本発明は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物学的活性を阻害する第一薬剤；およびＥＧＦ受容体の生物学的活性を阻害する第二薬剤を含み、成分（Ａ）および成分（Ｂ）の各々が、薬学的に許容できるアジュバント、希釈剤、または担体との混合により処方されている併用製品を提供する。好ましい実施態様において、この（これらの）薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体の転写、翻訳、および／または結合特性を変更する。好ましくは、この（これらの）薬剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体に対する結合親和性を有する化合物からなる群より選択される。本発明はさらに、患者における癌細胞の増殖および／または転移の阻害方法、ならびに癌の処置において使用するための医薬組成物を提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の処置に使用するための薬学的に活性な薬剤の新規の組み合わせに関する。特に、本発明は、乳癌細胞の増殖及び／または転移を阻害することのできる併用療法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
導入
抗細菌タンパク質は先天性免疫系における重要なエフェクターである。ヒトカセリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）抗細菌タンパク質ｈＣＡＰ１８は、ヒトにおいて唯一知られているカセリシジンであり、保存されたカセリン（ｃａｔｈｅｌｉｎ）ドメインおよびＬＬ−３７と呼ばれる可変Ｃ末端からなる（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １２３８：３２５−３２；Ｚａｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３７４：１−５）。広範な抗細菌活性（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：７０８５−９；Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１９５−９９）および宿主細胞に対する効果、そのうちのいくつかはＧタンパク質共役受容体ホルミルペプチド受容体様１（ＦＰＲＬ１）により媒介される（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０６９−７４；Ｋｏｃｚｕｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１１：１６６５−７２）、を有するＬＬ−３７ペプチドは、ホロタンパクの細胞外タンパク分解プロセシングにより放出される。ｈＣＡＰ１８は、白血球に存在し（Ｃｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３６８：１７３−７６）、皮膚およびその他の上皮において発現され、炎症（Ｃｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３６８：１７３−７６；Ｆｒｏｈｍ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：１５２５８−６３）および損傷（Ｄｏｒｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１７：９１−９７；Ｈｅｉｌｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２０：３７９−８９）の際にアップレギュレートされるのであるが、これは先天性バリア保護における役割と言えよう。最近、カセリシジンを含む抗細菌タンパク質が、腫瘍に対する非特異的宿主防御における役割も果たすことが提唱された（Ｗｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２４２：６０８−１２；Ｏｈｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １８１：３９３−４０３）。
【０００３】
受容体型チロシンキナーゼの上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーは、４つの受容体ＥＧＦ−Ｒ（ＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２（Ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４からなる。ＥＧＦ−Ｒファミリーのメンバーは、細胞質チロシンキナーゼドメイン、一回膜貫通ドメイン、ならびにリガンド結合および受容体の二量体化に関与する細胞外ドメインを含む。ＥＧＦ−Ｒが活性化されると、様々な細胞経路が開始される。
【０００４】
有害な環境刺激、例えば紫外線照射またはＥＧＦによる受容体の占拠を受けると、ＥＧＦ−Ｒは他のファミリーメンバーとホモまたはヘテロ二量体を形成する。各々の二量体型受容体複合体は、様々なＳｒｃホモロジー２（ＳＨ２）含有エフェクタータンパク質を動員することによって別個のシグナル伝達経路を開始する。二量体化は、細胞増殖またはアポトーシス等の細胞反応をもたらす事象における下流のカスケードを開始させる自己リン酸化を引き起こす。
【０００５】
活性化型ＥＧＦ−Ｒ二量体は、グアニンヌクレオチド放出因子ＳＯＳに結合したアダプタータンパク質Ｇｒｂと複合体化する。Ｇｒｂ−ＳＯＳ複合体は、この受容体のホスホチロシン部位に直接的にまたはＳｈｃを通じて間接的に結合することができる。これらのタンパク質の相互作用によりＳＯＳがＲａｓに接近し、それによってＲａｓを活性化する。これは、その後、ＥＲＫおよびＪＮＫシグナル伝達経路を活性化し、これにより、遺伝子発現を促進し細胞増殖に寄与する転写因子、例えばｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１、およびＥｌｋ−１が活性化される。
【０００６】
遺伝子の増幅による過剰なＥＧＲＦ受容体分子は細胞分裂の増加を招き、癌性細胞の形成に関与する場合がある。例えば、ＥｒｂＢ２の過剰発現は乳癌の約２５％において見出されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明の第一の局面においては：
（Ａ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物学的活性を阻害する第一薬剤；および
（Ｂ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体の生物学的活性を阻害する第二薬剤
を含み、成分（Ａ）および成分（Ｂ）の各々が、薬学的に許容できるアジュバント、希釈剤、または担体との混合により処方されている、併用製品を提供する。
【０００８】
「薬剤」には、すべての化学物質、例えばオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、および小分子化合物が含まれる。
【０００９】
好ましい実施態様において、本発明の併用製品は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物学的活性を阻害する第一薬剤、ＥＧＦ受容体の生物学的活性を阻害する第二薬剤、および薬学的に許容できるアジュバント、希釈剤、または担体を含む医薬製剤を含む。
【００１０】
別の実施態様において、本発明の併用製品は、以下の成分：
（Ａ）薬学的に許容できるアジュバント、希釈剤、または担体と混合された、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の活性を阻害する第一薬剤を含む医薬製剤；および
（Ｂ）薬学的に許容できるアジュバント、希釈剤、または担体と混合された、ＥＧＦ受容体の活性を阻害する第二薬剤を含む医薬製剤
を含み、成分（Ａ）および（Ｂ）が各々、他と組み合わせて投与するのに適した形態で提供されるキット・オブ・パーツ（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）を含む。
【００１１】
二つの成分を互いに他と「関連づける（ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ）」には、そのキット・オブ・パーツの成分（Ａ）および成分（Ｂ）が：
（ｉ）後に併用療法において相互に組み合わせて使用するためにまとめられる別個の製剤（すなわち、互いから独立した製剤）として提供されること；または
（ｉｉ）併用療法において相互に組み合わせて使用されるよう、「組み合わせパック」における別個の成分としてパッケージされひとまとまりで提供されること、
が含まれ得る。
【００１２】
従って、本発明に係る併用製品に関しては、用語「組み合わせて投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ）」には、併用製品の二つの成分（ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の活性を阻害する第一薬剤およびＥＧＦ受容体の活性を阻害する第二薬剤）を、関連する状態の処置過程において患者にとって有益な効果が、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の活性を阻害する第一薬剤を含む製剤またはＥＧＦ受容体の活性を阻害する第二薬剤を含む製剤のいずれかを同じ処置過程において他方の成分の非存在下で単独で投与（場合により反復的に）した場合よりも大きくなるよう、一緒にまたは十分短い時間内に投与（場合により反復的に）することが含まれる。その組み合わせが特定の状態に関しておよびその特定の状態の処置過程においてより大きな有益な効果を提供するかどうかの決定は、処置または予防すべき状態に依存するであろうが、これらは当業者により日常的になされていることであろう。
【００１３】
好ましくは、阻害されるＥＧＦ受容体は、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦ−Ｒ）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４から選択される少なくとも一つである。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様において、第一薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の転写、翻訳、切断、および／もしくは結合特性を変更することによってｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物学的活性を阻害し、ならびに／または第二薬剤は、ＥＧＦ受容体の転写、翻訳、および／もしくは結合特性を変更することによってＥＧＦ受容体の生物学的活性を阻害する。
【００１５】
このような薬剤は、当該分野で周知の方法を用いて、例えば：
（ａ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７またはＥＧＦ受容体ｍＲＮＡの発現レベルに対する試験薬剤の効果を、例えばノーザンブロッティングまたは定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定することによって；
（ｂ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７またはＥＧＦ受容体タンパク質のレベルに対する試験薬剤の効果を、例えば抗ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７抗体または抗ＥＧＦ受容体抗体を用いる免疫アッセイによって測定することによって；および
（ｃ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７またはＥＧＦ受容体活性の機能的マーカー、例えばＥｒｂＢ２のリン酸化に対する試験薬剤の効果を測定することによって、
同定され得る。
【００１６】
好ましい実施態様において、第一薬剤はｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の転写の阻害剤であり、および／または第二薬剤はＥＧＦ受容体の転写の阻害剤である。
【００１７】
別の実施態様において、第一薬剤はｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の翻訳の阻害剤であり、および／または第二薬剤はＥＧＦ受容体の翻訳の阻害剤である。
【００１８】
さらに別の実施態様において、第一薬剤はｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の結合特性の阻害剤であり、および／または第二薬剤はＥＧＦ受容体の結合特性の阻害剤である。例えば、この（これらの）薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の立体配座をその受容体に結合できないよう変更するものであり得る。
【００１９】
さらに別の実施態様において、第一薬剤はｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体アンタゴニストであり、および／または第二薬剤はＥＧＦ受容体アンタゴニストである。この（これらの）薬剤が受容体機能を直接的にブロックすることによって、すなわち受容体アンタゴニストとして作用することによって、または間接的にブロックすることによってその生物学的活性を阻害することが、当業者に理解されているであろう。
【００２０】
一つの実施態様において、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体はＦＲＰファミリーの受容体である。
【００２１】
好ましい実施態様において、第一薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物学的活性を阻害することができ、および／または第二薬剤は、ＥＧＦ受容体の生物学的活性を阻害することができる。例えば、第一薬剤は、カセリシジンタンパク分解プロセスの阻害剤、例えばプロテアーゼ阻害剤（例えばプロテイナーゼ３）であり得る。
【００２２】
さらに好ましい実施態様において、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体の生物学的活性は、癌細胞において選択的に阻害される。
【００２３】
「選択的」は、その薬剤が、癌細胞中の他のタンパク質の活性を調節するよりも大きくｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体の生物学的活性を阻害することを意味する。好ましくは、その薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体の生物学的活性のみを阻害するものであるが、癌細胞中の他のタンパク質の発現および活性がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体の選択的阻害の下流での結果として変化し得ることが理解されよう。このように、本発明者らは、遺伝子発現および／または癌細胞成長に対する非特異的効果を有する薬剤を排除する。
【００２４】
本発明の薬剤によるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体の生物学的活性の阻害は全体的なものまたは部分的なものであり得ることが当業者に理解されよう。例えば、薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物学的活性を、その薬剤に被曝させなかった癌細胞におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体の生物学的活性と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％、最も好ましくは１００％阻害し得る。
【００２５】
第一薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物学的活性を、当該薬剤に被曝させなかった癌細胞におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物学的活性と比較して５０％またはそれ以上阻害することができ、および／または第二薬剤は、ＥＲＢＢ２の生物学的活性を、当該薬剤に被曝させなかった癌細胞におけるＥＲＢＢ２の生物学的活性と比較して５０％またはそれ以上阻害することができるのが好都合である。
【００２６】
好ましくは、第一薬剤および／または第二薬剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体に対する結合親和性を有する化合物、ならびに小分子阻害化合物からなる群より選択される。
【００２７】
あるいは、第一薬剤は、小分子阻害化合物、例えばビタミンＤのアンタゴニスト、例えばＺＫ１５９２２２（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）およびＴＥＩ−９６４７（Ｔｅｊｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｔｏｋｙｏ）、ならびにビタミンＡのアンタゴニスト、例えばＡＧＮ１９３１０９（Ａｌｌｅｒｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）であり得る。
【００２８】
ＥＧＦ受容体阻害剤の例には、ＥｒｂＢ２に対する特異性を有するモノクローナル抗体である薬品ハーセプチン（トラスツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＥＧＦ−Ｒ（ＥｒｂＢ１）に対する特異性を有するモノクローナル抗体である薬品エルビタックス（セツキシマブ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、その他のモノクローナル抗体、例えばＭＡＢ２２５、チロシンキナーゼを阻害することによってＥＧＦ受容体を阻害する小分子イレッサ（ゲフィチニブ、Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）、およびその他のチロシンキナーゼ阻害剤（例えばＰＤ１５３０３５、ＧＷ５７２０１６等、これらはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ｍｅｒｃｋ等の業者から入手できる）が含まれる。
【００２９】
好ましい実施態様において、第一薬剤および／または第二薬剤の少なくとも一方は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。
【００３０】
ＲＮＡ干渉は二段階プロセスである。第一の段階は、開始段階（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ）と呼ばれ、投入したｄｓＲＮＡが、おそらくはＡＴＰ依存的な様式で（直接的にまたはトランスジーンもしくはウイルスを通じて導入された）ｄｓＲＮＡを処理（切断）するｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲｎａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーであるＤｉｃｅｒの作用によって消化され、２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）の小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）となる。このＲＮＡは、その後の切断イベントにより、各々２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する１９〜２１ｂｐの二重鎖（ｓｉＲＮＡ）に分解される（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ＆ Ｚａｍｏｒｅ，２００２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：２２５−２３２；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−３６６）。
【００３１】
そのエフェクター段階において、ｓｉＲＮＡ二重鎖はヌクレアーゼ複合体に結合してＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ＲＩＳＣの活性化には、ｓｉＲＮＡ二重鎖のＡＴＰ依存的な巻き戻しが必要とされる。次いで活性化型ＲＩＳＣは塩基対相互作用によって相同な転写物を標的化し、そのｍＲＮＡをｓｉＲＮＡの３’末端から１２個のヌクレオチドフラグメントに切断する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ＆ Ｚａｍｏｒｅ，２００２，前出；Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０−１１９（２００１）；Ｓｈａｒｐ，２００１，Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．１５：４８５−９０）。その切断メカニズムは現在も解析中であるが、各々のＲＩＳＣが一つのｓｉＲＮＡおよびＲＮａｓｅを含むことが研究によって示されている（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ＆ Ｚａｍｏｒｅ，２００２，前出）。
【００３２】
ＲＮＡｉの傑出した能力から、ＲＮＡｉ経路内での増幅工程が示唆されている。増幅は、投入したｄｓＲＮＡの複製によりより多くのｓｉＲＮＡを生成することによって、または形成されたｓｉＲＮＡの複製によって行われ得る。あるいはまたはそれに加えて、増幅は、ＲＩＳＣの複数回の代謝回転（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）事象によってもたらされ得る（Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００１，前出；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ＆ Ｚａｍｏｒｅ，２００２）。ＲＮＡｉに関する追加の情報は、以下のレビュー、Ｔｕｓｃｈｌ，２００１，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５、Ｃｕｌｌｅｎ，２００２，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７−５９９、およびＢｒａｎｔｌ，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔ．１５７５：１５−２５から得ることができる。
【００３３】
本発明において使用するのに適したＲＮＡｉ分子の合成は、以下のようにして行うことができる。まず、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７ ｍＲＮＡの配列を、ＡＡジヌクレオチド配列についてＡＵＧ開始コドンの下流をスキャンする。各々のＡＡの出現および３’側に隣接する１９ヌクレオチドを、ｓｉＲＮＡ標的部位候補として記録する。好ましくは、非翻訳領域（ＵＴＲ）は調節タンパク質結合部位に豊富に存在するので、ｓｉＲＮＡ標的部位をオーブンリーディングフレームから選択する。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合と干渉する可能性がある（Ｔｕｓｃｈｌ，ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５）。しかし、非翻訳領域に対するｓｉＲＮＡも有効な場合があることが理解されよう。
【００３４】
次に、配列アラインメントソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用いて、標的部位候補を適当なゲノムデータベース（例えばヒト、マウス、ラット等）と比較する。他のコード配列に対して有意な相同性を示す推定標的部位は排除する。
【００３５】
合格した標的配列をｓｉＲＮＡ合成のテンプレートとして選択する。好ましい配列はＧ／Ｃ含有量の低い配列である。これらは、５５％より高いＧ／Ｃ含有量を有する配列と比較して遺伝子サイレンシングの媒介に効果が高いことが証明されているからである。好ましくは、評価のために、数個の標的部位を標的遺伝子全長から選択する。好ましくは、選択したｓｉＲＮＡのより良い評価のために、ネガティブコントロールを併せて使用する。好ましくは、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡは、そのｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含むがそのゲノムに対する有意な相同性を欠くものである。従って、好ましくは、任意の他の遺伝子に対して有意な相同性を示さないｓｉＲＮＡのスクランブルヌクレオチド配列を使用する。
【００３６】
好ましくは、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７を阻害するｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１のヌクレオチド配列のフラグメント、またはその変異体を含むものである。
【表１】

【００３７】
あるいは、ｓｉＲＮＡ分子は、ＥＮＳＧ０００００１６４０４７（ゲノム配列）から転写されたヌクレオチド配列のフラグメントを含む。
【００３８】
好ましくは、ＥＧＦ受容体を阻害するｓｉＲＮＡ分子は、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦ−Ｒ）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、もしくはＥｒｂＢ４をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列のフラグメント、またはその変異体を含む。
【００３９】
ｍＲＮＡ配列の例は、次の通りである：
ＥＧＦＲ： ＥＮＳＴ０００００２７５４９３（ＥＮＳＥＭＢＬデータベースアクセス番号）
ＥＲＢＢ２： ＥＮＳＴ０００００２６９５７１
ＥＲＢＢ３： ＥＮＳＴ０００００２６７１０１
ＥＲＢＢ４： ＥＮＳＴ０００００３４２７８８
【００４０】
「フラグメント」は、少なくとも１０ヌクレオチド、例えば、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドを意味する。
【００４１】
「変異体」は、そのヌクレオチド配列が、配列番号１のフラグメントと少なくとも９０％の配列同一性を、または配列番号１のフラグメントと少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を共有することを意味する。
【００４２】
二つのポリヌクレオチド間の配列同一性の比率は、適当なコンピュータープログラム、例えばＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを用いて決定され得、同一性の比率は、最適なアラインメントがなされた配列を有するポリヌクレオチドとの関係で算出されることが理解されよう。
【００４３】
あるいは、アラインメントは、（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０に記載されるような）Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて行われ得る。
【００４４】
使用するパラメータは、次の通りであり得る：
ファスト・ペアワイズ・アラインメント・パラメータ：Ｋ−タプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５，ギャップペナルティ；３、トップダイアゴナル数；５、スコアリングメソッド：ｘパーセント
マルチ・アラインメント・パラメータ：ギャップオープンペナルティ；１０、ギャップエクステンションペナルティ；０．０５
スコアリングマトリクス：ＢＬＯＳＵＭ
【００４５】
あるいは、部分配列アラインメントを決定するのにＢＥＳＴＦＩＴプログラムが使用され得る。
【００４６】
ｓｉＲＮＡ分子は１９〜２３ヌクレオチド長であるのが良い。
【００４７】
別の実施態様において、第一薬剤および第二薬剤の少なくとも一方はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００４８】
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体のレベル／活性を効果的に低下させるのに使用できるアンチセンス分子の設計には、アンチセンスアプローチに重要な二つの局面を考慮することが必要である。第一の局面は癌細胞の細胞質へのオリゴヌクレオチドの送達であり、第二の局面はその翻訳を阻害する様式で細胞内の指定されたｍＲＮＡに特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
【００４９】
先行技術は、オリゴヌクレオチドを幅広い細胞型に効果的に送達するのに使用できる多くの送達ストラテジーを教示している（例えば、Ｌｕｆｔ，１９９８，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７６：７５−６；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９１：８５２−６２；Ｒａｊｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ８：９３５−４０；Ｌａｖｉｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３７：５６６−７１；Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３１：５４０−５を参照のこと）。
【００５０】
さらに、標的ｍＲＮＡおよびそのオリゴヌクレオチドの両方における構造変化のエネルギー論を説明する熱力学サイクルに基づき、予想される標的ｍＲＮＡに対する結合親和性が最も高い配列を同定するアルゴリズムが利用可能である（例えば、Ｗａｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６５：１−９を参照のこと）。
【００５１】
インビトロ系を用いて特異的なオリゴヌクレオチドを設計およびその有効性を予測するためのいくつかのアプローチも公知である（例えば、Ｍａｔｖｅｅｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１３７４−１３７５を参照のこと）。
【００５２】
いくつかの臨床試験が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実現可能性、および活性を実証している。例えば、癌の処置に適したアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に成功している（Ｈｏｌｍｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １：３７２−８５；Ｇｅｒｗｉｔｚ，１９９９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １：２９７−３０６）。さらに最近、ヒトヘパラナーゼ遺伝子の発現のアンチセンスを介した抑制が、マウスモデルにおいてヒト癌細胞の胸膜転移を阻害することが報告された（Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：７８５５−６０）。
【００５３】
従って、当業者は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体の発現をダウンレギュレートするのに適したアンチセンスアプローチを容易に設計および実施することができる。
【００５４】
好ましくは、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチドのフラグメントまたはその変異体を含む。
【００５５】
好ましくは、ＥＧＦ受容体を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦ−Ｒ）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、もしくはＥｒｂＢ４をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列のフラグメント、またはその変異体を含む。
【００５６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは１５〜３５ヌクレオチド長であるのが都合良い。例えば、２０マーオリゴヌクレオチドは、上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの発現を阻害することが示されており（Ｗｉｔｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ ５３：４１−５０（１９９９））、２５マーオリゴヌクレオチドは、副腎皮質刺激ホルモンの発現を９０％より多く減少させることが示されている（Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ９１：２６１−７（１９９９））。しかし、この範囲外の長さ、例えば１０、１１、１２、１３、もしくは１４塩基、または３６、３７、３８、３９、もしくは４０塩基を有するオリゴヌクレオチドを使用するのが望ましい場合もあることを理解されたい。
【００５７】
さらに、オリゴヌクレオチドは細胞内因性ヌクレアーゼによる分解または不活性化に曝されることが当業者に理解されよう。この問題に対処するために、修飾されたオリゴヌクレオチド、例えば天然型のホスホジエステル結合が別の結合で置換された改良型インターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドを使用することが可能である。例えば、Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，７０７９−７０８３は、オリゴヌクレオチドホスホロアミデートおよびホスホロチオエートを用いることで組織培養物中でのＨＩＶ−１に対する阻害性が向上することを示した。Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，７４４８−７４５１は、オリゴヌクレオチドメチルホスホネートを用いることでＨＩＶ−１に対する阻害性が向上することを実証した。Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，７７９０−７７９４は、感染初期および慢性感染状態の細胞培養物の両方において、ヌクレオチド配列特異的なオリゴヌクレオチドホスホロチオエートを用いてＨＩＶ−１の複製を阻害することを示した。Ｌｅｉｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，３４３０−３４３４は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートによる組織培養物中でのインフルエンザウイルスの複製の阻害を報告している。
【００５８】
人工的な結合を有するオリゴヌクレオチドは、インビボでの分解に耐性であることが示されている。例えば、Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ（１９９１）は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，７４７−７５０において、他の部分は非修飾型であるオリゴヌクレオチドが、それらの３’末端を特定のキャップ構造でブロックした場合、インビボでのヌクレアーゼに対する耐性を増加させること、および非キャップ型のオリゴヌクレオチドホスホロチオエートがインビボで分解されないことを報告している。
【００５９】
オリゴヌクレオシドホスホロチオエートの合成におけるＨ−ホスホネートアプローチの詳細な説明は、Ａｇｒａｗａｌ ａｎｄ Ｔａｎｇ（１９９０）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１，７５４１−７５４４に記載されており、その教示を参照により本明細書に援用する。オリゴヌクレオシドメチルホスホネート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、リン酸エステル、架橋ホスホロアミデート、および架橋ホスホロチオエートの合成は当該分野で公知である。例えば、その教示内容を参照により本明細書に援用する、Ａｇｒａｗａｌ ａｎｄ Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８，３５３９；Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９，２９１１；Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７，７２３７；Ｕｚｎａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８，３４０１；Ｂａｎｎｗａｒｔｈ（１９８８）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．７１，１５１７；Ｃｒｏｓｓｔｉｃｋ ａｎｄ Ｖｙｌｅ（１９８９）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０，４６９３；Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１４０１−１４０５を参照のこと。他の合成または製造方法も可能である。好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であるが、リボ核酸（ＲＮＡ）配列もまた合成および利用され得る。
【００６０】
本発明において有用なオリゴヌクレオチドは、好ましくは、内因性の核酸分解酵素による分解に耐性を有するように設計される。オリゴヌクレオチドのインビボ分解は、短いオリゴヌクレオチド分解産物を生じる。このような分解産物は、それらの全長対応物と比較して、非特異的なハイブリダイゼーションに関与する可能性が高く、有効性が低い。従って、体内での分解に耐性でありかつ標的細胞に到達することのできるオリゴヌクレオチドを使用することが望ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、ネイティブのホスホジエステル結合を一つまたはそれ以上の人工的な内部インターヌクレオチド結合で置換することによって、例えばその結合におけるリン酸を硫黄で置換することによってインビボでの分解に対する耐性を高めることができる。使用され得る結合の例には、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、様々なホスホロアミデート、リン酸エステル、架橋ホスホロチオエート、および架橋ホスホロアミデートが含まれる。他のインターヌクレオチド結合も当該分野で周知であるので、このような例は一例にすぎず、限定的なものではない。ホスホジエステルインターヌクレオチド結合の代わりにこれらの結合を一つまたそれ以上有するオリゴヌクレオチドの合成は、混合型インターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドを製造するための合成経路を含めて、当該分野で周知である。
【００６１】
オリゴヌクレオチドは、５’または３’末端ヌクレオチドにおける「キャッピング」または類似する基の導入によって内因性酵素による伸長に対して耐性にすることができる。キャップ用試薬は、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡからＡｍｉｎｏ−Ｌｉｎｋ ＩＩ^TMとして販売されている。キャップ法は、例えば、Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，７４７−７５０およびＡｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８（１７），７５９５−７５９９に記載されている。
【００６２】
ヌクレアーゼからの攻撃に対してオリゴヌクレオチドを耐性にするさらなる方法は、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１，２７２９−２７３５に記載されるようにそれらを「自己安定化」させることである。自己安定化オリゴヌクレオチドは、それらの３’末端でヘアピンループ構造を有し、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、および胎仔ウシ血清による分解に対して高い耐性を示す。そのオリゴヌクレオチドの自己安定化領域は、相補的な核酸とのハイブリダイゼーションに干渉せず、マウスにおける薬物動態・安定性研究は、自己安定化型オリゴヌクレオチドがそれらの直鎖型対応物よりもインビボ耐性が高いことを示した。
【００６３】
例えば、本発明のｓｉＲＮＡ分子および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、次の表に示される配列から選択された配列を含むまたはそれらからなる場合がある（これらの配列は実施例にも記載されている）。
【表２】

【００６４】
さらに別の実施態様において、第一薬剤はｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に対する結合親和性を有する化合物であり、第二薬剤はＥＧＦ受容体に対する結合親和性を有する化合物、例えばタンパク質または糖質である。
【００６５】
例えば、化合物は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体の活性部位に実質的に可逆的にまたは実質的に不可逆的に結合するものであり得る。さらなる例において、化合物は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体の活性部位ではない部分に結合し、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体のリガンドまたは受容体への結合を妨げるものであり得る。なおさらなる例において、化合物は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体の一部に結合し、アロステリック効果によってそのタンパク質活性を低下させるものであり得る。このアロステリック効果は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体の活性の自然調節に関与する、例えばｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体の「上流の活性化因子」による活性化に関与するアロステリック効果であり得る。
【００６６】
試験化合物とタンパク質、例えばｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７またはＥＧＦ受容体の間の相互作用を検出する方法は当該分野で周知である。例えば、イオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法による限外濾過または他の物理的・分析的方法が使用され得る。さらに、二つの蛍光標識体の結合を、相互に接近した際の蛍光標識の相互作用を測定することによって測定する蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法も使用され得る。
【００６７】
高分子に対するポリペプチド、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、およびリン脂質の結合を検出する別の方法には、例えばＰｌａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎａｌｙｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２６（２），３４２−３４８に記載される表面プラズモン共鳴アッセイが含まれる。この方法では、標識された、例えば放射線標識または蛍光標識により標識されたポリペプチドが利用され得る。
【００６８】
ポリペプチドに結合できる化合物を同定するさらなる方法は、ポリペプチドを化合物に被曝させ、そのポリペプチドへの化合物の結合を検出および／または測定する方法である。ポリペプチドに対する化合物の結合についての結合定数が決定され得る。ポリペプチドへの化合物の結合を検出および／または測定（定量）するのに適した方法は当業者に周知であり、例えば、高スループットの操作を実現する方法、例えばチップベースの方法を用いて実施され得る。ＶＬＳＩＰＳ（登録商標）とよばれる新技術は、数十万またはそれ以上の異なる分子プローブを含む極小のチップの製造を可能にした。これらの生物学的チップまたはアレイにプローブが配列され、各プローブに特定位置が割り当てられる。各々の位置が、例えば１０ミクロンのスケールとなる生物学的チップが開発されている。このチップは、標的分子がチップ上のいずれのプローブと相互作用するかを決定するのに使用できる。このアレイを選択された試験条件下で標的分子に被曝させた後、スキャン機器によりアレイの各位置を調査し、標的分子がその位置のプローブと相互作用したかどうかを決定する。
【００６９】
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に対する結合親和性を有する化合物を同定する別の方法は、酵母ツーハイブリッドシステムであり、このシステムにおいて本発明のポリペプチドをｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に結合するタンパク質を「捕捉」するのに使用することができる。酵母ツーハイブリッドシステムはＦｉｅｌｄｓ ＆ Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６（１９８９）に記載されている。
【００７０】
さらに別の実施態様において、化合物は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体に対するリガンド結合能を有するものである。例えば、第一薬剤はｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体の可溶性フラグメントであり得る（例えばＦＰＲＬ１であるがこれに限定されない）。
【００７１】
あるいは、薬剤は、抗体を模倣する高親和性分子（いわゆる「アフィボディ」）であり得る（例えばＵＳ ５,８３１,０１２およびｗｗｗ．ａｆｆｉｂｏｄｙ．ｓｅを参照のこと）。これらのリガンドは、足場としてのプロテインＡ（細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の表面タンパク質）のＩｇＧ結合ドメインの一つを基礎とする三ヘリックスバンドルで構成される小さく単純なタンパク質である。この足場はアフィニティリガンドとしての優れた特徴を有し、任意の所定の標的タンパク質に対して高い親和性で結合するよう設計することができる。
【００７２】
さらに別の実施態様において、第一薬剤および／または第二薬剤は小分子阻害化合物である。
【００７３】
好ましくは、第一薬剤および／または第二薬剤はポリペプチドを含むまたはポリペプチドからなる。
【００７４】
好ましい実施態様において、ポリペプチドは抗体またはその抗原結合フラグメントであり、好ましくは抗体またはその抗原結合フラグメントはＦｖフラグメント、Ｆａｂ様フラグメント、単可変ドメイン（ｓｉｎｇｌｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ）、およびドメイン抗体からなる群より選択される。抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化されているのが都合良い。「抗体」には、実質的にインタクトな抗体分子だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（少なくとも一つのアミノ酸が天然型のヒト抗体と比べて変異しているもの）、単鎖抗体、二特異性抗体（例えば、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７およびＥＧＦ受容体の両方に対する親和性を有する抗体）、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、ならびにそれらの抗原結合フラグメントおよび誘導体が含まれる。
【００７５】
「抗原結合フラグメント」は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体に結合できる抗体の機能的フラグメントを意味する。
【００７６】
好ましくは、抗原結合フラグメントは、Ｆｖフラグメント（例えば単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合型Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、およびＦ（ａｂ）₂フラグメント）、単可変ドメイン（例えばＶ_HドメインおよびＶ_Lドメイン）、ならびにドメイン抗体（ｄＡｂ、シングル型およびデュアル型［すなわちｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）からなる群より選択される。
【００７７】
全長抗体ではなく抗体フラグメントを使用する利点はいくつかある。フラグメントのサイズの小ささは薬理学的特性を改善する、例えば固形組織への浸透性を向上させることがある。さらに、抗原結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、およびｄＡｂ抗体フラグメントはＥ．ｃｏｌｉで発現させ分泌させることができるので、容易に多量のフラグメントを製造することができる。
【００７８】
抗体およびその抗原結合フラグメントの修飾型、例えばポリエチレングリコールまたは他の適当なポリマーの共有結合により修飾されたものもまた本発明の範囲に含まれる。
【００７９】
抗体及び抗体フラグメントを作製する方法は当該分野で周知である。例えば、抗体は、抗体分子のインビボ生成の誘導、免疫グロブリンライブラリのスクリーニング（Ｏｒｌａｎｄｉ．ｅｔ ａｌ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：３８３３−３８３７；Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９）、または培養細胞株によるモノクローナル抗体分子の産生を利用する様々な方法の任意の一つを通じて作製され得る。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）−ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７５．Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５０４９７；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２；Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６２：１０９−１２０）が含まれるがこれらに限定されない。
【００８０】
選択された抗原に対する適当なモノクローナル抗体は、公知技術、例えば“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｈ Ｚｏｌａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）および“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｊ Ｇ Ｒ Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８２）に開示される技術によって作製され得る。
【００８１】
抗体フラグメントは、当該分野で周知の方法を用いて得ることができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，１９８８，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例えば、本発明に係る抗体フラグメントは、抗体のタンパク質加水分解によってまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉもしくは哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系）中での発現によって得ることができる。あるいは、抗体フラグメントは、従来法による全長抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。
【００８２】
ヒトの治療または診断にヒト化抗体の使用が好まれることは当業者に理解されているであろう。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化型は、好ましくは最小限の非ヒト抗体由来部分を有する遺伝子操作されたキメラ抗体または抗体フラグメントである。ヒト化抗体には、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域が所望の官能性を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、またはウサギの相補性決定領域由来の残基で置換された抗体が含まれる。いくつかの例において、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基で置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも移植された相補性決定領域もしくはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全ての相補性決定領域が非ヒト抗体のそれに対応し、全てまたは実質的に全てのフレームワーク領域が関連するヒトコンセンサス配列のそれに対応する、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体は、典型的にはヒト抗体に由来する抗体の定常領域例えばＦｃ領域の少なくとも一部も含むことが好ましい（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６．Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９；Ｐｒｅｓｔａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照のこと）。
【００８３】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該分野で周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト源から導入された一つまたはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基、しばしば移入残基（ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）と称される、は典型的には移入した可変ドメインから得る。ヒト化は、基本的に、記載されているように（例えばＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８．Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６ｌ；ＵＳ ４，８１６，５６７を参照のこと）、ヒト相補性決定領域を対応する齧歯類相補性決定領域で置換することによって行うことができる。従って、このようなヒト化抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に小さい領域が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である。実際のヒト化抗体は、典型的には、いくつかの相補性決定領域の残基およびおそらくはいくつかのフレームワーク残基が齧歯類抗体における類似部分由来の残基で置換されたヒト抗体である。
【００８４】
ヒト抗体また、ファージディスプレイライブラリ（例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐｐ．７７；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５を参照のこと）を含む当該分野で公知の様々な技術を用いて特定することができる。
【００８５】
適当な抗体が獲得されれば、それらは、例えばＥＬＩＳＡによって活性について試験され得る。
【００８６】
好ましい実施態様において、第一薬剤および／または第二薬剤の少なくとも一方は、癌細胞に選択的に送達または癌細胞により選択的に活性化されることが可能である。
【００８７】
「選択的」は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体の生物学的活性に対する薬剤の阻害作用が、（その薬剤の癌細胞部位への局所投与によってではなく）癌細胞でまたは癌細胞内で優先的に発揮されることを意味する。
【００８８】
薬剤を特定の細胞型、例えば癌細胞に標的化する方法は当該分野で周知である（例えばＶａｓｉｒ ＆ Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ，２００５，Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．４（４）：３６３−７４；Ｂｒａｎｎｏｎ−Ｐｅｐｐａｓ ＆ Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ，２００４，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．５６（１１）：１６４９−５９およびＺｈａｏ ＆ Ｌｅｅ，２００４，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．５６（８）：１１９３−２０４を参照のこと）。
【００８９】
好ましくは、第一薬剤および／または第二薬剤は標的細胞特異的部分を含み、この標的細胞特異的部分は抗体またはその抗原結合フラグメントであるのがよく、これらはヒト化され得る。
【００９０】
「標的細胞特異的」部分は、標的癌細胞上の物質を認識しこれに結合する一つまたはそれ以上の結合部位を含む薬剤の部分を意味する。標的細胞に接触すると、標的細胞特異的部分は阻害性部分とともに内部移行され得る。
【００９１】
標的細胞特異的部分によって認識される物質は、標的癌細胞において優勢的に、好ましくは排他的に発現されるものである。標的細胞特異的部分は、同じ標的細胞型において発現される異なる物質に対する一つもしくはそれ以上の結合部位、または二つもしくはそれ以上の異なる標的細胞型において発現される異なる物質に対する一つもしくはそれ以上の結合部位を含み得る。
【００９２】
好ましくは、標的細胞特異的部分は、高結合力で標的細胞を認識する。
【００９３】
「高結合力」は、標的細胞特異的部分が、標的細胞を、少なくともＫ_d＝１０^-6Ｍ、好ましくは少なくともＫ_d＝１０^-9Ｍ、適当なのはＫ_d＝１０^-10Ｍ、より適当なのはＫ_d＝１０^-11Ｍ、さらにより適当なのはＫ_d＝１０^-12Ｍ、より好ましくはＫ_d＝１０^-15Ｍ、さらにはＫ_d＝１０^-18Ｍの結合定数で認識することを意味する。
【００９４】
好ましい実施態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、癌細胞の表面上で発現される抗原に対する特異性を有する。
【００９５】
認識される物質は、腫瘍細胞によって発現される任意の適当な物質であり得る。多くの場合、認識される物質は抗原であろう。
【００９６】
抗原の例には表１に列挙されるものが含まれる。
【表３】

【００９７】
他の抗原には、アルファフェトタンパク質、Ｃａ−２５、前立腺特異的抗原、および上皮増殖因子受容体ファミリーのメンバー、すなわちｅｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、およびｅｒｂＢ４が含まれる。
【００９８】
従って、一つの実施態様において、第二薬剤は、抗ＥＧＦ受容体抗体、例えば抗ｅｒｂＢ２抗体（例えばハーセプチン）であり得る。第二薬剤は、第一薬剤に融合またはそれ以外の方法で結合されている場合、ＥＧＦ受容体阻害剤および標的化剤の両方として作用することができる。
【００９９】
標的細胞特異的部分が標的細胞に対する二つまたはそれ以上の結合部位を含む、抗体またはその二価フラグメントであるのが都合良い。この標的細胞特異的部分は、互いと同じ物質を認識するまたは異なる物質を認識する各「アーム」を有し得る。
【０１００】
本発明の薬剤の一つの実施態様において、標的細胞特異的部分は、同じ標的細胞上の異なる分子を認識する二つの「アーム」を有し、その同じ標的細胞上の分子はその細胞型に限定的なものではなくいくつかの他の細胞型にも存在し得るものである。例えば、標的細胞特異的部分の一方の「アーム」はＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ型細胞上の分子を認識し、他方の「アーム」はＩ、ＩＶ、およびＶ型細胞上の分子を認識する。従って、このような標的細胞特異的部分を含む本発明の薬剤は、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ型細胞と比較して、Ｉ型細胞に対する特異性が高くなるであろう。完全に標的細胞特異的な分子はほとんど発見されておらず、いくつかの細胞型に存在し本発明のこの局面において有用な分子が周知であるため、本発明のこの局面は特に有益である。このような分子は通常、それに対して交差反応する抗体が知られている細胞表面抗原である。
【０１０１】
表１に列挙した抗原の多くに結合するモノクローナル抗体はすでに公知であるが、いずれの場合も、今日のモノクローナル抗体技術をもってすればほとんどの抗原に対して抗体を作製することができる（上記参照）。
【０１０２】
認識される物質は、抗原性である場合または抗原性でない場合があり、いくつかの他の方法で認識および選択的に結合され得る場合がある。例えば、それは、特徴的な細胞表面受容体、例えば黒色腫細胞において多量に発現されるメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）に対する受容体であり得る。あるいは、その物質は、標的細胞において誘導される物質であり得る。細胞特異的部分は、非免疫な様式で、例えば細胞表面酵素の基質もしくはそのアナログまたはメッセンジャーとしてその物質に特異的に結合する化合物またはその一部であり得る。
【０１０３】
好ましくは、高結合力の標的細胞特異的部分は、標的細胞に対する二つまたはそれ以上の異なる結合部位を含む。
【０１０４】
標的細胞に対する異なる結合部位は、標的細胞において発現される異なる物質に対する二つまたはそれ以上の異なる抗体またはそのフラグメントである場合またはそうでない場合がある。あるいは、標的細胞に対する異なる結合部位は、いくつかの他の非免疫的な様式で細胞を認識しそれに選択的に結合し得る。
【０１０５】
標的化部分が任意の適当な手段によって本発明の阻害性薬剤に結合され、それによって二つの部分で機能的活性を保持し得ることが理解されよう。例えば、標的化部分および阻害性部分が共にポリペプチドの場合、それらは相互に融合され、融合タンパク質が形成され得る。このような融合物の例は当業者に周知である。
【０１０６】
好ましくは、第一薬剤および／または第二薬剤は、癌細胞によって選択的に活性化されるプロドラッグである。
【０１０７】
本願において使用される場合、用語「プロドラッグ」は、その親の薬物と比較して癌細胞に対する細胞毒性が小さく、より活性な親の形態に酵素的に活性化または変換できる、薬学的に有効な物質の前駆体または誘導体形態を意味する（例えばＤ．Ｅ．Ｖ．Ｗｉｌｍａｎ “Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ １４，３７５−３８２（６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｂｅｌｆａｓｔ １９８６）およびＶ．Ｊ．Ｓｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ “Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ” Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒ．Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ（ｅｄ．）ｐａｇｅｓ ２４７−２６７（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９８５）を参照のこと）。
【０１０８】
このようなプロドラック薬剤を製造するのに適した方法は当該分野で周知である（例えばＤｅｎｎｙ，２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．２２（４）：６０４−１９；Ｒｏｏｓｅｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ．２００４ ５６（１）：５３−１０２；ＷＯ ０３／１０６４９１を参照のこと）。
【０１０９】
プロドラッグの活性化のための酵素を選択する上でいくつかの要素を考慮する必要がある。これらには、その酵素の分子量および物理的特性、その生理学的条件下での活性および安定性、ならびに酵素の生成する薬物の性質が含まれる。
【０１１０】
このストラテジーの柔軟性は、多くの機械的に別々の抗癌剤を放出する能力を有する様々な酵素の利用に耐えるものである。特に有益なのは、単一のＭａｂ−酵素複合体が、相乗作用的な活性を有する治療有効用量の機械的に別々の抗癌剤を生成することができるという事実である。これは免疫原性の理由から重要であることが分かるはずである。これらの局面においては、好ましい動態および広範な基質特異性ならびにセファロスポリン基質の３’部分に付加された置換基を除去するという能力から、多くのβ−ラクタマーゼが多くの能力を保持している（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９２）“Ｍａｂ−β−ｌａｃｔａｍａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ ｍｕｓｔａｒｄ ｐｒｏｄｒｕｇ”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３，１７６−１８１を参照のこと）。
【０１１１】
哺乳動物起源および非哺乳動物起源の両方の酵素が、様々なプロドラッグの活性化に使用されている（Ｓｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ４，３−９；Ｓｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９１．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ＶＩ，ｅｄ．Ｍ．Ｚ．Ａｔａｓｓｉ．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ９７−１０）。哺乳動物起源の酵素は免疫原性が低い点で有利であるが、それらが作用するプロドラッグは対応する内因性酵素の基質の可能性もある。
【０１１２】
好ましい実施態様において、成分（ａ）および成分（ｂ）は、癌細胞の処置において逐次的に、別個に、および／または同時に使用するのに適している。
【０１１３】
本発明の薬剤は様々なタイプの癌細胞の増殖を阻害するのに使用され得ることが当業者に理解されよう。好ましくは、癌細胞は上皮細胞および／または扁平上皮細胞である。
【０１１４】
望ましくは、癌細胞は、乳房、胆管、脳、結腸、胃、生殖器、肺および気道、皮膚、胆嚢、肝臓、鼻咽頭、神経細胞、腎臓、前立腺、リンパ腺、胃腸管、ならびに内分泌系の癌細胞からなる群より選択される。
【０１１５】
好ましくは、癌細胞は乳癌細胞である。
【０１１６】
最も好ましくは、癌細胞はエストロゲン陽性である。しかし、本発明の薬剤及び方法はその他の癌タイプの処置にも利用され得る。
【０１１７】
一つの実施態様において、乳癌細胞はＥｌｓｔｏｎグレードＩＩＩ細胞でありかつ転移性であり得る。
【０１１８】
本発明の第二の局面において、その方法が本発明の第一の局面において規定される成分（ａ）を、本発明の第一の局面において規定される成分（ｂ）と関連付け、二つの成分を互いに組み合わせて投与するのに適合させることを含む、本発明の第一の局面において規定される併用製品の製造方法を提供する。
【０１１９】
本発明の第三の局面において：
（ｉ）請求項１〜４０のいずれか一項に記載の成分（ａ）および成分（ｂ）の少なくとも一方；と共に
（ｉｉ）その成分をその二つの成分の他方と組み合わせて使用するための説明書、
を含む、キット・オブ・パーツを提供する。
【０１２０】
本発明に係るキット・オブ・パーツとの関係で、用語「〜と組み合わせて（ｉｎ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ）」は、二つの製剤の一方または他方がもう一方の成分の投与前に、投与後に、および／または同時に投与され得る（場合により反復的に）ことを包含する。この文脈で使用される場合、用語「同時に投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）」および「同時に投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ ａｓ）」は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の活性を阻害する第一薬剤およびＥＧＦ受容体の活性を阻害する第二薬剤のそれぞれが互いから４８時間（例えば２４時間）以内に投与されることを包含する。
【０１２１】
本発明の第四の局面において、癌細胞の処置において使用するための、本発明の第一の局面において規定される併用製品または第三の局面において規定されるキット・オブ・パーツを提供する。
【０１２２】
本発明の第五の局面において、本発明の第一の局面において規定される併用製品または第三の局面において規定されるキット・オブ・パーツを、癌患者または癌に対して感受性の患者に投与することを含む、癌細胞の処置方法を提供する。
【０１２３】
「処置」は、患者の治療的処置および予防的処置の両方を包含する。用語「予防的」は、患者または被験者における癌を防止するまたはその可能性を低下させる、本明細書中に記載されるポリペプチドまたは製剤の使用を包含するよう使用される。
【０１２４】
好ましくは、この処置方法は、患者の癌細胞の増殖の阻害および／または転移の阻害を含む。
【０１２５】
好ましくは、患者はヒトであり、薬剤は癌細胞に選択的に送達されるまたは癌細胞により選択的に活性化されるものがよい。
【０１２６】
本発明の第六の局面において、医薬において使用するための本発明の第一の局面に係る併用製品を提供する。
【０１２７】
好ましくは、併用製品は癌の処置において使用するためのものである。
【０１２８】
本発明の第七の局面において、本発明の第一の局面に係る併用製品および薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤、または担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１２９】
好ましくは、医薬組成物は非経口投与に適したものである。
【０１３０】
好ましい実施態様において、この医薬組成物の製剤は、癌細胞を標的化して薬剤を送達することができる。
【０１３１】
本発明の第八の局面において、癌細胞の増殖を阻害するための医薬の製造における本発明の第一の実施態様に係る併用製品を提供する。
【０１３２】
好ましい実施態様において、癌細胞は上皮細胞および／または扁平上皮細胞である。
【０１３３】
好ましくは、癌細胞は、乳房、胆管、脳、結腸、胃、生殖器、肺および気道、皮膚、胆嚢、肝臓、鼻咽頭、神経細胞、腎臓、前立腺、リンパ腺、ならびに胃腸管の癌細胞からなる群より選択される。
【０１３４】
より好ましくは、癌細胞は乳癌細胞、例えばＥｌｓｔｏｎグレードＩＩＩ細胞でありかつ転移性であり得る。
【０１３５】
本明細書中で使用される場合、「医薬製剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」は、本発明に係る治療上有効な製剤を意味する。
【０１３６】
本明細書中で使用される場合、「治療有効量」または「有効量」または治療上有効な」は、所定の状態および投与レジメンにおいて治療効果を提供する量を意味する。これは、必要な添加剤および希釈剤、すなわち担体または投与媒体と組み合わせて所望の治療効果を生じるよう計算された活性成分の既定量である。さらに、この用語は、活性、機能、および宿主の反応における臨床的に重大な欠陥を減らす、最も好ましくは防止するのに十分な量を意味する。あるいは、治療有効量は、宿主における臨床的に重大な状態に改善をもたらすのに十分な量である。当業者に理解されていることであるが、化合物の量はその比活性に依存して変化し得る。適当な投与量には、必要な希釈剤と組み合わせて所望の治療効果を生じるよう計算された活性成分の既定量が含まれ得る。本発明の組成物の製造方法および使用において、治療有効量の有効成分が提供される。治療有効量は、当該分野で周知のように、患者の特徴、例えば年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患等に基づき医師または獣医により決定され得る。
【０１３７】
このような有効量の薬剤またはその製剤は単ボーラス投与（すなわち急性的投与）として、またはより好ましくは経時的な一連の投与（すなわち慢性的投与）として送達され得ることが当業者に理解されるであろう。
【０１３８】
本発明の薬剤は、使用する化合物の効能／毒性およびそれを使用する上での効能に依存して、様々な濃度で処方され得る。好ましくは、製剤は、０.１μＭ〜１ｍＭの間、より好ましくは１μＭ〜１００μＭの間、５μＭ〜５０μＭの間、１０μＭ〜５０μＭの間、２０μＭ〜４０μＭの間、最も好ましくは約３０μＭの濃度の本発明の薬剤を含む。インビトロ用途では、製剤はそれより低い濃度、例えば０.００２５μＭ〜１μＭの間の本発明の化合物を含み得る。
【０１３９】
本発明の薬剤は、一般的に、意図する投与経路および医薬品取り扱い基準（ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を考慮して選択された適当な薬学的賦形剤、希釈剤、または担体と混合して投与されることが当業者に理解されているであろう（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９^thｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，Ｅｄ．Ａｌｆｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡを参照のこと）。
【０１４０】
例えば、本発明の薬剤は、即時、遅延、または制御放出用の錠剤、カプセル剤、オブール剤（ｏｖｕｌｅ）、エリキシル剤、溶液剤、または懸濁剤の形態で経口投与、口腔投与、または舌下投与することができ、これらは矯味剤または着色剤を含み得る。本発明の薬剤はまた、海綿体注射を通じて投与され得る。
【０１４１】
このような錠剤は、微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、およびグリシン等の賦形剤、デンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ、またはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、および特定のケイ酸錯体等の崩壊剤、ならびにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン、およびアカシア等の造粒結合剤を含み得る。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、およびタルク等の滑沢剤も含まれ得る。
【０１４２】
類似のタイプの固形組成物もまた、ゼラチンカプセルにおける増量剤として利用され得る。この点で好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、または高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁剤またはエリキシル剤においては、本発明の化合物は、様々な甘味剤または矯味剤、着色剤または色素と、乳化剤および／または懸濁剤と、ならびに希釈剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、およびグリセリンと、ならびにそれらの混合物と混合され得る。
【０１４３】
本発明の薬剤はまた、非経口投与、例えば静脈内投与、関節内投与、動脈内投与、腹腔内投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、胸骨内投与、頭蓋内投与、筋内投与、もしくは皮下投与され得るか、またはそれらは注入技術によって投与され得る。これらは、滅菌水溶液の形態で使用するのが最もよく、この溶液には他の物質、例えばその溶液を血液と等張にするための十分な塩またはグルコースが含まれ得る。必要に応じて、この水溶液は、適当に（好ましくはｐＨ３〜９に）緩衝化されるべきである。滅菌条件下での適当な非経口製剤の製造は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に行われる。
【０１４４】
非経口投与に適した製剤には、水性および非水性の滅菌注射溶液、これらには抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、およびその製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質が含まれ得る；ならびに水性および非水性の滅菌懸濁物が含まれ、これらには懸濁剤および増粘剤が含まれ得る。製剤は、単回量または複数回量用の容器、例えば密封式のアンプルおよびバイアルに収められ、使用の直前に滅菌液体担体、例えば注射用水を加えることだけを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。直接利用型の注射溶液および懸濁物は滅菌粉末、顆粒、および上記の種の錠剤から製造され得る。
【０１４５】
ヒト患者に対する経口および非経口投与においては、本発明の薬剤の一日の用量レベルは通常、成人一人あたり１〜１０００ｍｇ（すなわち約０.０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ）であり、一回または複数回の投薬により投与されるであろう。
【０１４６】
本発明の薬剤はまた鼻腔内にまたは吸入により投与することができ、乾燥粉末吸入器または適当な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ １３４Ａ３）もしくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ ２２７ＥＡ３）、二酸化炭素、もしくは他の適当なガスを用いる加圧容器、ポンプ、スプレー、またはネブライザーからのエアゾール噴霧の形態で送達されるのがよい。加圧式エアゾールの場合、単位用量は、秤量した量を送達するための弁を提供することによって決定され得る。加圧容器、ポンプ、スプレー、またはネブライザーは、例えば、エタノールおよび溶媒としての噴霧剤の混合物を用いる活性化合物の溶液または懸濁物を含み得、さらに滑沢剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンが含まれ得る。吸入器または注入器において使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチン製のもの）は、本発明の化合物および適当な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含むよう処方され得る。
【０１４７】
エアゾールまたは粉末乾燥製剤は、好ましくは、各々の秤量された用量または「一吹き（ｐｕｆｆ）」が、本発明の化合物少なくとも１ｍｇを患者への送達用に含むよう設定される。エアゾールによる全一日量は患者ごとに異なり、これらは一回投与でまたはより通常はその日の中での分割投与により投与され得ることが理解されるであろう。
【０１４８】
あるいは、本発明の薬剤は、坐剤または膣坐剤の形式で投与することができるか、またはこれらはローション剤、溶液剤、クリーム剤、軟膏剤、もしくは散布剤の形式で局所適用され得る。本発明の化合物はまた、例えば皮膚パッチの使用によって経皮投与され得る。これらはまた、眼経路によって投与され得る。
【０１４９】
眼に使用するために、本発明の薬剤は、等張性、ｐＨ調整済み、滅菌性の生理食塩水中の微粒子懸濁物または好ましくは等張性、ｐＨ調整済み、滅菌性の生理食塩水中溶液として、場合により保存剤、例えば塩化ベンジルアルコニウムと共に処方することができる。あるいは、これらは軟膏、例えばワセリンを用いて処方され得る。
【０１５０】
皮膚への局所適用のために、本発明の薬剤は、例えば以下の一つまたはそれ以上を含む混合物中に懸濁または溶解された活性化合物を含む適当な軟膏剤として処方することができる：鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ろう、および水。あるいは、これらは、例えば以下の一つまたはそれ以上の混合物中に懸濁または溶解された適当なローション剤またはクリーム剤として処方することができる：鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水。
【０１５１】
口内に局所投与するのに適した製剤には、矯味基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に有効成分を含むロゼンジ剤；不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア中に有効成分を含むトローチ剤；ならびに適当な液体担体中に有効成分を含む口内洗浄剤が含まれる。
【０１５２】
薬剤がポリペプチドの場合、徐放性薬物送達系、例えばマイクロスフィアを使用するのが好ましい場合がある。これらは特に注射の頻度を減らすよう設計される。このような系の例は、生分解性のマイクロスフィア中に組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）を被包し、注射後長時間にわたってｒｈＧＨをゆっくりと放出するＮｕｔｒｏｐｉｎ Ｄｅｐｏｔである。
【０１５３】
あるいは、本発明のポリペプチド薬剤は、必要な部位に対して直接的に薬物を放出する外科移植デバイスによって投与することができる。
【０１５４】
電気穿孔療法（ＥＰＴ）システムも、タンパク質およびポリペプチドの投与のために利用することができる。細胞に対してパルス電場を送達するデバイスは細胞膜の薬物透過性を増加させ、細胞内への薬物送達を大きく改善する。
【０１５５】
タンパク質およびポリペプチドはまた、電気導入（ＥＩ）によって送達することができる。ＥＩは、皮膚表面上の直径が３０ミクロン以下の微粒子が電気穿孔で使用されるのと同一または類似の電気パルスを受けた場合に起こる。ＥＩにより、これらの粒子は角質層を通じて皮膚深層へと誘導される。その粒子に薬物もしくは遺伝子を充填もしくはコーティングすることもできるし、または単に皮膚を通して薬物が進入できるように皮膚に孔を形成する「弾丸」として作用することができる。
【０１５６】
別のタンパク質およびポリペプチド送達方法は、温度感受性のＲｅＧｅｌの注射である。ＲｅＧｅｌは体温以下では注射可能な液体であるが、体温では直ちにゲルレザバーを形成し、徐々に腐食および溶解して公知の安全な生分解性ポリマーとなる。活性な薬物は、この生物高分子が溶解するのに伴い徐々に送達される。
【０１５７】
タンパク質薬およびポリペプチド薬はまた、経口送達することができる。一つのこのような系は、タンパク質およびポリペプチドを共送達するために体内でのビタミンＢ１２の経口摂取に関する自然プロセスを利用するものである。ビタミンＢ１２摂取系に乗ることによって、タンパク質またはポリペプチドは腸壁を通じて移動することができる。ビタミンＢ１２アナログと薬物の間で形成された複合体は、その複合体のビタミンＢ１２部分において内因子（ＩＦ）に対する有意な親和性と、その複合体の薬物部分において有意な生物活性の両方を保持する。
【０１５８】
本発明のオリゴヌクレオチド薬剤またはポリヌクレオチド薬剤を投与する方法も当該分野で周知である（Ｄａｓｓ，２００２，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５４（１）：３−２７；Ｄａｓｓ，２００１，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．８（４）：１９１−２１３；Ｌｅｂｅｄｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．５０（１）：１０１−１９；Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．５（１）：４１−５５；Ｌｙｓｉｋ ＆ Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，２００３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２００３ ２（８）：１５５９−７３；Ｄａｓｓ，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０（Ｐｔ ２）：１１３−２２；Ｍｅｄｉｎａ，２００４，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．１０（２４）：２９８１−９を参照のこと）。
【０１５９】
例えば、本発明の構築物は、レトロウイルスを利用してその構築物を細胞のゲノムに挿入する方法によって細胞に導入され得る。例えば、Ｋｕｒｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃ．ａｎｄ Ｆｕｎｃ．１６，５０３−５１０においては、精製されたレトロウイルスが投与されている。上記のポリヌクレオチドを含むレトロウイルスＤＮＡ構築物は、当該分野で周知の方法を用いて作製され得る。このような構築物から活性なレトロウイルスを生じさせるために、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養したエコトロピックなｐｓｉ２パッケージング細胞株を使用するのが通例である。細胞株のトランスフェクションは、リン酸カルシウム共沈によるのがよく、安定な形質転換体は終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるようＧ４１８を加えることによって選択する（レトロウイルス構築物がｎｅｏ^(R)遺伝子を含む場合）。独立コロニーを単離し、これを培養し、培養上清を０.４５μｍ孔径のフィルターを通じて濾過することで除去し、−７０℃で保存する。レトロウイルスを腫瘍細胞に導入する場合は、１０μｇ／ｍｌポリブレンを加えたレトロウイルス上清を直接注射するのがよい。１０ｍｍ径を超える腫瘍の場合は、レトロウイルス上清を０.１ｍｌ〜１ｍｌ；好ましくは０.５ｍｌ注射するのが適当である。
【０１６０】
あるいは、Ｃｕｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，１５５０−１５５２に記載されるように、レトロウイルスを産生する細胞が注射される。そのようにして導入されたレトロウイルス産生細胞は、レトロウイルスベクター粒子の継続的な産生がインサイチュの腫瘍塊内で行われるようそのベクターを能動的に産生するよう加工されたものである。従って、増殖性細胞は、レトロウイルスベクター産生細胞と混合された場合、インビボで首尾良く形質導入され得る。
【０１６１】
標的化されたレトロウイルスもまた本発明において使用することができる；例えば、特異的な結合親和性を付与する配列が既存のウイルスｅｎｖ遺伝子に導入され得る（これおよびその他の遺伝子療法用標的化ベクターのレビューについてはＭｉｌｌｅｒ ＆ Ｖｉｌｅ（１９９５）Ｆａｓｅｂ Ｊ．９，１９０−１９９を参照のこと）。
【０１６２】
他の方法は、その構築物を細胞に単純に送達し、限定的な時間またはゲノムへの組み込み後により長時間発現させることである。後者のアプローチの例にはリポソームが含まれる（Ｎａｅｓｓａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２，６４６−６５３）。
【０１６３】
免疫性リポソーム（ｉｍｍｕｎｏ−ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）を作製するためには、Ｍａｒｔｉｎ ＆ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，２８６−２８８の方法に従いＭＰＢ−ＰＥ（Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル］−ホスファチジルエタノールアミン）を合成する。リポソーム表面に抗体またはそのフラグメントを共有結合させるために、ＭＰＢ−ＰＥをリポソームの二重層に組み込む。例えば、本発明の薬剤（例えばＤＮＡまたはその他の遺伝子構築物）の溶液中でリポソームを形成させ、０.８ＭＰａ以下の窒素圧下で０.６μｍおよび０.２μｍ孔径のポリカーボネートメンブレンフィルターを通じて連続押出しを行うことによって、標的細胞への送達用に本発明の薬剤をリポソームに充填するのがよい。押出し後、捕捉されたＤＮＡ構築物を、８００００×ｇ、４５分間の超遠心分離によって遊離のＤＮＡ構築物から分離する。新たに作製した脱酸素緩衝液中のＭＰＢ−ＰＥ−リポソームを新たに作製した抗体（またはそのフラグメント）と混合し、窒素雰囲気下、４℃で一晩絶えず回転させながらカップリング反応を行う。免疫性リポソームは、８００００×ｇ、４５分間の超遠心分離によって非結合型の抗体から分離する。免疫性リポソームは、腹腔内にまたは腫瘍に直接注射され得る。
【０１６４】
他の送達方法には、抗体・ポリリジン架橋を通じて外来ＤＮＡを保持するアデノウイルス（Ｃｕｒｉｅｌ Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４０，１−１８を参照のこと）およびキャリアとしてのトランスフェリン・ポリカチオン複合体（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，３４１０−３４１４）が含まれる。これらの方法のうちの一番目の方法においては、ポリカチオン・抗体複合体を本発明のオリゴヌクレオチド薬剤を含むよう形成する。抗体は野生型アデノウイルスまたはその抗体に結合する新たなエピトープが導入された変異型アデノウイルスのいずれかに対して特異的なものである。ポリカチオン部分は、オリゴヌクレオチド薬剤と、そのリン酸骨格との静電気的相互作用を通じて結合する。アデノウイルスは、非修飾型の線維およびペントンタンパク質を含むので細胞内に移行し、本発明のオリゴヌクレオチド薬剤をその細胞内に運び込む。ポリカチオンがポリリジンであるのが好ましい。
【０１６５】
オリゴヌクレオチド薬剤は、例えば以下に記載されるように薬剤をアデノウイルス粒子に内包させてアデノウイルスによって送達する場合もある。
【０１６６】
別の方法においては、受容体媒介エンドサイトーシスによってＤＮＡ高分子を細胞内に運び込む高効率核酸送達系を利用する。これは、核酸に結合するポリカチオンに鉄輸送タンパク質であるトランスフェリンを結合させることによってなされる。ヒトトランスフェリンもしくはニワトリホモログのコンアルブミンまたはこれらの組み合わせを、ＤＮＡ結合性の小タンパク質であるプロタミンまたは様々なサイズのポリリジンに、ジスルフィド結合を通じて共有結合させる。これらの修飾型トランスフェリン分子は、それらの同族受容体に結合し、細胞内への効率的な鉄輸送を媒介する能力を保持している。トランスフェリン・ポリカチオン分子は、核酸サイズ（短いオリゴヌクレオチド〜２１キロ塩基対のＤＮＡ）とは独立に、本発明のＤＮＡ構築物またはその他の遺伝子構築物を含む電気泳動上安定な複合体を形成する。トランスフェリン・ポリカチオンおよび本発明のＤＮＡ構築物またはその他の遺伝子構築物の複合体を腫瘍細胞に供給した場合、細胞内でのこの構築物からの高レベルの発現が期待される。
【０１６７】
Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，６０９４−６０９８の方法によって作製された不完全または化学的に不活性なアデノウイルス粒子のエンドソーム破壊活性を用いる本発明のＤＮＡ構築物またはその他の遺伝子構築物の高効率受容体媒介送達もまた利用され得る。このアプローチは、アデノウイルスがリソソームを通さずにエンドソームからそれらのＤＮＡを放出するよう適合され、かつ例えば本発明のＤＮＡ構築物またはその他の遺伝子構築物に結合されたトランスフェリンの存在下でその構築物がアデノウイルス粒子と同じ経路で細胞に取り込まれるという事実に基づくようである。
【０１６８】
このアプローチは、複雑なレトロウイルス構築物を使用する必要がない；レトロウイルス感染によってゲノムが恒久的に改変されることがなく；かつ標的化発現系と標的化送達系の組み合わせにより、他の細胞型に対する毒性が軽減されるという利点を有する。
【０１６９】
「裸のＤＮＡ」ならびに陽イオン性および中性脂質と複合体化されたＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡを処置すべき個人の細胞に導入する上で有用であり得ることが理解されるであろう。遺伝子療法における非ウイルスアプローチは、Ｌｅｄｌｅｙ（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６，１１２９−１１４４に記載されている。
【０１７０】
別の標的化送達系、例えばＷＯ９４／１０３２３に記載される、典型的にはＤＮＡがアデノウイルスまたはアデノウイルス様粒子内で保持される修飾型アデノウイルス系もまた公知である。Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２，６６０−６６８は、線維タンパク質に細胞選択部分を追加するアデノウイルスの修飾について記載する。ｐ５３欠損ヒト腫瘍細胞において選択的に複製する変異アデノウイルス、例えばＢｉｓｃｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４，３７３−３７６に記載されるウイルスもまた、本発明の遺伝子構築物を細胞に送達するのに有用である。従って、本発明のさらなる局面は、本発明の遺伝子構築物を含むウイルスまたはウイルス様粒子を提供することであることが理解されよう。他の適当なウイルスまたはウイルス様粒子には、ＨＳＶ、ＡＡＶ、ワクシニア、およびパルボウイルスが含まれる。
【０１７１】
さらなる実施態様において、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の機能を選択的に妨げる薬剤は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７ ｍＲＮＡまたはＤＮＡを標的化して切断することのできるリボザイムである。このリボザイムを発現する遺伝子は、アンチセンス分子の場合と実質的に同じ媒体を用いて投与され得る。
【０１７２】
ここで開示されるウイルスまたはウイルス様粒子のゲノムにおいてコードされ得るリボザイムは、ＵＳ ５,１８０,８１８、ＵＳ ５,１６８,０５３、ＵＳ ５,１４９,７９６、ＵＳ ５,１１６,７４２、ＵＳ ５,０９３,２４６、およびＵＳ ４,９８７,０７１に記載されている。
【０１７３】
アンチセンス分子またはリボザイムは細胞特異的なプロモーターエレメントから発現されることが望ましい場合があることが理解されよう。
【０１７４】
本発明の製剤の特に好ましい実施態様において、製剤は、本発明の薬剤を癌細胞に標的化して送達することのできるものである。
【０１７５】
当業者はさらに、本発明の薬剤および医薬製剤が医学および獣医学の両方の分野において有用性を有することを理解するであろう。従って、本発明の薬剤は、ヒトならびに非ヒト動物（例えばウマ、イヌ、およびネコ）の両方の処置に使用され得る。しかし、好ましくは、患者はヒトである。
【０１７６】
本発明の好ましい局面を、以下の非限定的な実施例において、添付図面を参照しつつ記載する。
【実施例】
【０１７７】
実施例
実施例Ａ − 抗細菌タンパク質ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は乳癌において高度に発現されかつ上皮細胞の推定増殖因子である
導入
本実施例においては、一連の乳癌におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現パターンを調査し、腫瘍細胞においてｈＣＡＰ１８ ｍＲＮＡおよびタンパク質が顕著にアップレギュレートされるがその隣接するストローマにおいてはそうでないことを実証する。興味深いことに、最も高レベルのｈＣＡＰ１８タンパク質が最も組織学的グレードの高い腫瘍から検出され、いくつかの低グレードの腫瘍におけるｈＣＡＰ１８レベルは正常な乳房組織において検出されるレベルと同等であった。これらの知見は、抗細菌ペプチドに関して提唱されてきた抗腫瘍効果説と明らかに相反するものであるが、上皮の修復および血管新生におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の役割を示唆する最近の知見と合致する^5,10。成長促進因子としてのｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７をさらに支持するため、本発明者らは、ここで、上皮細胞の増殖が合成性の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチドによる処理およびｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現の両方によって有意に増強されることを実証する。
【０１７８】
材料および方法
組織
２８名の乳癌患者由来の凍結腫瘍組織をＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｄｅｒｙｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎから入手した（表２）。これらの腫瘍を、確立されているガイドラインに従い、Ｅｌｓｔｏｎ ａｎｄ Ｅｌｌｉｓ Ｉ〜ＩＩＩに従い等級付けを行った¹³。サイクリンＡを、増殖マーカーとして使用した（Ｎｏｖａ−Ｃａｓｔｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｕｐｏｎ Ｔｙｎｅ，ＵＫ）。エストロゲン受容体のステータスを、慣用的に処理したパラフィン切片において評価した。８名の乳癌患者および乳房除去手術（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｓｕｒｇｅｒｙ）を受けた２名の健常者由来の非病変乳房組織をコントロールとして用いた。全てのサンプルを同じ病理学者（Ｂ．Ｓ．）に試験させ、通常通りに分類した（表２）。書面によるインフォームドコンセントを全患者から得た。本研究は地方倫理委員会の承認を得て行った。
【０１７９】
ｈＣＡＰ１８のインサイチュハイブリダイゼーション
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした４３５ｂｐのｈＣＡＰ１８全長ｃＤＮＡを、［³⁵Ｓ］標識アンチセンスおよびセンスプローブのインビトロ転写に使用し、サンプル０〜１７において、基本的に記載⁸された通りにインサイチュハイブリダイゼーションを行った（表２）。
【０１８０】
免疫組織化学
サンプル０〜１７において免疫組織化学を行った（表２）。組換えｈＣＡＰ１８に対するカセリンアフィニティ精製ウサギ抗血清¹⁴を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＵＳＡ）を用いた間接的ペルオキシダーゼ法に従い、以前に記載¹⁰されたようにして１：５００希釈で使用した。染色の特異性を確認するため、以前に報告¹⁰されたようにして免疫吸着を行った。ＦＰＲＬ１受容体の検出のために、アフィニティ精製ヤギポリクローナル抗体を、関節的ペルオキシダーゼ法に従い、１：４００希釈（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で使用した。
【０１８１】
タンパク質抽出およびウェスタンブロット分析
凍結腫瘍組織１６〜６０ｍｇを、リジン緩衝液中で、電動ホモゲナイザーを用いてホモゲナイズした。腫瘍組織および細胞株由来のタンパク質を、標準的なプロトコル¹⁵に従いＳＤＳ含有サンプル緩衝液中で抽出した。そのタンパク質濃度を分光学的アッセイによって測定し、タンパク質濃度が等しくなるようＳＤＳ含有サンプル緩衝液で調整した¹⁶。ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の検出のために、その抽出物を１６.５％ Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ Ｒｅａｄｙゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で分離した。組換えカセリン¹⁷および合成ＬＬ−３７ペプチドをサイズ基準として使用した。ＥＲＫ１／２およびＦＰＲＬ１の検出のために、タンパク質を、それぞれ１２％および８％ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲルで分離した。各サンプルにほぼ等量のタンパク質がブロットされていることを確認するため、フィルターを、一次抗体とのインキュベーションの前に、３％ ＴＣＡ中３％ポンソーＳ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）で可逆的に染色した。アフィニティ精製抗カセリン抗血清¹⁷、アフィニティ精製抗ＬＬ−３７抗血清¹⁰、抗ＦＰＲＬ１抗血清（ｓｃ１８１９１，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）、およびモノクローナル抗ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を、全て１：１０００希釈で使用した。ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上での電気ブロッティングならびに一次抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）との逐次的なインキュベーションの後、増感化学発光（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）からのシグナルをＣＣＤカメラ（ＬＡＳ １０００，Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で捕捉した。
【０１８２】
ＥＬＩＳＡ
以前に記載¹⁷されたサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、正常な乳腺および腫瘍組織由来のタンパク質抽出物中のｈＣＡＰ１８を定量した。
【０１８３】
リアルタイムＰＣＲによるｈＣＡＰ１８の発現分析
４つの正常サンプルおよび４つの腫瘍からＲＮＡをＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキット（Ｏｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出し、第一鎖合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を用いて逆転写した。ＲＮＡを、標準的なプロトコルに従いｃＤＮＡ １０ｎｇを用いてＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるリアルタイムＰＣＲにより定量した。サンプルは三連で評価した。配列は、プライマーについては５'−ＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡＡ−３'［配列番号２］および５'−ＴＴＧＡＧＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣＣＡＴＡ−３'［配列番号３］であり、蛍光プローブについては６−ＦＡＭ−５'−ＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＴＴ−３'−ＢＨＱ１［配列番号４］であった。サンプルは１８Ｓ−ＲＮＡの定量によって正規化した（Ａｓｓａｙ ｏｎ Ｄｅｍａｎｄ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。正常サンプルの平均発現値を裁量で１に設定した。
【０１８４】
合成ＬＬ−３７ペプチド
ＬＬ−３７ペプチドを合成し、ＨＰＬＣにより純度９８％まで精製した（ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ａ／Ｓ，Ｈｉｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。このペプチドの生物学的活性は抗細菌アッセイ¹⁸において確認した。
【０１８５】
上皮細胞のＬＬ−３７ペプチド処理
自然不死化型ヒトケラチノサイト細胞株（ＨａＣａｔ）¹⁹を、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清、Ｈｙ−Ｃｌｏｎｅ，Ｂｏｕｌｅ Ｎｏｒｄｉｃ ＡＢ Ｈｕｄｄｉｎｇｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）および抗生物質（ＰＥＳＴ＝ペニシリン５０Ｕ／ｌおよびストレプトマイシン５０ｍｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）中で培養した。細胞を７０％コンフルエンスで回収し、９６ウェルプレートに１００μｌ培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳおよびＰＥＳＴ）中に２０００細胞となるよう播種した。１２時間後、培地を無血清培地（ＤＭＥＭ＋ＰＥＳＴ）に交換し、７２時間の血清飢餓によって細胞をＧ０／Ｇ１で同調させ、次いで合成性の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチドを１０μｇ／ｍｌ含有する培地（ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ＋ＰＥＳＴ）１００μｌで処理した。ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳおよびＰＥＳＴのみで処理した細胞をコントロールとして用いた。この実験を四連で行った。細胞増殖は、［³Ｈ］チミジン取り込みによって評価した。細胞を、［³Ｈ］チミジン（２０.００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ） １μＣｉ／ウェルで１２時間処理し、ガラス繊維フィルター（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）に回収した（Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ ９６，Ｔｏｍｔｅｃ，Ｏｒａｇｅ，ＣＴ）。［³Ｈ］チミジンの取り込みを、液体シンチレーションカウンター（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｐｌｕｓｓ，Ｗａｌｌａｃ Ｓｖｅｒｉｇｅｓ ＡＢ）を用いて測定した。この実験を６連で二回繰り返した。
【０１８６】
ＨＥＫ２９３およびＨａＣａＴ細胞におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現
１６ｂｐの５’非翻訳領域を含む全長コード配列を含むＩｍａｇｅクローン３０５７９３１²⁰由来のＢｆａ１フラグメントを、バイシストロン性ベクターｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＳｍａ１部位にサブクローニングした。ＨＥＫ２９３およびＨａＣａＴ細胞を標準的な条件下でＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてトランスフェクトし、二週間の間、４００ｎｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）によって選別した。細胞を、Ｓｕｍｍｉｔ（商標）データ分析ソフトウェアを用いてＭｏＦｌｏ（登録商標）高速細胞ソーティングフローサイトメーター（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）によってＥＧＦＰ発現についてソーティングし、それらのＣＡＰ１８発現を免疫ブロッティングによって定量した。コントロール細胞株は、ＥＧＦＰのみを発現するベクターを用いたトランスフェクションによって同様に構築した。これらの細胞株は、数ヶ月間の非選択下での連続培養の間、安定的なＣＡＰ１８発現を維持した。本実験は３０連で二回繰り返した。
【０１８７】
ｈＣＡＰ１８で安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３およびＨａＣａＴ細胞の増殖アッセイ
ｈＣＡＰ１８でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を７０％コンフルエンスで回収し、２４ウェルプレートに播種した。２４時間後に培地を交換し、細胞を５％ＦＣＳおよびＰＥＳＴを補充した培地（Ｏｐｔｉｍｅｍ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）２ｍｌ中で培養した。細胞を６日目に回収し、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）によって計数した。細胞の生存性をトリパンブルーによって測定したところ、全ての条件下で細胞の５％未満がトリパンブルー陽性であった。全ての条件を三連で行った。ＥＧＦＰのみを発現するベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をコントロールとして用いた。
【０１８８】
ｈＣＡＰ１８でトランスフェクトしたＨａＣａｔ細胞を７０％コンフルエンスで回収し、９６ウェルプレート中の１０％ＦＣＳ＋ＰＥＳＴ含有ＤＭＥＭ中に、ウェルあたり２０００細胞となるよう播種した。１２時間後に培地を、５％ＦＣＳ＋ＰＥＳＴを補充したＤＭＥＭに交換した。２４時間の培養後、細胞を、上記の通り、［³Ｈ］チミジン １μＣｉ／ウェルで１２時間処理し、回収し、分析した。ＥＧＦＰのみを発現するベクターでトランスフェクトしたＨａＣａＴ細胞をコントロールとして用いた。
【０１８９】
ＦＰＲＬ１の発現分析
ＨａＣａＴ細胞からＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、第一鎖合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて逆転写した。ＦＰＲＬ１ ＲＮＡを、上記の通り、リアルタイムＰＣＲにより定量し、１８Ｓ−ＲＮＡに対して正規化した。配列は、プライマーについては５'−ＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＴＣＴＧＣ−３'［配列番号２］および５'−ＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧ−３'［配列番号３］、蛍光プローブについては６−ＦＡＭ−５'−ＣＣＣＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＡＧＧＡ−３'−ＢＨＱ１［配列番号４］であった。
【０１９０】
百日咳毒素アッセイ
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７により誘導される上皮細胞の増殖刺激の媒介にＦＰＲＬ１が関与するかを評価するため、ＨａＣａＴ細胞をＧタンパク質共役受容体阻害剤である百日咳毒素で処理した。細胞を、百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と共に事前インキュベートし、２４時間後に毒素終濃度２０ｎｇ／ｍｌ下でＬＬ−３７処理を行った。培地を細胞播種の４８時間後に交換し、ＨａＣａＴ細胞を、合成性の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチドを１ｍｌあたり５または１０μｇ含む培地（ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳおよびＰＥＳＴ）それぞれ１００μｌで処理した。ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳおよびＰＥＳＴのみで処理した細胞をコントロールとして用いた。
【０１９１】
ＬＬ−３７処理したＨａＣａＴ細胞におけるリン酸化型ＥＲＫ１／２のアッセイ
ＨａＣａＴ細胞を１０％コンフルエンスで播種し、０.２％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中で３６時間維持した。さらに４８時間、細胞を１％または５％ＦＣＳをそれぞれ含有するＤＭＥＭ中、ＬＬ−３７ １０μｇ／ｍｌの存在下または非存在下で、毎日培地を交換しながら培養した。ＥＧＦ １０ｎｇ／ｍｌをポジティブコントロールとして用いた。リン酸化型ＥＲＫ１／２の発現は、マウスモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いるウェスタンブロット分析によって評価した。
【０１９２】
統計分析
値は平均細胞数またはカウント／毎分（ＣＰＭ）プラスマイナスＳＤで表す。グループ間の比較は、両側ｔ検定によって分析した。結果は、Ｐ値＜０.０５で統計学的に有意であるとみなした。腫瘍における発現の分析については、片側ｔ検定を有意水準＜０.０５でｈＣＡＰ１８タンパク質レベルについて行った。
【０１９３】
結果
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は乳癌において発現される
患者の詳細を表２に記載する。
【０１９４】
インサイチュハイブリダイゼーションによって、健常者コントロール由来の乳房組織（図１）および非病変乳癌（示さず）においてｈＣＡＰ１８ ｍＲＮＡの小さなシグナル（示さず）およびｈＣＡＰ１８タンパク質の弱い免疫反応が見られた。全ての乳癌組織は、腫瘍細胞においてｈＣＡＰ１８に対する免疫反応を示したが、ストローマにおいては示さなかった（図１ａ、ｃ、ｄ）。腫瘍細胞集団はｈＣＡＰ１８の免疫反応性に関しては均質でなく、強陽性細胞が、検出可能なｈＣＡＰ１８を欠く細胞近辺で見出された（図１ｃ）。カセリン組換えタンパク質による免疫吸着は、ｈＣＡＰ１８の免疫反応を消滅させた（図１ｅ、ｆ）。インサイチュハイブリダイゼーションにより、ｈＣＡＰ１８ ｍＲＮＡに対する陽性シグナルが同じ領域において検出され、免疫組織化学により得られた発現パターンと強く一致した（図１ｂ）。シグナル強度は同じではなく、グレードの高い腫瘍で最も強かった。センスｈＣＡＰ１８ ｃＲＮＡプローブとハイブリダイズさせたコントロール切片は、ｈＣＡＰ１８ ｍＲＮＡに対する特異的なシグナルを生じなかった（示さず）。
【０１９５】
ＥＬＩＳＡによる乳癌組織抽出物中のｈＣＡＰ１８タンパク質の定量は、Ｅｌｓｔｏｎ ＩグレードとＩＩグレードの腫瘍の間では相違ないが、悪性度が最も高い腫瘍においてはｈＣＡＰ１８レベルがはっきりと高いことを明らかにした（表２）。Ｅｌｓｔｏｎ ＩＩＩグレードの腫瘍と残りの腫瘍との間の差は統計学的に有意であった（ｐ＜０.０１）。１３のグレードＩＩＩ腫瘍のうちの１０が５ｎｇ／ｍｇ総タンパク質のｈＣＡＰ１８濃度に達したまたはそれを超過した。残りの１８の腫瘍サンプルではわずか２つしかこのレベルに到達しなかった。アッセイした健常な乳房組織のうちの４検体もまた、Ｅｌｓｔｏｎ ＩまたはＩＩ腫瘍と同様のレベルに到達した。ＥＬＩＳＡによって得られた発現パターンを検証するため、本発明者らは４の正常サンプルおよび４の腫瘍に対してリアルタイムＰＣＲを行った。転写物の定量の結果は、タンパク質の発現に関するデータと合致するものであった（表２）。
【０１９６】
免疫ブロッティングによって、調査した全ての腫瘍および正常な乳房組織が、インタクトな未プロセシング型の１８ｋＤａホロタンパクに対応する免疫反応バンドを示した（図２）。５つの調査したグレードＩＩＩ腫瘍（表２、サンプル６〜１０）のうちの４つにおいて、本発明者らはプロセシング型ｈＣＡＰ１８タンパク質であるＬＬ−３７に対応するバンドも検出した（図２）。使用した抗血清は、ｈＣＡＰ１８ホロタンパクに対して惹起されたものであり、カセリンペプチドに対してアフィニティ精製されたものである¹⁰にもかかわらず、高濃度のＬＬ−３７を検出した。
【０１９７】
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は上皮細胞の増殖を亢進する。
ｈＣＡＰ１８（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）発現ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３およびＨａＣａＴ細胞は、ＥＧＦＰのみを発現するベクター（Ｅ）でトランスフェクトしたコントロール細胞よりも有意に高い増殖率を示した（図３ＡおよびＢ）。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３およびＨａＣａＴ細胞由来のタンパク質抽出物の免疫ブロッティングによって、本発明者らは、これらのｈＣＡＰ１８ベクター含有細胞がホロタンパクを産生し（図３ＡおよびＢ）、ＬＬ−３７に対応する４ｋＤの免疫反応バンドが細胞培地中で検出される（データは示さず）ことを確認した。さらに、５％ウシ胎仔血清下で培養し１０μｇ／ｍｌの合成性の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチドで処理したＨａＣａｔ細胞は、有意な細胞増殖の亢進を示した（図４）。
【０１９８】
【表４】

【０１９９】
【表５】

【０２００】
ＬＬ−３７受容体ＦＰＲＬ１は乳癌において発現される
Ｇタンパク質共役受容体ＦＰＲＬ１は、真核生物細胞におけるＬＬ−３７により誘導される効果を媒介することが示されており^4,5、本実験の設定下でのその潜在的役割を評価するため、本発明者らは乳房組織におけるＦＰＲＬ１タンパク質の発現を調査し、乳癌細胞および正常な腺上皮の両方においてＦＰＲＬ１に対する強い免疫反応を確認した（図５ａ、ｂ）。免疫ブロッティングは、ＦＰＲＬ１が両方の組織で発現されることを確認した（図５ｃ）。さらに、ｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現は、ＨａＣａＴ細胞におけるＦＰＲＬ１ ｍＲＮＡの発現を有意に増加させ（図５ｄ）、これによりｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のシグナル伝達におけるＦＰＲＬ１の関与がさらに支持された。しかし、百日咳毒素によるＨａＣａＴ細胞の事前処理はこれらの細胞の増殖を排除せず、およそ５０％抑制し（示さず）、これによりＦＰＲＬ１がこれらの細胞におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の成長刺激効果の媒介に関与する唯一の存在ではないことが示された。上皮細胞の増殖の活性化におけるＥＲＫ１／２の関与の可能性を試験するため、本発明者らはＨａＣａＴ細胞を合成性の生物学的に活性なＬＬ−３７で処理したがＥＲＫ１／２の有意な活性化は見られず、これによりＥＧＦＲがＨａＣａＴ細胞の増殖に対するＬＬ−３７の刺激効果の媒介に関与しないことが示された。
【０２０１】
考察
本研究において、本発明者らは、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７が正常な乳腺上皮において構成的に産生されることを実証した。このことは、ヒトにおける抗細菌バリアによる保護におけるＬＬ−３７の役割と合致し、ＬＬ−３７の低い構成的発現が正常な静穏状態の上皮において見られ、それに対して顕著な発現が傷害および炎症に関連して見られるという以前の報告^7-10に沿うものである。抗細菌ペプチドの構成的発現は、汗腺におけるヒトカセリシジンＬＬ−３７、マウス唾液腺におけるカセリシジンＣＲＡＭＰ、およびヒト唾液腺におけるベータ−ディフェンシンのように、これまでに様々な外分泌腺において検出されている^21-23。乳腺におけるヒトベータ−ディフェンシン２（ｈＢＤ−２） ｍＲＮＡの発現は１９９８年にＢａｌｓらによって報告され、最近他のグループが授乳期でない女性の乳腺組織ならびに授乳期の乳房組織および母乳において構成的なｈＢＤ−１の発現を見出した^24-26。
【０２０２】
興味深いことに、ｈＣＡＰ１８の産生は、グレードの高い腫瘍の乳房上皮において、正常な乳房上皮またはグレードの低い腫瘍と比較して最も顕著に増加した。しかし、ｈＣＡＰ１８の発現は、普遍的でも均一でもない、すなわち全ての癌細胞がｈＣＡＰ１８陽性というわけではないが、明らかに陽性の細胞が検出可能なｈＣＡＰ ｍＲＮＡおよびタンパク質を欠く細胞の近辺で見出され（図１ｃ）、その発現の程度は全ての腫瘍タイプにおいて細胞間で大きく異なるものであった。このことは、腎細胞癌におけるヒトアルファディフェンシンに関して示唆されているような²⁷、複雑であるが厳密な制御下にあるｈＣＡＰ１８の調節を反映していると考えられる。
【０２０３】
本発明者らの研究において、最も高いｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７レベルが、最も高い組織学的グレードを有する腫瘍から検出された。高いグレードの腫瘍と低いグレードおよび正常な乳房組織の間のｈＣＡＰ１８発現の差は統計学的に有意であるが、緊密な相関関係は認められていない。全てのグループの中には、健常サンプルのレベルでｈＣＡＰ１８を発現する腫瘍が存在し、グレードＩ腫瘍のうちの二つは、それ以外ではグレードＩＩＩ腫瘍でのみ観察される比較的高い発現を示した。しかし、サンプル数の限界を考慮すれば、本発明者らの観察は、悪性の程度とｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現の間の潜在的相関関係を示唆するものと言える。乳癌におけるｈＣＡＰ１８の過剰発現はｈＣＡＰ１８の調節に影響する細胞内経路における欠陥に起因するものかもしれず、ｈＣＡＰ１８の発現は腫瘍に成長する上での優位性を提供するものではなくこれらの変化を反映するものであると反論する者もいるかもしれない。しかし、本明細書中に記載されるインビトロ研究と併せて考慮すれば、本発明者らはこれらのデータが腫瘍の成長の促進におけるＬＬ−３７の潜在的役割を指摘するものであると考える。
【０２０４】
高いｈＢＤ−２タンパク質濃度ならびにヒトアルファ−およびベータ−ディフェンシンの両方に対する顕著な免疫反応が様々な口腔癌において見出されており、これらの抗細菌ペプチドのレベルの上昇が感染および／またはサイトカインによる刺激の結果であり得ることが示唆されている^28-30。他の研究は、昆虫から単離された抗細菌ペプチド、例えばメリチンおよびセクロピン関連ペプチドが哺乳動物の腫瘍細胞に対して抗腫瘍効果を発揮することを提唱している^31-34。さらに、ヒト膀胱癌細胞株へのセクロピンおよびメリチンのコード配列のベクター媒介送達およびそれらの発現は、ヌードマウスにおいて腫瘍原性を抑制した¹¹。同様に、ブタカセリシジンＰＲ−３９のトランスジェニック発現は、ヒト肝細胞癌の浸潤能を低下させた¹²。
【０２０５】
抗細菌ペプチドの多機能的役割は徐々に明らかになりつつある。直接的な膜効果を通じた病原体不活性化に加えて、ＬＬ−３７はインビボで走化性効果を発揮し、ヒト好中球、単球、Ｔ細胞サブセット、およびマスト細胞の移動を誘導する^4,35,36。この走化活性は、百日咳毒素感受性の膜結合型Ｇタンパク質共役受容体であるＦＰＲＬ１に対するＬＬ−３７の結合に依存する⁴。ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７について示唆されているさらなる機能には、皮膚の創傷部の再上皮形成および新血管新生を促進することによる上皮の修復および血管新生における役割が含まれる^5,10。
【０２０６】
従って、本明細書に示される乳癌細胞における顕著なｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現は、これらの腫瘍細胞の成長上の優位性を反映するものである。この学説を試験するため、本発明者らはｈＣＡＰ１８発現ベクターでヒト上皮細胞株ＨＥＫ２９３およびＨａＣａＴをトランスフェクトし、トランスフェクト細胞の増殖の有意な増加を確認した。さらに、合成性の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチドは、ＨａＣａＴ細胞の増殖を有意に増加させた。これらの知見は、抗細菌ペプチドについて提唱されている抗腫瘍効果と明確に相反するものであるが、ヒトアルファディフェンシンが腎細胞癌（ＲＣＣ）の進行を調節する可能性があるとするＭｕｅｌｌｅｒらによる最近の知見と合致する。これらのディフェンシンは、ＲＣＣの腫瘍細胞および正常な腎臓の尿細管上皮において見出され、生理学的濃度で腫瘍細胞の増殖を刺激した²⁷。
【０２０７】
本発明者らのインビトロ研究は、ＬＬ−３７が、部分的にＦＰＲＬ１を通じて、上皮細胞の増殖を刺激することを示唆している。百日咳毒素によるこの受容体のブロックが外因性のＬＬ−３７の増殖効果をおよそ５０％低下させるからであり、このことはおそらく他の受容体の関与も示しているからである。最近の研究で、ＬＬ−３７が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のトランス活性化を通じたマイトジェン活性化プロテインキナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ＝ＭＥＫ）の活性化により気道上皮細胞を活性化することが示唆された³⁷。
【０２０８】
結論としては、本明細書中に示される結果はＬＬ−３７が腫瘍の成長を促進することを示しているということである。
【０２０９】
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３６．Ｎｉｙｏｎｓａｂａ Ｆ，Ｉｗａｂｕｃｈｉ Ｋ，Ｓｏｍｅｙａ Ａ，Ｈｉｒａｔａ Ｍ，Ｍａｔｓｕｄａ Ｈ，Ｏｇａｗａ Ｈ，Ｎａｇａｏｋａ Ｉ．Ａ ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ＬＬ−３７ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２；１０６：２０−６．
３７．Ｔｊａｂｒｉｎｇａ ＧＳ，Ａａｒｂｉｏｕ Ｊ，Ｎｉｎａｂｅｒ ＤＫ，Ｄｒｉｊｆｈｏｕｔ ＪＷ，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ＯＥ，Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ Ｎ，Ｒａｂｅ ＫＦ，Ｈｉｅｍｓｔｒａ ＰＳ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ＬＬ−３７ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｔ ｔｈｅ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｙ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；１７１：６６９０−６．
【０２１０】
実施例Ｂ − エストロゲン受容体（ＥＲ）およびリンパ節（Ｎ）陽性乳房腫瘍におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の発現増加
材料および方法
ＲＮＡを、１４０の乳房腫瘍および４の非病変乳房組織サンプルから抽出し、プライマーとしてランダムヘキサマーを用いて逆転写した。ｈＣＡＰ１８転写物の発現は、（上記の）標準的なプロトコルに従いｃＤＮＡ １０ｎｇを用いるリアルタイムＰＣＲにより測定した。
結果および考察
結果を図６に示す。非病変サンプルの平均発現値を裁量で１に設定した。平均および偏差はＡｎｏｖａ統計法によって評価した。
ｈＣＡＰ１８の発現は、リンパ節が形成されたＥＲ陽性腫瘍において、リンパ節を有さないものよりも有意に（約５倍）高かった。
【０２１１】
実施例Ｃ − ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７活性を阻害する薬剤の同定
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の腫瘍の進行への寄与の様々な局面、すなわち周知のシグナル伝達経路の誘導、細胞増殖の刺激およびアポトーシスの抑制、コロニー成長および足場非依存的成長の刺激、基底膜を通じた浸潤の刺激、最後にマウスにおける腫瘍の成長および転移形成の増強を実証するために、多くの確立されたインビトロおよびインビボアッセイを使用することができる。
これまでに原発性ケラチノサイトおよび上皮細胞株におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７から得られた上記の特徴はまた、乳癌細胞株においても実証することができる。適当な標的細胞株は、ｈＣＡＰ１８を発現しない悪性度の低いエストロゲン受容体陽性細胞株ＭＣＦ−７である。上記の局面を調査するため、組換えプラスミドからｈＣＡＰ１８を発現するＭＣＦ−７の亜株を樹立した。ｈＣＡＰ１８タンパク質のオートクリン活性とＬＬ−３７のパラクリン活性は異なるものなので、実験の性質上許容される場合は、インビトロアッセイを、細胞内での内因的産生の代わりに、ＬＬ−３７の外因的添加によっても行われる。
【０２１２】
上記の実験は、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の腫瘍形成能全体を評価するものであるが、抗ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７活性を有する薬剤によるこれらの効果の阻害を実証するためにさらなる実験を行うことができる。例えば、合成された活性なタンパク質ＬＬ−３７は、抗体による阻害のための標的とみなすことができる。さらに、このタンパク質の産生は、プロモーターのブロックを通じてｈＣＡＰ１８遺伝子の転写を阻害することによっておよびＲＮＡ干渉による転写物の転写後ダウンレギュレーションによって妨害することができる。
【０２１３】
従って、作用のメカニズムおよび標的を実証するためインビトロで、および体内での効果を実証するためマウス内の腫瘍においてインビボでの両方で実験が行われ得る。このようなインビトロ実験は、上記のＭＣＦ−７亜株において行われ得る。ｈＣＡＰ１８遺伝子の調節実験については、ｈＣＡＰ１８を低度であるが明確に検出できるレベルで発現する乳癌細胞株ＺＲ７５−ｌが使用される。
【０２１４】
以下に記載する実験においては、そうでないことが明記されない限り、以下の条件を使用した：細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させた。トランスジェニック株用の培地は、トランスジーンを維持するために、１５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンおよび４００μｇ／ｍｌジェネティシンを含有するものとした。３日未満継続する実験については、細胞を使用する２４時間前に抗生物質を取り除き、ウシ胎仔血清の濃度を、各々の特定の実験に必要な濃度に調整した。ＬＬ−３７は２μＭの濃度で添加した。
【０２１５】
細胞増殖の刺激（Ｈｅｉｌｂｏｒｎ ２００５を参照のこと）
トランスジェニック細胞株および細胞株を７０％コンフルエンスで回収し、９６ウェルプレートの１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中に、ウェルあたり２０００個になるよう播種した。２４時間後、培地を、ＬＬ−３７を添加したまたは添加しない、５％ＦＣＳ含有培地に交換した。２４時間の培養後、細胞を１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジン、２０Ｃｉ／ｍｍｏｌで１２時間処理し、ガラス繊維フィルター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）上に回収した（Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ ９６；Ｔｏｍｔｅｃ，Ｏｒａｇｅ，ＣＴ）。［３Ｈ］チミジンの取り込みを、液体シンチレーションカウンター（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｐｌｕｓ，Ｗａｌｌａｃ）を用いて測定した。本実験の統計学的有意性を確認するため、各条件／細胞株につき２４のウェルを使用した。
【０２１６】
細胞成長アッセイ（Ｌｕ ２００５，Ｌｕｄｅｓ−Ｍｅｙｅｒｓ ２００２を参照のこと）
このアッセイは、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７による細胞増殖の刺激を決定するため、［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイの補足として行った。ＭＣＦ−７亜株を、各時点につき三連で、５０細胞／ｍｍ²（６ウェルプレートにおよそ５００００細胞／ウェル）の密度になるようプレーティングした。総細胞数を血球計数器で２日毎に計数した。細胞の生存性をトリパンブルーを用いて評価した。
【０２１７】
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７によるアポトーシスの阻害
アポトーシスの誘導ために、細胞を、５％ＦＣＳを含む６ウェルプレート培地に２５０００細胞／ウェルとなるよう播種し、６μＭのトポイソメラーゼＩ阻害剤カンプトテシン（ＣＡＭ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｕｉｓ，ＭＯ）で２４時間処理した。
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７によるアポトーシスの抑制を確認するため、二つのアポトーシスパラメータ、ＤＮＡ含有量およびカスパーゼ−３活性を評価した。全ての実験は、統計学的有意性を確保するため、６回行った。
【０２１８】
フローサイトメトリーによるＤＮＡ含有量の分析（Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ ２００５を参照のこと）
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）／ＲＮａｓｅ染色緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）をこの分析に使用した。トリプシン処理した細胞を冷やした７０％（Ｖ／Ｖ）エタノール中で固定し、使用するまで４℃で保存した。ＤＮＡ含有量は、ＤＮＡへのＰＩの取り込みを通じて測定した。蛍光分析はＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。粒子のＦＣＳ（前方散乱光）およびＳＳＣ（側方散乱光）を同時に測定し、細胞のサイズおよび粒度を測定した。ＰＩで染色された核の赤色蛍光をＦＬ−４ウィンドウ（６００ｎｍバンドパスフィルターおよび３５ｎｍバンド幅）で検出した。蛍光強度は細胞のＤＮＡ含有量に比例する。各ヒストグラムを２つの部分：（１）非同調性、非アポトーシス性の生存細胞（２Ｎ〜４Ｎに相当するＤＮＡ含有量を有するＧ１、Ｓ、およびＧ２期の細胞）を表すＭ１領域；ならびに（２）生存細胞よりもＤＮＡの量が少ないアポトーシス細胞を表すＭ２領域、に分けた。
【０２１９】
カスパーゼ−３活性アッセイ
カスパーゼ−３酵素活性は、蛍光基質ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ（１００μＭ）およびＤＥＶＤ−ＡＭＣ（５０μＭ）を用いて測定した。細胞溶解産物を反応緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％スクロース、５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１０〜６％ ＮＰ−４０、および０.１％ ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７.２５）中に集め、これをマイクロタイタープレートに移した。蛍光発生基質の切断は、Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ ＩＩプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）においてＡＭＢの遊離により観察した。蛍光単位を、遊離のＡＭＣから作成した標準曲線を用いてＡＭＣのｐｍｏｌに変換した。データは線形回帰法により分析した。
【０２２０】
コロニー形成アッセイ（Ｌｕｄｅｓ−Ｍｅｙｅｒｓ ２００２，Ｗａｎｇ ２００５を参照のこと）
このアッセイは、細胞が、支持体となる周辺細胞の非存在下で持続的に増殖する能力を測定するために使用した。この特性は、細胞が腫瘍を形成する能力を反映するものと考えられている。
トランスジェニック細胞をサブコンフルエント状態で維持し、最大７０％コンフルエンスでトリプシン処理し、次いで５、１０、および２５細胞／ｍｌ増殖培地の濃度まで希釈した。細胞を３〜７日間増殖させ（基本的には３〜４回の倍加に十分な時間）、コロニーあたりの細胞数を計測した。組換えプラスミドから緑色蛍光タンパク質を発現させる場合は、細胞およびコロニーを蛍光顕微鏡下で計数することができる。コロニー形成の結果をコロニー毎の蛍光細胞の分布として表し、ウイルコクソンの順位和検定を用いて培地中のＬＬ−３７の存在下および非存在下での異なるトランスジェニック株間の分布を比較した。ＭＣＦ−７細胞はβ−エストロゲンのみの存在下で腫瘍を形成することが知られているので、トランスジェニック細胞の成長に対する１〜５ｎＭエストロゲンの効果をアッセイすることができる。
【０２２１】
足場非依存的増殖アッセイ（Ｆｉｕｃｃｉ ２００２を参照のこと）
このアッセイは、細胞が転移を形成する能力を反映するものである。細胞を、３００ｕ／ｍｌトリプシン、２０ｕ／ｍｌエラスターゼ、および１ｍＭ ＥＤＴＡの混合物による処理により調製した。エラスターゼの存在は、細胞が単細胞懸濁物に分散するのを促す。細胞を増殖培地中に懸濁し、溶融した０.７％Ｓｅａｐｌａｑｕｅ低融解温度アガロースを含有する増殖培地と１：１混合し、終濃度５００細胞／ｍｌおよび０.３５％アガロースとした。この混合物１ｍｌを、６ウェルプレート中、固体培地／０.６％アガロースの２ｍｌ層の上からプレーティングした。この細胞に、３〜４日毎に、増殖培地１００μｌを与えた。２週間後、培養物の上層を０.２％ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（Ｓｉｇｍａ）で染色し、１００μＭ径よりも大きなコロニーを計数した。このアッセイは三連で行い、これを二回繰り返した。
【０２２２】
浸潤の誘導（Ｆｉｕｃｃｉ ２００２を参照のこと）
マトリゲルは基底膜とみなされ、ＥＨＳ肉腫から製造される。マトリゲルは基底膜成分（コラーゲン、ラミニン、およびプロテオグリカン）だけでなく、マトリクス分解酵素／それらの阻害剤および増殖因子も含有する。腫瘍細胞のマトリゲルへの浸潤は、腫瘍の進行において役割を果たす細胞外マトリクス受容体およびマトリクス分解酵素の関与を特徴付けるために使用されている。
【０２２３】
マトリゲルを冷やした無血清増殖培地で２ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌを２４ウェルのトランスウェルの上チャンバにプレーティングし、ゲル化のために３７℃で一晩インキュベートした。細胞を回収し、１％ＦＣＳを含有する培地中に１０６／ｍｌの密度になるよう懸濁した。マトリゲルを暖めた無血清培地で洗浄した後、細胞懸濁物１００μｌを上チャンバにプレーティングした。下チャンバを、化学誘引物質として馴らし培地を含有する増殖培地６００μｌで満たした。このチャンバを細胞インキュベーター中で６時間〜２４時間インキュベートした。トランスウェルを染色し（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ染色液、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、非浸潤細胞を綿棒でかき取った後、浸潤細胞を光学顕微鏡下で計数した。
【０２２４】
ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍の増殖（Ｗａｎｇ ２００５ Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ ２００５を参照のこと）
サブコンフルエントに培養した細胞を回収し、冷やしたＰＢＳに２.５×１０７細胞／ｍｌとなるよう懸濁した。その一部２００μｌを、４〜６週齢の雌のＳＣＩＤマウスの脂肪体または尾静脈に皮下注射した。ＭＣＦ−７細胞の腫瘍形成は一般的にエストロゲンに依存するので、６０日間にわたってβ−エストラジオールを一日あたり１.７ｍｇ放出するペレットを皮下移植した。このマウスを週に二回触診し、最初の触診可能な腫瘍が生じた日時を記録した。腫瘍の増殖はマニュアルで観察し、遅くとも腫瘍の直径が１ｃｍになるまでにマウスを屠殺した。腫瘍の数、サイズ、分布を記録した。マウスを切開することによって小さな転移を検出し、組換えプラスミドから発現されたＧＦＰからの蛍光を誘導するためこれをスキャンした。さらに、脾臓および肝臓をコラーゲン処理し、単細胞懸濁物をＦＡＣＳソーターにおいて評価し、蛍光細胞の数を測定した。
【０２２５】
ｈＣＡＰ１８転写アンタゴニストを用いる阻害研究（Ａｇａｒｗａｌ １９９８，Ａｎｄｅｌａ ２００４，Ｔｏｅｌｌ ２００１，Ｉｓｈｉｚｕｋａ ２００５，Ｗｅｂｅｒ ２００５を参照のこと）
現在知られているｈＣＡＰ１８転写の最強の誘導因子はビタミンＤである。ビタミンＤ受容体は、ｈＣＡＰ１８プロモーターの応答エレメントに結合することによってｈＣＡＰ１８転写を直接活性化する。このような小さな分子がｈＣＡＰ１８の発現を制御することができるのであるから、阻害性化合物を体系的にスクリーニングするのも有意義である。初期研究は、エストロゲンおよびその代謝産物のいくつかが効果を有さないことを示した。ビタミンＡは皮膚のケラチノサイトにおける転写を阻害するが、乳癌細胞株ＺＲ−７５−１における転写を刺激する。これらの知見に基づけば、ビタミンＤアンタゴニスト、例えばＺＫ１５９２２２（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）およびＴＥＩ−９６４７（Ｔｅｊｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｔｏｋｙｏ）、ならびにビタミンＡアンタゴニスト、例えばＡＧＮ１９３１０９（Ａｌｌｅｒｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が、本発明の方法において使用するための薬剤候補となる。
【０２２６】
ｈＣＡＰ１８転写阻害剤のスクリーニング（Ｗｅｂｅｒ ２００５を参照のこと）
ＺＲ７５−１細胞を２５％コンフルエンスでプレーティングし、イソプロパノールまたはＤＭＳＯ中に１００μＭとなるよう溶解させた阻害剤候補、終濃度１００ｎＭで処理した。２４時間後、ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキット（Ｏｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出し、第一鎖合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を用いて逆転写した。ＲＮＡは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて標準的なプロトコルに従いｃＤＮＡ ５ｎｇを用いるリアルタイムＰＣＲにより定量した。サンプルは三連で評価した。配列は、プライマーについては５'−ＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡＡ−３'［配列番号２］および５'−ＴＴＧＡＧＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＣＣＣＡＴＡ−３'［配列番号３］であり、蛍光プローブについては６−ＦＡＭ−５'−ＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＴＴ−３'−ＢＨＱ１［配列番号４］であった。サンプルは１８Ｓ−ＲＮＡ（Ａｓｓａｙ ｏｎ Ｄｅｍａｎｄ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の定量により正規化した。
【０２２７】
阻害の調節機構を調査するため、プロモーターの活性を、ｈＣＡＰ１８プロモーターがルシフェラーゼレポーター遺伝子を制御する組換えプラスミドを使用することによって測定した。ＺＲ７５−１細胞を２５％コンフルエンスで６ウェルプレートにプレーティングし、ウェルあたり、ｊｅｔＰＥＩ（ｑＢｉｏｇｅｎｅ）６μｌと複合体化させたレポータープラスミド３μｇを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションから１４時間後、阻害剤を上記の通りに添加した。２４時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。この活性を、共トランスフェクトしたプラスミド（ｐＥＦ１／ｌａｃＺ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２００ｎｇから発現されたβ−ガラクトシダーゼに対して正規化した。各実験を少なくとも二度、各アッセイにつき三連で行った。
【０２２８】
転写後阻害研究（Ｗａｎｇ ２００５，Ｚｈａｎｇ ２００５，Ｒｏｈ ２０００を参照のこと）
現時点で最も有効な転写後阻害はＲＮＡ干渉であり、これは標的ｍＲＮＡの配列特異的、触媒的分解を誘導することを基礎とするものである。転写物中の最も有効な標的部位は、最も簡単な手法では、低分子干渉ＲＮＡをトランスフェクトする細胞株においてスクリーニングすることができる。ＲＮＡ干渉の効果は定量ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析によって観察する。次いで好適な標的部位であれば、腫瘍部位において標的分子を発現するよう設計された組換えベクターにおいて発現させることができる。
【０２２９】
低分子干渉ＲＮＡは、ｈＣＡＰ１８のコード配列に基づき設計および合成する。このＲＮＡは二本鎖の１９マーおよびいずれかの末端における２塩基のｄＴｄＴオーバーハングからなる。最も簡単な手法では、その設計に、標的部位が予め選択されている市販のｓｉＲＮＡデータベースを使用することができる（ｈＣＡＰ１８については、例えばＡｍｂｉｏｎ社のｓｉＲＮＡ１４５８６番、１４４０２番、１４６３６５番）。非特異的反応、例えばインターフェロン関連経路を回避するため、ＺＲ７５−１細胞またはトランスジェニックＭＣＦ−７細胞を最大終濃度１０ｎＭのｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。コントロールｓｉＲＮＡは、標的配列内に２〜３個のミスマッチを含むものであった。細胞をトランスフェクションから２４〜７２時間後に回収し、ｈＣＡＰ１８の発現を上記のようなリアルタイムＰＣＲおよび定量ウェスタンブロット分析により測定した。ウェスタンブロット分析においては、上記のように、タンパク質をＳＤＳ含有サンプル緩衝液中で抽出し、１５％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル上で分離し、ニトロセルロースフィルター上に電気ブロットした。フィルターを３％ポンソーＳで可逆的に染色し、その後に１／１０００希釈のアフィニティ精製した抗ＬＬ−３７抗血清と共にインキュベートした。増感化学発光を用いたＨＲＰ結合型二次ＩｇＧからのシグナルを捕捉し、上記の通りに評価した。
【０２３０】
ｈＣＡＰ１８発現に対する最も有効な転写阻害剤のためにインビボ実験を設定した。１２匹のマウスに、トランスジェニックｈＣＡＰ１８を発現するＭＣＦ−７細胞を注射した。マウスの半数に対して、５０μｌオリーブ油（Ｓｉｇｍａ）に溶解した阻害剤３０ｍｇを毎日皮下注射により与えた。腫瘍形成の始期、サイズ、および分布を上記の通りにアッセイした。インビボアプローチにおいて有効なｓｉＲＮＡは、ｈＣＡＰ１８の発現を少なくとも９０％ダウンレギュレートするものとすべきである。
【０２３１】
マウスにおける腫瘍形成を妨げるためには、ｈＣＡＰ１８発現のダウンレギュレーションを数週間維持することが必要であった。毎日多量のｓｉＲＮＡを尾静脈に注射することも可能であることが分かったが、治療アプローチとしては現実的でないように思われる。代替法は、組織／腫瘍細胞におけるｓｉＲＮＡの安定的な発現である。後に細胞内でｓｉＲＮＡに変換されるＲＮＡをヘアピンとして発現するプラスミドが開発されている（例えばｐＳｕｐｅｒ，ＯｒｉＧｅｎｅ Ｉｎｃ）。本発明者らによる初期アプローチにおいて、上記実験により決定された標的ｓｉＲＮＡ配列をｐＳｕｐｅｒにクローニングし、マウスへの移植前にこの構築物で腫瘍細胞をトランスフェクトした。治療アプローチ、すなわち腫瘍形成後の発現ベクターの送達は、現時点では確立されていないが、この目的では、リポソームによるプラスミドの送達ならびにレトロウイルスおよびアデノウイルス発現ベクターの構築が世界中で研究されている。
【０２３２】
ＲＮＡｉの代替法は、「古典的」なアンチセンスアプローチである。標的転写物に相補的な２０〜３ｂｐ長の単鎖オリゴヌクレオチドを細胞培地に直接添加またはマウスに注射する。オリゴヌクレオチドの骨格は、通常、その分解を防ぎ、いかなるキャリア基質にもよらないで取り込みを促進するよう修飾する。しかし、この方法は、阻害メカニズムが非触媒的なものであるため高用量を必要とし、かつ骨格修飾は細胞毒性の非特異的な副作用を増加させる。マウス実験において、典型的な投与範囲は１００〜５００μｇ／動物／日である。
【０２３３】
抗体によるＬＬ−３７活性の阻害（Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ ２００５を参照のこと）
ニワトリ抗体を作製し、ラージスケールで、計画した実験に十分な量をアフィニティ精製した。ＬＬ−３７に対する抗体は、ＬＬ−３７の活性を阻害することができることが以前に示されている。従ってインビトロ実験は不要とした。
インビボ実験のために、上記の通りにマウスにおいて腫瘍を誘導した。腫瘍が触診可能になったら抗体を週に二度注射し、開始時には１〜１００ｍｇ／ｋｇの抗体を用いた。
【０２３４】
次いで、腫瘍の進行に対する抗体の効果を評価した。
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【０２３５】
実施例Ｄ − ヒト抗細菌ペプチドＬＬ−３７はヒトケラチノサイト培養物においてアポトーシスを阻害しアポトーシスタンパク質阻害因子（ＩＡＰ−２）の発現をアップレギュレートする
導入
カセリシジンは、多くの哺乳動物種において見られる抗細菌ペプチドのファミリーである。これらは、高度に保存されたアミノ末端ドメイン、カセリン、およびタンパク分解により遊離することによって抗細菌活性を得る可変性カルボキシ末端ドメインからなる（１，２）。このファミリーの唯一のヒトメンバーである１８ｋＤａヒト陽イオン性抗細菌タンパク質（ｈＣＡＰ１８）は、主として好中球、いくつかの上皮および粘膜細胞（皮膚、気管支、頬側粘膜、食道（ｓｏｐｈａｇｏｕｓ）、頸、膣、精巣上体（ｅｐｉｄｉｍｕｓ）、および唾液腺）により産生される（３〜８）。そのＣ末端３７アミノ酸ドメインであるＬＬ−３７は、膜安定性の破壊を通じて（１１，１２）幅広い微生物に対する抗細菌活性を示す（９，１０）。
【０２３６】
抗細菌機能に加え、このペプチドは他の生物学的活性、例えば血液および上皮細胞における走化性およびサイトカイン放出（８，１３）、上皮細胞増殖の誘導（１４）、ならびに血管新生（１５）への関与が指摘されている。最近の研究は、ＬＬ−３７が創傷治癒時に高度に発現され、ヒトケラチノサイトのインビトロ増殖に影響し、創傷の再上皮化（ｒｅ−ｅｐｉｔｈｅｌｉｚａｔｉｏｎ）に関与することを示している（１６，１７）。
【０２３７】
材料および方法
細胞培養
包皮上皮ケラチノサイトをＣａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手し、０.０６ｍＭカルシウム、０.２％ｖ／ｖ ＢＰＥ、５μｇ／ｍｌウシインスリン、０.１８μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、５μｇ／ｍｌウシトランスフェリン、０.２ｎｇ／ｍｌヒト上皮増殖因子、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、および０.２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（全てＣａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を補充したＥｐｉｌｉｆｅ基本培地（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，．）中、３７℃および５％ＣＯ２下で培養した。細胞を、０.０２５％（ｗ／ｖ）トリプシンおよび０.０１％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を用いて毎週継代した。
【０２３８】
ＨａＣａＴケラチノサイトは、１０％ウシ胎仔血清（ｈｙＣｌｏｎｅ，Ｂｏｕｌｅ Ｎｏｒｄｉｃ ＡＢ Ｈｕｄｄｉｎｇｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（５０Ｕ／Ｌ Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、およびストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）中で培養した。
【０２３９】
細胞の処理
２５,０００細胞／ウェルを６ウェルプレート培養皿にプレーティングした。プレーティングから４８後、細胞を０、０.２３、０.４６、０.６９、０.９、１.１５、２.３、４.６、および１１.５μＭ ＬＬ−３７で処理した。その配列を以下に示す。
【表６】

【０２４０】
各々の処理を三連で行った。ペプチドは培地（ＨａＣａｔ細胞に対してはＤＭＥＭ ５％ＦＣＳおよびＨＥＫｎ細胞に対しては０.１％ＦＣＳを補充したＥｐｉｌｉｆｅ基本培地）で希釈した。細胞は計２４時間の間処理した。ＬＬ−３７刺激後、ジメチルスルホキシド中のトポイソメラーゼＩ阻害剤カンプトテシン（ＣＡＭ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｕｉｓ，ＭＯ）を終濃度６μＭとなるよう細胞に添加した。細胞を分析前にさらに２４時間インキュベートした。
【０２４１】
フローサイトメトリーによるアポトーシスの評価
二つのアポトーシスパラメータ、膜完全性の喪失およびＤＮＡの減少をフローサイトメトリーにより評価した。
膜完全性の評価：ＬＬ−３７刺激およびＣＡＭ処理後、細胞をトリプシン処理により回収した。次いで細胞を冷やしたダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、血球計算器（Ｈａｕｓｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）で計数した。細胞密度をＰＢＳ中１×１０⁶細胞／ｍｌに調整した。アポトーシスは、ヨウ化プロピジウムおよびＹＯ−ＰＲＯ−１色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色することによって検出した。染色された細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析した。細胞を、分析のために、前方散乱光（ＦＣＳ）および側方散乱光（ＳＳＣ）の特性に基づきゲーティングした。ＹＯ−ＰＲＯおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を示す細胞の分析は、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて行い、ＹＯ−ＰＲＯおよびＰＩ陽性細胞の比率を得た。ＹＯ−ＰＲＯによって緑色に染色された細胞をアポトーシス性であるとみなした。ヨウ化プロピジウムによって赤色にも染色された細胞は壊死性であった。生存細胞はほとんどまたは全く色素を取り込まない。
【０２４２】
フローサイトメトリーによるＤＮＡ含有量の分析：ＰＩ／ＲＮａｓｅ染色緩衝液（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）をこの分析に使用した。トリプシン処理した細胞を冷やした７０％（ｖ／ｖ）エタノールで固定し、使用するまで４℃で保存した。ＤＮＡ含有量は、ＤＮＡへのヨウ化プロピジウムの取り込みを通じて測定した。蛍光分析は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。粒子のＦＣＳ（前方散乱光）およびＳＳＣ（側方散乱光）を同時に測定し、細胞のサイズおよび粒度を測定した。ＰＩで染色された核の赤色蛍光をＦＬ−４ウィンドウ（６００ｎｍバンドパスフィルターおよび３５ｎｍバンド幅）で検出した。蛍光強度は細胞のＤＮＡ含有量に比例した。各ヒストグラムを２つの部分：（１）非同調性、非アポトーシス性の生存細胞（２ｎ〜４Ｎに相当するＤＮＡ含有量を有するＧ１、Ｓ、およびＧ２期の細胞）を表すＭ１領域；ならびに（２）生存細胞よりもＤＮＡの量が少ないアポトーシス細胞を表すＭ２領域、に分けた。
【０２４３】
カスパーゼ−３活性アッセイ
カスパーゼ−３酵素活性は、上記のように蛍光基質ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ（１００μＭ）およびＤＥＶＤ−ＡＭＣ（５０μＭ）を用いて測定した。簡単に説明すると、細胞溶解産物を反応緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％スクロース、５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１０〜６％ ＮＰ−４０、および０.１％ ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７.２５）中に集め、これをマイクロタイタープレートに移した。蛍光発生基質の切断は、Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ ＩＩプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）においてＡＭＢの遊離により観察した。蛍光単位を、遊離のＡＭＣから作成した標準曲線を用いてＡＭＣのｐｍｏｌに変換した。データは線形回帰法により分析し、毎分のＡＭＣの遊離ｐｍｏｌとして表した。
【０２４４】
ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡを、Ｑｕｉａｇｅｎ ＲＮａｓｙキット（Ｏｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いることによって、製造元の指示に従う様々な処理の後に細胞から単離した。逆転写は第一鎖合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。
【０２４５】
結果
ＬＬ−３７によるＣＡＭ誘導アポトーシスの阻害
本発明者らは、アポトーシス誘導剤として広く使用されている薬物であるＣＡＭにより誘導される細胞死およびアポトーシスに対するＬＬ−３７の効果を試験した。処理後に、膜完全性およびＤＮＡ断片化を、二つの方法を用いてフローサイトメトリーにより分析した。一つ目の方法は、細胞膜の透過性の亢進を判別することができる二色染色系であり；未処理細胞を染色強度について分析し（図７）、三つの類型：生存性の非染色細胞、アポトーシス性のＹＯ−ＰＲＯ染色細胞、ならびにＹＯ−ＰＲＯおよびＰＩの両方で染色された壊死性細胞に分類した。二番目の方法においては、エタノール透過処理細胞中のＤＮＡ含有量をＰＩによって分析した。アポトーシス細胞は、断片化によりＤＮＡ量の低下を示す。
【０２４６】
ＨａＣａｔ細胞およびＨＥＫｎ細胞においてアポトーシスを誘導する用量および時間を選択するため、事前に濃度・時点実験を行った（データは示さず）。２４時間の間ＣＡＭ ６μＭに被曝させた場合、ＨａＣａｔおよびケラチノサイトは両方ともアポトーシスに特徴的な形態学的変化、例えば膜完全性およびＤＮＡプロフィール上の変化を示した（図７）。細胞を、２４時間、ＬＬ−３７単独でまたはＬＬ−３７およびＣＡＭで同時に処理した場合、アポトーシス細胞の量における変化は観察されなかった（データは示さず）。しかし、高濃度のＬＬ−３７（４.６および１１.５μＭ）は細胞毒性であり、アポトーシス細胞のフラクションではなく壊死性細胞のフラクションを増加させた。同時処理の代わりに細胞をＬＬ−３７に２４時間被曝させた後にＣＡＭによりアポトーシスを誘導した場合、結果は異なるものになった。０.２３μＭ〜２.３μＭの濃度で、ＬＬ−３７はＨＥＫｎ細胞およびＨａＣａＴ細胞においてＤＮＡの断片化および膜透過性の喪失の両方を阻害した（図７および８）。これらの条件下において、ＬＬ−３７は、高濃度（４.６μＭおよび１１.５μＭ）では細胞死も引き起こした。毒性濃度においてさえアポトーシス細胞のフラクションは小さいままであり、これによりＬＬ−３７による細胞死は非アポトーシスメカニズムにより起きることが示された。
【０２４７】
ＬＬ−３７はＨａＣａＴ細胞およびＨＥＫｎ細胞においてＣＡＭによるカスパーゼ−３の誘導を阻害する
カスパーゼ−３はアポトーシス経路における重要なタンパク質の一つであり、アポトーシスの初期の指標であるので、本発明者らはＬＬ−３７処理したまたは未処理のケラチノサイトにおけるカスパーゼ−３活性を測定することを決定した。カスパーゼ活性は、ケラチノサイトにおいて、ＣＡＭ処理の最初の１２時間以内に有意に増加し、２４時間でピークに達した。ＬＬ−３７ ２.３μＭによる事前処理は、カンプトテシン誘導型のカスパーゼ活性化を減少させた（図９ａおよびｂ）。これらのデータは、ＬＬ−３７がヒトケラチノサイトにおいてカスパーゼ活性を減少させることによりアポトーシスを阻害することを示唆している。
【０２４８】
ＬＬ−３７はヒトケラチノサイトにおけるＩＡＰ−２の発現を誘導する
アポトーシスタンパク質の阻害因子のメンバー（ＩＡＰ）はアポトーシスの重要な調節因子であることが記載されている。このファミリーは、カスパーゼ−３の活性を阻害する能力を有する。ブタカセリシジンメンバーＰＲ３９の抗アポトーシス機能はＩＡＰ−２の発現の誘導に関連付けられている。従って本発明者らは、様々な濃度のＬＬ−３７で処理したケラチノサイトにおけるＩＡＰ−２のＨＥＫｎ細胞中での発現を様々な時点でＲＴ−ＰＣＲにより分析した。２.３μＭ ＬＬ−３７による刺激は、刺激の６時間後〜１２時間後のＩＡＰ−２ ｍＲＮＡを増加させた（図１０）。２.３μＭ未満のＬＬ−３７濃度はｃ−ＩＡＰ−２レベルに影響しなかった（データは示さず）。
【０２４９】
ＬＬ−３７刺激したケラチノサイトはＣＯＸ−２をアップレギュレートする。
これまでの研究は、ＣＯＸ−２をＩＡＰ−２発現の調節因子であると認識していた。それは、上皮細胞におけるＣＯＸ−２の阻害がＩＡＰ−２の発現を減少させるからである。従って本発明者らは、ＬＬ３７ ２.３μＭで処理したＨＥＫｎにおけるＣＯＸ−２の発現を分析した。ｍＲＮＡレベルの時間依存的な増加が確認され（図１１）、１２時間後に最高レベルが見られた。ＣＯＸ−２がＬＬ−３７刺激後のＩＡＰ−２の発現増加を媒介するのかどうかをアッセイするため、ＨＥＫｎ細胞を特異的なＣＯＸ−２阻害剤であるＳＣ−７９１ ２５ｎＭで１２時間事前処理し、次いで２μＭ ＬＬ−３７で刺激した。これらの条件下で、ＬＬ−３７処理は、以前に観察されたようにＩＡＰ−２ ｍＲＮＡレベルを増加させなかった（図１２）。これらのデータは、ＬＬ−３７が、ＣＯＸ−２酵素の発現の増加を通じてＩＡＰ−２レベルを増加させることを示唆している。
【０２５０】
考察
抗細菌ペプチドＬＬ−３７の発現増加が皮膚損傷後に見られることが報告された。このペプチドの発現は、感染予防を通じてだけでなく、様々な創傷治癒関連プロセス、例えば走化性、移動、血管新生、および再上皮化への能動的関与を通じて、創傷治癒の促進と関連する。
ここで示したデータは、ＬＬ−３７が、アポトーシスに対する阻害効果を通じて、ケラチノサイトにおける細胞生存の促進にも関与することを示している。
【０２５１】
略語
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７、ヒトカセリシジン抗細菌ペプチド１８ ｋＤａ／ＬＬ−３７；ＩＡＰ−２、アポトーシス阻害タンパク質−２；ＣＯＸ−２、シクロオキシゲナーゼ−２；ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ、カスパーゼ３基質；ＨＥＫｎ、新生児ヒト上皮ケラチノサイト；ＤＭＥＮ、ダルベッコ改変イーグル培地；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水。ＤＥＶＤａｓｅ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐプロテアーゼ活性 ＣＨＡＰＳ、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチル−アンモニオ］プロパン−１−スルホン酸、ＣＡＭ：カンプトテシン
【０２５２】
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１５．Ｋｏｃｚｕｌｌａ，Ｒ．，ｖｏｎ Ｄｅｇｅｎｆｅｌｄ，Ｇ．，Ｋｕｐａｔｔ，Ｃ．，Ｋｒｏｔｚ，Ｆ．，Ｚａｈｌｅｒ，Ｓ．，Ｇｌｏｅ，Ｔ．，Ｉｓｓｂｒｕｃｋｅｒ，Ｋ．，Ｕｎｔｅｒｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．，Ｚａｉｏｕ，Ｍ．，Ｌｅｂｈｅｒｚ，Ｃ．，Ｋａｒｌ，Ａ．，Ｒａａｋｅ，Ｐ．，Ｐｆｏｓｓｅｒ，Ａ．，Ｂｏｅｋｓｔｅｇｅｒｓ，Ｐ．，Ｗｅｌｓｃｈ，Ｕ．，Ｈｉｅｍｓｔｒａ，Ｐ．Ｓ．，Ｖｏｇｅｌｍｅｉｅｒ，Ｃ．，Ｇａｌｌｏ，Ｒ．Ｌ．，Ｃｌａｕｓｓ，Ｍ．，ａｎｄ Ｂａｌｓ，Ｒ．（２００３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１１（１１），１６６５−１６７２
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【０２５３】
実施例Ｅ − ＥＦＧ受容体活性に対するＬＬ−３７およびヘレグリンのコインキュベーションの効果
材料及び方法
リン酸化のウェスタンブロット分析
ＥＲＢＢ２、ＳＴＡＴ３、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫ（＝ＥＲＫ１／２）、プロトコルの概略：
この研究を通じて悪性度の低い乳癌株ＺＲ７５−１（ＡＴＣＣから入手）を使用した。ＺＲ７５−１はｈＣＡＰ１８およびＥＲＢＢ２の両方を低レベルで発現する。
処理：
全ての実験を三連で行った。細胞を１０％ＦＣＳを含有するＯｐｔｉｍｅｍで増殖させ、５０％コンフルエンスで１２ウェルプレートにプレーティングした。再付着後、細胞をＦＣＳ非含有のＤＭＥＭ中で４８時間飢餓状態に置いた。誘導実験のために、予め暖めておいたＰＢＳに溶解させた基質を培地に加え、細胞を２０分間インキュベートした。ＬＬ−３７の終濃度を１０μｇ／ｍｌ、ヘレグリンの終濃度を２または２０ｎｇ／ｍｌとした。
ＬＬ−３７は自ら合成した。組換えヘレグリン−β（ＥＧＦドメイン、ａｃ１７８〜２４１）はＵｐｓｔａｔｅ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹから入手した。
細胞を、ホスファターゼ阻害剤（１ｍＭ ＮａＦ＋１ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄）およびプロテアーゼ阻害剤として２ｍＭ ＰＭＳＦを含有する氷冷ＰＢＳで洗浄し、上記の阻害剤を含有する２００μｌ ＳＤＳサンプル緩衝液で溶解させた。サンプルを、標準的な手法に従いホモゲナイズし、８０℃で変性させ、次いでサンプル５０μｌを７.５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、分離し、ニトロセルロースにブロットした。
ＴＢＳ／０.１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、４％ ＮＦＤＭ中でブロッキングした後、メンブレンを４℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートした。
【０２５４】
使用した抗体は：
ｐＥＲＢＢ２（ｐＴｙｒ １２４８、ウサギ、Ｕｐｓｔａｔｅ（ｃａｔ ｎｏ．０６−２２９）、１／２０００で使用 − 再利用可能
ｐＭＡＰＫ １／２（ｐＴｈｒ ２０２／ｐＴｙｒ ２０４）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｉｎｃであった。
洗浄およびＨＲＰ結合型二次抗体との２時間のインキュベーションの後、膜をＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で現像した。シグナルは、ＣＣＤカメラを用い、定量プログラム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｔｏｋｙｏ）によって測定した。
化学発光シグナルをポンソー染色に対して正規化した。
一つの実験において、チロシンキナーゼ阻害剤ＰＤ１５３０３５（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を２０ｎＭから２.５μＭまでの漸増濃度で添加した。
【０２５５】
結果
ＬＬ−３７およびヘレグリンの併用処理の効果を図１３に示す。定量データは図１４に示す。
図１３は、ＺＲ７５−１細胞における、ＬＬ−３７、ヘレグリン、またはその両方による処理後のＥＲＢＢ２およびＭＡＰＫの活性化を示す。細胞抽出物を、リン酸化型ＥＲＢＢ２およびＭＡＰＫに対するウェスタンブロットによって分析した。シグナルはＣＣＤカメラで捕捉し、ポンソー染色に対して正規化した後に定量した。図１４に示されるのは三連の評価であり、ＬＬ−３７およびヘレグリンが活性化において協働することを示している。
ＥＲＢＢ２のリン酸化は、チロシンキナーゼ阻害剤ＰＤ１５３０３５によって阻害されることが見出され、これによりシグナル伝達におけるＭＡＰＫの役割が示された。
【０２５６】
実施例Ｆ − インビトロの乳癌細胞の転移に対するＬＬ−３７の効果
材料および方法
足場依存的増殖アッセイ
このアッセイは、細胞が転移を生じる能力を反映するものである。細胞を、３００ｕ／ｍｌトリプシン、２０ｕ／ｍｌエラスターゼ、および１ｍＭ ＥＤＴＡの混合物による処理により調製した。エラスターゼの存在は、細胞が単細胞懸濁物に分散するのを促す。
１.４％ Ｓｅａｐｌａｑｕｅアガロースを７０℃の水槽でＯｐｔｉｍｅｍ（添加物なし）中に融解させ、４２℃まで冷まし、予め暖めておいた、終濃度の２倍のＦＣＳおよび添加物を含有する培地と１：１混合した。この混合物４ｍｌを下側寒天としてマス目の付いた４ｃｍペトリ皿に注ぎ込み、静置して固化させた。
【０２５７】
トリプシン処理した細胞をセルストレーナーを通し、終濃度が１０００細胞／ｍｌとなるよう培地（二番濃度の添加物を含有する）に懸濁した。この細胞懸濁物を３７℃に暖め、上記のようにして調製した０.７％アガロース溶液と１：１混合した。２ｍｌを下側寒天の上層として注ぎ、ＲＴで３０分間静置して上層を固化させた。このプレートをインキュベーターに入れ、３〜４日毎に、細胞に増殖培地１００μｌを与えた。２週間後、培養物の上層を０.２％ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（Ｓｉｇｍａ）で染色し、１００μＭ径よりも大きなコロニーを計数した。このアッセイは三連で行い、これを二回繰り返した。
【０２５８】
添加物：
ＦＣＳ：１〜８％
Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ＿（アンホテリシンＢ）：０.５μｇ／ｍｌ
ハイグロマイシンＢ（トランスジェニックＭＣＦ７株に利用する場合）１５０μｇ／ｍｌペニシリンＧ／ストレプトマイシン（ＺＲ７５−１株に利用する場合）：１％ストック溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ＬＬ−３７：１０μｇ／ｍｌ
ヘレグリン（組換えタンパク質、Ｕｐｓｔａｔｅ）：２ｎｇ／ｍｌ
【０２５９】
足場非依存的増殖のアッセイ方法はＦｉｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１：２３６５−２３７５にも記載されている。
【０２６０】
結果
結果を図１６に示す。腫瘍原性に対するＬＬ−３７の効果を、軟寒天における乳癌株ＺＲ７５−１のコロニー形成に対するその影響をアッセイすることによってインビトロで調査した。その効果は、他の因子、例えばＦＣＳおよびヘレグリンの存在によって大きく調節された。図１６ａは２％ＦＣＳでのコロニー数への効果を示す。ヘレグリンの非存在下では、ＬＬ−３７はこのようにコロニー数を有意に減少させた。ＬＬ−３７の負の効果は、ヘレグリンの存在によって完全に取り除かれ、これによりこれらの機能的連携が必要とされることが示された。
ＬＬ−３７およびヘレグリンは、軟寒天コロニーの外見に大きな影響を及ぼした。図１６ｂは、１４日間の培養および生細胞の染色後に得られた軟寒天コロニーの代表例を示す。ＬＬ−３７単独に被曝させると、コロニーの染色が弱まり、見かけ上のコンパクトさが失われたことから、コロニー密度が大きく低下したことが示された。代わりに、母クローンの周囲に単細胞のコロナが現れた。ヘレグリン単独ではほとんど効果を有さなかった。ヘレグリンとＬＬ−３７を組み合わせると、母コロニーが未処理コロニーと同様に染色された。しかし、ＬＬ−３７により誘導された単細胞コロナは維持された。健常な母クローンからの単細胞の流出は、腫瘍からの転移細胞の発生を類似／模倣するものである。まとめると、ＬＬ−３７は原発性腫瘍の増殖に寄与しないがその転移を生じる能力を大いに刺激するようである。従って、ＬＬ−３７の阻害剤は、乳癌における転移の生成を減少させると考えられる。通常、原発性腫瘍ではなく転移物が乳癌における死亡原因とされる。
【０２６１】
実施例Ｇ − インビボでの乳癌細胞の転移に対するＬＬ−３７の効果
材料および方法
ＭＣＦ７亜株におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現
細胞株ＭＪ１１１７［Ｍ Ｅｇｅｂｌａｄ氏より譲受けた；Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８６，６１７−６２５（２０００）を参照のこと］は、エピソーム発現ベクターからＥＲＢＢ２を発現するＭＣＦ７の亜株である。ＭＪ１００５は、空のコントロールベクターを保有する対応するコントロール株である。この細胞株を、Ｏｐｔｉｍｅｍ、５−１０％ ＦＣＳ、およびハイグロマイシンＢ、１５０μｇ／ｍｌ中で培養した。
ｈＣＡＰ１８用発現ベクターを構築するため（図１７を参照のこと）、１６ｂｐの５’非翻訳領域を含む全長コード配列を含むＩｍａｇｅクローン３０５７９３１ １９由来のＢｆａ１フラグメントを、バイシストロン性ベクターｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＳｍａ１部位にサブクローニングした。この細胞株を標準的な条件下でＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてトランスフェクトし、二週間の間、４００ｎｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）によって選別した。細胞を、Ｓｕｍｍｉｔ（商標）データ分析ソフトウェアを用いてＭｏＦｌｏ（登録商標）高速細胞ソーティングフローサイトメーター（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）によってＥＧＦＰ発現についてソーティングし、それらのＣＡＰ１８発現を免疫ブロッティングによって定量した。コントロール細胞株は、ＥＧＦＰのみを発現するベクターを用いたトランスフェクションによって同じように構築した。これらの細胞株は、数ヶ月間の非選択下での連続培養の間、安定的なＣＡＰ１８発現を維持した。
ＥＧＦＰおよびｈＣＡＰ１８の同時発現は細胞の選別および維持を容易にするだけでなく、マウス実験時に血液および臓器における単転移細胞の検出を可能にする。
【０２６２】
ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍原性研究
細胞を、Ｏｐｔｉｍｅｍ／１０％ＦＣＳ／ハイグロマイシン１５０μｇ／ｍｌ／Ｇ４１８ ４００μｇ／ｍｌ中で増殖した。抗生物質は、５０％コンフルエンスで回収する２４時間前に除去した。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ／１ｍＭ ＭｇＣｌ２中に、５千万細胞／ｍｌとなるよう懸濁した。１千万細胞（２００μｌ）をマウスに皮下注射した。ＭＣＦ７細胞は腫瘍形成にβ−エストロゲンを必要とする。
【０２６３】
デポジトリーピル（ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ｐｉｌｌｓ）（１.７ｍｇ／日）を、感染前日にマウスに移植した。マウスを毎日観察し、毎週二回、腫瘍形成について触診した。注射部位における触診可能な浸潤は、注射の一週間後にすでに観察されたが、持続的に増殖する腫瘍はおよそ４０日後に顕れた。腫瘍がおよそ１ｃｍ³サイズに達した場合、マウスを屠殺した。注射部位のまたはマウス内で拡散した、全ての腫瘍を摘出または瞬間凍結させた。さらに、脾臓および肝臓をホモゲナイズし、赤血球を０.１７％ ＮＨ４Ｃｌで溶解し、残骸を遠心分離で除去した後に、ＦＡＣＳ分析によりＥＧＦＰ発現細胞の存在について分析した。
【０２６４】
結果
結果を図１８に示す。
図１８ａは、ＳＣＩＤマウスにおいて、ＭＣＦ７の亜株であるコントロール株ＭＪ１００５ ＩＲＥＳから発生した腫瘍の例を示す。現在に至るまで、コントロールマウスにおいては、二次腫瘍も肝臓または脾臓における転移細胞も検出されていない。
図１８ｂは、同じ細胞株におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現の効果を示す。原発腫瘍は、コントロール株よりも大きく増殖することはなかった。しかし、二次腫瘍は、原発腫瘍に隣接するおよびその反対側の脇腹のリンパ節ならびに大腹部腫瘤（ｌａｒｇｅ ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｍａｓｓｅｓ）等の複数箇所で見られた。腹水（図１８ｃ）は、ｈＣＡＰ１８トランスジーンと同時に産生される緑色蛍光タンパク質を発現する細胞を多量に含んでいた。ｈＣＡＰ１８産生株を感染させたＳＣＩＤマウスの３／４は、転移腫瘍または脾臓および肝臓への転移性細胞の拡散を示した。これらの観察に基づき、本発明者らは、ＬＬ−３７が原発腫瘍から転移性細胞を生成するとの結論に至った。従って、ＬＬ−３７の阻害剤は、他の部位への癌細胞の拡散を阻害すると考えられる。
【０２６５】
実施例Ｈ − 腫瘍および乳癌細胞におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７のｓｉＲＮＡによる阻害
１．腫瘍におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質発現のｓｉＲＮＡによる阻害
ｈＣＡＰ１８ ｍＲＮＡに特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による用量依存的な強い阻害が、そうでなければｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質を過剰発現するＭＣＦ７−ｈＣＡＰ１８トランスジーン細胞の処理後４８時間後にすでに見られた（実施例ＧのＭ＆Ｍ、ＭＣＦ７亜株におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現の節を参照のこと）。ＨＰＬＣ精製、複製ずみの、即利用可能なネガティブコントロールｓｉＲＮＡおよび４つのｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７特異的ｓｉＲＮＡを、最適化されたトランスフェクション効率および再現性のためのｓｉＰＯＲＴ ＮｅｏＦＸトランスフェクション試薬と共に（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＵＳＡ）から購入した。
【０２６６】
【表７】

【０２６７】
４つ全てのｓｉＲＮＡ−ＣＡＭＰを、非特異的効果を最小限に抑えるためにカクテルとしてプールし、ネガティブｓｉＲＮＡコントロールも同様に扱った。トランスフェクションの最適化のための指示は、ｓｉＰＯＲＴトランスフェクション試薬に添付の詳細なプロトコルに提供されている。全ての実験手順を、製造元の説明に従い行った。ｓｉＲＮＡの終濃度は１０ｎＭ、２５ｎＭ、または１００ｎＭであった。処理した乳癌細胞の細胞抽出物をウェスタンブロットにおいて、実施例ＣのＭ＆Ｍに記載されるように１／２０００希釈のｈＣＡＰ１８に対する抗体を用いてｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質について分析した。増感化学発光（ＥＣＬ）シグナル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）をＣＣＤカメラ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で捕捉し、ポンソー染色に対して正規化した後に定量した。結果を図１９に示す。
【０２６８】
２．ヒト抗細菌タンパク質ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は乳癌において転移性の表現型を誘導し、これはｈＣＡＰ１８特異的ｓｉＲＮＡによって逆転させることができる
結果を図２０に示す。
（Ａ）乳癌細胞におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の過剰発現は癌細胞においてより転移性の表現型をもたらす。
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質を過剰発現するＭＣＦ７−ｈＣＡＰ１８トランスジーン細胞の転移能を、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７非発現性のＭＣＦ７−ＩＲＥＳトランスジーンコントロール細胞と比較して評価するために、マトリゲル浸潤アッセイを行った（実施例ＧのＭ＆Ｍ、ＭＣＦ７亜株におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現を参照のこと）。
【０２６９】
ＢｉｏＣｏａｔ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒキット（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を全て製造元の指示に従い使用した。細胞をマトリゲルフィルターに移す前に、細胞をＦＣＳを含まないＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で２４時間飢餓状態下に置いた。細胞を使用する日に０.２５％ Ｔｒｙｐ−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ＃２５２００−０５６）でトリプシン処理し、５０μｌトリプシン阻害剤および１００μｌ ＤＭＥＭを加えることによってこれを停止した。２２０,０００細胞／ｍｌの細胞懸濁物２００μｌをマトリゲルでコートしたフィルターを有するトランスウェルインサートチャンバーに播種し、これを、５％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ ７５０μｌで満たした下部チャンバ中に設置した。チャンバを３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で４８時間インキュベートした。その後、インサートを取り除き、フィルターの上側に残存する非浸潤癌細胞をかき取った。フィルターの下側に浸潤した細胞を染色し、位相差顕微鏡下で観察し、計数した。癌細胞の浸潤能は、フィルターの下側に浸潤した細胞の平均数として表した。このアッセイを三連で行った。
【０２７０】
（Ｂ）乳癌細胞においてｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７により誘導された浸潤性・転移性の表現型のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７特異的ｓｉＲＮＡ処理による阻害
腫瘍において発現されるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の減少を通じて癌細胞の転移能を阻害する能力を実証するためにＲＮＡ干渉を使用した。
ＲＮＡ干渉において、非特異的効果を最小限に抑えるために、４つ全てのｓｉＲＮＡ−ＣＡＭＰを１０ｎＭのカクテルとして一緒に使用し、ネガティブｓｉＲＮＡコントロールも同様に扱った。ｓｉＲＮＡ処理（実施例１９参照）は、（Ａ）に記載のマトリゲル浸潤アッセイを行う４０時間前に行った。ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉は、浸潤性の腫瘍細胞の数を減らすことによって癌細胞の転移能を阻害する能力をはっきりと示した。
（詳細については、実施例Ｃの転写後阻害研究および浸潤の誘導の節も参照のこと）
【０２７１】
実施例Ｉ − 本発明の薬剤の製造およびインビボでの使用
抗ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および抗ｅｒｂＢ２抗体の発現
抗ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７抗体をＮＳＯ骨髄腫細胞において発現させた。同様に抗ｅｒｂＢ２抗体を別のＮＳＯ骨髄腫細胞において発現させた。
【０２７２】
簡単に説明すると、この融合タンパク質の軽鎖成分および重鎖成分をコードする発現ベクターを用いた電気穿孔により、ＮＳＯ骨髄腫細胞をコトランスフェクトした。次いで、ＥＬＩＳＡアッセイにより、形質転換体を抗体産生について選別およびスクリーニングした。
【０２７３】
患者への投与
抗体を水性滅菌注射溶液として処方した。
次いでこの製剤を、乳癌患者に対して、９０分間の静脈内（ＩＶ）注入により投与した。
用量は、医師により決定される各患者ごとの要件に応じて選択する。しかし、典型的には、初期用量４ｍｇ／ｋｇを使用した後、メンテナンス用量２ｍｇ／ｋｇを毎週使用する。
【０２７４】
疾患の進行の観察
次いで、乳癌の進行、特に癌細胞の転移に対する抗体処置の影響を従来的な走査／ＮＭＲによって観察した。
【図面の簡単な説明】
【０２７５】
【図１】ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は乳癌において高度に発現される。 （Ａ）ストローマ島（ｓｔｒｏｍａｌ ｉｓｌａｎｄ）（ｓｔ）を取り囲む腫瘍細胞におけるｈＣＡＰ１８タンパク質に対する強い免疫反応（赤色の沈着）を示す腺管乳癌グレードＩＩＩ（患者７番、表２）の切片。（Ｂ）インサイチュハイブリダイゼーションは、同じ組織由来の切片において合致するｈＣＡＰ１８ ｍＲＮＡのシグナルを示している。強いオートラジオグラフシグナルは、暗視野照明下で白色の粒として見られる。（Ｃ）癌腫細胞の高倍率観察は、免疫反応性を欠く腫瘍細胞に隣接して強い免疫反応性の細胞が存在することを示している。（Ｄ）血管内のｈＣＡＰ１８免疫反応性乳癌細胞。（Ｅ）カセリン組換えペプチドによる免疫吸着は、ｈＣＡＰ１８の免疫反応を完全に消滅させた（Ａと同じ組織）。（Ｆ）免疫吸着時のポジティブコントロールとしての一般的なｈＣＡＰ１８の免疫染色（Ａと同じ組織）。（Ｇ）正常な乳腺上皮は、ｈＣＡＰ１８に対する弱い免疫反応を示す。顕微鏡写真（Ａ、Ｃ〜Ｇ）は、１：５００希釈のｈＣＡＰ１８抗体を用いて得た結果を示す。スケールバー（Ａ、Ｂ）＝１００μｍ；（Ｃ、Ｄ）＝２５μｍ；（Ｅ、Ｆ、Ｇ）＝１０μｍ。
【図２】ｈＣＡＰ−１８／ＬＬ−３７は乳癌における免疫ブロッティングによって検出される。 患者の臨床データを表２に示す（サンプル１〜１０）。組換えカセリン（Ｃ）およびＬＬ−３７ペプチド（Ｌ）をサイズ基準として使用した。正常な乳房組織をレーン１に示す。ＥｌｓｔｏｎグレードＩ腫瘍をレーン２、４、および５に示す。グレードＩＩ腫瘍をレーン３に示し、グレードＩＩＩ腫瘍をレーン６〜１０に示す。全ての組織において、インタクトな非プロセシング型１８ｋＤａホロタンパクに対応する免疫反応バンドが見られた。プロセシング型ＬＬ−３７ペプチド（４ｋＤ）を５つのグレードＩＩＩ腫瘍のうちの４つ（７〜１０番）において確認した。
【図３】上皮細胞におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現は細胞増殖を増加させる。 Ａ：上パネル、左レーン；抗ＬＬ３７抗血清を用いたＨＥＫ２９３抽出物の免疫ブロッティング。バイシストロン性ベクターｈＣＡＰ１８＋ＥＧＦＰでトランスフェクトした細胞（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）はｈＣＡＰ１８タンパク質の発現を示している。上パネル、右レーン；ＥＧＦＰのみでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（Ｅ）。下パネル；ＨＥＫ２９３細胞（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）はコントロール細胞（Ｅ）と比較して有意に高い増殖率（フローサイトメトリーによる評価）を示している。ポンソー染色をローディングコントロールとして示す。Ｂ：上パネル、左レーン；Ａに記載されるようにトランスフェクトしたＨａＣａＴ細胞。下パネル；ｈＣＡＰ１８トランスフェクトしたＨａＣａＴ細胞は、コントロール細胞と比較して有意に高い増殖率（３Ｈ−チミジン取り込みによる評価）を示している。
【図４】合成性ＬＬ−３７ペプチド処理は上皮細胞の細胞増殖を増加させる。 ７２時間の血清枯渇によって同調させ、次いで合成性の生物学的に活性なＬＬ−３７ペプチド１０μｇ／ｍｌ（ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ＋ＰＥＳＴ中）で３６時間処理したＨａＣａＴ細胞は、未処理（コントロール）ＨａＣａＴ細胞と比較して有意な細胞増殖の増加を示している。増殖率は［³Ｈ］チミジン取り込みによって評価した。
【図５−１】ＬＬ−３７受容体ＦＰＲＬ１は乳癌および正常な乳腺上皮において発現される。 （Ａ）腫瘍細胞においてＦＰＲＬ１受容体に対する顕著な免疫反応（赤色の沈着）が見られる腺管乳癌Ｅｌｓｔｏｎグレード２（患者１２番、表２）の切片。（Ｂ）腺管領域においてＦＰＲＬ１に対する免疫反応（赤色の沈着）を示す正常な乳腺上皮の切片。顕微鏡写真は、１：４００希釈のＦＰＲＬ１抗血清を用いて得た結果を示す。スケールバー（Ａ）＝５０μｍ；（Ｂ）＝１０μｍ。
【図５−２】図５−１の続き。 （Ｃ）免疫ブロッティングは、ＬＬ−３７受容体であるＦＰＲＬ１が正常組織（Ｎ）および乳癌（Ｔ）組織の両方において発現されることを明らかにした。（Ｄ）バイシストロン性ベクターｈＣＡＰ＋ＥＧＦＰでトランスフェクトしたＨａＣａＴ（ｈＣＡＰ１８／Ｅ）は、リアルタイムＰＣＲにより、有意に増加したＦＰＲＬ１受容体ｍＲＮＡの発現を示す。ＥＧＦＰのみでトランスフェクトしたＨａＣａＴ細胞（Ｅ）をコントロールとして用いた。
【図６】エストロゲン受容体（ＥＲ）およびリンパ節（Ｎ）陽性乳癌におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の高発現（対数スケールで表示）。 ＲＮＡを１４０の乳癌および４の非病変乳房組織サンプルから抽出し、プライマーとしてランダムヘキサマーを用いて逆転写した。ｈＣＡＰ１８転写物の発現を、標準的なプロトコルに従い、ｃＤＮＡ １０ｎｇを用いるリアルタイムＰＣＲによって測定した。サンプルは１８Ｓ−ＲＮＡの定量によって正規化した。非病変サンプルの平均発現値を裁量で１に設定した。平均および偏差はＡｎｏｖａ統計法によって評価している。
【図７Ａ】ＬＬ−３７はＨＥＫ細胞におけるカンプトテシン誘導型のアポトーシスを阻害する。 サブコンフルエントな細胞を、異なるＬＬ−３７（１、２、および４μＭ）濃度で２４時間処理した。培地のみで処理した細胞をコントロール細胞として使用した（ａ）。次いで、６μＭカンプトテシンの非存在下（ａ〜ｄ）または存在下（ｅ〜ｈ）で細胞を２４時間さらに培養した。回収した細胞を二色アポトーシスアッセイおよびフローサイトメトリーに供し、蛍光強度による四象限分析により、生存性（ｖｉａｂｌｅ）（蛍光がないまたは少ない）、アポトーシス性（ＦＬ−１ ＹＯＰＲＯ色素陽性）、および壊死性（ＦＬ−１およびＰＩ蛍光の両方とも陽性）に分類した。図は、各々三連で行った三回の独立実験の典型例を示している。
【図７Ｂ】ＬＬ−３７はＨａＣａＴ細胞におけるカンプトテシン誘導型のアポトーシスを阻害する。 アポトーシス細胞の定量分析。
【図８】ＬＬ−３７によるＨＥＫｎ細胞の事前処理によるカンプトテシン誘導型のアポトーシスからの保護を示すＨＥＫｎ細胞のフローサイトメトリー分析。 ＬＬ−３７ １または２μＭで２４時間処理した細胞（ｂ、ｃ、ｅ、ｆ）および未処理細胞（ａ、ｄ）を、２４時間のカンプトテシン処理（ｄ〜ｆ）によりアポトーシスを誘導した。次いで細胞をフローサイトメトリーにより分析し、非アポトーシス性集団（２Ｎ〜４Ｎ）およびアポトーシス性集団（２Ｎ以下）を検出した。グラフは、各々三連で行った三回の実験の代表例である。
【図９】ＬＬ−３７はＨＥＫｎ細胞におけるカスパーゼ−３のカンプトテシン活性化を減少させる。 細胞をＬＬ−３７およびカンプトテシンの存在下または非存在下で培養し、次いで回収してＶＤＶＡＤ−ＡＭＣのインビトロ加水分解によりカスパーゼ−３活性を分析した。カンプトテシンと共に２４時間インキュベートすることによって誘導されたカスパーゼの活性化は、ＬＬ−３７による細胞の処理によって減少した。値は、各々三連で行った三回の異なる実験の平均値である。
【図１０】ＬＬ−３７処理はＩＡＰ２の発現を増加させる。 ＨＥＫｎ細胞を２μＭ ＬＬ−３７で処理し、刺激後の異なる時点で回収した。これらの細胞由来のＲＮＡを逆転写し、ＩＡＰ−２の発現をリアルタイムＰＣＲにより測定した。各々の時点でのＩＡＰ−２の転写レベルを、１８ＳＲＮＡに対して正規化し、未処理細胞（各々の時点において１に設定したコントロール）に対する相対値で示す。
【図１１】ＬＬ−３７はＨＥＫ細胞におけるプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現を増加させる。 ＨＥＫｎ細胞を２μＭ ＬＬ−３７で処理し、刺激から６、１２、および２４時間後に回収した。未処理細胞を各時点のコントロールとして用いた（薄灰色カラム）。これらの細胞由来のＲＮＡを逆転写し、コントロールに対するＣＯＸ−２の相対発現値を上記のようにｑＰＣＲにより測定した。
【図１２】ＣＯＸ−２の阻害はＩＡＰ−２のＬＬ−３７誘導型の増加を妨げる。 ＨＥＫｎ細胞を特異的なＣＯＸ−２阻害剤ＳＣ−７９１（２５μＭ）で処理しまたはその不在下で処理し、ＬＬ−３７（２μＭ）と共にまたはその不在下で６時間さらにインキュベートした。ＩＡＰ−２ ｍＲＮＡ遺伝子のレベルをＲＴ−ＰＣＲによって分析し、それを未処理コントロールサンプルとの相対値として示す。
【図１３】ＬＬ−３７はヘレグリンを通じたＥＧＦＲシグナル伝達系の活性化を増強する。 乳癌株ＺＲ７５−１の抽出物を、示されるようなリン酸化タンパク質に対するウェスタンブロット分析により分析した。
【図１４】ウェスタンブロット分析によるＥＲＢＢ２のリン酸化（Ｔｙｒ１２４８）の定量。 化学発光シグナルを、ポンソー染色に対して正規化した後に定量した。
【図１５】ＬＬ−３７はＥＧＦＲファミリーを通じてＭＡＰＫを活性化する。 ＬＬ−３７はＥＧＦＲファミリーを通じてＭＡＰＫを活性化し、この活性化はチロシンキナーゼ阻害剤ＰＤ１５３０３５によって完全にブロックすることができる。完全な阻害に必要な濃度は２.５μＭであり、これはＥＧＦＲについて必要とされる濃度よりも高いが、ＥＲＢＢ２の活性化をブロックするのに必要な濃度である。
【図１６Ａ】ＬＬ−３７は乳癌細胞の転移を阻害する。 ＬＬ−３７の腫瘍原性を、乳癌株ＺＲ７５−１を用いるコロニー形成アッセイにおいて調査した。低い血清濃度では、ＬＬ−３７単独でコロニー数を減少させたが、ＬＬ−３７およびヘレグリンの組み合わせはコロニー数を増加させた。
【図１６Ｂ】ＬＬ−３７は乳癌細胞の転移を阻害する。 それよりも劇的だったのが表現型の変化である。ＬＬ−３７の存在下では、コンパクトなコロニー構造が破壊され、単細胞性のサテライトが見られた。ヘレグリンはコロニーの密度を回復させるが、ＬＬ−３７が存在する場合の単細胞の離脱を阻止しなかった。
【図１７】ｈＣＡＰ１８用の発現ベクターの構築。 ｈＣＡＰ１８用の発現ベクターを構築するため、１６ｂｐの５’非翻訳領域を含む全コード配列を含むＩｍａｇｅクローン３０５７９３１ １９由来のＢｆａ１フラグメントをバイシストロン性ベクターｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＳｍａ１部位にサブクローニングした。
【図１８Ａ】インビボでの二次腫瘍の形成。 親ＭＣＦ７を注射したＳＣＩＤマウスにおける原発性腫瘍
【図１８Ｂ】複数の転移が認められるＭＣＦ７−ｈＣＡＰ１８トランスジーンを注射したＳＣＩＤマウス
【図１８Ｃ】ｈＣＡＰ１８でトランスフェクトされこれを過剰発現する乳癌細胞を注射したＳＣＩＤマウスから採取したトランスフェクト腹水細胞におけるＬＬ−３７の発現。ＭＣＦ７腹水細胞（上側）におけるｈＣＡＰ１８の能動的な転写を、マーカーとしての緑色蛍光タンパク質の共発現（下側）により確認した。
【図１９】腫瘍におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質の発現のｓｉＲＮＡによる阻害。 ｈＣＡＰ１８ ｍＲＮＡに特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による用量依存的な強い阻害が、そうでなければｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質を過剰発現するＭＣＦ７−ｈＣＡＰ１８トランスジーン細胞の処理後４８時間以降ですでに見られた（実施例ＧのＭ＆Ｍ、ＭＣＦ７亜株におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現の節を参照のこと）。ＨＰＬＣ精製、複製ずみの、即利用可能なネガティブコントロールｓｉＲＮＡおよび４つのｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７特異的ｓｉＲＮＡを、高トランスフェクション効率および再現性のために最適化されたｓｉＰＯＲＴ ＮｅｏＦＸトランスフェクション試薬と共に（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＵＳＡ）から購入した。 ４つ全てのｓｉＲＮＡ−ＣＡＭＰ（ｓｉＲＮＡ−ＣＡＭＰ１〜４；実施例Ｈに記載）を、非特異的効果を最小限に抑えるためにカクテルとしてプールし、ネガティブｓｉＲＮＡコントロールも同様に扱った。トランスフェクションの最適化のための指示は、ｓｉＰＯＲＴトランスフェクション試薬に添付の詳細なプロトコルに提供されている。全ての実験手順を、製造元の説明に従い行った。ｓｉＲＮＡの終濃度は１０ｎＭ、２５ｎＭ、または１００ｎＭであった。処理した乳癌細胞の細胞抽出物をウェスタンブロットにおいて、実施例ＣのＭ＆Ｍに記載されるように１／２０００希釈のｈＣＡＰ１８に対する抗体を用いてｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質について分析した。増感化学発光（ＥＣＬ）シグナル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）をＣＣＤカメラ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で捕捉し、ポンソー染色に対して正規化した後に定量した。
【図２０】ヒト抗細菌タンパク質ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７は乳癌において転移性の表現型を誘導し、これはｈＣＡＰ１８特異的ｓｉＲＮＡによって逆転させることができる。 （Ａ）乳癌細胞におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の過剰発現は癌細胞においてより転移性の表現型をもたらす。ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７タンパク質を過剰発現するＭＣＦ７−ｈＣＡＰ１８トランスジーン細胞の転移能を、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７非発現性のＭＣＦ７−ＩＲＥＳトランスジーンコントロール細胞と比較して評価するために、マトリゲル浸潤アッセイを行った（実施例ＧのＭ＆Ｍ、ＭＣＦ７亜株におけるｈＣＡＰ１８のトランスジェニック発現を参照のこと）。 ＢｉｏＣｏａｔ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒキット（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を全て製造元の指示に従い使用した。細胞をマトリゲルフィルターに移す前に、細胞をＦＣＳを含まないＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で２４時間飢餓状態下に置いた。細胞を使用する日に０.２５％ Ｔｒｙｐ−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ＃２５２００−０５６）でトリプシン処理し、５０μｌトリプシン阻害剤および１００μｌ ＤＭＥＭを加えることによってこれを停止した。２２０,０００細胞／ｍｌの細胞懸濁物２００μｌをマトリゲルでコートしたフィルターを有するトランスウェルインサートチャンバーに播種し、５％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ ７５０μｌで満たした下部チャンバ内に設置した。チャンバーを３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で４８時間インキュベートした。その後、インサートを取り除き、フィルターの上側に残存する非浸潤癌細胞をかき取った。フィルターの下側に浸潤した細胞を染色し、位相差顕微鏡下で観察し、計数した。癌細胞の浸潤能は、フィルターの下側に浸潤した細胞の平均数として表した。このアッセイを三連で行った。 （Ｂ）乳癌細胞においてｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７により誘導された浸潤性・転移性の表現型のｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７特異的ｓｉＲＮＡ処理による阻害。 腫瘍により発現されるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の減少を通じて癌細胞の転移能を阻害する能力を実証するためにＲＮＡ干渉を使用した。 ＲＮＡ干渉において、非特異的効果を最小限に抑えるために、４つ全てのｓｉＲＮＡ−ＣＡＭＰを１０ｎＭのカクテルとして一緒に使用し、ネガティブｓｉＲＮＡコントロールも同様に扱った。ｓｉＲＮＡ処理（実施例１９参照）は、（Ａ）に記載のマトリゲル浸潤アッセイを行う４０時間前に行った。ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉は、浸潤性の腫瘍細胞の数を減らすことによって癌細胞の転移能を阻害する能力をはっきりと示した。（詳細については、実施例Ｃの転写後阻害研究および浸潤の誘導の節も参照のこと）

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物学的活性を阻害する第一薬剤；および
（Ｂ）ＥＧＦ受容体の生物学的活性を阻害する第二薬剤
を含み、成分（Ａ）および成分（Ｂ）の各々が、薬学的に許容できるアジュバント、希釈剤、または担体との混合により処方されている、併用製品。
【請求項２】
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物学的活性を阻害する第一薬剤、ＥＧＦ受容体の生物学的活性を阻害する第二薬剤、および薬学的に許容できるアジュバント、希釈剤、または担体を包含する医薬製剤を含む、請求項１に記載の併用製品。
【請求項３】
以下の成分：
（Ａ）薬学的に許容できるアジュバント、希釈剤、または担体と混合された、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物学的活性を阻害する第一薬剤を包含する医薬製剤；および
（Ｂ）薬学的に許容できるアジュバント、希釈剤、または担体と混合された、ＥＧＦ受容体の生物学的活性を阻害する第二薬剤を包含する医薬製剤
を含むキット・オブ・パーツを含み、成分（Ａ）および（Ｂ）が各々、他と組み合わせて投与するのに適した形態で提供される、請求項１に記載の併用製品。
【請求項４】
第二薬剤により阻害されるＥＧＦ受容体が、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦ−Ｒ）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４から選択される少なくとも一つである、請求項１〜３のいずれかに記載の併用製品。
【請求項５】
第一薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の転写、翻訳、および／もしくは結合特性を変更することによってｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物学的活性を阻害し、ならびに／または第二薬剤がＥＧＦ受容体の転写、翻訳、および／もしくは結合特性を変更することによってＥＧＦ受容体の生物学的活性を阻害する、請求項１〜４のいずれかに記載の併用製品。
【請求項６】
第一薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の転写の阻害剤であり、および／または第二薬剤がＥＧＦ受容体の転写の阻害剤である、請求項１〜５のいずれかに記載の併用製品。
【請求項７】
第一薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の翻訳の阻害剤であり、および／または第二薬剤がＥＧＦ受容体の翻訳の阻害剤である、請求項１〜５のいずれかに記載の併用製品。
【請求項８】
第一薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の結合特性の阻害剤であり、および／または第二薬剤がＥＧＦ受容体の結合特性の阻害剤である、請求項１〜５のいずれかに記載の併用製品。
【請求項９】
第一薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体アンタゴニストであり、および／または第二薬剤がＥＧＦ受容体アンタゴニストである、請求項１〜５のいずれかに記載の併用製品。
【請求項１０】
ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７受容体がＦＰＲＬ１または関連受容体である、請求項９に記載の併用製品。
【請求項１１】
癌細胞において選択的に、第一薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物学的活性を阻害することができ、および／または第二薬剤がＥＧＦ受容体の生物学的活性を阻害することができる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項１２】
第一薬剤が、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物学的活性を、該薬剤に被爆させなかった癌細胞におけるｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７の生物学的活性と比較して１０％またはそれ以上阻害することができ、および／または第二薬剤が、ＥＧＦ受容体の生物学的活性を、当該薬剤に被爆させなかった癌細胞におけるＥＧＦ受容体の生物学的活性と比較して１０％またはそれ以上阻害することができる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項１３】
第一薬剤および／または第二薬剤が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体に対する結合親和性を有する化合物、ならびに小分子阻害化合物からなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項１４】
第一薬剤および／または第二薬剤が低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項１５】
ｓｉＲＮＡ分子が１９〜２３ヌクレオチド長である、請求項１４に記載の併用製品。
【請求項１６】
第一薬剤が、配列番号１のヌクレオチド配列のフラグメントを含むかもしくはそのフラグメントからなるｓｉＲＮＡ分子、またはその変異体である、請求項１４または１５に記載の併用製品。
【請求項１７】
第二薬剤が、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦ−Ｒ）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、もしくはＥｒｂＢ４ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列のフラグメントを含むかまたはそのフラグメントからなるｓｉＲＮＡ分子、またはその変異体である、請求項１４〜１６のいずれかに記載の併用製品。
【請求項１８】
第一薬剤および／または第二薬剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項１９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが１５〜３５ヌクレオチド長である、請求項１８に記載の併用製品。
【請求項２０】
第一薬剤が、配列番号１のヌクレオチドのフラグメントを含むかもしくはそのフラグメントからなるアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその変異体である、請求項１８または１９に記載の併用製品。
【請求項２１】
第二薬剤が、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦ−Ｒ）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、もしくはＥｒｂＢ４ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列のフラグメントを含むかまたはそのフラグメントからなるアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその変異体である、請求項１８〜２０のいずれかに記載の併用製品。
【請求項２２】
第一薬剤がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７に対する結合親和性を有する化合物であり、および／または第二薬剤がＥＧＦ受容体に対する結合親和性を有する化合物である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項２３】
化合物がポリペプチドを含むまたはポリペプチドからなる、請求項２２に記載の併用製品。
【請求項２４】
ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項２３に記載の併用製品。
【請求項２５】
抗体またはその抗原結合フラグメントがＦｖフラグメント、Ｆａｂ様フラグメント、単可変ドメイン、およびドメイン抗体からなる群より選択される、請求項２４に記載の併用製品。
【請求項２６】
抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化型である、請求項２４または２５に記載の併用製品。
【請求項２７】
第一薬剤および／または第二薬剤が小分子阻害化合物である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項２８】
化合物がｈＣＡＰ１８／ＬＬ−３７および／またはＥＧＦ受容体に対するリガンド結合能を有する、請求項２７に記載の併用製品。
【請求項２９】
第一薬剤および／または第二薬剤が癌細胞に選択的に送達されるおよび／または癌細胞によって選択的に活性化されることが可能である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項３０】
第一薬剤および／または第二薬剤が標的細胞特異的部分を含む、請求項２９に記載の併用製品。
【請求項３１】
標的細胞特異的部分が抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項３０に記載の併用製品。
【請求項３２】
抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化型である、請求項３１に記載の併用製品。
【請求項３３】
抗体またはその抗原結合フラグメントが癌細胞表面に発現される抗原に対する特異性を有する、請求項３１または３２に記載の併用製品。
【請求項３４】
癌細胞表面に発現される抗原が、ＥＧＦ受容体（例えばＥｒｂＢ２）、Ｃ４６、８５Ａ１２、Ｈ１７Ｅ２、ＮＲ−ＬＵ−１０、ＨＭＦＧ１、ＳＭ−３（ＩｇＧ１）、Ｗ１４、Ｌ６（ＩｇＧ２ａ）、１Ｆ５（ＩｇＧ２ａ）、アルファフェトプロテイン、Ｃａ−１２５、前立腺特異的抗原、および上皮成長因子受容体ファミリーのメンバーからなる群より選択される、請求項３３に記載の併用製品。
【請求項３５】
癌細胞表面に発現される抗原が、ＥｒｂＢ２である、請求項３４に記載の併用製品。
【請求項３６】
第一薬剤および／または第二薬剤が癌細胞により選択的に活性化されるプロドラッグである、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項３７】
成分（Ａ）および成分（Ｂ）が、癌の処置において逐次的に、別個に、および／または同時に使用するのに適したものである、請求項１〜３６のいずれかに記載の併用製品。
【請求項３８】
癌の処置が癌細胞の増殖および／または転移の阻害を含む、請求項３７に記載の併用製品。
【請求項３９】
癌細胞が上皮細胞である、請求項３８に記載の併用製品。
【請求項４０】
癌細胞が扁平上皮細胞である、請求項３８に記載の併用製品。
【請求項４１】
癌細胞が、乳房、胆管、脳、結腸、胃、生殖器、肺および気道、皮膚、胆嚢、肝臓、鼻咽頭、神経細胞、腎臓、前立腺、リンパ腺、胃腸管、ならびに内分泌系の癌細胞からなる群より選択される、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項４２】
癌細胞が乳癌細胞である、請求項４１に記載の併用製品。
【請求項４３】
乳癌細胞がＥｌｓｔｏｎグレードＩＩＩ細胞である、請求項４２に記載の併用製品。
【請求項４４】
癌細胞が転移性である、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項４５】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載の成分（Ａ）を、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の成分（Ｂ）と関連付け、二つの成分を互いに組み合わせて投与するのに適合させることを含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の併用製品の製造方法。
【請求項４６】
（ｉ）請求項１〜４４のいずれか一項に記載の成分（Ａ）および成分（Ｂ）の少なくとも一方；と共に
（ｉｉ）その成分を他方の成分と組み合わせて使用するための説明書、
を含む、キット・オブ・パーツ。
【請求項４７】
癌細胞の処置に使用するための、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の併用製品または請求項４６に記載のキット・オブ・パーツ。
【請求項４８】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載の併用製品または請求項４６に記載のキット・オブ・パーツを、癌患者または癌に対して感受性の患者に投与することを含む、癌細胞の処置方法。
【請求項４９】
請求項１〜４４に記載の併用製品を患者に投与することを含む、患者の癌細胞の増殖および／または転移の阻害方法。
【請求項５０】
患者がヒトである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
薬剤が癌細胞に選択的に送達されるおよび／または癌細胞により選択的に活性化される、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
医薬において使用するための、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の併用製品。
【請求項５３】
癌の処置において使用するための、請求項５２に記載の併用製品。
【請求項５４】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載の併用製品および薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤、または担体を含む、医薬組成物。
【請求項５５】
非経口投与に適した、請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
処方物が癌細胞を標的化して薬剤を送達することができる、請求項５４または５５に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
癌細胞の増殖および／または転移を阻害するための医薬の製造における、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の併用製品の使用。
【請求項５８】
癌細胞が上皮細胞である、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法または請求項５７に記載の使用。
【請求項５９】
癌細胞が扁平上皮細胞である、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法または請求項５７に記載の使用。
【請求項６０】
癌細胞が、乳房、胆管、脳、結腸、胃、生殖器、肺および気道、皮膚、胆嚢、肝臓、鼻咽頭、神経細胞、腎臓、前立腺、リンパ腺、ならびに胃腸管の癌細胞からなる群より選択される、請求項４８〜５１に記載の方法または請求項５７に記載の使用。
【請求項６１】
癌細胞が乳癌細胞である、請求項６０に記載の方法または使用。
【請求項６２】
乳癌細胞がエストロゲン陽性である、請求項６１に記載の方法または使用。
【請求項６３】
癌細胞が転移性である、請求項６０〜６２に記載の方法または使用。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５−１】

【図５−２】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１７】

【図１８Ａ】

【図１８Ｂ】

【図１８Ｃ】

【図１９】

【図２０】

【公表番号】特表２００９−５３５３９２（Ｐ２００９−５３５３９２Ａ）
【公表日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０８４７５（Ｐ２００９−５０８４７５）
【出願日】平成１９年５月４日（２００７．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００１６７１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３２１７８
【国際公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５０５２８５０８７）リポペプチド・アクチエボラーグ (7)
【Ｆターム（参考）】