乳癌を検出するためのバイオマーカーの使用
本発明は、高い特異性及び高い感度を有する乳癌のための腫瘍バイオマーカーを同定する方法に関する。本発明の好ましい方法は、（ａ）被験動物からのサンプルについて、少なくとも１種の開示されたバイオマーカーを測定すること、及び（ｂ）その測定値と乳癌の状態とを相関させることからなる被験動物の乳癌の状態を認定することを含む。本発明はさらに被験動物の乳癌の状態を認定するためのキットに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００２年３月６日出願された米国仮出願第６０／３６２，４７３号の利益を主張するものであり、その全内容は参照として本明細書に取り込まれる。
【０００２】
本発明は、乳癌の診断、予後、及び腫瘍の病期における進行度の同定に重要であるバイオマーカーの検出及び同定において、高い特異性及び高い感度を提供する。乳癌の患者における血漿タンパク質プロファイルは、バイオチップアレイ及びＳＥＬＤＩ分析法を用いて、腫瘍非罹患の個人から識別される。この技術は、血漿サンプルを用いて乳癌を診断するための簡単であるが感度の高い方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
米国国立癌研究所（ＮＣＩ）の罹患率、及び国立健康統計センター（ＮＣＨＳ）の死亡データに基づいて、米国癌学会は、２００２年の米国において、乳癌が女性で最も多く診断される癌となるだろうと予測した。女性における新たな癌患者のうち、乳癌は３１％（２０３，５００）の割合を占めると予想され、３９，６００人がこの病気で死亡するであろうと報告されている（Ｊｅｍａｌ Ａ，Ｔｈｏｍａｓ Ａ，Ｍｕｒｒａｙ Ｔ，Ｔｈｕｎ Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００２．ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ．２００２；５２：２３−４７）。早期癌を検出するための発症前スクリーニングを、まだ治療の可能性があると認められる期間中に行えば、乳癌に関連する死亡率を著しく減少させることができる。残念なことに、診断の時には、乳癌の約５０％しか、場所を突き止めることができない（米国国立癌研究所。Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔ ＰＤＱ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｕｍｍａｒｉｅｓ．“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ”に関するモノグラフ、ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｎｅｔ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｄｑ．ｈｔｍｌ（２００１年１月更新））。４０歳以上の女性における定期的なスクリーニング法として、マンモグラフィーの有効性とそれの利用の推奨にも関わらず、総人口に対する乳癌死亡率を減少させることにおけるその有効性は、今もなお調査中である（Ｋ．Ａｎｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ．１９９９；２８１：１４７０−２）。現在、乳癌の検出への利用について研究されている血清腫瘍マーカーは、大集団において早期の癌を検出するのに適用することができるための適切な感度及び特異性をいまだに持ち合わせていない。ＣＡ１５．３やＣＡ２７．２９のようなＦＤＡ承認腫瘍マーカーは、進行乳癌又は乳癌の再発のモニタリング治療法のためのみに推奨されている（Ｄ．Ｗ．Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．１９９７；１５：２３２２−２３２８）。単独で、又は現存の診断法と組み合わせて使用することができる、費用効率の高い乳癌のスクリーニングのための新しいバイオマーカーが、今もなお早急に求められている。
以下の参考文献もまた、本明細書に参照として取り込まれる。
【非特許文献１】Jemal A, Thomas A, Murray T., Thun M., Cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin. 2002; 52:23-47.
【非特許文献２】National Cancer Institute. Cancer Net PDQ Cancer Information Summaries. Monographs on“Screening for breast cancer.”http://cancer net. nci. nih. gov/pdq. html (Updated January ２００１年１月更新）.
【非特許文献３】Antman K, Shea S. Screening mammography under age 50. JAMA.1999; 281:1470-2.
【非特許文献４】Chan DW, Beveridge RA, Muss H, Fritsche HA, Hortobagyi G, Theriault R, et al. Use of Truquant BR Radioimmunoassay for early detection of breast cancer recurrence in patients with stage II and stage III disease, J Clin. Oncology. 1997; 15:2322-2328.
【非特許文献５】Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988; 60: 2299-2301.
【非特許文献６】Hutchens TW, Yip TT. New desorption strategies for the massspectrometricanalysis of micromolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993; 7: 576-80.
【非特許文献７】Merchant M, Weinberger SR. Recent advancements in surface-enhanced laserdesorption/ionization-time of flight-mass spectrometry. Electrophoresis. 2000; 21:1164-67.
【非特許文献８】Wright Jr GL, Cazares LH, Leung S-M, Nasim S, Adam B-L, Yip T-T, et al. ProteinChipＴＭ surface enhanced laser desorption/ionization (SELDI) mass spectrometry: a novel protein biochip technology for detection of prostate cancer biomarkers in complex protein mixtures. Prostate Cancer Prostate Dis. 1999; 2: 264-76.
【非特許文献９】Hlavaty JJ, Partin AW, Kusinitz F, Shue MJ, Stieg M, Bennett K, Briggman JV. Mass spectroscopy as a discovery tool for identifying serum markers for prostate cancer. Clin. Chem. [Abstract]. 2001; 47:1924-26.
【非特許文献１０】Paweletz CP, Trock B, Pennanen M, Tsangaris T, Magnant C, Liotta LA, et al. Proteomic patterns of nipple aspirate fluids obtained by SELDI-TOF: potential for new biomarkers to aid in the diagnosis of breast cancer. Dis Markers. 2001; 17:301- 7.
【非特許文献１１】Vlahou A, Schellhammer PF, Medrinos S, Patel K, Kondylis FI, Gong L, et al. Development of a novel proteomic approach for the detection of transitional cell carcinoma of the bladder in urine. Am J Pathol. 2001; 158:1491-502.
【非特許文献１２】Patricoin EF III, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. The Lancet. 2002; 359:572-577.
【非特許文献１３】Zhang Z, Page G, Zhang H. Applying Classification Separability Analysis to Microarray Data, in Proc. of Critical Assessment of Techniques for Microarray Data Analysis (CAMDA'00), Kluwer Academic Publishers, 2001.
【非特許文献１４】Vapnik VN, Statistical Learning Theory, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1998.
【非特許文献１５】Efron B and Tibshirani R. Bootstrap Methods for Standard Errors, Confidence Intervals, and Other Measures of Statistical Accuracy. Statistical Science. 1986; 1:54- 75.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、異なる臨床病期における腫瘍サンプル中に異なった形で存在する、新しいタンパク質マーカーを初めて提供するものである。患者のサンプルにおけるこれらのマーカーの測定値は、単独であるいは組み合わせて、診断医がヒト癌の異なる臨床病期における予想される診断と相関することができる情報を提供する。これは、浸潤前癌についてのバイオマーカーを同定しようとする際に特に重要であり、したがって、このような診断は生命を救うと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のタンパク質マーカーは、いくつかの点において特徴付けることができる。
特に、一つの態様では、本発明のマーカーは、本明細書で特定されている条件下で、特にマススペクトル分析により決定されるような分子量によって特徴づけられる。
他の態様では、当該マーカーは、マーカーのスペクトルピークの大きさ（面積を含む）及び／又は形のようなマーカーのマススペクトル・シグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の特性、隣接するピークの近接性、大きさ及び形を含む特性等により特徴付けることができる。
さらに他の態様では、当該マーカーは、親和性結合特性、特に特定の条件下におけるＩＭＡＣ−Ｎｉ吸着剤に対する結合力により特徴付けることができる。
好ましい実施の形態では、本発明のマーカーは、このような態様、すなわち分子量、マススペクトル・シグネチャー、及びＩＭＡＣ−Ｎｉ吸着結合のそれぞれによって特徴付けることができる。
本発明のタンパク質バイオマーカーは、本明細書において、マーカーＩ〜ＸＩＶとして指定された以下のものを含む。質量分析法により測定された分子量もまた、各マーカーについて特定される。
マーカーＩ（ＢＣ１）：約４．３ｋＤの分子量を持つ
マーカーＩＩ（ＢＣ２）：約８．１ｋＤの分子量を持つ
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）：約８．９ｋＤの分子量を持つ
マーカーＩＶ：約４．５ｋＤの分子量を持つ
マーカーＶ：約４．０ｋＤの分子量を持つ
マーカーＶＩ：約８．３ｋＤの分子量を持つ
マーカーＶＩＩ：約１７ｋＤの分子量を持つ
マーカーＶＩＩＩ：約１８ｋＤの分子量を持つ
マーカーＩＸ：約１０．２ｋＤの分子量を持つ
マーカーＸ：約６．０ｋＤの分子量を持つ
マーカーＸＩ：約８．４ｋＤの分子量を持つ
マーカーＸＩＩ：約７．５ｋＤの分子量を持つ
マーカーＸＩＩＩ：約９．４ｋＤの分子量を持つ
マーカーＸＩＶ：約１６．３ｋＤの分子量を持つ
マーカーＩ〜ＸＩＶも、マススペクトル・シグネチャーにより特徴付けられる。マーカーＩ〜ＸＩＶのそれぞれのマススペクトルを、図１Ａ〜１Ｎにそれぞれ示す。
また、マーカーＩ〜ＸＩＶのそれぞれも、本明細書に明記しているように、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、ＩＭＡＣ−Ｎｉ吸着剤との結合力により特徴付けられる。
【０００６】
一つの態様では、本発明は、
（ａ）被験動物からのサンプルについて、少なくとも１種のバイオマーカーを測定すること、
（ただし、このマーカーは、マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）、マーカーＩＶ、マーカーＶ、マーカーＶＩ、マーカーＶＩＩ、マーカーＶＩＩＩ、マーカーＩＸ、マーカーＸ、マーカーＸＩ、マーカーＸＩＩ、マーカーＸＩＩＩ、マーカーＸＩＶ、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される）、及び
（ｂ）この測定値と乳癌の状態とを相関させること、
からなる被験動物の乳癌の状態を認定する方法を提供する。ある方法では、当該測定工程はサンプル中のマーカーの有無を検出することからなり、他の方法では、当該測定工程はサンプル中のマーカー（又はマーカー群）の量を測定することからなり、他の方法では、当該測定工程はサンプル中のバイオマーカーのタイプを認定することからなる。
ある方法では、当該測定工程はサンプル中のマーカーの有無を検出することからなり、他の方法では、当該測定工程はサンプル中のマーカー（又はマーカー群）の量を測定することからなり、他の方法では、当該測定工程は、サンプル中のバイオマーカーのタイプを認定することからなる。
【０００７】
また、本発明は、当該測定工程が、血液又は血液由来物質である被験動物のサンプルをタンパク質バイオマーカーと結合する捕捉試薬からなる基質の表面に沈着させることからなる方法にも関する。被験動物のサンプルは、状況に応じて、そのような沈着工程の前に分画（例えばｐＨ勾配において）してもよく、その回収され、及び選択されたフラクションを当該基質に沈着させてもよい。当該血液由来物質としては、例えば血清や血漿が挙げられる。好ましい実施の形態では、当該基質はＩＭＡＣ−Ｎｉ表面からなるＳＥＬＤＩプローブであり、その中で当該タンパク質バイオマーカーがＳＥＬＤＩにより検出される。他の実施の形態では、当該基質は、上記のように同定されたマーカーＩ〜ＸＩＶなどに結合する生体特異的親和性試薬からなるＳＥＬＤＩプローブであり、その中で当該タンパク質バイオマーカーがＳＥＬＤＩにより検出される。他の実施の形態では、当該基質は、上記のように同定されたマーカーＩ〜ＸＩＶのうち１種以上と結合する生体特異的親和性試薬からなるマイクロタイタープレートであり、その１種以上のタンパク質バイオマーカーが免疫測定法により検出される。
【０００８】
ある実施の形態で、当該方法は、さらに当該方法により決定された状態に基づいて、被験動物の治療を管理することからなる。例えば、本発明の方法の結果が結論に達しない、もしくは状態の確認が必要であるという根拠がある場合、医師はさらに検査をするよう命令することができる。また、状態が手術が妥当であることを示す場合は、医師は患者の手術を計画することができる。同様に、検査の結果が陽性である、例えば状態が末期の乳癌である場合、あるいは、さもなければ状態が深刻である場合、更なる措置は何ら是認されないとすることができる。さらに、その結果が、治療が成功したことを示す場合、更なる管理は必要ないとすることができる。
また本発明は、被験動物の管理後、少なくとも１種のバイオマーカーを再び測定する方法も提供する。このような場合、被験動物の治療を管理する工程は、その後得られた結果に応じて繰り返され、及び／又は変更される。
【０００９】
「乳癌の状態」という用語は、患者の疾病の状態のことをいう。乳癌の状態の種類は、例えば被験動物の癌のリスク、疾病の有無、患者の疾病の病期、及び疾病の治療の有効性を含むが、これに限定されない。他の状態及びそれぞれの状態の程度は当該技術分野で周知である。
本発明のマーカーは、各種の分画技術、例えば、質量分析法と併用したクロマトグラフ分離法を用いることにより、あるいは従来の免疫測定法により、サンプル中の他のタンパク質から分離することができる。好ましい実施の形態では、当該分離方法は、質量分析プローブの表面が当該マーカーと結合する吸着剤からなる表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析に関連する。
【００１０】
他の好ましい実施の形態では、比較タンパク質プロファイルが、乳癌であると診断された患者、及び公知の腫瘍性疾患に罹患していない患者から、プロテインチップ・バイオマーカー・システムを用いて作成される。バイオマーカーの一部は、教師付き分析法より得られた共同研究の結果に基づいて選択された。好ましい分析法は、統合最大分離可能度分析（Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｐａｒａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ （ＵＭＳＡ））アルゴリズムの線形バージョンを実行するＰｒｏＰｅａｋ（３Ｚ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，サウスカロライナ州）、及びバイオマーカー・パターン・ソフトウェアＶ４．０（ＢＰＳ）（サイファージェン、カリフォルニア州）において実行される分類木と回帰木法（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅ（ＣＡＲＴ））が挙げられる。
好ましい実施の形態では、この分析法は、乳癌の患者と癌に罹患していないコントロール間の識別に最も寄与しているピークを選別するために、単独で及び相互に比較して用いられる。
【００１１】
他の態様では、当該バイオマーカーは精製され、同定された。選択されたバイオマーカーは、腫瘍マーカーであるＣＡ１５．３とＣＡ２７．２９と共に、多変量ロジスティック回帰により、個別に及び組み合わせて評価された。
これらのマーカーの絶対的な正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）はまだ分かっていないが、このような知識は、患者のサンプル中のマーカーを測定するのに必要ではない。なぜなら、マーカーは、例えば、質量や親和性により十分特徴付けられるからである。分子量及び結合性がこれらのマーカーの特徴であり、検出もしくは単離の手段を制限するものではないことを特筆しておく。さらに、本明細書で記述されている方法又は当該技術分野で周知である他の方法を用いて、当該マーカーの絶対的な正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を決定することができる。
【００１２】
癌の検出及び診断における好ましい方法は、被験動物のサンプル中の、少なくとも１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出すること、及びこの１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出と癌の診断とを相関させることからなる。ただし、その相関は、それぞれの診断において正常な被験動物と比較しながら、１種以上のバイオマーカーの検出を考慮し、また、当該１種以上のタンパク質マーカーは、マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）、マーカーＩＶ、マーカーＶ、マーカーＶＩ、マーカーＶＩＩ、マーカーＶＩＩＩ、マーカーＩＸ、マーカーＸ、マーカーＸＩ、マーカーＸＩＩ、マーカーＸＩＩＩ、マーカーＸＩＶ、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。
検出における好ましい方法では、乳癌の臨床病期についての診断及び決定は、被験動物のサンプル中の、少なくとも１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出すること（ただし、当該タンパク質マーカーは、マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）、及びこれらの組み合わせから選択される）、及びこの１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出と乳癌の診断とを相関させること（ただし、その相関は、それぞれの診断において正常な被験動物と比較しながら、１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出を考慮する）からなる。
【００１３】
検出における好ましい方法では、乳癌の最初期の臨床病期についての診断及び決定は、被験動物のサンプル中の、少なくとも１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出すること（ただし、当該タンパク質マーカーは、マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）、及びこれらの組み合わせから選択される）、及びこの１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出と乳癌の診断とを相関させること（ただし、その相関は、それぞれの診断において正常な被験動物と比較しながら、１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出を考慮する）からなる。当該マーカーは、乳癌の最も早い段階であるステージ０期にて検出されるのが好ましい。当該マーカーを早期に検出する感度及び特異度を示す結果は、以下に示す実施例に記述する。
【００１４】
他の好ましい実施の形態では、複数の当該バイオマーカーが検出され、好ましくは少なくとも１種の当該バイオマーカーが検出され、より好ましくは少なくとも２種の当該バイオマーカーが検出され、最も好ましくは、少なくとも３種の当該バイオマーカーが検出される。最も好ましいマーカーを以下に示す。
マーカーＩ（ＢＣ１）：約４．３ｋＤの分子量を持つ
マーカーＩＩ（ＢＣ２）：約８．１ｋＤの分子量を持つ
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）：約８．９ｋＤの分子量を持つ
癌の異なる悪性度を診断及び識別するための好ましい方法では、当該方法は、生物学的マーカーの第一セットを表す第一データセットを作成するために、バイオチップアレイを用いること、被験動物のサンプル中の少なくとも１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出する第一データセットを評価すること、及び正常な被験動物と比較しながら、１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出と癌の進行性悪性度とを相関させることからなる。
本発明の一つの態様では、当該方法は、癌の異なる悪性度を診断及び識別するために使用される１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出することからなる。ただし、当該１種以上のタンパク質マーカーは、マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）、マーカーＩＶ、マーカーＶ、マーカーＶＩ、マーカーＶＩＩ、マーカーＶＩＩＩ、マーカーＩＸ、マーカーＸ、マーカーＸＩ、マーカーＸＩＩ、マーカーＸＩＩＩ、マーカーＸＩＶ、及びこれらの組み合わせより選択される。
【００１５】
他の態様では、本発明は、乳癌の異なる悪性度を診断及び識別する方法を提供する。当該方法は、被験動物のサンプル中の少なくとも１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出すること、及びこの１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出と乳癌の診断とを相関させることからなる。ただし、その相関は、それぞれの診断において正常な被験動物と比較しながら、１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出を考慮する。
本発明の他の態様では、癌の異なる悪性度を識別するために１種のバイオマーカーが使用される。また、癌を診断するための公知の癌バイオマーカー、例えば乳癌のマーカーであるＣＡ１５．３及びＣＡ２７．２９を１種以上組み合わせて、癌の異なる悪性度を識別するための１種のバイオマーカーも提供する。乳癌のような癌に罹患しやすい、あるいは癌に罹患している患者からのタンパク質プロファイルと正常な被験動物のものと比較するために、１種以上のタンパク質バイオマーカーを使用するのが好ましい。
本発明の他の態様では、患者のサンプルが、血液、血漿、血清、尿、組織、細胞、器官及び膣液からなる群より選択される。
【００１６】
好ましい検出方法は、バイオチップアレイを用いることを含む。本発明に有用なバイオチップアレイとしては、タンパク質アレイ及び核酸アレイが挙げられる。１種以上のマーカーを当該バイオチップアレイに固定化し、そのマーカーの分子量を検出するためにそれをレーザーイオン化する。マーカーの分析は、例えば、全イオン流に対して正規化される許容限界強度（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）に対する当該１種以上のマーカーの分子量による。ピーク強度の範囲を減少させるために対数変換を用いて、検出するマーカーの数を制限するのが好ましい。
他の好ましい方法では、バイオチップアレイに固定化した被験動物のサンプルについてのデータは、前記のバイオチップアレイをレーザーイオン化して、質量／電荷比の信号強度を検出し、そのデータをコンピュータに読み込み可能な形式に変換し、乳癌に罹患している患者に存在し、癌に罹患していない被験動物コントロールには存在しないマーカーを表す信号を検出するためのユーザー・インプット・パラメータに従って、そのデータを分類するアルゴリズムを実行することにより作成される。
好ましくは、当該バイオチップの表面は、例えばイオン性、アニオン性であり、陽イオン及び陰イオンの混合物からなる固定化されたニッケルイオンからなり、１種以上の抗体、一本鎖又は二本鎖の核酸より構成され、タンパク質、ペプチド又はそれらのフラグメントあるいはアミノ酸プローブより構成され、あるいはファージ・ディスプレイ・ライブラリーより構成される。
【００１７】
他の好ましい方法では、レーザー脱離／イオン化質量分析法を用いて１種以上の当該マーカーが検出される。この方法は、吸着剤が結合した質量分析計の使用に適したプローブを供与すること、被験動物のサンプルをその吸着剤に接触させること、当該マーカー又はマーカー群を当該プローブから脱離及びイオン化すること、及び質量分析計を用いてその脱離／イオン化されたマーカーを検出することからなる。
レーザー脱離／イオン化質量分析法は、吸着剤が結合した基質を供与すること、被験動物のサンプルをその吸着剤に接触させること、吸着剤が結合した質量分析計の使用に適したプローブにその基質を設置すること、当該マーカー又はマーカー群をプローブから脱離及びイオン化すること、及び質量分析計を用いてその脱離／イオン化されたマーカー又はマーカー群を検出することからなるのが好ましい。
【００１８】
他の態様では、乳癌の診断をさらに補助するために、以下に示す種々の組成物が提供される：
マーカーＩ及びマーカーＩＩ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＩＩ及びマーカーＩ，ＩＩＩ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＩＩＩ及びマーカーＩ，ＩＩ、ＩＶ〜ＸＩＶより選択される少なくとも一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＩＶ及びマーカーＩ，ＩＩ、ＩＩＩ，Ｖ〜ＸＩＶより選択される少なくとも一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＶ及びマーカーＩ，ＩＩ、ＩＩＩ，ＩＶ、ＶＩ〜ＸＩＶより選択される少なくとも一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＶＩ及びマーカーＩ，ＩＩ、ＩＩＩ，ＩＶ、Ｖ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＶＩＩ及びマーカーＩ，ＩＩ、ＩＩＩ，ＩＶ、Ｖ、ＶＩ，ＶＩＩＩ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＶＩＩＩ及びマーカーＩ，ＩＩ、ＩＩＩ，ＩＶ、Ｖ、ＶＩ，ＶＩＩ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＩＸ及びマーカーＩ，ＩＩ、ＩＩＩ，ＩＶ、Ｖ、ＶＩ，ＶＩＩ，ＶＩＩＩ，Ｘ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＸ及びマーカーＩ〜ＩＸ，ＸＩ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＸＩ及びマーカーＩ〜Ｘ，ＸＩＩ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＸＩＩ及びマーカーＩ〜ＸＩ，ＸＩＩＩ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＸＩＩＩ及びマーカーＩ〜ＸＩＩ，ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＸＩＶ及びマーカーＩ〜ＸＩＩＩより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物。これらの組成物において、当該マーカーは、実質的に純粋である及び／又は、例えば血清サンプルから単離されるのが好ましい。
【００１９】
本明細書に開示されているマーカーの質量値については、スペクトル装置における質量の正確性は、その開示された分子量の値の約±０．１５％以内であるとみなされる。さらに、そのように認識されている装置の正確性のばらつきについては、分光質量の決定は、約４００〜１０００ｍ／ｄｍ（ただし、ｍは質量であり、ｄｍは０．５のピーク高さにおけるマススペクトルのピーク幅である）の分解能限度の範囲内で変動することができる。質量分析装置及びそれらの操作に関連するこのような質量の正確性及び分解能のばらつきは、マーカーＩ〜ＸＩＶのそれぞれにおける質量に記載されている「約」という用語を用いることにより反映される。また、このような質量の正確性及び分解能のばらつき、及びマーカーＩ〜ＸＩＶのそれぞれにおける質量に関するこのような「約」という用語の意味は、被験動物の性別及び／又は民族性及び特定の癌もしくはその起源や病期により存在するかもしれない当該マーカーの変種も包含することを意図する。
【００２０】
本発明の方法を用いる乳癌のための当該バイオマーカーの発見では、好ましい期日の分析は、検出されるマーカーの数を制限するために、ピーク強度範囲を減少させるための対数変換によるものであり、各サンプルのピーク強度から得られたデータを個々のポイントとして、三次元成分空間に投影する。この成分空間は、ピーク強度の線形結合である。各成分空間は、およそ二つの事前に指定されたデータグループが、コンピュータモニター上の双方向性三次元ディスプレイにより決定された最大分離を達成する方向に一致する。それぞれの質量ピークにおける有意性スコアを計算し、それぞれの質量ピークは、二つの事前に指定されたデータグループの最大分離に対する集団寄与率に従ってランク付けられる。有意性スコアはプラスでもマイナスでもよく、プラスのスコアは、癌に罹患している患者のサンプルから得られた対応する質量ピークの発現の増加に相関し、マイナスのスコアは、癌に罹患している患者のサンプルから得られた対応する質量ピークの発現の減少に相関する。
【００２１】
固定化された分子は、各バイオマーカーの質量ピークを検出するためにレーザーイオン化され、当該１種以上のマーカーの質量ピークは、全イオン流に対して正規化された許容限界強度について解析される。選択された質量ピークは、約２Ｋ〜約１５０Ｋの間であるのが好ましい。
好ましい実施の形態では、定率のバイオマーカーサンプルが、中央値及び平均ランクがピークごとに決定される質量ピークの解析中ランダムに除外される。この解析は、少なくとも約１００回行われる。
【００２２】
他の好ましい実施の形態では、癌の進行段階を検出し、識別するためのバイオマーカーを表す質量ピークを予測するための方法が提供される。この方法は、正常な被験動物と癌に罹患している被験動物からサンプルを得ること、及び、当該サンプルの質量ピークを評価するためのバイオチップアレイを提供すること（ただし、当該バイオチップアレイは、化学修飾された金属親和性表面からなり、当該表面には、タンパク質、ペプチド又はそれらのフラグメントからなる群のうち少なくとも１種に選択的に結合することができる複数の分子が安定的に結合している）、バイオマーカーの第一セットを表す第一データセットを得るために、正常な被験動物と癌患者の被験動物からのサンプルを用いること、被験動物のサンプル中の少なくとも１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出する第一データセットを評価すること、及び、正常な被験動物と比較しながら、１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出と乳癌のような癌の進行性の悪性度とを相関させることからなる。
一つの態様では、コントロールデータセットが作成されるが、これは、正常な被験動物を表すバイオマーカーのコントロールセットを作成すること、当該バイオマーカーのコントロールセットを表すコントロールデータセットを作成するためにバイオチップアレイを用いること、及び、どの質量ピークが癌の進行の異なる悪性度を識別するバイオマーカーを表すかを予測するために、第一データセット及びコントロールデータセットを比較することからなる。
他の態様では、当該方法はさらに、癌に罹患している患者を表すバイオマーカーの第二のセットを作成すること、第一ステージの癌を表す第二のデータセットを作成するためにバイオチップアレイを用いること、及び、どの質量ピークが癌の進行の第一ステージ及び第二ステージを識別するバイオマーカーを表すかを予測するために、第二のデータセットとコントロールデータセットを比較することからなる。
当該方法は、悪性癌のあるステージを表す任意の有望なバイオマーカーの質量ピークを予測するために使用されるデータセットが得られるまで、少なくとも１回以上繰り返される。
【００２３】
他の好ましい実施の形態では、乳癌の異なる病期を表す複数のデータセットを含むバイオマーカーデータベースが構築され、そのテストデータセットと当該データベースを比較することにより、乳癌の少なくとも１つの病期を検出するための有望なバイオマーカーである質量ピークが予測される。
当該データベースは、乳癌の任意の病期を検出し、異なる癌の異なる病期を識別する有望なバイオマーカーを評価し、予測するためのデータベースからデータをマイニングするための有望なバイオマーカーである質量ピークを予測するために使用される。
他の好ましい実施の形態では、乳癌のような腫瘍の浸潤前に存在する有望なバイオマーカーを決定するために使用される質量ピークのデータセットを得ることにより、癌患者からの組織サンプルを分析し、正常な被験動物のものと比較する。
本発明の他の態様は、以下に記述する。
【００２４】
定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野における当業者により一般に理解されている意味を持つ。以下の参考文献は、本発明で使用されている多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使われているように、以下の用語は、特に明記しない限り記載された意味を持つ。
【００２５】
「気相イオン分光分析装置」とは、気相イオンを検出する装置のことをいう。気相イオン分光分析装置は、気相イオンを供給するイオン源を含む。気相イオン分光分析装置としては、例えば質量分析計、イオン移動度分光計及び全イオン電流測定装置が挙げられる。「気相イオン分光分析」とは、気相イオン分光分析装置を用いて気相イオンを検出することをいう。
「質量分析計」とは、質量電荷比に変換することができる気相イオンのパラメータを測定する気相イオン分光分析装置のことをいう。質量分析計は、一般にイオン源及び質量分析器を含む。質量分析計としては、例えば飛行時間型質量分析計、磁場型質量分析計、四重極型質量分析計、イオントラップ型質量分析計、イオンサイクロトロン共鳴質量分析計、扇形静電分析器及びそれらのハイブリッド型が挙げられる。「質量分析」とは、質量分析計を用いて気相イオンを検出することをいう。
「レーザー脱離質量分析計」とは、検体を脱離、気化及びイオン化させる手段としてレーザー光のエネルギーを利用する質量分析計のことをいう。
【００２６】
「タンデム質量分析計」とは、イオン混合物中のイオンを含むイオンのｍ／ｚに基づく識別もしくは測定における二つの連続する段階を実行することができる任意の質量分析計のことをいう。この語句は、空間的に直列なイオンのｍ／ｚに基づく識別もしくは測定における二つの連続する段階を実行することができる二つの質量分析器を有する質量分析計を包含する。さらにこの語句は、時間的に直列なイオンのｍ／ｚに基づく識別もしくは測定における二つの連続する段階を実行することができる一つの質量分析器を有する質量分析計を包含する。従って、この語句は、Ｑｑ−ＴＯＦ質量分析計、イオントラップ型質量分析計、イオントラップ−ＴＯＦ質量分析計、ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析計、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計、扇形静電−扇形磁場質量分析計及びこれらの組み合わせを明らかに包含する。
【００２７】
「質量分析器」とは、質量電荷比に変換することができる気相イオンのパラメータを測定するための手段からなる質量分析計の部分組立品のことをいう。飛行時間型質量分析計では、当該質量分析器は、イオン光学組立品、飛行管及びイオン検出器からなる。
「イオン源」とは、気相イオンを供給する気相イオン分光分析装置の部分組立品のことをいう。一つの実施の形態では、当該イオン源は、脱離／イオン化プロセスを介してイオンを供給する。このような実施の形態は、一般に、イオン化エネルギー源（例えばレーザー脱離／イオン化源）と条件検索が可能である関係にあるプローブと、常圧、もしくは減圧下における同時通信で、気相イオン分光分析装置の検出器を、位置的に接合させるプローブインターフェースからなる。
【００２８】
検体を固相から脱離し、イオン化するためのイオン化エネルギーの形態としては、（１）レーザー光エネルギー；（２）高速原子（高速原子衝撃において使用される）；（３）放射性核種のβ分解により生成される高エネルギー粒子（プラズマ脱離において使用される）；及び（４）二次イオンを生成する一次イオン（二次イオン質量分析において使用される）が挙げられる。固相の検体のためのイオン化エネルギーにおける好ましい形態としては、レーザー光（レーザー脱離／イオン化において使用される）が挙げられ、特に窒素レーザー、Ｎｄ−Ｙａｇレーザー、及び他のパルスレーザー源が好ましい。「フルエンス」とは、条件検索された画像の単位面積あたりにつき供給されるエネルギーのことをいう。レーザー光のような高フルエンス源は、約１ｍＪ／ｍｍ２から５０ｍＪ／ｍｍ２を供給する。典型的には、サンプルはプローブの表面に設置され、そのプローブはプローブインターフェースに接合され、そのプローブ表面はイオン化エネルギーにより衝撃が与えられる。当該エネルギーは、検体分子をその表面から気相へと脱離させ、それをイオン化する。
【００２９】
検体のためのイオン化エネルギーの他の形態としては、例えば、（１）気相のニュートラル（ｎｅｕｔｒａｌ）をイオン化する電子；（２）気相、固相又は液相のニュートラルからイオン化を誘導するための強い電場；及び（３）気相、固相又は液相のニュートラルの化学イオン化を誘導するためのイオン化粒子又は電場と中性化学物質との組み合わせを適用するソースが挙げられる。
本発明の文中における「プローブ」とは、気相イオン分光分析装置（例えば質量分析計）のプローブインターフェースを接合させ、及びイオン化及び気相イオン分光分析装置に導入させるためのイオン化エネルギーを検体に供給するために利用されるデバイスのことをいう。「プローブ」は、一般に検体がイオン化エネルギー源を供給される面を提供するサンプルからなる固体の基質（弾力性のある基質でも弾力性の無い基質でもどちらでもよい）より構成される。
「表面増強レーザー脱離／イオン化法」、すなわち「ＳＥＬＤＩ」とは、気相イオン分光分析装置のプローブインターフェースと接合するＳＥＬＤＩプローブの表面に検体が捕捉される、脱離／イオン化気相イオン分光分析（例えば質量分析）における方法のことをいう。「ＳＥＬＤＩ−ＭＳ」では、気相イオン分光分析装置は、質量分析計である。ＳＥＬＤＩ技術は、例えば米国特許第５，７１９，０６０号明細書（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ）及び米国特許第６，２２５，０４７号明細書（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ）に記載されている。
【００３０】
「表面増強アフィニティーキャプチャー法」すなわち「ＳＥＡＣ」は、吸収性表面からなるプローブ（ＳＥＡＣプローブ）を使用するＳＥＬＤＩの変形である。「吸着性表面」とは、吸着剤が結合している表面のことをいう（「捕捉試薬」又は「親和性試薬」とも呼ばれる）。吸着剤は検体（例えば、ターゲットのポリペプチド又は核酸）を結合させることができる任意の物質である。「クロマトグラフ吸着剤」とは、クロマトグラフィーに典型的に使用される物質のことをいう。クロマトグラフ吸着剤としては、例えばイオン交換物質、金属キレート（例えば、ニトリロ酢酸又はイミノニ酢酸）、固定化金属キレート、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、色素、単純生体分子（例えばヌクレオチド、アミノ酸、単純糖質及び脂肪酸）及び混合型吸着剤（例えば、疎水性誘引／静電反発吸着剤）が挙げられる。
「生体特異的吸着剤」とは、例えば核酸分子（例えばアプタマー）、ポリペプチド、多糖、脂質、ステロイド、あるいはこれらの抱合体（例えば、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、核酸（例えばＤＮＡ）−タンパク質抱合体）の生体分子からなる吸着剤のことをいう。ある場合では、当該生体特異的吸着剤は、多タンパク質複合体のような高分子構造体、生体膜あるいはウィルスとすることができる。生体特異的吸着剤としては、例えば抗体、受容体タンパク質、及び核酸が挙げられる。生体特異的吸着剤は、典型的にはクロマトグラフ吸着剤よりもターゲットの検体に対する特異性が高い。ＳＥＬＤＩに使用される吸着剤の更なる例は、米国特許第６，２２５，０４７号明細書（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ， “Ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｐｓ”２００１年５月１日）中に見出すことができる。
【００３１】
ある実施の形態では、ＳＥＡＣプローブは、最適な吸着剤を提供するために修飾することができる、事前に活性化された表面として提供される。例えば、任意のプローブには、共有結合により生体分子と結合することがきる、反応部分が備わっている。エポキシド及びカルボジイミドゾール（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）が、抗体や細胞受容体のような生体特異的吸着剤と共有結合するのに有用な反応部分である。
「吸着」とは、吸着剤又は捕捉試薬に対する検体の検出可能な非共有結合のことをいう。
【００３２】
「表面増強ニート脱離法（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｎｅａｔ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）」すなわち「ＳＥＮＤ」は、プローブの表面に化学結合されるエネルギー吸収分子からなるプローブ（ＳＥＮＤプローブ）を使用する、ＳＥＬＤＩの変形である。「エネルギー吸収分子」（ＥＡＭ）とは、レーザー脱離／イオン化源からのエネルギーを吸収することができ、その後、検体分子に接触してその検体分子の脱離及びイオン化に寄与することができる分子のことをいう。この語句は、しばしば「マトリックス」と呼ばれるＭＡＬＤＩに使用される分子を包含し、ケイ皮酸誘導体、シナピン酸（ＳＰＡ），シアノ−ヒドロキシ−ケイ皮酸（ＣＨＣＡ）及びジヒドロキシ安息香酸、フェルラ酸、ヒドロキシアセトフェノン誘導体などを明らかに包含する。また、この語句は、ＳＥＬＤＩに使用されるＥＡＭも包含する。ＳＥＮＤについては、米国特許第５，７１９，０６０号明細書及び２００２年９月４日に出願された米国特許出願公開第６０／４０８，２５５号明細書（Ｋｉｔａｇａｗａ，“Ｍｏｎｏｍｅｒｓ Ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｂｓｏｒｂｉｎｇ Ｍｏｉｅｔｉｅｓ Ｏｆ Ｕｓｅ Ｉｎ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎａｌｙｔｅｓ”）にさらに記述されている。
「表面増強感光結合及び放出法（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）」すなわち「ＳＥＰＡＲ」は、検体に共有結合することができ、次いで光（例えばレーザー光）照射後、プローブの部分における感光結合が切断されることにより検体が脱離することができる表面に結合する部分を有するプローブを使用する、ＳＥＬＤＩの変形である。ＳＥＰＡＲについては、米国特許第５，７１９，０６０号明細書にさらに記述されている。
【００３３】
「溶離剤」又は「洗浄液」とは、吸着性表面への検体の吸着に影響を及ぼす、あるいはそれを改変する及び／又は非結合物質を当該表面から除去するために使用される薬剤、典型的には溶液のことをいう。溶離剤の溶離性は、例えばｐＨ、イオン強度、疎水性、カオトロピック効果の度合い、洗浄強度及び温度によって左右される可能性がある。
「検体」とは、検出したいサンプルにおける任意の構成要素のことをいう。この用語は、サンプル中の１種の構成要素だけでなく複数の構成要素においても言及することができる。
アフィニティーキャプチャープローブの吸着性表面に吸着されるサンプルの「複雑度」とは、吸着される、異なるタンパク質種の数を意味する。
「分子結合パートナー」及び「特異的結合パートナー」とは、特異的結合を示す分子ペア、典型的には生体分子ペアのことをいう。分子結合パートナーは、受容体とリガンド、抗体と抗原、ビオチンとアビジン、及びビオチンとストレプトアビジンを含むが、これに限定されない。
「モニタリング」とは、連続的に変わるパラメータの変化を記録することをいう。
「バイオチップ」とは、一般に、吸着剤が結合する平面状の表面を有する固体の基質のことをいう。当該バイオチップの表面は、しばしば複数のアドレス可能な場所を含み、そのそれぞれの場所には吸着剤が結合される。バイオチップは、プローブインターフェースと接合するようになっており、従って、プローブとしても機能することができる。
【００３４】
「タンパク質バイオチップ」とは、ポリペプチドの捕捉に適合したバイオチップのことをいう。タンパク質バイオチップについては、多くのものが当当該技術に説明されており、それらは例えば、サイファージェン・バイオシステムズ社（フレモント、カリフォルニア州）、パッカード・バイオサイエンス社（メリデン、コネチカット州）、ザイオミクス社（Ｚｙｏｍｙｘ（ヘーワード、カリフォルニア州））及びファイロス社（Ｐｈｙｌｏｓ（レキシントン、マサチューセッツ州））により製造されるタンパク質バイオチップが含まれる。このようなタンパク質バイオチップの例は、以下の特許又は特許出願書に記載されている：米国特許第６，２２５，０４７号明細書（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ，“Ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｐｓ”，２００１年５月１日）；国際公開第ＷＯ ９９／５１７７３号明細書（Ｋｕｉｍｅｌｉｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，“Ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｒａｙｓ”，１９９９年１０月１４日）、米国特許第６，３２９，２０９号明細書（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａｒｒａｙｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃａｐｔｕｒｅ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ ｔｈｅｒｅｏｆ”，２００１年１２月１１日）；及び国際公開第ＷＯ ００／５６９３４号明細書（Ｅｎｇｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｒｉｘ ａｒｒａｙｓ”，２０００年９月２８日）。
【００３５】
サイファージェン・バイオシステムズ社により製造されるタンパク質バイオチップは、クロマトグラフ吸着剤もしくは生体特異的吸着剤が、アドレス可能な場所に結合した表面からなる。サイファージェンのプロテインチップ（ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標））アレイとしては、ＮＰ２０，Ｈ４，Ｈ５０，ＳＡＸ−２，ＷＣＸ−２，ＣＭ−１０，ＩＭＡＣ−３，ＩＭＡＣ−３０，ＬＳＡＸ−３０，ＬＷＣＸ−３０，ＩＭＡＣ−４０，ＰＳ−１０，ＰＳ−２０及びＰＧ−２０が挙げられる。これらのタンパク質バイオチップは、細長い切れ（ストリップ）状のアルミニウム基質からなる。このストリップの表面は、二酸化ケイ素でコーティングされている。
ＮＰ−２０バイオチップの場合、酸化ケイ素は親水性のタンパク質を捕捉するための親水性吸着剤として機能する。
【００３６】
Ｈ４，Ｈ５０，ＳＡＸ−２，ＷＣＸ−２，ＣＭ−１０，ＩＭＡＣ−３，ＩＭＡＣ−３０，ＰＳ−１０及びＰＳ−２０のバイオチップは、さらに物理的にバイオチップの表面に結合する、あるいはシランを介してバイオチップの表面に共有結合するヒドロゲル状の機能付与された架橋ポリマーからなる。Ｈ４バイオチップは、疎水結合のためのイソプロピル官能基を有し、Ｈ５０バイオチップは、疎水結合のためのノニルフェノキポリ（エチレングリコール）メタクリレートを有し、ＳＡＸ−２バイオチップは、陰イオン交換のための第四級アンモニウム官能基を有し、ＷＣＸ−２及びＣＭ−１０バイオチップは、陽イオン交換のためのカルボン酸官能基を有し、ＩＭＡＣ−３及びＩＭＡＣ−３０バイオチップは、Ｃｕ２＋やＮｉ２＋のような遷移金属イオンをキレート化により吸着するニトリロ酢酸官能基を有す。このような固定化金属イオンは、配位結合によりペプチド及びタンパク質を吸着させることができる。ＰＳ−１０バイオチップは、タンパク質上の共有結合のための基と反応することができるカルボイミドゾール（ｃａｒｂｏｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）官能基を有し、ＰＳ−２０バイオチップは、タンパク質と共有結合するためのエポキシド官能基を有す。一連のＰＳバイオチップは、抗体、受容体、レクチン、ヘパリン、プロテインＡ，ビオチン／ストレプトアビジンのような生体特異的吸着剤をサンプルからの検体を特異的に捕捉する機能を有するチップ表面に結合させるのに有用である。ＰＧ−２０バイオチップは、プロテインＧが結合するＰＳ−２０チップである。ＬＳＡＸ−３０（陰イオン交換）、ＬＷＣＸ−３０（陽イオン交換）及びＩＭＡＣ−４０（金属キレート）バイオチップは、表面に機能付与されたラテックスビーズを有す。このようなバイオチップは、ＷＯ ００／６６２６５（Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ａ Ｇａｓ Ｐｈａｓｅ Ｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ”，２０００年１１月９日）；ＷＯ ００／６７２９３（Ｂｅｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓａｍｐｌｅ Ｈｏｌｄｅｒ ｗｉｔｈ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｃｏａｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｇａｓ Ｐｈａｓｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ”，２０００年１１月９日）；米国特許出願公開第２００３００３２０４３Ａ１号明細書（Ｐｏｈｌ ａｎｄ Ｐａｐａｎｕ， “Ｌａｔｅｘ Ｂａｓｅｄ Ａｄｓｏｒｂｅｎｔ Ｃｈｉｐ”，２００２年７月１６日）及び米国特許出願公開第６０／３５０，１１０号明細書（Ｕｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｃｈｉｐ”，２００１年１１月８日）にさらに記載されている。
【００３７】
反応培地又はバイオチップのような基質上に捕捉される際に、検体は、例えば気相イオン分光分析法、光学的方法、電気化学的方法、原子間力顕微鏡法、及び高周波法より選択される各種検出方法により検出することができる。本明細書では気相イオン分光分析法について記述する。特に関心があるのは質量分析法、とりわけＳＥＬＤＩを利用することである。光学的方法は、例えば蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、複屈折、もしくは屈折率（例えば表面プラズモン共鳴法、偏光解析法、共振ミラー法、グレーティング・カップラ・ウェイブガイド法（ｇｒａｔｉｎｇ ｃｏｕｐｌｅｒ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ）又は干渉分光法）の検出を含む。光学的方法としては、光学顕微鏡法（共焦点及び非共焦点）、画像法及び非画像法が挙げられる。様々なフォーマットの免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ）は、固相に捕捉される検体を検出するのに人気の高い方法である。電気化学的方法としては、電解電流法や電流測定法が挙げられる。高周波法としては、多極共鳴分光分析法（ｍｕｌｔｉｐｏｌａｒ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）が挙げられる。
【００３８】
本発明の文中で使われている「マーカー」とは、コントロール被験動物（例えば診断が陰性であった被験動物、検出できなかった癌を有する被験動物、正常な被験動物又は健康な被験動物）から採取された比較可能なサンプルと比較して、ヒト癌を有する患者から採取されたサンプル中に異なった形で存在する（特定の、明らかな分子量を持つ）ポリペプチドのことをいう。
「異なった形で存在」という語句は、コントロール被験動物と比較して、ヒト癌を有する患者から採取されたサンプル中に存在するマーカーの量及び／又は頻度の相違のことをいう。例えば、マーカーは、コントロール被験動物のサンプルと比較して、ヒト癌患者のサンプル中で、高い濃度、あるいは低い濃度で存在するポリペプチドであってもよい。また、マーカーは、コントロール被験動物のサンプルと比較して、ヒト癌患者のサンプル中で、高い頻度、あるいは低い頻度で検出されるポリペプチドであってもよい。マーカーは、量、頻度、あるいはその両方の点からみて、異なった形で存在するかもしれない。
【００３９】
一つのサンプル中のポリペプチド量が、他方のサンプル中のポリペプチド量と比べて統計的に有意に異なる場合は、ポリペプチドは二つのサンプル間で異なった形で存在する。例えば、他方のサンプルに存在するポリペプチドと比較して、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％、あるいは少なくとも約１０００％多く存在する場合、あるいは一つのサンプル中には検出することができ、他方では検出することができない場合は、ポリペプチドは二つのサンプル間で異なった形で存在する。
また、ヒト癌患者のサンプルにおいてポリペプチドを検出する頻度が、コントロールサンプルと比較して統計的に有意に高い、あるいは低い場合は、ポリペプチドは、二つのサンプルセット間で異なった形で存在する。例えば、他方のサンプルセットと比較して、１つのサンプルセット中に少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％、あるいは少なくとも約１０００％高頻度、あるいは低頻度にポリペプチドが観察される場合、ポリペプチドは二つのサンプルセット間で異なった形で存在する。
【００４０】
「診断」とは、病態の有無あるいは性質を同定することを意味する。診断法は、その感度及び特異度で異なる。診断検査の「感度」は、検査で陽性反応を示す罹患者の割合である（「真の陽性者」の割合）。当該検査により検出されない罹患者は「偽陰性者」である。罹患してなく、当該検査において陰性反応を示す被験動物は「真の陰性者」と呼ばれる。診断検査の「特異度」は、１から偽陽性率を引いた値である。ここで「偽陽性」率は、検査で陽性反応を示す非罹患者の割合として定義される。特定の診断法は、状態について決定的な診断を提供するものではないかもしれないが、その方法が診断を補助する陽性の表示を提供すれば、それで十分である。
【００４１】
マーカーの「テスト量」とは、テストされるサンプル中に存在するマーカーの量のことをいう。テスト量は、絶対量（例えばμｇ／ｍｌ）でも相対量（例えば信号の相対強度）でもどちらでもよい。
マーカーの「診断量」とは、ヒト癌の診断と一致する被験動物サンプル中のマーカーの量のことをいう。診断量は、絶対量（例えばμｇ／ｍｌ）でも相対量（例えば信号の相対強度）でもどちらでもよい。
マーカーの「コントロール量」とは、任意の量あるいはマーカーのテスト量に対して比較されるべき量の範囲のことをいう。例えば、マーカーのコントロール量は、ヒト癌に罹患していない人におけるマーカーの量であるかもしれない。コントロール量は、絶対量（例えばμｇ／ｍｌ）でも相対量（例えば信号の相対強度）でもどちらでもよい。
【００４２】
「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子群、あるいはそれらのフラグメントにより実質的にコードされているポリペプチドリガンドのことをいい、それはエピトープ（例えば抗原）に特異的に結合し、認識する。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ及びλのＬ鎖の定常領域における遺伝子、α、γ、δ、ε及びμのＨ鎖の定常領域における遺伝子、及び無数の免疫グロブリンの可変領域における遺伝子が挙げられる。抗体は、例えば無処置の免疫グロブリンとして、あるいは各種ペプチダーゼを用いる消化により産生された、よく特徴付けられている多数のフラグメントとして存在している。これは、例えばＦａｂ’及びＦ（ａｂ）’２フラグメントを含む。本明細書で使用される「抗体」という用語は、完全な抗体を改変することにより産生された、あるいは組み換えＤＮＡ法を用いて新たに合成された抗体フラグメントも包含する。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいは単鎖抗体も包含する。抗体の「Ｆｃ」部とは、Ｈ鎖の定常領域ドメインであるＣＨ１，ＣＨ２及びＣＨ３の１種以上からなるが、Ｈ鎖の可変領域を含まない免疫グロブリンにおけるＨ鎖の部位のことをいう。
「免疫測定法」とは、抗原（例えばマーカー）に特異的に結合する抗体を用いる測定法のことをいう。免疫測定法は、抗原を単離する、対象とする、及び／又は定量するために、特定の抗体の特異的な結合性を利用することにより特徴付けられている。
【００４３】
抗体に「特異的に（あるいは選択的に）結合する」又は「特異的に（あるいは選択的に）免疫反応する」という語句は、タンパク質又はペプチドについて言及する場合、異種のタンパク質の集団及び他の生物製剤中に当該タンパク質が存在していることを決定する結合反応のことをいう。従って、指定された免疫測定の条件下では、指定された抗体は、バックグランドの少なくとも２倍特定のタンパク質に結合し、実質的にサンプル中に存在する他のタンパク質に対し、有意な量結合することはない。このような条件下での抗体への特異的な結合には、特定のタンパク質に対する特異性について選択される抗体を要するかもしれない。例えば、ラット、マウス、あるいはヒトのような特定の種から産生されたマーカーＢｒ１と反応するポリクローナル抗体は、マーカーＢｒ１と特異的に免疫反応し、多形性変異体及びマーカーＢｒ１の対立遺伝子を除く他のタンパク質とは特異的に免疫反応しないポリクローナル抗体のみが得られるように選択することができる。この選択は、他の種からマーカーＢｒ１分子と交差反応する抗体を取り除くことにより達成されるだろう。特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために、各種のイムノアッセイフォーマットを用いてもよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫測定法が、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用される（特定の免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイフォーマット及び条件の記述については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照する）。特異的又は選択的反応は、典型的にはバックグランドシグナルあるいはノイズの少なくとも２倍、さらに典型的にはバックグランドの１０倍から１００倍以上である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明は、乳癌のための腫瘍バイオマーカーを同定するための、高い特異性及び高い感度を有する方法に関する。
乳癌の病期に関連する１５（１４）種のバイオマーカーが同定された。当該１４種のバイオマーカーにおけるタンパク質又はタンパク質のフラグメントは、ＳＥＬＤＩ（表面強調レーザー脱離／イオン化）プロテインチップ／マススペクトルの強度ピークとして表され、分子質量が以下に示す値のあたりに集中している。
マーカーＩ（ＢＣ１）： ４２８３ダルトン
マーカーＩＩ（ＢＣ２）： ８１２６ダルトン
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）： ８９３２ダルトン
マーカーＩＶ： ４４６５ダルトン
マーカーＶ： ４０６０ダルトン
マーカーＶＩ： ８３２２ダルトン
マーカーＶＩＩ： １７０４６ダルトン
マーカーＶＩＩＩ： １７６９６ダルトン
マーカーＩＸ： １０２４０ダルトン
マーカーＸ： ５８９１ダルトン
マーカーＸＩ： ８４２６ダルトン
マーカーＸＩＩ： ７５４１ダルトン
マーカーＸＩＩＩ： ９４１３ダルトン
マーカーＸＩＶ： １６２４４ダルトン
マーカーＩ〜ＸＩＶのこれらの質量は、開示されているＳＥＬＤＩ−質量分析のプロトコルにより決定された規定値の０．１５％以内の範囲で正確であると考えられる。
【００４５】
我々は、マーカーＩ〜ＸＩＶが、コントロール被験動物と比較して、ヒト乳癌に罹患している患者から採取したサンプル中の量及び／又は頻度の面で以下のように異なった形で存在することを発見し、特に、癌患者のサンプル中でマーカーが上方制御される（すなわち、コントロール被験動物からのサンプルと比較し、乳癌患者のサンプル中の濃度が上昇する）、あるいはマーカーが下方制御される（すなわち、コントロール被験動物からのサンプルと比較し、乳癌患者のサンプル中の濃度が低下する）ことを発見した。
マーカーＩ（ＢＣ１）： 癌患者のサンプルにおいて下方制御される
マーカーＩＩ（ＢＣ２）： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＩＶ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＶ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＶＩ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＶＩＩ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＶＩＩＩ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＩＸ： 癌患者のサンプルにおいて下方制御される
マーカーＸ： 癌患者のサンプルにおいて下方制御される
マーカーＸＩ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＸＩＩ： 癌患者のサンプルにおいて下方制御される
マーカーＸＩＩＩ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＸＩＶ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
【００４６】
マーカーＩ〜ＸＩＶと乳癌の有無の関連は、様々な病期における腫瘍の切除及び治療をする前の乳癌を有する患者（ｎ＝１０３）、良性の乳房疾患を有する女性（ｎ＝２５）及び公知の腫瘍性疾患を有してない女性健常者（ｎ＝４１）において確立された。乳癌の異なる病期を識別するバイオマーカーを同定するために使用される当該方法が高い特異度及び高い感度を有することは、これらのバイオマーカーのうち３種（４２８３（ＢＣ１），８１２６（ＢＣ２），及び８９３２（ＢＣ３））のみを使用することにより強調され、異なる病期の乳癌患者のうち９３％が正確に同定された（ステージ０／Ｉ期（９３％）、ステージＩＩ期（８５％）及びステージＩＩＩ期（９４％））。１種のバイオマーカー（ＢＣ３）のみを使用した場合でも、ステージ０／Ｉ期（８８％）、ステージＩＩ期（７８％）及びステージＩＩＩ期（９２％）を示し、乳癌患者のうち８５％の正確な同定が達成された。
【００４７】
特に、乳癌に罹患しているもしくは罹患していない被験動物からの１６９の血清サンプルにおけるタンパク質プロファイルの同時分析が実施され、その結果、本明細書に記載された方法が高い特異性及び高い選択性を有することが実証された。被験動物の１６９の血清サンプルから、３種の識別バイオマーカーが同定され、これらの組み合わせにより、癌に罹患していないコントロールからの乳癌の検出において、高い感度（９３％）及び高い特異度（９１％）の両方が達成された。
【００４８】
上記のように、マーカーＩ〜ＸＩＶは、吸着剤に対する親和性、特に以下で説明する実施例の概説の項目でのプロテインチップ分析で指定されている条件下における固定化Ｎｉキレート（ＩＭＡＣ）基質表面に対する結合に基づいて特徴付けることもできる。この条件は、以下の条件を含む。３０μｌの８Ｍ尿素、１％ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を２０μｌの血清サンプルに加え、その希釈サンプルを４℃で１５分間ボルテックスし、ＰＢＳで１：４０の比で希釈する。固定化金属アフィニティーキャプチャーチップ（ＩＭＡＣ３）をメーカー（サイファージェン・バイオシステムズ社、カリフォルニア州）の使用説明書に従って、５０ｍＭのＮｉＳＯ４で活性化し、９６−ウェル・バイオプロセッサ（サイファージェン・バイオシステムズ社、カリフォルニア州）を用いて、その希釈した血清サンプルを５０μｌずつ、プロテインチップアレイ上の各スポットに分注する。プラットフォームシェーカー上で６０分間室温にて結合させた後、１００μｌのＰＢＳで５分間のアレイの洗浄を２回行い、その後１００μｌのｄＨ２Ｏで２回リンスする。結合は、質量リーダーで検出することができる。本明細書で説明する、特定のタンパク質マーカーをＩＭＡＣ−Ｎｉ吸着剤と結合するとして特徴付けることができることは、当該マーカーとこのような条件下で処理した血清サンプルとの結合が検出されることを示す。
【００４９】
バイオマーカーを同定するための以下に示す本発明の具体的な例は、本発明を限定するあるいは解釈することを意図しているものでは決してない。乳癌の早期発見を可能とする血清バイオマーカーを同定するために、ステージ０期とＩ期の癌患者からの試料のタンパク質プロファイルを癌に罹患していないコントロールからのものと比較した。次に選択されたバイオマーカーについて、バイオマーカー選択プロセスに含まれていないステージＩＩ期及びＩＩＩ期の乳癌患者からのデータを用いて試験した。複合タンパク質の発現パターンのハイスループット・プロファイリングにより、大量の有望なマーカーを同時にスクリーニングすることが非常に容易になる。ＵＭＳＡアルゴリズムは、あらかじめ定義された二つの診断グループの分離に対する寄与に応じて、多数のピークを集合的にランク付けするための効率的なモデルを提供した。ＰｒｏＰｅａｋブートストラップモジュールを用いてランダム摂動（ｒａｎｄｏｍ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を導入し、上位にランク付けされたピークの一貫性を検査するために、これを複数回実行し、複数回の実行から計算されたランクの標準偏差によりそれを判断した。その成績が単なる偶然とみなされないためのピークのランクにおける標準偏差のカットオフ値の上限を確立するために、実際のデータ分布をシミュレートする、ランダムに作成されたデータセットに同じブートストラップ手順を適用した。この「シミュレートされたピーク」からのランクの標準偏差の最小値は、ピークが無作為の偶然により得られる可能性の一貫性の程度を示す。この最小値は、更に検討するために、元の１４７のピークを上位にランク付けされた１５のピークのサブセットまでに減らすために手助けとなるカットオフとして用いた。このようなピークの成績は、データにおける無作為なアーティファクトに起因するものとはなりにくいと考えられる。
【００５０】
簡単にするために、複合指数は、単純多変量ロジスティック回帰により導き出された。これらの選択されたバイオマーカーをさらにバリデートするときは、より複雑な非線形分類モデルを利用して、複数のバイオマーカーを組み合わせてもよい。注意深くスクリーニングされ、検査されたバイオマーカーについて複雑なモデリング法を利用することにより、一般に多数の質量ピークからの生データに関してそのような方法を直接適用するよりも頑強な成績が提供されるはずである。選択されたバイオマーカーの識別能は、ステージＩＩ〜ＩＩＩ期のデータを個々のテストセットとして用いることにより実証された。成績のブートストラップ・クロスバリデーション評価により、将来のデータにわたる、これらのバイオマーカーの一般化可能性（ｇｅｎｅｒａｌｉｚａｂｉｌｉｔｙ）について統計的信頼度が提供される。選択されたこの３種のバイオマーカーについて、これらのマーカーの濃度と腫瘍サイズ又はリンパ節転移間における有意な相関は何もみられなかった。従って、これらのマーカーの識別能は、腫瘍の進行よりもそれの悪性を反映している可能性が非常に高い。
【００５１】
本明細書で使われている「腫瘍の病期」又は「腫瘍の進行」とは、腫瘍の異なる臨床病期のことをいう。腫瘍の臨床病期は、医学の分野で確立されている様々なパラメータにより定義される。そのパラメータの例としては、形態、腫瘍サイズ、患者の体内への転移の度合いなどが挙げられる。
ヒト癌は、前悪性状態から悪性そして最終的に患者を死に至らしめる転移性疾患への進行を含む多段階のプロセスであるようにみえる。ヒトにおける疫学的研究は、ある病態が悪性腫瘍のリスクの増加に関連しているのを受けて、それを「前癌性」であると規定した。癌予防戦略として、前浸潤性病変を検出し、取り除く前例がある。例えば、子宮頚部の異形成及び上皮内癌は、細胞学的スクリーニング法により子宮頚癌の予防に利用されて成功した前癌性の例である。残念なことに、乳房は、子宮頚部ほど簡単にサンプル採取できないので、乳房の前癌性のためのスクリーニング法の開発には、子宮頚癌を検出するために現在使用されている細胞形態学的スクリーニング法よりも複雑な手段を要する。
【００５２】
前癌性乳房疾患も、異型の異常増殖から上皮内癌（前浸潤性癌）へ、そして最終的には広がり、転移し、患者を死に至らしめる浸潤性癌までの見かけ上の形態的進行によって特徴付けられる。乳房バイオプシーについての注意深い組織学的検査により、他のものではなく、このような特徴のいくつかを要する中間ステージが実証された。詳細な疫学的研究により、異なる形態の病変が異なる速さで、（リスクの低い）異型の異常増殖から患者において高い確率で浸潤性癌に進行する面皰性非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）まで様々な形で進行することが確立された（Ｌｏｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１；及びＰａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９７８）。家族歴もまた、乳癌の発症における重要な危険因子であり、前癌性病変の相対リスクを増加させる（Ｄｕｐｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｄｕｐｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９３；及びＬｏｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９１）。特に関心があるのは、非面皰性上皮内癌が、コントロールグループと比較して乳癌の相対リスクが１０倍以上増加したことに関連していることである（Ｏｔｔｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。相対リスクの増加のほかに、以下に示す二つの理由も、ＤＣＩＳが前癌性であるという概念をサポートする。１）乳癌がこのような患者に発生する場合、それはＤＣＩＳが発見されたのと同じ乳房の同じ領域にいつも発生する。２）ＤＣＩＳはしばしば浸潤性乳癌に隣接する組織に存在する（Ｏｔｔｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。これらの理由により、ＤＣＩＳが、女性の浸潤性乳癌の発症における律速段階に相当する可能性が極めて高い。
【００５３】
Ｉ．好ましい実施の形態の例
好ましい実施の形態では、本発明は、１種以上のマーカー、例えばマーカー４２８３（ＢＣ１），８１２６（ＢＣ２）及び８９３２（ＢＣ３）を用いてヒト癌の診断を補助するための方法を提供する。これらのマーカーは、ヒト癌の診断を補助する際に単独で、あるいは任意のセット中の他のマーカーもしくは全く異なるマーカー（例えばＣＡ１５．３やＣＡ２７．２９）と組み合わせて使用することができる。当該マーカーは、ヒト癌患者（例えば乳癌患者）及びヒト癌を検出することができない正常な被験動物からのサンプル中に異なった形で存在する。例えば、当該マーカーのいくつかは正常な被験動物と比べてヒト癌患者において、高い濃度で発現する及び／又は高い頻度で存在する。従って、人における１種以上のこれらのマーカーの検出は、その人がヒト癌を有しているかもしれない可能性について有用な情報を提供し、また腫瘍の臨床病期を決定することができると考えられる。
【００５４】
このようにして、本発明の実施の形態は、（ａ）バイオチップアレイを用いて生物学的マーカーの第一セットを表す第一データセットを作成し；（ｂ）被験動物のサンプル中の少なくとも１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出する第一データセットを評価し；（ｃ）１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出と正常な被験動物とを比較して癌の進行性悪性病期とを相関させることにより、癌の異なる悪性病期を診断及び識別するための方法を含む。この相関は、コントロール（例えばヒト癌を検出することができない正常な被験動物）のマーカー又はマーカー群の量と比較したサンプル中のマーカー又はマーカー群の量を考慮してもよいし（マーカー又はマーカー群の上方制御あるいは下方制御）、テストサンプル中のマーカーの有無及びコントロール中の同じマーカーの検出の頻度を考慮してもよいし、被験動物がヒト癌を有しているかいないかの決定を容易にするこのようなファクターを両方考慮してもよい。
【００５５】
マーカーを検出するために、任意の適切なサンプルを被験動物から得ることができる。サンプルは、好ましくは被験動物からの血清サンプルである。必要ならば、サンプルは、マーカーの検出能を増強させるために上記のように調製することができる。例えば、マーカー４２８３（ＢＣ１），８１２６（ＢＣ２），及び８９３２（ＢＣ３）の検出能を増加させるために、被験動物からの血清サンプルは、好ましくは、例えばチバクロンブルーアガロースクロマトグラフィー、単鎖ＤＮＡアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーなどにより分画することができる。プレ分画のプロトコルのようなサンプルの調製は任意であり、用いられる検出法に応じてマーカーの検出能を増強させる必要がないかもしれない。例えば、もしサンプル中のマーカーの有無を検出するためにマーカーに特異的に結合する抗体を使用するならば、サンプルの調製は不要であるかもしれない。
【００５６】
サンプル中のマーカー又はマーカー群を検出するために、任意の適切な方法を用いることができる。例えば、気相イオン分光分析法や免疫測定法を上記のように使用することができる。
これらの方法を用いて、１種以上のマーカーを検出することができる。サンプルは、複数のマーカーの有無について試験されるのが好ましい。単独のマーカーよりも複数のマーカーの有無を検出する方が、診断医により多くの情報を与えることになると考えられる。具体的に、サンプル中の複数のマーカーの検出は、真の陽性診断及び真の陰性診断の割合を増加させ、また偽陽性診断又は偽陰性診断の割合を減少させると考えられる。
次に、マーカー又はマーカー群の検出をヒト癌の推定診断と相関させる。ある実施の形態では、マーカーの量を測らずに、単なるマーカーの有無の検出が有用であり、その検出とヒト癌の推定診断及び腫瘍の臨床病期の決定とを相関させることができる。例えば、これらのバイオマーカーのうち３種（マーカー４２８３（ＢＣ１），８１２６（ＢＣ２），及び８９３２（ＢＣ３））のみを使用することにより、９３％の乳癌患者が以下の病期において正確に同定された：ステージ０／Ｉ期（９３％）、ステージＩＩ期（８５％）及びステージＩＩＩ期（９４％）。１種のバイオマーカー（ＢＣ３）のみを使用しても、ステージ０／Ｉ期（８８％）、ステージＩＩ期（７８％）及びステージＩＩＩ期（９２％）を示し、８５％の乳癌患者が正確に同定された。こうして、試験される被験動物における１種以上のこれらのマーカーの単なる検出により、その被験動物が腫瘍の異なる臨床病期に進行していることが示される。
【００５７】
他の実施の形態では、マーカーの検出が、マーカーの検出とヒト癌の推定診断とを相関させるために、マーカーを定量することを関与させることができる。従って、検査される被験動物において検出されるマーカーの量がコントロール量と比較して高い場合は、検査される当該被験動物が、ヒト癌を有している可能性がより高い。
同様に、他の実施の形態では、マーカーの検出がさらに、当該マーカーの量が正常な被験動物からの血清サンプル中に含まれる量よりもヒト癌患者からの血清サンプル中に含まれる量が少ない場合における、マーカーの検出とヒト癌の推定診断とを相関させるために、マーカーを定量することを関与させることができる。従って、検査される被験動物において検出されるマーカーの量がコントロール量と比較して低い場合は、検査される当該被験動物が、ヒト癌を有している可能性がより高い。
【００５８】
マーカーを定量する時は、それをコントロールと比較することができる。コントロールは、例えばヒト癌を検出することができない正常な被験動物の比較できるサンプル中に存在するマーカー量の平均値もしくは中央値でもよい。コントロール量は、テスト量を測定する場合と同じあるいは実質的に同様の実験条件下で測定される。例えば、テストサンプルを被験動物の血清サンプルから取得し、マーカーを特定のプローブを用いて検出する場合、マーカーのコントロール量は同じプローブを用いて患者の血清サンプルから決定されるのが好ましい。マーカーのコントロール量は、多数のヒト癌を有していない正常な被験動物からのサンプルに基づいて決定されるのが好ましく、そうすることにより、その集団のマーカー量のばらつきが反映される。
質量分析により作成されたデータは、次にコンピュータソフトウェアにより分析することができる。ソフトウェアは、質量分析計からの信号をコンピュータに読み込み可能な形式に変換するコードにより構成することができる。また、当該ソフトウェアは、当該信号が本発明のマーカーあるいは他の有用なマーカーに相当する信号における「ピーク」を表しているかどうかを決定するための信号の分析に、アルゴリズムを適用するコードを含むこともできる。また、当該ソフトウェアは、テストサンプルからの信号を、「正常な」及びヒト癌の特徴を示す典型的な信号と比較するアルゴリズムを実行し、またその二つの信号間の適合の接近性を決定するコードを含むこともできる。当該ソフトウェアはまた、どのテストサンプルが最も接近しているかを示すコードも含むことができ、これにより推定診断が提供される。
【００５９】
本発明、すなわち本明細書に記述されている方法によれば、悪性腫瘍に進行する前浸潤性腫瘍の原因になるバイオマーカーを同定することにより、前浸潤性腫瘍、あるいは良性の腫瘍でさえも診断が可能かもしれない。同定されるバイオマーカーのタイプ及びバイオマーカーの量は、前浸潤性腫瘍から悪性段階の腫瘍へのジャンプと相関している可能性がある。その腫瘍が浸潤性になる前に、直ちにその腫瘍を切除するような治療法、あるいは化学療法や放射線療法のような治療法を実行することができる。前浸潤性バイオマーカーの同定は、例えば乳癌におけるマンモグラムの利用のような従来の方法を用いる診断に利用することができる。
こうして、本発明は、このような腫瘍に関連するバイオマーカーを同定することにより前浸潤性腫瘍の迅速な同定を提供し、それにより患者は救命治療が与えられるかもしれない。さらに、癌患者の長期治療の費用も削減されると考えられる。
【００６０】
より具体的には、本発明は、ヒト癌患者及びコントロールの被験動物のサンプル中に異なった形で存在するタンパク質マーカーの発見、及びこの発見をヒト癌の診断を補助する方法、及び腫瘍の病期の進行を同定する方法への適用に基づく。これらのタンパク質マーカーのいくつかは、コントロール（例えばヒト癌を検出することができない女性）と比較して、ヒト癌患者からのサンプル中において、高い濃度及び／又は高い頻度で検出される。従って、コントロールと比較して、テストサンプル中に検出される１種以上のマーカーの量、又はテストサンプル中の１種以上のマーカーの単なる検出が、検査された被験動物がヒト癌を有しているか否かの可能性に関する有用な情報を提供する。
【００６１】
本発明のタンパク質マーカーは、他にも多くの用途がある。例えば、インビトロ又はインビボにおける当該マーカーの発現を調節する化合物をスクリーニングするために、当該マーカーを使用することができる。その化合物は患者に対するヒト癌の治療や予防に有用であるかもしれない。他の例では、ヒト癌の任意の治療に対する反応をモニターするために、マーカーを使用することができる。さらに他の例では、当該マーカーを遺伝に関する研究に用いることがきる。例えば、任意のマーカーは、遺伝学的に関連しているかもしれない。これは、例えば、家族がヒト癌の経歴を有しているヒト癌患者の集団からのサンプルを分析することにより決定することができる。その結果を次に、例えば家族がヒト癌の経歴を有していないヒト癌患者から得られたデータと比較することができる。遺伝子学的に関連しているマーカーは、家族がヒト癌の経歴を有する被験動物がヒト癌に罹患しやすいかどうかを決定する手段として使用されるかもしれない。
【００６２】
他の態様では、本発明はヒト癌患者とコントロール（例えばヒト癌を検出することができない女性）のサンプル中に異なる形で存在するマーカーを検出するための方法を提供する。このマーカーは多数の生体サンプル中に検出することができる。サンプルは、好ましくは生体液のサンプルである。本発明において有用な生体液のサンプルとしては、例えば血液、血清、血漿、乳頭吸引液、尿、涙、唾液などが挙げられる。全てのマーカーが血清中に検出されるので、血清が本発明の実施の形態における好ましいサンプル源である。
本明細書に記載された１種以上のマーカーを検出するために、任意の適切な方法を用いることができる。これらの方法は、質量分析法（例えばレーザー脱離／イオン化質量分析法）、蛍光法（例えばサンドイッチ免疫測定法）、表面プラズモン共鳴法、偏光解析法及び原子間力顕微鏡法を含むが、これに限定されない。
【００６３】
好ましい実施の形態では、当該分離方法は、質量分析プローブの表面が、マーカーが結合する吸着剤より構成される表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析法に関連する。ＳＥＬＤＩは、化学修飾された表面（ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ、サイファージェン・バイオシステムズ社、フレモント、カリフォルニア州）にタンパク質が選択的に吸着され、バッファーで洗浄することにより不純物が取り除かれるという親和性に基づく質量分析法である。異なる表面を有するアレイと洗浄条件とを組み合わせることにより、高速、高分解クロマトグラフ分離がチップ上で達成される（Ｍ．Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０００；２１：１１６４−６７）。
【００６４】
ＳＥＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳは、ハイスループットタンパク質プロファイリングを提供する。他の多くのタイプのハイスループット発現データのように、タンパク質アレイデータは、小さいサンプルサイズ（検体の数）に対して、多数の変数（マスピーク）によりしばしば特徴付けられる。疾患に関連するバイオマーカーをスクリーニングするためにこのようなデータを分析する際の重要な問題点は、限られた数のサンプルからできるだけ多くの情報を抽出すること、及び成績がデータにおける疾患と関連がないアーティファクトにより主に影響されるバイオマーカーの選択を回避することである。バイオインフォマティクス手段の効果的で適切な使用が、非常に重要となってくる。
【００６５】
他の好ましい実施の形態では、乳癌の早期発見のための有望な血清バイオマーカーをスクリーニングするために、固定化金属アフィニティープロテインチップアレイ及びＳＥＬＤＩがハイスループットスクリーニングに使用される。例えば、乳癌を有しているあるいは有していない患者から全部で１６９の遡及的血清サンプルをジョーンズ・ホプキンス臨床化学血清バンク（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｕｍ Ｂａｎｋｓ）から入手し、同時に分析した。キレート化された金属（ヒスチジン、トリプトファン、システイン又はリン酸化アミノ酸を介して）に結合したタンパク質をＰＢＳ−ＩＩマスリーダー（サイファージェン・バイオシステムズ社、フレモント、カリフォルニア州）上で分析した。複合タンパク質プロファイルは、収集されたバイオインフォマティクス手段を用いて分析した。ステージ０〜Ｉ期の乳癌患者と癌を有していないコントロール（健康＋良性）との最適な分離に対して一貫して有意に寄与したことを根拠として、３種のバイオマーカーパネルを選択した。次に、この選択されたバイオマーカーの有効性をステージＩＩ〜ＩＩＩ期の乳癌患者からの個々のデータを用い、ブートストラップのクロスバリデーションにより検査を行った。
【００６６】
ＩＩ．マーカーの調製
サンプルはバイオマーカーの検出を行う前に調製するのが好ましい。典型的には、これは検査されるべき被験動物からのサンプルを収集することに関与する。サンプルは、被験動物からの任意の生体サンプルとすることができる。血液、血漿、血清、尿、リンパ液、あるいは管の洗浄液などの生体液又はそれらの由来物質が好ましく、サンプルが血清であるのが最も好ましい。
サンプルをプレ分画し、バイオマーカーを含んでいると決定されたフラクションを集めるのが有用であるかもしれない。プレ分画の方法としては、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逐次抽出法、ゲル電気泳動法及び液体クロマトグラフィーが挙げられる。検体もまた検出を行う前に改変してもよい。これらの方法は、さらに分析を行う場合、サンプルを単純化するのに有用である。例えば、分析を行う前にアルブミンのような多量のタンパク質を血液から除去することが有用であるかもしれない。しかし、本発明のマーカーは、血液から血清を単離した後は、それ以上分画を行わないでもＳＥＬＤＩにより検出可能である。
【００６７】
一つの実施の形態では、サンプルは、サイズ排除クロマトグラフィーを利用してサンプル中のタンパク質のサイズに従ってプレ分画することができる。入手できるサンプル量が少ない生体サンプルについては、サイズセレクションスピンカラムを用いるのが好ましい。例えば、Ｋ３０スピンカラム（プリンストン・セパレーション（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、サイファージェン・バイオシステムズ社などから入手できる）を使用することができる。一般に、カラムから溶離される最初のフラクション（フラクション１）は高分子量のタンパク質の割合が高く、フラクション２は高分子量のタンパク質の割合がそれより低く、フラクション３は高分子量のタンパク質の割合がさらに低く、フラクション４は高分子量のタンパク質の割合が最も低く、このように、後になるほど高分子量のタンパク質の割合が低くなる。次に各フラクションは、気相イオン分光分析法によりマーカーの検出について分析することができる。
【００６８】
他の実施の形態では、サンプルは、陰イオン交換クロマトグラフィーによりプレ分画することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、帯電特性におおざっぱに従ってサンプル中のタンパク質のプレ分画をすることができる。例えば、Ｑ陰イオン交換樹脂（例えばＱ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ，Ｂｉｏｓｅｐｒａ）を用いることができ、サンプルは、異なるｐＨの溶離剤で連続して溶離することができる（図３及び実施例、セクションＶＩ Ｂ参照）。陰イオン交換クロマトグラフィーは、より負に帯電したサンプル中の生体分子を他のタイプの生体分子から分離することができる。高いｐＨの溶離剤で溶離されたタンパク質は、弱く負に帯電していることが多く、また、低いｐＨの溶離剤で溶離されるフラクションは、強く負に帯電していることが多い。従って、サンプルの複雑度を減少させるほかに、陰イオン交換クロマトグラフィーは、結合特性に従ってタンパク質を分離する。
【００６９】
さらに他の実施の形態では、サンプルは、ヘパリンクロマトグラフィーによりプレ分画することができる。ヘパリンクロマトグラフィーは、ヘパリンとの親和性相互作用及び帯電特性にも基づいて、サンプル中のマーカーのプレ分画をすることができる。硫酸化ムコ多糖であるヘパリンは、正に帯電した部分を有するマーカーに結合し、サンプルは、異なるｐＨの溶離剤もしくは塩濃度の溶離剤で連続して溶離することができる。低いｐＨの溶離剤で溶離されたマーカーは弱く正に帯電していることが多く、高いｐＨの溶離剤で溶離されるマーカーは、強く正に帯電していることが多い。従って、ヘパリンクロマトグラフィーもまた、サンプルの複雑度を減少させ、結合特性に従ってマーカーを分離する。
【００７０】
さらに他の実施の形態では、サンプルは、サンプル中に多量に存在するタンパク質、あるいはマーカーの検出を妨げるかもしれないタンパク質を除去することによりプレ分画することができる。例えば、血清サンプル中には血清アルブミンが多量に存在し、マーカーの分析を分かりにくくしているかもしれない。従って、血清サンプルは、血清アルブミンを除去することにより、プレ分画することができる。血清アルブミンは、血清アルブミンに特異的に結合する吸着剤からなる基質を用いて除去することができる。例えば、チバクロンブルーアガロース（血清アルブミンに対する高い親和性を有する）や抗血清アルブミン抗体からなるカラムを用いることができる（例えば、図２と４を参照）。
【００７１】
さらに他の実施の形態では、サンプルは、特定の特性を有するタンパク質、例えばグリコシル化されたタンパク質を単離することによりプレ分画することができる。例えば、血清サンプルは、レクチンクロマトグラフィーカラム（糖に対する高い親和性を有する）にサンプルを通過させることにより、分画することができる。グリコシル化タンパク質は、レクチンカラムに結合し、非グリコシル化タンパク質はフローとともに通過する。次にグリコシル化タンパク質は、糖、例えばＮ−アセチルグルコサミンを含む溶離剤によりレクチンカラムから溶離され、更なる分析のために用いることができる。
【００７２】
血清サンプルをプレ分画するのに適するアフィニティー吸着剤は、多くのタイプが存在する。サンプルをプレ分画するために使用できる別のタイプのアフィニティークロマトグラフィーの例としては、単鎖ＤＮＡスピンカラムが挙げられる。このカラムは、基本的なタンパク質又は正に帯電したタンパク質に結合する。結合したタンパク質は次に、変性剤を含む溶離剤又は高いｐＨの溶離剤を用いてカラムから溶離される。
このように、サンプル中のタンパク質の結合特性、あるいはサンプル中のタンパク質の特性に基づいて、サンプルの複雑度を減少させる方法はたくさんある。
【００７３】
さらに他の実施の形態では、サンプルは逐次抽出プロトコルを用いて分画することができる。逐次抽出法では、サンプルから異なるタイプの生体分子を抽出するために、サンプルを一連の吸着剤に接触させる。例えば、特定のタンパク質を抽出するために、サンプルを第一吸着剤にアプライし、非吸着性タンパク質（すなわち第一吸着剤に結合しなかったタンパク質）を含む溶離液を回収する。次に、そのフラクションを第二の吸着剤に接触させる。これにより、様々なタンパク質がフラクションからさらに抽出される。この第二のフラクションは、次に第三の吸着剤に接触させ、同様にして、逐次溶離液を次の吸着剤に接触させる。
【００７４】
サンプルの逐次抽出を実行するために、任意の適切な物質及び方法を用いることができる。例えば、異なる吸着剤からなる一連のスピンカラムを用いることができる。他の例では、底に異なる吸着剤を含むマルチウェルを用いることができる。他の例では、気相イオン分光分析装置の使用に適応したプローブの表面が、生体分子に結合するための吸着剤からなるプローブ上で逐次抽出を実行することができる。本実施の形態では、当該プローブ上で第一吸着剤にサンプルをアプライし、次に溶離剤でそれを洗浄する。第一吸着剤に結合しないマーカーは、溶離剤で除去される。このフラクション中に存在するマーカーは、当該プローブ上の第二吸着剤にアプライすることができ、同様にして、逐次溶離液を次の吸着剤にアプライする。気相イオン分光分析装置のプローブ上で逐次抽出を行う長所は、気相イオン分光分析装置を用いて、逐次抽出プロトコルの各ステージにおいて様々な吸着剤と結合するマーカーを直接分析することができることである。
【００７５】
さらに他の実施の形態では、高分解能電気泳動法、例えば一次元又は二次元ゲル電気泳動法により、サンプル中の生体分子を分離することができる。マーカーを含むフラクションを単離することができ、気相イオン分光分析法によりさらにそれを分析することができる。１種以上のマーカーを含む生体分子スポットの二次元アレイを作成するために、二次元ゲル電気泳動法を用いるのが好ましい（例えば、Ｊｕｎｇｂｌｕｔ ａｎｄ Ｔｈｉｅｄｅ，Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒ．Ｒｅｖ．１６：１４５−１６２（１９９７）参照）。
【００７６】
二次元ゲル電気泳動法は、当該技術分野で公知の方法を用いて実行することができる（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８２．参照）。典型的には、サンプル中の生体分子は、例えば等電点電気泳動法によって分離される。その間、正味荷電がゼロ（すなわち等電点）であるスポットに達するまでｐＨ勾配によってサンプル中の生体分子が分離される。この第一分離工程により、生体分子の一次元アレイが得られる。一次元アレイの生体分子は、第一分離工程で使用したものと一般に異なる技術を用いてさらに分離される。例えば、第二の様相では、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動法のようなポリアクリルアミドゲルを用いて、等電点電気泳動法により分離された生体分子をさらに分離する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、生体分子の分子質量に基づいてさらに分離することができる。典型的には、二次元ゲル電気泳動法は、複合混合物内の１，０００〜２００，０００Ｄａの範囲の分子質量における化学的に異なる生体分子を分離することができる。
【００７７】
二次元アレイでの生体分子は、当該技術分野で公知である任意の適切な方法を用いて検出することができる。例えば、ゲル中の生体分子は、標識又は染色（例えばクマシーブルー又は銀染色）することができる。ゲル電気泳動により、１種以上の本発明のマーカーの分子量に相当するスポットが生成されるならば、そのスポットを、気相イオン分光分析法によりさらに分析する。例えば、スポットをゲルから切り取り、気相イオン分光分析法によりそれを分析する。あるいは、電界を与えることにより、生体分子を含むゲルを不活性膜に移すこともできる。次に、マーカーの分子量にほぼ相当する膜上のスポットを気相イオン分光分析法により分析することができる。気相イオン分光分析法では、スポットは、ＭＡＬＤＩやＳＥＬＤＩ（例えばＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイを用いて）のような任意の適切な技術を用いて分析することができる。
【００７８】
気相イオン分光分析の前に、プロテアーゼ（例えばトリプシン）のような切断剤を用いて、スポット中の生体分子をより小さいフラグメントに切断するのが望ましいかもしれない。生体分子を小断片に消化することにより、スポット中の生体分子のマスフィンガープリントが供与され、これは必要ならば、マーカーの同一性を決定するために使用することができる。
さらに他の実施の形態では、極性、帯電、サイズのような異なる物理的特性に基づいてサンプル中の生体分子の混合物を分離するために、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。ＨＰＬＣ装置は、典型的には移動相の貯蔵槽、ポンプ、インジェクター、分離カラム及び検出器より構成される。サンプル中の生体分子は、サンプルのアリコットをカラムに注入することにより分離される。混合物中の異なる生体分子は、移動液相と固定相との間の分配挙動が異なるために、異なる速度でカラムを通過する。１種以上のマーカーの分子量及び／又は物理的特性に相当するフラクションを収集することができる。このフラクションは、次にマーカーを検出するために気相イオン分光分析法により分析することができる。例えば、以下で詳しく説明するＭＡＬＤＩ又はＳＥＬＤＩ（例えばＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイを用いて）のいずれか一方を用いて、当該スポットを分析することができる。
【００７９】
状況に応じて、マーカーは、その分解能を改善するためもしくはその同一性を決定するために、分析前に改変することができる。例えば、当該マーカーは、分析前にタンパク質分解させてもよく、任意のプロテアーゼを用いることができる。トリプシンのようなプロテアーゼは、マーカーを不連続の数のフラグメントに切断することが多いので、特に有用である。消化により生成したフラグメントは、マーカーのフィンガープリントとして機能し、これにより間接的にそれらを検出することができる。これは、同じような分子質量を有するマーカーが複数存在し、問題となっているマーカーが混同されるかもしれない場合に、特に有用である。また、より小さいマーカーの方が質量分析により簡単に分離されるので、タンパク質分解による断片化は、高分子量のマーカーにも有用である。他の例では、検出分解能を改善するために、生体分子を改変することができる。例えば、陰イオン性吸着剤（例えば陽イオン交換ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ）への結合を改善するため及び検出分解能を改善するために、糖タンパク質から末端シアル酸残基を除去するためにノイラミニダーゼを用いることができる。他の例では、さらにマーカーを識別できるように、分子マーカーと特異的に結合する特定の分子量のタグを結合させることにより、マーカーを改変することができる。状況に応じて、そのような改変されたマーカーを検出した後、改変されたマーカーの物理化学的特性をプロテインデータベース（例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）において適合させることにより、マーカーの同一性をさらに決定することができる。
【００８０】
ＩＩＩ．マーカーの捕捉
バイオマーカーは、本明細書に記載された任意のバイオチップ、マルチウェルマイクロタイタープレート、又は樹脂のような固体の担体に固定化された捕捉試薬を用いて捕捉されるのが好ましい。特に、本発明のバイオマーカーは、ＳＥＬＤＩプロテインバイオチップ上に捕捉されるのが好ましい。捕捉は、クロマトグラフの表面上か生体特異的表面上で行うことができる。本発明のバイオマーカーを捕捉し、検出するために、反応性表面からなる任意のＳＥＬＤＩプロテインバイオチップを用いることができる。しかし、本発明のバイオマーカーは、固定化金属キレートによく結合する。従って、Ｃｕ２＋やＮｉ２＋のような遷移金属イオンをキレート化により吸着するニトリロ酢酸官能基を有するＩＭＡＣ−３及びＩＭＡＣ−３０バイオチップが、本発明のバイオマーカーを補足する好ましいＳＥＬＤＩバイオチップである。ＳＥＬＤＩバイオチップもまた、当該バイオマーカーを特異的に捕捉する抗体を用いて誘導体化することができる、あるいは免疫グロブリンに結合するプロテインＡやプロテインＧのような捕捉試薬を用いて誘導体化することができる。次に、特定の抗体を用いて溶液中のバイオマーカーを捕捉することができ、その捕捉されたマーカーは、捕捉試薬を介してチップ上で単離することができる。
【００８１】
一般に、血清のような、バイオマーカーを含むサンプルを、バイオチップの活性表面上に結合させるために十分な時間、サンプルを配置する。次に、リン酸緩衝生理食塩水のような適切な溶離剤を用いて結合しなかった分子を表面から洗浄する。一般に、溶離剤がより厳しいものであるほど、タンパク質は洗浄後でも保持されているようにより堅く結合していなければならない。次に、その保持されたタンパク質バイオマーカーは適切な方法により検出することができる。
【００８２】
ＩＶ．マーカーの検出及び特徴づけ
Ａ．分光分析法
プロテインバイオチップの表面に捕捉された検体は、当該技術分野に公知である任意の方法により検出することができる。この方法としては、例えば質量分析法、蛍光法、表面プラズモン共鳴法、偏光解析法及び原子間力顕微鏡法が挙げられる。質量分析法、特にＳＥＬＤＩ質量分析法が、本発明のバイオマーカーの検出に対し特に有用な方法である。好ましくは、レーザー脱離飛行時間型質量分析計を本発明の実施の形態で用いる。
【００８３】
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法、すなわちＭＡＬＤＩ−ＭＳは、しばしばマトリックスと呼ばれる、プローブの表面からタンパク質をそのまま脱離させるためのエネルギー吸収分子を用いる質量分析法である。ＭＡＬＤＩは、例えば米国特許第５，１１８，９３７号明細書（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．）及び米国特許第５，０４５，６９４号明細書（Ｂｅａｖｉｓ ａｎｄ Ｃｈａｉｔ）に記載されている。ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、サンプルは典型的にはマトリックス物質と混合され、不活性プローブの表面に配置される。模範的なエネルギー吸収分子としては、ケイヒ皮酸誘導体、シナピン酸（ＳＰＡ），シアノ−ヒドロキシ−ケイ皮酸（ＣＨＣＡ）及びジヒドロキシ安息香酸が挙げられる。他の適切なエネルギー吸収分子は、当業者に公知である。マトリックスは乾燥させ、検体分子を封入する結晶を形成させる。次にその検体分子をレーザー脱離／イオン化質量分析法により検出する。ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、上記の調製方法を用いてサンプルの複雑度がかなり減少されれば、本発明のバイオマーカーを検出するのに有用である。
【００８４】
表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析法、すなわちＳＥＬＤＩ−ＭＳは、複合混合物中に存在するタンパク質のような生体分子を分画及び検出するためのＭＡＬＤＩにおける改良体に相当し、本発明の好ましい方法である。ＳＥＬＤＩは、プロテインバイオチップに結合した捕捉試薬を用いてそのプロテインバイオチップの表面にタンパク質のような生体分子を捕捉する質量分析法である。典型的には、結合しない分子は、検査する前にプローブの表面から洗浄する。ＳＥＬＤＩ技術は、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）システムの一部として、サイファージェン・バイオシステムズ社、フレモント、カリフォルニア州から入手できる。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイはＳＥＬＤＩでの使用に特に適応している。ＳＥＬＤＩは、例えば米国特許第５，７１９，０６０号明細書（”Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｅｓ”，Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ，１９９８年２月１７日）、米国特許第６，２２５，０４７号明細書（”Ｕｓｅ ｏｆ Ｒｅｔｅｎｔａｔｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｏ Ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｐｓ”，Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ，２００１年５月１日）及びＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒらの Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｒ．Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ，ｅｄ．，ｐｐ１１９１５−１１９１８ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，２０００中の“Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”に記載されている。
【００８５】
基質表面上のマーカーは、気相イオン分光分析法を用いて脱離及びイオン化することができる。気相イオン分光分析計は、基質上のマーカーを分解することができれば、任意の適切なものを使用することができる。好ましくは、気相イオン分光分析計はマーカーの定量ができるものである。好ましくは、プロテインバイオチップ上に捕捉されたマーカーは、本明細書に記載されているレーザー脱離飛行時間型質量分析計を用いて検出される。
レーザー脱離質量分析法では、マーカーを含む基質又はプローブはインレットシステムに導入される。マーカーはイオン源からのレーザー光により気相中に脱離及びイオン化される。生成されたイオンは、イオン・オプティック・アセンブリ（ｉｏｎ ｏｐｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ）により収集され、次いで飛行時間型質量分析計において、イオンは短時間の高圧領域を通って加速され、高真空チャンバーへと漂流される。高真空チャンバーの末端部では、この加速されたイオンが高感度の検出器の表面を異なる時間に衝突する。この飛行時間はイオンの質量における機能なので、帯電率に対する特定の質量のマーカーの有無を確認するために、イオンが形成されてからイオン検出器に衝突するまでの経過時間を利用することができる。
【００８６】
他の実施の形態では、マーカーを検出するためにイオン移動度分光計を用いることができる。イオン移動度分光計の原理は、このイオンの異なる移動度に基づいている。具体的に、イオン化により生成されたサンプルのイオンは、例えば質量、帯電あるいは形状の違いにより、電界の影響を受けた管の中を異なる速度で移動する。このイオン（典型的には電流の形の）は検出器に登録され、それはその後マーカーあるいはサンプル中の他の物質を同定するために使用することができる。イオン移動度分光法の長所は、常圧で操作が可能であることである。
さらに他の実施の形態では、マーカーを検出し、特徴付けるために全イオン電流測定装置を用いることができる。この装置は、基質が１種のマーカーのみを有する場合に使用することができる。１種のマーカーが基質上にある場合、イオン化されたマーカーから生成された全電流は、マーカーの量及び他の特徴を反映する。マーカーより生成された全イオン流は、次にコントロール（例えば公知の化合物の全イオン流）と比較することができる。マーカーの量及び他の特徴は次に決定することができる。
【００８７】
Ｂ．免疫測定法
他の実施の形態では、サンプル中のマーカーを検出及び分析するために免疫測定法を用いることができる。この方法は、（ａ）マーカーに特異的に結合する抗体を提供すること；（ｂ）サンプルをその抗体に接触させること；及び（ｃ）そのサンプルについてそのマーカーに結合した抗体の複合体の有無を検出することからなる。
マーカーに特異的に結合する抗体を調製するために、精製されたマーカー又はその核酸配列を用いることができる。マーカーについての核酸配列及びアミノ酸配列は、これらのマーカーをさらに特徴付けることによって入手することができる。例えば、各マーカーは、多くの酵素（例えばトリプシン、Ｖ８プロテアーゼなど）を用いてマッピングされたペプチドにすることができる。各マーカーから消化により生成されたフラグメントの分子量を用いてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースのようなデータベースを検索し、その各種酵素により生成された消化フラグメントの分子量と一致する配列を得ることができる。この方法を用いて、他のマーカーの核酸及びアミノ酸の配列を、もしそのマーカーがデータベースにおける公知のタンパク質ならば、同定することができる。
【００８８】
あるいは、プロテイン・ラダー・シークエンス法を用いてタンパク質の塩基配列を決定することができる。プロテイン・ラダーは、例えば分子を断片化し、そのフラグメントを酵素消化することにより、あるいはフラグメントの末端から単一アミノ酸を連続的に除去する他の方法により作成することができる。プロテイン・ラダーの作成方法は、例えば国際公開第ＷＯ ９３／２４８３４号明細書（Ｃｈａｉｔ ｅｔ ａｌ．）及び米国特許第５，７９２，６６４号明細書（Ｃｈａｉｔ ｅｔ ａｌ．）に記述されている。ラダー・フラグメントは、次に質量分析法により分析される。ラダー・フラグメントの質量の差により、分子の末端から除去されたアミノ酸が同定される。
【００８９】
マーカーがデータベースにおいて未知のタンパク質ならば、核酸及びアミノ酸の配列は、たとえマーカーの一部のアミノ酸配列でもその知識を用いて決定することができる。例えば、マーカーのＮ末端アミノ酸配列に基づいて変性プローブを作成することができる。これらのプローブを用いて、次に、マーカーを最初に検出したサンプルから作成したゲノムライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。陽性クローンを同定し、増幅し、そしてよく知られた方法を用いて組み換えＤＮＡ配列をサブクローニングすることができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ １９８９）、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ ２００１）参照）。
【００９０】
当該技術分野で公知である任意の適切な方法を用いて、精製されたマーカー又はその核酸配列を使用し、マーカーに特異的に結合する抗体を作成することができる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）；Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．１９８６）；及びＫｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）参照）。このような方法には、ファージあるいは同様のベクターを用いて、組み換え抗体のライブラリーから抗体を選択することにより抗体を作成する方法、及び免疫ラット又は免疫マウスによりポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作成する方法が含まれるが、これに限定されない（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６（１９８９）参照）。
【００９１】
抗体が提供された後は、当該技術分野に公知である任意の適切な免疫結合法（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を用いてマーカーを検出及び／又は定量することができる（例えば、米国特許第４，３６６，２４１；４，３７６，１１０；４，５１７，２８８；及び４，８３７，１６８号明細書参照）。有用な測定法としては、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）のような酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ），ウエスタンブロット法及びスロットブロット法が挙げられる。これらの方法もまた、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ３７（Ａｓａｉ，ｅｄ．１９９３）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ，ｅｄｓ．，７ｔｈ ｅｄ．１９９１）；及びＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，ｓｕｐｒａに記述されている。
【００９２】
一般に、被験動物から得られたサンプルは、マーカーと特異的に結合する抗体に接触させることができる。状況に応じて、抗体は洗浄及び次の工程である複合体の単離を容易にするために、抗体とサンプルを接触させる前に抗体を固体の担体に固定することができる。固体の担体としては、例えばマイクロタイタープレート、スティック、ビーズ、あるいはマイクロビーズの形状のガラスあるいはプラスチックが挙げられる。また、抗体は上記のプローブ基質又はＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイに結合させることもできる。サンプルは、好ましくは被験動物から採取した生体液である。生体液のサンプルとしては、例えば血液、血清、血漿、乳頭吸引液、尿、涙、唾液などが挙げられる。好ましい実施の形態では、生体液は血清からなる。このサンプルは、抗体と接触させる前に、適切な溶離剤で希釈することができる。
【００９３】
サンプルを抗体とともにインキュベートした後は、この混合物を洗浄し、形成された抗体とマーカーの複合体を検出することができる。これは、洗浄した混合物を検出試薬とともにインキュベートすることにより遂行することができる。この検出試薬は、例えば検出可能なラベルで標識された二次抗体でもよい。模範的な検出可能なラベルとしては、電磁ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標））、蛍光色素、放射標識、酵素（例えばホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ及びＥＬＩＳＡで一般に使用される他の酵素）、及び金コロイド、着色ガラス、プラスチックビーズのような比色標識（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｌａｂｅｌ）が挙げられる。あるいは、結合したマーカー特異的抗体を検出するために、例えば二次の標識抗体を使用する間接的測定法を用いて、及び／又は、例えば、マーカーの特有のエピトープと結合するモノクローナル抗体を混合物とともに同時にインキュベートする競合試験法又は阻止試験法を用いてサンプル中のマーカーを検出することができる。
【００９４】
これらのアッセイの間、それぞれの試薬を組み合わせた後は、インキュベーション及び／又は洗浄工程を要するかもしれない。インキュベーション工程は、約５秒から数時間までと様々であり、好ましくは、約５分から約２４時間である。しかし、インキュベーション時間はアッセイフォーマット、マーカー、溶液の量、濃度等に応じて変わる。アッセイは１０℃〜４０℃のような温度範囲にわたって実行することができるが、通常は常温で行われる。
免疫測定法は、サンプル中のマーカーの有無及びサンプル中のマーカーの量を決定するために用いることができる。まず、サンプル中のマーカーのテスト量を上記の免疫測定法を用いて検出することができる。もしマーカーがサンプル中に存在するならば、上記の適切なインキュベーション条件下でマーカーに特異的に結合する抗体を用いて、抗体とマーカーの複合体が形成される。抗体とマーカーの複合体の量は、標準品と比較することにより決定することができる。標準品は、例えば公知の化合物あるいはサンプル中に存在することが公知である他のタンパク質とすることができる。上記のように、マーカーのテスト量は、その測定単位がコントロールと比較することが可能ならば、絶対単位で測定する必要は無い。
【００９５】
サンプルについてのこれらのマーカーを測定する方法は、多くの用途がある。例えば、ヒト癌の診断又は予後診断を補助するために、１種以上のマーカーを測定することができる。他の例では、癌の治療に対する被験動物の反応をモニターするために、このマーカーの検出方法を用いることができる。他の例では、インビボあるいはインビトロにおけるこれらのマーカーの発現を調節する化合物を測定するため及び同定するために、このマーカーを検出する方法を使用することができる。好ましい例では、腫瘍の進行における異なる段階を識別するためにバイオマーカーが使用され、従って、適切な治療及び腫瘍の転移の度合いを決定するのに役立つ。
【００９６】
Ｖ．データ分析
質量分析によるデータ作成は、イオン検出器によりイオンを検出することから始まる。典型的なレーザー脱離質量分析計は３３７．１ｎｍの窒素レーザーを使用することができる。有用なパルス幅は約４ナノ秒であり、一般に約１〜２５Ｊの出力が使用される。検出器に衝突するイオンは電位を生成し、それはアナログ信号をデジタル化して捕集する高速時間配列記録装置によりデジタル化される。サイファージェンのＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）システムは、これを実行するためにアナログ・デジタル・コンバータ（ＡＤＣ）を使用する。ＡＤＣは、一定時間ごとに検出器のアウトプットを時間依存性ビン（ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｎｓ）に統合する。時間間隔は、典型的には１から４ナノ秒である。さらに、最終的に分析される飛行時間スペクトルは、典型的にはサンプルに対するイオン化エネルギーの単一パルスからの信号ではなく、多数のパルスからの信号の合計を表す。これはノイズを減少させ、ダイナミック・レンジを増加させる。この飛行時間データは、次にデータ処理される。サイファージェンのＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）ソフトウェアでは、データ処理は典型的には、ＴＯＦからＭ／Ｚへの変換、ベースライン減算、高周波ノイズフィルタリングを含む。
【００９７】
ＴＯＦからＭ／Ｚへの変換は、飛行時間を質量電荷比（Ｍ／Ｚ）に変換するアルゴリズムの適用に関連する。この工程では、信号は、タイム・ドメインからマス・ドメインに変換される。すなわち、各飛行時間は、質量電荷比（Ｍ／Ｚ）に変換される。キャリブレーションは内部からあるいは外部から行うことができる。内部キャリブレーションでは、分析されるサンプルに、公知のＭ／Ｚの検体が１種以上含まれる。これらの集団の検体を表す飛行時間における信号ピークに、公知のＭ／Ｚが付与される。これらの付与されたＭ／Ｚ比に基づいて、飛行時間をＭ／Ｚに変換する数学関数によってパラメータが算出される。外部キャリブレーションでは、事前の内部キャリブレーションによって作成されたような飛行時間をＭ／Ｚに変換する関数が、内部キャリブラント（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃａｌｉｂｒａｎｔ）を使用しないで飛行時間スペクトルに適用される。
【００９８】
ベースライン減算は、スペクトルを乱す、人工的で再現可能な装置のオフセットを排除することによりデータの定量化を改善する。これは、ピーク幅のようなパラメータを組み入れるアルゴリズムを用いてスペクトルベースラインを算出し、次にマススペクトルからそのベースラインを差し引くことに関連する。
高周波ノイズ信号は、平滑化関数を適用することにより排除される。典型的な平滑化関数は、移動平均機能を各時間依存性ビン（ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｎ）に適用される。改良版では、移動平均フィルターは、例えばピークバンド幅の関数としてフィルターのバンド幅が異なる可変幅のデジタルフィルターであり、一般に飛行時間が増加するにつれて広くなる（例えば、国際公開第ＷＯ ００／７０６４８号明細書、２０００年１１月２３日（Ｇａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｗｉｄｔｈ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｆｉｌｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”）参照）。
【００９９】
コンピュータは、得られたスペクトルを、ディスプレイのための様々なフォーマットに変換することができる。「スペクトル図又は保持マップ（ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｖｉｅｗ ｏｒ ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｍａｐ）」と呼ばれる一つのフォーマットでは、標準スペクトル図を表示することができ、その中でその図は、特定の分子量ごとに検出器に到達した検体の量を示す。「ピークマップ」と呼ばれる他のフォーマットでは、スペクトル図からピークの高さ及び質量の情報のみが保持され、よりきれいな画像を生み出し、ほぼ同じ分子量を持つ検体をより簡単に認識することができる。「ゲル図」と呼ばれるさらに他のフォーマットでは、それぞれのピークの高さに基づいて、ピーク図からのそれぞれの質量を濃淡画像に変換することができ、その結果、外観が電気泳動ゲル上のバンドのように見える。「３Ｄオーバーレイ」と呼ばれるさらに他のフォーマットでは、相対的なピークの高さのわずかな変化を観察するために、いくつかのスペクトルを重ね合わせることができる。「相違マップ図」と呼ばれるさらに他のフォーマットでは、独特の検体及びサンプル間において上方制御あるいは下方制御される検体を簡便に強調表示することにより、２つ以上のスペクトルを比較することができる。
【０１００】
分析は一般に、検体からの信号を表すスペクトルにおけるピークの同定に関連する。ピークの選択は、もちろん視覚的に行うことができる。しかし、ピークの検出を自動化することができるサイファージェンのＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）ソフトウェアの一部としてソフトウェアを利用することができる。一般に、このソフトウェアは、選択された閾値よりも高い信号対雑音比を持つ信号を同定し、ピーク信号の中心にあるピークの質量を標識することにより機能する。一つの有用な適用では、選択されたある割合のマススペクトル中に存在する同一のピークを同定するために、多くのスペクトルが比較される。このソフトウェアの一つのバージョンは、指定された質量範囲内の様々なスペクトル中に現れた全てのピークを集めて、質量（Ｍ／Ｚ）集団の中間点に近い全てのピークに、質量（Ｍ／Ｚ）を付与する。
【０１０１】
１つ以上のスペクトルからのピークデータは、例えば、各行が特定のマススペクトルを表し、各列がその質量により規定されたスペクトルのピークを表し、各セルがその特定のスペクトルにおけるピークの強度を含む集計表を作製することにより、さらに分析することができる。様々な統計的アプローチ又はパターン認識的アプローチをそのデータに適用することができる。
本発明の実施の形態で生成されたスペクトルは、分類モデルを使用するパターン認識処理を用いて分類することができる。一般に、スペクトルは少なくとも二つの異なるグループからのサンプルを表し、そのための分類アルゴリズムが探求される。そのグループは、例えば病的対非病的（例えば、癌対非癌）、薬物反応者対薬物非反応者、毒性反応対非毒性反応、病期が進行する人対病期が進行しない人、表現型条件がある人対表現型条件がない人等が挙げられる。
【０１０２】
ある実施の形態では、「公知のサンプル」のようなサンプルを用いて生成されたスペクトル（例えばマススペクトル又は飛行時間スペクトル）から得られたデータは、次に分類モデルを「訓練（ｔｒａｉｎ）」するために使用することができる。「公知のサンプル」は事前に分類されたサンプルである。スペクトルから得られ、分類モデルを作成するために使用されるデータは、「トレーニングデータセット」と呼ぶことができる。いったん訓練されると、分類モデルは、未知のサンプルを用いて生成されたスペクトルから得られたデータのパターンを認識することができる。この分類モデルは、次に未知のサンプルをいくつかのクラスに分類するために使用することができる。これは、例えばある生体サンプルが、特定の生物学的条件（例えば罹患している対罹患していない）に関連しているかどうかを予測するのに有用であるかもしれない。
【０１０３】
分類モデルを作成するために使用されるトレーニングデータセットは、生データ又は事前に処理されたデータより構成されてもよい。ある実施の形態では、生データは飛行時間スペクトル又はマススペクトルから直接得ることができ、次いで、状況に応じて上記のようにそれを「事前に処理」してもよい。
分類モデルは、データ中に存在する目的のパラメータに基づいてデータ本体をクラスに分類しようとする任意の適切な統計的な分類（又は「学習」）法を用いて作成することができる。分類法は、教師付きでも教師なしでもどちらでもよい。教師付き分類及び教師なし分類処理の例は、Ｊａｉｎ，“Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”，ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ ２０００に記述されている。
【０１０４】
教師付き分類では、公知のカテゴリーの例を含むトレーニングデータが、公知のクラスをそれぞれ規定する１セット以上の関連性を学習する学習機構に提供される。新しいデータは学習機構に適用されてもよく、次に学習された関連性を用いてその新しいデータを分類する。教師付き分類処理としては、例えば、線形回帰処理（例えば、多重線形回帰（ＭＬＲ）、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰、及び主成分回帰（ＰＣＲ））、二分決定木（例えば、ＣＡＲＴ（分類木と回帰木）のような再帰的分割処理）、バックプロパゲーション・ネットワークのような人工神経ネットワーク、判別分析（例えば、ベイズ分類器（Ｂａｙｅｓｉａｎ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）又はフィッシャー分析）、ロジスティック分類器（ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）及びサポート・ベクトル分類器（Ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅ）が挙げられる。
【０１０５】
好ましい教師付き分類法は、再帰的分割処理である。再帰的分割処理は、未知のサンプルから得られるスペクトルを分類するために再帰的分割木が用いられる。再帰的分割処理については、米国特許仮出願公開第６０／２４９，８３５号明細書（出願日：２０００年１１月１６日）及び第６０／２５４，７４６号明細書（出願日：２０００年１２月１１日）及び米国特許本出願公開第０９／９９９，０８１号明細書（出願日：２００１年１１月１５日）及び第１０／０８４，５８７号明細書（出願日：２００２年２月２５日）にさらに詳しく説明されている。これら全ての米国特許仮出願及び本出願は、あらゆる目的で、本明細書にそのまま参照として取り込まれる。
【０１０６】
他の実施の形態では、作成される分類モデルを、教師なし学習法を用いて作成することができる。教師なし分類法は、トレーニングデータセットが得られたスペクトルを事前に分類しないで、トレーニングデータセットにおける類似性に基づいて分類法を学習しようとする。教師なし学習法はクラスター分析を含む。クラスター分析はデータを「集落（クラスター）」すなわち、理想的には互いに非常に似ており、他の集落の要素とは非常に異なっている要素を有するグループに分類しようとする。次に、データアイテム間の距離を測定するある距離メトリックを用いて類似性を測定し、互いに距離が近いデータアイテムを集めて集落にする。クラスタリングの方法としては、ＭａｃＱｕｅｅｎのＫ−平均アルゴリズム及びＫｏｈｏｎｅｎの自己組織化マップアルゴリズムが挙げられる。
【０１０７】
分類モデルは、任意の適切なデジタルコンピュータ上で作成し、使用することができる。適切なデジタルコンピュータとしては、ユニックス、ウィンドウズ（登録商標）、リナックス（登録商標）ベースのオペレーティングシステムなどの、任意の標準オペレーティングシステム又は専門オペレーティングシステムを用いるマイクロコンピュータ、ミニコンピュータ及び大型コンピュータが挙げられる。使用されるこのデジタルコンピュータは、関心があるスペクトルを生成するために使用される質量分析計と物理的に分離されていてもよいし、連結されていてもよい。
本発明の実施の形態によるトレーニングデータセット及び分類モデルは、デジタルコンピュータにより実行される、あるいは使用されるコンピュータコードにより統合することができる。このコンピュータコードは、光ディスク、磁気ディスク、スティック、テープなど、任意の適切なコンピュータ可読の媒体に保存することができ、且つＣ，Ｃ＋＋、ビジュアルベーシックなどの、任意の適切なコンピュータプログラミング言語で書き込むことができる。
【０１０８】
マーカーの脱離及び検出により作成されたデータは、任意の適切な手段を用いて分析することができる。一つの実施の形態では、プログラム可能なデジタルコンピュータを利用して、データが分析される。コンピュータプログラムは一般にコードを保存する可読媒体を含む。あるコードは、プローブ上のそれぞれの特徴づけるものの場所、その特徴づけるものに対する吸着剤の同一性及びその吸着剤を洗浄するために用いられる溶離条件を含むメモリーに専念することができる。また、コンピュータもインプットとして、プローブ上の特定のアドレス可能な場所から受け取る、様々な分子質量に対する信号の強度に関するデータを受け取るコードを含む。このデータは、各マーカーにより生成された信号の強度を含み、検出されたマーカーの数を示すことができる。
【０１０９】
データ分析は、検出されるマーカーの信号強度（例えばピークの高さ）を決定する工程及び「外れ値」（所定の統計的分布から逸脱したデータ）を取り除く工程を含むことができる。観察されたピークは正規化することができ、それによりある基準に対するそれぞれのピークの高さが算出される。例えば、基準は装置や化学物質（例えばエネルギー吸収分子）により生成されたバックグラウンドノイズとすることができる。これはスケールにおいてゼロに設定される。次に各マーカー又は他の生体分子について検出された信号強度を所望のスケール（例えば１００）における相対強度の形で表示することができる。あるいは、サンプルについて標準品（例えば血清タンパク質）を承認し、各マーカー又は他の検出されるマーカーについて観察される信号の相対強度を算出するために、その標準品のピークを基準として用いることができる。
【０１１０】
コンピュータは、得られたデータを、ディスプレイのための様々なフォーマットに変換することができる。「スペクトル図又は保持マップ（ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｖｉｅｗ ｏｒ ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｍａｐ）」と呼ばれる一つのフォーマットでは、標準スペクトル図を表示することができ、その中でその図は、特定の分子量ごとに検出器に到達したマーカーの量を示す。「ピークマップ」と呼ばれる他のフォーマットでは、スペクトル図からピークの高さ及び質量の情報のみが保持され、よりきれいな画像を生み出し、ほぼ同じ分子量を持つマーカーをより簡単に認識することができる。「ゲル図」と呼ばれるさらに他のフォーマットでは、それぞれのピークの高さに基づいて、ピーク図からのそれぞれの質量を濃淡画像に変換することができ、その結果、外観が電気泳動ゲル上のバンドのように見える。「３Ｄオーバーレイ」と呼ばれるさらに他のフォーマットでは、相対的なピークの高さのわずかな変化を観察するために、いくつかのスペクトルを重ね合わせることができる。「相違マップ図」と呼ばれるさらに他のフォーマットでは、独特のマーカー及びサンプル間において上方制御あるいは下方制御されるマーカーを簡便に強調表示することにより、２つ以上のスペクトルを比較することができる。任意の二つのサンプルからのマーカープロファイル（スペクトル）は、視覚的に比較してもよい。さらに他のフォーマットでは、スポットファイア・スキャタ・プロット（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ Ｓｃａｔｔｅｒ Ｐｌｏｔ）を用いることができ、これは検出されるマーカーを点でプロットし、プロットの一つの軸は検出されたマーカーの見かけの分子を示し、他方の軸は検出されたマーカーの信号強度を示す。それぞれのサンプルについて、検出されたマーカー及びサンプル中に存在するマーカーの量をコンピュータ可読媒体に保存することができる。このデータは次にコントロール（例えば、ヒト癌を検出することができない女性などのコントロール中に検出されたマーカーのプロファイル又は量）と比較することができる。
【０１１１】
Ｖ．被験動物の状態の決定
任意のバイオマーカーが個別的に、乳癌の状態の決定を補助するのに有用である。まず、被験動物のサンプル中の選択されたバイオマーカーを本明細書に記述した方法（例えば、ＳＥＬＤＩ ＩＭＡＣ−Ｎｉバイオチップ上で捕捉し、次に質量分析法により検出する）を用いて測定する。次に、その測定値を診断量又は乳癌の状態を癌に罹患していない状態から識別するコントロールと比較する。診断量は、特定のバイオマーカーが癌に罹患していない状態と比較すると、癌の状態において上方制御又は下方制御されるという本明細書での情報を反映する。当該技術分野でよく知られているように、使用される特定の診断量は、診断医の好みに応じて、診断検査の感度又は特異度が増加するように調整することができる。従って、テスト量と診断量を比較することにより、乳癌の状態が示される。
【０１１２】
個々のバイオマーカーは有用な診断マーカーであるが、バイオマーカーを組み合わせると、単独のマーカーよりも予測値が高くなることが分かっている。より具体的には、マーカーＢＣ１、ＢＣ２及びＢＣ３が、単独でも組み合わせてでも、最も高い識別力を示すバイオマーカーである。
このバイオマーカーを組み合わせて使用するためには、ロジスティック回帰アルゴリズムが有用である。テストデータより診断アルゴリズムを作成するためにＵＭＳＡアルゴリズムが特に有用である。このアルゴリズムは、Ｚ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｙｉｎｇ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｅｐａｒａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｍｉｃｒｏａａｒｙ ｄａｔａに開示されている。（Ｉｎ：Ｌｉｎ，ＳＭ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＫＦ，ｅｄｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐａｐｅｒｓ ｆｒｏｍ ＣＡＭＤＡ ’００．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００１：１２５−１３６；ａｎｄ Ｚ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｓｈｉｎｇ Ｅｘｐｅｄｉｔｉｏｎ −ａ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｆｒｏｍ ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅｓ． Ｉｎ Ｌｉｎ ＳＭ， Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＫＦ，ｅｄｓ．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＩＩ：Ｐａｐｅｒｓ ｆｒｏｍ ＣＡＭＤＡ ’０１．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００２）
【０１１３】
学習アルゴリズムは、操作者が所望する特定の特異度及び感度に合わせた多変量分類（診断）アルゴリズムを生成する。次に、乳癌の状態を決定するためにその分類アルゴリズムを使用することができる。この方法もまた、被験動物のサンプル中の選択されたバイオマーカー（例えば、マーカーＢＣ１、ＢＣ２及びＢＣ３）を測定することに関連する。これらの測定値について分類アルゴリズムを実行する。分類アルゴリズムは、乳癌の状態を示す指標スコアを生成する。
【０１１４】
以下の実施例は、例として提供されるものであり、限定することを意図していない。今まで具体的な例を提供してきたが、上記の記述は例示であって制限的なものではない。先に説明した実施の形態における任意の１つ以上の特質は、任意の方法により、本発明の任意の他の実施の形態における１つ以上の特質と組み合わせることができる。さらに、本明細書を精査すれば、本発明における多くの変形が当業者にとって明らかとなるだろう。従って、本発明の範囲は、上記の説明を参照して決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲を参照して、それらの同等物の全容とともに決定されるべきである。
本出願に引用された全ての出版物及び特許文献は、個々の出版物又は特許文献がそのように個別に示されているのと同程度のあらゆる目的で、その全内容は本明細書に参照として取り込まれる。各種の参考文献を本明細書に引用することにより、本出願者らは任意の特定の参考文献が本発明の「先行技術」であるとは認めない。
【０１１５】
実施例
概説
以下の実施例では、以下に示す材料と方法が使用された。
サンプル
遡及的血清サンプルは、臨床試験におけるジョーンズ・ホプキンス・ジョイント・コミティー（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）が承認したプロトコルに従って、ジョーンズ・ホプキンスの臨床化学血清バンクから入手した。本試験には、全部で１６９の検体が含まれた。癌グループは、異なる臨床病期（ステージ０期（ｎ＝４）、ステージＩ期（ｎ＝３８）、ステージＩＩ期（ｎ＝３７）及びステージＩＩＩ期（ｎ＝２４））の乳癌患者から１０３の血清サンプルより構成された。診断は病理学的に確認し、検体は治療前に入手した。これらの患者のうち、６名の年齢の情報が入手できなかった。残り９６名の患者の年齢は３４歳から８７歳の範囲にわたり、中央値は５６歳だった。癌に罹患していないコントロールグループは、２５名の良性の乳房疾患（ＢＮ）及び４１名の健康な女性（ＨＣ）からの血清より構成された。２１名の健康な女性からは、正確な年齢の情報を入手できなかった。残り２０名の健康な女性の年齢は３９歳から５７歳の範囲にわたり、中央値は４５歳だった。良性状態のグループの年齢は２１歳から７８歳の範囲にわたり、中央値は４８歳だった。全てのサンプルは、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１１６】
プロテインチップ分析
２０μｌの各血清サンプルに、３０μｌの８Ｍの尿素、１％のＣＨＡＰＳを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加えた。混合液は４℃で１５分間ボルテックスし、ＰＢＳで１：４０の比となるように希釈した。固定化金属アフィニティーキャプチャーチップ（ＩＭＡＣ３）は、メーカーの使用説明書（サイファージェン・バイオシステムズ社、カリフォルニア州）に従って、５０ｍＭのＮｉＳＯ４で活性化させた。５０μｌの希釈したサンプルを、９６ウェルバイオプロセッサ（サイファージェン・バイオシステムズ社、カリフォルニア州）を用いてプロテインチップアレイ上のスポットにそれぞれアプライした。プラットフォームシェーカー上で室温にて６０分間結合させた後、１００μｌのＰＢＳで５分間のアレイの洗浄を２回行い、次に１００μｌのｄＨ２Ｏで２回すばやくリンスした。風乾した後、５０％のアセトニトリル及び０．５％のトリフルオロ酢酸で調製した０．５μｌの飽和シナピン酸（ＳＰＡ）を各スポットに２回アプライした。キレート化した金属（ヒスチジン、トリプトファン、システイン又はリン酸化アミノ酸を介して）に結合したタンパク質は、ＰＢＳ−ＩＩマスリーダーで検出した。強度を２４０、検出器の感度を８にして、８０のレーザーショットを平均化することにより、データを収集した。再現性は２つの代表的な血清サンプル（一つは健常コントロールから、もう一つは癌患者から）を用いて評価した。二つのバイオプロセッサのそれぞれにおいて、一つのＩＭＡＣ−Ｎｉチップの８ベイト表面の全てに、各血清サンプルをスポットした。変動係数は、選択されたマスピークについて評価した。
【０１１７】
バイオインフォマティクス及び生物統計学
２Ｋ〜１５０Ｋ間のＭ／Ｚを有する認定されたマスピーク（Ｓ／Ｎ＞５、及び０．３％のクラスター・マス・ウィンドウ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｍａｓｓ ｗｉｎｄｏｗ））を選択し、プロテインチップ・ソフトウェア３．０（サイファージェン・バイオシステムズ社、カリフォルニア州）を用いてピーク強度を全イオン流に対して正規化した。更なる事前の処理工程は、目的のスペクトル（Ｍ／Ｚ＝２ｋＤ〜１５０ｋＤ）の全ての範囲にわたって、より一貫性のあるレベルのデータのばらつきを得るために、ピーク強度のデータに適用された対数変換が含まれた。
【０１１８】
二つの診断グループの最適な分離に対するそれぞれのピークの寄与率を計算し、ランク付けるために、ソフトウェア・パッケージ・ＰｒｏＰｅａｋ（３Ｚ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、サウスカロライナ州）を使用した。ＰｒｏＰｅａｋは、マイクロアレイデータ分析において使用したことが最初に報告された統合最大分離可能度分析（Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｐａｒａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＵＭＳＡ））アルゴリズムの線形バージョンを実行する（Ｚ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｙｉｎｇ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｐａｒａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｄａｔａ，ｉｎ Ｐｒｏｃ．ｏｆ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＡＭＤＡ ’００），Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００１）。ＵＭＳＡアルゴリズムの鍵となる特性は、二つのデータのクラスが最もよく分離される方向を同定するために、データ分布情報を構造的リスク最小化学習（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｉｓｋ ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ−ｌｅａｒｎｉｎｇ）アルゴリズムに組み入れたことである（Ｖａｐｎｉｋ ＶＮ， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｈｅｏｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８１４）。この方向は、元の変数の一次結合（加重和）として表される。この結合におけるそれぞれの変数に割り当てられた重みは、二つのデータクラスの分離に対する変数の寄与率を測定する。
【０１１９】
ＰｒｏＰｅａｋは３種のＵＭＳＡベースの分析モジュールを提供する。第一のモジュールは、それぞれの検体を個々の点として３次元の成分空間に投影する成分分析モジュールである。この成分（軸）は、元のスペクトルピーク強度の一次結合である。この軸は、二つの事前に規定したデータグループが最大の分離可能度を達成する方向に相当する。二つのデータグループ間の分離は、双方向性３Ｄディスプレイで点検することができる。第二のモジュールは、それぞれのピークについての有意性スコアを計算し、二つの事前に規定したデータグループの最大の分離に対するそれらの集積された寄与率に従ってランク付けするためのＵＭＳＡを適用するために後進ステップワイズ変数選択（ｂａｃｋｗａｒｄ ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）プロセスを用いるステップワイズ・セレクション・モジュールである。スコアの絶対値がデータ分離に対する相対的な重要度を表すのに対し、正のスコア及び負のスコアは、罹患グループについて相当するマスピークの発現レベルが相対的に増加した及び減少したことをそれぞれ示す。データ中の関係のないアーティファクトのみに基づいたピークの選択を避けるために、第三のＰｒｏＰｅａｋのモジュール、すなわちブートストラップは、毎回両方のグループから定率のサンプルをランダムに除去する操作を複数回実行するためのＵＭＳＡを繰り返すブートストラップ手順を使用する。中央値及び平均ランク、及び相当する標準偏差がピークごとに推定される。有望なバイオマーカーは、中央値及び平均ランクが上位であり、標準偏差のランクが最小であるピークであるべきである。目的物の選択基準を確立する方法としては、同じブートストラップ手順が、実際のデータの分布をピークからピークへ順次シミュレートするランダムデータセットにも適用される。一貫性のある成績を有するピークを選択するための標準偏差のランクに関する統計的に適切なカットオフ値を設定するために、実際のデータからの結果をシミュレートされたデータからのものと比較する。
【実施例１】
【０１２０】
乳癌を早期段階で検出するバイオマーカーの同定
乳癌を早期段階で検出することができる有望なバイオマーカーを同定するために、ステージ０〜Ｉ期の乳癌患者からの検体のタンパク質プロファイルを癌に罹患していないコントロールのものと比較した。分析は、ＰｒｏＰｅａｋの三種全てのモジュールを用い、複数回繰り返して行った。この繰り返しの過程で、元の完全なスペクトルは、二つの選択された診断グループ間の最適な分離において高レベルの有意性を一貫して実証するマスピークの小さいサブセットまでに削減された。
【０１２１】
バイオマーカーの小さいパネルを選択し、ステージＩＩ期及びＩＩＩ期の癌患者からのデータを用いて、そのマーカーの乳癌検出能を個別的に試験した。その全部のデータセットに基づいて、多変量ロジスティック回帰を用いて複合指数を導き出した。二標本ｔ検定からのｐ値を含む記述統計を推定した。次に、選択されたバイオマーカーと複合指数について受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を実行した。ブートストラップ手順を用いて、感度及び特異度のような複合指数の成績評価基準を推定した（Ｅｆｒｏｎ Ｂ ａｎｄ Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ Ｒ．Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｅｒｒｏｒｓ，Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｖａｌｓ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｍｅａｓｕｒｅｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｃｃｕｒａｃｙ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８６；１：５４−７５）。この手順では、感度及び特異度を計算するためのロジスティック回帰及びテストセットにより複合指数を導き出すために、ランダムリサンプリングにより、患者のデータセットの全てをトレーニングセットに分割した。このリサンプリングプロセスは何度も繰り返した。感度及び特異度におけるブートストラップ推定を作成するために、複数回の実行により得られた結果を最後に集約した。
【実施例２】
【０１２２】
ピーク検出及びデータ処理
ＩＭＡＣ−Ｎｉ２＋チップ上に保持された血清タンパク質は、ＰＢＳ−ＩＩマスリーダーで分析した。全部で１４７の２ＫＤを超えるＭ／Ｚを有する定量化したマスピーク（Ｓ／Ｎ＞５、及び０．３％のクラスター・マス・ウィンドウ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｍａｓｓ ｗｉｎｄｏｗ））を選択した。２ＫＤに満たないＭ／Ｚのピークは、マトリックスからの干渉を排除するために除外される。オール・イン・１・プロテイン標準品（Ａｌｌ Ｉｎ １ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（サイファージェン・バイオシステムズ社、カリフォルニア州））を用いて外部キャリブレーションにより０．１％の質量の正確性が達成された。このような分析から得られた代表的なスペクトルを図２に示す。対数変換をピーク強度値に適用した。図３のプロットは、対数変換によるばらつき低減及び同等化の効果を示す。
【実施例３】
【０１２３】
早期癌及び癌に罹患していないコントロールに基づくバイオマーカーの選択
乳癌を早期に検出する可能性があるバイオマーカーを同定するために、早期癌の罹患者を陽性グループ（ステージ０〜Ｉ期、ｎ＝４２）及び癌に罹患していないコントロールを陰性グループ（ＨＣ＋ＢＮ、ｎ＝６６）として用い、ＵＭＳＡを実行した。まず、１４７のマスピーク全ての一次結合から導き出されたＵＭＳＡを用いて、二つのグループ間の分離可能度を試験した。早期癌は、全てのタンパク質プロファイルを比較した際に、癌に罹患していないグループから分離することができた。図４Ａは、ＵＭＳＡ成分３Ｄ空間における早期癌に罹患しているグループ（淡色）と癌に罹患していないグループ（濃色）をプロットしたものである。
一貫して良い成績を示すバイオマーカーを選択するために、ＰｒｏＰｅａｋブートストラップモジュールを用いてＵＭＳＡを繰り返し適用し、毎回３０％の除外率で合計１００回行った。同様の手順を、シミュレートされたランダムデータセットにも適用した。シミュレートされたデータから導き出された最小標準偏差は７だった。実験データでは、１５のマスピークがこの値よりも小さい標準偏差を有していた。このマスピークのサブセットは、さらに分析するために、候補バイオマーカーとして選択した。これらの平均ランク及び相当する標準偏差をプロットしたものを図４に示す。
【０１２４】
この削減された候補バイオマーカーのセットについて、それらのピークをさらにランク付けるために、ＰｒｏＰｅａｋのステップワイズ・セレクション・モジュールを適用した。１５のピーク（表４参照）における相対的有意性スコアの絶対値を降順にプロットしたものを図８Ａに示す。これにより、最初の６つのピークが二つのグループ間の大部分の分離可能度に寄与していることが分かる。これらの６つのピークのうち４つが特徴的である。他の２つは、その特徴的なピークのうちの２つの二重荷電の形態であることが、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐソフトウェア３．０を用いて確認された。このピークの二重荷電の形態と１重荷電の形態の両方の認識は、それらがその選択された２つの診断グループを識別するのに重要であることを示唆する。この二重荷電の形態を取り除き、４つの特徴的なピークを再結合し、ステップワイズ・セレクションを用いて再び評価した。再び算出した相対的有意性スコアをプロットしたものを図６Ｂに示す。上位スコアの３つのピーク（ＢＣ１、ＢＣ２及びＢＣ３と称される）は、最終的に乳癌の検出に有望なバイオマーカーとして選択された。ＢＣ１は下方制御（スコア値が負）され、ＢＣ２及びＢＣ３は上方制御（スコア値が正）されているように観察された。これら３種のバイオマーカーを用いたステージ０〜Ｉ期の乳癌と癌に罹患していないコントロールとを比較する３Ｄプロットを図４Ｂに示す。
【実施例４】
【０１２５】
選択されたバイオマーカーの評価
これら３種のバイオマーカーの記述統計を表１に記載する。図７はＲＯＣ分析の結果を示す。この３種のバイオマーカーのうち、ＢＣ３が最も個別的な診断力を示した。癌患者の臨床病期を含む診断グループにわたるＢＣ３の寄与をプロットし、これを図８Ａに示す。診断グループを識別するために、０．８のカットオフ値でＢＣ３のみを用いた際の感度及び特異度を表２Ａに記載する。
対数変換したピーク強度の推定ＣＶは、ＢＣ１については６％、ＢＣ２については７％、そしてＢＣ３については１３％だった（データは図示せず）。この３種のバイオマーカーのうち、ＢＣ３が最も高い１３％のＣＶを有していた。これに対し、癌患者におけるＢＣ３の平均値は、癌に罹患していないコントロールの平均値よりもほぼ９０％高かった（表１のデータの基づいて算出）。
【０１２６】
【表１】
【実施例５】
【０１２７】
３種の選択されたバイオマーカーを組み合わせた使用
図９は、ペアにしたバイオマーカーの全ての組み合わせにおける、癌に罹患していないコントロールに対する全臨床病期の癌患者の分布を比較したものである。この観察に基づいて、３種の選択されたバイオマーカーを組み合わせるために多変量ロジスティック回帰を使用し、単一値の複合指数を作成した。この複合指数の記述統計は、表１に付加する。様々な診断グループにわたる分布をプロットし、これを図８Ｂに示す。複合指数のＲＯＣ曲線分析により、個々のバイオマーカーからのものと比較して非常に改善されたＡＵＣが提供された（図７）。
【０１２８】
複合指数の診断成績を推定するためにブートストラップ・クロスバリデーションを使用した（２０回実行；それぞれの実行において、複合指数を導出するために７０％のサンプルをランダムに選択し、残りの３０％を検査した）。推定感度及び推定特異度を表２Ｂに記載する。
また、ｐＴ（腫瘍サイズ）及びｐＮ（リンパ節転移）のカテゴリーに関して、この３種の有望なバイオマーカーのレベルも評価した。有意な相関は何もみられなかった。
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
【表３】
【実施例６】
【０１３１】
ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ及びＳＥＬＤＩ−質量分析法を用いた血清プロテオミクスの分析による乳房の上皮内癌の検出
乳癌を有している及び有していない女性からの１６９の血清サンプルのタンパク質プロファイルを分析し、３種のタンパク質（８．９ＫＤ、８．１ＫＤ、４．３ＫＤ）のパネルが、組み合わせて使用することにより、高い感度（ステージ０〜ＩＩＩ期：９３％）及び高い特異度（健康なコントロール＋良性：９１％）で乳癌を検出することができることを確認した。この３種のマーカーのうち、８．９ＫＤのタンパク質が最も良い成績を示し、８５％の感度及び９１％の特異度を達成した。
【０１３２】
非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）及び上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）は、非浸潤性乳癌における最初期の形態（ステージ０期）である。この早期において乳癌であると診断された女性はほとんど１００％治療することができる。乳癌の早期検出についてこれらのマーカーをバリデートするために、共同研究している機関により収集された血清を用いてこの３種の事前に同定されたバイオマーカーの能力を評価した。このサンプル集団は、１７名のＤＣＩＳを有する女性、１名のＬＣＩＳを有する女性、８名の良性乳癌を有する女性及び４０名の年齢をマッチングした、外見上健康なコントロール（４５〜６５歳）から構成された。タンパク質プロファイルは、ＩＭＡＣ−Ｎｉ（固定金属アフィニティーキャプチャー）プロテインチップアレイを用い、上記と同じ実験条件下で３つ作成した。二標本ｔ検定を用いて、３種のタンパク質のそれぞれについての対数の相対強度を異なる診断グループ間で比較した。３つのマーカーのうち二つ（８．９ＫＤ及び８．１ＫＤ）の発現パターンは前の結果と一致した。これら２つのバイオマーカーのｐ値及びＲＯＣ曲線下面積を表３にまとめた。
【０１３３】
【表４】
【０１３４】
本発明を特定の実施の形態を参照して詳しく説明したが、当然のことながら、当業者はこの開示を考慮して、本発明の精神及び範囲内で改変を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１Ａ〜ＮはマーカーＩ〜ＸＩＶのマススペクトルをそれぞれ示したものである。これらの図の中で、指定されたマーカーのマススペクトルピークは、矢印で示されたスペクトルの範囲内に示される。図の表示は、参照されるスペクトルの上にそれぞれ配置される。
【図２】ＩＭＡＣ−Ｎｉ２＋チップ上に保持された血清タンパク質のＳＥＬＤＩ分析より得られた代表的な質量ピークスペクトルを示したものである。上段はスペクトル図を示し、下段は４，０００〜１０，０００間のＭ／Ｚ（質量依存速度）の同じスペクトルにおける疑似ゲル図を示す。
【図３】データのばらつきの削減及び平衡化における対数変換の結果を示したものである。
【図４】癌に罹患していないコントロール（白抜き四角）に対する乳癌（黒い四角）のステージ０〜Ｉ期についての三次元ＵＭＳＡ成分プロットを示したものである。 図４Ａは、全１４７ピークにおける線形結合より導き出されたＵＭＳＡを用いて達成された分離の結果を示したものである。 図４Ｂは、三つの選択されたピークを用いた線形結合より導き出されたＵＭＳＡを用いて達成された分離の結果を示したものである。
【図５】ＰｒｏＰｅａｋブートストラップ分析より導き出された上位の平均ランクと最小ランクの標準偏差を持つ１５のピークを示すグラフである。７．０にある横線は、ランダムに作成した、元のデータの分布をシミュレートするデータセットに同じ手順を適用させて計算した最小ランクの標準偏差である。
【図６】ステージ０〜Ｉ期の乳癌と癌に罹患していないコントロールとの間の分離に対する寄与に基づいて選択されたピークについての相対的有意性スコアの絶対値のプロットを示すグラフである。 図６Ａは、ＰｒｏＰｅａｋブートストラップ分析より選択された、ランク標準偏差が７．０より小さい、１５ピークの結果を示したものである。 図６Ｂは、図５Ａより選ばれた上位４ピークを再評価したスコアを示すグラフである。
【図７】ＢＣ１，ＢＣ２及びＢＣ３の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析及びロジスティック回帰より導き出された複合指数を示すグラフである。個々のバイオマーカーと複合指数とのＡＵＣ（曲線下面積）比較より得られたｐ値は、図中に記載した。
【図８】癌患者の臨床病期を含む全ての診断グループにわたる、選択されたバイオマーカー（又はマーカー群）の分布を示す散乱プロットである。 図８Ａは、ＢＣ３のみを用いて得られた結果を示す散乱プロットである。 図８Ｂは、ＢＣ１，ＢＣ２及びＢＣ３を用いた、ロジスティック回帰より導き出された複合指数の結果を示す散乱プロットである。
【図９】全ての患者サンプルの分布を表す２次元散乱プロットを示す３枚のパネルである。
【図１−Ａ】
【図１−Ｂ】
【図１−Ｃ】
【図１−Ｄ】
【図１−Ｅ】
【図１−Ｆ】
【図１−Ｇ】
【図１−Ｈ】
【図１−Ｉ】
【図１−Ｊ】
【図１−Ｋ】
【図１−Ｌ】
【図１−Ｍ】
【図１−Ｎ】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００２年３月６日出願された米国仮出願第６０／３６２，４７３号の利益を主張するものであり、その全内容は参照として本明細書に取り込まれる。
【０００２】
本発明は、乳癌の診断、予後、及び腫瘍の病期における進行度の同定に重要であるバイオマーカーの検出及び同定において、高い特異性及び高い感度を提供する。乳癌の患者における血漿タンパク質プロファイルは、バイオチップアレイ及びＳＥＬＤＩ分析法を用いて、腫瘍非罹患の個人から識別される。この技術は、血漿サンプルを用いて乳癌を診断するための簡単であるが感度の高い方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
米国国立癌研究所（ＮＣＩ）の罹患率、及び国立健康統計センター（ＮＣＨＳ）の死亡データに基づいて、米国癌学会は、２００２年の米国において、乳癌が女性で最も多く診断される癌となるだろうと予測した。女性における新たな癌患者のうち、乳癌は３１％（２０３，５００）の割合を占めると予想され、３９，６００人がこの病気で死亡するであろうと報告されている（Ｊｅｍａｌ Ａ，Ｔｈｏｍａｓ Ａ，Ｍｕｒｒａｙ Ｔ，Ｔｈｕｎ Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００２．ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ．２００２；５２：２３−４７）。早期癌を検出するための発症前スクリーニングを、まだ治療の可能性があると認められる期間中に行えば、乳癌に関連する死亡率を著しく減少させることができる。残念なことに、診断の時には、乳癌の約５０％しか、場所を突き止めることができない（米国国立癌研究所。Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔ ＰＤＱ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｕｍｍａｒｉｅｓ．“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ”に関するモノグラフ、ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｎｅｔ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｄｑ．ｈｔｍｌ（２００１年１月更新））。４０歳以上の女性における定期的なスクリーニング法として、マンモグラフィーの有効性とそれの利用の推奨にも関わらず、総人口に対する乳癌死亡率を減少させることにおけるその有効性は、今もなお調査中である（Ｋ．Ａｎｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ．１９９９；２８１：１４７０−２）。現在、乳癌の検出への利用について研究されている血清腫瘍マーカーは、大集団において早期の癌を検出するのに適用することができるための適切な感度及び特異性をいまだに持ち合わせていない。ＣＡ１５．３やＣＡ２７．２９のようなＦＤＡ承認腫瘍マーカーは、進行乳癌又は乳癌の再発のモニタリング治療法のためのみに推奨されている（Ｄ．Ｗ．Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．１９９７；１５：２３２２−２３２８）。単独で、又は現存の診断法と組み合わせて使用することができる、費用効率の高い乳癌のスクリーニングのための新しいバイオマーカーが、今もなお早急に求められている。
以下の参考文献もまた、本明細書に参照として取り込まれる。
【非特許文献１】Jemal A, Thomas A, Murray T., Thun M., Cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin. 2002; 52:23-47.
【非特許文献２】National Cancer Institute. Cancer Net PDQ Cancer Information Summaries. Monographs on“Screening for breast cancer.”http://cancer net. nci. nih. gov/pdq. html (Updated January ２００１年１月更新）.
【非特許文献３】Antman K, Shea S. Screening mammography under age 50. JAMA.1999; 281:1470-2.
【非特許文献４】Chan DW, Beveridge RA, Muss H, Fritsche HA, Hortobagyi G, Theriault R, et al. Use of Truquant BR Radioimmunoassay for early detection of breast cancer recurrence in patients with stage II and stage III disease, J Clin. Oncology. 1997; 15:2322-2328.
【非特許文献５】Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988; 60: 2299-2301.
【非特許文献６】Hutchens TW, Yip TT. New desorption strategies for the massspectrometricanalysis of micromolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993; 7: 576-80.
【非特許文献７】Merchant M, Weinberger SR. Recent advancements in surface-enhanced laserdesorption/ionization-time of flight-mass spectrometry. Electrophoresis. 2000; 21:1164-67.
【非特許文献８】Wright Jr GL, Cazares LH, Leung S-M, Nasim S, Adam B-L, Yip T-T, et al. ProteinChipＴＭ surface enhanced laser desorption/ionization (SELDI) mass spectrometry: a novel protein biochip technology for detection of prostate cancer biomarkers in complex protein mixtures. Prostate Cancer Prostate Dis. 1999; 2: 264-76.
【非特許文献９】Hlavaty JJ, Partin AW, Kusinitz F, Shue MJ, Stieg M, Bennett K, Briggman JV. Mass spectroscopy as a discovery tool for identifying serum markers for prostate cancer. Clin. Chem. [Abstract]. 2001; 47:1924-26.
【非特許文献１０】Paweletz CP, Trock B, Pennanen M, Tsangaris T, Magnant C, Liotta LA, et al. Proteomic patterns of nipple aspirate fluids obtained by SELDI-TOF: potential for new biomarkers to aid in the diagnosis of breast cancer. Dis Markers. 2001; 17:301- 7.
【非特許文献１１】Vlahou A, Schellhammer PF, Medrinos S, Patel K, Kondylis FI, Gong L, et al. Development of a novel proteomic approach for the detection of transitional cell carcinoma of the bladder in urine. Am J Pathol. 2001; 158:1491-502.
【非特許文献１２】Patricoin EF III, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. The Lancet. 2002; 359:572-577.
【非特許文献１３】Zhang Z, Page G, Zhang H. Applying Classification Separability Analysis to Microarray Data, in Proc. of Critical Assessment of Techniques for Microarray Data Analysis (CAMDA'00), Kluwer Academic Publishers, 2001.
【非特許文献１４】Vapnik VN, Statistical Learning Theory, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1998.
【非特許文献１５】Efron B and Tibshirani R. Bootstrap Methods for Standard Errors, Confidence Intervals, and Other Measures of Statistical Accuracy. Statistical Science. 1986; 1:54- 75.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、異なる臨床病期における腫瘍サンプル中に異なった形で存在する、新しいタンパク質マーカーを初めて提供するものである。患者のサンプルにおけるこれらのマーカーの測定値は、単独であるいは組み合わせて、診断医がヒト癌の異なる臨床病期における予想される診断と相関することができる情報を提供する。これは、浸潤前癌についてのバイオマーカーを同定しようとする際に特に重要であり、したがって、このような診断は生命を救うと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のタンパク質マーカーは、いくつかの点において特徴付けることができる。
特に、一つの態様では、本発明のマーカーは、本明細書で特定されている条件下で、特にマススペクトル分析により決定されるような分子量によって特徴づけられる。
他の態様では、当該マーカーは、マーカーのスペクトルピークの大きさ（面積を含む）及び／又は形のようなマーカーのマススペクトル・シグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の特性、隣接するピークの近接性、大きさ及び形を含む特性等により特徴付けることができる。
さらに他の態様では、当該マーカーは、親和性結合特性、特に特定の条件下におけるＩＭＡＣ−Ｎｉ吸着剤に対する結合力により特徴付けることができる。
好ましい実施の形態では、本発明のマーカーは、このような態様、すなわち分子量、マススペクトル・シグネチャー、及びＩＭＡＣ−Ｎｉ吸着結合のそれぞれによって特徴付けることができる。
本発明のタンパク質バイオマーカーは、本明細書において、マーカーＩ〜ＸＩＶとして指定された以下のものを含む。質量分析法により測定された分子量もまた、各マーカーについて特定される。
マーカーＩ（ＢＣ１）：約４．３ｋＤの分子量を持つ
マーカーＩＩ（ＢＣ２）：約８．１ｋＤの分子量を持つ
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）：約８．９ｋＤの分子量を持つ
マーカーＩＶ：約４．５ｋＤの分子量を持つ
マーカーＶ：約４．０ｋＤの分子量を持つ
マーカーＶＩ：約８．３ｋＤの分子量を持つ
マーカーＶＩＩ：約１７ｋＤの分子量を持つ
マーカーＶＩＩＩ：約１８ｋＤの分子量を持つ
マーカーＩＸ：約１０．２ｋＤの分子量を持つ
マーカーＸ：約６．０ｋＤの分子量を持つ
マーカーＸＩ：約８．４ｋＤの分子量を持つ
マーカーＸＩＩ：約７．５ｋＤの分子量を持つ
マーカーＸＩＩＩ：約９．４ｋＤの分子量を持つ
マーカーＸＩＶ：約１６．３ｋＤの分子量を持つ
マーカーＩ〜ＸＩＶも、マススペクトル・シグネチャーにより特徴付けられる。マーカーＩ〜ＸＩＶのそれぞれのマススペクトルを、図１Ａ〜１Ｎにそれぞれ示す。
また、マーカーＩ〜ＸＩＶのそれぞれも、本明細書に明記しているように、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、ＩＭＡＣ−Ｎｉ吸着剤との結合力により特徴付けられる。
【０００６】
一つの態様では、本発明は、
（ａ）被験動物からのサンプルについて、少なくとも１種のバイオマーカーを測定すること、
（ただし、このマーカーは、マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）、マーカーＩＶ、マーカーＶ、マーカーＶＩ、マーカーＶＩＩ、マーカーＶＩＩＩ、マーカーＩＸ、マーカーＸ、マーカーＸＩ、マーカーＸＩＩ、マーカーＸＩＩＩ、マーカーＸＩＶ、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される）、及び
（ｂ）この測定値と乳癌の状態とを相関させること、
からなる被験動物の乳癌の状態を認定する方法を提供する。ある方法では、当該測定工程はサンプル中のマーカーの有無を検出することからなり、他の方法では、当該測定工程はサンプル中のマーカー（又はマーカー群）の量を測定することからなり、他の方法では、当該測定工程はサンプル中のバイオマーカーのタイプを認定することからなる。
ある方法では、当該測定工程はサンプル中のマーカーの有無を検出することからなり、他の方法では、当該測定工程はサンプル中のマーカー（又はマーカー群）の量を測定することからなり、他の方法では、当該測定工程は、サンプル中のバイオマーカーのタイプを認定することからなる。
【０００７】
また、本発明は、当該測定工程が、血液又は血液由来物質である被験動物のサンプルをタンパク質バイオマーカーと結合する捕捉試薬からなる基質の表面に沈着させることからなる方法にも関する。被験動物のサンプルは、状況に応じて、そのような沈着工程の前に分画（例えばｐＨ勾配において）してもよく、その回収され、及び選択されたフラクションを当該基質に沈着させてもよい。当該血液由来物質としては、例えば血清や血漿が挙げられる。好ましい実施の形態では、当該基質はＩＭＡＣ−Ｎｉ表面からなるＳＥＬＤＩプローブであり、その中で当該タンパク質バイオマーカーがＳＥＬＤＩにより検出される。他の実施の形態では、当該基質は、上記のように同定されたマーカーＩ〜ＸＩＶなどに結合する生体特異的親和性試薬からなるＳＥＬＤＩプローブであり、その中で当該タンパク質バイオマーカーがＳＥＬＤＩにより検出される。他の実施の形態では、当該基質は、上記のように同定されたマーカーＩ〜ＸＩＶのうち１種以上と結合する生体特異的親和性試薬からなるマイクロタイタープレートであり、その１種以上のタンパク質バイオマーカーが免疫測定法により検出される。
【０００８】
ある実施の形態で、当該方法は、さらに当該方法により決定された状態に基づいて、被験動物の治療を管理することからなる。例えば、本発明の方法の結果が結論に達しない、もしくは状態の確認が必要であるという根拠がある場合、医師はさらに検査をするよう命令することができる。また、状態が手術が妥当であることを示す場合は、医師は患者の手術を計画することができる。同様に、検査の結果が陽性である、例えば状態が末期の乳癌である場合、あるいは、さもなければ状態が深刻である場合、更なる措置は何ら是認されないとすることができる。さらに、その結果が、治療が成功したことを示す場合、更なる管理は必要ないとすることができる。
また本発明は、被験動物の管理後、少なくとも１種のバイオマーカーを再び測定する方法も提供する。このような場合、被験動物の治療を管理する工程は、その後得られた結果に応じて繰り返され、及び／又は変更される。
【０００９】
「乳癌の状態」という用語は、患者の疾病の状態のことをいう。乳癌の状態の種類は、例えば被験動物の癌のリスク、疾病の有無、患者の疾病の病期、及び疾病の治療の有効性を含むが、これに限定されない。他の状態及びそれぞれの状態の程度は当該技術分野で周知である。
本発明のマーカーは、各種の分画技術、例えば、質量分析法と併用したクロマトグラフ分離法を用いることにより、あるいは従来の免疫測定法により、サンプル中の他のタンパク質から分離することができる。好ましい実施の形態では、当該分離方法は、質量分析プローブの表面が当該マーカーと結合する吸着剤からなる表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析に関連する。
【００１０】
他の好ましい実施の形態では、比較タンパク質プロファイルが、乳癌であると診断された患者、及び公知の腫瘍性疾患に罹患していない患者から、プロテインチップ・バイオマーカー・システムを用いて作成される。バイオマーカーの一部は、教師付き分析法より得られた共同研究の結果に基づいて選択された。好ましい分析法は、統合最大分離可能度分析（Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｐａｒａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ （ＵＭＳＡ））アルゴリズムの線形バージョンを実行するＰｒｏＰｅａｋ（３Ｚ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，サウスカロライナ州）、及びバイオマーカー・パターン・ソフトウェアＶ４．０（ＢＰＳ）（サイファージェン、カリフォルニア州）において実行される分類木と回帰木法（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｒｅｅ（ＣＡＲＴ））が挙げられる。
好ましい実施の形態では、この分析法は、乳癌の患者と癌に罹患していないコントロール間の識別に最も寄与しているピークを選別するために、単独で及び相互に比較して用いられる。
【００１１】
他の態様では、当該バイオマーカーは精製され、同定された。選択されたバイオマーカーは、腫瘍マーカーであるＣＡ１５．３とＣＡ２７．２９と共に、多変量ロジスティック回帰により、個別に及び組み合わせて評価された。
これらのマーカーの絶対的な正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）はまだ分かっていないが、このような知識は、患者のサンプル中のマーカーを測定するのに必要ではない。なぜなら、マーカーは、例えば、質量や親和性により十分特徴付けられるからである。分子量及び結合性がこれらのマーカーの特徴であり、検出もしくは単離の手段を制限するものではないことを特筆しておく。さらに、本明細書で記述されている方法又は当該技術分野で周知である他の方法を用いて、当該マーカーの絶対的な正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を決定することができる。
【００１２】
癌の検出及び診断における好ましい方法は、被験動物のサンプル中の、少なくとも１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出すること、及びこの１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出と癌の診断とを相関させることからなる。ただし、その相関は、それぞれの診断において正常な被験動物と比較しながら、１種以上のバイオマーカーの検出を考慮し、また、当該１種以上のタンパク質マーカーは、マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）、マーカーＩＶ、マーカーＶ、マーカーＶＩ、マーカーＶＩＩ、マーカーＶＩＩＩ、マーカーＩＸ、マーカーＸ、マーカーＸＩ、マーカーＸＩＩ、マーカーＸＩＩＩ、マーカーＸＩＶ、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。
検出における好ましい方法では、乳癌の臨床病期についての診断及び決定は、被験動物のサンプル中の、少なくとも１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出すること（ただし、当該タンパク質マーカーは、マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）、及びこれらの組み合わせから選択される）、及びこの１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出と乳癌の診断とを相関させること（ただし、その相関は、それぞれの診断において正常な被験動物と比較しながら、１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出を考慮する）からなる。
【００１３】
検出における好ましい方法では、乳癌の最初期の臨床病期についての診断及び決定は、被験動物のサンプル中の、少なくとも１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出すること（ただし、当該タンパク質マーカーは、マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）、及びこれらの組み合わせから選択される）、及びこの１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出と乳癌の診断とを相関させること（ただし、その相関は、それぞれの診断において正常な被験動物と比較しながら、１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出を考慮する）からなる。当該マーカーは、乳癌の最も早い段階であるステージ０期にて検出されるのが好ましい。当該マーカーを早期に検出する感度及び特異度を示す結果は、以下に示す実施例に記述する。
【００１４】
他の好ましい実施の形態では、複数の当該バイオマーカーが検出され、好ましくは少なくとも１種の当該バイオマーカーが検出され、より好ましくは少なくとも２種の当該バイオマーカーが検出され、最も好ましくは、少なくとも３種の当該バイオマーカーが検出される。最も好ましいマーカーを以下に示す。
マーカーＩ（ＢＣ１）：約４．３ｋＤの分子量を持つ
マーカーＩＩ（ＢＣ２）：約８．１ｋＤの分子量を持つ
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）：約８．９ｋＤの分子量を持つ
癌の異なる悪性度を診断及び識別するための好ましい方法では、当該方法は、生物学的マーカーの第一セットを表す第一データセットを作成するために、バイオチップアレイを用いること、被験動物のサンプル中の少なくとも１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出する第一データセットを評価すること、及び正常な被験動物と比較しながら、１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出と癌の進行性悪性度とを相関させることからなる。
本発明の一つの態様では、当該方法は、癌の異なる悪性度を診断及び識別するために使用される１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出することからなる。ただし、当該１種以上のタンパク質マーカーは、マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）、マーカーＩＶ、マーカーＶ、マーカーＶＩ、マーカーＶＩＩ、マーカーＶＩＩＩ、マーカーＩＸ、マーカーＸ、マーカーＸＩ、マーカーＸＩＩ、マーカーＸＩＩＩ、マーカーＸＩＶ、及びこれらの組み合わせより選択される。
【００１５】
他の態様では、本発明は、乳癌の異なる悪性度を診断及び識別する方法を提供する。当該方法は、被験動物のサンプル中の少なくとも１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出すること、及びこの１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出と乳癌の診断とを相関させることからなる。ただし、その相関は、それぞれの診断において正常な被験動物と比較しながら、１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出を考慮する。
本発明の他の態様では、癌の異なる悪性度を識別するために１種のバイオマーカーが使用される。また、癌を診断するための公知の癌バイオマーカー、例えば乳癌のマーカーであるＣＡ１５．３及びＣＡ２７．２９を１種以上組み合わせて、癌の異なる悪性度を識別するための１種のバイオマーカーも提供する。乳癌のような癌に罹患しやすい、あるいは癌に罹患している患者からのタンパク質プロファイルと正常な被験動物のものと比較するために、１種以上のタンパク質バイオマーカーを使用するのが好ましい。
本発明の他の態様では、患者のサンプルが、血液、血漿、血清、尿、組織、細胞、器官及び膣液からなる群より選択される。
【００１６】
好ましい検出方法は、バイオチップアレイを用いることを含む。本発明に有用なバイオチップアレイとしては、タンパク質アレイ及び核酸アレイが挙げられる。１種以上のマーカーを当該バイオチップアレイに固定化し、そのマーカーの分子量を検出するためにそれをレーザーイオン化する。マーカーの分析は、例えば、全イオン流に対して正規化される許容限界強度（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）に対する当該１種以上のマーカーの分子量による。ピーク強度の範囲を減少させるために対数変換を用いて、検出するマーカーの数を制限するのが好ましい。
他の好ましい方法では、バイオチップアレイに固定化した被験動物のサンプルについてのデータは、前記のバイオチップアレイをレーザーイオン化して、質量／電荷比の信号強度を検出し、そのデータをコンピュータに読み込み可能な形式に変換し、乳癌に罹患している患者に存在し、癌に罹患していない被験動物コントロールには存在しないマーカーを表す信号を検出するためのユーザー・インプット・パラメータに従って、そのデータを分類するアルゴリズムを実行することにより作成される。
好ましくは、当該バイオチップの表面は、例えばイオン性、アニオン性であり、陽イオン及び陰イオンの混合物からなる固定化されたニッケルイオンからなり、１種以上の抗体、一本鎖又は二本鎖の核酸より構成され、タンパク質、ペプチド又はそれらのフラグメントあるいはアミノ酸プローブより構成され、あるいはファージ・ディスプレイ・ライブラリーより構成される。
【００１７】
他の好ましい方法では、レーザー脱離／イオン化質量分析法を用いて１種以上の当該マーカーが検出される。この方法は、吸着剤が結合した質量分析計の使用に適したプローブを供与すること、被験動物のサンプルをその吸着剤に接触させること、当該マーカー又はマーカー群を当該プローブから脱離及びイオン化すること、及び質量分析計を用いてその脱離／イオン化されたマーカーを検出することからなる。
レーザー脱離／イオン化質量分析法は、吸着剤が結合した基質を供与すること、被験動物のサンプルをその吸着剤に接触させること、吸着剤が結合した質量分析計の使用に適したプローブにその基質を設置すること、当該マーカー又はマーカー群をプローブから脱離及びイオン化すること、及び質量分析計を用いてその脱離／イオン化されたマーカー又はマーカー群を検出することからなるのが好ましい。
【００１８】
他の態様では、乳癌の診断をさらに補助するために、以下に示す種々の組成物が提供される：
マーカーＩ及びマーカーＩＩ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＩＩ及びマーカーＩ，ＩＩＩ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＩＩＩ及びマーカーＩ，ＩＩ、ＩＶ〜ＸＩＶより選択される少なくとも一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＩＶ及びマーカーＩ，ＩＩ、ＩＩＩ，Ｖ〜ＸＩＶより選択される少なくとも一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＶ及びマーカーＩ，ＩＩ、ＩＩＩ，ＩＶ、ＶＩ〜ＸＩＶより選択される少なくとも一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＶＩ及びマーカーＩ，ＩＩ、ＩＩＩ，ＩＶ、Ｖ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＶＩＩ及びマーカーＩ，ＩＩ、ＩＩＩ，ＩＶ、Ｖ、ＶＩ，ＶＩＩＩ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＶＩＩＩ及びマーカーＩ，ＩＩ、ＩＩＩ，ＩＶ、Ｖ、ＶＩ，ＶＩＩ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＩＸ及びマーカーＩ，ＩＩ、ＩＩＩ，ＩＶ、Ｖ、ＶＩ，ＶＩＩ，ＶＩＩＩ，Ｘ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＸ及びマーカーＩ〜ＩＸ，ＸＩ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＸＩ及びマーカーＩ〜Ｘ，ＸＩＩ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＸＩＩ及びマーカーＩ〜ＸＩ，ＸＩＩＩ〜ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＸＩＩＩ及びマーカーＩ〜ＸＩＩ，ＸＩＶより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物、
マーカーＸＩＶ及びマーカーＩ〜ＸＩＩＩより選択される一種以上のバイオマーカーからなる組成物。これらの組成物において、当該マーカーは、実質的に純粋である及び／又は、例えば血清サンプルから単離されるのが好ましい。
【００１９】
本明細書に開示されているマーカーの質量値については、スペクトル装置における質量の正確性は、その開示された分子量の値の約±０．１５％以内であるとみなされる。さらに、そのように認識されている装置の正確性のばらつきについては、分光質量の決定は、約４００〜１０００ｍ／ｄｍ（ただし、ｍは質量であり、ｄｍは０．５のピーク高さにおけるマススペクトルのピーク幅である）の分解能限度の範囲内で変動することができる。質量分析装置及びそれらの操作に関連するこのような質量の正確性及び分解能のばらつきは、マーカーＩ〜ＸＩＶのそれぞれにおける質量に記載されている「約」という用語を用いることにより反映される。また、このような質量の正確性及び分解能のばらつき、及びマーカーＩ〜ＸＩＶのそれぞれにおける質量に関するこのような「約」という用語の意味は、被験動物の性別及び／又は民族性及び特定の癌もしくはその起源や病期により存在するかもしれない当該マーカーの変種も包含することを意図する。
【００２０】
本発明の方法を用いる乳癌のための当該バイオマーカーの発見では、好ましい期日の分析は、検出されるマーカーの数を制限するために、ピーク強度範囲を減少させるための対数変換によるものであり、各サンプルのピーク強度から得られたデータを個々のポイントとして、三次元成分空間に投影する。この成分空間は、ピーク強度の線形結合である。各成分空間は、およそ二つの事前に指定されたデータグループが、コンピュータモニター上の双方向性三次元ディスプレイにより決定された最大分離を達成する方向に一致する。それぞれの質量ピークにおける有意性スコアを計算し、それぞれの質量ピークは、二つの事前に指定されたデータグループの最大分離に対する集団寄与率に従ってランク付けられる。有意性スコアはプラスでもマイナスでもよく、プラスのスコアは、癌に罹患している患者のサンプルから得られた対応する質量ピークの発現の増加に相関し、マイナスのスコアは、癌に罹患している患者のサンプルから得られた対応する質量ピークの発現の減少に相関する。
【００２１】
固定化された分子は、各バイオマーカーの質量ピークを検出するためにレーザーイオン化され、当該１種以上のマーカーの質量ピークは、全イオン流に対して正規化された許容限界強度について解析される。選択された質量ピークは、約２Ｋ〜約１５０Ｋの間であるのが好ましい。
好ましい実施の形態では、定率のバイオマーカーサンプルが、中央値及び平均ランクがピークごとに決定される質量ピークの解析中ランダムに除外される。この解析は、少なくとも約１００回行われる。
【００２２】
他の好ましい実施の形態では、癌の進行段階を検出し、識別するためのバイオマーカーを表す質量ピークを予測するための方法が提供される。この方法は、正常な被験動物と癌に罹患している被験動物からサンプルを得ること、及び、当該サンプルの質量ピークを評価するためのバイオチップアレイを提供すること（ただし、当該バイオチップアレイは、化学修飾された金属親和性表面からなり、当該表面には、タンパク質、ペプチド又はそれらのフラグメントからなる群のうち少なくとも１種に選択的に結合することができる複数の分子が安定的に結合している）、バイオマーカーの第一セットを表す第一データセットを得るために、正常な被験動物と癌患者の被験動物からのサンプルを用いること、被験動物のサンプル中の少なくとも１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出する第一データセットを評価すること、及び、正常な被験動物と比較しながら、１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出と乳癌のような癌の進行性の悪性度とを相関させることからなる。
一つの態様では、コントロールデータセットが作成されるが、これは、正常な被験動物を表すバイオマーカーのコントロールセットを作成すること、当該バイオマーカーのコントロールセットを表すコントロールデータセットを作成するためにバイオチップアレイを用いること、及び、どの質量ピークが癌の進行の異なる悪性度を識別するバイオマーカーを表すかを予測するために、第一データセット及びコントロールデータセットを比較することからなる。
他の態様では、当該方法はさらに、癌に罹患している患者を表すバイオマーカーの第二のセットを作成すること、第一ステージの癌を表す第二のデータセットを作成するためにバイオチップアレイを用いること、及び、どの質量ピークが癌の進行の第一ステージ及び第二ステージを識別するバイオマーカーを表すかを予測するために、第二のデータセットとコントロールデータセットを比較することからなる。
当該方法は、悪性癌のあるステージを表す任意の有望なバイオマーカーの質量ピークを予測するために使用されるデータセットが得られるまで、少なくとも１回以上繰り返される。
【００２３】
他の好ましい実施の形態では、乳癌の異なる病期を表す複数のデータセットを含むバイオマーカーデータベースが構築され、そのテストデータセットと当該データベースを比較することにより、乳癌の少なくとも１つの病期を検出するための有望なバイオマーカーである質量ピークが予測される。
当該データベースは、乳癌の任意の病期を検出し、異なる癌の異なる病期を識別する有望なバイオマーカーを評価し、予測するためのデータベースからデータをマイニングするための有望なバイオマーカーである質量ピークを予測するために使用される。
他の好ましい実施の形態では、乳癌のような腫瘍の浸潤前に存在する有望なバイオマーカーを決定するために使用される質量ピークのデータセットを得ることにより、癌患者からの組織サンプルを分析し、正常な被験動物のものと比較する。
本発明の他の態様は、以下に記述する。
【００２４】
定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野における当業者により一般に理解されている意味を持つ。以下の参考文献は、本発明で使用されている多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使われているように、以下の用語は、特に明記しない限り記載された意味を持つ。
【００２５】
「気相イオン分光分析装置」とは、気相イオンを検出する装置のことをいう。気相イオン分光分析装置は、気相イオンを供給するイオン源を含む。気相イオン分光分析装置としては、例えば質量分析計、イオン移動度分光計及び全イオン電流測定装置が挙げられる。「気相イオン分光分析」とは、気相イオン分光分析装置を用いて気相イオンを検出することをいう。
「質量分析計」とは、質量電荷比に変換することができる気相イオンのパラメータを測定する気相イオン分光分析装置のことをいう。質量分析計は、一般にイオン源及び質量分析器を含む。質量分析計としては、例えば飛行時間型質量分析計、磁場型質量分析計、四重極型質量分析計、イオントラップ型質量分析計、イオンサイクロトロン共鳴質量分析計、扇形静電分析器及びそれらのハイブリッド型が挙げられる。「質量分析」とは、質量分析計を用いて気相イオンを検出することをいう。
「レーザー脱離質量分析計」とは、検体を脱離、気化及びイオン化させる手段としてレーザー光のエネルギーを利用する質量分析計のことをいう。
【００２６】
「タンデム質量分析計」とは、イオン混合物中のイオンを含むイオンのｍ／ｚに基づく識別もしくは測定における二つの連続する段階を実行することができる任意の質量分析計のことをいう。この語句は、空間的に直列なイオンのｍ／ｚに基づく識別もしくは測定における二つの連続する段階を実行することができる二つの質量分析器を有する質量分析計を包含する。さらにこの語句は、時間的に直列なイオンのｍ／ｚに基づく識別もしくは測定における二つの連続する段階を実行することができる一つの質量分析器を有する質量分析計を包含する。従って、この語句は、Ｑｑ−ＴＯＦ質量分析計、イオントラップ型質量分析計、イオントラップ−ＴＯＦ質量分析計、ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析計、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計、扇形静電−扇形磁場質量分析計及びこれらの組み合わせを明らかに包含する。
【００２７】
「質量分析器」とは、質量電荷比に変換することができる気相イオンのパラメータを測定するための手段からなる質量分析計の部分組立品のことをいう。飛行時間型質量分析計では、当該質量分析器は、イオン光学組立品、飛行管及びイオン検出器からなる。
「イオン源」とは、気相イオンを供給する気相イオン分光分析装置の部分組立品のことをいう。一つの実施の形態では、当該イオン源は、脱離／イオン化プロセスを介してイオンを供給する。このような実施の形態は、一般に、イオン化エネルギー源（例えばレーザー脱離／イオン化源）と条件検索が可能である関係にあるプローブと、常圧、もしくは減圧下における同時通信で、気相イオン分光分析装置の検出器を、位置的に接合させるプローブインターフェースからなる。
【００２８】
検体を固相から脱離し、イオン化するためのイオン化エネルギーの形態としては、（１）レーザー光エネルギー；（２）高速原子（高速原子衝撃において使用される）；（３）放射性核種のβ分解により生成される高エネルギー粒子（プラズマ脱離において使用される）；及び（４）二次イオンを生成する一次イオン（二次イオン質量分析において使用される）が挙げられる。固相の検体のためのイオン化エネルギーにおける好ましい形態としては、レーザー光（レーザー脱離／イオン化において使用される）が挙げられ、特に窒素レーザー、Ｎｄ−Ｙａｇレーザー、及び他のパルスレーザー源が好ましい。「フルエンス」とは、条件検索された画像の単位面積あたりにつき供給されるエネルギーのことをいう。レーザー光のような高フルエンス源は、約１ｍＪ／ｍｍ２から５０ｍＪ／ｍｍ２を供給する。典型的には、サンプルはプローブの表面に設置され、そのプローブはプローブインターフェースに接合され、そのプローブ表面はイオン化エネルギーにより衝撃が与えられる。当該エネルギーは、検体分子をその表面から気相へと脱離させ、それをイオン化する。
【００２９】
検体のためのイオン化エネルギーの他の形態としては、例えば、（１）気相のニュートラル（ｎｅｕｔｒａｌ）をイオン化する電子；（２）気相、固相又は液相のニュートラルからイオン化を誘導するための強い電場；及び（３）気相、固相又は液相のニュートラルの化学イオン化を誘導するためのイオン化粒子又は電場と中性化学物質との組み合わせを適用するソースが挙げられる。
本発明の文中における「プローブ」とは、気相イオン分光分析装置（例えば質量分析計）のプローブインターフェースを接合させ、及びイオン化及び気相イオン分光分析装置に導入させるためのイオン化エネルギーを検体に供給するために利用されるデバイスのことをいう。「プローブ」は、一般に検体がイオン化エネルギー源を供給される面を提供するサンプルからなる固体の基質（弾力性のある基質でも弾力性の無い基質でもどちらでもよい）より構成される。
「表面増強レーザー脱離／イオン化法」、すなわち「ＳＥＬＤＩ」とは、気相イオン分光分析装置のプローブインターフェースと接合するＳＥＬＤＩプローブの表面に検体が捕捉される、脱離／イオン化気相イオン分光分析（例えば質量分析）における方法のことをいう。「ＳＥＬＤＩ−ＭＳ」では、気相イオン分光分析装置は、質量分析計である。ＳＥＬＤＩ技術は、例えば米国特許第５，７１９，０６０号明細書（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ）及び米国特許第６，２２５，０４７号明細書（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ）に記載されている。
【００３０】
「表面増強アフィニティーキャプチャー法」すなわち「ＳＥＡＣ」は、吸収性表面からなるプローブ（ＳＥＡＣプローブ）を使用するＳＥＬＤＩの変形である。「吸着性表面」とは、吸着剤が結合している表面のことをいう（「捕捉試薬」又は「親和性試薬」とも呼ばれる）。吸着剤は検体（例えば、ターゲットのポリペプチド又は核酸）を結合させることができる任意の物質である。「クロマトグラフ吸着剤」とは、クロマトグラフィーに典型的に使用される物質のことをいう。クロマトグラフ吸着剤としては、例えばイオン交換物質、金属キレート（例えば、ニトリロ酢酸又はイミノニ酢酸）、固定化金属キレート、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、色素、単純生体分子（例えばヌクレオチド、アミノ酸、単純糖質及び脂肪酸）及び混合型吸着剤（例えば、疎水性誘引／静電反発吸着剤）が挙げられる。
「生体特異的吸着剤」とは、例えば核酸分子（例えばアプタマー）、ポリペプチド、多糖、脂質、ステロイド、あるいはこれらの抱合体（例えば、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、核酸（例えばＤＮＡ）−タンパク質抱合体）の生体分子からなる吸着剤のことをいう。ある場合では、当該生体特異的吸着剤は、多タンパク質複合体のような高分子構造体、生体膜あるいはウィルスとすることができる。生体特異的吸着剤としては、例えば抗体、受容体タンパク質、及び核酸が挙げられる。生体特異的吸着剤は、典型的にはクロマトグラフ吸着剤よりもターゲットの検体に対する特異性が高い。ＳＥＬＤＩに使用される吸着剤の更なる例は、米国特許第６，２２５，０４７号明細書（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ， “Ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｐｓ”２００１年５月１日）中に見出すことができる。
【００３１】
ある実施の形態では、ＳＥＡＣプローブは、最適な吸着剤を提供するために修飾することができる、事前に活性化された表面として提供される。例えば、任意のプローブには、共有結合により生体分子と結合することがきる、反応部分が備わっている。エポキシド及びカルボジイミドゾール（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）が、抗体や細胞受容体のような生体特異的吸着剤と共有結合するのに有用な反応部分である。
「吸着」とは、吸着剤又は捕捉試薬に対する検体の検出可能な非共有結合のことをいう。
【００３２】
「表面増強ニート脱離法（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｎｅａｔ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）」すなわち「ＳＥＮＤ」は、プローブの表面に化学結合されるエネルギー吸収分子からなるプローブ（ＳＥＮＤプローブ）を使用する、ＳＥＬＤＩの変形である。「エネルギー吸収分子」（ＥＡＭ）とは、レーザー脱離／イオン化源からのエネルギーを吸収することができ、その後、検体分子に接触してその検体分子の脱離及びイオン化に寄与することができる分子のことをいう。この語句は、しばしば「マトリックス」と呼ばれるＭＡＬＤＩに使用される分子を包含し、ケイ皮酸誘導体、シナピン酸（ＳＰＡ），シアノ−ヒドロキシ−ケイ皮酸（ＣＨＣＡ）及びジヒドロキシ安息香酸、フェルラ酸、ヒドロキシアセトフェノン誘導体などを明らかに包含する。また、この語句は、ＳＥＬＤＩに使用されるＥＡＭも包含する。ＳＥＮＤについては、米国特許第５，７１９，０６０号明細書及び２００２年９月４日に出願された米国特許出願公開第６０／４０８，２５５号明細書（Ｋｉｔａｇａｗａ，“Ｍｏｎｏｍｅｒｓ Ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｂｓｏｒｂｉｎｇ Ｍｏｉｅｔｉｅｓ Ｏｆ Ｕｓｅ Ｉｎ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎａｌｙｔｅｓ”）にさらに記述されている。
「表面増強感光結合及び放出法（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）」すなわち「ＳＥＰＡＲ」は、検体に共有結合することができ、次いで光（例えばレーザー光）照射後、プローブの部分における感光結合が切断されることにより検体が脱離することができる表面に結合する部分を有するプローブを使用する、ＳＥＬＤＩの変形である。ＳＥＰＡＲについては、米国特許第５，７１９，０６０号明細書にさらに記述されている。
【００３３】
「溶離剤」又は「洗浄液」とは、吸着性表面への検体の吸着に影響を及ぼす、あるいはそれを改変する及び／又は非結合物質を当該表面から除去するために使用される薬剤、典型的には溶液のことをいう。溶離剤の溶離性は、例えばｐＨ、イオン強度、疎水性、カオトロピック効果の度合い、洗浄強度及び温度によって左右される可能性がある。
「検体」とは、検出したいサンプルにおける任意の構成要素のことをいう。この用語は、サンプル中の１種の構成要素だけでなく複数の構成要素においても言及することができる。
アフィニティーキャプチャープローブの吸着性表面に吸着されるサンプルの「複雑度」とは、吸着される、異なるタンパク質種の数を意味する。
「分子結合パートナー」及び「特異的結合パートナー」とは、特異的結合を示す分子ペア、典型的には生体分子ペアのことをいう。分子結合パートナーは、受容体とリガンド、抗体と抗原、ビオチンとアビジン、及びビオチンとストレプトアビジンを含むが、これに限定されない。
「モニタリング」とは、連続的に変わるパラメータの変化を記録することをいう。
「バイオチップ」とは、一般に、吸着剤が結合する平面状の表面を有する固体の基質のことをいう。当該バイオチップの表面は、しばしば複数のアドレス可能な場所を含み、そのそれぞれの場所には吸着剤が結合される。バイオチップは、プローブインターフェースと接合するようになっており、従って、プローブとしても機能することができる。
【００３４】
「タンパク質バイオチップ」とは、ポリペプチドの捕捉に適合したバイオチップのことをいう。タンパク質バイオチップについては、多くのものが当当該技術に説明されており、それらは例えば、サイファージェン・バイオシステムズ社（フレモント、カリフォルニア州）、パッカード・バイオサイエンス社（メリデン、コネチカット州）、ザイオミクス社（Ｚｙｏｍｙｘ（ヘーワード、カリフォルニア州））及びファイロス社（Ｐｈｙｌｏｓ（レキシントン、マサチューセッツ州））により製造されるタンパク質バイオチップが含まれる。このようなタンパク質バイオチップの例は、以下の特許又は特許出願書に記載されている：米国特許第６，２２５，０４７号明細書（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ，“Ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｐｓ”，２００１年５月１日）；国際公開第ＷＯ ９９／５１７７３号明細書（Ｋｕｉｍｅｌｉｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，“Ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｒａｙｓ”，１９９９年１０月１４日）、米国特許第６，３２９，２０９号明細書（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａｒｒａｙｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃａｐｔｕｒｅ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ ｔｈｅｒｅｏｆ”，２００１年１２月１１日）；及び国際公開第ＷＯ ００／５６９３４号明細書（Ｅｎｇｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｒｉｘ ａｒｒａｙｓ”，２０００年９月２８日）。
【００３５】
サイファージェン・バイオシステムズ社により製造されるタンパク質バイオチップは、クロマトグラフ吸着剤もしくは生体特異的吸着剤が、アドレス可能な場所に結合した表面からなる。サイファージェンのプロテインチップ（ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標））アレイとしては、ＮＰ２０，Ｈ４，Ｈ５０，ＳＡＸ−２，ＷＣＸ−２，ＣＭ−１０，ＩＭＡＣ−３，ＩＭＡＣ−３０，ＬＳＡＸ−３０，ＬＷＣＸ−３０，ＩＭＡＣ−４０，ＰＳ−１０，ＰＳ−２０及びＰＧ−２０が挙げられる。これらのタンパク質バイオチップは、細長い切れ（ストリップ）状のアルミニウム基質からなる。このストリップの表面は、二酸化ケイ素でコーティングされている。
ＮＰ−２０バイオチップの場合、酸化ケイ素は親水性のタンパク質を捕捉するための親水性吸着剤として機能する。
【００３６】
Ｈ４，Ｈ５０，ＳＡＸ−２，ＷＣＸ−２，ＣＭ−１０，ＩＭＡＣ−３，ＩＭＡＣ−３０，ＰＳ−１０及びＰＳ−２０のバイオチップは、さらに物理的にバイオチップの表面に結合する、あるいはシランを介してバイオチップの表面に共有結合するヒドロゲル状の機能付与された架橋ポリマーからなる。Ｈ４バイオチップは、疎水結合のためのイソプロピル官能基を有し、Ｈ５０バイオチップは、疎水結合のためのノニルフェノキポリ（エチレングリコール）メタクリレートを有し、ＳＡＸ−２バイオチップは、陰イオン交換のための第四級アンモニウム官能基を有し、ＷＣＸ−２及びＣＭ−１０バイオチップは、陽イオン交換のためのカルボン酸官能基を有し、ＩＭＡＣ−３及びＩＭＡＣ−３０バイオチップは、Ｃｕ２＋やＮｉ２＋のような遷移金属イオンをキレート化により吸着するニトリロ酢酸官能基を有す。このような固定化金属イオンは、配位結合によりペプチド及びタンパク質を吸着させることができる。ＰＳ−１０バイオチップは、タンパク質上の共有結合のための基と反応することができるカルボイミドゾール（ｃａｒｂｏｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）官能基を有し、ＰＳ−２０バイオチップは、タンパク質と共有結合するためのエポキシド官能基を有す。一連のＰＳバイオチップは、抗体、受容体、レクチン、ヘパリン、プロテインＡ，ビオチン／ストレプトアビジンのような生体特異的吸着剤をサンプルからの検体を特異的に捕捉する機能を有するチップ表面に結合させるのに有用である。ＰＧ−２０バイオチップは、プロテインＧが結合するＰＳ−２０チップである。ＬＳＡＸ−３０（陰イオン交換）、ＬＷＣＸ−３０（陽イオン交換）及びＩＭＡＣ−４０（金属キレート）バイオチップは、表面に機能付与されたラテックスビーズを有す。このようなバイオチップは、ＷＯ ００／６６２６５（Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ａ Ｇａｓ Ｐｈａｓｅ Ｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ”，２０００年１１月９日）；ＷＯ ００／６７２９３（Ｂｅｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓａｍｐｌｅ Ｈｏｌｄｅｒ ｗｉｔｈ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｃｏａｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｇａｓ Ｐｈａｓｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ”，２０００年１１月９日）；米国特許出願公開第２００３００３２０４３Ａ１号明細書（Ｐｏｈｌ ａｎｄ Ｐａｐａｎｕ， “Ｌａｔｅｘ Ｂａｓｅｄ Ａｄｓｏｒｂｅｎｔ Ｃｈｉｐ”，２００２年７月１６日）及び米国特許出願公開第６０／３５０，１１０号明細書（Ｕｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｃｈｉｐ”，２００１年１１月８日）にさらに記載されている。
【００３７】
反応培地又はバイオチップのような基質上に捕捉される際に、検体は、例えば気相イオン分光分析法、光学的方法、電気化学的方法、原子間力顕微鏡法、及び高周波法より選択される各種検出方法により検出することができる。本明細書では気相イオン分光分析法について記述する。特に関心があるのは質量分析法、とりわけＳＥＬＤＩを利用することである。光学的方法は、例えば蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、複屈折、もしくは屈折率（例えば表面プラズモン共鳴法、偏光解析法、共振ミラー法、グレーティング・カップラ・ウェイブガイド法（ｇｒａｔｉｎｇ ｃｏｕｐｌｅｒ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ）又は干渉分光法）の検出を含む。光学的方法としては、光学顕微鏡法（共焦点及び非共焦点）、画像法及び非画像法が挙げられる。様々なフォーマットの免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ）は、固相に捕捉される検体を検出するのに人気の高い方法である。電気化学的方法としては、電解電流法や電流測定法が挙げられる。高周波法としては、多極共鳴分光分析法（ｍｕｌｔｉｐｏｌａｒ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）が挙げられる。
【００３８】
本発明の文中で使われている「マーカー」とは、コントロール被験動物（例えば診断が陰性であった被験動物、検出できなかった癌を有する被験動物、正常な被験動物又は健康な被験動物）から採取された比較可能なサンプルと比較して、ヒト癌を有する患者から採取されたサンプル中に異なった形で存在する（特定の、明らかな分子量を持つ）ポリペプチドのことをいう。
「異なった形で存在」という語句は、コントロール被験動物と比較して、ヒト癌を有する患者から採取されたサンプル中に存在するマーカーの量及び／又は頻度の相違のことをいう。例えば、マーカーは、コントロール被験動物のサンプルと比較して、ヒト癌患者のサンプル中で、高い濃度、あるいは低い濃度で存在するポリペプチドであってもよい。また、マーカーは、コントロール被験動物のサンプルと比較して、ヒト癌患者のサンプル中で、高い頻度、あるいは低い頻度で検出されるポリペプチドであってもよい。マーカーは、量、頻度、あるいはその両方の点からみて、異なった形で存在するかもしれない。
【００３９】
一つのサンプル中のポリペプチド量が、他方のサンプル中のポリペプチド量と比べて統計的に有意に異なる場合は、ポリペプチドは二つのサンプル間で異なった形で存在する。例えば、他方のサンプルに存在するポリペプチドと比較して、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％、あるいは少なくとも約１０００％多く存在する場合、あるいは一つのサンプル中には検出することができ、他方では検出することができない場合は、ポリペプチドは二つのサンプル間で異なった形で存在する。
また、ヒト癌患者のサンプルにおいてポリペプチドを検出する頻度が、コントロールサンプルと比較して統計的に有意に高い、あるいは低い場合は、ポリペプチドは、二つのサンプルセット間で異なった形で存在する。例えば、他方のサンプルセットと比較して、１つのサンプルセット中に少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％、あるいは少なくとも約１０００％高頻度、あるいは低頻度にポリペプチドが観察される場合、ポリペプチドは二つのサンプルセット間で異なった形で存在する。
【００４０】
「診断」とは、病態の有無あるいは性質を同定することを意味する。診断法は、その感度及び特異度で異なる。診断検査の「感度」は、検査で陽性反応を示す罹患者の割合である（「真の陽性者」の割合）。当該検査により検出されない罹患者は「偽陰性者」である。罹患してなく、当該検査において陰性反応を示す被験動物は「真の陰性者」と呼ばれる。診断検査の「特異度」は、１から偽陽性率を引いた値である。ここで「偽陽性」率は、検査で陽性反応を示す非罹患者の割合として定義される。特定の診断法は、状態について決定的な診断を提供するものではないかもしれないが、その方法が診断を補助する陽性の表示を提供すれば、それで十分である。
【００４１】
マーカーの「テスト量」とは、テストされるサンプル中に存在するマーカーの量のことをいう。テスト量は、絶対量（例えばμｇ／ｍｌ）でも相対量（例えば信号の相対強度）でもどちらでもよい。
マーカーの「診断量」とは、ヒト癌の診断と一致する被験動物サンプル中のマーカーの量のことをいう。診断量は、絶対量（例えばμｇ／ｍｌ）でも相対量（例えば信号の相対強度）でもどちらでもよい。
マーカーの「コントロール量」とは、任意の量あるいはマーカーのテスト量に対して比較されるべき量の範囲のことをいう。例えば、マーカーのコントロール量は、ヒト癌に罹患していない人におけるマーカーの量であるかもしれない。コントロール量は、絶対量（例えばμｇ／ｍｌ）でも相対量（例えば信号の相対強度）でもどちらでもよい。
【００４２】
「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子群、あるいはそれらのフラグメントにより実質的にコードされているポリペプチドリガンドのことをいい、それはエピトープ（例えば抗原）に特異的に結合し、認識する。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ及びλのＬ鎖の定常領域における遺伝子、α、γ、δ、ε及びμのＨ鎖の定常領域における遺伝子、及び無数の免疫グロブリンの可変領域における遺伝子が挙げられる。抗体は、例えば無処置の免疫グロブリンとして、あるいは各種ペプチダーゼを用いる消化により産生された、よく特徴付けられている多数のフラグメントとして存在している。これは、例えばＦａｂ’及びＦ（ａｂ）’２フラグメントを含む。本明細書で使用される「抗体」という用語は、完全な抗体を改変することにより産生された、あるいは組み換えＤＮＡ法を用いて新たに合成された抗体フラグメントも包含する。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいは単鎖抗体も包含する。抗体の「Ｆｃ」部とは、Ｈ鎖の定常領域ドメインであるＣＨ１，ＣＨ２及びＣＨ３の１種以上からなるが、Ｈ鎖の可変領域を含まない免疫グロブリンにおけるＨ鎖の部位のことをいう。
「免疫測定法」とは、抗原（例えばマーカー）に特異的に結合する抗体を用いる測定法のことをいう。免疫測定法は、抗原を単離する、対象とする、及び／又は定量するために、特定の抗体の特異的な結合性を利用することにより特徴付けられている。
【００４３】
抗体に「特異的に（あるいは選択的に）結合する」又は「特異的に（あるいは選択的に）免疫反応する」という語句は、タンパク質又はペプチドについて言及する場合、異種のタンパク質の集団及び他の生物製剤中に当該タンパク質が存在していることを決定する結合反応のことをいう。従って、指定された免疫測定の条件下では、指定された抗体は、バックグランドの少なくとも２倍特定のタンパク質に結合し、実質的にサンプル中に存在する他のタンパク質に対し、有意な量結合することはない。このような条件下での抗体への特異的な結合には、特定のタンパク質に対する特異性について選択される抗体を要するかもしれない。例えば、ラット、マウス、あるいはヒトのような特定の種から産生されたマーカーＢｒ１と反応するポリクローナル抗体は、マーカーＢｒ１と特異的に免疫反応し、多形性変異体及びマーカーＢｒ１の対立遺伝子を除く他のタンパク質とは特異的に免疫反応しないポリクローナル抗体のみが得られるように選択することができる。この選択は、他の種からマーカーＢｒ１分子と交差反応する抗体を取り除くことにより達成されるだろう。特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために、各種のイムノアッセイフォーマットを用いてもよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫測定法が、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用される（特定の免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイフォーマット及び条件の記述については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照する）。特異的又は選択的反応は、典型的にはバックグランドシグナルあるいはノイズの少なくとも２倍、さらに典型的にはバックグランドの１０倍から１００倍以上である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明は、乳癌のための腫瘍バイオマーカーを同定するための、高い特異性及び高い感度を有する方法に関する。
乳癌の病期に関連する１５（１４）種のバイオマーカーが同定された。当該１４種のバイオマーカーにおけるタンパク質又はタンパク質のフラグメントは、ＳＥＬＤＩ（表面強調レーザー脱離／イオン化）プロテインチップ／マススペクトルの強度ピークとして表され、分子質量が以下に示す値のあたりに集中している。
マーカーＩ（ＢＣ１）： ４２８３ダルトン
マーカーＩＩ（ＢＣ２）： ８１２６ダルトン
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）： ８９３２ダルトン
マーカーＩＶ： ４４６５ダルトン
マーカーＶ： ４０６０ダルトン
マーカーＶＩ： ８３２２ダルトン
マーカーＶＩＩ： １７０４６ダルトン
マーカーＶＩＩＩ： １７６９６ダルトン
マーカーＩＸ： １０２４０ダルトン
マーカーＸ： ５８９１ダルトン
マーカーＸＩ： ８４２６ダルトン
マーカーＸＩＩ： ７５４１ダルトン
マーカーＸＩＩＩ： ９４１３ダルトン
マーカーＸＩＶ： １６２４４ダルトン
マーカーＩ〜ＸＩＶのこれらの質量は、開示されているＳＥＬＤＩ−質量分析のプロトコルにより決定された規定値の０．１５％以内の範囲で正確であると考えられる。
【００４５】
我々は、マーカーＩ〜ＸＩＶが、コントロール被験動物と比較して、ヒト乳癌に罹患している患者から採取したサンプル中の量及び／又は頻度の面で以下のように異なった形で存在することを発見し、特に、癌患者のサンプル中でマーカーが上方制御される（すなわち、コントロール被験動物からのサンプルと比較し、乳癌患者のサンプル中の濃度が上昇する）、あるいはマーカーが下方制御される（すなわち、コントロール被験動物からのサンプルと比較し、乳癌患者のサンプル中の濃度が低下する）ことを発見した。
マーカーＩ（ＢＣ１）： 癌患者のサンプルにおいて下方制御される
マーカーＩＩ（ＢＣ２）： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＩＶ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＶ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＶＩ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＶＩＩ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＶＩＩＩ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＩＸ： 癌患者のサンプルにおいて下方制御される
マーカーＸ： 癌患者のサンプルにおいて下方制御される
マーカーＸＩ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＸＩＩ： 癌患者のサンプルにおいて下方制御される
マーカーＸＩＩＩ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
マーカーＸＩＶ： 癌患者のサンプルにおいて上方制御される
【００４６】
マーカーＩ〜ＸＩＶと乳癌の有無の関連は、様々な病期における腫瘍の切除及び治療をする前の乳癌を有する患者（ｎ＝１０３）、良性の乳房疾患を有する女性（ｎ＝２５）及び公知の腫瘍性疾患を有してない女性健常者（ｎ＝４１）において確立された。乳癌の異なる病期を識別するバイオマーカーを同定するために使用される当該方法が高い特異度及び高い感度を有することは、これらのバイオマーカーのうち３種（４２８３（ＢＣ１），８１２６（ＢＣ２），及び８９３２（ＢＣ３））のみを使用することにより強調され、異なる病期の乳癌患者のうち９３％が正確に同定された（ステージ０／Ｉ期（９３％）、ステージＩＩ期（８５％）及びステージＩＩＩ期（９４％））。１種のバイオマーカー（ＢＣ３）のみを使用した場合でも、ステージ０／Ｉ期（８８％）、ステージＩＩ期（７８％）及びステージＩＩＩ期（９２％）を示し、乳癌患者のうち８５％の正確な同定が達成された。
【００４７】
特に、乳癌に罹患しているもしくは罹患していない被験動物からの１６９の血清サンプルにおけるタンパク質プロファイルの同時分析が実施され、その結果、本明細書に記載された方法が高い特異性及び高い選択性を有することが実証された。被験動物の１６９の血清サンプルから、３種の識別バイオマーカーが同定され、これらの組み合わせにより、癌に罹患していないコントロールからの乳癌の検出において、高い感度（９３％）及び高い特異度（９１％）の両方が達成された。
【００４８】
上記のように、マーカーＩ〜ＸＩＶは、吸着剤に対する親和性、特に以下で説明する実施例の概説の項目でのプロテインチップ分析で指定されている条件下における固定化Ｎｉキレート（ＩＭＡＣ）基質表面に対する結合に基づいて特徴付けることもできる。この条件は、以下の条件を含む。３０μｌの８Ｍ尿素、１％ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を２０μｌの血清サンプルに加え、その希釈サンプルを４℃で１５分間ボルテックスし、ＰＢＳで１：４０の比で希釈する。固定化金属アフィニティーキャプチャーチップ（ＩＭＡＣ３）をメーカー（サイファージェン・バイオシステムズ社、カリフォルニア州）の使用説明書に従って、５０ｍＭのＮｉＳＯ４で活性化し、９６−ウェル・バイオプロセッサ（サイファージェン・バイオシステムズ社、カリフォルニア州）を用いて、その希釈した血清サンプルを５０μｌずつ、プロテインチップアレイ上の各スポットに分注する。プラットフォームシェーカー上で６０分間室温にて結合させた後、１００μｌのＰＢＳで５分間のアレイの洗浄を２回行い、その後１００μｌのｄＨ２Ｏで２回リンスする。結合は、質量リーダーで検出することができる。本明細書で説明する、特定のタンパク質マーカーをＩＭＡＣ−Ｎｉ吸着剤と結合するとして特徴付けることができることは、当該マーカーとこのような条件下で処理した血清サンプルとの結合が検出されることを示す。
【００４９】
バイオマーカーを同定するための以下に示す本発明の具体的な例は、本発明を限定するあるいは解釈することを意図しているものでは決してない。乳癌の早期発見を可能とする血清バイオマーカーを同定するために、ステージ０期とＩ期の癌患者からの試料のタンパク質プロファイルを癌に罹患していないコントロールからのものと比較した。次に選択されたバイオマーカーについて、バイオマーカー選択プロセスに含まれていないステージＩＩ期及びＩＩＩ期の乳癌患者からのデータを用いて試験した。複合タンパク質の発現パターンのハイスループット・プロファイリングにより、大量の有望なマーカーを同時にスクリーニングすることが非常に容易になる。ＵＭＳＡアルゴリズムは、あらかじめ定義された二つの診断グループの分離に対する寄与に応じて、多数のピークを集合的にランク付けするための効率的なモデルを提供した。ＰｒｏＰｅａｋブートストラップモジュールを用いてランダム摂動（ｒａｎｄｏｍ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を導入し、上位にランク付けされたピークの一貫性を検査するために、これを複数回実行し、複数回の実行から計算されたランクの標準偏差によりそれを判断した。その成績が単なる偶然とみなされないためのピークのランクにおける標準偏差のカットオフ値の上限を確立するために、実際のデータ分布をシミュレートする、ランダムに作成されたデータセットに同じブートストラップ手順を適用した。この「シミュレートされたピーク」からのランクの標準偏差の最小値は、ピークが無作為の偶然により得られる可能性の一貫性の程度を示す。この最小値は、更に検討するために、元の１４７のピークを上位にランク付けされた１５のピークのサブセットまでに減らすために手助けとなるカットオフとして用いた。このようなピークの成績は、データにおける無作為なアーティファクトに起因するものとはなりにくいと考えられる。
【００５０】
簡単にするために、複合指数は、単純多変量ロジスティック回帰により導き出された。これらの選択されたバイオマーカーをさらにバリデートするときは、より複雑な非線形分類モデルを利用して、複数のバイオマーカーを組み合わせてもよい。注意深くスクリーニングされ、検査されたバイオマーカーについて複雑なモデリング法を利用することにより、一般に多数の質量ピークからの生データに関してそのような方法を直接適用するよりも頑強な成績が提供されるはずである。選択されたバイオマーカーの識別能は、ステージＩＩ〜ＩＩＩ期のデータを個々のテストセットとして用いることにより実証された。成績のブートストラップ・クロスバリデーション評価により、将来のデータにわたる、これらのバイオマーカーの一般化可能性（ｇｅｎｅｒａｌｉｚａｂｉｌｉｔｙ）について統計的信頼度が提供される。選択されたこの３種のバイオマーカーについて、これらのマーカーの濃度と腫瘍サイズ又はリンパ節転移間における有意な相関は何もみられなかった。従って、これらのマーカーの識別能は、腫瘍の進行よりもそれの悪性を反映している可能性が非常に高い。
【００５１】
本明細書で使われている「腫瘍の病期」又は「腫瘍の進行」とは、腫瘍の異なる臨床病期のことをいう。腫瘍の臨床病期は、医学の分野で確立されている様々なパラメータにより定義される。そのパラメータの例としては、形態、腫瘍サイズ、患者の体内への転移の度合いなどが挙げられる。
ヒト癌は、前悪性状態から悪性そして最終的に患者を死に至らしめる転移性疾患への進行を含む多段階のプロセスであるようにみえる。ヒトにおける疫学的研究は、ある病態が悪性腫瘍のリスクの増加に関連しているのを受けて、それを「前癌性」であると規定した。癌予防戦略として、前浸潤性病変を検出し、取り除く前例がある。例えば、子宮頚部の異形成及び上皮内癌は、細胞学的スクリーニング法により子宮頚癌の予防に利用されて成功した前癌性の例である。残念なことに、乳房は、子宮頚部ほど簡単にサンプル採取できないので、乳房の前癌性のためのスクリーニング法の開発には、子宮頚癌を検出するために現在使用されている細胞形態学的スクリーニング法よりも複雑な手段を要する。
【００５２】
前癌性乳房疾患も、異型の異常増殖から上皮内癌（前浸潤性癌）へ、そして最終的には広がり、転移し、患者を死に至らしめる浸潤性癌までの見かけ上の形態的進行によって特徴付けられる。乳房バイオプシーについての注意深い組織学的検査により、他のものではなく、このような特徴のいくつかを要する中間ステージが実証された。詳細な疫学的研究により、異なる形態の病変が異なる速さで、（リスクの低い）異型の異常増殖から患者において高い確率で浸潤性癌に進行する面皰性非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）まで様々な形で進行することが確立された（Ｌｏｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１；及びＰａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９７８）。家族歴もまた、乳癌の発症における重要な危険因子であり、前癌性病変の相対リスクを増加させる（Ｄｕｐｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｄｕｐｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９３；及びＬｏｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９１）。特に関心があるのは、非面皰性上皮内癌が、コントロールグループと比較して乳癌の相対リスクが１０倍以上増加したことに関連していることである（Ｏｔｔｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。相対リスクの増加のほかに、以下に示す二つの理由も、ＤＣＩＳが前癌性であるという概念をサポートする。１）乳癌がこのような患者に発生する場合、それはＤＣＩＳが発見されたのと同じ乳房の同じ領域にいつも発生する。２）ＤＣＩＳはしばしば浸潤性乳癌に隣接する組織に存在する（Ｏｔｔｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。これらの理由により、ＤＣＩＳが、女性の浸潤性乳癌の発症における律速段階に相当する可能性が極めて高い。
【００５３】
Ｉ．好ましい実施の形態の例
好ましい実施の形態では、本発明は、１種以上のマーカー、例えばマーカー４２８３（ＢＣ１），８１２６（ＢＣ２）及び８９３２（ＢＣ３）を用いてヒト癌の診断を補助するための方法を提供する。これらのマーカーは、ヒト癌の診断を補助する際に単独で、あるいは任意のセット中の他のマーカーもしくは全く異なるマーカー（例えばＣＡ１５．３やＣＡ２７．２９）と組み合わせて使用することができる。当該マーカーは、ヒト癌患者（例えば乳癌患者）及びヒト癌を検出することができない正常な被験動物からのサンプル中に異なった形で存在する。例えば、当該マーカーのいくつかは正常な被験動物と比べてヒト癌患者において、高い濃度で発現する及び／又は高い頻度で存在する。従って、人における１種以上のこれらのマーカーの検出は、その人がヒト癌を有しているかもしれない可能性について有用な情報を提供し、また腫瘍の臨床病期を決定することができると考えられる。
【００５４】
このようにして、本発明の実施の形態は、（ａ）バイオチップアレイを用いて生物学的マーカーの第一セットを表す第一データセットを作成し；（ｂ）被験動物のサンプル中の少なくとも１種以上のタンパク質バイオマーカーを検出する第一データセットを評価し；（ｃ）１種以上のタンパク質バイオマーカーの検出と正常な被験動物とを比較して癌の進行性悪性病期とを相関させることにより、癌の異なる悪性病期を診断及び識別するための方法を含む。この相関は、コントロール（例えばヒト癌を検出することができない正常な被験動物）のマーカー又はマーカー群の量と比較したサンプル中のマーカー又はマーカー群の量を考慮してもよいし（マーカー又はマーカー群の上方制御あるいは下方制御）、テストサンプル中のマーカーの有無及びコントロール中の同じマーカーの検出の頻度を考慮してもよいし、被験動物がヒト癌を有しているかいないかの決定を容易にするこのようなファクターを両方考慮してもよい。
【００５５】
マーカーを検出するために、任意の適切なサンプルを被験動物から得ることができる。サンプルは、好ましくは被験動物からの血清サンプルである。必要ならば、サンプルは、マーカーの検出能を増強させるために上記のように調製することができる。例えば、マーカー４２８３（ＢＣ１），８１２６（ＢＣ２），及び８９３２（ＢＣ３）の検出能を増加させるために、被験動物からの血清サンプルは、好ましくは、例えばチバクロンブルーアガロースクロマトグラフィー、単鎖ＤＮＡアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーなどにより分画することができる。プレ分画のプロトコルのようなサンプルの調製は任意であり、用いられる検出法に応じてマーカーの検出能を増強させる必要がないかもしれない。例えば、もしサンプル中のマーカーの有無を検出するためにマーカーに特異的に結合する抗体を使用するならば、サンプルの調製は不要であるかもしれない。
【００５６】
サンプル中のマーカー又はマーカー群を検出するために、任意の適切な方法を用いることができる。例えば、気相イオン分光分析法や免疫測定法を上記のように使用することができる。
これらの方法を用いて、１種以上のマーカーを検出することができる。サンプルは、複数のマーカーの有無について試験されるのが好ましい。単独のマーカーよりも複数のマーカーの有無を検出する方が、診断医により多くの情報を与えることになると考えられる。具体的に、サンプル中の複数のマーカーの検出は、真の陽性診断及び真の陰性診断の割合を増加させ、また偽陽性診断又は偽陰性診断の割合を減少させると考えられる。
次に、マーカー又はマーカー群の検出をヒト癌の推定診断と相関させる。ある実施の形態では、マーカーの量を測らずに、単なるマーカーの有無の検出が有用であり、その検出とヒト癌の推定診断及び腫瘍の臨床病期の決定とを相関させることができる。例えば、これらのバイオマーカーのうち３種（マーカー４２８３（ＢＣ１），８１２６（ＢＣ２），及び８９３２（ＢＣ３））のみを使用することにより、９３％の乳癌患者が以下の病期において正確に同定された：ステージ０／Ｉ期（９３％）、ステージＩＩ期（８５％）及びステージＩＩＩ期（９４％）。１種のバイオマーカー（ＢＣ３）のみを使用しても、ステージ０／Ｉ期（８８％）、ステージＩＩ期（７８％）及びステージＩＩＩ期（９２％）を示し、８５％の乳癌患者が正確に同定された。こうして、試験される被験動物における１種以上のこれらのマーカーの単なる検出により、その被験動物が腫瘍の異なる臨床病期に進行していることが示される。
【００５７】
他の実施の形態では、マーカーの検出が、マーカーの検出とヒト癌の推定診断とを相関させるために、マーカーを定量することを関与させることができる。従って、検査される被験動物において検出されるマーカーの量がコントロール量と比較して高い場合は、検査される当該被験動物が、ヒト癌を有している可能性がより高い。
同様に、他の実施の形態では、マーカーの検出がさらに、当該マーカーの量が正常な被験動物からの血清サンプル中に含まれる量よりもヒト癌患者からの血清サンプル中に含まれる量が少ない場合における、マーカーの検出とヒト癌の推定診断とを相関させるために、マーカーを定量することを関与させることができる。従って、検査される被験動物において検出されるマーカーの量がコントロール量と比較して低い場合は、検査される当該被験動物が、ヒト癌を有している可能性がより高い。
【００５８】
マーカーを定量する時は、それをコントロールと比較することができる。コントロールは、例えばヒト癌を検出することができない正常な被験動物の比較できるサンプル中に存在するマーカー量の平均値もしくは中央値でもよい。コントロール量は、テスト量を測定する場合と同じあるいは実質的に同様の実験条件下で測定される。例えば、テストサンプルを被験動物の血清サンプルから取得し、マーカーを特定のプローブを用いて検出する場合、マーカーのコントロール量は同じプローブを用いて患者の血清サンプルから決定されるのが好ましい。マーカーのコントロール量は、多数のヒト癌を有していない正常な被験動物からのサンプルに基づいて決定されるのが好ましく、そうすることにより、その集団のマーカー量のばらつきが反映される。
質量分析により作成されたデータは、次にコンピュータソフトウェアにより分析することができる。ソフトウェアは、質量分析計からの信号をコンピュータに読み込み可能な形式に変換するコードにより構成することができる。また、当該ソフトウェアは、当該信号が本発明のマーカーあるいは他の有用なマーカーに相当する信号における「ピーク」を表しているかどうかを決定するための信号の分析に、アルゴリズムを適用するコードを含むこともできる。また、当該ソフトウェアは、テストサンプルからの信号を、「正常な」及びヒト癌の特徴を示す典型的な信号と比較するアルゴリズムを実行し、またその二つの信号間の適合の接近性を決定するコードを含むこともできる。当該ソフトウェアはまた、どのテストサンプルが最も接近しているかを示すコードも含むことができ、これにより推定診断が提供される。
【００５９】
本発明、すなわち本明細書に記述されている方法によれば、悪性腫瘍に進行する前浸潤性腫瘍の原因になるバイオマーカーを同定することにより、前浸潤性腫瘍、あるいは良性の腫瘍でさえも診断が可能かもしれない。同定されるバイオマーカーのタイプ及びバイオマーカーの量は、前浸潤性腫瘍から悪性段階の腫瘍へのジャンプと相関している可能性がある。その腫瘍が浸潤性になる前に、直ちにその腫瘍を切除するような治療法、あるいは化学療法や放射線療法のような治療法を実行することができる。前浸潤性バイオマーカーの同定は、例えば乳癌におけるマンモグラムの利用のような従来の方法を用いる診断に利用することができる。
こうして、本発明は、このような腫瘍に関連するバイオマーカーを同定することにより前浸潤性腫瘍の迅速な同定を提供し、それにより患者は救命治療が与えられるかもしれない。さらに、癌患者の長期治療の費用も削減されると考えられる。
【００６０】
より具体的には、本発明は、ヒト癌患者及びコントロールの被験動物のサンプル中に異なった形で存在するタンパク質マーカーの発見、及びこの発見をヒト癌の診断を補助する方法、及び腫瘍の病期の進行を同定する方法への適用に基づく。これらのタンパク質マーカーのいくつかは、コントロール（例えばヒト癌を検出することができない女性）と比較して、ヒト癌患者からのサンプル中において、高い濃度及び／又は高い頻度で検出される。従って、コントロールと比較して、テストサンプル中に検出される１種以上のマーカーの量、又はテストサンプル中の１種以上のマーカーの単なる検出が、検査された被験動物がヒト癌を有しているか否かの可能性に関する有用な情報を提供する。
【００６１】
本発明のタンパク質マーカーは、他にも多くの用途がある。例えば、インビトロ又はインビボにおける当該マーカーの発現を調節する化合物をスクリーニングするために、当該マーカーを使用することができる。その化合物は患者に対するヒト癌の治療や予防に有用であるかもしれない。他の例では、ヒト癌の任意の治療に対する反応をモニターするために、マーカーを使用することができる。さらに他の例では、当該マーカーを遺伝に関する研究に用いることがきる。例えば、任意のマーカーは、遺伝学的に関連しているかもしれない。これは、例えば、家族がヒト癌の経歴を有しているヒト癌患者の集団からのサンプルを分析することにより決定することができる。その結果を次に、例えば家族がヒト癌の経歴を有していないヒト癌患者から得られたデータと比較することができる。遺伝子学的に関連しているマーカーは、家族がヒト癌の経歴を有する被験動物がヒト癌に罹患しやすいかどうかを決定する手段として使用されるかもしれない。
【００６２】
他の態様では、本発明はヒト癌患者とコントロール（例えばヒト癌を検出することができない女性）のサンプル中に異なる形で存在するマーカーを検出するための方法を提供する。このマーカーは多数の生体サンプル中に検出することができる。サンプルは、好ましくは生体液のサンプルである。本発明において有用な生体液のサンプルとしては、例えば血液、血清、血漿、乳頭吸引液、尿、涙、唾液などが挙げられる。全てのマーカーが血清中に検出されるので、血清が本発明の実施の形態における好ましいサンプル源である。
本明細書に記載された１種以上のマーカーを検出するために、任意の適切な方法を用いることができる。これらの方法は、質量分析法（例えばレーザー脱離／イオン化質量分析法）、蛍光法（例えばサンドイッチ免疫測定法）、表面プラズモン共鳴法、偏光解析法及び原子間力顕微鏡法を含むが、これに限定されない。
【００６３】
好ましい実施の形態では、当該分離方法は、質量分析プローブの表面が、マーカーが結合する吸着剤より構成される表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析法に関連する。ＳＥＬＤＩは、化学修飾された表面（ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ、サイファージェン・バイオシステムズ社、フレモント、カリフォルニア州）にタンパク質が選択的に吸着され、バッファーで洗浄することにより不純物が取り除かれるという親和性に基づく質量分析法である。異なる表面を有するアレイと洗浄条件とを組み合わせることにより、高速、高分解クロマトグラフ分離がチップ上で達成される（Ｍ．Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０００；２１：１１６４−６７）。
【００６４】
ＳＥＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳは、ハイスループットタンパク質プロファイリングを提供する。他の多くのタイプのハイスループット発現データのように、タンパク質アレイデータは、小さいサンプルサイズ（検体の数）に対して、多数の変数（マスピーク）によりしばしば特徴付けられる。疾患に関連するバイオマーカーをスクリーニングするためにこのようなデータを分析する際の重要な問題点は、限られた数のサンプルからできるだけ多くの情報を抽出すること、及び成績がデータにおける疾患と関連がないアーティファクトにより主に影響されるバイオマーカーの選択を回避することである。バイオインフォマティクス手段の効果的で適切な使用が、非常に重要となってくる。
【００６５】
他の好ましい実施の形態では、乳癌の早期発見のための有望な血清バイオマーカーをスクリーニングするために、固定化金属アフィニティープロテインチップアレイ及びＳＥＬＤＩがハイスループットスクリーニングに使用される。例えば、乳癌を有しているあるいは有していない患者から全部で１６９の遡及的血清サンプルをジョーンズ・ホプキンス臨床化学血清バンク（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｕｍ Ｂａｎｋｓ）から入手し、同時に分析した。キレート化された金属（ヒスチジン、トリプトファン、システイン又はリン酸化アミノ酸を介して）に結合したタンパク質をＰＢＳ−ＩＩマスリーダー（サイファージェン・バイオシステムズ社、フレモント、カリフォルニア州）上で分析した。複合タンパク質プロファイルは、収集されたバイオインフォマティクス手段を用いて分析した。ステージ０〜Ｉ期の乳癌患者と癌を有していないコントロール（健康＋良性）との最適な分離に対して一貫して有意に寄与したことを根拠として、３種のバイオマーカーパネルを選択した。次に、この選択されたバイオマーカーの有効性をステージＩＩ〜ＩＩＩ期の乳癌患者からの個々のデータを用い、ブートストラップのクロスバリデーションにより検査を行った。
【００６６】
ＩＩ．マーカーの調製
サンプルはバイオマーカーの検出を行う前に調製するのが好ましい。典型的には、これは検査されるべき被験動物からのサンプルを収集することに関与する。サンプルは、被験動物からの任意の生体サンプルとすることができる。血液、血漿、血清、尿、リンパ液、あるいは管の洗浄液などの生体液又はそれらの由来物質が好ましく、サンプルが血清であるのが最も好ましい。
サンプルをプレ分画し、バイオマーカーを含んでいると決定されたフラクションを集めるのが有用であるかもしれない。プレ分画の方法としては、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逐次抽出法、ゲル電気泳動法及び液体クロマトグラフィーが挙げられる。検体もまた検出を行う前に改変してもよい。これらの方法は、さらに分析を行う場合、サンプルを単純化するのに有用である。例えば、分析を行う前にアルブミンのような多量のタンパク質を血液から除去することが有用であるかもしれない。しかし、本発明のマーカーは、血液から血清を単離した後は、それ以上分画を行わないでもＳＥＬＤＩにより検出可能である。
【００６７】
一つの実施の形態では、サンプルは、サイズ排除クロマトグラフィーを利用してサンプル中のタンパク質のサイズに従ってプレ分画することができる。入手できるサンプル量が少ない生体サンプルについては、サイズセレクションスピンカラムを用いるのが好ましい。例えば、Ｋ３０スピンカラム（プリンストン・セパレーション（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、サイファージェン・バイオシステムズ社などから入手できる）を使用することができる。一般に、カラムから溶離される最初のフラクション（フラクション１）は高分子量のタンパク質の割合が高く、フラクション２は高分子量のタンパク質の割合がそれより低く、フラクション３は高分子量のタンパク質の割合がさらに低く、フラクション４は高分子量のタンパク質の割合が最も低く、このように、後になるほど高分子量のタンパク質の割合が低くなる。次に各フラクションは、気相イオン分光分析法によりマーカーの検出について分析することができる。
【００６８】
他の実施の形態では、サンプルは、陰イオン交換クロマトグラフィーによりプレ分画することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、帯電特性におおざっぱに従ってサンプル中のタンパク質のプレ分画をすることができる。例えば、Ｑ陰イオン交換樹脂（例えばＱ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ，Ｂｉｏｓｅｐｒａ）を用いることができ、サンプルは、異なるｐＨの溶離剤で連続して溶離することができる（図３及び実施例、セクションＶＩ Ｂ参照）。陰イオン交換クロマトグラフィーは、より負に帯電したサンプル中の生体分子を他のタイプの生体分子から分離することができる。高いｐＨの溶離剤で溶離されたタンパク質は、弱く負に帯電していることが多く、また、低いｐＨの溶離剤で溶離されるフラクションは、強く負に帯電していることが多い。従って、サンプルの複雑度を減少させるほかに、陰イオン交換クロマトグラフィーは、結合特性に従ってタンパク質を分離する。
【００６９】
さらに他の実施の形態では、サンプルは、ヘパリンクロマトグラフィーによりプレ分画することができる。ヘパリンクロマトグラフィーは、ヘパリンとの親和性相互作用及び帯電特性にも基づいて、サンプル中のマーカーのプレ分画をすることができる。硫酸化ムコ多糖であるヘパリンは、正に帯電した部分を有するマーカーに結合し、サンプルは、異なるｐＨの溶離剤もしくは塩濃度の溶離剤で連続して溶離することができる。低いｐＨの溶離剤で溶離されたマーカーは弱く正に帯電していることが多く、高いｐＨの溶離剤で溶離されるマーカーは、強く正に帯電していることが多い。従って、ヘパリンクロマトグラフィーもまた、サンプルの複雑度を減少させ、結合特性に従ってマーカーを分離する。
【００７０】
さらに他の実施の形態では、サンプルは、サンプル中に多量に存在するタンパク質、あるいはマーカーの検出を妨げるかもしれないタンパク質を除去することによりプレ分画することができる。例えば、血清サンプル中には血清アルブミンが多量に存在し、マーカーの分析を分かりにくくしているかもしれない。従って、血清サンプルは、血清アルブミンを除去することにより、プレ分画することができる。血清アルブミンは、血清アルブミンに特異的に結合する吸着剤からなる基質を用いて除去することができる。例えば、チバクロンブルーアガロース（血清アルブミンに対する高い親和性を有する）や抗血清アルブミン抗体からなるカラムを用いることができる（例えば、図２と４を参照）。
【００７１】
さらに他の実施の形態では、サンプルは、特定の特性を有するタンパク質、例えばグリコシル化されたタンパク質を単離することによりプレ分画することができる。例えば、血清サンプルは、レクチンクロマトグラフィーカラム（糖に対する高い親和性を有する）にサンプルを通過させることにより、分画することができる。グリコシル化タンパク質は、レクチンカラムに結合し、非グリコシル化タンパク質はフローとともに通過する。次にグリコシル化タンパク質は、糖、例えばＮ−アセチルグルコサミンを含む溶離剤によりレクチンカラムから溶離され、更なる分析のために用いることができる。
【００７２】
血清サンプルをプレ分画するのに適するアフィニティー吸着剤は、多くのタイプが存在する。サンプルをプレ分画するために使用できる別のタイプのアフィニティークロマトグラフィーの例としては、単鎖ＤＮＡスピンカラムが挙げられる。このカラムは、基本的なタンパク質又は正に帯電したタンパク質に結合する。結合したタンパク質は次に、変性剤を含む溶離剤又は高いｐＨの溶離剤を用いてカラムから溶離される。
このように、サンプル中のタンパク質の結合特性、あるいはサンプル中のタンパク質の特性に基づいて、サンプルの複雑度を減少させる方法はたくさんある。
【００７３】
さらに他の実施の形態では、サンプルは逐次抽出プロトコルを用いて分画することができる。逐次抽出法では、サンプルから異なるタイプの生体分子を抽出するために、サンプルを一連の吸着剤に接触させる。例えば、特定のタンパク質を抽出するために、サンプルを第一吸着剤にアプライし、非吸着性タンパク質（すなわち第一吸着剤に結合しなかったタンパク質）を含む溶離液を回収する。次に、そのフラクションを第二の吸着剤に接触させる。これにより、様々なタンパク質がフラクションからさらに抽出される。この第二のフラクションは、次に第三の吸着剤に接触させ、同様にして、逐次溶離液を次の吸着剤に接触させる。
【００７４】
サンプルの逐次抽出を実行するために、任意の適切な物質及び方法を用いることができる。例えば、異なる吸着剤からなる一連のスピンカラムを用いることができる。他の例では、底に異なる吸着剤を含むマルチウェルを用いることができる。他の例では、気相イオン分光分析装置の使用に適応したプローブの表面が、生体分子に結合するための吸着剤からなるプローブ上で逐次抽出を実行することができる。本実施の形態では、当該プローブ上で第一吸着剤にサンプルをアプライし、次に溶離剤でそれを洗浄する。第一吸着剤に結合しないマーカーは、溶離剤で除去される。このフラクション中に存在するマーカーは、当該プローブ上の第二吸着剤にアプライすることができ、同様にして、逐次溶離液を次の吸着剤にアプライする。気相イオン分光分析装置のプローブ上で逐次抽出を行う長所は、気相イオン分光分析装置を用いて、逐次抽出プロトコルの各ステージにおいて様々な吸着剤と結合するマーカーを直接分析することができることである。
【００７５】
さらに他の実施の形態では、高分解能電気泳動法、例えば一次元又は二次元ゲル電気泳動法により、サンプル中の生体分子を分離することができる。マーカーを含むフラクションを単離することができ、気相イオン分光分析法によりさらにそれを分析することができる。１種以上のマーカーを含む生体分子スポットの二次元アレイを作成するために、二次元ゲル電気泳動法を用いるのが好ましい（例えば、Ｊｕｎｇｂｌｕｔ ａｎｄ Ｔｈｉｅｄｅ，Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒ．Ｒｅｖ．１６：１４５−１６２（１９９７）参照）。
【００７６】
二次元ゲル電気泳動法は、当該技術分野で公知の方法を用いて実行することができる（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８２．参照）。典型的には、サンプル中の生体分子は、例えば等電点電気泳動法によって分離される。その間、正味荷電がゼロ（すなわち等電点）であるスポットに達するまでｐＨ勾配によってサンプル中の生体分子が分離される。この第一分離工程により、生体分子の一次元アレイが得られる。一次元アレイの生体分子は、第一分離工程で使用したものと一般に異なる技術を用いてさらに分離される。例えば、第二の様相では、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動法のようなポリアクリルアミドゲルを用いて、等電点電気泳動法により分離された生体分子をさらに分離する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、生体分子の分子質量に基づいてさらに分離することができる。典型的には、二次元ゲル電気泳動法は、複合混合物内の１，０００〜２００，０００Ｄａの範囲の分子質量における化学的に異なる生体分子を分離することができる。
【００７７】
二次元アレイでの生体分子は、当該技術分野で公知である任意の適切な方法を用いて検出することができる。例えば、ゲル中の生体分子は、標識又は染色（例えばクマシーブルー又は銀染色）することができる。ゲル電気泳動により、１種以上の本発明のマーカーの分子量に相当するスポットが生成されるならば、そのスポットを、気相イオン分光分析法によりさらに分析する。例えば、スポットをゲルから切り取り、気相イオン分光分析法によりそれを分析する。あるいは、電界を与えることにより、生体分子を含むゲルを不活性膜に移すこともできる。次に、マーカーの分子量にほぼ相当する膜上のスポットを気相イオン分光分析法により分析することができる。気相イオン分光分析法では、スポットは、ＭＡＬＤＩやＳＥＬＤＩ（例えばＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイを用いて）のような任意の適切な技術を用いて分析することができる。
【００７８】
気相イオン分光分析の前に、プロテアーゼ（例えばトリプシン）のような切断剤を用いて、スポット中の生体分子をより小さいフラグメントに切断するのが望ましいかもしれない。生体分子を小断片に消化することにより、スポット中の生体分子のマスフィンガープリントが供与され、これは必要ならば、マーカーの同一性を決定するために使用することができる。
さらに他の実施の形態では、極性、帯電、サイズのような異なる物理的特性に基づいてサンプル中の生体分子の混合物を分離するために、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。ＨＰＬＣ装置は、典型的には移動相の貯蔵槽、ポンプ、インジェクター、分離カラム及び検出器より構成される。サンプル中の生体分子は、サンプルのアリコットをカラムに注入することにより分離される。混合物中の異なる生体分子は、移動液相と固定相との間の分配挙動が異なるために、異なる速度でカラムを通過する。１種以上のマーカーの分子量及び／又は物理的特性に相当するフラクションを収集することができる。このフラクションは、次にマーカーを検出するために気相イオン分光分析法により分析することができる。例えば、以下で詳しく説明するＭＡＬＤＩ又はＳＥＬＤＩ（例えばＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイを用いて）のいずれか一方を用いて、当該スポットを分析することができる。
【００７９】
状況に応じて、マーカーは、その分解能を改善するためもしくはその同一性を決定するために、分析前に改変することができる。例えば、当該マーカーは、分析前にタンパク質分解させてもよく、任意のプロテアーゼを用いることができる。トリプシンのようなプロテアーゼは、マーカーを不連続の数のフラグメントに切断することが多いので、特に有用である。消化により生成したフラグメントは、マーカーのフィンガープリントとして機能し、これにより間接的にそれらを検出することができる。これは、同じような分子質量を有するマーカーが複数存在し、問題となっているマーカーが混同されるかもしれない場合に、特に有用である。また、より小さいマーカーの方が質量分析により簡単に分離されるので、タンパク質分解による断片化は、高分子量のマーカーにも有用である。他の例では、検出分解能を改善するために、生体分子を改変することができる。例えば、陰イオン性吸着剤（例えば陽イオン交換ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ）への結合を改善するため及び検出分解能を改善するために、糖タンパク質から末端シアル酸残基を除去するためにノイラミニダーゼを用いることができる。他の例では、さらにマーカーを識別できるように、分子マーカーと特異的に結合する特定の分子量のタグを結合させることにより、マーカーを改変することができる。状況に応じて、そのような改変されたマーカーを検出した後、改変されたマーカーの物理化学的特性をプロテインデータベース（例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）において適合させることにより、マーカーの同一性をさらに決定することができる。
【００８０】
ＩＩＩ．マーカーの捕捉
バイオマーカーは、本明細書に記載された任意のバイオチップ、マルチウェルマイクロタイタープレート、又は樹脂のような固体の担体に固定化された捕捉試薬を用いて捕捉されるのが好ましい。特に、本発明のバイオマーカーは、ＳＥＬＤＩプロテインバイオチップ上に捕捉されるのが好ましい。捕捉は、クロマトグラフの表面上か生体特異的表面上で行うことができる。本発明のバイオマーカーを捕捉し、検出するために、反応性表面からなる任意のＳＥＬＤＩプロテインバイオチップを用いることができる。しかし、本発明のバイオマーカーは、固定化金属キレートによく結合する。従って、Ｃｕ２＋やＮｉ２＋のような遷移金属イオンをキレート化により吸着するニトリロ酢酸官能基を有するＩＭＡＣ−３及びＩＭＡＣ−３０バイオチップが、本発明のバイオマーカーを補足する好ましいＳＥＬＤＩバイオチップである。ＳＥＬＤＩバイオチップもまた、当該バイオマーカーを特異的に捕捉する抗体を用いて誘導体化することができる、あるいは免疫グロブリンに結合するプロテインＡやプロテインＧのような捕捉試薬を用いて誘導体化することができる。次に、特定の抗体を用いて溶液中のバイオマーカーを捕捉することができ、その捕捉されたマーカーは、捕捉試薬を介してチップ上で単離することができる。
【００８１】
一般に、血清のような、バイオマーカーを含むサンプルを、バイオチップの活性表面上に結合させるために十分な時間、サンプルを配置する。次に、リン酸緩衝生理食塩水のような適切な溶離剤を用いて結合しなかった分子を表面から洗浄する。一般に、溶離剤がより厳しいものであるほど、タンパク質は洗浄後でも保持されているようにより堅く結合していなければならない。次に、その保持されたタンパク質バイオマーカーは適切な方法により検出することができる。
【００８２】
ＩＶ．マーカーの検出及び特徴づけ
Ａ．分光分析法
プロテインバイオチップの表面に捕捉された検体は、当該技術分野に公知である任意の方法により検出することができる。この方法としては、例えば質量分析法、蛍光法、表面プラズモン共鳴法、偏光解析法及び原子間力顕微鏡法が挙げられる。質量分析法、特にＳＥＬＤＩ質量分析法が、本発明のバイオマーカーの検出に対し特に有用な方法である。好ましくは、レーザー脱離飛行時間型質量分析計を本発明の実施の形態で用いる。
【００８３】
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法、すなわちＭＡＬＤＩ−ＭＳは、しばしばマトリックスと呼ばれる、プローブの表面からタンパク質をそのまま脱離させるためのエネルギー吸収分子を用いる質量分析法である。ＭＡＬＤＩは、例えば米国特許第５，１１８，９３７号明細書（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．）及び米国特許第５，０４５，６９４号明細書（Ｂｅａｖｉｓ ａｎｄ Ｃｈａｉｔ）に記載されている。ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、サンプルは典型的にはマトリックス物質と混合され、不活性プローブの表面に配置される。模範的なエネルギー吸収分子としては、ケイヒ皮酸誘導体、シナピン酸（ＳＰＡ），シアノ−ヒドロキシ−ケイ皮酸（ＣＨＣＡ）及びジヒドロキシ安息香酸が挙げられる。他の適切なエネルギー吸収分子は、当業者に公知である。マトリックスは乾燥させ、検体分子を封入する結晶を形成させる。次にその検体分子をレーザー脱離／イオン化質量分析法により検出する。ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、上記の調製方法を用いてサンプルの複雑度がかなり減少されれば、本発明のバイオマーカーを検出するのに有用である。
【００８４】
表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析法、すなわちＳＥＬＤＩ−ＭＳは、複合混合物中に存在するタンパク質のような生体分子を分画及び検出するためのＭＡＬＤＩにおける改良体に相当し、本発明の好ましい方法である。ＳＥＬＤＩは、プロテインバイオチップに結合した捕捉試薬を用いてそのプロテインバイオチップの表面にタンパク質のような生体分子を捕捉する質量分析法である。典型的には、結合しない分子は、検査する前にプローブの表面から洗浄する。ＳＥＬＤＩ技術は、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）システムの一部として、サイファージェン・バイオシステムズ社、フレモント、カリフォルニア州から入手できる。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイはＳＥＬＤＩでの使用に特に適応している。ＳＥＬＤＩは、例えば米国特許第５，７１９，０６０号明細書（”Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｅｓ”，Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ，１９９８年２月１７日）、米国特許第６，２２５，０４７号明細書（”Ｕｓｅ ｏｆ Ｒｅｔｅｎｔａｔｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｏ Ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｐｓ”，Ｈｕｔｃｈｅｎｓ ａｎｄ Ｙｉｐ，２００１年５月１日）及びＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒらの Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｒ．Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ，ｅｄ．，ｐｐ１１９１５−１１９１８ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，２０００中の“Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”に記載されている。
【００８５】
基質表面上のマーカーは、気相イオン分光分析法を用いて脱離及びイオン化することができる。気相イオン分光分析計は、基質上のマーカーを分解することができれば、任意の適切なものを使用することができる。好ましくは、気相イオン分光分析計はマーカーの定量ができるものである。好ましくは、プロテインバイオチップ上に捕捉されたマーカーは、本明細書に記載されているレーザー脱離飛行時間型質量分析計を用いて検出される。
レーザー脱離質量分析法では、マーカーを含む基質又はプローブはインレットシステムに導入される。マーカーはイオン源からのレーザー光により気相中に脱離及びイオン化される。生成されたイオンは、イオン・オプティック・アセンブリ（ｉｏｎ ｏｐｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ）により収集され、次いで飛行時間型質量分析計において、イオンは短時間の高圧領域を通って加速され、高真空チャンバーへと漂流される。高真空チャンバーの末端部では、この加速されたイオンが高感度の検出器の表面を異なる時間に衝突する。この飛行時間はイオンの質量における機能なので、帯電率に対する特定の質量のマーカーの有無を確認するために、イオンが形成されてからイオン検出器に衝突するまでの経過時間を利用することができる。
【００８６】
他の実施の形態では、マーカーを検出するためにイオン移動度分光計を用いることができる。イオン移動度分光計の原理は、このイオンの異なる移動度に基づいている。具体的に、イオン化により生成されたサンプルのイオンは、例えば質量、帯電あるいは形状の違いにより、電界の影響を受けた管の中を異なる速度で移動する。このイオン（典型的には電流の形の）は検出器に登録され、それはその後マーカーあるいはサンプル中の他の物質を同定するために使用することができる。イオン移動度分光法の長所は、常圧で操作が可能であることである。
さらに他の実施の形態では、マーカーを検出し、特徴付けるために全イオン電流測定装置を用いることができる。この装置は、基質が１種のマーカーのみを有する場合に使用することができる。１種のマーカーが基質上にある場合、イオン化されたマーカーから生成された全電流は、マーカーの量及び他の特徴を反映する。マーカーより生成された全イオン流は、次にコントロール（例えば公知の化合物の全イオン流）と比較することができる。マーカーの量及び他の特徴は次に決定することができる。
【００８７】
Ｂ．免疫測定法
他の実施の形態では、サンプル中のマーカーを検出及び分析するために免疫測定法を用いることができる。この方法は、（ａ）マーカーに特異的に結合する抗体を提供すること；（ｂ）サンプルをその抗体に接触させること；及び（ｃ）そのサンプルについてそのマーカーに結合した抗体の複合体の有無を検出することからなる。
マーカーに特異的に結合する抗体を調製するために、精製されたマーカー又はその核酸配列を用いることができる。マーカーについての核酸配列及びアミノ酸配列は、これらのマーカーをさらに特徴付けることによって入手することができる。例えば、各マーカーは、多くの酵素（例えばトリプシン、Ｖ８プロテアーゼなど）を用いてマッピングされたペプチドにすることができる。各マーカーから消化により生成されたフラグメントの分子量を用いてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースのようなデータベースを検索し、その各種酵素により生成された消化フラグメントの分子量と一致する配列を得ることができる。この方法を用いて、他のマーカーの核酸及びアミノ酸の配列を、もしそのマーカーがデータベースにおける公知のタンパク質ならば、同定することができる。
【００８８】
あるいは、プロテイン・ラダー・シークエンス法を用いてタンパク質の塩基配列を決定することができる。プロテイン・ラダーは、例えば分子を断片化し、そのフラグメントを酵素消化することにより、あるいはフラグメントの末端から単一アミノ酸を連続的に除去する他の方法により作成することができる。プロテイン・ラダーの作成方法は、例えば国際公開第ＷＯ ９３／２４８３４号明細書（Ｃｈａｉｔ ｅｔ ａｌ．）及び米国特許第５，７９２，６６４号明細書（Ｃｈａｉｔ ｅｔ ａｌ．）に記述されている。ラダー・フラグメントは、次に質量分析法により分析される。ラダー・フラグメントの質量の差により、分子の末端から除去されたアミノ酸が同定される。
【００８９】
マーカーがデータベースにおいて未知のタンパク質ならば、核酸及びアミノ酸の配列は、たとえマーカーの一部のアミノ酸配列でもその知識を用いて決定することができる。例えば、マーカーのＮ末端アミノ酸配列に基づいて変性プローブを作成することができる。これらのプローブを用いて、次に、マーカーを最初に検出したサンプルから作成したゲノムライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。陽性クローンを同定し、増幅し、そしてよく知られた方法を用いて組み換えＤＮＡ配列をサブクローニングすることができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ １９８９）、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ ２００１）参照）。
【００９０】
当該技術分野で公知である任意の適切な方法を用いて、精製されたマーカー又はその核酸配列を使用し、マーカーに特異的に結合する抗体を作成することができる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）；Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．１９８６）；及びＫｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）参照）。このような方法には、ファージあるいは同様のベクターを用いて、組み換え抗体のライブラリーから抗体を選択することにより抗体を作成する方法、及び免疫ラット又は免疫マウスによりポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作成する方法が含まれるが、これに限定されない（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６（１９８９）参照）。
【００９１】
抗体が提供された後は、当該技術分野に公知である任意の適切な免疫結合法（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を用いてマーカーを検出及び／又は定量することができる（例えば、米国特許第４，３６６，２４１；４，３７６，１１０；４，５１７，２８８；及び４，８３７，１６８号明細書参照）。有用な測定法としては、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）のような酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ），ウエスタンブロット法及びスロットブロット法が挙げられる。これらの方法もまた、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ３７（Ａｓａｉ，ｅｄ．１９９３）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ，ｅｄｓ．，７ｔｈ ｅｄ．１９９１）；及びＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，ｓｕｐｒａに記述されている。
【００９２】
一般に、被験動物から得られたサンプルは、マーカーと特異的に結合する抗体に接触させることができる。状況に応じて、抗体は洗浄及び次の工程である複合体の単離を容易にするために、抗体とサンプルを接触させる前に抗体を固体の担体に固定することができる。固体の担体としては、例えばマイクロタイタープレート、スティック、ビーズ、あるいはマイクロビーズの形状のガラスあるいはプラスチックが挙げられる。また、抗体は上記のプローブ基質又はＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイに結合させることもできる。サンプルは、好ましくは被験動物から採取した生体液である。生体液のサンプルとしては、例えば血液、血清、血漿、乳頭吸引液、尿、涙、唾液などが挙げられる。好ましい実施の形態では、生体液は血清からなる。このサンプルは、抗体と接触させる前に、適切な溶離剤で希釈することができる。
【００９３】
サンプルを抗体とともにインキュベートした後は、この混合物を洗浄し、形成された抗体とマーカーの複合体を検出することができる。これは、洗浄した混合物を検出試薬とともにインキュベートすることにより遂行することができる。この検出試薬は、例えば検出可能なラベルで標識された二次抗体でもよい。模範的な検出可能なラベルとしては、電磁ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標））、蛍光色素、放射標識、酵素（例えばホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ及びＥＬＩＳＡで一般に使用される他の酵素）、及び金コロイド、着色ガラス、プラスチックビーズのような比色標識（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｌａｂｅｌ）が挙げられる。あるいは、結合したマーカー特異的抗体を検出するために、例えば二次の標識抗体を使用する間接的測定法を用いて、及び／又は、例えば、マーカーの特有のエピトープと結合するモノクローナル抗体を混合物とともに同時にインキュベートする競合試験法又は阻止試験法を用いてサンプル中のマーカーを検出することができる。
【００９４】
これらのアッセイの間、それぞれの試薬を組み合わせた後は、インキュベーション及び／又は洗浄工程を要するかもしれない。インキュベーション工程は、約５秒から数時間までと様々であり、好ましくは、約５分から約２４時間である。しかし、インキュベーション時間はアッセイフォーマット、マーカー、溶液の量、濃度等に応じて変わる。アッセイは１０℃〜４０℃のような温度範囲にわたって実行することができるが、通常は常温で行われる。
免疫測定法は、サンプル中のマーカーの有無及びサンプル中のマーカーの量を決定するために用いることができる。まず、サンプル中のマーカーのテスト量を上記の免疫測定法を用いて検出することができる。もしマーカーがサンプル中に存在するならば、上記の適切なインキュベーション条件下でマーカーに特異的に結合する抗体を用いて、抗体とマーカーの複合体が形成される。抗体とマーカーの複合体の量は、標準品と比較することにより決定することができる。標準品は、例えば公知の化合物あるいはサンプル中に存在することが公知である他のタンパク質とすることができる。上記のように、マーカーのテスト量は、その測定単位がコントロールと比較することが可能ならば、絶対単位で測定する必要は無い。
【００９５】
サンプルについてのこれらのマーカーを測定する方法は、多くの用途がある。例えば、ヒト癌の診断又は予後診断を補助するために、１種以上のマーカーを測定することができる。他の例では、癌の治療に対する被験動物の反応をモニターするために、このマーカーの検出方法を用いることができる。他の例では、インビボあるいはインビトロにおけるこれらのマーカーの発現を調節する化合物を測定するため及び同定するために、このマーカーを検出する方法を使用することができる。好ましい例では、腫瘍の進行における異なる段階を識別するためにバイオマーカーが使用され、従って、適切な治療及び腫瘍の転移の度合いを決定するのに役立つ。
【００９６】
Ｖ．データ分析
質量分析によるデータ作成は、イオン検出器によりイオンを検出することから始まる。典型的なレーザー脱離質量分析計は３３７．１ｎｍの窒素レーザーを使用することができる。有用なパルス幅は約４ナノ秒であり、一般に約１〜２５Ｊの出力が使用される。検出器に衝突するイオンは電位を生成し、それはアナログ信号をデジタル化して捕集する高速時間配列記録装置によりデジタル化される。サイファージェンのＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）システムは、これを実行するためにアナログ・デジタル・コンバータ（ＡＤＣ）を使用する。ＡＤＣは、一定時間ごとに検出器のアウトプットを時間依存性ビン（ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｎｓ）に統合する。時間間隔は、典型的には１から４ナノ秒である。さらに、最終的に分析される飛行時間スペクトルは、典型的にはサンプルに対するイオン化エネルギーの単一パルスからの信号ではなく、多数のパルスからの信号の合計を表す。これはノイズを減少させ、ダイナミック・レンジを増加させる。この飛行時間データは、次にデータ処理される。サイファージェンのＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）ソフトウェアでは、データ処理は典型的には、ＴＯＦからＭ／Ｚへの変換、ベースライン減算、高周波ノイズフィルタリングを含む。
【００９７】
ＴＯＦからＭ／Ｚへの変換は、飛行時間を質量電荷比（Ｍ／Ｚ）に変換するアルゴリズムの適用に関連する。この工程では、信号は、タイム・ドメインからマス・ドメインに変換される。すなわち、各飛行時間は、質量電荷比（Ｍ／Ｚ）に変換される。キャリブレーションは内部からあるいは外部から行うことができる。内部キャリブレーションでは、分析されるサンプルに、公知のＭ／Ｚの検体が１種以上含まれる。これらの集団の検体を表す飛行時間における信号ピークに、公知のＭ／Ｚが付与される。これらの付与されたＭ／Ｚ比に基づいて、飛行時間をＭ／Ｚに変換する数学関数によってパラメータが算出される。外部キャリブレーションでは、事前の内部キャリブレーションによって作成されたような飛行時間をＭ／Ｚに変換する関数が、内部キャリブラント（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃａｌｉｂｒａｎｔ）を使用しないで飛行時間スペクトルに適用される。
【００９８】
ベースライン減算は、スペクトルを乱す、人工的で再現可能な装置のオフセットを排除することによりデータの定量化を改善する。これは、ピーク幅のようなパラメータを組み入れるアルゴリズムを用いてスペクトルベースラインを算出し、次にマススペクトルからそのベースラインを差し引くことに関連する。
高周波ノイズ信号は、平滑化関数を適用することにより排除される。典型的な平滑化関数は、移動平均機能を各時間依存性ビン（ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｎ）に適用される。改良版では、移動平均フィルターは、例えばピークバンド幅の関数としてフィルターのバンド幅が異なる可変幅のデジタルフィルターであり、一般に飛行時間が増加するにつれて広くなる（例えば、国際公開第ＷＯ ００／７０６４８号明細書、２０００年１１月２３日（Ｇａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｗｉｄｔｈ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｆｉｌｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”）参照）。
【００９９】
コンピュータは、得られたスペクトルを、ディスプレイのための様々なフォーマットに変換することができる。「スペクトル図又は保持マップ（ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｖｉｅｗ ｏｒ ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｍａｐ）」と呼ばれる一つのフォーマットでは、標準スペクトル図を表示することができ、その中でその図は、特定の分子量ごとに検出器に到達した検体の量を示す。「ピークマップ」と呼ばれる他のフォーマットでは、スペクトル図からピークの高さ及び質量の情報のみが保持され、よりきれいな画像を生み出し、ほぼ同じ分子量を持つ検体をより簡単に認識することができる。「ゲル図」と呼ばれるさらに他のフォーマットでは、それぞれのピークの高さに基づいて、ピーク図からのそれぞれの質量を濃淡画像に変換することができ、その結果、外観が電気泳動ゲル上のバンドのように見える。「３Ｄオーバーレイ」と呼ばれるさらに他のフォーマットでは、相対的なピークの高さのわずかな変化を観察するために、いくつかのスペクトルを重ね合わせることができる。「相違マップ図」と呼ばれるさらに他のフォーマットでは、独特の検体及びサンプル間において上方制御あるいは下方制御される検体を簡便に強調表示することにより、２つ以上のスペクトルを比較することができる。
【０１００】
分析は一般に、検体からの信号を表すスペクトルにおけるピークの同定に関連する。ピークの選択は、もちろん視覚的に行うことができる。しかし、ピークの検出を自動化することができるサイファージェンのＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）ソフトウェアの一部としてソフトウェアを利用することができる。一般に、このソフトウェアは、選択された閾値よりも高い信号対雑音比を持つ信号を同定し、ピーク信号の中心にあるピークの質量を標識することにより機能する。一つの有用な適用では、選択されたある割合のマススペクトル中に存在する同一のピークを同定するために、多くのスペクトルが比較される。このソフトウェアの一つのバージョンは、指定された質量範囲内の様々なスペクトル中に現れた全てのピークを集めて、質量（Ｍ／Ｚ）集団の中間点に近い全てのピークに、質量（Ｍ／Ｚ）を付与する。
【０１０１】
１つ以上のスペクトルからのピークデータは、例えば、各行が特定のマススペクトルを表し、各列がその質量により規定されたスペクトルのピークを表し、各セルがその特定のスペクトルにおけるピークの強度を含む集計表を作製することにより、さらに分析することができる。様々な統計的アプローチ又はパターン認識的アプローチをそのデータに適用することができる。
本発明の実施の形態で生成されたスペクトルは、分類モデルを使用するパターン認識処理を用いて分類することができる。一般に、スペクトルは少なくとも二つの異なるグループからのサンプルを表し、そのための分類アルゴリズムが探求される。そのグループは、例えば病的対非病的（例えば、癌対非癌）、薬物反応者対薬物非反応者、毒性反応対非毒性反応、病期が進行する人対病期が進行しない人、表現型条件がある人対表現型条件がない人等が挙げられる。
【０１０２】
ある実施の形態では、「公知のサンプル」のようなサンプルを用いて生成されたスペクトル（例えばマススペクトル又は飛行時間スペクトル）から得られたデータは、次に分類モデルを「訓練（ｔｒａｉｎ）」するために使用することができる。「公知のサンプル」は事前に分類されたサンプルである。スペクトルから得られ、分類モデルを作成するために使用されるデータは、「トレーニングデータセット」と呼ぶことができる。いったん訓練されると、分類モデルは、未知のサンプルを用いて生成されたスペクトルから得られたデータのパターンを認識することができる。この分類モデルは、次に未知のサンプルをいくつかのクラスに分類するために使用することができる。これは、例えばある生体サンプルが、特定の生物学的条件（例えば罹患している対罹患していない）に関連しているかどうかを予測するのに有用であるかもしれない。
【０１０３】
分類モデルを作成するために使用されるトレーニングデータセットは、生データ又は事前に処理されたデータより構成されてもよい。ある実施の形態では、生データは飛行時間スペクトル又はマススペクトルから直接得ることができ、次いで、状況に応じて上記のようにそれを「事前に処理」してもよい。
分類モデルは、データ中に存在する目的のパラメータに基づいてデータ本体をクラスに分類しようとする任意の適切な統計的な分類（又は「学習」）法を用いて作成することができる。分類法は、教師付きでも教師なしでもどちらでもよい。教師付き分類及び教師なし分類処理の例は、Ｊａｉｎ，“Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”，ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ ２０００に記述されている。
【０１０４】
教師付き分類では、公知のカテゴリーの例を含むトレーニングデータが、公知のクラスをそれぞれ規定する１セット以上の関連性を学習する学習機構に提供される。新しいデータは学習機構に適用されてもよく、次に学習された関連性を用いてその新しいデータを分類する。教師付き分類処理としては、例えば、線形回帰処理（例えば、多重線形回帰（ＭＬＲ）、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰、及び主成分回帰（ＰＣＲ））、二分決定木（例えば、ＣＡＲＴ（分類木と回帰木）のような再帰的分割処理）、バックプロパゲーション・ネットワークのような人工神経ネットワーク、判別分析（例えば、ベイズ分類器（Ｂａｙｅｓｉａｎ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）又はフィッシャー分析）、ロジスティック分類器（ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）及びサポート・ベクトル分類器（Ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅ）が挙げられる。
【０１０５】
好ましい教師付き分類法は、再帰的分割処理である。再帰的分割処理は、未知のサンプルから得られるスペクトルを分類するために再帰的分割木が用いられる。再帰的分割処理については、米国特許仮出願公開第６０／２４９，８３５号明細書（出願日：２０００年１１月１６日）及び第６０／２５４，７４６号明細書（出願日：２０００年１２月１１日）及び米国特許本出願公開第０９／９９９，０８１号明細書（出願日：２００１年１１月１５日）及び第１０／０８４，５８７号明細書（出願日：２００２年２月２５日）にさらに詳しく説明されている。これら全ての米国特許仮出願及び本出願は、あらゆる目的で、本明細書にそのまま参照として取り込まれる。
【０１０６】
他の実施の形態では、作成される分類モデルを、教師なし学習法を用いて作成することができる。教師なし分類法は、トレーニングデータセットが得られたスペクトルを事前に分類しないで、トレーニングデータセットにおける類似性に基づいて分類法を学習しようとする。教師なし学習法はクラスター分析を含む。クラスター分析はデータを「集落（クラスター）」すなわち、理想的には互いに非常に似ており、他の集落の要素とは非常に異なっている要素を有するグループに分類しようとする。次に、データアイテム間の距離を測定するある距離メトリックを用いて類似性を測定し、互いに距離が近いデータアイテムを集めて集落にする。クラスタリングの方法としては、ＭａｃＱｕｅｅｎのＫ−平均アルゴリズム及びＫｏｈｏｎｅｎの自己組織化マップアルゴリズムが挙げられる。
【０１０７】
分類モデルは、任意の適切なデジタルコンピュータ上で作成し、使用することができる。適切なデジタルコンピュータとしては、ユニックス、ウィンドウズ（登録商標）、リナックス（登録商標）ベースのオペレーティングシステムなどの、任意の標準オペレーティングシステム又は専門オペレーティングシステムを用いるマイクロコンピュータ、ミニコンピュータ及び大型コンピュータが挙げられる。使用されるこのデジタルコンピュータは、関心があるスペクトルを生成するために使用される質量分析計と物理的に分離されていてもよいし、連結されていてもよい。
本発明の実施の形態によるトレーニングデータセット及び分類モデルは、デジタルコンピュータにより実行される、あるいは使用されるコンピュータコードにより統合することができる。このコンピュータコードは、光ディスク、磁気ディスク、スティック、テープなど、任意の適切なコンピュータ可読の媒体に保存することができ、且つＣ，Ｃ＋＋、ビジュアルベーシックなどの、任意の適切なコンピュータプログラミング言語で書き込むことができる。
【０１０８】
マーカーの脱離及び検出により作成されたデータは、任意の適切な手段を用いて分析することができる。一つの実施の形態では、プログラム可能なデジタルコンピュータを利用して、データが分析される。コンピュータプログラムは一般にコードを保存する可読媒体を含む。あるコードは、プローブ上のそれぞれの特徴づけるものの場所、その特徴づけるものに対する吸着剤の同一性及びその吸着剤を洗浄するために用いられる溶離条件を含むメモリーに専念することができる。また、コンピュータもインプットとして、プローブ上の特定のアドレス可能な場所から受け取る、様々な分子質量に対する信号の強度に関するデータを受け取るコードを含む。このデータは、各マーカーにより生成された信号の強度を含み、検出されたマーカーの数を示すことができる。
【０１０９】
データ分析は、検出されるマーカーの信号強度（例えばピークの高さ）を決定する工程及び「外れ値」（所定の統計的分布から逸脱したデータ）を取り除く工程を含むことができる。観察されたピークは正規化することができ、それによりある基準に対するそれぞれのピークの高さが算出される。例えば、基準は装置や化学物質（例えばエネルギー吸収分子）により生成されたバックグラウンドノイズとすることができる。これはスケールにおいてゼロに設定される。次に各マーカー又は他の生体分子について検出された信号強度を所望のスケール（例えば１００）における相対強度の形で表示することができる。あるいは、サンプルについて標準品（例えば血清タンパク質）を承認し、各マーカー又は他の検出されるマーカーについて観察される信号の相対強度を算出するために、その標準品のピークを基準として用いることができる。
【０１１０】
コンピュータは、得られたデータを、ディスプレイのための様々なフォーマットに変換することができる。「スペクトル図又は保持マップ（ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｖｉｅｗ ｏｒ ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｍａｐ）」と呼ばれる一つのフォーマットでは、標準スペクトル図を表示することができ、その中でその図は、特定の分子量ごとに検出器に到達したマーカーの量を示す。「ピークマップ」と呼ばれる他のフォーマットでは、スペクトル図からピークの高さ及び質量の情報のみが保持され、よりきれいな画像を生み出し、ほぼ同じ分子量を持つマーカーをより簡単に認識することができる。「ゲル図」と呼ばれるさらに他のフォーマットでは、それぞれのピークの高さに基づいて、ピーク図からのそれぞれの質量を濃淡画像に変換することができ、その結果、外観が電気泳動ゲル上のバンドのように見える。「３Ｄオーバーレイ」と呼ばれるさらに他のフォーマットでは、相対的なピークの高さのわずかな変化を観察するために、いくつかのスペクトルを重ね合わせることができる。「相違マップ図」と呼ばれるさらに他のフォーマットでは、独特のマーカー及びサンプル間において上方制御あるいは下方制御されるマーカーを簡便に強調表示することにより、２つ以上のスペクトルを比較することができる。任意の二つのサンプルからのマーカープロファイル（スペクトル）は、視覚的に比較してもよい。さらに他のフォーマットでは、スポットファイア・スキャタ・プロット（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ Ｓｃａｔｔｅｒ Ｐｌｏｔ）を用いることができ、これは検出されるマーカーを点でプロットし、プロットの一つの軸は検出されたマーカーの見かけの分子を示し、他方の軸は検出されたマーカーの信号強度を示す。それぞれのサンプルについて、検出されたマーカー及びサンプル中に存在するマーカーの量をコンピュータ可読媒体に保存することができる。このデータは次にコントロール（例えば、ヒト癌を検出することができない女性などのコントロール中に検出されたマーカーのプロファイル又は量）と比較することができる。
【０１１１】
Ｖ．被験動物の状態の決定
任意のバイオマーカーが個別的に、乳癌の状態の決定を補助するのに有用である。まず、被験動物のサンプル中の選択されたバイオマーカーを本明細書に記述した方法（例えば、ＳＥＬＤＩ ＩＭＡＣ−Ｎｉバイオチップ上で捕捉し、次に質量分析法により検出する）を用いて測定する。次に、その測定値を診断量又は乳癌の状態を癌に罹患していない状態から識別するコントロールと比較する。診断量は、特定のバイオマーカーが癌に罹患していない状態と比較すると、癌の状態において上方制御又は下方制御されるという本明細書での情報を反映する。当該技術分野でよく知られているように、使用される特定の診断量は、診断医の好みに応じて、診断検査の感度又は特異度が増加するように調整することができる。従って、テスト量と診断量を比較することにより、乳癌の状態が示される。
【０１１２】
個々のバイオマーカーは有用な診断マーカーであるが、バイオマーカーを組み合わせると、単独のマーカーよりも予測値が高くなることが分かっている。より具体的には、マーカーＢＣ１、ＢＣ２及びＢＣ３が、単独でも組み合わせてでも、最も高い識別力を示すバイオマーカーである。
このバイオマーカーを組み合わせて使用するためには、ロジスティック回帰アルゴリズムが有用である。テストデータより診断アルゴリズムを作成するためにＵＭＳＡアルゴリズムが特に有用である。このアルゴリズムは、Ｚ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｙｉｎｇ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｅｐａｒａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｍｉｃｒｏａａｒｙ ｄａｔａに開示されている。（Ｉｎ：Ｌｉｎ，ＳＭ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＫＦ，ｅｄｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐａｐｅｒｓ ｆｒｏｍ ＣＡＭＤＡ ’００．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００１：１２５−１３６；ａｎｄ Ｚ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｓｈｉｎｇ Ｅｘｐｅｄｉｔｉｏｎ −ａ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｆｒｏｍ ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅｓ． Ｉｎ Ｌｉｎ ＳＭ， Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＫＦ，ｅｄｓ．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＩＩ：Ｐａｐｅｒｓ ｆｒｏｍ ＣＡＭＤＡ ’０１．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００２）
【０１１３】
学習アルゴリズムは、操作者が所望する特定の特異度及び感度に合わせた多変量分類（診断）アルゴリズムを生成する。次に、乳癌の状態を決定するためにその分類アルゴリズムを使用することができる。この方法もまた、被験動物のサンプル中の選択されたバイオマーカー（例えば、マーカーＢＣ１、ＢＣ２及びＢＣ３）を測定することに関連する。これらの測定値について分類アルゴリズムを実行する。分類アルゴリズムは、乳癌の状態を示す指標スコアを生成する。
【０１１４】
以下の実施例は、例として提供されるものであり、限定することを意図していない。今まで具体的な例を提供してきたが、上記の記述は例示であって制限的なものではない。先に説明した実施の形態における任意の１つ以上の特質は、任意の方法により、本発明の任意の他の実施の形態における１つ以上の特質と組み合わせることができる。さらに、本明細書を精査すれば、本発明における多くの変形が当業者にとって明らかとなるだろう。従って、本発明の範囲は、上記の説明を参照して決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲を参照して、それらの同等物の全容とともに決定されるべきである。
本出願に引用された全ての出版物及び特許文献は、個々の出版物又は特許文献がそのように個別に示されているのと同程度のあらゆる目的で、その全内容は本明細書に参照として取り込まれる。各種の参考文献を本明細書に引用することにより、本出願者らは任意の特定の参考文献が本発明の「先行技術」であるとは認めない。
【０１１５】
実施例
概説
以下の実施例では、以下に示す材料と方法が使用された。
サンプル
遡及的血清サンプルは、臨床試験におけるジョーンズ・ホプキンス・ジョイント・コミティー（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）が承認したプロトコルに従って、ジョーンズ・ホプキンスの臨床化学血清バンクから入手した。本試験には、全部で１６９の検体が含まれた。癌グループは、異なる臨床病期（ステージ０期（ｎ＝４）、ステージＩ期（ｎ＝３８）、ステージＩＩ期（ｎ＝３７）及びステージＩＩＩ期（ｎ＝２４））の乳癌患者から１０３の血清サンプルより構成された。診断は病理学的に確認し、検体は治療前に入手した。これらの患者のうち、６名の年齢の情報が入手できなかった。残り９６名の患者の年齢は３４歳から８７歳の範囲にわたり、中央値は５６歳だった。癌に罹患していないコントロールグループは、２５名の良性の乳房疾患（ＢＮ）及び４１名の健康な女性（ＨＣ）からの血清より構成された。２１名の健康な女性からは、正確な年齢の情報を入手できなかった。残り２０名の健康な女性の年齢は３９歳から５７歳の範囲にわたり、中央値は４５歳だった。良性状態のグループの年齢は２１歳から７８歳の範囲にわたり、中央値は４８歳だった。全てのサンプルは、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１１６】
プロテインチップ分析
２０μｌの各血清サンプルに、３０μｌの８Ｍの尿素、１％のＣＨＡＰＳを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加えた。混合液は４℃で１５分間ボルテックスし、ＰＢＳで１：４０の比となるように希釈した。固定化金属アフィニティーキャプチャーチップ（ＩＭＡＣ３）は、メーカーの使用説明書（サイファージェン・バイオシステムズ社、カリフォルニア州）に従って、５０ｍＭのＮｉＳＯ４で活性化させた。５０μｌの希釈したサンプルを、９６ウェルバイオプロセッサ（サイファージェン・バイオシステムズ社、カリフォルニア州）を用いてプロテインチップアレイ上のスポットにそれぞれアプライした。プラットフォームシェーカー上で室温にて６０分間結合させた後、１００μｌのＰＢＳで５分間のアレイの洗浄を２回行い、次に１００μｌのｄＨ２Ｏで２回すばやくリンスした。風乾した後、５０％のアセトニトリル及び０．５％のトリフルオロ酢酸で調製した０．５μｌの飽和シナピン酸（ＳＰＡ）を各スポットに２回アプライした。キレート化した金属（ヒスチジン、トリプトファン、システイン又はリン酸化アミノ酸を介して）に結合したタンパク質は、ＰＢＳ−ＩＩマスリーダーで検出した。強度を２４０、検出器の感度を８にして、８０のレーザーショットを平均化することにより、データを収集した。再現性は２つの代表的な血清サンプル（一つは健常コントロールから、もう一つは癌患者から）を用いて評価した。二つのバイオプロセッサのそれぞれにおいて、一つのＩＭＡＣ−Ｎｉチップの８ベイト表面の全てに、各血清サンプルをスポットした。変動係数は、選択されたマスピークについて評価した。
【０１１７】
バイオインフォマティクス及び生物統計学
２Ｋ〜１５０Ｋ間のＭ／Ｚを有する認定されたマスピーク（Ｓ／Ｎ＞５、及び０．３％のクラスター・マス・ウィンドウ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｍａｓｓ ｗｉｎｄｏｗ））を選択し、プロテインチップ・ソフトウェア３．０（サイファージェン・バイオシステムズ社、カリフォルニア州）を用いてピーク強度を全イオン流に対して正規化した。更なる事前の処理工程は、目的のスペクトル（Ｍ／Ｚ＝２ｋＤ〜１５０ｋＤ）の全ての範囲にわたって、より一貫性のあるレベルのデータのばらつきを得るために、ピーク強度のデータに適用された対数変換が含まれた。
【０１１８】
二つの診断グループの最適な分離に対するそれぞれのピークの寄与率を計算し、ランク付けるために、ソフトウェア・パッケージ・ＰｒｏＰｅａｋ（３Ｚ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、サウスカロライナ州）を使用した。ＰｒｏＰｅａｋは、マイクロアレイデータ分析において使用したことが最初に報告された統合最大分離可能度分析（Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｐａｒａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＵＭＳＡ））アルゴリズムの線形バージョンを実行する（Ｚ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｙｉｎｇ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｐａｒａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｄａｔａ，ｉｎ Ｐｒｏｃ．ｏｆ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＡＭＤＡ ’００），Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００１）。ＵＭＳＡアルゴリズムの鍵となる特性は、二つのデータのクラスが最もよく分離される方向を同定するために、データ分布情報を構造的リスク最小化学習（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｉｓｋ ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ−ｌｅａｒｎｉｎｇ）アルゴリズムに組み入れたことである（Ｖａｐｎｉｋ ＶＮ， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｈｅｏｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８１４）。この方向は、元の変数の一次結合（加重和）として表される。この結合におけるそれぞれの変数に割り当てられた重みは、二つのデータクラスの分離に対する変数の寄与率を測定する。
【０１１９】
ＰｒｏＰｅａｋは３種のＵＭＳＡベースの分析モジュールを提供する。第一のモジュールは、それぞれの検体を個々の点として３次元の成分空間に投影する成分分析モジュールである。この成分（軸）は、元のスペクトルピーク強度の一次結合である。この軸は、二つの事前に規定したデータグループが最大の分離可能度を達成する方向に相当する。二つのデータグループ間の分離は、双方向性３Ｄディスプレイで点検することができる。第二のモジュールは、それぞれのピークについての有意性スコアを計算し、二つの事前に規定したデータグループの最大の分離に対するそれらの集積された寄与率に従ってランク付けするためのＵＭＳＡを適用するために後進ステップワイズ変数選択（ｂａｃｋｗａｒｄ ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）プロセスを用いるステップワイズ・セレクション・モジュールである。スコアの絶対値がデータ分離に対する相対的な重要度を表すのに対し、正のスコア及び負のスコアは、罹患グループについて相当するマスピークの発現レベルが相対的に増加した及び減少したことをそれぞれ示す。データ中の関係のないアーティファクトのみに基づいたピークの選択を避けるために、第三のＰｒｏＰｅａｋのモジュール、すなわちブートストラップは、毎回両方のグループから定率のサンプルをランダムに除去する操作を複数回実行するためのＵＭＳＡを繰り返すブートストラップ手順を使用する。中央値及び平均ランク、及び相当する標準偏差がピークごとに推定される。有望なバイオマーカーは、中央値及び平均ランクが上位であり、標準偏差のランクが最小であるピークであるべきである。目的物の選択基準を確立する方法としては、同じブートストラップ手順が、実際のデータの分布をピークからピークへ順次シミュレートするランダムデータセットにも適用される。一貫性のある成績を有するピークを選択するための標準偏差のランクに関する統計的に適切なカットオフ値を設定するために、実際のデータからの結果をシミュレートされたデータからのものと比較する。
【実施例１】
【０１２０】
乳癌を早期段階で検出するバイオマーカーの同定
乳癌を早期段階で検出することができる有望なバイオマーカーを同定するために、ステージ０〜Ｉ期の乳癌患者からの検体のタンパク質プロファイルを癌に罹患していないコントロールのものと比較した。分析は、ＰｒｏＰｅａｋの三種全てのモジュールを用い、複数回繰り返して行った。この繰り返しの過程で、元の完全なスペクトルは、二つの選択された診断グループ間の最適な分離において高レベルの有意性を一貫して実証するマスピークの小さいサブセットまでに削減された。
【０１２１】
バイオマーカーの小さいパネルを選択し、ステージＩＩ期及びＩＩＩ期の癌患者からのデータを用いて、そのマーカーの乳癌検出能を個別的に試験した。その全部のデータセットに基づいて、多変量ロジスティック回帰を用いて複合指数を導き出した。二標本ｔ検定からのｐ値を含む記述統計を推定した。次に、選択されたバイオマーカーと複合指数について受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を実行した。ブートストラップ手順を用いて、感度及び特異度のような複合指数の成績評価基準を推定した（Ｅｆｒｏｎ Ｂ ａｎｄ Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ Ｒ．Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｅｒｒｏｒｓ，Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｖａｌｓ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｍｅａｓｕｒｅｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｃｃｕｒａｃｙ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８６；１：５４−７５）。この手順では、感度及び特異度を計算するためのロジスティック回帰及びテストセットにより複合指数を導き出すために、ランダムリサンプリングにより、患者のデータセットの全てをトレーニングセットに分割した。このリサンプリングプロセスは何度も繰り返した。感度及び特異度におけるブートストラップ推定を作成するために、複数回の実行により得られた結果を最後に集約した。
【実施例２】
【０１２２】
ピーク検出及びデータ処理
ＩＭＡＣ−Ｎｉ２＋チップ上に保持された血清タンパク質は、ＰＢＳ−ＩＩマスリーダーで分析した。全部で１４７の２ＫＤを超えるＭ／Ｚを有する定量化したマスピーク（Ｓ／Ｎ＞５、及び０．３％のクラスター・マス・ウィンドウ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｍａｓｓ ｗｉｎｄｏｗ））を選択した。２ＫＤに満たないＭ／Ｚのピークは、マトリックスからの干渉を排除するために除外される。オール・イン・１・プロテイン標準品（Ａｌｌ Ｉｎ １ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（サイファージェン・バイオシステムズ社、カリフォルニア州））を用いて外部キャリブレーションにより０．１％の質量の正確性が達成された。このような分析から得られた代表的なスペクトルを図２に示す。対数変換をピーク強度値に適用した。図３のプロットは、対数変換によるばらつき低減及び同等化の効果を示す。
【実施例３】
【０１２３】
早期癌及び癌に罹患していないコントロールに基づくバイオマーカーの選択
乳癌を早期に検出する可能性があるバイオマーカーを同定するために、早期癌の罹患者を陽性グループ（ステージ０〜Ｉ期、ｎ＝４２）及び癌に罹患していないコントロールを陰性グループ（ＨＣ＋ＢＮ、ｎ＝６６）として用い、ＵＭＳＡを実行した。まず、１４７のマスピーク全ての一次結合から導き出されたＵＭＳＡを用いて、二つのグループ間の分離可能度を試験した。早期癌は、全てのタンパク質プロファイルを比較した際に、癌に罹患していないグループから分離することができた。図４Ａは、ＵＭＳＡ成分３Ｄ空間における早期癌に罹患しているグループ（淡色）と癌に罹患していないグループ（濃色）をプロットしたものである。
一貫して良い成績を示すバイオマーカーを選択するために、ＰｒｏＰｅａｋブートストラップモジュールを用いてＵＭＳＡを繰り返し適用し、毎回３０％の除外率で合計１００回行った。同様の手順を、シミュレートされたランダムデータセットにも適用した。シミュレートされたデータから導き出された最小標準偏差は７だった。実験データでは、１５のマスピークがこの値よりも小さい標準偏差を有していた。このマスピークのサブセットは、さらに分析するために、候補バイオマーカーとして選択した。これらの平均ランク及び相当する標準偏差をプロットしたものを図４に示す。
【０１２４】
この削減された候補バイオマーカーのセットについて、それらのピークをさらにランク付けるために、ＰｒｏＰｅａｋのステップワイズ・セレクション・モジュールを適用した。１５のピーク（表４参照）における相対的有意性スコアの絶対値を降順にプロットしたものを図８Ａに示す。これにより、最初の６つのピークが二つのグループ間の大部分の分離可能度に寄与していることが分かる。これらの６つのピークのうち４つが特徴的である。他の２つは、その特徴的なピークのうちの２つの二重荷電の形態であることが、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐソフトウェア３．０を用いて確認された。このピークの二重荷電の形態と１重荷電の形態の両方の認識は、それらがその選択された２つの診断グループを識別するのに重要であることを示唆する。この二重荷電の形態を取り除き、４つの特徴的なピークを再結合し、ステップワイズ・セレクションを用いて再び評価した。再び算出した相対的有意性スコアをプロットしたものを図６Ｂに示す。上位スコアの３つのピーク（ＢＣ１、ＢＣ２及びＢＣ３と称される）は、最終的に乳癌の検出に有望なバイオマーカーとして選択された。ＢＣ１は下方制御（スコア値が負）され、ＢＣ２及びＢＣ３は上方制御（スコア値が正）されているように観察された。これら３種のバイオマーカーを用いたステージ０〜Ｉ期の乳癌と癌に罹患していないコントロールとを比較する３Ｄプロットを図４Ｂに示す。
【実施例４】
【０１２５】
選択されたバイオマーカーの評価
これら３種のバイオマーカーの記述統計を表１に記載する。図７はＲＯＣ分析の結果を示す。この３種のバイオマーカーのうち、ＢＣ３が最も個別的な診断力を示した。癌患者の臨床病期を含む診断グループにわたるＢＣ３の寄与をプロットし、これを図８Ａに示す。診断グループを識別するために、０．８のカットオフ値でＢＣ３のみを用いた際の感度及び特異度を表２Ａに記載する。
対数変換したピーク強度の推定ＣＶは、ＢＣ１については６％、ＢＣ２については７％、そしてＢＣ３については１３％だった（データは図示せず）。この３種のバイオマーカーのうち、ＢＣ３が最も高い１３％のＣＶを有していた。これに対し、癌患者におけるＢＣ３の平均値は、癌に罹患していないコントロールの平均値よりもほぼ９０％高かった（表１のデータの基づいて算出）。
【０１２６】
【表１】
【実施例５】
【０１２７】
３種の選択されたバイオマーカーを組み合わせた使用
図９は、ペアにしたバイオマーカーの全ての組み合わせにおける、癌に罹患していないコントロールに対する全臨床病期の癌患者の分布を比較したものである。この観察に基づいて、３種の選択されたバイオマーカーを組み合わせるために多変量ロジスティック回帰を使用し、単一値の複合指数を作成した。この複合指数の記述統計は、表１に付加する。様々な診断グループにわたる分布をプロットし、これを図８Ｂに示す。複合指数のＲＯＣ曲線分析により、個々のバイオマーカーからのものと比較して非常に改善されたＡＵＣが提供された（図７）。
【０１２８】
複合指数の診断成績を推定するためにブートストラップ・クロスバリデーションを使用した（２０回実行；それぞれの実行において、複合指数を導出するために７０％のサンプルをランダムに選択し、残りの３０％を検査した）。推定感度及び推定特異度を表２Ｂに記載する。
また、ｐＴ（腫瘍サイズ）及びｐＮ（リンパ節転移）のカテゴリーに関して、この３種の有望なバイオマーカーのレベルも評価した。有意な相関は何もみられなかった。
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
【表３】
【実施例６】
【０１３１】
ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ及びＳＥＬＤＩ−質量分析法を用いた血清プロテオミクスの分析による乳房の上皮内癌の検出
乳癌を有している及び有していない女性からの１６９の血清サンプルのタンパク質プロファイルを分析し、３種のタンパク質（８．９ＫＤ、８．１ＫＤ、４．３ＫＤ）のパネルが、組み合わせて使用することにより、高い感度（ステージ０〜ＩＩＩ期：９３％）及び高い特異度（健康なコントロール＋良性：９１％）で乳癌を検出することができることを確認した。この３種のマーカーのうち、８．９ＫＤのタンパク質が最も良い成績を示し、８５％の感度及び９１％の特異度を達成した。
【０１３２】
非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）及び上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）は、非浸潤性乳癌における最初期の形態（ステージ０期）である。この早期において乳癌であると診断された女性はほとんど１００％治療することができる。乳癌の早期検出についてこれらのマーカーをバリデートするために、共同研究している機関により収集された血清を用いてこの３種の事前に同定されたバイオマーカーの能力を評価した。このサンプル集団は、１７名のＤＣＩＳを有する女性、１名のＬＣＩＳを有する女性、８名の良性乳癌を有する女性及び４０名の年齢をマッチングした、外見上健康なコントロール（４５〜６５歳）から構成された。タンパク質プロファイルは、ＩＭＡＣ−Ｎｉ（固定金属アフィニティーキャプチャー）プロテインチップアレイを用い、上記と同じ実験条件下で３つ作成した。二標本ｔ検定を用いて、３種のタンパク質のそれぞれについての対数の相対強度を異なる診断グループ間で比較した。３つのマーカーのうち二つ（８．９ＫＤ及び８．１ＫＤ）の発現パターンは前の結果と一致した。これら２つのバイオマーカーのｐ値及びＲＯＣ曲線下面積を表３にまとめた。
【０１３３】
【表４】
【０１３４】
本発明を特定の実施の形態を参照して詳しく説明したが、当然のことながら、当業者はこの開示を考慮して、本発明の精神及び範囲内で改変を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１Ａ〜ＮはマーカーＩ〜ＸＩＶのマススペクトルをそれぞれ示したものである。これらの図の中で、指定されたマーカーのマススペクトルピークは、矢印で示されたスペクトルの範囲内に示される。図の表示は、参照されるスペクトルの上にそれぞれ配置される。
【図２】ＩＭＡＣ−Ｎｉ２＋チップ上に保持された血清タンパク質のＳＥＬＤＩ分析より得られた代表的な質量ピークスペクトルを示したものである。上段はスペクトル図を示し、下段は４，０００〜１０，０００間のＭ／Ｚ（質量依存速度）の同じスペクトルにおける疑似ゲル図を示す。
【図３】データのばらつきの削減及び平衡化における対数変換の結果を示したものである。
【図４】癌に罹患していないコントロール（白抜き四角）に対する乳癌（黒い四角）のステージ０〜Ｉ期についての三次元ＵＭＳＡ成分プロットを示したものである。 図４Ａは、全１４７ピークにおける線形結合より導き出されたＵＭＳＡを用いて達成された分離の結果を示したものである。 図４Ｂは、三つの選択されたピークを用いた線形結合より導き出されたＵＭＳＡを用いて達成された分離の結果を示したものである。
【図５】ＰｒｏＰｅａｋブートストラップ分析より導き出された上位の平均ランクと最小ランクの標準偏差を持つ１５のピークを示すグラフである。７．０にある横線は、ランダムに作成した、元のデータの分布をシミュレートするデータセットに同じ手順を適用させて計算した最小ランクの標準偏差である。
【図６】ステージ０〜Ｉ期の乳癌と癌に罹患していないコントロールとの間の分離に対する寄与に基づいて選択されたピークについての相対的有意性スコアの絶対値のプロットを示すグラフである。 図６Ａは、ＰｒｏＰｅａｋブートストラップ分析より選択された、ランク標準偏差が７．０より小さい、１５ピークの結果を示したものである。 図６Ｂは、図５Ａより選ばれた上位４ピークを再評価したスコアを示すグラフである。
【図７】ＢＣ１，ＢＣ２及びＢＣ３の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析及びロジスティック回帰より導き出された複合指数を示すグラフである。個々のバイオマーカーと複合指数とのＡＵＣ（曲線下面積）比較より得られたｐ値は、図中に記載した。
【図８】癌患者の臨床病期を含む全ての診断グループにわたる、選択されたバイオマーカー（又はマーカー群）の分布を示す散乱プロットである。 図８Ａは、ＢＣ３のみを用いて得られた結果を示す散乱プロットである。 図８Ｂは、ＢＣ１，ＢＣ２及びＢＣ３を用いた、ロジスティック回帰より導き出された複合指数の結果を示す散乱プロットである。
【図９】全ての患者サンプルの分布を表す２次元散乱プロットを示す３枚のパネルである。
【図１−Ａ】
【図１−Ｂ】
【図１−Ｃ】
【図１−Ｄ】
【図１−Ｅ】
【図１−Ｆ】
【図１−Ｇ】
【図１−Ｈ】
【図１−Ｉ】
【図１−Ｊ】
【図１−Ｋ】
【図１−Ｌ】
【図１−Ｍ】
【図１−Ｎ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被験動物からのサンプルについて、少なくとも１種のバイオマーカーを測定すること、及び
（ｂ）前記測定値と乳癌の状態とを相関させること、
を含んで成る被験動物の乳癌を認定する方法において、前記バイオマーカーが、
マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ
マーカーＸＩＶ
及び、これらの組み合わせ
からなる群より選択される方法。
【請求項２】
（ｃ）前記の状態に基づいて被験動物の治療を管理することを更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験動物の治療を管理することが、より多くの休息を命令すること、手術を実施すること、及び更なる措置を取らないことより選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｄ）被験動物の管理後、前記少なくとも１種のバイオマーカーを測定することを更に含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
乳癌の状態が、被験動物の癌のリスク、疾病の有無、疾病の病期、及び治療の有効性からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
測定することが、質量分析法により検出することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１種のバイオマーカーが、マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、及びマーカーＩＩＩ（ＢＣ３）より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
被験動物からのサンプルについて、公知の乳癌におけるバイオマーカーを測定すること、及び公知のバイオマーカーの測定値及びマーカーＩ〜ＸＩＶのうちのいずれか１種以上の測定値と、乳癌の状態とを相関させることを更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
公知のバイオマーカーが、ＣＡ１５．３又はＣＡ２７．２９から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、及びマーカーＩＩＩ（ＢＣ３）を測定することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
被験動物からのサンプルについて、公知の乳癌におけるバイオマーカーを測定すること、公知のバイオマーカーの測定値及びマーカーＩ〜ＸＩＶのうちのいずれか１種以上の測定値と、乳癌の状態とを相関させることを更に含んで成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
公知のバイオマーカーが、ＣＡ１５．３又はＣＡ２７．２９から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
測定することが、
（ａ）血液又は血液由来物質の被験動物のサンプルを用意すること、
（ｂ）サンプルからマーカーＩ〜ＸＩＶのうち１種以上を、タンパク質バイオマーカーと結合する捕捉試薬を含有する基質の表面に捕捉させること、
を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
基質が、ＩＭＡＣ−Ｎｉ表面を含有するＳＥＬＤＩプローブであり、タンパク質バイオマーカーがＳＥＬＤＩにより検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
基質が、マーカーＩ〜ＸＩＶのうち１種以上と結合する生体特異的親和性試薬を含有するＳＥＬＤＩプローブであり、タンパク質バイオマーカーが、ＳＥＬＤＩにより検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
基質が、マーカーＩ〜ＸＶのうち１種以上と結合する生体特異的親和性試薬を含有するマイクロタイタープレートであり、タンパク質バイオマーカーが、免疫測定法により検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
測定することが、バイオマーカー（又はバイオマーカー群）の有無を検出すること、そのマーカー（又はマーカー群）の量を測定すること、及びバイオマーカーのタイプを認定することから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１種のバイオマーカーが、バイオチップアレイを用いて測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
バイオチップアレイが、プロテインチップアレイである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
バイオチップアレイが、核酸アレイである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１種のバイオマーカーが、バイオチップアレイに固定化されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質バイオマーカーが、ＳＥＬＤＩにより測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質バイオマーカーが、免疫測定法により測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
相関させることが、分類アルゴリズムソフトウェアにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
サンプルが、血液、血清及び血漿から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）被験動物からのサンプルについて、複数のバイオマーカーを測定すること、
を含んで成る方法において、複数のバイオマーカーが、
マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ、及び
マーカーＸＩＶ
からなる群より選択される方法。
【請求項２７】
複数のバイオマーカーが、マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、及びマーカーＩＩＩ（ＢＣ３）を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
公知のバイオマーカーを測定することを更に含んで成る、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
公知のバイオマーカーが、ＣＡ１５．３又はＣＡ２７．２９から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
タンパク質バイオマーカーが、ＳＥＬＤＩ又は免疫測定法により検出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
サンプルが、血液、血清及び血漿から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）被験動物からのサンプルについて、少なくとも１種のバイオマーカーを測定すること、を含んで成る方法において、前記バイオマーカーが、
マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ、及び
マーカーＸＩＶ
及び、これらの組み合わせ
からなる群より選択される方法。
【請求項３３】
公知のバイオマーカーを測定することを更に含んで成る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
公知のバイオマーカーが、ＣＡ１５．３又はＣＡ２７．２９から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
タンパク質バイオマーカーが、ＳＥＬＤＩ又は免疫測定法により検出される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
サンプルが、血液、血清及び血漿から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ、及び
マーカーＸＩＶ
及び、これらの組み合わせ
からなる群より選択されるバイオマーカーと結合する捕捉試薬、及び
（ｂ）少なくとも１種の前記バイオマーカーを含有する容器、
を含んで成るキット。
【請求項３８】
捕捉試薬が複数のバイオマーカーと結合するキットである、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
捕捉試薬がＳＥＬＤＩプローブであるキットである、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
さらにＣＡ１５．３又はＣＡ２７．２９と結合する捕捉試薬を更に含んで成る、請求項３７に記載のキット。
【請求項４１】
第一の捕捉試薬が結合しないバイオマーカーの一つに結合する第二の捕捉試薬を更に含んで成る、請求項３７に記載のキット。
【請求項４２】
（ａ）マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ、及び
マーカーＸＩＶ
からなる群より選択される、少なくとも１種のバイオマーカーと結合する第一の捕捉試薬、及び
（ｂ）第一の捕捉試薬が結合しない前記バイオマーカーのうち少なくとも一種に結合する第二の捕捉試薬、
を含んで成るキット。
【請求項４３】
少なくとも１種の捕捉試薬が抗体である、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
少なくとも１種の捕捉試薬と結合する、もしくは結合できるＭＳプローブを更に含んで成る、請求項４２に記載のキット。
【請求項４５】
捕捉試薬が、固定化金属キレート（ＩＭＡＣ）である、請求項４２に記載のキット。
【請求項４６】
洗浄後、他のバイオマーカーと比較して、捕捉試薬に結合しているバイオマーカーの保持を選択的に可能にする洗浄液を更に含んで成る、請求項４２に記載のキット。
【請求項４７】
（ａ）マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ、及び
マーカーＸＩＶ
からなる群より選択される、少なくとも１種のバイオマーカーと結合する第一の捕捉試薬、及び
（ｂ）前記バイオマーカーを検出する前記捕捉試薬の使用説明書
を含んで成るキット。
【請求項４８】
捕捉試薬が抗体である、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
捕捉試薬と結合する、もしくは結合できるＭＳプローブを更に含んで成る、請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
捕捉試薬が、固定化金属キレート（ＩＭＡＣ）である、請求項４７に記載のキット。
【請求項５１】
洗浄後、他のバイオマーカーと比較して、捕捉試薬に結合しているバイオマーカーの保持を選択的に可能にする洗浄液を更に含んで成る、請求項４７に記載のキット。
【請求項５２】
癌の検出のためのキットの使用説明書を更に含んで成る、請求項４７に記載のキット。
【請求項５３】
使用説明書がテストサンプルを捕捉試薬に接触させ、捕捉試薬により保持された１種以上のバイオマーカーを検出する方法を提供する、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
（ａ）マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ、及び
マーカーＸＩＶ
からなる群より選択される、少なくとも２種のバイオマーカーと結合する少なくとも１種の捕捉試薬、
を含んで成る製造品。
【請求項５５】
公知のバイオマーカーと結合する捕捉試薬を更に含んで成る、請求項５４に記載の製造品。
【請求項５６】
公知のバイオマーカーがＣＡ１５．３又はＣＡ２７．２９である、請求項５５に記載の製造品。
【請求項５７】
（ａ）それぞれの捕捉試薬が、
マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ、及び
マーカーＸＩＶ
からなる群より選択される、異なるバイオマーカーと結合した複数の捕捉試薬、
を含んで成るシステム。
【請求項１】
（ａ）被験動物からのサンプルについて、少なくとも１種のバイオマーカーを測定すること、及び
（ｂ）前記測定値と乳癌の状態とを相関させること、
を含んで成る被験動物の乳癌を認定する方法において、前記バイオマーカーが、
マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ
マーカーＸＩＶ
及び、これらの組み合わせ
からなる群より選択される方法。
【請求項２】
（ｃ）前記の状態に基づいて被験動物の治療を管理することを更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験動物の治療を管理することが、より多くの休息を命令すること、手術を実施すること、及び更なる措置を取らないことより選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｄ）被験動物の管理後、前記少なくとも１種のバイオマーカーを測定することを更に含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
乳癌の状態が、被験動物の癌のリスク、疾病の有無、疾病の病期、及び治療の有効性からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
測定することが、質量分析法により検出することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１種のバイオマーカーが、マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、及びマーカーＩＩＩ（ＢＣ３）より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
被験動物からのサンプルについて、公知の乳癌におけるバイオマーカーを測定すること、及び公知のバイオマーカーの測定値及びマーカーＩ〜ＸＩＶのうちのいずれか１種以上の測定値と、乳癌の状態とを相関させることを更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
公知のバイオマーカーが、ＣＡ１５．３又はＣＡ２７．２９から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、及びマーカーＩＩＩ（ＢＣ３）を測定することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
被験動物からのサンプルについて、公知の乳癌におけるバイオマーカーを測定すること、公知のバイオマーカーの測定値及びマーカーＩ〜ＸＩＶのうちのいずれか１種以上の測定値と、乳癌の状態とを相関させることを更に含んで成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
公知のバイオマーカーが、ＣＡ１５．３又はＣＡ２７．２９から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
測定することが、
（ａ）血液又は血液由来物質の被験動物のサンプルを用意すること、
（ｂ）サンプルからマーカーＩ〜ＸＩＶのうち１種以上を、タンパク質バイオマーカーと結合する捕捉試薬を含有する基質の表面に捕捉させること、
を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
基質が、ＩＭＡＣ−Ｎｉ表面を含有するＳＥＬＤＩプローブであり、タンパク質バイオマーカーがＳＥＬＤＩにより検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
基質が、マーカーＩ〜ＸＩＶのうち１種以上と結合する生体特異的親和性試薬を含有するＳＥＬＤＩプローブであり、タンパク質バイオマーカーが、ＳＥＬＤＩにより検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
基質が、マーカーＩ〜ＸＶのうち１種以上と結合する生体特異的親和性試薬を含有するマイクロタイタープレートであり、タンパク質バイオマーカーが、免疫測定法により検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
測定することが、バイオマーカー（又はバイオマーカー群）の有無を検出すること、そのマーカー（又はマーカー群）の量を測定すること、及びバイオマーカーのタイプを認定することから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１種のバイオマーカーが、バイオチップアレイを用いて測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
バイオチップアレイが、プロテインチップアレイである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
バイオチップアレイが、核酸アレイである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１種のバイオマーカーが、バイオチップアレイに固定化されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質バイオマーカーが、ＳＥＬＤＩにより測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質バイオマーカーが、免疫測定法により測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
相関させることが、分類アルゴリズムソフトウェアにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
サンプルが、血液、血清及び血漿から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）被験動物からのサンプルについて、複数のバイオマーカーを測定すること、
を含んで成る方法において、複数のバイオマーカーが、
マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ、及び
マーカーＸＩＶ
からなる群より選択される方法。
【請求項２７】
複数のバイオマーカーが、マーカーＩ（ＢＣ１）、マーカーＩＩ（ＢＣ２）、及びマーカーＩＩＩ（ＢＣ３）を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
公知のバイオマーカーを測定することを更に含んで成る、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
公知のバイオマーカーが、ＣＡ１５．３又はＣＡ２７．２９から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
タンパク質バイオマーカーが、ＳＥＬＤＩ又は免疫測定法により検出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
サンプルが、血液、血清及び血漿から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）被験動物からのサンプルについて、少なくとも１種のバイオマーカーを測定すること、を含んで成る方法において、前記バイオマーカーが、
マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ、及び
マーカーＸＩＶ
及び、これらの組み合わせ
からなる群より選択される方法。
【請求項３３】
公知のバイオマーカーを測定することを更に含んで成る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
公知のバイオマーカーが、ＣＡ１５．３又はＣＡ２７．２９から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
タンパク質バイオマーカーが、ＳＥＬＤＩ又は免疫測定法により検出される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
サンプルが、血液、血清及び血漿から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ、及び
マーカーＸＩＶ
及び、これらの組み合わせ
からなる群より選択されるバイオマーカーと結合する捕捉試薬、及び
（ｂ）少なくとも１種の前記バイオマーカーを含有する容器、
を含んで成るキット。
【請求項３８】
捕捉試薬が複数のバイオマーカーと結合するキットである、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
捕捉試薬がＳＥＬＤＩプローブであるキットである、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
さらにＣＡ１５．３又はＣＡ２７．２９と結合する捕捉試薬を更に含んで成る、請求項３７に記載のキット。
【請求項４１】
第一の捕捉試薬が結合しないバイオマーカーの一つに結合する第二の捕捉試薬を更に含んで成る、請求項３７に記載のキット。
【請求項４２】
（ａ）マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ、及び
マーカーＸＩＶ
からなる群より選択される、少なくとも１種のバイオマーカーと結合する第一の捕捉試薬、及び
（ｂ）第一の捕捉試薬が結合しない前記バイオマーカーのうち少なくとも一種に結合する第二の捕捉試薬、
を含んで成るキット。
【請求項４３】
少なくとも１種の捕捉試薬が抗体である、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
少なくとも１種の捕捉試薬と結合する、もしくは結合できるＭＳプローブを更に含んで成る、請求項４２に記載のキット。
【請求項４５】
捕捉試薬が、固定化金属キレート（ＩＭＡＣ）である、請求項４２に記載のキット。
【請求項４６】
洗浄後、他のバイオマーカーと比較して、捕捉試薬に結合しているバイオマーカーの保持を選択的に可能にする洗浄液を更に含んで成る、請求項４２に記載のキット。
【請求項４７】
（ａ）マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ、及び
マーカーＸＩＶ
からなる群より選択される、少なくとも１種のバイオマーカーと結合する第一の捕捉試薬、及び
（ｂ）前記バイオマーカーを検出する前記捕捉試薬の使用説明書
を含んで成るキット。
【請求項４８】
捕捉試薬が抗体である、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
捕捉試薬と結合する、もしくは結合できるＭＳプローブを更に含んで成る、請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
捕捉試薬が、固定化金属キレート（ＩＭＡＣ）である、請求項４７に記載のキット。
【請求項５１】
洗浄後、他のバイオマーカーと比較して、捕捉試薬に結合しているバイオマーカーの保持を選択的に可能にする洗浄液を更に含んで成る、請求項４７に記載のキット。
【請求項５２】
癌の検出のためのキットの使用説明書を更に含んで成る、請求項４７に記載のキット。
【請求項５３】
使用説明書がテストサンプルを捕捉試薬に接触させ、捕捉試薬により保持された１種以上のバイオマーカーを検出する方法を提供する、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
（ａ）マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ、及び
マーカーＸＩＶ
からなる群より選択される、少なくとも２種のバイオマーカーと結合する少なくとも１種の捕捉試薬、
を含んで成る製造品。
【請求項５５】
公知のバイオマーカーと結合する捕捉試薬を更に含んで成る、請求項５４に記載の製造品。
【請求項５６】
公知のバイオマーカーがＣＡ１５．３又はＣＡ２７．２９である、請求項５５に記載の製造品。
【請求項５７】
（ａ）それぞれの捕捉試薬が、
マーカーＩ（ＢＣ１）
マーカーＩＩ（ＢＣ２）
マーカーＩＩＩ（ＢＣ３）
マーカーＩＶ
マーカーＶ
マーカーＶＩ
マーカーＶＩＩ
マーカーＶＩＩＩ
マーカーＩＸ
マーカーＸ
マーカーＸＩ
マーカーＸＩＩ
マーカーＸＩＩＩ、及び
マーカーＸＩＶ
からなる群より選択される、異なるバイオマーカーと結合した複数の捕捉試薬、
を含んで成るシステム。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００６−５０８３２６（Ｐ２００６−５０８３２６Ａ）
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−５７５０７１（Ｐ２００３−５７５０７１）
【出願日】平成１５年３月６日（２００３．３．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００６８５０
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０７６８９６
【国際公開日】平成１５年９月１８日（２００３．９．１８）
【出願人】（３０１０５９６４０）ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ (34)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年３月６日（２００３．３．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００６８５０
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０７６８９６
【国際公開日】平成１５年９月１８日（２００３．９．１８）
【出願人】（３０１０５９６４０）ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ (34)
【Ｆターム（参考）】
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