土壌、地下水の浄化方法、微生物の培養方法及び栄養剤
【課題】有機化合物により汚染された土壌、地下水等の汚染環境を短期間のうちに効率良く、かつ低コストで浄化処理することが可能になるとともに、汚染環境中の窒素濃度を抑制することが可能になる土壌、地下水の浄化方法を提供する。
【解決手段】有機化合物により汚染された土壌及び地下水のうち少なくとも１つにコーンスティープリカー及び糖蜜を添加して、嫌気性条件下で微生物により有機化合物を分解する土壌、地下水の浄化方法である。
【解決手段】有機化合物により汚染された土壌及び地下水のうち少なくとも１つにコーンスティープリカー及び糖蜜を添加して、嫌気性条件下で微生物により有機化合物を分解する土壌、地下水の浄化方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌、地下水の浄化方法、微生物の培養方法及び栄養剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）やテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）等の揮発性有機化合物（ＶＯＣ）に代表される有機化合物による土壌、地下水、底質、汚泥等の汚染が深刻化している。このような汚染された地下水等の浄化方法としては、水層まで井戸を掘り、地下水を揚水し、地上密閉装置の中で曝気を行いＶＯＣを揮散させ、活性炭等で吸着処理する地下水の揚水曝気方法、加熱処理を目的としたロータリーキルン法や土壌の分解剤として酸化剤や還元剤等を加え、酸化還元反応により対象物質を分解する方法、土壌間隙中の土壌ガスを吸引することによって土壌中の揮発性有機化合物を除去する真空吸引法などの物理化学的処理法が多用されている。
【０００３】
また、近年では汚染環境中に栄養塩や有機物、酸素等を添加することにより汚染環境中に存在する微生物群の活動を活発化させて汚染物質の分解、無害化を行う方法（バイオスティミュレーション）等の生物化学的処理法（バイオレメディエーション）も物理化学的処理法と比較してコスト的に有利である等の理由から一部の汚染物質に対して適用され始めている。特に、最近では低コストな浄化技術として有機塩素化合物汚染土壌や地下水中に有機物や栄養塩等を添加し、汚染環境を還元的雰囲気にし、水素生成菌により発生した水素を使用して有機塩素化合物の脱塩素化を行う微生物群を活性化させて無害化を行う嫌気性バイオスティミュレーション法が使用されてきている。このときの有機物源としてはエタノール、メタノール、クエン酸等の低分子化合物から、油脂やポリ乳酸グリセリンエステルのような高分子化合物まで様々なものが使用されている。
【０００４】
嫌気性バイオスティミュレーション法においては汚染環境中に水素供与体として有機物を注入する必要があり、現状ではポリ乳酸エステル（例えば特許文献１参照）、酵母エキス（例えば特許文献２参照）、クエン酸塩（例えば特許文献３参照）等が用いられている。
【０００５】
【特許文献１】特許第３２３９８９９号公報
【特許文献２】特許第３５６４５７３号公報
【特許文献３】特許第３６９５２９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、酵母エキスやクエン酸塩類は微生物による分解性が非常に高く、汚染土壌、地下水中に供給されると直ちに分解され、地中での持続性が低いため浄化が完了するまで継続的に薬剤を供給、もしくは初期に多量の薬剤を注入する必要が生じている。またポリ乳酸エステルおよびクエン酸塩は薬剤中に窒素やリン等の栄養塩を含まないため、必要に応じて別途栄養塩の添加を行う必要がある。さらに、ポリ乳酸エステルや酵母エキスは非常に高価な有機物源であるため、浄化にかかるコストが高くなる等の問題点があった。
【０００７】
本発明は、有機化合物により汚染された土壌、地下水等の汚染環境を短期間のうちに効率良く、かつ低コストで浄化処理することが可能になるとともに、汚染環境中の窒素濃度を抑制することが可能になる土壌、地下水の浄化方法、及びそれに用いられる微生物の培養方法、栄養剤である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、有機化合物により汚染された土壌及び地下水のうち少なくとも１つにコーンスティープリカー及び糖蜜を添加して、嫌気性条件下で微生物により前記有機化合物を分解する土壌、地下水の浄化方法である。
【０００９】
また、前記土壌、地下水の浄化方法において、前記コーンスティープリカー及び糖蜜を、添加後の前記土壌または地下水中の窒素濃度が１０ｍｇ／Ｌ以下になるように添加することが好ましい。
【００１０】
また、前記土壌、地下水の浄化方法において、前記コーンスティープリカー及び糖蜜を、添加後の前記土壌または地下水中の有機体炭素（ＴＯＣ）濃度が５０〜５００ｍｇ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましい。
【００１１】
また、本発明は、有機化合物を分解する微生物をコーンスティープリカー及び糖蜜の存在下で培養し、前記培養した微生物を用いて、有機化合物により汚染された土壌及び地下水のうち少なくとも１つを浄化する土壌、地下水の浄化方法である。
【００１２】
また、本発明は、有機化合物を分解する微生物をコーンスティープリカー及び糖蜜の存在下で培養する微生物の培養方法である。
【００１３】
さらに、本発明は、有機化合物を分解する微生物の活性を高めるための栄養剤であって、コーンスティープリカー及び糖蜜から構成される栄養剤である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、コーンスティープリカー及び糖蜜を添加して、嫌気性条件下で微生物により有機化合物を分解することにより、有機化合物により汚染された土壌、地下水等の汚染環境を短期間のうちに効率よく、かつ低コストで浄化処理することが可能になるとともに、汚染環境中の窒素濃度を抑制することが可能になる。
【００１５】
また、本発明によれば、コーンスティープリカー及び糖蜜の存在下で培養した、有機化合物を分解する微生物を用いることにより、有機化合物により汚染された土壌、地下水等の汚染環境を短期間のうちに効率よく、かつ低コストで浄化処理することが可能になるとともに、汚染環境中の窒素濃度を抑制することが可能になる。
【００１６】
また、本発明によれば、コーンスティープリカー及び糖蜜の存在下で有機化合物を分解する微生物を培養することにより、有機化合物により汚染された土壌、地下水等の汚染環境を短期間のうちに効率よく、かつ低コストで浄化処理することが可能になるとともに、汚染環境中の窒素濃度を抑制することが可能な微生物を得ることができる。
【００１７】
また、本発明によれば、コーンスティープリカー及び糖蜜から構成される栄養剤により、有機化合物を分解する微生物の活性を高め、有機化合物により汚染された土壌、地下水等の汚染環境を短期間のうちに効率よく、かつ低コストで浄化処理することが可能になるとともに、汚染環境中の窒素濃度を抑制することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。特に揮発性有機塩素化合物等の揮発性有機化合物で汚染された地下水の浄化に本実施形態に係る方法を適用する場合を中心に説明する。
【００１９】
本発明者らは、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）という植物体の抽出液を汚染環境に添加する有機物（有機基質）として用いたところ、従来の有機物に比較して、高い浄化効果が得られることを見出した。ＣＳＬはトウモロコシの抽出液、であり、主成分としてアミノ酸類を２０〜３０重量％、糖類を１〜１０重量％程度の含有率で含むものである。ＣＳＬはコーンスターチ等の精製過程で製造される副生成物であり、コーンウエットミリング等で発生するものが一般的である。コーンウエットミリングではトウモロコシを亜硫酸水溶液中に浸漬し、水に可溶な成分が抽出される。この抽出液を濃縮したものがＣＳＬであり、抽出液は亜硫酸浸漬中に一部乳酸発酵するため、糖類やアミノ酸類を豊富に含んでおり、微生物に対して非常に有効な栄養源となりうる。さらに、ＣＳＬは通常、含有有機物の１／４程度を微細な粒子状物質で構成されており、これが比較的ゆっくり微生物分解を受けるため、有機基質としての持続性も有している。また、ＣＳＬにコーンウエットミリング工程で分離される繊維分を添加したものはコーングルテンフィードと呼ばれるが、これもバイオレメディエーションにおいて有用な有機物源となる（本明細書では、これもＣＳＬの範疇に含める）。なお、バイオレメディエーションにＣＳＬを使用する場合、有機物源として単独で用いることのほか、他の有機物源と混合して使用してもよい。
【００２０】
ＣＳＬが高い浄化効果を有するのは、含有するアミノ酸等の有効成分によるものと推測される。さらに、ＣＳＬは含有する有機体炭素（ＴＯＣ）濃度が低いことから、嫌気状態を創出するためや微生物が生育するために必要な、例えばＴＯＣ１００ｍｇ／Ｌ以上を確保しようとすると、浄化に必要な有効成分は過剰に存在するものと推測される。
【００２１】
しかし、ＣＳＬはＴＯＣ含有量に比べて窒素含有量が高い。ＣＳＬ中の窒素は地下水中で最終的に硝酸性窒素に転換するおそれがあり、その濃度を環境基準値以下（１０ｍｇ−Ｎ／Ｌ以下）に抑制するためには、地下水中に注入するＣＳＬ量を抑制してＴＯＣ濃度を低くする必要が生じ、浄化が進行しにくくなることが懸念される。
【００２２】
このように、ＣＳＬが汚染環境に添加するための最適な有機物であるとはいえず、かつ窒素含有量の問題がある。さらに、ＣＳＬはポリ乳酸エステルや酵母エキス等に比べれば安価であるが大量に工業生産される有機物に比べれば高価である等、改良の余地が多分にあった。
【００２３】
そこで本発明者らはさらに検討したところ、汚染環境に添加するための有機物としてＣＳＬのみを用いるのではなく、有効成分源としてのＣＳＬに有機物源として別の物質を混合することを検討した。安価に大量に入手可能な有機物はメタノールに代表されるように多々あるが、種々の有機物を試した結果、嫌気状態の創出のし易さや価格等を考慮すると糖蜜が最適であることを見出した。糖蜜は、糖分を含んだ液体であり、主成分として糖類を４０〜６０重量％、タンパク質を５〜１５重量％程度の含有率で含むものである。糖蜜は一般的にはサトウキビまたはテンサイ等から作られる原料糖の精製過程の副生成物である。有機物としてＣＳＬのみを使用する場合と、糖蜜およびＣＳＬの混合物を使用する場合とを比較した結果、ＣＳＬのみより浄化効果が高いことを確認し、低コストな水素供与体として使用できることを見出し、汚染土壌、地下水等の汚染環境の浄化方法として確立した。さらに、ＣＳＬと糖蜜とを混合することで、汚染環境中の窒素濃度を抑制することができることを見出した。
【００２４】
本実施形態に係る土壌、地下水の浄化方法は、有機化合物により汚染された土壌、地下水等の汚染環境を浄化するものである。有機化合物としては、主に四塩化炭素、ジクロロメタン、１，１，１−トリクロロエタン、トリクロロエチレン、ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン、テトラクロロエチレン、ビニルクロライド（塩化ビニル）等の揮発性有機塩素化合物等の揮発性有機化合物（ＶＯＣ）を対象としているが、ダイオキシン類、ＰＣＢ等の有機塩素化合物、その他の地下水汚染の浄化に対しても本実施形態に係る方法は有効である。
【００２５】
また、有機物および栄養塩等を添加して汚染環境中の微生物を増殖、活性化させて浄化を行うバイオスティミュレーションの他、汚染物質およびそこから生成する副生成物を分解する微生物を積極的に外部から添加するバイオオーギュメンテーションに対しても本実施形態に係る方法は好適に使用することができる。
【００２６】
すなわち、コーンスティープリカー及び糖蜜を例えば混合液の状態で直接汚染土壌、地下水、底泥等の汚染環境に添加して、汚染環境中に生育する嫌気性微生物の活性を高めることにより、汚染物質の無害化を生物化学的に行うバイオスティミュレーションを実施することができる。また、コーンスティープリカー及び糖蜜の混合液を栄養剤として有機化合物を分解する微生物を培養し、その培養液を汚染土壌、地下水、底泥等の汚染環境に添加することにより、汚染物質の無害化を生物化学的に行うバイオオーグメンテーションを実施することができる。
【００２７】
なお、嫌気性バイオスティミュレーションにおける塩素化エチレンの主な分解経路は、例えば下記式に示すように塩素が一つずつ脱離していく段階的な反応であり、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）からトリクロロエチレン（ＴＣＥ）、シス−１，２−ジクロロエチレン（ｃｉｓ−ＤＣＥ）、ビニルクロライド（塩化ビニル：ＶＣ）を経て最終的に害の少ないエチレンまで分解されると考えられている。
【００２８】
【化１】
【００２９】
微生物としては、有機化合物を分解することができる微生物を含むものであれば良く特に制限はないが、例えば、有機塩素化合物の分解菌として知られているデハロコッコイデス（Dehalococcoides（学術名））属、硫酸還元菌（Desulfitobacterium（学術名）属等）、ＰＣＥを分解できると知られているメタン菌（Methanosarcina（学術名）属等）、デハロバクター（Dehalobacter（学術名））属、クロストリジウム（Clostridium（学術名））属等を含むものが挙げられる。
【００３０】
本実施形態においては、まず現地調査より汚染された地下水等の汚染環境の範囲、汚染物質およびその濃度範囲を確定することができる。これに基づき実験室でプレテストを行い、有機物の最適な添加量、添加方法等を決定する。このプレテストは汚染環境中に対象汚染物質もしくは汚染物質が分解して生成する分解生成物を分解することのできる微生物が存在するかどうかの微生物学的試験および実際に採取した地下水等の汚染物質に有機物を添加して汚染物質濃度の濃度変化を確認するビーカースケール試験、実際に汚染現場において有機物を添加して汚染物質濃度の変化を確認する現場試験等から適宜選択する。ただし、汚染現場の状態から明らかに有機物の添加により汚染物質の分解が起こるであろうことが予測される場合（汚染現場において対象汚染物質が分解して無害化された分解産物が確認される場合等）はこれらのプレテストを省略することができる。
【００３１】
本実施形態においてはこの有機物源としてコーンスティープリカー（ＣＳＬ）と糖蜜を例えば混合液の状態で使用する。通常、ＣＳＬ中のＴＯＣは０．１〜０．２ｇ／ｇ程度であり、炭素（Ｃ）：窒素（Ｎ）比率は５：１程度である。また、通常、糖蜜中のＴＯＣは０．２〜０．３ｇ／ｇ程度であり、炭素（Ｃ）：窒素（Ｎ）比率は５０：１程度となっている。有機物を汚染環境中の栄養剤として使用する場合、ＴＯＣが少ないとＶＯＣ分解菌の増殖も行われず、ＶＯＣの分解も進まない。そこでＶＯＣの分解に効果があるＣＳＬと、嫌気状態を創出するために有効で、かつ窒素含有量が低い糖蜜を混合することによって新たな栄養剤を開発した。
【００３２】
本実施形態において、コーンスティープリカー及び糖蜜を、添加後の土壌、地下水等の汚染環境中の窒素濃度が１０ｍｇ／Ｌ以下になるように添加することが好ましい。その理由は、汚染環境中で硝化菌の働きにより窒素が酸化されて硝酸性窒素になるとき、その濃度が１０ｍｇ／Ｌを超えると、環境へ悪影響を与える場合があるからである。
【００３３】
また、本実施形態において、コーンスティープリカー及び糖蜜を、添加後の土壌、地下水等の汚染環境中の有機体炭素（ＴＯＣ）濃度が５０〜５００ｍｇ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、１００ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌの範囲になるように添加することがより好ましい。ＴＯＣ濃度が５０ｍｇ／Ｌ未満であると微生物の活性化が進まない場合があり、５００ｍｇ／Ｌを超えても効果はそれほど変わらない。
【００３４】
ここで、本明細書において、「添加後」の汚染環境中の窒素濃度、ＴＯＣ濃度とは、浄化対象エリアを特定し、コーンスティープリカー及び糖蜜を添加して７日〜３０日後のそのエリア内における地下水等の中の窒素濃度、ＴＯＣ濃度を平均して求めたものである。
【００３５】
このとき、土壌、地下水等の汚染環境中の窒素濃度を１０ｍｇ／Ｌ以下にするために、栄養剤中のＣＳＬの含有率が２０〜３５％、糖蜜は６５〜８０％の範囲となるように混合すればよい。なお、嫌気性生物処理では、有機体窒素（ＴＯＣ）：窒素（Ｎ）＝２０：１程度が良いとされている。したがって、ＣＳＬと糖蜜との混合比率は重量％で、ＣＳＬ：２０〜３５％、糖蜜：６５〜８０％、特にはＣＳＬ：２７％、糖蜜：７３％として、ＴＯＣ：Ｎ＝２０：１程度とすることがより好ましい。
【００３６】
浄化対象となる地下水等に対しＣＳＬを添加、注入する方法としては、一般的な方法が使用でき、特に限定はないが、例えば、浄化対象エリアに薬剤注入用の井戸を設置して注入する方法等が好適に使用できる。この際、薬剤の注入は重力により行う方法や圧力をかけて注入する方法等が選択できる。また、井戸は地表面に対して垂直である必要はなく、斜めもしくは水平井戸等により注入を行うことも可能である。
【００３７】
注入用の井戸等を設置して飽和層中にＣＳＬ及び糖蜜を含有する有機物を注入する場合には、浄化対象エリアの地下水量等より計算された必要量を満足するように注入量を調整することになるため、濃縮液として注入することもできるが、適切な濃度に希釈した水溶液を注入することが有機物を汚染エリアへ速やかに拡散させるためにも好ましい。また、別途揚水用の井戸等を設置し、揚水を行うことにより地下水の飽和層内の流動を促進させることによって有機物を拡散させる手法も好適に用いることができる。注入は必要量を一度に添加する方法のほか、浄化終了までに間欠的にもしくは連続的に注入することができる。なお、ＣＳＬ及び糖蜜を他の有機物と混合して使用することも可能である。
【００３８】
ＣＳＬには豊富な窒素およびリンを含有しており、通常はこれらの栄養塩を添加する必要はないが、他の有機物を混合することなどでこれらの栄養塩が不足する場合には別途もしくは同時に添加を行うことができる。また、有機塩素化合物の分解によって精製する塩酸や、有機化合物の分解によって精製する有機酸等によってアルカリ度が消費されるため、地下水中のアルカリ度が不足する場合（おおむね１００ｍｇＣａＣＯ3／Ｌ程度以下）の場合には炭酸塩等のアルカリ化合物等を添加することが好ましい。
【００３９】
以下に、ＣＳＬ及び糖蜜の好ましい使用条件について説明する。
（１）ｐＨ：６．０〜８．５（より好ましくは７．０〜８．０）
ＣＳＬの添加により嫌気性条件で通常、有機酸が生成する。そのため、対象となる地下水中にはある程度（１００ｍｇ−ＣａＣＯ3／Ｌ）のアルカリ度があることが好ましい。アルカリ度が不足している場合には炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸塩、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム等の一般的なアルカリ物質を添加することにより調整可能である。
【００４０】
（２）硫酸イオン濃度：１５００ｍｇ−ＳＯ42-／Ｌ以下（より好ましくは１０００ｍｇ／Ｌ以下）
硫酸イオンが高濃度に存在する場合、通常、有機物を添加することにより嫌気性硫酸還元菌の働きが活発になり、硫化水素を生成する。また、脱塩素を担う微生物の活性を阻害することがある。そのため硫酸イオン濃度は低いことが好ましい。（ちなみに海水中硫酸イオン濃度は２７００ｍｇ／Ｌ程度である。）
【００４１】
（３）注入方法：
注入用の井戸等から、地下水によって飽和している地層である帯水層中に注入することが好ましい。注入は連続、間欠、一度のみ等いずれでも可能である。
【００４２】
（４）注入量：
浄化対象エリアを特定し、そのエリア内において地下水中の有機物質濃度がＴＯＣとして平均で目標の範囲となるように調整する。
【００４３】
（５）希釈水：
特に規定はないが、有害物質を含まないものを使用することが好ましい。また、固形物を多く含む水は井戸のスクリーンや地層等を閉塞する可能性があるので使用しないことが好ましい。また、微量元素を考慮する観点からは純水よりも工水、水道水、地下水等の方が好ましい。
【００４４】
（６）希釈方法：
ＣＳＬ及び糖蜜は上記の希釈水を用いて希釈してもよい。希釈方法はラインミキサ等による混合、タンク等の容器内での混合（ミキサの使用可）等が挙げられる。また、気温が低い場合などに固形物が生成している場合には加温することによって溶解して使用してもよい。
【００４５】
（７）注入ＣＳＬのモニタリング：
注入したＣＳＬはＴＯＣ計によるＴＯＣ測定、ＢＯＤ測定、ＣＯＤＣｒ測定、過マンガン酸消費量の測定等により濃度のモニタリングを行うことができる。このうち現場においてはＣＯＤＣｒ測定キットを使用した測定方法や過マンガン酸消費量を測定することが簡便である。
【００４６】
（８）温度：
温度は一般的な地下水温度（１０〜２０℃程度）で使用することができる。ただし、環境が許せば加温（２０〜３５℃程度）を行うことによって浄化の期間を短縮することが可能である。
【００４７】
本実施形態に係る微生物の培養方法は、有機化合物を嫌気的に分解する微生物を、コーンスティープリカー及び糖蜜を添加して培養するものである。また、コーンスティープリカーと糖蜜を混合することにより、有機化合物を分解する嫌気性微生物の活性を高める栄養剤として用いることができる。
【００４８】
浄化対象現場に、汚染物質の分解菌が存在せずプレテスト結果によっても、浄化の傾向が確認されない時には、培養した分解微生物（分解菌）を汚染現場に添加する手法であるバイオオーグメンテーションが有効となる。デハロコッコイデス属に代表されるような分解微生物を外部で培養する際には、例えばコーンスティープリカーと糖蜜との混合液を、培地容積に対して好ましくは０．００２〜０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）、より好ましくは０．０１〜０．０２％（ｗｔ／ｖｏｌ）程度添加し、スラリー状態で撹拌しながら培養することができる。培養時に有機化合物を添加する場合には、その有機化合物が分解していることを確認した培養液を汚染現場の原位置に注入を行う。または、掘削された汚染土壌、揚水された汚染地下水に培養した分解微生物を添加し分解することも可能である。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
＜試験１＞
（比較例１）
ＶＯＣに汚染された地下水４０ｍＬを容積１００ｍＬのバイアル瓶に入れ、嫌気条件を創出するため、上部の空気を窒素パージした。これに対して、汚染物質のシス−１，２−ジクロロエチレン（ｃｉｓ−ＤＣＥ）を１２ｍｇ／Ｌになるように加え、コーンスティープリカー（サンエイ糖化製、主成分：アミノ酸類を２０〜３０重量％、糖類を１〜１０重量％含有）をＴＯＣが２００ｍｇ／Ｌとなるように添加して２０℃に設定したインキュベータ内で培養を行った。この試料のヘッドスペース（ＨＳ）部分を定期的にサンプリングして、ＰＩＤ検出器付ガスクロマトグラフ（日本電子（株）製、ＧＣ−３１１型）でｃｉｓ−ＤＣＥの分析を行い、水溶液中のそれぞれの濃度を定量した。結果を図１に示す。また、試料中の窒素濃度は３８．６ｍｇ／Ｌであった。なお、窒素濃度は全有機体炭素計（（株）島津製作所製、ＴＯＣ−ＶオプションＴＮＭ−１）を用いて測定した。ＴＯＣ濃度は全有機体炭素計（（株）島津製作所製、ＡＳＩ−５０００）を用いて測定した。
【００５１】
（比較例２）
ＣＳＬの代わりにポリ乳酸グリセリンエステル（商品名ＨＲＣ、Ｒｅｇｅｎｅｓｉｓ社製）を使用して比較例１と同様の試験を実施した。結果を図１に示す。また、試料中の窒素濃度は１０．０ｍｇ／Ｌであった。
【００５２】
（比較例３）
ＣＳＬの代わりに酵母エキスを使用して比較例１と同様の試験を実施した。結果を図１に示す。また、試料中の窒素濃度は９．８ｍｇ／Ｌであった。
【００５３】
＜試験結果＞
図１に結果を示すように、ＣＳＬを使用した比較例１においては他の有機基質を使用した比較例２、３と比較してｃｉｓ−ＤＣＥの脱塩素化反応の発現が早いことが確認された。
【００５４】
＜試験２＞
（実施例１）
滅菌地下水３８ｍＬとＶＯＣ分解菌（デハロコッコイデス属）の培養液２ｍＬ（１０6個／ｍＬ）とを容積１００ｍＬのバイアル瓶に入れ、嫌気条件を創出するため、上部の空気を窒素パージした。これに対して、汚染物質のｃｉｓ−ＤＣＥを１ｍｇ／Ｌになるように加え、有機基質である廃糖蜜（富士デベロップメント製、糖類を４０〜６０重量％、タンパク質を５〜１５重量％含有）とコーンスティープリカー（サンエイ糖化製）の混合液をＴＯＣとして１００ｍｇ／Ｌとなるように添加して２０℃に設定したインキュベータ内で培養を行った。ＣＳＬと糖蜜との混合比率は、有機体炭素（ＴＯＣ）：窒素（Ｎ）がほぼ２０：１となるようにＣＳＬ：糖蜜＝２７：７３（重量比）に固定して行った。この試料のヘッドスペース（ＨＳ）部分を定期的にサンプリングして、ＰＩＤ検出器付ガスクロマトグラフでｃｉｓ−ＤＣＥの分析を行い、水溶液中のそれぞれの濃度を定量した。結果を図２に示す。また、試料中の窒素濃度は５．０ｍｇ／Ｌであった。
【００５５】
（比較例４）
ＣＳＬのみをＴＯＣが１００ｍｇ／Ｌとなるように添加して、実施例１と同様の条件で試験を行った。結果を図２に示す。また、試料中の窒素濃度は１９．３ｍｇ／Ｌであった。
【００５６】
＜試験結果＞
図２に試験結果を示すように、実施例１と比較例４においてほぼ同時にｃｉｓ−ＤＣＥの脱塩素化反応が発現したことが確認された。従って糖蜜とＣＳＬの混合物は有機化合物を分解する微生物の活性を高めるための栄養剤としてＣＳＬのみの場合と同等の効果があることが示唆された。
【００５７】
＜試験１、試験２の総合評価＞
試験１と試験２の結果を表１にまとめた。浄化速度、二次汚染（硝酸性窒素）、コスト面で、総合的に評価すると、地下水浄化においての栄養剤には、糖蜜＋ＣＳＬが最も適していることが分かった。
【００５８】
【表１】
【００５９】
＜試験３＞
（実施例２〜７）
滅菌地下水３８ｍＬとＶＯＣ分解菌（デハロコッコイデス属）の培養液２ｍＬ（１０6個／ｍＬ）とを容積１００ｍＬのバイアル瓶に入れ、嫌気条件を創出するため、上部の空気を窒素パージした。これに対して、汚染物質のｃｉｓ−ＤＣＥを１ｍｇ／Ｌになるように加え、有機基質である廃糖蜜（富士デベロップメント製）とコーンスティープリカー（サンエイ糖化製）の混合液（混合比率＝ＣＳＬ：糖蜜＝２７：７３（重量比））をＴＯＣとして２０ｍｇ／Ｌとなるように添加して２０℃に設定したインキュベータ内で培養を行った。この試料のヘッドスペース（ＨＳ）部分を定期的にサンプリングして、ＰＩＤ検出器付ガスクロマトグラフでｃｉｓ−ＤＣＥの分析を行い、水溶液中のそれぞれの濃度を定量した。また、実施例３〜７として有機基質である糖蜜とＣＳＬの混合液をＴＯＣとして５０ｍｇ／Ｌ（実施例３）、１００ｍｇ／Ｌ（実施例４）、２００ｍｇ／Ｌ（実施例５）、３００ｍｇ／Ｌ（実施例６）、５００ｍｇ／Ｌ（実施例７）となるように添加して、実施例２と同様の試験を実施した。結果を図３に示す。また、試料中の窒素濃度は１．０ｍｇ／Ｌ（実施例２）、２．５ｍｇ／Ｌ（実施例３）、５．０ｍｇ／Ｌ（実施例４）、１０．０ｍｇ／Ｌ（実施例５）、１５．０ｍｇ／Ｌ（実施例６）、２５．１ｍｇ／Ｌ（実施例７）、であった。
【００６０】
＜試験結果＞
図３にｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示すように、ＣＳＬと糖蜜の混合液（混合比率＝ＣＳＬ：糖蜜＝２７：７３（重量比））をＴＯＣとして２００ｍｇ／Ｌとなるように添加した実施例５において、他の実施例、比較例と比較してｃｉｓ−ＤＣＥの脱塩素化反応の発現が早いことが確認された。また、ＴＯＣが５０ｍｇ／Ｌ以上ではある程度ｃｉｓ−ＤＣＥの脱塩素反応は早く進むが、ＴＯＣが５０ｍｇ／Ｌ未満であると、脱塩素反応の速度が下がることが判明した。これらのことから、地中の窒素濃度を１０ｍｇ／Ｌ以下に抑えつつ、より早く脱塩素反応を進めるためには、ＣＳＬ中の有効成分以外に嫌気状態創出、微生物増殖のための有機物が必要であるとわかった。その有機物を糖蜜とし、ＣＳＬと糖蜜を混合比率、ＣＳＬ：糖蜜＝２７：７３、ＴＯＣは２００ｍｇ／Ｌにするのが最適な方法として確立した。
【００６１】
＜試験４＞
（実施例８〜１１）
再現性を確認するために、実施例２（ＴＯＣ：２０ｍｇ／Ｌ）、実施例３（ＴＯＣ：５０ｍｇ／Ｌ）、実施例４（ＴＯＣ：１００ｍｇ／Ｌ）、実施例５（ＴＯＣ：２００ｍｇ／Ｌ）の試験を同じ条件でそれぞれ実施例８〜１１として行った。結果を図４に示す。また、試料中の窒素濃度は１．０ｍｇ／Ｌ（実施例８）、２．５ｍｇ／Ｌ（実施例９）、５．０ｍｇ／Ｌ（実施例１０）、１０．０ｍｇ／Ｌ（実施例１１）であった。
【００６２】
＜試験結果＞
図４にｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示すように、ＣＳＬと糖蜜の混合液（混合比率＝ＣＳＬ：糖蜜＝２７：７３）をＴＯＣとして１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌとなるように添加した実施例１０，１１において、他の実施例と比較してｃｉｓ−ＤＣＥの脱塩素化反応の発現が早いことが確認された。
【００６３】
＜試験３、試験４の総合評価＞
試験３と試験４の結果を表２にまとめた。浄化速度、二次汚染（硝酸性窒素）、再現性、コスト面で、総合的に評価すると、地下水浄化においてのＴＯＣは、５０〜５００ｍｇ／Ｌの範囲が適しており、１００〜２００ｍｇ／Ｌの範囲が最も適していることが分かった。
【００６４】
【表２】
【００６５】
＜試験５＞
（実施例１２、比較例５，６）
ＶＯＣに汚染された地下水４０ｍＬを容積１００ｍＬのバイアル瓶に入れ、嫌気条件を創出するため、上部の空気を窒素パージした。これに対して、汚染物質のｃｉｓ−ＤＣＥを５ｍｇ／Ｌになるように加え、栄養剤として糖蜜とＣＳＬとの混合物（実施例１２）、糖蜜のみ（比較例５）、ＣＳＬのみ（比較例６）をＴＯＣが２００ｍｇ／Ｌとなるように添加して２０℃に設定したインキュベータ内で培養を行った。この試料のヘッドスペース（ＨＳ）部分を定期的にサンプリングして、ＰＩＤ検出器付ガスクロマトグラフでｃｉｓ−ＤＣＥの分析を行い、水溶液中のそれぞれの濃度を定量した。結果を図５に示す。また、試料中の窒素濃度は１０．０ｍｇ／Ｌ（実施例１２）、３．９ｍｇ／Ｌ（比較例５）、３８．６ｍｇ／Ｌ（比較例６）であった。
【００６６】
＜試験結果＞
図５にｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示すように、糖蜜のみを使用してもｃｉｓ−ＤＣＥの脱塩素化反応はほとんど起こらないことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の比較例１〜３におけるｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示す図である。
【図２】本発明の実施例１及び比較例４におけるｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示す図である。
【図３】本発明の実施例２〜７におけるｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示す図である。
【図４】本発明の実施例８〜１１におけるｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示す図である。
【図５】本発明の実施例１２、比較例５，６におけるｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌、地下水の浄化方法、微生物の培養方法及び栄養剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）やテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）等の揮発性有機化合物（ＶＯＣ）に代表される有機化合物による土壌、地下水、底質、汚泥等の汚染が深刻化している。このような汚染された地下水等の浄化方法としては、水層まで井戸を掘り、地下水を揚水し、地上密閉装置の中で曝気を行いＶＯＣを揮散させ、活性炭等で吸着処理する地下水の揚水曝気方法、加熱処理を目的としたロータリーキルン法や土壌の分解剤として酸化剤や還元剤等を加え、酸化還元反応により対象物質を分解する方法、土壌間隙中の土壌ガスを吸引することによって土壌中の揮発性有機化合物を除去する真空吸引法などの物理化学的処理法が多用されている。
【０００３】
また、近年では汚染環境中に栄養塩や有機物、酸素等を添加することにより汚染環境中に存在する微生物群の活動を活発化させて汚染物質の分解、無害化を行う方法（バイオスティミュレーション）等の生物化学的処理法（バイオレメディエーション）も物理化学的処理法と比較してコスト的に有利である等の理由から一部の汚染物質に対して適用され始めている。特に、最近では低コストな浄化技術として有機塩素化合物汚染土壌や地下水中に有機物や栄養塩等を添加し、汚染環境を還元的雰囲気にし、水素生成菌により発生した水素を使用して有機塩素化合物の脱塩素化を行う微生物群を活性化させて無害化を行う嫌気性バイオスティミュレーション法が使用されてきている。このときの有機物源としてはエタノール、メタノール、クエン酸等の低分子化合物から、油脂やポリ乳酸グリセリンエステルのような高分子化合物まで様々なものが使用されている。
【０００４】
嫌気性バイオスティミュレーション法においては汚染環境中に水素供与体として有機物を注入する必要があり、現状ではポリ乳酸エステル（例えば特許文献１参照）、酵母エキス（例えば特許文献２参照）、クエン酸塩（例えば特許文献３参照）等が用いられている。
【０００５】
【特許文献１】特許第３２３９８９９号公報
【特許文献２】特許第３５６４５７３号公報
【特許文献３】特許第３６９５２９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、酵母エキスやクエン酸塩類は微生物による分解性が非常に高く、汚染土壌、地下水中に供給されると直ちに分解され、地中での持続性が低いため浄化が完了するまで継続的に薬剤を供給、もしくは初期に多量の薬剤を注入する必要が生じている。またポリ乳酸エステルおよびクエン酸塩は薬剤中に窒素やリン等の栄養塩を含まないため、必要に応じて別途栄養塩の添加を行う必要がある。さらに、ポリ乳酸エステルや酵母エキスは非常に高価な有機物源であるため、浄化にかかるコストが高くなる等の問題点があった。
【０００７】
本発明は、有機化合物により汚染された土壌、地下水等の汚染環境を短期間のうちに効率良く、かつ低コストで浄化処理することが可能になるとともに、汚染環境中の窒素濃度を抑制することが可能になる土壌、地下水の浄化方法、及びそれに用いられる微生物の培養方法、栄養剤である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、有機化合物により汚染された土壌及び地下水のうち少なくとも１つにコーンスティープリカー及び糖蜜を添加して、嫌気性条件下で微生物により前記有機化合物を分解する土壌、地下水の浄化方法である。
【０００９】
また、前記土壌、地下水の浄化方法において、前記コーンスティープリカー及び糖蜜を、添加後の前記土壌または地下水中の窒素濃度が１０ｍｇ／Ｌ以下になるように添加することが好ましい。
【００１０】
また、前記土壌、地下水の浄化方法において、前記コーンスティープリカー及び糖蜜を、添加後の前記土壌または地下水中の有機体炭素（ＴＯＣ）濃度が５０〜５００ｍｇ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましい。
【００１１】
また、本発明は、有機化合物を分解する微生物をコーンスティープリカー及び糖蜜の存在下で培養し、前記培養した微生物を用いて、有機化合物により汚染された土壌及び地下水のうち少なくとも１つを浄化する土壌、地下水の浄化方法である。
【００１２】
また、本発明は、有機化合物を分解する微生物をコーンスティープリカー及び糖蜜の存在下で培養する微生物の培養方法である。
【００１３】
さらに、本発明は、有機化合物を分解する微生物の活性を高めるための栄養剤であって、コーンスティープリカー及び糖蜜から構成される栄養剤である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、コーンスティープリカー及び糖蜜を添加して、嫌気性条件下で微生物により有機化合物を分解することにより、有機化合物により汚染された土壌、地下水等の汚染環境を短期間のうちに効率よく、かつ低コストで浄化処理することが可能になるとともに、汚染環境中の窒素濃度を抑制することが可能になる。
【００１５】
また、本発明によれば、コーンスティープリカー及び糖蜜の存在下で培養した、有機化合物を分解する微生物を用いることにより、有機化合物により汚染された土壌、地下水等の汚染環境を短期間のうちに効率よく、かつ低コストで浄化処理することが可能になるとともに、汚染環境中の窒素濃度を抑制することが可能になる。
【００１６】
また、本発明によれば、コーンスティープリカー及び糖蜜の存在下で有機化合物を分解する微生物を培養することにより、有機化合物により汚染された土壌、地下水等の汚染環境を短期間のうちに効率よく、かつ低コストで浄化処理することが可能になるとともに、汚染環境中の窒素濃度を抑制することが可能な微生物を得ることができる。
【００１７】
また、本発明によれば、コーンスティープリカー及び糖蜜から構成される栄養剤により、有機化合物を分解する微生物の活性を高め、有機化合物により汚染された土壌、地下水等の汚染環境を短期間のうちに効率よく、かつ低コストで浄化処理することが可能になるとともに、汚染環境中の窒素濃度を抑制することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。特に揮発性有機塩素化合物等の揮発性有機化合物で汚染された地下水の浄化に本実施形態に係る方法を適用する場合を中心に説明する。
【００１９】
本発明者らは、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）という植物体の抽出液を汚染環境に添加する有機物（有機基質）として用いたところ、従来の有機物に比較して、高い浄化効果が得られることを見出した。ＣＳＬはトウモロコシの抽出液、であり、主成分としてアミノ酸類を２０〜３０重量％、糖類を１〜１０重量％程度の含有率で含むものである。ＣＳＬはコーンスターチ等の精製過程で製造される副生成物であり、コーンウエットミリング等で発生するものが一般的である。コーンウエットミリングではトウモロコシを亜硫酸水溶液中に浸漬し、水に可溶な成分が抽出される。この抽出液を濃縮したものがＣＳＬであり、抽出液は亜硫酸浸漬中に一部乳酸発酵するため、糖類やアミノ酸類を豊富に含んでおり、微生物に対して非常に有効な栄養源となりうる。さらに、ＣＳＬは通常、含有有機物の１／４程度を微細な粒子状物質で構成されており、これが比較的ゆっくり微生物分解を受けるため、有機基質としての持続性も有している。また、ＣＳＬにコーンウエットミリング工程で分離される繊維分を添加したものはコーングルテンフィードと呼ばれるが、これもバイオレメディエーションにおいて有用な有機物源となる（本明細書では、これもＣＳＬの範疇に含める）。なお、バイオレメディエーションにＣＳＬを使用する場合、有機物源として単独で用いることのほか、他の有機物源と混合して使用してもよい。
【００２０】
ＣＳＬが高い浄化効果を有するのは、含有するアミノ酸等の有効成分によるものと推測される。さらに、ＣＳＬは含有する有機体炭素（ＴＯＣ）濃度が低いことから、嫌気状態を創出するためや微生物が生育するために必要な、例えばＴＯＣ１００ｍｇ／Ｌ以上を確保しようとすると、浄化に必要な有効成分は過剰に存在するものと推測される。
【００２１】
しかし、ＣＳＬはＴＯＣ含有量に比べて窒素含有量が高い。ＣＳＬ中の窒素は地下水中で最終的に硝酸性窒素に転換するおそれがあり、その濃度を環境基準値以下（１０ｍｇ−Ｎ／Ｌ以下）に抑制するためには、地下水中に注入するＣＳＬ量を抑制してＴＯＣ濃度を低くする必要が生じ、浄化が進行しにくくなることが懸念される。
【００２２】
このように、ＣＳＬが汚染環境に添加するための最適な有機物であるとはいえず、かつ窒素含有量の問題がある。さらに、ＣＳＬはポリ乳酸エステルや酵母エキス等に比べれば安価であるが大量に工業生産される有機物に比べれば高価である等、改良の余地が多分にあった。
【００２３】
そこで本発明者らはさらに検討したところ、汚染環境に添加するための有機物としてＣＳＬのみを用いるのではなく、有効成分源としてのＣＳＬに有機物源として別の物質を混合することを検討した。安価に大量に入手可能な有機物はメタノールに代表されるように多々あるが、種々の有機物を試した結果、嫌気状態の創出のし易さや価格等を考慮すると糖蜜が最適であることを見出した。糖蜜は、糖分を含んだ液体であり、主成分として糖類を４０〜６０重量％、タンパク質を５〜１５重量％程度の含有率で含むものである。糖蜜は一般的にはサトウキビまたはテンサイ等から作られる原料糖の精製過程の副生成物である。有機物としてＣＳＬのみを使用する場合と、糖蜜およびＣＳＬの混合物を使用する場合とを比較した結果、ＣＳＬのみより浄化効果が高いことを確認し、低コストな水素供与体として使用できることを見出し、汚染土壌、地下水等の汚染環境の浄化方法として確立した。さらに、ＣＳＬと糖蜜とを混合することで、汚染環境中の窒素濃度を抑制することができることを見出した。
【００２４】
本実施形態に係る土壌、地下水の浄化方法は、有機化合物により汚染された土壌、地下水等の汚染環境を浄化するものである。有機化合物としては、主に四塩化炭素、ジクロロメタン、１，１，１−トリクロロエタン、トリクロロエチレン、ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン、テトラクロロエチレン、ビニルクロライド（塩化ビニル）等の揮発性有機塩素化合物等の揮発性有機化合物（ＶＯＣ）を対象としているが、ダイオキシン類、ＰＣＢ等の有機塩素化合物、その他の地下水汚染の浄化に対しても本実施形態に係る方法は有効である。
【００２５】
また、有機物および栄養塩等を添加して汚染環境中の微生物を増殖、活性化させて浄化を行うバイオスティミュレーションの他、汚染物質およびそこから生成する副生成物を分解する微生物を積極的に外部から添加するバイオオーギュメンテーションに対しても本実施形態に係る方法は好適に使用することができる。
【００２６】
すなわち、コーンスティープリカー及び糖蜜を例えば混合液の状態で直接汚染土壌、地下水、底泥等の汚染環境に添加して、汚染環境中に生育する嫌気性微生物の活性を高めることにより、汚染物質の無害化を生物化学的に行うバイオスティミュレーションを実施することができる。また、コーンスティープリカー及び糖蜜の混合液を栄養剤として有機化合物を分解する微生物を培養し、その培養液を汚染土壌、地下水、底泥等の汚染環境に添加することにより、汚染物質の無害化を生物化学的に行うバイオオーグメンテーションを実施することができる。
【００２７】
なお、嫌気性バイオスティミュレーションにおける塩素化エチレンの主な分解経路は、例えば下記式に示すように塩素が一つずつ脱離していく段階的な反応であり、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）からトリクロロエチレン（ＴＣＥ）、シス−１，２−ジクロロエチレン（ｃｉｓ−ＤＣＥ）、ビニルクロライド（塩化ビニル：ＶＣ）を経て最終的に害の少ないエチレンまで分解されると考えられている。
【００２８】
【化１】
【００２９】
微生物としては、有機化合物を分解することができる微生物を含むものであれば良く特に制限はないが、例えば、有機塩素化合物の分解菌として知られているデハロコッコイデス（Dehalococcoides（学術名））属、硫酸還元菌（Desulfitobacterium（学術名）属等）、ＰＣＥを分解できると知られているメタン菌（Methanosarcina（学術名）属等）、デハロバクター（Dehalobacter（学術名））属、クロストリジウム（Clostridium（学術名））属等を含むものが挙げられる。
【００３０】
本実施形態においては、まず現地調査より汚染された地下水等の汚染環境の範囲、汚染物質およびその濃度範囲を確定することができる。これに基づき実験室でプレテストを行い、有機物の最適な添加量、添加方法等を決定する。このプレテストは汚染環境中に対象汚染物質もしくは汚染物質が分解して生成する分解生成物を分解することのできる微生物が存在するかどうかの微生物学的試験および実際に採取した地下水等の汚染物質に有機物を添加して汚染物質濃度の濃度変化を確認するビーカースケール試験、実際に汚染現場において有機物を添加して汚染物質濃度の変化を確認する現場試験等から適宜選択する。ただし、汚染現場の状態から明らかに有機物の添加により汚染物質の分解が起こるであろうことが予測される場合（汚染現場において対象汚染物質が分解して無害化された分解産物が確認される場合等）はこれらのプレテストを省略することができる。
【００３１】
本実施形態においてはこの有機物源としてコーンスティープリカー（ＣＳＬ）と糖蜜を例えば混合液の状態で使用する。通常、ＣＳＬ中のＴＯＣは０．１〜０．２ｇ／ｇ程度であり、炭素（Ｃ）：窒素（Ｎ）比率は５：１程度である。また、通常、糖蜜中のＴＯＣは０．２〜０．３ｇ／ｇ程度であり、炭素（Ｃ）：窒素（Ｎ）比率は５０：１程度となっている。有機物を汚染環境中の栄養剤として使用する場合、ＴＯＣが少ないとＶＯＣ分解菌の増殖も行われず、ＶＯＣの分解も進まない。そこでＶＯＣの分解に効果があるＣＳＬと、嫌気状態を創出するために有効で、かつ窒素含有量が低い糖蜜を混合することによって新たな栄養剤を開発した。
【００３２】
本実施形態において、コーンスティープリカー及び糖蜜を、添加後の土壌、地下水等の汚染環境中の窒素濃度が１０ｍｇ／Ｌ以下になるように添加することが好ましい。その理由は、汚染環境中で硝化菌の働きにより窒素が酸化されて硝酸性窒素になるとき、その濃度が１０ｍｇ／Ｌを超えると、環境へ悪影響を与える場合があるからである。
【００３３】
また、本実施形態において、コーンスティープリカー及び糖蜜を、添加後の土壌、地下水等の汚染環境中の有機体炭素（ＴＯＣ）濃度が５０〜５００ｍｇ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、１００ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌの範囲になるように添加することがより好ましい。ＴＯＣ濃度が５０ｍｇ／Ｌ未満であると微生物の活性化が進まない場合があり、５００ｍｇ／Ｌを超えても効果はそれほど変わらない。
【００３４】
ここで、本明細書において、「添加後」の汚染環境中の窒素濃度、ＴＯＣ濃度とは、浄化対象エリアを特定し、コーンスティープリカー及び糖蜜を添加して７日〜３０日後のそのエリア内における地下水等の中の窒素濃度、ＴＯＣ濃度を平均して求めたものである。
【００３５】
このとき、土壌、地下水等の汚染環境中の窒素濃度を１０ｍｇ／Ｌ以下にするために、栄養剤中のＣＳＬの含有率が２０〜３５％、糖蜜は６５〜８０％の範囲となるように混合すればよい。なお、嫌気性生物処理では、有機体窒素（ＴＯＣ）：窒素（Ｎ）＝２０：１程度が良いとされている。したがって、ＣＳＬと糖蜜との混合比率は重量％で、ＣＳＬ：２０〜３５％、糖蜜：６５〜８０％、特にはＣＳＬ：２７％、糖蜜：７３％として、ＴＯＣ：Ｎ＝２０：１程度とすることがより好ましい。
【００３６】
浄化対象となる地下水等に対しＣＳＬを添加、注入する方法としては、一般的な方法が使用でき、特に限定はないが、例えば、浄化対象エリアに薬剤注入用の井戸を設置して注入する方法等が好適に使用できる。この際、薬剤の注入は重力により行う方法や圧力をかけて注入する方法等が選択できる。また、井戸は地表面に対して垂直である必要はなく、斜めもしくは水平井戸等により注入を行うことも可能である。
【００３７】
注入用の井戸等を設置して飽和層中にＣＳＬ及び糖蜜を含有する有機物を注入する場合には、浄化対象エリアの地下水量等より計算された必要量を満足するように注入量を調整することになるため、濃縮液として注入することもできるが、適切な濃度に希釈した水溶液を注入することが有機物を汚染エリアへ速やかに拡散させるためにも好ましい。また、別途揚水用の井戸等を設置し、揚水を行うことにより地下水の飽和層内の流動を促進させることによって有機物を拡散させる手法も好適に用いることができる。注入は必要量を一度に添加する方法のほか、浄化終了までに間欠的にもしくは連続的に注入することができる。なお、ＣＳＬ及び糖蜜を他の有機物と混合して使用することも可能である。
【００３８】
ＣＳＬには豊富な窒素およびリンを含有しており、通常はこれらの栄養塩を添加する必要はないが、他の有機物を混合することなどでこれらの栄養塩が不足する場合には別途もしくは同時に添加を行うことができる。また、有機塩素化合物の分解によって精製する塩酸や、有機化合物の分解によって精製する有機酸等によってアルカリ度が消費されるため、地下水中のアルカリ度が不足する場合（おおむね１００ｍｇＣａＣＯ3／Ｌ程度以下）の場合には炭酸塩等のアルカリ化合物等を添加することが好ましい。
【００３９】
以下に、ＣＳＬ及び糖蜜の好ましい使用条件について説明する。
（１）ｐＨ：６．０〜８．５（より好ましくは７．０〜８．０）
ＣＳＬの添加により嫌気性条件で通常、有機酸が生成する。そのため、対象となる地下水中にはある程度（１００ｍｇ−ＣａＣＯ3／Ｌ）のアルカリ度があることが好ましい。アルカリ度が不足している場合には炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸塩、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム等の一般的なアルカリ物質を添加することにより調整可能である。
【００４０】
（２）硫酸イオン濃度：１５００ｍｇ−ＳＯ42-／Ｌ以下（より好ましくは１０００ｍｇ／Ｌ以下）
硫酸イオンが高濃度に存在する場合、通常、有機物を添加することにより嫌気性硫酸還元菌の働きが活発になり、硫化水素を生成する。また、脱塩素を担う微生物の活性を阻害することがある。そのため硫酸イオン濃度は低いことが好ましい。（ちなみに海水中硫酸イオン濃度は２７００ｍｇ／Ｌ程度である。）
【００４１】
（３）注入方法：
注入用の井戸等から、地下水によって飽和している地層である帯水層中に注入することが好ましい。注入は連続、間欠、一度のみ等いずれでも可能である。
【００４２】
（４）注入量：
浄化対象エリアを特定し、そのエリア内において地下水中の有機物質濃度がＴＯＣとして平均で目標の範囲となるように調整する。
【００４３】
（５）希釈水：
特に規定はないが、有害物質を含まないものを使用することが好ましい。また、固形物を多く含む水は井戸のスクリーンや地層等を閉塞する可能性があるので使用しないことが好ましい。また、微量元素を考慮する観点からは純水よりも工水、水道水、地下水等の方が好ましい。
【００４４】
（６）希釈方法：
ＣＳＬ及び糖蜜は上記の希釈水を用いて希釈してもよい。希釈方法はラインミキサ等による混合、タンク等の容器内での混合（ミキサの使用可）等が挙げられる。また、気温が低い場合などに固形物が生成している場合には加温することによって溶解して使用してもよい。
【００４５】
（７）注入ＣＳＬのモニタリング：
注入したＣＳＬはＴＯＣ計によるＴＯＣ測定、ＢＯＤ測定、ＣＯＤＣｒ測定、過マンガン酸消費量の測定等により濃度のモニタリングを行うことができる。このうち現場においてはＣＯＤＣｒ測定キットを使用した測定方法や過マンガン酸消費量を測定することが簡便である。
【００４６】
（８）温度：
温度は一般的な地下水温度（１０〜２０℃程度）で使用することができる。ただし、環境が許せば加温（２０〜３５℃程度）を行うことによって浄化の期間を短縮することが可能である。
【００４７】
本実施形態に係る微生物の培養方法は、有機化合物を嫌気的に分解する微生物を、コーンスティープリカー及び糖蜜を添加して培養するものである。また、コーンスティープリカーと糖蜜を混合することにより、有機化合物を分解する嫌気性微生物の活性を高める栄養剤として用いることができる。
【００４８】
浄化対象現場に、汚染物質の分解菌が存在せずプレテスト結果によっても、浄化の傾向が確認されない時には、培養した分解微生物（分解菌）を汚染現場に添加する手法であるバイオオーグメンテーションが有効となる。デハロコッコイデス属に代表されるような分解微生物を外部で培養する際には、例えばコーンスティープリカーと糖蜜との混合液を、培地容積に対して好ましくは０．００２〜０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）、より好ましくは０．０１〜０．０２％（ｗｔ／ｖｏｌ）程度添加し、スラリー状態で撹拌しながら培養することができる。培養時に有機化合物を添加する場合には、その有機化合物が分解していることを確認した培養液を汚染現場の原位置に注入を行う。または、掘削された汚染土壌、揚水された汚染地下水に培養した分解微生物を添加し分解することも可能である。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
＜試験１＞
（比較例１）
ＶＯＣに汚染された地下水４０ｍＬを容積１００ｍＬのバイアル瓶に入れ、嫌気条件を創出するため、上部の空気を窒素パージした。これに対して、汚染物質のシス−１，２−ジクロロエチレン（ｃｉｓ−ＤＣＥ）を１２ｍｇ／Ｌになるように加え、コーンスティープリカー（サンエイ糖化製、主成分：アミノ酸類を２０〜３０重量％、糖類を１〜１０重量％含有）をＴＯＣが２００ｍｇ／Ｌとなるように添加して２０℃に設定したインキュベータ内で培養を行った。この試料のヘッドスペース（ＨＳ）部分を定期的にサンプリングして、ＰＩＤ検出器付ガスクロマトグラフ（日本電子（株）製、ＧＣ−３１１型）でｃｉｓ−ＤＣＥの分析を行い、水溶液中のそれぞれの濃度を定量した。結果を図１に示す。また、試料中の窒素濃度は３８．６ｍｇ／Ｌであった。なお、窒素濃度は全有機体炭素計（（株）島津製作所製、ＴＯＣ−ＶオプションＴＮＭ−１）を用いて測定した。ＴＯＣ濃度は全有機体炭素計（（株）島津製作所製、ＡＳＩ−５０００）を用いて測定した。
【００５１】
（比較例２）
ＣＳＬの代わりにポリ乳酸グリセリンエステル（商品名ＨＲＣ、Ｒｅｇｅｎｅｓｉｓ社製）を使用して比較例１と同様の試験を実施した。結果を図１に示す。また、試料中の窒素濃度は１０．０ｍｇ／Ｌであった。
【００５２】
（比較例３）
ＣＳＬの代わりに酵母エキスを使用して比較例１と同様の試験を実施した。結果を図１に示す。また、試料中の窒素濃度は９．８ｍｇ／Ｌであった。
【００５３】
＜試験結果＞
図１に結果を示すように、ＣＳＬを使用した比較例１においては他の有機基質を使用した比較例２、３と比較してｃｉｓ−ＤＣＥの脱塩素化反応の発現が早いことが確認された。
【００５４】
＜試験２＞
（実施例１）
滅菌地下水３８ｍＬとＶＯＣ分解菌（デハロコッコイデス属）の培養液２ｍＬ（１０6個／ｍＬ）とを容積１００ｍＬのバイアル瓶に入れ、嫌気条件を創出するため、上部の空気を窒素パージした。これに対して、汚染物質のｃｉｓ−ＤＣＥを１ｍｇ／Ｌになるように加え、有機基質である廃糖蜜（富士デベロップメント製、糖類を４０〜６０重量％、タンパク質を５〜１５重量％含有）とコーンスティープリカー（サンエイ糖化製）の混合液をＴＯＣとして１００ｍｇ／Ｌとなるように添加して２０℃に設定したインキュベータ内で培養を行った。ＣＳＬと糖蜜との混合比率は、有機体炭素（ＴＯＣ）：窒素（Ｎ）がほぼ２０：１となるようにＣＳＬ：糖蜜＝２７：７３（重量比）に固定して行った。この試料のヘッドスペース（ＨＳ）部分を定期的にサンプリングして、ＰＩＤ検出器付ガスクロマトグラフでｃｉｓ−ＤＣＥの分析を行い、水溶液中のそれぞれの濃度を定量した。結果を図２に示す。また、試料中の窒素濃度は５．０ｍｇ／Ｌであった。
【００５５】
（比較例４）
ＣＳＬのみをＴＯＣが１００ｍｇ／Ｌとなるように添加して、実施例１と同様の条件で試験を行った。結果を図２に示す。また、試料中の窒素濃度は１９．３ｍｇ／Ｌであった。
【００５６】
＜試験結果＞
図２に試験結果を示すように、実施例１と比較例４においてほぼ同時にｃｉｓ−ＤＣＥの脱塩素化反応が発現したことが確認された。従って糖蜜とＣＳＬの混合物は有機化合物を分解する微生物の活性を高めるための栄養剤としてＣＳＬのみの場合と同等の効果があることが示唆された。
【００５７】
＜試験１、試験２の総合評価＞
試験１と試験２の結果を表１にまとめた。浄化速度、二次汚染（硝酸性窒素）、コスト面で、総合的に評価すると、地下水浄化においての栄養剤には、糖蜜＋ＣＳＬが最も適していることが分かった。
【００５８】
【表１】
【００５９】
＜試験３＞
（実施例２〜７）
滅菌地下水３８ｍＬとＶＯＣ分解菌（デハロコッコイデス属）の培養液２ｍＬ（１０6個／ｍＬ）とを容積１００ｍＬのバイアル瓶に入れ、嫌気条件を創出するため、上部の空気を窒素パージした。これに対して、汚染物質のｃｉｓ−ＤＣＥを１ｍｇ／Ｌになるように加え、有機基質である廃糖蜜（富士デベロップメント製）とコーンスティープリカー（サンエイ糖化製）の混合液（混合比率＝ＣＳＬ：糖蜜＝２７：７３（重量比））をＴＯＣとして２０ｍｇ／Ｌとなるように添加して２０℃に設定したインキュベータ内で培養を行った。この試料のヘッドスペース（ＨＳ）部分を定期的にサンプリングして、ＰＩＤ検出器付ガスクロマトグラフでｃｉｓ−ＤＣＥの分析を行い、水溶液中のそれぞれの濃度を定量した。また、実施例３〜７として有機基質である糖蜜とＣＳＬの混合液をＴＯＣとして５０ｍｇ／Ｌ（実施例３）、１００ｍｇ／Ｌ（実施例４）、２００ｍｇ／Ｌ（実施例５）、３００ｍｇ／Ｌ（実施例６）、５００ｍｇ／Ｌ（実施例７）となるように添加して、実施例２と同様の試験を実施した。結果を図３に示す。また、試料中の窒素濃度は１．０ｍｇ／Ｌ（実施例２）、２．５ｍｇ／Ｌ（実施例３）、５．０ｍｇ／Ｌ（実施例４）、１０．０ｍｇ／Ｌ（実施例５）、１５．０ｍｇ／Ｌ（実施例６）、２５．１ｍｇ／Ｌ（実施例７）、であった。
【００６０】
＜試験結果＞
図３にｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示すように、ＣＳＬと糖蜜の混合液（混合比率＝ＣＳＬ：糖蜜＝２７：７３（重量比））をＴＯＣとして２００ｍｇ／Ｌとなるように添加した実施例５において、他の実施例、比較例と比較してｃｉｓ−ＤＣＥの脱塩素化反応の発現が早いことが確認された。また、ＴＯＣが５０ｍｇ／Ｌ以上ではある程度ｃｉｓ−ＤＣＥの脱塩素反応は早く進むが、ＴＯＣが５０ｍｇ／Ｌ未満であると、脱塩素反応の速度が下がることが判明した。これらのことから、地中の窒素濃度を１０ｍｇ／Ｌ以下に抑えつつ、より早く脱塩素反応を進めるためには、ＣＳＬ中の有効成分以外に嫌気状態創出、微生物増殖のための有機物が必要であるとわかった。その有機物を糖蜜とし、ＣＳＬと糖蜜を混合比率、ＣＳＬ：糖蜜＝２７：７３、ＴＯＣは２００ｍｇ／Ｌにするのが最適な方法として確立した。
【００６１】
＜試験４＞
（実施例８〜１１）
再現性を確認するために、実施例２（ＴＯＣ：２０ｍｇ／Ｌ）、実施例３（ＴＯＣ：５０ｍｇ／Ｌ）、実施例４（ＴＯＣ：１００ｍｇ／Ｌ）、実施例５（ＴＯＣ：２００ｍｇ／Ｌ）の試験を同じ条件でそれぞれ実施例８〜１１として行った。結果を図４に示す。また、試料中の窒素濃度は１．０ｍｇ／Ｌ（実施例８）、２．５ｍｇ／Ｌ（実施例９）、５．０ｍｇ／Ｌ（実施例１０）、１０．０ｍｇ／Ｌ（実施例１１）であった。
【００６２】
＜試験結果＞
図４にｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示すように、ＣＳＬと糖蜜の混合液（混合比率＝ＣＳＬ：糖蜜＝２７：７３）をＴＯＣとして１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌとなるように添加した実施例１０，１１において、他の実施例と比較してｃｉｓ−ＤＣＥの脱塩素化反応の発現が早いことが確認された。
【００６３】
＜試験３、試験４の総合評価＞
試験３と試験４の結果を表２にまとめた。浄化速度、二次汚染（硝酸性窒素）、再現性、コスト面で、総合的に評価すると、地下水浄化においてのＴＯＣは、５０〜５００ｍｇ／Ｌの範囲が適しており、１００〜２００ｍｇ／Ｌの範囲が最も適していることが分かった。
【００６４】
【表２】
【００６５】
＜試験５＞
（実施例１２、比較例５，６）
ＶＯＣに汚染された地下水４０ｍＬを容積１００ｍＬのバイアル瓶に入れ、嫌気条件を創出するため、上部の空気を窒素パージした。これに対して、汚染物質のｃｉｓ−ＤＣＥを５ｍｇ／Ｌになるように加え、栄養剤として糖蜜とＣＳＬとの混合物（実施例１２）、糖蜜のみ（比較例５）、ＣＳＬのみ（比較例６）をＴＯＣが２００ｍｇ／Ｌとなるように添加して２０℃に設定したインキュベータ内で培養を行った。この試料のヘッドスペース（ＨＳ）部分を定期的にサンプリングして、ＰＩＤ検出器付ガスクロマトグラフでｃｉｓ−ＤＣＥの分析を行い、水溶液中のそれぞれの濃度を定量した。結果を図５に示す。また、試料中の窒素濃度は１０．０ｍｇ／Ｌ（実施例１２）、３．９ｍｇ／Ｌ（比較例５）、３８．６ｍｇ／Ｌ（比較例６）であった。
【００６６】
＜試験結果＞
図５にｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示すように、糖蜜のみを使用してもｃｉｓ−ＤＣＥの脱塩素化反応はほとんど起こらないことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の比較例１〜３におけるｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示す図である。
【図２】本発明の実施例１及び比較例４におけるｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示す図である。
【図３】本発明の実施例２〜７におけるｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示す図である。
【図４】本発明の実施例８〜１１におけるｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示す図である。
【図５】本発明の実施例１２、比較例５，６におけるｃｉｓ−ＤＣＥ濃度の経時変化を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機化合物により汚染された土壌及び地下水のうち少なくとも１つにコーンスティープリカー及び糖蜜を添加して、嫌気性条件下で微生物により前記有機化合物を分解することを特徴とする土壌、地下水の浄化方法。
【請求項２】
請求項１に記載の土壌、地下水の浄化方法であって、
前記コーンスティープリカー及び糖蜜を、添加後の前記土壌または地下水中の窒素濃度が１０ｍｇ／Ｌ以下になるように添加することを特徴とする土壌、地下水の浄化方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の土壌、地下水の浄化方法であって、
前記コーンスティープリカー及び糖蜜を、添加後の前記土壌または地下水中の有機体炭素（ＴＯＣ）濃度が５０〜５００ｍｇ／Ｌの範囲になるように添加することを特徴とする土壌、地下水の浄化方法。
【請求項４】
有機化合物を分解する微生物をコーンスティープリカー及び糖蜜の存在下で培養し、前記培養した微生物を用いて、有機化合物により汚染された土壌及び地下水のうち少なくとも１つを浄化することを特徴とする土壌、地下水の浄化方法。
【請求項５】
有機化合物を分解する微生物をコーンスティープリカー及び糖蜜の存在下で培養することを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項６】
有機化合物を分解する微生物の活性を高めるための栄養剤であって、コーンスティープリカー及び糖蜜から構成されることを特徴とする栄養剤。
【請求項１】
有機化合物により汚染された土壌及び地下水のうち少なくとも１つにコーンスティープリカー及び糖蜜を添加して、嫌気性条件下で微生物により前記有機化合物を分解することを特徴とする土壌、地下水の浄化方法。
【請求項２】
請求項１に記載の土壌、地下水の浄化方法であって、
前記コーンスティープリカー及び糖蜜を、添加後の前記土壌または地下水中の窒素濃度が１０ｍｇ／Ｌ以下になるように添加することを特徴とする土壌、地下水の浄化方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の土壌、地下水の浄化方法であって、
前記コーンスティープリカー及び糖蜜を、添加後の前記土壌または地下水中の有機体炭素（ＴＯＣ）濃度が５０〜５００ｍｇ／Ｌの範囲になるように添加することを特徴とする土壌、地下水の浄化方法。
【請求項４】
有機化合物を分解する微生物をコーンスティープリカー及び糖蜜の存在下で培養し、前記培養した微生物を用いて、有機化合物により汚染された土壌及び地下水のうち少なくとも１つを浄化することを特徴とする土壌、地下水の浄化方法。
【請求項５】
有機化合物を分解する微生物をコーンスティープリカー及び糖蜜の存在下で培養することを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項６】
有機化合物を分解する微生物の活性を高めるための栄養剤であって、コーンスティープリカー及び糖蜜から構成されることを特徴とする栄養剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−９０１８３（Ｐ２００９−９０１８３Ａ）
【公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２６１７５８（Ｐ２００７−２６１７５８）
【出願日】平成１９年１０月５日（２００７．１０．５）
【出願人】（０００００４４００）オルガノ株式会社 (606)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月５日（２００７．１０．５）
【出願人】（０００００４４００）オルガノ株式会社 (606)
【Ｆターム（参考）】
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