光学的検出装置を含むバイオアッセイシステム、および生体分子を検出する方法
バイオアッセイシステムを開示する。バイオアッセイシステムは、複数の光学的検出装置を含んでいてよく、その各々が光検出器を有する基板、および光検出器上方に形成されるリンカー部位を含み、リンカー部位は、生体分子をリンカー部位に付着させるように処理されている。リンカー部位は、光検出器に近接し、かつ１００μｍ以下の距離だけ光検出器から間隔が置かれる。光検出器は、０．８ＳＩステラジアン以上の立体角の範囲内で生体分子から発生される光を収集する。光学的検出装置は、生体分子に付着する蛍光色素分子を励起するための光源を提供するように、基板上方に形成される励起光源をさらに含んでいてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の光学的検出装置を含むバイオアッセイシステム、ならびに、核酸などの生体分子を検出および分析するためのバイオアッセイシステムの使用に関するものである。より詳細には、本発明は、生体分子を検出および分析するために、いくつかの実施形態においては、多数の蛍光色素分子を並行してモニタリングするのに用いられる少なくとも１万個の光学的検出装置を含むバイオアッセイシステムに関するものである。
【０００２】
本出願は、２００７年１０月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／９９６０１６号および２００８年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／０３６６５２号の優先権の利益を主張し、その両者の全体の内容は、全体として参照して本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ヒトゲノム計画（ＨＧＰ）は、シークエンシングの処理能力の著しい向上を加速し、その結果として、対応するシークエンシングコストを低下させた。１３年およびほぼ３０億ＵＳドルのコストと対照的に、ゲノム当たりのシークエンシングコストは著しく低下し、実際、最近２つの個人ゲノムが完成されている（非特許文献１）。個人ゲノムは、患者と医療関連機関の両方にとって、医療のパラダイムシフトを意味する。疾病の遺伝的危険因子を管理することにより、医療関連機関は、より容易に予防医学を実践できると共に、カスタマイズされた治療を提供できるようになる。多数の完成ゲノムバンクにより、薬物設計および投与は、より効率的となり、これにより誕生したばかりの薬理ゲノム学の分野が推進されることになる。
【０００４】
個人向けのカスタマイズ医療を普及するため、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）国立ヒトゲノム研究所（ＮＨＧＲＩ）は、ゲノム当たりのシークエンシングコストを１，０００万ＵＳドルから約１，０００ＵＳドルまで低下させるという基準を定めた。しかしながら、従来の高処理能力キャピラリー電気泳動および自動ゲノムシークエンシング技術は、個人ゲノムシークエンシングに対する増加した需要を満たすことはできない。さらに、既存のシークエンシング法には、複雑かつエラーが起きやすい画像収集および解析のステップが必要とされる。例えば、多くの既存技術では、多重画像を捕捉するためにアレイまたは検出システムが移動することが必要とされる。次いで、その結果得られた画像を、タイル表示し、整列させ、かつ解析しなければならない。画像収集、処理、および解析のステップは、いずれもエラーが起こり易く、追加の時間がかかり、かつ高価な設備を必要とする。反対に、移動する光学装置を含まない既存のシステムは、通常、非常に少ない数の検出ユニットにより制限される。最後に、既存のデバイスでは、検出される分子が対応する検出ユニットにごく接近してセットされず、このことは検出信号の強度を実質的に制限する。
【０００５】
したがって、核酸シークエンシングのコストを低減するために、デバイスに対する必要性が存在する。「１，０００ドルゲノム」パラダイムに近づくためには、装置は、多数の分子を並行してシークエンシングすることが可能で、設計および製造プロセスが簡略化されると共に、既存の装置および方法の、複雑かつエラーが起きやすい走査および画像解析プロセスの必要性を回避するものでなければならない。さらに、装置は、単一の分子をシークエンシングすることができ、これによりクラスター化シークエンシング法の増幅（例えば、理想的にクローナルなテンプレートのシークエンス間のドリフト）およびシークエンシング（例えば、シークエンシングテンプレート間の段階的シークエンシング反応の位相ずれ）ステップの両方において知られている非同時性の困難を回避できるものでなくてはならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】マガイア（ＭｃＧｕｉｒｅ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），３１７：１６８７（２００７）
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、複数の光学的検出装置を含むバイオアッセイシステム、および核酸の検出、例えば、シークエンシングのために、このバイオアッセイシステムを用いる方法を提供する。本発明により提供されるバイオアッセイシステムは、大規模の並行シークエンシング反応が可能である、すなわち、多数の異なる核酸のテンプレートを同時にシークエンシングすることができるものである。各シークエンシング反応では、単一の分子をテンプレートとして用いる（すなわち、単一分子シークエンシング）。提供される装置は、さらに、設計が簡略化されており、現在の装置の、複雑で、高価で、かつエラーが起きやすい走査ステップおよび検出ステップの必要性をなくす。本発明により提供されるシステムの簡略化された設計および機能は、一部においては、検出される核酸が（直接的に、または、例えば、ポリメラーゼ分子により）付着するリンカー部位と、１個またはそれ以上の検出ユニット（例えば、光検出器）との直接的な対応に基づくものであり、また、一部においては、リンカー部位と検出ユニットとの間の短い距離に基づくものである。この核酸と検出ユニットとの間の短い距離は、いくつかの実施形態において、検出の大きい立体角により表される。
【０００８】
ある態様において、検出ユニットにて単一の生体分子を同定するためのバイオアッセイシステムが提供される。このバイオアッセイシステムは、その各々が光検出器を備える基板を含む複数の光学的検出装置、および光検出器上方に形成されるリンカー部位を含んでいてよく、リンカー部位は、生体分子がリンカー部位に付着するように処理されており、このうち、リンカー部位は光検出器に近接している。いくつかの実施形態において、リンカー部位は、１００μｍ以下の距離だけ光検出器から間隔が置かれ、光検出器は、０．８ＳＩステラジアン以上の立体角の範囲内で生体分子から発生される光を収集する。光学的検出装置は、生体分子に付着した蛍光色素分子を励起するための光源を提供するように基板上方に形成された励起光源をさらに含んでいてもよい。
【０００９】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの核酸を本発明により提供される光学的検出装置のリンカー部位に（直接的に、または、リンカー部位に結合された核酸ポリメラーゼを結合させることにより）連結させ、かつ対応する光検出器上で核酸を検出することにより核酸を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態において、核酸は、例えば、標識されたプローブへのハイブリダイゼーションにより検出される。いくつかの実施形態では、核酸は、光学的検出装置上で核酸シークエンシングを行うことにより検出される。いくつかの実施形態において、核酸シークエンシングの方法は、塩基伸長シークエンシング、末端標識リン酸シークエンシング、および混合塩基（ｗｏｂｂｌｅ）シークエンシングから選択される。特定の実施形態では、シークエンシング反応は、塩基伸長シークエンシング反応である。さらなる特定の実施形態では、塩基伸長シークエンシング反応は、封鎖および標識されたヌクレオチドを光学的検出装置に添加するステップをさらに含む。またさらなる特定の実施形態においては、ヌクレオチドは、蛍光標識されている。
【００１０】
また、本発明は、別の態様において、サンプル分子を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法は、標識されたサンプル分子を本発明により提供される光学的検出装置上のリンカー部位に付着させるステップ、および対応する光検出器上でサンプル分子を検出するステップを含む。いくつかの実施形態においては、サンプル分子は、連結分子によりリンカー部位に付着させられる。いくつかの実施形態では、連結分子は、１）サンプル分子を結合させるのに適当な捕捉分子、および２）核酸タグを含む。特定の実施形態では、サンプル分子は、連結分子がリンカー部位にすでに付着している光学的検出装置であって、本発明により提供される光学的検出装置に塗布される。別の実施形態では、サンプル分子が連結分子を結合させるようにしてもよく、次いで、その結合複合体を光学的検出装置に塗布してリンカー部位に付着させるようにする。特定の実施形態では、サンプル分子は、生体分子、例えば、ポリペプチド、核酸、脂質、多糖、または代謝産物である。
【００１１】
以上の概略的な説明および以下の詳細な説明は、いずれも例示的および説明的なものにすぎず、クレームに係る発明を限定するものではないことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に従った光学的検出装置のアレイを含むバイオアッセイシステムを示す平面図である。
【図２】本発明に従った実施形態による光学的検出装置を示す、図１の線Ａ−Ａに沿った断面図である。
【図３】本発明に従った光学的検出装置の寸法の詳細を示す断面図である。
【図４】本発明に従った別の実施形態による光学的検出装置を示す、図１の線Ａ−Ａに沿った断面図である。
【図５】本発明に従った実施形態によるフィルター層の構造を示す表である。
【図６】本発明に従った装置のリンカー部位上に連結した核酸を示す。
【図７】封鎖および標識されたヌクレオチドを用いた１回の塩基伸長後の装置のリンカー部位上に連結した核酸を示す。
【図８】図７に示した塩基伸長シークエンシング反応の別の実施形態を示す。
【図９】塩基伸長シークエンシングによる並行した数個の核酸の１回のシークエンシングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明に従った実施形態について詳細に言及していくが、その例は添付の図面に図示されている。可能な限り、同じまたは類似する部分に言及する際に、図面全体を通して同じ参照番号を用いることにする。
【００１４】
１．バイオアッセイシステム
本発明に従ったバイオアッセイシステムは、多数の（例えば、いくつかの実施形態においては、１０，０００より多い）単一生体分子を並行してモニターするために用いることができる。バイオアッセイシステムは、複数の光学的検出装置を含み得る。各光学的検出装置は、単一分子上の蛍光色素分子の存在を、この蛍光色素分子から発生される光子を検出することにより感知することができる。光学的検出装置を並行して動作させることにより、本発明に従ったバイオアッセイシステムは、例えば、組織サンプル中のゲノムのシークエンスまたは発現される遺伝子のプロファイルを高処理能力で決定することができる。
【００１５】
図１を参照すると、本発明に従ったバイオアッセイシステム１が図示されている。バイオアッセイシステム１は、バイオアッセイ基板１０および基板１０上に形成された複数の光学的検出装置２０を含み得る。各光学的検出装置２０は、それぞれ独立に動作して、それに付着した単一の生体分子を検出および同定することができる。例えば、一本鎖ＤＮＡのシークエンスは、順次に塩基伸長を行い、かつ光学的検出装置２０を用いて、伸長された塩基に結合された蛍光色素分子から発生される光を検出することにより決定することができる。基板１０上に膨大な数の光学的検出装置２０を集積することにより、膨大な数の単一生体分子を並行に検出および同定することができる。設計上の選択に応じて、バイオアッセイシステム１は、基板１０上に形成される光学的検出装置２０を、少なくとも、例えば、１万（１０，０００）個以上、２５万（２５０，０００）個以上、２００万（２，０００，０００）個以上、さらには１，０００万（１０，０００，０００）個以上含むことができる。
【００１６】
バイオアッセイシステム１は、基板１０に連結されて光学的検出装置２０の動作を制御すると共に光学的検出装置２０から得たデータを記録するための検出および記録システム２をさらに含んでいてもよい。そのうえ、バイオアッセイシステム１は、励起光源（図示せず）をさらに含んでいてもよい。励起光源は、蛍光色素分子に蛍光を発光させるために励起光を発生することができる。ある実施形態において、励起光源は、光学的検出装置２０またはバイオアッセイ基板１０から独立していてもよい。別の実施形態では、励起光源は、光学的検出装置２０またはバイオアッセイ基板１０と一体とすることができる。
【００１７】
この特定の実施形態では、図１に示されるように、光学的検出装置２０は、上から見たときに円形であってよい。光学的検出装置２０は、その他の幾何学的形状、例えば、四角形、多角形、楕円形、および類似の形状であってもよいことは、理解されるべきである。さらに、図１は、複数の光学的検出装置２０が正方格子のパターンに配列していることを示している。光学的検出装置２０は、その他のパターン、例えば、三角格子のパターン、ハニカム格子のパターン、および類似のパターンであってもよいことは、理解されるべきである。
【００１８】
バイオアッセイシステム１の複数の光学的検出装置１０は、独立して動作可能であるため、本発明に従った様々な実施形態に基づき、以下、１つの光学的検出装置１０についてのみ説明する。１つの光学的検出装置１０についてのみ説明するが、バイオアッセイシステム１中の異なる光学的検出装置１０は、必ずしも同一ではないと理解される。設計上の選択に応じて、異なるタイプの光学的検出装置１０が、本発明に従った異なる実施形態に基づいて構成されてもよい。
【００１９】
図２を参照すると、本発明に従ったある実施形態に基づいて、光学的検出装置２０の図１の線Ａ−Ａに沿った断面図が示されている。図２に示されるように、光学的検出装置２０は、基板１０上に形成された光検出器２１０、および光検出器２１０上方に形成されたリンカー部位２２０を含んでいる。そのうえ、光学的検出装置２０は、基板１０上に形成されて光検出器２１０の動作を制御するのに用いられる制御回路２１５をさらに含んでいてもよい。制御回路２１５は、検出および記録システム２からの制御命令を受け取り、かつ検出および記録システム２に検出信号を転送するように、検出および記録システム２に接続されてもよい。いくつかの実施形態において、基板１０は、ガラス基板、半導体基板（例えば、シリコン）、またはプラスチック基板とすることができる。いくつかの実施形態において、１個またはそれ以上の制御回路２１５は、各光検出器２１０に対応していてもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態において、光検出器２１０は、単一の光伝導光子検出器または一群の光伝導光子検出器を含んでいてよい。別の実施形態において、光検出器２１０は、単一の光起電光子検出器または一群の光起電光子検出器を含んでいてよい。別の実施形態において、光検出器２１０は、単一のフォトダイオードまたは一群のフォトダイオードを含んでいてよい。別の実施形態において、光検出器２１０は、単一のアバランシェフォトダイオードまたは一群のアバランシェフォトダイオードを含んでいてよい。別の実施形態において、光検出器２１０は、単一のフォトトランジスタまたは一群のフォトトランジスタを含んでいてよい。
【００２１】
ある実施形態において、光学的検出装置２０は、光検出器２１０上方にブラインドシート２３０をさらに含んでいてもよい。ブラインドシート２３０は、ピンホール２３５を含んでいてよい。ある実施形態では、ピンホール２３５は、円形とすることができ、かつ、１，０００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下の直径Ｄ１を有していてよい。ピンホール２３５は、その他の形状、例えば、楕円形、四角形、および類似の形状であってもよいと理解される。ある実施形態において、ブラインドシート２３０は、光検出器２１０に望ましくない光が届くのを阻止するように、不透明な材料から構成されていてよい。それゆえ、所望の光がピンホール２３５を介して光検出器２１０に届くようになる。
【００２２】
リンカー部位２２０は、ピンホール２３５に近接して形成することができる。この図に示されている実施形態において、リンカー部位２２０は、ピンホール２３５の内側に形成される。ある実施形態では、ピンホール２３５に近接して形成されたリンカー部位２２０は、１００μｍ以下の距離Ｈ１だけ光検出器２１０から間隔が置かれていてよい。別の実施形態においては、距離Ｈ１は、７５μｍ以下、５０μｍ以下、２５μｍ以下、１５μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下、または３μｍ以下であってよい。
【００２３】
光学的検出装置２０は、光検出器２１０とブラインドシート２３０との間にフィルター層２４０（任意）およびマイクロレンズ２５０（任意）をさらに含んでいてもよい。図２は、フィルター層２４０がマイクロレンズ２５０上方に形成されていることを示すが、フィルター層２４０は、マイクロレンズ２５０の下に形成されていてもよいと理解される。いくつかの実施形態において、フィルター層２４０は、単一の透明層、または異なる屈折率を有する複数の透明副層を含んでいてよい。フィルター層２４０が複数の副層を含む場合、フィルター層２４０は、基板１０上方に副層を順次堆積することにより形成される。いくつかの実施形態では、比較的高い屈折率を有する副層を、２つの比較的低い屈折率を有する副層で挟むことができる。また、比較的低い屈折率を有する副層を、２つの比較的高い屈折率を有する副層で挟むこともできる。いくつかの実施形態において、フィルター層２４０は、単一の領域を有する層、または異なる波長範囲に対する異なる透明性を持つ複数の副領域を有する層を含んでいてよい。
【００２４】
なお、図２を参照すると、リンカー部位２２０は、単一の生体分子３０をそこに付着させるように処理することができる。ある実施形態において、生体分子３０は、一本鎖ＤＮＡ分子３２およびＤＮＡ分子３２に結合された末端プライマー３４を含んでいてよい。生体分子３０は、末端連結プライマー３４を介してリンカー部位２２０に付着させることができる。さらに、ＤＮＡ分子３２は、蛍光色素分子３６で標識してもよい。第１の波長λ１の励起光により励起されたとき、蛍光色素分子３６は、第２の波長λ２の蛍光を発生することができる。いくつかの実施形態において、第１の波長λ１は第２の波長λ２よりも短い。いくつかの実施形態では、例えば、多光子励起において、第１の波長λ１は第２の波長λ２よりも長い。そして、光検出器２１０は、蛍光色素分子３６が付着している塩基のタイプを識別するために、蛍光色素分子３６から発生された蛍光を検出し、これによりＤＮＡ分子３２のシークエンスが順次決定されることになる。
【００２５】
図３を参照すると、本発明に従ったある実施形態に基づいて、光学的検出装置２０の断面図が示されている。図３に示されるように、ブラインドシート２３０は、光検出器２１０上方に形成されると共に、光検出器２１０から距離Ｈ１だけ垂直方向に間隔が置かれている。厚さＴを有するブラインドシート２３０は、半径Ｒ１（すなわち、直径Ｄ１の半分）を有するピンホール２３５を含む。この実施形態では、リンカー部位２２０は、ピンホール２３５中に形成されて生体分子（図示せず）と結合することができる。
【００２６】
蛍光色素分子３６がリンカー部位２２０上方の第１の位置３６Ａで発見され、かつリンカー部位２２０から距離Ｈ２だけ離れている場合、半径Ｒ２を有する光検出器２１０は、第１の立体角θ１の範囲内で蛍光色素分子３６から発生される蛍光を収集することができる。蛍光色素分子３６が第２の位置３６Ｂで発見され、かつリンカー部位２２０にほぼ接触しそうな（すなわち、距離Ｈ２が０μｍまたは１μｍ未満に近い）場合、光検出器２１０は、第２の立体角θ２の範囲内で蛍光色素分子３６から発生される蛍光を収集することができる。第２の立体角θ２は、第１の立体角θ１よりも大きく、実質的により強度な信号を提供する。
【００２７】
光検出器２１０がピンホール２３５を通して蛍光色素分子３６から発生される蛍光に曝露されるように、光検出器２１０の半径Ｒ２は、光検出器２１０の上表面に投影される第２の立体角θ２に対応する半径以上でなければならない。ブラインドシート２３０（またはリンカー部位２２０）を光検出器２１０に近づけることにより（すなわち、距離Ｈ１を減らすことにより）、光検出器２１０は、立体角の範囲内から、より集中した光（すなわち、より強度な光信号）を収集できるようになる。ある実施形態において、ブラインドシート２３０（またはリンカー部位２２０）と光検出器２１０は、小さい距離Ｈ１だけ離されており、それゆえ、第２の立体角θ２は、少なくとも０．８ＳＩステラジアンである。
【００２８】
図４を参照すると、本発明に従った別の実施形態に基づいて、光学的検出装置２０の図１の線Ａ−Ａに沿った断面図が示されている。この実施形態では、励起光源４０は、光学的検出装置２０と一体とされている。図４に示されるように、励起光源４０は、光学的検出装置２０のブラインドシート２３０上に形成される。ある実施形態において、励起光源４０は、ｐ型およびｎ型半導体層（４１０および４３０）、ならびに層４１０と層４３０の接合領域の間の発光層４２０を含んでいてよい。層４１０および層４３０は、電源に接続することができる。層４１０、層４２０、および層４３０に用いられる材料、および／または、材料の物理的および原子構造に応じて、励起光源４０は、発光ダイオード（ＬＥＤ）、発光レーザーダイオード（ＬＤ）、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）、または高分子発光ダイオード（ＰＬＥＤ）とすることができる。例えば、ガリウムヒ素、リン化インジウム、アンチモン化ガリウム、および窒化ガリウムなどの無機材料、または、例えば、ポリ（パラ−フェニレン−ビニレン）骨格を有する共役高分子などの有機材料は、いずれも、光を放つ接合ダイオードを作製するのに用いることが可能な半導体材料の例である。
【００２９】
別の実施形態において、励起光源４０は、ブラインドシート２３０を形成していても、ブラインドシート２３０内に形成されていてもよい。いくつかの実施形態において、光学的検出装置２０と一体とされた励起光源４０は、１つの波長域または複数の波長域の光を発生することができる。励起光源４０は、断続的にまたは連続的に光を発生することができる。励起光源４０は、一度に１つの波長域の、または同時にいくつかの波長域の光を発生することができる。
【００３０】
図４を再び参照すると、励起光源４０は、ピンホール２３５を露出させるように、その中央部分に空洞４５０を含んでいてよい。この実施形態では、リンカー部位２２０は、ピンホール２３５内に形成されないこともある。より正確に言えば、リンカー部位２２０は、空洞４５０内に形成され、かつピンホール２３５に近接していてよい。励起光源４０がブラインドシート２３０を形成するか、あるいは、ブラインドシート２３０内に形成される実施形態では、空洞４５０がピンホール２３５を形成するか、あるいは、ピンホール２３５内に形成される。いくつかの実施形態において、ピンホール２３５は、層４１０およびブラインドシート２３０両者の中央部分に、例えば、適当な方法を用いて、層４１０およびブラインドシート２３０をエッチングすることにより形成することができる。
【００３１】
さらに、励起光源４０は、下方の層４１０上に形成された金属接点４１５および上方の層４３０上に形成された金属接点４３５を介して電源４４０と接続することができる。電源４４０は、独立していて、かつ検出および記録システム２により制御されても、あるいは、検出および記録システム２と一体とされていてもよい。
【００３２】
励起光源４０の発光層４２０は、図４における発光層４２０上に描かれた矢印に示されるような水平方向に沿って励起光を空洞４５０内に放出することができる。この実施形態では、励起光は、ブラインドシート２３０の上表面と実質的に平行な方向に沿って放出される。したがって、励起光は、光検出器２１０へ向かう蛍光を妨害し得ない。それゆえ、本発明に従った光学的検出装置２０は、従来のデバイスに比べて、より正確に生体分子を同定することが可能である。
【００３３】
２．核酸検出
本発明に従ったバイオアッセイシステム（例えば、単一の光学的検出装置または複数のかかる装置を含む）は、分子検出、例えば、核酸シークエンシングに用いるシステムの一部として、またはその方法もしくはプロセスに用いることができる。このバイオアッセイシステム、およびそれを用いる方法またはプロセスは、例えば、分析および診断的用途に有用である。これらの用途は、個人用、公用、商用、または産業用であってよい。
【００３４】
いくつかの実施形態では、バイオアッセイシステムは、核酸の大規模並行シークエンシングに適している。一部において、バイオアッセイシステムのリンカー部位と光検出器との直接的な対応、および／または、リンカー部位と光検出器との近接近（いくつかの実施形態において、大きい立体角として表される）のために、本発明において提供されるバイオアッセイシステムは、高価、複雑、かつエラーが起きやすい走査および解析システム、例えば、移動走査レンズまたは移動デバイスステージおよび後続の画像解析の必要性なしに、核酸をシークエンスするのに用いることができ、それゆえ、エラーとコストが低減される。バイオアッセイシステムは、実質的に信号強度が向上した光信号を検出することができ、このことは単一分子の分析を可能にする。
【００３５】
本発明に従ったバイオアッセイシステムは、様々なシークエンシングの手法と共に用いることができ、かつ単一分子をシークエンシングするのに適している。そのうえ、本発明に従った光学的検出装置は、既存のバイオチップ装置に比べて、設計、組み立て、および製造が簡略化されている。例えば、シークエンスされるべき核酸をアレイ上の任意のリンカー部位に付着させることができ、これにより核酸を所定の位置に堆積または合成させるための時間がかかり、かつ高価なロボティクスの利用が回避されることになる。
【００３６】
本発明に従ったバイオアッセイシステムは、例えば、全ゲノムシークエンシング、転写プロファイリング、比較転写プロファイリング、または遺伝子同定のための核酸ハイブリダイゼーションまたはシークエンシングを含む生体分子検出に用いる方法およびプロセスにおけるシステムの一部として用いることができる。また、生体分子検出は、結合相互作用、例えば、タンパク質／タンパク質、抗体／抗原、レセプター／リガンド、および核酸／タンパク質の検出および／または測定をも含み得る。これらの応用は、分析的または診断的プロセスおよび方法に有用である。
【００３７】
本発明により提供されるシステムでの検出に用いるのに適当な核酸は、いくつかの実施形態において、結合相互作用をアッセイするのに適当な分子、例えば、タンパク質、他の核酸、炭水化物部分、または小分子を本発明により提供される装置上のリンカー部位に付着させる連結分子の一部であってよい。連結分子は、いくつかの実施形態において、結合相互作用についてアッセイされる分子に結合する捕捉分子をさらに含んでいてもよい。連結分子中の核酸は、例えば、直接的なシークエンシングまたはハイブリダイゼーションにより、連結分子の捕捉分子の識別タグとして機能する。
【００３８】
本発明により提供される方法は、通常、検出されるべき分子を、本発明により提供される装置のアドレスアレイに付着させるステップを含む。いくつかの実施形態において、アドレスアレイは、複数のピンホール２３５を有するブラインドシート２３０を含んでいてよく、また、リンカー部位２２０は、ピンホール２３５の内側または周囲に形成されていてもよい。例えば、図１および２を参照されたい。かくして、本発明に従ったバイオアッセイシステムは、何百万もの核酸セグメントを同時に読み取ることが可能である。各セグメントが、例えば、塩基長１，０００である場合、単一の装置は、何十億というシークエンス情報の断片を得ることができ、これにより、例えば、全ゲノムシークエンシングおよび再シークエンシングが可能となる。
【００３９】
２．１．検出されるべき分子
本発明により提供される方法による検出に適する核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡ（ペプチド核酸）を含めて、任意の核酸を含むことができ、かつ、天然に存在するシークエンスまたは人工のシークエンスを含めて、既知および未知の両方の任意のシークエンスを含むことができる。核酸は、天然由来のもの、組み換え技術により製造されたもの、または化学的に合成されたものであってよい。核酸は、天然に存在するヌクレオチド、自然界に存在しないヌクレオチド類似体、または修飾ヌクレオチドを含んでいてよい。検出されるべき核酸の長さは、実際の応用に応じて変化する。いくつかの実施形態において、核酸は、少なくとも、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上、２，０００個以上、５，０００個以上、１０，０００個以上、２０，０００個以上の塩基を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、１０〜２０個、１０〜５０個、１０〜１００個、５０〜１００個、５０〜５００個、５０〜１，０００個、５０〜５，０００個、５００〜２，０００個、５００〜５，０００個、または１，０００〜５，０００個の塩基であってよい。
【００４０】
検出に用いる核酸は、一本鎖であってよい。一本鎖核酸テンプレートは、例えば、加熱またはアルカリまたはその他の化学的処理を含む当該分野で知られた手段により、二本鎖分子から得ることができる。一本鎖核酸テンプレートは、例えば、化学的または生体外合成により製造することも可能である。
【００４１】
いくつかの実施形態において、検出されるべき核酸は、その５’末端または３’末端でリンカー部位に付着する。いくつかの実施形態において、核酸は、さらに、核酸の５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合された１個またはそれ以上の末端連結プライマーを含んでいてもよい。特定の実施形態では、末端連結プライマーは、核酸の３’末端に付着する。末端連結プライマーは、検出されるべき核酸を装置上のリンカー部位に付着させるため、および、１個またはそれ以上の検出プライマー、例えば、シークエンシングプライマーの相補配列を提供するため、の両方に用いられ得る。
【００４２】
２．１．１．末端連結プライマー
末端連結プライマーは、通常は１００個未満のヌクレオチドからなる短い核酸分子である。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーは、少なくとも、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、５０個以上、７５個以上、９０個以上のヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、末端連結プライマーは、８〜２５個、１０〜２０個、１０〜３０個、または１０〜５０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーは、分岐しておらず、一方、別の実施形態では、それらは分岐していてもよい。
【００４３】
末端連結プライマーは、検出されるべき核酸をアドレスアレイ上のリンカー部位に付着させるのに用いることができる。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーは、例えば、共有結合（例えば、エステルもしくはチオール結合）、または非共有結合、例えば、抗原／抗体もしくはビオチンアビジン結合により、核酸をアレイ表面に直接的に連結させることができる。例えば、図５、図６、および図７を参照されたい。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーは、例えば、中間分子、例えば、ポリメラーゼを結合させることにより、間接的に核酸をアレイ表面に連結させることができる。例えば、図８を参照されたい。したがって、末端連結プライマーは、修飾ヌクレオチドを含むことができ、あるいは、そうでなければ、当該分野で知られた手段、例えば、ジスルフィド、チオエステル、アミド、ホスホジエステル、もしくはエステル結合により、または、例えば、抗体／抗原もしくはビオチン／アビジン結合により、リンカー部位への付着を容易にするために修飾されていることができ、例えば、末端連結プライマーは、抗原部分またはビオチン化ヌクレオチドを含むヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、末端連結プライマーの３’末端にある。いくつかの実施形態では、末端連結プライマーの５’末端が修飾ヌクレオチドを含む。
【００４４】
末端連結プライマーは、核酸を検出するのに用いられる１個またはそれ以上のプライマー、例えば、シークエンシングプライマーの相補体としての機能も果たすことができる。いくつかの実施形態において、プライマーは、ハイブリダイゼーションにより核酸を検出するのに用いられ、例えば、プライマーは、検出可能な標識、例えば、蛍光または放射性同位体標識を含んでいる。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーの５’末端は、シークエンシングプライマーの配列相補体を含む。いくつかの実施形態において、シークエンシングプライマーの相補体である末端連結プライマーの配列は、シークエンシングプライマーの３’末端がシークエンスされるべき核酸中の１個目のヌクレオチドに直接的に隣接するような向きに置かれる。
【００４５】
例えば、図６は、本発明に従った光学的検出装置２０に付着したシークエンスされるべき核酸のある実施形態の図式表示である。一本鎖核酸３２、末端連結プライマー３４、およびアニールされたシークエンシングプライマー３４６が、末端連結プライマー３４上の修飾ヌクレオチド３４４を結合させる反応性官能基を持つよう処理されたリンカー部位２２０に付着する。いくつかの実施形態において、核酸３２は、その５’末端によりリンカー部位２２０に付着でき、かつ末端連結プライマー３４は、核酸３２の３’末端に付着してシークエンシングプライマー３４６の相補体として機能し得る。
【００４６】
いくつかの実施形態において、末端連結プライマーは、リガーゼ、例えば、ＤＮＡリガーゼにより、検出されるべき核酸の末端に添加される。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーおよび検出されるべき核酸は、ライゲーション前は両者とも一本鎖である。別の実施形態では、両者は二本鎖である。さらに別の実施形態では、一方が一本鎖で他方が二本鎖である。ライゲーションは当該分野ではよく知られている。例えば、ポロニーシークエンシング法において、シェンデュア（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ）ら（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），３０９：１７２８−１７３２（２００５））は、ニュー・イングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（ＮＥＢ）のクイック・ライゲーション・キット（Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用い、Ｔ３０末端連結プライマー（３２ｂｐ）をサンプルＤＮＡ断片にライゲートした。ここで、ライゲーション反応溶液は、１× クイック・ライゲーション（Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ）バッファー中にＤＮＡ０．２６ｐｍｏｌ、Ｔ３０末端連結プライマー０．８ｐｍｏｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ４．０μＬを含むものであった。混合後、その反応溶液を約１０分間室温でインキュベートしてから、氷上に置いた。サンプルを１０分間６５℃に加熱することによりライゲーション反応を停止させた。
【００４７】
別の実施形態において、末端連結プライマーは、検出されるべき核酸上に合成されてもよい。例えば、末端連結プライマーは、例えば、ターミナルトランスフェラーゼにより付加されるホモポリマーであってよい。例えば、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）ら（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），３２０：１０６−１０９（２００８））は、ポリＡ尾部をＤＮＡテンプレートに付加し、ウイルスゲノムの単一分子シークエンシングにおけるポリＴシークエンシングプライマーの相補体とした。
【００４８】
２．１．２．シークエンシングプライマー
シークエンシングプライマーは、検出されるべき核酸の断片またはそれに関連した末端連結プライマーに相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、シークエンシングプライマーは、少なくとも、８個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上、５０個以上のヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、シークエンシングプライマーは、８〜２５個、１０〜２０個、１０〜３０個、または１０〜５０個のヌクレオチドの長さとすることができる。シークエンシングプライマーは、天然に存在するヌクレオチド、自然界に存在しないヌクレオチド類似体、または修飾ヌクレオチドを含む任意のタイプのヌクレオチドからなっていてよい。特定の実施形態において、シークエンシングプライマーの５’末端は、シークエンシングプライマーが、１個またはそれ以上の末端連結分子を含むシークエンスされるべき核酸とハイブリダイズした後に、アドレスアレイ上のリンカー部位に結合しやすくなるように修飾されていてもよい。
【００４９】
いくつかの実施形態において、シークエンシングプライマーは、修飾ヌクレオチド、例えば、ロック核酸（ＬＮＡｓ；修飾リボヌクレオチドであり、それは、ポリ核酸中に高められた塩基スタッキング相互作用を提供する）を含んでいる。ＬＮＡｓの有用性の説明として、ラヴィン（Ｌｅｖｉｎ）ら（ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３４（２０）：１４２（２００６））は、ＬＮＡ−含有プライマーが、対応するロックされていないプライマーに比べて、特異性が改善され、かつより強力な結合を呈したことを示した。プライマー中の異なる位置に３個のＬＮＡヌクレオチド（キャップにおける）を含むＭＣＰ１プライマー（５’−ｃｔｔａａａｔｔｔｔｃｔｔｇａａｔ−３’）の３個の変異体：ＭＣＰ１−ＬＮＡ−３’（５’−ｃｔｔａａａｔｔｔｔＣｔＴｇａＡｔ−３’）；ＭＣＰ１−ＬＮＡ−５’（５’−ＣｔＴａＡａｔｔｔｔｃｔｔｇａａｔ−３’）；およびＭＣＰ１−ＬＮＡ−ｅｖｅｎ （５’−ｃｔＴａａａｔＴｔｔｃｔＴｇａａｔ−３’）を作製した。すべてのＬＮＡ−置換プライマーは、Ｔｍが高まり、さらにＭＣＰ１−ＬＮＡ−５’プライマーは、特に向上されたシークエンシング精度を示した（フレッド・キュー・サーティ・カウンツ（Ｐｈｒｅｄ Ｑ３０ ｃｏｕｎｔｓ））。したがって、特定の実施形態において、シークエンシングプライマーは、少なくとも１つのロックされたヌクレオチドを、その５’領域、すなわちシークエンシングプライマーの５’の半分、３分の１、または４分の１に含んでいてよい。
【００５０】
シークエンシングプライマーおよび一本鎖サンプル核酸（すなわち、少なくとも１つの末端連結プライマーを含む検出されるべき核酸）は、本発明に従った光学的検出装置に塗布する前に、ハイブリダイズさせることができる。シークエンシングプライマーおよびサンプル核酸は、例えば、５× ＳＳＣ（または５× ＳＳＰＥ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（または０．１％ＳＤＳ）、および０．１％ＢＳＡバッファーのような塩含有溶液中でサンプル核酸をモル過剰のシークエンシングプライマーと混合することによりハイブリダイズさせることができる。その混合物を少なくとも５分間６５℃に加熱し、ゆっくりと室温まで冷却して、プライマー／テンプレートをアニーリングさせる。残存プライマーは、例えば、分子篩を含む適当な手段により除去することができる。
【００５１】
末端連結およびシークエンシングプライマーの両方を含むプライマーは、シークエンスの視覚的検査またはコンピュータ利用のプライマー設計を含む適当な手段により設計することが可能である。ＤＮＡＳｔａｒ（登録商標）（ディー・エヌ・エイ・スター（ＤＮＡＳｔａｒ）社、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ），ウィスコンシン州（ＷＩ））、ＯＬＩＧＯ ４．０（ナショナル・バイオサイエンシーズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）、Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５（プレミエールバイオソフト（Ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ）社）、およびＰｒｉｍｅｒ３（ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ），マサチューセッツ州（ＭＡ））を含む多数のソフトウェアパッケージが、プライマー設計をアシストするために利用可能である。プライマーは、例えば、シークエンスされるべき分子、特異性、長さ、所望の融解温度、二次構造、プライマーダイマー、ＧＣ含量、バッファー溶液のｐＨおよびイオン強度、ならびに用いられる酵素（すなわち、ポリメラーゼまたはリガーゼ）を考慮に入れて設計する。例えば、ジョセフ・サムブロック（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびデイヴィッド・ラッセル（Ｄａｖｉｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ），モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；第３版（２００１）を参照されたい。
【００５２】
２．１．３．アレイ表面への結合
シークエンシングプライマー、および１個またはそれ以上の末端連結プライマーを含むシークエンスされるべき核酸をアニールした後、この複合体を適当なバッファー中で調製し、アドレスアレイの表面に塗布し、結合させる。いくつかの実施形態において、サンプル核酸（検出されるべき核酸および１個またはそれ以上の末端連結プライマー）をリンカー部位に付着させ、その後、シークエンシングまたは検出プライマーを塗布する。別の実施形態では、複合体を、装置に塗布する前にハイブリダイズさせる。１つのサンプル核酸のみが結合するリンカー部位は、有効なアドレスとして知られる。特定の実施形態において、複合体を光学的検出装置に塗布し、そしてサンプル核酸がアドレスアレイ上の任意のリンカー部位に付着する。別の実施形態では、例えば、ロボッティクスまたは液体処理システムを含む適当な手段により、サンプル核酸をアドレスアレイ上の所定のリンカー部位に塗布してもよい。
【００５３】
核酸を固相担体に付着させるのに適当な手段は、当該分野においてよく知られている。いくつかの実施形態において、サンプル核酸を、共有結合、例えば、ジスルフィド結合、チオエステル結合、アミド結合、ホスホジエステル結合、もしくはエステル結合により、または非共有結合、例えば、抗体／抗原もしくはビオチン／アビジン結合により、リンカー部位に直接的に付着させることができる。いくつかの実施形態において、サンプル核酸を媒介分子によりリンカー部位に付着させてもよい。いくつかの実施形態において、媒介分子は、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼとすることができる。
【００５４】
核酸の直接的かつ共有結合的な付着の説明に役立つ実例として、アディーシ（Ａｄｅｅｓｉ）ら（ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），２８：８７（２０００））は、プライマーの５’末端を修飾してＳＨ官能基が含まれるようにした。アディーシ（Ａｄｅｅｓｉ）らの手法によれば、核酸は、５０μＭリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）（ＮａＰｉ：０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ）中で調製することができる。次いで、プライマー溶液約１〜５μＬをシラン化スライドガラスの表面に塗布し、室温の調湿ボックス中で約５時間インキュベートして、プライマーをチップ表面に結合させることができる。結合反応が完了した後、ＰＢＳ溶液を室温で２回５分ずつ振動洗浄し、未結合のＤＮＡを除去する。洗浄後、１０ｍＭ β−メルカプトエタノールをＰＢＳ溶液に添加し、室温下でアドレスアレイ表面をリンスするのに用いて、未結合のＤＮＡのチオール基を不活性化させる。次に、アレイ表面を、例えば、５× ＳＳＣ ０．１％Ｔｗｅｅｎで１回、および５× ＳＳＣバッファー溶液で１回洗浄する。それゆえ、いくつかの実施形態においては、アディーシ（Ａｄｅｅｓｉ）らが用いた手法を、本発明により提供される方法に用いて、サンプル核酸複合体をリンカー部位に、例えば、シークエンシングプライマーまたはサンプル核酸の５’末端を介して付着させることができる。
【００５５】
別の実施形態において、サンプル核酸は、例えば、ビオチン化ヌクレオチドを含んでいてよく、リンカー部位表面上のアビジンに結合する。他の実施形態において、サンプル核酸は、リンカー部位上の抗体（またはその断片）により結合される抗原部分、例えば、ＢｒｄＵまたはジゴキシゲニンを含んでいてもよい。「抗体」という用語は、例えば、１つもしくはそれ以上のＣＤＲ領域；または可変重鎖もしくは可変軽鎖断片を含むイムノグロビン分子の断片を含むと理解されるべきである。抗体は、天然に存在するもの、組み換え体、または合成されたものであってよい。また、抗体は、例えば、ポリクローナルおよびモノクローナル変異体を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、少なくとも、１０６Ｍ以上、１０７Ｍ以上、１０８Ｍ以上、１０９Ｍ以上の結合定数で、それらの抗原（複数の抗原）に結合する。抗体の構造、機能、および産生は、当該分野においてよく知られている。例えば、ゲイリー・ハワード（Ｇａｒｙ Ｈｏｗａｒｄ）およびマシュー・カサー（Ｍａｔｔｈｅｗ Ｋａｓｓｅｒ），メイキング・アンド・ユージング・アンチボディーズ（Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）：ア・プラクティカル・ハンドブック（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ），シー・アール・シー・プレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）；第１版（２００６）を参照されたい。
【００５６】
さらに別の実施形態において、サンプル核酸を、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによりリンカー部位に付着させてもよい。例えば、酵素の一次、二次、および三次構造のような酵素機能の入手可能な情報を保つことを考慮に入れなければならないということが、当業者には理解される。例えば、ＴａｑおよびＰｈｉ２９ポリメラーゼの構造が当該分野において知られており、キム（Ｋｉｍ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３７６：６１２−６１６（１９９５）、およびカムテカー（Ｋａｍｔｅｋａｒ）ら、モレキュラー・セル（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ），１６：６０９−６１８（２００４）をそれぞれ参照されたい。活性を保ちながらポリメラーゼを表面に固定する手段は、当該分野において知られており、例えば、２００８年８月２１日に公開された米国特許出願公開第２００８／０１９９９３２号、およびコーラック（Ｋｏｒｌａｃｈ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（ＰＮＡＳ），１０５：１１７６−１１８１（２００８）に記載されている。図８は、サンプル核酸（すなわち、シークエンスされるべき核酸３２、末端連結プライマー３４、およびシークエンシングプライマー３４６）が手段３８４、例えば、直接的な非共有結合性吸着、抗体、ビオチン、または化学結合、例えば、アミド結合によりリンカー部位２２０にすでに結合されたポリメラーゼ３８を介して、リンカー部位２２０に結合されている本発明のある実施形態の図式表示である。
【００５７】
いくつかの実施形態において、リンカー部位のアルデヒドで修飾された表面は、アルデヒド含有シラン試薬で処理される。アルデヒドは、タンパク質上の１級アミンと反応しやすく、これによりシッフ塩基結合を形成する。多くのタンパク質は、通常、よりよく反応するＮＨ２−末端のα−アミンに加えて、それらの表面上にリジンを示すので、それらタンパク質は、様々な配向でスライドに付着することができ、これによりタンパク質の異なる面が溶液中で他のタンパク質または小分子と作用することができるようになる。別の実施形態では、ｐｈｏｔｏＮＨＳ（炭素鎖リンカーを有するアジドニトロベンゼン分子に連結されたＮ−ヒドロキシスクシンイミドカルボキシレート分子）が、装置上のアミンで修飾された表面にＵＶ光活性化により付着する。これらの実施形態では、ＵＶ光がアジドニトロベンゼン部分を励起し、窒素を除去することで、反応性に富むナイトレンを生じる。ナイトレンは、装置の表面上のＮＨ２と反応しやすく、ヒドラジン結合を形成する。リンカーの他の末端は、ＮＨＳカルボキシレートであり、それはポリメラーゼの表面上のリジンと反応してアミド共有結合を生じる。別の実施形態において、ＮＨＳカルボキシレート部分を、緩衝条件下で、装置の表面上の１級アミンと反応させる。ＵＶ光は、アジドニトロベンゼン部分を活性化し、電子不足基である反応性に富むナイトレンを形成し、ポリメラーゼ上のリジン残基の１級アミンと容易に反応させるために用いられる。これらの方法は、以下の実施例４においてさらに詳細に説明される。
【００５８】
２．２．シークエンシングの様式
本発明により提供されるバイオアッセイシステムは、例えば、米国特許第６，９４６，２４９号、およびシェンデュア（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ）ら、ネイチャー・レビューズ・ジェネティクス（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．），５：３３５−４４（２００４）に概説されているような当該分野で知られた手段により核酸を検出およびシークエンシングするのに用いることができる。いくつかの実施形態において、シークエンシング法は、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼの特異性に依存し、例えば、塩基伸長シークエンシング（単一塩基段階的伸長）、合成による多塩基シークエンシング（例えば、末端標識されたヌクレオチドを用いるシークエンシング）および混合塩基（ｗｏｂｂｌｅ）シークエンシングを含み、それはライゲーションベースのものである。方法のすべてが、通常は、リンカー部位に（直接的または間接的に）付着することになる少なくとも１つの末端連結プライマーを含む一本鎖サンプル核酸を要する。そして、シークエンシングプライマーでシークエンシングが開始する（リガーゼベースのシークエンシングでは、一般にアンカープライマーと呼び、シークエンシングプライマーに類似した目的を果たす）。
【００５９】
全てのシークエンシングの様式に対し、本発明は単一分子を再シークエンスできるという利点を提示する。例えば、シークエンシング読み取りの完了後、シークエンシングプライマーおよび伸長されたヌクレオチドをサンプル核酸から取り去ることができ、装置を洗浄し、そしてシークエンシングを繰り返し行う。様々な実施形態において、再シークエンシングは、同じまたは異なる方法により行うことができる。同一の分子を再シークエンシングすることで、シークエンシングエラーは、シークエンシング読み取り数の指数にしたがって減少することが見込まれる。例えば、単一の読み取りの塩基あたりのエラー率が１０−３である場合、２回の読み取り後、これは（１０−３）２、すなわち１０−６に減少する。このことは、シークエンシングに用いられる修飾ヌクレオチドが、例えば、擬似の欠失をもたらすそれらの標識または封鎖基を失ってもよいために、単一分子のシークエンシングに特に利点がある。
【００６０】
２．２．１．塩基伸長シークエンシング：段階的伸長
いくつかの実施形態において、本発明により提供される光検出装置は、例えば、米国特許第５，３０２，５０９号に開示されているような塩基伸長シークエンシングを実行するのに用いることができる。いくつかの実施形態において、塩基伸長シークエンシングは、図６に示されているように、シークエンスされるべき一本鎖核酸３２、シークエンスされるべき核酸３２の３’末端につながれた末端連結プライマー３４、およびそれにアニールされたシークエンシングプライマー３４６を含む一部二本鎖のサンプル核酸を、リンカー部位２２０に付着させることにより開始する。いくつかの実施形態では、続いてポリメラーゼ３８および修飾ヌクレオチドを適当なバッファー中で光検出装置に塗布する。いくつかの実施形態において、サンプル核酸複合体を、リンカー部位のポリメラーゼによりリンカー部位に付着させる。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、いかなる二次的な伸長をも阻止するための共有結合している検出可能な標識、例えば、蛍光標識、および封鎖基を含む。したがって、単一のヌクレオチドのシークエンシングプライマー３４６の３’末端への付加の後、シークエンシングが停止する。
【００６１】
図７は、塩基伸長シークエンシング反応のある実施形態の第１段階の図式表示である。蛍光封鎖基３６４を有するヌクレオチド３６２をＤＮＡポリメラーゼ３８によりシークエンシングプライマー３４６の３’末端に添加する。いくつかの実施形態において、蛍光標識は、封鎖基として機能する。別の実施形態では、それらは分離した部分である。単一のヌクレオチドをシークエンシングプライマー３４６の３’末端に組み込み、対応する光検出器２１０を用いて、その標識により同定する。次いで、蛍光標識および封鎖基を、例えば、化学的または酵素溶解により除去して、塩基伸長のさらなるサイクルを可能にする。特定の実施形態では、標識および封鎖基を同時または順次に任意の順序で除去することができる。添加される塩基の順序を編集することにより、１度に１塩基ずつ、３’から５’方向にサンプル核酸のシークエンスを推定する。図９は、いくつかのサンプル核酸の並行した伸長、検出、封鎖解除／標識解除の１サイクルを説明している。
【００６２】
一般に、段階的伸長中に添加されるヌクレオチドを見分ける方法は２つある。第１のケースでは、４種のヌクレオチドすべてが同じ検出可能な標識を有するが、所定の順に、一度に１種添加する。伸長されたヌクレオチドのアイデンティティーは、ヌクレオチドが伸長反応に添加される順番により決定される。伸長中に挿入される塩基を見分ける第２のモードでは、４種の異なるヌクレオチドを同時に添加し、各々を異なる検出可能な標識に結合させる。異なる実施形態において、標識の励起または発光スペクトルおよび／または強度はそれぞれ異なり得る。伸長反応に添加されるヌクレオチドのアイデンティティーは、検出された標識の強度および／または波長（すなわち、励起または発光スペクトル）により決定される。これら２つの手法の例が実施例５に提示される。
【００６３】
２．２．２．合成によるシークエンシング：多段階伸長
いくつかの実施形態において、合成によるシークエンシングは、例えば、封鎖基を用いずに、多数の連続した伸長反応により進行することができる。これらの実施形態では、重合反応を、ヌクレオシド三リン酸加水分解後のピロリン酸の放出、すなわちβおよびγリン酸複合体の放出を検出することにより観察する。この複合体は、例えば、複合体上の蛍光部分により、直接的に、または、ピロリン酸を化学もしくは生物発光検出システムに結合させることにより、間接的に、検出することが可能である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、サンプル核酸を、基本的に末端リン酸標識ヌクレオチドを用いることにより連続してシークエンスする。末端リン酸標識ヌクレオチドおよびそれらの使用法の例示的な実施形態は、例えば、米国特許第７，３６１，４６６号および２００７年６月２１日に公開された米国特許出願公開第２００７／０１４１５９８号に記載されている。簡単に言うと、ヌクレオチドを本発明により提供される装置に塗布し、重合反応中の加水分解時に、標識したピロリン酸を対応する光検出器で検出する。いくつかの実施形態において、４種すべてのヌクレオチドは異なる標識を含み、かつ同時に添加することができる。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは区別できない、例えば、同一の標識を含み、所定の順に順次添加する。区別できない標識を持つヌクレオチドの順次的かつ循環的な添加でも、例えば、ホモポリマーのシークエンスにおける多数の連続した重合ステップが可能となる。
【００６５】
２．２．３．リガーゼベースのシークエンシング
別の実施形態においては、サンプル核酸は、本発明により提供される光学的検出装置上で、リガーゼベースのシークエンシングによりシークエンスされる。リガーゼベースのシークエンシング法は、例えば、米国特許第５，７５０，３４１号、国際公開第０６／０７３５０４号パンフレット、およびシェンデュア（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），３０９：１７２８−１７３２（２００５）に開示されている。シェンデュア（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ）らの方法では、例えば、未知の一本鎖ＤＮＡサンプルは、両側に２つの末端連結プライマーを配置し、固相担体上に固定することができる。未知のシークエンス中の特定の位置（例えば、特定の末端連結プライマーに近接するｎ個目の塩基）は、いわゆるアンカープライマー（シークエンシングプライマーに類似するもの）を末端連結プライマーのうちの１つにアニールすること、そして、４個の縮重九量体のプールを混合物に添加することにより調べることができる。４個の九量体は、すべて異なる蛍光標識を有しており、各九量体が異なる塩基のＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴで調べる照会位置を除いて、すべての位置で縮重する。サンプルを洗浄し、蛍光走査し、そして照会塩基を識別する。続いて、アンカープライマーおよびライゲートされた九量体をサンプル核酸から取り去り、装置を洗浄し、このプロセスを繰り返して、異なる位置の照会を行う。有利には、この方法は、非累積的である、すなわち、塩基は、順番に照会が行われる必要がない。それゆえ、エラーが累積的ではない。そのうえ、この方法は、５’または３’からの方向でヌクレオチドの照会を行うことができ、すなわち標準的な５’→３’のＤＮＡ合成を必要としない。サンプル核酸の合計約１３個の塩基は、通常、この方法によりシークエンスすることができる。
【００６６】
２．３．応用
本発明に従ったバイオアッセイシステムは、何百万もの核酸セグメントを同時に検出することができる。各セグメントが、例えば、１，０００塩基長であるとすると、単一の装置は、何十億以上もの塩基シークエンスを一度に得ることができる。以下に述べられるのは、本願により提供される装置および方法のさらなる応用である。
【００６７】
２．３．１．全ゲノムシークエンシング
本発明に従ったバイオアッセイシステムは、例えば、ウィルス、バクテリア、菌類、真核生物、または脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトの全ゲノムまたは部分ゲノムシークエンシングを行うのに用いることができる。
【００６８】
シークエンシングのために、ゲノムＤＮＡは、少なくとも、２０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、３００個以上、５００個以上、８００個以上、１，２００個以上、１，５００個以上のヌクレオチドの断片に切断することができる。いくつかの実施形態において、切断されたゲノムＤＮＡは、２０〜５０個、２０〜１００個、２０〜５００個、２０〜１，０００個、５００〜１，２００個、または５００〜１，５００個のヌクレオチド長であってよい。いくつかの実施形態において、シークエンスされるべき核酸は、関連した末端連結プライマーと共に、一本鎖にし、シークエンシングプライマーにアニールし、かつ本発明により提供される装置に塗布して、上述のようなシークエンシングを行う。
【００６９】
２．３．２．遺伝子発現プロファイリング
別の実施形態において、本発明に従ったバイオアッセイシステムは、遺伝子発現プロファイリングのためにｃＤＮＡをシークエンスするのに用いることができる。例えば、ｍＲＮＡレベルは、特定のシークエンスが装置上で検出される相対頻度を測定することにより定量化することができる。数百万個のｃＤＮＡ分子を本発明により提供される装置上で並行してシークエンスすることができる。１つの細胞が平均して３５０，０００個のｍＲＮＡ分子を含むとすると、細胞あたりのたった１コピーに現れる転写産物でも、１００万のシークエンシング反応中に、およそ３回シークエンスされることが見込まれる。したがって、本発明により提供される装置は、単一のコピー数の感度による単一分子シークエンシングに適している。
【００７０】
ｃＤＮＡ合成は、当該分野においてよく知られており、通常、任意のｍＲＮＡの濃縮を伴う全ＲＮＡ抽出を含む。ｃＤＮＡは、例えば、第一鎖合成のための逆転写；残存ＲＮＡを除去するためのＲＮＡｓｅ処理；ＤＮＡポリメラーゼによる第一鎖、および第二鎖合成のランダムヘキサマープライミングを含むステップによりｍＲＮＡから生成される。結果として得られるｃＤＮＡは、本発明により提供される装置上でシークエンシングを行うのに適している。ＤＮＡおよびＲＮＡ両者の単離と調製は、当該分野においてよく知られている。例えば、ジョセフ・サムブロック（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびデイヴィッド・ラッセル（Ｄａｖｉｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ），モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；第３版（２００１）を参照されたい。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡは、米国特許第６，８１２，００５号および第７，３６１，４８８号に開示されたような方法によりシークエンスすることができる。簡単に言うと、ｃＤＮＡにアダプターポリ核酸をライゲートし、アダプターを特殊な制限酵素で処理すると、最後に、処理した核酸が、本発明により提供される装置のリンカー部位に付着した相補オリゴヌクレオチドに結合する。特定の実施形態において、アダプター分子は末端連結プライマーである。
【００７２】
本発明に従ったいくつかの実施形態において、ｍＲＮＡのポリＡ尾部は、適当な末端連結プライマーとなり得、それはポリＴシークエンシングプライマーに相補的である。
【００７３】
２．３．３．結合相互作用の検出および／または測定
別の実施形態において、バイオアッセイシステムは、例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡ塩基対合、核酸／タンパク質相互作用、抗原／抗体、レセプター／リガンド結合、および酵素／基質結合を含む様々な結合相互作用を検出するのに用いることができる。通常、サンプル分子は、核酸識別タグ（ＩＤ）を含む連結分子に付着させる。いくつかの実施形態において、連結分子は、サンプル分子を結合させる捕捉分子をさらに含む。また、連結分子は、リンカー部位に結合するための手段、例えば、ジスルフィド、チオエステル、アミド、ホスホジエステル、もしくはエステル結合のような共有化学結合、または非共有結合、例えば、抗体／抗原もしくはビオチン／アビジン結合を助ける部分を含む。いくつかの実施形態においては、連結分子は、ＩＤタグによりアレイに付着させる。
【００７４】
サンプル分子は、本発明に従った装置に塗布され、そのリンカー分子により任意のリンカー部位に、例えば、連結分子上に位置する捕捉分子を結合させることにより、付着させられる。いくつかの実施形態において、サンプル分子およびリンカー分子は、混合して結合させ、そして、本発明により提供される装置に塗布される。いくつかの実施形態においては、まず、リンカー分子は、装置に塗布してリンカー部位に付着させてから、サンプル分子が塗布される。次に、本発明に従った方法により（例えば、ハイブリダイゼーションまたはシークエンシングにより）ＩＤが検出され、関連したサンプル分子を同定する。複数のサンプル分子種は、同一のアレイに付着させることができ、かつ、それらの標識により区別され、さらに、それらの結合相互作用は、その結合する捕捉分子の固有のＩＤを用いて特徴付けられることができる。それゆえ、いくつかの実施形態において、標識されたサンプル分子を検出する方法は、サンプル分子を本発明に従った装置のリンカー部位に核酸タグを含むリンカー分子により連結させるステップ、ＩＤの核酸シークエンシングを行うステップ、および標識されたサンプル分子を検出するステップを含む。特定の実施形態において、核酸シークエンシングは、塩基伸長シークエンシングである。いくつかの実施形態では、核酸シークエンシングは、リガーゼベースのシークエンシング、または末端リン酸標識ヌクレオチドシークエンシングから選ばれる。
【００７５】
ヌクレオチドの「小片」を利用することで、最高で４ｎの異なる捕捉分子を本発明に従ったバイオアッセイシステムに付着させ同定することができる。ここで、ｎはシークエンスされるＩＤの長さを表す自然数である。例えば、５個のヌクレオチドは、１，０００を超える固有のＩＤを提供することができ、また、１２個のヌクレオチドは、１，６００万を超える組み合わせを提供する。例えば、リンカー分子は、本発明に従った装置に付着させられ、それらの位置は、それらの対応するＩＤタグを検出することにより決定される。そして、リンカー分子は、例えば、１個またはそれ以上の標識されたサンプル分子との結合相互作用を調べるためのプローブとなる。すなわち、１個またはそれ以上のリンカー分子が付着した装置は、プローブアレイとして機能し得るのである。
【００７６】
特定の実施形態において、標識されたサンプル分子は、蛍光標識されたものである。リンカー分子の捕捉分子に結合されると、標識されたサンプル分子は、リンカー分子が付着しているリンカー部位に対応する光検出器（複数の光検出器）により検出される。それゆえ、いくつかの実施形態において、本発明に従った方法は、標識されたサンプル分子を本発明に従った装置に塗布するステップ、および標識されたサンプル分子を検出するステップをさらに含んでいてもよい。特定の実施形態では、装置は、そのリンカー部位に付着する核酸タグ（ＩＤ）を含むリンカー分子を有する。多数の標識されたサンプル分子は、同時にプローブアレイに塗布され、それらの標識により、例えば、それら蛍光標識の強度および／または波長により、区別されることができる。サンプル分子と標識された照会分子との間の結合相互作用の解離定数は、所定濃度の標識された照会分子における動力学（例えば、結合／解離の比率）および静力学（例えば、任意の所定時間における結合または未結合状態にあるサンプル分子の割合）の両方に基づいて推測することができる。
【００７７】
いくつかの実施形態においては、連結分子のＩＤは、少なくとも、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、７５個以上、９０個以上、１００個以上、１５０個以上、２００個以上のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ＩＤは、５〜１０個、５〜２０個、５〜４０個、５〜８０個もしくは５〜１６０個；または、１０〜２０個もしくは１０〜５０個；または、２０〜３５個のヌクレオチド長である。ＩＤは、固有の核酸シークエンス、すなわち検出されるべき核酸を含む。特定の実施形態では、固有の核酸シークエンスは、少なくとも、１個以上、２個以上、４個以上、６個以上、８個以上、１０個以上、１２個以上、１４個以上、１６個以上、２０個以上、２４個以上、３０個以上のヌクレオチド長であってよい。いくつかの実施形態において、固有の核酸シークエンスは、４〜１０個、４〜１２個、４〜１５個もしくは４〜２０個；または、１０〜２０個のヌクレオチド長である。ＩＤは、少なくとも１つの末端連結プライマーを含む、すなわち、ＩＤは、いくつかの実施形態において、例えば、ビオチン化ヌクレオチドを含ませることにより修飾されてリンカー部位に付着するシークエンシングプライマーに相補的なシークエンスを含む。いくつかの実施形態において、ＩＤの末端連結プライマー部分は、固有の核酸シークエンスの３’側である。いくつかの実施形態において、それは、固有の核酸シークエンスの５’側である。さらに別の実施形態では、末端連結プライマーは、固有の核酸シークエンスの３’末端および５’末端の両方に存在する。
【００７８】
特定の実施形態において、サンプル分子および捕捉分子は、炭水化物、脂質、タンパク質、ペプチド、抗原、核酸、ホルモン、有機小分子（例えば、医薬）、もしくはビタミン部分、またはこれらの組み合わせから選択される部分を含む。これらの部分は、天然に存在する（例えば、生化学的に精製された）もの、あるいは、合成の（例えば、化学的に合成された、もしくは組み換え技術により製造された）ものであってよい。さらに、これらの基質は、非天然成分（例えば、非天然アミノ酸、封鎖基もしくは保護基など）を含まない、一部を含む、または全てを含んでいてもよい。特定の実施形態において、サンプル分子または捕捉分子は、タンパク質、例えば、成長因子、ペプチド抗原、抗体、またはレセプターである。
【００７９】
核酸をリンカー分子またはリンカー部位にコンジュゲートさせる様々な手法は、例えば、米国特許出願公開第２００４／００３８３３１号に概説されているように、当該分野において知られている。公開‘３３１号は、タンパク質オリゴヌクレオチドコンジュゲート体を固相担体上に形成する方法を開示する。米国特許第４，７４８，１１１号は、タンパク質を核酸の３’末端にコンジュゲートさせる一例を提示している。そこでは、まず、末端転移酵素を用いて、リボース残基を分子の３’部分に添加する。そして、過ヨウ素酸塩酸化反応により、核酸上に３’アルデヒド基が生じ、続いて、それがタンパク質のアミド基と共有結合を形成する。タンパク質をＩＤの３’末端にコンジュゲートさせる場合、リンカー部位への付着は、ＩＤの５’末端によりなされる。
【００８０】
いくつかの実施形態において、捕捉分子、例えば、タンパク質は、ＩＤの５’末端に連結される。これらの実施形態では、ＩＤの３’末端またはシークエンシングプライマーの５’末端が捕捉分子をリンカー部位に付着させるために用いられる。例えば、米国特許第６，０１３，４３４号は、その連結がオリゴヌクレオチドの５’末端によりなされるオリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート体を開示する。米国特許第６，１９７，５１３号は、ＰＮＡおよびＤＮＡの両方について、核酸の５’末端によるカルボン酸部分を有する分子、例えば、タンパク質へのコンジュゲート体を開示する。ＰＮＡおよびＤＮＡ分子は、アリールアミンまたはアミノオキシアセチル部分を含む。米国特許第６，１５３，７３７号は、様々な分子をそれにコンジュゲートさせるのに適当な少なくとも１つの２’官能化ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを開示する。
【００８１】
２．３．４．さらなる検出方法
２．３．４．１．ＦＲＥＴ
いくつかの実施形態において、分子は、本発明により提供される光検出装置上で、時として蛍光共鳴エネルギー移動として知られる、フェルスター（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ）共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により検出される。当該分野で知られているように、ＦＲＥＴは、励起されたドナー分子がエネルギーをアクセプター分子に無放射的に移動させるときに起こり、それは、通常、光としてエネルギーを放出する。ＦＲＥＴは、例えば、検出される分子の有効励起および発光波長間のより大きなスペクトル分離を提供することにより、バックグラウンド信号を低減するのに有用である。ＦＲＥＴは、しばしば、そのドナーおよびアクセプター分子間の距離の６乗である効率の減衰のために、近接する分子の相互作用を検出するのに用いられる。例えば、チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（ネイチャー・マテリアルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ），４：８２６−３１（２００５））は、ＦＲＥＴにより核酸ハイブリダイゼーションを検出した。そこでは、ビオチン化核酸ターゲットをアビジンでコートされた量子ドットドナーにコンジュゲートさせ、そして、それがＣｙ５−コンジュゲートＤＮＡプローブを励起した。本発明のいくつかの実施形態において、標識された捕捉分子および標識されたサンプル分子は、ＦＲＥＴによる検出のためにドナー／アクセプター（またはその逆）ペアを形成することが可能である。
【００８２】
本発明により提供される核酸シークエンシングのいくつかの実施形態において、蛍光標識されたヌクレオチドは、ポリメラーゼまたはリガーゼに付着したドナー発光団に対するアクセプター発光団として機能する。したがって、これらの実施形態では、ポリメラーゼまたはリガーゼ上に位置するドナー発光団は、サンプル核酸に重合、またはライゲートされるヌクレオチド上のアクセプター発光団を励起する。ポリメラーゼに近接しないヌクレオチドは、ＦＲＥＴ効率の急速な低下のために励起されない。いくつかの実施形態において、ドナー分子は、例えば、別の蛍光色素分子、例えば、量子ドットである。量子ドット、例えば、半導体量子ドットは、当該分野において知られており、例えば、国際公開第０３／００３０１５号パンフレットに記載されている。量子ドットを、例えば、生体分子に結合する手法は、例えば、メドニッツ（Ｍｅｄｎｉｔｚ）ら、ネイチャー・マテリアルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ），４：２３５−４６（２００５）、ならびに２００６年３月３０日および２００８年４月１７日にそれぞれ公開された米国特許出願公開第２００６／００６８５０６号および第２００８／００８７８４３号に概説されているように、当該分野において知られている。いくつかの実施形態では、量子ドットは、ＤＮＡポリメラーゼ分子にコンジュゲートされる。それは、以下の実施例３でさらに説明される。酵素をリンカー部位にコンジュゲートさせることについて、すでに上で述べたように、当業者は、蛍光色素分子を、例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼにコンジュゲートさせるときに、蛍光色素分子をコンジュゲートさせることが酵素の一次、二次、および三次構造に与えるあらゆる影響を軽減することにより酵素機能を保つよう注意を払わなければならないということを、間違いなく理解する。
【００８３】
２．３．４．２．多光子励起
いくつかの実施形態では、発色団は、２つまたはそれ以上の光子により励起される。例えば、いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴにおけるドナーまたはアクセプター発光団の励起は、２つまたはそれ以上の光子によりなされる。２光子および多光子励起は、例えば、米国特許第６，３４４，６５３号および第５，０３４，６１３号にさらに記載されている。
【００８４】
２．３．４．３．時間分解検出
いくつかの実施形態において、本発明により提供される装置の光源および光検出器は、特有の位相シフトを持つように調節することができる。例えば、２００８年２月１４日に公開された米国特許出願公開第２００８／００３７００８号に開示されているような当該分野で知られる方法を用いて、本発明により提供される装置上で検出される分子から発生される光を、励起光源からの妨害なしに、対応する光検出器で測定することができる。
【００８５】
３．バイオアッセイシステムを用いる生体分子分析サービス
また、本発明は、本発明に従った実施形態によるバイオアッセイシステムを用いる生体分子分析サービスを提供する方法をも提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、分析されるべき生体分子を含むサンプルをサービス要求者からサービス提供者へ提供するステップ、およびサービス要求者がサービス提供者から分析結果を受け取るステップを含み、この結果は、本発明により提供される装置を用いて生成されるものである。いくつかの実施形態において、この方法は、利益のある対価、例えば、サービスごとの個別支払いまたはサービス請負契約のために実行される。さらに、サンプルは、サービス要求者とサービス提供者間で直接的に輸送されても、ベンダーにより仲介されてもよい。いくつかの実施形態において、サービス提供者またはベンダーは、地理的に、アメリカ合衆国外の領域、例えば、別の国に位置していてもよい。
【００８６】
本明細書に引用したすべての特許、特許出願、またはその他の文献について、すべての目的そして挙げられた課題のためにそれがその全体として参照として組み入れられるということが、理解されるべきである。参照として組み入れられる文献と本出願との間に何らかの不一致が存在する場合、本出願が優位に立つことになる。
【００８７】
本明細書は、本明細書内に引用される参照文献の教示内容を考慮すれば、最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の具体例の説明を提示するものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、その他多くの実施形態が本発明に包含されるということを容易に認識する。本開示に引用される全ての刊行物および特許は、それらの全体として参照して組み込まれる。参照として組み込まれる材料が本明細書と相反するまたは矛盾する限りにおいては、本明細書は、いかなるそのような材料にも優先し得る。本明細書中のいかなる参照文献の引用も、かかる参照文献が本発明の先行技術であるということの承認ではない。
【００８８】
特に示さない限り、クレームを含む本明細書中で用いられる成分、反応条件、およびその他の量を表す数字はいずれも、すべての場合において「約」という用語により修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、そうでないということが特に示されない限り、数値パラメーターは近似値であり、かつ、本発明により得ようとする所望の特性に応じて変わり得る。最低限でも、そしてクレームの範囲の均等論の適用を制限しようとするのではなく、各数値パラメーターは、有効数字の数および通常の丸めの手法を踏まえて解釈されるべきである。
【００８９】
特に示さない限り、一連の要素の前に来る「少なくとも」という用語は、その連なりの中のすべての要素に言及するということが理解されなければならない。当業者は、日常的なものにすぎない実験により、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認める、または確認することができる。そのような均等物は、以下のクレームに包含されることが意図されている。
【実施例】
【００９０】
実施例１：高処理能力バイオアッセイシステムの構築
以下、バイオアッセイシステム１を製造する方法を図１〜４を参照することにより詳細に述べる。まず、シリコン基板１０を、一般のロジックおよび光学デバイスに用いる商用の０．２５μｍ半導体製造プロセスにより基板１０の上表面上に形成された複数の光検出器２１０と共に準備する。光検出器２１０は、フォトダイオード光子検出器であり、各々が直径２４μｍおよび露光面積４５２μｍ２を有する。各光検出器は互いに隣接するように配置され、これにより、光検出器２１０の５１２の列および５１２の行のアレイが基板１０上に形成される。
【００９１】
複数の制御回路２１５を、光検出器２１０が形成されていない基板１０の上表面上に形成する。この実施形態では、その対応する光検出器２１０の動作を制御し、かつ光検出器２１０と検出および記録システム２との間の情報交換を制御するように、１つの制御回路２１５は１つの光検出器２１０に対応する。
【００９２】
この実施形態においては、フィルター層２４０を光検出器２１０および制御回路２１５の上表面の上方に形成する。フィルター層２４０を形成する前に、グローバル平坦化プロセスを光検出器２１０および制御回路２１５の上表面に施す。フィルター層２４０は複数の副層を含む。この実施形態において、フィルター層２４０は、まず、より高い屈折率を持つ副層を、光検出器２１０および制御回路２１５の平坦化された上表面の上方に堆積することにより形成する。次いで、より低い屈折率を持つ副層を、すでに形成されたより高い屈折率を持つ副層上に堆積する。より高い屈折率およびより低い屈折率の副層を次々と堆積していくことにより、多数の副層をそうして堆積していき、フィルター層２４０を形成する。この実施形態では、フィルター層２４０は多数の副層を含む。
【００９３】
図５を参照すると、フィルター層２４０の実例の構造を要約する表が示されている。図５において、より小さい番号の付いた副層は、フィルター層２４０の底表面により近い副層を表し、より大きい番号の付いた副層は、フィルター層２４０の上表面により近い副層を表す。図５に示されるように、この特定の実施形態において、フィルター層２４０の奇数番号の副層は、例えば、ニオブ酸化物（Ｎｂ２Ｏ５）で作製され、それは、より高い屈折率を有するものである。偶数番号の副層は、例えば、シリコン酸化物（ＳｉＯ２）で作製され、それは、より低い屈折率を有するものである。副層は、スパッタリングシステムを用いて形成することができ、その例は、シンクロン社（日本、東京、品川区）製ラジカル支援スパッタリングシリーズの型番：ＲＡＳ １１００を含む。この実施例における各副層の厚さも、図５の表に提示されている。結果として得られるフィルター層２４０は、蛍光色素分子Ｃｙ５の蛍光に対して透明度が高く、蛍光色素分子Ｃｙ５を励起するための外部光源として用いられる波長約６３３ｎｍのヘリウム−ネオンレーザーから発生される光に対して低い透明性を有している。
【００９４】
図２および４を再び参照すると、ピンホール２３５を有するブラインドシート２３０をフィルター層２４０上に形成する。以下、ピンホール２３５を有するブラインドシート２３０をフィルター層２４０または基板１０の上方に作製するプロセスを詳細に述べる。
【００９５】
まず、フォトレジスト層を、フィルター層２４０上に（フィルター層２４０を選択的に光検出器２１０および制御回路２１５の上表面上に形成する場合）、または平坦化された光検出器２１０および制御回路２１５の上表面上に（フィルター層２４０を形成しない場合）、例えば、フィルター層２４０上にレジスト材料をスピンコーティングすることにより形成する。その後、フォトレジスト層を現像してピンホール領域にフォトレジストパターンを形成する。フォトレジストパターンは、フォトマスクを用いてピンホール領域を覆い、フォトマスクに覆われた領域のみがフィルター層２４０上または平坦化された光検出器２１０および制御回路２１５の上表面上に残るようにフォトレジスト層を露光することで形成する。
【００９６】
次いで、金属層を、フォトレジストパターンがすでに形成されたフィルター層２４０の上方に堆積する。この実施形態において、金属層はクロム（Ｃｒ）を含み、これを、マグネトロンスパッタリングプロセスを行うことによりフィルター層２４０または平坦化された光検出器２１０および制御回路２１５の上表面の上方に堆積する。
【００９７】
続いて、ピンホール領域上の金属層の部分およびピンホール領域内のフォトレジストパターンを除去し、これによりピンホール２３５を有するブラインドシート２３０が形成される。
【００９８】
また、ブラインドシート２３０を、まず、金属層（例えば、Ｃｒ）をフィルター層２４０上に堆積してから、金属層上にマスクを形成することにより形成してもよく、これにより金属層の上表面の一部が露出される。次に、金属層の露出された部分を、フィルター層２４０が露出するまでエッチングし、これにより金属層上にピンホールが形成される。そして、マスクを金属層から除去し、ピンホール２３５を有するブラインドシート２３０をフィルター層２４０上に形成する。
【００９９】
図２および４を再び参照すると、この実施形態では、リンカー部位２２０を、ピンホール２３５または空洞４５０に支持材料を充填することにより形成する。支持材料は、蛍光色素分子３６から発生される蛍光に透明なポリマーまたは無機材料とすることができる。
【０１００】
図１を再び参照すると、１２個の光学的検出装置２０だけが示されているが、少なくとも１万個の光学的検出装置２０を基板１０上に形成できることは理解される。例えば、この実施形態において、各光学的検出装置２０は、半径約５μｍ以下の円形を有しており、それは、約１００μｍ２の面積を占めるものであってよい。１インチの２乗（すなわち、２．５４ｃｍ×２．５４ｃｍ）の面積を有する基板１０の場合、６００万個以上の光学的検出装置２０を１つの基板１０上に作製することが可能である。それら６００万個の光学的検出装置２０を同時に動作させることにより、生体分子を高処理能力で検出することができる。
【０１０１】
実施例２：高処理能力バイオアッセイシステムによる生体分子の付着および検出
検出システムをテストするために蛍光色素Ｃｙ５で標識された核酸を用いる。Ｃｙ５およびビオチンを、６０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの３’および５’末端にそれぞれ付着させる。標識およびビオチン化されたＤＮＡをＴｒｉｓＭｇ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０）バッファー中に溶解し、アドレスアレイ上に堆積し、湿ったチャンバ中でインキュベートする。約３０分後、未結合のＤＮＡをＴｒｉｓバッファーで洗い落とす。
【０１０２】
ブラインドシート上に形成してもよい６３５ｎｍの発光ダイオードにより励起光を提供する。各ピクセルからの信号を読み取るために、励起光を約１〜５秒間オンにし、各ピクセルから信号を記録し、このサイクルを１００回繰り返す。次いで、各ピクセルの代表的な平均信号および対応する標準偏差を適宜計算する。ＤＮＡサンプルの堆積前後の信号を比較し、標準偏差の和の３倍よりも平均信号の差が大きいピクセルを正のピクセルと見なす。すなわち、
（ＡｖｇＡｆｔｅｒ−ＡｖｇＢｅｆｏｒｅ）＞３×（ＳＴＤＡｆｔｅｒ＋ＳＴＤＢｅｆｏｒｅ）
である。
【０１０３】
実施例３：量子ドットのポリメラーゼへの結合
以下に、官能化量子ドットをポリメラーゼ分子上の１級アミンにコンジュゲートさせる２つの方法を示す。第１の方法はアミンで活性化されたドットを用い、第２の方法はカルボキシルで活性化されたドットを用いる。
【０１０４】
３．１．アミンＥＶＩＴＡＧ（登録商標）のＤＮＡポリメラーゼへのコンジュゲート体
アミンＥＶＩＴＡＧ（登録商標）（例えば、エヴィデント・テクノロジーズ（Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、カタログ番号：Ｅ２−Ｃ１１−ＡＭ２−０６２０；ＥＶＩＴＡＧ（登録商標）の一連のＱＤ製品は、商標ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）でイー・バイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ），カルフォルニア州（ＣＡ）からも販売されている）官能化量子ドット（ＱＤｓ）をＢＳ３（ビス−（スルホスクシンイミジル）スベラート、８−炭素スペーサアームの各末端にアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを含むホモ二官能性、水溶性架橋剤により活性化する。ＮＨＳエステルは、ＱＤｓの表面上の１級アミンとｐＨ７〜９で反応して安定したアミド結合を形成し、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド離脱基を放出する。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、ＮＨＳ−エステル架橋結合のターゲットとして利用できるいくつかの１級アミン（例えば、リジン（Ｋ）残基および各ポリペプチドのＮ末端）を有している。
【０１０５】
３．１．１．量子ドットの表面活性
ＥＶＩＴＡＧ（登録商標）２．０ｎｍｏｌを２５μＬ １０ｍＭ ＢＳ３（ビス−（スルホスクシンイミジル）スベラート、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社、品番：２１５８０）および２５μＬ １０× ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で活性化し、ｄ−Ｈ２Ｏで最終体積を２５０μＬにする。３０分間インキュベートした後、その溶液を、ＰＤ−１０カラム（アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、製品コード：１７−０８５１−０１）を用いて脱塩し、１× ＰＢＳで溶出する。着色された部分は活性化されたＱＤｓを含んでいる。
【０１０６】
３．１．２．ＤＮＡポリメラーゼ結合
ｐＨ９．２の０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー中のＤＮＡポリメラーゼ１００μｇを上記混合物へ添加することにより、ポリメラーゼを結合させる。充分混合した後、そのサンプルを２時間傾斜回転させながら４℃でインキュベートする。
【０１０７】
３．１．３．ＱＤコンジュゲートポリメラーゼの精製
上記コンジュゲート体を３０Ｋマイクロスピン（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）フィルター（パール・コーポレイション（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、品番：ＯＤ１００Ｃ３３）を用いた６，０００ｒｐｍ、５〜１０分間の遠心分離により全容量約２００μＬに濃縮する。そのコンジュゲート体を３０Ｋマイクロスピン（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）フィルター上にてｄ−Ｈ２Ｏで２回洗浄する。
【０１０８】
次いで、そのコンジュゲート体をスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）３０／７５樹脂（ジー・イー・ヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、低分子タンパク質およびペプチド用の品番：１７−０９０５−１０または１７−１０４４−１０）上でサイズ排除により精製する。濃縮した結合混合物をカラムにロードして、それがカラムベッドに入るようにする前に、そのカラムをｄ−Ｈ２Ｏで前平衡化する。そのサンプルをブラックライト励起下、ｄ−Ｈ２Ｏで溶出し、その蛍光画分を収集する。その蛍光画分をプールし、１００Ｋマイクロスピン（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）フィルターを用いた６，０００ｒｐｍ、５〜１０分間の遠心分離により全容量約１００μＬに濃縮する。その精製および濃縮したコンジュゲート体は、４℃で保管することができる。
【０１０９】
３．２．カルボキシルＥＶＩＴＡＧ（登録商標）のＤＮＡポリメラーゼへのコンジュゲート
カルボキシルＥＶＩＴＡＧ（登録商標）（例えば、エヴィデント・テクノロジーズ（Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、カタログ番号：Ｅ２−Ｃ１１−ＣＢ２−０６２０）官能化ＱＤｓを、ＥＤＣ媒介のスルホ−ＮＨＳエステルカップリング反応を利用して活性化させる。そのアミン反応性スルホ−ＮＨＳエステルは、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ上のリジン（Ｋ）残基の側鎖における１級アミンと反応する。
【０１１０】
３．２．１．量子ドットの表面活性化
ＥＶＩＴＡＧ（登録商標）２．０ｎｍｏｌを２５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０ バッファー中に希釈する。用いる直前に、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社、品番：２２９８０）を、低温の２５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０中に、濃度５０ｍｇ／ｍＬまで溶解する。並行して、ｐＨ５．０の２５ｍＭ ＭＥＳ中のスルホ−ＮＨＳ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社、品番：２４５２５）の５０ｍｇ／ｍＬ溶液を同じように調製する。
【０１１１】
次に、ＥＤＣ溶液５０μＬおよびスルホ−ＮＨＳ溶液５０μＬをＥＶＩＴＡＧ（登録商標）溶液に添加する。その混合物を充分に混合し、室温で３０分間ゆっくり傾斜回転させながらインキュベートする。そして、その混合物を、ＰＤ−１０カラム（アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、製品コード：１７−０８５１−０１）を用いて、脱塩し、ｐＨ９．２の０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファーで溶出する。活性化されたＱＤｓを含む着色された部分を収集する。
【０１１２】
３．２．２．ＤＮＡポリメラーゼ結合
ｐＨ９．２の０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー中のＤＮＡポリメラーゼ１００μｇを上記混合物に添加する。充分に混合した後、そのサンプルを２時間傾斜回転させながら４℃でインキュベートする。
【０１１３】
３．２．３．ＱＤ−コンジュゲートポリメラーゼの精製
上記コンジュゲート体を、３０Ｋマイクロスピン（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）フィルター（パール・コーポレイション（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、品番：ＯＤ１００Ｃ３３）を用いた６，０００ｒｐｍ、５〜１０分間の遠心分離により全容量約２００μＬに濃縮する。そのコンジュゲート体を３０Ｋマイクロスピン（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）フィルター上にてｄ−Ｈ２Ｏで２回洗浄する。次いで、そのコンジュゲート体をスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）３０／７５樹脂を用いてサイズ排除により精製する。
【０１１４】
手短に言うと、そのカラムをｄ−Ｈ２Ｏで前平衡化する。次いで、濃縮した結合混合物をカラムにロードし、カラムベッドに入るようにする。そのカラムをブラックライト励起下、ｄ−Ｈ２Ｏで溶出し、その蛍光画分を収集する。蛍光画分をプールし、１００Ｋマイクロスピン（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）フィルターを用いた６，０００ｒｐｍ、５〜１０分間の遠心分離により全容量約１００μＬに濃縮する。その精製および濃縮したコンジュゲート体は、４℃で保管することができる。
【０１１５】
実施例４：ポリメラーゼの装置への連結
酵素、例えば、ポリメラーゼを装置に付着させるためのｐｈｏｔｏＮＨＳ（炭素鎖リンカーを有するアジドニトロベンゼン分子に連結されたＮ−ヒドロキシスクシンイミドカルボキシレート分子）を用いる２つの方法を説明する。
【０１１６】
４．１．ＵＶ表面活性化
ｐｈｏｔｏＮＨＳを用いて、ＵＶ光での光活性化によりポリメラーゼを装置のアミンで修飾した表面に付着させる。ＵＶ光がアジドニトロベンゼン部分を励起し、窒素を除去することで反応性に富むナイトレン基を生じる。ナイトレンは、装置の表面上のＮＨ２と反応し、ヒドラジン結合を形成する。リンカーの他の末端は、ＮＨＳカルボキシレートであり、それは、ポリメラーゼ上のリジン残基と反応してアミド共有結合を生成する。
【０１１７】
４．１．１．表面の作製
１ｍＭ ｐｈｏｔｏＮＨＳ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、商品番号：Ａ３４０７，分子量３９０．３５）の溶液を９５％エタノール中で調製する。アミンで修飾した表面を、炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３）、続いて、９５％エタノールで洗浄する。次に、ｐｈｏｔｏＮＨＳ溶液をアミンで修飾した表面に塗布する。２５４〜３６５ｎｍのＵＶ光を表面に３分間照射し、続いて、９５％エタノールで３回リンスする。
【０１１８】
４．１．２．アミンの末端キャップ
１０ｍＭ Ｎ−アセトキシスクシンイミドの溶液を炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３）中で調製し、表面に塗布して任意の未反応のアミンを末端キャップする。その装置を優しく振盪しながら室温で２時間インキュベートする。次いで、その表面を炭酸塩バッファー、および蒸留された脱イオン水で３回ずつ洗浄する。
【０１１９】
４．１．３．ＤＮＡポリメラーゼ結合
次に、炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３）中の１ｍＭ ＤＮＡポリメラーゼの溶液を表面に塗布し、連続的な優しい振盪の下、室温で２時間インキュベートする。次いで、その表面を炭酸塩バッファーおよびｐＨ７．４ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で３回ずつ洗浄する。そのポリメラーゼ結合表面は、４℃で保管することができる。
【０１２０】
４．２．緩衝化表面活性化
別の実施形態においては、ｐｈｏｔｏＮＨＳを緩衝化条件下で活性化し、表面にコンジュゲートすることができる。次いで、ＵＶ光を用い、ポリメラーゼの存在下、アジドニトロベンゼン部分を活性化する。同様に、反応性に富むナイトレンが、ＵＶ光の下、電子不足基として形成され、ポリメラーゼの表面上の１級アミンと素早く反応し、これにより表面への共有結合が形成される。
【０１２１】
４．２．１．表面の調製
１ｍＭ ｐｈｏｔｏＮＨＳ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、商品番号：Ａ３４０７，分子量３９０．３５）の溶液を炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３）中で調製する。アミンで修飾した表面を、炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３）でリンスする。そのｐｈｏｔｏＮＨＳ溶液を、アミンで修飾した表面に塗布し、連続的な優しい振盪の下、２時間インキュベートする。そして、その表面を炭酸塩バッファーで３回リンスする。
【０１２２】
４．２．２．アミンの末端キャップ
炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３）中で調製した１０ｍＭ Ｎ−アセトキシスクシンイミド溶液を表面に塗布して未反応のアミン基を末端キャップする。その溶液を連続的な優しい振盪の下、室温で２時間インキュベートしてから、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で３回リンスする。
【０１２３】
４．２．３．ＤＮＡポリメラーゼ結合
１ｍＭ ＤＮＡポリメラーゼの溶液をＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中で調製し、末端キャップされた表面に塗布する。ＵＶ光（２５４〜３６５ｎｍ）をその表面に３分間照射する。次に、その表面をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回リンスする。そして、そのポリメラーゼ結合表面は、４℃で保管することができる。
【０１２４】
実施例５：塩基伸長シークエンシングの様式
上述したように、段階的伸長中に添加されるヌクレオチドを識別するための２種の一般的な方法として、同様に標識された４個のヌクレオチドの順次添加、または、異なって標識された４個のヌクレオチドの同時添加がある。これらの様式の各々の例が以下に提示される。
【０１２５】
５．１．同一の標識を有する４個のヌクレオチドを順次添加する
５．１．１．アデニン（Ａ）分子伸長：封鎖および標識されたアデニンおよび適当なポリメラーゼをシークエンシング反応バッファー溶液（例えば、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に添加する。チミン（Ｔ）が、末端連結プライマーの５’末端に隣接するシークエンスされる核酸中のヌクレオチドであるときにのみ、アデニンがシークエンシングプライマーの３’末端に添加されることになる。プライマーの３’末端に最も近い核酸のヌクレオチドがグアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、またはアデニン（Ａ）である場合には、伸長は起こらない。
【０１２６】
５．１．２．伸長反応洗浄ステップ：伸長反応が完了した後、そのアレイチップを５× ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１回、そして５× ＳＳＣで１回洗浄し、アデニンと未反応の溶液を除去する。
【０１２７】
５．１．３．蛍光検出および記録:リンカー部位の蛍光信号を読み取り、アデニンが伸長されたかを判断するが、それは、シークエンスされる核酸中の対応するチミンを示すものである。
【０１２８】
５．１．４．保護および蛍光基を除去：検出後、保護および蛍光基を化学的または酵素的切断により除去する。
【０１２９】
５．１．５．洗浄ステップ：上記アレイチップを５× ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１回、そして５× ＳＳＣで１回洗浄して、切断された保護基および標識基を除去する。
【０１３０】
５．１．６．校正および記録:前の伸長ステップから、保護基および蛍光基の除去の成功を確認する。残留した保護基および蛍光基がある場合、例えば、検出および記録システム２上の検出および分析ソフトウェアが、その位置を記録することになる。シークエンス反応の記録は、保護基および蛍光基の除去が次の洗浄ステップで確認された場合にのみ、進行できる。
【０１３１】
５．１．７．今回は伸長反応にグアニンを用い、５．１．１〜５．１．６を繰り返す。
【０１３２】
５．１．８．今回は伸長反応にシトシンを用い、５．１．１〜５．１．６を繰り返す。
【０１３３】
５．１．９．今回は伸長反応にチミンを用い、５．１．１〜５．１．６を繰り返す。
【０１３４】
５．１．１０．Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔを用いる４回毎の伸長反応が１サイクルである。このサイクルを繰り返すことにより、核酸のシークエンスが段階的な形で決定される。
【０１３５】
５．２．異なる標識を有する４個のヌクレオチドを同時に添加する
５．２．１．塩基伸長反応：４個の封鎖および異なるよう標識されたＤＮＡヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）および核酸ポリメラーゼをアレイ上のシークエンシングバッファーに添加する。伸長反応はシークエンシングプライマーの３’末端でのみ起こり得る。連結プライマーの５’末端に最も近いシークエンスされる核酸のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドは、シークエンシングプライマーの３’末端に添加されることになる。例えば、図６を参照されたい。
【０１３６】
５．２．２．伸長反応洗浄ステップ：伸長反応が完了した後、そのチップを５× ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１回、そして５× ＳＳＣで１回洗浄して、反応溶液中に残った物質を除去する。
【０１３７】
５．２．３．蛍光検出および記録:各リンカー部位における異なる蛍光信号のそれぞれを検出して、添加されたヌクレオチドを決定する。
【０１３８】
５．２．４．保護および蛍光基を除去：検出後、保護および蛍光基を化学的または酵素的切断により除去する。
【０１３９】
５．２．５．洗浄ステップ：上記チップを５× ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１回、そして５× ＳＳＣで１回洗浄して、切断された保護および蛍光基を除去する。
【０１４０】
５．２．６．校正および記録:前のステップから、保護基および蛍光基の除去の成功を確認する。残留した保護基および蛍光基がある場合、例えば、検出および記録システム２上の検出および分析ソフトウェアがその位置を記録することになる。シークエンス反応の記録は、その位置の保護基および蛍光基の除去が次の洗浄ステップで確認された場合にのみ、進行できる。
【０１４１】
５．２．７．ここでは、５．２．１〜５．２．６を繰り返す。反応サイクルを繰り返して核酸のシークエンスを決定する。
【０１４２】
実施例６：既知核酸のシークエンシング
既知シークエンスを有する化学的に合成された６０ｍｅｒオリゴヌクレオチド：ビオチン−５’−ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃ ＡＣＡＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＡ−３’がシークエンシングテンプレートとなる。このシークエンシングテンプレートを１４ｍｅｒオリゴヌクレオチドシークエンシングプライマー（５’−ＴＡＧＡＡＣＣＴＣＣＧＴＧＴ−３’）に結合させる。テンプレートの５’末端を、ビオチン分子を含むように修飾する。テンプレート分子を、ストレプトアビジンを含むリアクター表面に付着させる。シークエンシング反応は、ＤＮＡポリメラーゼを用い、１５ｍＭ ＤＴＴを有する１× シークエンシングバッファー中で塩基伸長反応を行う。各伸長反応ステップでは、二次的な伸長の保護（封鎖）基および蛍光標識（例えば、Ｃｙ５）を有する１種類のヌクレオチドのみを添加する。シークエンシングプライマーの３’末端に隣接するＤＮＡテンプレートのヌクレオチドが、添加されたヌクレオチドに相補的である場合に、蛍光標識された塩基が添加される。未反応の塩基物質を洗い落とした後、その蛍光信号を検出する。添加された塩基が相補的でない場合は、蛍光信号は検出されないことになる。検出後、保護蛍光基を化学的に除去し、塩含有溶液（例えば、５× ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ）を用いて、そのアレイをさらに洗浄し、再び検出して蛍光標識の除去を確認する。除去および洗浄ステップ後に蛍光信号が検出されない位置については、蛍光標識がすでに除去されたものと見なす。そして、次の反応サイクルで得られる蛍光信号は、次の伸長かつシークエンスされたものの信号と見なす。除去および洗浄後に蛍光信号が依然残る位置については、その位置を、ソフトウェアにより不完全な除去反応を有するものとして記録する。この位置からの信号は、次のサイクルにおける除去ステップが確認された場合にのみ、記録され続けることができる。この方法に基づき、４種の反応塩基物質を順次添加し、反応を循環的に行うことができる。したがって、テンプレートのシークエンスが決定される。
【０１４３】
本発明に従った他の実施形態は、本明細書の検討およびここに開示される本発明の実行から、当業者には明らかとなろう。本明細書および実施例は単に例示的なものと考えられることを意図しており、以下のクレームにより本発明の真の範囲および精神が示される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の光学的検出装置を含むバイオアッセイシステム、ならびに、核酸などの生体分子を検出および分析するためのバイオアッセイシステムの使用に関するものである。より詳細には、本発明は、生体分子を検出および分析するために、いくつかの実施形態においては、多数の蛍光色素分子を並行してモニタリングするのに用いられる少なくとも１万個の光学的検出装置を含むバイオアッセイシステムに関するものである。
【０００２】
本出願は、２００７年１０月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／９９６０１６号および２００８年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／０３６６５２号の優先権の利益を主張し、その両者の全体の内容は、全体として参照して本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ヒトゲノム計画（ＨＧＰ）は、シークエンシングの処理能力の著しい向上を加速し、その結果として、対応するシークエンシングコストを低下させた。１３年およびほぼ３０億ＵＳドルのコストと対照的に、ゲノム当たりのシークエンシングコストは著しく低下し、実際、最近２つの個人ゲノムが完成されている（非特許文献１）。個人ゲノムは、患者と医療関連機関の両方にとって、医療のパラダイムシフトを意味する。疾病の遺伝的危険因子を管理することにより、医療関連機関は、より容易に予防医学を実践できると共に、カスタマイズされた治療を提供できるようになる。多数の完成ゲノムバンクにより、薬物設計および投与は、より効率的となり、これにより誕生したばかりの薬理ゲノム学の分野が推進されることになる。
【０００４】
個人向けのカスタマイズ医療を普及するため、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）国立ヒトゲノム研究所（ＮＨＧＲＩ）は、ゲノム当たりのシークエンシングコストを１，０００万ＵＳドルから約１，０００ＵＳドルまで低下させるという基準を定めた。しかしながら、従来の高処理能力キャピラリー電気泳動および自動ゲノムシークエンシング技術は、個人ゲノムシークエンシングに対する増加した需要を満たすことはできない。さらに、既存のシークエンシング法には、複雑かつエラーが起きやすい画像収集および解析のステップが必要とされる。例えば、多くの既存技術では、多重画像を捕捉するためにアレイまたは検出システムが移動することが必要とされる。次いで、その結果得られた画像を、タイル表示し、整列させ、かつ解析しなければならない。画像収集、処理、および解析のステップは、いずれもエラーが起こり易く、追加の時間がかかり、かつ高価な設備を必要とする。反対に、移動する光学装置を含まない既存のシステムは、通常、非常に少ない数の検出ユニットにより制限される。最後に、既存のデバイスでは、検出される分子が対応する検出ユニットにごく接近してセットされず、このことは検出信号の強度を実質的に制限する。
【０００５】
したがって、核酸シークエンシングのコストを低減するために、デバイスに対する必要性が存在する。「１，０００ドルゲノム」パラダイムに近づくためには、装置は、多数の分子を並行してシークエンシングすることが可能で、設計および製造プロセスが簡略化されると共に、既存の装置および方法の、複雑かつエラーが起きやすい走査および画像解析プロセスの必要性を回避するものでなければならない。さらに、装置は、単一の分子をシークエンシングすることができ、これによりクラスター化シークエンシング法の増幅（例えば、理想的にクローナルなテンプレートのシークエンス間のドリフト）およびシークエンシング（例えば、シークエンシングテンプレート間の段階的シークエンシング反応の位相ずれ）ステップの両方において知られている非同時性の困難を回避できるものでなくてはならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】マガイア（ＭｃＧｕｉｒｅ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），３１７：１６８７（２００７）
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、複数の光学的検出装置を含むバイオアッセイシステム、および核酸の検出、例えば、シークエンシングのために、このバイオアッセイシステムを用いる方法を提供する。本発明により提供されるバイオアッセイシステムは、大規模の並行シークエンシング反応が可能である、すなわち、多数の異なる核酸のテンプレートを同時にシークエンシングすることができるものである。各シークエンシング反応では、単一の分子をテンプレートとして用いる（すなわち、単一分子シークエンシング）。提供される装置は、さらに、設計が簡略化されており、現在の装置の、複雑で、高価で、かつエラーが起きやすい走査ステップおよび検出ステップの必要性をなくす。本発明により提供されるシステムの簡略化された設計および機能は、一部においては、検出される核酸が（直接的に、または、例えば、ポリメラーゼ分子により）付着するリンカー部位と、１個またはそれ以上の検出ユニット（例えば、光検出器）との直接的な対応に基づくものであり、また、一部においては、リンカー部位と検出ユニットとの間の短い距離に基づくものである。この核酸と検出ユニットとの間の短い距離は、いくつかの実施形態において、検出の大きい立体角により表される。
【０００８】
ある態様において、検出ユニットにて単一の生体分子を同定するためのバイオアッセイシステムが提供される。このバイオアッセイシステムは、その各々が光検出器を備える基板を含む複数の光学的検出装置、および光検出器上方に形成されるリンカー部位を含んでいてよく、リンカー部位は、生体分子がリンカー部位に付着するように処理されており、このうち、リンカー部位は光検出器に近接している。いくつかの実施形態において、リンカー部位は、１００μｍ以下の距離だけ光検出器から間隔が置かれ、光検出器は、０．８ＳＩステラジアン以上の立体角の範囲内で生体分子から発生される光を収集する。光学的検出装置は、生体分子に付着した蛍光色素分子を励起するための光源を提供するように基板上方に形成された励起光源をさらに含んでいてもよい。
【０００９】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの核酸を本発明により提供される光学的検出装置のリンカー部位に（直接的に、または、リンカー部位に結合された核酸ポリメラーゼを結合させることにより）連結させ、かつ対応する光検出器上で核酸を検出することにより核酸を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態において、核酸は、例えば、標識されたプローブへのハイブリダイゼーションにより検出される。いくつかの実施形態では、核酸は、光学的検出装置上で核酸シークエンシングを行うことにより検出される。いくつかの実施形態において、核酸シークエンシングの方法は、塩基伸長シークエンシング、末端標識リン酸シークエンシング、および混合塩基（ｗｏｂｂｌｅ）シークエンシングから選択される。特定の実施形態では、シークエンシング反応は、塩基伸長シークエンシング反応である。さらなる特定の実施形態では、塩基伸長シークエンシング反応は、封鎖および標識されたヌクレオチドを光学的検出装置に添加するステップをさらに含む。またさらなる特定の実施形態においては、ヌクレオチドは、蛍光標識されている。
【００１０】
また、本発明は、別の態様において、サンプル分子を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法は、標識されたサンプル分子を本発明により提供される光学的検出装置上のリンカー部位に付着させるステップ、および対応する光検出器上でサンプル分子を検出するステップを含む。いくつかの実施形態においては、サンプル分子は、連結分子によりリンカー部位に付着させられる。いくつかの実施形態では、連結分子は、１）サンプル分子を結合させるのに適当な捕捉分子、および２）核酸タグを含む。特定の実施形態では、サンプル分子は、連結分子がリンカー部位にすでに付着している光学的検出装置であって、本発明により提供される光学的検出装置に塗布される。別の実施形態では、サンプル分子が連結分子を結合させるようにしてもよく、次いで、その結合複合体を光学的検出装置に塗布してリンカー部位に付着させるようにする。特定の実施形態では、サンプル分子は、生体分子、例えば、ポリペプチド、核酸、脂質、多糖、または代謝産物である。
【００１１】
以上の概略的な説明および以下の詳細な説明は、いずれも例示的および説明的なものにすぎず、クレームに係る発明を限定するものではないことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に従った光学的検出装置のアレイを含むバイオアッセイシステムを示す平面図である。
【図２】本発明に従った実施形態による光学的検出装置を示す、図１の線Ａ−Ａに沿った断面図である。
【図３】本発明に従った光学的検出装置の寸法の詳細を示す断面図である。
【図４】本発明に従った別の実施形態による光学的検出装置を示す、図１の線Ａ−Ａに沿った断面図である。
【図５】本発明に従った実施形態によるフィルター層の構造を示す表である。
【図６】本発明に従った装置のリンカー部位上に連結した核酸を示す。
【図７】封鎖および標識されたヌクレオチドを用いた１回の塩基伸長後の装置のリンカー部位上に連結した核酸を示す。
【図８】図７に示した塩基伸長シークエンシング反応の別の実施形態を示す。
【図９】塩基伸長シークエンシングによる並行した数個の核酸の１回のシークエンシングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明に従った実施形態について詳細に言及していくが、その例は添付の図面に図示されている。可能な限り、同じまたは類似する部分に言及する際に、図面全体を通して同じ参照番号を用いることにする。
【００１４】
１．バイオアッセイシステム
本発明に従ったバイオアッセイシステムは、多数の（例えば、いくつかの実施形態においては、１０，０００より多い）単一生体分子を並行してモニターするために用いることができる。バイオアッセイシステムは、複数の光学的検出装置を含み得る。各光学的検出装置は、単一分子上の蛍光色素分子の存在を、この蛍光色素分子から発生される光子を検出することにより感知することができる。光学的検出装置を並行して動作させることにより、本発明に従ったバイオアッセイシステムは、例えば、組織サンプル中のゲノムのシークエンスまたは発現される遺伝子のプロファイルを高処理能力で決定することができる。
【００１５】
図１を参照すると、本発明に従ったバイオアッセイシステム１が図示されている。バイオアッセイシステム１は、バイオアッセイ基板１０および基板１０上に形成された複数の光学的検出装置２０を含み得る。各光学的検出装置２０は、それぞれ独立に動作して、それに付着した単一の生体分子を検出および同定することができる。例えば、一本鎖ＤＮＡのシークエンスは、順次に塩基伸長を行い、かつ光学的検出装置２０を用いて、伸長された塩基に結合された蛍光色素分子から発生される光を検出することにより決定することができる。基板１０上に膨大な数の光学的検出装置２０を集積することにより、膨大な数の単一生体分子を並行に検出および同定することができる。設計上の選択に応じて、バイオアッセイシステム１は、基板１０上に形成される光学的検出装置２０を、少なくとも、例えば、１万（１０，０００）個以上、２５万（２５０，０００）個以上、２００万（２，０００，０００）個以上、さらには１，０００万（１０，０００，０００）個以上含むことができる。
【００１６】
バイオアッセイシステム１は、基板１０に連結されて光学的検出装置２０の動作を制御すると共に光学的検出装置２０から得たデータを記録するための検出および記録システム２をさらに含んでいてもよい。そのうえ、バイオアッセイシステム１は、励起光源（図示せず）をさらに含んでいてもよい。励起光源は、蛍光色素分子に蛍光を発光させるために励起光を発生することができる。ある実施形態において、励起光源は、光学的検出装置２０またはバイオアッセイ基板１０から独立していてもよい。別の実施形態では、励起光源は、光学的検出装置２０またはバイオアッセイ基板１０と一体とすることができる。
【００１７】
この特定の実施形態では、図１に示されるように、光学的検出装置２０は、上から見たときに円形であってよい。光学的検出装置２０は、その他の幾何学的形状、例えば、四角形、多角形、楕円形、および類似の形状であってもよいことは、理解されるべきである。さらに、図１は、複数の光学的検出装置２０が正方格子のパターンに配列していることを示している。光学的検出装置２０は、その他のパターン、例えば、三角格子のパターン、ハニカム格子のパターン、および類似のパターンであってもよいことは、理解されるべきである。
【００１８】
バイオアッセイシステム１の複数の光学的検出装置１０は、独立して動作可能であるため、本発明に従った様々な実施形態に基づき、以下、１つの光学的検出装置１０についてのみ説明する。１つの光学的検出装置１０についてのみ説明するが、バイオアッセイシステム１中の異なる光学的検出装置１０は、必ずしも同一ではないと理解される。設計上の選択に応じて、異なるタイプの光学的検出装置１０が、本発明に従った異なる実施形態に基づいて構成されてもよい。
【００１９】
図２を参照すると、本発明に従ったある実施形態に基づいて、光学的検出装置２０の図１の線Ａ−Ａに沿った断面図が示されている。図２に示されるように、光学的検出装置２０は、基板１０上に形成された光検出器２１０、および光検出器２１０上方に形成されたリンカー部位２２０を含んでいる。そのうえ、光学的検出装置２０は、基板１０上に形成されて光検出器２１０の動作を制御するのに用いられる制御回路２１５をさらに含んでいてもよい。制御回路２１５は、検出および記録システム２からの制御命令を受け取り、かつ検出および記録システム２に検出信号を転送するように、検出および記録システム２に接続されてもよい。いくつかの実施形態において、基板１０は、ガラス基板、半導体基板（例えば、シリコン）、またはプラスチック基板とすることができる。いくつかの実施形態において、１個またはそれ以上の制御回路２１５は、各光検出器２１０に対応していてもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態において、光検出器２１０は、単一の光伝導光子検出器または一群の光伝導光子検出器を含んでいてよい。別の実施形態において、光検出器２１０は、単一の光起電光子検出器または一群の光起電光子検出器を含んでいてよい。別の実施形態において、光検出器２１０は、単一のフォトダイオードまたは一群のフォトダイオードを含んでいてよい。別の実施形態において、光検出器２１０は、単一のアバランシェフォトダイオードまたは一群のアバランシェフォトダイオードを含んでいてよい。別の実施形態において、光検出器２１０は、単一のフォトトランジスタまたは一群のフォトトランジスタを含んでいてよい。
【００２１】
ある実施形態において、光学的検出装置２０は、光検出器２１０上方にブラインドシート２３０をさらに含んでいてもよい。ブラインドシート２３０は、ピンホール２３５を含んでいてよい。ある実施形態では、ピンホール２３５は、円形とすることができ、かつ、１，０００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下の直径Ｄ１を有していてよい。ピンホール２３５は、その他の形状、例えば、楕円形、四角形、および類似の形状であってもよいと理解される。ある実施形態において、ブラインドシート２３０は、光検出器２１０に望ましくない光が届くのを阻止するように、不透明な材料から構成されていてよい。それゆえ、所望の光がピンホール２３５を介して光検出器２１０に届くようになる。
【００２２】
リンカー部位２２０は、ピンホール２３５に近接して形成することができる。この図に示されている実施形態において、リンカー部位２２０は、ピンホール２３５の内側に形成される。ある実施形態では、ピンホール２３５に近接して形成されたリンカー部位２２０は、１００μｍ以下の距離Ｈ１だけ光検出器２１０から間隔が置かれていてよい。別の実施形態においては、距離Ｈ１は、７５μｍ以下、５０μｍ以下、２５μｍ以下、１５μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下、または３μｍ以下であってよい。
【００２３】
光学的検出装置２０は、光検出器２１０とブラインドシート２３０との間にフィルター層２４０（任意）およびマイクロレンズ２５０（任意）をさらに含んでいてもよい。図２は、フィルター層２４０がマイクロレンズ２５０上方に形成されていることを示すが、フィルター層２４０は、マイクロレンズ２５０の下に形成されていてもよいと理解される。いくつかの実施形態において、フィルター層２４０は、単一の透明層、または異なる屈折率を有する複数の透明副層を含んでいてよい。フィルター層２４０が複数の副層を含む場合、フィルター層２４０は、基板１０上方に副層を順次堆積することにより形成される。いくつかの実施形態では、比較的高い屈折率を有する副層を、２つの比較的低い屈折率を有する副層で挟むことができる。また、比較的低い屈折率を有する副層を、２つの比較的高い屈折率を有する副層で挟むこともできる。いくつかの実施形態において、フィルター層２４０は、単一の領域を有する層、または異なる波長範囲に対する異なる透明性を持つ複数の副領域を有する層を含んでいてよい。
【００２４】
なお、図２を参照すると、リンカー部位２２０は、単一の生体分子３０をそこに付着させるように処理することができる。ある実施形態において、生体分子３０は、一本鎖ＤＮＡ分子３２およびＤＮＡ分子３２に結合された末端プライマー３４を含んでいてよい。生体分子３０は、末端連結プライマー３４を介してリンカー部位２２０に付着させることができる。さらに、ＤＮＡ分子３２は、蛍光色素分子３６で標識してもよい。第１の波長λ１の励起光により励起されたとき、蛍光色素分子３６は、第２の波長λ２の蛍光を発生することができる。いくつかの実施形態において、第１の波長λ１は第２の波長λ２よりも短い。いくつかの実施形態では、例えば、多光子励起において、第１の波長λ１は第２の波長λ２よりも長い。そして、光検出器２１０は、蛍光色素分子３６が付着している塩基のタイプを識別するために、蛍光色素分子３６から発生された蛍光を検出し、これによりＤＮＡ分子３２のシークエンスが順次決定されることになる。
【００２５】
図３を参照すると、本発明に従ったある実施形態に基づいて、光学的検出装置２０の断面図が示されている。図３に示されるように、ブラインドシート２３０は、光検出器２１０上方に形成されると共に、光検出器２１０から距離Ｈ１だけ垂直方向に間隔が置かれている。厚さＴを有するブラインドシート２３０は、半径Ｒ１（すなわち、直径Ｄ１の半分）を有するピンホール２３５を含む。この実施形態では、リンカー部位２２０は、ピンホール２３５中に形成されて生体分子（図示せず）と結合することができる。
【００２６】
蛍光色素分子３６がリンカー部位２２０上方の第１の位置３６Ａで発見され、かつリンカー部位２２０から距離Ｈ２だけ離れている場合、半径Ｒ２を有する光検出器２１０は、第１の立体角θ１の範囲内で蛍光色素分子３６から発生される蛍光を収集することができる。蛍光色素分子３６が第２の位置３６Ｂで発見され、かつリンカー部位２２０にほぼ接触しそうな（すなわち、距離Ｈ２が０μｍまたは１μｍ未満に近い）場合、光検出器２１０は、第２の立体角θ２の範囲内で蛍光色素分子３６から発生される蛍光を収集することができる。第２の立体角θ２は、第１の立体角θ１よりも大きく、実質的により強度な信号を提供する。
【００２７】
光検出器２１０がピンホール２３５を通して蛍光色素分子３６から発生される蛍光に曝露されるように、光検出器２１０の半径Ｒ２は、光検出器２１０の上表面に投影される第２の立体角θ２に対応する半径以上でなければならない。ブラインドシート２３０（またはリンカー部位２２０）を光検出器２１０に近づけることにより（すなわち、距離Ｈ１を減らすことにより）、光検出器２１０は、立体角の範囲内から、より集中した光（すなわち、より強度な光信号）を収集できるようになる。ある実施形態において、ブラインドシート２３０（またはリンカー部位２２０）と光検出器２１０は、小さい距離Ｈ１だけ離されており、それゆえ、第２の立体角θ２は、少なくとも０．８ＳＩステラジアンである。
【００２８】
図４を参照すると、本発明に従った別の実施形態に基づいて、光学的検出装置２０の図１の線Ａ−Ａに沿った断面図が示されている。この実施形態では、励起光源４０は、光学的検出装置２０と一体とされている。図４に示されるように、励起光源４０は、光学的検出装置２０のブラインドシート２３０上に形成される。ある実施形態において、励起光源４０は、ｐ型およびｎ型半導体層（４１０および４３０）、ならびに層４１０と層４３０の接合領域の間の発光層４２０を含んでいてよい。層４１０および層４３０は、電源に接続することができる。層４１０、層４２０、および層４３０に用いられる材料、および／または、材料の物理的および原子構造に応じて、励起光源４０は、発光ダイオード（ＬＥＤ）、発光レーザーダイオード（ＬＤ）、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）、または高分子発光ダイオード（ＰＬＥＤ）とすることができる。例えば、ガリウムヒ素、リン化インジウム、アンチモン化ガリウム、および窒化ガリウムなどの無機材料、または、例えば、ポリ（パラ−フェニレン−ビニレン）骨格を有する共役高分子などの有機材料は、いずれも、光を放つ接合ダイオードを作製するのに用いることが可能な半導体材料の例である。
【００２９】
別の実施形態において、励起光源４０は、ブラインドシート２３０を形成していても、ブラインドシート２３０内に形成されていてもよい。いくつかの実施形態において、光学的検出装置２０と一体とされた励起光源４０は、１つの波長域または複数の波長域の光を発生することができる。励起光源４０は、断続的にまたは連続的に光を発生することができる。励起光源４０は、一度に１つの波長域の、または同時にいくつかの波長域の光を発生することができる。
【００３０】
図４を再び参照すると、励起光源４０は、ピンホール２３５を露出させるように、その中央部分に空洞４５０を含んでいてよい。この実施形態では、リンカー部位２２０は、ピンホール２３５内に形成されないこともある。より正確に言えば、リンカー部位２２０は、空洞４５０内に形成され、かつピンホール２３５に近接していてよい。励起光源４０がブラインドシート２３０を形成するか、あるいは、ブラインドシート２３０内に形成される実施形態では、空洞４５０がピンホール２３５を形成するか、あるいは、ピンホール２３５内に形成される。いくつかの実施形態において、ピンホール２３５は、層４１０およびブラインドシート２３０両者の中央部分に、例えば、適当な方法を用いて、層４１０およびブラインドシート２３０をエッチングすることにより形成することができる。
【００３１】
さらに、励起光源４０は、下方の層４１０上に形成された金属接点４１５および上方の層４３０上に形成された金属接点４３５を介して電源４４０と接続することができる。電源４４０は、独立していて、かつ検出および記録システム２により制御されても、あるいは、検出および記録システム２と一体とされていてもよい。
【００３２】
励起光源４０の発光層４２０は、図４における発光層４２０上に描かれた矢印に示されるような水平方向に沿って励起光を空洞４５０内に放出することができる。この実施形態では、励起光は、ブラインドシート２３０の上表面と実質的に平行な方向に沿って放出される。したがって、励起光は、光検出器２１０へ向かう蛍光を妨害し得ない。それゆえ、本発明に従った光学的検出装置２０は、従来のデバイスに比べて、より正確に生体分子を同定することが可能である。
【００３３】
２．核酸検出
本発明に従ったバイオアッセイシステム（例えば、単一の光学的検出装置または複数のかかる装置を含む）は、分子検出、例えば、核酸シークエンシングに用いるシステムの一部として、またはその方法もしくはプロセスに用いることができる。このバイオアッセイシステム、およびそれを用いる方法またはプロセスは、例えば、分析および診断的用途に有用である。これらの用途は、個人用、公用、商用、または産業用であってよい。
【００３４】
いくつかの実施形態では、バイオアッセイシステムは、核酸の大規模並行シークエンシングに適している。一部において、バイオアッセイシステムのリンカー部位と光検出器との直接的な対応、および／または、リンカー部位と光検出器との近接近（いくつかの実施形態において、大きい立体角として表される）のために、本発明において提供されるバイオアッセイシステムは、高価、複雑、かつエラーが起きやすい走査および解析システム、例えば、移動走査レンズまたは移動デバイスステージおよび後続の画像解析の必要性なしに、核酸をシークエンスするのに用いることができ、それゆえ、エラーとコストが低減される。バイオアッセイシステムは、実質的に信号強度が向上した光信号を検出することができ、このことは単一分子の分析を可能にする。
【００３５】
本発明に従ったバイオアッセイシステムは、様々なシークエンシングの手法と共に用いることができ、かつ単一分子をシークエンシングするのに適している。そのうえ、本発明に従った光学的検出装置は、既存のバイオチップ装置に比べて、設計、組み立て、および製造が簡略化されている。例えば、シークエンスされるべき核酸をアレイ上の任意のリンカー部位に付着させることができ、これにより核酸を所定の位置に堆積または合成させるための時間がかかり、かつ高価なロボティクスの利用が回避されることになる。
【００３６】
本発明に従ったバイオアッセイシステムは、例えば、全ゲノムシークエンシング、転写プロファイリング、比較転写プロファイリング、または遺伝子同定のための核酸ハイブリダイゼーションまたはシークエンシングを含む生体分子検出に用いる方法およびプロセスにおけるシステムの一部として用いることができる。また、生体分子検出は、結合相互作用、例えば、タンパク質／タンパク質、抗体／抗原、レセプター／リガンド、および核酸／タンパク質の検出および／または測定をも含み得る。これらの応用は、分析的または診断的プロセスおよび方法に有用である。
【００３７】
本発明により提供されるシステムでの検出に用いるのに適当な核酸は、いくつかの実施形態において、結合相互作用をアッセイするのに適当な分子、例えば、タンパク質、他の核酸、炭水化物部分、または小分子を本発明により提供される装置上のリンカー部位に付着させる連結分子の一部であってよい。連結分子は、いくつかの実施形態において、結合相互作用についてアッセイされる分子に結合する捕捉分子をさらに含んでいてもよい。連結分子中の核酸は、例えば、直接的なシークエンシングまたはハイブリダイゼーションにより、連結分子の捕捉分子の識別タグとして機能する。
【００３８】
本発明により提供される方法は、通常、検出されるべき分子を、本発明により提供される装置のアドレスアレイに付着させるステップを含む。いくつかの実施形態において、アドレスアレイは、複数のピンホール２３５を有するブラインドシート２３０を含んでいてよく、また、リンカー部位２２０は、ピンホール２３５の内側または周囲に形成されていてもよい。例えば、図１および２を参照されたい。かくして、本発明に従ったバイオアッセイシステムは、何百万もの核酸セグメントを同時に読み取ることが可能である。各セグメントが、例えば、塩基長１，０００である場合、単一の装置は、何十億というシークエンス情報の断片を得ることができ、これにより、例えば、全ゲノムシークエンシングおよび再シークエンシングが可能となる。
【００３９】
２．１．検出されるべき分子
本発明により提供される方法による検出に適する核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡ（ペプチド核酸）を含めて、任意の核酸を含むことができ、かつ、天然に存在するシークエンスまたは人工のシークエンスを含めて、既知および未知の両方の任意のシークエンスを含むことができる。核酸は、天然由来のもの、組み換え技術により製造されたもの、または化学的に合成されたものであってよい。核酸は、天然に存在するヌクレオチド、自然界に存在しないヌクレオチド類似体、または修飾ヌクレオチドを含んでいてよい。検出されるべき核酸の長さは、実際の応用に応じて変化する。いくつかの実施形態において、核酸は、少なくとも、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上、２，０００個以上、５，０００個以上、１０，０００個以上、２０，０００個以上の塩基を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、１０〜２０個、１０〜５０個、１０〜１００個、５０〜１００個、５０〜５００個、５０〜１，０００個、５０〜５，０００個、５００〜２，０００個、５００〜５，０００個、または１，０００〜５，０００個の塩基であってよい。
【００４０】
検出に用いる核酸は、一本鎖であってよい。一本鎖核酸テンプレートは、例えば、加熱またはアルカリまたはその他の化学的処理を含む当該分野で知られた手段により、二本鎖分子から得ることができる。一本鎖核酸テンプレートは、例えば、化学的または生体外合成により製造することも可能である。
【００４１】
いくつかの実施形態において、検出されるべき核酸は、その５’末端または３’末端でリンカー部位に付着する。いくつかの実施形態において、核酸は、さらに、核酸の５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端の両方に結合された１個またはそれ以上の末端連結プライマーを含んでいてもよい。特定の実施形態では、末端連結プライマーは、核酸の３’末端に付着する。末端連結プライマーは、検出されるべき核酸を装置上のリンカー部位に付着させるため、および、１個またはそれ以上の検出プライマー、例えば、シークエンシングプライマーの相補配列を提供するため、の両方に用いられ得る。
【００４２】
２．１．１．末端連結プライマー
末端連結プライマーは、通常は１００個未満のヌクレオチドからなる短い核酸分子である。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーは、少なくとも、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、５０個以上、７５個以上、９０個以上のヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、末端連結プライマーは、８〜２５個、１０〜２０個、１０〜３０個、または１０〜５０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーは、分岐しておらず、一方、別の実施形態では、それらは分岐していてもよい。
【００４３】
末端連結プライマーは、検出されるべき核酸をアドレスアレイ上のリンカー部位に付着させるのに用いることができる。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーは、例えば、共有結合（例えば、エステルもしくはチオール結合）、または非共有結合、例えば、抗原／抗体もしくはビオチンアビジン結合により、核酸をアレイ表面に直接的に連結させることができる。例えば、図５、図６、および図７を参照されたい。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーは、例えば、中間分子、例えば、ポリメラーゼを結合させることにより、間接的に核酸をアレイ表面に連結させることができる。例えば、図８を参照されたい。したがって、末端連結プライマーは、修飾ヌクレオチドを含むことができ、あるいは、そうでなければ、当該分野で知られた手段、例えば、ジスルフィド、チオエステル、アミド、ホスホジエステル、もしくはエステル結合により、または、例えば、抗体／抗原もしくはビオチン／アビジン結合により、リンカー部位への付着を容易にするために修飾されていることができ、例えば、末端連結プライマーは、抗原部分またはビオチン化ヌクレオチドを含むヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、末端連結プライマーの３’末端にある。いくつかの実施形態では、末端連結プライマーの５’末端が修飾ヌクレオチドを含む。
【００４４】
末端連結プライマーは、核酸を検出するのに用いられる１個またはそれ以上のプライマー、例えば、シークエンシングプライマーの相補体としての機能も果たすことができる。いくつかの実施形態において、プライマーは、ハイブリダイゼーションにより核酸を検出するのに用いられ、例えば、プライマーは、検出可能な標識、例えば、蛍光または放射性同位体標識を含んでいる。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーの５’末端は、シークエンシングプライマーの配列相補体を含む。いくつかの実施形態において、シークエンシングプライマーの相補体である末端連結プライマーの配列は、シークエンシングプライマーの３’末端がシークエンスされるべき核酸中の１個目のヌクレオチドに直接的に隣接するような向きに置かれる。
【００４５】
例えば、図６は、本発明に従った光学的検出装置２０に付着したシークエンスされるべき核酸のある実施形態の図式表示である。一本鎖核酸３２、末端連結プライマー３４、およびアニールされたシークエンシングプライマー３４６が、末端連結プライマー３４上の修飾ヌクレオチド３４４を結合させる反応性官能基を持つよう処理されたリンカー部位２２０に付着する。いくつかの実施形態において、核酸３２は、その５’末端によりリンカー部位２２０に付着でき、かつ末端連結プライマー３４は、核酸３２の３’末端に付着してシークエンシングプライマー３４６の相補体として機能し得る。
【００４６】
いくつかの実施形態において、末端連結プライマーは、リガーゼ、例えば、ＤＮＡリガーゼにより、検出されるべき核酸の末端に添加される。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーおよび検出されるべき核酸は、ライゲーション前は両者とも一本鎖である。別の実施形態では、両者は二本鎖である。さらに別の実施形態では、一方が一本鎖で他方が二本鎖である。ライゲーションは当該分野ではよく知られている。例えば、ポロニーシークエンシング法において、シェンデュア（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ）ら（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），３０９：１７２８−１７３２（２００５））は、ニュー・イングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（ＮＥＢ）のクイック・ライゲーション・キット（Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用い、Ｔ３０末端連結プライマー（３２ｂｐ）をサンプルＤＮＡ断片にライゲートした。ここで、ライゲーション反応溶液は、１× クイック・ライゲーション（Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ）バッファー中にＤＮＡ０．２６ｐｍｏｌ、Ｔ３０末端連結プライマー０．８ｐｍｏｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ４．０μＬを含むものであった。混合後、その反応溶液を約１０分間室温でインキュベートしてから、氷上に置いた。サンプルを１０分間６５℃に加熱することによりライゲーション反応を停止させた。
【００４７】
別の実施形態において、末端連結プライマーは、検出されるべき核酸上に合成されてもよい。例えば、末端連結プライマーは、例えば、ターミナルトランスフェラーゼにより付加されるホモポリマーであってよい。例えば、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）ら（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），３２０：１０６−１０９（２００８））は、ポリＡ尾部をＤＮＡテンプレートに付加し、ウイルスゲノムの単一分子シークエンシングにおけるポリＴシークエンシングプライマーの相補体とした。
【００４８】
２．１．２．シークエンシングプライマー
シークエンシングプライマーは、検出されるべき核酸の断片またはそれに関連した末端連結プライマーに相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、シークエンシングプライマーは、少なくとも、８個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上、５０個以上のヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、シークエンシングプライマーは、８〜２５個、１０〜２０個、１０〜３０個、または１０〜５０個のヌクレオチドの長さとすることができる。シークエンシングプライマーは、天然に存在するヌクレオチド、自然界に存在しないヌクレオチド類似体、または修飾ヌクレオチドを含む任意のタイプのヌクレオチドからなっていてよい。特定の実施形態において、シークエンシングプライマーの５’末端は、シークエンシングプライマーが、１個またはそれ以上の末端連結分子を含むシークエンスされるべき核酸とハイブリダイズした後に、アドレスアレイ上のリンカー部位に結合しやすくなるように修飾されていてもよい。
【００４９】
いくつかの実施形態において、シークエンシングプライマーは、修飾ヌクレオチド、例えば、ロック核酸（ＬＮＡｓ；修飾リボヌクレオチドであり、それは、ポリ核酸中に高められた塩基スタッキング相互作用を提供する）を含んでいる。ＬＮＡｓの有用性の説明として、ラヴィン（Ｌｅｖｉｎ）ら（ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３４（２０）：１４２（２００６））は、ＬＮＡ−含有プライマーが、対応するロックされていないプライマーに比べて、特異性が改善され、かつより強力な結合を呈したことを示した。プライマー中の異なる位置に３個のＬＮＡヌクレオチド（キャップにおける）を含むＭＣＰ１プライマー（５’−ｃｔｔａａａｔｔｔｔｃｔｔｇａａｔ−３’）の３個の変異体：ＭＣＰ１−ＬＮＡ−３’（５’−ｃｔｔａａａｔｔｔｔＣｔＴｇａＡｔ−３’）；ＭＣＰ１−ＬＮＡ−５’（５’−ＣｔＴａＡａｔｔｔｔｃｔｔｇａａｔ−３’）；およびＭＣＰ１−ＬＮＡ−ｅｖｅｎ （５’−ｃｔＴａａａｔＴｔｔｃｔＴｇａａｔ−３’）を作製した。すべてのＬＮＡ−置換プライマーは、Ｔｍが高まり、さらにＭＣＰ１−ＬＮＡ−５’プライマーは、特に向上されたシークエンシング精度を示した（フレッド・キュー・サーティ・カウンツ（Ｐｈｒｅｄ Ｑ３０ ｃｏｕｎｔｓ））。したがって、特定の実施形態において、シークエンシングプライマーは、少なくとも１つのロックされたヌクレオチドを、その５’領域、すなわちシークエンシングプライマーの５’の半分、３分の１、または４分の１に含んでいてよい。
【００５０】
シークエンシングプライマーおよび一本鎖サンプル核酸（すなわち、少なくとも１つの末端連結プライマーを含む検出されるべき核酸）は、本発明に従った光学的検出装置に塗布する前に、ハイブリダイズさせることができる。シークエンシングプライマーおよびサンプル核酸は、例えば、５× ＳＳＣ（または５× ＳＳＰＥ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（または０．１％ＳＤＳ）、および０．１％ＢＳＡバッファーのような塩含有溶液中でサンプル核酸をモル過剰のシークエンシングプライマーと混合することによりハイブリダイズさせることができる。その混合物を少なくとも５分間６５℃に加熱し、ゆっくりと室温まで冷却して、プライマー／テンプレートをアニーリングさせる。残存プライマーは、例えば、分子篩を含む適当な手段により除去することができる。
【００５１】
末端連結およびシークエンシングプライマーの両方を含むプライマーは、シークエンスの視覚的検査またはコンピュータ利用のプライマー設計を含む適当な手段により設計することが可能である。ＤＮＡＳｔａｒ（登録商標）（ディー・エヌ・エイ・スター（ＤＮＡＳｔａｒ）社、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ），ウィスコンシン州（ＷＩ））、ＯＬＩＧＯ ４．０（ナショナル・バイオサイエンシーズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）、Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５（プレミエールバイオソフト（Ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ）社）、およびＰｒｉｍｅｒ３（ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ），マサチューセッツ州（ＭＡ））を含む多数のソフトウェアパッケージが、プライマー設計をアシストするために利用可能である。プライマーは、例えば、シークエンスされるべき分子、特異性、長さ、所望の融解温度、二次構造、プライマーダイマー、ＧＣ含量、バッファー溶液のｐＨおよびイオン強度、ならびに用いられる酵素（すなわち、ポリメラーゼまたはリガーゼ）を考慮に入れて設計する。例えば、ジョセフ・サムブロック（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびデイヴィッド・ラッセル（Ｄａｖｉｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ），モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；第３版（２００１）を参照されたい。
【００５２】
２．１．３．アレイ表面への結合
シークエンシングプライマー、および１個またはそれ以上の末端連結プライマーを含むシークエンスされるべき核酸をアニールした後、この複合体を適当なバッファー中で調製し、アドレスアレイの表面に塗布し、結合させる。いくつかの実施形態において、サンプル核酸（検出されるべき核酸および１個またはそれ以上の末端連結プライマー）をリンカー部位に付着させ、その後、シークエンシングまたは検出プライマーを塗布する。別の実施形態では、複合体を、装置に塗布する前にハイブリダイズさせる。１つのサンプル核酸のみが結合するリンカー部位は、有効なアドレスとして知られる。特定の実施形態において、複合体を光学的検出装置に塗布し、そしてサンプル核酸がアドレスアレイ上の任意のリンカー部位に付着する。別の実施形態では、例えば、ロボッティクスまたは液体処理システムを含む適当な手段により、サンプル核酸をアドレスアレイ上の所定のリンカー部位に塗布してもよい。
【００５３】
核酸を固相担体に付着させるのに適当な手段は、当該分野においてよく知られている。いくつかの実施形態において、サンプル核酸を、共有結合、例えば、ジスルフィド結合、チオエステル結合、アミド結合、ホスホジエステル結合、もしくはエステル結合により、または非共有結合、例えば、抗体／抗原もしくはビオチン／アビジン結合により、リンカー部位に直接的に付着させることができる。いくつかの実施形態において、サンプル核酸を媒介分子によりリンカー部位に付着させてもよい。いくつかの実施形態において、媒介分子は、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼとすることができる。
【００５４】
核酸の直接的かつ共有結合的な付着の説明に役立つ実例として、アディーシ（Ａｄｅｅｓｉ）ら（ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），２８：８７（２０００））は、プライマーの５’末端を修飾してＳＨ官能基が含まれるようにした。アディーシ（Ａｄｅｅｓｉ）らの手法によれば、核酸は、５０μＭリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）（ＮａＰｉ：０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ６．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ）中で調製することができる。次いで、プライマー溶液約１〜５μＬをシラン化スライドガラスの表面に塗布し、室温の調湿ボックス中で約５時間インキュベートして、プライマーをチップ表面に結合させることができる。結合反応が完了した後、ＰＢＳ溶液を室温で２回５分ずつ振動洗浄し、未結合のＤＮＡを除去する。洗浄後、１０ｍＭ β−メルカプトエタノールをＰＢＳ溶液に添加し、室温下でアドレスアレイ表面をリンスするのに用いて、未結合のＤＮＡのチオール基を不活性化させる。次に、アレイ表面を、例えば、５× ＳＳＣ ０．１％Ｔｗｅｅｎで１回、および５× ＳＳＣバッファー溶液で１回洗浄する。それゆえ、いくつかの実施形態においては、アディーシ（Ａｄｅｅｓｉ）らが用いた手法を、本発明により提供される方法に用いて、サンプル核酸複合体をリンカー部位に、例えば、シークエンシングプライマーまたはサンプル核酸の５’末端を介して付着させることができる。
【００５５】
別の実施形態において、サンプル核酸は、例えば、ビオチン化ヌクレオチドを含んでいてよく、リンカー部位表面上のアビジンに結合する。他の実施形態において、サンプル核酸は、リンカー部位上の抗体（またはその断片）により結合される抗原部分、例えば、ＢｒｄＵまたはジゴキシゲニンを含んでいてもよい。「抗体」という用語は、例えば、１つもしくはそれ以上のＣＤＲ領域；または可変重鎖もしくは可変軽鎖断片を含むイムノグロビン分子の断片を含むと理解されるべきである。抗体は、天然に存在するもの、組み換え体、または合成されたものであってよい。また、抗体は、例えば、ポリクローナルおよびモノクローナル変異体を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、少なくとも、１０６Ｍ以上、１０７Ｍ以上、１０８Ｍ以上、１０９Ｍ以上の結合定数で、それらの抗原（複数の抗原）に結合する。抗体の構造、機能、および産生は、当該分野においてよく知られている。例えば、ゲイリー・ハワード（Ｇａｒｙ Ｈｏｗａｒｄ）およびマシュー・カサー（Ｍａｔｔｈｅｗ Ｋａｓｓｅｒ），メイキング・アンド・ユージング・アンチボディーズ（Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）：ア・プラクティカル・ハンドブック（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ），シー・アール・シー・プレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）；第１版（２００６）を参照されたい。
【００５６】
さらに別の実施形態において、サンプル核酸を、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによりリンカー部位に付着させてもよい。例えば、酵素の一次、二次、および三次構造のような酵素機能の入手可能な情報を保つことを考慮に入れなければならないということが、当業者には理解される。例えば、ＴａｑおよびＰｈｉ２９ポリメラーゼの構造が当該分野において知られており、キム（Ｋｉｍ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３７６：６１２−６１６（１９９５）、およびカムテカー（Ｋａｍｔｅｋａｒ）ら、モレキュラー・セル（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ），１６：６０９−６１８（２００４）をそれぞれ参照されたい。活性を保ちながらポリメラーゼを表面に固定する手段は、当該分野において知られており、例えば、２００８年８月２１日に公開された米国特許出願公開第２００８／０１９９９３２号、およびコーラック（Ｋｏｒｌａｃｈ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（ＰＮＡＳ），１０５：１１７６−１１８１（２００８）に記載されている。図８は、サンプル核酸（すなわち、シークエンスされるべき核酸３２、末端連結プライマー３４、およびシークエンシングプライマー３４６）が手段３８４、例えば、直接的な非共有結合性吸着、抗体、ビオチン、または化学結合、例えば、アミド結合によりリンカー部位２２０にすでに結合されたポリメラーゼ３８を介して、リンカー部位２２０に結合されている本発明のある実施形態の図式表示である。
【００５７】
いくつかの実施形態において、リンカー部位のアルデヒドで修飾された表面は、アルデヒド含有シラン試薬で処理される。アルデヒドは、タンパク質上の１級アミンと反応しやすく、これによりシッフ塩基結合を形成する。多くのタンパク質は、通常、よりよく反応するＮＨ２−末端のα−アミンに加えて、それらの表面上にリジンを示すので、それらタンパク質は、様々な配向でスライドに付着することができ、これによりタンパク質の異なる面が溶液中で他のタンパク質または小分子と作用することができるようになる。別の実施形態では、ｐｈｏｔｏＮＨＳ（炭素鎖リンカーを有するアジドニトロベンゼン分子に連結されたＮ−ヒドロキシスクシンイミドカルボキシレート分子）が、装置上のアミンで修飾された表面にＵＶ光活性化により付着する。これらの実施形態では、ＵＶ光がアジドニトロベンゼン部分を励起し、窒素を除去することで、反応性に富むナイトレンを生じる。ナイトレンは、装置の表面上のＮＨ２と反応しやすく、ヒドラジン結合を形成する。リンカーの他の末端は、ＮＨＳカルボキシレートであり、それはポリメラーゼの表面上のリジンと反応してアミド共有結合を生じる。別の実施形態において、ＮＨＳカルボキシレート部分を、緩衝条件下で、装置の表面上の１級アミンと反応させる。ＵＶ光は、アジドニトロベンゼン部分を活性化し、電子不足基である反応性に富むナイトレンを形成し、ポリメラーゼ上のリジン残基の１級アミンと容易に反応させるために用いられる。これらの方法は、以下の実施例４においてさらに詳細に説明される。
【００５８】
２．２．シークエンシングの様式
本発明により提供されるバイオアッセイシステムは、例えば、米国特許第６，９４６，２４９号、およびシェンデュア（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ）ら、ネイチャー・レビューズ・ジェネティクス（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．），５：３３５−４４（２００４）に概説されているような当該分野で知られた手段により核酸を検出およびシークエンシングするのに用いることができる。いくつかの実施形態において、シークエンシング法は、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼの特異性に依存し、例えば、塩基伸長シークエンシング（単一塩基段階的伸長）、合成による多塩基シークエンシング（例えば、末端標識されたヌクレオチドを用いるシークエンシング）および混合塩基（ｗｏｂｂｌｅ）シークエンシングを含み、それはライゲーションベースのものである。方法のすべてが、通常は、リンカー部位に（直接的または間接的に）付着することになる少なくとも１つの末端連結プライマーを含む一本鎖サンプル核酸を要する。そして、シークエンシングプライマーでシークエンシングが開始する（リガーゼベースのシークエンシングでは、一般にアンカープライマーと呼び、シークエンシングプライマーに類似した目的を果たす）。
【００５９】
全てのシークエンシングの様式に対し、本発明は単一分子を再シークエンスできるという利点を提示する。例えば、シークエンシング読み取りの完了後、シークエンシングプライマーおよび伸長されたヌクレオチドをサンプル核酸から取り去ることができ、装置を洗浄し、そしてシークエンシングを繰り返し行う。様々な実施形態において、再シークエンシングは、同じまたは異なる方法により行うことができる。同一の分子を再シークエンシングすることで、シークエンシングエラーは、シークエンシング読み取り数の指数にしたがって減少することが見込まれる。例えば、単一の読み取りの塩基あたりのエラー率が１０−３である場合、２回の読み取り後、これは（１０−３）２、すなわち１０−６に減少する。このことは、シークエンシングに用いられる修飾ヌクレオチドが、例えば、擬似の欠失をもたらすそれらの標識または封鎖基を失ってもよいために、単一分子のシークエンシングに特に利点がある。
【００６０】
２．２．１．塩基伸長シークエンシング：段階的伸長
いくつかの実施形態において、本発明により提供される光検出装置は、例えば、米国特許第５，３０２，５０９号に開示されているような塩基伸長シークエンシングを実行するのに用いることができる。いくつかの実施形態において、塩基伸長シークエンシングは、図６に示されているように、シークエンスされるべき一本鎖核酸３２、シークエンスされるべき核酸３２の３’末端につながれた末端連結プライマー３４、およびそれにアニールされたシークエンシングプライマー３４６を含む一部二本鎖のサンプル核酸を、リンカー部位２２０に付着させることにより開始する。いくつかの実施形態では、続いてポリメラーゼ３８および修飾ヌクレオチドを適当なバッファー中で光検出装置に塗布する。いくつかの実施形態において、サンプル核酸複合体を、リンカー部位のポリメラーゼによりリンカー部位に付着させる。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、いかなる二次的な伸長をも阻止するための共有結合している検出可能な標識、例えば、蛍光標識、および封鎖基を含む。したがって、単一のヌクレオチドのシークエンシングプライマー３４６の３’末端への付加の後、シークエンシングが停止する。
【００６１】
図７は、塩基伸長シークエンシング反応のある実施形態の第１段階の図式表示である。蛍光封鎖基３６４を有するヌクレオチド３６２をＤＮＡポリメラーゼ３８によりシークエンシングプライマー３４６の３’末端に添加する。いくつかの実施形態において、蛍光標識は、封鎖基として機能する。別の実施形態では、それらは分離した部分である。単一のヌクレオチドをシークエンシングプライマー３４６の３’末端に組み込み、対応する光検出器２１０を用いて、その標識により同定する。次いで、蛍光標識および封鎖基を、例えば、化学的または酵素溶解により除去して、塩基伸長のさらなるサイクルを可能にする。特定の実施形態では、標識および封鎖基を同時または順次に任意の順序で除去することができる。添加される塩基の順序を編集することにより、１度に１塩基ずつ、３’から５’方向にサンプル核酸のシークエンスを推定する。図９は、いくつかのサンプル核酸の並行した伸長、検出、封鎖解除／標識解除の１サイクルを説明している。
【００６２】
一般に、段階的伸長中に添加されるヌクレオチドを見分ける方法は２つある。第１のケースでは、４種のヌクレオチドすべてが同じ検出可能な標識を有するが、所定の順に、一度に１種添加する。伸長されたヌクレオチドのアイデンティティーは、ヌクレオチドが伸長反応に添加される順番により決定される。伸長中に挿入される塩基を見分ける第２のモードでは、４種の異なるヌクレオチドを同時に添加し、各々を異なる検出可能な標識に結合させる。異なる実施形態において、標識の励起または発光スペクトルおよび／または強度はそれぞれ異なり得る。伸長反応に添加されるヌクレオチドのアイデンティティーは、検出された標識の強度および／または波長（すなわち、励起または発光スペクトル）により決定される。これら２つの手法の例が実施例５に提示される。
【００６３】
２．２．２．合成によるシークエンシング：多段階伸長
いくつかの実施形態において、合成によるシークエンシングは、例えば、封鎖基を用いずに、多数の連続した伸長反応により進行することができる。これらの実施形態では、重合反応を、ヌクレオシド三リン酸加水分解後のピロリン酸の放出、すなわちβおよびγリン酸複合体の放出を検出することにより観察する。この複合体は、例えば、複合体上の蛍光部分により、直接的に、または、ピロリン酸を化学もしくは生物発光検出システムに結合させることにより、間接的に、検出することが可能である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、サンプル核酸を、基本的に末端リン酸標識ヌクレオチドを用いることにより連続してシークエンスする。末端リン酸標識ヌクレオチドおよびそれらの使用法の例示的な実施形態は、例えば、米国特許第７，３６１，４６６号および２００７年６月２１日に公開された米国特許出願公開第２００７／０１４１５９８号に記載されている。簡単に言うと、ヌクレオチドを本発明により提供される装置に塗布し、重合反応中の加水分解時に、標識したピロリン酸を対応する光検出器で検出する。いくつかの実施形態において、４種すべてのヌクレオチドは異なる標識を含み、かつ同時に添加することができる。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは区別できない、例えば、同一の標識を含み、所定の順に順次添加する。区別できない標識を持つヌクレオチドの順次的かつ循環的な添加でも、例えば、ホモポリマーのシークエンスにおける多数の連続した重合ステップが可能となる。
【００６５】
２．２．３．リガーゼベースのシークエンシング
別の実施形態においては、サンプル核酸は、本発明により提供される光学的検出装置上で、リガーゼベースのシークエンシングによりシークエンスされる。リガーゼベースのシークエンシング法は、例えば、米国特許第５，７５０，３４１号、国際公開第０６／０７３５０４号パンフレット、およびシェンデュア（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），３０９：１７２８−１７３２（２００５）に開示されている。シェンデュア（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ）らの方法では、例えば、未知の一本鎖ＤＮＡサンプルは、両側に２つの末端連結プライマーを配置し、固相担体上に固定することができる。未知のシークエンス中の特定の位置（例えば、特定の末端連結プライマーに近接するｎ個目の塩基）は、いわゆるアンカープライマー（シークエンシングプライマーに類似するもの）を末端連結プライマーのうちの１つにアニールすること、そして、４個の縮重九量体のプールを混合物に添加することにより調べることができる。４個の九量体は、すべて異なる蛍光標識を有しており、各九量体が異なる塩基のＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴで調べる照会位置を除いて、すべての位置で縮重する。サンプルを洗浄し、蛍光走査し、そして照会塩基を識別する。続いて、アンカープライマーおよびライゲートされた九量体をサンプル核酸から取り去り、装置を洗浄し、このプロセスを繰り返して、異なる位置の照会を行う。有利には、この方法は、非累積的である、すなわち、塩基は、順番に照会が行われる必要がない。それゆえ、エラーが累積的ではない。そのうえ、この方法は、５’または３’からの方向でヌクレオチドの照会を行うことができ、すなわち標準的な５’→３’のＤＮＡ合成を必要としない。サンプル核酸の合計約１３個の塩基は、通常、この方法によりシークエンスすることができる。
【００６６】
２．３．応用
本発明に従ったバイオアッセイシステムは、何百万もの核酸セグメントを同時に検出することができる。各セグメントが、例えば、１，０００塩基長であるとすると、単一の装置は、何十億以上もの塩基シークエンスを一度に得ることができる。以下に述べられるのは、本願により提供される装置および方法のさらなる応用である。
【００６７】
２．３．１．全ゲノムシークエンシング
本発明に従ったバイオアッセイシステムは、例えば、ウィルス、バクテリア、菌類、真核生物、または脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトの全ゲノムまたは部分ゲノムシークエンシングを行うのに用いることができる。
【００６８】
シークエンシングのために、ゲノムＤＮＡは、少なくとも、２０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、３００個以上、５００個以上、８００個以上、１，２００個以上、１，５００個以上のヌクレオチドの断片に切断することができる。いくつかの実施形態において、切断されたゲノムＤＮＡは、２０〜５０個、２０〜１００個、２０〜５００個、２０〜１，０００個、５００〜１，２００個、または５００〜１，５００個のヌクレオチド長であってよい。いくつかの実施形態において、シークエンスされるべき核酸は、関連した末端連結プライマーと共に、一本鎖にし、シークエンシングプライマーにアニールし、かつ本発明により提供される装置に塗布して、上述のようなシークエンシングを行う。
【００６９】
２．３．２．遺伝子発現プロファイリング
別の実施形態において、本発明に従ったバイオアッセイシステムは、遺伝子発現プロファイリングのためにｃＤＮＡをシークエンスするのに用いることができる。例えば、ｍＲＮＡレベルは、特定のシークエンスが装置上で検出される相対頻度を測定することにより定量化することができる。数百万個のｃＤＮＡ分子を本発明により提供される装置上で並行してシークエンスすることができる。１つの細胞が平均して３５０，０００個のｍＲＮＡ分子を含むとすると、細胞あたりのたった１コピーに現れる転写産物でも、１００万のシークエンシング反応中に、およそ３回シークエンスされることが見込まれる。したがって、本発明により提供される装置は、単一のコピー数の感度による単一分子シークエンシングに適している。
【００７０】
ｃＤＮＡ合成は、当該分野においてよく知られており、通常、任意のｍＲＮＡの濃縮を伴う全ＲＮＡ抽出を含む。ｃＤＮＡは、例えば、第一鎖合成のための逆転写；残存ＲＮＡを除去するためのＲＮＡｓｅ処理；ＤＮＡポリメラーゼによる第一鎖、および第二鎖合成のランダムヘキサマープライミングを含むステップによりｍＲＮＡから生成される。結果として得られるｃＤＮＡは、本発明により提供される装置上でシークエンシングを行うのに適している。ＤＮＡおよびＲＮＡ両者の単離と調製は、当該分野においてよく知られている。例えば、ジョセフ・サムブロック（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびデイヴィッド・ラッセル（Ｄａｖｉｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ），モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；第３版（２００１）を参照されたい。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡは、米国特許第６，８１２，００５号および第７，３６１，４８８号に開示されたような方法によりシークエンスすることができる。簡単に言うと、ｃＤＮＡにアダプターポリ核酸をライゲートし、アダプターを特殊な制限酵素で処理すると、最後に、処理した核酸が、本発明により提供される装置のリンカー部位に付着した相補オリゴヌクレオチドに結合する。特定の実施形態において、アダプター分子は末端連結プライマーである。
【００７２】
本発明に従ったいくつかの実施形態において、ｍＲＮＡのポリＡ尾部は、適当な末端連結プライマーとなり得、それはポリＴシークエンシングプライマーに相補的である。
【００７３】
２．３．３．結合相互作用の検出および／または測定
別の実施形態において、バイオアッセイシステムは、例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡ塩基対合、核酸／タンパク質相互作用、抗原／抗体、レセプター／リガンド結合、および酵素／基質結合を含む様々な結合相互作用を検出するのに用いることができる。通常、サンプル分子は、核酸識別タグ（ＩＤ）を含む連結分子に付着させる。いくつかの実施形態において、連結分子は、サンプル分子を結合させる捕捉分子をさらに含む。また、連結分子は、リンカー部位に結合するための手段、例えば、ジスルフィド、チオエステル、アミド、ホスホジエステル、もしくはエステル結合のような共有化学結合、または非共有結合、例えば、抗体／抗原もしくはビオチン／アビジン結合を助ける部分を含む。いくつかの実施形態においては、連結分子は、ＩＤタグによりアレイに付着させる。
【００７４】
サンプル分子は、本発明に従った装置に塗布され、そのリンカー分子により任意のリンカー部位に、例えば、連結分子上に位置する捕捉分子を結合させることにより、付着させられる。いくつかの実施形態において、サンプル分子およびリンカー分子は、混合して結合させ、そして、本発明により提供される装置に塗布される。いくつかの実施形態においては、まず、リンカー分子は、装置に塗布してリンカー部位に付着させてから、サンプル分子が塗布される。次に、本発明に従った方法により（例えば、ハイブリダイゼーションまたはシークエンシングにより）ＩＤが検出され、関連したサンプル分子を同定する。複数のサンプル分子種は、同一のアレイに付着させることができ、かつ、それらの標識により区別され、さらに、それらの結合相互作用は、その結合する捕捉分子の固有のＩＤを用いて特徴付けられることができる。それゆえ、いくつかの実施形態において、標識されたサンプル分子を検出する方法は、サンプル分子を本発明に従った装置のリンカー部位に核酸タグを含むリンカー分子により連結させるステップ、ＩＤの核酸シークエンシングを行うステップ、および標識されたサンプル分子を検出するステップを含む。特定の実施形態において、核酸シークエンシングは、塩基伸長シークエンシングである。いくつかの実施形態では、核酸シークエンシングは、リガーゼベースのシークエンシング、または末端リン酸標識ヌクレオチドシークエンシングから選ばれる。
【００７５】
ヌクレオチドの「小片」を利用することで、最高で４ｎの異なる捕捉分子を本発明に従ったバイオアッセイシステムに付着させ同定することができる。ここで、ｎはシークエンスされるＩＤの長さを表す自然数である。例えば、５個のヌクレオチドは、１，０００を超える固有のＩＤを提供することができ、また、１２個のヌクレオチドは、１，６００万を超える組み合わせを提供する。例えば、リンカー分子は、本発明に従った装置に付着させられ、それらの位置は、それらの対応するＩＤタグを検出することにより決定される。そして、リンカー分子は、例えば、１個またはそれ以上の標識されたサンプル分子との結合相互作用を調べるためのプローブとなる。すなわち、１個またはそれ以上のリンカー分子が付着した装置は、プローブアレイとして機能し得るのである。
【００７６】
特定の実施形態において、標識されたサンプル分子は、蛍光標識されたものである。リンカー分子の捕捉分子に結合されると、標識されたサンプル分子は、リンカー分子が付着しているリンカー部位に対応する光検出器（複数の光検出器）により検出される。それゆえ、いくつかの実施形態において、本発明に従った方法は、標識されたサンプル分子を本発明に従った装置に塗布するステップ、および標識されたサンプル分子を検出するステップをさらに含んでいてもよい。特定の実施形態では、装置は、そのリンカー部位に付着する核酸タグ（ＩＤ）を含むリンカー分子を有する。多数の標識されたサンプル分子は、同時にプローブアレイに塗布され、それらの標識により、例えば、それら蛍光標識の強度および／または波長により、区別されることができる。サンプル分子と標識された照会分子との間の結合相互作用の解離定数は、所定濃度の標識された照会分子における動力学（例えば、結合／解離の比率）および静力学（例えば、任意の所定時間における結合または未結合状態にあるサンプル分子の割合）の両方に基づいて推測することができる。
【００７７】
いくつかの実施形態においては、連結分子のＩＤは、少なくとも、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、７５個以上、９０個以上、１００個以上、１５０個以上、２００個以上のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ＩＤは、５〜１０個、５〜２０個、５〜４０個、５〜８０個もしくは５〜１６０個；または、１０〜２０個もしくは１０〜５０個；または、２０〜３５個のヌクレオチド長である。ＩＤは、固有の核酸シークエンス、すなわち検出されるべき核酸を含む。特定の実施形態では、固有の核酸シークエンスは、少なくとも、１個以上、２個以上、４個以上、６個以上、８個以上、１０個以上、１２個以上、１４個以上、１６個以上、２０個以上、２４個以上、３０個以上のヌクレオチド長であってよい。いくつかの実施形態において、固有の核酸シークエンスは、４〜１０個、４〜１２個、４〜１５個もしくは４〜２０個；または、１０〜２０個のヌクレオチド長である。ＩＤは、少なくとも１つの末端連結プライマーを含む、すなわち、ＩＤは、いくつかの実施形態において、例えば、ビオチン化ヌクレオチドを含ませることにより修飾されてリンカー部位に付着するシークエンシングプライマーに相補的なシークエンスを含む。いくつかの実施形態において、ＩＤの末端連結プライマー部分は、固有の核酸シークエンスの３’側である。いくつかの実施形態において、それは、固有の核酸シークエンスの５’側である。さらに別の実施形態では、末端連結プライマーは、固有の核酸シークエンスの３’末端および５’末端の両方に存在する。
【００７８】
特定の実施形態において、サンプル分子および捕捉分子は、炭水化物、脂質、タンパク質、ペプチド、抗原、核酸、ホルモン、有機小分子（例えば、医薬）、もしくはビタミン部分、またはこれらの組み合わせから選択される部分を含む。これらの部分は、天然に存在する（例えば、生化学的に精製された）もの、あるいは、合成の（例えば、化学的に合成された、もしくは組み換え技術により製造された）ものであってよい。さらに、これらの基質は、非天然成分（例えば、非天然アミノ酸、封鎖基もしくは保護基など）を含まない、一部を含む、または全てを含んでいてもよい。特定の実施形態において、サンプル分子または捕捉分子は、タンパク質、例えば、成長因子、ペプチド抗原、抗体、またはレセプターである。
【００７９】
核酸をリンカー分子またはリンカー部位にコンジュゲートさせる様々な手法は、例えば、米国特許出願公開第２００４／００３８３３１号に概説されているように、当該分野において知られている。公開‘３３１号は、タンパク質オリゴヌクレオチドコンジュゲート体を固相担体上に形成する方法を開示する。米国特許第４，７４８，１１１号は、タンパク質を核酸の３’末端にコンジュゲートさせる一例を提示している。そこでは、まず、末端転移酵素を用いて、リボース残基を分子の３’部分に添加する。そして、過ヨウ素酸塩酸化反応により、核酸上に３’アルデヒド基が生じ、続いて、それがタンパク質のアミド基と共有結合を形成する。タンパク質をＩＤの３’末端にコンジュゲートさせる場合、リンカー部位への付着は、ＩＤの５’末端によりなされる。
【００８０】
いくつかの実施形態において、捕捉分子、例えば、タンパク質は、ＩＤの５’末端に連結される。これらの実施形態では、ＩＤの３’末端またはシークエンシングプライマーの５’末端が捕捉分子をリンカー部位に付着させるために用いられる。例えば、米国特許第６，０１３，４３４号は、その連結がオリゴヌクレオチドの５’末端によりなされるオリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート体を開示する。米国特許第６，１９７，５１３号は、ＰＮＡおよびＤＮＡの両方について、核酸の５’末端によるカルボン酸部分を有する分子、例えば、タンパク質へのコンジュゲート体を開示する。ＰＮＡおよびＤＮＡ分子は、アリールアミンまたはアミノオキシアセチル部分を含む。米国特許第６，１５３，７３７号は、様々な分子をそれにコンジュゲートさせるのに適当な少なくとも１つの２’官能化ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを開示する。
【００８１】
２．３．４．さらなる検出方法
２．３．４．１．ＦＲＥＴ
いくつかの実施形態において、分子は、本発明により提供される光検出装置上で、時として蛍光共鳴エネルギー移動として知られる、フェルスター（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ）共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により検出される。当該分野で知られているように、ＦＲＥＴは、励起されたドナー分子がエネルギーをアクセプター分子に無放射的に移動させるときに起こり、それは、通常、光としてエネルギーを放出する。ＦＲＥＴは、例えば、検出される分子の有効励起および発光波長間のより大きなスペクトル分離を提供することにより、バックグラウンド信号を低減するのに有用である。ＦＲＥＴは、しばしば、そのドナーおよびアクセプター分子間の距離の６乗である効率の減衰のために、近接する分子の相互作用を検出するのに用いられる。例えば、チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（ネイチャー・マテリアルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ），４：８２６−３１（２００５））は、ＦＲＥＴにより核酸ハイブリダイゼーションを検出した。そこでは、ビオチン化核酸ターゲットをアビジンでコートされた量子ドットドナーにコンジュゲートさせ、そして、それがＣｙ５−コンジュゲートＤＮＡプローブを励起した。本発明のいくつかの実施形態において、標識された捕捉分子および標識されたサンプル分子は、ＦＲＥＴによる検出のためにドナー／アクセプター（またはその逆）ペアを形成することが可能である。
【００８２】
本発明により提供される核酸シークエンシングのいくつかの実施形態において、蛍光標識されたヌクレオチドは、ポリメラーゼまたはリガーゼに付着したドナー発光団に対するアクセプター発光団として機能する。したがって、これらの実施形態では、ポリメラーゼまたはリガーゼ上に位置するドナー発光団は、サンプル核酸に重合、またはライゲートされるヌクレオチド上のアクセプター発光団を励起する。ポリメラーゼに近接しないヌクレオチドは、ＦＲＥＴ効率の急速な低下のために励起されない。いくつかの実施形態において、ドナー分子は、例えば、別の蛍光色素分子、例えば、量子ドットである。量子ドット、例えば、半導体量子ドットは、当該分野において知られており、例えば、国際公開第０３／００３０１５号パンフレットに記載されている。量子ドットを、例えば、生体分子に結合する手法は、例えば、メドニッツ（Ｍｅｄｎｉｔｚ）ら、ネイチャー・マテリアルズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ），４：２３５−４６（２００５）、ならびに２００６年３月３０日および２００８年４月１７日にそれぞれ公開された米国特許出願公開第２００６／００６８５０６号および第２００８／００８７８４３号に概説されているように、当該分野において知られている。いくつかの実施形態では、量子ドットは、ＤＮＡポリメラーゼ分子にコンジュゲートされる。それは、以下の実施例３でさらに説明される。酵素をリンカー部位にコンジュゲートさせることについて、すでに上で述べたように、当業者は、蛍光色素分子を、例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼにコンジュゲートさせるときに、蛍光色素分子をコンジュゲートさせることが酵素の一次、二次、および三次構造に与えるあらゆる影響を軽減することにより酵素機能を保つよう注意を払わなければならないということを、間違いなく理解する。
【００８３】
２．３．４．２．多光子励起
いくつかの実施形態では、発色団は、２つまたはそれ以上の光子により励起される。例えば、いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴにおけるドナーまたはアクセプター発光団の励起は、２つまたはそれ以上の光子によりなされる。２光子および多光子励起は、例えば、米国特許第６，３４４，６５３号および第５，０３４，６１３号にさらに記載されている。
【００８４】
２．３．４．３．時間分解検出
いくつかの実施形態において、本発明により提供される装置の光源および光検出器は、特有の位相シフトを持つように調節することができる。例えば、２００８年２月１４日に公開された米国特許出願公開第２００８／００３７００８号に開示されているような当該分野で知られる方法を用いて、本発明により提供される装置上で検出される分子から発生される光を、励起光源からの妨害なしに、対応する光検出器で測定することができる。
【００８５】
３．バイオアッセイシステムを用いる生体分子分析サービス
また、本発明は、本発明に従った実施形態によるバイオアッセイシステムを用いる生体分子分析サービスを提供する方法をも提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、分析されるべき生体分子を含むサンプルをサービス要求者からサービス提供者へ提供するステップ、およびサービス要求者がサービス提供者から分析結果を受け取るステップを含み、この結果は、本発明により提供される装置を用いて生成されるものである。いくつかの実施形態において、この方法は、利益のある対価、例えば、サービスごとの個別支払いまたはサービス請負契約のために実行される。さらに、サンプルは、サービス要求者とサービス提供者間で直接的に輸送されても、ベンダーにより仲介されてもよい。いくつかの実施形態において、サービス提供者またはベンダーは、地理的に、アメリカ合衆国外の領域、例えば、別の国に位置していてもよい。
【００８６】
本明細書に引用したすべての特許、特許出願、またはその他の文献について、すべての目的そして挙げられた課題のためにそれがその全体として参照として組み入れられるということが、理解されるべきである。参照として組み入れられる文献と本出願との間に何らかの不一致が存在する場合、本出願が優位に立つことになる。
【００８７】
本明細書は、本明細書内に引用される参照文献の教示内容を考慮すれば、最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の具体例の説明を提示するものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、その他多くの実施形態が本発明に包含されるということを容易に認識する。本開示に引用される全ての刊行物および特許は、それらの全体として参照して組み込まれる。参照として組み込まれる材料が本明細書と相反するまたは矛盾する限りにおいては、本明細書は、いかなるそのような材料にも優先し得る。本明細書中のいかなる参照文献の引用も、かかる参照文献が本発明の先行技術であるということの承認ではない。
【００８８】
特に示さない限り、クレームを含む本明細書中で用いられる成分、反応条件、およびその他の量を表す数字はいずれも、すべての場合において「約」という用語により修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、そうでないということが特に示されない限り、数値パラメーターは近似値であり、かつ、本発明により得ようとする所望の特性に応じて変わり得る。最低限でも、そしてクレームの範囲の均等論の適用を制限しようとするのではなく、各数値パラメーターは、有効数字の数および通常の丸めの手法を踏まえて解釈されるべきである。
【００８９】
特に示さない限り、一連の要素の前に来る「少なくとも」という用語は、その連なりの中のすべての要素に言及するということが理解されなければならない。当業者は、日常的なものにすぎない実験により、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認める、または確認することができる。そのような均等物は、以下のクレームに包含されることが意図されている。
【実施例】
【００９０】
実施例１：高処理能力バイオアッセイシステムの構築
以下、バイオアッセイシステム１を製造する方法を図１〜４を参照することにより詳細に述べる。まず、シリコン基板１０を、一般のロジックおよび光学デバイスに用いる商用の０．２５μｍ半導体製造プロセスにより基板１０の上表面上に形成された複数の光検出器２１０と共に準備する。光検出器２１０は、フォトダイオード光子検出器であり、各々が直径２４μｍおよび露光面積４５２μｍ２を有する。各光検出器は互いに隣接するように配置され、これにより、光検出器２１０の５１２の列および５１２の行のアレイが基板１０上に形成される。
【００９１】
複数の制御回路２１５を、光検出器２１０が形成されていない基板１０の上表面上に形成する。この実施形態では、その対応する光検出器２１０の動作を制御し、かつ光検出器２１０と検出および記録システム２との間の情報交換を制御するように、１つの制御回路２１５は１つの光検出器２１０に対応する。
【００９２】
この実施形態においては、フィルター層２４０を光検出器２１０および制御回路２１５の上表面の上方に形成する。フィルター層２４０を形成する前に、グローバル平坦化プロセスを光検出器２１０および制御回路２１５の上表面に施す。フィルター層２４０は複数の副層を含む。この実施形態において、フィルター層２４０は、まず、より高い屈折率を持つ副層を、光検出器２１０および制御回路２１５の平坦化された上表面の上方に堆積することにより形成する。次いで、より低い屈折率を持つ副層を、すでに形成されたより高い屈折率を持つ副層上に堆積する。より高い屈折率およびより低い屈折率の副層を次々と堆積していくことにより、多数の副層をそうして堆積していき、フィルター層２４０を形成する。この実施形態では、フィルター層２４０は多数の副層を含む。
【００９３】
図５を参照すると、フィルター層２４０の実例の構造を要約する表が示されている。図５において、より小さい番号の付いた副層は、フィルター層２４０の底表面により近い副層を表し、より大きい番号の付いた副層は、フィルター層２４０の上表面により近い副層を表す。図５に示されるように、この特定の実施形態において、フィルター層２４０の奇数番号の副層は、例えば、ニオブ酸化物（Ｎｂ２Ｏ５）で作製され、それは、より高い屈折率を有するものである。偶数番号の副層は、例えば、シリコン酸化物（ＳｉＯ２）で作製され、それは、より低い屈折率を有するものである。副層は、スパッタリングシステムを用いて形成することができ、その例は、シンクロン社（日本、東京、品川区）製ラジカル支援スパッタリングシリーズの型番：ＲＡＳ １１００を含む。この実施例における各副層の厚さも、図５の表に提示されている。結果として得られるフィルター層２４０は、蛍光色素分子Ｃｙ５の蛍光に対して透明度が高く、蛍光色素分子Ｃｙ５を励起するための外部光源として用いられる波長約６３３ｎｍのヘリウム−ネオンレーザーから発生される光に対して低い透明性を有している。
【００９４】
図２および４を再び参照すると、ピンホール２３５を有するブラインドシート２３０をフィルター層２４０上に形成する。以下、ピンホール２３５を有するブラインドシート２３０をフィルター層２４０または基板１０の上方に作製するプロセスを詳細に述べる。
【００９５】
まず、フォトレジスト層を、フィルター層２４０上に（フィルター層２４０を選択的に光検出器２１０および制御回路２１５の上表面上に形成する場合）、または平坦化された光検出器２１０および制御回路２１５の上表面上に（フィルター層２４０を形成しない場合）、例えば、フィルター層２４０上にレジスト材料をスピンコーティングすることにより形成する。その後、フォトレジスト層を現像してピンホール領域にフォトレジストパターンを形成する。フォトレジストパターンは、フォトマスクを用いてピンホール領域を覆い、フォトマスクに覆われた領域のみがフィルター層２４０上または平坦化された光検出器２１０および制御回路２１５の上表面上に残るようにフォトレジスト層を露光することで形成する。
【００９６】
次いで、金属層を、フォトレジストパターンがすでに形成されたフィルター層２４０の上方に堆積する。この実施形態において、金属層はクロム（Ｃｒ）を含み、これを、マグネトロンスパッタリングプロセスを行うことによりフィルター層２４０または平坦化された光検出器２１０および制御回路２１５の上表面の上方に堆積する。
【００９７】
続いて、ピンホール領域上の金属層の部分およびピンホール領域内のフォトレジストパターンを除去し、これによりピンホール２３５を有するブラインドシート２３０が形成される。
【００９８】
また、ブラインドシート２３０を、まず、金属層（例えば、Ｃｒ）をフィルター層２４０上に堆積してから、金属層上にマスクを形成することにより形成してもよく、これにより金属層の上表面の一部が露出される。次に、金属層の露出された部分を、フィルター層２４０が露出するまでエッチングし、これにより金属層上にピンホールが形成される。そして、マスクを金属層から除去し、ピンホール２３５を有するブラインドシート２３０をフィルター層２４０上に形成する。
【００９９】
図２および４を再び参照すると、この実施形態では、リンカー部位２２０を、ピンホール２３５または空洞４５０に支持材料を充填することにより形成する。支持材料は、蛍光色素分子３６から発生される蛍光に透明なポリマーまたは無機材料とすることができる。
【０１００】
図１を再び参照すると、１２個の光学的検出装置２０だけが示されているが、少なくとも１万個の光学的検出装置２０を基板１０上に形成できることは理解される。例えば、この実施形態において、各光学的検出装置２０は、半径約５μｍ以下の円形を有しており、それは、約１００μｍ２の面積を占めるものであってよい。１インチの２乗（すなわち、２．５４ｃｍ×２．５４ｃｍ）の面積を有する基板１０の場合、６００万個以上の光学的検出装置２０を１つの基板１０上に作製することが可能である。それら６００万個の光学的検出装置２０を同時に動作させることにより、生体分子を高処理能力で検出することができる。
【０１０１】
実施例２：高処理能力バイオアッセイシステムによる生体分子の付着および検出
検出システムをテストするために蛍光色素Ｃｙ５で標識された核酸を用いる。Ｃｙ５およびビオチンを、６０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの３’および５’末端にそれぞれ付着させる。標識およびビオチン化されたＤＮＡをＴｒｉｓＭｇ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０）バッファー中に溶解し、アドレスアレイ上に堆積し、湿ったチャンバ中でインキュベートする。約３０分後、未結合のＤＮＡをＴｒｉｓバッファーで洗い落とす。
【０１０２】
ブラインドシート上に形成してもよい６３５ｎｍの発光ダイオードにより励起光を提供する。各ピクセルからの信号を読み取るために、励起光を約１〜５秒間オンにし、各ピクセルから信号を記録し、このサイクルを１００回繰り返す。次いで、各ピクセルの代表的な平均信号および対応する標準偏差を適宜計算する。ＤＮＡサンプルの堆積前後の信号を比較し、標準偏差の和の３倍よりも平均信号の差が大きいピクセルを正のピクセルと見なす。すなわち、
（ＡｖｇＡｆｔｅｒ−ＡｖｇＢｅｆｏｒｅ）＞３×（ＳＴＤＡｆｔｅｒ＋ＳＴＤＢｅｆｏｒｅ）
である。
【０１０３】
実施例３：量子ドットのポリメラーゼへの結合
以下に、官能化量子ドットをポリメラーゼ分子上の１級アミンにコンジュゲートさせる２つの方法を示す。第１の方法はアミンで活性化されたドットを用い、第２の方法はカルボキシルで活性化されたドットを用いる。
【０１０４】
３．１．アミンＥＶＩＴＡＧ（登録商標）のＤＮＡポリメラーゼへのコンジュゲート体
アミンＥＶＩＴＡＧ（登録商標）（例えば、エヴィデント・テクノロジーズ（Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、カタログ番号：Ｅ２−Ｃ１１−ＡＭ２−０６２０；ＥＶＩＴＡＧ（登録商標）の一連のＱＤ製品は、商標ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）でイー・バイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ），カルフォルニア州（ＣＡ）からも販売されている）官能化量子ドット（ＱＤｓ）をＢＳ３（ビス−（スルホスクシンイミジル）スベラート、８−炭素スペーサアームの各末端にアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを含むホモ二官能性、水溶性架橋剤により活性化する。ＮＨＳエステルは、ＱＤｓの表面上の１級アミンとｐＨ７〜９で反応して安定したアミド結合を形成し、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド離脱基を放出する。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、ＮＨＳ−エステル架橋結合のターゲットとして利用できるいくつかの１級アミン（例えば、リジン（Ｋ）残基および各ポリペプチドのＮ末端）を有している。
【０１０５】
３．１．１．量子ドットの表面活性
ＥＶＩＴＡＧ（登録商標）２．０ｎｍｏｌを２５μＬ １０ｍＭ ＢＳ３（ビス−（スルホスクシンイミジル）スベラート、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社、品番：２１５８０）および２５μＬ １０× ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で活性化し、ｄ−Ｈ２Ｏで最終体積を２５０μＬにする。３０分間インキュベートした後、その溶液を、ＰＤ−１０カラム（アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、製品コード：１７−０８５１−０１）を用いて脱塩し、１× ＰＢＳで溶出する。着色された部分は活性化されたＱＤｓを含んでいる。
【０１０６】
３．１．２．ＤＮＡポリメラーゼ結合
ｐＨ９．２の０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー中のＤＮＡポリメラーゼ１００μｇを上記混合物へ添加することにより、ポリメラーゼを結合させる。充分混合した後、そのサンプルを２時間傾斜回転させながら４℃でインキュベートする。
【０１０７】
３．１．３．ＱＤコンジュゲートポリメラーゼの精製
上記コンジュゲート体を３０Ｋマイクロスピン（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）フィルター（パール・コーポレイション（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、品番：ＯＤ１００Ｃ３３）を用いた６，０００ｒｐｍ、５〜１０分間の遠心分離により全容量約２００μＬに濃縮する。そのコンジュゲート体を３０Ｋマイクロスピン（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）フィルター上にてｄ−Ｈ２Ｏで２回洗浄する。
【０１０８】
次いで、そのコンジュゲート体をスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）３０／７５樹脂（ジー・イー・ヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、低分子タンパク質およびペプチド用の品番：１７−０９０５−１０または１７−１０４４−１０）上でサイズ排除により精製する。濃縮した結合混合物をカラムにロードして、それがカラムベッドに入るようにする前に、そのカラムをｄ−Ｈ２Ｏで前平衡化する。そのサンプルをブラックライト励起下、ｄ−Ｈ２Ｏで溶出し、その蛍光画分を収集する。その蛍光画分をプールし、１００Ｋマイクロスピン（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）フィルターを用いた６，０００ｒｐｍ、５〜１０分間の遠心分離により全容量約１００μＬに濃縮する。その精製および濃縮したコンジュゲート体は、４℃で保管することができる。
【０１０９】
３．２．カルボキシルＥＶＩＴＡＧ（登録商標）のＤＮＡポリメラーゼへのコンジュゲート
カルボキシルＥＶＩＴＡＧ（登録商標）（例えば、エヴィデント・テクノロジーズ（Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、カタログ番号：Ｅ２−Ｃ１１−ＣＢ２−０６２０）官能化ＱＤｓを、ＥＤＣ媒介のスルホ−ＮＨＳエステルカップリング反応を利用して活性化させる。そのアミン反応性スルホ−ＮＨＳエステルは、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ上のリジン（Ｋ）残基の側鎖における１級アミンと反応する。
【０１１０】
３．２．１．量子ドットの表面活性化
ＥＶＩＴＡＧ（登録商標）２．０ｎｍｏｌを２５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０ バッファー中に希釈する。用いる直前に、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社、品番：２２９８０）を、低温の２５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０中に、濃度５０ｍｇ／ｍＬまで溶解する。並行して、ｐＨ５．０の２５ｍＭ ＭＥＳ中のスルホ−ＮＨＳ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社、品番：２４５２５）の５０ｍｇ／ｍＬ溶液を同じように調製する。
【０１１１】
次に、ＥＤＣ溶液５０μＬおよびスルホ−ＮＨＳ溶液５０μＬをＥＶＩＴＡＧ（登録商標）溶液に添加する。その混合物を充分に混合し、室温で３０分間ゆっくり傾斜回転させながらインキュベートする。そして、その混合物を、ＰＤ−１０カラム（アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、製品コード：１７−０８５１−０１）を用いて、脱塩し、ｐＨ９．２の０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファーで溶出する。活性化されたＱＤｓを含む着色された部分を収集する。
【０１１２】
３．２．２．ＤＮＡポリメラーゼ結合
ｐＨ９．２の０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー中のＤＮＡポリメラーゼ１００μｇを上記混合物に添加する。充分に混合した後、そのサンプルを２時間傾斜回転させながら４℃でインキュベートする。
【０１１３】
３．２．３．ＱＤ−コンジュゲートポリメラーゼの精製
上記コンジュゲート体を、３０Ｋマイクロスピン（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）フィルター（パール・コーポレイション（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、品番：ＯＤ１００Ｃ３３）を用いた６，０００ｒｐｍ、５〜１０分間の遠心分離により全容量約２００μＬに濃縮する。そのコンジュゲート体を３０Ｋマイクロスピン（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）フィルター上にてｄ−Ｈ２Ｏで２回洗浄する。次いで、そのコンジュゲート体をスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）３０／７５樹脂を用いてサイズ排除により精製する。
【０１１４】
手短に言うと、そのカラムをｄ−Ｈ２Ｏで前平衡化する。次いで、濃縮した結合混合物をカラムにロードし、カラムベッドに入るようにする。そのカラムをブラックライト励起下、ｄ−Ｈ２Ｏで溶出し、その蛍光画分を収集する。蛍光画分をプールし、１００Ｋマイクロスピン（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）フィルターを用いた６，０００ｒｐｍ、５〜１０分間の遠心分離により全容量約１００μＬに濃縮する。その精製および濃縮したコンジュゲート体は、４℃で保管することができる。
【０１１５】
実施例４：ポリメラーゼの装置への連結
酵素、例えば、ポリメラーゼを装置に付着させるためのｐｈｏｔｏＮＨＳ（炭素鎖リンカーを有するアジドニトロベンゼン分子に連結されたＮ−ヒドロキシスクシンイミドカルボキシレート分子）を用いる２つの方法を説明する。
【０１１６】
４．１．ＵＶ表面活性化
ｐｈｏｔｏＮＨＳを用いて、ＵＶ光での光活性化によりポリメラーゼを装置のアミンで修飾した表面に付着させる。ＵＶ光がアジドニトロベンゼン部分を励起し、窒素を除去することで反応性に富むナイトレン基を生じる。ナイトレンは、装置の表面上のＮＨ２と反応し、ヒドラジン結合を形成する。リンカーの他の末端は、ＮＨＳカルボキシレートであり、それは、ポリメラーゼ上のリジン残基と反応してアミド共有結合を生成する。
【０１１７】
４．１．１．表面の作製
１ｍＭ ｐｈｏｔｏＮＨＳ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、商品番号：Ａ３４０７，分子量３９０．３５）の溶液を９５％エタノール中で調製する。アミンで修飾した表面を、炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３）、続いて、９５％エタノールで洗浄する。次に、ｐｈｏｔｏＮＨＳ溶液をアミンで修飾した表面に塗布する。２５４〜３６５ｎｍのＵＶ光を表面に３分間照射し、続いて、９５％エタノールで３回リンスする。
【０１１８】
４．１．２．アミンの末端キャップ
１０ｍＭ Ｎ−アセトキシスクシンイミドの溶液を炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３）中で調製し、表面に塗布して任意の未反応のアミンを末端キャップする。その装置を優しく振盪しながら室温で２時間インキュベートする。次いで、その表面を炭酸塩バッファー、および蒸留された脱イオン水で３回ずつ洗浄する。
【０１１９】
４．１．３．ＤＮＡポリメラーゼ結合
次に、炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３）中の１ｍＭ ＤＮＡポリメラーゼの溶液を表面に塗布し、連続的な優しい振盪の下、室温で２時間インキュベートする。次いで、その表面を炭酸塩バッファーおよびｐＨ７．４ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で３回ずつ洗浄する。そのポリメラーゼ結合表面は、４℃で保管することができる。
【０１２０】
４．２．緩衝化表面活性化
別の実施形態においては、ｐｈｏｔｏＮＨＳを緩衝化条件下で活性化し、表面にコンジュゲートすることができる。次いで、ＵＶ光を用い、ポリメラーゼの存在下、アジドニトロベンゼン部分を活性化する。同様に、反応性に富むナイトレンが、ＵＶ光の下、電子不足基として形成され、ポリメラーゼの表面上の１級アミンと素早く反応し、これにより表面への共有結合が形成される。
【０１２１】
４．２．１．表面の調製
１ｍＭ ｐｈｏｔｏＮＨＳ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、商品番号：Ａ３４０７，分子量３９０．３５）の溶液を炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３）中で調製する。アミンで修飾した表面を、炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３）でリンスする。そのｐｈｏｔｏＮＨＳ溶液を、アミンで修飾した表面に塗布し、連続的な優しい振盪の下、２時間インキュベートする。そして、その表面を炭酸塩バッファーで３回リンスする。
【０１２２】
４．２．２．アミンの末端キャップ
炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３）中で調製した１０ｍＭ Ｎ−アセトキシスクシンイミド溶液を表面に塗布して未反応のアミン基を末端キャップする。その溶液を連続的な優しい振盪の下、室温で２時間インキュベートしてから、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で３回リンスする。
【０１２３】
４．２．３．ＤＮＡポリメラーゼ結合
１ｍＭ ＤＮＡポリメラーゼの溶液をＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中で調製し、末端キャップされた表面に塗布する。ＵＶ光（２５４〜３６５ｎｍ）をその表面に３分間照射する。次に、その表面をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回リンスする。そして、そのポリメラーゼ結合表面は、４℃で保管することができる。
【０１２４】
実施例５：塩基伸長シークエンシングの様式
上述したように、段階的伸長中に添加されるヌクレオチドを識別するための２種の一般的な方法として、同様に標識された４個のヌクレオチドの順次添加、または、異なって標識された４個のヌクレオチドの同時添加がある。これらの様式の各々の例が以下に提示される。
【０１２５】
５．１．同一の標識を有する４個のヌクレオチドを順次添加する
５．１．１．アデニン（Ａ）分子伸長：封鎖および標識されたアデニンおよび適当なポリメラーゼをシークエンシング反応バッファー溶液（例えば、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に添加する。チミン（Ｔ）が、末端連結プライマーの５’末端に隣接するシークエンスされる核酸中のヌクレオチドであるときにのみ、アデニンがシークエンシングプライマーの３’末端に添加されることになる。プライマーの３’末端に最も近い核酸のヌクレオチドがグアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、またはアデニン（Ａ）である場合には、伸長は起こらない。
【０１２６】
５．１．２．伸長反応洗浄ステップ：伸長反応が完了した後、そのアレイチップを５× ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１回、そして５× ＳＳＣで１回洗浄し、アデニンと未反応の溶液を除去する。
【０１２７】
５．１．３．蛍光検出および記録:リンカー部位の蛍光信号を読み取り、アデニンが伸長されたかを判断するが、それは、シークエンスされる核酸中の対応するチミンを示すものである。
【０１２８】
５．１．４．保護および蛍光基を除去：検出後、保護および蛍光基を化学的または酵素的切断により除去する。
【０１２９】
５．１．５．洗浄ステップ：上記アレイチップを５× ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１回、そして５× ＳＳＣで１回洗浄して、切断された保護基および標識基を除去する。
【０１３０】
５．１．６．校正および記録:前の伸長ステップから、保護基および蛍光基の除去の成功を確認する。残留した保護基および蛍光基がある場合、例えば、検出および記録システム２上の検出および分析ソフトウェアが、その位置を記録することになる。シークエンス反応の記録は、保護基および蛍光基の除去が次の洗浄ステップで確認された場合にのみ、進行できる。
【０１３１】
５．１．７．今回は伸長反応にグアニンを用い、５．１．１〜５．１．６を繰り返す。
【０１３２】
５．１．８．今回は伸長反応にシトシンを用い、５．１．１〜５．１．６を繰り返す。
【０１３３】
５．１．９．今回は伸長反応にチミンを用い、５．１．１〜５．１．６を繰り返す。
【０１３４】
５．１．１０．Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔを用いる４回毎の伸長反応が１サイクルである。このサイクルを繰り返すことにより、核酸のシークエンスが段階的な形で決定される。
【０１３５】
５．２．異なる標識を有する４個のヌクレオチドを同時に添加する
５．２．１．塩基伸長反応：４個の封鎖および異なるよう標識されたＤＮＡヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）および核酸ポリメラーゼをアレイ上のシークエンシングバッファーに添加する。伸長反応はシークエンシングプライマーの３’末端でのみ起こり得る。連結プライマーの５’末端に最も近いシークエンスされる核酸のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドは、シークエンシングプライマーの３’末端に添加されることになる。例えば、図６を参照されたい。
【０１３６】
５．２．２．伸長反応洗浄ステップ：伸長反応が完了した後、そのチップを５× ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１回、そして５× ＳＳＣで１回洗浄して、反応溶液中に残った物質を除去する。
【０１３７】
５．２．３．蛍光検出および記録:各リンカー部位における異なる蛍光信号のそれぞれを検出して、添加されたヌクレオチドを決定する。
【０１３８】
５．２．４．保護および蛍光基を除去：検出後、保護および蛍光基を化学的または酵素的切断により除去する。
【０１３９】
５．２．５．洗浄ステップ：上記チップを５× ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１回、そして５× ＳＳＣで１回洗浄して、切断された保護および蛍光基を除去する。
【０１４０】
５．２．６．校正および記録:前のステップから、保護基および蛍光基の除去の成功を確認する。残留した保護基および蛍光基がある場合、例えば、検出および記録システム２上の検出および分析ソフトウェアがその位置を記録することになる。シークエンス反応の記録は、その位置の保護基および蛍光基の除去が次の洗浄ステップで確認された場合にのみ、進行できる。
【０１４１】
５．２．７．ここでは、５．２．１〜５．２．６を繰り返す。反応サイクルを繰り返して核酸のシークエンスを決定する。
【０１４２】
実施例６：既知核酸のシークエンシング
既知シークエンスを有する化学的に合成された６０ｍｅｒオリゴヌクレオチド：ビオチン−５’−ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃａｇ ｔｃ ＡＣＡＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＡ−３’がシークエンシングテンプレートとなる。このシークエンシングテンプレートを１４ｍｅｒオリゴヌクレオチドシークエンシングプライマー（５’−ＴＡＧＡＡＣＣＴＣＣＧＴＧＴ−３’）に結合させる。テンプレートの５’末端を、ビオチン分子を含むように修飾する。テンプレート分子を、ストレプトアビジンを含むリアクター表面に付着させる。シークエンシング反応は、ＤＮＡポリメラーゼを用い、１５ｍＭ ＤＴＴを有する１× シークエンシングバッファー中で塩基伸長反応を行う。各伸長反応ステップでは、二次的な伸長の保護（封鎖）基および蛍光標識（例えば、Ｃｙ５）を有する１種類のヌクレオチドのみを添加する。シークエンシングプライマーの３’末端に隣接するＤＮＡテンプレートのヌクレオチドが、添加されたヌクレオチドに相補的である場合に、蛍光標識された塩基が添加される。未反応の塩基物質を洗い落とした後、その蛍光信号を検出する。添加された塩基が相補的でない場合は、蛍光信号は検出されないことになる。検出後、保護蛍光基を化学的に除去し、塩含有溶液（例えば、５× ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ）を用いて、そのアレイをさらに洗浄し、再び検出して蛍光標識の除去を確認する。除去および洗浄ステップ後に蛍光信号が検出されない位置については、蛍光標識がすでに除去されたものと見なす。そして、次の反応サイクルで得られる蛍光信号は、次の伸長かつシークエンスされたものの信号と見なす。除去および洗浄後に蛍光信号が依然残る位置については、その位置を、ソフトウェアにより不完全な除去反応を有するものとして記録する。この位置からの信号は、次のサイクルにおける除去ステップが確認された場合にのみ、記録され続けることができる。この方法に基づき、４種の反応塩基物質を順次添加し、反応を循環的に行うことができる。したがって、テンプレートのシークエンスが決定される。
【０１４３】
本発明に従った他の実施形態は、本明細書の検討およびここに開示される本発明の実行から、当業者には明らかとなろう。本明細書および実施例は単に例示的なものと考えられることを意図しており、以下のクレームにより本発明の真の範囲および精神が示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の生体分子を同定する装置であって、
光検出器を有する基板、および
前記光検出器の上方に形成されたリンカー部位であって、前記生体分子を該リンカー部位に付着させるように処理されているリンカー部位、
を含み、
前記リンカー部位が前記光検出器に近接し、かつ１００μｍ以下の距離だけ前記光検出器から間隔が置かれている、装置。
【請求項２】
前記基板上方に形成されたブラインドシートをさらに含み、該ブラインドシートが所定の直径を有するピンホールを含み、前記リンカー部位が該ピンホールに近接して形成されている請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記ピンホールが１，０００ｎｍ以下の直径を有する請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記ピンホールが２００ｎｍ以下の直径を有する請求項２に記載の装置。
【請求項５】
前記基板と前記ブラインドシートとの間に形成されたフィルター層をさらに含む請求項２に記載の装置。
【請求項６】
前記基板と前記ブラインドシートとの間に形成されたマイクロレンズをさらに含む請求項２に記載の装置。
【請求項７】
前記距離が２５μｍ以下である請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記距離が６μｍ以下である請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記光検出器が所定の立体角の範囲内で前記生体分子からの光を収集し、該立体角が０．８ＳＩステラジアン以上である請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
単一の生体分子を同定する装置であって、
光検出器を有する基板、
前記光検出器の上方に形成されたリンカー部位であって、前記生体分子を該リンカー部位に付着させるように処理されているリンカー部位、および
前記基板の上方に形成された励起光源、
を含み、
前記リンカー部位が前記光検出器に近接し、かつ１００μｍ以下の距離だけ前記光検出器から間隔が置かれている、装置。
【請求項１１】
前記励起光源が発光層を含み、該発光層が前記光検出器の表面に平行な水平方向に沿って前記リンカー部位に励起光を放出する請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記基板と前記発光層との間に形成されたフィルター層をさらに含む請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記励起光源が、発光ダイオード（ＬＥＤ）、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）、高分子発光ダイオード（ＰＬＥＤ）、およびレーザーダイオード（ＬＤ）から選択される請求項１０に記載の装置。
【請求項１４】
前記励起光源が、前記生体分子から発生される光の第２の波長範囲に重複しない第１の波長範囲の励起光を提供する請求項１０に記載の装置。
【請求項１５】
前記距離が２５μｍ以下である請求項１０に記載の装置。
【請求項１６】
前記距離が６μｍ以下である請求項１０に記載の装置。
【請求項１７】
前記光検出器が所定の立体角の範囲内で前記生体分子からの光を収集し、該立体角が０．８ＳＩステラジアン以上である請求項１０に記載の装置。
【請求項１８】
単一の生体分子を同定する装置であって、
光検出器を有する基板、および
前記光検出器の上方に形成されたリンカー部位であって、前記生体分子を該リンカー部位に付着させるように処理されているリンカー部位、
を含み、
前記光検出器が０．８ＳＩステラジアン以上の立体角の範囲内で前記生体分子から発生される光を収集する、装置。
【請求項１９】
前記基板上方に形成されるブラインドシートをさらに含み、該ブラインドシートが所定の直径を有するピンホールを含み、前記リンカー部位が該ピンホールに近接して形成されている請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記ピンホールが１，０００ｎｍ以下の直径を有する請求項１８に記載の装置。
【請求項２１】
前記ピンホールが２００ｎｍ以下の直径を有する請求項１８に記載の装置。
【請求項２２】
前記基板と前記ブラインドシートとの間に形成されたフィルター層をさらに含む請求項１９に記載の装置。
【請求項２３】
前記基板と前記ブラインドシートとの間に形成されたマイクロレンズをさらに含む請求項１９に記載の装置。
【請求項２４】
単一の生体分子を同定する装置であって、
光検出器を有する基板、
前記光検出器の上方に形成されたリンカー部位であって、前記生体分子をそれに付着させるように処理されているリンカー部位、および
前記基板の上方に形成される励起光源、
を含み、
前記光検出器が０．８ＳＩステラジアン以上の立体角の範囲内で前記生体分子から発生される光を収集する、装置。
【請求項２５】
前記励起光源が前記基板の上方に形成された発光層であり、励起光が前記光検出器の表面に平行な水平方向に沿って前記リンカー部位に放出される請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記基板と前記発光層との間に形成されたフィルター層をさらに含む請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
前記励起光源が、発光ダイオード（ＬＥＤ）、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）、高分子発光ダイオード（ＰＬＥＤ）、およびレーザーダイオード（ＬＤ）から選択される請求項２４に記載の装置。
【請求項２８】
請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の装置を少なくとも１０，０００個含む光学的検出システム。
【請求項２９】
請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の装置を少なくとも２５０，０００個含む光学的検出システム。
【請求項３０】
請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の装置を少なくとも２，０００，０００個含む光学的検出システム。
【請求項３１】
請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の装置を少なくとも１０，０００，０００個含む光学的検出システム。
【請求項３２】
核酸をシークエンシングする方法であって、
１つの核酸分子を請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の前記装置の前記リンカー部位に付着させるステップ、および
前記装置上で前記核酸分子の核酸シークエンシングを行うステップ、
を含む方法。
【請求項３３】
前記核酸が、前記リンカー部位に付着したポリメラーゼ分子に結合することにより、前記リンカー部位に付着させられる請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸シークエンシングが、標識されたヌクレオチドを前記装置に添加するステップを含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ヌクレオチドが蛍光標識されている請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ヌクレオチドが、それらの末端リン酸上に蛍光標識されている請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記核酸シークエンシングが塩基伸長シークエンシングであり、封鎖および標識されたヌクレオチドを前記装置に添加するステップを含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記ヌクレオチドが蛍光標識されている請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヌクレオチドが、同一の蛍光標識を有しており、順次添加される請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ヌクレオチドが、異なる蛍光標識を有しており、同時に添加される請求項３８に記載の方法
【請求項４１】
前記核酸シークエンシングがリガーゼベースのシークエンシングである請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸が、核酸シークエンシングの前に前記リンカー部位で増幅される請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸のシークエンスが未知である請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
複数の核酸分子をシークエンシングする方法であって、
複数の核酸分子を請求項２８〜請求項３１のいずれか１項に記載の前記光学的検出システムの前記リンカー部位に付着させるステップ、および
前記光学的検出システム上で前記核酸分子の核酸シークエンシングを並行して行うステップ、
を含む方法。
【請求項４５】
生体分子を検出する方法であって、
１個またはそれ以上の生体分子を請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の前記装置の前記リンカー部位に付着させるステップ、および
前記装置上で前記生体分子を検出するステップ、
を含む方法。
【請求項４６】
前記生体分子が標識を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記標識が蛍光である請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記生体分子が、ポリペプチド、抗体、脂質、ビタミン、低分子量有機分子、および多糖から選ばれた部分を含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記生体分子が、連結分子により前記装置の前記リンカー部位に付着させられる請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記連結分子が捕捉分子を含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記捕捉分子がタンパク質である請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記捕捉分子が抗体である請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記連結分子が核酸タグを含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記装置上で前記連結分子の前記核酸タグを検出するステップをさらに含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記核酸タグが核酸シークエンシングにより検出される請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記核酸タグが核酸プローブへのハイブリダイゼーションにより検出される請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記核酸プローブが蛍光標識されている請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記核酸が、フェルスター（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ）共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により励起される標識で検出される請求項３２〜請求項４５または請求項５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記核酸が、時間分解蛍光技術により標識で検出される請求項３２〜請求項４５または請求項５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
複数の生体分子を検出する方法であって、
複数の生体分子を請求項２８〜請求項３１のいずれか１項に記載の前記光学的検出システムの前記リンカー部位に付着させるステップ、および
前記光学的検出システム上で前記生体分子を並行して検出するステップ、
を含む方法。
【請求項６１】
単一の生体分子を同定するのに用いる装置を製造するための方法であって、
基板上に光検出器および制御回路を形成すること、
前記基板上にピンホールを有するブラインドシートを形成すること、ならびに
前記光検出器の上方にかつ前記ピンホールに近接してリンカー部位を形成すること、
を含み、
前記リンカー部位が前記生体分子を前記リンカー部位に付着させるように処理されており、前記リンカー部位が前記光検出器に近接し、かつ１００μｍ以下の距離だけ前記光検出器から間隔が置かれている、方法。
【請求項６２】
前記基板と前記ブラインドシートとの間にフィルター層を形成することをさらに含む請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ブラインドシートを形成することが、
前記フィルター層上に不透明層を形成すること、
前記不透明層上にフォトレジスト層を形成すること、
前記フォトレジスト層をパターニングして前記不透明層の一部を露出させること、
前記パターン化されたフォトレジスト層をマスクとして用い前記フィルター層が露出するまで前記不透明層をエッチングすること、および
前記フォトレジスト層を除去すること、
を含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記不透明層が金属を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
生体分子分析サービスを提供する方法であって、
生体分子を含むサンプルをサービス要求者からサービス提供者へ提供するステップ、
前記サービス要求者が前記サービス提供者から分析結果を受け取るステップ、
を含み、
前記結果が請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の前記装置を用いて生成されたものである、方法。
【請求項６６】
前記方法が利益のある対価のために行われる請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記サービス要求者および前記サービス提供者がベンダーにより仲介される請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記分析結果が別の国で生成される請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記分析結果がアメリカ合衆国以外の国で生成される請求項６５に記載の方法。
【請求項１】
単一の生体分子を同定する装置であって、
光検出器を有する基板、および
前記光検出器の上方に形成されたリンカー部位であって、前記生体分子を該リンカー部位に付着させるように処理されているリンカー部位、
を含み、
前記リンカー部位が前記光検出器に近接し、かつ１００μｍ以下の距離だけ前記光検出器から間隔が置かれている、装置。
【請求項２】
前記基板上方に形成されたブラインドシートをさらに含み、該ブラインドシートが所定の直径を有するピンホールを含み、前記リンカー部位が該ピンホールに近接して形成されている請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記ピンホールが１，０００ｎｍ以下の直径を有する請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記ピンホールが２００ｎｍ以下の直径を有する請求項２に記載の装置。
【請求項５】
前記基板と前記ブラインドシートとの間に形成されたフィルター層をさらに含む請求項２に記載の装置。
【請求項６】
前記基板と前記ブラインドシートとの間に形成されたマイクロレンズをさらに含む請求項２に記載の装置。
【請求項７】
前記距離が２５μｍ以下である請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記距離が６μｍ以下である請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記光検出器が所定の立体角の範囲内で前記生体分子からの光を収集し、該立体角が０．８ＳＩステラジアン以上である請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
単一の生体分子を同定する装置であって、
光検出器を有する基板、
前記光検出器の上方に形成されたリンカー部位であって、前記生体分子を該リンカー部位に付着させるように処理されているリンカー部位、および
前記基板の上方に形成された励起光源、
を含み、
前記リンカー部位が前記光検出器に近接し、かつ１００μｍ以下の距離だけ前記光検出器から間隔が置かれている、装置。
【請求項１１】
前記励起光源が発光層を含み、該発光層が前記光検出器の表面に平行な水平方向に沿って前記リンカー部位に励起光を放出する請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記基板と前記発光層との間に形成されたフィルター層をさらに含む請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記励起光源が、発光ダイオード（ＬＥＤ）、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）、高分子発光ダイオード（ＰＬＥＤ）、およびレーザーダイオード（ＬＤ）から選択される請求項１０に記載の装置。
【請求項１４】
前記励起光源が、前記生体分子から発生される光の第２の波長範囲に重複しない第１の波長範囲の励起光を提供する請求項１０に記載の装置。
【請求項１５】
前記距離が２５μｍ以下である請求項１０に記載の装置。
【請求項１６】
前記距離が６μｍ以下である請求項１０に記載の装置。
【請求項１７】
前記光検出器が所定の立体角の範囲内で前記生体分子からの光を収集し、該立体角が０．８ＳＩステラジアン以上である請求項１０に記載の装置。
【請求項１８】
単一の生体分子を同定する装置であって、
光検出器を有する基板、および
前記光検出器の上方に形成されたリンカー部位であって、前記生体分子を該リンカー部位に付着させるように処理されているリンカー部位、
を含み、
前記光検出器が０．８ＳＩステラジアン以上の立体角の範囲内で前記生体分子から発生される光を収集する、装置。
【請求項１９】
前記基板上方に形成されるブラインドシートをさらに含み、該ブラインドシートが所定の直径を有するピンホールを含み、前記リンカー部位が該ピンホールに近接して形成されている請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記ピンホールが１，０００ｎｍ以下の直径を有する請求項１８に記載の装置。
【請求項２１】
前記ピンホールが２００ｎｍ以下の直径を有する請求項１８に記載の装置。
【請求項２２】
前記基板と前記ブラインドシートとの間に形成されたフィルター層をさらに含む請求項１９に記載の装置。
【請求項２３】
前記基板と前記ブラインドシートとの間に形成されたマイクロレンズをさらに含む請求項１９に記載の装置。
【請求項２４】
単一の生体分子を同定する装置であって、
光検出器を有する基板、
前記光検出器の上方に形成されたリンカー部位であって、前記生体分子をそれに付着させるように処理されているリンカー部位、および
前記基板の上方に形成される励起光源、
を含み、
前記光検出器が０．８ＳＩステラジアン以上の立体角の範囲内で前記生体分子から発生される光を収集する、装置。
【請求項２５】
前記励起光源が前記基板の上方に形成された発光層であり、励起光が前記光検出器の表面に平行な水平方向に沿って前記リンカー部位に放出される請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記基板と前記発光層との間に形成されたフィルター層をさらに含む請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
前記励起光源が、発光ダイオード（ＬＥＤ）、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）、高分子発光ダイオード（ＰＬＥＤ）、およびレーザーダイオード（ＬＤ）から選択される請求項２４に記載の装置。
【請求項２８】
請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の装置を少なくとも１０，０００個含む光学的検出システム。
【請求項２９】
請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の装置を少なくとも２５０，０００個含む光学的検出システム。
【請求項３０】
請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の装置を少なくとも２，０００，０００個含む光学的検出システム。
【請求項３１】
請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の装置を少なくとも１０，０００，０００個含む光学的検出システム。
【請求項３２】
核酸をシークエンシングする方法であって、
１つの核酸分子を請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の前記装置の前記リンカー部位に付着させるステップ、および
前記装置上で前記核酸分子の核酸シークエンシングを行うステップ、
を含む方法。
【請求項３３】
前記核酸が、前記リンカー部位に付着したポリメラーゼ分子に結合することにより、前記リンカー部位に付着させられる請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸シークエンシングが、標識されたヌクレオチドを前記装置に添加するステップを含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ヌクレオチドが蛍光標識されている請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ヌクレオチドが、それらの末端リン酸上に蛍光標識されている請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記核酸シークエンシングが塩基伸長シークエンシングであり、封鎖および標識されたヌクレオチドを前記装置に添加するステップを含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記ヌクレオチドが蛍光標識されている請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヌクレオチドが、同一の蛍光標識を有しており、順次添加される請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ヌクレオチドが、異なる蛍光標識を有しており、同時に添加される請求項３８に記載の方法
【請求項４１】
前記核酸シークエンシングがリガーゼベースのシークエンシングである請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸が、核酸シークエンシングの前に前記リンカー部位で増幅される請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸のシークエンスが未知である請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
複数の核酸分子をシークエンシングする方法であって、
複数の核酸分子を請求項２８〜請求項３１のいずれか１項に記載の前記光学的検出システムの前記リンカー部位に付着させるステップ、および
前記光学的検出システム上で前記核酸分子の核酸シークエンシングを並行して行うステップ、
を含む方法。
【請求項４５】
生体分子を検出する方法であって、
１個またはそれ以上の生体分子を請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の前記装置の前記リンカー部位に付着させるステップ、および
前記装置上で前記生体分子を検出するステップ、
を含む方法。
【請求項４６】
前記生体分子が標識を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記標識が蛍光である請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記生体分子が、ポリペプチド、抗体、脂質、ビタミン、低分子量有機分子、および多糖から選ばれた部分を含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記生体分子が、連結分子により前記装置の前記リンカー部位に付着させられる請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記連結分子が捕捉分子を含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記捕捉分子がタンパク質である請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記捕捉分子が抗体である請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記連結分子が核酸タグを含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記装置上で前記連結分子の前記核酸タグを検出するステップをさらに含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記核酸タグが核酸シークエンシングにより検出される請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記核酸タグが核酸プローブへのハイブリダイゼーションにより検出される請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記核酸プローブが蛍光標識されている請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記核酸が、フェルスター（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ）共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により励起される標識で検出される請求項３２〜請求項４５または請求項５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記核酸が、時間分解蛍光技術により標識で検出される請求項３２〜請求項４５または請求項５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
複数の生体分子を検出する方法であって、
複数の生体分子を請求項２８〜請求項３１のいずれか１項に記載の前記光学的検出システムの前記リンカー部位に付着させるステップ、および
前記光学的検出システム上で前記生体分子を並行して検出するステップ、
を含む方法。
【請求項６１】
単一の生体分子を同定するのに用いる装置を製造するための方法であって、
基板上に光検出器および制御回路を形成すること、
前記基板上にピンホールを有するブラインドシートを形成すること、ならびに
前記光検出器の上方にかつ前記ピンホールに近接してリンカー部位を形成すること、
を含み、
前記リンカー部位が前記生体分子を前記リンカー部位に付着させるように処理されており、前記リンカー部位が前記光検出器に近接し、かつ１００μｍ以下の距離だけ前記光検出器から間隔が置かれている、方法。
【請求項６２】
前記基板と前記ブラインドシートとの間にフィルター層を形成することをさらに含む請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ブラインドシートを形成することが、
前記フィルター層上に不透明層を形成すること、
前記不透明層上にフォトレジスト層を形成すること、
前記フォトレジスト層をパターニングして前記不透明層の一部を露出させること、
前記パターン化されたフォトレジスト層をマスクとして用い前記フィルター層が露出するまで前記不透明層をエッチングすること、および
前記フォトレジスト層を除去すること、
を含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記不透明層が金属を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
生体分子分析サービスを提供する方法であって、
生体分子を含むサンプルをサービス要求者からサービス提供者へ提供するステップ、
前記サービス要求者が前記サービス提供者から分析結果を受け取るステップ、
を含み、
前記結果が請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の前記装置を用いて生成されたものである、方法。
【請求項６６】
前記方法が利益のある対価のために行われる請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記サービス要求者および前記サービス提供者がベンダーにより仲介される請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記分析結果が別の国で生成される請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記分析結果がアメリカ合衆国以外の国で生成される請求項６５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１１−５０４２２３（Ｐ２０１１−５０４２２３Ａ）
【公表日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３０２５８（Ｐ２０１０−５３０２５８）
【出願日】平成２０年１０月２４日（２００８．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／０７２８２４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５６０６５
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０７０８４０７３）インダストリアル テクノロジー リサーチ インスティテュート (22)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２４日（２００８．１０．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／０７２８２４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５６０６５
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０７０８４０７３）インダストリアル テクノロジー リサーチ インスティテュート (22)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]