンの位置１２９で修飾されている。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様では、前記修飾はアミノ酸置換である。好ましくは、前記置換は、グリシンアミノ酸残基をアルギニンアミノ酸残基で置き換えるものである。好ましくは、前記修飾は、少なくとも９、１０、１１、１２、１３又は１４末端アミノ酸残基の欠失を更に含む。
これに代わる本発明の実施態様では、ポリペプチドの結合ドメインは互いに類似していない。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは、成長ホルモン結合ドメインである第１の結合ドメイン及びプロラクチン結合ドメインである第２の結合ドメインを含む。
好ましくは、前記ポリペプチドは、成長ホルモン結合ドメイン及びプロラクチン結合ドメインからなる。
【００３１】
これに代わる本発明の好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは、修飾された成長ホルモン結合ドメインである第１の結合ドメイン及び修飾されたプロラクチン結合ドメインである第２の結合ドメインを含む。
好ましくは、前記ポリペプチドは、修飾された成長ホルモン結合ドメイン及び修飾されたプロラクチン結合ドメインからなる。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様では、前記修飾された成長ホルモン結合ドメインは、グリシン１２０のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。好ましくは、前記修飾は、グリシン１２０の、アルギニン、リジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、又はグルタミン酸から選択されるアミノ酸での置換である。
本発明の好ましい実施態様では、前記修飾は、グリシン１２０のアルギニンアミノ酸残基での置換である。
【００３３】
本発明の更に好ましい実施態様では、前記修飾されたプロラクチン結合ドメインは、グリシン１２９の修飾を含む。好ましくは、前記修飾は、グリシン１２９のアルギニンアミノ酸残基での置換である。好ましくは、前記修飾は、９、１０、１１、１２、１３又は１４アミノ末端アミノ酸残基の欠失を更に含む。
【００３４】
本発明の更に好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは、サイトカインレセプターのリガンド結合ドメインを更に含む。好ましくは、前記レセプターは成長ホルモンレセプターである。これに代わる本発明の好ましい実施態様では、前記レセプターはプロラクチンレセプターである。
本発明の好ましい実施態様では、前記リガンド結合ドメインは、不撓性の螺旋領域を含む又はそれからなるリンカーによって、前記サイトカイン結合ドメインに連結されてもよい。
【００３５】
本発明の更なる態様では、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。
本発明の好ましい実施態様では、前記核酸分子は、前記ポリペプチドの発現のために適合されたベクターである。
典型的には、その適合は、細胞／組織特異的発現を媒介する転写調節配列（プロモータ配列）の提供を含む。これらのプロモータは、細胞／組織特異的、誘導性又は構造性であってよい。
【００３６】
プロモータは、この分野で認められた用語であり、明確にするために以下の特徴を含むが、これらは例示するためだけに与えるものである。エンハンサー要素はｃｉｓ作用性核酸配列であり、遺伝子の転写開始部位の５’に多く見られる（エンハンサーは、遺伝子配列の３’にも見られ、又は隣接配列に位置することもある、従って位置独立的である）。エンハンサーは、エンハンサーが結合した遺伝子の転写速度を向上させるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサー要素に特異的に結合することが示されたｔｒａｎｓ作用性転写因子（ポリペプチド）に依存する。転写因子（David S LatchmanによるEukaryotic Transcription Factors, Academic Press Ltd, San Diego参照）の結合性／活性は、環境的合図の数に依存し、それは、例えば、中間的代謝物（例えばグルコース）、環境的エフェクター（例えば熱）を含む。
【００３７】
またプロモータ要素は、いわゆるＴＡＴＡボックス及びＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列を含み、それは転写開始の部位を選択するよう機能する。これらの配列は、ポリペプチドにも結合し、それは、中でも、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を促進するように機能する。
適合は、選択可能なマーカー及び自律的複製配列の提供を含み、それらは共に真核ま原核細胞におけるベクターの維持を促進する。自律的に維持されるベクターは、エピソーマルベクターと呼ばれる。
【００３８】
ベクターにコードされる遺伝子の発現を促進する適合は、転写停止／ポリアデニル化配列の提供を含む。これはまた、２又は多−シストロン発現カセットに配列されたベクターにコードされる遺伝子の発現を最大化するように機能する内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）の提供を含む。
【００３９】
これらの適合は、当該分野で良く知られている。発現ベクター構築及び組換えＤＮＡ技術一般に関するかなりの数の文献が出版されている。Sambrook等, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY 及びそれらの参考文献；Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol III IRL Press, Oxford UK； DNA Cloning: F M Ausbel等, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照されたい。
【００４０】
本発明のベクターが、遺伝子治療ベクターでありうることは当業者には明らかであろう。遺伝子治療ベクターは、典型的にはウイルスベクターである。多くのウイルスが、外来遺伝子の輸送のためのベクターとして共通して使用されている。共通して使用されるベクターは、組換え的に修飾されたエンベロープ又は非エンベロープＤＮＡ及びＲＮＡウイルスを含み、好ましくはバキュロウイルス、パルボウイルス、ピコルノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、又はピコルナウイルスから選択される。キメラベクターも用いることができ、それらは親ベクターの各特性の有利な要素を活かしている（例えば、Feng, 等 (1997) Nature Biotechnology 15: 866-870参照）。それらのベクターは、野生型でも、組換えＤＮＡ技術により修飾され、複製不全、条件的複製又は複製コンピテントとされていてもよい。
【００４１】
好ましいベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びレトロウイルスゲノムから誘導される。本発明の最も好まし実施形態では、ベクターは、ヒトアデノウイルスゲノムから誘導される。特に好ましいベクターは、ヒトアデノウイルスの血清型２又は５から誘導される。そのようなベクターの複製能力は、Ｅ１ａ及び／又はＥ１ｂコード化領域のおける修飾又は欠失によって（「複製不全」と考えられる点まで）弱めてよい。特別な発現特性を達成し、又は複製管理又は低免疫反応を許容するためのウイルスゲノムに対する他の修飾は好ましい。
【００４２】
あるいは、ウイルスベクターは、条件的複製又は複製コンピテントであってよい。条件的複製ウイルスベクターは、不都合な広い範囲の感染を回避して特定の細胞型における選択的発現を達成するために使用される。条件的複製ベクターの例は、Pennisi,E. (1996) Science 274: 342-343; Russel, and S.J. (1994) Eur. J. of Cancer 30A(8): 1165-1171に記載されている。選択的複製ベクターの他の例は、ウイルスの複製に必要な遺伝子がプロモータの制御下にあり、そのプロモータが特定の細胞型又は細胞状態においてのみ活性であるため、そのような遺伝子の発現が無ければウイルスが複製されないベクターを含む。そのようなベクターの例は、１９９７年１２月１６日発行のHenderson等, 米国特許第５,６９８４４３号、１９９９年２月１６日発行のHenderson等, 米国特許第５,８７１,７２６号に記載されており、それらの全教示を参考として本明細書に取り入れるものとする。
【００４３】
さらに、ウイルスゲノムは、或る条件下でのみ複製又は発現を達成する誘導プロモータを含むように修飾してもよい。誘導プロモータの例は、化学文献（例えば、Yoshida及びHamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230: 426-430; Iida等 (1996) J. Virol. 70(9): 6054-6059; Hwang等 (1997) J. Virol 71(9): 7128-7131; Lee等 (1997) Mol. Cell Biol. 17(9): 5097-5105;及びDreher等 (1997) J. Biol. Chem. 272(46); 29364-29371）において知られている。
【００４４】
また、ベクターは非−ウイルス性でもよく、当業者が容易に利用できる多くの商業的供給源から入手可能である。例えば、ベクターはエピソーマル又はインテグレーティングであるプラスミドであってもよい。
【００４５】
本発明の更なる態様では、本発明の核酸又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされた細胞が提供される。
本発明の好ましい実施態様では、前記細胞は真核細胞である。
好ましくは、前記真核細胞は、真菌細胞、例えば、Saccharomyces cervisiae, Pichia spp；粘菌（例えば、Dictyostelium spp）；昆虫細胞（例えば、Spodoptera frugiperda）；植物細胞、又は哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）からなる群から選択される。
これに代わる本発明の好ましい実施態様では、前記細胞は原核細胞である。
【００４６】
本発明の更なる態様では、本発明のポリペプチドを製造する方法が提供され、前記方法は、
ｉ）本発明の細胞を、本発明のポリペプチドの製造を導く条件下で成長させる工程、及び、
ｉｉ）細胞、又は成長環境からポリペプチドを単離する工程を含む。
【００４７】
本発明の好ましい方法では、前記ポリペプチドは、親和性タグとともに提供される。
親和性タグは、当該分野で知られており、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、カルモジュリン結合タンパク質、及びポリヒスチジントラックのタンパク質への加工を含み、それは次いでニッケル含有マトリクス上での親和性精製によって精製される。多くの場合、商業的に入手可能なベクター及び／又はキットは、対象とするタンパク質を適切な親和性タグに融合するために使用でき、それは次いで発現、それに続く親和性マトリクスでの抽出及び精製のために宿主細胞にトランスフェクトされる。
【００４８】
我々の係属中の出願、ＷＯ０３／０３４２７５において、その内容を参考として取り入れるが、我々は、ポリペプチドへのグリコシルホスファチジルイノシトールの付加を制御するシグナル配列を含むドメインをル要するポリペプチドのための新規な親和性タグを記載している。グリコシルホスファチジルイノシトールタグを含むポリペプチドは、優先的に脂質膜に挿入され、サイトカインレセプター活性化に対してアンタゴニスト的な効果を有する。従って、本明細書に開示される本発明は、結合したグリコシルホスファチジルイノシトール分子を持つポリペプチドを含む。
【００４９】
本発明の更なる態様では、第２のサイトカイン結合ドメインに連結された第１のサイトカイン結合ドメインを含むポリペプチドが提供され、前記ポリペプチドはサイトカインレセプターの細胞外ドメインを更に含む。
本発明の好ましい実施態様では、前記第１及び第２の結合ドメインは、可撓性のリンカー分子で連結されている。
【００５０】
これに代わる本発明の実施態様では、前記第１及び第２の結合ドメインは、不撓性の螺旋領域を含むペプチドリンカー分子で連結されている。
本発明の好ましい実施態様では、前記第１及び第２の結合ドメインは、不撓性の螺旋領域及び可撓性の非螺旋領域を含むペプチドリンカー分子で連結されている。
【００５１】
不撓性の螺旋領域及び不撓性螺旋領域と可撓性非螺旋領域の組み合わせを含むペプチドリンカーは上記で既に記載しており、既に特定したようにサイトカイン及びサイトカインレセプターである場合、本発明のこの実施態様に適用可能である。
本発明の好ましい実施態様では、サイトカインレセプターの細胞外ドメインが、リンカー分子を介して第１間第２のサイトカイン結合ドメインに連結される。好ましくは、前記リンカー分子は、不撓性の螺旋領域を含む。
【００５２】
これに代わる本発明の好ましい実施態様では、前記リンカー分子は可撓性である。
好ましくは、前記リンカー分子は、不撓性の螺旋領域及び可撓性の非螺旋領域を含む。
本発明の好ましい実施態様では、前記サイトカイン結合ドメインは、成長ホルモン、又はその成長ホルモン変異体であり、前記細胞外ドメインは、成長ホルモン細胞外ドメインである。好ましくは、前記ドメインはヒトである。
【００５３】
本発明のポリペプチドは２つの機能を示す。第一に、サイトカイン又はその一部を含む第１及び第２のドメインは、好ましくは不撓性螺旋領域を含むペプチドリンカー分子によって連結されており、細胞表面サイトカインレセプターに結合することができ、これらのレセプターの結合をレセプター複合体で立体的に妨害するため、下流の細胞シグナル伝達を防止する。第二に、サイトカインレセプター又はその一部を含む第３のドメインを提供することは、可溶性レセプターとして機能することが可能であり、よって、それが細胞表面レセプターに結合する前に、任意のサイトカインを連結する。この第３のドメインは、好ましくは第１又は第２のドメインと、不撓性螺旋領域を含むペプチドリンカー分子によって連結される。これに代わる本発明の実施態様では、第３のドメインは、好ましくは第１又は第２のドメインと、可撓性の非螺旋領域を含むペプチドリンカーによって連結される。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様では、前記ペプチドリンカー分子は、タンパク質分解的解裂に感受性のアミノ酸配列を更に含む。
本発明の更なる態様では、本発明のポリペプチド又は核酸分子の医薬としての使用が提供される。
好ましくは、本発明のポリペプチド又は核酸分子を含む医薬組成物が提供される。好ましくは、前記医薬組成物は、キャリア、賦形剤、及び／又は希釈剤を含む。
【００５５】
投与されるとき、本発明の治療用組成物は、製薬的に許容される製剤で投与される。「製薬的に許容される」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害しない非毒性の材料を意味する。そのような製剤は、通常、塩、緩衝剤、適合性キャリア、防腐剤及び任意の他の治療剤を含む。
【００５６】
医薬において使用される場合、塩は製薬的に許容されなけらばならないが、非製薬的に許容される塩を、便宜的に製薬的に許容される塩の調製に使用してもよく、本発明の範囲から除外されるものではない。薬理学的及び製薬的に許容される塩は、限定されないが、以下の三から調製されるものを含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、等。また、製薬的に許容される塩は、ナトリウム、カリウム又はカルシウム塩などの、アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩として調製することもできる。
【００５７】
医薬組成物は、適切な緩衝剤を含有してもよく、酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、及びリン酸塩を含む。
組成物は、所望される場合は、製薬的に許容されるキャリアと混合してもよい。「製薬的に許容されるキャリア」という用語は、本明細書において、ヒトへの投与に適した１又はそれ以上の適合性固体又は液体フィラー、希釈剤又はカプセル化物質を意味する。「キャリア」という用語は、適用性を向上させるために活性成分と混合される、有機又は無機の、天然又は合成の成分を示す。また医薬組成物の成分は、本発明の分子と、そして互いに、所望の医薬的有効性を実質的に損なう相互作用が無いような方法で混合することができる。
【００５８】
医薬組成物は、単位投与形態で提供してもよく、製薬業で良く知られた任意の方法で調整してもよい。全ての方法は、活性成分を１又はそれ以上の補足成分からなるキャリアと混合する工程を含む。一般的に、組成物は均一かつ緊密に調製され、活性化合物が、液体キャリア、微細化された固体キャリア、又はその両方と混合され、次いで必要ならば製品に成形される。
また医薬組成物は、任意に、適切な防腐剤、例えば、塩化ベンズアルコニウム、クロロブタノール、パラベン及びチメロサールを含んでいてもよい。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、注入を含む任意の従来の経路によって投与しても、又は長時間徐々に注入してもよい。投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、又は経皮であってよい。
経口投与に適した組成物は、各々が所定量の活性化合物を含有するカプセル、錠剤、トローチ剤などの別々の単位として提供してもよい。他の組成は、水性液体、シロップなどの非水性液体、エリキシル剤又はエマルジョンを含む。
【００６０】
本発明の組成物は有効量で投与される。「有効量」とは、単独で、又は更なる投薬とともに、所望の応答を生ずる組成物の量である。癌などの特定の疾患を治療する場合、所望の応答とは疾患の進行を阻害することである。これは、疾患の進行を一時的に遅延させることのみを含み得るが、より好ましくは、疾患の進行を永久に停止させることを含む。これは、常套的な方法で監視することができる。
【００６１】
そのような量は、当然のことながら、治療すべき特定の病状、病状の重篤さ、個々の患者のパラメータ、例えば、年齢、身体条件、大きさ及び重さ、治療の継続時間、併用療法（ある場合には）、特定の投与経路、及び健康実務者の知識及び技量の範囲内にある類似の要因に依存する。これらの要因は、当業者に良く知られており、日常的な実験を超えることなく対処できる。一般的には、各成分又はそれらの組み合わせの最大投与量、即ち、正常な医学的判断に従った最高の安全投与量を使用するのが好ましい。しかしながら、当業者は、患者が、医学的理由、生理学的理由、又は事実上他の任意の理由により、より低い投与量又は我慢できる投与量を主張しうることを理解するであろう。
【００６２】
本発明の更なる態様では、本発明のポリペプチド又は核酸分子の、末端肥大症；巨人症；ＧＨ欠乏症；ターナー症候群；腎不全；骨粗鬆症；骨関節炎；真性糖尿病；癌（例えば、前立腺癌、子宮頚癌、乳癌、黒色腫、ヘパトーマ、腎臓癌、神経膠腫、膀胱癌、肺癌、神経癌、卵巣癌、睾丸癌、膵臓癌、消化管癌、リンパ腫）；肥満；インシュリン抵抗性；高脂血症；高血圧症；貧血；自己免疫性及び感染性疾患；関節リウマチを含む炎症性疾患からなる群から選択される疾患治療のための医薬の製造のための使用が提供される。
【００６３】
また本発明は、有効量のポリペプチド、核酸分子、医薬組成物又は医薬を患者に投与することを含むヒト又は動物患者を治療する方法も提供する。
【００６４】
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通じて、「含む」という語及びその語の変形、例えば、「含んでいる」は、「含むが限定されない」ことを意味しており、他の部分、添加物、成分、整数又は工程を排除することを意図しない。
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通じて、単数形は、前後関係で特に要求しなければ複数形も包含する。特に、制限のない記載が用いられている場合、本明細書は、前後関係で特に要求しなければ複数並びに単数を考慮していると解される。
本発明の特定の態様、実施態様又は実施例とともに記載される特徴、整数、特性、化合物、化学的部分及び基は、矛盾がなければ、本明細書に記載された他の全ての態様、実施態様又は実施例に適用可能であると解される。
本発明の実施態様が、例示するためだけに、添付の図面を参照して記載される。
【００６５】
材料及び方法
ＧＨタンデムにおけるリンカーの修飾は、発現されたタンパク質のＮ末端から突出した３０アミノ酸を除去するよう修正されたＧＨ−(Ｇ４Ｓ)−ＧＨ分子（χ１Ｃ１）に対する遺伝子から開始され、また遺伝子は、修正されたｐＥＴ２１（＋）ベクターにサブクローニングされてｐＥＴ２１：χ１Ｃ１ｂが生成された（図３）。
可撓性末端を持つ螺旋状リンカーを持つ構築物のために、リンカーは、相補的なオリゴヌクレオチドを互いに連結することにより構築され；これらのオリゴヌクレオチドは、所望のリンカーをコードし、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化されたベクターｐＥＴ：χ１Ｃ１ｂに結合する末端を有するように設計された。これらのリンカーの総括を図４に示す。
【００６６】
ＧＨドメイン間の堅固なリンカーのために、ＧＨドメインは、それらのＣ末端（ＧＨ１）及びＮ末端（ＧＨ２）を切り取って、ドメインが螺旋の末端で終端するようにしなければならなかった。次いで、縮重コドン法を利用して、制限部位が設計され、それにより新たなリンカーが、２つのドメイン間に形成される螺旋を妨害することなく導入される（図５Ａ）。プライマーは、これらの修飾をＧＨタンデムのＧＨドメインに実行するように設計された（図５Ｂ）。得られた構築物は、χ１Ｃ５と呼ばれる（図６）。相補的なオリゴヌクレオチドが、ＮｏｔＩ及びＮｒｕＩに隣接するリンカー領域を生成するために使用され、これらは次いで、ＮｏｔＩ及びＮｒｕＩで消化されたｐＥＴ：χ１Ｃ５にライゲートされた。これらのリンカーの概略を図７に示す。
【００６７】
構築物の発現は、第一にｐＥＴ発現ベクターを発現株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓＲＩＰＬにトランスフォームすることにより実施した。発現は多くの条件下で実施でき、それは異なるインキュベーション温度（例えば、室温、３７℃）、異なる媒体（例えば、ＬＢ、２ＹＴ、５ＹＴ、等）、異なる誘導点（即ち、培地が誘導されるＯＤ６００）、培地を誘導するために使用される異なるＩＰＴＧ（又は他のインデューサ）濃度、及び誘導後に細胞が収集される時間を含む。
【００６８】
構築物のＣ末端にＨｉｓ−タグを付加することができ、それは固定化金属イオンクロマトグラフィ（Ｎｉ２＋又はＣｏ２＋カラム）を用いた精製を促進する。Ｈｉｓ−タグを持たない構築物は、種々の手段、例えばイオン交換クロマトグラフィ、疎水性カラム及びサイズ排除クロマトグラフィを用いて精製されうる。適切な純度のタンパク質を生成するためにこれらの精製技術の１又はそれ以上が必要な場合もある。
【００６９】
χ１Ｃ５の構築
修飾したＧＨドメインは、ＰＣＲ及び関連するプライマーを用いて生成された。ＧＨ１はＤｉＧＨＮｃｏＧＦ及びＧＨ［ＡＥＡ３］ＮｏｔＲを用いて修飾され、ＧＨ２はＥｃｏＩ−（Ｎｒｕ）ＧＨ−Ｆ及びＧＨＤ*−ＨＲを用いて修飾された。ＰＣＲ反応は、１ｍｌの １００ｐｍｏｌ／ｍｌ フォワードプライマー、１ｍｌの１００ｐｍｏｌ／ｍｌ リバースプライマー、１ｍｌの ｐＴｒｃＨｉｓＧＨｓｔｏｐ（希釈）、１ｍｌの１０ｍＭｄＮＴＰｓ、５ｍｌの１０ｘ 増幅バッファー、１ｍｌの５０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．５ｍｌのＰｆｘ ポリメラーゼ、３９．５ｍｌの無菌水からなる。ＰＣＲは、これらの反応混合物に対して、以下の温度プロフィールで実施した；９５℃で５分間；１５ ｘ （９５℃で４５秒間、５５℃で ４５秒間、７２℃で４５秒間）；７２℃で５分間。ＰＣＲ産物は、アガロースゲルを用いて確認し、所望のＰＣＲ産物を精製した。修飾したＧＨ１を、ｐＥＴ２１：χ１Ｃ１ｂに、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ部位の間にライゲートして、ｐＥＴ２１：χ１Ｃ４を得た。修飾したＧＨ２は、ｐＥＴ２１：χ１Ｃ４に、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にライゲートして、ｐＥＴ２１：χ１Ｃ５を得た。このプロセスの概略を図８に示す。
【００７０】
リンカー変性物
プライマーのリン酸化
リンカーを生成するために２又はそれ以上のプライマー二本鎖が必要な場合は、内部５’末端を含むプライマーを第一にリン酸化した。リン酸化すべき各プライマーのために以下の反応混合物を作成した：２ｍｌの１００ｐｍｏｌ／ｍｌ オリゴヌクレオチド、２ｍｌの１０ｘ キナーゼバッファー、２ｍｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、１３ｍｌの無菌水、１ｍｌのＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／ｍｌ）。これらを、３７℃で３０分間、次いで７０℃で１０分間インキュベートした。次いで、サンプルを、アニーリングバッファー （１０ｍＭ ＴＲＩＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５−８．０）を用いて１：１０に希釈し、０．１ｐｍｏｌ／ｍｌの溶液を得た。これらは、次いで、以下のアニーリング反応に使用できた。
【００７１】
プライマー二本鎖のアニーリング
プライマーを、アニーリングバッファー（１０ｍＭ ＴＲＩＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５−８．０）を用いて０．１ｐｍｏｌ／ｍｌに希釈した。１０ｍｌの相補的プライマーを新鮮なチューブ内で混合した。チューブを９５℃で２分間インキュベートし、温度を４０−６０分間の時間で３０℃まで低下させた。
１を超えるプライマー二本鎖が必要な場合は、等量のプライマー二本鎖を混合して、所望の隣家を形成するのに必要な全ての二本鎖を含有する溶液を得た。溶液は、次いで氷上に保存した。
【００７２】
ライゲーション及びトランスフォーメーション
関連する制限酵素で消化したベクター（例えば、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化したｐＥＴ２１：χ１Ｃ１ｂ又はＮｏｔＩ及びＮｒｕＩで消化したｐＥＴ２１：χ１Ｃ５）の約２００ｎｇを４ｍｌのアニールしたプライマー、１ｍｌのリガーゼバッファー、２ｍｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼととみインキュベートし、反応物を無菌水で１０ｍｌにした。これらを氷のビーカーで終夜インキュベートし、その間に解凍させた。５ｍｌの終夜ライゲーションさせたものを、次いで、５０ｍｌの化学的コンピテントなＥ．ｃｏｌｉＳＵＲＥ細胞に添加した。これを氷上で１時間インキュベートし、次いで、４２℃で３０秒間熱衝撃を与えた。細胞に４５０ｍｌのＬＢ媒体を添加し、次いでサンプルを３７℃で３０分間インキュベートした。次に、ミニーカルチャーを４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られたペレットを５０ｍｌのＬＢ媒体中に再懸濁させ、次いで、カルベニシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１０ｍｇ／ｍｌ）及びグルコース（０．３％ ｗ／ｖ）を含むＬＢプレートにプレーティングした。これを３７℃で終夜インキュベートした。
得られたコロニーをスクリーニングし、リンカーの変性が成功したことをチェックした。
【００７３】
一般的方法の修正
ｐＥＴ２１：χ１Ｃ５を消化するための制限酵素ＮｏｔＩ及びＮｒｕＩを用いた堅固なリンカーを持つ構築物の生成は、トランスフィーめーション後にネガティブコントロールプレート（ライゲーション反応にプライマー二本鎖が無い）上に多くのコロニーを生成させ、従って、ポジティブコントロールをスクリーニングするのが困難であった。これは、消化されたベクターの脱リン酸化を反映しており；１５μｌのＮｏｔＩ及びＮｒｕＩで消化されたｐＥＴ２１：χ１Ｃ５を、２ｍｌ ＣＩＡＰ １０ｘ ｂｕｆｆｅｒ、１ｍｌ ＣＩＡＰ（コウシ腸アルカリホスファターゼ）（１０Ｕ／ｍｌ）及び２ｍｌ無菌水と混合した。これを、３７℃で１時間、次いで８０℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＤＮＡを精製キット（例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて溶液から精製した。プライマー二本鎖を作成するために使用した全てのプライマーは、上記の方法を用いてリン酸化した。リン酸化したプライマー二本鎖は、次いで上記のように脱リン酸化されたベクターにライゲートした。
【００７４】
χ１Ｌ１のクローニング及び発現
成長ホルモンＧＨの２つのドメインからなるχ１Ｌ１は、単一の細胞外成長ホルモンドメインに続き、これらのドメイン各々は、現在は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ４）リンカーで連結されている（図８）。χ１Ｌ１のヌクレオチド配列を図９に示し、アミノ酸配列を図１０に示す。
χ１Ｌ１は、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ部位に隣接するｈＧＨ遺伝子を、χ１Ｅ２（ＧＨＲａ−ＧＨＧＨＲｂ）に連結することにより構築し、これはχ１Ｋ１を与えた。ＧＨＲドメインは、次いでχ１Ｋ１に、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間で連結し、χ１Ｌ１を与えた。この手法の模式図を図１１に示す。
【００７５】
χ１Ｌ１遺伝子をシーケンスによってチェックし、正しいことが確認された。発現は、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓＲＩＰＬ細胞内の修飾したｐＥＴ２１（＋）ベクターを用いて実施した。１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）と０．５−０．６のＯＤ６００で４時間インキュベートした後にＬＢ媒体中に発現されたタンパク質は、部分的に可溶性であり、ＧＨに対してプローブされたウエスタンブロットにおいて多重のＭｗバンドが観察された（図１２）。
χ１Ｌ１のＣ末端Ｈｉｓ−タグバージョンは、Ｃｏ２＋カラムを用いて精製した（図１３）。タンパク質調製物中に混入した多くのタンパク質及び多重のバンドが得いす単ブロットにおいて未だ観察された。このタンパク質の調製物の予備的バイオアッセイは、それが有意なアゴニスト活性を持つことを示した（図１４）。
【００７６】
プロラクチンタンデム及びプロラクチン：成長ホルモンタンデムの構築
ＰＲＬ及びＧＨタンデムは、標準的なＰＣＲ技術、次いで調製されたベクターのライゲーション及びトランスフォーメーションを用いて生成した。リンカーは、アニールしたオリゴヌクレオチド対を調製したベクターにライゲーション及びトランスフォーメーションすることにより変化させられる。ＰＲＬ及びＧＨタンデムについての３つの例示的方法を以下に示す。
【００７７】
方法１
ＰＲＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＰＲＬの生成
１．ＰＲＬのＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ部位の間でのＰＣＲ（フォワードプライマー＝ａｔａｔｃｃａｔｇｇｇｃＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＣ；リバースプライマー＝ａｔａｔａｔａｔａｔａｔｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃＧＣＡＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＧＧ）。
２．ＰＣＲ産物のＮｃｏＩ及びＮｏｔＩでの消化。
３．複製ベクターのＮｃｏＩ及びＮｏｔＩでの消化→ｐＥＴ２１（ｍ）χ１Ｃ１ｂ（即ち、ＧＨ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨ）。
４．ＰＣＲ産物のベクターへのライゲーション；ｐＥＴ２１（ｍ）ＰＲＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨを与える。
５．ＰＲＬのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩＩ部位間でのＰＣＲ（フォワードプライマー＝ａｔａｔｇａａｔｔｃＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＣ； リバースプライマー＝ａｔａｔａａｇｃｔｔＧＣＡＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＧＧ）。
６．ＰＣＲ産物のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでの消化。
７．複製ベクターのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでの消化→ｐＥＴ２１（ｍ）ＰＲＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＨ。
８．ＰＣＲ酸靴のベクターへのライゲーション；ｐＥＴ２１（ｍ）ＰＲＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＰＲＬを与える。
【００７８】
方法２
ＰＲＬ−Ａ（ＥＡ３Ｋ）２Ａ−ＧＨの生成
１ ＰＲＬのＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ部位間でのＰＣＲ（フォワードプライマー＝ａｔａｔｃｃａｔｇｇｇｃＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＣ； リバースプライマー＝ａｔａｔａｔａｔａｔａｔｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃＧＣＡＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＧＧ）。
２ ＰＣＲ産物のＮｃｏＩ及びＮｏｔＩでの消化。
３ 複製ベクターのＮｃｏＩ及びＮｏｔＩでの消化→ｐＥＴ２１（ｍ）Ｔ１ａＥＡＫ２ （即ち、ＧＨ−Ａ（ＥＡ３Ｋ）２Ａ−ＧＨ）。
４ ＰＣＲ産物のベクターへのライゲーション；ＰＲＬ−Ａ（ＥＡ３Ｋ）２Ａ−ＧＨを与える。
【００７９】
方法３
ＰＲＬ−Ａ（ＥＡ３Ｋ）４Ａ−ＰＲＬの生成
１． Ａ（ＥＡ３Ｋ）４Ａリンカーの生成のためのプライマーのアニール。
２． 複製ベクターのＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩでの消化→ｐＥＴ２１（ｍ）ＰＲＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＰＲＬ（上記例１から）。
３．オリゴヌクレオチドダイマーのベクターへのライゲーション；ＰＲＬ−Ａ（ＥＡ３Ｋ）４Ａ−ＰＲＬを与える。
上記の方法は、図２４に例示してある。
【００８０】
実施例１
半堅固タンデム
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＰＬ細胞を、カルベニシリン、テトラサイクリン及びコラムフェニコール(choramphenicol)を添加した１０ｍｌのＬＢ媒体中で成長させた。細胞は、３７℃で振とうさせながら成長させた。培地を、０．４−０．７のＯＤ６００において１ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧを用いて誘導した。細胞を、リゾチーム、デオキシコール酸ｍ及び超音波処理を組み合わせて溶解させた。次いで可溶性画分を遠心分離で単離した。クマシー染色したＰＡＧＥゲルにより、タンデムの発現の明確なバンドが示された。
【００８１】
可溶性画分をＥＬＩＳＡにより決定し、４０ｎｇ／ウェルのタンデムを１２％ＰＡＧＥゲル上に負荷した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ウサギ抗−ＧＨ Ａｂ（一次）及び抗−ウサギ−ＨＲＰ Ａｂ（二次）を用いてウエスタンブロットした；図１６ｄ参照。半堅固リンカーを持つＧＨタンデムの生物活性を図１６ｅに示す。
【００８２】
実施例２
堅固タンデム
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＰＬ細胞を、カルベニシリン、テトラサイクリン及びコラムフェニコール(choramphenicol)を添加した１０ｍｌのＬＢ媒体中で成長させた。細胞は、３７℃で振とうさせながら成長させた。培地を、０．４−０．７のＯＤ６００において１ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧを用いて誘導した。培地を更に４時間成長させた後に収集した。
【００８３】
細胞を、リゾチーム、デオキシコール酸及び超音波処理を組み合わせて溶解させた。次いで可溶性画分を遠心分離で単離した。クマシー染色したＰＡＧＥゲルにより、タンデムの発現の明確なバンドが示された。
可溶性画分をＥＬＩＳＡにより決定し、４０ｎｇ／ウェルのタンデムを１２％ＰＡＧＥゲル上に負荷した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ウサギ抗−ＧＨ Ａｂ（一次）及び抗−ウサギ−ＨＲＰ Ａｂ（二次）を用いてウエスタンブロットした；図１７ｄ参照。堅固リンカーを持つＧＨタンデムの生物活性を図１７ｅに示す。
【００８４】
実施例３
タンデムの精製
構築物Ｔ１ｃＥＡＫ２＋３Ｈｉｓ及びＴ１ｃＥＡＫ２＋４Ｈｉｓを、バイオアッセイにおける初期超最大活性(initial supra-maximal activities) に基づいて更に実験するためにショートリストに載せた。発現プラスミドを Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｏｄｏｎｐｌｕｓ ＲＩＰＬ細胞にトランスフォームし、ＩＬバッチ培地中で発現を実施した。可溶性タンパク質画分に対して、Ｎｉ−キレート固定化金属イオンクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）及びイオン交換クロマトグラフィの組み合わせを用いて精製を実施した。ＩＭＡＣは最初の精製工程であり、ｐＨ勾配（ｐＨからｐＨ３）を用いて初期溶離がなされる；しかしながら、カラム洗浄において多くのタンパク質が失われたことがわかった。従って、我々は精製方法における戦略を変更し、イミダゾール溶離（０から５０Ｍのイミダゾール）を用いることに戻り、＞７０％の純度を達成した。次いで、イオン交換カラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ）を＞９０％の更なる精製に使用した。これを図１８に例示する。
【００８５】
ＥＬＩＳＡに基づく定量化の結果：
Ｔ１ｃＥＡＫ２＋３Ｈｉｓ（ＲＱ１３／４） ＝ ２１５μｇ／ｍｌ；
Ｔ１ｃＥＡＫ２＋３Ｈｉｓ（ＲＱ１４／４） ＝ １７７μｇ／ｍｌ
各々１ｍｌを得たので、全収量は３９２μｇである。これは、２リットルの培地から得た→１リットルあたりの収量 ＝ 〜２００μｇ。
Ｔ１ｃＥＡＫ２＋３−Ｈｉｓの活性は、より高いタンパク質濃度において、ｒｈＧＨより高い折り畳みの誘導に到達した。同様の結果はタンデムをモルベースで試験した場合に得られた、図１８Ｂ及び図１８Ｃ参照。Ｔ１ｃＥＡＫ２＋４Ｈｉｓに対して同様の分析を行った。精製及び生物活性を図１８Ｄ、１８Ｅ及び１８Ｆに示す。
【００８６】
Ｔ１ｃＥＡＫ２＋４Ｈｉｓ（ＲＱ１３／４）ＥＬＩＳＡに基づく定量化の結果 ＝ ５５０μｇ／ｍｌ。各々１ｍｌを得たので、全収量は５５０μｇである。これは、２リットルの培地から得た→１リットルあたりの収量 ＝ 〜２７５μｇ。Ｔ１ｃＥＡＫ２＋３−Ｈｉｓの活性は、より高いタンパク質濃度において、ｒｈＧＨより高い折り畳みの誘導に到達した。同様の結果はタンデムをモルベースで試験した場合に得られた。
【００８７】
実施例４
χ１Ｃ３の濃度は、ブラッドフォード(Bradford)アッセイを用いて測定した。ｒｈGH（１ｍｇ／ｍｌにおいて）を平行して測定し、ブラッドフォードアッセイから得られたデータの正しさを確認した。次いでχ１Ｃ３を用いて、ＧＨバイオアッセイのＧＨ標準を直接置換し、タンデム標準曲線を得た。純粋及び不純なタンデムサンプル及びｒｈＧＨを、ＧＨ標準曲線及びタンデム標準曲線に対して測定し、次いでタンパク質濃度を各ＥＬＩＳＡプレートから測定した。ＧＨのＥＬＩＳＡは、これらのＥＬＩＳＡによる測定した場合のタンデムの実測値の約２倍を与えた。これを図１９に例示する。
【００８８】
実施例５
プロラクチン／ＧＨタンデム
対応するアゴニスト的変異を持つ又は持たないプロラクチン及び／又はＧＨのタンデムは、タンデム遺伝子へのライゲーションを可能にするような遺伝子の何れかの末端への適切な制限部位に対するＰＣＲを用いて合成できる。
【００８９】
可撓性タンデム
タンデム遺伝子は、２つのタンパク質ドメインを（Ｇ４Ｓ）ｎに基づいて可撓性リンカーで連結することにより構築した；タンパク質ドメイン及びリンカーの各末端に独特の制限部位がある（図２０）。
従って、タンデムにおける２つのタンパク質ドメインは、異なるドメインで連結することにより変化させることができる。例えば、プロラクチン（ＰＲＬ）、プロラクチン１−１４アミノ酸欠失Ｇ１２９Ｒ変異体（Δ１−１４ＰＲＬ．Ｇ１２９Ｒ）、成長ホルモン（ＧＨ）及び成長ホルモンＧ１２０Ｒアンタゴニスト変異体（ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ）は、様々な方法でタンデム遺伝子に結合させることができる（図Ｂ）。図２２及び２３は、これらのドメインのヌクレオチド配列及びタンパク質配列を示している。
【００９０】
適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接する所望のタンパク質ドメインの遺伝子を精製するために標準ＰＣＲを使用することができる。ＰＣＲ産物及び複製ベクターをこれらの制限エンドヌクレアーゼで消化し、ライゲーション及びトランスフォームをすることにより、所望のタンパク質ドメインを持つタンデムが生成される。このプロセスは、タンパク質ドメイン又はリンカーの何れかに実施され（図２４）、既に記載したオリゴクレオチドダイマーを用いて置換される。
【００９１】
半堅固タンデム
タンデム遺伝子は、２つのタンパク質ドメインを配列Ａ（ＥＡ３Ｋ）ｎＡに基づいて螺旋リンカーで連結することにより構築した；タンパク質ドメイン及びリンカーの各末端に独特の制限部位がある（図２０）。
従って、タンデムにおける２つのタンパク質ドメインは、異なるドメインで連結することにより変化させることができる。例えば、プロラクチン（ＰＲＬ）、プロラクチン１−１４アミノ酸欠失Ｇ１２９Ｒ変異体（Δ１−１４ＰＲＬ．Ｇ１２９Ｒ）、成長ホルモン（ＧＨ）及び成長ホルモンＧ１２０Ｒアンタゴニスト変異体（ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ）は、様々な方法でタンデム遺伝子に結合させることができる（図２１）。図２２及び２３は、これらのドメインのヌクレオチド配列及びタンパク質配列を示している。
【００９２】
適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接する所望のタンパク質ドメインの遺伝子を精製するために標準ＰＣＲを使用することができる。ＰＣＲ産物及び複製ベクターをこれらの制限エンドヌクレアーゼで消化し、ライゲーション及びトランスフォームをすることにより、所望のタンパク質ドメインを持つタンデムが生成される。このプロセスは、タンパク質ドメイン又はリンカーの何れかに実施され（図２４）、既に記載したオリゴクレオチドダイマーを用いて置換される。
【００９３】
堅固タンデム
タンデムの２つのドメインは、ドメインＡのＣ末端α螺旋と末端ＢのＮ末端α螺旋を介して直接連結される必要がある。従って、タンパク質の遺伝子（図２２及び２３）はドメインＡ及びＢにおいて切断され、これらの螺旋に螺旋リンカー［Ａ［ＥＡ３Ｋ）ｎＡ］が直接結合されるようにしなければならない。
従って：
【００９４】
タンデム遺伝子は、２つのタンパク質ドメインを配列Ａ（ＥＡ３Ｋ）ｎＡに基づいて螺旋リンカーで連結することにより構築した；タンパク質ドメイン及びリンカーの各末端に独特の制限部位がある（図２０）。独特なＮｏｔＩ部位はリンカー領域のＮ末端に加工され、独特なＮｒｕＩ部位はＧＨのＣ末端に加工され（図５及び６）；これにより、リンカー領域をＧＨタンデムに変化させることが可能になる。
ＮｏｔＩを含むＮ末端リンカー配列は、ドメインＡ位置においてＰＲＬ遺伝子に付加され、構築すべきテンプレートＰＲＬ−リンカーＧＨに基づく構築を可能にする（図２５）。しかしながら、ドメインＢがＰＲＬである場合は、独特な制限部位は、リンカーとドメインＢとの境界に導入されなければならない（図２５）。
【００９５】
従って、タンデムにおける２つのタンパク質ドメインは、異なる切断されたドメインで連結することにより変化させることができる。例えば、プロラクチン（ＰＲＬ）、プロラクチン１−１４アミノ酸欠失Ｇ１２９Ｒ変異体（Δ１−１４ＰＲＬ．Ｇ１２９Ｒ）、成長ホルモン（ＧＨ）及び成長ホルモンＧ１２０Ｒアンタゴニスト変異体（ＧＨ．Ｇ１２０Ｒ）は、様々な方法でタンデム遺伝子に結合させることができる（図２１）。ドメインＡ又はドメインＢにおけるそれらの位置に依存して、タンパク質ドメインは上記のように切断されなければならない。
【００９６】
適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接する所望のタンパク質ドメインの遺伝子を精製するために標準ＰＣＲを使用することができる。ＰＣＲ産物及び複製ベクターをこれらの制限エンドヌクレアーゼで消化し、ライゲーション及びトランスフォームをすることにより、所望のタンパク質ドメインを持つタンデムが生成される。このプロセスは、タンパク質ドメイン又はリンカーの何れかに実施され、可撓性及び半堅固リンカーに対して使用された方法論と同様である（図２４）。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１Ａでは、サイトカインドメイン（楕円形）が、アルファ螺旋（影付き長方形）によって連結されている。可撓性リンカー（曲がった矢印）が、第１のサイトカインドメインを螺旋に、螺旋を第２のサイトカインドメインに結合させている。図１Ｂでは、サイトカインドメインはアルファ螺旋によって連結されている。可撓性リンカーが、第１のサイトカインドメインを螺旋リンカーに、螺旋リンカーを第２のサイトカインドメインに結合させている。
【図２】螺旋リンカーは可撓性のコネクタを持たず、その代わりに、サイトカイン１のＣ末端螺旋（４）に連続し、それをサイトカイン２のＮ末端螺旋（１’）と繋いで、単一の長い螺旋４−リンカー螺旋−１’によって連結された堅固なタンデムを形成している。従って、２つのサイトカインドメインの相対的な方向は固定されている。しかしながら、リンカーにアミノ酸を付加する又はアミノ酸を除去することにより異なる構造とすることによって、ドメインが異なる配向をした一連の堅固なタンデムを生成することができる。
【図３】構築物χ１Ｃ１ｂのマップ及びヌクレオチド／アミノ酸配列を示す。
【図４】可撓性末端を持つ螺旋リンカーを有するタンデムを生成するために使用したリンカーデザイン及びプライマーを示す。
【図５】Ａ）中断されない螺旋リンカーを作成するためのプライマー二本鎖のライゲーションを可能にするＧＨドメインとリンカーとの間の境界領域のデザインを示す。Ｂ）χ１Ｃ５を生成するためのχ１Ｃ１ｂの修飾に使用されたプライマーを示す。
【図６】構築物χ１Ｃ５のマップ及びリンカー領域の配列を示す。
【図７】リンカーデザイン及び堅固な螺旋リンカーを生成するために使用したプライマーの概要を示す。
【図８】χ１L1を構築するための方法を示す模式図である。
【図９】χ１L1のヌクレオチド配列を示す。ＧＨドメインは灰色で示し、ＧＨＲドメインは太字で示し、リンカーは下線を施した。
【図１０】χ１Ｌ１のアミノ酸配列を示す。ＧＨドメインは灰色で示し、ＧＨＲドメインは太字で示し、リンカーは下線を施した。
【図１１】χ１Ｌ１を構築するためのクローニング方法を示す模式図である。
【図１２】χ１L1の発現を示す。
【図１３】χ１Ｌ１−ＨＩＳの一次精製を示す。χ１Ｌ１−ＨＩＳはＣｏ２＋カラムを用いて精製された。
【図１４】χ１L1がアゴニスト活性を示すことを示すグラフである。
【図１５】堅固又は半堅固ＧＨ構築物に対して使用した命名法の概要を示す。
【図１６−１】ａ）半堅固リンカー配列を含むＧＨタンデムの核酸配列である。ｂ）半堅固リンカー配列を含むＧＨタンデムのアミノ酸配列である。
【図１６−２】ｃ）ＧＨタンデムの構築に使用された半堅固リンカーの例を示す。ｄ）半堅固リンカーを含むＧＨタンデムの細菌発現を例示する。ｅ）半堅固リンカーを含むＧＨタンデムの生物活性を例示する。
【図１７−１】ａ）堅固リンカー配列を含むＧＨタンデムの核酸配列である。ｂ）堅固リンカー配列を含むＧＨタンデムのアミノ酸配列である。
【図１７−２】ｃ）ＧＨタンデムの構築に使用された堅固リンカーの例を示す。
【図１７−３】ｄ）堅固リンカーを含むＧＨタンデムの細菌発現を例示する。ｅ）堅固リンカーを含むＧＨタンデムの生物活性を例示する。
【図１８−１】図１８Ａは、Ｔ１ｃＥＡＫ２＋３Ｈｉｓの精製及びクマシー染色及びウエスタンブロットによる分析を示す。
【図１８−２】図１８Ｂ及び１８Ｃは、Ｔ１ｃＥＡＫ２＋３Ｈｉｓの生物活性を示す。
【図１８−３】図１８Ｄは、Ｔ１ｃＥＡＫ２＋４Ｈｉｓの精製及びクマシー染色及びウエスタンブロットによる分析を示す。
【図１８−４】図１８Ｅ及び１８Ｆは、Ｔ１ｃＥＡＫ２＋４Ｈｉｓの生物活性を示す。
【図１９】成長ホルモンタンデムの検出のためのＥＬＩＳＡを例示する。
【図２０】可撓性、半堅固及び堅固リンカーによって連結された成長ホルモンタンデムの模式図である。
【図２１】プロラクチン（ＰＲＬ）、成長ホルモン（ＧＨ）及びそれらのアンタゴニスト的変異体の可能な組み合わせを例示する。
【図２２】プロラクチン及びそのアンタゴニスト的形態の一つ、１−１４アミノ酸切断Ｇ１２９Ｒ変異体（下線）を例示する。
【図２３】成長ホルモン及びそのアンタゴニスト的形態の一つ、Ｇ１２０Ｒ変異体（下線）を例示する。
【図２４】プロラクチンタンデムの模式図である。
【図２５】（Ａ）加工された制限部位、ＮｏｔＩ及びＮｒｕＩを持つＧＨ堅固タンデム構築物の模式図であり、リンカーが隣接するドメインの末端螺旋に直接結合することを可能にし、リンカーの変化を促進もしている。（Ｂ）加工された制限部位、ＮｏｔＩ及びＮｒｕＩを持つＰＲＬ−リンカー−ＧＨ堅固構築物の模式図であり、（Ａ）と類似する機能を有し、ＮｏｔＩ部位がリンカー領域にあるので、ドメインＡの切断されたＰＲＬ遺伝子にちょうど付加される。（Ｃ）ＰＲＬ堅固タンデムの模式図であり、独特な制限部位は、縮重したアミノ酸コードを用いて、リンカーとドメインＢのＰＲＬとの間の境界において加工され、タンデム遺伝子の合成及び修飾を容易にする必要がある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインレセプターに結合することができる少なくとも２つのサイトカイン結合ドメインを含むポリペプチドであって、前記ドメインが不撓性の螺旋領域を含むペプチドリンカー分子によって連結されているポリペプチド。
【請求項２】
前記ドメインが、直列に配列した３、４、５、６、７、８、９、又は１０の結合ドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、直列に配列した１０を超えるドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記不撓性の螺旋領域が、Ａ(ＥＡＡＡＫ)ＸＡなるモチーフ又はその機能的変異体の少なくとも１つのコピーを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記リンカー分子が、少なくとも１つの可撓性の非螺旋領域を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記可撓性の非螺旋領域が、ペプチドリンカー分子のアミノ末端又はその近傍に位置している、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記可撓性の非螺旋領域が、ペプチドリンカー分子のカルボキシル末端又はその近傍に位置している、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記可撓性の非螺旋領域が、ペプチドリンカー分子のアミノ及びカルボキシル末端又はその近傍に位置している、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記可撓性の非螺旋領域が、結合ドメインの少なくとも１つに隣接して位置している、請求項５から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＥＡＡＡＫなるモチーフのコピーを１０未満含む、請求項４から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、ＥＡＡＡＫなるモチーフのコピーを５未満含む、請求項４から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記結合ドメインが、不撓性の螺旋リンカーからなる連結分子によって連結されている、請求項２から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記螺旋リンカーが、１つの結合ドメインのカルボキシル末端を第２の結合ドメインのアミノ末端と結合している、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記螺旋リンカーが、第１の結合ドメインのＣ末端螺旋と第２の結合ドメインのＮ末端螺旋との間で連続しており、それにより２つの結合ドメインを実質的に固定された方向で堅固に連結している、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドの結合ドメインが、互いに同一であるか又は類似している、請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、 成長ホルモン；レプチン；エリスロポエチン；プロラクチン；インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のサブユニットｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；カージオトロフィン（ＣＴ−１）；白血球阻害因子（ＬＩＦ）；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターフェロン、ＩＦＮα及びＩＮＦβ；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α及びＴＮＦβ、及びＲＡＮＫリガンドからなる群から選択されるサイトカインの結合ドメインを含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ドメインの少なくとも１つが、成長ホルモン結合ドメイン、又は成長ホルモン変異体を含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、少なくとも２つの成長ホルモンの結合ドメイン、又は成長ホルモン変異体ポリペプチドを含む、請求項１６又は１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、少なくとも２つのプロラクチンの結合ドメイン、又はプロラクチン変異体を含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記プロラクチン変異体ポリペプチドがアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列が、プロラクチンの１２９位で修飾されている、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記修飾が、アミノ酸置換である、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記置換が、グリシンアミノ酸残基をアルギニンアミノ酸残基で置き換えるものである、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、プロラクチンの９から１４末端アミノ酸残基の欠失を更に含む、請求項１９から２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリペプチドの結合ドメインが、互いに類似していない、請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、成長ホルモン結合ドメインである第１の結合ドメイン及びプロラクチン結合ドメインである第２の結合ドメインを含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、成長ホルモン結合ドメイン及びプロラクチン結合ドメインからなる、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、修飾された成長ホルモン結合ドメインである第１の結合ドメイン及び修飾されたプロラクチン結合ドメインである第２の結合ドメインを含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、修飾された成長ホルモン結合ドメイン及び修飾されたプロラクチン結合ドメインからなる、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記修飾された成長ホルモン結合ドメインが、グリシン１２０のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む、請求項２７又は２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記修飾が、グリシン１２０のアルギニン、リジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、又はグルタミン酸から選択されるアミノ酸での置換である、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記修飾が、グリシン１２０のアルギニンアミノ酸残基での置換である、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記修飾されたプロラクチンが、グリシン１２９の修飾を含む、請求項２７から３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記修飾が、グリシン１２９のアルギニンアミノ酸残基での置換である、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、プロラクチンの９から１４アミノ末端アミノ酸残基の欠失を更に含む、請求項２８から３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、サイトカインレセプターのリガンド結合ドメインを更に含む、請求項２８から３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記レセプターが、成長ホルモンレセプターである、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記レセプターが、プロラクチンレセプターである、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
請求項１から３７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項３９】
前記核酸が、前記ポリペプチドの発現のために適合されたベクターである、請求項３８に記載の核酸。
【請求項４０】
請求項３８又は３９に記載の核酸又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされた、単離された細胞。
【請求項４１】
前記細胞が真核細胞である、請求項４０に記載の単離された細胞。
【請求項４２】
前記細胞が原核細胞である、請求項４０に記載の単離された細胞。
【請求項４３】
本発明のポリペプチドを製造する方法であって、前記方法が、
ｉ）請求項４０から４２のいずれか一項に記載の細胞を、請求項１から３７のいずれか一項に記載のポリペプチドの製造を導く条件下で成長させる工程、及び、
ｉｉ）細胞、又は成長環境からポリペプチドを単離する工程
を含む方法。
【請求項４４】
第２のサイトカイン結合ドメインに連結された第１のサイトカイン結合ドメインを含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドがサイトカインレセプターの細胞外ドメインを更に含む、ポリペプチド。
【請求項４５】
前記第１及び第２の結合ドメインが、可撓性のリンカー分子で連結されている、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記第１及び第２の結合ドメインが、不撓性の螺旋領域を含むペプチドリンカー分子で連結されている、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記第１及び第２の結合ドメインが、不撓性の螺旋領域及び可撓性の非螺旋領域を含むペプチドリンカー分子で連結されている、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
前記サイトカイン結合ドメインが、成長ホルモン、又はその成長ホルモン変異体であり、前記細胞外ドメインが、成長ホルモン細胞外ドメインである、請求項４４から４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
請求項４４から４８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項５０】
前記核酸が、前記ポリペプチドの発現のために適合されたベクターである、請求項４９に記載の核酸。
【請求項５１】
請求項４９に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５２】
請求項１から３９又は４４から５１のいずれか一項に記載のポリペプチド又は核酸分子の医薬としての使用。
【請求項５３】
請求項１から３９又は４４から５１のいずれか一項に記載のポリペプチド又は核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項５４】
請求項４９又は５１に記載の核酸又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされた、単離された細胞。
【請求項５５】
前記細胞が真核細胞である、請求項５４に記載の単離された細胞。
【請求項５６】
前記細胞が原核細胞である、請求項５４に記載の単離された細胞。
【請求項１】
サイトカインレセプターに結合することができる少なくとも２つのサイトカイン結合ドメインを含むポリペプチドであって、前記ドメインが不撓性の螺旋領域を含むペプチドリンカー分子によって連結されているポリペプチド。
【請求項２】
前記ドメインが、直列に配列した３、４、５、６、７、８、９、又は１０の結合ドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、直列に配列した１０を超えるドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記不撓性の螺旋領域が、Ａ(ＥＡＡＡＫ)ＸＡなるモチーフ又はその機能的変異体の少なくとも１つのコピーを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記リンカー分子が、少なくとも１つの可撓性の非螺旋領域を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記可撓性の非螺旋領域が、ペプチドリンカー分子のアミノ末端又はその近傍に位置している、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記可撓性の非螺旋領域が、ペプチドリンカー分子のカルボキシル末端又はその近傍に位置している、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記可撓性の非螺旋領域が、ペプチドリンカー分子のアミノ及びカルボキシル末端又はその近傍に位置している、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記可撓性の非螺旋領域が、結合ドメインの少なくとも１つに隣接して位置している、請求項５から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＥＡＡＡＫなるモチーフのコピーを１０未満含む、請求項４から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、ＥＡＡＡＫなるモチーフのコピーを５未満含む、請求項４から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記結合ドメインが、不撓性の螺旋リンカーからなる連結分子によって連結されている、請求項２から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記螺旋リンカーが、１つの結合ドメインのカルボキシル末端を第２の結合ドメインのアミノ末端と結合している、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記螺旋リンカーが、第１の結合ドメインのＣ末端螺旋と第２の結合ドメインのＮ末端螺旋との間で連続しており、それにより２つの結合ドメインを実質的に固定された方向で堅固に連結している、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドの結合ドメインが、互いに同一であるか又は類似している、請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、 成長ホルモン；レプチン；エリスロポエチン；プロラクチン；インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のサブユニットｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；カージオトロフィン（ＣＴ−１）；白血球阻害因子（ＬＩＦ）；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターフェロン、ＩＦＮα及びＩＮＦβ；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α及びＴＮＦβ、及びＲＡＮＫリガンドからなる群から選択されるサイトカインの結合ドメインを含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ドメインの少なくとも１つが、成長ホルモン結合ドメイン、又は成長ホルモン変異体を含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、少なくとも２つの成長ホルモンの結合ドメイン、又は成長ホルモン変異体ポリペプチドを含む、請求項１６又は１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、少なくとも２つのプロラクチンの結合ドメイン、又はプロラクチン変異体を含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記プロラクチン変異体ポリペプチドがアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列が、プロラクチンの１２９位で修飾されている、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記修飾が、アミノ酸置換である、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記置換が、グリシンアミノ酸残基をアルギニンアミノ酸残基で置き換えるものである、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、プロラクチンの９から１４末端アミノ酸残基の欠失を更に含む、請求項１９から２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリペプチドの結合ドメインが、互いに類似していない、請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、成長ホルモン結合ドメインである第１の結合ドメイン及びプロラクチン結合ドメインである第２の結合ドメインを含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、成長ホルモン結合ドメイン及びプロラクチン結合ドメインからなる、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、修飾された成長ホルモン結合ドメインである第１の結合ドメイン及び修飾されたプロラクチン結合ドメインである第２の結合ドメインを含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、修飾された成長ホルモン結合ドメイン及び修飾されたプロラクチン結合ドメインからなる、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記修飾された成長ホルモン結合ドメインが、グリシン１２０のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む、請求項２７又は２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記修飾が、グリシン１２０のアルギニン、リジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、又はグルタミン酸から選択されるアミノ酸での置換である、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記修飾が、グリシン１２０のアルギニンアミノ酸残基での置換である、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記修飾されたプロラクチンが、グリシン１２９の修飾を含む、請求項２７から３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記修飾が、グリシン１２９のアルギニンアミノ酸残基での置換である、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、プロラクチンの９から１４アミノ末端アミノ酸残基の欠失を更に含む、請求項２８から３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、サイトカインレセプターのリガンド結合ドメインを更に含む、請求項２８から３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記レセプターが、成長ホルモンレセプターである、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記レセプターが、プロラクチンレセプターである、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
請求項１から３７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項３９】
前記核酸が、前記ポリペプチドの発現のために適合されたベクターである、請求項３８に記載の核酸。
【請求項４０】
請求項３８又は３９に記載の核酸又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされた、単離された細胞。
【請求項４１】
前記細胞が真核細胞である、請求項４０に記載の単離された細胞。
【請求項４２】
前記細胞が原核細胞である、請求項４０に記載の単離された細胞。
【請求項４３】
本発明のポリペプチドを製造する方法であって、前記方法が、
ｉ）請求項４０から４２のいずれか一項に記載の細胞を、請求項１から３７のいずれか一項に記載のポリペプチドの製造を導く条件下で成長させる工程、及び、
ｉｉ）細胞、又は成長環境からポリペプチドを単離する工程
を含む方法。
【請求項４４】
第２のサイトカイン結合ドメインに連結された第１のサイトカイン結合ドメインを含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドがサイトカインレセプターの細胞外ドメインを更に含む、ポリペプチド。
【請求項４５】
前記第１及び第２の結合ドメインが、可撓性のリンカー分子で連結されている、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記第１及び第２の結合ドメインが、不撓性の螺旋領域を含むペプチドリンカー分子で連結されている、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記第１及び第２の結合ドメインが、不撓性の螺旋領域及び可撓性の非螺旋領域を含むペプチドリンカー分子で連結されている、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
前記サイトカイン結合ドメインが、成長ホルモン、又はその成長ホルモン変異体であり、前記細胞外ドメインが、成長ホルモン細胞外ドメインである、請求項４４から４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
請求項４４から４８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項５０】
前記核酸が、前記ポリペプチドの発現のために適合されたベクターである、請求項４９に記載の核酸。
【請求項５１】
請求項４９に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５２】
請求項１から３９又は４４から５１のいずれか一項に記載のポリペプチド又は核酸分子の医薬としての使用。
【請求項５３】
請求項１から３９又は４４から５１のいずれか一項に記載のポリペプチド又は核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項５４】
請求項４９又は５１に記載の核酸又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされた、単離された細胞。
【請求項５５】
前記細胞が真核細胞である、請求項５４に記載の単離された細胞。
【請求項５６】
前記細胞が原核細胞である、請求項５４に記載の単離された細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６−１】
【図１６−２】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１７−３】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１８−３】
【図１８−４】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６−１】
【図１６−２】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１７−３】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１８−３】
【図１８−４】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【公表番号】特表２００８−５０７２９２（Ｐ２００８−５０７２９２Ａ）
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２３１４１（Ｐ２００７−５２３１４１）
【出願日】平成１７年７月１８日（２００５．７．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２８２６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１０８９１
【国際公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【出願人】（５０７０２９８０１）アステリオン・リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月１８日（２００５．７．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２８２６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１０８９１
【国際公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【出願人】（５０７０２９８０１）アステリオン・リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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