乾燥方法
本発明は、生物学的サンプルまたは他の不安定なサンプルを高い粘性を有する液体として保存することができるように乾燥する方法に関する。この方法は、安定化剤の溶液中に活性薬剤を溶解／懸濁することにより保存サンプルを調製する工程、保存サンプルが凍結したり発泡して気泡を形成したりすることなく蒸発により溶媒を放出するような温度および圧力条件に、該保存サンプルを供する工程、ならびに保存サンプルが乾燥して高い粘性を有する液体を形成するまで溶媒を除去する工程を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的サンプルおよび他の不安定なサンプルの保存、そのような保存されたサンプルならびにそのようなサンプルを保存するための新規な方法に関する。この新規な方法は、活性薬剤および安定化剤を含むサンプルを容器に添加し、該サンプルを凍結させたり発泡させて気泡を形成させたりすることなく、蒸発により溶媒の喪失を引き起こすような温度および圧力条件に該サンプルを供することを含む。続いて、第２の乾燥段階において、溶媒が除去され、保存サンプルが乾燥して高い粘性を有する液体を形成するように、圧力および温度条件を維持するかまたは調整する。さらに、本発明は、本発明の方法により保存された組成物、そして特に、保存されたワクチン組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
不安定なサンプル、特に生物学的サンプルの安定性、従って保存寿命を延長させる必要性が存在する。伝統的に、これは物質の溶液を作製し、そのサンプルを凍結させる凍結乾燥の方法を用いて達成されてきた。第１の乾燥段階において、大部分の水を、減圧条件下で氷からの昇華により除去し、多孔性の「ケーキ」を形成させる。通常、この後、圧力および温度を変え、水を固体の「ケーキ」から蒸発させる第２の乾燥段階を行う。得られる凍結乾燥サンプルは、液体製剤と比較して改良された安定性を有する。しかしながら、凍結乾燥方法は、長期間に渡り、費用がかさみ、製造方法における速度制限工程となり得る。
【０００３】
凍結乾燥はまた、いくつかの活性薬剤の活性または抗原性の喪失が生じ得る。生ウイルスなどの特定の生物材料については、凍結乾燥工程において活性の有意な喪失が生じ得る(Pikal(1994) ACS Symposium 567:120-133)。多くの凍結乾燥された物質は、周囲温度では依然として不安定である(Carpenterら(1994) ACS Symposium 567; 134-147)。
【０００４】
凍結工程により引き起こされる損傷は、ポリオールなどの安定化剤の使用により、ある程度まで回避することができる。凍結乾燥工程におけるさらなる改良はまた、該工程におけるサンプルの凍結回避および沸騰による水の除去により為されてきた(WO96/40077；US6306345)。この方法は、保存しようとするサンプルと共に好適な溶媒中にガラス-マトリックス形成材料の混合物を調製し、該混合物からバルク溶媒を蒸発させてシロップを取得し、シロップの沸騰を引き起こすのに十分な圧力および温度にシロップを曝露し、そして残渣の溶媒を除去することを含む。これと同様の方法を、発泡乾燥技術と呼ぶ。そのような技術では、「沸騰」段階における気泡の形成および破裂に起因するストレスに、保存しようとするサンプルを曝露することになる。特に、不安定な物質を保存しようとする場合、これは活性の喪失をもたらし得る。
【０００５】
同様の方法がUS5,766,520に記載されており、この方法は水を部分的に除去して粘性の液体を形成させ、さらに、そのシロップを、減圧工程にかけて「沸騰」させ、さらに、100℃よりかなり低い温度で乾燥させることを含む。この方法は依然として、従来の凍結乾燥の問題のいくつかを欠点として有する。この方法を大きな凍結乾燥装置中で実行する場合、サンプルは貯蔵庫中のその位置に依存して異なる速度で乾燥し、これは乾燥工程において、異なる量の活性を喪失した異なるサンプルをもたらす。これは、バッチ内の一貫性の欠如をもたらす。
【０００６】
トレハロースは、その安定化特性が好ましいポリオールである。トレハロースは、最初はいくつかの植物および動物における乾燥による損傷の防止と関連することが見出された、天然の、不活性な、非還元性および非毒性の、ガラス形成ジサッカリドである。トレハロースは、１つには、比較的高いガラス転移温度(無水状態で約120℃)を有するために、乾燥およびその後の保存中の、タンパク質、ウイルスおよび食品などの種々の物質の変性を防止するのに有用である(US4891319；US5149653；US5026566)。トレハロースはまた、酵素を安定化させる(ArgallおよびSmith(1993) Biochem. Mol. Biol. Int. 30;491)。トレハロースおよび種々の安定化ポリオールはまた、サンプルが凍結乾燥工程において活性を喪失する傾向がある場合には特に、凍結乾燥されたサンプルの保存を改良するのに有用であることが見出されている。凍結乾燥技術において有用な他の糖としては、スクロースおよびラクトースが挙げられる。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、特に、活性薬剤が、ごく慣用された乾燥工程において不安定であり活性を喪失する傾向がある場合に、該活性薬剤を保存するための改良された方法に関する。この方法は、活性薬剤を、安定化剤の溶液中に溶解／懸濁することにより保存サンプルを調製する工程；該保存サンプルが凍結したり発泡して気泡を形成したりすることなく該サンプルが蒸発により溶媒を放出するような温度および圧力条件に、該保存サンプルを供する工程；ならびに該保存サンプルが乾燥して高い粘性を有する液体を形成するまで溶媒を除去する工程を含む。
【０００８】
この方法は非常に穏やかなものであり、活性薬剤を凍結または沸騰に曝さず、従って、サンプルをこれらのストレスの一方または両方に供する従来の凍結乾燥技術および発泡乾燥技術よりも有利である。保存しようとする活性薬剤が不安定である場合、本発明の方法の使用は、活性および／または抗原性の保持性を向上させる。そのことは、溶媒、好ましくは水または水性溶液中で、乾燥された活性薬剤を再構成し、標準的なアッセイ(例えば、ELISA)により活性または抗原性を測定し、その結果と、乾燥されていないサンプルまたは凍結乾燥技術もしくは発泡乾燥技術により乾燥した後、再構成されたサンプルを用いて得られた結果とを比較することにより測定することができる。
【０００９】
本発明の方法を用いて、IPV(不活化ポリオウイルス、注射可能なポリオワクチン中の免疫原)を乾燥するのが特に有利である。IPVは、液体製剤として公知のワクチン中に存在する(WO99/48525)。標準的な凍結乾燥手順はIPVの抗原性の喪失をもたらすため、IPVの固形製剤をワクチンに使用する試みにおいて問題が生じている。本発明の方法は、部分的には本発明の方法により必要とされる時間の減少により、ポリオウイルス抗原のより高い保持をもたらす。
【００１０】
本発明の方法は、稼動サイクルがより短く、冷凍を必要とせず、それによりエネルギー効率がより高まるため、通常の凍結乾燥よりも有利である。乾燥工程は、処理過程の速度制限工程であることが多いため、本発明の方法の使用は少ない費用でより高いレベルの生産をもたらす。
【００１１】
詳細な説明
本発明の方法は活性薬剤の保存に使用されるものであって、この方法は、下記工程：
・安定化剤の溶液中に活性薬剤を懸濁または溶解することにより、保存サンプルを調製する工程；および
・凍結したり泡立って気泡を形成したりすることなく蒸発により該保存サンプルが溶媒を放出するような温度および圧力条件に、該保存サンプルを供して、粘性の液体を形成させる工程；
を含み、必要に応じて、さらなる工程：
・粘性の液体が乾燥して高い粘性を有する液体を形成するまで溶媒を除去する工程、
を含む。
【００１２】
活性薬剤を保存する方法は、長期保存に耐えることができ、その間、該活性薬剤の活性および／または抗原性および／または免疫原性が維持されるような形態の活性薬剤を生産する。この活性薬剤は、4℃で保存した場合、少なくとも3、6、9、12、24ヶ月の期間に渡って、元の活性、抗原性および／または免疫原性の少なくとも40、50、60、70、好ましくは80、90、95％を保持するのが好ましい。抗原性または免疫原性は、以下に記載する標準的なアッセイにより測定することができる。
【００１３】
この方法は、溶液中に保存した場合に、または凍結するかもしくは発泡させて気泡を形成させる場合に急速に活性を喪失する不安定な産物の保存寿命を延長させるのに特に有用である。
【００１４】
不安定な産物は、溶液中での保存および／または凍結および／または気泡形成の際の発泡に関与するものなどのストレスの負荷後に、活性喪失および／または抗原性喪失および／または免疫原性喪失を生じやすい。
【００１５】
ガラス形成ポリオールの濃度がより低い(例えば、3〜15％w/v)ことが有利であり、乾燥工程がより短い(4、6、8、10または12時間未満)ことが好ましい場合、その使用は特に適用可能である。
【００１６】
粘性の液体は、溶媒の大部分がサンプルから失われた時点での、第１の溶媒除去段階の生成物として定義される。この時点は、蒸発の速度が遅くなり、サンプルの温度がバルク蒸発の吸熱効果が失われる周囲温度に戻るため、認識することができる。
【００１７】
高い粘性を有する液体は、第１の乾燥段階の終了時点で生成されていた粘性の液体を、第１の乾燥段階の終了後のさらなる期間、減圧下に曝した後に生成される。高い粘性を有する液体は、好ましくはKarl Fischerの電量湿度分析装置(Eur. J. Pharm. Biopharm.(2000) 50;277-284)により決定されるように、15、12、10、8、5、4、3、2または1％(w/w)以下の溶媒含量を有する。溶媒含量の好ましい範囲は1〜3％、3〜5％、5〜10％、または10〜15％(w/w)である。高い粘性を有する液体は、活性薬剤が4℃で少なくとも3、6、9、12または24ヶ月間、安定状態で保存され、この期間に渡って、活性薬剤が活性および／または抗原性および／または免疫原性の少なくとも40、50、60、好ましくは70、80、90、95％を保持できるようにするだけの十分に低い溶媒含量を有する。高い粘性を有する液体は固形の外見を有するだけでなく、ゴムまたはガラス、好ましくはガラスであり、2、4、または6日間、好ましくは1、2、3または4週間、より好ましくは2、4、6、8、10または12ヶ月間かけて、非常にゆっくりと流動することができるのが好ましい。極端にゆっくりとした流動は、高い粘性を有する液体を含む容器を倒置させ、高い粘性を有する液体の流動が観察されるまで室温で静置することにより測定することができる。好ましい実施形態においては、高い粘性を有する液体は、倒置状態で、2、4または6日後、好ましくは1、2、3、または4週間後、より好ましくは2、4、6、8、10または12ヶ月後でも流動が認められないであろう。高い粘性を有する液体は、明澄透明性の外見を有するのが好ましい。
【００１８】
保存サンプルの調製
任意の安定化剤が、本発明の第1工程における使用にとって好適である。好適な材料としては、限定されるものではないが、炭水化物および非炭水化物ポリオールを含む全てのポリオールが挙げられる。安定化ポリオールは、変性、凝集または他の手段によって活性を実質的に喪失させることなく、活性薬剤を保存できるようにするのが好ましい。特に好適な材料としては、糖、糖アルコールおよび炭水化物誘導体が挙げられる。好ましくは、ガラス形成ポリオールは、グルコース、マルツロース、イソ-マルツロース、ラクツロース、スクロース、マルトース、ラクトース、イソ-マルトース、マルチトール、ラクチトール、パラチニット、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトースもしくはデキストランなどの炭水化物またはその誘導体であり、最も好ましくは、トレハロース、スクロース、ソルビトール、ラフィノース、マンニトール、ラクトース、ラクチトールもしくはパラチニット、最も好ましくはスクロース、ソルビトール、ラクトースもしくはトレハロースである。
【００１９】
細菌性多糖は、それらが安定化剤および免疫原の両方として働くことができるため、免疫原性組成物における安定化剤としての使用にとって特に有利である。
【００２０】
炭水化物としては、限定されるものではないが、モノサッカリド、ジサッカリド、トリサッカリド、オリゴ糖およびそれらの対応する糖アルコール、炭水化物誘導体および化学的に修飾された炭水化物などのポリヒドロキシル化合物、ヒドロキシエチルスターチならびに糖コポリマーが挙げられる。天然および合成の炭水化物の両方が使用に好適である。合成炭水化物としては、限定されるものではないが、チオールまたは炭素結合により置換されたグリコシド結合を有するものが挙げられる。DおよびL型の両方の炭水化物を用いることができる。この炭水化物は、非還元性でも還元性でもよい。還元炭水化物を用いる場合、Maillard反応の阻害剤の添加が好ましい。
【００２１】
本発明における使用にとって好適な還元炭水化物は当業界で公知であり、限定されるものではないが、グルコース、マルトース、ラクトース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、マルツロースおよびラクツロースが挙げられる。非還元炭水化物としては、限定されるものではないが、糖アルコールおよび他の直鎖ポリアルコールから選択されるポリヒドロキシル化合物の非還元グリコシドが挙げられる。他の有用な炭水化物としては、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、スクロース、セルビオース、マンノビオースおよび糖アルコールが挙げられる。糖アルコールグリコシドが好ましいモノグリコシドであり、特に、ラクトース、マルトース、ラクツロースおよびマルツロースなどのジサッカリドの還元により得られる化合物が好ましい。
【００２２】
特に好ましい炭水化物はトレハロース、スクロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、パラチニットおよびグルコピラノシル-1→6-マンニトールである。
【００２３】
アミノ酸は安定化剤として働くことができ、それ単独で用いることもできるが、ポリオールと組み合わせて用いるのが好ましい。好ましいアミノ酸としては、グリシン、アラニン、アルギニン、リジンおよびグルタミンが挙げられるが、任意のアミノ酸、またはアミノ酸の組合せ、ペプチド、加水分解タンパク質、または血清アルブミンなどのタンパク質も、安定化剤として働くことができる。
【００２４】
本発明の方法において用いられる安定化剤の濃度は、1〜50％(重量／体積(w/v))であってよいが、好ましくは1〜5％、5〜10％、15〜20％、20〜25％または25〜50％、最も好ましくは15％または10％(w/v)以下である。必要とされる安定化剤の量は、存在する塩の量に比例する。従って、2〜10％の安定化剤のレベルが好ましいが、高い塩含量(100 mM、200 mM、300 mM、400 mMまたは500 mMを上回る)のサンプルを乾燥するには、10〜25％のより高い濃度が必要である。
【００２５】
保存サンプルは、本発明の高い粘性を有する液体中での結晶形成を阻害することができる成分を含むのが好ましい。塩、ならびにアミノ酸およびフェノールレッドなどの他の分子は、結晶形成を阻害する。
【００２６】
容器
異なる混合物、ならびに種々の容器の形状および大きさを、同時に処理することができる。理想的には、用いる容器の大きさは、最初の混合物を含有し、その形成される固体の体積を収容するのに十分なものである。通常、これはガラス形成材料の質量、容器の表面積、およびガラス形成の条件により決定される。ガラス形成材料の質量は、実際には容器の単位表面積あたりの最小の質量に変換される粘性のシロップを与えるのに、十分なものでなければならない。この比率は、混合物間、および用いる容器の間で様々であるが、本明細書で説明する手順に従えば、当業者は経験的に容易に決定することができる。Wheaton成型バイアルおよびチューブカットバイアルなどの任意のバイアルを用いることができる。
【００２７】
本発明の方法は、溶媒をはじく物質を有する容器、好ましくは水をはじく内部表面を有する容器を用いるのが好ましい。これは、例えばシリコーン処理などにより、疎水性組成物で内部表面をコーティングすることによって達成される。シリコーン処理は、当業者には周知の方法により達成される。一つの方法においては、容器の内部をシリコーンの乳濁液ですすいだ後、高温、典型的には350℃にてオーブンを通して処理することにより、その容器をシリコーン処理する。あるいは、水をはじく内部表面は、水をはじく組成物で容器を作製することにより達成する。
【００２８】
容器の水をはじく内部表面は、水が容器の側面に集まりにくいため、前記方法の乾燥生成物の再構成が容易になる。
【００２９】
本発明では単一の形態を用いることができるが、2種以上のガラスマトリックス形成材料、2種以上の添加剤、および2種以上の物質が存在してもよい。これらの成分の有効量は、当業者により容易に決定することができる。
【００３０】
溶液
安定化剤および活性薬剤を混合する溶媒は、水性、有機性のもの、またはその両方の混合物であってもよい。ガラスマトリックス形成材料を溶解するのに十分な水性溶媒および疎水性物質を溶解するのに十分な有機溶媒を用いて、疎水性物質を含有するガラスを形成させることができる。
【００３１】
溶媒の選択は、ガラスマトリックス形成に関して選択される材料の性質、ならびに任意の添加剤および／または含有させようとする物質の性質に、依存するであろう。溶媒は、ガラスマトリックス形成材料ならびに任意の添加剤および／または物質の十分な可溶化を行うのに十分な性質および容量のものであるべきである。前記物質が親水性材料である場合、液体は、有害な溶媒相互作用に起因する活性のいかなる喪失の可能性をも回避するために、水性であるのが好ましい。好ましくは、この水性溶媒は、限定されるものではないが、水および生物学的緩衝溶液などの、当業界で公知の任意の好適な水性溶媒を含む。この水性溶媒は、5〜98体積％、より好ましくは80〜98体積％、最も好ましくは85〜98体積％の量で存在するのが好ましい。
【００３２】
溶媒の容量は様々であってよく、ガラスマトリックス形成材料および組み入れようとする物質ならびに任意の添加剤に依存するであろう。必要とされる最小の容量は、種々の成分を可溶化するのに必要な量である。しかしながら、均一に分散された物質の懸濁液を用いることもできる。特定の実施形態における成分の好適な量は、本明細書に提供される実施例を考慮に入れて、当業者であれば容易に決定することができる。
【００３３】
種々の添加剤を、保存サンプルに導入することができる。好ましい添加剤はMaillard反応の阻害剤である。好ましくは、前記物質および／またはガラスマトリックス形成材料がカルボニルおよびアミノ、イミノまたはグアニジノ基を含む場合、前記組成物はさらに、該組成物中のアミノ基と反応性カルボニル基の縮合を実質的に阻止するのに有効な量の、少なくとも1種の生理学的に許容し得るMaillard反応の阻害剤を含む。Maillard反応の阻害剤は当業界で公知の任意のものであってよい。この阻害剤は、アミノ基と反応性カルボニル基の縮合を阻止するか、または実質的に阻止するのに十分な量で存在する。典型的には、アミノ基は前記物質上に存在し、カルボニル基はガラスマトリックス形成材料上に存在するか、またはその逆である。しかしながら、アミノ基およびカルボニル基は前記物質または炭水化物内の分子内のものであってもよい。
【００３４】
Maillard反応に対して阻害作用を示し、従って本明細書に記載の組成物において有用である種々のクラスの化合物が公知である。これらの化合物は、一般的には、Maillard反応の競合的または非競合的な阻害剤である。競合的阻害剤としては、限定されるものではないが、アミノ酸残基(DおよびLの両方)、アミノ酸残基の組合せおよびペプチドが挙げられる。特に好ましいものは、リジン、アルギニン、ヒスチジンおよびトリプトファンである。リジンおよびアルギニンが最も有効である。多くの公知の非競合的阻害剤が存在する。これらのものとしては、限定されるものではないが、アミノグアニジンおよびその誘導体ならびにアンフォテリシンBが挙げられる。EP-A-0 433 679はまた、4-ヒドロキシ-5,8-ジオキソキノリン誘導体を含む好適なMaillard阻害剤を記載している。
【００３５】
本発明の方法の乾燥産物のより容易な視覚化を可能にするために、保存サンプル中に着色剤を含有させるのが有利である。これは、高い粘性を有する液体が使用前に完全に再構成されることを確実にするために、再構成の際に特に重要である。この着色剤は中性のpHでその色を維持し、患者への注射に適合性であるのが好ましい。最も好ましくは、着色剤はフェノールレッドである。
【００３６】
蒸発による溶媒の喪失(蒸発乾燥-工程b)
本発明の方法は、保存サンプルが凍結または発泡して気泡を形成することなく該保存サンプルが溶媒を失うような圧力および温度条件に、該保存サンプルを供することを含む。
【００３７】
保存サンプル内の温度は、時には、蒸発工程の吸熱性のために、サンプルの外部の温度とは異なるであろう。温度に対する言及は、保存サンプルの外部の条件、例えば、大きい工業用凍結乾燥装置を用いる場合は、貯蔵温度に対するものである。これは通常、凍結乾燥装置の温度設定に対応する。
【００３８】
必要に応じて、保存サンプルを脱気する予備工程が、本発明の方法中に存在する。圧力を、少なくとも5分間にわたり、200 ミリバール(mbar)以下、好ましくは200〜35 mbarに低下させた後、圧力をさらに低下させる。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態は、温度条件を制御しながら圧力を低下させることにより、蒸発乾燥を達成する。温度設定を0℃を上回る温度、好ましくは5〜37℃、4〜10℃、10〜15℃、15〜20℃、20〜25℃、25〜30℃、30〜37℃または37〜45℃の温度に維持しながら、圧力を、30、25、20、好ましくは15、12、最も好ましくは10、8、7、6、5、4、3、2または1 mbar以下に調整する。これらの条件を、少なくとも1、2、3、4、5、8、10、12、16または24時間、好ましくは2〜4時間、4〜6時間、6〜8時間、8〜12時間、または12〜18時間、維持する。特に好ましい実施形態においては、温度設定を15℃にしてサンプルの凍結を防止する場合、圧力を2 mbarを上回る温度で維持する。好ましい実施形態においては、温度を15℃で維持し、圧力を5〜10 mbar、より好ましくは6〜9 mbar、最も好ましくは約8 mbarに設定する。より高い温度設定を用いる場合、サンプルを凍結することなくわずかにより低い圧力が可能であり、より低い温度設定を用いる場合、凍結を防止するために、圧力をより高いレベルに維持するべきである。サンプルの温度が、サンプルの外部の温度とほぼ同じになるように蒸発速度を遅くするような十分な時間、この条件を維持するのが好ましい。
【００４０】
保存サンプルが凍結したり発泡／沸騰して気泡を形成したりせず、溶媒を放出して粘性の液体または高い粘性を有する液体を形成するのが好ましい。
【００４１】
高い粘性を有する液体を形成させるための溶媒の除去
本発明の方法のそれに続く段階は、保存サンプルが乾燥して高い粘性を有する液体を形成するまで溶媒を除去することを含む。第２の乾燥段階では、サンプルは凍結も発泡して気泡を形成することもない。高い粘性を有する液体を、好ましくはKarl Fischerの電量湿度分析装置を用いる測定値で、15、12、10、より好ましくは8、5、4、3、2または1％(w/w)以下の溶媒含量を有する材料と定義する。高い粘性を有する液体は、活性薬剤が4℃で少なくとも3、6、9、12または24ヶ月間、安定状態で保存され、かつこの期間に渡って、活性薬剤がその活性および／または抗原性および／または免疫原性の少なくとも40、50、60、好ましくは70、80、90、95％を保持できるような十分に低い溶媒含量を有する。好ましくは、高い粘性を有する液体は固形のおよび／または明澄な外見を有するだけでなく、ガラスであり、2、4、または6日間、好ましくは2、3または4週間、より好ましくは2、4、6、8、10または12ヶ月間かけて非常にゆっくりと流動できる。極端にゆっくりとした流動を、高い粘性を有する液体を含む容器を倒置し、高い粘性を有する液体の流動が観察されるまで室温に静置することにより測定することができる。好ましい実施形態においては、高い粘性を有する液体は、倒置された状態で、2、4または6日後、好ましくは2、3または4週間後、より好ましくは2、4、6、8、10または12ヶ月後でも流動が認められないであろう。
【００４２】
本発明の一実施形態においては、これは、圧力および温度条件を、第１の蒸発乾燥段階において適用された条件で維持することにより達成される。例えば、0℃より高い温度、好ましくは5〜37℃、5〜10℃、10〜15℃、15〜20℃、20〜25℃、25〜30℃、または30〜37℃の温度で温度設定を維持しながら、30、25、20、好ましくは15、12、最も好ましくは10、8、7、6、5、4、3、2または1 mbar以下に圧力を維持する。15℃の温度設定については、5〜10 mbar、好ましくは6〜9 mBar、最も好ましくは約8 mbarの圧力を、4〜24時間、好ましくは1〜4、4〜8、8〜12または12〜16時間、維持する。これらの温度および圧力条件を、1、2、3、4、5、6、8、10、12、18時間以上維持して、好ましくはKarl Fischerの電量湿度分析装置により測定される15、12、好ましくは10、8、5、4、3、2または1％(w/w)以下の溶媒含量を有する高い粘性を有する液体を取得する。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、溶媒除去の際の温度設定を、その処理過程においてより早期に維持したものよりも高い温度設定に増加させる。これにより、本発明の方法をより短い時間で完了させられるようなより速い速度で溶媒がサンプルから除かれるようにする。例えば、圧力を30、25、20、好ましくは15、12、最も好ましくは10、8、7、6、5、4、3、2または1 mbar以下に維持しながら、温度設定を、0℃より高い温度に、より好ましくは20℃より高い温度に、好ましくは5〜37℃、5〜10℃、10〜20℃、20〜30℃、より好ましくは30〜40℃、より好ましくは40〜50℃、最も好ましくは50〜60℃に増加させる。これらの温度および圧力条件を、少なくとも1、2、3、4、5、6、8、10、12または18時間以上に渡って維持して、好ましくはKarl Fischerの電量湿度分析装置により測定される15、12、10、8、5、4、3、2または1％(w/w)以下の溶媒含量を有する固体を取得する。この実施形態は、活性薬剤が、成功裏に実行されるこの方法に用いられる温度で、熱安定性であることを必要とする。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態は、溶媒除去(工程c)における圧力設定を、本処理過程のより早期(工程b)において用いるよりも低い圧力設定まで下げる。これにより、より速い速度でサンプルから溶媒を除去することによって、本発明の方法をより短い時間で完了することができるようにする。また、それにより、失われる溶媒の割合をより高くすることもできる。例えば、0℃以上、好ましくは10〜20℃、20〜30℃、30〜35℃、または40℃以上に温度を維持しながら、圧力設定を、7、6、好ましくは5、4、3、より好ましくは2、1.5、1、最も好ましくは0.8、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、または0.005 mbar以下に設定する。これらの温度および圧力条件を、1、2、3、4、5、6、8、10、12または18時間以上に渡り維持して、好ましくはKarl Fischerの電量湿度分析装置(Eur. J. Pharm. Biopharm.(2000) 50; 277-284)により決定される15、12、好ましくは10、8、5、4、3、2または1％(w/w)以下の溶媒含量を有する固体を取得する。
【００４５】
好ましくは、工程b)およびc)(または工程b)のみ)を、18時間以下、好ましくは16、12、10時間、最も好ましくは8、6、5または4時間以下の時間で完了させるべきである。
【００４６】
活性薬剤
本発明の方法は、任意の活性薬剤を保存するのに有用であるが、他の保存方法において活性および／または抗原性および／または免疫原性を失う不安定な活性薬剤の場合に特に有用である。
【００４７】
本発明の方法を用いて保存しようとする活性薬剤は、細胞、細胞成分組成物、細菌、外膜ベシクル調製物およびウイルス、ウイルス成分またはウイルス様粒子からなる群より選択される生物学的システムを含んでもよい。また、分子、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ポリ核酸、オリゴヌクレオチド、多糖、オリゴ糖、多糖-タンパク質コンジュゲート、オリゴ糖-タンパク質コンジュゲートを含んでもよい。
【００４８】
本発明の方法を用いて保存することができる活性薬剤の例としては、限定されるものではないが、抗炎症剤、鎮痛剤、トランキライザー、抗不安剤、鎮痙剤、抗鬱剤、抗精神病剤、トランキライザー、抗不安剤、麻酔拮抗剤、抗パーキンソン病剤、コリン作動薬、化学療法剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤、食欲抑制剤、抗コリン剤、抗メトリクス剤(antimetrics)、抗ヒスタミン剤、抗片頭痛薬、冠血管拡張剤、脳血管拡張剤もしくは末梢血管拡張剤、ホルモン剤、避妊剤、抗血栓剤、利尿剤、抗高血圧剤、心血管薬、オピオイドなどの薬学的効果のある物質などの任意の生物活性物質が挙げられる。
【００４９】
好適な薬剤には、治療剤および予防剤も包含される。これらには、限定されるものではないが、任意の治療上有効な生物学的改変物質が包含される。そのような物質としては、限定されるものではないが、細胞成分組成物、細胞、細菌、外膜ベシクル調製物、ウイルス、ならびに、限定されるものではないが、脂質、有機物、タンパク質およびペプチド(合成および天然)、ペプチド模倣物質、ホルモン(ペプチド、ステロイドおよびコルチコステロイド)、DおよびLアミノ酸ポリマー、オリゴ糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびDNAおよびRNAなどの核酸、タンパク質核酸ハイブリッド、小分子および生理学的に活性なそれらの類似体などの分子が挙げられる。さらに、それらの改変物質は、天然の起源から得てもよいし、または組換えもしくは合成手段により作製してもよく、類似体、アゴニストおよび相同体を包含する。
【００５０】
本明細書で用いる「タンパク質」とは、ペプチドおよびポリペプチドも指す。そのようなタンパク質としては、限定されるものではないが、酵素、生物薬剤、成長ホルモン、増殖因子、インスリン、抗体、モノクローナルおよびポリクローナルならびにそのフラグメント、インターフェロン、インターロイキンならびにサイトカインが挙げられる。
【００５１】
本明細書に記載の方法により調製される治療用核酸に基づく薬剤も、本発明に包含される。本明細書で用いる「核酸」としては、限定されるものではないが、DNA、RNA、およびそれらの生理学的に活性な類似体などの当業界で公知の治療上有効な核酸が挙げられる。このヌクレオチドは遺伝子をコードしていてもよいし、限定されるものではないが、プラスミド、レトロウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどの組換えDNAの分野で公知の任意のベクターであってもよい。
【００５２】
さらに、予防活性を有する物質およびその担体の保存も本発明に包含される。好ましい組成物としては、ワクチンなどの免疫原が挙げられる。ワクチンは経口投与用のものであってもよいし、再構成後に注射するためのものであってもよい。好適なワクチンとしては、限定されるものではないが、生ワクチンおよび弱毒化ワクチン、抗原をコードするヌクレオチドベクター、生細菌および弱毒化細菌、タンパク質、多糖、オリゴ糖および／またはリポ多糖抗原、抗原＋アジュバントならびに抗原および／または担体に結合したハプテンが挙げられる。特に好ましいのは、ジフテリア、破傷風、百日咳、ボツリヌス、コレラ、デング熱、A、B、CおよびE型肝炎、b型インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae b)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、B群連鎖球菌、A群連鎖球菌、ヘルペスウイルス、ヘリコバクターピロリ(Helicobacterium pylori)、インフルエンザ、日本脳炎、A、B、C、Y、W型髄膜炎菌、麻疹、流行性耳下腺炎、パピローマウイルス、肺炎球菌、ポリオウイルス、不活化ポリオウイルス(IPV、好ましくはワクチン分野で標準的な1、2および3型を含むもの、最も好ましくはSalkポリオワクチン)、風疹、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、赤痢菌、結核、水痘帯状疱疹ウイルス、黄熱病およびそれらの組合せに対して有効なワクチンである。ワクチンの抗原成分を、病原体から誘導されたタンパク質の１部分または２以上の部分を含む組換えペプチドまたは融合タンパク質を製造するための分子生物学的技術により製造することもできる。例えば、抗原とコレラ毒素のBサブユニットを含む融合タンパク質は、該抗原に対する免疫応答を誘導することが示された(Sanchesら(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 481-485)。ワクチンは単回投与組成物中への組込みに特に好適である。これらは、周囲条件下で無期限に安定であり、接種直前に滅菌され
た希釈液に再溶解することができる。
【００５３】
好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、血清群A、C、W-135およびYの髄膜炎菌のうち1種以上から誘導された莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、肺炎球菌から誘導された莢膜多糖を含む。肺炎球菌莢膜多糖抗原は、好ましくは血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33F(最も好ましくは血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23F)から選択される。さらに好ましい実施形態は、b型インフルエンザ菌のPRP莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、黄色ブドウ球菌の5型、8型、336、またはPNAG莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、表皮ブドウ球菌のI型、II型、III型またはPIA莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、B群連鎖球菌のIa型、Ic型、II型またはIII型莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、A群連鎖球菌の莢膜多糖を含み、好ましくはさらに少なくとも1種のMタンパク質およびより好ましくは複数の型のMタンパク質を含む。
【００５４】
本発明の一実施形態においては、細菌性多糖は、全長の、精製された天然多糖である。本発明の代替的な実施形態においては、この多糖は、より扱いやすくするためより小さいサイズとなるように、2〜20倍、好ましくは2〜5倍、5〜10倍、10〜15倍または15〜20倍のサイズである。好ましい実施形態においては、オリゴ糖を用いる。典型的には、オリゴ糖は2〜20個の反復単位を含む。
【００５５】
多糖およびオリゴ糖は、コンジュゲート化しなくてもよいし、以下に記載のようにコンジュゲート化してもよい。
【００５６】
2種以上の上記活性薬剤の組合せを、本発明の保存方法を用いて保存することができる。ワクチンの一部または全部を、本発明の保存方法を用いて保存することができる。
【００５７】
本発明の方法を用いて保存しようとする好ましい活性薬剤は、IPV(ポリオウイルス株の不活化混合物)を含む。IPV、特に3型成分は、凍結乾燥または発泡乾燥およびそれに続く再構成の後に抗原を喪失することが示されるように、従来の凍結乾燥技術および発泡乾燥技術に対して壊れやすい。
【００５８】
IPVは、不活化されたポリオウイルス(好ましくはワクチン分野で標準的な1、2および3型を含み、最も好ましくはSalkポリオワクチンである)と定義される。IPVのワクチン用量は、20〜80、好ましくは40または80 D-抗原ユニットの1型(Mahoney)、4〜16、好ましくは8または16 D-抗原ユニットの2型(MEF-1)、および20〜64、好ましくは32または64 D-抗原ユニットの3型(Saukett)を含む。
【００５９】
本発明の方法により乾燥する場合、1、2、および3型のポリオウイルスのうち1、2、または3種全部の抗原性が保持されるのが好ましい。1型、2型、3型、1型および2型、1型および3型、2型および3型、または1型、2型および3型の抗原性が、乾燥工程に供していない参照サンプルの抗原性の少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％または98％のレベルで保持されるのがより好ましい。これを、1、2および／もしくは3型ポリオウイルスに対するポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体を用いるELISAによるなどの任意の好適な方法により、水性溶液中への高い粘性を有する液体の再構成後に測定することができる。
【００６０】
本発明の方法により乾燥する場合、1、2、および3型のポリオウイルスのうち1、2、または3種全ての免疫原性が保持されるのが好ましい。1型；2型；3型；1型および2型；1型および3型；2型および3型；または1型、2型および3型の免疫原性が、乾燥工程に供していない参照サンプルの免疫原性の少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％または98％のレベルで保持されるのがより好ましい。これを、任意の好適な方法により、水性溶液中への高い粘性を有する液体の再構成後に測定することができる。好ましい方法においては、高い粘性を有する液体を水性溶液中で再構成し、動物、好ましくはラットに接種する。好適な時間の後、接種された動物から抗血清を回収し、血清変換を試験する。好ましくは、未乾燥の参照サンプルと比較して、少なくとも0.4、0.5、0.6、0.7、0.8または0.9の相対効力を達成する。
【００６１】
好ましくは、IPVを、1種以上のHib(b型インフルエンザ菌)PRP多糖もしくはオリゴ糖ならびに／または髄膜炎菌のA、C、Wおよび／もしくはY型多糖もしくはオリゴ糖ならびに／または肺炎球菌の多糖もしくはオリゴ糖と組み合わせる。最も好ましくは、活性薬剤は、IPVおよびHib；IPVおよびMenC；IPV、HibおよびMenC；HibおよびMenC；IPVならびにMenAおよびC；HibならびにMenAおよびC；IPV、Hib、MenAおよびC；Hib、MenCおよびY；またはIPV、Hib、MenCおよびYを含む。
【００６２】
上記の詳述した活性薬剤は、以下に記載の1種以上の肺炎球菌莢膜多糖を含んでもよい。
【００６３】
多糖を用いる上記の組成物において、オリゴ糖を用いることもできる(以下に定義する)。
【００６４】
これらの組成物にアジュバント添加することはできるが(以下に記載)、これらには好ましくはアジュバント添加しないか、好ましくはアルミニウム塩を含有させない。
【００６５】
前記多糖またはオリゴ糖を、T-ヘルパーエピトープを含むペプチドまたは担体タンパク質とコンジュゲート化するのが好ましい(以下に記載)。
【００６６】
追加成分
本発明の方法により乾燥された好ましい組合せを、他の抗原と組み合わせて組合せワクチンとしてもよく、それは乾燥させてもよいし、好ましくはその乾燥成分を再構成するのに用いることができる液体製剤としてもよい。上記パラグラフに記載の活性薬剤と組み合わせるのに好ましい抗原としては、1種以上のジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、全細胞百日咳(Pw)、非細胞性百日咳(Pa)(以下に記載)、B型肝炎表面抗原、A型肝炎ウイルス、b型インフルエンザ菌多糖、髄膜炎菌多糖、髄膜炎菌血清型Bタンパク質、肺炎球菌多糖、肺炎球菌タンパク質または以下に列挙する抗原のいずれかが挙げられる。細菌性多糖を、以下に記載するように破傷風トキソイド、破傷風トキソイド断片C、ジフテリアトキソイド、CRM197、ニューモリシン、プロテインD(US6342224)などの担体タンパク質とコンジュゲート化することができる。
【００６７】
本発明の方法を用いて保存される活性薬剤を、髄膜炎菌、b型インフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌、A群連鎖球菌、B群連鎖球菌、黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌のうち1種以上から得られた莢膜多糖と共に製剤化することができる。好ましい実施形態においては、免疫原性組成物は血清群A、C、W-135およびYの髄膜炎菌のうち1種以上から得られた莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、肺炎連鎖球菌から誘導された莢膜多糖を含む。肺炎球菌の莢膜多糖抗原は、好ましくは血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33F(最も好ましくは血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23F)から選択される。さらに好ましい実施形態は、b型インフルエンザ菌のPRP莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、黄色ブドウ球菌の5型、8型、336またはPNAG莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、表皮ブドウ球菌のI型、II型、III型またはPIA莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、B群連鎖球菌のIa型、Ic型、II型またはIII型莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、A群連鎖球菌の莢膜多糖を含み、好ましくはさらに少なくとも1種のMタンパク質およびより好ましくは複数の型のMタンパク質を含む。
【００６８】
本発明の一実施形態においては、細菌性多糖は全長の、精製された天然多糖である。本発明の代替的な実施形態においては、この多糖は、より扱いやすくするためより小さいサイズとなるように、2〜20倍、好ましくは2〜5倍、5〜10倍、10〜15倍または15〜20倍のサイズである。好ましい実施形態においては、オリゴ糖を用いる。典型的には、オリゴ糖は2〜20個の反復単位を含む。
【００６９】
そのような莢膜多糖は、コンジュゲートしなくてもよいし、破傷風トキソイド、破傷風トキソイド断片C、ジフテリアトキソイド、CRM197、ニューモリシン、プロテインD(US6342224)などの担体タンパク質とコンジュゲート化してもよい。破傷風毒素、ジフテリア毒素およびニューモリシンを、遺伝的突然変異および／または好ましくは化学的処理により解毒する。
【００７０】
多糖コンジュゲートを、当業界で公知の任意のカップリング技術により調製することができる。例えば、多糖を、チオエーテル結合を介してカップリングすることができる。このコンジュゲーション方法は、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP)を用いて前記多糖を活性化させて、シアン酸エステルを形成させることによるものである。かくして、活性化された多糖を、担体タンパク質上のアミノ基と、直接カップリングさせるか、またはスペーサー基を介してカップリングさせることができる。好ましくは、シアン酸エステルを、ヘキサンジアミンとカップリングさせ、アミノ誘導体化された多糖を、チオエーテル結合の形成を伴うヘテロ結合化学を用いて担体タンパク質とコンジュゲートさせる。そのようなコンジュゲートは、PCT公開WO93/15760(Uniformed Services University)に記載されている。
【００７１】
前記コンジュゲートを、US4365170 (Jennings)およびUS4673574 (Anderson)に記載の直接還元アミノ化法により調製することもできる。別の方法がEP-0-161-188、EP-208375およびEP-0-477508に記載されている。
【００７２】
さらなる方法は、カルボジイミド縮合(Chu C.ら、Infect. Immunity, 1983, 245-256)による、タンパク質担体への、アジピン酸ヒドラジド(ADH)を用いて誘導体化したシアノゲンブロミド活性化多糖のカップリングを含む。
【００７３】
好ましい肺炎球菌タンパク質抗原は、肺炎球菌の外膜上に露出された肺炎球菌タンパク質(肺炎球菌の生活環の少なくとも一部の間は宿主の免疫系により認識され得る)、または肺炎球菌により分泌もしくは放出されるタンパク質である。最も好ましくは、前記タンパク質は、毒素、アドヘシン、2成分シグナル伝達因子、もしくは肺炎連鎖球菌のリポタンパク質、またはそれらの断片である。特に好ましいタンパク質としては、限定されるものではないが、ニューモリシン(好ましくは、化学的処理もしくは突然変異により解毒される) [Mitchellら、Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18(13):4010 「1型および2型肺炎連鎖球菌由来ニューモリシンの遺伝子およびタンパク質の比較」、Mitchellら、Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67-72 「大腸菌におけるニューモリシン遺伝子の発現：迅速な精製および生物学的特性」、WO96/05859 (A. Cyanamid)、WO90/06951 (Patonら)、WO99/03884 (NAVA)]；PspAおよびその膜貫通欠失変異体 (US5804193-Brilesら)；PspCおよびその膜貫通欠失変異体 (WO97/09994-Brilesら)；PsaAおよびその膜貫通欠失変異体 (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64(12): 5255-62 「PsaAの配列異種性、肺炎連鎖球菌のビルレンスにとって必須である37キロダルトンの推定アドヘシン」；肺炎球菌コリン結合タンパク質およびその膜貫通欠失変異体 (WO97/41151；WO99/51266)；CbpAおよび膜貫通欠失変異体(WO 97/41151; WO99/51266)；グリセルアルデヒド-3-リン酸-デヒドロゲナーゼ(Infect. Immun. 1996, 64:3544)；HSP70 (WO96/40928)；PcpA (Sanchez-Beatoら、FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14)；M様タンパク質(EP0837130)ならびにアドヘシン18627(EP0834568)が挙げられる。さらに好ましい肺炎球菌タンパク質抗原は、WO98/18931に開示されたものであり、特に、WO98/18930およびPCT/US99/30390で選択されたものである。
【００７４】
本発明の免疫原性組成物と共に製剤化するのに好ましい髄膜炎菌タンパク質としては、TbpA (WO93/06861; EP586266; WO92/03467; US5912336)、TbpB (WO93/06861; EP586266)、Hsf (WO99/31132)、NspA (WO96/29412)、Hap (PCT/EP99/02766)、PorA、PorB、OMP85(D15としても知られる)(WO00/23595)、PilQ (PCT/EP99/03603)、PldA (PCT/EP99/06718)、FrpB (WO96/31618、配列番号38を参照)、FrpAもしくはFrpCまたはその両方の少なくとも30、50、100、500、750アミノ酸に共通する保存された部分(WO92/01460)、LbpAおよび／またはLbpB (PCT/EP98/05117; Schryversら、Med. Microbiol. 1999, 32:1117)、FhaB (WO98/02547)、HasR (PCT/EP99/05989)、lipo02 (PCT/EP99/08315)、MltA (WO99/57280)ならびにctrA (PCT/EP00/00135)が挙げられる。髄膜炎菌タンパク質を、外膜調製物の一部として、精製されたタンパク質として添加するのが好ましい。
【００７５】
前記ワクチンを、ジフテリア菌、破傷風菌および百日咳菌(Bordetella pertussis)感染のうち1つ以上に対する防御を提供する抗原と共に製剤化するのが好ましい。百日咳菌成分は、PT、FHAおよび69kDaパータクチンに由来する少なくとも1種の抗原(好ましくは、2種または3種全部)を含む死滅させた全細胞百日咳菌(Pw)または非細胞性百日咳菌(Pa)であってもよい。特定の他の非細胞性ワクチンもFim2およびFim3などの凝集原を含み、これらのワクチンも本発明における使用が意図される。典型的には、ジフテリア菌および破傷風菌に対する防御を提供する抗原は、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドである。これらのトキソイドは、化学的に不活化された毒素(例えば、ホルムアルデヒドにより処理したもの)または1個以上の点突然変異の導入により不活化された毒素である。
【００７６】
あるいは、本発明の高い粘性を有する液体を、一方の容器に入れた高い粘性を有する液体ガラスおよび他方の容器に入れた液体DTPaまたはDTPwを有するキットとして、提供することができる。そのようなキットは、例えば、乾燥された成分と液体成分とを、同じシリンジ中であるが異なるチャンバー中に含有させて有する２室シリンジを含んでもよい。乾燥された成分は、次いで、単一ワクチンとして注射する直前に、液体ワクチンと合わせて再構成する。かくして、例えば、本発明の高い粘性を有する液体組成物を、液体DTPaまたはDTPwワクチンと共に再構成し(好ましくは即席で)、単一ワクチンとして投与する。典型的には、DTPaまたはDTPwワクチンには、水酸化アルミニウムを、少なくとも部分的にアジュバント添加する(例えば、GlaxoSmithKline Biologicals s.a.のInfanrix(登録商標)およびTritanrix(登録商標)ワクチン)。
【００７７】
本ワクチンは、必要に応じて、不定型インフルエンザ菌、RSVに対して宿主を保護することができる1種以上の抗原、および／またはインフルエンザウイルスに対して宿主を保護することができる1種以上の抗原を含んでもよい。
【００７８】
好ましい不定型インフルエンザ菌タンパク質抗原としては、Fimbrinタンパク質 (US5766608)およびそれに由来するペプチドを含む融合タンパク質(例えば、LB1 Fusion) (US5843464-Ohio State Research Foundation)、OMP26、P6、プロテインD、TbpA、TbpB、Hia、Hmw1、Hmw2、Hap、およびD15が挙げられる。
【００７９】
好ましいインフルエンザウイルス抗原としては、卵もしくはMDCK細胞中で増殖させた全ウイルス、生ウイルスもしくは不活化ウイルス、分割インフルエンザウイルス、またはベロ細胞もしくは全インフルエンザ・ビロソーム(R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920により記載)、またはHA、NP、NA、もしくはMタンパク質、もしくはその組合せなどのその精製もしくは組換えタンパク質が挙げられる。
【００８０】
好ましいRSV(呼吸器合胞体ウイルス)抗原としては、F糖タンパク質、G糖タンパク質、HNタンパク質、Mタンパク質またはその誘導体が挙げられる。本発明の抗原性組成物は、単一種の細菌に由来する1種以上の莢膜多糖を含んでもよいことが理解されるべきである。抗原性組成物はまた、1種以上の種の細菌に由来する莢膜多糖を含んでもよい。
【００８１】
免疫原性組成物およびワクチン
本発明のさらなる態様は、本発明の高い粘性を有する液体と製薬上許容し得る賦形剤を含む免疫原性組成物またはワクチンを含む。
【００８２】
好ましくは、この免疫原性組成物またはワクチンは免疫原に対する免疫応答を増強するのに十分な量のアジュバントを含む。好適なアジュバントとしては、限定されるものではないが、アルミニウム塩、スクアレン混合物(SAF-1)、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリア細胞壁調製物、モノホスホリルリピドA、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Quil A、コレラ毒素Bサブユニット、ポルホスファゼン(polphosphazene)およびその誘導体、ならびにTakahashiら(1990)、Nature 344: 873-875により記載されたものなどの免疫賦活性複合体(ISCOM)が挙げられる。獣医学的使用、および動物における抗体産生についても、フロイントアジュバントのマイトジェン成分を用いることができる。
【００８３】
全ての免疫原性組成物またはワクチンに関して、前記免疫原の免疫学的に有効な量を、実験的に決定しなければならない。考慮すべき因子としては、免疫原性、免疫原をアジュバントもしくは担体タンパク質もしくは他の担体と複合体化させるか、または共有結合させるか否か、投与経路および投与すべき免疫投与量の値などが挙げられる。そのような因子はワクチン分野で公知であり、過度な実験を行うことなくそのような決定を行うことは十分に免疫学の当業者の技能の範囲内にある。
【００８４】
活性薬剤を、本発明の高い粘性を有する液体またはワクチン中、様々な濃度で存在させることができる。典型的には、前記物質の最低濃度は、その意図される用途を達成するのに必要な量であり、一方、最高濃度は、溶液で維持されるかまたは最初の混合物内で均質に懸濁される最大量である。例えば、治療剤の最小量は、治療上有効な単回用量を提供するものであるのが好ましい。生物活性を有する物質については、最低濃度は再構成に際して生物活性にとって必要な量であり、最大濃度は均質な懸濁を維持することができない時点のものである。単回投与単位の場合、その量は単回の治療用途のものである。一般的には、各用量は1〜100μg、好ましくは5〜50μg、最も好ましくは5〜25μgのタンパク質抗原を含むことが予想される。細菌性多糖の好ましい用量は、10〜20μg、10〜5μg、5〜2.5μgまたは2.5〜1μgである。前記物質の好ましい量は、物質間で様々であるが、当業者であれば容易に決定できる。
【００８５】
活性薬剤を含む高い粘性を有する液体
本発明の別の態様は、好ましくは本発明の方法を用いて取得可能であるか、または取得された活性薬剤を含む高い粘性を有する液体である。活性薬剤は、本発明の方法を用いる乾燥およびそれに続く再構成の後でもその活性および／または抗原性および／または免疫原性を維持するのが好ましい。活性薬剤の活性、抗原性もしくは免疫原性の少なくとも40、50、60、70、80、90、または95％が保持されるのが好ましい。これを、例えば、上記のような任意の好適な方法により決定することができる。
【００８６】
本発明の高い粘性を有する液体は、グルコース、マルツロース、イソ-マルツロース、ラクツロース、スクロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、イソ-マルトース、マルチトール、ラクチトール、パラチニット、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトースおよびデキストランからなる群より選択されるガラス形成ポリオールを含むのが好ましい。
【００８７】
本発明の高い粘性を有する液体は、上記の活性薬剤のうち任意のものを含んでよい。高い粘性を有する液体により保存された活性薬剤は、生物学的システム、例えば、細胞、細胞成分(subcellular)組成物、細菌、外膜ベシクル調製物およびウイルスを含んでもよい。あるいは、またはさらに、それは分子、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ポリ核酸、オリゴヌクレオチド、多糖、オリゴ糖、多糖-タンパク質コンジュゲート、オリゴ糖-タンパク質コンジュゲートを含んでもよい。また、それは上記活性薬剤の2種以上を含む組合せを含んでもよい。
【００８８】
好ましい実施形態は、好ましくは本発明の方法により取得されたか、または取得可能である高い粘性を有する液体であって、活性薬剤がワクチンもしくはワクチン成分であるか、またはこれらを含むその液体を包含する。ワクチンの好ましい成分は上述されており、IPV、より好ましくはIPVと細菌性多糖、好ましくはb型インフルエンザ菌ならびにA、C、WおよびY型髄膜炎菌に由来する多糖またはオリゴ糖を含む。
【００８９】
好ましいワクチン成分としては、IPV(ポリオウイルス株の不活化混合物)が挙げられる。IPVを、Hib PRP多糖ならびに／またはA、C、Wおよび／もしくはY型髄膜炎菌多糖および／または肺炎球菌多糖(上記)のうち1つ以上と組み合わせることが好ましく、より好ましくはIPVおよびHib；IPVおよびMenC；IPV、HibおよびMenC；HibおよびMenC；IPVおよびMenAおよびC；HibおよびMenAおよびC；IPV、Hib、MenAおよびC；Hib、MenCおよびY；またはIPV、Hib、MenCおよびYである。
【００９０】
多糖を用いる上記組成物においては、オリゴ糖を用いることもできる(上記で定義する通り)。
【００９１】
これらの組成物をアジュバント化できるが(上記のとおり)、これらをアジュバント化しないか、またはアルミニウム塩を含まないようにするのが好ましい。
【００９２】
前記多糖またはオリゴ糖を、T-ヘルパーエピトープを含むペプチドまたは担体タンパク質とコンジュゲートするのが好ましい(上記のとおり)。
【００９３】
本発明の高い粘性を有する液体は、必要に応じて乾燥されているかまたは好ましくは乾燥された成分を再構成するのに用いることができる液体製剤である他の抗原と組み合わせて、組合せワクチンとするのが好ましい。本発明の容器の内容物と組み合わせるのに好ましい抗原としては、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、全細胞百日咳(Pw)、非細胞性百日咳(Pa)(上記のとおり)、B型肝炎表面抗原、肺炎球菌多糖、肺炎球菌タンパク質、髄膜炎菌多糖、髄膜炎菌タンパク質のうちの1種以上が挙げられる。細菌性多糖を、上記のような破傷風トキソイド、破傷風トキソイド断片C、ジフテリアトキソイド、CRM197、ニューモリシン、プロテインD(US6342224)などの担体タンパク質とコンジュゲートしてもよい。
【００９４】
本発明のさらなる態様は、高い粘性を有する液体を水性溶液中で再構成する工程を含むワクチンの製造方法である。好ましい実施形態においては、前記水性溶液はジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび百日咳(非細胞性または全細胞性)抗原を含み、必要に応じて、さらにB型肝炎表面抗原を含む。DTPワクチンに、必要に応じてアルミニウム塩、好ましくは水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムを加えて少なくとも部分的にアジュバント化する。
【００９５】
本発明の別の実施形態は、第1の容器に保持された本発明の高い粘性を有する液体と、第2の容器中の液体DTP(非細胞性または全細胞性)を含むワクチンとを含むキットである。上記のような２室シリンジを用いることができる。
【００９６】
本特許出願明細書内で引用された全ての参考文献または特許出願は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例は、別途詳細に記載する点以外は、当業者には周知であり日常的である標準的な技術を用いて行う。実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
【００９８】
実施例1. 凍結条件の確立
サンプルを、水にスクロースを溶解させて1％、5％、10％および20％溶液を得ることにより作製した。保存温度を1℃以内で調節することができ、コンデンサーの最終温度が-85℃であり、圧力をブリード弁により調節し、6個の熱電対を利用して生成物の温度を測定することができる、Heto Drywinner 8-85凍結乾燥装置中にサンプルを入れた。保存温度の設定を、処理過程を通じて15℃に維持した。圧力を、最初は200 mbarに低下させ、このレベルで10分間維持した後、圧力をさらに50 mbar、5 mbar、2.5 mbar、0.75 mbar、0.4 mbarおよび0.2 mbarに低下させた。各圧力レベルを20分間維持して、温度を平衡化させ、サンプルの温度を、熱電対を用いて読み取った。熱電対を、異なるスクロース濃度のサンプルに付着させた。表1に記録された温度はその温度の平均値である。
【００９９】
結果
全てのサンプルは、存在するスクロースの濃度にかかわらず、1.66〜1.11 mbarで凍結した。様々な圧力において測定された温度は、3点曲線から予測されるものと非常に近かった。従って、スクロースの存在は、様々な圧力でのサンプルの温度に対して大きな効果は示さない。
【０１００】
サンプルの凍結を回避するためには、15℃の保存温度について、圧力を2 mbarより高く維持するべきである。より低い温度では、圧力をより高いレベルに維持するべきであり、一方、より高い温度を使用すれば、サンプルが凍結することなく圧力をさらに低下させることができる。
【表１】
【０１０１】
実施例2. 凍結も気泡形成もさせることなく乾燥する方法
5％、10％、15％および25％のスクロースを含む保存サンプルを作製し、バイアルに添加した。サンプルを、処理過程を通じて15℃の温度設定で凍結乾燥装置に入れた。圧力を、最初は200 mBarに低下させてこのレベルで10分間維持し、脱気した後、圧力をさらに低下させた。圧力を2〜3時間に渡ってさらに8 mbarに低下させ、その間、サンプルの内側の熱電対は、サンプルの温度が蒸発冷却によって4℃に低下したことを示していた。2〜3時間後、サンプルの温度は15℃に戻ったが、これは、これらの温度および圧力条件下での蒸発がほぼ完了したことを示している。サンプル内の活性薬剤ができる限りストレスに曝されないようにするため、本処理過程のこの段階において、サンプルを沸騰させて気泡を形成させたり凍結させたりはしなかった。サンプルは粘性の液体の外観を有する。
【０１０２】
サンプルのさらなる乾燥を、保存温度の設定を15℃に保持しながら圧力をさらに0.1 mbarに低下させることにより、達成した。これらの条件をさらに10〜16時間維持した。この段階の間、蒸発速度が遅かったため、サンプル温度は15℃を保持した。さらなる乾燥が起こり、得られたサンプルは固体の外見を示した。サンプルを横倒しで置いた場合、サンプルの内容物は、数日間かけて、非常にゆっくりと流動し、サンプルが高い粘性を有する液体ガラスであることを示した。図1は、高い粘性を有する液体の外見を示す。
【０１０３】
実施例3. 凍結も気泡形成もさせることなく乾燥した後のIPV免疫原性の保持
そのようなサンプルは、気泡形成を伴う発泡または凍結と関連したストレスに供しなかった。この方法が、IPVを乾燥するのに用いられた場合に高いレベルで抗原保持をもたらすかどうかを判定するために、実験を行った。
【０１０４】
安定化剤として10％スクロースまたは10％トレハロースを含む水性溶液中にIPVを再懸濁する3つの別々の実験を行った。サンプルをシリコーン処理したバイアルに入れ、これをHeto Drywinner 8-85凍結乾燥装置に入れて温度を15℃に設定した。圧力を、最初は35 ミリバール(mBar)に低下させて、サンプルを脱気した。10分後、圧力をさらに8 mBarに低下させ、このレベルで2時間保持した。この期間中、温度設定を15℃に保持し、サンプル内の温度をモニターした。水がサンプルから蒸発するにつれて温度は4℃まで低下したが、蒸発速度が遅いため、2時間の終わりに向けて、温度は15℃に戻った。これらの条件下では、発泡も気泡形成も起こらなかった。次いで、圧力をさらに0.1 mbarに低下させ、これらの条件を、最初の2つの実験については、さらに16時間以上に渡って維持し、3つめの実験については10時間以上に渡って維持した。
【０１０５】
サンプルを水中で再構成させ、ELISAを用いて、3種のポリオウイルス株の抗原性の保持を評価した。3型IPVに対するモノクローナル抗体をELISAにおいて用いて、凍結させなかった参照サンプルと比較して、再構成された凍結乾燥サンプルにおける抗原保持の程度を評価した。結果を、乾燥手順を行わなかったサンプルについて得られた読み取り値の％として示す。
【０１０６】
結果
乾燥されたサンプルは固体の外見を示していたが、容器を倒置した場合に、乾燥されたサンプルは数日間をかけて流動することができたので、それらは高い粘性を有する液体／ガラスの形態であると考えられた。
【表２】
【０１０７】
3型IPV抗原保持のこれらのレベルは、同じELISA方式で3型に対するモノクローナル抗体を用いる場合に通常は非常に低い値が認められる以下に示した凍結乾燥の結果よりも、はるかに優れている。
【表３】
【０１０８】
実施例4. 高い粘性を有する液体／ガラスとして保存される乾燥されたIPVの長期保存安定性
実施例3に記載の方法を用いて乾燥されたサンプルを、4℃にて9ヶ月間保存した。サンプルを150 mM NaClを含む水中で再構成し、ELISAを用いて、3種のポリオウイルス株の抗原性の保持を評価した。各株に対して１つずつの、3種のモノクローナル抗体を別々のELISAにおいて用いて、再構成された保存サンプルにおける抗原保持の程度を評価した。保存前の同じバッチに由来する再構成サンプルについて、同様のELISAを行った。全ての結果を、乾燥していない参照サンプルと比較した。結果を、乾燥手順を行っていないサンプルについて得られた読み取り値の％として示す。
【０１０９】
結果
【表４】
【０１１０】
従って、実施例3に記載の方法により乾燥されたIPVは、抗原性を喪失せずに4℃で少なくとも9ヶ月間保存される。
【０１１１】
実施例5. 乾燥して高い粘性を有する液体を形成し再構成した後のIPVと、乾燥されていないIPVのin vivoにおける免疫原性の比較
10匹のWistarラットの群に、実施例2に開示された方法を用いて、10％スクロースの存在下で乾燥して高い粘性を有する液体を形成させ、再構成させたIPVを、種々の希釈度で接種した。10匹のWistarラットのさらなる群に、同じ方法で調製したが乾燥していないIPVの参照サンプルを接種した。
【０１１２】
21日後、全てのラットから血清を取得し、1型、2型および3型ポリオウイルスを用いる別々の免疫沈降アッセイにおいてその血清を試験した。
【０１１３】
結果を、a) 各IPV希釈物に対する応答ラット数、b) 免疫沈降アッセイにより評価した、50％のラットの血清転換を確保するのに必要な用量であるED50、およびc) 乾燥していない参照IPVと比較した、乾燥して再構成したIPVの相対効力、を含む表5に示す。
【表５】
【０１１４】
JLEO17/05は、乾燥されて高い粘性を有する液体を形成し続いて再構成されたIPVバッチである。JLE097は乾燥していない参照である。
【０１１５】
表5は、IPVの各希釈物を接種した反応個体数が、乾燥され再構成されたIPVの2つのバッチと乾燥していない参照サンプルとの間でよく似ていることを示す。全体的には、1型IPVが最良の免疫応答を引き出し、2型がわずかに少ないラットにおいて免疫応答を引き出した。3型は最も弱い免疫応答を引き出した。
【０１１６】
乾燥させて高い粘性を有する液体を形成させる工程は、in vivoで免疫沈降抗体を惹起するIPVの能力を損なわない。1.0の相対効力(RP)読み取り値は、サンプルが参照サンプルと同等の応答を惹起することを示している。乾燥されたサンプルは共に、3つ全ての型のポリオウイルスについて1.0に近いRP読み取り値をもたらすが、これは本乾燥工程が、免疫応答を惹起するサンプルの能力に影響を及ぼさないことを示している。
【０１１７】
実施例6. 安定化剤としてスクロースまたはトレハロースを用いて高い粘性を有する液体を形成するように乾燥させることの、in vivoにおける免疫沈降性免疫応答を惹起するIPVの能力に対する影響
10匹のWistarラットの群に、実施例2に記載のように10％スクロースまたは10％トレハロースの存在下で乾燥させた後で再構成させたIPVを、接種した。さらに10匹のWistarラットの群に、参照サンプルとして、乾燥していない等量のIPVを接種した。
【０１１８】
21日後、全てのラットから血清を回収し、実施例5に記載のように免疫中和アッセイを用いて、1型、2型および3型ポリオウイルスの各々に対して生じた免疫中和抗体の量を評価した。
【０１１９】
その免疫応答を、乾燥していない参照サンプルにより惹起された免疫応答と比較することにより、各サンプルについて相対効力を算出した。
【０１２０】
結果を表6に示す。
【表６】
【０１２１】
サンプル中に残存する水の量は、Karl Fischerの電量湿度分析装置により測定したところ、スクロースを安定化剤として用いた場合は約5％の残存湿度であり、安定化剤としてトレハロースを用いた場合の約10％と比較して低かった。
【０１２２】
スクロースおよびトレハロースは共に、再構成されたIPVが異なる型のポリオウイルスの大部分について1.0に達する相対効力読み取り値を与えたように、乾燥工程においてIPVを安定化させるのに有効であった。この相対効力は、比較的容易にその免疫原性を喪失する3型ポリオウイルスについて特に良好であった。
【０１２３】
実施例7. Karl Fischerによる湿度の測定
分析はKarl Fischerの滴定測定装置(Aqua 30.00 - Elektrochemie Halle)で行った。サンプルの質量を測り、80℃に設定したオーブンに入れた。サンプルは、窒素ガスでフラッシュした後、ヒドラナル試薬(Riedel de Hahn)に添加して、電量分析により分析を行った。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】倒置したバイアル中の高い粘性を有する液体の写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的サンプルおよび他の不安定なサンプルの保存、そのような保存されたサンプルならびにそのようなサンプルを保存するための新規な方法に関する。この新規な方法は、活性薬剤および安定化剤を含むサンプルを容器に添加し、該サンプルを凍結させたり発泡させて気泡を形成させたりすることなく、蒸発により溶媒の喪失を引き起こすような温度および圧力条件に該サンプルを供することを含む。続いて、第２の乾燥段階において、溶媒が除去され、保存サンプルが乾燥して高い粘性を有する液体を形成するように、圧力および温度条件を維持するかまたは調整する。さらに、本発明は、本発明の方法により保存された組成物、そして特に、保存されたワクチン組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
不安定なサンプル、特に生物学的サンプルの安定性、従って保存寿命を延長させる必要性が存在する。伝統的に、これは物質の溶液を作製し、そのサンプルを凍結させる凍結乾燥の方法を用いて達成されてきた。第１の乾燥段階において、大部分の水を、減圧条件下で氷からの昇華により除去し、多孔性の「ケーキ」を形成させる。通常、この後、圧力および温度を変え、水を固体の「ケーキ」から蒸発させる第２の乾燥段階を行う。得られる凍結乾燥サンプルは、液体製剤と比較して改良された安定性を有する。しかしながら、凍結乾燥方法は、長期間に渡り、費用がかさみ、製造方法における速度制限工程となり得る。
【０００３】
凍結乾燥はまた、いくつかの活性薬剤の活性または抗原性の喪失が生じ得る。生ウイルスなどの特定の生物材料については、凍結乾燥工程において活性の有意な喪失が生じ得る(Pikal(1994) ACS Symposium 567:120-133)。多くの凍結乾燥された物質は、周囲温度では依然として不安定である(Carpenterら(1994) ACS Symposium 567; 134-147)。
【０００４】
凍結工程により引き起こされる損傷は、ポリオールなどの安定化剤の使用により、ある程度まで回避することができる。凍結乾燥工程におけるさらなる改良はまた、該工程におけるサンプルの凍結回避および沸騰による水の除去により為されてきた(WO96/40077；US6306345)。この方法は、保存しようとするサンプルと共に好適な溶媒中にガラス-マトリックス形成材料の混合物を調製し、該混合物からバルク溶媒を蒸発させてシロップを取得し、シロップの沸騰を引き起こすのに十分な圧力および温度にシロップを曝露し、そして残渣の溶媒を除去することを含む。これと同様の方法を、発泡乾燥技術と呼ぶ。そのような技術では、「沸騰」段階における気泡の形成および破裂に起因するストレスに、保存しようとするサンプルを曝露することになる。特に、不安定な物質を保存しようとする場合、これは活性の喪失をもたらし得る。
【０００５】
同様の方法がUS5,766,520に記載されており、この方法は水を部分的に除去して粘性の液体を形成させ、さらに、そのシロップを、減圧工程にかけて「沸騰」させ、さらに、100℃よりかなり低い温度で乾燥させることを含む。この方法は依然として、従来の凍結乾燥の問題のいくつかを欠点として有する。この方法を大きな凍結乾燥装置中で実行する場合、サンプルは貯蔵庫中のその位置に依存して異なる速度で乾燥し、これは乾燥工程において、異なる量の活性を喪失した異なるサンプルをもたらす。これは、バッチ内の一貫性の欠如をもたらす。
【０００６】
トレハロースは、その安定化特性が好ましいポリオールである。トレハロースは、最初はいくつかの植物および動物における乾燥による損傷の防止と関連することが見出された、天然の、不活性な、非還元性および非毒性の、ガラス形成ジサッカリドである。トレハロースは、１つには、比較的高いガラス転移温度(無水状態で約120℃)を有するために、乾燥およびその後の保存中の、タンパク質、ウイルスおよび食品などの種々の物質の変性を防止するのに有用である(US4891319；US5149653；US5026566)。トレハロースはまた、酵素を安定化させる(ArgallおよびSmith(1993) Biochem. Mol. Biol. Int. 30;491)。トレハロースおよび種々の安定化ポリオールはまた、サンプルが凍結乾燥工程において活性を喪失する傾向がある場合には特に、凍結乾燥されたサンプルの保存を改良するのに有用であることが見出されている。凍結乾燥技術において有用な他の糖としては、スクロースおよびラクトースが挙げられる。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、特に、活性薬剤が、ごく慣用された乾燥工程において不安定であり活性を喪失する傾向がある場合に、該活性薬剤を保存するための改良された方法に関する。この方法は、活性薬剤を、安定化剤の溶液中に溶解／懸濁することにより保存サンプルを調製する工程；該保存サンプルが凍結したり発泡して気泡を形成したりすることなく該サンプルが蒸発により溶媒を放出するような温度および圧力条件に、該保存サンプルを供する工程；ならびに該保存サンプルが乾燥して高い粘性を有する液体を形成するまで溶媒を除去する工程を含む。
【０００８】
この方法は非常に穏やかなものであり、活性薬剤を凍結または沸騰に曝さず、従って、サンプルをこれらのストレスの一方または両方に供する従来の凍結乾燥技術および発泡乾燥技術よりも有利である。保存しようとする活性薬剤が不安定である場合、本発明の方法の使用は、活性および／または抗原性の保持性を向上させる。そのことは、溶媒、好ましくは水または水性溶液中で、乾燥された活性薬剤を再構成し、標準的なアッセイ(例えば、ELISA)により活性または抗原性を測定し、その結果と、乾燥されていないサンプルまたは凍結乾燥技術もしくは発泡乾燥技術により乾燥した後、再構成されたサンプルを用いて得られた結果とを比較することにより測定することができる。
【０００９】
本発明の方法を用いて、IPV(不活化ポリオウイルス、注射可能なポリオワクチン中の免疫原)を乾燥するのが特に有利である。IPVは、液体製剤として公知のワクチン中に存在する(WO99/48525)。標準的な凍結乾燥手順はIPVの抗原性の喪失をもたらすため、IPVの固形製剤をワクチンに使用する試みにおいて問題が生じている。本発明の方法は、部分的には本発明の方法により必要とされる時間の減少により、ポリオウイルス抗原のより高い保持をもたらす。
【００１０】
本発明の方法は、稼動サイクルがより短く、冷凍を必要とせず、それによりエネルギー効率がより高まるため、通常の凍結乾燥よりも有利である。乾燥工程は、処理過程の速度制限工程であることが多いため、本発明の方法の使用は少ない費用でより高いレベルの生産をもたらす。
【００１１】
詳細な説明
本発明の方法は活性薬剤の保存に使用されるものであって、この方法は、下記工程：
・安定化剤の溶液中に活性薬剤を懸濁または溶解することにより、保存サンプルを調製する工程；および
・凍結したり泡立って気泡を形成したりすることなく蒸発により該保存サンプルが溶媒を放出するような温度および圧力条件に、該保存サンプルを供して、粘性の液体を形成させる工程；
を含み、必要に応じて、さらなる工程：
・粘性の液体が乾燥して高い粘性を有する液体を形成するまで溶媒を除去する工程、
を含む。
【００１２】
活性薬剤を保存する方法は、長期保存に耐えることができ、その間、該活性薬剤の活性および／または抗原性および／または免疫原性が維持されるような形態の活性薬剤を生産する。この活性薬剤は、4℃で保存した場合、少なくとも3、6、9、12、24ヶ月の期間に渡って、元の活性、抗原性および／または免疫原性の少なくとも40、50、60、70、好ましくは80、90、95％を保持するのが好ましい。抗原性または免疫原性は、以下に記載する標準的なアッセイにより測定することができる。
【００１３】
この方法は、溶液中に保存した場合に、または凍結するかもしくは発泡させて気泡を形成させる場合に急速に活性を喪失する不安定な産物の保存寿命を延長させるのに特に有用である。
【００１４】
不安定な産物は、溶液中での保存および／または凍結および／または気泡形成の際の発泡に関与するものなどのストレスの負荷後に、活性喪失および／または抗原性喪失および／または免疫原性喪失を生じやすい。
【００１５】
ガラス形成ポリオールの濃度がより低い(例えば、3〜15％w/v)ことが有利であり、乾燥工程がより短い(4、6、8、10または12時間未満)ことが好ましい場合、その使用は特に適用可能である。
【００１６】
粘性の液体は、溶媒の大部分がサンプルから失われた時点での、第１の溶媒除去段階の生成物として定義される。この時点は、蒸発の速度が遅くなり、サンプルの温度がバルク蒸発の吸熱効果が失われる周囲温度に戻るため、認識することができる。
【００１７】
高い粘性を有する液体は、第１の乾燥段階の終了時点で生成されていた粘性の液体を、第１の乾燥段階の終了後のさらなる期間、減圧下に曝した後に生成される。高い粘性を有する液体は、好ましくはKarl Fischerの電量湿度分析装置(Eur. J. Pharm. Biopharm.(2000) 50;277-284)により決定されるように、15、12、10、8、5、4、3、2または1％(w/w)以下の溶媒含量を有する。溶媒含量の好ましい範囲は1〜3％、3〜5％、5〜10％、または10〜15％(w/w)である。高い粘性を有する液体は、活性薬剤が4℃で少なくとも3、6、9、12または24ヶ月間、安定状態で保存され、この期間に渡って、活性薬剤が活性および／または抗原性および／または免疫原性の少なくとも40、50、60、好ましくは70、80、90、95％を保持できるようにするだけの十分に低い溶媒含量を有する。高い粘性を有する液体は固形の外見を有するだけでなく、ゴムまたはガラス、好ましくはガラスであり、2、4、または6日間、好ましくは1、2、3または4週間、より好ましくは2、4、6、8、10または12ヶ月間かけて、非常にゆっくりと流動することができるのが好ましい。極端にゆっくりとした流動は、高い粘性を有する液体を含む容器を倒置させ、高い粘性を有する液体の流動が観察されるまで室温で静置することにより測定することができる。好ましい実施形態においては、高い粘性を有する液体は、倒置状態で、2、4または6日後、好ましくは1、2、3、または4週間後、より好ましくは2、4、6、8、10または12ヶ月後でも流動が認められないであろう。高い粘性を有する液体は、明澄透明性の外見を有するのが好ましい。
【００１８】
保存サンプルの調製
任意の安定化剤が、本発明の第1工程における使用にとって好適である。好適な材料としては、限定されるものではないが、炭水化物および非炭水化物ポリオールを含む全てのポリオールが挙げられる。安定化ポリオールは、変性、凝集または他の手段によって活性を実質的に喪失させることなく、活性薬剤を保存できるようにするのが好ましい。特に好適な材料としては、糖、糖アルコールおよび炭水化物誘導体が挙げられる。好ましくは、ガラス形成ポリオールは、グルコース、マルツロース、イソ-マルツロース、ラクツロース、スクロース、マルトース、ラクトース、イソ-マルトース、マルチトール、ラクチトール、パラチニット、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトースもしくはデキストランなどの炭水化物またはその誘導体であり、最も好ましくは、トレハロース、スクロース、ソルビトール、ラフィノース、マンニトール、ラクトース、ラクチトールもしくはパラチニット、最も好ましくはスクロース、ソルビトール、ラクトースもしくはトレハロースである。
【００１９】
細菌性多糖は、それらが安定化剤および免疫原の両方として働くことができるため、免疫原性組成物における安定化剤としての使用にとって特に有利である。
【００２０】
炭水化物としては、限定されるものではないが、モノサッカリド、ジサッカリド、トリサッカリド、オリゴ糖およびそれらの対応する糖アルコール、炭水化物誘導体および化学的に修飾された炭水化物などのポリヒドロキシル化合物、ヒドロキシエチルスターチならびに糖コポリマーが挙げられる。天然および合成の炭水化物の両方が使用に好適である。合成炭水化物としては、限定されるものではないが、チオールまたは炭素結合により置換されたグリコシド結合を有するものが挙げられる。DおよびL型の両方の炭水化物を用いることができる。この炭水化物は、非還元性でも還元性でもよい。還元炭水化物を用いる場合、Maillard反応の阻害剤の添加が好ましい。
【００２１】
本発明における使用にとって好適な還元炭水化物は当業界で公知であり、限定されるものではないが、グルコース、マルトース、ラクトース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、マルツロースおよびラクツロースが挙げられる。非還元炭水化物としては、限定されるものではないが、糖アルコールおよび他の直鎖ポリアルコールから選択されるポリヒドロキシル化合物の非還元グリコシドが挙げられる。他の有用な炭水化物としては、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、スクロース、セルビオース、マンノビオースおよび糖アルコールが挙げられる。糖アルコールグリコシドが好ましいモノグリコシドであり、特に、ラクトース、マルトース、ラクツロースおよびマルツロースなどのジサッカリドの還元により得られる化合物が好ましい。
【００２２】
特に好ましい炭水化物はトレハロース、スクロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、パラチニットおよびグルコピラノシル-1→6-マンニトールである。
【００２３】
アミノ酸は安定化剤として働くことができ、それ単独で用いることもできるが、ポリオールと組み合わせて用いるのが好ましい。好ましいアミノ酸としては、グリシン、アラニン、アルギニン、リジンおよびグルタミンが挙げられるが、任意のアミノ酸、またはアミノ酸の組合せ、ペプチド、加水分解タンパク質、または血清アルブミンなどのタンパク質も、安定化剤として働くことができる。
【００２４】
本発明の方法において用いられる安定化剤の濃度は、1〜50％(重量／体積(w/v))であってよいが、好ましくは1〜5％、5〜10％、15〜20％、20〜25％または25〜50％、最も好ましくは15％または10％(w/v)以下である。必要とされる安定化剤の量は、存在する塩の量に比例する。従って、2〜10％の安定化剤のレベルが好ましいが、高い塩含量(100 mM、200 mM、300 mM、400 mMまたは500 mMを上回る)のサンプルを乾燥するには、10〜25％のより高い濃度が必要である。
【００２５】
保存サンプルは、本発明の高い粘性を有する液体中での結晶形成を阻害することができる成分を含むのが好ましい。塩、ならびにアミノ酸およびフェノールレッドなどの他の分子は、結晶形成を阻害する。
【００２６】
容器
異なる混合物、ならびに種々の容器の形状および大きさを、同時に処理することができる。理想的には、用いる容器の大きさは、最初の混合物を含有し、その形成される固体の体積を収容するのに十分なものである。通常、これはガラス形成材料の質量、容器の表面積、およびガラス形成の条件により決定される。ガラス形成材料の質量は、実際には容器の単位表面積あたりの最小の質量に変換される粘性のシロップを与えるのに、十分なものでなければならない。この比率は、混合物間、および用いる容器の間で様々であるが、本明細書で説明する手順に従えば、当業者は経験的に容易に決定することができる。Wheaton成型バイアルおよびチューブカットバイアルなどの任意のバイアルを用いることができる。
【００２７】
本発明の方法は、溶媒をはじく物質を有する容器、好ましくは水をはじく内部表面を有する容器を用いるのが好ましい。これは、例えばシリコーン処理などにより、疎水性組成物で内部表面をコーティングすることによって達成される。シリコーン処理は、当業者には周知の方法により達成される。一つの方法においては、容器の内部をシリコーンの乳濁液ですすいだ後、高温、典型的には350℃にてオーブンを通して処理することにより、その容器をシリコーン処理する。あるいは、水をはじく内部表面は、水をはじく組成物で容器を作製することにより達成する。
【００２８】
容器の水をはじく内部表面は、水が容器の側面に集まりにくいため、前記方法の乾燥生成物の再構成が容易になる。
【００２９】
本発明では単一の形態を用いることができるが、2種以上のガラスマトリックス形成材料、2種以上の添加剤、および2種以上の物質が存在してもよい。これらの成分の有効量は、当業者により容易に決定することができる。
【００３０】
溶液
安定化剤および活性薬剤を混合する溶媒は、水性、有機性のもの、またはその両方の混合物であってもよい。ガラスマトリックス形成材料を溶解するのに十分な水性溶媒および疎水性物質を溶解するのに十分な有機溶媒を用いて、疎水性物質を含有するガラスを形成させることができる。
【００３１】
溶媒の選択は、ガラスマトリックス形成に関して選択される材料の性質、ならびに任意の添加剤および／または含有させようとする物質の性質に、依存するであろう。溶媒は、ガラスマトリックス形成材料ならびに任意の添加剤および／または物質の十分な可溶化を行うのに十分な性質および容量のものであるべきである。前記物質が親水性材料である場合、液体は、有害な溶媒相互作用に起因する活性のいかなる喪失の可能性をも回避するために、水性であるのが好ましい。好ましくは、この水性溶媒は、限定されるものではないが、水および生物学的緩衝溶液などの、当業界で公知の任意の好適な水性溶媒を含む。この水性溶媒は、5〜98体積％、より好ましくは80〜98体積％、最も好ましくは85〜98体積％の量で存在するのが好ましい。
【００３２】
溶媒の容量は様々であってよく、ガラスマトリックス形成材料および組み入れようとする物質ならびに任意の添加剤に依存するであろう。必要とされる最小の容量は、種々の成分を可溶化するのに必要な量である。しかしながら、均一に分散された物質の懸濁液を用いることもできる。特定の実施形態における成分の好適な量は、本明細書に提供される実施例を考慮に入れて、当業者であれば容易に決定することができる。
【００３３】
種々の添加剤を、保存サンプルに導入することができる。好ましい添加剤はMaillard反応の阻害剤である。好ましくは、前記物質および／またはガラスマトリックス形成材料がカルボニルおよびアミノ、イミノまたはグアニジノ基を含む場合、前記組成物はさらに、該組成物中のアミノ基と反応性カルボニル基の縮合を実質的に阻止するのに有効な量の、少なくとも1種の生理学的に許容し得るMaillard反応の阻害剤を含む。Maillard反応の阻害剤は当業界で公知の任意のものであってよい。この阻害剤は、アミノ基と反応性カルボニル基の縮合を阻止するか、または実質的に阻止するのに十分な量で存在する。典型的には、アミノ基は前記物質上に存在し、カルボニル基はガラスマトリックス形成材料上に存在するか、またはその逆である。しかしながら、アミノ基およびカルボニル基は前記物質または炭水化物内の分子内のものであってもよい。
【００３４】
Maillard反応に対して阻害作用を示し、従って本明細書に記載の組成物において有用である種々のクラスの化合物が公知である。これらの化合物は、一般的には、Maillard反応の競合的または非競合的な阻害剤である。競合的阻害剤としては、限定されるものではないが、アミノ酸残基(DおよびLの両方)、アミノ酸残基の組合せおよびペプチドが挙げられる。特に好ましいものは、リジン、アルギニン、ヒスチジンおよびトリプトファンである。リジンおよびアルギニンが最も有効である。多くの公知の非競合的阻害剤が存在する。これらのものとしては、限定されるものではないが、アミノグアニジンおよびその誘導体ならびにアンフォテリシンBが挙げられる。EP-A-0 433 679はまた、4-ヒドロキシ-5,8-ジオキソキノリン誘導体を含む好適なMaillard阻害剤を記載している。
【００３５】
本発明の方法の乾燥産物のより容易な視覚化を可能にするために、保存サンプル中に着色剤を含有させるのが有利である。これは、高い粘性を有する液体が使用前に完全に再構成されることを確実にするために、再構成の際に特に重要である。この着色剤は中性のpHでその色を維持し、患者への注射に適合性であるのが好ましい。最も好ましくは、着色剤はフェノールレッドである。
【００３６】
蒸発による溶媒の喪失(蒸発乾燥-工程b)
本発明の方法は、保存サンプルが凍結または発泡して気泡を形成することなく該保存サンプルが溶媒を失うような圧力および温度条件に、該保存サンプルを供することを含む。
【００３７】
保存サンプル内の温度は、時には、蒸発工程の吸熱性のために、サンプルの外部の温度とは異なるであろう。温度に対する言及は、保存サンプルの外部の条件、例えば、大きい工業用凍結乾燥装置を用いる場合は、貯蔵温度に対するものである。これは通常、凍結乾燥装置の温度設定に対応する。
【００３８】
必要に応じて、保存サンプルを脱気する予備工程が、本発明の方法中に存在する。圧力を、少なくとも5分間にわたり、200 ミリバール(mbar)以下、好ましくは200〜35 mbarに低下させた後、圧力をさらに低下させる。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態は、温度条件を制御しながら圧力を低下させることにより、蒸発乾燥を達成する。温度設定を0℃を上回る温度、好ましくは5〜37℃、4〜10℃、10〜15℃、15〜20℃、20〜25℃、25〜30℃、30〜37℃または37〜45℃の温度に維持しながら、圧力を、30、25、20、好ましくは15、12、最も好ましくは10、8、7、6、5、4、3、2または1 mbar以下に調整する。これらの条件を、少なくとも1、2、3、4、5、8、10、12、16または24時間、好ましくは2〜4時間、4〜6時間、6〜8時間、8〜12時間、または12〜18時間、維持する。特に好ましい実施形態においては、温度設定を15℃にしてサンプルの凍結を防止する場合、圧力を2 mbarを上回る温度で維持する。好ましい実施形態においては、温度を15℃で維持し、圧力を5〜10 mbar、より好ましくは6〜9 mbar、最も好ましくは約8 mbarに設定する。より高い温度設定を用いる場合、サンプルを凍結することなくわずかにより低い圧力が可能であり、より低い温度設定を用いる場合、凍結を防止するために、圧力をより高いレベルに維持するべきである。サンプルの温度が、サンプルの外部の温度とほぼ同じになるように蒸発速度を遅くするような十分な時間、この条件を維持するのが好ましい。
【００４０】
保存サンプルが凍結したり発泡／沸騰して気泡を形成したりせず、溶媒を放出して粘性の液体または高い粘性を有する液体を形成するのが好ましい。
【００４１】
高い粘性を有する液体を形成させるための溶媒の除去
本発明の方法のそれに続く段階は、保存サンプルが乾燥して高い粘性を有する液体を形成するまで溶媒を除去することを含む。第２の乾燥段階では、サンプルは凍結も発泡して気泡を形成することもない。高い粘性を有する液体を、好ましくはKarl Fischerの電量湿度分析装置を用いる測定値で、15、12、10、より好ましくは8、5、4、3、2または1％(w/w)以下の溶媒含量を有する材料と定義する。高い粘性を有する液体は、活性薬剤が4℃で少なくとも3、6、9、12または24ヶ月間、安定状態で保存され、かつこの期間に渡って、活性薬剤がその活性および／または抗原性および／または免疫原性の少なくとも40、50、60、好ましくは70、80、90、95％を保持できるような十分に低い溶媒含量を有する。好ましくは、高い粘性を有する液体は固形のおよび／または明澄な外見を有するだけでなく、ガラスであり、2、4、または6日間、好ましくは2、3または4週間、より好ましくは2、4、6、8、10または12ヶ月間かけて非常にゆっくりと流動できる。極端にゆっくりとした流動を、高い粘性を有する液体を含む容器を倒置し、高い粘性を有する液体の流動が観察されるまで室温に静置することにより測定することができる。好ましい実施形態においては、高い粘性を有する液体は、倒置された状態で、2、4または6日後、好ましくは2、3または4週間後、より好ましくは2、4、6、8、10または12ヶ月後でも流動が認められないであろう。
【００４２】
本発明の一実施形態においては、これは、圧力および温度条件を、第１の蒸発乾燥段階において適用された条件で維持することにより達成される。例えば、0℃より高い温度、好ましくは5〜37℃、5〜10℃、10〜15℃、15〜20℃、20〜25℃、25〜30℃、または30〜37℃の温度で温度設定を維持しながら、30、25、20、好ましくは15、12、最も好ましくは10、8、7、6、5、4、3、2または1 mbar以下に圧力を維持する。15℃の温度設定については、5〜10 mbar、好ましくは6〜9 mBar、最も好ましくは約8 mbarの圧力を、4〜24時間、好ましくは1〜4、4〜8、8〜12または12〜16時間、維持する。これらの温度および圧力条件を、1、2、3、4、5、6、8、10、12、18時間以上維持して、好ましくはKarl Fischerの電量湿度分析装置により測定される15、12、好ましくは10、8、5、4、3、2または1％(w/w)以下の溶媒含量を有する高い粘性を有する液体を取得する。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、溶媒除去の際の温度設定を、その処理過程においてより早期に維持したものよりも高い温度設定に増加させる。これにより、本発明の方法をより短い時間で完了させられるようなより速い速度で溶媒がサンプルから除かれるようにする。例えば、圧力を30、25、20、好ましくは15、12、最も好ましくは10、8、7、6、5、4、3、2または1 mbar以下に維持しながら、温度設定を、0℃より高い温度に、より好ましくは20℃より高い温度に、好ましくは5〜37℃、5〜10℃、10〜20℃、20〜30℃、より好ましくは30〜40℃、より好ましくは40〜50℃、最も好ましくは50〜60℃に増加させる。これらの温度および圧力条件を、少なくとも1、2、3、4、5、6、8、10、12または18時間以上に渡って維持して、好ましくはKarl Fischerの電量湿度分析装置により測定される15、12、10、8、5、4、3、2または1％(w/w)以下の溶媒含量を有する固体を取得する。この実施形態は、活性薬剤が、成功裏に実行されるこの方法に用いられる温度で、熱安定性であることを必要とする。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態は、溶媒除去(工程c)における圧力設定を、本処理過程のより早期(工程b)において用いるよりも低い圧力設定まで下げる。これにより、より速い速度でサンプルから溶媒を除去することによって、本発明の方法をより短い時間で完了することができるようにする。また、それにより、失われる溶媒の割合をより高くすることもできる。例えば、0℃以上、好ましくは10〜20℃、20〜30℃、30〜35℃、または40℃以上に温度を維持しながら、圧力設定を、7、6、好ましくは5、4、3、より好ましくは2、1.5、1、最も好ましくは0.8、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、または0.005 mbar以下に設定する。これらの温度および圧力条件を、1、2、3、4、5、6、8、10、12または18時間以上に渡り維持して、好ましくはKarl Fischerの電量湿度分析装置(Eur. J. Pharm. Biopharm.(2000) 50; 277-284)により決定される15、12、好ましくは10、8、5、4、3、2または1％(w/w)以下の溶媒含量を有する固体を取得する。
【００４５】
好ましくは、工程b)およびc)(または工程b)のみ)を、18時間以下、好ましくは16、12、10時間、最も好ましくは8、6、5または4時間以下の時間で完了させるべきである。
【００４６】
活性薬剤
本発明の方法は、任意の活性薬剤を保存するのに有用であるが、他の保存方法において活性および／または抗原性および／または免疫原性を失う不安定な活性薬剤の場合に特に有用である。
【００４７】
本発明の方法を用いて保存しようとする活性薬剤は、細胞、細胞成分組成物、細菌、外膜ベシクル調製物およびウイルス、ウイルス成分またはウイルス様粒子からなる群より選択される生物学的システムを含んでもよい。また、分子、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ポリ核酸、オリゴヌクレオチド、多糖、オリゴ糖、多糖-タンパク質コンジュゲート、オリゴ糖-タンパク質コンジュゲートを含んでもよい。
【００４８】
本発明の方法を用いて保存することができる活性薬剤の例としては、限定されるものではないが、抗炎症剤、鎮痛剤、トランキライザー、抗不安剤、鎮痙剤、抗鬱剤、抗精神病剤、トランキライザー、抗不安剤、麻酔拮抗剤、抗パーキンソン病剤、コリン作動薬、化学療法剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤、食欲抑制剤、抗コリン剤、抗メトリクス剤(antimetrics)、抗ヒスタミン剤、抗片頭痛薬、冠血管拡張剤、脳血管拡張剤もしくは末梢血管拡張剤、ホルモン剤、避妊剤、抗血栓剤、利尿剤、抗高血圧剤、心血管薬、オピオイドなどの薬学的効果のある物質などの任意の生物活性物質が挙げられる。
【００４９】
好適な薬剤には、治療剤および予防剤も包含される。これらには、限定されるものではないが、任意の治療上有効な生物学的改変物質が包含される。そのような物質としては、限定されるものではないが、細胞成分組成物、細胞、細菌、外膜ベシクル調製物、ウイルス、ならびに、限定されるものではないが、脂質、有機物、タンパク質およびペプチド(合成および天然)、ペプチド模倣物質、ホルモン(ペプチド、ステロイドおよびコルチコステロイド)、DおよびLアミノ酸ポリマー、オリゴ糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびDNAおよびRNAなどの核酸、タンパク質核酸ハイブリッド、小分子および生理学的に活性なそれらの類似体などの分子が挙げられる。さらに、それらの改変物質は、天然の起源から得てもよいし、または組換えもしくは合成手段により作製してもよく、類似体、アゴニストおよび相同体を包含する。
【００５０】
本明細書で用いる「タンパク質」とは、ペプチドおよびポリペプチドも指す。そのようなタンパク質としては、限定されるものではないが、酵素、生物薬剤、成長ホルモン、増殖因子、インスリン、抗体、モノクローナルおよびポリクローナルならびにそのフラグメント、インターフェロン、インターロイキンならびにサイトカインが挙げられる。
【００５１】
本明細書に記載の方法により調製される治療用核酸に基づく薬剤も、本発明に包含される。本明細書で用いる「核酸」としては、限定されるものではないが、DNA、RNA、およびそれらの生理学的に活性な類似体などの当業界で公知の治療上有効な核酸が挙げられる。このヌクレオチドは遺伝子をコードしていてもよいし、限定されるものではないが、プラスミド、レトロウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどの組換えDNAの分野で公知の任意のベクターであってもよい。
【００５２】
さらに、予防活性を有する物質およびその担体の保存も本発明に包含される。好ましい組成物としては、ワクチンなどの免疫原が挙げられる。ワクチンは経口投与用のものであってもよいし、再構成後に注射するためのものであってもよい。好適なワクチンとしては、限定されるものではないが、生ワクチンおよび弱毒化ワクチン、抗原をコードするヌクレオチドベクター、生細菌および弱毒化細菌、タンパク質、多糖、オリゴ糖および／またはリポ多糖抗原、抗原＋アジュバントならびに抗原および／または担体に結合したハプテンが挙げられる。特に好ましいのは、ジフテリア、破傷風、百日咳、ボツリヌス、コレラ、デング熱、A、B、CおよびE型肝炎、b型インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae b)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、B群連鎖球菌、A群連鎖球菌、ヘルペスウイルス、ヘリコバクターピロリ(Helicobacterium pylori)、インフルエンザ、日本脳炎、A、B、C、Y、W型髄膜炎菌、麻疹、流行性耳下腺炎、パピローマウイルス、肺炎球菌、ポリオウイルス、不活化ポリオウイルス(IPV、好ましくはワクチン分野で標準的な1、2および3型を含むもの、最も好ましくはSalkポリオワクチン)、風疹、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、赤痢菌、結核、水痘帯状疱疹ウイルス、黄熱病およびそれらの組合せに対して有効なワクチンである。ワクチンの抗原成分を、病原体から誘導されたタンパク質の１部分または２以上の部分を含む組換えペプチドまたは融合タンパク質を製造するための分子生物学的技術により製造することもできる。例えば、抗原とコレラ毒素のBサブユニットを含む融合タンパク質は、該抗原に対する免疫応答を誘導することが示された(Sanchesら(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 481-485)。ワクチンは単回投与組成物中への組込みに特に好適である。これらは、周囲条件下で無期限に安定であり、接種直前に滅菌され
た希釈液に再溶解することができる。
【００５３】
好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、血清群A、C、W-135およびYの髄膜炎菌のうち1種以上から誘導された莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、肺炎球菌から誘導された莢膜多糖を含む。肺炎球菌莢膜多糖抗原は、好ましくは血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33F(最も好ましくは血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23F)から選択される。さらに好ましい実施形態は、b型インフルエンザ菌のPRP莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、黄色ブドウ球菌の5型、8型、336、またはPNAG莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、表皮ブドウ球菌のI型、II型、III型またはPIA莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、B群連鎖球菌のIa型、Ic型、II型またはIII型莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、A群連鎖球菌の莢膜多糖を含み、好ましくはさらに少なくとも1種のMタンパク質およびより好ましくは複数の型のMタンパク質を含む。
【００５４】
本発明の一実施形態においては、細菌性多糖は、全長の、精製された天然多糖である。本発明の代替的な実施形態においては、この多糖は、より扱いやすくするためより小さいサイズとなるように、2〜20倍、好ましくは2〜5倍、5〜10倍、10〜15倍または15〜20倍のサイズである。好ましい実施形態においては、オリゴ糖を用いる。典型的には、オリゴ糖は2〜20個の反復単位を含む。
【００５５】
多糖およびオリゴ糖は、コンジュゲート化しなくてもよいし、以下に記載のようにコンジュゲート化してもよい。
【００５６】
2種以上の上記活性薬剤の組合せを、本発明の保存方法を用いて保存することができる。ワクチンの一部または全部を、本発明の保存方法を用いて保存することができる。
【００５７】
本発明の方法を用いて保存しようとする好ましい活性薬剤は、IPV(ポリオウイルス株の不活化混合物)を含む。IPV、特に3型成分は、凍結乾燥または発泡乾燥およびそれに続く再構成の後に抗原を喪失することが示されるように、従来の凍結乾燥技術および発泡乾燥技術に対して壊れやすい。
【００５８】
IPVは、不活化されたポリオウイルス(好ましくはワクチン分野で標準的な1、2および3型を含み、最も好ましくはSalkポリオワクチンである)と定義される。IPVのワクチン用量は、20〜80、好ましくは40または80 D-抗原ユニットの1型(Mahoney)、4〜16、好ましくは8または16 D-抗原ユニットの2型(MEF-1)、および20〜64、好ましくは32または64 D-抗原ユニットの3型(Saukett)を含む。
【００５９】
本発明の方法により乾燥する場合、1、2、および3型のポリオウイルスのうち1、2、または3種全部の抗原性が保持されるのが好ましい。1型、2型、3型、1型および2型、1型および3型、2型および3型、または1型、2型および3型の抗原性が、乾燥工程に供していない参照サンプルの抗原性の少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％または98％のレベルで保持されるのがより好ましい。これを、1、2および／もしくは3型ポリオウイルスに対するポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体を用いるELISAによるなどの任意の好適な方法により、水性溶液中への高い粘性を有する液体の再構成後に測定することができる。
【００６０】
本発明の方法により乾燥する場合、1、2、および3型のポリオウイルスのうち1、2、または3種全ての免疫原性が保持されるのが好ましい。1型；2型；3型；1型および2型；1型および3型；2型および3型；または1型、2型および3型の免疫原性が、乾燥工程に供していない参照サンプルの免疫原性の少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％または98％のレベルで保持されるのがより好ましい。これを、任意の好適な方法により、水性溶液中への高い粘性を有する液体の再構成後に測定することができる。好ましい方法においては、高い粘性を有する液体を水性溶液中で再構成し、動物、好ましくはラットに接種する。好適な時間の後、接種された動物から抗血清を回収し、血清変換を試験する。好ましくは、未乾燥の参照サンプルと比較して、少なくとも0.4、0.5、0.6、0.7、0.8または0.9の相対効力を達成する。
【００６１】
好ましくは、IPVを、1種以上のHib(b型インフルエンザ菌)PRP多糖もしくはオリゴ糖ならびに／または髄膜炎菌のA、C、Wおよび／もしくはY型多糖もしくはオリゴ糖ならびに／または肺炎球菌の多糖もしくはオリゴ糖と組み合わせる。最も好ましくは、活性薬剤は、IPVおよびHib；IPVおよびMenC；IPV、HibおよびMenC；HibおよびMenC；IPVならびにMenAおよびC；HibならびにMenAおよびC；IPV、Hib、MenAおよびC；Hib、MenCおよびY；またはIPV、Hib、MenCおよびYを含む。
【００６２】
上記の詳述した活性薬剤は、以下に記載の1種以上の肺炎球菌莢膜多糖を含んでもよい。
【００６３】
多糖を用いる上記の組成物において、オリゴ糖を用いることもできる(以下に定義する)。
【００６４】
これらの組成物にアジュバント添加することはできるが(以下に記載)、これらには好ましくはアジュバント添加しないか、好ましくはアルミニウム塩を含有させない。
【００６５】
前記多糖またはオリゴ糖を、T-ヘルパーエピトープを含むペプチドまたは担体タンパク質とコンジュゲート化するのが好ましい(以下に記載)。
【００６６】
追加成分
本発明の方法により乾燥された好ましい組合せを、他の抗原と組み合わせて組合せワクチンとしてもよく、それは乾燥させてもよいし、好ましくはその乾燥成分を再構成するのに用いることができる液体製剤としてもよい。上記パラグラフに記載の活性薬剤と組み合わせるのに好ましい抗原としては、1種以上のジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、全細胞百日咳(Pw)、非細胞性百日咳(Pa)(以下に記載)、B型肝炎表面抗原、A型肝炎ウイルス、b型インフルエンザ菌多糖、髄膜炎菌多糖、髄膜炎菌血清型Bタンパク質、肺炎球菌多糖、肺炎球菌タンパク質または以下に列挙する抗原のいずれかが挙げられる。細菌性多糖を、以下に記載するように破傷風トキソイド、破傷風トキソイド断片C、ジフテリアトキソイド、CRM197、ニューモリシン、プロテインD(US6342224)などの担体タンパク質とコンジュゲート化することができる。
【００６７】
本発明の方法を用いて保存される活性薬剤を、髄膜炎菌、b型インフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌、A群連鎖球菌、B群連鎖球菌、黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌のうち1種以上から得られた莢膜多糖と共に製剤化することができる。好ましい実施形態においては、免疫原性組成物は血清群A、C、W-135およびYの髄膜炎菌のうち1種以上から得られた莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、肺炎連鎖球菌から誘導された莢膜多糖を含む。肺炎球菌の莢膜多糖抗原は、好ましくは血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33F(最も好ましくは血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23F)から選択される。さらに好ましい実施形態は、b型インフルエンザ菌のPRP莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、黄色ブドウ球菌の5型、8型、336またはPNAG莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、表皮ブドウ球菌のI型、II型、III型またはPIA莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、B群連鎖球菌のIa型、Ic型、II型またはIII型莢膜多糖を含む。さらに好ましい実施形態は、A群連鎖球菌の莢膜多糖を含み、好ましくはさらに少なくとも1種のMタンパク質およびより好ましくは複数の型のMタンパク質を含む。
【００６８】
本発明の一実施形態においては、細菌性多糖は全長の、精製された天然多糖である。本発明の代替的な実施形態においては、この多糖は、より扱いやすくするためより小さいサイズとなるように、2〜20倍、好ましくは2〜5倍、5〜10倍、10〜15倍または15〜20倍のサイズである。好ましい実施形態においては、オリゴ糖を用いる。典型的には、オリゴ糖は2〜20個の反復単位を含む。
【００６９】
そのような莢膜多糖は、コンジュゲートしなくてもよいし、破傷風トキソイド、破傷風トキソイド断片C、ジフテリアトキソイド、CRM197、ニューモリシン、プロテインD(US6342224)などの担体タンパク質とコンジュゲート化してもよい。破傷風毒素、ジフテリア毒素およびニューモリシンを、遺伝的突然変異および／または好ましくは化学的処理により解毒する。
【００７０】
多糖コンジュゲートを、当業界で公知の任意のカップリング技術により調製することができる。例えば、多糖を、チオエーテル結合を介してカップリングすることができる。このコンジュゲーション方法は、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP)を用いて前記多糖を活性化させて、シアン酸エステルを形成させることによるものである。かくして、活性化された多糖を、担体タンパク質上のアミノ基と、直接カップリングさせるか、またはスペーサー基を介してカップリングさせることができる。好ましくは、シアン酸エステルを、ヘキサンジアミンとカップリングさせ、アミノ誘導体化された多糖を、チオエーテル結合の形成を伴うヘテロ結合化学を用いて担体タンパク質とコンジュゲートさせる。そのようなコンジュゲートは、PCT公開WO93/15760(Uniformed Services University)に記載されている。
【００７１】
前記コンジュゲートを、US4365170 (Jennings)およびUS4673574 (Anderson)に記載の直接還元アミノ化法により調製することもできる。別の方法がEP-0-161-188、EP-208375およびEP-0-477508に記載されている。
【００７２】
さらなる方法は、カルボジイミド縮合(Chu C.ら、Infect. Immunity, 1983, 245-256)による、タンパク質担体への、アジピン酸ヒドラジド(ADH)を用いて誘導体化したシアノゲンブロミド活性化多糖のカップリングを含む。
【００７３】
好ましい肺炎球菌タンパク質抗原は、肺炎球菌の外膜上に露出された肺炎球菌タンパク質(肺炎球菌の生活環の少なくとも一部の間は宿主の免疫系により認識され得る)、または肺炎球菌により分泌もしくは放出されるタンパク質である。最も好ましくは、前記タンパク質は、毒素、アドヘシン、2成分シグナル伝達因子、もしくは肺炎連鎖球菌のリポタンパク質、またはそれらの断片である。特に好ましいタンパク質としては、限定されるものではないが、ニューモリシン(好ましくは、化学的処理もしくは突然変異により解毒される) [Mitchellら、Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18(13):4010 「1型および2型肺炎連鎖球菌由来ニューモリシンの遺伝子およびタンパク質の比較」、Mitchellら、Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67-72 「大腸菌におけるニューモリシン遺伝子の発現：迅速な精製および生物学的特性」、WO96/05859 (A. Cyanamid)、WO90/06951 (Patonら)、WO99/03884 (NAVA)]；PspAおよびその膜貫通欠失変異体 (US5804193-Brilesら)；PspCおよびその膜貫通欠失変異体 (WO97/09994-Brilesら)；PsaAおよびその膜貫通欠失変異体 (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64(12): 5255-62 「PsaAの配列異種性、肺炎連鎖球菌のビルレンスにとって必須である37キロダルトンの推定アドヘシン」；肺炎球菌コリン結合タンパク質およびその膜貫通欠失変異体 (WO97/41151；WO99/51266)；CbpAおよび膜貫通欠失変異体(WO 97/41151; WO99/51266)；グリセルアルデヒド-3-リン酸-デヒドロゲナーゼ(Infect. Immun. 1996, 64:3544)；HSP70 (WO96/40928)；PcpA (Sanchez-Beatoら、FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14)；M様タンパク質(EP0837130)ならびにアドヘシン18627(EP0834568)が挙げられる。さらに好ましい肺炎球菌タンパク質抗原は、WO98/18931に開示されたものであり、特に、WO98/18930およびPCT/US99/30390で選択されたものである。
【００７４】
本発明の免疫原性組成物と共に製剤化するのに好ましい髄膜炎菌タンパク質としては、TbpA (WO93/06861; EP586266; WO92/03467; US5912336)、TbpB (WO93/06861; EP586266)、Hsf (WO99/31132)、NspA (WO96/29412)、Hap (PCT/EP99/02766)、PorA、PorB、OMP85(D15としても知られる)(WO00/23595)、PilQ (PCT/EP99/03603)、PldA (PCT/EP99/06718)、FrpB (WO96/31618、配列番号38を参照)、FrpAもしくはFrpCまたはその両方の少なくとも30、50、100、500、750アミノ酸に共通する保存された部分(WO92/01460)、LbpAおよび／またはLbpB (PCT/EP98/05117; Schryversら、Med. Microbiol. 1999, 32:1117)、FhaB (WO98/02547)、HasR (PCT/EP99/05989)、lipo02 (PCT/EP99/08315)、MltA (WO99/57280)ならびにctrA (PCT/EP00/00135)が挙げられる。髄膜炎菌タンパク質を、外膜調製物の一部として、精製されたタンパク質として添加するのが好ましい。
【００７５】
前記ワクチンを、ジフテリア菌、破傷風菌および百日咳菌(Bordetella pertussis)感染のうち1つ以上に対する防御を提供する抗原と共に製剤化するのが好ましい。百日咳菌成分は、PT、FHAおよび69kDaパータクチンに由来する少なくとも1種の抗原(好ましくは、2種または3種全部)を含む死滅させた全細胞百日咳菌(Pw)または非細胞性百日咳菌(Pa)であってもよい。特定の他の非細胞性ワクチンもFim2およびFim3などの凝集原を含み、これらのワクチンも本発明における使用が意図される。典型的には、ジフテリア菌および破傷風菌に対する防御を提供する抗原は、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドである。これらのトキソイドは、化学的に不活化された毒素(例えば、ホルムアルデヒドにより処理したもの)または1個以上の点突然変異の導入により不活化された毒素である。
【００７６】
あるいは、本発明の高い粘性を有する液体を、一方の容器に入れた高い粘性を有する液体ガラスおよび他方の容器に入れた液体DTPaまたはDTPwを有するキットとして、提供することができる。そのようなキットは、例えば、乾燥された成分と液体成分とを、同じシリンジ中であるが異なるチャンバー中に含有させて有する２室シリンジを含んでもよい。乾燥された成分は、次いで、単一ワクチンとして注射する直前に、液体ワクチンと合わせて再構成する。かくして、例えば、本発明の高い粘性を有する液体組成物を、液体DTPaまたはDTPwワクチンと共に再構成し(好ましくは即席で)、単一ワクチンとして投与する。典型的には、DTPaまたはDTPwワクチンには、水酸化アルミニウムを、少なくとも部分的にアジュバント添加する(例えば、GlaxoSmithKline Biologicals s.a.のInfanrix(登録商標)およびTritanrix(登録商標)ワクチン)。
【００７７】
本ワクチンは、必要に応じて、不定型インフルエンザ菌、RSVに対して宿主を保護することができる1種以上の抗原、および／またはインフルエンザウイルスに対して宿主を保護することができる1種以上の抗原を含んでもよい。
【００７８】
好ましい不定型インフルエンザ菌タンパク質抗原としては、Fimbrinタンパク質 (US5766608)およびそれに由来するペプチドを含む融合タンパク質(例えば、LB1 Fusion) (US5843464-Ohio State Research Foundation)、OMP26、P6、プロテインD、TbpA、TbpB、Hia、Hmw1、Hmw2、Hap、およびD15が挙げられる。
【００７９】
好ましいインフルエンザウイルス抗原としては、卵もしくはMDCK細胞中で増殖させた全ウイルス、生ウイルスもしくは不活化ウイルス、分割インフルエンザウイルス、またはベロ細胞もしくは全インフルエンザ・ビロソーム(R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920により記載)、またはHA、NP、NA、もしくはMタンパク質、もしくはその組合せなどのその精製もしくは組換えタンパク質が挙げられる。
【００８０】
好ましいRSV(呼吸器合胞体ウイルス)抗原としては、F糖タンパク質、G糖タンパク質、HNタンパク質、Mタンパク質またはその誘導体が挙げられる。本発明の抗原性組成物は、単一種の細菌に由来する1種以上の莢膜多糖を含んでもよいことが理解されるべきである。抗原性組成物はまた、1種以上の種の細菌に由来する莢膜多糖を含んでもよい。
【００８１】
免疫原性組成物およびワクチン
本発明のさらなる態様は、本発明の高い粘性を有する液体と製薬上許容し得る賦形剤を含む免疫原性組成物またはワクチンを含む。
【００８２】
好ましくは、この免疫原性組成物またはワクチンは免疫原に対する免疫応答を増強するのに十分な量のアジュバントを含む。好適なアジュバントとしては、限定されるものではないが、アルミニウム塩、スクアレン混合物(SAF-1)、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリア細胞壁調製物、モノホスホリルリピドA、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Quil A、コレラ毒素Bサブユニット、ポルホスファゼン(polphosphazene)およびその誘導体、ならびにTakahashiら(1990)、Nature 344: 873-875により記載されたものなどの免疫賦活性複合体(ISCOM)が挙げられる。獣医学的使用、および動物における抗体産生についても、フロイントアジュバントのマイトジェン成分を用いることができる。
【００８３】
全ての免疫原性組成物またはワクチンに関して、前記免疫原の免疫学的に有効な量を、実験的に決定しなければならない。考慮すべき因子としては、免疫原性、免疫原をアジュバントもしくは担体タンパク質もしくは他の担体と複合体化させるか、または共有結合させるか否か、投与経路および投与すべき免疫投与量の値などが挙げられる。そのような因子はワクチン分野で公知であり、過度な実験を行うことなくそのような決定を行うことは十分に免疫学の当業者の技能の範囲内にある。
【００８４】
活性薬剤を、本発明の高い粘性を有する液体またはワクチン中、様々な濃度で存在させることができる。典型的には、前記物質の最低濃度は、その意図される用途を達成するのに必要な量であり、一方、最高濃度は、溶液で維持されるかまたは最初の混合物内で均質に懸濁される最大量である。例えば、治療剤の最小量は、治療上有効な単回用量を提供するものであるのが好ましい。生物活性を有する物質については、最低濃度は再構成に際して生物活性にとって必要な量であり、最大濃度は均質な懸濁を維持することができない時点のものである。単回投与単位の場合、その量は単回の治療用途のものである。一般的には、各用量は1〜100μg、好ましくは5〜50μg、最も好ましくは5〜25μgのタンパク質抗原を含むことが予想される。細菌性多糖の好ましい用量は、10〜20μg、10〜5μg、5〜2.5μgまたは2.5〜1μgである。前記物質の好ましい量は、物質間で様々であるが、当業者であれば容易に決定できる。
【００８５】
活性薬剤を含む高い粘性を有する液体
本発明の別の態様は、好ましくは本発明の方法を用いて取得可能であるか、または取得された活性薬剤を含む高い粘性を有する液体である。活性薬剤は、本発明の方法を用いる乾燥およびそれに続く再構成の後でもその活性および／または抗原性および／または免疫原性を維持するのが好ましい。活性薬剤の活性、抗原性もしくは免疫原性の少なくとも40、50、60、70、80、90、または95％が保持されるのが好ましい。これを、例えば、上記のような任意の好適な方法により決定することができる。
【００８６】
本発明の高い粘性を有する液体は、グルコース、マルツロース、イソ-マルツロース、ラクツロース、スクロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、イソ-マルトース、マルチトール、ラクチトール、パラチニット、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトースおよびデキストランからなる群より選択されるガラス形成ポリオールを含むのが好ましい。
【００８７】
本発明の高い粘性を有する液体は、上記の活性薬剤のうち任意のものを含んでよい。高い粘性を有する液体により保存された活性薬剤は、生物学的システム、例えば、細胞、細胞成分(subcellular)組成物、細菌、外膜ベシクル調製物およびウイルスを含んでもよい。あるいは、またはさらに、それは分子、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ポリ核酸、オリゴヌクレオチド、多糖、オリゴ糖、多糖-タンパク質コンジュゲート、オリゴ糖-タンパク質コンジュゲートを含んでもよい。また、それは上記活性薬剤の2種以上を含む組合せを含んでもよい。
【００８８】
好ましい実施形態は、好ましくは本発明の方法により取得されたか、または取得可能である高い粘性を有する液体であって、活性薬剤がワクチンもしくはワクチン成分であるか、またはこれらを含むその液体を包含する。ワクチンの好ましい成分は上述されており、IPV、より好ましくはIPVと細菌性多糖、好ましくはb型インフルエンザ菌ならびにA、C、WおよびY型髄膜炎菌に由来する多糖またはオリゴ糖を含む。
【００８９】
好ましいワクチン成分としては、IPV(ポリオウイルス株の不活化混合物)が挙げられる。IPVを、Hib PRP多糖ならびに／またはA、C、Wおよび／もしくはY型髄膜炎菌多糖および／または肺炎球菌多糖(上記)のうち1つ以上と組み合わせることが好ましく、より好ましくはIPVおよびHib；IPVおよびMenC；IPV、HibおよびMenC；HibおよびMenC；IPVおよびMenAおよびC；HibおよびMenAおよびC；IPV、Hib、MenAおよびC；Hib、MenCおよびY；またはIPV、Hib、MenCおよびYである。
【００９０】
多糖を用いる上記組成物においては、オリゴ糖を用いることもできる(上記で定義する通り)。
【００９１】
これらの組成物をアジュバント化できるが(上記のとおり)、これらをアジュバント化しないか、またはアルミニウム塩を含まないようにするのが好ましい。
【００９２】
前記多糖またはオリゴ糖を、T-ヘルパーエピトープを含むペプチドまたは担体タンパク質とコンジュゲートするのが好ましい(上記のとおり)。
【００９３】
本発明の高い粘性を有する液体は、必要に応じて乾燥されているかまたは好ましくは乾燥された成分を再構成するのに用いることができる液体製剤である他の抗原と組み合わせて、組合せワクチンとするのが好ましい。本発明の容器の内容物と組み合わせるのに好ましい抗原としては、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、全細胞百日咳(Pw)、非細胞性百日咳(Pa)(上記のとおり)、B型肝炎表面抗原、肺炎球菌多糖、肺炎球菌タンパク質、髄膜炎菌多糖、髄膜炎菌タンパク質のうちの1種以上が挙げられる。細菌性多糖を、上記のような破傷風トキソイド、破傷風トキソイド断片C、ジフテリアトキソイド、CRM197、ニューモリシン、プロテインD(US6342224)などの担体タンパク質とコンジュゲートしてもよい。
【００９４】
本発明のさらなる態様は、高い粘性を有する液体を水性溶液中で再構成する工程を含むワクチンの製造方法である。好ましい実施形態においては、前記水性溶液はジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび百日咳(非細胞性または全細胞性)抗原を含み、必要に応じて、さらにB型肝炎表面抗原を含む。DTPワクチンに、必要に応じてアルミニウム塩、好ましくは水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムを加えて少なくとも部分的にアジュバント化する。
【００９５】
本発明の別の実施形態は、第1の容器に保持された本発明の高い粘性を有する液体と、第2の容器中の液体DTP(非細胞性または全細胞性)を含むワクチンとを含むキットである。上記のような２室シリンジを用いることができる。
【００９６】
本特許出願明細書内で引用された全ての参考文献または特許出願は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例は、別途詳細に記載する点以外は、当業者には周知であり日常的である標準的な技術を用いて行う。実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
【００９８】
実施例1. 凍結条件の確立
サンプルを、水にスクロースを溶解させて1％、5％、10％および20％溶液を得ることにより作製した。保存温度を1℃以内で調節することができ、コンデンサーの最終温度が-85℃であり、圧力をブリード弁により調節し、6個の熱電対を利用して生成物の温度を測定することができる、Heto Drywinner 8-85凍結乾燥装置中にサンプルを入れた。保存温度の設定を、処理過程を通じて15℃に維持した。圧力を、最初は200 mbarに低下させ、このレベルで10分間維持した後、圧力をさらに50 mbar、5 mbar、2.5 mbar、0.75 mbar、0.4 mbarおよび0.2 mbarに低下させた。各圧力レベルを20分間維持して、温度を平衡化させ、サンプルの温度を、熱電対を用いて読み取った。熱電対を、異なるスクロース濃度のサンプルに付着させた。表1に記録された温度はその温度の平均値である。
【００９９】
結果
全てのサンプルは、存在するスクロースの濃度にかかわらず、1.66〜1.11 mbarで凍結した。様々な圧力において測定された温度は、3点曲線から予測されるものと非常に近かった。従って、スクロースの存在は、様々な圧力でのサンプルの温度に対して大きな効果は示さない。
【０１００】
サンプルの凍結を回避するためには、15℃の保存温度について、圧力を2 mbarより高く維持するべきである。より低い温度では、圧力をより高いレベルに維持するべきであり、一方、より高い温度を使用すれば、サンプルが凍結することなく圧力をさらに低下させることができる。
【表１】
【０１０１】
実施例2. 凍結も気泡形成もさせることなく乾燥する方法
5％、10％、15％および25％のスクロースを含む保存サンプルを作製し、バイアルに添加した。サンプルを、処理過程を通じて15℃の温度設定で凍結乾燥装置に入れた。圧力を、最初は200 mBarに低下させてこのレベルで10分間維持し、脱気した後、圧力をさらに低下させた。圧力を2〜3時間に渡ってさらに8 mbarに低下させ、その間、サンプルの内側の熱電対は、サンプルの温度が蒸発冷却によって4℃に低下したことを示していた。2〜3時間後、サンプルの温度は15℃に戻ったが、これは、これらの温度および圧力条件下での蒸発がほぼ完了したことを示している。サンプル内の活性薬剤ができる限りストレスに曝されないようにするため、本処理過程のこの段階において、サンプルを沸騰させて気泡を形成させたり凍結させたりはしなかった。サンプルは粘性の液体の外観を有する。
【０１０２】
サンプルのさらなる乾燥を、保存温度の設定を15℃に保持しながら圧力をさらに0.1 mbarに低下させることにより、達成した。これらの条件をさらに10〜16時間維持した。この段階の間、蒸発速度が遅かったため、サンプル温度は15℃を保持した。さらなる乾燥が起こり、得られたサンプルは固体の外見を示した。サンプルを横倒しで置いた場合、サンプルの内容物は、数日間かけて、非常にゆっくりと流動し、サンプルが高い粘性を有する液体ガラスであることを示した。図1は、高い粘性を有する液体の外見を示す。
【０１０３】
実施例3. 凍結も気泡形成もさせることなく乾燥した後のIPV免疫原性の保持
そのようなサンプルは、気泡形成を伴う発泡または凍結と関連したストレスに供しなかった。この方法が、IPVを乾燥するのに用いられた場合に高いレベルで抗原保持をもたらすかどうかを判定するために、実験を行った。
【０１０４】
安定化剤として10％スクロースまたは10％トレハロースを含む水性溶液中にIPVを再懸濁する3つの別々の実験を行った。サンプルをシリコーン処理したバイアルに入れ、これをHeto Drywinner 8-85凍結乾燥装置に入れて温度を15℃に設定した。圧力を、最初は35 ミリバール(mBar)に低下させて、サンプルを脱気した。10分後、圧力をさらに8 mBarに低下させ、このレベルで2時間保持した。この期間中、温度設定を15℃に保持し、サンプル内の温度をモニターした。水がサンプルから蒸発するにつれて温度は4℃まで低下したが、蒸発速度が遅いため、2時間の終わりに向けて、温度は15℃に戻った。これらの条件下では、発泡も気泡形成も起こらなかった。次いで、圧力をさらに0.1 mbarに低下させ、これらの条件を、最初の2つの実験については、さらに16時間以上に渡って維持し、3つめの実験については10時間以上に渡って維持した。
【０１０５】
サンプルを水中で再構成させ、ELISAを用いて、3種のポリオウイルス株の抗原性の保持を評価した。3型IPVに対するモノクローナル抗体をELISAにおいて用いて、凍結させなかった参照サンプルと比較して、再構成された凍結乾燥サンプルにおける抗原保持の程度を評価した。結果を、乾燥手順を行わなかったサンプルについて得られた読み取り値の％として示す。
【０１０６】
結果
乾燥されたサンプルは固体の外見を示していたが、容器を倒置した場合に、乾燥されたサンプルは数日間をかけて流動することができたので、それらは高い粘性を有する液体／ガラスの形態であると考えられた。
【表２】
【０１０７】
3型IPV抗原保持のこれらのレベルは、同じELISA方式で3型に対するモノクローナル抗体を用いる場合に通常は非常に低い値が認められる以下に示した凍結乾燥の結果よりも、はるかに優れている。
【表３】
【０１０８】
実施例4. 高い粘性を有する液体／ガラスとして保存される乾燥されたIPVの長期保存安定性
実施例3に記載の方法を用いて乾燥されたサンプルを、4℃にて9ヶ月間保存した。サンプルを150 mM NaClを含む水中で再構成し、ELISAを用いて、3種のポリオウイルス株の抗原性の保持を評価した。各株に対して１つずつの、3種のモノクローナル抗体を別々のELISAにおいて用いて、再構成された保存サンプルにおける抗原保持の程度を評価した。保存前の同じバッチに由来する再構成サンプルについて、同様のELISAを行った。全ての結果を、乾燥していない参照サンプルと比較した。結果を、乾燥手順を行っていないサンプルについて得られた読み取り値の％として示す。
【０１０９】
結果
【表４】
【０１１０】
従って、実施例3に記載の方法により乾燥されたIPVは、抗原性を喪失せずに4℃で少なくとも9ヶ月間保存される。
【０１１１】
実施例5. 乾燥して高い粘性を有する液体を形成し再構成した後のIPVと、乾燥されていないIPVのin vivoにおける免疫原性の比較
10匹のWistarラットの群に、実施例2に開示された方法を用いて、10％スクロースの存在下で乾燥して高い粘性を有する液体を形成させ、再構成させたIPVを、種々の希釈度で接種した。10匹のWistarラットのさらなる群に、同じ方法で調製したが乾燥していないIPVの参照サンプルを接種した。
【０１１２】
21日後、全てのラットから血清を取得し、1型、2型および3型ポリオウイルスを用いる別々の免疫沈降アッセイにおいてその血清を試験した。
【０１１３】
結果を、a) 各IPV希釈物に対する応答ラット数、b) 免疫沈降アッセイにより評価した、50％のラットの血清転換を確保するのに必要な用量であるED50、およびc) 乾燥していない参照IPVと比較した、乾燥して再構成したIPVの相対効力、を含む表5に示す。
【表５】
【０１１４】
JLEO17/05は、乾燥されて高い粘性を有する液体を形成し続いて再構成されたIPVバッチである。JLE097は乾燥していない参照である。
【０１１５】
表5は、IPVの各希釈物を接種した反応個体数が、乾燥され再構成されたIPVの2つのバッチと乾燥していない参照サンプルとの間でよく似ていることを示す。全体的には、1型IPVが最良の免疫応答を引き出し、2型がわずかに少ないラットにおいて免疫応答を引き出した。3型は最も弱い免疫応答を引き出した。
【０１１６】
乾燥させて高い粘性を有する液体を形成させる工程は、in vivoで免疫沈降抗体を惹起するIPVの能力を損なわない。1.0の相対効力(RP)読み取り値は、サンプルが参照サンプルと同等の応答を惹起することを示している。乾燥されたサンプルは共に、3つ全ての型のポリオウイルスについて1.0に近いRP読み取り値をもたらすが、これは本乾燥工程が、免疫応答を惹起するサンプルの能力に影響を及ぼさないことを示している。
【０１１７】
実施例6. 安定化剤としてスクロースまたはトレハロースを用いて高い粘性を有する液体を形成するように乾燥させることの、in vivoにおける免疫沈降性免疫応答を惹起するIPVの能力に対する影響
10匹のWistarラットの群に、実施例2に記載のように10％スクロースまたは10％トレハロースの存在下で乾燥させた後で再構成させたIPVを、接種した。さらに10匹のWistarラットの群に、参照サンプルとして、乾燥していない等量のIPVを接種した。
【０１１８】
21日後、全てのラットから血清を回収し、実施例5に記載のように免疫中和アッセイを用いて、1型、2型および3型ポリオウイルスの各々に対して生じた免疫中和抗体の量を評価した。
【０１１９】
その免疫応答を、乾燥していない参照サンプルにより惹起された免疫応答と比較することにより、各サンプルについて相対効力を算出した。
【０１２０】
結果を表6に示す。
【表６】
【０１２１】
サンプル中に残存する水の量は、Karl Fischerの電量湿度分析装置により測定したところ、スクロースを安定化剤として用いた場合は約5％の残存湿度であり、安定化剤としてトレハロースを用いた場合の約10％と比較して低かった。
【０１２２】
スクロースおよびトレハロースは共に、再構成されたIPVが異なる型のポリオウイルスの大部分について1.0に達する相対効力読み取り値を与えたように、乾燥工程においてIPVを安定化させるのに有効であった。この相対効力は、比較的容易にその免疫原性を喪失する3型ポリオウイルスについて特に良好であった。
【０１２３】
実施例7. Karl Fischerによる湿度の測定
分析はKarl Fischerの滴定測定装置(Aqua 30.00 - Elektrochemie Halle)で行った。サンプルの質量を測り、80℃に設定したオーブンに入れた。サンプルは、窒素ガスでフラッシュした後、ヒドラナル試薬(Riedel de Hahn)に添加して、電量分析により分析を行った。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】倒置したバイアル中の高い粘性を有する液体の写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
a) 安定化剤の溶液中に活性薬剤を溶解／懸濁することにより、保存サンプルを調製する工程、および
b) 該保存サンプルを、該保存サンプルが凍結することまたは発泡して気泡を形成することなく蒸発により溶媒を放出するような温度および圧力条件に供して、粘性の液体を形成させる工程、
を含む、活性薬剤の保存方法。
【請求項２】
c) さらに、前記粘性の液体が乾燥して高い粘性を有する液体を形成するような温度および圧力条件に、前記保存サンプルを供する工程、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程b)において、圧力を20 mbar以下に低下させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程b)の間、保存サンプルに対して外部の温度が5〜37℃である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程c)の間、保存サンプルに対して外部の温度が5〜37℃である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程c)の間、保存サンプルに対して外部の温度が、工程b)における該温度よりも高い、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程c)の間の、保存サンプルに対する外部の温度を、20℃を上回る温度に上昇させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程c)における圧力を、工程b)における圧力と比較して低下させる、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程c)の間の圧力を、1 mbar以下に低下させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程b)を4時間以内に完了させる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程b)およびc)を、12時間以内に完了させる、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
安定化剤が、グルコース、マルツロース、イソ-マルツロース、ラクツロース、スクロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、イソ-マルトース、マルチトール、ラクチトール、パラチニット、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトースおよびデキストランからなる群より選択されるガラス形成ポリオールを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
安定化剤がスクロースである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
安定化剤の濃度が15％未満である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
保存サンプルがフェノールレッドを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
保存サンプルを、溶媒をはじく内部表面を有する容器中で乾燥させる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
活性薬剤が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、多糖、オリゴ糖、多糖-タンパク質コンジュゲートおよびオリゴ糖-タンパク質コンジュゲートからなる群より選択される分子を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
活性薬剤が、細胞、細胞成分組成物、細菌、ウイルス、ウイルス成分およびウイルス様粒子からなる群より選択される生物学的システムを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
活性薬剤がIPV(不活化ポリオウイルス)を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
活性薬剤がHib(b型インフルエンザ菌)多糖またはオリゴ糖を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
活性薬剤がC型髄膜炎菌多糖またはオリゴ糖を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
活性薬剤がワクチンを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
抗原性または活性が保存されている活性薬剤を含む、高い粘性を有する液体。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法により取得可能な請求項２３に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項２５】
グルコース、マルツロース、イソ-マルツロース、ラクツロース、スクロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、イソ-マルトース、マルチトール、ラクチトール、パラチニット、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトースおよびデキストランからなる群より選択されるガラス形成ポリオールを含む、請求項２３または２４に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項２６】
ガラス形成ポリオールがスクロースである、請求項２５に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項２７】
活性薬剤がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、多糖、オリゴ糖、多糖-タンパク質コンジュゲートおよびオリゴ糖-タンパク質コンジュゲートからなる群より選択される分子を含む、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項２８】
活性薬剤が細胞、細胞成分組成物、細菌、ウイルス、ウイルス成分およびウイルス様粒子からなる群より選択される生物学的システムを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項２９】
活性薬剤がワクチンを含む、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項３０】
活性薬剤がIPVを含む、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項３１】
活性薬剤が細菌性多糖またはオリゴ糖を含む、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項３２】
活性薬剤が、好ましくは担体タンパク質にコンジュゲート化された、Hib(b型インフルエンザ菌)多糖またはオリゴ糖を含む、請求項３１に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項３３】
活性薬剤が、好ましくは担体タンパク質にコンジュゲート化された、血清群C髄膜炎菌多糖またはオリゴ糖を含む、請求項２３〜３２のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項３４】
溶媒をはじく内部表面を有する容器内に保持された請求項２３〜３３のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項３５】
請求項２３または２４に記載の高い粘性を有する液体と、製薬上許容し得る賦形剤とを含む、免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３６】
水性溶液中に請求項２３〜３５のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体を再構成する工程を含む、ワクチンの製造方法。
【請求項３７】
前記水性溶液が、ジフテリア抗原、破傷風抗原および百日咳抗原(非細胞性または全細胞性)を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
DTPワクチンが、水酸化アルミニウムを用いて少なくとも部分的にアジュバント添加されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
第1の容器中に保持された請求項２３〜３４のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体と、第2の容器中の液体ワクチン成分とを含むキット。
【請求項１】
下記工程：
a) 安定化剤の溶液中に活性薬剤を溶解／懸濁することにより、保存サンプルを調製する工程、および
b) 該保存サンプルを、該保存サンプルが凍結することまたは発泡して気泡を形成することなく蒸発により溶媒を放出するような温度および圧力条件に供して、粘性の液体を形成させる工程、
を含む、活性薬剤の保存方法。
【請求項２】
c) さらに、前記粘性の液体が乾燥して高い粘性を有する液体を形成するような温度および圧力条件に、前記保存サンプルを供する工程、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程b)において、圧力を20 mbar以下に低下させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程b)の間、保存サンプルに対して外部の温度が5〜37℃である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程c)の間、保存サンプルに対して外部の温度が5〜37℃である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程c)の間、保存サンプルに対して外部の温度が、工程b)における該温度よりも高い、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程c)の間の、保存サンプルに対する外部の温度を、20℃を上回る温度に上昇させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程c)における圧力を、工程b)における圧力と比較して低下させる、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程c)の間の圧力を、1 mbar以下に低下させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程b)を4時間以内に完了させる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程b)およびc)を、12時間以内に完了させる、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
安定化剤が、グルコース、マルツロース、イソ-マルツロース、ラクツロース、スクロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、イソ-マルトース、マルチトール、ラクチトール、パラチニット、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトースおよびデキストランからなる群より選択されるガラス形成ポリオールを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
安定化剤がスクロースである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
安定化剤の濃度が15％未満である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
保存サンプルがフェノールレッドを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
保存サンプルを、溶媒をはじく内部表面を有する容器中で乾燥させる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
活性薬剤が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、多糖、オリゴ糖、多糖-タンパク質コンジュゲートおよびオリゴ糖-タンパク質コンジュゲートからなる群より選択される分子を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
活性薬剤が、細胞、細胞成分組成物、細菌、ウイルス、ウイルス成分およびウイルス様粒子からなる群より選択される生物学的システムを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
活性薬剤がIPV(不活化ポリオウイルス)を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
活性薬剤がHib(b型インフルエンザ菌)多糖またはオリゴ糖を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
活性薬剤がC型髄膜炎菌多糖またはオリゴ糖を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
活性薬剤がワクチンを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
抗原性または活性が保存されている活性薬剤を含む、高い粘性を有する液体。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法により取得可能な請求項２３に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項２５】
グルコース、マルツロース、イソ-マルツロース、ラクツロース、スクロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、イソ-マルトース、マルチトール、ラクチトール、パラチニット、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトースおよびデキストランからなる群より選択されるガラス形成ポリオールを含む、請求項２３または２４に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項２６】
ガラス形成ポリオールがスクロースである、請求項２５に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項２７】
活性薬剤がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、多糖、オリゴ糖、多糖-タンパク質コンジュゲートおよびオリゴ糖-タンパク質コンジュゲートからなる群より選択される分子を含む、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項２８】
活性薬剤が細胞、細胞成分組成物、細菌、ウイルス、ウイルス成分およびウイルス様粒子からなる群より選択される生物学的システムを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項２９】
活性薬剤がワクチンを含む、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項３０】
活性薬剤がIPVを含む、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項３１】
活性薬剤が細菌性多糖またはオリゴ糖を含む、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項３２】
活性薬剤が、好ましくは担体タンパク質にコンジュゲート化された、Hib(b型インフルエンザ菌)多糖またはオリゴ糖を含む、請求項３１に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項３３】
活性薬剤が、好ましくは担体タンパク質にコンジュゲート化された、血清群C髄膜炎菌多糖またはオリゴ糖を含む、請求項２３〜３２のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項３４】
溶媒をはじく内部表面を有する容器内に保持された請求項２３〜３３のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体。
【請求項３５】
請求項２３または２４に記載の高い粘性を有する液体と、製薬上許容し得る賦形剤とを含む、免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３６】
水性溶液中に請求項２３〜３５のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体を再構成する工程を含む、ワクチンの製造方法。
【請求項３７】
前記水性溶液が、ジフテリア抗原、破傷風抗原および百日咳抗原(非細胞性または全細胞性)を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
DTPワクチンが、水酸化アルミニウムを用いて少なくとも部分的にアジュバント添加されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
第1の容器中に保持された請求項２３〜３４のいずれか１項に記載の高い粘性を有する液体と、第2の容器中の液体ワクチン成分とを含むキット。
【図１】
【公表番号】特表２００６−５０４８０１（Ｐ２００６−５０４８０１Ａ）
【公表日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０１８１９（Ｐ２００５−５０１８１９）
【出願日】平成１５年１０月３０日（２００３．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１２１９１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３９４１７
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【出願人】（３９７０６２７００）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (37)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月３０日（２００３．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１２１９１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３９４１７
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【出願人】（３９７０６２７００）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (37)
【Ｆターム（参考）】
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