本発明は修飾ヒドロキシラーゼに関連する。本発明はさらに、該修飾ヒドロキシラーゼを発現する細胞、および適当な基質を該細胞に接触させることでヒドロキシル化アルカンを生成する方法に関連する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
3-炭素アルカンに対する相対活性が2-炭素アルカンまたは4-炭素アルカンに対する相対活性よりも高いプロパンヒドロキシラーゼ活性を持つ、単離または組換えシトクロムP450ポリペプチド。
【請求項２】
プロパンを基質として用いる場合に触媒効率が少なくとも1 x 10⁴ M^-1 sec^-1である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが巨大菌シトクロムP450または巨大菌シトクロムP450の変異型である、請求項1または2記載のポリペプチド。
【請求項４】
ヨードメタンデハロゲナーゼ活性を持つ、単離または組換えシトクロムP450ポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドが巨大菌シトクロムP450または巨大菌シトクロムP450の変異型である、請求項4記載のポリペプチド。
【請求項６】
残基47、52、74、78、82、94、142、175、184、188、205、226、236、252、255、290、328、353、366および443を除いて最高50の同類アミノ酸置換を持つ、配列番号1に定めた残基1〜約455のアミノ酸配列を含む、単離または組換えポリペプチドであって、
（a）47、82、142、205、236、252、および255位のアミノ酸残基が、グリシン（G）、アスパラギン（N）、グルタミン（Q）、セリン（S）、トレオニン（T）、チロシン（Y）、およびシステイン（C）から成る群から選択され、
（b）52、94、175、184、188、290、353、366および443位のアミノ酸残基が、アラニン（A）、バリン（V）、ロイシン（L）、イソロイシン（I）、プロリン（P）、およびメチオニン（M）から成る群から選択され、
（c）226位のアミノ酸残基が、リシン（K）およびアルギニン（R）から成る群から選択され、
（d）78および328位のアミノ酸残基が、チロシン（Y）、フェニルアラニン（F）、トリプトファン（W）、およびヒスチジン（H）から成る群から選択され、
（e）74位のアミノ酸残基は、アラニン（A）、セリン（S）、およびグルタミン酸（E）から成る群から選択され、
プロパンからプロパノールへの変換を触媒する、上記ポリペプチド。
【請求項７】
最高50の同類アミノ酸置換が最高25の同類アミノ酸置換を含む、請求項6記載のポリペプチド。
【請求項８】
最高50の同類アミノ酸置換が最高10の同類アミノ酸置換を含む、請求項6記載のポリペプチド。
【請求項９】
最高50の同類アミノ酸置換が最高5の同類アミノ酸置換を含む、請求項6記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ポリペプチドが以下より成る群から選択される、請求項6記載のポリペプチド：
（a）配列番号125に定める配列を含むポリペプチド、および
（b）配列番号125に定める配列から成るポリペプチド。
【請求項１１】
以下より成る群から選択される、単離または組換えポリペプチドであって：
（a）配列番号125に定めたアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも80%のポリペプチドであって、プロパンからプロパノールへの変換を触媒する、上記ポリペプチド、ならびに
（b）最高75の同類アミノ酸置換を持つ配列番号125のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号125の47、52、74、78、82、94、142、175、184、188、205、226、236、252、255、290、328、353、366、443、464、698、および710位のアミノ酸残基は置換されておらず、プロパンからプロパノールへの変換を触媒する、上記ポリペプチド。
【請求項１２】
以下より成る群から選択される、単離または組換えポリペプチドであって：
（a）残基47、52、74、78、82、94、142、175、184、188、205、226、236、252、255、290、328、353、366および443を除いて最高50の同類アミノ酸置換を持つ、配列番号1に定めたアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（b）残基48、53、75、79、83、95、143、176、185、189、206、227、238、254、257、292、330、355、368および445を除いて最高50の同類アミノ酸置換を持つ、配列番号2または配列番号3に定めたアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（c）残基50、55、77、81、85、97、145、178、187、191、208、229、240、256、259、294、332、358、371および448を除いて最高50の同類アミノ酸置換を持つ、配列番号4に定めたアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（d）残基54、59、81、85、89、101、149、182、191、195、212、232、243、259、262、297、336、361、374および452を除いて最高50の同類アミノ酸置換を持つ、配列番号5に定めたアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（e）残基51、56、78、82、86、98、146、179、188、192、208、231、242、258、262、296、337、353、376および455を除いて最高50の同類アミノ酸置換を持つ、配列番号6に定めたアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ここで：
（i）配列番号1の47、82、142、205、236、252、および255位、配列番号2または配列番号3の位置48、83、143、206、238、254、および257位、配列番号4の50、85、145、208、240、256、および259位、配列番号5の54、89、149、212、243、259、および262位、ならびに配列番号6の51、86、146、208、242、258、および262位のアミノ酸残基が、グリシン（G）、アスパラギン（N）、グルタミン（Q）、セリン（S）、トレオニン（T）、チロシン（Y）、およびシステイン（C）から成る群から選択され、
（ii）配列番号1の52、94、175、184、188、290、353、366および443位、配列番号2または配列番号3の53、95、176、185、189、292、355、368および445位、配列番号4の55、97、178、187、191、294、358、371および448位、配列番号5の59、101、182、191、195、297、361、374および452位、ならびに配列番号6の56、98、179、188、192、296、353、376および455位のアミノ酸残基が、アラニン（A）、バリン（V）、ロイシン（L）、イソロイシン（I）、プロリン（P）、およびメチオニン（M）から成る群から選択され、
（iii）配列番号1の226位、配列番号2または配列番号3の227位、配列番号4の229位、配列番号5の232位、および配列番号6の231位にアミノ酸残基が、リジン（K）およびアルギニン（R）から成る群から選択され、
（iv）配列番号1の78および328位、配列番号2または配列番号3の79および330位、配列番号4の81および332位、配列番号5の85および336位、ならびに配列番号6の82および337位にアミノ酸残基が、チロシン（Y）、フェニルアラニン（F）、トリプトファン（W）、およびヒスチジン（H）から成る群から選択され、
（v）配列番号1の74位、配列番号2または配列番号3の75位、配列番号4の77位、配列番号5の81位、および配列番号6の78位のアミノ酸残基が、アラニン（A）、セリン（S）、およびグルタミン酸（E）から成る群から選択され、
プロパンからプロパノールへの変換を触媒する、上記ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項1、4、6、11または12のいずれか1項記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項１４】
請求項13記載の核酸を含むベクター。
【請求項１５】
発現ベクターである、請求項14記載のベクター。
【請求項１６】
請求項13記載の単離された核酸をトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１７】
請求項14記載のベクターをトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１８】
細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項17記載の宿主細胞。
【請求項１９】
真核細胞が酵母細胞、昆虫細胞、または動物細胞である、請求項18記載の宿主細胞。
【請求項２０】
原核細胞が細菌細胞である、請求項18記載の宿主細胞。
【請求項２１】
宿主細胞が核酸を発現し、アルカンからアルコールへの酵素触媒ができるよう十分な時間アルカンの存在下で宿主細胞を培養することを特徴とする、請求項17記載の宿主細胞をアルカンと接触させることを含む、アルカンをアルコールに変換する方法。
【請求項２２】
請求項1、6、11または12のいずれか1項記載のポリペプチドを準備すること、およびアルカンからアルコールへの酵素触媒ができるよう十分な時間ポリペプチドをアルカンと接触させることを含む、アルカンをアルコールに変換する方法。
【請求項２３】
宿主細胞が核酸を発現し、ハロゲンの酵素的除去ができるよう化合物の存在下で十分な時間宿主細胞を培養することを特徴とする、請求項17記載の宿主細胞とハロゲンを含む化合物を接触させることから成る、ハロゲンを化合物から除去する方法。
【請求項２４】
請求項4のポリペプチドを提供し、ハロゲンの酵素的除去ができるよう十分な時間ポリペプチドを化合物と接触させることを含む、ハロゲンを化合物から除去する方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６Ａ−１】

【図６Ａ−２】

【図６Ａ−３】

【図６Ｂ−１】

【図６Ｂ−２】

【図６Ｂ−３】

【図６Ｃ−１】

【図６Ｃ−２】

【図６Ｃ−３】

【図６Ｄ−１】

【図６Ｄ−２】

【図６Ｄ−３】

【図６Ｅ−１】

【図６Ｅ−２】

【図６Ｅ−３】

【図６Ｅ−４】

【図６Ｆ−１】

【図６Ｆ−２】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０Ａ】

【図２０Ｂ】

【図２１】

【図２２Ａ】

【図２２Ｂ】

【図２３】

【図２４Ａ】

【図２４Ｂ】

【図２５Ａ】

【図２５Ｂ】

【図２５Ｃ】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１Ａ−１】

【図３１Ａ−２】

【図３１Ａ−３】

【図３１Ｂ−１】

【図３１Ｂ−２】

【図３１Ｂ−３】

【図３１Ｃ−１】

【図３１Ｃ−２】

【図３２】

【図３３】

【図３４Ａ】

【図３４Ｂ】

【図３５Ａ】

【図３５Ｂ】

【図３５Ｃ】

【図３６】

【図３７Ａ】

【図３７Ｂ】

【図３７Ｃ】

【図３７Ｄ】

【図３７Ｅ】

【図３７Ｆ】

【図３８Ａ】

【図３８Ｂ】

【図３８Ｃ】

【図３８Ｄ】

【図３８Ｅ】

【図３８Ｆ】

【図３８Ｇ】

【図３８Ｈ】

【図３８Ｉ】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３Ａ】

【図４３Ｂ】

【図４３Ｃ】

【公表番号】特表２０１０−５１７５７９（Ｐ２０１０−５１７５７９Ａ）
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４９２７０（Ｐ２００９−５４９２７０）
【出願日】平成２０年２月８日（２００８．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３４７２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９８１９８
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（５０５００２４０６）ザ　カリフォルニア　インスティチュート　オブ　テクノロジー (3)
【Ｆターム（参考）】