乳濁物中の架橋ヒアルロン酸
本発明は、架橋ヒアルロン酸微小ビーズの生産、及びその生産された微小ビーズに関し、該方法は：（ａ）ヒアルロン酸又はその塩を含むアルカリ水溶液を、架橋剤を含む溶液と混合し、（ｂ）有機相又は油相中で前記工程（ａ）の混合した溶液から所望のサイズを有する微小液滴を形成して、有機中水又は油中水（Ｗ／Ｏ）乳濁物を形成し、（ｃ）該Ｗ／Ｏ乳濁物を継続的に攪拌することにより、ヒアルロン酸とジビニルスルホンとの反応を引き起こし、架橋ヒアルロン酸微小ビーズを生じさせ、そして（ｄ）該架橋ヒアルロン酸微小ビーズを精製する工程を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋ヒアルロン酸微小ビーズの生産、及びその生産された微小ビーズに関し、該方法は：
（ａ）ヒアルロン酸又はその塩を含むアルカリ水溶液を、架橋剤を含む溶液と混合し、
（ｂ）有機相又は油相中で前記工程（ａ）の混合した溶液から所望のサイズを有する微小液滴を形成して、有機中水又は油中水（Ｗ／Ｏ）乳濁物を形成し、
（ｃ）該Ｗ／Ｏ乳濁物を継続的に攪拌することにより、ヒアルロン酸とジビニルスルホンとの反応を引き起こし、架橋ヒアルロン酸微小ビーズを生じさせ、そして
（ｄ）該架橋ヒアルロン酸微小ビーズを精製する
工程を含む。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、生物医学、及び薬理的用途に使用される、乳濁物中の改変ヒアルロン酸（ＨＡ）、特に架橋ＨＡを調製するプロセスに関する。
【０００３】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、非硫酸化グリコサミノグリカンのクラスに属する、天然の、直鎖糖質ポリマーである。ヒアルロン酸は、ベータ−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン及びベータ−１，４−グルクロン酸の二種類の糖の単位の繰り返しから構成され、分子量（ＭＷ）が６ＭＤａに上る。ヒアルロン酸は、硝子軟骨、滑膜関節体液、及び真皮及び表皮両方の皮膚組織に存在する。ＨＡは、脊椎動物の結合組織を含む天然の組織から、ヒト臍帯から、そしてニワトリの鶏冠から抽出され得る。しかしながら、今日では、感染性の因子を担持する潜在的リスクを最小化し、生産物の均一性、水準及び入手可能性を増大させるために、微生物学的手法によりヒアルロン酸を調製するのが好ましい（ＷＯ ０３／０１７５９０２， Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）。
【０００４】
生体における、ＨＡの多くの機能が知られている。ＨＡは、生体器官における、皮膚、腱、筋肉及び軟骨等の多くの組織の細胞の機械的支持において重要な役割を果たす。ＨＡは、組織の保湿、及び滑潤等の重要な生物学的プロセスに関与する。また、ＨＡは、接着、発生、細胞運動、癌、血管真性、及び創傷治癒等の、様々な生理学的機能に一定の役割を果たすとも考えられている。特異な物理的及び生物学的特性（粘弾性、生体適合性、生分解性を含む）により、ＨＡは、眼科学、リューマチ学、薬物送達、創傷治癒及び組織工学の分野の、様々な、既存の及び開発中の用途において採用されている。これらの用途の幾つかにおけるＨＡの使用は、ＨＡが室温、即ち約２０℃で水に溶け、体内のヒアルロニダーゼにより迅速に分解し、そして生体材料への加工が困難であるという事実により、制限される。故に、ＨＡの物理的及び機械的特性、並びにインビボでの存在期間を改善するために、ＨＡの架橋が導入されていた。
【０００５】
米国特許第４，５８２，８６５号（Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）は、架橋剤としてジビニルスルホン（ＤＶＳ）を使用する、単独、又は多の親水性ポリマーと混合した、ＨＡの架橋ゲルの調製を記載している。多官能性エポキシ化合物を使用する、架橋ＨＡ又はその塩の調製は、ＥＰ ０ １６１ ８８７ Ｂ１に開示されている。共有結合を通じてＨＡを架橋するのに採用されている他の二官能性又は多官能性薬剤は、ホルムアルデヒド（Ｕ．Ｓ． ４，７１３，４４８、Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）、ポリアジリジン（ＷＯ ０３／０８９４７６ Ａ１、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．）、Ｌ−アミノ酸若しくはＬ−アミノエステル（ＷＯ ２００４／０６７５７５， Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ Ｓ．Ｐ．Ａ．）を含む。カルボジイミドも、ＨＡの架橋剤として報告されている（Ｕ．Ｓ． ５，０１７，２２９、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．； Ｕ．Ｓ． ６，０１３，６７９、Ａｎｉｋａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ）。脂肪族アルコールとＨＡとの全体的又は部分的架橋エステル、及びそのような部分的エステルと無機又は有機塩基との塩は、ＵＳ ４，９５７，７４４に開示されている。水／アセトン混合物中の、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（「ＥＤＡＣ」）、及びアジピン酸ジヒドラジドを用いたＨＡの架橋は、ＵＳ ２００６／００４０８９２（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｔｅｘａｓ）に開示された。また、ＷＯ ２００６／５６２０４（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）は、架橋剤として字ビニルスルホン（ＤＶＳ）を使用するＨＡの架橋ゲルを調製する方法も開示している。
【０００６】
ＷＯ ２００８／１０００４４は、本出願の優先年に公開されたもので、ヒアルロン酸を架橋することによるヒアルロンヒドロゲルナノ粒子を調製する方法を記載し、この方法は、ｉ）界面活性剤が溶解した油相と、ｉｉ）ヒアルロン酸及び水溶性架橋剤が溶解した塩基性水溶液の水相とを混合する工程を含むが、ここに、Ｗ／Ｏ乳濁物を形成するためのジビニルスルホン、該Ｗ／Ｏ乳濁物中でのヒアルロン酸の架橋、該油相がドデカン、ヘプタン、又はセチルエチルヘキサノエートを含むことは、言及されていない。
【０００７】
ＥＰ Ｏ ８３０ ４１６（ＵＳ ６，２１４，３３１に対応する）は、架橋水溶性ポリマー粒子調製物の調製を記載し、該粒子は、直径２１２μｍ未満で、該粒子の少なくとも８０％が球形で、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、セルロース、キチン、キトサン、アガロース、カラギーナン、カードラン、デキストラン、アマルサン、ゲラン、キサンタン、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、タンパク質、糖タンパク質、ペプチドグリカン、プロテオグリカン、リポ多糖類、又はそれらの組合せから選択される水溶性ポリマーを含むポリマー水溶液を、油中水乳化剤を含む油性基材に添加して、該混合物を混合して、ポリマー液滴を含む乳濁物を形成して、そのまま、架橋剤を添加することにより該ポリマー液滴を架橋して、こうして架橋ポリマー粒子を形成させることにより収得が可能である。前記架橋剤は、最初に、水溶液のｐＨを１１に調製することにより不活性化され、そしてｐＨを７〜８に下げることにより活性化される。トルエン、ｏ−キシレン、又はイソオクタンが、油相として好ましい。水相と油相との重量の比率は、約１：１である。
【０００８】
Ｎｕｒｅｔｔｉｎ Ｓａｈｉｎｅｒ及びＸｉｎｑｉａｏ Ｊａｉ（Ｔｕｒｋ Ｊ Ｃｈｅｍ， ３２ （２００８）， ３９７−４０９）は、油相としてイソオクタンを使用する、ヒアルロン酸を基礎とするミクロン未満のヒドロゲル粒子の調製を記載している。０．５４ｍｌのヒアルロン酸水溶液を、１５ｍｌのイソオクタンに添加して調製され、得られた水相と油相との重量比は１０：１を超える。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上により、架橋ＨＡゲルの調製に適した幾つかの架橋剤が公知であることは明らかである。しかしながら、様々な用途に特に適したＨＡの新たな製剤の提供には、なおも商業的関心が存在する。例えば、ナノからマイクロメートルの範囲の断面を有する所望のサイズのゲル様架橋ＡＨ微小ビーズを提供する新たな方法は、商業的関心が高い。そのような架橋ＨＡの微小ビーズは、例えば、薬理的薬物の送達用ビヒクルとして、それ自体が生物活性物質として、組成物、及びあらゆる生物医学的用途における構成成分として、多くの用途に使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、第一の側面において、本発明は、架橋ヒアルロン酸微小ビーズを生産する方法を提供し、該方法は：
（ａ）ヒアルロン酸又はその塩を含むアルカリ水溶液と架橋剤を含む溶液を混合し；
（ｂ）有機相又は油相中で前記工程（ａ）の混合した溶液から所望のサイズを有する微小液滴を形成して、有機中水又は油中水（Ｗ／Ｏ）乳濁物を形成し、
（ｃ）該Ｗ／Ｏ乳濁物を継続的に攪拌することにより、ヒアルロン酸とジビニルスルホンとの反応を引き起こし、架橋ヒアルロン酸微小ビーズを生じさせ、そして
（ｄ）該架橋ヒアルロン酸微小ビーズを精製する
工程を含む。
【００１１】
第二の側面において、本発明は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、ジビニルスルホンで架橋され；好ましくは前記第一の速年の方法により作製される、微小ビーズに関する。
【００１２】
第三の側面において、本発明は、前記第二の側面において定義される微小ビーズ、および好ましくは薬理的活性物質である有効成分を含む組成物に関する。
【００１３】
本発明の第四の側面は、前記第二の側面において定義される有効な量の微小ビーズを、医薬として許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に含む、医薬組成物に関する。
【００１４】
第五の側面は、前記第二の側面において定義される有効な量の微小ビーズをビヒクルとして、薬理的活性物質と共に含み、好ましくは該薬理活性物質が、該微小ビーズ中に分散物又は溶液として封入される、医薬組成物に関する。
【００１５】
第六の側面において、本発明は、前記第二の側面において定義される微小ビーズ、又は前記第三、第四、又は第五の側面のいずれかにおいて定義される組成物を含む、衛生、医療、又は手術用品であり、好ましくは該用品は、おむつ、生理用ナプキン、手術用スポンジ、創傷治癒用スポンジ、若しくは絆創膏の一部、又は他の創傷包帯材料である。
【００１６】
重要な側面は、前記第二の側面において定義される微小ビーズ、又は前記第三、第四、又は第五の側面のいずれかにおいて定義される組成物を含む、カプセル又は微小カプセルに関する。
【００１７】
多くの側面は、変形性関節症、癌の治療用医薬を生産するための、眼科的処置用の医薬を生産するための、創傷治療用の医薬を生産するための、血管真性用の医薬を生産するための、脱毛若しくは禿の治療用の医薬を生産するための、保湿剤を生産するための、皮膚充填剤（ｄｅｒｍａｌ ｆｉｌｌｅｒ）、薬物送達系／ビヒクルもしくは組織増加（ｔｉｓｓｕｅ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）用のデバイスを生産するための、前記第二の側面において定義される微小ビーズ、又は前記第三、第四、又は第五の側面のいずれかにおいて定義される組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】直径２２マイクロメートルの粒子の球形のプロフィールを呈する、単離された架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の顕微鏡写真を示す。
【００１９】
【図２】着色料としてｐＨ表示薬を含む乳濁物の顕微鏡写真を示す。この写真は、より大きな粒子に囲まれた、小さな粒子（１〜５マイクロメートル）の貢献を示す。
【００２０】
【図３】最大で直径１ｍｍのゲル粒子を呈する、単離された架橋ヒアルロン酸ゲル粒子（ｘ８０）の顕微鏡写真を示す。
【００２１】
【図４】直径５００〜１０００マイクロメートルの範囲の様々なサイズの粒子の球形のプロフィールを呈する、単離された微小ビーズ粒子の顕微鏡写真を示す。
【００２２】
【図５】洗浄手順の後の粒子の写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
「ヒアルロン酸」という用語は、文中では、異なる分子量を有し、Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸の残基により構成され、天然に細胞表面に存在し、脊椎動物の結合組織の基本的な細胞外物質中に、関節の滑膜体液中に、眼球内液中に、ヒト臍帯組織中に、及びニワトリの鶏冠中に存在する、酸性多糖類を意味する。
【００２４】
「ヒアルロン酸」という用語は、実際は、通常、分子量が様々なＤ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸の交互の残基を有する全ての型の多糖類、又はその分解フラクションさえ意味するものとして使用されるので、「ヒアルロン酸」は、複数形として用いるのがより妥当と考えられる。しかしながら、本明細書中の全てにおいて、単数形が使用されており；加えて、「ＨＡ」という略語は、この総称に代えて頻繁に使用され得る。
【００２５】
「ヒアルロン酸」は、本明細書中では、Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸がベータ−１，４及びベータ−１，３−グリコシド結合により交互に連結され、二糖が反復することにより構成される、非硫酸化グリコサミノグリカンとして定義される。ヒアルロン酸は、ヒアルロナン、ヒアルロネート、又はＨＡとしても知られる。ヒアルロナン及びヒアルロン酸という用語は、本明細書中で、相互に置換可能なものとして使用される。
【００２６】
ニワトリの鶏冠は、ヒアルロナンの重要な商業的供給源である。微生物は、代替的な供給源である。米国特許第４，８０１ ，５３９号は、ストレプトコッカス・ズウエピデミクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）の株を利用するヒアルロン酸を調製するための発酵方法を開示しており、１リットルあたり約３．６ｇのヒアルロン酸が収得されたことを報告している。欧州特許第ＥＰ０６９４６１６号は、ストレプトコッカス・ズウエピデミクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）の改良した株を利用する発酵プロセスを開示しており、約３．５ｇのヒアルロン酸が取得されたことを報告している。本明細書中に全てが援用されるＷＯ ０３／０５４１６３（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）に開示されているように、ヒアルロン酸又はその塩は、例えばグラム陽性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主中で、組換え的に生産され得る。
【００２７】
ヒアルロナンシンターゼは、脊椎動物、細菌性病原体、及び藻類ウイルス由来のものが記載されている（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ， Ｐ． Ｌ．， １９９９， Ｃｅｌｌ． ＭｏＩ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５６： ６７０−６８２）。ＷＯ ９９／２３２２７はストレプトコッカス・エキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）由来のグループＩヒアルロネートシンターゼを開示している。ＷＯ ９９／５１２６５ ａｎｄ ＷＯ ００／２７４３７は、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来のグループＩＩヒアルロネートシンターゼを開示している。Ｆｅｒｒｅｔｔｉらは、ストレプトッコッカス・ピオゲンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のヒアルロナンシンターゼオペロンを開示し、該オペロンは、ｈａｓＡ、ｈａｓＢ、及びｈａｓＣの２つの遺伝子を有し、それぞれヒアルロネートシンターゼ、ＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼ、及びＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼをコードする（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９８， ４６５８−４６６３， ２００１）。ＷＯ ９９／５１２６５は、ストレプトコッカス・エキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）ヒアルロナンシンターゼのコード領域を有する、核酸断片を記載する。
【００２８】
組換えバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞のヒアルロン酸は培養培地に直接発現されるため、培地からヒアルロナンを単離するのに単純なプロセスが使用され得る。第一に、バチルス細胞及び細胞デブリが培養培地から物理的に除去される。この培養培地を必要に応じて希釈して、培地の粘性を低下させる。遠心分離又は精密濾過等、培養培地から細胞を除去する多くの方法は、当業者に知られている。必要に応じて、残った上澄を超遠心等により濾過して、ヒアルロナンを濃縮し、小分子のコンタミネーションを除去する。細胞及び細胞デブリの除去後、既知のメカニズムのよりヒアルロナンを培地から沈殿させる。前記濾過物からヒアルロナンを沈殿させるのに、塩、アルコール、又は塩とアルコールの組合せが使用され得る。沈殿物に変えた後、ヒアルロナンは、物理的な手段により、溶液から容易に単離され得る。凍結乾燥又は噴霧乾燥等の当業者に知られる蒸発技術を使用することにより、ヒアルロナンは、乾燥され、又は濾過溶液から濃縮される。
【００２９】
本明細書中で、「微小ビーズ」という用語は、微小滴、微小液滴、微小粒子、微小球、ナノビーズ、ナノ滴、ナノ液滴、ナノ粒子、ナノ球等の用語と相互に置換可能なものとして使用される。典型的な微小ビーズは、概ね球形で、断面の直径が約１ナノメートルカラ１ミリメートルの範囲内である。しかし、通常、本発明の発明に係る微小ビーズは、更により狭い範囲で所望のサイズとなるように、即ち殆ど均一となるように作製し得る。好ましくは、該微小ビーズの直径は、約１００〜１０００ナノメートルの範囲内；又は１０００ナノメートル〜１０００マイクロメートルの範囲内である。該微小ビーズのサイズ分布は小さく、多分散度（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ）は狭い。
【００３０】
宿主細胞
好ましい態様は、前記ヒアルロン酸又はその塩が、組換え的に生産され、好ましくはグラム陽性細菌、又は宿主細胞により、より好ましくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌により生産される、前記第一の側面の方法に関する。
【００３１】
前記宿主細胞は、ヒアルロン酸の組換え生産に適した任意のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であってもよい。該バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、野生型バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞又はその突然変異体であってもよい。本発明の実施に有用なバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、限定されないが、バチルス・アガラデレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇａｒａｄｅｒｈｅｎｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びバチルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含む。ＷＯ ９８／２２５９８において、組換え発現に特に適応した突然変異バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞が記載されている。無鞘（Ｎｏｎ− ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、本発明において特に有用である。
【００３２】
好ましい態様において、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）又はバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞である。好ましい態様において、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞である。他のより好ましい態様において、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）細胞である。他のより好ましい態様において、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）細胞である。他のより好ましい態様において、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞である。他のより好ましい態様において、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞である。最も好ましい態様において、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ａ１６４Δ５（米国特許第５，８９１ ，７０１号を参照されたい）又はバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８Δ４である。
【００３３】
分子量
ヒアルロン酸の構成は、改変カルバゾール法に従い決定され得る（Ｂｉｔｔｅｒ ａｎｄ Ｍｕｉｒ， １９６２， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４： ３３０−３３４）。更に、ヒアルロン酸の平均分子量の値は、Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ３６， ４９７１−４９７５、Ｗｙａｔｔ， １９９３， Ａｎａｌ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ２７２： １−４０、並びにＷｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， １９９９， “Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＤＡＷＮ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ”及び“ＤＡＷＮ ＥＯＳ Ｍａｎｕａｌ” Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ等に記載の、当該技術分野の標準的な手法を使用して決定され得る。
【００３４】
好ましい態様において、本発明のヒアルロン酸又はその塩の分子量は、約１０，０００〜１０，０００，０００Ｄａである。より好ましい態様において、本発明のヒアルロン酸又はその塩の分子量は、約２５，０００〜約５，０００，０００Ｄａである。最も好ましい態様において、前記ヒアルロン酸の分子量は、約５０，０００〜約３，０００，０００Ｄａである。
【００３５】
好ましい態様において、前記ヒアルロン酸又はその塩の分子量は３００，０００〜３，０００，０００の範囲内；好ましくは４００，０００〜２，５００，０００の範囲内；より好ましくは５００，０００〜２，０００，０００の範囲内；そして最も好ましくは６００，０００〜１，８００，０００の範囲内である。
【００３６】
なおももう一つの好ましい態様において、前記ヒアルロン酸又はその塩の平均分子量が小さいもので、１０，０００〜８００，０００Ｄａの範囲内；好ましくは２０，０００〜６００，０００Ｄａの範囲内；より好ましくは３０，０００〜５００，０００Ｄａの範囲内；なおもより好ましくは４０，０００〜４００，０００Ｄａの範囲内； そして最も好ましくは５０，０００〜３００，０００Ｄａの範囲内である。
【００３７】
塩及び架橋ＨＡ
好ましい態様は、ヒアルロン酸の無機塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、又はヒアルロン酸コバルト等を含む、前記第一の側面の方法に関する。
【００３８】
他の成分
好ましい態様において、本発明の方法により生産される生産物は、他の成分、好ましくは１つ以上の有効成分、好ましくは１つ以上の医薬活性物質、また好ましくは水溶性賦形剤、ラクトース又は非生物由来の糖類等も含む。
【００３９】
本発明に使用され得る有効成分又は１つ以上の医薬活性物質の例には、ビタミン、抗炎症薬、抗生物質、静菌剤、一般的な麻酔薬、リドカイン、モルヒネ、並びにタンパク質及び／又はペプチド薬、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、ホルモン／ペプチド関連成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、骨形成タンパク質、インターフェロン若しくはその誘導体、インスリン若しくはその誘導体、心房性ナトリウム利尿ペプチドＩＩＩ、モノクローナル抗体、腫瘍壊死因子、マクロファージ活性化因子、インターロイキン、腫瘍分解因子、インスリン様増殖因子、上皮細胞増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子、因子ＩＩＶ、因子ＩＩＩＶ、並びにウロキナーゼ等が含まれる。
【００４０】
水溶性賦形剤は、前記有効成分を安定化する目的で加えられる場合があり、そのような賦形剤は、例えばアルブミン又はゼラチン等のタンパク質；グリシン、アラニン、グルタミン酸、アルギニン、リシン等のアミノ酸及びそれらの塩；グルコース、ラクトース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、サッカロース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、トレハロース及びコンドロイチン硫酸等の糖質；リン酸塩等の無機酸塩；ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ＩＣＩ）等の界面活性剤、ポリエチレングリコール、並びにそれらの混合物を含む。前記賦形剤又は安定化剤は、生産物の重量の０．００１〜９９％の範囲を占める量が使用され得る。
【００４１】
本発明の幾つかの側面は、とりわけ、有効な量の架橋ＨＡ生産物、好ましくは該有効成分が医薬活性物質である有効成分；医薬として許容される担体、賦形剤又は希釈剤、好ましくは水溶性賦形剤、及び最も好ましくはラクトースを含む、様々な組成物及び医薬に関する。
【００４２】
本発明の複数の側面は、前記第一の側面において定義される生産物又は前記複数の側面及び上記態様において定義される組成物を含む物品に関し、例えば衛生用品、医療用品又は手術用品が挙げられる。最後の態様において、本発明は、前記第一の側面において定義される生産物、又は他の側面及び本発明の態様において定義される組成物を含む、医薬カプセル又は微小カプセルに関する。
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明の第一の側面は、架橋ヒアルロン酸微小ビーズを生産する方法であり、該方法は、以下の；
（ａ）ヒアルロン酸又はその塩を含むアルカリ水溶液を、架橋剤を含む溶液と混合し、
（ｂ）有機相又は油相中で前記工程（ａ）の混合した溶液から所望のサイズを有する微小液滴を形成して、有機中水又は油中水（Ｗ／Ｏ）乳濁物を形成し、
（ｃ）該Ｗ／Ｏ乳濁物を継続的に攪拌することにより、ヒアルロン酸とジビニルスルホンとの反応を引き起こし、架橋ヒアルロン酸微小ビーズを生じさせ、そして
（ｄ）該架橋ヒアルロン酸微小ビーズを精製する
工程を含む。
【００４４】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中で組換え的にヒアルロン酸を生産する方法は、ＷＯ ２００３／０５４１６３， Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（全て本明細書中に参照により援用される）に既に記載されている。
【００４５】
従って、好ましい態様において、本発明は、前記第一の側面に関し、前記ヒアルロン酸又はその塩は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中で組換え的に生産される。
【００４６】
ヒアルロン酸の様々な分子量フラクションは、特定の目的に有利なものとして記載されている。
【００４７】
本発明の好ましい態様は、前記第一の側面の方法に関し、前記ヒアルロン酸又はその塩の平均分子量の値は、１００〜３０００ｋＤａ、好ましくは５００〜２０００ｋＤａ、そして最も好ましくは７００〜１８００ｋＤａである。
【００４８】
ヒアルロン酸又はその塩の最初の濃度は、本発明の方法において、得られる架橋微小ビーズの特性に影響する。従って、本発明の好ましい態様は、前記第一の側面の方法に関し、前記アルカリ溶液に溶解したヒアルロン酸又はその塩の濃度が、０．１％〜４０％（ｗ／ｖ）である。
【００４９】
また、架橋反応中のｐＨ値も結果に影響するため、好ましい態様において、本発明は、前記第一の側面の方法に関し、前記アルカリ溶液に溶解した水酸化ナトリウムの濃度が、０．００１〜２．０Ｍである。
【００５０】
また、架橋剤の濃度も、得られる微小ビーズに重大な影響を与えることも注目に値する。
【００５１】
従って、本発明の好ましい態様は、前記第一の側面の方法に関し、前記架橋剤がジビニルスルホン（ＤＶＳ）であり；好ましくはＤＶＳは、前記工程（ａ）の混合溶液と、ＨＡ／ＤＶＳの重量比が１：１〜１００：１（乾燥重量）となるように、好ましくはＨＡ／ＤＶＳの重量比が２：１〜５０：１となるように含まれる。
【００５２】
ビセポキシド架橋技術に基づく架橋剤：ＧＤＥ＝グリセロールジグリシジルエーテル及びＢＤＥ：１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル等の他の架橋剤も、本発明の方法に適したものとして想定される。
【００５３】
本発明の方法に適した架橋剤は、例えば、多官能性（＞＝２）ＯＨ−反応性化合物である。適切な架橋剤の例は、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）又はビセポキシド架橋技術に基づく架橋剤、例えばＧＤＥ＝グリセロールジグリシジルエーテル及びＢＤＥ：１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルである。前記架橋剤は、好ましくは、ジビニルスルホン、グリセロールジグリシジルエーテル又は１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルから選択される。本発明の最も好ましい架橋剤は、好ましくは上記重量比率で使用されるジビニルスルホンである。
【００５４】
本発明は、架橋剤とＨＡ溶液を含む溶液を混合している間に、及び／又はその直後に、最初の攪拌をすることが、十分なゲル化を達成するのに望ましいことを見出した。
【００５５】
従って、本発明の好ましい態様は、前記第一の側面の方法に関し、前記ヒアルロン酸とジビニルスルホンとの反応が、５℃〜１００℃の温度範囲内で、好ましくは１５℃〜５０℃の範囲内で、より好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内で行われる。
【００５６】
前記第一の側面の方法の他の好ましい態様において、工程（ｃ）の攪拌は、１〜１８０分間継続される。
【００５７】
本発明は、前記溶液を混合した後の加熱工程が有益であることを決定した。
【００５８】
従って、本発明の好ましい態様は、前記第一の側面の方法に関し、前記混合した溶液を、２０℃〜１００℃の温度範囲内で、好ましくは２５℃〜８０℃の範囲内で、より好ましくは３０℃〜６０℃の範囲内で、そして最も好ましくは３５℃〜５５℃の範囲内で加熱し、該温度を、該溶液を混合後少なくとも５分、好ましくは少なくとも１０分、２０分、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、又は最も好ましくは１８０分維持し、このとき好ましくは攪拌しない。
【００５９】
架橋反応後短い時間、前記反応混合物を、攪拌を続けつつ室温に移すのが有利である。
【００６０】
前記第一の側面の方法の好ましい態様において、前記反応混合物は、前記反応が行われた後、少なくとも５分、好ましくは少なくとも１０分、２０分、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、又は最も好ましくは１８０分、０℃〜４０℃の温度範囲内で、好ましくは１０℃〜３０℃の範囲内で維持される。
【００６１】
工程（ｂ）の微小液滴の平均の直径の値は、約１ナノメートル〜１ミリメートルの範囲内であるのが有利である。工程（ｂ）の微小液滴の粒子サイズ分布の最大値は、好ましくは約０．１〜１００μｍの範囲内で、より好ましくは０．５〜１０μｍであり、そして最も好ましくは１〜２μｍである。前記液滴のサイズは、使用される乳化剤及び攪拌の強さの選択により調整され得る。所望のサイズの液滴を取得するのに必要な使用される乳化剤の組み合わせおよび攪拌の強さは、一連の単純な試験により決定され得る。前記液滴又は微小ビーズのサイズは、Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ （Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ ７８０ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒ， ＰＳＳ ＮＩＣＯＭＰ， Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ， ＣＡＬ， ＵＳＡ ｗｉｔｈ Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ ７８０ＡＤ ＣＷ７８８−Ｎｉｃｏｍｐ ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｖ １．６８ （２０００））を用いて決定され得る。
【００６２】
好ましい態様において、本発明は、前記第一の側面の方法に関し、前記工程（ｂ）の微小液滴の直径の平均値が、約１ナノメートル〜１ミリメートルの範囲内である。また、前記第二の側面の架橋微小ビーズの直径の平均値が、約１ナノメートル〜１ミリメートルの範囲内であることも好ましい。
【００６３】
工程（ｃ）における分散物を取得するのに、未反応の架橋剤を殆ど含まないのが有利であり得る。好ましくは、前記分散物、より好ましくは微小ビーズの含有量は、１０重量ｐｐｍ（ｗｐｐｍ）、より好ましくは５ｗｐｐｍである。前記分散物中の遊離架橋剤の濃度は、該分散物が医薬又は生化学の用途／デバイス組成物に直接使用されるとしたら、低くあるべきである。なぜなら、未反応の架橋剤は、毒性を有する恐れがあるからである。従って、分散物に含まれる未反応の架橋剤の濃度が上記の値になるまで、工程（ｃ）の反応を続行するのが好ましい。
【００６４】
以下の：８〜２２個のＣ原子を有する直鎖脂肪アルコール上の、１２〜２２個のＣ原子を有する脂肪酸上の、そしてアルキル基が８〜１５個のＣ原子を有するアルキルフェノール上の２〜１００ｍｏｌのエチレンオキシド及び／又は０〜５ｍｏｌのプロピレンオキシドの付加生成物（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）、６〜２２個の炭素原子を有する飽和及び不飽和脂肪酸の、グリセロール、グリセロールモノ−及びジエステル並びにソルビタンモノ−及びジエステル上の、１〜１００ｍｏｌのエチレンオキシドの付加生成物のＣ１２／１８脂肪酸モノ−及びジエステル、並びにそのエチレンオキシド付加生成物、アルキルラジカル中に８〜２２個の炭素原子を有するアルキルモノ−及びオリゴグリコシド、並びにそのエチレンオキシド付加生成物、ヒマシ油及び／又は水素化ヒマシ油、直鎖、分岐、不飽和又は飽和Ｃ６〜Ｃ２２脂肪酸、レチノレイン酸及び１２−ヒドロキシステアリン酸、並びにグリセロール、ポリグリセロール、ペンタエリスリトール、ジペンタエリスリトール、糖アルコール（例えばソルビトール）、アルキルグルコシド（例えばセルロース）、モノ−、ジ−及びトリアルキルリン酸塩、並びにモノ−、ジ−及びトリ−ＰＥＧ−アルキルリン酸塩、並びにその塩、ポリシロキサン／ポリエーテルコポリマー（ジメチコンコポリオール）、例えばＰＥＧ／ＰＰＧ−２０／６ジメチコン、ＰＥＧ／ＰＰＧ−２０／２０ジメチコン、ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−２０／２０ジメチコン、ＰＥＧ−１２又はＰＥＧ−１４ジメチコン、ＰＥＧ／ＰＰＧ−１４／４又は４／１２又は２０／２０又は１８／１８又は１７／１８又は１５／１５、ポリシロキサン／ポリアルキルポリエーテルコポリマー及び対応する誘導体、例えばラウリル又はセチルジメチコンコポリオール、特にセチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン（ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０（Ｅｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ））、ＤＥ１１ ６５ ５７４に従うペンタエリスリトール、脂肪酸、クエン酸及び脂肪アルコールの混合したエステル及び／又は６〜２２個の炭素原子を有する脂肪酸の混合したエステル、メチルグルコース、並びにポリオール、例えばグリセロール又はポリグリセロール、クエン酸エステル、例えばグリセリルステアレートシトレート、グリセリルオレエートシトレート及びジラウリルシトレートに基づく部分エステル上の２〜２００ｍｏｌの付加生成物の群の少なくとも１つの化合物が、非イオン性乳化剤又は界面活性剤として採用され得る。
【００６５】
本発明において使用される好ましい乳化剤は、ＨＬＢ値が３〜９、好ましくは４〜６、そしてより好ましくは約５であるものから選択される。好ましい乳化剤は、ポリセリル−４−ジイソステアラット／ポリヒドロキシステアラット／セバカット（ＩＳＯＬＡＮ（登録商標）ＧＰＳ）、ＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン（ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０）、ポリグリセリル−４イソステアレート（ＩＳＯＬＡＮ（登録商標）Ｇｌ３４）、ポリグリセリル−３オレエート（ＩＳＯＬＡＮ（登録商標）ＧＯ３３）、メリルグルコースイソステアレート（ＩＳＯＬＡＮ（登録商標）ＩＳ）、ジイソステアロイルポリグリセリル−３ダイマージリノレエート（ＩＳＯＬＡＮ（登録商標）ＰＤＩ）、グリセリルオレエート（ＴＥＧＩＮ（登録商標）ＯＶ）、ソルビタンラウレート（ＴＥＧＯ（登録商標）ＳＭＬ）、ソルビタンオレエート（ＴＥＧＯ（登録商標）ＳＭＯＶ）、及びソルビタンステアレート（ＴＥＧＯ（登録商標）ＳＭＳ）から選択される。
【００６６】
アニオン性乳化剤又は界面活性剤は、水溶性を付与する基を含み得て、例えばカルボキシル基、硫酸基、スルホン酸基又はリン酸基、並びに親油性ラジカルが挙げられる。皮膚が耐えられるアニオン性界面活性剤は、当業者に多く知られており、市販されている。本明細書中で、これらは、アルカリ金属、アンモニウム、又はアルカノルアンモニウム塩の形態の、アルキルスルフェート、又はアルキルリン酸塩、アルカリ金属又はアンモニウム塩の形態のアルキルエーテルスルフェート、アルキルエーテルカルボキシレート、アシルサルコシネート、及びスルホスクシネート、及びアシルグルタメートであってもよい。
【００６７】
カチオン性乳化剤及び界面活性剤も添加される場合がある。第四級アンモニウム化合物、特に８〜２２個の炭素原子を有する少なくとも１つの直鎖及び／又は分岐鎖、飽和又は不飽和アルキル鎖を有するものが、特に、例えばアルキルトリメチルアンモニウムハライド、例えばセチルトリメチルアンモニクムクロライド又はブロマイド又はべヘニルトリメチルアンモニウムクロライドに採用され得て、ジアルキルジメチルアンモニウムハライド、例えばジステアリルジメチルアンモニウムクロライドであってもよい。
【００６８】
モノアルキルアミドカット例えばパルミタミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、又は対応するジアルキルアミドカットは、更に採用され得る。モノ−、ジ−又はトリエタノールアミンに基づく四級化された脂肪酸エステルであり得る容易に生分解する第四級エステル化合物は、更に採用され得る。アルキルグアニジニウム塩は、更にカチオン性乳化剤として混合され得る。
【００６９】
穏和な界面活性剤、即ち皮膚が特に耐えられる界面活性剤の典型的な例として、脂肪アルコールポリグリコールエーテルスルフェート、モノグリセリドスルフェート、モノ−及び／又はジアルキルスルホスクシネート、脂肪酸イセチオネート、脂肪酸サルコシネート、脂肪酸タウリド、脂肪酸グルタメート、エーテル−カルボン酸、アルキルオリゴグルコシド、シボウサングルカミド、アルキルアミドベタイン及び／又はタンパク質−脂肪酸濃縮物、後者は例えば小麦タンパク質に基づくものが挙げられる。
【００７０】
更に、両性海面活性剤、例えばベタイン、アンフォアセテート又はアンフォフォプロピオネート、故に例えばＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムグリシネート、例えばココ−アルキルジメチルアンモニウムグリシネート、Ｎ−アシルアミノプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムグリシネート、例えばココ−アシルアミノプロピルジメチルアンモニウムグリシネート、及び２−アルキル−３−カルボキシメチル−３−ヒドロキシエチルイミダゾリンであり、それぞれのケースにおいて、アルキル又はアシル基中に８〜１８個のＣ原子を有し、並びにココ−アシルアミノエチルヒドロキシエチルカルボキシメチルグリシネートを採用し得る。
【００７１】
前記両性界面活性剤において、Ｃ８／１８−アルキル又はアシル基から離れて、少なくとも１個の遊離アミノ基及び少なくとも１個の−ＣＯＯＨ、又はＳＯ３Ｈ基を分子中に含み、内塩（ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ）の形成が可能な表面活性化合物が採用され得る。適切な両性界面活性剤の例として、Ｎ−アルキルグリシネート、Ｎ−アルキルプロピオン酸、Ｎ−アルキルアミノ酪酸、Ｎ−アルキルイミノジブロピオン酸、Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−アルキルアミドプロピルグリシン、Ｎ−アルキルタウリン、Ｎ−アルキルサルコシン、２−アルキルアミノプロピオン酸、ヲヨ帯アルキルアミノ酢酸であり、各ケースにおいて、アルキル基中に約８〜１８個のＣ原子を有するものが挙げられる。更に、両性界面活性剤の例として、Ｎ−ココ−アルキルアミノプロピオネート、ココ−アシルアミノエチルアミノプロピオネート、及びＣ１２／１８−アクリルサルコシンが挙げられる。
【００７２】
前記組成物を製剤化するのに使用される好ましい乳化剤又は界面活性剤は、前記微小ビーズの生産において使用されるものと同一である。
【００７３】
当業者に周知なように、多くの種類の緩衝剤が、本発明の微小ビーズの膨潤及び中和に適したものとして想定されている。好ましい態様において、前記緩衝剤のｐＨ値は２．０〜８．０の範囲内であり、好ましくは５．０〜７．５の範囲内である。
【００７４】
最適な場合、適切な緩衝剤は、ｐＨ値を考慮して選択され、その結果、架橋微小ビーズのｐＨは、可能な限り中性に近い値となる。好ましい態様において、前記緩衝剤は、前記架橋微小ビーズのｐＨの値を５．０〜７．５にするｐＨの値を示す緩衝剤を含む。
【００７５】
前記第一の側面の方法における緩衝剤は、リン酸緩衝剤及び／又は生理食塩水緩衝剤を含むのが好ましい。
【００７６】
また、前記架橋微小ビーズは、ｐＨ値が２．０〜８．０の範囲内、好ましくは５．０〜７．５の範囲内である、水、水及び酸、水及びリン酸緩衝剤、水及び生理食塩水緩衝剤、又は水及びリン酸緩衝剤及び生理食塩水緩衝剤で、少なくとも１回洗浄されるのも好ましい。
【００７７】
前記精製工程は、例えば濾過、デキャンテーション、遠心分離等の、当業者に知られる任意の分離技術を含み得る。１つ以上の精製工程と１つ以上の中和工程を組み合わせるのが有利であり得る。
【００７８】
前記第一の側面の好ましい態様は、前記方法に関し、前記精製工程は、１３，０００ダルトン未満のサイズの分子が自由に拡散する透析膜を使用して、脱イオン水に対して前記架橋微小ビーズを透析することを含む。
【００７９】
油相として、美容用又は個人治療用製剤において使用される、標準的な皮膚軟化剤を使用するのが好ましい。そのような標準的な皮膚軟化剤は、炭化水素又は芳香族炭化水素ではなく、特にトルエン、ｏ−キシレン、ドデカン、ヘプタン、イソオクタン又はセチルエチルヘキサノエートではない。本発明において使用される好ましい皮膚柔軟化剤は、１〜２２個のＣ原子を有する直鎖及び／又は分岐飽和又は不飽和アルコールのモノ−又はジエステル、１〜２２個のＣ原子を有する単官能性脂肪族カルボン酸と２〜３６個のＣ原子を有する脂肪属二官能性アルコールのエステル化生産物、長鎖アリール酸エステル、例えば直鎖及び／又は分岐鎖Ｃ６〜Ｃ２２アルコールとベンズ酸、あるいはベンズ酸イソステアリルエステル、ベンズ酸ブチルオクチルエステル、又はベンズ酸オクチルドデシルエステル、カルボネート、好ましくは直鎖Ｃ６〜Ｃ２２脂肪族アルコールカルボネート、ゲルベカルボネート（Ｇｕｅｒｂｅｔ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、例えばジカプリリルカルボネート、ジエチルヘキシルカルボネート、長鎖トリグリセリド、即ち３個の酸分子を有し、それらの少なくとも１つが脂肪族アルコールであるグリセロールの三重エステル、Ｃ６〜Ｃ１０脂肪酸に基づくトリグリセリド、直鎖又は分岐鎖脂肪族アルコール、例えばオレイルアルコール又はオクチルドデカノール、及び脂肪族アルコールエステル、例えばジアルキルエーテル、例えばジカプリリルエーテル、シリコーンオイル及び蝋、例えばポリジメチルシロキサン、シクロメチルシロキサン、及びアリール−又はアルキル−又はアルコキシ−置換されたポリメチルシロキサン又はシクロメチルシロキサン、６〜１８個、好ましくは８〜１０個の炭素原子を有する脂肪族アルコールに基づくゲルベアルコール、直鎖Ｃ６〜Ｃ２２脂肪族アルコールと直鎖Ｃ６〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、直鎖Ｃ６〜Ｃ２２脂肪族アルコール、特に２−エチルへキサノール又はイソノナノールと分岐Ｃ６〜Ｃ１３カルボン酸のエステル、Ｃ８〜Ｃ１８と直鎖Ｃ６〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、分岐アルコール、特に２−エチルへキサノール又はイソノナノールと分岐鎖Ｃ６〜Ｃ１３カルボン酸のエステル、多価アルコール（例えばプロピレングリコール、ダイマージオール又はトリマートリオール）及び／又はゲルベアルコールと直鎖及び／又は分岐鎖脂肪酸のエステル、Ｃ６〜Ｃ１８脂肪酸に基づく液体モノ−／ジ−／トリグリセリド混合物、芳香族カルボン酸とＣ６〜Ｃ２２脂肪族アルコール及び／又はゲルベアルコールのエステル、植物油、分岐第一級アルコール、置換シクロヘキサン、ポリオール及び／又はシリコーンオイルとエポキシ化脂肪酸エステルの開環生産物、あるいは２つ以上のこれらの化合物の混合物から選択される。使用される皮膚軟化剤は、相分離無くして水に混ざらないのが好ましい。
【００８０】
皮膚軟化剤及び油性成分に適したものエステルは、例えば１２〜２２個のＣ原子を有する脂肪酸のメチルエステル及びイソプロピルエステル、例えばメチルラウレート、メチルステアレート、メチルオレエート、メチルエルケート、イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、イソプロピルステアレート、イソプロピルオレエート等である。他の適切なモノエステルは、例えば、ｎ−ブチルステアレート、ｎ−ヘキシルラウレート、ｎ−デシルオレエート、イソオクチルステアレート、イソノニルパルミテート、イソノニルイソノナノエート、２−エチルヘキシルラウレート、２−エチルヘキシルパルミテート、２−エチルヘキシルステアレート、２−ヘキシルデシルステアレート、２−オクチルドデシルパルミテート、オレイルオレエート、オレイルエルケート、エルシルオレエート、及びテクニカルグレート脂肪族アルコールカット及びテクニカルグレート脂肪族カルボン酸混合物から取得できるエステル、例えば１２〜２２個のＣ原子を有する不飽和脂肪族アルコールと１２〜２２個のＣ原子を有する飽和及び不飽和脂肪酸のエステル、例えば動物及び植物脂肪から採取できるものである。しかしながら、天然に存在するモノエステル及び蝋エステル混合物、例えばホホバ油又はマッコウクジラ油中に存在するものも適切である。適切なジカルボン酸エステルは、例えば、ジ−ｎ−ブチルアジペート、ジ−ｎ−ブチルセバケート、ジ−（２−エチルヘキシル）アジペート、ジ−（２−ヘキシルデシル）スクシネート、ジ−イソトリデシルアゼレートである。適切なジオールエステルは、例えば、エチレングリコールジオレエート、エチレングリコールジ−イソトリデカノエート、プロピレングリコールジ−（２−エチルヘキサノエート）、ブタンジオールジ−イソステアレート、ブタンジオールジ−カプリレート／カプレート及びネオペニルグリコールジ−カプリレエートである。
【００８１】
本明細書中で、脂肪酸トリグリセリドの例として；例えば天然植物油、例えばオリーブ油、ヒマワリ油、ダイズ油、ラッカセイ油、ナタネ油、アーモンド油、ゴマ油、アボカド油、ヒマシ油、カカオバター、パーム油、並びにココナッツ油又はパーム核油等の液体成分、並びに動物油、例えばサメ肝臓油、タラ肝臓油、クジラ油、牛肉獣脂、バター脂肪分、蝋、例えば蜜蝋、カルナバヤシ蝋、羊毛及び牛脚油、牛肉の液体成分、あるいはカプリル酸／カプリン酸混合物の合成トリグリセリド、テクニカルグレードのオレイン酸由来のトリグリセリド、イソステアリン酸との、あるいはパルミチン酸／オレイン酸混合物由来のトリグリセリド、が、皮膚軟化剤（油相）として採用され得る。
【００８２】
前記第一の側面の他の好ましい態様において、有機又は油相は、ミネラルオイル又はＴＥＧＯＳＯＦＴ（登録商標）Ｍを含む。
【００８３】
好ましくは、前記皮膚柔軟化剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、レシチン、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、トコフェロール、トコフェリルポリエチレングリコールスクシネート、トコフェロールパルミテート及びトコフェロールアセテート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、又はそれらの混合物から選択される。
【００８４】
本発明の微小ビーズは、これらの微小ビーズを含む本発明の組成物へのアクセスを可能とする。本発明の組成物は、皮膚軟化剤、乳化剤及び界面活性剤／粘度調整剤／安定化剤、ＵＶ光保護フィルター、抗酸化剤、水刺激剤（ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔ）（又はポリオール）、固体及び充填剤、フィルム形成剤、防虫剤、保存料、品質調整剤、香料、染料、生物活性物質、保湿剤及び溶媒の群から選択される少なくとも１つの追加的な成分を含む。好ましくは、前記追加的な成分は、本発明の組成物中で、微小ビーズの外側又は内側に存在する。
【００８５】
好ましい態様において、本発明の組成物は、乳濁物、懸濁物、溶液、クリーム、軟膏、ペースト、ゲル、油、粉末、エアロゾル、棒又はスプレーであってもよい。
【００８６】
本発明の微小ビーズ又は組成物は、経皮薬物送達系／ビヒクルとして使用され得る。局所的に適用されると、該微小ビーズは、皮膚のしわ（ｗｒｉｎｋｌｅ）及びたるみ（ｆｏｌｄ）に集合する（データ未公開）。
【実施例】
【００８７】
実施例１．乳濁物中のＤＶＳ架橋微小顆粒の調製
この実施例は、ＤＶＳ架橋微小顆粒の調製を例証するものである。
【００８８】
室温で３時間、激しく攪拌して、ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、５８０ｋＤａ、１．９０ｇ）をＮａＯＨ水溶液（０．２Ｍ、３７．５ｍｌ）中に溶解して、均一な溶液を得た。塩化ナトリウム（０．２９ｇ）を添加して、短時間混合した。
【００８９】
ミネラルオイル（１０．０ｇ）及びＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０界面活性剤（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ ジメチコン、１．０ｇ）を、攪拌により混合した。
【００９０】
前記アルカリＨＡ水溶液にジビニルスルホン（ＤＶＳ、３２０マイクロリットル）を添加して、水相中に均一に分布するように１分間混合した。該水相を２分間以内に前記油相に添加して、低速のメカニカルスターラーで攪拌した。即座に乳濁物が形成され、室温で３０分間攪拌が続行された。該乳濁物を、室温で一晩放置した。
【００９１】
ＨＣｌ水溶液（４Ｍ、約２．０ｍｌ）を添加することにより前記乳濁物を中和し、約４０分間攪拌した。
【００９２】
実施例２．ｐＨ表示薬を使用して中和した乳濁物中のＤＶＳ架橋微小粒子の調製
この実施例は、ｐＨ表示薬を使用して中和したＤＶＳ架橋微小粒子の調製を例証する。
【００９３】
室温で２時間、激しく攪拌して、ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、５８０ｋＤａ、１．８８ｇ）をＮａＯＨ水溶液（０．２Ｍ、３７．５ｍｌ）中に溶解して、均一な溶液を得た。プロモチモールブルーｐＨ表示薬（等価範囲ｐＨ６．６〜６．８）を添加した（１５滴、溶液中の青色）。塩化ナトリウム（０．２５ｇ）を添加して、短時間混合した。
【００９４】
ミネラルオイル（１０．０ｇ）及びＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０界面活性剤（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ ジメチコン、１．０ｇ）を、攪拌により混合した。
【００９５】
前記アルカリＨＡ水溶液にジビニルスルホン（ＤＶＳ、３２０マイクロリットル）を添加して、水相中に均一に分布するように３０〜６０秒間激しく混合した。該水相を３０秒以内に前記油相に添加して、４００ＲＰＭのメカニカルスターラーで攪拌した。即座に乳濁物が形成され、室温で３０分間攪拌が続行された。該乳濁物を、ＨＣｌ水溶液（４Ｍ、約１．６ｍｌ）を添加することにより中和し、マグネチックスターラーで攪拌しながら室温で４時間放置した。ゲル粒子中に存在するｐＨ表示薬は、緑色に変色した。ｐＨスティックによる測定では、該乳濁物のｐＨは３〜４であった。該乳濁物を、冷蔵庫中に一晩放置した。ゲル粒子中に存在するｐＨ表示薬は、黄色に変色した。
【００９６】
実施例３．乳濁物の文離、微小粒子の膨潤及び単離
この実施例は、Ｗ／Ｏ乳濁物の破壊、そしてその後の相分離及び透析を例証する。有機溶媒抽出により、架橋ＨＡ微小粒子をＷ／Ｏ乳濁物から分離した。
【００９７】
前記Ｗ／Ｏ乳濁物（５ｇ）とｎ−ブタノール／クロロホルム混合物（１／１ｖ％、４．５ｍｌ）とを混合して、室温で、試験管中で、回転混合により激しく攪拌した。過剰のｍＱ−水（２０ｍｌ）を添加して、相分離を生じさせた。該試験管を遠心分離し、有機相の下相、ゲル粒子の中相、及び透明な水溶液の上相の３つの相を生じさせた。上相及び下相を捨て、ゲル粒子の中相を透析チューブ（ＭＷＣＯ １２−１４，０００、直径２９ｍｍ、容積／長さ ６．４ｍｌ／ｃｍ）に移した。
【００９８】
前記試料を、室温で一晩、ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水中で透析した。更に２回透析液を交換して、一晩放置した。得られたゲルは、厚く、粘性が高く、体積が約５０ｍｌに膨潤しており、これが０．００４ｇＨＡ／ｃｍ３に相当する。
【００９９】
実施例４．乳濁物中のＤＶＳ架橋微小粒子の調製及び微小粒子の分離
この実施例は、ＤＶＳ架橋ＨＡ微小粒子の調製を例示する。
【０１００】
ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、５８０ｋＤａ、１．８９ｇ）をＮａＯＨ水溶液（０．２Ｍ、３７．５ｍｌ）中に溶解した。塩化ナトリウム（０．２５ｇ）を添加して、均一な溶液が得られるように、これを室温で１時間、マグネチックスターラーで攪拌した。
【０１０１】
ＴＥＧＯＳＯＦＴ（登録商標）Ｍ（１０．０ｇ）油及びＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０界面活性剤（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン、１．０ｇ）を、攪拌により混合した。
【０１０２】
前記アルカリＨＡ水溶液にジビニルスルホン（ＤＶＳ、３２０マイクロリットル）を添加して、１分間混合した。該水相を２分以内に前記油相に添加して、メカニカルスターラーで攪拌した（３００ＲＰＭ）。即座に乳濁物が形成され、室温で３０分間攪拌が続行された。
【０１０３】
化学量論的量のＨＣｌ（４Ｍ、１．８ｍｌ）を添加することにより前記乳濁物を中和し、約４０分間攪拌した。該乳濁物を、ｎ−ブタノール／クロロホルム混合物（１：１ｖ％、９０ｍｌ）及び過剰のＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水（１００ｍｌ）を添加することにより破壊し、そしてマグネチックスターラーにより攪拌した。約１７５ｍｌの体積の上相が分離された。最後の洗浄において、有機相を３０ｍｌのｍＱ水で洗浄した。前記組み合わせられた水／ゲル相（２０５ｍｌ）を透析チューブ（ＭＷＣＯ １２−１４，０００、直径２９ｍｍ、容積／長さ ６．４ｍｌ／ｃｍ）に移し、室温で一晩、ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水に対して透析した。水を交換（３回）し、透析（二晩）した後の時点で、伝導性は０．６７マイクロシーベルト／ｃｍにまで低下した。得られた微小粒子を、顕微鏡（ＤＩＣ ２００ｘ）により評価した。図１を参照されたい。１つの微小粒子の断面が示され、「２１，５７８．９２ｎｍ」と標識されている。
【０１０４】
実施例５．乳濁物の相分離及び微小粒子の単離
この実施例は、Ｗ／Ｏ乳濁物の破壊及びゲル微小粒子の単離を例証する。
【０１０５】
有機抽出により、ゲル微小粒子をＷ／Ｏ乳濁物から分離した。抽出に使用される有機溶媒は、例えばブタノール／クロロホルムの７５：２０〜２０：８０の比率（ｖ％）の混合物であった。Ｗ／Ｏ乳濁物と有機溶媒の重量比（ｗ％）は、約１：１であった。
【０１０６】
小スケールの分離：Ｗ／Ｏ乳濁物（５ｇ）を遠心チューブ（５０ｍｌ）中に量り取った。ブタノール／クロロホルムの混合物を調製（１：１ｖ％）して、この混合物を前記試験管に４．５ｍｌ添加した。全ての乳濁物が溶解するように、試験管を慎重に混合した。該試験管を回転混合により混合し、室温で放置して相分離させた。相分離において、通常、上方の水相と下方の有機相との間に、白色の乳濁物の相が観察される。更に水および有機相を加えることにより、分離が促進した。デカンテーションにより水相を捨て、更に精製及び特定を行った。
【０１０７】
実施例６．油中水乳濁物の調製
この実施例は、ＨＡ微小粒子が形成される組成物を例証する。
【０１０８】
製造時間を短縮するために、温めた油相に冷やした水相を加える手順を使用する場合がある。以下に、非限定的な製剤の一例を示す。
【０１０９】
相Ａ：
・２．０％ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン）
・２０．０％ミネラルオイル（又はＴＥＧＥＳＯＦＴ（登録商標）Ｍ）
【０１１０】
相Ｂ：
・０．５％塩化ナトリウム
・３．８％ヒアルロン酸
・０．２ＭＮａＯＨ（ａｑ） １００％迄
【０１１１】
相Ｃ：
・約０．６％ジビニルスルホン
【０１１２】
調製
１．室温で相Ａを混合する。
２．ＮａＯＨ水溶液中にヒアルロン酸（Ｈｙａｃａｒｅ（登録商標））を攪拌して溶解し、そしてＮａＣｌを添加して攪拌して、これを相Ｂとする。
３．相ＢにＤＶＳを添加して、１分間攪拌する。
４．攪拌しながら相Ａに相Ｂを添加する。
５．短時間ホモジナイズ又は攪拌して、反応をとめる。
６．攪拌及び膨潤させる。
７．３０℃未満で攪拌を続行する。
８．中和する。
【０１１３】
実施例７．ＤＶＳ架橋微小粒子の調製及び分離
ＮａＯＨ（０．２Ｍ、３７．５ｍｌ）中に、ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、５８０ｋＤａ、１．８８ｇ）を溶解した。塩化ナトリウム（０．２５ｇ）を添加して、均一な溶液を得るために、該溶液を、室温で１時間、マグネチックスターラーにより攪拌した。
【０１１４】
油：ＴＥＧＯＳＯＦＴ（登録商標）Ｍ（１０．０ｇ）、及び界面活性剤ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン、１．０ｇ）を、攪拌により混合した。前記アルカリＨＡ水溶液にジビニルスルホン（ＤＶＳ、３２０マイクロリットル）を添加し、水相中に均一に分布するように、１時間混合した。そして水相を２分以内に前記油相に添加して、メカニカルスターラー（３００ＲＰＭ）により攪拌した。直ちに乳濁物が形成され、攪拌は、室温で３０分間続行された。
【０１１５】
化学量論的量のＨＣｌ（４Ｍ、１．８ｍｌ）を添加することにより前記乳濁物を中和し、約４０分間攪拌した。該乳濁物を分離じょうご（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｕｎｎｅｌ）に移し、ｎ−ブタノール／クロロホルム混合物（１：１ｖ％、９０ｍｌ）及び過剰のＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水（１００ｍｌ）を添加することにより破壊し、そして激しく攪拌した。約１７５ｍｌの体積の上相が分離された。最後の洗浄において、有機相を１００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水で洗浄した。前記組み合わせられた水／ゲル相（２０５ｍｌ）を透析チューブ（ＭＷＣＯ １２−１４，０００、直径２９ｍｍ、容積／長さ ６．４ｍｌ／ｃｍ）に移し、室温で一晩、ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水に対して透析した。水を交換（３回）し、透析（二晩）した後の時点で、伝導性は１０マイクロシーベルト／ｃｍにまで低下した。得られた微小粒子を、顕微鏡により評価した（図４）。
【０１１６】
実施例８．微小粒子を精製する洗浄手順
この実施例は、微小粒子の最終的な単離及び精製を例示する。
【０１１７】
予め単離した粒子１００ｍｌを、Ｎａ２ＨＰＯ４／ ＮａＨ２ＰＯ４緩衝剤（０．１５Ｍ、４００ｍｌ）で再懸濁し、１／２時間穏やかに攪拌した。該懸濁物を５℃で２時間立てて置き、固形化した油滴を抜き取った。そして溶液をメッシュでろ過し、更に５０ｍｌの緩衝剤で２回洗浄した。ドリップ乾燥の後、粒子を特定した（図５）。
【０１１８】
実施例９．微小粒子の流動学的特性の調査
この実施例は、粒子の流動学的研究の実行を例示する。粒子試料を、５０ｍｍ２°コーン／プレートジオメトリーの使用により、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ （Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＧｍｂＨ， Ｇｒａｚ， Ａｕｓｔｒｉａ， Ｐｈｙｓｉｃａ ＭＣＲ ３０１ ， Ｓｏｆｔｗａｒｅ： Ｒｈｅｏｐｌｕｓ）上で解析した。第一に、材料の粘弾特性Ｇ’（貯蔵モジュール）及びＧ’’（損失モジュール）の線形範囲を、可変ひずみ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｔｒａｉｎ）γを用いた振幅掃引により決定される。第二に、周波数掃引が作成され、前記粘弾性値、Ｇ’及びＧ’’の値に基づいて、ｔａｎδが、弱／強ゲル挙動における値として計算され得る。
【０１１９】
実施例１０．Ｔｅｘｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｚｅｒによる注射針通過可能性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）実験の調査
この実施例は、所定の速度で注入するのに掛かる力の、前記試料の均一性の関数としての調査の実行を例証する。粒子試料を、２７Ｇｘ１／２、３０Ｇｘ１／２のいずれかの針を取り付けたシリンジに移し、これをテクスチャーアナライザー（Ｓｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓｕｒｒｅｙ， ＵＫ， ＴＡ．ＸＴ Ｐｌｕｓ， Ｓｏｆｔｗａｒｅ： Ｔｅｘｔｕｒｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ３２）の試料リグにセットする。該試験は、１２．５ｍｍ／ｍｉｎの速度で所定の距離を通して実行される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋ヒアルロン酸微小ビーズの生産、及びその生産された微小ビーズに関し、該方法は：
（ａ）ヒアルロン酸又はその塩を含むアルカリ水溶液を、架橋剤を含む溶液と混合し、
（ｂ）有機相又は油相中で前記工程（ａ）の混合した溶液から所望のサイズを有する微小液滴を形成して、有機中水又は油中水（Ｗ／Ｏ）乳濁物を形成し、
（ｃ）該Ｗ／Ｏ乳濁物を継続的に攪拌することにより、ヒアルロン酸とジビニルスルホンとの反応を引き起こし、架橋ヒアルロン酸微小ビーズを生じさせ、そして
（ｄ）該架橋ヒアルロン酸微小ビーズを精製する
工程を含む。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、生物医学、及び薬理的用途に使用される、乳濁物中の改変ヒアルロン酸（ＨＡ）、特に架橋ＨＡを調製するプロセスに関する。
【０００３】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、非硫酸化グリコサミノグリカンのクラスに属する、天然の、直鎖糖質ポリマーである。ヒアルロン酸は、ベータ−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン及びベータ−１，４−グルクロン酸の二種類の糖の単位の繰り返しから構成され、分子量（ＭＷ）が６ＭＤａに上る。ヒアルロン酸は、硝子軟骨、滑膜関節体液、及び真皮及び表皮両方の皮膚組織に存在する。ＨＡは、脊椎動物の結合組織を含む天然の組織から、ヒト臍帯から、そしてニワトリの鶏冠から抽出され得る。しかしながら、今日では、感染性の因子を担持する潜在的リスクを最小化し、生産物の均一性、水準及び入手可能性を増大させるために、微生物学的手法によりヒアルロン酸を調製するのが好ましい（ＷＯ ０３／０１７５９０２， Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）。
【０００４】
生体における、ＨＡの多くの機能が知られている。ＨＡは、生体器官における、皮膚、腱、筋肉及び軟骨等の多くの組織の細胞の機械的支持において重要な役割を果たす。ＨＡは、組織の保湿、及び滑潤等の重要な生物学的プロセスに関与する。また、ＨＡは、接着、発生、細胞運動、癌、血管真性、及び創傷治癒等の、様々な生理学的機能に一定の役割を果たすとも考えられている。特異な物理的及び生物学的特性（粘弾性、生体適合性、生分解性を含む）により、ＨＡは、眼科学、リューマチ学、薬物送達、創傷治癒及び組織工学の分野の、様々な、既存の及び開発中の用途において採用されている。これらの用途の幾つかにおけるＨＡの使用は、ＨＡが室温、即ち約２０℃で水に溶け、体内のヒアルロニダーゼにより迅速に分解し、そして生体材料への加工が困難であるという事実により、制限される。故に、ＨＡの物理的及び機械的特性、並びにインビボでの存在期間を改善するために、ＨＡの架橋が導入されていた。
【０００５】
米国特許第４，５８２，８６５号（Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）は、架橋剤としてジビニルスルホン（ＤＶＳ）を使用する、単独、又は多の親水性ポリマーと混合した、ＨＡの架橋ゲルの調製を記載している。多官能性エポキシ化合物を使用する、架橋ＨＡ又はその塩の調製は、ＥＰ ０ １６１ ８８７ Ｂ１に開示されている。共有結合を通じてＨＡを架橋するのに採用されている他の二官能性又は多官能性薬剤は、ホルムアルデヒド（Ｕ．Ｓ． ４，７１３，４４８、Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）、ポリアジリジン（ＷＯ ０３／０８９４７６ Ａ１、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．）、Ｌ−アミノ酸若しくはＬ−アミノエステル（ＷＯ ２００４／０６７５７５， Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ Ｓ．Ｐ．Ａ．）を含む。カルボジイミドも、ＨＡの架橋剤として報告されている（Ｕ．Ｓ． ５，０１７，２２９、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．； Ｕ．Ｓ． ６，０１３，６７９、Ａｎｉｋａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ）。脂肪族アルコールとＨＡとの全体的又は部分的架橋エステル、及びそのような部分的エステルと無機又は有機塩基との塩は、ＵＳ ４，９５７，７４４に開示されている。水／アセトン混合物中の、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（「ＥＤＡＣ」）、及びアジピン酸ジヒドラジドを用いたＨＡの架橋は、ＵＳ ２００６／００４０８９２（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｔｅｘａｓ）に開示された。また、ＷＯ ２００６／５６２０４（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）は、架橋剤として字ビニルスルホン（ＤＶＳ）を使用するＨＡの架橋ゲルを調製する方法も開示している。
【０００６】
ＷＯ ２００８／１０００４４は、本出願の優先年に公開されたもので、ヒアルロン酸を架橋することによるヒアルロンヒドロゲルナノ粒子を調製する方法を記載し、この方法は、ｉ）界面活性剤が溶解した油相と、ｉｉ）ヒアルロン酸及び水溶性架橋剤が溶解した塩基性水溶液の水相とを混合する工程を含むが、ここに、Ｗ／Ｏ乳濁物を形成するためのジビニルスルホン、該Ｗ／Ｏ乳濁物中でのヒアルロン酸の架橋、該油相がドデカン、ヘプタン、又はセチルエチルヘキサノエートを含むことは、言及されていない。
【０００７】
ＥＰ Ｏ ８３０ ４１６（ＵＳ ６，２１４，３３１に対応する）は、架橋水溶性ポリマー粒子調製物の調製を記載し、該粒子は、直径２１２μｍ未満で、該粒子の少なくとも８０％が球形で、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、セルロース、キチン、キトサン、アガロース、カラギーナン、カードラン、デキストラン、アマルサン、ゲラン、キサンタン、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、タンパク質、糖タンパク質、ペプチドグリカン、プロテオグリカン、リポ多糖類、又はそれらの組合せから選択される水溶性ポリマーを含むポリマー水溶液を、油中水乳化剤を含む油性基材に添加して、該混合物を混合して、ポリマー液滴を含む乳濁物を形成して、そのまま、架橋剤を添加することにより該ポリマー液滴を架橋して、こうして架橋ポリマー粒子を形成させることにより収得が可能である。前記架橋剤は、最初に、水溶液のｐＨを１１に調製することにより不活性化され、そしてｐＨを７〜８に下げることにより活性化される。トルエン、ｏ−キシレン、又はイソオクタンが、油相として好ましい。水相と油相との重量の比率は、約１：１である。
【０００８】
Ｎｕｒｅｔｔｉｎ Ｓａｈｉｎｅｒ及びＸｉｎｑｉａｏ Ｊａｉ（Ｔｕｒｋ Ｊ Ｃｈｅｍ， ３２ （２００８）， ３９７−４０９）は、油相としてイソオクタンを使用する、ヒアルロン酸を基礎とするミクロン未満のヒドロゲル粒子の調製を記載している。０．５４ｍｌのヒアルロン酸水溶液を、１５ｍｌのイソオクタンに添加して調製され、得られた水相と油相との重量比は１０：１を超える。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上により、架橋ＨＡゲルの調製に適した幾つかの架橋剤が公知であることは明らかである。しかしながら、様々な用途に特に適したＨＡの新たな製剤の提供には、なおも商業的関心が存在する。例えば、ナノからマイクロメートルの範囲の断面を有する所望のサイズのゲル様架橋ＡＨ微小ビーズを提供する新たな方法は、商業的関心が高い。そのような架橋ＨＡの微小ビーズは、例えば、薬理的薬物の送達用ビヒクルとして、それ自体が生物活性物質として、組成物、及びあらゆる生物医学的用途における構成成分として、多くの用途に使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、第一の側面において、本発明は、架橋ヒアルロン酸微小ビーズを生産する方法を提供し、該方法は：
（ａ）ヒアルロン酸又はその塩を含むアルカリ水溶液と架橋剤を含む溶液を混合し；
（ｂ）有機相又は油相中で前記工程（ａ）の混合した溶液から所望のサイズを有する微小液滴を形成して、有機中水又は油中水（Ｗ／Ｏ）乳濁物を形成し、
（ｃ）該Ｗ／Ｏ乳濁物を継続的に攪拌することにより、ヒアルロン酸とジビニルスルホンとの反応を引き起こし、架橋ヒアルロン酸微小ビーズを生じさせ、そして
（ｄ）該架橋ヒアルロン酸微小ビーズを精製する
工程を含む。
【００１１】
第二の側面において、本発明は、ヒアルロン酸又はその塩を含み、ジビニルスルホンで架橋され；好ましくは前記第一の速年の方法により作製される、微小ビーズに関する。
【００１２】
第三の側面において、本発明は、前記第二の側面において定義される微小ビーズ、および好ましくは薬理的活性物質である有効成分を含む組成物に関する。
【００１３】
本発明の第四の側面は、前記第二の側面において定義される有効な量の微小ビーズを、医薬として許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に含む、医薬組成物に関する。
【００１４】
第五の側面は、前記第二の側面において定義される有効な量の微小ビーズをビヒクルとして、薬理的活性物質と共に含み、好ましくは該薬理活性物質が、該微小ビーズ中に分散物又は溶液として封入される、医薬組成物に関する。
【００１５】
第六の側面において、本発明は、前記第二の側面において定義される微小ビーズ、又は前記第三、第四、又は第五の側面のいずれかにおいて定義される組成物を含む、衛生、医療、又は手術用品であり、好ましくは該用品は、おむつ、生理用ナプキン、手術用スポンジ、創傷治癒用スポンジ、若しくは絆創膏の一部、又は他の創傷包帯材料である。
【００１６】
重要な側面は、前記第二の側面において定義される微小ビーズ、又は前記第三、第四、又は第五の側面のいずれかにおいて定義される組成物を含む、カプセル又は微小カプセルに関する。
【００１７】
多くの側面は、変形性関節症、癌の治療用医薬を生産するための、眼科的処置用の医薬を生産するための、創傷治療用の医薬を生産するための、血管真性用の医薬を生産するための、脱毛若しくは禿の治療用の医薬を生産するための、保湿剤を生産するための、皮膚充填剤（ｄｅｒｍａｌ ｆｉｌｌｅｒ）、薬物送達系／ビヒクルもしくは組織増加（ｔｉｓｓｕｅ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）用のデバイスを生産するための、前記第二の側面において定義される微小ビーズ、又は前記第三、第四、又は第五の側面のいずれかにおいて定義される組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】直径２２マイクロメートルの粒子の球形のプロフィールを呈する、単離された架橋ヒアルロン酸ゲル粒子の顕微鏡写真を示す。
【００１９】
【図２】着色料としてｐＨ表示薬を含む乳濁物の顕微鏡写真を示す。この写真は、より大きな粒子に囲まれた、小さな粒子（１〜５マイクロメートル）の貢献を示す。
【００２０】
【図３】最大で直径１ｍｍのゲル粒子を呈する、単離された架橋ヒアルロン酸ゲル粒子（ｘ８０）の顕微鏡写真を示す。
【００２１】
【図４】直径５００〜１０００マイクロメートルの範囲の様々なサイズの粒子の球形のプロフィールを呈する、単離された微小ビーズ粒子の顕微鏡写真を示す。
【００２２】
【図５】洗浄手順の後の粒子の写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
「ヒアルロン酸」という用語は、文中では、異なる分子量を有し、Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸の残基により構成され、天然に細胞表面に存在し、脊椎動物の結合組織の基本的な細胞外物質中に、関節の滑膜体液中に、眼球内液中に、ヒト臍帯組織中に、及びニワトリの鶏冠中に存在する、酸性多糖類を意味する。
【００２４】
「ヒアルロン酸」という用語は、実際は、通常、分子量が様々なＤ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸の交互の残基を有する全ての型の多糖類、又はその分解フラクションさえ意味するものとして使用されるので、「ヒアルロン酸」は、複数形として用いるのがより妥当と考えられる。しかしながら、本明細書中の全てにおいて、単数形が使用されており；加えて、「ＨＡ」という略語は、この総称に代えて頻繁に使用され得る。
【００２５】
「ヒアルロン酸」は、本明細書中では、Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸がベータ−１，４及びベータ−１，３−グリコシド結合により交互に連結され、二糖が反復することにより構成される、非硫酸化グリコサミノグリカンとして定義される。ヒアルロン酸は、ヒアルロナン、ヒアルロネート、又はＨＡとしても知られる。ヒアルロナン及びヒアルロン酸という用語は、本明細書中で、相互に置換可能なものとして使用される。
【００２６】
ニワトリの鶏冠は、ヒアルロナンの重要な商業的供給源である。微生物は、代替的な供給源である。米国特許第４，８０１ ，５３９号は、ストレプトコッカス・ズウエピデミクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）の株を利用するヒアルロン酸を調製するための発酵方法を開示しており、１リットルあたり約３．６ｇのヒアルロン酸が収得されたことを報告している。欧州特許第ＥＰ０６９４６１６号は、ストレプトコッカス・ズウエピデミクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）の改良した株を利用する発酵プロセスを開示しており、約３．５ｇのヒアルロン酸が取得されたことを報告している。本明細書中に全てが援用されるＷＯ ０３／０５４１６３（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）に開示されているように、ヒアルロン酸又はその塩は、例えばグラム陽性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主中で、組換え的に生産され得る。
【００２７】
ヒアルロナンシンターゼは、脊椎動物、細菌性病原体、及び藻類ウイルス由来のものが記載されている（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ， Ｐ． Ｌ．， １９９９， Ｃｅｌｌ． ＭｏＩ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５６： ６７０−６８２）。ＷＯ ９９／２３２２７はストレプトコッカス・エキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）由来のグループＩヒアルロネートシンターゼを開示している。ＷＯ ９９／５１２６５ ａｎｄ ＷＯ ００／２７４３７は、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来のグループＩＩヒアルロネートシンターゼを開示している。Ｆｅｒｒｅｔｔｉらは、ストレプトッコッカス・ピオゲンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のヒアルロナンシンターゼオペロンを開示し、該オペロンは、ｈａｓＡ、ｈａｓＢ、及びｈａｓＣの２つの遺伝子を有し、それぞれヒアルロネートシンターゼ、ＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼ、及びＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼをコードする（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９８， ４６５８−４６６３， ２００１）。ＷＯ ９９／５１２６５は、ストレプトコッカス・エキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）ヒアルロナンシンターゼのコード領域を有する、核酸断片を記載する。
【００２８】
組換えバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞のヒアルロン酸は培養培地に直接発現されるため、培地からヒアルロナンを単離するのに単純なプロセスが使用され得る。第一に、バチルス細胞及び細胞デブリが培養培地から物理的に除去される。この培養培地を必要に応じて希釈して、培地の粘性を低下させる。遠心分離又は精密濾過等、培養培地から細胞を除去する多くの方法は、当業者に知られている。必要に応じて、残った上澄を超遠心等により濾過して、ヒアルロナンを濃縮し、小分子のコンタミネーションを除去する。細胞及び細胞デブリの除去後、既知のメカニズムのよりヒアルロナンを培地から沈殿させる。前記濾過物からヒアルロナンを沈殿させるのに、塩、アルコール、又は塩とアルコールの組合せが使用され得る。沈殿物に変えた後、ヒアルロナンは、物理的な手段により、溶液から容易に単離され得る。凍結乾燥又は噴霧乾燥等の当業者に知られる蒸発技術を使用することにより、ヒアルロナンは、乾燥され、又は濾過溶液から濃縮される。
【００２９】
本明細書中で、「微小ビーズ」という用語は、微小滴、微小液滴、微小粒子、微小球、ナノビーズ、ナノ滴、ナノ液滴、ナノ粒子、ナノ球等の用語と相互に置換可能なものとして使用される。典型的な微小ビーズは、概ね球形で、断面の直径が約１ナノメートルカラ１ミリメートルの範囲内である。しかし、通常、本発明の発明に係る微小ビーズは、更により狭い範囲で所望のサイズとなるように、即ち殆ど均一となるように作製し得る。好ましくは、該微小ビーズの直径は、約１００〜１０００ナノメートルの範囲内；又は１０００ナノメートル〜１０００マイクロメートルの範囲内である。該微小ビーズのサイズ分布は小さく、多分散度（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ）は狭い。
【００３０】
宿主細胞
好ましい態様は、前記ヒアルロン酸又はその塩が、組換え的に生産され、好ましくはグラム陽性細菌、又は宿主細胞により、より好ましくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌により生産される、前記第一の側面の方法に関する。
【００３１】
前記宿主細胞は、ヒアルロン酸の組換え生産に適した任意のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であってもよい。該バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、野生型バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞又はその突然変異体であってもよい。本発明の実施に有用なバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、限定されないが、バチルス・アガラデレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇａｒａｄｅｒｈｅｎｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びバチルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含む。ＷＯ ９８／２２５９８において、組換え発現に特に適応した突然変異バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞が記載されている。無鞘（Ｎｏｎ− ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、本発明において特に有用である。
【００３２】
好ましい態様において、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）又はバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞である。好ましい態様において、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞である。他のより好ましい態様において、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）細胞である。他のより好ましい態様において、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）細胞である。他のより好ましい態様において、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞である。他のより好ましい態様において、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞である。最も好ましい態様において、前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ａ１６４Δ５（米国特許第５，８９１ ，７０１号を参照されたい）又はバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８Δ４である。
【００３３】
分子量
ヒアルロン酸の構成は、改変カルバゾール法に従い決定され得る（Ｂｉｔｔｅｒ ａｎｄ Ｍｕｉｒ， １９６２， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４： ３３０−３３４）。更に、ヒアルロン酸の平均分子量の値は、Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ３６， ４９７１−４９７５、Ｗｙａｔｔ， １９９３， Ａｎａｌ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ２７２： １−４０、並びにＷｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， １９９９， “Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＤＡＷＮ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ”及び“ＤＡＷＮ ＥＯＳ Ｍａｎｕａｌ” Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ等に記載の、当該技術分野の標準的な手法を使用して決定され得る。
【００３４】
好ましい態様において、本発明のヒアルロン酸又はその塩の分子量は、約１０，０００〜１０，０００，０００Ｄａである。より好ましい態様において、本発明のヒアルロン酸又はその塩の分子量は、約２５，０００〜約５，０００，０００Ｄａである。最も好ましい態様において、前記ヒアルロン酸の分子量は、約５０，０００〜約３，０００，０００Ｄａである。
【００３５】
好ましい態様において、前記ヒアルロン酸又はその塩の分子量は３００，０００〜３，０００，０００の範囲内；好ましくは４００，０００〜２，５００，０００の範囲内；より好ましくは５００，０００〜２，０００，０００の範囲内；そして最も好ましくは６００，０００〜１，８００，０００の範囲内である。
【００３６】
なおももう一つの好ましい態様において、前記ヒアルロン酸又はその塩の平均分子量が小さいもので、１０，０００〜８００，０００Ｄａの範囲内；好ましくは２０，０００〜６００，０００Ｄａの範囲内；より好ましくは３０，０００〜５００，０００Ｄａの範囲内；なおもより好ましくは４０，０００〜４００，０００Ｄａの範囲内； そして最も好ましくは５０，０００〜３００，０００Ｄａの範囲内である。
【００３７】
塩及び架橋ＨＡ
好ましい態様は、ヒアルロン酸の無機塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、又はヒアルロン酸コバルト等を含む、前記第一の側面の方法に関する。
【００３８】
他の成分
好ましい態様において、本発明の方法により生産される生産物は、他の成分、好ましくは１つ以上の有効成分、好ましくは１つ以上の医薬活性物質、また好ましくは水溶性賦形剤、ラクトース又は非生物由来の糖類等も含む。
【００３９】
本発明に使用され得る有効成分又は１つ以上の医薬活性物質の例には、ビタミン、抗炎症薬、抗生物質、静菌剤、一般的な麻酔薬、リドカイン、モルヒネ、並びにタンパク質及び／又はペプチド薬、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、ホルモン／ペプチド関連成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、骨形成タンパク質、インターフェロン若しくはその誘導体、インスリン若しくはその誘導体、心房性ナトリウム利尿ペプチドＩＩＩ、モノクローナル抗体、腫瘍壊死因子、マクロファージ活性化因子、インターロイキン、腫瘍分解因子、インスリン様増殖因子、上皮細胞増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子、因子ＩＩＶ、因子ＩＩＩＶ、並びにウロキナーゼ等が含まれる。
【００４０】
水溶性賦形剤は、前記有効成分を安定化する目的で加えられる場合があり、そのような賦形剤は、例えばアルブミン又はゼラチン等のタンパク質；グリシン、アラニン、グルタミン酸、アルギニン、リシン等のアミノ酸及びそれらの塩；グルコース、ラクトース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、サッカロース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、トレハロース及びコンドロイチン硫酸等の糖質；リン酸塩等の無機酸塩；ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ＩＣＩ）等の界面活性剤、ポリエチレングリコール、並びにそれらの混合物を含む。前記賦形剤又は安定化剤は、生産物の重量の０．００１〜９９％の範囲を占める量が使用され得る。
【００４１】
本発明の幾つかの側面は、とりわけ、有効な量の架橋ＨＡ生産物、好ましくは該有効成分が医薬活性物質である有効成分；医薬として許容される担体、賦形剤又は希釈剤、好ましくは水溶性賦形剤、及び最も好ましくはラクトースを含む、様々な組成物及び医薬に関する。
【００４２】
本発明の複数の側面は、前記第一の側面において定義される生産物又は前記複数の側面及び上記態様において定義される組成物を含む物品に関し、例えば衛生用品、医療用品又は手術用品が挙げられる。最後の態様において、本発明は、前記第一の側面において定義される生産物、又は他の側面及び本発明の態様において定義される組成物を含む、医薬カプセル又は微小カプセルに関する。
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明の第一の側面は、架橋ヒアルロン酸微小ビーズを生産する方法であり、該方法は、以下の；
（ａ）ヒアルロン酸又はその塩を含むアルカリ水溶液を、架橋剤を含む溶液と混合し、
（ｂ）有機相又は油相中で前記工程（ａ）の混合した溶液から所望のサイズを有する微小液滴を形成して、有機中水又は油中水（Ｗ／Ｏ）乳濁物を形成し、
（ｃ）該Ｗ／Ｏ乳濁物を継続的に攪拌することにより、ヒアルロン酸とジビニルスルホンとの反応を引き起こし、架橋ヒアルロン酸微小ビーズを生じさせ、そして
（ｄ）該架橋ヒアルロン酸微小ビーズを精製する
工程を含む。
【００４４】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中で組換え的にヒアルロン酸を生産する方法は、ＷＯ ２００３／０５４１６３， Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（全て本明細書中に参照により援用される）に既に記載されている。
【００４５】
従って、好ましい態様において、本発明は、前記第一の側面に関し、前記ヒアルロン酸又はその塩は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中で組換え的に生産される。
【００４６】
ヒアルロン酸の様々な分子量フラクションは、特定の目的に有利なものとして記載されている。
【００４７】
本発明の好ましい態様は、前記第一の側面の方法に関し、前記ヒアルロン酸又はその塩の平均分子量の値は、１００〜３０００ｋＤａ、好ましくは５００〜２０００ｋＤａ、そして最も好ましくは７００〜１８００ｋＤａである。
【００４８】
ヒアルロン酸又はその塩の最初の濃度は、本発明の方法において、得られる架橋微小ビーズの特性に影響する。従って、本発明の好ましい態様は、前記第一の側面の方法に関し、前記アルカリ溶液に溶解したヒアルロン酸又はその塩の濃度が、０．１％〜４０％（ｗ／ｖ）である。
【００４９】
また、架橋反応中のｐＨ値も結果に影響するため、好ましい態様において、本発明は、前記第一の側面の方法に関し、前記アルカリ溶液に溶解した水酸化ナトリウムの濃度が、０．００１〜２．０Ｍである。
【００５０】
また、架橋剤の濃度も、得られる微小ビーズに重大な影響を与えることも注目に値する。
【００５１】
従って、本発明の好ましい態様は、前記第一の側面の方法に関し、前記架橋剤がジビニルスルホン（ＤＶＳ）であり；好ましくはＤＶＳは、前記工程（ａ）の混合溶液と、ＨＡ／ＤＶＳの重量比が１：１〜１００：１（乾燥重量）となるように、好ましくはＨＡ／ＤＶＳの重量比が２：１〜５０：１となるように含まれる。
【００５２】
ビセポキシド架橋技術に基づく架橋剤：ＧＤＥ＝グリセロールジグリシジルエーテル及びＢＤＥ：１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル等の他の架橋剤も、本発明の方法に適したものとして想定される。
【００５３】
本発明の方法に適した架橋剤は、例えば、多官能性（＞＝２）ＯＨ−反応性化合物である。適切な架橋剤の例は、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）又はビセポキシド架橋技術に基づく架橋剤、例えばＧＤＥ＝グリセロールジグリシジルエーテル及びＢＤＥ：１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルである。前記架橋剤は、好ましくは、ジビニルスルホン、グリセロールジグリシジルエーテル又は１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルから選択される。本発明の最も好ましい架橋剤は、好ましくは上記重量比率で使用されるジビニルスルホンである。
【００５４】
本発明は、架橋剤とＨＡ溶液を含む溶液を混合している間に、及び／又はその直後に、最初の攪拌をすることが、十分なゲル化を達成するのに望ましいことを見出した。
【００５５】
従って、本発明の好ましい態様は、前記第一の側面の方法に関し、前記ヒアルロン酸とジビニルスルホンとの反応が、５℃〜１００℃の温度範囲内で、好ましくは１５℃〜５０℃の範囲内で、より好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内で行われる。
【００５６】
前記第一の側面の方法の他の好ましい態様において、工程（ｃ）の攪拌は、１〜１８０分間継続される。
【００５７】
本発明は、前記溶液を混合した後の加熱工程が有益であることを決定した。
【００５８】
従って、本発明の好ましい態様は、前記第一の側面の方法に関し、前記混合した溶液を、２０℃〜１００℃の温度範囲内で、好ましくは２５℃〜８０℃の範囲内で、より好ましくは３０℃〜６０℃の範囲内で、そして最も好ましくは３５℃〜５５℃の範囲内で加熱し、該温度を、該溶液を混合後少なくとも５分、好ましくは少なくとも１０分、２０分、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、又は最も好ましくは１８０分維持し、このとき好ましくは攪拌しない。
【００５９】
架橋反応後短い時間、前記反応混合物を、攪拌を続けつつ室温に移すのが有利である。
【００６０】
前記第一の側面の方法の好ましい態様において、前記反応混合物は、前記反応が行われた後、少なくとも５分、好ましくは少なくとも１０分、２０分、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、又は最も好ましくは１８０分、０℃〜４０℃の温度範囲内で、好ましくは１０℃〜３０℃の範囲内で維持される。
【００６１】
工程（ｂ）の微小液滴の平均の直径の値は、約１ナノメートル〜１ミリメートルの範囲内であるのが有利である。工程（ｂ）の微小液滴の粒子サイズ分布の最大値は、好ましくは約０．１〜１００μｍの範囲内で、より好ましくは０．５〜１０μｍであり、そして最も好ましくは１〜２μｍである。前記液滴のサイズは、使用される乳化剤及び攪拌の強さの選択により調整され得る。所望のサイズの液滴を取得するのに必要な使用される乳化剤の組み合わせおよび攪拌の強さは、一連の単純な試験により決定され得る。前記液滴又は微小ビーズのサイズは、Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ （Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ ７８０ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒ， ＰＳＳ ＮＩＣＯＭＰ， Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ， ＣＡＬ， ＵＳＡ ｗｉｔｈ Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ ７８０ＡＤ ＣＷ７８８−Ｎｉｃｏｍｐ ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｖ １．６８ （２０００））を用いて決定され得る。
【００６２】
好ましい態様において、本発明は、前記第一の側面の方法に関し、前記工程（ｂ）の微小液滴の直径の平均値が、約１ナノメートル〜１ミリメートルの範囲内である。また、前記第二の側面の架橋微小ビーズの直径の平均値が、約１ナノメートル〜１ミリメートルの範囲内であることも好ましい。
【００６３】
工程（ｃ）における分散物を取得するのに、未反応の架橋剤を殆ど含まないのが有利であり得る。好ましくは、前記分散物、より好ましくは微小ビーズの含有量は、１０重量ｐｐｍ（ｗｐｐｍ）、より好ましくは５ｗｐｐｍである。前記分散物中の遊離架橋剤の濃度は、該分散物が医薬又は生化学の用途／デバイス組成物に直接使用されるとしたら、低くあるべきである。なぜなら、未反応の架橋剤は、毒性を有する恐れがあるからである。従って、分散物に含まれる未反応の架橋剤の濃度が上記の値になるまで、工程（ｃ）の反応を続行するのが好ましい。
【００６４】
以下の：８〜２２個のＣ原子を有する直鎖脂肪アルコール上の、１２〜２２個のＣ原子を有する脂肪酸上の、そしてアルキル基が８〜１５個のＣ原子を有するアルキルフェノール上の２〜１００ｍｏｌのエチレンオキシド及び／又は０〜５ｍｏｌのプロピレンオキシドの付加生成物（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）、６〜２２個の炭素原子を有する飽和及び不飽和脂肪酸の、グリセロール、グリセロールモノ−及びジエステル並びにソルビタンモノ−及びジエステル上の、１〜１００ｍｏｌのエチレンオキシドの付加生成物のＣ１２／１８脂肪酸モノ−及びジエステル、並びにそのエチレンオキシド付加生成物、アルキルラジカル中に８〜２２個の炭素原子を有するアルキルモノ−及びオリゴグリコシド、並びにそのエチレンオキシド付加生成物、ヒマシ油及び／又は水素化ヒマシ油、直鎖、分岐、不飽和又は飽和Ｃ６〜Ｃ２２脂肪酸、レチノレイン酸及び１２−ヒドロキシステアリン酸、並びにグリセロール、ポリグリセロール、ペンタエリスリトール、ジペンタエリスリトール、糖アルコール（例えばソルビトール）、アルキルグルコシド（例えばセルロース）、モノ−、ジ−及びトリアルキルリン酸塩、並びにモノ−、ジ−及びトリ−ＰＥＧ−アルキルリン酸塩、並びにその塩、ポリシロキサン／ポリエーテルコポリマー（ジメチコンコポリオール）、例えばＰＥＧ／ＰＰＧ−２０／６ジメチコン、ＰＥＧ／ＰＰＧ−２０／２０ジメチコン、ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−２０／２０ジメチコン、ＰＥＧ−１２又はＰＥＧ−１４ジメチコン、ＰＥＧ／ＰＰＧ−１４／４又は４／１２又は２０／２０又は１８／１８又は１７／１８又は１５／１５、ポリシロキサン／ポリアルキルポリエーテルコポリマー及び対応する誘導体、例えばラウリル又はセチルジメチコンコポリオール、特にセチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン（ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０（Ｅｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ））、ＤＥ１１ ６５ ５７４に従うペンタエリスリトール、脂肪酸、クエン酸及び脂肪アルコールの混合したエステル及び／又は６〜２２個の炭素原子を有する脂肪酸の混合したエステル、メチルグルコース、並びにポリオール、例えばグリセロール又はポリグリセロール、クエン酸エステル、例えばグリセリルステアレートシトレート、グリセリルオレエートシトレート及びジラウリルシトレートに基づく部分エステル上の２〜２００ｍｏｌの付加生成物の群の少なくとも１つの化合物が、非イオン性乳化剤又は界面活性剤として採用され得る。
【００６５】
本発明において使用される好ましい乳化剤は、ＨＬＢ値が３〜９、好ましくは４〜６、そしてより好ましくは約５であるものから選択される。好ましい乳化剤は、ポリセリル−４−ジイソステアラット／ポリヒドロキシステアラット／セバカット（ＩＳＯＬＡＮ（登録商標）ＧＰＳ）、ＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン（ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０）、ポリグリセリル−４イソステアレート（ＩＳＯＬＡＮ（登録商標）Ｇｌ３４）、ポリグリセリル−３オレエート（ＩＳＯＬＡＮ（登録商標）ＧＯ３３）、メリルグルコースイソステアレート（ＩＳＯＬＡＮ（登録商標）ＩＳ）、ジイソステアロイルポリグリセリル−３ダイマージリノレエート（ＩＳＯＬＡＮ（登録商標）ＰＤＩ）、グリセリルオレエート（ＴＥＧＩＮ（登録商標）ＯＶ）、ソルビタンラウレート（ＴＥＧＯ（登録商標）ＳＭＬ）、ソルビタンオレエート（ＴＥＧＯ（登録商標）ＳＭＯＶ）、及びソルビタンステアレート（ＴＥＧＯ（登録商標）ＳＭＳ）から選択される。
【００６６】
アニオン性乳化剤又は界面活性剤は、水溶性を付与する基を含み得て、例えばカルボキシル基、硫酸基、スルホン酸基又はリン酸基、並びに親油性ラジカルが挙げられる。皮膚が耐えられるアニオン性界面活性剤は、当業者に多く知られており、市販されている。本明細書中で、これらは、アルカリ金属、アンモニウム、又はアルカノルアンモニウム塩の形態の、アルキルスルフェート、又はアルキルリン酸塩、アルカリ金属又はアンモニウム塩の形態のアルキルエーテルスルフェート、アルキルエーテルカルボキシレート、アシルサルコシネート、及びスルホスクシネート、及びアシルグルタメートであってもよい。
【００６７】
カチオン性乳化剤及び界面活性剤も添加される場合がある。第四級アンモニウム化合物、特に８〜２２個の炭素原子を有する少なくとも１つの直鎖及び／又は分岐鎖、飽和又は不飽和アルキル鎖を有するものが、特に、例えばアルキルトリメチルアンモニウムハライド、例えばセチルトリメチルアンモニクムクロライド又はブロマイド又はべヘニルトリメチルアンモニウムクロライドに採用され得て、ジアルキルジメチルアンモニウムハライド、例えばジステアリルジメチルアンモニウムクロライドであってもよい。
【００６８】
モノアルキルアミドカット例えばパルミタミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、又は対応するジアルキルアミドカットは、更に採用され得る。モノ−、ジ−又はトリエタノールアミンに基づく四級化された脂肪酸エステルであり得る容易に生分解する第四級エステル化合物は、更に採用され得る。アルキルグアニジニウム塩は、更にカチオン性乳化剤として混合され得る。
【００６９】
穏和な界面活性剤、即ち皮膚が特に耐えられる界面活性剤の典型的な例として、脂肪アルコールポリグリコールエーテルスルフェート、モノグリセリドスルフェート、モノ−及び／又はジアルキルスルホスクシネート、脂肪酸イセチオネート、脂肪酸サルコシネート、脂肪酸タウリド、脂肪酸グルタメート、エーテル−カルボン酸、アルキルオリゴグルコシド、シボウサングルカミド、アルキルアミドベタイン及び／又はタンパク質−脂肪酸濃縮物、後者は例えば小麦タンパク質に基づくものが挙げられる。
【００７０】
更に、両性海面活性剤、例えばベタイン、アンフォアセテート又はアンフォフォプロピオネート、故に例えばＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムグリシネート、例えばココ−アルキルジメチルアンモニウムグリシネート、Ｎ−アシルアミノプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムグリシネート、例えばココ−アシルアミノプロピルジメチルアンモニウムグリシネート、及び２−アルキル−３−カルボキシメチル−３−ヒドロキシエチルイミダゾリンであり、それぞれのケースにおいて、アルキル又はアシル基中に８〜１８個のＣ原子を有し、並びにココ−アシルアミノエチルヒドロキシエチルカルボキシメチルグリシネートを採用し得る。
【００７１】
前記両性界面活性剤において、Ｃ８／１８−アルキル又はアシル基から離れて、少なくとも１個の遊離アミノ基及び少なくとも１個の−ＣＯＯＨ、又はＳＯ３Ｈ基を分子中に含み、内塩（ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ）の形成が可能な表面活性化合物が採用され得る。適切な両性界面活性剤の例として、Ｎ−アルキルグリシネート、Ｎ−アルキルプロピオン酸、Ｎ−アルキルアミノ酪酸、Ｎ−アルキルイミノジブロピオン酸、Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−アルキルアミドプロピルグリシン、Ｎ−アルキルタウリン、Ｎ−アルキルサルコシン、２−アルキルアミノプロピオン酸、ヲヨ帯アルキルアミノ酢酸であり、各ケースにおいて、アルキル基中に約８〜１８個のＣ原子を有するものが挙げられる。更に、両性界面活性剤の例として、Ｎ−ココ−アルキルアミノプロピオネート、ココ−アシルアミノエチルアミノプロピオネート、及びＣ１２／１８−アクリルサルコシンが挙げられる。
【００７２】
前記組成物を製剤化するのに使用される好ましい乳化剤又は界面活性剤は、前記微小ビーズの生産において使用されるものと同一である。
【００７３】
当業者に周知なように、多くの種類の緩衝剤が、本発明の微小ビーズの膨潤及び中和に適したものとして想定されている。好ましい態様において、前記緩衝剤のｐＨ値は２．０〜８．０の範囲内であり、好ましくは５．０〜７．５の範囲内である。
【００７４】
最適な場合、適切な緩衝剤は、ｐＨ値を考慮して選択され、その結果、架橋微小ビーズのｐＨは、可能な限り中性に近い値となる。好ましい態様において、前記緩衝剤は、前記架橋微小ビーズのｐＨの値を５．０〜７．５にするｐＨの値を示す緩衝剤を含む。
【００７５】
前記第一の側面の方法における緩衝剤は、リン酸緩衝剤及び／又は生理食塩水緩衝剤を含むのが好ましい。
【００７６】
また、前記架橋微小ビーズは、ｐＨ値が２．０〜８．０の範囲内、好ましくは５．０〜７．５の範囲内である、水、水及び酸、水及びリン酸緩衝剤、水及び生理食塩水緩衝剤、又は水及びリン酸緩衝剤及び生理食塩水緩衝剤で、少なくとも１回洗浄されるのも好ましい。
【００７７】
前記精製工程は、例えば濾過、デキャンテーション、遠心分離等の、当業者に知られる任意の分離技術を含み得る。１つ以上の精製工程と１つ以上の中和工程を組み合わせるのが有利であり得る。
【００７８】
前記第一の側面の好ましい態様は、前記方法に関し、前記精製工程は、１３，０００ダルトン未満のサイズの分子が自由に拡散する透析膜を使用して、脱イオン水に対して前記架橋微小ビーズを透析することを含む。
【００７９】
油相として、美容用又は個人治療用製剤において使用される、標準的な皮膚軟化剤を使用するのが好ましい。そのような標準的な皮膚軟化剤は、炭化水素又は芳香族炭化水素ではなく、特にトルエン、ｏ−キシレン、ドデカン、ヘプタン、イソオクタン又はセチルエチルヘキサノエートではない。本発明において使用される好ましい皮膚柔軟化剤は、１〜２２個のＣ原子を有する直鎖及び／又は分岐飽和又は不飽和アルコールのモノ−又はジエステル、１〜２２個のＣ原子を有する単官能性脂肪族カルボン酸と２〜３６個のＣ原子を有する脂肪属二官能性アルコールのエステル化生産物、長鎖アリール酸エステル、例えば直鎖及び／又は分岐鎖Ｃ６〜Ｃ２２アルコールとベンズ酸、あるいはベンズ酸イソステアリルエステル、ベンズ酸ブチルオクチルエステル、又はベンズ酸オクチルドデシルエステル、カルボネート、好ましくは直鎖Ｃ６〜Ｃ２２脂肪族アルコールカルボネート、ゲルベカルボネート（Ｇｕｅｒｂｅｔ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、例えばジカプリリルカルボネート、ジエチルヘキシルカルボネート、長鎖トリグリセリド、即ち３個の酸分子を有し、それらの少なくとも１つが脂肪族アルコールであるグリセロールの三重エステル、Ｃ６〜Ｃ１０脂肪酸に基づくトリグリセリド、直鎖又は分岐鎖脂肪族アルコール、例えばオレイルアルコール又はオクチルドデカノール、及び脂肪族アルコールエステル、例えばジアルキルエーテル、例えばジカプリリルエーテル、シリコーンオイル及び蝋、例えばポリジメチルシロキサン、シクロメチルシロキサン、及びアリール−又はアルキル−又はアルコキシ−置換されたポリメチルシロキサン又はシクロメチルシロキサン、６〜１８個、好ましくは８〜１０個の炭素原子を有する脂肪族アルコールに基づくゲルベアルコール、直鎖Ｃ６〜Ｃ２２脂肪族アルコールと直鎖Ｃ６〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、直鎖Ｃ６〜Ｃ２２脂肪族アルコール、特に２−エチルへキサノール又はイソノナノールと分岐Ｃ６〜Ｃ１３カルボン酸のエステル、Ｃ８〜Ｃ１８と直鎖Ｃ６〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、分岐アルコール、特に２−エチルへキサノール又はイソノナノールと分岐鎖Ｃ６〜Ｃ１３カルボン酸のエステル、多価アルコール（例えばプロピレングリコール、ダイマージオール又はトリマートリオール）及び／又はゲルベアルコールと直鎖及び／又は分岐鎖脂肪酸のエステル、Ｃ６〜Ｃ１８脂肪酸に基づく液体モノ−／ジ−／トリグリセリド混合物、芳香族カルボン酸とＣ６〜Ｃ２２脂肪族アルコール及び／又はゲルベアルコールのエステル、植物油、分岐第一級アルコール、置換シクロヘキサン、ポリオール及び／又はシリコーンオイルとエポキシ化脂肪酸エステルの開環生産物、あるいは２つ以上のこれらの化合物の混合物から選択される。使用される皮膚軟化剤は、相分離無くして水に混ざらないのが好ましい。
【００８０】
皮膚軟化剤及び油性成分に適したものエステルは、例えば１２〜２２個のＣ原子を有する脂肪酸のメチルエステル及びイソプロピルエステル、例えばメチルラウレート、メチルステアレート、メチルオレエート、メチルエルケート、イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、イソプロピルステアレート、イソプロピルオレエート等である。他の適切なモノエステルは、例えば、ｎ−ブチルステアレート、ｎ−ヘキシルラウレート、ｎ−デシルオレエート、イソオクチルステアレート、イソノニルパルミテート、イソノニルイソノナノエート、２−エチルヘキシルラウレート、２−エチルヘキシルパルミテート、２−エチルヘキシルステアレート、２−ヘキシルデシルステアレート、２−オクチルドデシルパルミテート、オレイルオレエート、オレイルエルケート、エルシルオレエート、及びテクニカルグレート脂肪族アルコールカット及びテクニカルグレート脂肪族カルボン酸混合物から取得できるエステル、例えば１２〜２２個のＣ原子を有する不飽和脂肪族アルコールと１２〜２２個のＣ原子を有する飽和及び不飽和脂肪酸のエステル、例えば動物及び植物脂肪から採取できるものである。しかしながら、天然に存在するモノエステル及び蝋エステル混合物、例えばホホバ油又はマッコウクジラ油中に存在するものも適切である。適切なジカルボン酸エステルは、例えば、ジ−ｎ−ブチルアジペート、ジ−ｎ−ブチルセバケート、ジ−（２−エチルヘキシル）アジペート、ジ−（２−ヘキシルデシル）スクシネート、ジ−イソトリデシルアゼレートである。適切なジオールエステルは、例えば、エチレングリコールジオレエート、エチレングリコールジ−イソトリデカノエート、プロピレングリコールジ−（２−エチルヘキサノエート）、ブタンジオールジ−イソステアレート、ブタンジオールジ−カプリレート／カプレート及びネオペニルグリコールジ−カプリレエートである。
【００８１】
本明細書中で、脂肪酸トリグリセリドの例として；例えば天然植物油、例えばオリーブ油、ヒマワリ油、ダイズ油、ラッカセイ油、ナタネ油、アーモンド油、ゴマ油、アボカド油、ヒマシ油、カカオバター、パーム油、並びにココナッツ油又はパーム核油等の液体成分、並びに動物油、例えばサメ肝臓油、タラ肝臓油、クジラ油、牛肉獣脂、バター脂肪分、蝋、例えば蜜蝋、カルナバヤシ蝋、羊毛及び牛脚油、牛肉の液体成分、あるいはカプリル酸／カプリン酸混合物の合成トリグリセリド、テクニカルグレードのオレイン酸由来のトリグリセリド、イソステアリン酸との、あるいはパルミチン酸／オレイン酸混合物由来のトリグリセリド、が、皮膚軟化剤（油相）として採用され得る。
【００８２】
前記第一の側面の他の好ましい態様において、有機又は油相は、ミネラルオイル又はＴＥＧＯＳＯＦＴ（登録商標）Ｍを含む。
【００８３】
好ましくは、前記皮膚柔軟化剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、レシチン、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、トコフェロール、トコフェリルポリエチレングリコールスクシネート、トコフェロールパルミテート及びトコフェロールアセテート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、又はそれらの混合物から選択される。
【００８４】
本発明の微小ビーズは、これらの微小ビーズを含む本発明の組成物へのアクセスを可能とする。本発明の組成物は、皮膚軟化剤、乳化剤及び界面活性剤／粘度調整剤／安定化剤、ＵＶ光保護フィルター、抗酸化剤、水刺激剤（ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔ）（又はポリオール）、固体及び充填剤、フィルム形成剤、防虫剤、保存料、品質調整剤、香料、染料、生物活性物質、保湿剤及び溶媒の群から選択される少なくとも１つの追加的な成分を含む。好ましくは、前記追加的な成分は、本発明の組成物中で、微小ビーズの外側又は内側に存在する。
【００８５】
好ましい態様において、本発明の組成物は、乳濁物、懸濁物、溶液、クリーム、軟膏、ペースト、ゲル、油、粉末、エアロゾル、棒又はスプレーであってもよい。
【００８６】
本発明の微小ビーズ又は組成物は、経皮薬物送達系／ビヒクルとして使用され得る。局所的に適用されると、該微小ビーズは、皮膚のしわ（ｗｒｉｎｋｌｅ）及びたるみ（ｆｏｌｄ）に集合する（データ未公開）。
【実施例】
【００８７】
実施例１．乳濁物中のＤＶＳ架橋微小顆粒の調製
この実施例は、ＤＶＳ架橋微小顆粒の調製を例証するものである。
【００８８】
室温で３時間、激しく攪拌して、ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、５８０ｋＤａ、１．９０ｇ）をＮａＯＨ水溶液（０．２Ｍ、３７．５ｍｌ）中に溶解して、均一な溶液を得た。塩化ナトリウム（０．２９ｇ）を添加して、短時間混合した。
【００８９】
ミネラルオイル（１０．０ｇ）及びＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０界面活性剤（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ ジメチコン、１．０ｇ）を、攪拌により混合した。
【００９０】
前記アルカリＨＡ水溶液にジビニルスルホン（ＤＶＳ、３２０マイクロリットル）を添加して、水相中に均一に分布するように１分間混合した。該水相を２分間以内に前記油相に添加して、低速のメカニカルスターラーで攪拌した。即座に乳濁物が形成され、室温で３０分間攪拌が続行された。該乳濁物を、室温で一晩放置した。
【００９１】
ＨＣｌ水溶液（４Ｍ、約２．０ｍｌ）を添加することにより前記乳濁物を中和し、約４０分間攪拌した。
【００９２】
実施例２．ｐＨ表示薬を使用して中和した乳濁物中のＤＶＳ架橋微小粒子の調製
この実施例は、ｐＨ表示薬を使用して中和したＤＶＳ架橋微小粒子の調製を例証する。
【００９３】
室温で２時間、激しく攪拌して、ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、５８０ｋＤａ、１．８８ｇ）をＮａＯＨ水溶液（０．２Ｍ、３７．５ｍｌ）中に溶解して、均一な溶液を得た。プロモチモールブルーｐＨ表示薬（等価範囲ｐＨ６．６〜６．８）を添加した（１５滴、溶液中の青色）。塩化ナトリウム（０．２５ｇ）を添加して、短時間混合した。
【００９４】
ミネラルオイル（１０．０ｇ）及びＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０界面活性剤（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ ジメチコン、１．０ｇ）を、攪拌により混合した。
【００９５】
前記アルカリＨＡ水溶液にジビニルスルホン（ＤＶＳ、３２０マイクロリットル）を添加して、水相中に均一に分布するように３０〜６０秒間激しく混合した。該水相を３０秒以内に前記油相に添加して、４００ＲＰＭのメカニカルスターラーで攪拌した。即座に乳濁物が形成され、室温で３０分間攪拌が続行された。該乳濁物を、ＨＣｌ水溶液（４Ｍ、約１．６ｍｌ）を添加することにより中和し、マグネチックスターラーで攪拌しながら室温で４時間放置した。ゲル粒子中に存在するｐＨ表示薬は、緑色に変色した。ｐＨスティックによる測定では、該乳濁物のｐＨは３〜４であった。該乳濁物を、冷蔵庫中に一晩放置した。ゲル粒子中に存在するｐＨ表示薬は、黄色に変色した。
【００９６】
実施例３．乳濁物の文離、微小粒子の膨潤及び単離
この実施例は、Ｗ／Ｏ乳濁物の破壊、そしてその後の相分離及び透析を例証する。有機溶媒抽出により、架橋ＨＡ微小粒子をＷ／Ｏ乳濁物から分離した。
【００９７】
前記Ｗ／Ｏ乳濁物（５ｇ）とｎ−ブタノール／クロロホルム混合物（１／１ｖ％、４．５ｍｌ）とを混合して、室温で、試験管中で、回転混合により激しく攪拌した。過剰のｍＱ−水（２０ｍｌ）を添加して、相分離を生じさせた。該試験管を遠心分離し、有機相の下相、ゲル粒子の中相、及び透明な水溶液の上相の３つの相を生じさせた。上相及び下相を捨て、ゲル粒子の中相を透析チューブ（ＭＷＣＯ １２−１４，０００、直径２９ｍｍ、容積／長さ ６．４ｍｌ／ｃｍ）に移した。
【００９８】
前記試料を、室温で一晩、ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水中で透析した。更に２回透析液を交換して、一晩放置した。得られたゲルは、厚く、粘性が高く、体積が約５０ｍｌに膨潤しており、これが０．００４ｇＨＡ／ｃｍ３に相当する。
【００９９】
実施例４．乳濁物中のＤＶＳ架橋微小粒子の調製及び微小粒子の分離
この実施例は、ＤＶＳ架橋ＨＡ微小粒子の調製を例示する。
【０１００】
ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、５８０ｋＤａ、１．８９ｇ）をＮａＯＨ水溶液（０．２Ｍ、３７．５ｍｌ）中に溶解した。塩化ナトリウム（０．２５ｇ）を添加して、均一な溶液が得られるように、これを室温で１時間、マグネチックスターラーで攪拌した。
【０１０１】
ＴＥＧＯＳＯＦＴ（登録商標）Ｍ（１０．０ｇ）油及びＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０界面活性剤（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン、１．０ｇ）を、攪拌により混合した。
【０１０２】
前記アルカリＨＡ水溶液にジビニルスルホン（ＤＶＳ、３２０マイクロリットル）を添加して、１分間混合した。該水相を２分以内に前記油相に添加して、メカニカルスターラーで攪拌した（３００ＲＰＭ）。即座に乳濁物が形成され、室温で３０分間攪拌が続行された。
【０１０３】
化学量論的量のＨＣｌ（４Ｍ、１．８ｍｌ）を添加することにより前記乳濁物を中和し、約４０分間攪拌した。該乳濁物を、ｎ−ブタノール／クロロホルム混合物（１：１ｖ％、９０ｍｌ）及び過剰のＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水（１００ｍｌ）を添加することにより破壊し、そしてマグネチックスターラーにより攪拌した。約１７５ｍｌの体積の上相が分離された。最後の洗浄において、有機相を３０ｍｌのｍＱ水で洗浄した。前記組み合わせられた水／ゲル相（２０５ｍｌ）を透析チューブ（ＭＷＣＯ １２−１４，０００、直径２９ｍｍ、容積／長さ ６．４ｍｌ／ｃｍ）に移し、室温で一晩、ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水に対して透析した。水を交換（３回）し、透析（二晩）した後の時点で、伝導性は０．６７マイクロシーベルト／ｃｍにまで低下した。得られた微小粒子を、顕微鏡（ＤＩＣ ２００ｘ）により評価した。図１を参照されたい。１つの微小粒子の断面が示され、「２１，５７８．９２ｎｍ」と標識されている。
【０１０４】
実施例５．乳濁物の相分離及び微小粒子の単離
この実施例は、Ｗ／Ｏ乳濁物の破壊及びゲル微小粒子の単離を例証する。
【０１０５】
有機抽出により、ゲル微小粒子をＷ／Ｏ乳濁物から分離した。抽出に使用される有機溶媒は、例えばブタノール／クロロホルムの７５：２０〜２０：８０の比率（ｖ％）の混合物であった。Ｗ／Ｏ乳濁物と有機溶媒の重量比（ｗ％）は、約１：１であった。
【０１０６】
小スケールの分離：Ｗ／Ｏ乳濁物（５ｇ）を遠心チューブ（５０ｍｌ）中に量り取った。ブタノール／クロロホルムの混合物を調製（１：１ｖ％）して、この混合物を前記試験管に４．５ｍｌ添加した。全ての乳濁物が溶解するように、試験管を慎重に混合した。該試験管を回転混合により混合し、室温で放置して相分離させた。相分離において、通常、上方の水相と下方の有機相との間に、白色の乳濁物の相が観察される。更に水および有機相を加えることにより、分離が促進した。デカンテーションにより水相を捨て、更に精製及び特定を行った。
【０１０７】
実施例６．油中水乳濁物の調製
この実施例は、ＨＡ微小粒子が形成される組成物を例証する。
【０１０８】
製造時間を短縮するために、温めた油相に冷やした水相を加える手順を使用する場合がある。以下に、非限定的な製剤の一例を示す。
【０１０９】
相Ａ：
・２．０％ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン）
・２０．０％ミネラルオイル（又はＴＥＧＥＳＯＦＴ（登録商標）Ｍ）
【０１１０】
相Ｂ：
・０．５％塩化ナトリウム
・３．８％ヒアルロン酸
・０．２ＭＮａＯＨ（ａｑ） １００％迄
【０１１１】
相Ｃ：
・約０．６％ジビニルスルホン
【０１１２】
調製
１．室温で相Ａを混合する。
２．ＮａＯＨ水溶液中にヒアルロン酸（Ｈｙａｃａｒｅ（登録商標））を攪拌して溶解し、そしてＮａＣｌを添加して攪拌して、これを相Ｂとする。
３．相ＢにＤＶＳを添加して、１分間攪拌する。
４．攪拌しながら相Ａに相Ｂを添加する。
５．短時間ホモジナイズ又は攪拌して、反応をとめる。
６．攪拌及び膨潤させる。
７．３０℃未満で攪拌を続行する。
８．中和する。
【０１１３】
実施例７．ＤＶＳ架橋微小粒子の調製及び分離
ＮａＯＨ（０．２Ｍ、３７．５ｍｌ）中に、ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ、５８０ｋＤａ、１．８８ｇ）を溶解した。塩化ナトリウム（０．２５ｇ）を添加して、均一な溶液を得るために、該溶液を、室温で１時間、マグネチックスターラーにより攪拌した。
【０１１４】
油：ＴＥＧＯＳＯＦＴ（登録商標）Ｍ（１０．０ｇ）、及び界面活性剤ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０（セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン、１．０ｇ）を、攪拌により混合した。前記アルカリＨＡ水溶液にジビニルスルホン（ＤＶＳ、３２０マイクロリットル）を添加し、水相中に均一に分布するように、１時間混合した。そして水相を２分以内に前記油相に添加して、メカニカルスターラー（３００ＲＰＭ）により攪拌した。直ちに乳濁物が形成され、攪拌は、室温で３０分間続行された。
【０１１５】
化学量論的量のＨＣｌ（４Ｍ、１．８ｍｌ）を添加することにより前記乳濁物を中和し、約４０分間攪拌した。該乳濁物を分離じょうご（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｕｎｎｅｌ）に移し、ｎ−ブタノール／クロロホルム混合物（１：１ｖ％、９０ｍｌ）及び過剰のＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水（１００ｍｌ）を添加することにより破壊し、そして激しく攪拌した。約１７５ｍｌの体積の上相が分離された。最後の洗浄において、有機相を１００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水で洗浄した。前記組み合わせられた水／ゲル相（２０５ｍｌ）を透析チューブ（ＭＷＣＯ １２−１４，０００、直径２９ｍｍ、容積／長さ ６．４ｍｌ／ｃｍ）に移し、室温で一晩、ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水に対して透析した。水を交換（３回）し、透析（二晩）した後の時点で、伝導性は１０マイクロシーベルト／ｃｍにまで低下した。得られた微小粒子を、顕微鏡により評価した（図４）。
【０１１６】
実施例８．微小粒子を精製する洗浄手順
この実施例は、微小粒子の最終的な単離及び精製を例示する。
【０１１７】
予め単離した粒子１００ｍｌを、Ｎａ２ＨＰＯ４／ ＮａＨ２ＰＯ４緩衝剤（０．１５Ｍ、４００ｍｌ）で再懸濁し、１／２時間穏やかに攪拌した。該懸濁物を５℃で２時間立てて置き、固形化した油滴を抜き取った。そして溶液をメッシュでろ過し、更に５０ｍｌの緩衝剤で２回洗浄した。ドリップ乾燥の後、粒子を特定した（図５）。
【０１１８】
実施例９．微小粒子の流動学的特性の調査
この実施例は、粒子の流動学的研究の実行を例示する。粒子試料を、５０ｍｍ２°コーン／プレートジオメトリーの使用により、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ （Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＧｍｂＨ， Ｇｒａｚ， Ａｕｓｔｒｉａ， Ｐｈｙｓｉｃａ ＭＣＲ ３０１ ， Ｓｏｆｔｗａｒｅ： Ｒｈｅｏｐｌｕｓ）上で解析した。第一に、材料の粘弾特性Ｇ’（貯蔵モジュール）及びＧ’’（損失モジュール）の線形範囲を、可変ひずみ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｔｒａｉｎ）γを用いた振幅掃引により決定される。第二に、周波数掃引が作成され、前記粘弾性値、Ｇ’及びＧ’’の値に基づいて、ｔａｎδが、弱／強ゲル挙動における値として計算され得る。
【０１１９】
実施例１０．Ｔｅｘｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｚｅｒによる注射針通過可能性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）実験の調査
この実施例は、所定の速度で注入するのに掛かる力の、前記試料の均一性の関数としての調査の実行を例証する。粒子試料を、２７Ｇｘ１／２、３０Ｇｘ１／２のいずれかの針を取り付けたシリンジに移し、これをテクスチャーアナライザー（Ｓｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓｕｒｒｅｙ， ＵＫ， ＴＡ．ＸＴ Ｐｌｕｓ， Ｓｏｆｔｗａｒｅ： Ｔｅｘｔｕｒｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ３２）の試料リグにセットする。該試験は、１２．５ｍｍ／ｍｉｎの速度で所定の距離を通して実行される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋ヒアルロン酸微小ビーズを生産する方法であり、以下の；
（ａ）ヒアルロン酸又はその塩を含むアルカリ水溶液を、架橋剤を含む溶液と混合し、
（ｂ）有機相又は油相中で前記工程（ａ）の混合した溶液から所望のサイズを有する微小液滴を形成して、有機中水又は油中水（Ｗ／Ｏ）乳濁物を形成し、
（ｃ）該Ｗ／Ｏ乳濁物を継続的に攪拌することにより、ヒアルロン酸とジビニルスルホンとの反応を引き起こし、架橋ヒアルロン酸微小ビーズを生じさせ、そして
（ｄ）該架橋ヒアルロン酸微小ビーズを精製する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸又はその塩が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中で組換え的に生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸又はその塩の平均分子量の値が１００〜３０００ｋＤａであり、好ましくは５００〜２０００ｋＤａであり、そして最も好ましくは７００〜１８００ｋＤａである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記アルカリ溶液が、溶解したヒアルロン酸又はその塩を、０．１％〜４０％（ｗ／ｖ）の濃度で含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記アルカリ溶液が、溶解した水酸化ナトリウムを、０．００１〜２．０Ｍの濃度で含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記架橋剤がジビニルスルホン（ＤＶＳ）である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＤＶＳが、工程（ａ）の混合溶液中に、ＨＡ／ＤＶＳ（乾燥重量）の重量比が１：１〜１００：１の比率となるように、好ましくはＨＡ／ＤＶＳ（乾燥重量）が２：１〜５０：１となるように含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒアルロン酸及びジビニルスルホンの反応が、５℃〜１００℃の温度範囲内で、好ましくは１５℃〜５０℃の範囲内で、より好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内で行われる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｃ）における攪拌が、１〜１８０分間継続される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｂ）の微小液滴の平均直径が、約１ナノメートル〜１ミリメートルの範囲内である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記精製工程が、１３，０００ダルトン未満のサイズの分子が自由に拡散する透析膜を使用して、脱イオン水に対して前記架橋微小ビーズを透析することを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記精製工程が、前記架橋ビーズのｐＨを、緩衝剤又は酸を用いて中和することを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝剤のｐＨの値が２．０〜８．０の範囲内、好ましくは５．０〜７．５の範囲内である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記緩衝剤が、精製工程の後に、前記架橋微小ビーズのｐＨの値を５．０〜７．５にするｐＨの値を示す緩衝剤を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記緩衝剤が、リン酸緩衝剤及び／又は生理食塩水緩衝剤を含む、請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記架橋微小ビーズが、水、並びに／又は、ｐＨの値が２．０〜８．０の範囲内、好ましくは５．０〜７．５の範囲内であるリン酸及び／若しくは食塩水緩衝剤で少なくとも１回洗浄される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記架橋反応の前又は後のいずれかに、前記架橋微小ビーズに、１つの成分として、保存料が添加される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ジビニルスルホンにより架橋された、ヒアルロン酸、又はその塩を含む微小ビーズ。
【請求項１９】
平均の直径の値が１ナノメートル〜１ミリメートルの範囲内である、前記微小ビーズ。
【請求項２０】
前記ヒアルロン酸又はその塩が、
３００，０００〜３，０００，０００の範囲内；好ましくは４００，０００〜２，５００，０００の範囲内；より好ましくは５００，０００〜２，０００，０００の範囲内；そして最も好ましくは６００，０００〜１，８００，０００の範囲内の分子量である、請求項１８又は１９に記載の微小ビーズ。
【請求項２１】
前記ヒアルロン酸又はその塩が、平均分子量が小さいもので、１０，０００〜８００，０００Ｄａの範囲内；好ましくは２０，０００〜６００，０００Ｄａの範囲内；より好ましくは３０，０００〜５００，０００Ｄａの範囲内；なおもより好ましくは４０，０００〜４００，０００Ｄａの範囲内；そして最も好ましくは５０，０００〜３００，０００Ｄａの範囲内である、請求項１８又は１９に記載の微小ビーズ。
【請求項２２】
ヒアルロン酸の無機塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、又はヒアルロン酸コバルトである、請求項１８〜２１のいずれかに記載の微小ビーズ。
【請求項２３】
有効成分も含む、請求項１８〜２２のいずれかに記載の微小ビーズ。
【請求項２４】
前記有効成分が、薬理的活性物質である、請求項２３に記載の微小ビーズ。
【請求項２５】
水溶性賦形剤、好ましくはラクトースも含む、請求項１８〜２４のいずれかに記載の微小ビーズ。
【請求項２６】
保存料も含む、請求項１８〜２５のいずれかに記載の微小ビーズ。
【請求項２７】
請求項１８〜２６のいずれかにおいて定義される微小ビーズ、及び好ましくは薬理的活性物質である有効成分を含む組成物。
【請求項２８】
水溶性賦形剤、好ましくはラクトースも含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
医薬として許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に、有効な量の請求項１８〜２６のいずれかにおいて定義される微小ビーズを含む医薬組成物。
【請求項３０】
薬理的有効成分と共に、有効な量の請求項１８〜２６のいずれかにおいて定義される微小ビーズを含む医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１８〜２６のいずれかにおいて定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかにおいて定義される組成物を含む、衛生、医療、又は手術用品であり；好ましくはおむつ、生理用ナプキン、手術用スポンジ、創傷治癒用スポンジ、若しくは絆創膏の一部、又は他の創傷包帯材料である、前記用品。
【請求項３２】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物を含む、薬剤カプセル又は微小カプセル。
【請求項３３】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、変形性関節症治療用の薬剤を生産するための使用。
【請求項３４】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、眼科的処置用の薬剤を生産するための使用。
【請求項３５】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、癌の治療用の薬剤を生産するための使用。
【請求項３６】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、創傷治療用の薬剤を生産するための使用。
【請求項３７】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、血管新生用の薬剤を生産するための使用。
【請求項３８】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、保湿剤を生産するための使用。
【請求項３９】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、脱毛又は禿治療用の薬剤を生産するための使用。
【請求項４０】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、皮膚充填剤（ｄｅｒｍａｌ ｆｉｌｌｅｒ）を生産するための使用。
【請求項４１】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、組織増加（ｔｉｓｓｕｅ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）用の薬剤を生産するための使用。
【請求項４２】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、薬物送達ビヒクルを生産するための使用。
【請求項１】
架橋ヒアルロン酸微小ビーズを生産する方法であり、以下の；
（ａ）ヒアルロン酸又はその塩を含むアルカリ水溶液を、架橋剤を含む溶液と混合し、
（ｂ）有機相又は油相中で前記工程（ａ）の混合した溶液から所望のサイズを有する微小液滴を形成して、有機中水又は油中水（Ｗ／Ｏ）乳濁物を形成し、
（ｃ）該Ｗ／Ｏ乳濁物を継続的に攪拌することにより、ヒアルロン酸とジビニルスルホンとの反応を引き起こし、架橋ヒアルロン酸微小ビーズを生じさせ、そして
（ｄ）該架橋ヒアルロン酸微小ビーズを精製する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸又はその塩が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中で組換え的に生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸又はその塩の平均分子量の値が１００〜３０００ｋＤａであり、好ましくは５００〜２０００ｋＤａであり、そして最も好ましくは７００〜１８００ｋＤａである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記アルカリ溶液が、溶解したヒアルロン酸又はその塩を、０．１％〜４０％（ｗ／ｖ）の濃度で含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記アルカリ溶液が、溶解した水酸化ナトリウムを、０．００１〜２．０Ｍの濃度で含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記架橋剤がジビニルスルホン（ＤＶＳ）である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＤＶＳが、工程（ａ）の混合溶液中に、ＨＡ／ＤＶＳ（乾燥重量）の重量比が１：１〜１００：１の比率となるように、好ましくはＨＡ／ＤＶＳ（乾燥重量）が２：１〜５０：１となるように含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒアルロン酸及びジビニルスルホンの反応が、５℃〜１００℃の温度範囲内で、好ましくは１５℃〜５０℃の範囲内で、より好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内で行われる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｃ）における攪拌が、１〜１８０分間継続される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｂ）の微小液滴の平均直径が、約１ナノメートル〜１ミリメートルの範囲内である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記精製工程が、１３，０００ダルトン未満のサイズの分子が自由に拡散する透析膜を使用して、脱イオン水に対して前記架橋微小ビーズを透析することを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記精製工程が、前記架橋ビーズのｐＨを、緩衝剤又は酸を用いて中和することを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝剤のｐＨの値が２．０〜８．０の範囲内、好ましくは５．０〜７．５の範囲内である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記緩衝剤が、精製工程の後に、前記架橋微小ビーズのｐＨの値を５．０〜７．５にするｐＨの値を示す緩衝剤を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記緩衝剤が、リン酸緩衝剤及び／又は生理食塩水緩衝剤を含む、請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記架橋微小ビーズが、水、並びに／又は、ｐＨの値が２．０〜８．０の範囲内、好ましくは５．０〜７．５の範囲内であるリン酸及び／若しくは食塩水緩衝剤で少なくとも１回洗浄される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記架橋反応の前又は後のいずれかに、前記架橋微小ビーズに、１つの成分として、保存料が添加される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ジビニルスルホンにより架橋された、ヒアルロン酸、又はその塩を含む微小ビーズ。
【請求項１９】
平均の直径の値が１ナノメートル〜１ミリメートルの範囲内である、前記微小ビーズ。
【請求項２０】
前記ヒアルロン酸又はその塩が、
３００，０００〜３，０００，０００の範囲内；好ましくは４００，０００〜２，５００，０００の範囲内；より好ましくは５００，０００〜２，０００，０００の範囲内；そして最も好ましくは６００，０００〜１，８００，０００の範囲内の分子量である、請求項１８又は１９に記載の微小ビーズ。
【請求項２１】
前記ヒアルロン酸又はその塩が、平均分子量が小さいもので、１０，０００〜８００，０００Ｄａの範囲内；好ましくは２０，０００〜６００，０００Ｄａの範囲内；より好ましくは３０，０００〜５００，０００Ｄａの範囲内；なおもより好ましくは４０，０００〜４００，０００Ｄａの範囲内；そして最も好ましくは５０，０００〜３００，０００Ｄａの範囲内である、請求項１８又は１９に記載の微小ビーズ。
【請求項２２】
ヒアルロン酸の無機塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、又はヒアルロン酸コバルトである、請求項１８〜２１のいずれかに記載の微小ビーズ。
【請求項２３】
有効成分も含む、請求項１８〜２２のいずれかに記載の微小ビーズ。
【請求項２４】
前記有効成分が、薬理的活性物質である、請求項２３に記載の微小ビーズ。
【請求項２５】
水溶性賦形剤、好ましくはラクトースも含む、請求項１８〜２４のいずれかに記載の微小ビーズ。
【請求項２６】
保存料も含む、請求項１８〜２５のいずれかに記載の微小ビーズ。
【請求項２７】
請求項１８〜２６のいずれかにおいて定義される微小ビーズ、及び好ましくは薬理的活性物質である有効成分を含む組成物。
【請求項２８】
水溶性賦形剤、好ましくはラクトースも含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
医薬として許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に、有効な量の請求項１８〜２６のいずれかにおいて定義される微小ビーズを含む医薬組成物。
【請求項３０】
薬理的有効成分と共に、有効な量の請求項１８〜２６のいずれかにおいて定義される微小ビーズを含む医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１８〜２６のいずれかにおいて定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかにおいて定義される組成物を含む、衛生、医療、又は手術用品であり；好ましくはおむつ、生理用ナプキン、手術用スポンジ、創傷治癒用スポンジ、若しくは絆創膏の一部、又は他の創傷包帯材料である、前記用品。
【請求項３２】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物を含む、薬剤カプセル又は微小カプセル。
【請求項３３】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、変形性関節症治療用の薬剤を生産するための使用。
【請求項３４】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、眼科的処置用の薬剤を生産するための使用。
【請求項３５】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、癌の治療用の薬剤を生産するための使用。
【請求項３６】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、創傷治療用の薬剤を生産するための使用。
【請求項３７】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、血管新生用の薬剤を生産するための使用。
【請求項３８】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、保湿剤を生産するための使用。
【請求項３９】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、脱毛又は禿治療用の薬剤を生産するための使用。
【請求項４０】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、皮膚充填剤（ｄｅｒｍａｌ ｆｉｌｌｅｒ）を生産するための使用。
【請求項４１】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、組織増加（ｔｉｓｓｕｅ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）用の薬剤を生産するための使用。
【請求項４２】
請求項１８〜２６のいずれかに定義される微小ビーズ、又は請求項２７〜３０のいずれかに定義される組成物の、薬物送達ビヒクルを生産するための使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１１−５０６７３４（Ｐ２０１１−５０６７３４Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８７６６（Ｐ２０１０−５３８７６６）
【出願日】平成２０年１２月１９日（２００８．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８０５０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７７６２０
【国際公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【出願人】（５０９１９８３４３）ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１９日（２００８．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８０５０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７７６２０
【国際公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【出願人】（５０９１９８３４３）ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ (11)
【Ｆターム（参考）】
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