修飾されたエキセンディン（Ｅｘｅｎｄｉｎｓ）及びその使用
【課題】ＧＬＰ−１受容体のアゴニストとして修飾されたエキセンディン−４及びそのポリエチレングリコール誘導体を提供する。
【解決手段】エキセンディン−４のアミノ酸配列において、２番目、１４番目、２７番目、２８番目の中の一つ又は複数位置が修飾された前記エキセンディン−４、並びに、そのポリエチレングリコール誘導体。これらの化合物は、インスリン分泌促進活性のあるＧＬＰ−１受容体のアゴニストとして、ＩＩ型糖尿病の治療に用いられる。
【解決手段】エキセンディン−４のアミノ酸配列において、２番目、１４番目、２７番目、２８番目の中の一つ又は複数位置が修飾された前記エキセンディン−４、並びに、そのポリエチレングリコール誘導体。これらの化合物は、インスリン分泌促進活性のあるＧＬＰ−１受容体のアゴニストとして、ＩＩ型糖尿病の治療に用いられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は長効インスリン分泌促進ペプチド誘導体及び製剤的に許容される塩に関わり、具体的に言えば、ポリエチレングリコールによって修飾されたインスリン分泌促進ペプチド化合物及びその製剤的に許容される塩に関わる。本発明はまた、その調製方法、及び該当化合物がすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（Glucagon-like Peptide1, ＧＬＰ−１）の受容体に作用することによって、β−細胞のインスリンの分泌を刺激し、血糖を調整して、ＩＩ型糖尿病の予防、治療に応用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年以来、生活レベルの向上、生活様式の現代化及び社会の老齢化に伴って、世界各地の糖尿病の病気にかかる比率が年年増えている。特にその貧乏から豊かになる発展途上国での上昇率が更に著しい。糖尿病は腫瘍、心脳血管病気に継ぎ、第三位のひどい慢性非伝染病で、致死、障害を起こす主な原因の一つになっている。１９９７年のＷＨＯの報告によれば、全世界での糖尿病患者が既に１．３５億人あり、２０００年には、更に１．７５億人に達すると予測された。中国の最新調査報告によれば、２０歳以上の自然人群れの中に、糖尿病の病気にかかる比率が３．２１％であり、初歩的に推定すると、中国の糖尿病患者は少なくとも２０００万人以上あり、その中の９５％以上がＩＩ型糖尿病患者であることを現している。統計によると、アメリカでは１９８７年から１９９２年まで、毎年直接或いは間接に糖尿病に使う経費支出は１０億ドルから９２０億ドルに増えてきた。中国でも近年糖尿病の治療費用が顕著なスピードで増えている。１９９３年の関連資料に対する統計、分析によれば、当年、直接糖尿病に使われた治療費用が２２．１６億元に達する。なお、この費用は糖尿病による併発症の治療費用、病院以外での治療と保健支出、及び間接的社会経済損失を含まない。
【０００３】
目下、ＩＩ型糖尿病を抑える方法には飲食の制限、体の鍛錬、及び薬物による血糖濃度の調節などがある。最もよく使う薬物はインスリン、スルフリル尿素類、ダブルグアニジン類及び格列ケトン類の化合物である。これらの薬物は体の中の血糖の正常化に主な役割があるが、糖尿病による併発症を更正することができなく、特に腎臓、心血管系統、視学及び神経系統に損傷が生ずる。これらの併発症は糖尿病による致死亡率の増加に直接の関係がある。第一世代の糖尿病を治療する薬物の主要な副作用は、低血糖、体重増加及び水腫である。これらの薬物はその作用機構はそれぞれ違うが、いずれもインスリンの分泌機能を有するβ−細胞を保護する役割がないため、体の中の正常な血糖の代謝と内分泌の調節を維持することができない。ほとんどが単一の薬物では次第に役が立たなくなり、やむを得ず２つ以上の薬物による治療方法を使うことが多い。さらに患者が同時に血圧降下用薬、コレステロール降下用薬を使用する場合が多いため、こういう方案の長期的な効果が人によって違う。従って、血糖を抑える新薬を検討、開発し、目下現有の薬物と協同することで、及びβ−細胞機能の保護及び修復を強調し、内分泌系統が食物の摂取に対する反応を調節することは、糖尿病の治療に対して、革命的に推進である。
【０００４】
すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体のアゴニストに対する研究は大したもので、この分野の研究と開発はＩＩ型糖尿病を治療する分野の新しい一章を開く可能性がある。すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１は１９８４年に発見され、腸内内分泌ホルモンである。ＩＩ型糖尿病患者にこのホルモンを注射すると、その血糖濃度が正常レベルに調節できる（Nathan, DM, et al. Diabetes Care 1992; 15:270-6; Zander, M, et al.
Lancet 2002; 359:824-30）。研究結果によると、すい臓の高血糖素の類似ペプチド及びその受容体のアゴニストの作用は主にすい臓β−細胞表面のすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１の受容体をアクティベーションすることによって、インスリンを分泌するからである。こういう効果は体の中の血糖濃度の高低によって決まるから、こうすれば、伝統的な薬物のように、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１及びその受容体のアゴニストが存在する場合でも、ひどい低血糖のため、生命危険のある低血糖ショックを起こすことがない。具体的に言えば、体の中の血糖濃度が６ｍｍｏｌ／Ｌより高い場合、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１が著しいインスリンの分泌を促進する役割があり、体の中の血糖が正常になる場合、その役割が継続しない。また、こういうアゴニストには、齧歯目動物（鼠）のインスリンβ−細胞の生長を刺激し、β−細胞組織を増加させる作用がある。このようなインスリンβ−細胞を修復する機能はＩＩ型糖尿病の全快に対して前景を描き、少なくともＩＩ型からＩ型への発展を遅らせることができる。また、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１及びその受容体のアゴニストが同時にすい臓の高血糖素の分泌を抑えるため、肝臓血糖の輸出を減らすことが可能である。さらに意義のあることは、こういうアゴニストは有効的に胃腸の能動性及び胃の完全吐き出しを抑えるため、食物の摂取を減らし、体重を減らすことができ、このようにしてＩＩ型糖尿病患者の体重を調節することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nathan, DM, et al. Diabetes Care1992; 15:270-6; Zander, M, et al. Lancet 2002; 359:824-30
【発明の概要】
【発明の効果】
【０００６】
本発明の目的は効果が長いポリエチレングリコールによって修飾されたインスリン分泌促進ペプチド化合物及びその製剤的に許容される塩を提出することにある。これらはすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体をアクティベーションして、インスリンの分泌を促進し、血糖を降下させる役割を有するので、ＩＩ型糖尿病の治療或いはＩＩ型糖尿病の予防に適用できる。このような化合物が体の中で更に長い滞在時間を持ち、効果を発揮できる理由は、ポリエチレングリコールによって修飾された後、腎臓を経由して排出される時間を遅らせたばかりでなく、もっと重要な理由は、そのポリペプチド骨格が体の中でもっといい酵素と化学安定性があるため、ポリエチレングリコールの修飾による長効の役割を保証するので、患者の注射回数を減らすことができ、患者の便利を図り、治療の品質と効果を向上することができる。
【０００７】
具体的に言えば、本発明は配列表に配列されたすべてのポリエチレングリコールの修飾に用いられるプレーカーソルポリペプチド、及び異なる分子量のポリエチレングリコールで修飾して生成された化合物及びその製剤的に許容される塩を含むが、またこれらに限られたものではない。
【０００８】
本発明のもう１つの目的は、ポリエチレングリコールで修飾した長効のインスリン分泌促進ペプチド化合物及びその製剤的に許容される塩を調製する方法を提出することにある。
【０００９】
本発明のまた１つの目的は、これらの長効のインスリン分泌促進ペプチド誘導体及び／或いはその製剤的に許容される塩がすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストとして、ＩＩ型糖尿病の予防、治療に応用することにある。
【００１０】
本発明の目的は下記の技術案によって実現されたもので、本発明はインスリン分泌促進ペプチド及びその製剤的に許容される塩に関わり、そのポリペプチド骨格は最適化された体内酵素及び化学安定性を有する。特に、本発明はインスリン分泌促進ペプチドに関わり、それは（Ａ）配列番号（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．）４〜１４１に示されたアミノ酸配列を含み、（Ｂ）は配列番号４〜１４１に示されたアミノ酸配列と実質的には同じアミノ酸配列を含む。 本発明は、また配列番号４〜１４１に示されたインスリン分泌促進ペプチドアミノ酸配列において、特に２番目、１４番目、２７番目、２８番目に対して、一つまたは一つ以上のポリエチレングリコールで修飾して得られたインスリン分泌促進ペプチド及びその製剤的に許容される塩に関する。前記ポリエチレングリコールの分子量は５，０００〜８０，０００であり、好ましくは２０，０００〜６０，０００である。本発明のこれらインスリン分泌促進ペプチドのアミノ酸化合物は肝心な修飾部分を持ち、それはインスリン分泌促進ペプチドアミノ酸配列の２番目、１４番目、２７番目、２８番目を含む。 また、本発明は上記インスリン分泌促進ペプチド及びその製剤的に許容される塩を調製する方法に関わり、その中に、固体相と液相の合成方法、ＨＰＬＣ、イオン交換及びゲル濾過精製方法及び冷凍乾燥を含む。
【００１１】
さらに、本発明はポリエチレングリコールで修飾する前或いは修飾した後のインスリン分泌促進ペプチド誘導体及びその製剤的に許容される塩がＩＩ型糖尿病の治療及び／或は予防の面での応用を提供する。
【００１２】
臨床実験データによれば、血糖濃度のコントロールが割合に悪いＩＩ型糖尿病患者に対して、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）で治療する場合、その空腹血糖濃度が正常（Gutniak, et al, New Eng. J. Med. 326:1316-1322,1992）に快復できる。長期に亘ってすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）を使用すると、そのβ−細胞の機能が正常の人と同じレベル（Rachman, et al., Diabetes
45:1524-1530,1996）になることができる。すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、ブドウ糖へ耐える機能が不健全の患者のベータ−細胞に対して、ブドウ糖に回答する機能を改善することができる（Byrne, et al., Diabetes47:1259-1265,1998）。但し、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）が体内では非常に容易にジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰＩＶ）の破壊によって活性を失ってしまうとともに、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）にもその他のエンドペプチダーゼ（例えばＮＥＰ２４．１１）の切断位点が存在しているので、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の体内での役割は短期間なものであるため、連続的に薬を与える方法を採用しないと、本当の治療効果を奏することができない。そのため、大部分の実験室はもっと安定したすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストの開発に力を入れている。これらの化合物は主にすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）本体を修飾することによって形成されたものである。非常に重要なのは、８０年代末、９０年代のはじめごろ、Ｅｎｇらはアメリカの西南部のトカゲ（Gila Monster, Heloderma Sespectrum）の唾液分泌器官からエキセンディン−４（Eng, J., et al., J.Biol. Chem.,265:20259-62, 1990, Eng, J., et al.,
J.Biol. Chem., 267:7402-05,1992）を分離した。エキセンディン−４は３９のアミノ酸を有するポリペプチドであり、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）と５３％の相同性を有する。エキセンディン−４はすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体と親和力があり、その能力もすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）本体より強い。体内におけるエキセンディン−４の体内血糖代謝調節能力はすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）よりもいいし、インスリンの分泌を促進する役割が生ずるに必要の濃度はすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）より低く、かつ、体内での半減期がすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）よりさらに長い（Kudsen, L.B.J.Med. Chem. 47:4128-4134,2004）。これは主にエキセンディン−４が独特の酵素安定性を有するからであり、これらの酵素安定性は主にポリペプチドの体内の酵素（例えばＮＥＰ２４．１１）の切断位点を削除したことから生まれる。
【００１３】
目下、大量の文献の中で、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニスト機能を有する化合物、例えば、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３７）、エキセンディン−４及びその他のＧＬＰ−１とエキセンディン−４の誘導体を報告した。これらの文献は、ＷＯ９８／４３６５８、ＷＯ００／１５２２４、ＷＯ００／６６６２９、ＷＯ０１／９８３３１、ＷＯ０１／０４１５６、ＵＳＰ
Ｎｏ．５，５４５，６１８、ＵＳＰ Ｎｏ．５，１１８、ＷＯ０３／０５８２０３、ＵＳ出願番号６０／３９５，７３８、ＷＯ０４／０２２００４及びその中で引用した文献などを含む。
【００１４】
次に天然存在するＧＬＰ−１の受容体アゴニストの比較を表す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
式の中の英文頭文字はＨ（Ｈｉｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｐ（Ｐｒｏ）である。
【００１７】
多くの実験室がもっと安定するすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストを開発しているが、それの体内での作用効果はやはり短いので、長効であり、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体激動機構によるインスリン分泌促進ペプチド誘導体の開発が目の前に迫っている。このような化合物の治療作用と副作用（嘔吐と吐き気）を起こすウインドーが狭いので、緩釈製剤を貯蔵して解決する方法は成功する確率がやはり小さい。長い効果のすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストの獲得を解決する方法は、体内で十分の滞留時間を有し、安定な化合物を生成することによって実現することしかない。
【００１８】
ポリエチレングリコールを活性蛋白とポリペプチドの中に導入すると、活性蛋白とポリペプチドの滞留時間を延長できる。この技術はすでに多くの蛋白質を主とする生物薬物の応用に成功した、例えば、ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ，
ＰＥＧＡＳＹＳ， Ｎｅｕｌａｓｔａ， Ｓｏｍａｖｅｒｔなど。ポリエチレングリコールをポリペプチド或いは蛋白骨格に導入する方法と化学は関連文献を参考する。例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅの要約（Veronese, FM, Biomaterial 2001 22:405-417）。すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）とエキセンディン−４はすべてすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体である事実に鑑み、アメリカ特許ＵＳＰ０５４２４２８６およびＷＯ９８／０５３５１は、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）とエキセンディン−４の体内インスリンの分泌を促進する作用の比較実験を報告した。当該実験によれば、エキセンディン−４の体内作用がすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）より強く、且つ、時間がすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）より長いが、その原因としては、エキセンディン−４が体内のポリペプチド水解酵素に対して、もっと安定的であるからである（ＤＰＰ
ＩＶ， ＮＥＰ２４．１１など）。ＷＯ２００４／０２２００４は、ポリエチレングリコールで修飾したすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストを開示し、かつ、使用するポリエチレングリコールの分子量が３００００（ダルトン）以上の場合、獲得した誘導体は頭脳内のすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体の活性化による吐気と嘔吐などの副作用がなくなる可能性があると示した。これはポリエチレングリコールで修飾したすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストは、体内の作用時間を延長するばかりでなく、副作用を削減する可能性もあることを表した。しかし、これら公開された化合物は体内、体外の活性に制限があるほかに、そのポリペプチド骨格の体内酵素及び化学安定性が改善できていなく、これらの化合物が長効製剤になる可能性を制限した。その弱くなった体内、体外活性が生産コストを向上させる。それで、酵素の安定性がいいエキセンディン−４の骨格をポリエチレングリコールで修飾するプレーカーソルの起点とすると、成功の可能性がもっと大きくなる。ＷＯ００／６６６２９には、直接エキセンディン−４をポリエチレングリコールの修飾プレーカーソルとして得られた化合物と方法を示したが、真の長効で、安定した、低コストの薬品の獲得とはかなり距離がある。その理由として、エキセンディン−４の体内滞留時間が従来の数時間から数十時間、さらにもっと長い時間に延長されたが、そのＮ端のＨｉｓ−Ｇｌｙはやはりディペプチドの制限性内切酵素（例えばＤＰＰ
ＩＶ）に切られる可能性があり、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体激動の活性機能を失活させることがある。同様に、長効のポリエチレングリコールで修飾したすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストは、また優れる化学安定性を有しなければならない。特に体温が３７℃の下で優れる化学安定性を有しなければならないが、エキセンディン−４の骨格の中の１４位メチオニンは容易に酸化され、生物活性の変化を起こしやすいと同時に、製剤の生産にも影響を与え、２８位のアスパラギンの加水分解は薬物が失活され、及び製剤困難の主要原因となる。その加水分解の機構は下記の通りである。
【００１９】
【化１】
【００２０】
加水分解の機構から、アスパラギンが存在により、発生した五員環加水分解は修飾されたすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストの活性を降下させるばかりでなく、また、ポリエチレングリコールとポリペプチドの骨格の分離を引き起こし、長効化合物の体内での滞留時間に影響を与えることが分かる。そのため、２位のグリシンに対する修正はエキセンディン−４のポリペプチドを基にする酵素安定性と化学安定性をアップさせる。１４位のメチオニンと２８位のアスパラギンに対する修正はエキセンディン−４のポリペプチドを基にする化学安定性をアップさせる。ＷＯ００／６６６２９は、ポリエチレングリコールによるエキセンディン−４の修飾で導入されたライシーン側鎖アミノ基によってアシル化反応を行い、ポリエチレングリコールの結合物を生成することを強調する。エキセンディン−４本体に同時にライシーンが存在するため、このように修飾した反応選択性は保護基を使用することで実現するしかなく、生産コストに自然的に影響を与える。ポリエチレングリコールを修飾、連結する切断位点と反応専一の基をポリペプチドのカルボキシル（基）側（Ｃ−側）に置くのは、ポリエチレングリコールのポリペプチドとその受容体に対する作用の影響を減らすことでなく、逆に反応が専一であるため、生産コストも明らかに低下する。
【００２１】
本発明は、１シリーズの２位、１４位、２７位或いは２８位がポリエチレングリコールにより修正されたエキセンディン−４の誘導体、及びこれらのポリペプチド骨格を用いてポリエチレングリコールの修飾を行って得られたインスリン分泌促進ペプチドを開示する。これらのポリエチレングリコールで修飾したインスリン分泌促進ペプチドは体内で長い効果を有し、長効注射剤に調製して使用することができる。
【００２２】
本発明が公開したインスリン分泌促進ペプチド化合物は、体内と体外でβ−細胞表面にあるＧＬＰ−１の受容体を活性化してインスリンを分泌する機能を有するため、血糖濃度を低下させる。これらインスリン分泌促進ペプチドの例は表１に挙げたポリペプチドの配列とポリエチレングリコールで修飾して得られた化合物を含むが、またこれらに限定されたものではない。ポリエチレングリコールの修飾ポイントとして、３９位のＳ（Ｓｅｒ）の代わりにシスティン或いはその他スルフヒドリルを含有する合成アミノ酸を使うことができる。同様に、ポイントの多いポリエチレングリコールの修飾は下記の方式によって完成でき、それはカルボキシル（基）側に２つ或いは複数のスルフヒドリルを含有するアミノ酸（例えば、システィン）を加えて、これらの延長されたポリペプチド誘導体をポリエチレングリコールの修飾用プレーカーソルとする。その２点修飾の通式はＣｙｓ（３９）−（Ｘａａ）（ｎ−１）−Ｃｙｓ（ｎ＋３９）であり、そのうち、ｎ＝１−１０であり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。
【００２３】
これらのポリペプチドは化学合成の方法で調製でき、その中に液体相セグメント合成、固体相合成（Merrifield. J. Am. Chem. Soc. 1963. 85:2149-2154を参照）或いは固体相、液体相結合の方法などを含む。ポリペプチド合成は手動と自動の方式があり、自動方式を採用する場合は、Applied Biosystems 431Aポリペプチド合成計器、Ｃｓｂｉｏポリペプチド合成用計器などを使ってもいい。また、ポリペプチド合成はユニット合成の方法を採用してもいい。
【００２４】
化学合成によって調製されたポリペプチドは、ＨＰＬＣ調製方法で精製する必要があり、通常は逆相材料を柱充填物とする（例えば、Ｃ４、Ｃ８、Ｃ１８）。得られたポリペプチドは分析・鑑定により（例えば、効率の高い液体相クラマトグラム（ＨＰＬＣ）、質量スペクトル（ＭＳ）、アミノ酸分析（ＡＡＡ））証明した後に、初めて体外、体内の薬効研究を進めることができる。これらの化合物はＨＰＬＣの調製方法で精製してから、冷凍、乾して製品となる。
【００２５】
ポリエチレングリコールは各メーカーから購入或いは周知の方式で合成できる。ポリエチレングリコールの分子量範囲は５０００〜８０，０００ダルトンであり、好ましくは２０，０００〜６０，０００ダルトンであり、より好ましくは４０，０００ダルトンぐらいである。
【００２６】
ポリエチレングリコールとポリペプチドは、ポリペプチドのカルボキシル（基）側で連結されるべきで、こうすれば、ポリエチレングリコール鎖のポリペプチド自身及びその受容体の間の作用に対する干渉を最低限度に減少できる。すなわち、ポリエチレングリコールは２９から３９までの残基の何れかの位置に連結することができる。これはスルフヒドリルを含むアミノ酸（例えば、システィン）で、任意の１つ或いは同時に数個のアミノ酸を置換することを要求する。もし単一位点でポリエチレングリコールの修飾をする場合、システィンでカルボキシル（基）側の３９位にあるＳ（Ｓｅｒ）を置換したほうが一番好ましい。同様に、２点修飾の場合、システィンで３９位にあるＳ（Ｓｅｒ）を置換してから、さらにシスティンを４０位、或いは３９＋ｎ位（ｎ＝１−１０）に入れたほうが一番好ましい。
【００２７】
システィン或いはスルフヒドリルを利用してポリエチレングリコールを連結する方法は、多くの文献において記述されている（Veronese, Biomaterials 2001, 22:405-417を参照）。化学訓練を受けた技術者ならば、誰でもポリエチレングリコールをスルフヒドリルを含有するインスリン分泌促進ペプチドに連結することができる。
【００２８】
具体的に言えば、スルフヒドリルを利用して連結反応を実現するには下記の方式を用いる。
１）スルフヒドリルはポリペプチドチェーンからできて、下記の式で表されるアミノ酸を導入する。
【００２９】
【化２】
【００３０】
この時のポリエチレングリコールは、マイクル付加引受体、例えばマレーイミドの中の二本鎖、ハロゲン及びスルフォンエステルより置換された基を含み、ポリペプチドとポリエチレングリコールはスルフィド鎖を形成して連結される。
２）スルフヒドリルが改良されたポリペプチド中のアミノ酸の側鎖からできて、例えば、スルフヒドリルがライシーンの側鎖アミノ基に連結される。側鎖が修正されたアミノ酸は下記の式の通りである。
【００３１】
【化３】
【００３２】
この時のポリエチレングリコールは、マイクル付加引受体、例えばマレーイミドの中の二本鎖、ハロゲン及びスルフォンエステルより置換された基を含み、ポリペプチドとポリエチレングリコールはスルフィド鎖を形成して連結される。
３）スルフヒドリルはポリエチレングリコールからできて、この時のポリペプチドの連結ポイントは、マイクル付加引受体、例えばマレーイミドの中の二本鎖、ハロゲン及びスルフォンエステルより置換された基を含み、ポリペプチドとポリエチレングリコールはスルフィド鎖を形成して連結される。
４）ポリエチレングリコールとポリペプチドがいずれももにスルフヒドリルを含む場合、不対称の−Ｓ−Ｓ−を形成することによって連結される。
【００３３】
ポリエチレングリコールと本発明で公開したポリペプチドは、スルフィドを形成することで共有原子価結合を形成することが好ましいが、ポリエチレングリコールとこれらのポリペプチドの結合は共有原子価結合に限らず、例えばアシル化反応、還元アミノ化反応、オキシーム形成反応などの結合方式も本発明に含まれる。
【００３４】
本発明におけるポリエチレングリコールの修飾に適合するプレーカーソルポリペプチド誘導体としては表１に記載のものが挙げられるが、これはいずれも本発明で挙げられた例に過ぎなく、本発明はこの配列に限定されたものではない。当該配列表において、好ましいポリペプチドの配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ８０〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１４１から選択される。
【００３５】
これらのポリエチレングリコールで修飾されたインスリン分泌促進ペプチド及びそのポリペプチドのプレーカーソル自体は両性の化合物で、酸性或いはアルカリ性物質と反応して塩を形成することができる。通常、塩の形成に用いられる酸としては、塩酸、アンモニウムブロム酸、水素ヨード酸、硫酸、燐酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メチルスルフォン、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、琥珀酸、クエン酸、安息香酸、酢酸、トリフルオロ酢酸などから選択される。これらの塩の例としては、硫酸塩、ピロホスフェート、重硫酸塩、亜硫酸塩、サルファイト、燐酸塩、燐酸水素塩、燐酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロホスフェート、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、アセテート、プロピオネート、カプリン酸塩、オクチル酸塩、アクリレート、蟻酸塩、イソブチレート、ヘキシル酸塩、へプチル酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、マロナート、琥珀酸塩、スベラート、セバケート、フマル酸塩、マレー酸塩、ブチンー１、４−ジカルボキシラート、ヘキシンー１、６−ジカルボキシラート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、ｐ−メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、クエン酸塩、乳酸塩、ｒ−ヒドロキシブチレート、グリセリン酸塩、タートレート、メタンスルホン酸塩、プロピルスルホン酸塩、ナフタレンー１−スルホン酸塩、ナフタレンー２−スルホン酸塩、マンデラートなどが挙げられる。好ましい酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩である。通常、塩に使用されるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、炭酸カリウムなどから選択される。
【００３６】
本発明においてインスリン分泌促進ペプチド化合物、特にポリエチレングリコールで修飾したインスリン分泌促進ペプチド化合物は、βー細胞機能を修復する潜在力を有するため、ＩＩ型糖尿病の予防、治療に用いることができ、特に体重が重すぎ、ひいては肥満による分泌の不正常の患者の治療に使うことができる。
【００３７】
それで、本発明はまたＩＩ型糖尿病の治療及び／或は予防の方法に関わり、その中にで、ＩＩ型糖尿病の治療及び／或は予防が必要の患者に、薬物の有効投与量の本発明のインスリン分泌促進ペプチドを使用する。
【００３８】
本発明により公開されたインスリン分泌促進ペプチド化合物は、糖尿病の治療に用いる場合、単独に使用することができが、その他の糖尿病用薬と組み合わせて使用することがさらに好ましい（例えば、ＰＰＡＲアゴニスト、スルフリル尿素類薬、非スルフリル尿素類似物（Secretagogues）、α−グルコシダーゼ（ａ−ブドウ糖カンゾウ酵素）
抑制剤、インスリン敏感度増加剤、インスリン分泌促進物質、グリコーゲン釈放抑制剤、インスリンとその他抗肥満薬）。
【００３９】
臨床使用量は具体的な化合物の薬効によって決めるべきであり、その範囲は０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から約２００ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、最も好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ／ｋｇ体重である。投与方式は注射方式（静脈注射、肌注射、皮下注射を含む）或いはその他の連続注射方式が採用できる。これらの化合物はまた色々な製剤に作ることができ、その他の常規ルートで投与することができる、例えば、内服、皮膚から投与、肺、鼻、口噴霧剤、座薬など。
【００４０】
本発明をさらに詳しく説明するために、下記の実施例をあげるが、本発明の範囲はこれらに限定されたものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９５のＬＣ−ＭＳ図である。
【図２】図２は、ｄｂ／ｄｂ小鼠のＰＥＧ−ＥＸ−４類似物を皮下注射した当日に糖耐量に対する影響を示す。
【図３】図３は、ｄｂ／ｄｂ小鼠のＰＥＧ−ＥＸ−４類似物を皮下注射した３日目に糖耐量に対する影響を示す。
【図４】図４は、ｄｂ／ｄｂ小鼠のＰＥＧ−ＥＸ−４類似物を皮下注射した６日目に糖耐量に対する影響を示す。
【図５】図５は、ｄｂ／ｄｂ小鼠のＰＥＧ−ＥＸ−４類似物を皮下注射した９日目に糖耐量に対する影響を示す。
【図６】図６は、小鼠のＰＥＧ−ＥＸ−４類似物を１１００μｇ／ｋｇ皮下注射した後の血糖の降下作用を示す。
【図７】図７は、小鼠のＰＥＧ−ＥＸ−４類似物を３３００μｇ／ｋｇ皮下注射した後の血糖の降下作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００４２】
本発明で得られた化合物ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９５の固体相合成調製
（１）合成に用いられるアミノ酸単体
【００４３】
【化４】
上記の略語はＦｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、Ｂｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニル基、Ｔｒｔ：トリベンジル基。ＯｔＢＵ：ｔ−ブトキシ基。ｔＢｕ：ｔ−ブチル基である。
【００４４】
（２）使用薬品：試薬はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、ヘキサヒドロピリジン、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｒｉｎｋ
ａｍｉｄｅ樹脂、ニンビドリン、メタノール、フェニルメチルエーテル、ジイソプロピルシラン、トリフルオロ醋酸である。
【００４５】
（３）操作
Ａ．合成：０．２５ｍｍｏｌの規模を例として、０．５ｇのＲｉｎｋのアミド樹脂を量って、リアクタの中に入れ、１ｍｍｏｌのアミノ酸を量って、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ方法で活性化し、ポリペプチドの配列に従って、Ｃ端からＮ端まで順次に合成を行う。反応は２５℃の室温で行うべきであり、下記のステップに従って操作する。
【００４６】
１．２０％のヘキサヒドロピリジンのＤＭＦ溶液で保護基のＦｍｏｃを除去し、１０分／回にする。
２．１０ｍｌのＤＭＦで３回洗浄し、完全に吸い込む。
３．保護用のアミノ酸（１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１ｍｍｏｌ）を量り取り、１０
ｍｌのＤＭＦの中に溶かし、ＤＩＣ（１ｍｍｏｌ）を入れて、１０分間活性化する。
【００４７】
４．前記活性化されたアミノ酸溶液をリアクタの中に入れ、１時間揺れて反応させる。
５．ＤＭＦで樹脂を３回洗浄し、完全に吸い込む。
６．もしニンビドリンの反応が陰性を示す場合、次のサイクルを行い、１から５のステップを再度実行する。もしニンビドリンの反応が陽性と表示すれば、３から５までのステップを繰り返す。
【００４８】
Ｂ．保護基の除去及びポリペプチドの切除
ポリペプチド付の樹脂１ｇをリアクタの中に入れ、断裂溶液を入れる。比例は下表の通りである。
【００４９】
【表２】
【００５０】
室温で２時間振とうしてから、濾過し、濾過液を収集し、少量の酢酸で樹脂を洗浄する。収集液を合併して濃縮した後、エーテルを入れて沈殿させ、沈殿を濾過し、少量のエーテルで洗浄して、粗製品を得る。
【００５１】
Ｃ．ＨＰＬＣの分離精製、冷凍乾燥
得られた粗製品を少量の１０％酢酸溶液に溶かし、ポールをつけ、ＨＰＬＣの分離精製、冷凍乾燥を行ってから製品を得る、得られたポリペプチドは、クロマトグラムと質量スペクトルとを連用して測定したところ、目的の化合物であることが確認できた。
クロマトグラムポール：lina C18 (2), 5μ,100Å
分離波長：λ＝２２０ｎｍ、Waters調製システム
【００５２】
【表３】
【実施例２】
【００５３】
ポリエチレングリコールでインスリン分泌促進ペプチドを修飾する方法
ポリエチレングリコールによるポリペプチドの修飾は、通常の方法を採用することができる。本発明は、スルフヒドリルを修飾することでスルフィドを形成する方法によるポリエチレングリコールとポリペプチドとの結合を強調する。具体的に言えば、最適化されたエキセンディン−４誘導体のカルボニル（基）端に１個或いは複数のシスティンを加えた後、マレー酸イミド機能基を含有するポリエチレングリコールでポリエチレングリコールの修飾反応を行い、マイクル付加反応後、スルフィド鎖を形成して、ポリペプチドをポリエチレングリコールとを共有原子価の結合をさせる。通常、所要のポリペプチドを０．１Ｍの燐酸塩緩衝液に溶かし、酸素除去した状況で、ポリエチレングリコールを入れる。ポリエチレングリコールとポリペプチドのモル比は１：１である。反応のｐＨは６〜７．５であり、反応液の中にＥＤＴＡを入れるとスルフヒドリルの酸化を減少することができる。２時間反応した後、反応液をＨＰＬＣで分離、精製し、過剰、未反応のポリエチレングリコールはイオン交換の方法で除去することができる。得られた製品は質量スペクトルで分子量を実証し、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びゲルクロマトグラムで純度を分析する。ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．９５の修飾を例として、１つの４３ＫＤ ＰＥＧで修飾する場合、回収率は７０〜９０％（ポリエチレングリコールで計算）である。
【実施例３】
【００５４】
ポリペプチドの安定性の測定
本発明により公開されたエキセンディン−４誘導体は最適化された酵素或いは化学安定性を有する。下記の方法は本発明により公開されたポリペプチドの化学安定性の検査に用いられる。
【００５５】
１ｍｇの各試料を１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭの燐酸ナトリウム塩の緩衝液に溶かし、濃度が４ｍｇ／ｍｌの溶液に調製し、当該溶液のｐＨは８．０である。試料溶液を４０℃のインキュベーターに入れ、液相のクロマトグラム−質量スペクトル連用方法でポリペプチドの純度を検査する。メインピーク面積が消える比例と時間の関係でポリペプチドの化学安定性を表す。
【００５６】
【表４】
【００５７】
表４はエキセンディン−４類化合物の安定性測定表である。
そのうち、試料１：エキセンディン−４と対照。配列は次の通りである。
【００５８】
【化５】
【００５９】
試料２：試料１の中の２＃Ｇｌｙをｄ−Ａｌａにし、３９＃をＣｙｓにする。試料３：試料１の中の２＃Ｇｌｙをｄ−Ａｌａにし、１４＃ＭｅｔをＮｌｅにし、２８＃ＡｓｎをＧｌｎにする。試料４：試料２とＰＥＧ４０ＫをＣ末端のＣｙｓを通して共有原子価結合をさせる、その中、試料１〜４のＣ末端はすべてアミドである。
【００６０】
結論：
試料１の配列は自然界で分離して得られたポリペプチド配列であるが、そのＮ末端のＨｉｓ−Ｇｌｙはジペプチダーゼの適切な基質であり、かつ、それが含有するＭｅｔは酸化し易く、Ａｓｎは自体反応し易いため、何れも試料１の不安定の原因となる。２位、１４位及び２８位の３つの点の交換を通じて、ペプチドの安定性は大きく向上され、かつ、３つとも交換する場合、その安定性の向上程度は、ただＨｉｓ−ＧｌｙをＨｉｓ−ｄＡｌａに交換した時の安定性の向上程度を遥かに超過した。試料２はあまり安定しないが、ＰＥＧ４０Ｋと結合してから（すなわち試料４）、非常に安定になる、これはＰＥＧがポリペプチドの安定性の向上に非常に大きな役割を有することを表した。
【実施例４】
【００６１】
【化６】
【００６２】
［実験例１］
ポリペプチド内服ブドウ糖の耐量実験
配列番号がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２５であるポリペプチドを分子量が４００００ぐらいのポリエチレングリコールで修飾してから（番号：試料５）、正常の小鼠に対して内服ブドウ糖の耐量実験を行い、その結果は下表の通りである。
【００６３】
表５及び表６． 薬の投与量が異なる試料５を皮下注射の方法で正常の小鼠に投与し、１日目と３日目の内服ブドウ糖耐量及び血糖カーブの下の面積の影響が観察できる。
【００６４】
【表５】
【００６５】
【表６】
【００６６】
［実験例２］
ＰＥＧ−エキセンディン−４（ＰＥＧ−ＥＸ−４）の類似物がＩＩ型糖尿病ｄｂ／ｄｂ小鼠に対する影響
１、テストを受ける動物：
種属、品系：ｄｂ／ｄｂ小鼠、出所：南京大学モデル動物センターから提供する、小鼠の体重：３５〜５０ｇ、オスメスが半分ずつ。動物数：４５匹、組当たりに５〜６匹。飼養条件：ＳＰＦクラス動物ハウスで飼養する、温度：２２〜２４℃、湿度：４５−８０％、日差し：１５０〜３００Ｌｘ、１２時間昼夜交替。
【００６７】
２、試験方法：
薬の投与量の設置：０．０３、０．１、０．３、１と３ｍｇ／ｋｇなど５つの薬の投与組を設置する。同時に空白対照組を設置する。薬の投与ルート：皮下注射。薬の投与容積：０．０５ｍｌ／ｋｇ体重。
【００６８】
（１）非禁食の状態でのｄｂ／ｄｂ小鼠の血糖に対する影響
ｄｂ／ｄｂ小鼠は非禁食血糖及び体重によって組を分け、１組には６匹で、オスメスを半分ずつにし、それぞれ空白対象組と５つのＰＥＧ−ＥＸ−４類似物薬投与組となっている。各組の動物にそれぞれ一回テストを受ける薬物と生理塩水を皮下注射し、薬を投与する前及び投与した後の１、２、４、８、２４時間に血糖を測し、それから２４時間置きにその非禁食血糖を測定して、テストを受ける動物の血糖降下作用の維持時間を観察するとともに、各組の動物の薬を投与した後の摂食量及び体重の変化を測定する。
【００６９】
（２）禁食の状態でのｄｂ／ｄｂ小鼠の血糖に対する影響
ｄｂ／ｄｂ小鼠は非禁食、禁食の血糖及び体重によって組を分け、１組には６匹で、オスメスを半分ずつにし、それぞれ空白対象組と５つのＰＥＧ−ＥＸ−４類似物薬投与組となっている。禁食して５時間後の各組の動物にそれぞれ一回テストを受ける薬物と生理塩水を皮下注射し、薬を投与する前及び投与した後の１、２時間に血糖を測り、それから２４時間置きにその非禁食と禁食の血糖を測定して、テストを受ける動物の血糖降下作用の維持時間を観察するとともに、各組の動物の薬を投与した後の摂食量及び体重の変化を測定する。
【００７０】
（３）禁食の状態でのｄｂ／ｄｂ小鼠の糖耐量に対する影響
ｄｂ／ｄｂ小鼠は禁食の血糖及び体重によって組を分け、１組には６匹で、それぞれ空白対象組と５つのＰＥＧ−ＥＸ−４類似物薬投与組となっている。禁食して５時間後にそれぞれ一回テストを受ける薬物と生理塩水を皮下注射し、薬を投与して１５分後にブドウ糖を２．５ｇ／ｋｇを内服させ、ブドウ糖を内服して０、３０、６０と１２０分の時に血糖値を測る。薬を投与して３、６及び９日目に、再度内服糖耐量の試験をそれぞれ行う。テストを受ける動物のｄｂ／ｄｂ糖耐量に対する影響及びその作用の維持時間を観察し、各組の動物の薬を投与した後の摂食量及び体重の変化を測定する。
【００７１】
３、試験結果：図面２〜５及び表７〜表１３を参照。ＰＥＧ−ＥＸ−４類似物がｄｂ／ｄｂ小鼠の血糖に対する影響
（１）禁食と非禁食の状態でのｄｂ／ｄｂ小鼠の血糖に対する影響
【００７２】
【表７】
【００７３】
【表８】
【００７４】
【表９】
【００７５】
（２）禁食の状態でのｄｂ／ｄｂ小鼠の糖耐量に対する影響
【００７６】
【表１０】
【００７７】
【表１１】
【００７８】
【表１２】
【００７９】
【表１３】
【００８０】
［実験例３］
ＰＥＧ−エキセンディン−４（ＰＥＧ−ＥＸ−４）の類似物のＫＫＡｙ小鼠血糖に対する影響の試験結果
１、試験方法：
ＫＫＡｙ小鼠に投与量の異なるＰＥＧ−ＥＸ−４類似物を一回皮下注射した後、異なる時間帯にその血糖変化状況を測定する。
【００８１】
２、試験結果：
（１）図６を参照。ＫＫＡｙ小鼠にＰＥＧ−ＥＸ−４類似物１１００μｇ／ｋｇを１回皮下注射した後、その血糖降下作用が３〜４日間ぐらい維持できる。
（２）図７を参照。ＫＫＡｙ小鼠にＰＥＧ−ＥＸ−４類似物３３００μｇ／ｋｇを１回皮下注射した後、その血糖降下作用が３〜４日間ぐらい維持できる。
【００８２】
以下の表１４〜表１８に、本発明で述べた長効インスリン分泌促進ペプチドのアミノ酸の配列を記載する。
【００８３】
【表１４】
【００８４】
【表１５】
【００８５】
【表１６】
【００８６】
【表１７】
【００８７】
【表１８】
【００８８】
表１４〜表１８で、Ｃ、ｈＣ、Ｋ＊はポリエチレングリコールの修飾点である。そのＣはシスティンであり、ｈＣは高級システィン、Ｋ＊は側鎖が修飾されたライシーンである、例えば、スルフヒドリルプロピオ酸がその側鎖のアミノ基に結合されている。もし、２つのＣＣ、ｈＣｈＣ、或いはＫ＊Ｋ＊が配列に現れる場合、２つのポリエチレングリコールの修飾点があることを意味する。Ｎｌｅはノルロイシンであり、ｄＡｌａはＤ型アラニン、−ＮＨ２はＣ端アミドである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は長効インスリン分泌促進ペプチド誘導体及び製剤的に許容される塩に関わり、具体的に言えば、ポリエチレングリコールによって修飾されたインスリン分泌促進ペプチド化合物及びその製剤的に許容される塩に関わる。本発明はまた、その調製方法、及び該当化合物がすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（Glucagon-like Peptide1, ＧＬＰ−１）の受容体に作用することによって、β−細胞のインスリンの分泌を刺激し、血糖を調整して、ＩＩ型糖尿病の予防、治療に応用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年以来、生活レベルの向上、生活様式の現代化及び社会の老齢化に伴って、世界各地の糖尿病の病気にかかる比率が年年増えている。特にその貧乏から豊かになる発展途上国での上昇率が更に著しい。糖尿病は腫瘍、心脳血管病気に継ぎ、第三位のひどい慢性非伝染病で、致死、障害を起こす主な原因の一つになっている。１９９７年のＷＨＯの報告によれば、全世界での糖尿病患者が既に１．３５億人あり、２０００年には、更に１．７５億人に達すると予測された。中国の最新調査報告によれば、２０歳以上の自然人群れの中に、糖尿病の病気にかかる比率が３．２１％であり、初歩的に推定すると、中国の糖尿病患者は少なくとも２０００万人以上あり、その中の９５％以上がＩＩ型糖尿病患者であることを現している。統計によると、アメリカでは１９８７年から１９９２年まで、毎年直接或いは間接に糖尿病に使う経費支出は１０億ドルから９２０億ドルに増えてきた。中国でも近年糖尿病の治療費用が顕著なスピードで増えている。１９９３年の関連資料に対する統計、分析によれば、当年、直接糖尿病に使われた治療費用が２２．１６億元に達する。なお、この費用は糖尿病による併発症の治療費用、病院以外での治療と保健支出、及び間接的社会経済損失を含まない。
【０００３】
目下、ＩＩ型糖尿病を抑える方法には飲食の制限、体の鍛錬、及び薬物による血糖濃度の調節などがある。最もよく使う薬物はインスリン、スルフリル尿素類、ダブルグアニジン類及び格列ケトン類の化合物である。これらの薬物は体の中の血糖の正常化に主な役割があるが、糖尿病による併発症を更正することができなく、特に腎臓、心血管系統、視学及び神経系統に損傷が生ずる。これらの併発症は糖尿病による致死亡率の増加に直接の関係がある。第一世代の糖尿病を治療する薬物の主要な副作用は、低血糖、体重増加及び水腫である。これらの薬物はその作用機構はそれぞれ違うが、いずれもインスリンの分泌機能を有するβ−細胞を保護する役割がないため、体の中の正常な血糖の代謝と内分泌の調節を維持することができない。ほとんどが単一の薬物では次第に役が立たなくなり、やむを得ず２つ以上の薬物による治療方法を使うことが多い。さらに患者が同時に血圧降下用薬、コレステロール降下用薬を使用する場合が多いため、こういう方案の長期的な効果が人によって違う。従って、血糖を抑える新薬を検討、開発し、目下現有の薬物と協同することで、及びβ−細胞機能の保護及び修復を強調し、内分泌系統が食物の摂取に対する反応を調節することは、糖尿病の治療に対して、革命的に推進である。
【０００４】
すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体のアゴニストに対する研究は大したもので、この分野の研究と開発はＩＩ型糖尿病を治療する分野の新しい一章を開く可能性がある。すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１は１９８４年に発見され、腸内内分泌ホルモンである。ＩＩ型糖尿病患者にこのホルモンを注射すると、その血糖濃度が正常レベルに調節できる（Nathan, DM, et al. Diabetes Care 1992; 15:270-6; Zander, M, et al.
Lancet 2002; 359:824-30）。研究結果によると、すい臓の高血糖素の類似ペプチド及びその受容体のアゴニストの作用は主にすい臓β−細胞表面のすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１の受容体をアクティベーションすることによって、インスリンを分泌するからである。こういう効果は体の中の血糖濃度の高低によって決まるから、こうすれば、伝統的な薬物のように、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１及びその受容体のアゴニストが存在する場合でも、ひどい低血糖のため、生命危険のある低血糖ショックを起こすことがない。具体的に言えば、体の中の血糖濃度が６ｍｍｏｌ／Ｌより高い場合、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１が著しいインスリンの分泌を促進する役割があり、体の中の血糖が正常になる場合、その役割が継続しない。また、こういうアゴニストには、齧歯目動物（鼠）のインスリンβ−細胞の生長を刺激し、β−細胞組織を増加させる作用がある。このようなインスリンβ−細胞を修復する機能はＩＩ型糖尿病の全快に対して前景を描き、少なくともＩＩ型からＩ型への発展を遅らせることができる。また、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１及びその受容体のアゴニストが同時にすい臓の高血糖素の分泌を抑えるため、肝臓血糖の輸出を減らすことが可能である。さらに意義のあることは、こういうアゴニストは有効的に胃腸の能動性及び胃の完全吐き出しを抑えるため、食物の摂取を減らし、体重を減らすことができ、このようにしてＩＩ型糖尿病患者の体重を調節することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nathan, DM, et al. Diabetes Care1992; 15:270-6; Zander, M, et al. Lancet 2002; 359:824-30
【発明の概要】
【発明の効果】
【０００６】
本発明の目的は効果が長いポリエチレングリコールによって修飾されたインスリン分泌促進ペプチド化合物及びその製剤的に許容される塩を提出することにある。これらはすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体をアクティベーションして、インスリンの分泌を促進し、血糖を降下させる役割を有するので、ＩＩ型糖尿病の治療或いはＩＩ型糖尿病の予防に適用できる。このような化合物が体の中で更に長い滞在時間を持ち、効果を発揮できる理由は、ポリエチレングリコールによって修飾された後、腎臓を経由して排出される時間を遅らせたばかりでなく、もっと重要な理由は、そのポリペプチド骨格が体の中でもっといい酵素と化学安定性があるため、ポリエチレングリコールの修飾による長効の役割を保証するので、患者の注射回数を減らすことができ、患者の便利を図り、治療の品質と効果を向上することができる。
【０００７】
具体的に言えば、本発明は配列表に配列されたすべてのポリエチレングリコールの修飾に用いられるプレーカーソルポリペプチド、及び異なる分子量のポリエチレングリコールで修飾して生成された化合物及びその製剤的に許容される塩を含むが、またこれらに限られたものではない。
【０００８】
本発明のもう１つの目的は、ポリエチレングリコールで修飾した長効のインスリン分泌促進ペプチド化合物及びその製剤的に許容される塩を調製する方法を提出することにある。
【０００９】
本発明のまた１つの目的は、これらの長効のインスリン分泌促進ペプチド誘導体及び／或いはその製剤的に許容される塩がすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストとして、ＩＩ型糖尿病の予防、治療に応用することにある。
【００１０】
本発明の目的は下記の技術案によって実現されたもので、本発明はインスリン分泌促進ペプチド及びその製剤的に許容される塩に関わり、そのポリペプチド骨格は最適化された体内酵素及び化学安定性を有する。特に、本発明はインスリン分泌促進ペプチドに関わり、それは（Ａ）配列番号（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．）４〜１４１に示されたアミノ酸配列を含み、（Ｂ）は配列番号４〜１４１に示されたアミノ酸配列と実質的には同じアミノ酸配列を含む。 本発明は、また配列番号４〜１４１に示されたインスリン分泌促進ペプチドアミノ酸配列において、特に２番目、１４番目、２７番目、２８番目に対して、一つまたは一つ以上のポリエチレングリコールで修飾して得られたインスリン分泌促進ペプチド及びその製剤的に許容される塩に関する。前記ポリエチレングリコールの分子量は５，０００〜８０，０００であり、好ましくは２０，０００〜６０，０００である。本発明のこれらインスリン分泌促進ペプチドのアミノ酸化合物は肝心な修飾部分を持ち、それはインスリン分泌促進ペプチドアミノ酸配列の２番目、１４番目、２７番目、２８番目を含む。 また、本発明は上記インスリン分泌促進ペプチド及びその製剤的に許容される塩を調製する方法に関わり、その中に、固体相と液相の合成方法、ＨＰＬＣ、イオン交換及びゲル濾過精製方法及び冷凍乾燥を含む。
【００１１】
さらに、本発明はポリエチレングリコールで修飾する前或いは修飾した後のインスリン分泌促進ペプチド誘導体及びその製剤的に許容される塩がＩＩ型糖尿病の治療及び／或は予防の面での応用を提供する。
【００１２】
臨床実験データによれば、血糖濃度のコントロールが割合に悪いＩＩ型糖尿病患者に対して、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）で治療する場合、その空腹血糖濃度が正常（Gutniak, et al, New Eng. J. Med. 326:1316-1322,1992）に快復できる。長期に亘ってすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）を使用すると、そのβ−細胞の機能が正常の人と同じレベル（Rachman, et al., Diabetes
45:1524-1530,1996）になることができる。すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、ブドウ糖へ耐える機能が不健全の患者のベータ−細胞に対して、ブドウ糖に回答する機能を改善することができる（Byrne, et al., Diabetes47:1259-1265,1998）。但し、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）が体内では非常に容易にジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰＩＶ）の破壊によって活性を失ってしまうとともに、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）にもその他のエンドペプチダーゼ（例えばＮＥＰ２４．１１）の切断位点が存在しているので、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の体内での役割は短期間なものであるため、連続的に薬を与える方法を採用しないと、本当の治療効果を奏することができない。そのため、大部分の実験室はもっと安定したすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストの開発に力を入れている。これらの化合物は主にすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）本体を修飾することによって形成されたものである。非常に重要なのは、８０年代末、９０年代のはじめごろ、Ｅｎｇらはアメリカの西南部のトカゲ（Gila Monster, Heloderma Sespectrum）の唾液分泌器官からエキセンディン−４（Eng, J., et al., J.Biol. Chem.,265:20259-62, 1990, Eng, J., et al.,
J.Biol. Chem., 267:7402-05,1992）を分離した。エキセンディン−４は３９のアミノ酸を有するポリペプチドであり、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）と５３％の相同性を有する。エキセンディン−４はすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体と親和力があり、その能力もすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）本体より強い。体内におけるエキセンディン−４の体内血糖代謝調節能力はすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）よりもいいし、インスリンの分泌を促進する役割が生ずるに必要の濃度はすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）より低く、かつ、体内での半減期がすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）よりさらに長い（Kudsen, L.B.J.Med. Chem. 47:4128-4134,2004）。これは主にエキセンディン−４が独特の酵素安定性を有するからであり、これらの酵素安定性は主にポリペプチドの体内の酵素（例えばＮＥＰ２４．１１）の切断位点を削除したことから生まれる。
【００１３】
目下、大量の文献の中で、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニスト機能を有する化合物、例えば、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３７）、エキセンディン−４及びその他のＧＬＰ−１とエキセンディン−４の誘導体を報告した。これらの文献は、ＷＯ９８／４３６５８、ＷＯ００／１５２２４、ＷＯ００／６６６２９、ＷＯ０１／９８３３１、ＷＯ０１／０４１５６、ＵＳＰ
Ｎｏ．５，５４５，６１８、ＵＳＰ Ｎｏ．５，１１８、ＷＯ０３／０５８２０３、ＵＳ出願番号６０／３９５，７３８、ＷＯ０４／０２２００４及びその中で引用した文献などを含む。
【００１４】
次に天然存在するＧＬＰ−１の受容体アゴニストの比較を表す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
式の中の英文頭文字はＨ（Ｈｉｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｐ（Ｐｒｏ）である。
【００１７】
多くの実験室がもっと安定するすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストを開発しているが、それの体内での作用効果はやはり短いので、長効であり、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体激動機構によるインスリン分泌促進ペプチド誘導体の開発が目の前に迫っている。このような化合物の治療作用と副作用（嘔吐と吐き気）を起こすウインドーが狭いので、緩釈製剤を貯蔵して解決する方法は成功する確率がやはり小さい。長い効果のすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストの獲得を解決する方法は、体内で十分の滞留時間を有し、安定な化合物を生成することによって実現することしかない。
【００１８】
ポリエチレングリコールを活性蛋白とポリペプチドの中に導入すると、活性蛋白とポリペプチドの滞留時間を延長できる。この技術はすでに多くの蛋白質を主とする生物薬物の応用に成功した、例えば、ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ，
ＰＥＧＡＳＹＳ， Ｎｅｕｌａｓｔａ， Ｓｏｍａｖｅｒｔなど。ポリエチレングリコールをポリペプチド或いは蛋白骨格に導入する方法と化学は関連文献を参考する。例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅの要約（Veronese, FM, Biomaterial 2001 22:405-417）。すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）とエキセンディン−４はすべてすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体である事実に鑑み、アメリカ特許ＵＳＰ０５４２４２８６およびＷＯ９８／０５３５１は、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）とエキセンディン−４の体内インスリンの分泌を促進する作用の比較実験を報告した。当該実験によれば、エキセンディン−４の体内作用がすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）より強く、且つ、時間がすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）より長いが、その原因としては、エキセンディン−４が体内のポリペプチド水解酵素に対して、もっと安定的であるからである（ＤＰＰ
ＩＶ， ＮＥＰ２４．１１など）。ＷＯ２００４／０２２００４は、ポリエチレングリコールで修飾したすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストを開示し、かつ、使用するポリエチレングリコールの分子量が３００００（ダルトン）以上の場合、獲得した誘導体は頭脳内のすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体の活性化による吐気と嘔吐などの副作用がなくなる可能性があると示した。これはポリエチレングリコールで修飾したすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストは、体内の作用時間を延長するばかりでなく、副作用を削減する可能性もあることを表した。しかし、これら公開された化合物は体内、体外の活性に制限があるほかに、そのポリペプチド骨格の体内酵素及び化学安定性が改善できていなく、これらの化合物が長効製剤になる可能性を制限した。その弱くなった体内、体外活性が生産コストを向上させる。それで、酵素の安定性がいいエキセンディン−４の骨格をポリエチレングリコールで修飾するプレーカーソルの起点とすると、成功の可能性がもっと大きくなる。ＷＯ００／６６６２９には、直接エキセンディン−４をポリエチレングリコールの修飾プレーカーソルとして得られた化合物と方法を示したが、真の長効で、安定した、低コストの薬品の獲得とはかなり距離がある。その理由として、エキセンディン−４の体内滞留時間が従来の数時間から数十時間、さらにもっと長い時間に延長されたが、そのＮ端のＨｉｓ−Ｇｌｙはやはりディペプチドの制限性内切酵素（例えばＤＰＰ
ＩＶ）に切られる可能性があり、すい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体激動の活性機能を失活させることがある。同様に、長効のポリエチレングリコールで修飾したすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストは、また優れる化学安定性を有しなければならない。特に体温が３７℃の下で優れる化学安定性を有しなければならないが、エキセンディン−４の骨格の中の１４位メチオニンは容易に酸化され、生物活性の変化を起こしやすいと同時に、製剤の生産にも影響を与え、２８位のアスパラギンの加水分解は薬物が失活され、及び製剤困難の主要原因となる。その加水分解の機構は下記の通りである。
【００１９】
【化１】
【００２０】
加水分解の機構から、アスパラギンが存在により、発生した五員環加水分解は修飾されたすい臓の高血糖素の類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の受容体アゴニストの活性を降下させるばかりでなく、また、ポリエチレングリコールとポリペプチドの骨格の分離を引き起こし、長効化合物の体内での滞留時間に影響を与えることが分かる。そのため、２位のグリシンに対する修正はエキセンディン−４のポリペプチドを基にする酵素安定性と化学安定性をアップさせる。１４位のメチオニンと２８位のアスパラギンに対する修正はエキセンディン−４のポリペプチドを基にする化学安定性をアップさせる。ＷＯ００／６６６２９は、ポリエチレングリコールによるエキセンディン−４の修飾で導入されたライシーン側鎖アミノ基によってアシル化反応を行い、ポリエチレングリコールの結合物を生成することを強調する。エキセンディン−４本体に同時にライシーンが存在するため、このように修飾した反応選択性は保護基を使用することで実現するしかなく、生産コストに自然的に影響を与える。ポリエチレングリコールを修飾、連結する切断位点と反応専一の基をポリペプチドのカルボキシル（基）側（Ｃ−側）に置くのは、ポリエチレングリコールのポリペプチドとその受容体に対する作用の影響を減らすことでなく、逆に反応が専一であるため、生産コストも明らかに低下する。
【００２１】
本発明は、１シリーズの２位、１４位、２７位或いは２８位がポリエチレングリコールにより修正されたエキセンディン−４の誘導体、及びこれらのポリペプチド骨格を用いてポリエチレングリコールの修飾を行って得られたインスリン分泌促進ペプチドを開示する。これらのポリエチレングリコールで修飾したインスリン分泌促進ペプチドは体内で長い効果を有し、長効注射剤に調製して使用することができる。
【００２２】
本発明が公開したインスリン分泌促進ペプチド化合物は、体内と体外でβ−細胞表面にあるＧＬＰ−１の受容体を活性化してインスリンを分泌する機能を有するため、血糖濃度を低下させる。これらインスリン分泌促進ペプチドの例は表１に挙げたポリペプチドの配列とポリエチレングリコールで修飾して得られた化合物を含むが、またこれらに限定されたものではない。ポリエチレングリコールの修飾ポイントとして、３９位のＳ（Ｓｅｒ）の代わりにシスティン或いはその他スルフヒドリルを含有する合成アミノ酸を使うことができる。同様に、ポイントの多いポリエチレングリコールの修飾は下記の方式によって完成でき、それはカルボキシル（基）側に２つ或いは複数のスルフヒドリルを含有するアミノ酸（例えば、システィン）を加えて、これらの延長されたポリペプチド誘導体をポリエチレングリコールの修飾用プレーカーソルとする。その２点修飾の通式はＣｙｓ（３９）−（Ｘａａ）（ｎ−１）−Ｃｙｓ（ｎ＋３９）であり、そのうち、ｎ＝１−１０であり、Ｘａａは任意のアミノ酸である。
【００２３】
これらのポリペプチドは化学合成の方法で調製でき、その中に液体相セグメント合成、固体相合成（Merrifield. J. Am. Chem. Soc. 1963. 85:2149-2154を参照）或いは固体相、液体相結合の方法などを含む。ポリペプチド合成は手動と自動の方式があり、自動方式を採用する場合は、Applied Biosystems 431Aポリペプチド合成計器、Ｃｓｂｉｏポリペプチド合成用計器などを使ってもいい。また、ポリペプチド合成はユニット合成の方法を採用してもいい。
【００２４】
化学合成によって調製されたポリペプチドは、ＨＰＬＣ調製方法で精製する必要があり、通常は逆相材料を柱充填物とする（例えば、Ｃ４、Ｃ８、Ｃ１８）。得られたポリペプチドは分析・鑑定により（例えば、効率の高い液体相クラマトグラム（ＨＰＬＣ）、質量スペクトル（ＭＳ）、アミノ酸分析（ＡＡＡ））証明した後に、初めて体外、体内の薬効研究を進めることができる。これらの化合物はＨＰＬＣの調製方法で精製してから、冷凍、乾して製品となる。
【００２５】
ポリエチレングリコールは各メーカーから購入或いは周知の方式で合成できる。ポリエチレングリコールの分子量範囲は５０００〜８０，０００ダルトンであり、好ましくは２０，０００〜６０，０００ダルトンであり、より好ましくは４０，０００ダルトンぐらいである。
【００２６】
ポリエチレングリコールとポリペプチドは、ポリペプチドのカルボキシル（基）側で連結されるべきで、こうすれば、ポリエチレングリコール鎖のポリペプチド自身及びその受容体の間の作用に対する干渉を最低限度に減少できる。すなわち、ポリエチレングリコールは２９から３９までの残基の何れかの位置に連結することができる。これはスルフヒドリルを含むアミノ酸（例えば、システィン）で、任意の１つ或いは同時に数個のアミノ酸を置換することを要求する。もし単一位点でポリエチレングリコールの修飾をする場合、システィンでカルボキシル（基）側の３９位にあるＳ（Ｓｅｒ）を置換したほうが一番好ましい。同様に、２点修飾の場合、システィンで３９位にあるＳ（Ｓｅｒ）を置換してから、さらにシスティンを４０位、或いは３９＋ｎ位（ｎ＝１−１０）に入れたほうが一番好ましい。
【００２７】
システィン或いはスルフヒドリルを利用してポリエチレングリコールを連結する方法は、多くの文献において記述されている（Veronese, Biomaterials 2001, 22:405-417を参照）。化学訓練を受けた技術者ならば、誰でもポリエチレングリコールをスルフヒドリルを含有するインスリン分泌促進ペプチドに連結することができる。
【００２８】
具体的に言えば、スルフヒドリルを利用して連結反応を実現するには下記の方式を用いる。
１）スルフヒドリルはポリペプチドチェーンからできて、下記の式で表されるアミノ酸を導入する。
【００２９】
【化２】
【００３０】
この時のポリエチレングリコールは、マイクル付加引受体、例えばマレーイミドの中の二本鎖、ハロゲン及びスルフォンエステルより置換された基を含み、ポリペプチドとポリエチレングリコールはスルフィド鎖を形成して連結される。
２）スルフヒドリルが改良されたポリペプチド中のアミノ酸の側鎖からできて、例えば、スルフヒドリルがライシーンの側鎖アミノ基に連結される。側鎖が修正されたアミノ酸は下記の式の通りである。
【００３１】
【化３】
【００３２】
この時のポリエチレングリコールは、マイクル付加引受体、例えばマレーイミドの中の二本鎖、ハロゲン及びスルフォンエステルより置換された基を含み、ポリペプチドとポリエチレングリコールはスルフィド鎖を形成して連結される。
３）スルフヒドリルはポリエチレングリコールからできて、この時のポリペプチドの連結ポイントは、マイクル付加引受体、例えばマレーイミドの中の二本鎖、ハロゲン及びスルフォンエステルより置換された基を含み、ポリペプチドとポリエチレングリコールはスルフィド鎖を形成して連結される。
４）ポリエチレングリコールとポリペプチドがいずれももにスルフヒドリルを含む場合、不対称の−Ｓ−Ｓ−を形成することによって連結される。
【００３３】
ポリエチレングリコールと本発明で公開したポリペプチドは、スルフィドを形成することで共有原子価結合を形成することが好ましいが、ポリエチレングリコールとこれらのポリペプチドの結合は共有原子価結合に限らず、例えばアシル化反応、還元アミノ化反応、オキシーム形成反応などの結合方式も本発明に含まれる。
【００３４】
本発明におけるポリエチレングリコールの修飾に適合するプレーカーソルポリペプチド誘導体としては表１に記載のものが挙げられるが、これはいずれも本発明で挙げられた例に過ぎなく、本発明はこの配列に限定されたものではない。当該配列表において、好ましいポリペプチドの配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ８０〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１４１から選択される。
【００３５】
これらのポリエチレングリコールで修飾されたインスリン分泌促進ペプチド及びそのポリペプチドのプレーカーソル自体は両性の化合物で、酸性或いはアルカリ性物質と反応して塩を形成することができる。通常、塩の形成に用いられる酸としては、塩酸、アンモニウムブロム酸、水素ヨード酸、硫酸、燐酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メチルスルフォン、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、琥珀酸、クエン酸、安息香酸、酢酸、トリフルオロ酢酸などから選択される。これらの塩の例としては、硫酸塩、ピロホスフェート、重硫酸塩、亜硫酸塩、サルファイト、燐酸塩、燐酸水素塩、燐酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロホスフェート、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、アセテート、プロピオネート、カプリン酸塩、オクチル酸塩、アクリレート、蟻酸塩、イソブチレート、ヘキシル酸塩、へプチル酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、マロナート、琥珀酸塩、スベラート、セバケート、フマル酸塩、マレー酸塩、ブチンー１、４−ジカルボキシラート、ヘキシンー１、６−ジカルボキシラート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、ｐ−メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、クエン酸塩、乳酸塩、ｒ−ヒドロキシブチレート、グリセリン酸塩、タートレート、メタンスルホン酸塩、プロピルスルホン酸塩、ナフタレンー１−スルホン酸塩、ナフタレンー２−スルホン酸塩、マンデラートなどが挙げられる。好ましい酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩である。通常、塩に使用されるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、炭酸カリウムなどから選択される。
【００３６】
本発明においてインスリン分泌促進ペプチド化合物、特にポリエチレングリコールで修飾したインスリン分泌促進ペプチド化合物は、βー細胞機能を修復する潜在力を有するため、ＩＩ型糖尿病の予防、治療に用いることができ、特に体重が重すぎ、ひいては肥満による分泌の不正常の患者の治療に使うことができる。
【００３７】
それで、本発明はまたＩＩ型糖尿病の治療及び／或は予防の方法に関わり、その中にで、ＩＩ型糖尿病の治療及び／或は予防が必要の患者に、薬物の有効投与量の本発明のインスリン分泌促進ペプチドを使用する。
【００３８】
本発明により公開されたインスリン分泌促進ペプチド化合物は、糖尿病の治療に用いる場合、単独に使用することができが、その他の糖尿病用薬と組み合わせて使用することがさらに好ましい（例えば、ＰＰＡＲアゴニスト、スルフリル尿素類薬、非スルフリル尿素類似物（Secretagogues）、α−グルコシダーゼ（ａ−ブドウ糖カンゾウ酵素）
抑制剤、インスリン敏感度増加剤、インスリン分泌促進物質、グリコーゲン釈放抑制剤、インスリンとその他抗肥満薬）。
【００３９】
臨床使用量は具体的な化合物の薬効によって決めるべきであり、その範囲は０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から約２００ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、最も好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ／ｋｇ体重である。投与方式は注射方式（静脈注射、肌注射、皮下注射を含む）或いはその他の連続注射方式が採用できる。これらの化合物はまた色々な製剤に作ることができ、その他の常規ルートで投与することができる、例えば、内服、皮膚から投与、肺、鼻、口噴霧剤、座薬など。
【００４０】
本発明をさらに詳しく説明するために、下記の実施例をあげるが、本発明の範囲はこれらに限定されたものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９５のＬＣ−ＭＳ図である。
【図２】図２は、ｄｂ／ｄｂ小鼠のＰＥＧ−ＥＸ−４類似物を皮下注射した当日に糖耐量に対する影響を示す。
【図３】図３は、ｄｂ／ｄｂ小鼠のＰＥＧ−ＥＸ−４類似物を皮下注射した３日目に糖耐量に対する影響を示す。
【図４】図４は、ｄｂ／ｄｂ小鼠のＰＥＧ−ＥＸ−４類似物を皮下注射した６日目に糖耐量に対する影響を示す。
【図５】図５は、ｄｂ／ｄｂ小鼠のＰＥＧ−ＥＸ−４類似物を皮下注射した９日目に糖耐量に対する影響を示す。
【図６】図６は、小鼠のＰＥＧ−ＥＸ−４類似物を１１００μｇ／ｋｇ皮下注射した後の血糖の降下作用を示す。
【図７】図７は、小鼠のＰＥＧ−ＥＸ−４類似物を３３００μｇ／ｋｇ皮下注射した後の血糖の降下作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００４２】
本発明で得られた化合物ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９５の固体相合成調製
（１）合成に用いられるアミノ酸単体
【００４３】
【化４】
上記の略語はＦｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、Ｂｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニル基、Ｔｒｔ：トリベンジル基。ＯｔＢＵ：ｔ−ブトキシ基。ｔＢｕ：ｔ−ブチル基である。
【００４４】
（２）使用薬品：試薬はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、ヘキサヒドロピリジン、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｒｉｎｋ
ａｍｉｄｅ樹脂、ニンビドリン、メタノール、フェニルメチルエーテル、ジイソプロピルシラン、トリフルオロ醋酸である。
【００４５】
（３）操作
Ａ．合成：０．２５ｍｍｏｌの規模を例として、０．５ｇのＲｉｎｋのアミド樹脂を量って、リアクタの中に入れ、１ｍｍｏｌのアミノ酸を量って、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ方法で活性化し、ポリペプチドの配列に従って、Ｃ端からＮ端まで順次に合成を行う。反応は２５℃の室温で行うべきであり、下記のステップに従って操作する。
【００４６】
１．２０％のヘキサヒドロピリジンのＤＭＦ溶液で保護基のＦｍｏｃを除去し、１０分／回にする。
２．１０ｍｌのＤＭＦで３回洗浄し、完全に吸い込む。
３．保護用のアミノ酸（１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１ｍｍｏｌ）を量り取り、１０
ｍｌのＤＭＦの中に溶かし、ＤＩＣ（１ｍｍｏｌ）を入れて、１０分間活性化する。
【００４７】
４．前記活性化されたアミノ酸溶液をリアクタの中に入れ、１時間揺れて反応させる。
５．ＤＭＦで樹脂を３回洗浄し、完全に吸い込む。
６．もしニンビドリンの反応が陰性を示す場合、次のサイクルを行い、１から５のステップを再度実行する。もしニンビドリンの反応が陽性と表示すれば、３から５までのステップを繰り返す。
【００４８】
Ｂ．保護基の除去及びポリペプチドの切除
ポリペプチド付の樹脂１ｇをリアクタの中に入れ、断裂溶液を入れる。比例は下表の通りである。
【００４９】
【表２】
【００５０】
室温で２時間振とうしてから、濾過し、濾過液を収集し、少量の酢酸で樹脂を洗浄する。収集液を合併して濃縮した後、エーテルを入れて沈殿させ、沈殿を濾過し、少量のエーテルで洗浄して、粗製品を得る。
【００５１】
Ｃ．ＨＰＬＣの分離精製、冷凍乾燥
得られた粗製品を少量の１０％酢酸溶液に溶かし、ポールをつけ、ＨＰＬＣの分離精製、冷凍乾燥を行ってから製品を得る、得られたポリペプチドは、クロマトグラムと質量スペクトルとを連用して測定したところ、目的の化合物であることが確認できた。
クロマトグラムポール：lina C18 (2), 5μ,100Å
分離波長：λ＝２２０ｎｍ、Waters調製システム
【００５２】
【表３】
【実施例２】
【００５３】
ポリエチレングリコールでインスリン分泌促進ペプチドを修飾する方法
ポリエチレングリコールによるポリペプチドの修飾は、通常の方法を採用することができる。本発明は、スルフヒドリルを修飾することでスルフィドを形成する方法によるポリエチレングリコールとポリペプチドとの結合を強調する。具体的に言えば、最適化されたエキセンディン−４誘導体のカルボニル（基）端に１個或いは複数のシスティンを加えた後、マレー酸イミド機能基を含有するポリエチレングリコールでポリエチレングリコールの修飾反応を行い、マイクル付加反応後、スルフィド鎖を形成して、ポリペプチドをポリエチレングリコールとを共有原子価の結合をさせる。通常、所要のポリペプチドを０．１Ｍの燐酸塩緩衝液に溶かし、酸素除去した状況で、ポリエチレングリコールを入れる。ポリエチレングリコールとポリペプチドのモル比は１：１である。反応のｐＨは６〜７．５であり、反応液の中にＥＤＴＡを入れるとスルフヒドリルの酸化を減少することができる。２時間反応した後、反応液をＨＰＬＣで分離、精製し、過剰、未反応のポリエチレングリコールはイオン交換の方法で除去することができる。得られた製品は質量スペクトルで分子量を実証し、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びゲルクロマトグラムで純度を分析する。ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．９５の修飾を例として、１つの４３ＫＤ ＰＥＧで修飾する場合、回収率は７０〜９０％（ポリエチレングリコールで計算）である。
【実施例３】
【００５４】
ポリペプチドの安定性の測定
本発明により公開されたエキセンディン−４誘導体は最適化された酵素或いは化学安定性を有する。下記の方法は本発明により公開されたポリペプチドの化学安定性の検査に用いられる。
【００５５】
１ｍｇの各試料を１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭの燐酸ナトリウム塩の緩衝液に溶かし、濃度が４ｍｇ／ｍｌの溶液に調製し、当該溶液のｐＨは８．０である。試料溶液を４０℃のインキュベーターに入れ、液相のクロマトグラム−質量スペクトル連用方法でポリペプチドの純度を検査する。メインピーク面積が消える比例と時間の関係でポリペプチドの化学安定性を表す。
【００５６】
【表４】
【００５７】
表４はエキセンディン−４類化合物の安定性測定表である。
そのうち、試料１：エキセンディン−４と対照。配列は次の通りである。
【００５８】
【化５】
【００５９】
試料２：試料１の中の２＃Ｇｌｙをｄ−Ａｌａにし、３９＃をＣｙｓにする。試料３：試料１の中の２＃Ｇｌｙをｄ−Ａｌａにし、１４＃ＭｅｔをＮｌｅにし、２８＃ＡｓｎをＧｌｎにする。試料４：試料２とＰＥＧ４０ＫをＣ末端のＣｙｓを通して共有原子価結合をさせる、その中、試料１〜４のＣ末端はすべてアミドである。
【００６０】
結論：
試料１の配列は自然界で分離して得られたポリペプチド配列であるが、そのＮ末端のＨｉｓ−Ｇｌｙはジペプチダーゼの適切な基質であり、かつ、それが含有するＭｅｔは酸化し易く、Ａｓｎは自体反応し易いため、何れも試料１の不安定の原因となる。２位、１４位及び２８位の３つの点の交換を通じて、ペプチドの安定性は大きく向上され、かつ、３つとも交換する場合、その安定性の向上程度は、ただＨｉｓ−ＧｌｙをＨｉｓ−ｄＡｌａに交換した時の安定性の向上程度を遥かに超過した。試料２はあまり安定しないが、ＰＥＧ４０Ｋと結合してから（すなわち試料４）、非常に安定になる、これはＰＥＧがポリペプチドの安定性の向上に非常に大きな役割を有することを表した。
【実施例４】
【００６１】
【化６】
【００６２】
［実験例１］
ポリペプチド内服ブドウ糖の耐量実験
配列番号がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２５であるポリペプチドを分子量が４００００ぐらいのポリエチレングリコールで修飾してから（番号：試料５）、正常の小鼠に対して内服ブドウ糖の耐量実験を行い、その結果は下表の通りである。
【００６３】
表５及び表６． 薬の投与量が異なる試料５を皮下注射の方法で正常の小鼠に投与し、１日目と３日目の内服ブドウ糖耐量及び血糖カーブの下の面積の影響が観察できる。
【００６４】
【表５】
【００６５】
【表６】
【００６６】
［実験例２］
ＰＥＧ−エキセンディン−４（ＰＥＧ−ＥＸ−４）の類似物がＩＩ型糖尿病ｄｂ／ｄｂ小鼠に対する影響
１、テストを受ける動物：
種属、品系：ｄｂ／ｄｂ小鼠、出所：南京大学モデル動物センターから提供する、小鼠の体重：３５〜５０ｇ、オスメスが半分ずつ。動物数：４５匹、組当たりに５〜６匹。飼養条件：ＳＰＦクラス動物ハウスで飼養する、温度：２２〜２４℃、湿度：４５−８０％、日差し：１５０〜３００Ｌｘ、１２時間昼夜交替。
【００６７】
２、試験方法：
薬の投与量の設置：０．０３、０．１、０．３、１と３ｍｇ／ｋｇなど５つの薬の投与組を設置する。同時に空白対照組を設置する。薬の投与ルート：皮下注射。薬の投与容積：０．０５ｍｌ／ｋｇ体重。
【００６８】
（１）非禁食の状態でのｄｂ／ｄｂ小鼠の血糖に対する影響
ｄｂ／ｄｂ小鼠は非禁食血糖及び体重によって組を分け、１組には６匹で、オスメスを半分ずつにし、それぞれ空白対象組と５つのＰＥＧ−ＥＸ−４類似物薬投与組となっている。各組の動物にそれぞれ一回テストを受ける薬物と生理塩水を皮下注射し、薬を投与する前及び投与した後の１、２、４、８、２４時間に血糖を測し、それから２４時間置きにその非禁食血糖を測定して、テストを受ける動物の血糖降下作用の維持時間を観察するとともに、各組の動物の薬を投与した後の摂食量及び体重の変化を測定する。
【００６９】
（２）禁食の状態でのｄｂ／ｄｂ小鼠の血糖に対する影響
ｄｂ／ｄｂ小鼠は非禁食、禁食の血糖及び体重によって組を分け、１組には６匹で、オスメスを半分ずつにし、それぞれ空白対象組と５つのＰＥＧ−ＥＸ−４類似物薬投与組となっている。禁食して５時間後の各組の動物にそれぞれ一回テストを受ける薬物と生理塩水を皮下注射し、薬を投与する前及び投与した後の１、２時間に血糖を測り、それから２４時間置きにその非禁食と禁食の血糖を測定して、テストを受ける動物の血糖降下作用の維持時間を観察するとともに、各組の動物の薬を投与した後の摂食量及び体重の変化を測定する。
【００７０】
（３）禁食の状態でのｄｂ／ｄｂ小鼠の糖耐量に対する影響
ｄｂ／ｄｂ小鼠は禁食の血糖及び体重によって組を分け、１組には６匹で、それぞれ空白対象組と５つのＰＥＧ−ＥＸ−４類似物薬投与組となっている。禁食して５時間後にそれぞれ一回テストを受ける薬物と生理塩水を皮下注射し、薬を投与して１５分後にブドウ糖を２．５ｇ／ｋｇを内服させ、ブドウ糖を内服して０、３０、６０と１２０分の時に血糖値を測る。薬を投与して３、６及び９日目に、再度内服糖耐量の試験をそれぞれ行う。テストを受ける動物のｄｂ／ｄｂ糖耐量に対する影響及びその作用の維持時間を観察し、各組の動物の薬を投与した後の摂食量及び体重の変化を測定する。
【００７１】
３、試験結果：図面２〜５及び表７〜表１３を参照。ＰＥＧ−ＥＸ−４類似物がｄｂ／ｄｂ小鼠の血糖に対する影響
（１）禁食と非禁食の状態でのｄｂ／ｄｂ小鼠の血糖に対する影響
【００７２】
【表７】
【００７３】
【表８】
【００７４】
【表９】
【００７５】
（２）禁食の状態でのｄｂ／ｄｂ小鼠の糖耐量に対する影響
【００７６】
【表１０】
【００７７】
【表１１】
【００７８】
【表１２】
【００７９】
【表１３】
【００８０】
［実験例３］
ＰＥＧ−エキセンディン−４（ＰＥＧ−ＥＸ−４）の類似物のＫＫＡｙ小鼠血糖に対する影響の試験結果
１、試験方法：
ＫＫＡｙ小鼠に投与量の異なるＰＥＧ−ＥＸ−４類似物を一回皮下注射した後、異なる時間帯にその血糖変化状況を測定する。
【００８１】
２、試験結果：
（１）図６を参照。ＫＫＡｙ小鼠にＰＥＧ−ＥＸ−４類似物１１００μｇ／ｋｇを１回皮下注射した後、その血糖降下作用が３〜４日間ぐらい維持できる。
（２）図７を参照。ＫＫＡｙ小鼠にＰＥＧ−ＥＸ−４類似物３３００μｇ／ｋｇを１回皮下注射した後、その血糖降下作用が３〜４日間ぐらい維持できる。
【００８２】
以下の表１４〜表１８に、本発明で述べた長効インスリン分泌促進ペプチドのアミノ酸の配列を記載する。
【００８３】
【表１４】
【００８４】
【表１５】
【００８５】
【表１６】
【００８６】
【表１７】
【００８７】
【表１８】
【００８８】
表１４〜表１８で、Ｃ、ｈＣ、Ｋ＊はポリエチレングリコールの修飾点である。そのＣはシスティンであり、ｈＣは高級システィン、Ｋ＊は側鎖が修飾されたライシーンである、例えば、スルフヒドリルプロピオ酸がその側鎖のアミノ基に結合されている。もし、２つのＣＣ、ｈＣｈＣ、或いはＫ＊Ｋ＊が配列に現れる場合、２つのポリエチレングリコールの修飾点があることを意味する。Ｎｌｅはノルロイシンであり、ｄＡｌａはＤ型アラニン、−ＮＨ２はＣ端アミドである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．）１７〜１４１（配列番号９５を除く）に示されたアミノ酸配列、あるいは、（Ｂ）配列番号１７〜１４１（配列番号９５を除く）に示されたアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を含有するインスリン分泌促進ペプチド。
【請求項２】
配列番号１７〜１４１（配列番号９５を除く）に示されたアミノ酸配列に対し、ポリエチレングリコールで修飾して得られたインスリン分泌促進ペプチド及びその製剤的に許容される塩を含んでいる請求項１に記載のインスリン分泌促進ペプチド。
【請求項３】
さらに配列番号１７〜１４１（配列番号９５を除く）に示されたインスリン分泌促進ペプチドのアミノ酸配列において、２番目、１４番目及び又は２８番目に対して、一つ又は一つ以上のポリエチレングリコールで修飾して得られたインスリン分泌促進ペプチド及びその製剤的に許容される塩を含んでいる請求項２に記載のインスリン分泌促進ペプチド。
【請求項４】
ポリエチレングリコールの分子量範囲が５，０００〜８０，０００である、請求項２に記載のインスリン分泌促進ペプチド。
【請求項５】
ポリエチレングリコールの分子量範囲が２０，０００〜６０，０００である、請求項２に記載のインスリン分泌促進ペプチド。
【請求項６】
インスリン分泌促進ペプチドの製剤的に許容される塩を含む、請求項１〜請求項５のいずれかに記載のインスリン分泌促進ペプチド。
【請求項７】
固体相と液相の合成、ＨＰＬＣ、イオン交換、ゲル濾過精製及び冷凍乾燥を含む、請求項１または２に記載のインスリン分泌促進ペプチド及びその製剤的に許容される塩の調製方法。
【請求項８】
請求項１または２に記載のインスリン分泌促進ペプチド及び／またはその製剤的に許容される塩のＩＩ型糖尿病の治療及び／または予防における使用。
【請求項９】
ＩＩ型糖尿病の治療及び／または予防を要する患者に、治療有効量の請求項１に記載のインスリン分泌促進ペプチドを投与するＩＩ型糖尿病の治療及び／または予防方法。
【請求項１】
（Ａ）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．）１７〜１４１（配列番号９５を除く）に示されたアミノ酸配列、あるいは、（Ｂ）配列番号１７〜１４１（配列番号９５を除く）に示されたアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を含有するインスリン分泌促進ペプチド。
【請求項２】
配列番号１７〜１４１（配列番号９５を除く）に示されたアミノ酸配列に対し、ポリエチレングリコールで修飾して得られたインスリン分泌促進ペプチド及びその製剤的に許容される塩を含んでいる請求項１に記載のインスリン分泌促進ペプチド。
【請求項３】
さらに配列番号１７〜１４１（配列番号９５を除く）に示されたインスリン分泌促進ペプチドのアミノ酸配列において、２番目、１４番目及び又は２８番目に対して、一つ又は一つ以上のポリエチレングリコールで修飾して得られたインスリン分泌促進ペプチド及びその製剤的に許容される塩を含んでいる請求項２に記載のインスリン分泌促進ペプチド。
【請求項４】
ポリエチレングリコールの分子量範囲が５，０００〜８０，０００である、請求項２に記載のインスリン分泌促進ペプチド。
【請求項５】
ポリエチレングリコールの分子量範囲が２０，０００〜６０，０００である、請求項２に記載のインスリン分泌促進ペプチド。
【請求項６】
インスリン分泌促進ペプチドの製剤的に許容される塩を含む、請求項１〜請求項５のいずれかに記載のインスリン分泌促進ペプチド。
【請求項７】
固体相と液相の合成、ＨＰＬＣ、イオン交換、ゲル濾過精製及び冷凍乾燥を含む、請求項１または２に記載のインスリン分泌促進ペプチド及びその製剤的に許容される塩の調製方法。
【請求項８】
請求項１または２に記載のインスリン分泌促進ペプチド及び／またはその製剤的に許容される塩のＩＩ型糖尿病の治療及び／または予防における使用。
【請求項９】
ＩＩ型糖尿病の治療及び／または予防を要する患者に、治療有効量の請求項１に記載のインスリン分泌促進ペプチドを投与するＩＩ型糖尿病の治療及び／または予防方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−１７３８８６（Ｐ２０１１−１７３８８６Ａ）
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５７３８８（Ｐ２０１１−５７３８８）
【出願日】平成２３年３月１６日（２０１１．３．１６）
【分割の表示】特願２００７−５５０６６０（Ｐ２００７−５５０６６０）の分割
【原出願日】平成１８年１月１０日（２００６．１．１０）
【出願人】（５０７２３９８０２）ウクスィ・グランドチャンプ・ファーマシューティカル・テクノロジー・カンパニー・リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１６日（２０１１．３．１６）
【分割の表示】特願２００７−５５０６６０（Ｐ２００７−５５０６６０）の分割
【原出願日】平成１８年１月１０日（２００６．１．１０）
【出願人】（５０７２３９８０２）ウクスィ・グランドチャンプ・ファーマシューティカル・テクノロジー・カンパニー・リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]