化学反応を制御するためのカートリッジ
【課題】 反応混合物の迅速な処理と、混合物中の分析物の検出感度を向上させることができるカートリッジを提供する。
【解決手段】 化学反応を制御するカートリッジ(２０)は、内部に形成された少なくとも１つの流路をもつ本体を備える。上記カートリッジは、上記本体から延び出し、化学反応と光学的検出のための反応混合物を保持する反応容器(４０)を更に備える。反応容器(４０)は、反応室の側壁を区画する剛な枠を有する。この枠は、上記流路を反応室に接続する少なくとも１つの流路を有する。上記反応容器は、反応室の対向する主壁を形成すべく上記枠の両側に取り付けられた柔軟なフィルムまたはシートを更に有する。加えて、上記側壁の少なくとも２つは、上記反応室内の分析物のリアルタイムな光学的検出を可能にすべく、透光性であるとともに角度をなすように互いに偏らせられている。
【解決手段】 化学反応を制御するカートリッジ(２０)は、内部に形成された少なくとも１つの流路をもつ本体を備える。上記カートリッジは、上記本体から延び出し、化学反応と光学的検出のための反応混合物を保持する反応容器(４０)を更に備える。反応容器(４０)は、反応室の側壁を区画する剛な枠を有する。この枠は、上記流路を反応室に接続する少なくとも１つの流路を有する。上記反応容器は、反応室の対向する主壁を形成すべく上記枠の両側に取り付けられた柔軟なフィルムまたはシートを更に有する。加えて、上記側壁の少なくとも２つは、上記反応室内の分析物のリアルタイムな光学的検出を可能にすべく、透光性であるとともに角度をなすように互いに偏らせられている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概ね生化学分析分野、特に化学反応を制御する新しいカートリッジに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床流体や環境流体の分析は一般的に、流体試料への化学的、光学的、電気的、機械的、または、熱学的一連の処理工程を含む。近年、様々な診断や監視目的のために生物学試料の分析を行う使い捨てカートリッジの開発への関心が高まっている。例えば、Wilding，米国特許第５,５８７,１２８号には、試料中の前もって選択されたポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド増幅反応を行って増幅する装置が開示されている。Anderson らの米国特許第５,９２２,５９１号では、小型の一体型核酸診断装置システムが述べられている。この装置では一般的に、１回以上の試料の獲得と準備操作を、１回以上の試料分析操作と組み合わせて行うことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５,５８７,１２８号明細書
【特許文献２】米国特許第５,９２２,５９１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記進歩にも関わらず、反応混合物の迅速な熱処理と、混合物中の分析物の検出感度を向上させることができるカートリッジの必要性が依然ある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の開示）
本発明は、流体試料を分析して試料中の分析物の有無を測定する装置と方法を供給する。この装置は、試料から所望の分析物を分離し、その分析物を化学反応と光学的検出のために入れるカートリッジを有する。この装置は、試料処理のためにカートリッジを受ける装置を備える。所望の分析物には例えば、有機体、細胞、タンパク質、核酸、炭水化物、ウイルス分子、バクテリア、化学物質や生化学物質が含まれる。好ましくは、所望の分析物は核酸を含み、行われる化学反応は、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を使う増幅がよい。
【０００６】
好ましい実施形態では、カートリッジは少なくとも１つの流路を有する本体を備える。カートリッジはまた、本体から延び出して化学反応と光学的検出を行うために反応混合物を入れる反応容器を備える。この反応容器は反応室の側壁を区画する剛な枠から成る。この枠は流路と反応室を接続する少なくとも１つの導管を有する。反応容器はまた、少なくとも１つの柔軟性のあるフィルムやシートを有する。フィルムやシートは剛な枠に取り付けられており、反応室の主壁を形成する。主壁は熱面と一致するのに十分柔軟である。反応容器は、剛な枠の両側に取り付けられ、反応室の対向する主壁を形成する第１および第２の柔軟なシートを有するのが好ましい。さらに、少なくとも２つの側壁は透光性があり、略９０度の角度で互いに偏らされている。
【０００７】
カートリッジは、反応室を挟んで収容するように配置された対向する熱板を有する装置と組み合わせて使うのが好ましい。この装置は、反応室内の圧力を増加する圧力源も有する。反応室内の圧力は、主壁を板の内面に一致するように接触させるのに十分なまで増加し、反応室への最適な熱伝導を確実にする。装置はまた、反応混合物の迅速な熱処理のため板上に熱要素を配する。装置はさらに、透光性の側壁のうちの第１の側壁を介して反応室内の反応混合物を励起する少なくとも１つの光源と、反応室から透光性の側壁のうちの第２の側壁を介して放出される光を検出する少なくとも１つの検出器を有する光学システムを備える。
【０００８】
本発明のカートリッジは、反応混合物の極めて迅速な加熱と冷却を可能にし、混合物と熱または冷却要素間の最適な伝熱を確実にし、反応生成物のリアルタイムで高感度な光学的検出と監視を行なう。
【０００９】
本発明は以下に述べる詳細な説明と付随する図面によってよりよく理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の第１実施形態の流体試料を分析するカートリッジの等角投影図である。
【図２】図１のカートリッジの下部の等角投影図である。
【図３】図１のカートリッジの分解図である。
【図４】図１のカートリッジの別の分解図である。
【図５】図１のカートリッジ内に設けられた溶解室の壁に連結された超音波ホーンの部分破断図である。
【図６】図１のカートリッジの溶解室内に設けられたフィルタスタックの分解図である。
【図７】図１のカートリッジの平面図である。
【図８】図１のカートリッジの底面図である。
【図９】図１のカートリッジの概略ブロック図である。
【図１０】図１のカートリッジを処理のために入れる装置の等角投影図である。
【図１１】図１０の装置の中の図１のカートリッジの等角投影図である。
【図１２】図１０の装置の中の図１のカートリッジの部分破断図である。
【図１３】図１のカートリッジ内の液体レベルを検出するための光センサの概略平面図である。
【図１４】図１のカートリッジのセンサ室内の液体レベルを検出するために差込まれた光センサの概略部分破断側面図である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、図１のカートリッジの本体一部の断面図であり、カートリッジ内の２つの異なるタイプの弁を示している。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、閉じた状態の図１５Ａの弁の断面図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、開いた状態の図１５Ａの弁のうち１つの別の断面図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、閉じた状態の図１６Ａの弁の断面図である。
【図１７】図１５Ａの弁を開閉する弁作動システムを図示したものである。
【図１８】図１５Ａの弁を開閉する弁作動システムを図示したものである。
【図１９】図１５Ａの弁を開閉する弁作動システムを図示したものである。
【図２０】図１のカートリッジ内の弁を開閉する代替の弁アクチュエータの断面図である。図２０はまた、図１のカートリッジ内の圧力ポートに封着された圧力供給ノズルを示す。
【図２１】図１のカートリッジの反応容器の部分分解等角投影図である。
【図２２】図２１の容器の正面図である。
【図２３】２つの熱板の間に挿入された図２１の容器の側面図である。
【図２４】図２３の熱板のうち１つの正面図である。
【図２５】本発明の代替の反応容器の正面図である。
【図２６】本発明の別の反応容器の正面図である。
【図２７】図２１の容器の別の正面図である。
【図２８】図１０の装置の熱交換モジュール内に挿入された図２１の容器の正面図である。
【図２９】図２３の板を保持する支持構造の分解図である。
【図３０】図２９の支持構造の組み立て図である。
【図３１】図２９の支持構造の組み立て図である。
【図３２】図２８の熱交換モジュール内の光学アッセンブリのうち１つの外面を示す等角投影図である。
【図３３】図３２の光学アッセンブリと接する図２３の板の等角投影図である。
【図３４】図２３の板の間に挿入された図２１の反応容器の部分破断等角投影図である。容器の下部のみが図に含まれている。
【図３５】図２８の熱交換モジュールの電子装置の概略ブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、流体の試料を分析するための装置および方法を提供する。第１の実施形態では、この発明は、流体試料から所望の分析物を分離するため、および化学反応のために分析物を保持するためのカートリッジを提供する。流体の試料は、溶液であるか、浮遊物である。特別な使用では、試料は人体の流体である(例えば、血液、尿、唾液、痰、精液、脊髄の流体、粘液、または他の人体の流体)。これと択一的に、試料は溶解できる固体であるか、または液体の中に浮遊している固体である。また、試料は、土、汚水、土の抽出物、殺虫剤の残留物、または流体に含まれる風媒の種子のような環境試料である。更に、試料は、１以上の化学薬品、試液、希釈剤、または緩衝液と混ぜ合わせられる。試料は、例えば化学薬品を混ぜ合わせたり、遠心分離機にかけたり、あるいは小さく丸めたりして、前もって処理され、あるいは未処理の形態である。
【００１２】
所望の分析物は、典型的には細胞内の物質である(例えば、核酸、蛋白質、炭水化物、脂質、細菌、または細胞内の寄生虫)。好ましい使用では、分析物は、カートリッジが流体試料から分離するとともに、(例えば、ＰＣＲを用いて)増幅し、かつ光学的検出するため保持する核酸である。本明細書で用いる用語「核酸」は、合成のあるいは自然に生ずるＤＮＡやＲＮＡのような核酸を指しており、この核酸はいかなる可能な外形、即ち、二重染色分体の核酸の形態、一重染色分体の核酸の形態、またはこれらの形態のいかなる可能な組み合わせの形態をとる。
【００１３】
図１は、好ましい実施形態のカートリッジ２０の等角投影図である。カートリッジ２０は、流体試料から核酸を分離するように設計されており、増幅および検出のために核酸を保持するように設計されている。カートリッジ２０は、頂部片２２,中央片２４および底部片２６を備える本体を有している。流体試料をカートリッジの中に導入するための入口は頂部片２２に形成されてキャップ３０によって密閉されている。また、６つの圧力ポート３２が、頂部片２２に形成されている。圧力ポート３２は、例えばポンプや真空などの圧力源からのノズルを収容するためにある。カートリッジはまた、装置(図１０で後述する)におけるカートリッジ２０の位置決めのために底部片２６から延び出る整列脚２８を有する。窪みまたは凹部３８A,３８B,３８Cは、頂部片２２および中央片２２に形成されている。この凹部は、カートリッジ２０内の流体の流れを検出するための光学センサを収容するためにある。カートリッジ２０は、更にベント３４,３６を有する。各圧力ポートと各ベントは、ベントおよび圧力ポートに対してガスが出入りするようにガスは通すが、液体は通さない疎水性の薄膜を有することが好ましい。変性アクリル樹脂共重合体の薄膜は、例えば、ゲルマンサイエンス社(ミシガン州,アン・アーバー)から市販され、また、粒子トラック腐食ポリカーボネートの薄膜は、ポリティクス社(カリフォルニア州,リバーモア)から市販されている。
【００１４】
図２は、カートリッジ２０の下側を示す等角投影図である。９つの穴６０が、カートリッジ２０の弁を開閉する弁アクチュエータを収容するために底部片２６に形成されている。トランスデューサ(図５で詳細に後述する)を収容するための穴６２も、底部片２６に形成されている。カートリッジ２０はまた、カートリッジの本体から外側に延び出す反応容器４０を有する。容器４０は、化学反応や光学的検出のための反応混合物(例えば、増感試薬および蛍光試料と混合された核酸)を保持するための反応室４２を有する。カートリッジにおける流路の１つは、化学反応と光学検出のために反応室４２に反応混合物を運ぶ。反応容器４０は、カートリッジ２０の本体から外側に延びていて、その結果、反応容器４０は、カートリッジ２０の残余の部分から反応容器４０を取り外す必要なしに、対向する一対の(反応室４２を加熱,冷却するための)熱板の間に挿入される。これは、汚染とこぼれのうちの少なくともいずれかが起こる危険性を大きく減じている。反応容器４０は、カートリッジの本体と一体に形成することができる(例えば、中央片２４と一体にモールド成形される)。しかしながら、目下、カートリッジの製造中に本体と連結される分離要素として反応室４０を製造するのが好ましい。
【００１５】
図３,図４は、カートリッジの分解図を示している。図３で示されているように、中央片２４は、内部に多数の室を有する。特に、中央片２４は、入口ポート６４を通じて導入される流体試料を保持する試料室６５と、洗剤液を保持する洗剤室６６と、溶解系試薬を保持する試薬室６７と、使用済みの試料と洗剤を収容するための廃水室６８と、中和剤を保持する中和剤室７０と、主混合物(例えば、増感試薬と蛍光試料)を保持して、流体試料から分離された分析物をもつ試料と試薬を混合する主混合室７１とを有する。試料室６５は、試料室６５より僅かに低い外壁を有する側室155をオプションで包含している。側室155は、充分な試料が試料室６５に加えられたとき、即ち試料室６５内での液面が側室の中に溢れ込むほど充分高いとき、ユーザに視覚的に知らせるためにある。
【００１６】
頂部片２２は、既述の如くベント３４,３６および圧力ポート３２を有する。エラストマーの薄膜またはガスケット６１は、頂部片２２,中央片２４に形成された様々な溝や室を密封するためにこれらの片２２,２４の間に挟まれるように配置される。中央片２４は、ガスケット６１が十分なシールを形成することを保証すべく、複数のシールリップを有するのが好ましい。特に、室６５,６６,６７,６８,７０,７１の夫々を取り囲むシールリップ７３を有するのが好ましい。中央片２４はまた、周囲を囲う支持壁７５と中間シールリップ７６とを有する。シールリップ７３,７６と支持壁７５は、局所的にガスケット６１を圧縮して、密封を達成する。
【００１７】
図４で示されるように、中央片２４は下側に様々な溝が形成されて、その溝の１つは、溶解室８６に通じている。溶解室８６は、底部片２６の穴６２と一直線に揃っていて、トランスデューサ(例えば、超音波ホーン)は、溶解室８６内に圧力波を生成するために穴６２を経て挿入される。中央片２４はまた、底面に形成された９つの弁座８４を有する。弁座８４は、底部片２６の９つの穴６０と一直線に揃っていて、弁アクチュエータが、弁座８４に穴６０を経て挿入される。
【００１８】
エラストマーの膜あるいはガスケット６１は、中央片、底部片２４，２６の間に挟まれるように位置して、中央片２４に形成された種々の流路、弁座、室を密閉する。中央片２４は、好ましくは多数のシールリップを有し、ガスケット６３が十分なシールを形成するのを確実にする。特に、中央片２４は、好ましくは、溶解室８６、弁座８４および種々の流路を取り囲むシールリップ７３を有している。また、中央片２４は、その周囲に支持壁７５を有するとともに、中間シールリップ７６を有している。上記シールリップ７３，７６と支持壁７５は、ガスケット６３を局部的に圧縮し、シールを完成する。種々の流路および室を密封するのに加えて、ガスケット６３は、複数の穴６０のうちの１つを通じて駆動させられたときに、対応する弁座８４に圧入し、これによって中央片２４の複数の流路のうちの１つを塞ぐことにより、弁軸としても機能する。この弁動作については、図１５〜１６を参照しながら後でより詳細に説明する。
【００１９】
ガスケット６３はまた、溶解室８６の底面壁を形成しており、この底面壁に当接してトランスデューサが配置され、溶解室８６内の細胞あるいはウイルスの破壊を生ぜしめる。ガスケット６１,６３は夫々、好ましくはエラストマーで構成されている。適切なガスケット材料は、シリコンゴム、ネオプレン、エチレンプロピレンジエンモノマー、あるいはその他の弾性材料である。ガスケット６１,６３は夫々、好ましくは0.005〜0.125インチ(0.125〜3.175mm)の範囲の厚さであり、より好ましくは0.01〜0.06インチ(0.25〜1.5mm)の範囲の厚さである。現在好適とされている厚さは、0.31インチ(0.79mm)である。ガスケットの厚さとしては、ガスケットが、流路や室を密封し、力が加えられたときに弁座８４に圧入し、そして圧力がかかっている状態で広がってトランスデューサと接触するのに十分な弾力性を備えるような厚さが選択されている。
【００２０】
図３に示されるように、中央片２４はスロット７９を有し、カートリッジ組み立ての際にこのスロットに反応容器４０が挿入される。この反応容器４０は、流体を加えたり、反応容器から流体を除くための２つの流体ポート４１，４３を有している。頂部片２２が、ガスケット６１を介して中央片２４に密着させられると、上記流体ポート４１，４３は、それぞれ頂部片２２に形成された流路８０,８１(図４参照)と流体連通する。ガスケット６１は、流体ポート４１,４３と流路８０,８１との間の夫々の流体境界面を密封する。頂部片、中央片、底部片２２,２４,２６は、好ましくは、ポリプロピレン、ポリカーボネート、あるいはアクリルなどのポリマー材料で作られた射出成形部品である。大量生産には成形が好適であるが、頂部片、中央片、底部片２２,２４,２６の機械加工も可能である。頂部片、中央片、底部片２２,２４,２６は、ねじあるいは留め金具で結合してもよい。これと択一的に、超音波接合、溶剤結合、あるいはスナップ嵌合設計を用いて、カートリッジを組み立てることもできる。
【００２１】
また、図４はフィルタリング８８を示している。このフィルタリング８８は、溶解室８６のフィルタの積み重ねを圧縮し、保持している。図６は、フィルタスタック８７の分解図を示している。このフィルタスタック８７の目的は、試料流体が溶解室を通るときに、流体試料から細胞やウイルスを捕捉することである。そして、捕捉された細胞やウイルスは、溶解室８６において破壊（溶解）される。細胞は、動物細胞または植物細胞、胞子、バクテリア、あるいは微生物であってもよい。ウイルスは、ＲＮＡあるいはＤＮＡ核を取り囲んでいるたんぱく質被膜を有するあらゆる種類の感染性物質でもよい。
【００２２】
上記フィルタスタック８７は、ガスケット９３、第１フィルタ９４、ガスケット９５、第１フィルタ９４よりも小さな孔を有する第２フィルタ９７、ガスケット９８、第２フィルタ９７よりも小さな孔を有する第３フィルタ100、ガスケット101、メッシュ102、ガスケット103を備えている。また、フィルタスタックは、好ましくは第１，第２フィルタ９４,９７の間に配置された第１組のビーズ９６と、第２,第３フィルタ97,100の間に配置された第２組のビーズ９９を有している。フィルタリング８８は、フィルタスタック８７を溶解室８６に圧入するので、ガスケット９３はフィルタ９４を押圧し、フィルタ９４はガスケット９５を押圧し、ガスケット９５はフィルタ９７を押圧し、フィルタ９７はガスケット９８を押圧し、ガスケット９８はフィルタ100を押圧し、フィルタ100はガスケット101を押圧し、ガスケット101はメッシュ102を押圧し、メッシュ102はガスケット103を押圧し、ガスケット103は溶解室８６の底面壁の外周部を押圧する。ビーズ９６がフィルタ９４,９７の間の空間を自由に移動するように、ガスケット９５の厚さはビーズ９６の平均直径よりも大きくなっている。同様に、ビーズ９９がフィルタ97,100の間の空間を自由に移動するように、ガスケット９８の厚さはビーズ９９の平均直径よりも大きくなっている。流路106を通って溶解室８６に流れ込む試料流体は、まずフィルタ９４を通って、それからフィルタ９７を通って、その次にフィルタ100を通って、最後にメッシュ102を通る。フィルタスタック８７を通った後、試料流体は溶解室８６の上部に形成されたフローリブ９１を通って、排出流路(図６には示さず)を通過する。
【００２３】
図５を参照すると、上記フィルタスタックに捕捉された細胞あるいはウイルス(図５には図解の明瞭化のため図示せず)は、トランスデューサ９２(例えば、超音波ホーン)を溶解室８６の壁に直接結合することによって溶解される。この実施形態において、溶解室８６の壁は、可撓ガスケット６３によって形成されている。トランスデューサ９２は、上記壁の外面に直接接触するべきである。「外面」とは、溶解室８６の外面である壁の表面を意味している。トランスデューサ９２は、溶解室８６において作動させられて圧力波を発生する振動装置である。この圧力波は、ビーズ９６,９９(図６)を振り動かし、ビーズのこの動きが、捕捉された細胞あるいはウイルスを破裂させる。一般に、溶解室８６の壁に接触するトランスデューサは、超音波、圧電、磁気歪、あるいは静電のトランスデューサでよい。また、トランスデューサは、ボイスコイルモータあるいはソレノイド装置などの巻きコイルを有する電磁装置であってもよい。アクチュエータは、超音波ホーンなどの超音波トランスデューサであるのが目下好ましい。適切なホーンとしては、アメリカ合衆国０６４７０−１６１４コネチカット州ニュートン、チャーチ・ヒル５３番に事務所を有するソニックス・アンド・マテリアル・インコーポレーテッドのものが市販されている。これと択一的に、超音波トランスデューサは、圧電ディスクあるいはコンテナに連結されるその他のいかなる種類の超音波トランスデューサを備えていてもよい。ホーン構造は非常に反響し、再現可能で活発な励磁波とホーン先端の大きな動きをもたらすため、超音波ホーンを用いるのが目下好ましい。
【００２４】
図６において既に述べたように、フィルタスタックは、その両端にガスケットを有している。図５に示されるように、カートリッジの中央片２４は、シールリップ９０を有しており、このシールリップに対して、フィルタスタックの一端のガスケットが圧縮される。フィルタスタックの他端のガスケットは、フィルタリング８８によって圧縮され、シールを形成する。ガスケット材料は、シールリップ９０の外側のレリーフに張り出してもよい。シールリップ９０の幅は狭く（通常０.５ｍｍ）、十分な密閉を行うのに余分な力を必要としない。
【００２５】
上記フィルタリング８８は、フィルタスタックとカートリッジガスケット６３の間に保持されている。カートリッジガスケット６３は、中央片２４と底部片２６の間にシールリップ406によって保持されている。したがって、力は底部片２６からガスケット６３を介してフィルタリング８８へ伝わり、最後にフィルタスタックに伝わる。フィルタリング８８は、ガスケット６３と接触する接触リップ404を含んでいる。この接触リップ404は、密閉は行うものの、主要なシールリップではなく、一つの力伝達機構である。接触リップ404の幅はシールリップ９０の幅よりも大きく、撓みおよび密閉作用はフィルタスタックで発生し、カートリッジガスケット６３を圧搾する際には生じないようになっている。また、カートリッジ中央片２４は、フィルタリング８８を取り囲むシールリップ４０６を有している。このシールリップは、フィルタリング８８の存在によって影響を受けることのない有効密閉領域である。このため、シールリップ406とフィルタリング８８上の接触リップ404との間には隙間407がある。この隙間407は、ガスケット６３がシールリップ406と接触リップ404によって圧縮されるときに、隙間407へ突出することができるようにするために備えられている。接触リップ404がシールリップ406と異なる高さになる場合、このシールは、隙間407およびリップ404と406との間の距離により、影響を受けることがない。
【００２６】
図６を再び参照すると、フィルタスタック８７は、試料流体がスタック８７を通過するときに、スタック内のフィルタ９４,97,100のどれも目詰まりさせることなく、細胞やウイルスを捕捉するのに効果的である。(穴の大きさが最も大きい)第１フィルタ９４は、塩の結晶、細胞片、毛髪、組織などの粗粒物質を濾過する。(穴の大きさが中くらいの)第２フィルタ９７は、試料流体中の細胞やウイルスを捕捉する。(穴の大きさが最も小さい)第３フィルタ100は、試料中のさらに小さい細胞やウイルスを捕捉する。したがって、フィルタスタック８７は、フィルタを目詰まりさせずに、大きさが異なる試料成分の同時捕捉を可能にする。第１フィルタ９４の平均的な穴の大きさは、試料流体から粗粒物質(例えば、塩の結晶、細胞片、毛髪、組織)を濾過して取り除くのに十分小さく、かつ、所望の分析物(例えば、核酸やたんぱく質)を含有する目標細胞やウイルスを通過させるのに十分大きくなるように選択される。一般に、第１フィルタ９４の穴の大きさは、約２〜２５μｍの範囲にあるのが望ましく、現在好ましいとされている穴の大きさは約５μｍである。
【００２７】
第２，第３フィルタの平均的な穴の大きさは、所望の分析物を含有する目標細胞あるいはウイルスの平均的な大きさに応じて選択される。例えば、一実施形態では、フィルタスタック８７は、淋疾(ＧＣ)およびクラミジア(Ｃｔ)有機体を捕捉して、試料流体中の疾患の存在を決定するのに用いられる。ＧＣおよびＣｔ有機体は異なる平均直径を有しており、ＧＣ有機体は約１〜２μｍ、Ｃｔ有機体は約０.３μｍである。この実施形態において、第２フィルタ９７は、平均の穴の大きさが約１.２μｍである一方、第３フィルタ100は、平均の穴の大きさが約０.２２μｍであるので、ＧＣ有機体のほとんどは、第２フィルタ９７によって捕捉される一方、Ｃｔ有機体のほとんどは、第３フィルタ100によって捕捉される。したがって、フィルタスタックは、異なる大きさの目標有機体の同時捕捉を可能にし、フィルタを目詰まりさせることなくこれを行う。フィルタ９７,100の穴の大きさは、あらゆる大きさの所望の細胞あるいはウイルスを捕捉するように選択することができ、本発明の範囲は上述の特定の例に限定されるものではない。
【００２８】
また、フィルタスタック８７は、捕捉された細胞あるいはウイルスを破裂させ、細胞内の物質（例えば核酸）を細胞から解放するのに有効である。この点において、第１,第２組のビーズ９６,９９は二つの有益な目的にかなうものである。まず第一に、ビーズは、トランスデューサによって発生させられた圧力波によって攪拌される。ビーズのこの動きは、捕捉された細胞あるいはウイルスを破裂させる。第二に、ビーズは、溶解された細胞あるいはウイルスから放出された核酸をせん断し、核酸のストランド(染色分体)がフィルタを通過して溶解室８６から流出するように、核酸のストランドを十分に短くすることができる。細胞あるいはウイルスを破裂させるのに適したビーズには、ホウケイ酸ガラス、石灰ガラス、シリカ、およびポリスチレンのビーズがある。
【００２９】
ビーズは、多孔でも無孔でもよく、好ましくは１〜200μｍの範囲の平均直径を有している。ビーズ９６,９９の平均直径は、ビーズによって破裂させるべき目的の目標細胞あるいはウイルスに応じて選択される。第１組のビーズ９６の平均直径は、第２組のビーズ９９の平均直径と同一でもよい。これと択一的に、第１組のビーズ９６が、第２組のビーズ９９によって破裂させられるべき種類の細胞あるいはウイルスとは異なる種類の目標細胞あるいはウイルスを破裂させるのに用いられる場合、第１組のビーズ９６の平均直径が第２組のビーズ９９の平均直径とは異なるように、ビーズの平均直径を選択することが有利である。例えば、フィルタスタックが上述のようにＧＣやＣｔ細胞を捕捉するのに用いられる場合、ビーズ９６は、ＧＣ有機体を破裂させるための直径２０μｍのホウケイ酸ガラスビーズであり、ビーズ９９は、Ｃｔ有機体を破裂させるための直径106μｍのソーダ石灰ガラスビーズである。シリコンガスケット９５,９８は夫々、ビーズ９６,９９が移動したり、細胞あるいはウイルスを破裂させるための空間を提供するのに十分な厚さを備えるべきである。
【００３０】
網102は、２つの有用な目的にかなう。第１に、網はフィルタスタック８７を支えている。第２に、網は気泡を破裂させ、泡がフローリブ９１を経て溶解室８６から外へ運ばれるようにする。効果的に気泡を破裂させるため、あるいは気泡の大きさを小さくするために、網102は網目が細かいことが好ましい。網目の平均の大きさが約２５μｍであるポリプロピレンで織られた網であるのが好ましい。気泡が溶解室８６から逃げるのを確実にするために、フィルタスタック８７および溶解室８６を経て液体が(重力に対して)流れ上がる向きでカートリッジを用いるのが望ましい。溶解室８６を通る上向きの流れは、溶解室８６から気泡が出ていくのを助ける。こうして、液体が溶解室８６に入るための入口ポートは、一般に溶解室の最も低い位置にあるべきであり、一方、出口は最も高い位置にあるべきである。
【００３１】
フィルタスタックについて多くの異なる実施形態が可能である。例えば、他の一実施形態において、フィルタスタックは２つのフィルタとこの２つのフィルタの間に１組のビーズを有するだけである。第１のフィルタの網目は最も大きく（例えば５μｍ）、塩の結晶、細胞の破片、毛髪や組織等といった粗い物質を濾過して取り除く。第２のフィルタの網目は第１のフィルタよりも小さくて、捕捉されるべき目的細胞あるいはウィルスよりも僅かに小さい。このようなフィルタスタックは、図３８を参照して後述する。カートリッジの他の実施形態において、(粗い物質の濾過のために)網目の大きさが最大であるフィルタは、溶解室８６の上流に位置するフィルタ室(図示せず)の中に置かれている。一つの流路がフィルタ室を溶解室８６へ接続している。この実施形態では、溶解室内で目的細胞あるいはウィルスを捕えるために、試料流体は最初にフィルタ室内の粗いフィルタを通り、それから溶解室内の第２のフィルタを通る。
【００３２】
さらに、フィルタスタック内のビーズは、目的細胞あるいはウィルスの捕獲を促進するように、試料流体内の目的細胞あるいはウィルスへの結合親和性を有していてもよい。例えば、試料内の目的細胞と結合するために、抗体あるいは或る受容体がビーズの表面に塗られていてもよい。さらに、溶解室８６は、目的細胞あるいはウィルスと相互に作用し合う２つの異なる型のビーズを収容していてもよい。例えば、溶解室は、目的細胞あるいはウィルスと結合するように抗体あるいは受容体で覆われた第１の１組のビーズと、捕捉された細胞あるいはウィルスを破裂させる第２の１組のビーズ(第１の１組のビーズと混合されている)を収容していてもよい。溶解室８６内のビーズもまた、破裂した細胞あるいはウィルスから放たれた細胞内の物質(例えば核酸)との結合親和性を有していてもよい。そのようなビーズは、続く分離および分析のために、目的核酸を分離するのに役立つ。例えば、溶解室はＤＮＡを分離するためにシリカビーズを有していてもよく、ＲＴ−ＰＣＲのための伝達ＲＮＡを分離するために、オリゴｄｔを有するセルローズビーズを収容してもよい。溶解室８６はまた、ＰＣＲを妨げる不要な物質(例えばタンパク質やペプチド)あるいは化学薬品(例えば塩、金属イオン、洗剤)を、試料から除去するビーズを収容してもよい。例えば、溶解室８６はタンパク質を除去するためのイオン交換ビーズを含んでいてもよい。これと択一的に、イミノ二酢酸のような金属イオンキレート化剤を有するビーズは、生物学的試料から金属イオンを除去する。
【００３３】
図２１,図２２は、反応容器４０の概略を示している。図２１は一部破断した容器４０を示し、図２２は容器４０の正面図を示している。容器４０は、反応混合物を収容する(本実施形態ではダイヤモンド形の)反応室４２を備えている。容器４０は、反応混合物に対して出入りする伝熱が最適になり、かつ、反応混合物を効率良く目視できるように設計されている。上記容器の薄い形状は、熱伝導および熱板との接触のための広い面積を提供することによって、最適の熱力学特性に寄与する。さらに、容器の壁は、反応室４２を覗き込む窓を提供し、反応混合物の全体が目視検査できるようになっている。より詳しくは、図２１,図２２の如く反応容器４０は、反応室４２の側壁５７A,５７B,５９A,５９Bを区画する剛な枠４６を有する。この枠４６は、また、反応室４２に入口ポート４１およびこの入口ポートを反応室４３に接続する流路５２を区画する。入口ポート４１と流路５０は、反応室４２に液体を加えるために用いられ、流路５２と出口ポート４３は、反応室４２からの液体の出口として用いられる。アラインメント・プロング４４A,４４Bは、カートリッジの組み立て中に容器４０を正確に位置決めするために用いられる。
【００３４】
図２１に示すように、容器４０は、剛な枠４６の両側に取り付けられて反応室の対向する主壁を形成する薄い柔軟なシートを有する。(図１には、図解の明瞭化のため剛な枠４６から分解された主壁４８が示されている。) かくて、反応室４２は、枠４６の剛な側壁５７A,５７B,５９A,５９Bと、対向する主壁４８とによって区画される。対向する主壁４８は、側壁５７A,５７B,５９A,５９Bが主壁４８を互いに連結するように枠４６の両側に封着される。主壁４８は、反応室４２に収容された反応混合物への最適な熱伝導を促進する。各主壁は、十分に柔軟で、夫々の熱面に合致するように接触して、熱面と反応室４２に収容された反応混合物との間の最適な熱接触および熱伝達を提供する。さらに、柔軟な壁４８は、熱交換作用の経過中の熱的膨張または収縮によって面の形状が変化しても、熱面に合致し続ける。
【００３５】
図２３に示すように、柔軟な壁４８に接触する熱面は、反応室４２を挟むように配置された１対の対向する板190A,190Bによって形成されるのが好ましい。容器４０の反応室４２が板190A,190Bの間に挿入されると、この板の内面は壁４８に接触し、柔軟な壁は板の面に合致する。板は、枠４６の厚さによって定義される反応室４２の厚さＴと等しい距離だけ互いに隔たっているのが好ましい。この位置で、板面と壁４８の間には最小の隙間があるか、あるいは隙間が全くない。板は、種々の熱素子によって加熱および冷却され、後に詳しく述べるように反応室４２内の温度変化を引き起こす。
【００３６】
壁４８は、ポリプロピレン,ポリエチレン,ポリエステル,他のポリマーなどの高分子材料からなる柔軟なフィルムであるのが好ましい。このフィルムは、例えば積層板等のように積層されているか、あるいは均質にすることができる。積層されたフィルムは、均質なフィルムよりも一般に良好な強度と構造上の完全性を有するので、より好ましい。特に、積層されたポリプロピレンフィルムは、ＰＣＲ(ポリメラーゼ・チェーン・リアクション)に対して抑制的でないので、現時点で好ましい。これと択一的に、壁４８は、急速な伝熱を可能にする薄くて柔軟なシートに形成できる他の材料から作ることができる。良好な熱伝導性を得るには、各壁４８の厚さは、好ましくは略0.003〜0.5mm、より好ましくは0.01〜0.15mm、最も好ましくは0.025〜0.08mmである。
【００３７】
再び図２２を参照すると、容器４０は、反応室４２内の反応混合物をその場所で目視検査するための目視窓を有するのが好ましい。好ましい実施形態では、目視窓は、剛な枠４６の側壁５７A,５７Bである。側壁５７A,５７Bは、反応室４２内の反応混合物を側壁５７Aを介して励起でき、かつ、反応室４２から放射される光を側壁Bを介して検出できるように透光性である。矢印Ａは、側壁４２を介して反応室４２に入射する照射光束を示し、矢印Ｂは、側壁５７Bを介して出射する放射光(例えば反応混合物中の標識が付けられた分析対象物から放出される蛍光)を示す。
【００３８】
側壁５７A,５７Bは、互いに角度が偏らせられているのが好ましい。側壁５７A,５７Bは、略９０°の角度だけ互いに偏っているのが一般に好ましい。励起光路と検出光路のなす９０°の角度は、側壁５７Aを介して入射する最少量の励起放射が、側壁５７Bを介して出射することを保証する。さらに、上記９０°の角度は、側壁５７Bを介して捕集されるべき最大量の放射光(例えば蛍光)を可能にする。側壁５７A,５７Bは、反応室４２の底部で「Ｖ」字状の交差をなすように互いに繋がるのが好ましい。これと択一的に、角度をなす側壁５７A,５７Bは、互いに直接繋がる必要はなく、容器の熱的および光学的性能を損なわない他の壁や種々の機械的または流体的特徴部分などの中間部分によって分離されることができる。例えば、側壁５７A,５７Bは、反応室４２に連通する一体化された毛細管電気泳動領域などの他の処理領域に導くポートで繋がることができる。この実施形態では、側壁５７A,５７Bの交差点の下方の枠４６から、位置決めタブ５８が延び出している。タブ５８は、図２８を参照して後述する熱交換モジュールに容器４０を適切に位置付けるために用いられる。
【００３９】
最適な光学的感度は、反応混合物中の標識が付けられた分析対象物を励起する光束および検出される放射光の光路長を、下式で示されるように最大化することによって達成される。
Ｉ0／Ｉi＝Ｃ*Ｌ*Ａ
ここで、Ｉ0はボルトで表示したフォトンなどの放射光の出力照度、Ｃは検出されるべき分析対象物の濃度、Ｉiは入力照度、Ｌは光路長、Ａは分析対象物の標識に用いた染料の固有吸光率である。
【００４０】
本発明の薄くて平坦な反応容器４０は、分析対象物の単位体積当たりの最大の光路長を与えることによって、検出感度を最適化する。図２３,図２７を参照すると、容器４０は、反応室４２の各側壁５７A,５７B,５９A,５９Bの長さＬが１〜１５mm、反応室の幅Ｗが1.4〜２０mm、反応室の厚さＴが0.5〜５mm、反応室の幅Ｗの厚さＴに対する比が２:１であるように構成されるのが好ましいい。これらのパラメータは、反応室を通る平均で１〜１５mmという比較的大きい平均光路長を持ち、しかも内部に収容する反応混合物の非常に急速な加熱と冷却を可能にするに十分薄い容器を提供するので、現時点で好ましい。反応室４２の平均光路長は、側壁５７Aの中央から反応室４２の中心までの距離に、反応室４２の中心から側壁５７Bの中央までの距離を加えた長さである。
【００４１】
より好ましくは、容器４０は、反応室４２の各側壁５７A,５７B,５９A,５９Bが、５〜１２mmの範囲の長さＬと、７〜１７mmの範囲の幅Ｗと、0.5〜２mmの範囲の厚さＴとを有し、反応室の厚さＴに対する幅Ｗの比が、少なくとも４:１である。これらの範囲は、容器を反応室の非常に急速な加熱と冷却を可能にするに十分薄く維持したまま、より長い平均光路長(つまり、５〜１２mm)と１２〜100μlの範囲の体積容量とをもつ容器を提供するので、より好ましい。比較的大きい体積容量は、核酸などの低濃度の分析対象物の検出感度を増加させる。
【００４２】
好ましい実施形態では、反応容器４０は、側壁５７A,５７B,５９A,５９Bで区画されるダイヤモンド形の反応室４２を有し、各側壁は、略１４mmの幅と、枠４６の厚さによって定義される１mmの厚さＴと、略100μlの体積容量とを有する。この反応容器は、反応室４２を通る１０mmという比較的長い平均光路長を提供する。加えて、薄い反応室は、内部に収容する反応混合物の非常に急速な加熱および冷却の少なくともいずれかを可能にする。ダイヤモンド形の反応室４２は、反応室が反応混合物で満たされる際、反応室内での気泡の形成を防ぐ助けをするとともに、反応混合物の目視検査を助ける。
【００４３】
図２２を再び参照すると、枠４６は、側壁５７A,５７Bが透光性になるように、例えばポリカーボネートや透明なポリプロピレンなどの透光性の材料で作るのが好ましい。ここで用いる透光性という用語は、１以上の波長の光が側壁を通ることを意味する。好ましい実施形態では、透光性の側壁５７A,５７Bは、実質上透明である。さらに、透光性の側壁５７A,５７Bの上に１以上の光学要素を設けることができる。光学要素は、例えば、光源によって照射される溶液の全体積を最大化したり、反応室４２の特定の領域に励起光を集光したり、反応室の可能な限り大きい部分からの可能な限り多くの蛍光信号を集めたりできるように設計される。これと択一的な実施形態では、光学要素は、特定の波長を選択する(回折)格子や、特定の波長のみを通すフィルタや、フィルタ機能を果たす色レンズで構成できる。側壁の表面は、特定の波長の吸収を増加させる液晶などの材料で作るか、被覆することができる。この好ましい実施形態では、透光性の側壁５７A,５７Bは、実質上透明で略１mmの厚さをもつ平坦な窓である。
【００４４】
側壁５９A,５９Bは、この側壁５９A,５９Bを経て反応室４２から出ようとする光を内方へ反射する反射面５６を備えるのが好ましい。反射面５６は、隣接する面が略９０°の角度だけ互いに偏らせられて配置されている。さらに、枠４６は、側壁５９A,５９Bと支持リブ５３との間に空き空間を区画する。この空き空間は、枠の材料(例えばプラスチック)と異なる屈折率をもつ周囲空気によって占められている。反射面５６は、上記屈折率の差によって側壁５９A,５９Bを経て反応室から出ようとする光を内方へ効果的に反射し、側壁５７A,５７Bを経る光学信号の検出を増大させる。好ましくは、透光性の側壁５７a,５７Bは、ダイヤモンド形の底部を区画し、逆反射の側壁５９A,５９Bは、反応室の頂部を区画する。
【００４５】
反応容器４０の好ましい製作方法を、図２１,図２２を参照しつつ説明する。反応容器４０は、公知の射出成形技術を用いて剛な枠４６をまず成形することによって作られる。枠４６は、例えば透明なポリプロピレンなどのポリマー材料からなる単一片として成形するのが好ましい。枠４６が作られた後、薄くて柔軟なシートが、所定寸法に切断され、反応室４２の主壁４８を形成するように枠４６の両側に封着される。主壁４８は、例えばポリプロピレンのフィルムなどのポリマー材料を流し込みまたは押し出して作るのが好ましく、このフィルムは、所定寸法に切断され、次の手順を用いて枠４６に取り付けられる。第１のフィルムが、枠４６の片面を覆うように置かれる。枠４６は、フィルムの頂縁を整列させるタックバー４７を持つのが好ましい。フィルムは、タックバー４７から下方の枠４６の下部を完全に覆い、かつ、フィルムの頂縁がタックバー４７に整列するようにして枠４６の下部を覆って置かれる。フィルムは、容易に保持して枠を横切って平坦に引き伸ばせるように、枠４６の下部よりも大きい。次いで、フィルムは、枠を覆うフィルムの部分を枠にクランプし、枠の外周を越えて外方へ延びるフィルム部分を、例えばレーザやダイス型を用いて切除することによって、枠の輪郭に一致する寸法に切断される。そして、フィルムは、好ましくはレーザを用いて枠にタック溶接される。
【００４６】
次に、フィルムは、好ましくはヒートシールによって枠４６に封着される。ヒートシーリングは、接着剤や溶剤接着技術を用いた場合のような潜在的汚染物質が容器に導入されることなく、強力なシールを作ることができるので、本実施形態で用いられる。また、ヒートシーリングは、簡単で安価である。ヒートシーリングは、例えば加熱プラテンを用いて行なわれる。反応室４２を完成すべく枠４６の反対面に第２のシートを切断して封着するために、同じ手順が用いられる。この製造手順には、多くの変形例が可能である。例えば、択一的な実施形態では、フィルムは、枠４６の下部を横切って引き伸ばされて、フィルムを所定寸法に切断する前に枠に封着される。フィルムを枠に封着した後、枠の外周を越えて外方へ伸びるフィルム部分が、たとえばレーザやダイス型を用いて切除される。
【００４７】
本実施形態では、単一片として枠４６をモールド成形したが、枠を複数の片から作ることもできる。例えば、角度をなす光学窓を形成する側壁５７A,５７Bは、良好な透明性をもつポリカーボネートをモールド成形して作る一方、枠の残りの部分は、安価でＰＣＲ(ポリメラーゼ・チェーン・リアクション)と互換性があるポリプロピレンをモールド成形して作ることができる。例えば、側壁５７A,５７Bは、プレス嵌めまたは接着の少なくともいずれかで枠４６の残りの部分に取り付けられる。次いで、柔軟な壁４８は、前述のように枠４６の両側に取り付けられる。
【００４８】
図３を再び参照すると、反応容器４０のポート４１,４３を対応するカートリッジ本体内の流路８０,８１(図４)に封着するために、本実施形態ではガスケット６１を用いている。これと択一的に、ルアー(luer)嵌め、締り嵌め、またはスエージング嵌めを用いて流体シールを行なうこともできる。他の実施形態では、カートリッジ本体と反応容器４０の枠は、単一部材としてモールド成形され、反応容器の主壁は、枠の両側にヒートシールされる。
【００４９】
再び図２２を参照すると、反応室４２は、液体(例えば反応混合物)をポート４１と流路５０を経て反応室４２に強制的に流入させることによって、充填される。液体は、差圧(つまり、液体を入口ポート４１を経て押し込み、あるいは出口ポート４３に真空を加えて液体を吸い出す)を用いて強制的に反応室４２に流入させることができる。液体が反応室４２を充填すると、液体は反応室内の空気と置き換わる。置き換えられる空気は、流路５２とポート４３を経て排出される。反応室４２内の分析対象物を最適に検出するには、反応室は、気泡を含んではならない。反応室４２内に気泡がトラップされるのを防止するため、反応室４２と出口流路５２との間の接続は、反応室４２において(重力に対して)最も高い位置になければならない。これが、反応室４２内の気泡を、トラップされることなく外部へ逃がさせる。従って、容器４０は、図２２に示すように鉛直に向けて用いられるように設計されている。
【００５０】
図２５は、水平に向けて用いられるように設計された他の反応容器206を示している。この反応容器206は、入口ポート４１と、この入口ポート４１を反応室４２の底部に接続する入口流路５０とを有する。上記反応容器は、また、出口ポート４３と、この出口ポート４３を反応室４２の頂部に接続する出口流路５２とを有する。こうして、反応室４２内の気泡は、トラップされることなく総て出口流路５２を経て外部へ逃げる。図２６は、２つの入口ポート４１,４５と１つの出口ポート４３をもつ他の容器207を示している。入口流路５０,５４は、夫々の入口ポート４１,４５を反応室４２に接続し、出口流路５２は、反応室４２を出口ポート４３に接続する。反応容器の多くの異なった実施形態が可能である。各実施形態において、反応室４２を(重力に対して)最も高い点から排気し、反応室内により低い点から液体を導入するのが好ましい。
【００５１】
図１５Ａ,図１５Ｂは、キャリッジに用いられる２種類の弁を示している。図１５Ａに示すように、弁の動作には２種類の基本的概念があり、従って２種類の弁がある。第１の弁は、キャリッジケースの中央片２４に形成された円錐形状つまり円錐状の弁座160を用いている。弁座160は、中央片２４にモールド成形または機械加工された窪みや凹部や穴である。弁座160は、円錐状の弁座160の中心で交差するポートまたは流路157を介して反応室167に連通する。図１５Ｂに示すように、球面をもつ弁アクチュエータ164は、弾性部材６３に押し付けられて弁座160に着座し、膜６３と弁座160との間に円環状の接触を確立する。この運動学的原理は、円錐に着座する球の原理である。膜６３と弁座160とによって形成される円状のシールは、流路157(と従って反応室167)と弁座160の側部から延び出す側流路158との間の流れを防止する。側流路158は、膜６３とカートリッジの中央片２４とによって区画される。
【００５２】
図１５Ａに示すように、他の種類の弁は、流路158と、膜６３とカートリッジの中央片２４との間に形成される他の側流路159との間の流れを制御する。この場合、円環状の接触は、有効ではない。その代わりに、第２の弁は、カートリッジの中央片２４に形成された窪みや凹部や穴161で構成される。穴161は、流路158と159を互いに分離する。流路158の端部は、穴161の一方の側に配置され、流路159の端部は、穴161の他方の側に配置される。穴161は、流路158の端部近傍に位置する第１曲面162Aと、流路159の端部近傍に位置する第２の曲面162Bと、第１,第２の曲面162A,162Bの間の第３の面162とによって区画される。図１５Ｂに示すように、曲面は、流路158と流路159との間の流れをシールするための膜６３の基本的接触領域である２つの弁座を備えている。この運動学的原理は、3つの接触点で支えられる球(または弁アクチュエータの球状の端部)と、アクチュエータに働く上向きの力と、２つの弁座162A,162Bとの原理である。
【００５３】
図１６Ａに示すように、第１の曲面162Aと第２の曲面162Bは、好ましくは同心の球面である。弁アクチュエータ164も、膜６３を曲面162A, 曲面162Bに密に押し付ける球面を有する。さらに、各曲面162A,162Bは、弁アクチュエータ164の曲率半径Ｒ２に膜６３の厚さＴを加えた組み合わせ半径に等しい曲率半径Ｒ１を有するのが好ましい。例えば、弁アクチュエータ164の曲面の曲率半径Ｒ２が0.094インチで、膜６３の厚さＴが0.094インチであれば、各曲面162A,162Bの曲率半径は、0.125インチである。一般に、弁座の寸法と曲率半径は、カートリッジ内の流路の寸法に依存する。弁は、流路を効果的にシールするに十分な大きさであって、カートリッジ内の無駄な空間を最小化するように作られるのが好ましい。
【００５４】
図１６Ｂに示すように、第３の面163は、膜６３が第１,第２の面162A,162Bに押し付けられるとき、膜６３と第３の面163との間に隙間166が生じるように第１,第２の面から窪ませて作られている。換言すれば、第１の面162Aと第２の面162Bは、第３の面163から上昇または隆起させれられている。隙間166は、膜６３によって最大の圧力が弁座162A,162Bに加わるように、膜６３が凹部161の全面でなく、弁座162A,162Bに基本的に接触することを保証する。これによって、最小のアクチュエータ力でもって非常に強いシールが提供される。
【００５５】
再び図１５Ｂを参照すると、両方の種類の弁において、夫々の運動学的原理が、嵌合する部材の位置を定義する。円錐内の球の概念および２つの球面と接触する球の概念のいずれにおいても、球または球状に形成された弁アクチュエータは、弁座に押し付けられるとき、それ自身の位置を実現しようとすることが可能になる。弁アクチュエータとキャリッジの底部片２６内の穴との間には、弁座の作用のみが嵌合片の位置を決めるようにアクチュエータが移動するような熟考された隙間(例えば0.01〜0.03インチ)がある。
【００５６】
弁アクチュエータは、種々の機構によって制御できる。図１７〜図１９は、このような機構を示している。図１７に示すように、弁アクチュエータ172は、ガスケット６３を弁座に押し込むような球面を有する。アクチュエータ172は、下部にフランジ177も有する。カートリッジは、カートリッジの底部片２６の出っ張りに当接して弁アクチュエータをガスケット６３に向けて付勢するばねなどの弾性体を備える。ばね174は、熟考された力がアクチュエータ172を押し下げるように働かない限り、十分に強力で弁を閉じる。キャリッジ内の弁は、キャリッジの使用前の運送や保管のために、このようにして閉状態に維持される。こうして、キャリッジは、試料液を分析するための必要な試薬と洗剤が予め製造中に充填され、これらの充填液体が運送や保管中に漏れ出すことがない。
【００５７】
アクチュエータを押し下げる機構は、通常、試料分析のためにキャリッジが置かれる装置内に設けられる(このような装置の１つは、図１０を参照して詳しく後述する)。押し下げ機構は、アクチュエータ172のフランジ177を収容する顎部181をもつ枢着された押し下げ部材180を回転させるスライドガイド175で構成される。図１８に示すように、スライドガイド175は、枢着された押し下げ部材180を、フランジ177が顎部181内に位置するまで回転させる。図１９に示すように、ソレノイド146は、押し下げ部材180、従って弁アクチュエータ172を押し下げ、その結果、ガスケット６３が弁座から開放され、弁が開き、流路170と流路171間に液体が流れる。
【００５８】
図２０は、カートリッジ内の試料室、洗剤室、中和室、および試薬室に対して流体が制御されて流入および流出する様子を示している。これらの各室は、図２０の室414で示されるように、ガスは通すが液体は通さない疎水性の膜410で覆われている。疎水性の膜410は、室414と圧力ポート３２の間に位置付けられている。圧力ポート３２は、カートリッジの頂部片２２内に設けられ、室414の上に位置する。膜410は、キャリッジの運送や保管中に、仮にキャリッジが倒立したとしても、室414内に液体を保持する。圧力ポート３２は、圧力ノズル812を収容するような寸法になっており、上記圧力ノズルは、通常外部の装置に設けられる圧力源(例えば真空ポンプまたは空気圧ポンプ)に接続される。ノズル182は、Ｏリング184とフランジ415とを有する。ばね185は、フランジ415に当接してノズル182を圧力ポート３２に押し付け、Ｏリング184が圧力ポート３２の周りのシールを確立する。運転において、正の空気圧または真空が、圧力ポート３２を介して室414に加えられ、室414に対して液体を強制的に流入または流出させる。
【００５９】
円錐状の弁座160(図１５Ａ,図１５Ｂを参照して既に述べた)は、室414と接続流路411との間の液体の流れを制御すべく室414の下方のカートリッジの中央片２４内に設けられている。弁は、フランジ187と、このフランジに当接して、アクチュエータ186に下向きの力が加わるまで弁を閉状態に保持するばね188とをもつ弁アクチュエータ188によって、開閉される。下向きの力は、弁を開くべくアクチュエータ186を押し下げるソレノイドによって加えられるのが好ましい。弁アクチュエータ186とソレノイドは、前述の装置に設けられる。
【００６０】
図７,図８は、カートリッジの上面図と底面図を夫々示している。図９は、は、カートリッジの概略ブロック図である。図７〜図９のいずれにも示されるように、カートリッジは、カートリッジに流体試料を加えるポートをもつ試料室６５と、この試料室６５から延び出す試料流路とを有する。試料流路は、試料室６５から延び出して、弁107を経て流路106に入る。流路106は、センサ域を有し、センサ域の流路106は、流路内に液体が存在することを容易に目視検出できる平坦な底部を有する。試料流路は、流路106から溶解室８６に入ってフィルタスタック８７を通る。試料流路は、流体が溶解室８６から出る流路109と、平坦な底部の検出域137をもつ流路110と、弁111と、弁114を経て通気孔をあけた廃液室６８に導く流路112とを有する。
【００６１】
カートリッジは、また、洗剤溶液を保持する洗剤室６６と、リジン試薬を保持する試薬室６７とを有する。洗剤室６６は、弁115、流路117および流路106を経て溶解室８６に接続される。試薬室６７は、弁119、流路117および流路106を経て溶解室８６に接続される。試料成分(例えば、試料中の細胞またはウィルス)は、フィルタスタック８７に捕捉され、溶解室８６内で溶解されて試料成分から目標の分析対象物(例えば、核酸)が解き放たれる。カートリッジは、また、溶解室８６から延び出して化学反応と光学的検出のための反応容器４０へ、流体試料から分離された分析対象物を運ぶための分析対象物流路を有する。分析対象物流路は、溶解室８６から延び出して、流路109、流路110および弁111を通る。分析対象物流路は、弁111を通った後、試料流路から分岐する。試料流路は、流路112を経て廃液室６８に入る一方、分析対象物流路は、Ｕ字状流路122へ分岐する。次いで、分析対象物流路は、弁124を経て中和室７０に流入した後、流出する。また、分析対象物流路は、弁126を経て主混合室７１に流入した後、流出する。分析対象物流路は、主混合室７１から流路122に沿って延び、弁127と流路８０とポート４１とを経て反応容器４０に入る。
【００６２】
反応容器４０は、この反応容器に反応混合物を加えるためのポート４１と、この反応容器から流体(例えば、空気または過剰な反応混合物)を出すためのポート４３とを有する。カートリッジは、ポート４３と連通する流路８１を有する。流路８１は、この流路に液体が存在することを検出するための平坦な底部の検出域130を有する。流路８１は、流路131(流路131は、図７の上面図の紙面と垂直方向に真直ぐ下方へ延びる)に接続される。流路131は、流路132に接続され、流路132は、弁133を介して流路134(流路134は、図７の上面図の紙面と垂直方向に真直ぐ上方へ延びる)に接続される。流路134は、カートリッジからガスは逃がすが、液体は逃がさない疎水性の膜を有するベント３６に繋がる。反応容器４０の下流に位置する上記流路、ベントおよび弁は、操作の節で後述するように、反応容器の反応室４２を加圧するために用いられる。
【００６３】
カートリッジは、また、試料室６５の上方に位置する第１圧力ポート105と、洗剤室６６の上方に位置する第２圧力ポート116と、試薬室６７の上方に位置する第３圧力ポート118と、中和室７０の上方に位置する第４圧力ポート123と、主混合室７１の上方に位置する第５圧力ポート125と、Ｕ字状流路122の上方に位置する第６圧力ポート128とを有する。カートリッジは、廃液室６８と連通するセンサ室120,121を更に有する。センサ室120,121は、後に詳述するように、廃液室６８に予め定められた体積の液体が収容されたとき、表示を行なう。
【００６４】
図１０を参照すると、カートリッジは、１以上のカートリッジを収容するように設計された装置140と組み合わせて用いるのが好ましい。図解を明瞭化するた、図１０に示された装置140は、カートリッジを１つだけ収容するものである。しかし、上記装置は、複数のカートリッジを同時に処理するように設計できるものと解釈されなければならない。装置140は、処理のためにカートリッジが入れられるカートリッジネストを有する。装置140は、カートリッジの溶解室内に圧力波を発生させるトランスデューサ９２(例えば、超音波ホーン)と、カートリッジ内の９つの弁を動かす９つの弁アクチュエータ142と、弁アクチュエータを押し下げる対応する９つのソレノイド146と、キャリッジ内に形成された対応する６つの圧力ポートに接続するための６つの圧力ノズル145とを有する。更に、上記装置は、圧力ノズル145を経てカートリッジに圧力を供給する１以上の調整された圧力源に接続されるか、この圧力源を有する。適切な圧力源は、油差しポンプ、圧縮空気源、空気圧ポンプまたは外部圧力源への接続手段を有する。上記装置は、３つのスロット付き光学センサ143と、３つの反射型光学センサ144とを有する。
【００６５】
図１３は、センサ室120,121および試薬室６７内の液体を検出するために設けられたスロット付き光学センサ143を示している。各センサ143は、組み込みＬＥＤ(発光ダイオード)と、上記センサの反対側に配置されたホトダイオードとを有する。ＬＥＤは、光束を放射し、この光束は、実質上屈折させられないなら、ホトダイオードによって検出される。このようなスロット付き光学センサは、幾つかのメーカによって市販されている。カートリッジは、スロット付き光学センサが室67,120,121の周りに適合するような形状になっている。各センサの操作は、次のとおりである。センサが取り囲む室内に液体が存在しないなら、ＬＥＤからの光束は、室内の空気によって実質上屈折され、室の内壁で曲がって、あるとしても微弱な信号だけがホトダイオードによって検出される。なぜなら、空気は、プラスッチク製のカートリッジの屈折率とかけ離れた屈折率を持つからである。しかし、室内に液体が存在すると、ＬＥＤからの光束は、僅かあるいは全く屈折されず、ホトダイオードで検出される非常に強い信号が発生される。なぜなら、液体は、プラスチック製のカートリッジの屈折率に近似した屈折率を持つからである。従って、光学センサ143は、室67,120,121に液体が存在するか否かを決めるのに有用である。
【００６６】
図１４は、廃液室６８に連通し、スロット付き光学センサ143によって囲まれたセンサ室120の概略破断側面図を示している。センサ室120とセンサ143は、予め定められた体積の液体が廃液室６８に存在するとき、これを表示するために用いられる。センサ室120は、溢水リム152をもつ壁151によって廃液室６８から部分的に分離されている。上記壁の高さは、予め定められた体積の液体が廃液室６８に収容されたとき、この液体が溢水リム152を越えてセンサ室120に流れ込むように選ばれている。そして、センサ室120内の液体は、センサ143によって検出される。
【００６７】
再び図１３を参照すると、キャリッジは、廃液室６８に連通する第２センサ室121を有する。第２センサ室121も、溢水リムをもつ壁153によって廃液室６８から分離されている。壁153は、壁152よりも高くて、予め定められた第１の体積の流体に加えて予め定められた第２の体積の流体が廃液室６８に収容されるまで、流体が壁153を越えて溢れないようになっている。センサ室120,121と光学センサ143は、カートリッジの操作を制御するのに役立つ。壁152の高さは、試料室６５からの所定体積の試料流体が試料流路を経て廃液室６８に流入したとき、試料流体がセンサ室120に溢れ出して検出されるように選ばれるのが好ましい。センサ室120での試料流体の検出は、洗剤室６６からの洗剤溶液の放出を引き起こし、この洗剤溶液は、試料流路を経て廃液室６８に流れ込む。廃液室６８に収容される洗剤溶液の体積が増加すると、流体は壁153を越えてセンサ室121に流れ込んで、検出される。センサ室121で液体が検出されると、試薬室６７からのリジン試薬の放出が引き起こされる。試薬室６７を取り囲むセンサ143が、試薬室６７が空であることを表示すると、超音波による溶解(溶菌)の開始が引き起こされる。これと択一的実施形態では、カートリッジは、試料用と洗剤用の２つの廃液室を有し、各廃液室は、それに接続された夫々のセンサ室を有する。
【００６８】
インラインの反射型光学センサ144は、流路81,106,110の底部が平坦な検出域130,136,137内の液体の有無を決定するのに用いられる(図７)。各センサ144は、組み込まれたエミッタと、平坦な底部の検出域の上方に配置された検出器とを有する。エミッタは、光束を放出し、この光束は、カートリッジで反射されて検出器で検出される。センサは、空気／液体の境界が検出域を通過するとき、信号の変化を検出する。オプションとして、検出操作をより信頼性あるものにするため、２重エミッタの反射型光学センサを用いることができる。上記２種の反射型光学センサは、この技術分野で周知であり、市販されている。
【００６９】
再び図１０を参照すると、装置140は、カートリッジの反応容器を収容するためのスロット148をもつ熱交換モジュール147を有する。この熱交換モジュール147は、図２８を参照して詳しく後述する。上記装置140は、カートリッジの上方の蓋150をラッチするラッチ機構149を有する。カートリッジネスト141は、カートリッジの脚を収容する整列穴401を有する。整列穴401は、ネスト内にカートリッジを適切に位置決めすることを保証し、その結果、圧力ノズル145、トランスデューサ９２および弁アクチュエータ142は、キャリッジ内の対応するポートに嵌合し、反応容器は、スロット148に嵌合する。トランスデューサ９２は、カートリッジがネスト141に入れられるとき、図５の破断図に示すように、溶解室８６の底壁に接触するように装置140内に位置決めされなければならない。さらに、上記装置は、トランスデューサ９２を溶解室８６の壁に当接するように付勢するばねなどの機構を有する。
【００７０】
装置140は、ソレノイド146、トランスデューサ９２、熱交換モジュール147および光学センサ143,144の操作を制御するマイクロコントローラをもつ主論理ボードを含む図１０に図示しない種々の慣用の装備を備える。上記装置は、この装置およびノズル145を経て空気圧を供給する空気圧ポンプに電力を供給する電源を備えるか、あるいは電源に接続される。装置140は、例えば操作の節で後述する機能を実行するべくプログラムされたマイクロコントローラなどを用いてコンピュータ制御されるのが好ましい。これと択一的に、上記装置は、分離したコンピュータまたは分離したコンピュータとオンボードのマイクロコントローラの組み合わせによって制御してもよい。
【００７１】
図１１は、装置140に処理のために載せられたカートリッジ２０の等角投影図を示している。図１１は、蓋150を開いた状態での装置140の部分破断図を示している。再び図１１を参照すると、メモリまたはマイクロプロセッサのチップが、カートリッジ２０の一部としてオプションで一体化される。上記チップは、カートリッジの種類などの情報、カートリッジを処理するための特定のプロトコルなどのプログラム情報、出し入れのための公差、クオリティ・トッラキングのための通し番号とロットコードおよび処理の結果を格納するための手段を有するのが好ましい。カートリッジ２０に一体化された電子的メモリは、流体処理の種々のプロトコルに対して装置140を迅速、容易、かつエラーなくセットアップすることができる。カートリッジ２０が装置140に挿入されると、この装置は、カートリッジ上のメモリに電子的に呼びかけて、挿入されたカートリッジについて実行されるべき流体処理のタイムシーケンスを制御するための適切な指令の組を自動的に受け取る。上記装置140は、単にカートリッジのメモリ中の各ステップを順に検索して実行するか、ユーザが例えばコントローラコンピュータを用いてシーケンスを編集できるように、メモリ中の内容をダウンロードする。
【００７２】
カートリッジ上に、書込み可能なメモリ(例えば、紫外線消去型ＰＲＯＭ(ＥＰＲＯＭ)や電気的消去型ＰＲＯＭ(ＥＥＰＲＯＭ))などの適切なメモリが含まれるなら、カートリッジに導入された試料に基づく中間および最終結果は、処理後の物理的試料と一緒に設けられた格納手段であるカートリッジのメモリに、上記装置によって書き込むことができる。このことは、試料と結果を保管することが必要な法医学などの適用例において、特に有利である。さらに、他の情報は、変更できない(または変更できる)形式でカートリッジのメモリに格納することができる。例えば、カートリッジの通し番号、製造ロット情報および関連する情報は、予めプログラムして変更不可にできる。ユーザのデータ、技術的な識別番号、試験日、試験場所および装置の通し番号は、変更できないようにカートリッジに書き込むことができる。このことは、試料を取り扱う際に「管理の鎖」による識別の容易化を可能にする。データ格納の分野の専門技術者は、電子的メモリ手段以外の光学的にアドレス付けられた印刷された領域(例えば、インクジェットや熱的)や磁気テープなどのメモリ手段を想起するであろう。
【００７３】
図２８は、反応混合物中の分析対象物を熱処理し、光学的に検出するために反応容器４０が挿入される上記装置の熱交換モジュールを示している。この熱交換モジュール147は、モジュールの種々の構成要素を保持するハウジング208を備えるのが好ましい。上記モジュール147は、前述の熱板190を有する。ハウジング208は、反応容器４０の反応室がスロットを経て上記熱板の間に挿入できるように、熱板190の上方に(図２８に図示しない)スロットを有する。熱交換モジュール147は、好ましくはファン212などの冷却システムを有する。ファン212は、熱板、従って反応容器内の反応混合物を冷却すべく、熱板190の表面を通り越して冷却空気を送るような位置に設けられている。ハウジング208は、冷却空気を熱板190を越えてモジュール147の外へ向かわせる流路を区画するのが好ましい。
【００７４】
熱交換モジュール147は、光学的な励起アセンブリ216と、反応容器４０に収容された反応混合物を光学的に検査する光学的検査アセンブリ218とを更に有する。励起アセンブリ216は、その電子構成部材を保持するための第１回路板220を有し、光学的検査アセンブリ218は、その電子構成部材を保持する第２回路板222を有する。励起アセンブリ216は、反応容器中の蛍光的に標識付けされた分析対象物を励起するための１以上の光源(例えば、ＬＥＤ、レーザまたは電球)を有する。励起アセンブリ216は、光源からの光を平行にする１以上のレンズと、関係する励起波長領域を選択するフィルタとを有する。検出アセンブリ218は、反応容器４０から放出される光を検出する１以上の検出器(例えば、ホトダイオード、光電子増幅管またはＣＣＤ)を有する。検出アセンブリ218は、放出光を集光し、平行にする１以上のレンズと、関係する放出波長領域を選択するフィルタとを有する。熱交換モジュール147で用いられる適切な光学的励起アセンブリと光学的検出アセンブリは、1999年11月25日に公開された国際公開WO 99/60380号公報(国際出願番号PCT/US99/11182号)に開示され、その開示内容は、参考のため本願明細書に一体化されている。
【００７５】
光学アセンブリ216,218は、反応容器４０の反応室が熱板190板の間に挿入されたとき、励起アセンブリ216が、透光性の側壁５７A(図２２参照)を介して反応室４２と光学的に連通し、検出アセンブリが、透光性の側壁５７B(図２２参照)を介して上記反応室と光学的に連通するように、ハウジング208内に配置されている。好ましい実施形態では、光学アセンブリ216,218は、反応容器の反応室が熱板の間に挿入されたとき、光学アセンブリ216,218が側壁に直接接触するか、側壁に極接近するように、光学アセンブリ216,218を単に熱板190の底部縁に隣接して配置することによって、透光性の側壁と光学的に連通せしめられる。
【００７６】
図３４は、熱板190A,190Bの間に挿入された反応容器の反応室の部分破断等角投影図を示している(反応容器の頂部は切除されている)。反応容器は、透光性の側壁５７A,５７Bで形成された角度をなす(例えば三角形の)底部を有する。各熱板190A,190Bは、対応する形状の底部を有する。第１熱板190Aの底部は、第１底部縁250Aと第２底部縁250Bを有する。同様に、第２熱板190Bの底部は、第１底部縁252Aと第２底部縁252Bを有する。各熱板の第１および第２底部縁は、側壁５７A,５７Bが互いに偏る角度(例えば、９０°)と同じ角度だけ互いに偏っているのが好ましい。さらに、熱板190A,190Bは、反応容器の反応室を挟んで収容するように配置されるのが好ましく、その結果、第１側壁５７Aが実質上各第１底部縁250A,250Bの近傍にこれと平行に位置し、第２側壁５７Bが実質上各第２底部縁252A,252Bの近傍にこれと平行に位置する。この配置は、透光性の側壁５７A,５７B、従って反応容器の反応室への容易な光学的アクセスを提供する。各光学アセンブリと側壁５７A,５７Bの間の光学的連絡を確立または改善するため、ゲルまたは流体がオプションとして用いられる。上記ゲルまたは流体は、結合される要素の屈折率に近い屈折率を有さなければならない。
【００７７】
再び図２８を参照すると、光学アセンブリ216,218は、励起光路と検出光路との間に９０°の角度を与えるように配置されるのが好ましい。励起光路と検出光路の間の９０°の角度は、反応室の第１側壁を経て入射する最少量の励起放射が、第２側壁を経て出射することを保証する。上記９０°の角度は、また、第２側壁を経て集光されるべき最大量の放出放射を可能にする。好ましい実施形態では、反応容器４０は、光学的検出のための反応容器４０の適切な位置決めを保証すべく、光学アセンブリ216,218の間に形成されたスロットに嵌合する位置決めタブ５８(図２２参照)を有する。検出を改善するため、熱交換モジュール147は、反応容器４０の頂部を覆って設けられ、反応容器が熱板190の間に挿入された後にハウジング208を遮光する遮光蓋(図示せず)を有する。
【００７８】
本実施形態では、光学アセンブリ216,218を熱板190の底部縁に隣接して設けたが、他の配置も可能である。例えば、光学アセンブリ216,218と反応容器の側壁との間の光学的連絡は、光ファイバ、光パイプ、導波部材などの装置によって確立できる。これらの装置の１つ利点は、光学アセンブリ216,218を熱板190の物理的近傍に設ける必要がなくなることである。このことは、熱板の周りにより多くの空間を残し、この空間に冷却空気や冷媒を循環させて、冷却を改善することができる。
【００７９】
熱交換モジュール147は、このモジュールの電子構成部材を保持するＰＣボード226と、このモジュール147を装置140(図１０)に接続するエッジコネクタ224とを有する。熱板190上の加熱要素および温度センサと光学ボード220,222は、フレキシブルケーブル(図解の明瞭化のため図２８には図示せず)によってＰＣボード226に接続される。熱交換モジュール147は、光学的検出回路をシールドするための接地トレース228を有する。熱交換モジュール147には、「加熱」、「冷却」、「完了」、「故障」などのモジュールの現在の状況をユーザに表示するＬＥＤなどの表示器をオプションで設けることができる。
【００８０】
ハウジング208は、剛で高性能なプラスチックまたは他の慣用の材料からモールド成形で作ることができる。ハウジング208の主たる機能は、熱板190、光学アセンブリ216,218、ファン212およびＰＣボード226を保持するための枠を提供することである。ハウジング208は、ファン212からの冷却空気を熱板190の表面を横切ってハウジングの外へ向かわせる流路とポートを有するのが好ましい。好ましい実施形態では、ハウジング208は、互いに嵌合することによって熱交換モジュール147の構成部材を挟んで囲む相補的部材片(図２８の概略側面図には一方の部材片のみが示されている)を有する。
【００８１】
図２３を再び参照すると、熱板190A,190Bは、セラミックや金属を含む種々の熱伝導性材料で作ることができる。適切なセラミック材料は、窒化アルミニウム、酸化アルミニウム、酸化ベリリウムおよび窒化シリコンである。上記熱板を作ることができる他の材料は、例えば、砒化ガリウム、シリコン、窒化シリコン、酸化シリコン、水晶、ガラス、ダイヤモンド、ポリアクリル酸、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーおよびポリテトラフルオロエチレンなどのハロゲン化ビニルポリマーである。熱板の他の可能な材料は、クロム／アルミニウム、スーパーアロイ(耐熱合金)、亜鉛合金、アルミニウム、鋼、金、銀、銅、タングステン、モリブデン、タンタル、真鍮、サファイアあるいはこれ以外の当分野で利用できる種々のセラミック、金属またはポリマー材料である。
【００８２】
本実施形態では、内面が非常に高い平滑度に都合良く加工できて高い耐摩耗性が得られ、高い耐薬品性と反応容器の柔軟な壁への良好な熱伝導性が得られることから、セラミック板が用いられている。セラミック板は、好ましくは略0.6〜1.3mmと非常に薄くすることができて、熱容量の低減によって非常に急速な温度変化を与えることができる。セラミックで作られた板は、良好な熱伝導体、かつ電気絶縁体であるので、板の温度は、この板に接続した抵抗加熱要素によって良好に制御することができる。
【００８３】
種々の熱素子を熱板190A,190Bの加熱または冷却に用いることができ、従って反応室４２内の反応混合物の温度を制御するここができる。一般に、板の加熱に適した素子は、導熱ヒータ、対流ヒータまたは放射ヒータである。導熱ヒータの例は、板に連結された抵抗加熱素子または誘導加熱素子である。適切な対流ヒータは、強制送風ヒータまたは板を貫流する流体用の流体熱交換器である。適切な放射ヒータは、赤外線ヒータまたはマイクロ波ヒータである。同様に、板を冷却するために種々の冷却素子を用いることができる。例えば、ファン、ぺルチェ素子、冷凍装置または板の表面を貫流する冷却流体用のジェットノズルである。これと択一的に、例えば板に直接接触する冷却された金属ブロックなどのヒートシンク等種々の熱伝導性の冷却要素を用いることができる。
【００８４】
図２４を参照すると、各板190は、外表面に配置された抵抗加熱要素206を有しているのが好まい。抵抗加熱要素206は、厚いか、または薄いフィルムであり、各板190、特に窒化アルミニウムまたは酸化アルミニウムのようなセラミック材料からなる板上に直接スクリーン印刷される。スクリーン印刷は、高い信頼性と、反応室内の熱を効率的に伝達するための小さな断面積とを有する。より均一な加熱を提供するため、例えば先端部で密に、中間部で疎に抵抗器を配置することによって、幾何学的なパターンを変えた厚いか、あるいは薄いフィルム抵抗器が、板の外側面に積層される。加熱要素を各板の外表面に積層するのが現在好ましいが、これと択一的に、特に板がセラミックの場合、加熱要素は、各板の内側に設けることができる。加熱要素206は、金属,タングステン,ポリシリコン, または電位差が加えられると、熱せられる他の材料で作ることができる。加熱要素206は、夫々の接点204と接続されている２つの端部を有しており、この接点204は、加熱要素に通電すべく電圧源(図２４に示さない)に接続される。各板190は、また熱電対,サーミスタ,またはＲＴＤのような温度センサ192を有するのが望ましく、この温度センサ192は、２つのトレース202によって夫々接点204に接続されている。温度センサ192は、制御された帰還ループで板190の温度を監視するのに使われる。
【００８５】
上記板は、板の迅速な加熱や冷却を可能にすべく小さい熱容量を有する。特に、各板は、５Ｊ/℃以下、好ましくは３Ｊ/℃以下、最も好ましくは１Ｊ/℃以下の熱容量を有する。本明細書で使われているように、板の熱容量という用語は、板の質量と板の比熱の積として定義される。加えて、各板は、反応室の各主壁を覆うのに充分な大きさであるべきである。目下の好ましい実施形態では、各板は、例えば２mm〜２２mmの範囲の幅Ｘと、２mm〜２２mmの範囲の長さＹと、0.5mm〜５mmの範囲の厚さを有する。各板の幅Ｘと長さＹは、反応室の幅と長さより僅かに大きく選ばれている。さらに、各板は、図３４を参照して前述したように、反応室の底部の外形に適合する角度をなす底部を有することが好ましい。また、好ましい実施形態では、各板は、0.75Ｊ/ｇ℃の比熱を有する窒化アルミニウムで作られる。各板の質量は、0.005ｇから5.0ｇの範囲にあるのが好ましく、その結果、各板は、0.00375Ｊ/℃〜3.75Ｊ/℃の範囲の熱容量を有する。
【００８６】
対向する板190は、反応室の柔軟な主壁が板の内面に接触して一致するように反応容器４０の反応室を挟み込んで収容するように配置される。板190は、例えば、ブラケット,支持具,または保持具を用いることによって、お互いに対向して保持されることが目下好まれている。これと択一的に、板190は、国際公開第ＷＯ９８/３８４８７号で述べられているように、互いに近づくようにばねで付勢してもよく、上記国際公開の開示内容は、本明細書に参考として組み込まれている。本発明の他の実施形態では、板の１つは、固定位置に保持され、この一番目の板に向けて、二番目の板が付勢されている。もし、１以上のばねが板を互いに近づくように付勢するのに使われるなら、ばねは、壁が板の内面に一致せしめられるように充分な力で、板が容器の柔軟な壁に押し付けられることを保証するような充分な硬さであるべきである。
【００８７】
図２９と図３０は、互いに対向して板190A,190Bを保持するための好ましい支持構造209を示している。図２９は、支持構造の分解図を示し、図３０は、支持構造の組立図を示している。図の明瞭化のために、支持構造209および板190A,190Bは、図２８の熱交換モジュールでの正常な方向づけを逆にした状態で示されている。図２９を参照すると、支持構造209は、内部に形成されたスロット148を有する取付板210を有する。スロット148は、反応容器の反応室が挿入できるくらいの充分な大きさである。間隔支柱230A,230Bは、スロット148の両側で取付板210から延び出ている。間隔支柱230Aは、その対向する両面に形成された窪み232(図２９の等角投影図では片側のみが見える)を有し、間隔支柱Ｂは、その対向する両面に形成された窪み234(図２９の等角投影図では片側のみが見える)を有している。間隔支柱での窪み232,234は、板190A,190Bの端部を収容するためにある。上記構造を組み立てるために、板190A,190Bは、板の縁が窪み232,234内に位置するように間隔支柱230A,230Bの両側に置かれている。そのとき、板の縁は、適切な保持手段を用いて窪み内に保持される。好ましい実施形態では、板は保持クリップ236A,236Bによって保持される。これと択一的に、板190A,190Bは、接着剤,ねじ,ボルト,クランプ,または他の適切な手段によって保持することができる。
【００８８】
取付板210および間隔支柱230A,230Bは、全体的にプラスチックの単一のモールド成形片として作るのが好ましい。上記プラスチックは、板190A,190Bが熱せられたとき、溶けて変形しないポリエチルイミドのような高温プラスチックであるべきである。保持クリップ230A,230Bは、ステンレス鋼であることが好ましい。取付板210は、各可撓ケーブル238A,238Bを支持するための窪み240A,240Bをオプションで備えてもよく、上記可撓ケーブル238A,238Bは、加熱要素および板190A,190B上に配置された温度センサを熱交換モジュール147(図２８)のＰＣ板226に接続している。板190A近傍の柔軟なケーブル238Aの部分は、一片のテープ242Aによって、窪み240A内に保持され、板190B近傍の柔軟なケーブル238Bの部分は、一片のテープ242Bによって、窪み240B内に保持される。
【００８９】
図３１は、組み立てられた支持構造209の等角投影図である。取付板210は、その両面から延び出し、熱交換モジュールのハウジングに支持構造209を固定するためのタブ246を有するのが好ましい。図２８を再び参照すると、ハウジング208は、取付板210を所定位置に確実に保持すべく上記タブを保持するためにスロットを含むのが好ましい。これと択一的に、取付板210は、例えば、接着剤,ねじ,ボルト,クランプ、または他の適切な手段を使ってハウジング208に取り付けることができる。
【００９０】
図２９を再び参照すると、支持構造209は、板190A,190Bの内面が互いに非常に僅かな角度で傾くように、板190A,190Bを支持することが好ましい。好ましい実施形態では、間隔支柱230A,230Bは、板190A,190Bが壁の対向する側に押し付けられるとき、板の内面が互いに僅かに傾くようになる僅かに先細になった壁244を有する。図２３で最も良く示されているように、板190A,190Bの内面は、室４２が挿入される僅かにＶ字形状となるスロットを形成すべく、互いに傾いている。内面が互いに傾いている量は、非常に僅かであり、平行から略１°傾けられるのが好ましい。両内面は、板190A,190Bの間に反応室４２が挿入される前に、板の底部が板の頂部よりも互いに僅かに近づいているように傾けられる。この内面の僅かな傾きは、反応容器の反応室４２を板の間に一層簡単に挿入し、板の間から反応容器の反応室４２を一層簡単に抜き取ることを可能にする。これと択一的に、板190A,190Bの内面は、互いに平行にすることもできるが、このとき反応容器４０の挿入および抜き取りは一層難しくなる。
【００９１】
加えて、板190A,190Bの内面は、枠４６の厚さと同じ距離だけ互いに隔たるのが好ましい。内面が互いに傾けられる実施形態では、内面の中心は、枠４６の厚さと同じ距離だけ互に隔てられ、板の底部は、最初は枠４６の厚さよりも僅かに小さい距離だけ隔てられるのが好ましい。室４２が、板190A,190Bの間に挿入されたとき、剛枠４６は、反応室４２が板の間に強固に挟まれるように、板の底部を互いに離間するように強制する。板190A,190Bが枠４６によって、互いに離間させられる距離は非常に小さく、例えば、枠の厚さが１mmであって内面が互いに１°傾いているならば、略0.035mmである。
【００９２】
図３０を再び参照すると、保持クリップ236A,236Bは、板190A,190Bのこの僅かな外側への移動を許容すべく充分柔軟でなければならないが、反応容器の挿入や除去の際、間隔支柱230A,230Bの凹部内に板を保持すべく充分堅くなければならない。板190Aと板190Bの間への反応容器の押し込みは、反応室に初期の予荷重を与えて、反応室の柔軟な主壁が圧縮されたとき板の内面と良好な熱的接触を達成することを保証する。
【００９３】
図２８を再び参照すると、容器４０の加圧のために、板190が離間する量を限定するために、停止部が光学アセンブリ216,218のハウジング内にモールドされる。図３２に示すように、光学アセンブリ218のハウジング249は、ハウジングから外側に延在する鉤爪状の停止部247A,247Bを含む。図３３に示すように、ハウジング249は、板190A,190Bの底部縁が停止部247A,247Bの間に挿入されるように配置されている。このようにして、停止部247A,247Bは、板190A,190Bが予め決められた最大距離から更に広がるのを防止している。わかりやすくするために図３３には示されていないが、光学アセンブリ216(図２８を参照)は、予め決められた最大距離よりも板の片割が互いに広がるのを防止するために、対応した停止部付きのハウジングを有している。図２３を再度参照すると、停止部によって板190A,190Bの内面が互いに間隔の開けられる最大距離は、枠４６の厚みにぴたりと合致しなければならない。好ましくは、板190A,190Bの内面の最大間隔は、枠４６の厚みよりも僅かに大きくして、容器４０および板190A,190Bにおける公差の変化に適合させる。例えば、上記最大間隔は、枠４６の厚みよりも約0.1〜0.3mm大きいことが好ましい。
【００９４】
図３５は、熱交換モジュール１４７の電気構成部品の概略ブロック図である。上記モジュールは、装置の主要ロジックボードに接続するためのコネクタ224または可撓性ケーブルを含む。上記モジュールは、また、熱板190A,190Bを含み，各板は上述した抵抗型加熱要素を有する。上記熱板190A,190Bは、上記装置からの電力入力253を受けるために平行に配線されている。上記熱板190A,190Bは、また、デジタル信号をアナログ−デジタルトランスデューサ264に出力する温度センサ192A,192Bを含んでいる。トランスデューサ264は、アナログ信号をデジタル信号に変換し、それらをコネクタ224を介してマイクロコントローラに送る。
【００９５】
熱交換モジュールは、また、熱板190A,190Bと、上記熱板間に挿入された容器内の反応混合物とを冷却するために、ファン212のような冷却システムを含んでいる。上記ファン212は、電力スイッチ272を入れることによって作動され、この電力スイッチ272は、今度はマイクロコントローラからの制御信号を受信する制御ロジックブロック270によって制御される。上記モジュールは、さらに、反応混合物内の標識付き分析物を励起するために例えばＬＥＤ200のような４つの光源と、反応混合物からの蛍光放射を検出するために好ましくはフォトダイオードのような４つの検出器198とを含んでいる。上記モジュールは、また、各ＬＥＤに可変電流量(例えば、０〜３０mＡの範囲)を供給するために調整可能な電流源225を含んで、ＬＥＤの明るさを変化させる。デジタル−アナログトランスデューサ260は、調整可能電流源255とマイクロコントローラとの間に接続されていて、マイクロコントローラが電流源をデジタル的に調整する。
【００９６】
調整可能な電流源255は、好ましくは、各ＬＥＤが作動されたときに略同じ明るさを有するように用いられる。製造の変動により、多くのＬＥＤは同一量の電流を与えても明るさが異なる。したがって、現在の所、熱交換モジュールの製造中に明るさの試験を実施し、且つ、モジュールのメモリ268に較正データを蓄えることが望ましい。較正データは、各ＬＥＤに与えるべき電流の正しい量を示す。マイクロコントローラは、メモリ268から較正データを読み、それに応じて電流源255を制御する。
【００９７】
上記モジュールは信号調節／利得選択／オフセット調整ブロック262を含み、上記ブロックは増幅器とスイッチと電子フィルタとデジタル−アナログトランスデューサとから成る。ブロック262は検出器198からの信号を調整して、利得を増加させ、オフセットし、ノイズを減少させる。マイクロコントローラは、デジタル出力レジスタ266を通して上記ブロック262を制御する。出力レジスタ266はマイクロコントローラからのデータを受け取って、ブロック262に制御電圧を出力する。上記ブロック262は、アナログ−デジタルトランスデューサ264とコネクタ224とを介して、調整された検知器信号をマイクロコントローラに出力する。モジュールは、また、好ましくはシリアルなＥＥＰＲＯＭのようなメモリ268を含んで、ＬＥＤや熱板190A,190Bや温度センサ192A,192Bの較正データなどのモジュールに特有のデータを保存する。
【００９８】
カートリッジおよび装置の操作について述べる。図３に示されるように、分析される流体試料は、試料ポートを通して試料室６５に添加され、キャップ３０はポート６４にねじ込まれてポートを密封する。図１０を参照すると、次に、カートリッジ２０は、処理のために装置140のカートリッジネスト141の中に配置される。初めに、カートリッジ２０内の総ての弁は、カートリッジが装置140内に配置されたとき、閉じられている。カートリッジが装置内に配置されるとき、トランスデューサ９２は、図５に示すように、溶解室８６の底壁を形成する可撓性ガスケット６３の外面と接触する。
【００９９】
図１０を再度参照すると、好ましくは、装置140は後述する機能を果すためにコンピュータ制御される。例えば、弁アクチュエータ142を使用してカートリッジ内での弁の開閉、ノズル145を経るカートリッジへの加圧、トランスデューサ９２の作動、光学サンサ143,144を使用した液体の有無の検出と液体レベルの検出、熱交換・光学検出モジュール147の制御である。下記の記述に基づいてこれらの機能を果すために、当該技術分野において通常の知識を有するプログラマは、マイクロコントローラとコンピュータのいずれか一方或いは両方をプログラムすることができる。
【０１００】
図９を参照すると、好ましくは、差圧を利用して液体は強制的にカートリッジを貫流させる。カートリッジ内の液体流を制御するために、ここでは正圧が記載されているが、負圧(真空)が使用されてもよい。通常、印加することのできる正圧の最大値は、平方インチ当たり３０ポンド(３０psi)以上の液体突破圧力に到達し得る疎水性膜によって制限される。圧力の下限値は、分析目標に適うべく、カートリッジを介して試料および他の液体を充分迅速に移動させる必要性によって限定される。例えば、１psi以下では、試料はフィルタスタック８７を通して充分に流れない可能性がある。一般的に、６〜２０psiの範囲の圧力が適切である。カートリッジを通る試料流量は、好ましくは、１０〜３０ミリリットル／分の範囲である。洗剤流量はより少なく、溶解室８６を有効に洗浄するために、洗剤流量は例えば６〜１８ミリリットル／分である。
【０１０１】
カートリッジの操作を図解するために、特定プロトコルを、図９を参照しつつ述べる。理解されたいのは、これは１つの可能なプロトコルの一例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではないことである。初めに、流体試料が試料室６５から強制的に流される前に、上記カートリッジに洗剤液が注入される。カートリッジに注入するには、弁111と115とが開かれて１０psiの圧力が圧力ポートを通して室６６に約２秒間加えられる。少量の洗剤液は、流路117,106と溶解室８６と流路109,110とを通って、Ｕ字形流路122に流れ込み、圧力ポート128の下の疎水性膜に至る。
【０１０２】
注入に続いて、弁115と圧力ポート116とが閉じられ、弁107と114が開かれる。同時に、２０psiの圧力が、約１５秒間圧力ポート105を介して試料室６５に印加される。その結果、試料は、流路106を通り、室８７内のフィルタスタック８７を通り、流路110,111,112を通って、換気された廃水室６８内に強制的に流れ込む。試料が流路106内のセンサ域136を通過するので、光学センサ144(図１３)を用いて、試料室６５が何時空になったかを決定することができる。試料液がフィルタスタック８７を貫流するとき、試料内の標的細胞あるいはウィルスが捕獲される。予め決められた量の試料が廃水室６８に到達すると、液体が溢れ出てセンサ室120内に入り、プロトコルにおける次ステップの誘因となる。この代りに、光学センサからのフィードバックを用いてものごとの誘因とするのではなく、予め決められたプロトコルのステップをタイム設定して、例えば、予め決められた圧力を予め決められた時間印加して、既知量を既知の流速で移動させる。
【０１０３】
溶解室８６の貫流設計では、比較的大きな試料容積からの標的細胞やウィルスがずっと小さな容積に濃縮されて増幅および検出される。このことは、例えば核酸のような試料内の低濃度分析物を検出するために重要である。特に、室８６の収容容積に対する溶解室を強制的に貫流させる試料の容積の比は、好ましくは少なくとも２：１であり、より好ましくは少なくとも５：１である。室８６を強制的に貫流させる試料の容積は、好ましくは少なくとも100μリットルであり、より好ましくは少なくとも１μリットルである。目下好ましい実施形態においては、５ミリリットルの試料容積は溶解室８６を強制的に貫流し、室８６は約０.５ミリリットルの収容容積を有している。したがって、その比は１０：１である。さらに、溶解室８６は、試料が室を通って強制的に流されるときに、(例えば、室の壁に結合された超音波ホーンを使用して)超音波処理される。室８６を超音波処理することは、フィルタスタック８７の目詰りを防ぎ、室８６を通る流れがより均一になる。特に、音波は、フィルタ内の特定の物質またはビーズがフィルタを目詰りさせないようにするのを助ける。
【０１０４】
次のステップでは、弁111,114,115が開かれ、２０psiの圧力が約７秒間洗剤室６６に印加されて、流路117,106を通って溶解室８６内に洗剤液を強制的に流し込む。洗剤液は、ＰＣＲ抑制物質と溶解室８６からの汚染物質を洗浄し、汚染物質を流路109,110,112を通って廃水室６８に移動させる。このために、ｐＨとか溶質成分とかイオン力の異なる様々な適切な洗剤液が使用され、そして、これらの洗剤液は当該分野において周知である。例えば、適切な洗剤試薬は、８０ｍＭの酢酸カリウム溶液であり、８.３ｍＭのトリスＨＣｌであり、ｐＨ７.５で４０μＭのＥＤＴＡであり、５５％のエタノールである。洗剤液を室に強制的に流している間、(例えば、室の壁に結合された超音波ホーンを使用して)溶解室８６は超音波処理される。室８６の超音波処理は、前述したように、フィルタスタック８７の目詰りを防ぎ、室８６に流体をより均一に貫流させる。さらに、上記音波は、物質を緩めて洗い流すのを促す。洗剤液は容積が増加すると廃水室６８に到達して、液の一部が溢れてセンサ室121内に入り、プロトコルにおける次のステップの誘因となる。
【０１０５】
次のステップでは、弁115が閉じられ、弁119が開かれる。１５psiの圧力が、約３秒間、圧力ポート118を介して試薬室６７に印加される。上記圧力は、溶解室６７から流路117,106を通って溶解室８６さらに流路110内に強制的に流される。室８６はこのようにして液体で満たされる。適切な溶解試薬は、例えば、グアニジン塩化水素、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジンイソチオシアン酸塩、沃化ナトリウム、尿素、過塩素酸ナトリウム、臭化カリウム等の攪乱塩を含有する溶液を含む。目下好ましい実施例では、ＰＣＲを抑制しない溶解試薬が使用される。溶解試薬は、１０ｍＭのトリス、５％のツウィーン-２０、１ｍＭのトリス(２カルボキシホスフィン塩酸塩)、０.１ｍＭエチレングリコールビス(ｂアミノエチルエーテル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ’、Ｎ'テトラセティク酸を有する。溶解室８６が溶解試薬で満たされた後、弁111,114は閉じられる。弁119は開かれたままで、２０psiの圧力が圧力ポート118に印加される。したがって、フィルタスタック８７に捕獲された細胞あるいはウィルスを溶解する準備段階では、溶解室８６内の静圧は２０psiまで増加する。
【０１０６】
図５を再度参照すると、溶解室８６の加圧は、トランスデューサ９２と溶解室８６の可撓性壁６３との間の結合を確実かつ有効なものにするので重要である。溶解室８６内の細胞あるいはウイルスを崩壊させるために、トランスデューサ９２が作動される(すなわち振動運動するようにセットされる)。溶解室８６の可撓性壁６３は、僅かな偏向によって、壁内に高圧を生じることなくトランスデューサ９２の振動を室８６内の液体に伝える。上述したように、壁６３はエラストマの膜によって形成される。この代わりに、壁は、好ましくは0.025〜0.1mmの範囲にある厚みのポリマー材の膜またはシート(例えばプリプロピレン膜)である。トランスデューサ９２は、好ましくは、室８６を超音波処理するための超音波ホーンである。室８６は、好ましくは、２０〜６０ｋＨｚの範囲にある周波数で１０〜４０秒間超音波処理される。例示のプロトコルでは、室は４７ｋＨｚの周波数で１５秒間超音波処理される。ホーンチップの振幅は、好ましくは、２０〜２５μｍの範囲にある(ピーク間で測定)。
【０１０７】
トランスデューサ９２の頂部が振動するとき、それは可撓性壁６３に繰返し衝撃を与える。(図６では上方向の)前進ストロークでは、トランスデューサ９２の頂部は壁６３を押圧して、室８６内に圧力パルスすなわち圧力波を発生する。(図５では下方向の)後退ストロークでは、通常、トランスデューサ９２の頂部が可撓性壁６３から離れ、可撓性壁６３はトランスデューサと同じ周波数で動くことができない。次の前進ストロークでは、再び、トランスデューサと壁とが互いに作用しながら、トランスデューサ９２の頂部は壁６３に正面衝突しながら衝撃を与える。トランスデューサ９２が振動するときにトランスデューサ９２と壁６３とが分離するので、トランスデューサの有効前進ストロークはピーク間の振幅よりも小さくなる。上記有効前進ストロークは、溶解室８６内での超音波処理のレベルを決定する。したがって、分解室８６の静圧を増加させることが重要となり、トランスデューサ９２の頂部が後退した時は、可撓性壁６３が強制的に外方に押しやられて頂部と当接する。トランスデューサ９２の有効前進ストロークによって圧力パルスまたは圧力波が室内で確実に発生するように、上記室８６内の静圧は充分なものでなければならない。目下のところ、室８６内での静圧を、カートリッジの外の雰囲気圧よりも少なくとも５psiまで増加させることが好ましく、さらに、雰囲気圧よりも１５〜２５psiの範囲の圧力に増加させることがより好ましい。
【０１０８】
各前進ストロークでは、トランスデューサ９２は、室内の液体に速度を付与して、室８６内を迅速に一掃する速度パルスを発生させる。フィルタスタック８７(図６)内のビーズは室８６内で圧力パルスによって攪拌される。圧力パルスは室８６内でビーズを激しく動かし、ビーズは細胞やウィルスを機械的に破壊して、それらから物質(例えば、核酸)を解放する。血液細胞などの或る種の細胞は、比較的脆弱で、ビーズを用いることなく圧力波のみを用いて崩壊させることができる。その他の細胞(特に胞子)は非常に耐性のある細胞壁を有していて、一般的に有効な溶解にはビーズが必要とされる。
【０１０９】
図９を参照すると、細胞やウィルスの崩壊に続いて、弁111,124が開かれ、１２psiの圧力が圧力ポートを介して試薬室６７に約４秒間供給される。この圧力によって強制的に、溶解試薬がフィルタスタック８７から核酸を溶離させ、核酸と共に中和室７０内に流れ込む。（例えば、室の壁に結合された超音波ホーンを用いて)溶解室８６を超音波処理して、核酸を溶離することができる。室８６の超音波処理は、上述したように、フィルタスタック８７の目詰りを防止する。室420は、溶解試薬を中和するために、洗剤などの中和剤で部分的に充填(例えば半分ほど充填)される。ＰＣＲに対して非抑制な溶解試薬が使用されるならば、中和剤はオプションとなる。
【０１１０】
次のステップでは、弁124が閉じられて、室７０内に溶解試薬と分析物と中和剤とが収容される。弁114が開かれ、１５psiの圧力が圧力ポート128を介して約３秒間印加されて、Ｕ字形流路122内の液体を廃水室６８に強制的に流し込む。次に、弁124,126が開かれ、１５psiの圧力が中和剤室７０の頂部の圧力ポート123を介して約５秒間印加される。この圧力によって強制的に、室７０内の中和された溶解試薬と核酸とが、流路122に流れ、主混合室７１に流れ込む。そのとき、主混合室７１の弁126は閉じられている。上記主混合室７１は、ＰＣＲ試薬と、中和された溶解試薬と核酸とを混合している蛍光プローブとを含有して、反応混合物を形成している。
【０１１１】
次のステップでは、廃水室６８への弁144を開くことによって流路112が一掃され、１５psiの圧力が圧力ポート128に約１秒間印加される。次のステップでは、主要混合物室７１に形成された反応混合物が、以下のようにして反応容器４０に移動される。すなわち、弁126,127,133が開かれ、１５psiの圧力が、主混合物室７１の頂部にある圧力ポート125に約６秒間印加されて、反応混合物が、流路122と弁127と流路８０を通って強制的に流され、ポート４１を経て反応室４０に至る。反応混合物は室内の空気と置き換わって容器の室４２を満たし、空気は出口流路５２を通って出て行く。この出口流路５２を通って出る空気は、流路８１内を移動しセンサ域130を通り過ぎて流路131内に入る。空気は、流路131から流路132内に流れ、弁133と流路134とを通って、通気孔３６を経てカートリッジを出る。室４２を満たすのに充分な容積の反応混合物が容器内に流れ、過剰となった反応混合物は、出口流路を経て容器から出て行く。過剰反応混合物は、流路８１に流れ込み、センサ域130において光学的に検出される。反応混合物が検出されたときは、弁133が閉じられ、圧力ポートからの圧力が印加されて反応室４２を加圧する。
【０１１２】
図２３を再度参照すると、室４２内を加圧することによって容器の可撓性主壁が膨張する。特に、上記圧力は、主壁４８を板190A,190Bの内面と強制的に接触させ、一致させる。これによって、板190A,190Bと室内の反応混合物との間で最良の熱伝導が確実に行なわれる。雰囲気圧力よりも２〜３０psi上の圧力に室４２を加圧することが目下のところ好ましい。この圧力範囲が目下のところ好ましいのは、一般的に２psiが、壁４８と板190A,190Bの表面との間を一致させるに充分な圧力である。３０psi以上では、壁４８の破裂や枠４６とか板190A,190Bの変形、あるいはカートリッジ内の膜の破裂を引き起こす可能性がある。より好ましくは、室４２が雰囲気圧力よりも８〜１５psi上の圧力に加圧されることである。この圧力範囲がより好ましいのは、上述の実用限界内に安全に収まっている為である。室４２が加圧されると、容器４０内の反応混合物は熱的に処理されて、混合物内の標的分析物の存否を決定する光学的応答指令信号が送られる。
【０１１３】
図３５を参照すると、目標温度と温度センサ192A,192Bからの帰還信号とを用いた標準的な比例積分微分(ＰＩＤ)制御を使用して、反応混合物は板190A,190B間で熱的に処理される。比例は、「オフ」の時間に対する「オン」の時間の比を変化させることによって行なわれるか、或いは、好ましくは、比例アナログ出力を用いて行なわれる。上記比例アナログ出力は、板190A,190Bの実際の温度が所望の設定温度に接近するにつれて、板190A,190Bの加熱要素あるいはファン212への供給平均電力を減少させる。ＰＩＤ制御は、比例モードに、自動リセット機能(時間に対して偏差信号を積分する)と比率処置(レイトアクション、微積信号を合計して比例帯を移動させる)とを組み合せたものである。標準ＰＩＤ制御は当該技術分野では周知であり、ここでこれ以上の説明は不要である。この代わりに、反応混合物は、国際公開番号ＷＯ９９／４８６０８(出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６６２８)に記載されているＰＩＤ制御の修正版を使用して、熱的な処理が施されてもよい。なお、上記文献の開示内容はこの参照によって本文に編入される。
【０１１４】
反応混合物は板190A,190Bの間で熱的なサイクルを受けて、混合物内の１以上の標的核酸配列を増幅させる。上記混合物は、好ましくは各熱サイクルの最低温度点において、応答指令信号が光学的に送信される。光学的な指令応答は、各発光ダイオード(ＬＥＤ)200を連続的に作動させ、混合物内の異なる蛍光で標識付けされた分析物を励起させ、検知器198を用いて室４２から放出される光を検出することによって行なわれる。図２２を再び参照すると、好ましくは、励起ビームは透光性の側壁５７Ａを通して室４２内に伝達され、一方、放出された蛍光は側壁５７Ｂを通して検出される。
【０１１５】
本発明のカートリッジの利点の一つは、比較的大きな容積の例えば数ミリリットル以上の流体試料から内細胞物質を分離させることができ、ずっと少ない容積の例えば100ミリリットル以下の反応液に濃縮できる。カートリッジは、ミリリットルの量の流体試料から物質を効率よく抽出することによって、並外れた濃度比率になる。特に、試料室６５は、好ましくは、100μリットル〜１２ミリリットルの収容容積を有する。より好ましくは、試料室６５は、少なくとも１ミリリットルの収容容積を有する。１ミリリットルという下限値が好ましい理由は、核酸のような低濃度の分析物を検出するためには、少なくとも１ミリリットルの試料が分析されなければならないからである。１２ミリリットルという上限値が好ましい理由は、１２ミリリットル以上の試料は、ずっと大きなカートリッジを必要とし、フィルタスタックが目詰りし易いからである。目下好ましい実施の形態では、試料室は、試料を５ミリリットル保有するために５.５ミリリットルの収容容積がある。
【０１１６】
洗剤室６６は、溶解室８６の容積と比例する収容容積を有している。特に、洗剤室６６は、好ましくは溶解室８６の容積の少なくとも１〜２倍の洗剤容積を有して、室８６からＰＣＲ抑制物および残骸物(デブリス)を洗い流すのに充分な洗剤液が存在するのを保証する。目下好ましい実施の形態では、溶解室の容積は約０.５ミリリットルであり、洗剤室６６の容積は、洗剤液を保持するために２.５ミリリットルである。０.５ミリリットルという溶解室６６の容積は、フィルタスタック８７の目詰りを避けるための充分に大きなサイズと、分析物を小さな容積に濃縮して改良された増幅と検出とをするための充分に小さなサイズとの間の妥協である。
【０１１７】
試薬室６７は、室を加圧して室から核酸を抽出するのに充分な溶解試薬が存在するには、溶解室８６の容積の少なくとも１倍乃至２倍の溶解試薬容積を収容能力があるものが好ましい。目下好ましい実施形態においては、室６７は、約１〜１.５ミリリットルの溶解試薬を収容するために、１.５ミリリットルの収容容積を有している。廃水室６８は充分な収容容積を有していて、試料と洗剤液と未使用の溶解試薬とを収容する。廃水室６８は、好ましい実施形態では、約９.５ミリリットルの収容容積の寸法に作られている。
【０１１８】
室７０内の中和剤が溶解室８６に充填された溶解試薬の容積を中和するので、中和室７０のサイズは溶解室８６の容積に左右される。溶解室は０.５ミリリットルの容積を有することが目下のところ好ましく、約０.５ミリリットルの中和剤を収容するために室７０は１.０ミリリットルの収容容積を有する。中和剤は０.５ミリリットルの溶解試薬と溶離された分析物とが混合される。主混合物室７１の収容容積は、反応混合物を製造するために充分なものであるべきで、容器４０を充填し、上記容器に導く流路122,127を充填する。目下好ましい実施形態において、主混合物室は、初期負荷となる100μリットルの主混合物を収容するために、200μリットルの収容容積を有する。この主混合物には、反応混合物を形成するために、100μリットルの中和溶解試薬と溶離分析物とが付加される。
【０１１９】
カートリッジ内の流路流路は、断面が略Ｄ形をしていて(ガスケットは流路の平坦な側面を形成している)、好ましくは１／６４〜１／８インチ(０.４〜３.２mm)の幅または直径を有し、より好ましくは１／３２〜１／１６インチ(０.８〜１.６mm)の幅を有している。これらの範囲は、流路が狭くなる(流れが制限される)のを防ぐと共に、流路が広く成り過ぎる(未使用の液体が流路内に停滞する)のを防ぐために、目下のところ好ましいものである。
【０１２０】
上記カートリッジおよび装置の構造と操作については、多くの変更が代替えの実施形態において可能である。例えば、ＰＣＲによる増幅が目下のところ好ましいが、熱サイクル増幅法と等温増幅法との両方を含む何らかの増幅法を用いて、上記カートリッジと装置とは核酸配列を増幅するために使用され得る。適切な熱サイクル法には、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ、米国特許第４,６８３,２０２号、米国特許第４,６８３,１９５号、米国特許第４,９６５,１８８号)、逆転写酵素ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)、ＤＮＡリガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ、国際特許出願第ＷＯ８９／０９８３５)、転写ベース増幅(D.Y. Kwoh et al. 1989、Proc. Nt. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177)がある。但し、これらに限定されるというものではない。本発明の実施に当たって有用かつ適切な等温増幅法は、限定されるものではないが、ローリングサークル増幅、ストランド置換増幅(ＳＤＡ、Walker et al. 1992, Proc, Nati, Acad. Sci. USA 89, 392-396)、Ｑベータレプリカーゼ(Lizardi et al. 1998, Bio/Technology 6, 1197-1202)、核酸ベースの配列増幅(ＮＡＳＢＡ、R. Sooknanan and L. Malek 1995, Bio/Technology 13, 563-65)、自己維持配列複製（３ＳＲ、Guatelli et al. 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878)を含む。
【０１２１】
さらに、上記カートリッジと装置とは、核酸増幅以外の化学反応を行なうために、使用されることができる。また、カートリッジ内の分析物を検出するためには、蛍光励起および放出検出が好ましいが、軸上結合構造(on-axis geometries)との直接吸収および／または透過に使用される光学的検出法が使用されてもよい。もう１つの可能な検出法は、時間減衰蛍光法である。さらには、上記カートリッジは、蛍光標識に基づいた検出に限定されるものではない。例えば、検出は、燐光標識または化学ルミネセンス標識または電気化学ルミネセンス標識に基づいてもよい。
【０１２２】
流体試料は、様々な手段によって手で或いは自動的にカートリッジ内に導かれる。手による添加では、測定された量の物質が入口ポートを通してカートリッジの収容領域内に置かれ、次にキャップが上記ポート上に配置される。これの代わりに、分析に必要とされる量よりも多い試料物質がカートリッジに添加され、カートリッジ内の機構が、所定のプロトコルに対して必要な試料を正確に測定し、等分し得る。例えば細胞生検物質や土壌や糞や滲出物やその他複合物等の試料を別の装置または付属器に搭載し、次に、上記副装置または付属器をカートリッジ内に搭載することが望まれる。例えば、一片の細胞は、２次装置の管腔内に載置されて、カートリッジの入口ポートに対してキャップとして機能する。上記キャップは上記ポート内に押圧されると、細胞はメッシュに強制的に通されて、上記メッシュは細胞を薄切り或いは分割する。
【０１２３】
自動的に試料が導入される場合には、カートリッジの添加設計の特徴が用いられていて、多くの場合、試料の増大機能をカートリッジに直接分与している。或る試料の場合、例えば人のレトロウイルス病原体のような操作者や環境に危険を呈するような場合には、試料のカートリッジへの移動は危険なものとなり得る。したがって、一実施形態においては、外部の流体試料をカートリッジ内に直接移動させる手段を設けるために、注入器が装置に組み込まれている。この代わりに、静脈穿刺針と吸引血液管とがカートリッジに取り付けられて、血液試料を採取するために用いられるアセンブリを形成する。採取後に、上記管と針は取り外されて廃棄される。そのとき、カートリッジは器具内に設置されて処理される。この方法の利点は操作者または環境が病原体に晒されないことである。
【０１２４】
入口ポートは、意図された試料の特性の関数として適当な人間的要因を考慮しつつ設計され得る。例えば、呼吸系の試料は、咳の喀出粘液として、或いは、喉や鼻腔の背後から綿棒または刷毛で集めた試料として、低呼吸管から得ることができる。前者の場合、入口ポートは、患者がカートリッジ内に直接咳ができるように、さもなければ、喀出試料をカートリッジ内に容易に吐けるように設計されている。刷毛または綿棒の試料に対しては、試料は入口ポート内に置かれ、ポートと閉塞部の特徴によって、カートリッジの収容領域内で綿棒または刷毛の端部を容易に折ったり保持したりできる。
【０１２５】
別の実施形態では、カートリッジは入口管および出口管が、例えば水流のような非常に大きな容積の試料プール内に配置されていて、試料物質はカートリッジを貫流する。この代わりに、カートリッジ全体が試料内に直接浸漬されるように、親水性の芯材が反応領域として機能し、充分な量の試料が上記芯材の中に吸収される。次に、上記カートリッジは取り除かれ、実験室に運ばれるか、あるいは携帯型器具を用いて直接分析される。別の実施形態では、配管を用いて、管の一端はカートリッジと直接連通させて少なくとも１つの反応領域との流体界面を与えると共に、管の他端は外部環境と接触できて試料の受取部として機能する。次に、上記管は試料内に配置され、ストローとして機能する。また、カートリッジ自体は実際の試料収集装置として機能し、これによって取り扱いが簡単になり不便さを減少させる。法的争いや犯罪調査に関わる試料の場合、試験物質を直接接近して流体のカートリッジ内に持ち込むことは、一連の保護された状態が都合良く且つ確実に保たれるので利点となる。
【０１２６】
図９を参照すると、試薬は使用前にカートリッジ内に外部から導入され、例えば、試薬室６７と中和剤室７０と主要混合物室７１の密封できる開口部を通して導入される。この代わりに、例えば、水溶液あるいは再構成を必要とする乾燥された試薬のような試薬は、製造中にカートリッジ内に置かれてもよい。反応が液相なのか固相なのかを含めた、試薬の固有熱安定性、再構成速度、反応速度など様々なパラメータに基づいて、特定のフォーマットが選定される。溶液のときに熱的に不安定な化合物を含む試薬は、凍結乾燥のような技法を用いて、乾燥させることにより、安定化させることができる。単一アルコールシュガー、メチルセルロース、バルキングプロテインのような添加剤は、安定性または再構成性を増加させるために、乾燥する前に試薬に添加してもよい。
【０１２７】
図２１を再度参照すると、反応容器４０は、反応室４２の対向主壁４８を形成する２つの可撓性シートを必要としない。例えば、代替えの一実施形態では、反応容器４０は反応室４２の主壁を形成する可撓性シートを唯一有する。剛枠４６は、室の側壁ばかりでなく室の他の主壁をも形成している。この実施形態では、枠によって形成された主壁は、約0.05インチ(1.25mm)の最小肉厚を有し、射出成形における典型的な実用最小肉厚であり、一方、可撓性シートの肉厚は0.0005インチ(0.0125mm)である。この実施形態の利点は、枠４６に唯一つの可撓性シートを取付けることが必要なだけであるので、反応室４０の製造が簡素化され、したがって安価になることである。不利な点は、反応混合物の加熱および冷却の速度が遅くなることであり、これは恐らく、枠４６によって形成された主壁が厚みの薄い可撓性シートほど熱伝導速度を高めることができないからである。
【０１２８】
図２８を参照すると、熱交換モジュール147は、反応容器４０の可撓性壁に接触するための１つの熱面と、上記熱面を加熱冷却するための１つの熱要素とを必要とするのみである。１つの熱面と１つの熱要素とを使用する利点は、装置がより安価に製造され得ることである。不利な点は、加熱と冷却の速度が約２倍ほど遅くなりそうなことである。さらに、熱面は熱的に伝導性のある板190によって形成されることが目下のところ好ましいが、各熱面には、容器４０の壁に接触するための接触領域を有する剛性構造体が設けられてもよい。熱面は、好ましくは、セラミックあるいは金属のような高い熱伝導性を有する物質を備える。さらに、熱面は熱要素自体の表面を備えてもよい。例えば、熱面は、室を加熱したり冷却したりするために壁と接触する熱電気装置の表面であってもよい。
【０１２９】
トランスデューサを装置140に組み込むことが目下のところ好ましい。しかしながら、他の実施形態においては、トランスデューサはカートリッジに組み込まれる。例えば、溶解室を超音波処理するために、圧電ディスクがカートリッジに組み込まれてもよい。この代わりに、スピーカあるいは電磁コイル装置がカートリッジに組み込まれてもよい。これらの実施形態では、カートリッジは適切な電気接続装置を含んで、トランスデューサを電源に接続している。トランスデューサがカートリッジに組み込まれる実施形態では、トランスデューサが流体試料と直接接触するのを防止しなければならず、例えば、トランスデューサは薄板を被せて、室壁で試料を分離しなければならない。さらに、細胞またはウィルスの溶解は、トランスデューサの代わりにヒータを使用して行なわれるか、或いは、ヒータとトランスデューサと組み合せて行なわれる。このヒータは抵抗型加熱要素であってカートリッジの一部となっている。或いは、ヒータは、カートリッジを収容する器具に組み込まれてもよい。この実施形態においては、分解室を高温(例えば、９５℃)に加熱して細胞壁を粉砕することによって、細胞またはウィルスは崩壊される。
【０１３０】
以上の説明は、多くの特質を含んでいるが、これらの特質は、本発明の範囲を制限するものと解されてはならず、幾つかの好ましい実施形態の例に過ぎないと解されなければならない。本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変更や置換が既述の装置および方法にできる。
【０１３１】
従って、本発明の範囲は、以下の請求項およびその均等物によって決定されるべきものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は概ね生化学分析分野、特に化学反応を制御する新しいカートリッジに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床流体や環境流体の分析は一般的に、流体試料への化学的、光学的、電気的、機械的、または、熱学的一連の処理工程を含む。近年、様々な診断や監視目的のために生物学試料の分析を行う使い捨てカートリッジの開発への関心が高まっている。例えば、Wilding，米国特許第５,５８７,１２８号には、試料中の前もって選択されたポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド増幅反応を行って増幅する装置が開示されている。Anderson らの米国特許第５,９２２,５９１号では、小型の一体型核酸診断装置システムが述べられている。この装置では一般的に、１回以上の試料の獲得と準備操作を、１回以上の試料分析操作と組み合わせて行うことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５,５８７,１２８号明細書
【特許文献２】米国特許第５,９２２,５９１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記進歩にも関わらず、反応混合物の迅速な熱処理と、混合物中の分析物の検出感度を向上させることができるカートリッジの必要性が依然ある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の開示）
本発明は、流体試料を分析して試料中の分析物の有無を測定する装置と方法を供給する。この装置は、試料から所望の分析物を分離し、その分析物を化学反応と光学的検出のために入れるカートリッジを有する。この装置は、試料処理のためにカートリッジを受ける装置を備える。所望の分析物には例えば、有機体、細胞、タンパク質、核酸、炭水化物、ウイルス分子、バクテリア、化学物質や生化学物質が含まれる。好ましくは、所望の分析物は核酸を含み、行われる化学反応は、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を使う増幅がよい。
【０００６】
好ましい実施形態では、カートリッジは少なくとも１つの流路を有する本体を備える。カートリッジはまた、本体から延び出して化学反応と光学的検出を行うために反応混合物を入れる反応容器を備える。この反応容器は反応室の側壁を区画する剛な枠から成る。この枠は流路と反応室を接続する少なくとも１つの導管を有する。反応容器はまた、少なくとも１つの柔軟性のあるフィルムやシートを有する。フィルムやシートは剛な枠に取り付けられており、反応室の主壁を形成する。主壁は熱面と一致するのに十分柔軟である。反応容器は、剛な枠の両側に取り付けられ、反応室の対向する主壁を形成する第１および第２の柔軟なシートを有するのが好ましい。さらに、少なくとも２つの側壁は透光性があり、略９０度の角度で互いに偏らされている。
【０００７】
カートリッジは、反応室を挟んで収容するように配置された対向する熱板を有する装置と組み合わせて使うのが好ましい。この装置は、反応室内の圧力を増加する圧力源も有する。反応室内の圧力は、主壁を板の内面に一致するように接触させるのに十分なまで増加し、反応室への最適な熱伝導を確実にする。装置はまた、反応混合物の迅速な熱処理のため板上に熱要素を配する。装置はさらに、透光性の側壁のうちの第１の側壁を介して反応室内の反応混合物を励起する少なくとも１つの光源と、反応室から透光性の側壁のうちの第２の側壁を介して放出される光を検出する少なくとも１つの検出器を有する光学システムを備える。
【０００８】
本発明のカートリッジは、反応混合物の極めて迅速な加熱と冷却を可能にし、混合物と熱または冷却要素間の最適な伝熱を確実にし、反応生成物のリアルタイムで高感度な光学的検出と監視を行なう。
【０００９】
本発明は以下に述べる詳細な説明と付随する図面によってよりよく理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の第１実施形態の流体試料を分析するカートリッジの等角投影図である。
【図２】図１のカートリッジの下部の等角投影図である。
【図３】図１のカートリッジの分解図である。
【図４】図１のカートリッジの別の分解図である。
【図５】図１のカートリッジ内に設けられた溶解室の壁に連結された超音波ホーンの部分破断図である。
【図６】図１のカートリッジの溶解室内に設けられたフィルタスタックの分解図である。
【図７】図１のカートリッジの平面図である。
【図８】図１のカートリッジの底面図である。
【図９】図１のカートリッジの概略ブロック図である。
【図１０】図１のカートリッジを処理のために入れる装置の等角投影図である。
【図１１】図１０の装置の中の図１のカートリッジの等角投影図である。
【図１２】図１０の装置の中の図１のカートリッジの部分破断図である。
【図１３】図１のカートリッジ内の液体レベルを検出するための光センサの概略平面図である。
【図１４】図１のカートリッジのセンサ室内の液体レベルを検出するために差込まれた光センサの概略部分破断側面図である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、図１のカートリッジの本体一部の断面図であり、カートリッジ内の２つの異なるタイプの弁を示している。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、閉じた状態の図１５Ａの弁の断面図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、開いた状態の図１５Ａの弁のうち１つの別の断面図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、閉じた状態の図１６Ａの弁の断面図である。
【図１７】図１５Ａの弁を開閉する弁作動システムを図示したものである。
【図１８】図１５Ａの弁を開閉する弁作動システムを図示したものである。
【図１９】図１５Ａの弁を開閉する弁作動システムを図示したものである。
【図２０】図１のカートリッジ内の弁を開閉する代替の弁アクチュエータの断面図である。図２０はまた、図１のカートリッジ内の圧力ポートに封着された圧力供給ノズルを示す。
【図２１】図１のカートリッジの反応容器の部分分解等角投影図である。
【図２２】図２１の容器の正面図である。
【図２３】２つの熱板の間に挿入された図２１の容器の側面図である。
【図２４】図２３の熱板のうち１つの正面図である。
【図２５】本発明の代替の反応容器の正面図である。
【図２６】本発明の別の反応容器の正面図である。
【図２７】図２１の容器の別の正面図である。
【図２８】図１０の装置の熱交換モジュール内に挿入された図２１の容器の正面図である。
【図２９】図２３の板を保持する支持構造の分解図である。
【図３０】図２９の支持構造の組み立て図である。
【図３１】図２９の支持構造の組み立て図である。
【図３２】図２８の熱交換モジュール内の光学アッセンブリのうち１つの外面を示す等角投影図である。
【図３３】図３２の光学アッセンブリと接する図２３の板の等角投影図である。
【図３４】図２３の板の間に挿入された図２１の反応容器の部分破断等角投影図である。容器の下部のみが図に含まれている。
【図３５】図２８の熱交換モジュールの電子装置の概略ブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、流体の試料を分析するための装置および方法を提供する。第１の実施形態では、この発明は、流体試料から所望の分析物を分離するため、および化学反応のために分析物を保持するためのカートリッジを提供する。流体の試料は、溶液であるか、浮遊物である。特別な使用では、試料は人体の流体である(例えば、血液、尿、唾液、痰、精液、脊髄の流体、粘液、または他の人体の流体)。これと択一的に、試料は溶解できる固体であるか、または液体の中に浮遊している固体である。また、試料は、土、汚水、土の抽出物、殺虫剤の残留物、または流体に含まれる風媒の種子のような環境試料である。更に、試料は、１以上の化学薬品、試液、希釈剤、または緩衝液と混ぜ合わせられる。試料は、例えば化学薬品を混ぜ合わせたり、遠心分離機にかけたり、あるいは小さく丸めたりして、前もって処理され、あるいは未処理の形態である。
【００１２】
所望の分析物は、典型的には細胞内の物質である(例えば、核酸、蛋白質、炭水化物、脂質、細菌、または細胞内の寄生虫)。好ましい使用では、分析物は、カートリッジが流体試料から分離するとともに、(例えば、ＰＣＲを用いて)増幅し、かつ光学的検出するため保持する核酸である。本明細書で用いる用語「核酸」は、合成のあるいは自然に生ずるＤＮＡやＲＮＡのような核酸を指しており、この核酸はいかなる可能な外形、即ち、二重染色分体の核酸の形態、一重染色分体の核酸の形態、またはこれらの形態のいかなる可能な組み合わせの形態をとる。
【００１３】
図１は、好ましい実施形態のカートリッジ２０の等角投影図である。カートリッジ２０は、流体試料から核酸を分離するように設計されており、増幅および検出のために核酸を保持するように設計されている。カートリッジ２０は、頂部片２２,中央片２４および底部片２６を備える本体を有している。流体試料をカートリッジの中に導入するための入口は頂部片２２に形成されてキャップ３０によって密閉されている。また、６つの圧力ポート３２が、頂部片２２に形成されている。圧力ポート３２は、例えばポンプや真空などの圧力源からのノズルを収容するためにある。カートリッジはまた、装置(図１０で後述する)におけるカートリッジ２０の位置決めのために底部片２６から延び出る整列脚２８を有する。窪みまたは凹部３８A,３８B,３８Cは、頂部片２２および中央片２２に形成されている。この凹部は、カートリッジ２０内の流体の流れを検出するための光学センサを収容するためにある。カートリッジ２０は、更にベント３４,３６を有する。各圧力ポートと各ベントは、ベントおよび圧力ポートに対してガスが出入りするようにガスは通すが、液体は通さない疎水性の薄膜を有することが好ましい。変性アクリル樹脂共重合体の薄膜は、例えば、ゲルマンサイエンス社(ミシガン州,アン・アーバー)から市販され、また、粒子トラック腐食ポリカーボネートの薄膜は、ポリティクス社(カリフォルニア州,リバーモア)から市販されている。
【００１４】
図２は、カートリッジ２０の下側を示す等角投影図である。９つの穴６０が、カートリッジ２０の弁を開閉する弁アクチュエータを収容するために底部片２６に形成されている。トランスデューサ(図５で詳細に後述する)を収容するための穴６２も、底部片２６に形成されている。カートリッジ２０はまた、カートリッジの本体から外側に延び出す反応容器４０を有する。容器４０は、化学反応や光学的検出のための反応混合物(例えば、増感試薬および蛍光試料と混合された核酸)を保持するための反応室４２を有する。カートリッジにおける流路の１つは、化学反応と光学検出のために反応室４２に反応混合物を運ぶ。反応容器４０は、カートリッジ２０の本体から外側に延びていて、その結果、反応容器４０は、カートリッジ２０の残余の部分から反応容器４０を取り外す必要なしに、対向する一対の(反応室４２を加熱,冷却するための)熱板の間に挿入される。これは、汚染とこぼれのうちの少なくともいずれかが起こる危険性を大きく減じている。反応容器４０は、カートリッジの本体と一体に形成することができる(例えば、中央片２４と一体にモールド成形される)。しかしながら、目下、カートリッジの製造中に本体と連結される分離要素として反応室４０を製造するのが好ましい。
【００１５】
図３,図４は、カートリッジの分解図を示している。図３で示されているように、中央片２４は、内部に多数の室を有する。特に、中央片２４は、入口ポート６４を通じて導入される流体試料を保持する試料室６５と、洗剤液を保持する洗剤室６６と、溶解系試薬を保持する試薬室６７と、使用済みの試料と洗剤を収容するための廃水室６８と、中和剤を保持する中和剤室７０と、主混合物(例えば、増感試薬と蛍光試料)を保持して、流体試料から分離された分析物をもつ試料と試薬を混合する主混合室７１とを有する。試料室６５は、試料室６５より僅かに低い外壁を有する側室155をオプションで包含している。側室155は、充分な試料が試料室６５に加えられたとき、即ち試料室６５内での液面が側室の中に溢れ込むほど充分高いとき、ユーザに視覚的に知らせるためにある。
【００１６】
頂部片２２は、既述の如くベント３４,３６および圧力ポート３２を有する。エラストマーの薄膜またはガスケット６１は、頂部片２２,中央片２４に形成された様々な溝や室を密封するためにこれらの片２２,２４の間に挟まれるように配置される。中央片２４は、ガスケット６１が十分なシールを形成することを保証すべく、複数のシールリップを有するのが好ましい。特に、室６５,６６,６７,６８,７０,７１の夫々を取り囲むシールリップ７３を有するのが好ましい。中央片２４はまた、周囲を囲う支持壁７５と中間シールリップ７６とを有する。シールリップ７３,７６と支持壁７５は、局所的にガスケット６１を圧縮して、密封を達成する。
【００１７】
図４で示されるように、中央片２４は下側に様々な溝が形成されて、その溝の１つは、溶解室８６に通じている。溶解室８６は、底部片２６の穴６２と一直線に揃っていて、トランスデューサ(例えば、超音波ホーン)は、溶解室８６内に圧力波を生成するために穴６２を経て挿入される。中央片２４はまた、底面に形成された９つの弁座８４を有する。弁座８４は、底部片２６の９つの穴６０と一直線に揃っていて、弁アクチュエータが、弁座８４に穴６０を経て挿入される。
【００１８】
エラストマーの膜あるいはガスケット６１は、中央片、底部片２４，２６の間に挟まれるように位置して、中央片２４に形成された種々の流路、弁座、室を密閉する。中央片２４は、好ましくは多数のシールリップを有し、ガスケット６３が十分なシールを形成するのを確実にする。特に、中央片２４は、好ましくは、溶解室８６、弁座８４および種々の流路を取り囲むシールリップ７３を有している。また、中央片２４は、その周囲に支持壁７５を有するとともに、中間シールリップ７６を有している。上記シールリップ７３，７６と支持壁７５は、ガスケット６３を局部的に圧縮し、シールを完成する。種々の流路および室を密封するのに加えて、ガスケット６３は、複数の穴６０のうちの１つを通じて駆動させられたときに、対応する弁座８４に圧入し、これによって中央片２４の複数の流路のうちの１つを塞ぐことにより、弁軸としても機能する。この弁動作については、図１５〜１６を参照しながら後でより詳細に説明する。
【００１９】
ガスケット６３はまた、溶解室８６の底面壁を形成しており、この底面壁に当接してトランスデューサが配置され、溶解室８６内の細胞あるいはウイルスの破壊を生ぜしめる。ガスケット６１,６３は夫々、好ましくはエラストマーで構成されている。適切なガスケット材料は、シリコンゴム、ネオプレン、エチレンプロピレンジエンモノマー、あるいはその他の弾性材料である。ガスケット６１,６３は夫々、好ましくは0.005〜0.125インチ(0.125〜3.175mm)の範囲の厚さであり、より好ましくは0.01〜0.06インチ(0.25〜1.5mm)の範囲の厚さである。現在好適とされている厚さは、0.31インチ(0.79mm)である。ガスケットの厚さとしては、ガスケットが、流路や室を密封し、力が加えられたときに弁座８４に圧入し、そして圧力がかかっている状態で広がってトランスデューサと接触するのに十分な弾力性を備えるような厚さが選択されている。
【００２０】
図３に示されるように、中央片２４はスロット７９を有し、カートリッジ組み立ての際にこのスロットに反応容器４０が挿入される。この反応容器４０は、流体を加えたり、反応容器から流体を除くための２つの流体ポート４１，４３を有している。頂部片２２が、ガスケット６１を介して中央片２４に密着させられると、上記流体ポート４１，４３は、それぞれ頂部片２２に形成された流路８０,８１(図４参照)と流体連通する。ガスケット６１は、流体ポート４１,４３と流路８０,８１との間の夫々の流体境界面を密封する。頂部片、中央片、底部片２２,２４,２６は、好ましくは、ポリプロピレン、ポリカーボネート、あるいはアクリルなどのポリマー材料で作られた射出成形部品である。大量生産には成形が好適であるが、頂部片、中央片、底部片２２,２４,２６の機械加工も可能である。頂部片、中央片、底部片２２,２４,２６は、ねじあるいは留め金具で結合してもよい。これと択一的に、超音波接合、溶剤結合、あるいはスナップ嵌合設計を用いて、カートリッジを組み立てることもできる。
【００２１】
また、図４はフィルタリング８８を示している。このフィルタリング８８は、溶解室８６のフィルタの積み重ねを圧縮し、保持している。図６は、フィルタスタック８７の分解図を示している。このフィルタスタック８７の目的は、試料流体が溶解室を通るときに、流体試料から細胞やウイルスを捕捉することである。そして、捕捉された細胞やウイルスは、溶解室８６において破壊（溶解）される。細胞は、動物細胞または植物細胞、胞子、バクテリア、あるいは微生物であってもよい。ウイルスは、ＲＮＡあるいはＤＮＡ核を取り囲んでいるたんぱく質被膜を有するあらゆる種類の感染性物質でもよい。
【００２２】
上記フィルタスタック８７は、ガスケット９３、第１フィルタ９４、ガスケット９５、第１フィルタ９４よりも小さな孔を有する第２フィルタ９７、ガスケット９８、第２フィルタ９７よりも小さな孔を有する第３フィルタ100、ガスケット101、メッシュ102、ガスケット103を備えている。また、フィルタスタックは、好ましくは第１，第２フィルタ９４,９７の間に配置された第１組のビーズ９６と、第２,第３フィルタ97,100の間に配置された第２組のビーズ９９を有している。フィルタリング８８は、フィルタスタック８７を溶解室８６に圧入するので、ガスケット９３はフィルタ９４を押圧し、フィルタ９４はガスケット９５を押圧し、ガスケット９５はフィルタ９７を押圧し、フィルタ９７はガスケット９８を押圧し、ガスケット９８はフィルタ100を押圧し、フィルタ100はガスケット101を押圧し、ガスケット101はメッシュ102を押圧し、メッシュ102はガスケット103を押圧し、ガスケット103は溶解室８６の底面壁の外周部を押圧する。ビーズ９６がフィルタ９４,９７の間の空間を自由に移動するように、ガスケット９５の厚さはビーズ９６の平均直径よりも大きくなっている。同様に、ビーズ９９がフィルタ97,100の間の空間を自由に移動するように、ガスケット９８の厚さはビーズ９９の平均直径よりも大きくなっている。流路106を通って溶解室８６に流れ込む試料流体は、まずフィルタ９４を通って、それからフィルタ９７を通って、その次にフィルタ100を通って、最後にメッシュ102を通る。フィルタスタック８７を通った後、試料流体は溶解室８６の上部に形成されたフローリブ９１を通って、排出流路(図６には示さず)を通過する。
【００２３】
図５を参照すると、上記フィルタスタックに捕捉された細胞あるいはウイルス(図５には図解の明瞭化のため図示せず)は、トランスデューサ９２(例えば、超音波ホーン)を溶解室８６の壁に直接結合することによって溶解される。この実施形態において、溶解室８６の壁は、可撓ガスケット６３によって形成されている。トランスデューサ９２は、上記壁の外面に直接接触するべきである。「外面」とは、溶解室８６の外面である壁の表面を意味している。トランスデューサ９２は、溶解室８６において作動させられて圧力波を発生する振動装置である。この圧力波は、ビーズ９６,９９(図６)を振り動かし、ビーズのこの動きが、捕捉された細胞あるいはウイルスを破裂させる。一般に、溶解室８６の壁に接触するトランスデューサは、超音波、圧電、磁気歪、あるいは静電のトランスデューサでよい。また、トランスデューサは、ボイスコイルモータあるいはソレノイド装置などの巻きコイルを有する電磁装置であってもよい。アクチュエータは、超音波ホーンなどの超音波トランスデューサであるのが目下好ましい。適切なホーンとしては、アメリカ合衆国０６４７０−１６１４コネチカット州ニュートン、チャーチ・ヒル５３番に事務所を有するソニックス・アンド・マテリアル・インコーポレーテッドのものが市販されている。これと択一的に、超音波トランスデューサは、圧電ディスクあるいはコンテナに連結されるその他のいかなる種類の超音波トランスデューサを備えていてもよい。ホーン構造は非常に反響し、再現可能で活発な励磁波とホーン先端の大きな動きをもたらすため、超音波ホーンを用いるのが目下好ましい。
【００２４】
図６において既に述べたように、フィルタスタックは、その両端にガスケットを有している。図５に示されるように、カートリッジの中央片２４は、シールリップ９０を有しており、このシールリップに対して、フィルタスタックの一端のガスケットが圧縮される。フィルタスタックの他端のガスケットは、フィルタリング８８によって圧縮され、シールを形成する。ガスケット材料は、シールリップ９０の外側のレリーフに張り出してもよい。シールリップ９０の幅は狭く（通常０.５ｍｍ）、十分な密閉を行うのに余分な力を必要としない。
【００２５】
上記フィルタリング８８は、フィルタスタックとカートリッジガスケット６３の間に保持されている。カートリッジガスケット６３は、中央片２４と底部片２６の間にシールリップ406によって保持されている。したがって、力は底部片２６からガスケット６３を介してフィルタリング８８へ伝わり、最後にフィルタスタックに伝わる。フィルタリング８８は、ガスケット６３と接触する接触リップ404を含んでいる。この接触リップ404は、密閉は行うものの、主要なシールリップではなく、一つの力伝達機構である。接触リップ404の幅はシールリップ９０の幅よりも大きく、撓みおよび密閉作用はフィルタスタックで発生し、カートリッジガスケット６３を圧搾する際には生じないようになっている。また、カートリッジ中央片２４は、フィルタリング８８を取り囲むシールリップ４０６を有している。このシールリップは、フィルタリング８８の存在によって影響を受けることのない有効密閉領域である。このため、シールリップ406とフィルタリング８８上の接触リップ404との間には隙間407がある。この隙間407は、ガスケット６３がシールリップ406と接触リップ404によって圧縮されるときに、隙間407へ突出することができるようにするために備えられている。接触リップ404がシールリップ406と異なる高さになる場合、このシールは、隙間407およびリップ404と406との間の距離により、影響を受けることがない。
【００２６】
図６を再び参照すると、フィルタスタック８７は、試料流体がスタック８７を通過するときに、スタック内のフィルタ９４,97,100のどれも目詰まりさせることなく、細胞やウイルスを捕捉するのに効果的である。(穴の大きさが最も大きい)第１フィルタ９４は、塩の結晶、細胞片、毛髪、組織などの粗粒物質を濾過する。(穴の大きさが中くらいの)第２フィルタ９７は、試料流体中の細胞やウイルスを捕捉する。(穴の大きさが最も小さい)第３フィルタ100は、試料中のさらに小さい細胞やウイルスを捕捉する。したがって、フィルタスタック８７は、フィルタを目詰まりさせずに、大きさが異なる試料成分の同時捕捉を可能にする。第１フィルタ９４の平均的な穴の大きさは、試料流体から粗粒物質(例えば、塩の結晶、細胞片、毛髪、組織)を濾過して取り除くのに十分小さく、かつ、所望の分析物(例えば、核酸やたんぱく質)を含有する目標細胞やウイルスを通過させるのに十分大きくなるように選択される。一般に、第１フィルタ９４の穴の大きさは、約２〜２５μｍの範囲にあるのが望ましく、現在好ましいとされている穴の大きさは約５μｍである。
【００２７】
第２，第３フィルタの平均的な穴の大きさは、所望の分析物を含有する目標細胞あるいはウイルスの平均的な大きさに応じて選択される。例えば、一実施形態では、フィルタスタック８７は、淋疾(ＧＣ)およびクラミジア(Ｃｔ)有機体を捕捉して、試料流体中の疾患の存在を決定するのに用いられる。ＧＣおよびＣｔ有機体は異なる平均直径を有しており、ＧＣ有機体は約１〜２μｍ、Ｃｔ有機体は約０.３μｍである。この実施形態において、第２フィルタ９７は、平均の穴の大きさが約１.２μｍである一方、第３フィルタ100は、平均の穴の大きさが約０.２２μｍであるので、ＧＣ有機体のほとんどは、第２フィルタ９７によって捕捉される一方、Ｃｔ有機体のほとんどは、第３フィルタ100によって捕捉される。したがって、フィルタスタックは、異なる大きさの目標有機体の同時捕捉を可能にし、フィルタを目詰まりさせることなくこれを行う。フィルタ９７,100の穴の大きさは、あらゆる大きさの所望の細胞あるいはウイルスを捕捉するように選択することができ、本発明の範囲は上述の特定の例に限定されるものではない。
【００２８】
また、フィルタスタック８７は、捕捉された細胞あるいはウイルスを破裂させ、細胞内の物質（例えば核酸）を細胞から解放するのに有効である。この点において、第１,第２組のビーズ９６,９９は二つの有益な目的にかなうものである。まず第一に、ビーズは、トランスデューサによって発生させられた圧力波によって攪拌される。ビーズのこの動きは、捕捉された細胞あるいはウイルスを破裂させる。第二に、ビーズは、溶解された細胞あるいはウイルスから放出された核酸をせん断し、核酸のストランド(染色分体)がフィルタを通過して溶解室８６から流出するように、核酸のストランドを十分に短くすることができる。細胞あるいはウイルスを破裂させるのに適したビーズには、ホウケイ酸ガラス、石灰ガラス、シリカ、およびポリスチレンのビーズがある。
【００２９】
ビーズは、多孔でも無孔でもよく、好ましくは１〜200μｍの範囲の平均直径を有している。ビーズ９６,９９の平均直径は、ビーズによって破裂させるべき目的の目標細胞あるいはウイルスに応じて選択される。第１組のビーズ９６の平均直径は、第２組のビーズ９９の平均直径と同一でもよい。これと択一的に、第１組のビーズ９６が、第２組のビーズ９９によって破裂させられるべき種類の細胞あるいはウイルスとは異なる種類の目標細胞あるいはウイルスを破裂させるのに用いられる場合、第１組のビーズ９６の平均直径が第２組のビーズ９９の平均直径とは異なるように、ビーズの平均直径を選択することが有利である。例えば、フィルタスタックが上述のようにＧＣやＣｔ細胞を捕捉するのに用いられる場合、ビーズ９６は、ＧＣ有機体を破裂させるための直径２０μｍのホウケイ酸ガラスビーズであり、ビーズ９９は、Ｃｔ有機体を破裂させるための直径106μｍのソーダ石灰ガラスビーズである。シリコンガスケット９５,９８は夫々、ビーズ９６,９９が移動したり、細胞あるいはウイルスを破裂させるための空間を提供するのに十分な厚さを備えるべきである。
【００３０】
網102は、２つの有用な目的にかなう。第１に、網はフィルタスタック８７を支えている。第２に、網は気泡を破裂させ、泡がフローリブ９１を経て溶解室８６から外へ運ばれるようにする。効果的に気泡を破裂させるため、あるいは気泡の大きさを小さくするために、網102は網目が細かいことが好ましい。網目の平均の大きさが約２５μｍであるポリプロピレンで織られた網であるのが好ましい。気泡が溶解室８６から逃げるのを確実にするために、フィルタスタック８７および溶解室８６を経て液体が(重力に対して)流れ上がる向きでカートリッジを用いるのが望ましい。溶解室８６を通る上向きの流れは、溶解室８６から気泡が出ていくのを助ける。こうして、液体が溶解室８６に入るための入口ポートは、一般に溶解室の最も低い位置にあるべきであり、一方、出口は最も高い位置にあるべきである。
【００３１】
フィルタスタックについて多くの異なる実施形態が可能である。例えば、他の一実施形態において、フィルタスタックは２つのフィルタとこの２つのフィルタの間に１組のビーズを有するだけである。第１のフィルタの網目は最も大きく（例えば５μｍ）、塩の結晶、細胞の破片、毛髪や組織等といった粗い物質を濾過して取り除く。第２のフィルタの網目は第１のフィルタよりも小さくて、捕捉されるべき目的細胞あるいはウィルスよりも僅かに小さい。このようなフィルタスタックは、図３８を参照して後述する。カートリッジの他の実施形態において、(粗い物質の濾過のために)網目の大きさが最大であるフィルタは、溶解室８６の上流に位置するフィルタ室(図示せず)の中に置かれている。一つの流路がフィルタ室を溶解室８６へ接続している。この実施形態では、溶解室内で目的細胞あるいはウィルスを捕えるために、試料流体は最初にフィルタ室内の粗いフィルタを通り、それから溶解室内の第２のフィルタを通る。
【００３２】
さらに、フィルタスタック内のビーズは、目的細胞あるいはウィルスの捕獲を促進するように、試料流体内の目的細胞あるいはウィルスへの結合親和性を有していてもよい。例えば、試料内の目的細胞と結合するために、抗体あるいは或る受容体がビーズの表面に塗られていてもよい。さらに、溶解室８６は、目的細胞あるいはウィルスと相互に作用し合う２つの異なる型のビーズを収容していてもよい。例えば、溶解室は、目的細胞あるいはウィルスと結合するように抗体あるいは受容体で覆われた第１の１組のビーズと、捕捉された細胞あるいはウィルスを破裂させる第２の１組のビーズ(第１の１組のビーズと混合されている)を収容していてもよい。溶解室８６内のビーズもまた、破裂した細胞あるいはウィルスから放たれた細胞内の物質(例えば核酸)との結合親和性を有していてもよい。そのようなビーズは、続く分離および分析のために、目的核酸を分離するのに役立つ。例えば、溶解室はＤＮＡを分離するためにシリカビーズを有していてもよく、ＲＴ−ＰＣＲのための伝達ＲＮＡを分離するために、オリゴｄｔを有するセルローズビーズを収容してもよい。溶解室８６はまた、ＰＣＲを妨げる不要な物質(例えばタンパク質やペプチド)あるいは化学薬品(例えば塩、金属イオン、洗剤)を、試料から除去するビーズを収容してもよい。例えば、溶解室８６はタンパク質を除去するためのイオン交換ビーズを含んでいてもよい。これと択一的に、イミノ二酢酸のような金属イオンキレート化剤を有するビーズは、生物学的試料から金属イオンを除去する。
【００３３】
図２１,図２２は、反応容器４０の概略を示している。図２１は一部破断した容器４０を示し、図２２は容器４０の正面図を示している。容器４０は、反応混合物を収容する(本実施形態ではダイヤモンド形の)反応室４２を備えている。容器４０は、反応混合物に対して出入りする伝熱が最適になり、かつ、反応混合物を効率良く目視できるように設計されている。上記容器の薄い形状は、熱伝導および熱板との接触のための広い面積を提供することによって、最適の熱力学特性に寄与する。さらに、容器の壁は、反応室４２を覗き込む窓を提供し、反応混合物の全体が目視検査できるようになっている。より詳しくは、図２１,図２２の如く反応容器４０は、反応室４２の側壁５７A,５７B,５９A,５９Bを区画する剛な枠４６を有する。この枠４６は、また、反応室４２に入口ポート４１およびこの入口ポートを反応室４３に接続する流路５２を区画する。入口ポート４１と流路５０は、反応室４２に液体を加えるために用いられ、流路５２と出口ポート４３は、反応室４２からの液体の出口として用いられる。アラインメント・プロング４４A,４４Bは、カートリッジの組み立て中に容器４０を正確に位置決めするために用いられる。
【００３４】
図２１に示すように、容器４０は、剛な枠４６の両側に取り付けられて反応室の対向する主壁を形成する薄い柔軟なシートを有する。(図１には、図解の明瞭化のため剛な枠４６から分解された主壁４８が示されている。) かくて、反応室４２は、枠４６の剛な側壁５７A,５７B,５９A,５９Bと、対向する主壁４８とによって区画される。対向する主壁４８は、側壁５７A,５７B,５９A,５９Bが主壁４８を互いに連結するように枠４６の両側に封着される。主壁４８は、反応室４２に収容された反応混合物への最適な熱伝導を促進する。各主壁は、十分に柔軟で、夫々の熱面に合致するように接触して、熱面と反応室４２に収容された反応混合物との間の最適な熱接触および熱伝達を提供する。さらに、柔軟な壁４８は、熱交換作用の経過中の熱的膨張または収縮によって面の形状が変化しても、熱面に合致し続ける。
【００３５】
図２３に示すように、柔軟な壁４８に接触する熱面は、反応室４２を挟むように配置された１対の対向する板190A,190Bによって形成されるのが好ましい。容器４０の反応室４２が板190A,190Bの間に挿入されると、この板の内面は壁４８に接触し、柔軟な壁は板の面に合致する。板は、枠４６の厚さによって定義される反応室４２の厚さＴと等しい距離だけ互いに隔たっているのが好ましい。この位置で、板面と壁４８の間には最小の隙間があるか、あるいは隙間が全くない。板は、種々の熱素子によって加熱および冷却され、後に詳しく述べるように反応室４２内の温度変化を引き起こす。
【００３６】
壁４８は、ポリプロピレン,ポリエチレン,ポリエステル,他のポリマーなどの高分子材料からなる柔軟なフィルムであるのが好ましい。このフィルムは、例えば積層板等のように積層されているか、あるいは均質にすることができる。積層されたフィルムは、均質なフィルムよりも一般に良好な強度と構造上の完全性を有するので、より好ましい。特に、積層されたポリプロピレンフィルムは、ＰＣＲ(ポリメラーゼ・チェーン・リアクション)に対して抑制的でないので、現時点で好ましい。これと択一的に、壁４８は、急速な伝熱を可能にする薄くて柔軟なシートに形成できる他の材料から作ることができる。良好な熱伝導性を得るには、各壁４８の厚さは、好ましくは略0.003〜0.5mm、より好ましくは0.01〜0.15mm、最も好ましくは0.025〜0.08mmである。
【００３７】
再び図２２を参照すると、容器４０は、反応室４２内の反応混合物をその場所で目視検査するための目視窓を有するのが好ましい。好ましい実施形態では、目視窓は、剛な枠４６の側壁５７A,５７Bである。側壁５７A,５７Bは、反応室４２内の反応混合物を側壁５７Aを介して励起でき、かつ、反応室４２から放射される光を側壁Bを介して検出できるように透光性である。矢印Ａは、側壁４２を介して反応室４２に入射する照射光束を示し、矢印Ｂは、側壁５７Bを介して出射する放射光(例えば反応混合物中の標識が付けられた分析対象物から放出される蛍光)を示す。
【００３８】
側壁５７A,５７Bは、互いに角度が偏らせられているのが好ましい。側壁５７A,５７Bは、略９０°の角度だけ互いに偏っているのが一般に好ましい。励起光路と検出光路のなす９０°の角度は、側壁５７Aを介して入射する最少量の励起放射が、側壁５７Bを介して出射することを保証する。さらに、上記９０°の角度は、側壁５７Bを介して捕集されるべき最大量の放射光(例えば蛍光)を可能にする。側壁５７A,５７Bは、反応室４２の底部で「Ｖ」字状の交差をなすように互いに繋がるのが好ましい。これと択一的に、角度をなす側壁５７A,５７Bは、互いに直接繋がる必要はなく、容器の熱的および光学的性能を損なわない他の壁や種々の機械的または流体的特徴部分などの中間部分によって分離されることができる。例えば、側壁５７A,５７Bは、反応室４２に連通する一体化された毛細管電気泳動領域などの他の処理領域に導くポートで繋がることができる。この実施形態では、側壁５７A,５７Bの交差点の下方の枠４６から、位置決めタブ５８が延び出している。タブ５８は、図２８を参照して後述する熱交換モジュールに容器４０を適切に位置付けるために用いられる。
【００３９】
最適な光学的感度は、反応混合物中の標識が付けられた分析対象物を励起する光束および検出される放射光の光路長を、下式で示されるように最大化することによって達成される。
Ｉ0／Ｉi＝Ｃ*Ｌ*Ａ
ここで、Ｉ0はボルトで表示したフォトンなどの放射光の出力照度、Ｃは検出されるべき分析対象物の濃度、Ｉiは入力照度、Ｌは光路長、Ａは分析対象物の標識に用いた染料の固有吸光率である。
【００４０】
本発明の薄くて平坦な反応容器４０は、分析対象物の単位体積当たりの最大の光路長を与えることによって、検出感度を最適化する。図２３,図２７を参照すると、容器４０は、反応室４２の各側壁５７A,５７B,５９A,５９Bの長さＬが１〜１５mm、反応室の幅Ｗが1.4〜２０mm、反応室の厚さＴが0.5〜５mm、反応室の幅Ｗの厚さＴに対する比が２:１であるように構成されるのが好ましいい。これらのパラメータは、反応室を通る平均で１〜１５mmという比較的大きい平均光路長を持ち、しかも内部に収容する反応混合物の非常に急速な加熱と冷却を可能にするに十分薄い容器を提供するので、現時点で好ましい。反応室４２の平均光路長は、側壁５７Aの中央から反応室４２の中心までの距離に、反応室４２の中心から側壁５７Bの中央までの距離を加えた長さである。
【００４１】
より好ましくは、容器４０は、反応室４２の各側壁５７A,５７B,５９A,５９Bが、５〜１２mmの範囲の長さＬと、７〜１７mmの範囲の幅Ｗと、0.5〜２mmの範囲の厚さＴとを有し、反応室の厚さＴに対する幅Ｗの比が、少なくとも４:１である。これらの範囲は、容器を反応室の非常に急速な加熱と冷却を可能にするに十分薄く維持したまま、より長い平均光路長(つまり、５〜１２mm)と１２〜100μlの範囲の体積容量とをもつ容器を提供するので、より好ましい。比較的大きい体積容量は、核酸などの低濃度の分析対象物の検出感度を増加させる。
【００４２】
好ましい実施形態では、反応容器４０は、側壁５７A,５７B,５９A,５９Bで区画されるダイヤモンド形の反応室４２を有し、各側壁は、略１４mmの幅と、枠４６の厚さによって定義される１mmの厚さＴと、略100μlの体積容量とを有する。この反応容器は、反応室４２を通る１０mmという比較的長い平均光路長を提供する。加えて、薄い反応室は、内部に収容する反応混合物の非常に急速な加熱および冷却の少なくともいずれかを可能にする。ダイヤモンド形の反応室４２は、反応室が反応混合物で満たされる際、反応室内での気泡の形成を防ぐ助けをするとともに、反応混合物の目視検査を助ける。
【００４３】
図２２を再び参照すると、枠４６は、側壁５７A,５７Bが透光性になるように、例えばポリカーボネートや透明なポリプロピレンなどの透光性の材料で作るのが好ましい。ここで用いる透光性という用語は、１以上の波長の光が側壁を通ることを意味する。好ましい実施形態では、透光性の側壁５７A,５７Bは、実質上透明である。さらに、透光性の側壁５７A,５７Bの上に１以上の光学要素を設けることができる。光学要素は、例えば、光源によって照射される溶液の全体積を最大化したり、反応室４２の特定の領域に励起光を集光したり、反応室の可能な限り大きい部分からの可能な限り多くの蛍光信号を集めたりできるように設計される。これと択一的な実施形態では、光学要素は、特定の波長を選択する(回折)格子や、特定の波長のみを通すフィルタや、フィルタ機能を果たす色レンズで構成できる。側壁の表面は、特定の波長の吸収を増加させる液晶などの材料で作るか、被覆することができる。この好ましい実施形態では、透光性の側壁５７A,５７Bは、実質上透明で略１mmの厚さをもつ平坦な窓である。
【００４４】
側壁５９A,５９Bは、この側壁５９A,５９Bを経て反応室４２から出ようとする光を内方へ反射する反射面５６を備えるのが好ましい。反射面５６は、隣接する面が略９０°の角度だけ互いに偏らせられて配置されている。さらに、枠４６は、側壁５９A,５９Bと支持リブ５３との間に空き空間を区画する。この空き空間は、枠の材料(例えばプラスチック)と異なる屈折率をもつ周囲空気によって占められている。反射面５６は、上記屈折率の差によって側壁５９A,５９Bを経て反応室から出ようとする光を内方へ効果的に反射し、側壁５７A,５７Bを経る光学信号の検出を増大させる。好ましくは、透光性の側壁５７a,５７Bは、ダイヤモンド形の底部を区画し、逆反射の側壁５９A,５９Bは、反応室の頂部を区画する。
【００４５】
反応容器４０の好ましい製作方法を、図２１,図２２を参照しつつ説明する。反応容器４０は、公知の射出成形技術を用いて剛な枠４６をまず成形することによって作られる。枠４６は、例えば透明なポリプロピレンなどのポリマー材料からなる単一片として成形するのが好ましい。枠４６が作られた後、薄くて柔軟なシートが、所定寸法に切断され、反応室４２の主壁４８を形成するように枠４６の両側に封着される。主壁４８は、例えばポリプロピレンのフィルムなどのポリマー材料を流し込みまたは押し出して作るのが好ましく、このフィルムは、所定寸法に切断され、次の手順を用いて枠４６に取り付けられる。第１のフィルムが、枠４６の片面を覆うように置かれる。枠４６は、フィルムの頂縁を整列させるタックバー４７を持つのが好ましい。フィルムは、タックバー４７から下方の枠４６の下部を完全に覆い、かつ、フィルムの頂縁がタックバー４７に整列するようにして枠４６の下部を覆って置かれる。フィルムは、容易に保持して枠を横切って平坦に引き伸ばせるように、枠４６の下部よりも大きい。次いで、フィルムは、枠を覆うフィルムの部分を枠にクランプし、枠の外周を越えて外方へ延びるフィルム部分を、例えばレーザやダイス型を用いて切除することによって、枠の輪郭に一致する寸法に切断される。そして、フィルムは、好ましくはレーザを用いて枠にタック溶接される。
【００４６】
次に、フィルムは、好ましくはヒートシールによって枠４６に封着される。ヒートシーリングは、接着剤や溶剤接着技術を用いた場合のような潜在的汚染物質が容器に導入されることなく、強力なシールを作ることができるので、本実施形態で用いられる。また、ヒートシーリングは、簡単で安価である。ヒートシーリングは、例えば加熱プラテンを用いて行なわれる。反応室４２を完成すべく枠４６の反対面に第２のシートを切断して封着するために、同じ手順が用いられる。この製造手順には、多くの変形例が可能である。例えば、択一的な実施形態では、フィルムは、枠４６の下部を横切って引き伸ばされて、フィルムを所定寸法に切断する前に枠に封着される。フィルムを枠に封着した後、枠の外周を越えて外方へ伸びるフィルム部分が、たとえばレーザやダイス型を用いて切除される。
【００４７】
本実施形態では、単一片として枠４６をモールド成形したが、枠を複数の片から作ることもできる。例えば、角度をなす光学窓を形成する側壁５７A,５７Bは、良好な透明性をもつポリカーボネートをモールド成形して作る一方、枠の残りの部分は、安価でＰＣＲ(ポリメラーゼ・チェーン・リアクション)と互換性があるポリプロピレンをモールド成形して作ることができる。例えば、側壁５７A,５７Bは、プレス嵌めまたは接着の少なくともいずれかで枠４６の残りの部分に取り付けられる。次いで、柔軟な壁４８は、前述のように枠４６の両側に取り付けられる。
【００４８】
図３を再び参照すると、反応容器４０のポート４１,４３を対応するカートリッジ本体内の流路８０,８１(図４)に封着するために、本実施形態ではガスケット６１を用いている。これと択一的に、ルアー(luer)嵌め、締り嵌め、またはスエージング嵌めを用いて流体シールを行なうこともできる。他の実施形態では、カートリッジ本体と反応容器４０の枠は、単一部材としてモールド成形され、反応容器の主壁は、枠の両側にヒートシールされる。
【００４９】
再び図２２を参照すると、反応室４２は、液体(例えば反応混合物)をポート４１と流路５０を経て反応室４２に強制的に流入させることによって、充填される。液体は、差圧(つまり、液体を入口ポート４１を経て押し込み、あるいは出口ポート４３に真空を加えて液体を吸い出す)を用いて強制的に反応室４２に流入させることができる。液体が反応室４２を充填すると、液体は反応室内の空気と置き換わる。置き換えられる空気は、流路５２とポート４３を経て排出される。反応室４２内の分析対象物を最適に検出するには、反応室は、気泡を含んではならない。反応室４２内に気泡がトラップされるのを防止するため、反応室４２と出口流路５２との間の接続は、反応室４２において(重力に対して)最も高い位置になければならない。これが、反応室４２内の気泡を、トラップされることなく外部へ逃がさせる。従って、容器４０は、図２２に示すように鉛直に向けて用いられるように設計されている。
【００５０】
図２５は、水平に向けて用いられるように設計された他の反応容器206を示している。この反応容器206は、入口ポート４１と、この入口ポート４１を反応室４２の底部に接続する入口流路５０とを有する。上記反応容器は、また、出口ポート４３と、この出口ポート４３を反応室４２の頂部に接続する出口流路５２とを有する。こうして、反応室４２内の気泡は、トラップされることなく総て出口流路５２を経て外部へ逃げる。図２６は、２つの入口ポート４１,４５と１つの出口ポート４３をもつ他の容器207を示している。入口流路５０,５４は、夫々の入口ポート４１,４５を反応室４２に接続し、出口流路５２は、反応室４２を出口ポート４３に接続する。反応容器の多くの異なった実施形態が可能である。各実施形態において、反応室４２を(重力に対して)最も高い点から排気し、反応室内により低い点から液体を導入するのが好ましい。
【００５１】
図１５Ａ,図１５Ｂは、キャリッジに用いられる２種類の弁を示している。図１５Ａに示すように、弁の動作には２種類の基本的概念があり、従って２種類の弁がある。第１の弁は、キャリッジケースの中央片２４に形成された円錐形状つまり円錐状の弁座160を用いている。弁座160は、中央片２４にモールド成形または機械加工された窪みや凹部や穴である。弁座160は、円錐状の弁座160の中心で交差するポートまたは流路157を介して反応室167に連通する。図１５Ｂに示すように、球面をもつ弁アクチュエータ164は、弾性部材６３に押し付けられて弁座160に着座し、膜６３と弁座160との間に円環状の接触を確立する。この運動学的原理は、円錐に着座する球の原理である。膜６３と弁座160とによって形成される円状のシールは、流路157(と従って反応室167)と弁座160の側部から延び出す側流路158との間の流れを防止する。側流路158は、膜６３とカートリッジの中央片２４とによって区画される。
【００５２】
図１５Ａに示すように、他の種類の弁は、流路158と、膜６３とカートリッジの中央片２４との間に形成される他の側流路159との間の流れを制御する。この場合、円環状の接触は、有効ではない。その代わりに、第２の弁は、カートリッジの中央片２４に形成された窪みや凹部や穴161で構成される。穴161は、流路158と159を互いに分離する。流路158の端部は、穴161の一方の側に配置され、流路159の端部は、穴161の他方の側に配置される。穴161は、流路158の端部近傍に位置する第１曲面162Aと、流路159の端部近傍に位置する第２の曲面162Bと、第１,第２の曲面162A,162Bの間の第３の面162とによって区画される。図１５Ｂに示すように、曲面は、流路158と流路159との間の流れをシールするための膜６３の基本的接触領域である２つの弁座を備えている。この運動学的原理は、3つの接触点で支えられる球(または弁アクチュエータの球状の端部)と、アクチュエータに働く上向きの力と、２つの弁座162A,162Bとの原理である。
【００５３】
図１６Ａに示すように、第１の曲面162Aと第２の曲面162Bは、好ましくは同心の球面である。弁アクチュエータ164も、膜６３を曲面162A, 曲面162Bに密に押し付ける球面を有する。さらに、各曲面162A,162Bは、弁アクチュエータ164の曲率半径Ｒ２に膜６３の厚さＴを加えた組み合わせ半径に等しい曲率半径Ｒ１を有するのが好ましい。例えば、弁アクチュエータ164の曲面の曲率半径Ｒ２が0.094インチで、膜６３の厚さＴが0.094インチであれば、各曲面162A,162Bの曲率半径は、0.125インチである。一般に、弁座の寸法と曲率半径は、カートリッジ内の流路の寸法に依存する。弁は、流路を効果的にシールするに十分な大きさであって、カートリッジ内の無駄な空間を最小化するように作られるのが好ましい。
【００５４】
図１６Ｂに示すように、第３の面163は、膜６３が第１,第２の面162A,162Bに押し付けられるとき、膜６３と第３の面163との間に隙間166が生じるように第１,第２の面から窪ませて作られている。換言すれば、第１の面162Aと第２の面162Bは、第３の面163から上昇または隆起させれられている。隙間166は、膜６３によって最大の圧力が弁座162A,162Bに加わるように、膜６３が凹部161の全面でなく、弁座162A,162Bに基本的に接触することを保証する。これによって、最小のアクチュエータ力でもって非常に強いシールが提供される。
【００５５】
再び図１５Ｂを参照すると、両方の種類の弁において、夫々の運動学的原理が、嵌合する部材の位置を定義する。円錐内の球の概念および２つの球面と接触する球の概念のいずれにおいても、球または球状に形成された弁アクチュエータは、弁座に押し付けられるとき、それ自身の位置を実現しようとすることが可能になる。弁アクチュエータとキャリッジの底部片２６内の穴との間には、弁座の作用のみが嵌合片の位置を決めるようにアクチュエータが移動するような熟考された隙間(例えば0.01〜0.03インチ)がある。
【００５６】
弁アクチュエータは、種々の機構によって制御できる。図１７〜図１９は、このような機構を示している。図１７に示すように、弁アクチュエータ172は、ガスケット６３を弁座に押し込むような球面を有する。アクチュエータ172は、下部にフランジ177も有する。カートリッジは、カートリッジの底部片２６の出っ張りに当接して弁アクチュエータをガスケット６３に向けて付勢するばねなどの弾性体を備える。ばね174は、熟考された力がアクチュエータ172を押し下げるように働かない限り、十分に強力で弁を閉じる。キャリッジ内の弁は、キャリッジの使用前の運送や保管のために、このようにして閉状態に維持される。こうして、キャリッジは、試料液を分析するための必要な試薬と洗剤が予め製造中に充填され、これらの充填液体が運送や保管中に漏れ出すことがない。
【００５７】
アクチュエータを押し下げる機構は、通常、試料分析のためにキャリッジが置かれる装置内に設けられる(このような装置の１つは、図１０を参照して詳しく後述する)。押し下げ機構は、アクチュエータ172のフランジ177を収容する顎部181をもつ枢着された押し下げ部材180を回転させるスライドガイド175で構成される。図１８に示すように、スライドガイド175は、枢着された押し下げ部材180を、フランジ177が顎部181内に位置するまで回転させる。図１９に示すように、ソレノイド146は、押し下げ部材180、従って弁アクチュエータ172を押し下げ、その結果、ガスケット６３が弁座から開放され、弁が開き、流路170と流路171間に液体が流れる。
【００５８】
図２０は、カートリッジ内の試料室、洗剤室、中和室、および試薬室に対して流体が制御されて流入および流出する様子を示している。これらの各室は、図２０の室414で示されるように、ガスは通すが液体は通さない疎水性の膜410で覆われている。疎水性の膜410は、室414と圧力ポート３２の間に位置付けられている。圧力ポート３２は、カートリッジの頂部片２２内に設けられ、室414の上に位置する。膜410は、キャリッジの運送や保管中に、仮にキャリッジが倒立したとしても、室414内に液体を保持する。圧力ポート３２は、圧力ノズル812を収容するような寸法になっており、上記圧力ノズルは、通常外部の装置に設けられる圧力源(例えば真空ポンプまたは空気圧ポンプ)に接続される。ノズル182は、Ｏリング184とフランジ415とを有する。ばね185は、フランジ415に当接してノズル182を圧力ポート３２に押し付け、Ｏリング184が圧力ポート３２の周りのシールを確立する。運転において、正の空気圧または真空が、圧力ポート３２を介して室414に加えられ、室414に対して液体を強制的に流入または流出させる。
【００５９】
円錐状の弁座160(図１５Ａ,図１５Ｂを参照して既に述べた)は、室414と接続流路411との間の液体の流れを制御すべく室414の下方のカートリッジの中央片２４内に設けられている。弁は、フランジ187と、このフランジに当接して、アクチュエータ186に下向きの力が加わるまで弁を閉状態に保持するばね188とをもつ弁アクチュエータ188によって、開閉される。下向きの力は、弁を開くべくアクチュエータ186を押し下げるソレノイドによって加えられるのが好ましい。弁アクチュエータ186とソレノイドは、前述の装置に設けられる。
【００６０】
図７,図８は、カートリッジの上面図と底面図を夫々示している。図９は、は、カートリッジの概略ブロック図である。図７〜図９のいずれにも示されるように、カートリッジは、カートリッジに流体試料を加えるポートをもつ試料室６５と、この試料室６５から延び出す試料流路とを有する。試料流路は、試料室６５から延び出して、弁107を経て流路106に入る。流路106は、センサ域を有し、センサ域の流路106は、流路内に液体が存在することを容易に目視検出できる平坦な底部を有する。試料流路は、流路106から溶解室８６に入ってフィルタスタック８７を通る。試料流路は、流体が溶解室８６から出る流路109と、平坦な底部の検出域137をもつ流路110と、弁111と、弁114を経て通気孔をあけた廃液室６８に導く流路112とを有する。
【００６１】
カートリッジは、また、洗剤溶液を保持する洗剤室６６と、リジン試薬を保持する試薬室６７とを有する。洗剤室６６は、弁115、流路117および流路106を経て溶解室８６に接続される。試薬室６７は、弁119、流路117および流路106を経て溶解室８６に接続される。試料成分(例えば、試料中の細胞またはウィルス)は、フィルタスタック８７に捕捉され、溶解室８６内で溶解されて試料成分から目標の分析対象物(例えば、核酸)が解き放たれる。カートリッジは、また、溶解室８６から延び出して化学反応と光学的検出のための反応容器４０へ、流体試料から分離された分析対象物を運ぶための分析対象物流路を有する。分析対象物流路は、溶解室８６から延び出して、流路109、流路110および弁111を通る。分析対象物流路は、弁111を通った後、試料流路から分岐する。試料流路は、流路112を経て廃液室６８に入る一方、分析対象物流路は、Ｕ字状流路122へ分岐する。次いで、分析対象物流路は、弁124を経て中和室７０に流入した後、流出する。また、分析対象物流路は、弁126を経て主混合室７１に流入した後、流出する。分析対象物流路は、主混合室７１から流路122に沿って延び、弁127と流路８０とポート４１とを経て反応容器４０に入る。
【００６２】
反応容器４０は、この反応容器に反応混合物を加えるためのポート４１と、この反応容器から流体(例えば、空気または過剰な反応混合物)を出すためのポート４３とを有する。カートリッジは、ポート４３と連通する流路８１を有する。流路８１は、この流路に液体が存在することを検出するための平坦な底部の検出域130を有する。流路８１は、流路131(流路131は、図７の上面図の紙面と垂直方向に真直ぐ下方へ延びる)に接続される。流路131は、流路132に接続され、流路132は、弁133を介して流路134(流路134は、図７の上面図の紙面と垂直方向に真直ぐ上方へ延びる)に接続される。流路134は、カートリッジからガスは逃がすが、液体は逃がさない疎水性の膜を有するベント３６に繋がる。反応容器４０の下流に位置する上記流路、ベントおよび弁は、操作の節で後述するように、反応容器の反応室４２を加圧するために用いられる。
【００６３】
カートリッジは、また、試料室６５の上方に位置する第１圧力ポート105と、洗剤室６６の上方に位置する第２圧力ポート116と、試薬室６７の上方に位置する第３圧力ポート118と、中和室７０の上方に位置する第４圧力ポート123と、主混合室７１の上方に位置する第５圧力ポート125と、Ｕ字状流路122の上方に位置する第６圧力ポート128とを有する。カートリッジは、廃液室６８と連通するセンサ室120,121を更に有する。センサ室120,121は、後に詳述するように、廃液室６８に予め定められた体積の液体が収容されたとき、表示を行なう。
【００６４】
図１０を参照すると、カートリッジは、１以上のカートリッジを収容するように設計された装置140と組み合わせて用いるのが好ましい。図解を明瞭化するた、図１０に示された装置140は、カートリッジを１つだけ収容するものである。しかし、上記装置は、複数のカートリッジを同時に処理するように設計できるものと解釈されなければならない。装置140は、処理のためにカートリッジが入れられるカートリッジネストを有する。装置140は、カートリッジの溶解室内に圧力波を発生させるトランスデューサ９２(例えば、超音波ホーン)と、カートリッジ内の９つの弁を動かす９つの弁アクチュエータ142と、弁アクチュエータを押し下げる対応する９つのソレノイド146と、キャリッジ内に形成された対応する６つの圧力ポートに接続するための６つの圧力ノズル145とを有する。更に、上記装置は、圧力ノズル145を経てカートリッジに圧力を供給する１以上の調整された圧力源に接続されるか、この圧力源を有する。適切な圧力源は、油差しポンプ、圧縮空気源、空気圧ポンプまたは外部圧力源への接続手段を有する。上記装置は、３つのスロット付き光学センサ143と、３つの反射型光学センサ144とを有する。
【００６５】
図１３は、センサ室120,121および試薬室６７内の液体を検出するために設けられたスロット付き光学センサ143を示している。各センサ143は、組み込みＬＥＤ(発光ダイオード)と、上記センサの反対側に配置されたホトダイオードとを有する。ＬＥＤは、光束を放射し、この光束は、実質上屈折させられないなら、ホトダイオードによって検出される。このようなスロット付き光学センサは、幾つかのメーカによって市販されている。カートリッジは、スロット付き光学センサが室67,120,121の周りに適合するような形状になっている。各センサの操作は、次のとおりである。センサが取り囲む室内に液体が存在しないなら、ＬＥＤからの光束は、室内の空気によって実質上屈折され、室の内壁で曲がって、あるとしても微弱な信号だけがホトダイオードによって検出される。なぜなら、空気は、プラスッチク製のカートリッジの屈折率とかけ離れた屈折率を持つからである。しかし、室内に液体が存在すると、ＬＥＤからの光束は、僅かあるいは全く屈折されず、ホトダイオードで検出される非常に強い信号が発生される。なぜなら、液体は、プラスチック製のカートリッジの屈折率に近似した屈折率を持つからである。従って、光学センサ143は、室67,120,121に液体が存在するか否かを決めるのに有用である。
【００６６】
図１４は、廃液室６８に連通し、スロット付き光学センサ143によって囲まれたセンサ室120の概略破断側面図を示している。センサ室120とセンサ143は、予め定められた体積の液体が廃液室６８に存在するとき、これを表示するために用いられる。センサ室120は、溢水リム152をもつ壁151によって廃液室６８から部分的に分離されている。上記壁の高さは、予め定められた体積の液体が廃液室６８に収容されたとき、この液体が溢水リム152を越えてセンサ室120に流れ込むように選ばれている。そして、センサ室120内の液体は、センサ143によって検出される。
【００６７】
再び図１３を参照すると、キャリッジは、廃液室６８に連通する第２センサ室121を有する。第２センサ室121も、溢水リムをもつ壁153によって廃液室６８から分離されている。壁153は、壁152よりも高くて、予め定められた第１の体積の流体に加えて予め定められた第２の体積の流体が廃液室６８に収容されるまで、流体が壁153を越えて溢れないようになっている。センサ室120,121と光学センサ143は、カートリッジの操作を制御するのに役立つ。壁152の高さは、試料室６５からの所定体積の試料流体が試料流路を経て廃液室６８に流入したとき、試料流体がセンサ室120に溢れ出して検出されるように選ばれるのが好ましい。センサ室120での試料流体の検出は、洗剤室６６からの洗剤溶液の放出を引き起こし、この洗剤溶液は、試料流路を経て廃液室６８に流れ込む。廃液室６８に収容される洗剤溶液の体積が増加すると、流体は壁153を越えてセンサ室121に流れ込んで、検出される。センサ室121で液体が検出されると、試薬室６７からのリジン試薬の放出が引き起こされる。試薬室６７を取り囲むセンサ143が、試薬室６７が空であることを表示すると、超音波による溶解(溶菌)の開始が引き起こされる。これと択一的実施形態では、カートリッジは、試料用と洗剤用の２つの廃液室を有し、各廃液室は、それに接続された夫々のセンサ室を有する。
【００６８】
インラインの反射型光学センサ144は、流路81,106,110の底部が平坦な検出域130,136,137内の液体の有無を決定するのに用いられる(図７)。各センサ144は、組み込まれたエミッタと、平坦な底部の検出域の上方に配置された検出器とを有する。エミッタは、光束を放出し、この光束は、カートリッジで反射されて検出器で検出される。センサは、空気／液体の境界が検出域を通過するとき、信号の変化を検出する。オプションとして、検出操作をより信頼性あるものにするため、２重エミッタの反射型光学センサを用いることができる。上記２種の反射型光学センサは、この技術分野で周知であり、市販されている。
【００６９】
再び図１０を参照すると、装置140は、カートリッジの反応容器を収容するためのスロット148をもつ熱交換モジュール147を有する。この熱交換モジュール147は、図２８を参照して詳しく後述する。上記装置140は、カートリッジの上方の蓋150をラッチするラッチ機構149を有する。カートリッジネスト141は、カートリッジの脚を収容する整列穴401を有する。整列穴401は、ネスト内にカートリッジを適切に位置決めすることを保証し、その結果、圧力ノズル145、トランスデューサ９２および弁アクチュエータ142は、キャリッジ内の対応するポートに嵌合し、反応容器は、スロット148に嵌合する。トランスデューサ９２は、カートリッジがネスト141に入れられるとき、図５の破断図に示すように、溶解室８６の底壁に接触するように装置140内に位置決めされなければならない。さらに、上記装置は、トランスデューサ９２を溶解室８６の壁に当接するように付勢するばねなどの機構を有する。
【００７０】
装置140は、ソレノイド146、トランスデューサ９２、熱交換モジュール147および光学センサ143,144の操作を制御するマイクロコントローラをもつ主論理ボードを含む図１０に図示しない種々の慣用の装備を備える。上記装置は、この装置およびノズル145を経て空気圧を供給する空気圧ポンプに電力を供給する電源を備えるか、あるいは電源に接続される。装置140は、例えば操作の節で後述する機能を実行するべくプログラムされたマイクロコントローラなどを用いてコンピュータ制御されるのが好ましい。これと択一的に、上記装置は、分離したコンピュータまたは分離したコンピュータとオンボードのマイクロコントローラの組み合わせによって制御してもよい。
【００７１】
図１１は、装置140に処理のために載せられたカートリッジ２０の等角投影図を示している。図１１は、蓋150を開いた状態での装置140の部分破断図を示している。再び図１１を参照すると、メモリまたはマイクロプロセッサのチップが、カートリッジ２０の一部としてオプションで一体化される。上記チップは、カートリッジの種類などの情報、カートリッジを処理するための特定のプロトコルなどのプログラム情報、出し入れのための公差、クオリティ・トッラキングのための通し番号とロットコードおよび処理の結果を格納するための手段を有するのが好ましい。カートリッジ２０に一体化された電子的メモリは、流体処理の種々のプロトコルに対して装置140を迅速、容易、かつエラーなくセットアップすることができる。カートリッジ２０が装置140に挿入されると、この装置は、カートリッジ上のメモリに電子的に呼びかけて、挿入されたカートリッジについて実行されるべき流体処理のタイムシーケンスを制御するための適切な指令の組を自動的に受け取る。上記装置140は、単にカートリッジのメモリ中の各ステップを順に検索して実行するか、ユーザが例えばコントローラコンピュータを用いてシーケンスを編集できるように、メモリ中の内容をダウンロードする。
【００７２】
カートリッジ上に、書込み可能なメモリ(例えば、紫外線消去型ＰＲＯＭ(ＥＰＲＯＭ)や電気的消去型ＰＲＯＭ(ＥＥＰＲＯＭ))などの適切なメモリが含まれるなら、カートリッジに導入された試料に基づく中間および最終結果は、処理後の物理的試料と一緒に設けられた格納手段であるカートリッジのメモリに、上記装置によって書き込むことができる。このことは、試料と結果を保管することが必要な法医学などの適用例において、特に有利である。さらに、他の情報は、変更できない(または変更できる)形式でカートリッジのメモリに格納することができる。例えば、カートリッジの通し番号、製造ロット情報および関連する情報は、予めプログラムして変更不可にできる。ユーザのデータ、技術的な識別番号、試験日、試験場所および装置の通し番号は、変更できないようにカートリッジに書き込むことができる。このことは、試料を取り扱う際に「管理の鎖」による識別の容易化を可能にする。データ格納の分野の専門技術者は、電子的メモリ手段以外の光学的にアドレス付けられた印刷された領域(例えば、インクジェットや熱的)や磁気テープなどのメモリ手段を想起するであろう。
【００７３】
図２８は、反応混合物中の分析対象物を熱処理し、光学的に検出するために反応容器４０が挿入される上記装置の熱交換モジュールを示している。この熱交換モジュール147は、モジュールの種々の構成要素を保持するハウジング208を備えるのが好ましい。上記モジュール147は、前述の熱板190を有する。ハウジング208は、反応容器４０の反応室がスロットを経て上記熱板の間に挿入できるように、熱板190の上方に(図２８に図示しない)スロットを有する。熱交換モジュール147は、好ましくはファン212などの冷却システムを有する。ファン212は、熱板、従って反応容器内の反応混合物を冷却すべく、熱板190の表面を通り越して冷却空気を送るような位置に設けられている。ハウジング208は、冷却空気を熱板190を越えてモジュール147の外へ向かわせる流路を区画するのが好ましい。
【００７４】
熱交換モジュール147は、光学的な励起アセンブリ216と、反応容器４０に収容された反応混合物を光学的に検査する光学的検査アセンブリ218とを更に有する。励起アセンブリ216は、その電子構成部材を保持するための第１回路板220を有し、光学的検査アセンブリ218は、その電子構成部材を保持する第２回路板222を有する。励起アセンブリ216は、反応容器中の蛍光的に標識付けされた分析対象物を励起するための１以上の光源(例えば、ＬＥＤ、レーザまたは電球)を有する。励起アセンブリ216は、光源からの光を平行にする１以上のレンズと、関係する励起波長領域を選択するフィルタとを有する。検出アセンブリ218は、反応容器４０から放出される光を検出する１以上の検出器(例えば、ホトダイオード、光電子増幅管またはＣＣＤ)を有する。検出アセンブリ218は、放出光を集光し、平行にする１以上のレンズと、関係する放出波長領域を選択するフィルタとを有する。熱交換モジュール147で用いられる適切な光学的励起アセンブリと光学的検出アセンブリは、1999年11月25日に公開された国際公開WO 99/60380号公報(国際出願番号PCT/US99/11182号)に開示され、その開示内容は、参考のため本願明細書に一体化されている。
【００７５】
光学アセンブリ216,218は、反応容器４０の反応室が熱板190板の間に挿入されたとき、励起アセンブリ216が、透光性の側壁５７A(図２２参照)を介して反応室４２と光学的に連通し、検出アセンブリが、透光性の側壁５７B(図２２参照)を介して上記反応室と光学的に連通するように、ハウジング208内に配置されている。好ましい実施形態では、光学アセンブリ216,218は、反応容器の反応室が熱板の間に挿入されたとき、光学アセンブリ216,218が側壁に直接接触するか、側壁に極接近するように、光学アセンブリ216,218を単に熱板190の底部縁に隣接して配置することによって、透光性の側壁と光学的に連通せしめられる。
【００７６】
図３４は、熱板190A,190Bの間に挿入された反応容器の反応室の部分破断等角投影図を示している(反応容器の頂部は切除されている)。反応容器は、透光性の側壁５７A,５７Bで形成された角度をなす(例えば三角形の)底部を有する。各熱板190A,190Bは、対応する形状の底部を有する。第１熱板190Aの底部は、第１底部縁250Aと第２底部縁250Bを有する。同様に、第２熱板190Bの底部は、第１底部縁252Aと第２底部縁252Bを有する。各熱板の第１および第２底部縁は、側壁５７A,５７Bが互いに偏る角度(例えば、９０°)と同じ角度だけ互いに偏っているのが好ましい。さらに、熱板190A,190Bは、反応容器の反応室を挟んで収容するように配置されるのが好ましく、その結果、第１側壁５７Aが実質上各第１底部縁250A,250Bの近傍にこれと平行に位置し、第２側壁５７Bが実質上各第２底部縁252A,252Bの近傍にこれと平行に位置する。この配置は、透光性の側壁５７A,５７B、従って反応容器の反応室への容易な光学的アクセスを提供する。各光学アセンブリと側壁５７A,５７Bの間の光学的連絡を確立または改善するため、ゲルまたは流体がオプションとして用いられる。上記ゲルまたは流体は、結合される要素の屈折率に近い屈折率を有さなければならない。
【００７７】
再び図２８を参照すると、光学アセンブリ216,218は、励起光路と検出光路との間に９０°の角度を与えるように配置されるのが好ましい。励起光路と検出光路の間の９０°の角度は、反応室の第１側壁を経て入射する最少量の励起放射が、第２側壁を経て出射することを保証する。上記９０°の角度は、また、第２側壁を経て集光されるべき最大量の放出放射を可能にする。好ましい実施形態では、反応容器４０は、光学的検出のための反応容器４０の適切な位置決めを保証すべく、光学アセンブリ216,218の間に形成されたスロットに嵌合する位置決めタブ５８(図２２参照)を有する。検出を改善するため、熱交換モジュール147は、反応容器４０の頂部を覆って設けられ、反応容器が熱板190の間に挿入された後にハウジング208を遮光する遮光蓋(図示せず)を有する。
【００７８】
本実施形態では、光学アセンブリ216,218を熱板190の底部縁に隣接して設けたが、他の配置も可能である。例えば、光学アセンブリ216,218と反応容器の側壁との間の光学的連絡は、光ファイバ、光パイプ、導波部材などの装置によって確立できる。これらの装置の１つ利点は、光学アセンブリ216,218を熱板190の物理的近傍に設ける必要がなくなることである。このことは、熱板の周りにより多くの空間を残し、この空間に冷却空気や冷媒を循環させて、冷却を改善することができる。
【００７９】
熱交換モジュール147は、このモジュールの電子構成部材を保持するＰＣボード226と、このモジュール147を装置140(図１０)に接続するエッジコネクタ224とを有する。熱板190上の加熱要素および温度センサと光学ボード220,222は、フレキシブルケーブル(図解の明瞭化のため図２８には図示せず)によってＰＣボード226に接続される。熱交換モジュール147は、光学的検出回路をシールドするための接地トレース228を有する。熱交換モジュール147には、「加熱」、「冷却」、「完了」、「故障」などのモジュールの現在の状況をユーザに表示するＬＥＤなどの表示器をオプションで設けることができる。
【００８０】
ハウジング208は、剛で高性能なプラスチックまたは他の慣用の材料からモールド成形で作ることができる。ハウジング208の主たる機能は、熱板190、光学アセンブリ216,218、ファン212およびＰＣボード226を保持するための枠を提供することである。ハウジング208は、ファン212からの冷却空気を熱板190の表面を横切ってハウジングの外へ向かわせる流路とポートを有するのが好ましい。好ましい実施形態では、ハウジング208は、互いに嵌合することによって熱交換モジュール147の構成部材を挟んで囲む相補的部材片(図２８の概略側面図には一方の部材片のみが示されている)を有する。
【００８１】
図２３を再び参照すると、熱板190A,190Bは、セラミックや金属を含む種々の熱伝導性材料で作ることができる。適切なセラミック材料は、窒化アルミニウム、酸化アルミニウム、酸化ベリリウムおよび窒化シリコンである。上記熱板を作ることができる他の材料は、例えば、砒化ガリウム、シリコン、窒化シリコン、酸化シリコン、水晶、ガラス、ダイヤモンド、ポリアクリル酸、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーおよびポリテトラフルオロエチレンなどのハロゲン化ビニルポリマーである。熱板の他の可能な材料は、クロム／アルミニウム、スーパーアロイ(耐熱合金)、亜鉛合金、アルミニウム、鋼、金、銀、銅、タングステン、モリブデン、タンタル、真鍮、サファイアあるいはこれ以外の当分野で利用できる種々のセラミック、金属またはポリマー材料である。
【００８２】
本実施形態では、内面が非常に高い平滑度に都合良く加工できて高い耐摩耗性が得られ、高い耐薬品性と反応容器の柔軟な壁への良好な熱伝導性が得られることから、セラミック板が用いられている。セラミック板は、好ましくは略0.6〜1.3mmと非常に薄くすることができて、熱容量の低減によって非常に急速な温度変化を与えることができる。セラミックで作られた板は、良好な熱伝導体、かつ電気絶縁体であるので、板の温度は、この板に接続した抵抗加熱要素によって良好に制御することができる。
【００８３】
種々の熱素子を熱板190A,190Bの加熱または冷却に用いることができ、従って反応室４２内の反応混合物の温度を制御するここができる。一般に、板の加熱に適した素子は、導熱ヒータ、対流ヒータまたは放射ヒータである。導熱ヒータの例は、板に連結された抵抗加熱素子または誘導加熱素子である。適切な対流ヒータは、強制送風ヒータまたは板を貫流する流体用の流体熱交換器である。適切な放射ヒータは、赤外線ヒータまたはマイクロ波ヒータである。同様に、板を冷却するために種々の冷却素子を用いることができる。例えば、ファン、ぺルチェ素子、冷凍装置または板の表面を貫流する冷却流体用のジェットノズルである。これと択一的に、例えば板に直接接触する冷却された金属ブロックなどのヒートシンク等種々の熱伝導性の冷却要素を用いることができる。
【００８４】
図２４を参照すると、各板190は、外表面に配置された抵抗加熱要素206を有しているのが好まい。抵抗加熱要素206は、厚いか、または薄いフィルムであり、各板190、特に窒化アルミニウムまたは酸化アルミニウムのようなセラミック材料からなる板上に直接スクリーン印刷される。スクリーン印刷は、高い信頼性と、反応室内の熱を効率的に伝達するための小さな断面積とを有する。より均一な加熱を提供するため、例えば先端部で密に、中間部で疎に抵抗器を配置することによって、幾何学的なパターンを変えた厚いか、あるいは薄いフィルム抵抗器が、板の外側面に積層される。加熱要素を各板の外表面に積層するのが現在好ましいが、これと択一的に、特に板がセラミックの場合、加熱要素は、各板の内側に設けることができる。加熱要素206は、金属,タングステン,ポリシリコン, または電位差が加えられると、熱せられる他の材料で作ることができる。加熱要素206は、夫々の接点204と接続されている２つの端部を有しており、この接点204は、加熱要素に通電すべく電圧源(図２４に示さない)に接続される。各板190は、また熱電対,サーミスタ,またはＲＴＤのような温度センサ192を有するのが望ましく、この温度センサ192は、２つのトレース202によって夫々接点204に接続されている。温度センサ192は、制御された帰還ループで板190の温度を監視するのに使われる。
【００８５】
上記板は、板の迅速な加熱や冷却を可能にすべく小さい熱容量を有する。特に、各板は、５Ｊ/℃以下、好ましくは３Ｊ/℃以下、最も好ましくは１Ｊ/℃以下の熱容量を有する。本明細書で使われているように、板の熱容量という用語は、板の質量と板の比熱の積として定義される。加えて、各板は、反応室の各主壁を覆うのに充分な大きさであるべきである。目下の好ましい実施形態では、各板は、例えば２mm〜２２mmの範囲の幅Ｘと、２mm〜２２mmの範囲の長さＹと、0.5mm〜５mmの範囲の厚さを有する。各板の幅Ｘと長さＹは、反応室の幅と長さより僅かに大きく選ばれている。さらに、各板は、図３４を参照して前述したように、反応室の底部の外形に適合する角度をなす底部を有することが好ましい。また、好ましい実施形態では、各板は、0.75Ｊ/ｇ℃の比熱を有する窒化アルミニウムで作られる。各板の質量は、0.005ｇから5.0ｇの範囲にあるのが好ましく、その結果、各板は、0.00375Ｊ/℃〜3.75Ｊ/℃の範囲の熱容量を有する。
【００８６】
対向する板190は、反応室の柔軟な主壁が板の内面に接触して一致するように反応容器４０の反応室を挟み込んで収容するように配置される。板190は、例えば、ブラケット,支持具,または保持具を用いることによって、お互いに対向して保持されることが目下好まれている。これと択一的に、板190は、国際公開第ＷＯ９８/３８４８７号で述べられているように、互いに近づくようにばねで付勢してもよく、上記国際公開の開示内容は、本明細書に参考として組み込まれている。本発明の他の実施形態では、板の１つは、固定位置に保持され、この一番目の板に向けて、二番目の板が付勢されている。もし、１以上のばねが板を互いに近づくように付勢するのに使われるなら、ばねは、壁が板の内面に一致せしめられるように充分な力で、板が容器の柔軟な壁に押し付けられることを保証するような充分な硬さであるべきである。
【００８７】
図２９と図３０は、互いに対向して板190A,190Bを保持するための好ましい支持構造209を示している。図２９は、支持構造の分解図を示し、図３０は、支持構造の組立図を示している。図の明瞭化のために、支持構造209および板190A,190Bは、図２８の熱交換モジュールでの正常な方向づけを逆にした状態で示されている。図２９を参照すると、支持構造209は、内部に形成されたスロット148を有する取付板210を有する。スロット148は、反応容器の反応室が挿入できるくらいの充分な大きさである。間隔支柱230A,230Bは、スロット148の両側で取付板210から延び出ている。間隔支柱230Aは、その対向する両面に形成された窪み232(図２９の等角投影図では片側のみが見える)を有し、間隔支柱Ｂは、その対向する両面に形成された窪み234(図２９の等角投影図では片側のみが見える)を有している。間隔支柱での窪み232,234は、板190A,190Bの端部を収容するためにある。上記構造を組み立てるために、板190A,190Bは、板の縁が窪み232,234内に位置するように間隔支柱230A,230Bの両側に置かれている。そのとき、板の縁は、適切な保持手段を用いて窪み内に保持される。好ましい実施形態では、板は保持クリップ236A,236Bによって保持される。これと択一的に、板190A,190Bは、接着剤,ねじ,ボルト,クランプ,または他の適切な手段によって保持することができる。
【００８８】
取付板210および間隔支柱230A,230Bは、全体的にプラスチックの単一のモールド成形片として作るのが好ましい。上記プラスチックは、板190A,190Bが熱せられたとき、溶けて変形しないポリエチルイミドのような高温プラスチックであるべきである。保持クリップ230A,230Bは、ステンレス鋼であることが好ましい。取付板210は、各可撓ケーブル238A,238Bを支持するための窪み240A,240Bをオプションで備えてもよく、上記可撓ケーブル238A,238Bは、加熱要素および板190A,190B上に配置された温度センサを熱交換モジュール147(図２８)のＰＣ板226に接続している。板190A近傍の柔軟なケーブル238Aの部分は、一片のテープ242Aによって、窪み240A内に保持され、板190B近傍の柔軟なケーブル238Bの部分は、一片のテープ242Bによって、窪み240B内に保持される。
【００８９】
図３１は、組み立てられた支持構造209の等角投影図である。取付板210は、その両面から延び出し、熱交換モジュールのハウジングに支持構造209を固定するためのタブ246を有するのが好ましい。図２８を再び参照すると、ハウジング208は、取付板210を所定位置に確実に保持すべく上記タブを保持するためにスロットを含むのが好ましい。これと択一的に、取付板210は、例えば、接着剤,ねじ,ボルト,クランプ、または他の適切な手段を使ってハウジング208に取り付けることができる。
【００９０】
図２９を再び参照すると、支持構造209は、板190A,190Bの内面が互いに非常に僅かな角度で傾くように、板190A,190Bを支持することが好ましい。好ましい実施形態では、間隔支柱230A,230Bは、板190A,190Bが壁の対向する側に押し付けられるとき、板の内面が互いに僅かに傾くようになる僅かに先細になった壁244を有する。図２３で最も良く示されているように、板190A,190Bの内面は、室４２が挿入される僅かにＶ字形状となるスロットを形成すべく、互いに傾いている。内面が互いに傾いている量は、非常に僅かであり、平行から略１°傾けられるのが好ましい。両内面は、板190A,190Bの間に反応室４２が挿入される前に、板の底部が板の頂部よりも互いに僅かに近づいているように傾けられる。この内面の僅かな傾きは、反応容器の反応室４２を板の間に一層簡単に挿入し、板の間から反応容器の反応室４２を一層簡単に抜き取ることを可能にする。これと択一的に、板190A,190Bの内面は、互いに平行にすることもできるが、このとき反応容器４０の挿入および抜き取りは一層難しくなる。
【００９１】
加えて、板190A,190Bの内面は、枠４６の厚さと同じ距離だけ互いに隔たるのが好ましい。内面が互いに傾けられる実施形態では、内面の中心は、枠４６の厚さと同じ距離だけ互に隔てられ、板の底部は、最初は枠４６の厚さよりも僅かに小さい距離だけ隔てられるのが好ましい。室４２が、板190A,190Bの間に挿入されたとき、剛枠４６は、反応室４２が板の間に強固に挟まれるように、板の底部を互いに離間するように強制する。板190A,190Bが枠４６によって、互いに離間させられる距離は非常に小さく、例えば、枠の厚さが１mmであって内面が互いに１°傾いているならば、略0.035mmである。
【００９２】
図３０を再び参照すると、保持クリップ236A,236Bは、板190A,190Bのこの僅かな外側への移動を許容すべく充分柔軟でなければならないが、反応容器の挿入や除去の際、間隔支柱230A,230Bの凹部内に板を保持すべく充分堅くなければならない。板190Aと板190Bの間への反応容器の押し込みは、反応室に初期の予荷重を与えて、反応室の柔軟な主壁が圧縮されたとき板の内面と良好な熱的接触を達成することを保証する。
【００９３】
図２８を再び参照すると、容器４０の加圧のために、板190が離間する量を限定するために、停止部が光学アセンブリ216,218のハウジング内にモールドされる。図３２に示すように、光学アセンブリ218のハウジング249は、ハウジングから外側に延在する鉤爪状の停止部247A,247Bを含む。図３３に示すように、ハウジング249は、板190A,190Bの底部縁が停止部247A,247Bの間に挿入されるように配置されている。このようにして、停止部247A,247Bは、板190A,190Bが予め決められた最大距離から更に広がるのを防止している。わかりやすくするために図３３には示されていないが、光学アセンブリ216(図２８を参照)は、予め決められた最大距離よりも板の片割が互いに広がるのを防止するために、対応した停止部付きのハウジングを有している。図２３を再度参照すると、停止部によって板190A,190Bの内面が互いに間隔の開けられる最大距離は、枠４６の厚みにぴたりと合致しなければならない。好ましくは、板190A,190Bの内面の最大間隔は、枠４６の厚みよりも僅かに大きくして、容器４０および板190A,190Bにおける公差の変化に適合させる。例えば、上記最大間隔は、枠４６の厚みよりも約0.1〜0.3mm大きいことが好ましい。
【００９４】
図３５は、熱交換モジュール１４７の電気構成部品の概略ブロック図である。上記モジュールは、装置の主要ロジックボードに接続するためのコネクタ224または可撓性ケーブルを含む。上記モジュールは、また、熱板190A,190Bを含み，各板は上述した抵抗型加熱要素を有する。上記熱板190A,190Bは、上記装置からの電力入力253を受けるために平行に配線されている。上記熱板190A,190Bは、また、デジタル信号をアナログ−デジタルトランスデューサ264に出力する温度センサ192A,192Bを含んでいる。トランスデューサ264は、アナログ信号をデジタル信号に変換し、それらをコネクタ224を介してマイクロコントローラに送る。
【００９５】
熱交換モジュールは、また、熱板190A,190Bと、上記熱板間に挿入された容器内の反応混合物とを冷却するために、ファン212のような冷却システムを含んでいる。上記ファン212は、電力スイッチ272を入れることによって作動され、この電力スイッチ272は、今度はマイクロコントローラからの制御信号を受信する制御ロジックブロック270によって制御される。上記モジュールは、さらに、反応混合物内の標識付き分析物を励起するために例えばＬＥＤ200のような４つの光源と、反応混合物からの蛍光放射を検出するために好ましくはフォトダイオードのような４つの検出器198とを含んでいる。上記モジュールは、また、各ＬＥＤに可変電流量(例えば、０〜３０mＡの範囲)を供給するために調整可能な電流源225を含んで、ＬＥＤの明るさを変化させる。デジタル−アナログトランスデューサ260は、調整可能電流源255とマイクロコントローラとの間に接続されていて、マイクロコントローラが電流源をデジタル的に調整する。
【００９６】
調整可能な電流源255は、好ましくは、各ＬＥＤが作動されたときに略同じ明るさを有するように用いられる。製造の変動により、多くのＬＥＤは同一量の電流を与えても明るさが異なる。したがって、現在の所、熱交換モジュールの製造中に明るさの試験を実施し、且つ、モジュールのメモリ268に較正データを蓄えることが望ましい。較正データは、各ＬＥＤに与えるべき電流の正しい量を示す。マイクロコントローラは、メモリ268から較正データを読み、それに応じて電流源255を制御する。
【００９７】
上記モジュールは信号調節／利得選択／オフセット調整ブロック262を含み、上記ブロックは増幅器とスイッチと電子フィルタとデジタル−アナログトランスデューサとから成る。ブロック262は検出器198からの信号を調整して、利得を増加させ、オフセットし、ノイズを減少させる。マイクロコントローラは、デジタル出力レジスタ266を通して上記ブロック262を制御する。出力レジスタ266はマイクロコントローラからのデータを受け取って、ブロック262に制御電圧を出力する。上記ブロック262は、アナログ−デジタルトランスデューサ264とコネクタ224とを介して、調整された検知器信号をマイクロコントローラに出力する。モジュールは、また、好ましくはシリアルなＥＥＰＲＯＭのようなメモリ268を含んで、ＬＥＤや熱板190A,190Bや温度センサ192A,192Bの較正データなどのモジュールに特有のデータを保存する。
【００９８】
カートリッジおよび装置の操作について述べる。図３に示されるように、分析される流体試料は、試料ポートを通して試料室６５に添加され、キャップ３０はポート６４にねじ込まれてポートを密封する。図１０を参照すると、次に、カートリッジ２０は、処理のために装置140のカートリッジネスト141の中に配置される。初めに、カートリッジ２０内の総ての弁は、カートリッジが装置140内に配置されたとき、閉じられている。カートリッジが装置内に配置されるとき、トランスデューサ９２は、図５に示すように、溶解室８６の底壁を形成する可撓性ガスケット６３の外面と接触する。
【００９９】
図１０を再度参照すると、好ましくは、装置140は後述する機能を果すためにコンピュータ制御される。例えば、弁アクチュエータ142を使用してカートリッジ内での弁の開閉、ノズル145を経るカートリッジへの加圧、トランスデューサ９２の作動、光学サンサ143,144を使用した液体の有無の検出と液体レベルの検出、熱交換・光学検出モジュール147の制御である。下記の記述に基づいてこれらの機能を果すために、当該技術分野において通常の知識を有するプログラマは、マイクロコントローラとコンピュータのいずれか一方或いは両方をプログラムすることができる。
【０１００】
図９を参照すると、好ましくは、差圧を利用して液体は強制的にカートリッジを貫流させる。カートリッジ内の液体流を制御するために、ここでは正圧が記載されているが、負圧(真空)が使用されてもよい。通常、印加することのできる正圧の最大値は、平方インチ当たり３０ポンド(３０psi)以上の液体突破圧力に到達し得る疎水性膜によって制限される。圧力の下限値は、分析目標に適うべく、カートリッジを介して試料および他の液体を充分迅速に移動させる必要性によって限定される。例えば、１psi以下では、試料はフィルタスタック８７を通して充分に流れない可能性がある。一般的に、６〜２０psiの範囲の圧力が適切である。カートリッジを通る試料流量は、好ましくは、１０〜３０ミリリットル／分の範囲である。洗剤流量はより少なく、溶解室８６を有効に洗浄するために、洗剤流量は例えば６〜１８ミリリットル／分である。
【０１０１】
カートリッジの操作を図解するために、特定プロトコルを、図９を参照しつつ述べる。理解されたいのは、これは１つの可能なプロトコルの一例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではないことである。初めに、流体試料が試料室６５から強制的に流される前に、上記カートリッジに洗剤液が注入される。カートリッジに注入するには、弁111と115とが開かれて１０psiの圧力が圧力ポートを通して室６６に約２秒間加えられる。少量の洗剤液は、流路117,106と溶解室８６と流路109,110とを通って、Ｕ字形流路122に流れ込み、圧力ポート128の下の疎水性膜に至る。
【０１０２】
注入に続いて、弁115と圧力ポート116とが閉じられ、弁107と114が開かれる。同時に、２０psiの圧力が、約１５秒間圧力ポート105を介して試料室６５に印加される。その結果、試料は、流路106を通り、室８７内のフィルタスタック８７を通り、流路110,111,112を通って、換気された廃水室６８内に強制的に流れ込む。試料が流路106内のセンサ域136を通過するので、光学センサ144(図１３)を用いて、試料室６５が何時空になったかを決定することができる。試料液がフィルタスタック８７を貫流するとき、試料内の標的細胞あるいはウィルスが捕獲される。予め決められた量の試料が廃水室６８に到達すると、液体が溢れ出てセンサ室120内に入り、プロトコルにおける次ステップの誘因となる。この代りに、光学センサからのフィードバックを用いてものごとの誘因とするのではなく、予め決められたプロトコルのステップをタイム設定して、例えば、予め決められた圧力を予め決められた時間印加して、既知量を既知の流速で移動させる。
【０１０３】
溶解室８６の貫流設計では、比較的大きな試料容積からの標的細胞やウィルスがずっと小さな容積に濃縮されて増幅および検出される。このことは、例えば核酸のような試料内の低濃度分析物を検出するために重要である。特に、室８６の収容容積に対する溶解室を強制的に貫流させる試料の容積の比は、好ましくは少なくとも２：１であり、より好ましくは少なくとも５：１である。室８６を強制的に貫流させる試料の容積は、好ましくは少なくとも100μリットルであり、より好ましくは少なくとも１μリットルである。目下好ましい実施形態においては、５ミリリットルの試料容積は溶解室８６を強制的に貫流し、室８６は約０.５ミリリットルの収容容積を有している。したがって、その比は１０：１である。さらに、溶解室８６は、試料が室を通って強制的に流されるときに、(例えば、室の壁に結合された超音波ホーンを使用して)超音波処理される。室８６を超音波処理することは、フィルタスタック８７の目詰りを防ぎ、室８６を通る流れがより均一になる。特に、音波は、フィルタ内の特定の物質またはビーズがフィルタを目詰りさせないようにするのを助ける。
【０１０４】
次のステップでは、弁111,114,115が開かれ、２０psiの圧力が約７秒間洗剤室６６に印加されて、流路117,106を通って溶解室８６内に洗剤液を強制的に流し込む。洗剤液は、ＰＣＲ抑制物質と溶解室８６からの汚染物質を洗浄し、汚染物質を流路109,110,112を通って廃水室６８に移動させる。このために、ｐＨとか溶質成分とかイオン力の異なる様々な適切な洗剤液が使用され、そして、これらの洗剤液は当該分野において周知である。例えば、適切な洗剤試薬は、８０ｍＭの酢酸カリウム溶液であり、８.３ｍＭのトリスＨＣｌであり、ｐＨ７.５で４０μＭのＥＤＴＡであり、５５％のエタノールである。洗剤液を室に強制的に流している間、(例えば、室の壁に結合された超音波ホーンを使用して)溶解室８６は超音波処理される。室８６の超音波処理は、前述したように、フィルタスタック８７の目詰りを防ぎ、室８６に流体をより均一に貫流させる。さらに、上記音波は、物質を緩めて洗い流すのを促す。洗剤液は容積が増加すると廃水室６８に到達して、液の一部が溢れてセンサ室121内に入り、プロトコルにおける次のステップの誘因となる。
【０１０５】
次のステップでは、弁115が閉じられ、弁119が開かれる。１５psiの圧力が、約３秒間、圧力ポート118を介して試薬室６７に印加される。上記圧力は、溶解室６７から流路117,106を通って溶解室８６さらに流路110内に強制的に流される。室８６はこのようにして液体で満たされる。適切な溶解試薬は、例えば、グアニジン塩化水素、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジンイソチオシアン酸塩、沃化ナトリウム、尿素、過塩素酸ナトリウム、臭化カリウム等の攪乱塩を含有する溶液を含む。目下好ましい実施例では、ＰＣＲを抑制しない溶解試薬が使用される。溶解試薬は、１０ｍＭのトリス、５％のツウィーン-２０、１ｍＭのトリス(２カルボキシホスフィン塩酸塩)、０.１ｍＭエチレングリコールビス(ｂアミノエチルエーテル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ’、Ｎ'テトラセティク酸を有する。溶解室８６が溶解試薬で満たされた後、弁111,114は閉じられる。弁119は開かれたままで、２０psiの圧力が圧力ポート118に印加される。したがって、フィルタスタック８７に捕獲された細胞あるいはウィルスを溶解する準備段階では、溶解室８６内の静圧は２０psiまで増加する。
【０１０６】
図５を再度参照すると、溶解室８６の加圧は、トランスデューサ９２と溶解室８６の可撓性壁６３との間の結合を確実かつ有効なものにするので重要である。溶解室８６内の細胞あるいはウイルスを崩壊させるために、トランスデューサ９２が作動される(すなわち振動運動するようにセットされる)。溶解室８６の可撓性壁６３は、僅かな偏向によって、壁内に高圧を生じることなくトランスデューサ９２の振動を室８６内の液体に伝える。上述したように、壁６３はエラストマの膜によって形成される。この代わりに、壁は、好ましくは0.025〜0.1mmの範囲にある厚みのポリマー材の膜またはシート(例えばプリプロピレン膜)である。トランスデューサ９２は、好ましくは、室８６を超音波処理するための超音波ホーンである。室８６は、好ましくは、２０〜６０ｋＨｚの範囲にある周波数で１０〜４０秒間超音波処理される。例示のプロトコルでは、室は４７ｋＨｚの周波数で１５秒間超音波処理される。ホーンチップの振幅は、好ましくは、２０〜２５μｍの範囲にある(ピーク間で測定)。
【０１０７】
トランスデューサ９２の頂部が振動するとき、それは可撓性壁６３に繰返し衝撃を与える。(図６では上方向の)前進ストロークでは、トランスデューサ９２の頂部は壁６３を押圧して、室８６内に圧力パルスすなわち圧力波を発生する。(図５では下方向の)後退ストロークでは、通常、トランスデューサ９２の頂部が可撓性壁６３から離れ、可撓性壁６３はトランスデューサと同じ周波数で動くことができない。次の前進ストロークでは、再び、トランスデューサと壁とが互いに作用しながら、トランスデューサ９２の頂部は壁６３に正面衝突しながら衝撃を与える。トランスデューサ９２が振動するときにトランスデューサ９２と壁６３とが分離するので、トランスデューサの有効前進ストロークはピーク間の振幅よりも小さくなる。上記有効前進ストロークは、溶解室８６内での超音波処理のレベルを決定する。したがって、分解室８６の静圧を増加させることが重要となり、トランスデューサ９２の頂部が後退した時は、可撓性壁６３が強制的に外方に押しやられて頂部と当接する。トランスデューサ９２の有効前進ストロークによって圧力パルスまたは圧力波が室内で確実に発生するように、上記室８６内の静圧は充分なものでなければならない。目下のところ、室８６内での静圧を、カートリッジの外の雰囲気圧よりも少なくとも５psiまで増加させることが好ましく、さらに、雰囲気圧よりも１５〜２５psiの範囲の圧力に増加させることがより好ましい。
【０１０８】
各前進ストロークでは、トランスデューサ９２は、室内の液体に速度を付与して、室８６内を迅速に一掃する速度パルスを発生させる。フィルタスタック８７(図６)内のビーズは室８６内で圧力パルスによって攪拌される。圧力パルスは室８６内でビーズを激しく動かし、ビーズは細胞やウィルスを機械的に破壊して、それらから物質(例えば、核酸)を解放する。血液細胞などの或る種の細胞は、比較的脆弱で、ビーズを用いることなく圧力波のみを用いて崩壊させることができる。その他の細胞(特に胞子)は非常に耐性のある細胞壁を有していて、一般的に有効な溶解にはビーズが必要とされる。
【０１０９】
図９を参照すると、細胞やウィルスの崩壊に続いて、弁111,124が開かれ、１２psiの圧力が圧力ポートを介して試薬室６７に約４秒間供給される。この圧力によって強制的に、溶解試薬がフィルタスタック８７から核酸を溶離させ、核酸と共に中和室７０内に流れ込む。（例えば、室の壁に結合された超音波ホーンを用いて)溶解室８６を超音波処理して、核酸を溶離することができる。室８６の超音波処理は、上述したように、フィルタスタック８７の目詰りを防止する。室420は、溶解試薬を中和するために、洗剤などの中和剤で部分的に充填(例えば半分ほど充填)される。ＰＣＲに対して非抑制な溶解試薬が使用されるならば、中和剤はオプションとなる。
【０１１０】
次のステップでは、弁124が閉じられて、室７０内に溶解試薬と分析物と中和剤とが収容される。弁114が開かれ、１５psiの圧力が圧力ポート128を介して約３秒間印加されて、Ｕ字形流路122内の液体を廃水室６８に強制的に流し込む。次に、弁124,126が開かれ、１５psiの圧力が中和剤室７０の頂部の圧力ポート123を介して約５秒間印加される。この圧力によって強制的に、室７０内の中和された溶解試薬と核酸とが、流路122に流れ、主混合室７１に流れ込む。そのとき、主混合室７１の弁126は閉じられている。上記主混合室７１は、ＰＣＲ試薬と、中和された溶解試薬と核酸とを混合している蛍光プローブとを含有して、反応混合物を形成している。
【０１１１】
次のステップでは、廃水室６８への弁144を開くことによって流路112が一掃され、１５psiの圧力が圧力ポート128に約１秒間印加される。次のステップでは、主要混合物室７１に形成された反応混合物が、以下のようにして反応容器４０に移動される。すなわち、弁126,127,133が開かれ、１５psiの圧力が、主混合物室７１の頂部にある圧力ポート125に約６秒間印加されて、反応混合物が、流路122と弁127と流路８０を通って強制的に流され、ポート４１を経て反応室４０に至る。反応混合物は室内の空気と置き換わって容器の室４２を満たし、空気は出口流路５２を通って出て行く。この出口流路５２を通って出る空気は、流路８１内を移動しセンサ域130を通り過ぎて流路131内に入る。空気は、流路131から流路132内に流れ、弁133と流路134とを通って、通気孔３６を経てカートリッジを出る。室４２を満たすのに充分な容積の反応混合物が容器内に流れ、過剰となった反応混合物は、出口流路を経て容器から出て行く。過剰反応混合物は、流路８１に流れ込み、センサ域130において光学的に検出される。反応混合物が検出されたときは、弁133が閉じられ、圧力ポートからの圧力が印加されて反応室４２を加圧する。
【０１１２】
図２３を再度参照すると、室４２内を加圧することによって容器の可撓性主壁が膨張する。特に、上記圧力は、主壁４８を板190A,190Bの内面と強制的に接触させ、一致させる。これによって、板190A,190Bと室内の反応混合物との間で最良の熱伝導が確実に行なわれる。雰囲気圧力よりも２〜３０psi上の圧力に室４２を加圧することが目下のところ好ましい。この圧力範囲が目下のところ好ましいのは、一般的に２psiが、壁４８と板190A,190Bの表面との間を一致させるに充分な圧力である。３０psi以上では、壁４８の破裂や枠４６とか板190A,190Bの変形、あるいはカートリッジ内の膜の破裂を引き起こす可能性がある。より好ましくは、室４２が雰囲気圧力よりも８〜１５psi上の圧力に加圧されることである。この圧力範囲がより好ましいのは、上述の実用限界内に安全に収まっている為である。室４２が加圧されると、容器４０内の反応混合物は熱的に処理されて、混合物内の標的分析物の存否を決定する光学的応答指令信号が送られる。
【０１１３】
図３５を参照すると、目標温度と温度センサ192A,192Bからの帰還信号とを用いた標準的な比例積分微分(ＰＩＤ)制御を使用して、反応混合物は板190A,190B間で熱的に処理される。比例は、「オフ」の時間に対する「オン」の時間の比を変化させることによって行なわれるか、或いは、好ましくは、比例アナログ出力を用いて行なわれる。上記比例アナログ出力は、板190A,190Bの実際の温度が所望の設定温度に接近するにつれて、板190A,190Bの加熱要素あるいはファン212への供給平均電力を減少させる。ＰＩＤ制御は、比例モードに、自動リセット機能(時間に対して偏差信号を積分する)と比率処置(レイトアクション、微積信号を合計して比例帯を移動させる)とを組み合せたものである。標準ＰＩＤ制御は当該技術分野では周知であり、ここでこれ以上の説明は不要である。この代わりに、反応混合物は、国際公開番号ＷＯ９９／４８６０８(出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６６２８)に記載されているＰＩＤ制御の修正版を使用して、熱的な処理が施されてもよい。なお、上記文献の開示内容はこの参照によって本文に編入される。
【０１１４】
反応混合物は板190A,190Bの間で熱的なサイクルを受けて、混合物内の１以上の標的核酸配列を増幅させる。上記混合物は、好ましくは各熱サイクルの最低温度点において、応答指令信号が光学的に送信される。光学的な指令応答は、各発光ダイオード(ＬＥＤ)200を連続的に作動させ、混合物内の異なる蛍光で標識付けされた分析物を励起させ、検知器198を用いて室４２から放出される光を検出することによって行なわれる。図２２を再び参照すると、好ましくは、励起ビームは透光性の側壁５７Ａを通して室４２内に伝達され、一方、放出された蛍光は側壁５７Ｂを通して検出される。
【０１１５】
本発明のカートリッジの利点の一つは、比較的大きな容積の例えば数ミリリットル以上の流体試料から内細胞物質を分離させることができ、ずっと少ない容積の例えば100ミリリットル以下の反応液に濃縮できる。カートリッジは、ミリリットルの量の流体試料から物質を効率よく抽出することによって、並外れた濃度比率になる。特に、試料室６５は、好ましくは、100μリットル〜１２ミリリットルの収容容積を有する。より好ましくは、試料室６５は、少なくとも１ミリリットルの収容容積を有する。１ミリリットルという下限値が好ましい理由は、核酸のような低濃度の分析物を検出するためには、少なくとも１ミリリットルの試料が分析されなければならないからである。１２ミリリットルという上限値が好ましい理由は、１２ミリリットル以上の試料は、ずっと大きなカートリッジを必要とし、フィルタスタックが目詰りし易いからである。目下好ましい実施の形態では、試料室は、試料を５ミリリットル保有するために５.５ミリリットルの収容容積がある。
【０１１６】
洗剤室６６は、溶解室８６の容積と比例する収容容積を有している。特に、洗剤室６６は、好ましくは溶解室８６の容積の少なくとも１〜２倍の洗剤容積を有して、室８６からＰＣＲ抑制物および残骸物(デブリス)を洗い流すのに充分な洗剤液が存在するのを保証する。目下好ましい実施の形態では、溶解室の容積は約０.５ミリリットルであり、洗剤室６６の容積は、洗剤液を保持するために２.５ミリリットルである。０.５ミリリットルという溶解室６６の容積は、フィルタスタック８７の目詰りを避けるための充分に大きなサイズと、分析物を小さな容積に濃縮して改良された増幅と検出とをするための充分に小さなサイズとの間の妥協である。
【０１１７】
試薬室６７は、室を加圧して室から核酸を抽出するのに充分な溶解試薬が存在するには、溶解室８６の容積の少なくとも１倍乃至２倍の溶解試薬容積を収容能力があるものが好ましい。目下好ましい実施形態においては、室６７は、約１〜１.５ミリリットルの溶解試薬を収容するために、１.５ミリリットルの収容容積を有している。廃水室６８は充分な収容容積を有していて、試料と洗剤液と未使用の溶解試薬とを収容する。廃水室６８は、好ましい実施形態では、約９.５ミリリットルの収容容積の寸法に作られている。
【０１１８】
室７０内の中和剤が溶解室８６に充填された溶解試薬の容積を中和するので、中和室７０のサイズは溶解室８６の容積に左右される。溶解室は０.５ミリリットルの容積を有することが目下のところ好ましく、約０.５ミリリットルの中和剤を収容するために室７０は１.０ミリリットルの収容容積を有する。中和剤は０.５ミリリットルの溶解試薬と溶離された分析物とが混合される。主混合物室７１の収容容積は、反応混合物を製造するために充分なものであるべきで、容器４０を充填し、上記容器に導く流路122,127を充填する。目下好ましい実施形態において、主混合物室は、初期負荷となる100μリットルの主混合物を収容するために、200μリットルの収容容積を有する。この主混合物には、反応混合物を形成するために、100μリットルの中和溶解試薬と溶離分析物とが付加される。
【０１１９】
カートリッジ内の流路流路は、断面が略Ｄ形をしていて(ガスケットは流路の平坦な側面を形成している)、好ましくは１／６４〜１／８インチ(０.４〜３.２mm)の幅または直径を有し、より好ましくは１／３２〜１／１６インチ(０.８〜１.６mm)の幅を有している。これらの範囲は、流路が狭くなる(流れが制限される)のを防ぐと共に、流路が広く成り過ぎる(未使用の液体が流路内に停滞する)のを防ぐために、目下のところ好ましいものである。
【０１２０】
上記カートリッジおよび装置の構造と操作については、多くの変更が代替えの実施形態において可能である。例えば、ＰＣＲによる増幅が目下のところ好ましいが、熱サイクル増幅法と等温増幅法との両方を含む何らかの増幅法を用いて、上記カートリッジと装置とは核酸配列を増幅するために使用され得る。適切な熱サイクル法には、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ、米国特許第４,６８３,２０２号、米国特許第４,６８３,１９５号、米国特許第４,９６５,１８８号)、逆転写酵素ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)、ＤＮＡリガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ、国際特許出願第ＷＯ８９／０９８３５)、転写ベース増幅(D.Y. Kwoh et al. 1989、Proc. Nt. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177)がある。但し、これらに限定されるというものではない。本発明の実施に当たって有用かつ適切な等温増幅法は、限定されるものではないが、ローリングサークル増幅、ストランド置換増幅(ＳＤＡ、Walker et al. 1992, Proc, Nati, Acad. Sci. USA 89, 392-396)、Ｑベータレプリカーゼ(Lizardi et al. 1998, Bio/Technology 6, 1197-1202)、核酸ベースの配列増幅(ＮＡＳＢＡ、R. Sooknanan and L. Malek 1995, Bio/Technology 13, 563-65)、自己維持配列複製（３ＳＲ、Guatelli et al. 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878)を含む。
【０１２１】
さらに、上記カートリッジと装置とは、核酸増幅以外の化学反応を行なうために、使用されることができる。また、カートリッジ内の分析物を検出するためには、蛍光励起および放出検出が好ましいが、軸上結合構造(on-axis geometries)との直接吸収および／または透過に使用される光学的検出法が使用されてもよい。もう１つの可能な検出法は、時間減衰蛍光法である。さらには、上記カートリッジは、蛍光標識に基づいた検出に限定されるものではない。例えば、検出は、燐光標識または化学ルミネセンス標識または電気化学ルミネセンス標識に基づいてもよい。
【０１２２】
流体試料は、様々な手段によって手で或いは自動的にカートリッジ内に導かれる。手による添加では、測定された量の物質が入口ポートを通してカートリッジの収容領域内に置かれ、次にキャップが上記ポート上に配置される。これの代わりに、分析に必要とされる量よりも多い試料物質がカートリッジに添加され、カートリッジ内の機構が、所定のプロトコルに対して必要な試料を正確に測定し、等分し得る。例えば細胞生検物質や土壌や糞や滲出物やその他複合物等の試料を別の装置または付属器に搭載し、次に、上記副装置または付属器をカートリッジ内に搭載することが望まれる。例えば、一片の細胞は、２次装置の管腔内に載置されて、カートリッジの入口ポートに対してキャップとして機能する。上記キャップは上記ポート内に押圧されると、細胞はメッシュに強制的に通されて、上記メッシュは細胞を薄切り或いは分割する。
【０１２３】
自動的に試料が導入される場合には、カートリッジの添加設計の特徴が用いられていて、多くの場合、試料の増大機能をカートリッジに直接分与している。或る試料の場合、例えば人のレトロウイルス病原体のような操作者や環境に危険を呈するような場合には、試料のカートリッジへの移動は危険なものとなり得る。したがって、一実施形態においては、外部の流体試料をカートリッジ内に直接移動させる手段を設けるために、注入器が装置に組み込まれている。この代わりに、静脈穿刺針と吸引血液管とがカートリッジに取り付けられて、血液試料を採取するために用いられるアセンブリを形成する。採取後に、上記管と針は取り外されて廃棄される。そのとき、カートリッジは器具内に設置されて処理される。この方法の利点は操作者または環境が病原体に晒されないことである。
【０１２４】
入口ポートは、意図された試料の特性の関数として適当な人間的要因を考慮しつつ設計され得る。例えば、呼吸系の試料は、咳の喀出粘液として、或いは、喉や鼻腔の背後から綿棒または刷毛で集めた試料として、低呼吸管から得ることができる。前者の場合、入口ポートは、患者がカートリッジ内に直接咳ができるように、さもなければ、喀出試料をカートリッジ内に容易に吐けるように設計されている。刷毛または綿棒の試料に対しては、試料は入口ポート内に置かれ、ポートと閉塞部の特徴によって、カートリッジの収容領域内で綿棒または刷毛の端部を容易に折ったり保持したりできる。
【０１２５】
別の実施形態では、カートリッジは入口管および出口管が、例えば水流のような非常に大きな容積の試料プール内に配置されていて、試料物質はカートリッジを貫流する。この代わりに、カートリッジ全体が試料内に直接浸漬されるように、親水性の芯材が反応領域として機能し、充分な量の試料が上記芯材の中に吸収される。次に、上記カートリッジは取り除かれ、実験室に運ばれるか、あるいは携帯型器具を用いて直接分析される。別の実施形態では、配管を用いて、管の一端はカートリッジと直接連通させて少なくとも１つの反応領域との流体界面を与えると共に、管の他端は外部環境と接触できて試料の受取部として機能する。次に、上記管は試料内に配置され、ストローとして機能する。また、カートリッジ自体は実際の試料収集装置として機能し、これによって取り扱いが簡単になり不便さを減少させる。法的争いや犯罪調査に関わる試料の場合、試験物質を直接接近して流体のカートリッジ内に持ち込むことは、一連の保護された状態が都合良く且つ確実に保たれるので利点となる。
【０１２６】
図９を参照すると、試薬は使用前にカートリッジ内に外部から導入され、例えば、試薬室６７と中和剤室７０と主要混合物室７１の密封できる開口部を通して導入される。この代わりに、例えば、水溶液あるいは再構成を必要とする乾燥された試薬のような試薬は、製造中にカートリッジ内に置かれてもよい。反応が液相なのか固相なのかを含めた、試薬の固有熱安定性、再構成速度、反応速度など様々なパラメータに基づいて、特定のフォーマットが選定される。溶液のときに熱的に不安定な化合物を含む試薬は、凍結乾燥のような技法を用いて、乾燥させることにより、安定化させることができる。単一アルコールシュガー、メチルセルロース、バルキングプロテインのような添加剤は、安定性または再構成性を増加させるために、乾燥する前に試薬に添加してもよい。
【０１２７】
図２１を再度参照すると、反応容器４０は、反応室４２の対向主壁４８を形成する２つの可撓性シートを必要としない。例えば、代替えの一実施形態では、反応容器４０は反応室４２の主壁を形成する可撓性シートを唯一有する。剛枠４６は、室の側壁ばかりでなく室の他の主壁をも形成している。この実施形態では、枠によって形成された主壁は、約0.05インチ(1.25mm)の最小肉厚を有し、射出成形における典型的な実用最小肉厚であり、一方、可撓性シートの肉厚は0.0005インチ(0.0125mm)である。この実施形態の利点は、枠４６に唯一つの可撓性シートを取付けることが必要なだけであるので、反応室４０の製造が簡素化され、したがって安価になることである。不利な点は、反応混合物の加熱および冷却の速度が遅くなることであり、これは恐らく、枠４６によって形成された主壁が厚みの薄い可撓性シートほど熱伝導速度を高めることができないからである。
【０１２８】
図２８を参照すると、熱交換モジュール147は、反応容器４０の可撓性壁に接触するための１つの熱面と、上記熱面を加熱冷却するための１つの熱要素とを必要とするのみである。１つの熱面と１つの熱要素とを使用する利点は、装置がより安価に製造され得ることである。不利な点は、加熱と冷却の速度が約２倍ほど遅くなりそうなことである。さらに、熱面は熱的に伝導性のある板190によって形成されることが目下のところ好ましいが、各熱面には、容器４０の壁に接触するための接触領域を有する剛性構造体が設けられてもよい。熱面は、好ましくは、セラミックあるいは金属のような高い熱伝導性を有する物質を備える。さらに、熱面は熱要素自体の表面を備えてもよい。例えば、熱面は、室を加熱したり冷却したりするために壁と接触する熱電気装置の表面であってもよい。
【０１２９】
トランスデューサを装置140に組み込むことが目下のところ好ましい。しかしながら、他の実施形態においては、トランスデューサはカートリッジに組み込まれる。例えば、溶解室を超音波処理するために、圧電ディスクがカートリッジに組み込まれてもよい。この代わりに、スピーカあるいは電磁コイル装置がカートリッジに組み込まれてもよい。これらの実施形態では、カートリッジは適切な電気接続装置を含んで、トランスデューサを電源に接続している。トランスデューサがカートリッジに組み込まれる実施形態では、トランスデューサが流体試料と直接接触するのを防止しなければならず、例えば、トランスデューサは薄板を被せて、室壁で試料を分離しなければならない。さらに、細胞またはウィルスの溶解は、トランスデューサの代わりにヒータを使用して行なわれるか、或いは、ヒータとトランスデューサと組み合せて行なわれる。このヒータは抵抗型加熱要素であってカートリッジの一部となっている。或いは、ヒータは、カートリッジを収容する器具に組み込まれてもよい。この実施形態においては、分解室を高温(例えば、９５℃)に加熱して細胞壁を粉砕することによって、細胞またはウィルスは崩壊される。
【０１３０】
以上の説明は、多くの特質を含んでいるが、これらの特質は、本発明の範囲を制限するものと解されてはならず、幾つかの好ましい実施形態の例に過ぎないと解されなければならない。本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変更や置換が既述の装置および方法にできる。
【０１３１】
従って、本発明の範囲は、以下の請求項およびその均等物によって決定されるべきものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学反応を制御するカートリッジにおいて、このカートリッジは、
a) 内部に形成された少なくとも第１と第２の流路を有する本体と、
b) この本体から延び出す反応容器とを備え、この反応容器は、
i) 反応室と、
ii) この反応室に入口流路を介して接続される入口ポートと、
iii) 上記反応室に出口流路を介して接続される出口ポートとを有し、上記反応容器の入口ポートは、上記本体内の第１の流路に接続され、上記反応容器の出口ポートは、上記本体内の第２の流路に接続されているカートリッジ。
【請求項２】
請求項１に記載のカートリッジにおいて、上記本体は、上記第２の流路に連通してガスを逃がすベントを更に有するカートリッジ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のカートリッジにおいて、上記本体の第１の流路内の流体を上記反応容器の入口ポートを経て上記反応室に送る差圧源を更に有するカートリッジ。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応容器は、
i) 上記反応室の側壁を区画する剛な枠と、
ii) 上記反応室の主壁を形成すべく上記剛な枠に取り付けられる少なくとも１つの柔軟なシートまたは膜とを有し、上記主壁は、熱面に一致するように十分柔軟であるようなカートリッジ。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応容器は、
i) 上記反応室の側壁を区画する剛な枠と、
ii) 上記反応室の対向する主壁を形成すべく上記剛な枠の対向する側面に取り付けられる第１と第２の柔軟なシートまたは膜とを有するカートリッジ。
【請求項６】
請求項５に記載のカートリッジにおいて、上記第１と第２の柔軟なシートまたは膜は、夫々ポリマー膜からなるカートリッジ。
【請求項７】
請求項４または５に記載のカートリッジにおいて、上記側壁の少なくとも２つは、透光性であるとともに、互いに角度的に偏らせられているカートリッジ。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室の厚さに対する幅の比は、少なくとも２:１であるカートリッジ。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室は、５mm以下の厚さを有するカートリッジ。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室は、0.5〜５mmの範囲の厚さを有するカートリッジ。
【請求項１１】
請求項１乃至７のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室の厚さに対する幅の比は、少なくとも４:１であるカートリッジ。
【請求項１２】
請求項１乃至７または請求項１１のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室は、0.5〜２mmの範囲の厚さを有するカートリッジ。
【請求項１３】
請求項１乃至７または１１乃至１２のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室は、２mm以下の範囲の厚さを有するカートリッジ。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記本体は、上記反応容器の入口ポートに上記第１の流路を経て接続され、流体試料を増幅試薬と混合するための混合室を更に有するカートリッジ。
【請求項１５】
請求項１乃至１４のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記本体は、内部に形成された
i) 試料流路と、
ii) 試料流体から所望の分析対象物を分離すべく、上記第１の流路を経て上記入口ポートに接続される上記試料流路内の分離領域とを有するカートリッジ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のカートリッジにおいて、上記本体内の分離領域は、
a) 上記試料流路に設けられ、上記試料中の細胞またはウイルスを溶解させて、これらの細胞またはウイルスから物質を解き放たせる溶解室と、
b) 上記溶解させられるべき細胞またはウイルスを捕捉すべく、上記溶解室内に設けられた少なくとも１つの固体の担体とを有するカートリッジ。
【請求項１７】
請求項１に記載のカートリッジを有する装置であって、上記反応容器は、上記反応室を区画する複数の壁を有し、少なくとも１つの壁は、柔軟なシートまたは膜からなり、上記装置は、
a) 上記シートまたは膜に接触する少なくとも１つの熱面と、
b) 上記反応室内の圧力の増加が、上記シートまたは膜を上記熱面に一致するように接触させるに十分であるように、上記反応室内の圧力を増大させる手段と、
c) 上記反応室内の温度変化を引き起こさせるべく上記熱面を加熱または冷却する少なくとも１つの熱要素とを更に有する装置。
【請求項１８】
請求項１乃至３のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応容器は、
i) ２つの対向する主壁と、
ii) 上記主壁を互いに連結して、上記反応室を区画する側壁とを備え、上記側壁の少なくとも２つは、透光性で互いに角度的に偏らせられているカートリッジ。
【請求項１９】
請求項１乃至３のいずれか１つに記載のカートリッジを有する装置であって、上記反応容器は、２つの対向する主壁と、上記主壁を互いに連結して、上記反応室を区画する側壁とを備え、上記側壁の少なくとも２つは、透光性であり、上記透光性の側壁のうちの第１の側壁を介して上記反応室内の反応混合物を励起する少なくとも１つの光源と、上記反応室から上記透光性の側壁のうちの第２の側壁を介して放出される光を検出する少なくとも１つの検出器とを有する光学システムを更に備えている装置。
【請求項２０】
請求項１乃至３または８乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室の各側面は、１〜１５mmの長さを持つカートリッジ。
【請求項２１】
請求項１乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応容器は、上記反応室を通る光路長が、１〜１５mmであるカートリッジ。
【請求項２２】
請求項１乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応容器は、上記反応室を通る光路長が、５〜１２mmであるカートリッジ。
【請求項２３】
請求項１乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室は、体積容量が１００μリッター以下であるカートリッジ。
【請求項２４】
請求項１乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室は、体積容量が１２〜１００μリッターであるカートリッジ。
【請求項２５】
請求項１乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室の壁の少なくとも１つは、0.5mm以下の厚さであるカートリッジ。
【請求項２６】
請求項１乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室の壁の少なくとも１つは、0.003〜0.5mmの厚さであるカートリッジ。
【請求項２７】
請求項１乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記本体内の第１と第２の流路の幅または直径は、0.4〜3.2mmであるカートリッジ。
【請求項１】
化学反応を制御するカートリッジにおいて、このカートリッジは、
a) 内部に形成された少なくとも第１と第２の流路を有する本体と、
b) この本体から延び出す反応容器とを備え、この反応容器は、
i) 反応室と、
ii) この反応室に入口流路を介して接続される入口ポートと、
iii) 上記反応室に出口流路を介して接続される出口ポートとを有し、上記反応容器の入口ポートは、上記本体内の第１の流路に接続され、上記反応容器の出口ポートは、上記本体内の第２の流路に接続されているカートリッジ。
【請求項２】
請求項１に記載のカートリッジにおいて、上記本体は、上記第２の流路に連通してガスを逃がすベントを更に有するカートリッジ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のカートリッジにおいて、上記本体の第１の流路内の流体を上記反応容器の入口ポートを経て上記反応室に送る差圧源を更に有するカートリッジ。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応容器は、
i) 上記反応室の側壁を区画する剛な枠と、
ii) 上記反応室の主壁を形成すべく上記剛な枠に取り付けられる少なくとも１つの柔軟なシートまたは膜とを有し、上記主壁は、熱面に一致するように十分柔軟であるようなカートリッジ。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応容器は、
i) 上記反応室の側壁を区画する剛な枠と、
ii) 上記反応室の対向する主壁を形成すべく上記剛な枠の対向する側面に取り付けられる第１と第２の柔軟なシートまたは膜とを有するカートリッジ。
【請求項６】
請求項５に記載のカートリッジにおいて、上記第１と第２の柔軟なシートまたは膜は、夫々ポリマー膜からなるカートリッジ。
【請求項７】
請求項４または５に記載のカートリッジにおいて、上記側壁の少なくとも２つは、透光性であるとともに、互いに角度的に偏らせられているカートリッジ。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室の厚さに対する幅の比は、少なくとも２:１であるカートリッジ。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室は、５mm以下の厚さを有するカートリッジ。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室は、0.5〜５mmの範囲の厚さを有するカートリッジ。
【請求項１１】
請求項１乃至７のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室の厚さに対する幅の比は、少なくとも４:１であるカートリッジ。
【請求項１２】
請求項１乃至７または請求項１１のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室は、0.5〜２mmの範囲の厚さを有するカートリッジ。
【請求項１３】
請求項１乃至７または１１乃至１２のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室は、２mm以下の範囲の厚さを有するカートリッジ。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記本体は、上記反応容器の入口ポートに上記第１の流路を経て接続され、流体試料を増幅試薬と混合するための混合室を更に有するカートリッジ。
【請求項１５】
請求項１乃至１４のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記本体は、内部に形成された
i) 試料流路と、
ii) 試料流体から所望の分析対象物を分離すべく、上記第１の流路を経て上記入口ポートに接続される上記試料流路内の分離領域とを有するカートリッジ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のカートリッジにおいて、上記本体内の分離領域は、
a) 上記試料流路に設けられ、上記試料中の細胞またはウイルスを溶解させて、これらの細胞またはウイルスから物質を解き放たせる溶解室と、
b) 上記溶解させられるべき細胞またはウイルスを捕捉すべく、上記溶解室内に設けられた少なくとも１つの固体の担体とを有するカートリッジ。
【請求項１７】
請求項１に記載のカートリッジを有する装置であって、上記反応容器は、上記反応室を区画する複数の壁を有し、少なくとも１つの壁は、柔軟なシートまたは膜からなり、上記装置は、
a) 上記シートまたは膜に接触する少なくとも１つの熱面と、
b) 上記反応室内の圧力の増加が、上記シートまたは膜を上記熱面に一致するように接触させるに十分であるように、上記反応室内の圧力を増大させる手段と、
c) 上記反応室内の温度変化を引き起こさせるべく上記熱面を加熱または冷却する少なくとも１つの熱要素とを更に有する装置。
【請求項１８】
請求項１乃至３のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応容器は、
i) ２つの対向する主壁と、
ii) 上記主壁を互いに連結して、上記反応室を区画する側壁とを備え、上記側壁の少なくとも２つは、透光性で互いに角度的に偏らせられているカートリッジ。
【請求項１９】
請求項１乃至３のいずれか１つに記載のカートリッジを有する装置であって、上記反応容器は、２つの対向する主壁と、上記主壁を互いに連結して、上記反応室を区画する側壁とを備え、上記側壁の少なくとも２つは、透光性であり、上記透光性の側壁のうちの第１の側壁を介して上記反応室内の反応混合物を励起する少なくとも１つの光源と、上記反応室から上記透光性の側壁のうちの第２の側壁を介して放出される光を検出する少なくとも１つの検出器とを有する光学システムを更に備えている装置。
【請求項２０】
請求項１乃至３または８乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室の各側面は、１〜１５mmの長さを持つカートリッジ。
【請求項２１】
請求項１乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応容器は、上記反応室を通る光路長が、１〜１５mmであるカートリッジ。
【請求項２２】
請求項１乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応容器は、上記反応室を通る光路長が、５〜１２mmであるカートリッジ。
【請求項２３】
請求項１乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室は、体積容量が１００μリッター以下であるカートリッジ。
【請求項２４】
請求項１乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室は、体積容量が１２〜１００μリッターであるカートリッジ。
【請求項２５】
請求項１乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室の壁の少なくとも１つは、0.5mm以下の厚さであるカートリッジ。
【請求項２６】
請求項１乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記反応室の壁の少なくとも１つは、0.003〜0.5mmの厚さであるカートリッジ。
【請求項２７】
請求項１乃至１６のいずれか１つに記載のカートリッジにおいて、上記本体内の第１と第２の流路の幅または直径は、0.4〜3.2mmであるカートリッジ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【公開番号】特開２００９−２８２０４１（Ｐ２００９−２８２０４１Ａ）
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８０７９１（Ｐ２００９−１８０７９１）
【出願日】平成２１年８月３日（２００９．８．３）
【分割の表示】特願２０００−６２１０７３（Ｐ２０００−６２１０７３）の分割
【原出願日】平成１２年５月３０日（２０００．５．３０）
【出願人】（５０００６５５６５）
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＰＨＥＩＤ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月３日（２００９．８．３）
【分割の表示】特願２０００−６２１０７３（Ｐ２０００−６２１０７３）の分割
【原出願日】平成１２年５月３０日（２０００．５．３０）
【出願人】（５０００６５５６５）
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＰＨＥＩＤ
【Ｆターム（参考）】
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