変異体フミコーラ・グリセアＣＢＨ１．１
【課題】バイオマスセルロースの効率的な加水分解方法の提供。
【解決手段】フミコーラ・グリセアＣｅｌ７Ａ（ＣＢＨ１．１）変異体、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨＩ、これらをエンコードする核酸及びこれらを生成する方法。当該変異体セルラーゼはファミリー７Ａのグリコシル加水分解酵素のアミノ酸配列を有し、１以上のアミノ酸残基が置換されている。
【解決手段】フミコーラ・グリセアＣｅｌ７Ａ（ＣＢＨ１．１）変異体、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨＩ、これらをエンコードする核酸及びこれらを生成する方法。当該変異体セルラーゼはファミリー７Ａのグリコシル加水分解酵素のアミノ酸配列を有し、１以上のアミノ酸残基が置換されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２００３年４月１日に出願された米国仮出願番号６０／４５９，７３４号（代理人整理番号、ＧＣ７９４Ｐ）に基づく優先権を主張するものであり、これをここに引用する。
連邦政府後援による研究開発のもと行われた発明に対する権利に関する陳述
【０００２】
この研究の一部は、米国エネルギー省の元契約番号ＤＥ−ＡＣ３６−９９ＧＯ１０３３７の下、再生可能エネルギー研究所の下請け番号ＺＣＯ−０−３００１７−０１により資金援助されたものである。従って、米国政府は本発明における特定の権利を有し得る。
発明の分野
【０００３】
本発明はセロビオヒドロラーゼI（ＣＢＨ１またはＣＢＨＩともいう）活性を有するポリペプチド及び当該ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに関する。また、本発明は核酸構築体、ベクター、及び当該核酸構築体を含む宿主細胞、並びに当該ポリペプチドを生成及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
セルロースは重要な工業的原料であり、再生可能エネルギーの供給源である。天然セルロースの物理的構造及び形態は複雑であり、その構造の細部を実験的に測定することは難しい。しかしながら、セルロースの化学組成は単純であり、β−１，４−グリコシド結合により結合したＤ−グルコース残基からなり直鎖を形成する。
【０００５】
効率をよくするため、セルロース消化は協調的に作用する数種の酵素を必要とする。少なくとも３つの酵素カテゴリーがセルロースをグルコースに変換するために必要である：ランダムにセルロース鎖を切断するエンド（１，４）−β−Ｄ−グルカナーゼ（ＥＣ３ １．４）；セルロース鎖末端からセロビオシル単位を切断するセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３ １．９１）及びセロビオース及び可溶性セロデキストリンをグルコースに変換するβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３ １．２１）。セルロース生分解に関する酵素のこれら３つのカテゴリーの中で、セロビオヒドロラーゼは天然結晶セルロース分解のために主要な酵素である。エキソ−セロビオヒドロラーゼ（セロビオヒドロラーゼ１またはＣＢＨ１）は、セルロースポリマー鎖の非還元末端からセロビオースを加水分解することによりセルロースを分解するセロビオヒドロラーゼをいう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
セロビオヒドロラーゼＩ活性を有する改善されたポリペプチド及び当該ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを提供することが本発明の目的である。改善されたポリペプチドは改善された特異活性及び／または改善された安定性、特に改善された熱安定性を有することができる。
【０００７】
セルラーゼ組成物についての開示は従来からあるが、家庭用洗剤、ストーンウォッシュ組成物または洗濯用洗剤等に使用するための新規で改善されたセルラーゼ組成物の必要性が依然として残っている。改善された性能を示すセルラーゼは特に関心が高い。
[先行技術文献]
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１はＨ．グリセアＣＢＨ１．１のゲノムＤＮＡ配列である（配列番号１）。推測上のイントロンは太字、下線で示す。
【図２】図２はＨ．グリセアＣＢＨ１．１のｃＤＮＡ配列である（配列番号２）。推測上のイントロン配列（図１中のヌクレオチド４１３−４７２）は欠失させた。
【図３】図３はＨ．グリセアＣＢＨ１．１のシグナル配列及び成熟アミノ酸配列である（配列番号３）。シグナル配列は太字、下線で示す。
【図４】図４はＨ．グリセアＣＢＨ１．１の成熟アミノ酸配列である（配列番号４）。
【図５】図５は２つの公知及び変異体フミコーラ・グリセアＣＢＨ１．１成熟配列の配置を示す。２つの公知配列はＸ１７２５８（配列番号５）及びＤ６３５１５（配列番号６）である。
【図６】図６はｐＲＡＸ１プラスミドである。このベクターは、アスペルギルス・ニデュランスゲノムＤＮＡ断片ＡＭＡ１配列の５２５９ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９６ １９：５６５−５７４）を挿入した以外は、プラスミドｐＧＡＰＴ２に基づく。塩基１〜１１３４はアルペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼ遺伝子プロモーターを含む。塩基３０９８〜３３５６及び４９５０〜４９７１はアルペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼターミネーターを含む。アスペルギルス・ニデュランスｐｙｒＧ遺伝子を真菌形質転換のためのマーカーとして３３５７〜４９４９に挿入した。遺伝子を挿入できるマルチクローニング部位（ＭＣＳ）が存在する。
【図７】図７はｐＲＡＸｄｅｓ２ベクター骨格である。このベクターはプラスミドｐＲＡＸ１に基づく。ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）カセットをｐＲＡＸベクター内に導入した（環状プラスミド内部の矢印によって示す）。このカセットは組換え配列ａｔｔＲ１及びａｔｔＲ２及び選択マーカーｃａｔＨ及びｃｃｄＢを含む。当該ベクターはＧａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングテクノロジー：バージョン１、第３４−３８頁のマニュアルに従って作り、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の大腸菌ＤＢ３．１中でのみ複製でき、その他の大腸菌宿主中では、当該ｃｃｄＢ遺伝子は死滅する。まず、ＰＣＲ断片をａｔｔＢ１／２組換え配列を含むプライマーを用いて作る。この断片はｐＤＯＮＲ２０１（インビトロジェンから市販）で組換え、このベクターは組換え部位間にｃａｔＨ及びｃｃｄＢを有するａｔｔＰ１／２組換え配列を含む。インビトロジェンのＢＰクロナーゼ酵素はこのいわゆるＥＮＴＲＹ（エントリー）ベクター内のＰＣＲ断片を組換えるために用い、挿入されたＰＣＲ断片を有するクローンはｃｃｄＢを発現するクローンが生き残らないので５０μｇ／ｍｌカナマイシンで選択できる。ここでａｔｔ配列を変異し、ａｔｔＬ１及びａｔｔＬ２と呼ぶ。第２の工程はｐＲＡＸｄｅｓ２ベクターを用いたこのクローンの組換えである（組換え部位間にａｔｔＲ１及びａｔｔＲ２ ｃａｔＨ及びｃｃｄＢを含む）。インビトロジェンからのＬＲクロナーゼ酵素は目的ベクター内にＥＮＴＲＹベクターからの挿入を組込むために用いる。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを用いると、ｃｃｄＢは死滅し、ＥＮＴＲＹベクターはアンピシリンに感受性であるので、ｐＲＡＸＣＢＨ１ベクターのみが選択される。この方法により発現ベクターが調製され、Ａ．ニガーを形質転換するために用いることができる。Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１発現はアスペルギルス・グルコアミラーゼプロモーター及びターミネーター制御下にある。形質転換マーカーｐｙｒＧ遺伝子及びＡＭＡ１配列はアスペルギルス・ニデュランス由来である。
【図８】図８はアスペルギルス中、ＣＢＨ１．１をエンコードする核酸を発現するために用いたｐＲＡＸｄｅｓ２ｃｂｈ１ベクターの説明である。ＣＢＨ１．１酵素変異体をエンコードする核酸はａｔｔ配列の相同組換えによりベクター内にクローンした。
【図９】図９は、基質として前処理伐採残（コーンストーバー）（ＰＣＳ）を用いた１日、３８℃及び１５ｍｇの全酵素／ｇセルロースでの、セルロース変換分析における種々のＣＢＨ１セルラーゼ活性を示す。この分析は約５０：５０質量比で試験ＣＢＨ１．１サンプルとＣＢＨ１が欠失されたＴ．リーゼイ株成長から得た上澄みを混合する。この分析において３８℃でＨ．グリセアＣＢＨ１．１は特徴を示さない。 凡例：ｄｅｌＣＢＨＩはその内生ＣＢＨ１が欠失された株である；ＣＢＨ１欠失である。ｒＣＢＨ１はＴ．リーゼイＣＢＨ１遺伝子が挿入されたＡ．ニガー株由来の精製酵素である。Ａ．ニガーはその内生セルラーゼＣＢＨＣを過剰発現するＡ．ニガー株由来の精製ＣＢＨＢである。Ｈ．シュワイニッチィ／Ａｎは、挿入されたヒポクレア・シュワイニッチィ由来の異種ＣＢＨ１遺伝子を発現するＡ．ニガー株由来の精製ＣＢＨ１である。Ｔ．プソイドコニンギ／Ａｎは、挿入されたトリコデルマ・プソイドコニンギ由来の異種ＣＢＨ１遺伝子を発現するＡ．ニガー株由来の精製ＣＢＨ１である。Ｈ．グリセア／Ａｎ−１は挿入されたＨ．グリセア由来の異種ＣＢＨ１．１遺伝子を発現する第１のＡ．ニガークローン由来の精製ＣＢＨ１．１である。Ｈ．グリセア／Ａｎ−２は挿入されたＨ．グリセア由来の異種ＣＢＨ１．１遺伝子を発現する第２のＡ．ニガークローン由来の精製ＣＢＨ１．１である。Ｈ．グリセア／Ａｎ−１及びＨ．グリセア／Ａｎ−２はＨ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１遺伝子を含むＡ．ニガーの同じ形質転換由来の２つのクローンである。
【図１０】図１０は、基質として前処理伐採残（コーンストーバー）を用いた１日、６５℃及び１５ｍｇの全酵素／ｇセルロースでの、セルロース変換分析におけるＣＢＨ１セルラーゼ活性を示す。この分析は約５０：５０質量比で試験ＣＢＨ１サンプルとＣＢＨ１が欠失されたＴ．リーゼイ株成長から得た上澄みを混合する。この分析において３８℃でＨ．グリセアＣＢＨ１．１は特徴を示さない。３８℃の結果と異なり、Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１サンプルの両方ともその他のサンプルよりも明らかに良い。凡例：図９と同じ。
【図１１】図１１は、基質として前処理伐採残（コーンストーバー）（ＰＣＳ）を用いた１日、３８℃及び１５ｍｇの全酵素／ｇセルロースでの、セルロース変換分析におけるＨ．グリセアＣＢＨ１．１及びＴ．リーゼイＣＢＨ１セルラーゼ活性を示す。この分析は約５０：５０質量比で試験ＣＢＨ１．１サンプルとＣＢＨ１が欠失されたＴ．リーゼイ株成長から得た上澄みを混合する。この分析において３８℃でＨ．グリセアＣＢＨ１．１は特徴を示さない。天然ＣＢＨ１（ｎＣＢＨ１）を当業者に公知の方法を用いてＴ．リーゼイセルラーゼ全体から精製した（ここに記載のＣＢＨの精製方法を参照）。
【図１２】図１２は、基質として前処理伐採残（コーンストーバー）を用いた１日、６５℃及び１５ｍｇの全酵素／ｇセルロースでの、セルロース変換分析のみにおけるＨ．グリセア及びＴ．リーゼイｒＣＢＨ１酵素の活性の結果を示す。この分析は約５０：５０質量比で試験ＣＢＨ１サンプルとＣＢＨ１が欠失されたＴ．リーゼイ株成長から得た上澄みを混合する。３８℃の結果と異なり、Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１サンプルはＴ．リーゼイよりも良い。
【図１３Ａ】種々の時点で測定したリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）についてのセルロース変換分析におけるＣＢＨＩセルラーゼ活性を示す。パネルＡにおいて、温度３８℃、１２０分間にわたって測定する。
【図１３Ｂ】種々の時点で測定したリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）についてのセルロース変換分析におけるＣＢＨＩセルラーゼ活性を示す。パネルＢにおいて、温度６５℃で測定した。
【図１３Ｃ】種々の時点で測定したリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）についてのセルロース変換分析におけるＣＢＨＩセルラーゼ活性を示す。パネルＣにおいて、温度７０℃で測定した。変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１はどの測定時点においてもＴ．リーゼイＣＢＨ１よりもセロビオースを多く放出することがわかる。
【図１４Ａ】スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１のゲノムＤＮＡ（配列番号７）配列を示す。
【図１４Ｂ】スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１のｃＤＮＡ（配列番号８）配列を示す。
【図１４Ｃ】スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１のアミノ酸（配列番号９）配列を示す。当該アミノ酸配列はシグナル配列を含む。
【図１５】図１５は、Ｈ．グリセア ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１（配列番号１０）及びスキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１（配列番号１１）の成熟型配置（すなわち、シグナル配列を含まない）を示す。また、コンセンサス配列も示す（配列番号１２）。Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１触媒ドメイン中の６つの残基を太字、下線で示し、当該部位が高められた安定性に重要である可能性を示す。
【図１６】図１６はＨ．グリセア ＣＢＨ１．１及びＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１の熱安定性プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、参照目的のみにより以下の定義及び実施例を用いて詳細を説明する。ここに引用する全ての特許及び文献は、当該特許及び文献内に開示される全ての配列も含めて、明示的にここに引用するものとする。
特段に示す場合を除いて、ここで用いる全ての技術及び科学用語は、本発明の属する当業者にとって理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、他、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（微生物学及び分子生物学の辞典）、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ
Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は当業者に本発明で用いる多くの用語の一般的な辞書を提供するものである。ここに記載の方法及び物質に類似または同等のいかなる方法及び物質も本発明を実施及び試験する際に用いることができるが、好ましい方法及び物質を記載する。数値範囲は範囲を定める数字を含める。別に示す場合を除いて、それぞれ核酸は左から右に５’〜３’方向；アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載する。実務者は特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９、及びＡｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．、１９９３を当業界の定義及び用語のために参照できる。本発明は記載された特定の方法、手順及び試薬に限定されないことは、これらが種々多様であることから当然に理解される。
【００１０】
ここに提供する表題は、明細書全体を参照することにより得られる本発明の種々の側面または実施態様を限定するものではない。従って、下記に定義する用語は明細書全体を参照することによりさらに十分に定義される。
ここに引用する全ての文献は、本発明に関連し得る組成物及び方法を記載及び開示する目的のため参照することによりここに明示的に引用する。
Ｉ．定義
【００１１】
“セルラーゼ”、“セルロース分解酵素” “セルラーゼ酵素”は細菌性または真菌性エキソグルカナーゼまたはエキソセロビオヒドロラーゼ、及び／またはエンドグルカナーゼ、及び／またはβ−グルコシダーゼを意味する。
【００１２】
“セルラーゼ”の語は、セルロースポリマーをより短いセロ−オリゴ糖オリゴマー、セロビオース及び／またはグルコースに加水分解できる酵素カテゴリーをいう。多数のセルラーゼの例、例えばエキソグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びグルコシダーゼがセルロース分解性微生物、特に真菌及び細菌から得られる。これらの微生物から作られる酵素は、セルロースをグルコースに変換するのに有用な３種の作用を有するタンパク質の混合物：すなわち、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、及びβ−グルコシダーゼである。これらの３つの異なる種類のセルラーゼ酵素はセルロース及びその誘導体をグルコースに変換するために相乗的に作用する。
多くの微生物はセルロースを加水分解する酵素を生成し、例えば真菌トリコデルマ、土壌細菌Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、バチルス、及びセルロモナス；ストレプトマイセス；及び真菌フミコーラ、アルペルギルス及びフサリウムなどがある。
【００１３】
“セロビオヒドロラーゼ１活性”とは、セルロース１，４−β−セロビオシダーゼ（エキソ−グルカナーゼ、エキソ−セロビオヒドロラーゼ、ＣＢＨ１または１，４−β−セロビオヒドロラーゼとも呼ぶ）活性を意味し、酵素分類ＥＣ３．２．１．９１として定義され、セルロース及びセロテトラオース中の１，４−β−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒し、セルロース鎖の非還元末端からセロビオースを放出する。本発明では、ＣＢＨ１活性は実施例４に記載の手順に従って測定できる。
【００１４】
“宿主細胞”の語はベクターを含み、複製及び／または転写または発現構築体の転写及び翻訳（発現）を助ける細胞を意味する。本発明で用いる宿主細胞は大腸菌などの原核細胞または酵母などの真核細胞、植物、昆虫、両生類または哺乳類細胞などの細胞である。通常、宿主細胞は糸状菌である。
【００１５】
細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いる“組換え体”の語は、該細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の挿入により、または天然核酸またはタンパク質の変異により修飾されたこと、または該細胞がそのように修飾された細胞由来であることを示す。従って、例えば、組換え細胞は当該細胞の天然（非組換え）型内では見られない遺伝子を発現し、または発現、または全く発現しない条件下で、通常は異常発現される天然遺伝子を発現する。
【００１６】
“分泌シグナル配列”の語は、大ポリペプチドの構成要素として、ポリペプチドが合成される細胞の分泌経路から当該大ポリペプチドに導かれるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をエンコードするＤＮＡ配列を示す。当該大ペプチドは普通は分割されて、分泌経路を通過する際に分泌ペプチドが取り除かれる。
【００１７】
ここで用いる、“セルラーゼ調製物全体”及び“セルラーゼ組成物全体”の語句は交換可能に用いられ、天然及び非天然組成物の両方をいう。“天然”組成物は天然源により生成した組成物であり、１以上のセロビオヒドロラーゼ型、１以上のエンドグルカナーゼ型、及び１以上のβ−グルコシダーゼ成分を含み、これらの各成分は供給源より生じた比率で見られる。天然組成物はセルロース分解酵素が非修飾の微生物から生成したものであり、従って当該成分酵素の比率は天然微生物により生成したものから変更されていない。
【００１８】
“非天然”組成物は、（１）天然比率または非天然、すなわち変更された比率で成分をセルロース分解酵素と混合；または（２）１以上のセルロース分解酵素を過剰発現または過少発現するように微生物を修飾；または（３）少なくとも１のセルロース分解酵素が欠失するように微生物を修飾、または（４）異種成分セルロース分解性酵素を発現するように微生物を修飾することにより生成したこれらの組成物を包含する。
【００１９】
ここで用いる、“プロモーター”の語は下流遺伝子の転写に導くように作用する核酸配列をいう。プロモーターは通常、標的遺伝子が発現する宿主細胞に適したものである。プロモーターはその他の転写及び翻訳調節核酸配列（“制御配列”とも呼ぶ）と一緒に所定の遺伝子を発現するために必要である。通常、転写及び翻訳調節配列は、限定されないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列及びエンハンサーまたは活性化配列を含む。プロモーターは下流遺伝子に通常関係するプロモーターであってもよく、または遺伝子に直接機能する限り、異種、すなわち他の遺伝子または他の微生物由来のものであってもよい。１の側面において、プロモーターは誘導性プロモーターである。１の側面において、プロモーターはジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）にアクセッション番号Ｄ８６２３５で寄託されているＴ．リーゼイｃｂｈ１プロモーターである。他の側面において、プロモーターはＴ．リーゼイ由来のｃｂｈＩＩまたはキシラナーゼプロモーターである。
【００２０】
例としては、Ａ．アワモリまたはＡ．ニガーグルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｈ．他（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４、２３０６−２３１５；Ｂｏｅｌ，Ｅ．他（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３，１５８１−１５８５）、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ カルボキシル・プロテアーゼ遺伝子、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓ．Ｐ．他（１９８４）欧州特許出願番号第ＥＰＯ０１３７２８０Ａ１）由来のプロモーター、Ａ．ニデュランスｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．他（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１，１４７０−１４７４；Ｍｕｌｌａｎｅｙ，Ｅ．Ｊ．他（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９，３７−４５）、Ａ．ニデュランスａｌｃＡ遺伝子（Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ａ．他（１９８６）Ｇｅｎｅ３３、１３７−１４９）、Ａ．ニデュランスｔｐｉＡ遺伝子（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｇ．Ｌ．他（１９８６）Ｃｅｌｌ４６，１４３−１４７）、Ａ．ニデュランスａｍｄＳ遺伝子（Ｈｙｎｅｓ，Ｍ．Ｊ．他（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３，１４３０−１４３９）、Ｔ．リーゼイ ｘｌｎ１遺伝子、Ｔ．リーゼイ ｃｂｈ２遺伝子、Ｔ．リーゼイ ｅｇｌ１遺伝子、Ｔ．リーゼイ ｅｇｌ２遺伝子、Ｔ．リーゼイ ｅｇｌ３遺伝子、及びＳＶ４０早期プロモーターなどの高等真核プロモーター（Ｂａｒｃｌａｙ，Ｓ．Ｌ．とＥ．Ｍｅｌｌｅｒ（１９８３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３，２１１７−２１３０）を含む。
【００２１】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に位置する場合、“動作可能に連結”する。例えば、分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）をエンコードするＤＮＡ、すなわちシグナルペプチドは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに動作可能に連結し；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に動作可能に連結し；またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するために位置する場合、コード配列に動作可能に連結する。通常、“動作可能に連結する”とは、連結ＤＮＡ配列が隣接しており、及び分泌リーダーの場合、隣接し、かつリーディングフレーム内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は都合のよい制限部位で連結反応により達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチド・アダプタまたはリンカーを従来実務に従って用いる。
【００２２】
ここで用いる“遺伝子”の語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡ断片を意味し、コード領域の先行及び後の領域、例えば５’非翻訳（５’ＵＴＲ）または“リーダー”配列及び３’ＵＴＲまたは“トレーラー”配列、及び個々のコード断片（エキソン）間の介在配列（イントロン）などを含んでも含まなくてもよい。
【００２３】
当該遺伝子は治療上重要なタンパク質またはペプチド、例えば成長因子、サイトカイン、配位子、受容体及び阻害因子、並びにワクチン及び抗体などをエンコードできる。当該遺伝子は商業的に重要な酵素などの工業タンパク質またはペプチド、例えばＨ．グリセア
ＣＢＨ１．１変異体、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１などのセルラーゼをエンコードできる。目的遺伝子は天然遺伝子、変異遺伝子または合成遺伝子である。
【００２４】
本発明の“糸状菌”は真核微生物であり、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ細目の全ての糸状形態を含む（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ（入門菌類学），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙを参照）。これらの真菌はキチン、セルロース及びその他の複合多糖からなる細胞壁を有する栄養菌糸を特徴とする。本発明の糸状菌は形態学的、生理学的、及び遺伝学的に酵母とはっきりと区別される。糸状菌による栄養増殖は菌糸伸長によるものであり、炭素異化は偏性好気性である。対照的に、Ｓ．セレビシェなどの酵母による栄養増殖は単細胞性葉状体の発芽によるものであり、炭素異化は発酵性である。Ｓ．セレビシェは突出した、非常に安定な複相を有し、一方、複相は、例えばアスペルギルス及びニューロスポーラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）など糸状菌における減数分裂前のごく短期間だけに存在する。Ｓ．セレビシェは１７の染色体を有し、一方、Ａ．ニデュランス及びアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）はそれぞれ８及び７の染色体を有する。最近説明されているＳ．セレビシェと糸状菌間の違いとして、Ｓ．セレビシェはアスペルギルス及びトリコデルマ・イントロンを処理できず、糸状菌の多くの転写制御因子を認識できない（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．他．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，２１−２６）。
【００２５】
核酸の一部に言及して用いる“異種”の語は、当該核酸が、通常は天然で同じ関係では見られない２以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、当該核酸は通常、遺伝子組換えにより生成し、例えば新しい機能的核酸を作るために配置した関連性のない遺伝子から２以上の配列を有し、例えば、１の供給源からプロモーターを有し、他の供給源からコード領域を有する。同様に、異種タンパク質は天然ではお互いに同じ関係で見られない２以上のサブ配列をいうことが多い（例えば、融合タンパク質）。
【００２６】
ここで用いる“単離”または“精製”の語は、天然に結合する少なくとも１の成分から除去された核酸またはアミノ酸をいう。
【００２７】
本文において、“実質的に純粋なポリペプチド”の語は、天然に関係するその他のポリペプチド物質を最大１０重量％含むポリペプチド調製物をいう（その他のポリペプチド物質の割合はより低いほうが好ましく、例えば、最大８重量％、最大６重量％、最大５重量％、最大４重量％、最大３重量％、最大２重量％、最大１重量％、及び最大１／２重量％である）。従って、実質的に純粋なポリペプチドは少なくとも９２％純粋であることが好ましく、すなわち、当該ポリペプチドは調製物中に存在する全ポリペプチド物質が少なくとも９２重量％であり、より割合が高いほうが好ましく、例えば少なくとも９４％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９６％純粋、少なくとも９７％純粋、少なくとも９８％純粋、少なくとも９９％純粋及び最大９９．５％純粋である。ここに開示するポリペプチドは好ましくは実質的に純粋な形態である。特に、ここに開示するポリペプチドは“本質的に純粋形態”であることが好ましく、すなわち、当該ポリペプチド調製物は天然に関係するその他のポリペプチド物質を本質的に含まない。このことは、例えば公知の組換え方法により当該ポリペプチドを調製することにより達成できる。従って、“実質的に純粋なポリペプチド”の語は“単離ポリペプチド”及び“単離形態のポリペプチド”の語と同義である。
【００２８】
通常、Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１をエンコードする核酸分子は中から高ストリンジェンシー条件下で、ここに配列番号１として提供する配列（変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１）にハイブリダイズする。しかしながら、場合によっては、実質的に異なるコドン使用を有する、ＣＢＨ１−エンコードヌクレオチド配列を有するが、当該ＣＢＨ１−エンコードヌクレオチド配列によりエンコードされるタンパク質は天然タンパク質と同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する。例えば、コード配列は特定の原核または真核発現系中におけるＣＢＨ１発現を促進してより速くするために、宿主が利用する特定コドン頻度に従って修飾できる。例えば、Ｔｅ’ｏ、他（２０００）は糸状菌中での発現のための遺伝子最適化について記載している。
【００２９】
核酸配列は、２つの配列が特異的に中から高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下でお互いにハイブリダイズする場合、対照核酸配列に“選択的にハイブリダイズ”すると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）に基づく。例えば、“最大ストリンジェンシー”は通常、約Ｔｍ−５℃で起こり（プローブのＴｍより５℃低い）；“高ストリンジェンシー”はＴｍより約５−１０℃低く；“中程度”または“中ストリンジェンシー”はプローブのＴｍより約１０−２０℃低く；及び“低ストリンジェンシー”はＴｍより約２０−２５℃低い。機能的に、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションプローブと厳密に同一またはほぼ厳密に同一な配列を同定するために用いることができ、高ストリンジェンシー条件はプローブと約８０％以上の配列同一性を有する配列を同定するために用いる。
【００３０】
中から高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は当業界に公知である（例えば、明示的にここに引用するＳａｍｂｒｏｏｋ、他、１９８９、第９章及び１１章、及びＡｕｓｕｂｅｌ、他、１９９３を参照）。高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％ ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中、約４２℃でのハイブリダイゼーション、及び続いて２Ｘ ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳ中、室温で２回洗浄及びさらに０．１Ｘ ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳ、４２℃で２回洗浄を含む。
【００３１】
“％相同性”の語は、ここで“％同一性”の語と交換可能に用いられ、配列配置プログラムを用いて配置した場合の、Ｈ．グリセア ＣＢＨ１．１変異体、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ
ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１アミノ酸配列をエンコードする核酸配列間の核酸またはアミノ酸配列同一性レベルをいう。
【００３２】
例えば、ここで用いる、８０％相同性とは明確なアルゴリズムにより測定された８０％配列同一性と同じ意味を有し、従って、所定の配列の相同体が所定の配列長さにわたって８０％より大きい配列同一性を有する。配列同一性レベルの例としては、限定されないが、所定の配列、例えばここに記載のＨ．グリセアＣＢＨ１．１変異体、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１のコード配列に対して８０、８５、９０、９５、９８％以上の配列同一性を含む。
【００３３】
２つの配列間の同一性を測定するために使用できるコンピュータープログラムの例は、限定されないが、ＢＬＡＳＴプログラム一式、例えばＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ及びＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ及びＴＢＬＡＳＴＮが挙げられ、インターネット上で一般に利用可能である（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。また、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、他、１９９０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、他、１９９７を参照されたい。
【００３４】
配列サーチは所定の核酸配列をジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＤＮＡ配列及びその他の公のデータベース中の核酸配列と比較して評価する場合、通常、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行う。ＢＬＡＳＴＸプログラムはジェンバンクタンパク質配列及びその他の公のデータベース中のアミノ酸配列に対する全てのリーディングフレームにおいて翻訳された核酸配列のサーチに好ましい。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸは共に、オープンギャップペナルティが１１．０及び伸長ギャップペナルティが１．０の初期設定パラメーターを用いて行い、ＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックスを利用する（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、他、１９９７を参照）。
【００３５】
２つ以上の配列間の“％同一性”を測定するための選択配列の好ましい配置は例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒバージョン６．５のＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムで動作し、オープンギャップペナルティ１０．０、伸長ギャップペナルティ０．１及びＢＬＯＳＵＭ３０類似マトリックスなどの初期パラメーターを用いて操作する。
【００３６】
ここで用いる細胞に関する“形質転換”、“安定に形質転換された”または“トランスジェニック”の語は、細胞が、ゲノム内に統合された、または複数の世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして非天然（異種）核酸配列を有することを意味する。ここで用いる“発現”の語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成されるプロセスをいう。当該プロセスは転写及び翻訳の両方を含む。
【００３７】
細胞への核酸配列の挿入に関する“導入”の語は“トランスフェクション”または“形質転換”または“形質導入”を意味し、原核または真核細胞内への核酸配列の組込みに関する場合を含み、ここで核酸配列は細胞のゲノム内（例えば、染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれることができ、自己レプリコンに変換され、または一時的に発現される（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。
【００３８】
“ＣＢＨ１．１発現”の語は変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼ遺伝子の転写及び翻訳、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後処理ポリペプチドの生成物ということになる。例として、ＣＢＨ１．１発現の分析は、ＣＢＨ１．１タンパク質のウエスタンブロット、ＣＢＨ１ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析、及びＳｈｏｅｍａｋｅｒ Ｓ．Ｐ．及びＢｒｏｗｎ Ｒ．Ｄ．Ｊｒ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９７８，５２３：１３３−１４６）及びＳｃｈｕｌｅｉｎ（１９８８）に記載のエンドグルカナーゼ活性分析を含む。同様に、ここで用いる“ＣＢＨ１発現”はＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ遺伝子の転写及び翻訳、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後処理ポリペプチドの生成物をいう。
【００３９】
ここで用いる“界面活性剤”の語は、表面活性特性を有するものとして当業界で通常認識されている任意の化合物をいう。従って、例えば、界面活性剤は陰イオン性、陽イオン性及び非イオン性界面活性剤を含み、例えば洗剤において通常見られるものである。陰イオン性界面活性剤は、直鎖または分岐鎖アルキルベンゼンスルフォネート；直鎖または分岐鎖アルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまたはアルケニル硫酸塩；オレフィンスルフォネート；及びアルカンスルフォネートが挙げられる。両性界面活性剤は第４級アンモニウム塩スルフォネート及びベタイン型両性界面活性剤が挙げられる。当該両性界面活性剤は同じ分子内に正及び負電荷の両方の基を有する。非イオン性界面活性剤はポリオキシアルキレンエーテル及び高脂肪酸アルカノールアミドまたはその酸化アルキレン付加、脂肪酸グリセリンモノエステル等を含むことができる。
【００４０】
ここで用いる“セルロース含有繊維”の語は、セルロースを含有する綿または非綿、またはセルロースブレンド、例えば天然セルロース誘導体及び人工セルロース誘導体（例えば、ジュート（黄麻）、亜麻布、ラミー、レーヨン及びリヨセル）を含有する綿または非綿から作られた任意の織布または不織布、糸または繊維をいう。
【００４１】
ここで用いる、“綿含有繊維”の語は、純粋な綿または綿ブレンドから作られた織布または不織布、糸または繊維をいい、綿織物、綿ニット、綿デニム、綿糸、原綿等を含む。
【００４２】
ここで用いる、“ストーンウォッシュ組成物”の語は、セルロース含有繊維をストーンウォッシュする際に用いる製剤をいう。ストーンウォッシュ組成物は販売前、すなわち製造プロセス時にセルロース含有繊維を修正するために用いる。これに対し、洗剤組成物は汚れた衣類の洗浄を目的とするものであり、製造プロセス時には用いられない。
【００４３】
ここで用いる“洗剤組成物”の語は汚れたセルロース含有繊維を洗濯するための洗浄手段で用いることを意図した混合物をいう。本発明において、当該組成物はセルラーゼ及び界面活性剤に加えて、さらに加水分解酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、青味剤及び蛍光色素、ケーキング防止剤、マスキング剤、セルラーゼ活性化剤、酸化防止剤及び可溶化剤を含むことができる。
【００４４】
ここで用いる“ｃｂｈ１．１遺伝子発現の減少または除去”とは、ｃｂｈ１．１遺伝子がゲノムから欠失され、従って組換え宿主微生物により発現できないこと；またはｃｂｈ１．１遺伝子が修飾され、機能的ＣＢＨ１．１酵素が宿主微生物により生成されないことを意味する。
【００４５】
“変異ｃｂｈ１．１遺伝子”または“変異ＣＢＨ１．１”の語はそれぞれ、Ｈ．グリセア由来ｃｂｈ１．１遺伝子の核酸配列がコード配列を除去、付加及び／または操作することにより変異されたこと、または発現タンパク質のアミノ酸配列がここに記載の発明に一致するように修飾されたことを意味する。
【００４６】
“変異体ｃｂｈ１遺伝子”または“変異体ＣＢＨ１” の語はそれぞれ、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来ｃｂｈ１遺伝子の核酸配列がコード配列を除去、付加及び／または操作することにより変異されたこと、または発現タンパク質のアミノ酸配列がここに記載の発明に一致するように修飾されたことを意味する。
【００４７】
ここで用いる“活性”及び“生物活性”の語は、特定タンパク質に関する生物活性をいい、ここで交換可能に用いられる。例えばプロテアーゼに関する酵素活性はタンパク質分解性であり、従って、プロテアーゼはタンパク質分解活性を有する。従って、所定タンパク質の生物活性は通常、当業者とって当該タンパク質に起因する任意の生物活性をいうことになる。
【００４８】
酵素溶液中で用いる場合、相同体または変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１成分は通常、バイオマスからの可溶性糖の放出速度を最高にするために十分な量で加える。加える相同体または変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１成分の量は、糖化されるバイオマスの種類に依存し、当業者により容易に測定できる。しかしながら、使用時の、セルラーゼ組成物中に存在するＥＧ型成分と比較した、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１成分の重量％は、好ましくは約１、好ましくは約５、好ましくは約１０、好ましくは約１５、または好ましくは約２０重量％〜好ましくは約２５、好ましくは約３０、好ましくは約３５、好ましくは約４０、好ましくは約４５、または好ましくは約５０重量％である。さらに、好ましい範囲は約０．５〜約１５重量％、約０．５〜約２０重量％、約１〜約１０重量％、約１〜約１５重量％、約１〜約２０重量％、約１〜約２５重量％、約５〜約２０重量％、約５〜約２５重量％、約５〜約３０重量％、約５〜約３５重量％、約５〜約４０重量％、約５〜約４５重量％、約５〜約５０重量％、約１０〜約２０重量％、約１０〜約２５重量％、約１０〜約３０重量％、約１０〜約３５重量％、約１０〜約４０重量％、約１０〜約４５重量％、約１０〜約５０重量％、約１５〜約２０重量％、約１５〜約２５重量％、約１５〜約３０重量％、約１５〜約３５重量％、約１５〜約４０重量％、約１５〜約４５重量％、約１５〜約５０重量％である。
ＩＩ．宿主微生物
【００４９】
糸状菌は、細目の真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の全ての線状体を含む。糸状菌はキチン、グルカン、キトサン、マンナン及びその他の複合多糖類からなる細胞壁を有する栄養菌糸、及び菌糸伸長による栄養成長並びに偏性好気性の炭素異化を特徴とする。
【００５０】
本発明において、糸状菌親細胞は限定されないが、トリコデルマ、例えばトリコデルマ・ロンギブラチアタム、トリコデルマ・ビリディ、トリコデルマ・コニンギ、トリコデルマ・ハルジアナム；ペニシリン種；フミコーラ・インソレンス及びフミコーラｇｒｉｓｅａなどのフミコーラ種；Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅなどのクリソスポリウム種；グリオクラディウム種；アスペルギルス種；フサリウム種、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、ヒポクレア種及びエメリセラ種の一連の細胞である。ここで用いる“トリコデルマ”または“トリコデルマ種”の語は、既にトリコデルマとして分類されている、または最近トリコデルマとして分類された任意の真菌株をいう。
【００５１】
１の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞はアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ａｃｕｌｅａｔｕｓまたはアスペルギルス・ニデュランス細胞である。
他の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞はトリコデルマ・リーゼイ細胞である。
ＩＩＩ．セルラーゼ
【００５２】
セルラーゼはセルロース（β−１，４−グルカンまたはβ−Ｄ−グルコシド結合）を加水分解してグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖などを生じる酵素として当業界に公知である。上述の通り、セルラーゼは従来から３つの主な分類に分けられる：エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）（“ＥＧ”）、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）（“ＣＢＨ”）及びβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）（“ＢＧ”）（Ｋｎｏｗｌｅｓ、他、１９８７；Ｓｃｈｕｌｅｉｎ、１９８８）。
【００５３】
特定の真菌は、エキソセロビオヒドロラーゼまたはＣＢＨ型セルラーゼ、エンドグルカナーゼまたはＥＧ型セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼまたはＢＧ型セルラーゼを含む完全なセルラーゼ系を生じる（Ｓｃｈｕｌｅｉｎ、１９８８）。しかしながら、これらの系はＣＢＨ型セルラーゼを欠く場合があり、また、細菌性セルラーゼは通常ＣＢＨ型セルラーゼを含まないか、またはほとんど含まない。さらに、ＥＧ成分及びＣＢＨ成分は相乗的に相互作用してより効果的にセルロースを分解することが示されている。例えば、Ｗｏｏｄ、１９８５を参照されたい。異なる成分、すなわち、複数成分または完全なセルラーゼ系中の種々のエンドグルカナーゼ及びエキソセロビオヒドロラーゼは通常、等電点、分子量、糖化度、基質特異性及び酵素作用パターンなど異なる性質を有する。
【００５４】
また、セルラーゼ組成物は綿含有織物を分解し、織物の強度を損なうことも示されており（米国特許第４，８２２，５１６号）、市販の洗剤用途にセルラーゼ組成物が用いにくい原因となっている。エンドグルカナーゼ成分を含むセルラーゼ組成物は完全なセルラーゼ系を含む組成物と比較して、綿含有織物の損失強度の減少を示すことが示唆されている。
【００５５】
また、セルラーゼはセルロースバイオマスからエタノールへの分解（ここでセルラーゼはセルロースをグルコースに分解し、酵母またはその他の微生物がさらにグルコースを発酵してエタノールになる）、機械パルプの処理（Ｐｅｒｅ、他、１９９６）、飼料添加物としての使用（ＷＯ９１／０４６７３）及び穀物湿式粉砕に有用であることが示されている。
【００５６】
ほとんどのＣＢＨ及びＥＧは、リンカーペプチドによりセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）から分離したコアドメインからなるマルチドメイン構造を有する（Ｓｕｕｒｎａｋｋｉ、他、２０００）。コアドメインは活性部位を含むのに対し、ＣＢＤは酵素をセルロースに結合させることによりセルロースと相互作用する（ｖａｎ Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ、他、１９８６；Ｔｏｍｍｅ、他、１９８８）。ＣＢＤは結晶セルロースの加水分解において特に重要である。結晶セルロースを分解するセロビオヒドロラーゼの能力はＣＢＤが不存在の場合には明確に減少することが示されている（Ｌｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｔｅｅｒｉ、１９９７）。しかしながら、ＣＢＤの正確な役割及び活性メカニズムは依然として推論のままである。ＣＢＤはセルロースの表面で効果的な酵素濃度を単に増加させることによって（Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ、他、１９９１）、及び／またはセルロース表面からセルロース一本鎖を解くことにより（Ｔｏｒｍｏ、他、１９９６）、酵素活性を高めることが示唆されている。異なる基質上のセルラーゼドメインの効果に関する研究の大部分はセロビオヒドロラーゼのコアタンパク質を用いて行われており、それらのコアタンパク質はパパインを用いた限定タンパク質分解により容易に生成できる（Ｔｏｍｍｅ、他、１９８８）。多数のセルラーゼが科学文献に記載されており、例として：トリコデルマ・リーゼイ由来：Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓ、他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：６９１−６９６、１９８３（ＣＢＨＩについて記載）；Ｔｅｅｒｉ，Ｔ．他、Ｇｅｎｅ，５１：４３−５２、１９８７（ＣＢＨＩＩについて記載）が挙げられる。トリコデルマ以外の種由来のセルラーゼも例えば以下の文献に記載されている：Ｏｏｉ、他、１９９０（アスペルギルス・ａｃｕｌｅａｔｕｓにより生成されるエンドグルカナーゼＦ１−ＣＭＣをコードするｃＤＮＡ配列を記載）；Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｔ，他、１９９６（アスペルギルス・ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来β−グルコシダーゼ１をエンコードするｃＤＮＡのクローニング及びシーケンシングを開示）；Ｓａｋａｍｏｔｏ、他、１９９５（アスペルギルス・カワチＩＦＯ４３０８由来エンドグルカナーゼＣＭＣアーゼ１をエンコードするｃＤＮＡ配列を開示）；Ｓａａｒｉｌａｈｔｉ、他、１９９０（エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖａｒａ）由来エンドグルカナーゼを開示）；Ｓｐｉｌｌｉａｅｒｔ Ｒ．ｅｔ ａｌ．、１９９４（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ由来好熱性βグルカナーゼをコードする、ｂｇｌＡのクローニング及びシーケンシングを開示）；及びＨａｌｌｄｏｒｓｄｏｔｔｉｒ Ｓ、他、１９９８（グリコシル加水分解酵素群１２の熱安定性セルラーゼをエンコードするＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ遺伝子のクローニング、シーケンシング及び過剰発現を開示）。しかしながら、熱応力条件下、または界面活性剤の存在下での改善された特性、増加した特異活性、変異した基質開裂パターン、及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの高レベル発現など、改善された特性を有する新規なセルラーゼの同定及びキャラクタリゼーションの必要性が依然として存在する。
【００５７】
様々な量のＣＢＨ型セルラーゼを含む新規で改善されたセルラーゼ組成物の開発は以下の用途に注目されている：（１）洗浄能力の向上、柔軟剤としての機能及び／または綿織物の手触りの改善を示す洗剤組成物（例えば、“ストーンウォッシング”または“バイオポリッシング”）での使用；（２）木材パルプまたはその他のバイオマスを糖に分解する組成物での使用（例えば、バイオ−エタノール生成）；及び／または（３）飼料組成物での使用。
ＩＶ．分子生物学
【００５８】
１の実施態様において、本発明は糸状菌において機能的なプロモーターの制御下、変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１セルラーゼ遺伝子の発現を提供する。従って、本発明は組換え遺伝学の分野における一般的な技術に依拠する。本発明で使用する一般的な方法を開示する基本テキストは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（遺伝子導入及び発現）：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及びＡｕｓｕｂｅｌ、他、編集。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）が挙げられる。
Ａ．変異体ＣＢＨ１．１遺伝子の同定方法
【００５９】
２つの公に入手可能なＨ．グリセアＣＢＨ１．１核酸配列を図５に示す。１の側面において、本発明はここに記載の変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１をエンコードする核酸分子を包含する。核酸はＤＮＡ分子であってもよい。
【００６０】
変異体ＣＢＨ１．１−エンコードＤＮＡ配列を単離するために用いることができる技術は当業者に公知であり、限定されないが、相同ＤＮＡプローブを用いるｃＤＮＡ及び／またはゲノムライブラリースクリーニング及び活性分析またはＣＢＨ１に対する抗体を用いる発現スクリーニングを含む。これらのいずれの方法もＳａｍｂｒｏｏｋ、他、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ、他、編集、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）（“Ａｕｓｕｂｅｌ”）で見ることができる。
Ｂ．核酸構築体／発現ベクター
【００６１】
変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１セルラーゼをエンコードする天然または合成ポリヌクレオチド断片（“変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１セルラーゼ−エンコード核酸配列”）は異種核酸構築体またはベクター内に組込むことができ、糸状菌または酵母細菌内に導入でき、かつ複製できる。ここに開示するベクター及び方法は変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼを発現するための宿主細胞中で使用するのに適している。導入される細胞内で複製可能かつ生存可能である限り、任意のベクターが使用できる。多数の適当なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、市販されている。また、クローニング及び発現ベクターについてもここに明示的に引用するＳａｍｂｒｏｏｋ、他、１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ、他、１９８９及びＳｔｒａｔｈｅｒｎ、他、１９８１に記載されている。真菌に適切な発現ベクターはｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）：Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．及びＬａｓｕｒｅ，Ｌ．Ｌ．（編集）Ｍｏｒｅ
Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第３９６〜４２８頁に記載されている。適当なＤＮＡ配列が種々の手順によりプラスミドまたはベクター（集合的にここで“ベクター”という）内に挿入できる。通常、ＤＮＡ配列は標準手順により、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。このような手順及び関連サブクローニング手順は当業者の知識の範囲内であると考えられる。
【００６２】
変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼのコード配列を含む組換え糸状菌は、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ−コード配列を含む異種核酸構築体を糸状菌の選択株細胞内に導入することにより生成できる。
【００６３】
所望の形態の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ核酸配列が得られると、それを種々の方法で修飾することができる。当該配列が非コードフランキング領域を含む場合、当該フランキング領域は切除、突然変異等に供することができる。従って、転移、塩基転換、欠失及び挿入を天然配列上で行うことができる。
【００６４】
選択した変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ−コード配列は公知の組換え技術に従って適切なベクター内に挿入でき、セルラーゼ発現が可能な糸状菌を形質転換するために用いることができる。遺伝コードの固有縮退のため、実質的に同じまたは機能的に同等なアミノ酸配列をエンコードするその他の核酸配列が変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ
ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをクローン及び発現するために用いることができる。そのため、コード領域内の当該置換は、本発明によりカバーされる配列変異体の範囲内に当然含まれる。
【００６５】
また、本発明は上述の１以上の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ−エンコード核酸配列を含む組換え核酸構築体を含むこともできる。当該構築体はプラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを含み、そこに本発明の配列がフォワードまたはリバース方向に挿入される。
【００６６】
異種核酸構築体は変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼのコード配列を含むことができ、それらは（ｉ）単離して（ｉｉ）融合タンパク質またはシグナルペプチドコード配列などの他のコード配列と組み合わせて（ここで所望のセルラーゼ−コード配列は優性コード配列）；（ｉｉｉ）イントロンなどの非コード配列、及び適当な宿主中でコード配列の発現に効果的な、プロモーター及びターミネーター因子または５’及び／または３’非翻訳領域など制御因子と組み合わせて；及び／または（ｉｖ）変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ−コード配列が異種遺伝子となるベクターまたは宿主環境において、含むことができる。
【００６７】
本発明の１の側面において、異種核酸構築体はｉｎ ｖｉｔｒｏで変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ−エンコード核酸配列を細胞内に移動させるために用いられ、確立された糸状菌及び酵母株が好ましい。変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼの長期間生成のために、安定な発現が好ましい。従って、安定な形質転換を生じるために効果的な任意の方法が本発明の実施に用いることができる。
【００６８】
適当なベクターは通常、選択マーカー−エンコード核酸配列、挿入部位及び適当な制御因子、例えばプロモーター及びターミネーター配列などを備える。当該ベクターは調節配列を含んでもよく、例えば、イントロンなどの非コード配列、及び制御因子、すなわち宿主細胞（及び／または修飾可溶性タンパク質抗原コード配列が通常は発現されないベクターまたは宿主細胞環境）内でコード配列の発現に効果的で、コード配列に動作可能に連結したプロモーター及びターミネーター因子または５’及び／または３’非翻訳領域を含むことができる。多数の適切なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、その多くが市販されており、及び／またはＳａｍｂｒｏｏｋ、他、（上記）に記載されている。典型的なプロモーターは保存プロモーター及び誘導性プロモーターの両方を含み、例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ｔｅｔ−ｏｎまたはｔｅｔ−ｏｆｆシステムにおいてｔｅｔ応答性因子（ＴＲＥ）を含むプロモーター（ＣｌｏｎＴｅｃｈ ａｎｄ ＢＡＳＦ）、β−アクチンプロモーター及び特定の金属塩の添加により非調節にできるメタロチオニンプロモーターが挙げられる。プロモーター配列は発現のために特定の糸状菌により認識されるＤＮＡ配列である。これは変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列に動作可能に連結する。当該連結は開示した発現ベクター中において変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列の開始コドンに関するプロモーターの位置決定を含む。プロモーター配列は、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１ポリペプチドの発現を媒介する転写及び翻訳制御配列を含む。例えば、アスペルギルス・ニガー、Ａ．アワモリまたはＡ．オリゼー・グルコアミラーゼ、α−アミラーゼまたはα−グルコシダーゼエンコード遺伝子；Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡまたはｔｒｐＣ遺伝子；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）ｃｂｈ１またはｔｒｐ１遺伝子；Ａ．ニガーまたはリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ−エンコード遺伝子；Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２またはその他のセルラーゼエンコード遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。
適当な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、種々の宿主の適当なマーカーは当業界に公知である。一般的な選択マーカー遺伝子はＡ．ニデュランスまたはＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来のａｒｇＢ、Ａ．ニデュランス由来のａｍｄＳ、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）またはＨ．ｊｏｃｏｒｉｎａ由来のｐｙｒ４、アスペルギルス・ニガーまたはＡ．ニデュランス由来のｐｙｒＧを含む。他の典型的な選択マーカーは、限定されないが、ｔｒｐｃ、ｔｒｐ１、ｏｌｉＣ３１、ｎｉａＤまたはｌｅｕ２が挙げられ、これらはｔｒｐ−、ｐｙｒ−、ｌｅｕ−等などの変異株を形質転換するために用いる異種核酸構築体に含まれる。
【００６９】
当該選択マーカーは形質転換体に、通常は糸状菌により代謝されない代謝産物を利用できる能力を与える。例えば、アセトアミダーゼ酵素をエンコードするＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来のａｍｄＳ遺伝子は、形質転換細胞が窒素源としてアセトアミド上で成長できるようにする。選択マーカー（例えば、ｐｙｒＧ）は栄養要求性変異株が選択最小培地上で成長する能力を回復させることができ、または選択マーカー（例えば、ｏｌｉｃ３１）は形質転換体に阻害薬または抗生物質の存在下で成長できる能力を与えることができる。
【００７０】
選択マーカーコード配列は当業界で用いられる一般的な方法を用いて適切なプラスミド内にクローンされる。典型的なプラスミドはｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＲＡＸ及びｐＵＣ１００が挙げられる。ｐＲＡＸプラスミドはＡ．ニデュランス由来のＡＭＡ１配列を含み、Ａ．ニガー中での複製を可能にする。
【００７１】
本発明の実施には他に指示がない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来技術を用い、当業者の技術の範囲内である。当該技術は文献中に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、他、１９８９；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７；Ａｕｓｕｂｅｌ、他、１９９３；及びＣｏｌｉｇａｎ、他、１９９１を参照されたい。ここで言及する全ての特許、特許出願、雑誌及び文献はここに明示的に引用される。
Ｃ．宿主細胞の形質転換方法
【００７２】
本発明において、糸状菌親細胞は、限定されないが、トリコデルマ、例えばトリコデルマ・ロンギブラチアタム（ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）（ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリディ、トリコデルマ・コニンギ、トリコデルマ・ハルジアナム；ペニシリン種；フミコーラ・インソレンスなどのフミコーラ種；Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅなどのクリソスポリウム種；グリオクラディウム種；アスペルギルス種；フサリウム種、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、ヒポクレア種及びエメリセラ種の細胞である。ここで用いる“トリコデルマ”または“トリコデルマ種”の語は、既にトリコデルマとして分類されている、または最近トリコデルマとして分類された任意の真菌株をいう。
【００７３】
変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１発現のために処理及び／または修飾できる親細胞株の例として、限定されないが、糸状菌細胞を含む。本発明の実施に用いる適当な主要な細胞種の例として、限定されないが、アスペルギルス及びトリコデルマが挙げられる。
【００７４】
１の実施態様において、糸状菌親細胞はアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ａｃｕｌｅａｔｕｓまたはアスペルギルス・ニデュランス細胞である。
【００７５】
第２の実施態様において、糸状菌親細胞はヒポクレア・ｊｅｃｏｒｉｎａ細胞である。この細胞はＴ．リーゼイとして前述した。
【００７６】
ＣＢＨ１．１変異体、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１をエンコードするＤＮＡ配列をＤＮＡ構築体内にクローンした後、当該ＤＮＡは微生物を形質転換するために用いる。変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１を本発明に従って発現する目的で形質転換される微生物はトリコデルマ種由来の株を含むことが有利である。従って、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼを本発明に従って調製する好ましい方法は、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１の一部または全部をエンコードするＤＮＡ断片を少なくとも含むＤＮＡ構築体を用いてトリコデルマ種宿主細胞を形質転換することを含む。当該ＤＮＡ構築体は通常、機能的に、すなわち動作可能にプロモーターに結合する。当該形質転換宿主細胞はそれから変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１を発現する条件下で成長させる。続いて、変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１を単離できる。実質的に純粋な形態で変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１を得ることが望ましい。同様に、本質的に純粋な形態で変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１を得ることが望ましい。
【００７７】
しかしながら、実際に、変異ＣＢＨ１．１をエンコードする所定ＤＮＡの最良の発現媒体がＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ（すなわち、Ｔ．リーゼイ）ではない場合も考えられる。従って、変異体ＣＢＨ１．１の微生物源と系統発生類似性を有する形質転換宿主で当該タンパク質を発現することが最も有利かもしれない。他の実施態様において、アスペルギルス・ニガーを発現媒体として用いることができる。Ａ．ニガーを用いる形質転換技術の記載に関しては、ここに開示の内容を引用するＷＯ９８／３１８２１を参照されたい。
【００７８】
従って、トリコデルマ種発現系の本発明の記載は説明目的のみのため提供するものであり、本発明の変異体ＣＢＨ１．１を発現する１の選択肢として提供するものである。しかしながら、当業者は適切な場合に種々の宿主細胞中で変異体ＣＢＨ１．１をエンコードするＤＮＡを発現させるものであると考えられ、最適な発現宿主を決定する際に変異体ＣＢＨ１．１の供給源を考慮すべきであることは当然である。さらに、本発明の分野の当業者は、当業界で利用可能な手段を利用して一般的な技術により特定遺伝子のために最良な発現系を選択することができる。
Ｄ．変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１の発現方法
【００７９】
本発明の方法は変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼを発現するために使用する細胞に依拠し、特定の発現方法を必要とするものではない。
【００８０】
本発明は、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いて変換、形質転換または核酸導入される宿主細胞を提供する。温度、ｐＨ等の培養条件は変換、形質転換または核酸導入前に親宿主細胞に既に用いた条件であり、当業者に明らかである。
【００８１】
１の手段において、糸状菌細胞または酵母細胞に、宿主細胞株で機能し、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ
ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードするＤＮＡ断片に動作可能に連結する、プロモーターまたは生物学的に活性なプロモーター断片または１以上の（例えば、一連の）エンハンサーを有する発現ベクターを用いて核酸導入し、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼが細胞株内で発現する。
【００８２】
従って、本発明は、対応する非形質転換親真菌と比較して変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ生成または発現を生じるために効果的な方法で修飾、選択及び培養された細胞を含む糸状菌を提供する。
【００８３】
所望のセルラーゼ発現のために処理及び／または修飾できる親糸状菌の種の例としては、限定されないが、トリコデルマ、ペニシリン種、フミコーラ種、例えばフミコーラ・インソレンス；アスペルギルス種、例えばアスペルギルス・ニガー、クリソスポリウム種、フサリウム種、ヒポクレア種及びエメリセラ種が挙げられる。
【００８４】
変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼを発現する細胞は通常、親真菌株を培養するために用いる条件下で培養する。一般的に、細胞はＰｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、編集、Ａｕｂｅｒｔ，Ｊ．Ｐ．他、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、第７７〜８６頁、１９８８及びＩｌｍｅｎ，Ｍ．他、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８−１３０６、１９９７に記載されるような生理食塩及び栄養物を含む標準培地内で培養する。また、培養条件も標準であり、例えば培養物は２８℃、振とう培養または発酵槽中で、所望レベルの変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼ発現が達成されるまで培養する。
【００８５】
所定の糸状菌の好ましい培養条件は科学文献及び／またはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；<www.atcc.org>）などの真菌源から見つけることができる。真菌成長の達成後、当該細胞は変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼの発現を生じるまたは可能にするために効果的な条件に曝す。
【００８６】
変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ−コード配列が誘導プロモーターの制御下にある場合、例えば糖、金属塩または抗生物質などの誘発剤を変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ発現を誘導するために有効な濃度で培地に加える。
【００８７】
１の実施態様において、株はアスペルギルス・ニガーを含み、当該株は過剰発現タンパク質を得るために有用な株である。例えば、Ａ．ニガー ｖａｒ アワモリ ｄｇｒ２４６は高められた量の分泌セルラーゼを分泌することが公知である（Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ、他、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ（２００２）４１：８９−９８）。ＧＣＤＡＰ３、ＧＣＤＡＰ４及びＧＡＰ３−４などのアスペルギルス・ニガー ｖａｒ アワモリのその他の株は公知である（Ｗａｒｄ，Ｍ，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．及びＫｏｄａｍａ，Ｋ．Ｈ．，１９９３，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８−７４３）。
【００８８】
他の実施態様において、株はトリコデルマ・リーゼイを含み、当該株は過剰発現タンパク質を得るために有用な株である。例えば、ＲＬ−Ｐ３７はＳｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ、他、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６−５３（１９８４）に記載されており、高められた量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られる。ＲＬ−Ｐ３７の機能的同等物としては、トリコデルマ・リーゼイ株ＲＵＴ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ番号５６７６５）及び株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ番号２６９２１）を含む。これらの株は変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１を過剰発現するのにも有用である。
【００８９】
潜在的に有害な天然セルロース分解活性がない所望のセルラーゼを得ることが望ましい場合、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ構築体またはプラスミドの導入前に、１以上の欠失したセルラーゼ遺伝子を持った宿主細胞株を得ることは有用である。このような株は、ここに開示の内容を引用する米国特許第５，２４６，８５３号及びＷＯ９２／０６２０９に開示の方法により調製できる。１以上のセルラーゼ遺伝子が欠落した宿主微生物中で変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼを発現することにより、同定及び次の精製手順が簡略化される。クローンしたトリコデルマ種由来のいかなる遺伝子も欠失することができ、例えば、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１及びｅｇｌ２遺伝子並びに変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１タンパク質をエンコードする遺伝子である（例えば、それぞれ米国特許第５，４７５，１０１号及びＷＯ９４／２８１１７を参照）。
【００９０】
遺伝子欠失は欠失または分離される所望の遺伝子形態を当業界に公知の方法によりプラスミド内に挿入することにより達成できる。次に、欠失プラスミドは所望の遺伝子コード領域及び遺伝子コード配列または選択マーカーで置換された当該配列の一部の内部にある適当な制限酵素部位で切断される。欠失または分離される遺伝子座由来のフランキングＤＮＡ配列は、好ましくは約０．５〜２．０ｋｂであり、両側の選択マーカー遺伝子を保持する。適当な欠失プラスミドは一般に、固有の制限酵素部位を有し、当該断片が欠失遺伝子を含み、フランキングＤＮＡ配列を含むことを可能にし、選択マーカー遺伝子が一本の線状片として除去される。
【００９１】
選択マーカーは形質転換微生物の検出が可能となるように選択しなければならない。選択した微生物中で発現する選択マーカー遺伝子は適している。例えば、アスペルギルス種を用いて選択マーカーを選択すると、形質転換体中の選択マーカーの存在はその特性に大きな影響を与えない。このような選択マーカーは分析可能な生成物をエンコードする遺伝子であると考えられる。例えば、アスペルギルス種遺伝子の機能的コピーは、宿主株中の欠失により栄養要求性表現型を示す宿主株を生じる場合、使用できる。
【００９２】
１の実施態様において、アスペルギルス種のｐｙｒＧ−誘導体株は機能的ｐｙｒＧ遺伝子を用いて形質転換し、従って、形質転換のための選択マーカーを提供する。ｐｙｒＧ−誘導体株はフルオロオロト酸（ＦＯＡ）に耐性のアスペルギルス種株を選択することにより得ることができる。ｐｙｒＧ遺伝子は、ウリジンの生合成に必要な酵素である、オロチジン−５’−モノリン酸デカルボキシラーゼをエンコードする。原型のｐｙｒＧ遺伝子を含む株はウリジン不足の培地中で成長するが、フルオロオロト酸に感受性である。機能的オロチジンモノリン酸デカルボキシラーゼ酵素を欠いており、ＦＯＲ耐性選択により成長のためにウリジンを必要とするｐｙｒＧ−誘導体株の選択が可能である。ＦＯＡ選択技術を用いて、機能的オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼが不足したウリジン要求性株を得ることも可能である。これらの細胞をこの酵素をエンコードする遺伝子の機能的コピーを用いて形質転換することが可能である（Ｂｅｒｇｅｓ＆Ｂａｒｒｅａｕ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３５９−３６５（１９９１）、及びｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔｅ、他（１９８６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｙｒＧ ｇｅｎｅ（ｐｙｒＧ遺伝子に基づくアスペルギルス・ニガーの相同形質転換系の進展）．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６：７１−７５）。誘導体株の選択は、上述のＦＯＡ耐性技術を用いて容易に行われ、従って、ｐｙｒＧ遺伝子は選択マーカーとして用いるのが好ましい。他の実施態様において、トリコデルマ種のｐｙｒ４−誘導体株を機能的ｐｙｒ４遺伝子を用いて形質転換し、それにより形質転換に用いる選択マーカーが提供される。以下はアスペルギルス系について論じるが、トリコデルマ及びその他の真菌系のため類似の手順が当業者により適切に用いられることができる。
【００９３】
１以上のセルラーゼ遺伝子の発現能力が欠落するようにｐｙｒＧ−アルペルギルス種を形質転換するために、分離または欠失したセルラーゼ遺伝子を含む一本鎖ＤＮＡ断片をそれから欠失プラスミドから単離し、適当なｐｙｒ−アスペルギルス宿主を形質転換するために用いる。次に、形質転換体はｐｙｒＧ遺伝子生成物を発現するそれらの能力に基づいて同定及び選択され、従って宿主株のウリジン栄養要求性を補う。サザンブロット分析を次に得られた形質転換体について行い、欠失する遺伝子のゲノムコピーのコード領域の一部または全部をｐｙｒ４選択マーカーで置換するダブルクロスオーバー融合イベントを同定及び確認する。
【００９４】
上述の特定プラスミドベクターはｐｙｒ−形質転換体の調製に関連するが、本発明はこれらのベクターに限定されない。種々の遺伝子がアスペルギルス種株内で上述の技術を用いて欠失及び置換できる。さらに、上述の通り、任意の入手可能な選択マーカーが使用できる。実際、クローンされ、そして同定された任意のアスペルギルス種遺伝子が上述の方法を用いてゲノムから欠失できる。
【００９５】
上述の通り、使用する宿主株は、選んだ選択マーカーに対応する非機能的遺伝子を欠く、または有するアスペルギルス種の誘導体である。例えば、ｐｙｒGの選択マーカーを選択した場合、それから形質転換手順において特定のｐｙｒＧ−誘導体株を受容体として用いる。同様に、アスペルギルス・ニデュランス遺伝子ａｍｄＤ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤに同等なアスペルギルス種遺伝子を含む選択マーカーが用いることができる。対応する受容体株は従って、それぞれａｒｇＢ−、ｔｒｐＣ−、ｎｉａＤ−などの誘導体株でなければならない。
【００９６】
変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼをエンコードするＤＮＡは次に、適当な微生物内に挿入するために調製する。本発明に従うと、変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼをエンコードするＤＮＡは機能的セルロース分解活性を有するタンパク質をエンコードするために必要なＤＮＡを含む。変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードするＤＮＡ断片は真菌プロモーター配列、例えばｇｌａＡ遺伝子のプロモーターに機能的に接合できる。
【００９７】
２以上の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードするＤＮＡのコピーが過剰発現を促進するために株内に組換えできることも本発明の範囲内である。変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードするＤＮＡは当該セルラーゼをエンコードするＤＮＡを運ぶ発現ベクターを構築することにより調製できる。変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼをエンコードする挿入ＤＮＡ断片を運ぶ発現ベクターは所定の宿主微生物中で独立して複製できる、または宿主、一般的にはプラスミドのＤＮＡ内に統合できるベクターである。好ましい実施態様において、遺伝子発現が得られる２種の発現ベクターが考えられる。１つは、プロモーター、遺伝子コード領域、及びターミネーター配列の全てが発現する遺伝子由来であるＤＮＡ配列を含む。遺伝子切断は、自身の転写及び翻訳調節配列の制御下で発現されるドメインを残すために、望ましくないＤＮＡ配列（例えば、望ましくないドメインをコードする）を欠失することが望ましい場合に行うことができる。選択マーカーはベクター上に含むこともでき、宿主内に新規な遺伝子配列の複数コピーを統合するための選択が可能になる。
【００９８】
２つ目の発現ベクターはあらかじめ組立てられ、高レベル転写に必要な配列及び選択マーカーを含む。遺伝子またはその一部のコード領域はこの汎用性発現ベクター内に挿入できると考えられ、従って、発現カセットプロモーター及びターミネーター配列の転写制御下にある。例えば、ｐＲＡＸはそのような汎用性発現ベクターである。遺伝子またはその一部は強力なｇｌａＡプロモーターの下流に挿入できる。
【００９９】
ベクター中、本発明の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードするＤＮＡ配列は転写及び翻訳配列、すなわち、リーディングフレームから構造遺伝子中の適当なプロモーター配列及びシグナル配列に動作可能に連結するべきである。プロモーターは宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり、宿主細胞と同種または異種のタンパク質をエンコードする遺伝子由来である。任意のシグナルペプチドは変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼの細胞外生成を提供する。シグナル配列をエンコードするＤＮＡは発現する遺伝子に天然で関連していることが好ましいが、任意の適当な供給源由来のシグナル配列が本発明で使用できる。
【０１００】
本発明の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをコードするＤＮＡ配列とプロモーターを適当なベクター内に融合するために用いる手順は当業界に公知である。
【０１０１】
発現ベクター、ＤＮＡベクターまたは上述の構築体をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞内に運ぶために種々の方法を用いることができる。異種核酸配列を発現するために核酸を細胞内に導入する方法は当業者に公知であり、限定されないが、エレクトロポレーション；核マイクロインジェクションまたは１の細胞内への直接マイクロインジェクション；無傷細胞を用いる細菌原形質融合；ポリカチオンの使用、例えば、ポリブレンまたはポリオルニチン；リポソーム、リポフェクトアミンまたはリポフェクション媒介トランスフェクションを用いる膜融合；ＤＮＡコートマイクロプロジェクタイルを用いる高速照射；リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿を用いる培養；ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション；変異ウイルス核酸を用いる感染；ＤＮＡのアグロバクテリウム媒介移動等が挙げられる。さらに、変異体ＣＢＨ１．１−エンコード核酸配列を含む異種核酸構築体はｉｎ ｖｉｔｒｏで転写でき、得られたＲＮＡを公知の方法、例えばインジェクションにより宿主細胞内に導入できる。
【０１０２】
形質転換のためにアスペルギルス種を調製する本発明の好ましい方法は、真菌の菌糸体由来の原形質体の調製を含む。Ｃａｍｐｂｅｌｌ、他、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ａ．ｎｅｇｅｒ ｕｓｉｎｇ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｎｉａＤ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（硝酸還元酵素の相同体ｎｉａＤ遺伝子を用いたＡ．ニガーの改善された形質転換効率）．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６；１９８９を参照されたい。菌糸体は発芽植物性胞子から得ることができる。菌糸体は細胞壁を消化して原形質体を生じる酵素で処理する。原形質体は次に懸濁培地中、浸透圧安定化剤の存在により保護される。これらの安定化剤はソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含む。通常、これら安定化剤の濃度は０．８Ｍ〜１．２Ｍ間で様々である。懸濁培地中、約１．２Ｍのソルビトール溶液を用いることが好ましい。
【０１０３】
ＤＮＡの宿主アスペルギルス種株内への摂取はカルシウムイオン濃度に依存する。通常、約１０ｍＭのＣａＣｌ２及び５０ｍＭのＣａＣｌ２が摂取溶液内で用いられる。摂取溶液中でカルシウムイオンが必要であることに加え、通常含まれるその他の品目は緩衝系、例えばＴＥバッファ（１０Ｍｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４；１ｍＭ ＥＤＴＡ）または１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ６．０バッファ（モルホリンプロパンスルホン酸）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは細胞膜の融合に作用すると考えられており、従って培地の内容物がアスペルギルス種株の細胞質内に運ばれ、プラスミドＤＮＡが核に移動する。この融合により、宿主染色体内に穏やかに統合されるプラスミドＤＮＡの複数コピーが残ることが多い。
【０１０４】
通常、アスペルギルス種原形質体または細胞を含む、密度１０５〜１０６／ｍＬ、好ましくは２×１０５／ｍＬで浸透圧処理に供した懸濁液を形質転換に使用する。適当な溶液中（例えば、１．２Ｍソルビトール；５０ｍＭ ＣａＣｌ２）の１００μＬの量のこれら原形質体または細胞は所望のＤＮＡと混合する。通常、高濃度のＰＥＧを摂取溶液に加える。０．１〜１の量（ｖｏｌｕｍｅ）の２５％ ＰＥＧ ４０００は原形質体の懸濁液に加えることができる。しかしながら、約０．２５の量（ｖｏｌｕｍｅ）を原形質体の懸濁液に加えることが好ましい。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等の添加剤も摂取溶液に加えてもよく、形質転換を助ける。類似の手順がその他の真菌宿主細胞に用いることができる。例えば、その内容をここに引用する米国特許第６，２６８，３２８号を参照されたい。
【０１０５】
通常、混合物はそれから約０℃で１０〜３０分間培養する。追加のＰＥＧをそれから混合物に加え、所望の遺伝子またはＤＮＡ配列の摂取をさらに高める。２５％ ＰＥＧ ４０００は通常、形質転換混合物の体積の５〜１５倍の体積で加えるが、それより大きい体積または小さい体積も適している。２５％ ＰＥＧ ４０００は好ましくは形質転換混合物の体積の約１０倍である。ＰＥＧを加えた後、形質転換混合物をそれから室温または氷上で、ソルビトール及びＣａＣｌ２溶液を添加する前に培養する。原形質体懸濁液をそれからさらに成長培地の融解アリコートに加える。この成長培地により形質転換だけの成長が可能になる。所望の形質転換の成長に適した任意の成長培地が本発明で使用できる。しかしながら、Ｐｙｒ＋形質転換を選択した場合、ウリジンを含まない成長培地を使用することが好ましい。その結果生じたコロニーをウリジンを使い尽くした成長培地上で移動及び精製する。
【０１０６】
この段階で、速い成長速度及びウリジンが欠落した固体培養基上の不規則な外形よりもむしろ、順調な環状コロニーの形成により安定な形質転換が不安定な形質転換と区別できる。さらに、場合によっては安定性のさらなる試験を、固体非選択性培地（すなわち、ウリジンを含む）上の形質転換体を成長させる、この培養基から胞子を収集し、及び次にウリジンが欠落した選択培地上で発芽及び成長するこれらの胞子のパーセンテージを測定することにより、行うことができる。もしくは、形質転換体を選択するために当業界に公知のその他の方法を用いることができる。
【０１０７】
上記方法の特定の実施態様において、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼは液体培地中で成長後、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼの適当な翻訳後処理の結果として、宿主細胞から活性体で回収される。
Ｅ．ＣＢＨ１核酸コード配列及び／またはタンパク質発現の分析方法
【０１０８】
変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ−エンコード核酸構築体を用いて形質転換した細胞株により変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ発現を評価するために、タンパク質レベル、ＲＮＡレベルで分析を行うことができ、または特にグルコシダーゼ活性及び／または生成に対する機能的バイオアッセイを使用することにより分析を行うことができる。
【０１０９】
ここに記載の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ核酸及びタンパク質配列の１の典型的な用途において、糸状菌、例えばトリコデルマ・リーゼイの遺伝子組換え株は増加した量の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼを生成するように設計できる。このような遺伝子組換え糸状菌はセルロース分解能が大きく増加したセルラーゼ生成物を生成するのに有用である。１の手段においてこれは、適当な宿主、例えばアスペルギルス・ニガーなどの糸状菌内に変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをコードする配列を導入することにより達成される。
【０１１０】
従って、本発明は糸状菌またはその他の適当な宿主の細胞内に変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを導入することにより糸状菌またはその他の適当な宿主内で変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼを発現するための方法を含む。
【０１１１】
他の側面において、本発明は糸状菌またはその他の適当な宿主内での変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ発現を修飾するための方法を含む。当該修飾は内生ＣＢＨの発現の減少または除去を含む。
【０１１２】
通常、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ発現を分析するために用いる分析は、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、または適当な標識プローブ（核酸コード配列に基づく）を用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び従来のサザンブロッティング及びオートラジオグラフィーが挙げられる。
【０１１３】
さらに、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼの生成及び／または発現はサンプル内で直接測定でき、例えばセロビオヒドロラーゼ活性、発現及び／または生成の分析により測定できる。当該分析は例えば、それぞれここに明示的に引用するＢｅｃｋｅｒ，他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２００１）３５６：１９−３０及びＭｉｔｓｕｉｓｈｉ、他、ＦＥＢＳ（１９９０）２７５：１３５−１３８に記載されている。ＣＢＨ１の単離可溶性及び不溶性基質を加水分解する能力はＳｒｉｓｏｄｓｕｋ、他、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９７）５７：４９−５７及びＮｉｄｅｔｚｋｙ及びＣｌａｅｙｓｓｅｎｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９４）４４：９６１−９６６に記載の分析を用いて測定できる。セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼまたはβ−グルコシダーゼ活性を分析するために有用な基質は結晶性セルロース、ろ紙、リン酸膨潤セルロース、セロオリゴ糖、メチルウンベリフェリル・ラクトシド、メチルウンベリフェリル・セロビオシド、オルトニトロフェニル・ラクトシド、パラニトロフェニル・ラクトシド、オルトニトロフェニル・セロビオシド、パラニトロフェニル・セロビオシドが挙げられる。
【０１１４】
さらに、タンパク質発現は、細胞、組織切片の免疫組織化学的染色または組織培養基の免疫学的分析など免疫学的方法、例えばウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより評価できる。当該免疫分析は変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ発現を定性的及び定量的に評価するために用いることができる。当該方法の詳細は当業者に公知であり、当該方法を実施するための多くの試薬が市販されている。
【０１１５】
変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼの精製体は種々の免疫分析に用いるために発現タンパク質に特異なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を生成するために用いることができる（例えば、Ｈｕ、他、１９９１を参照）。典型的な分析はＥＬＩＳＡ、競合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、間接免疫蛍光試験などが挙げられる。通常、市販の抗体及び／またはキットはセロビオヒドロラーゼタンパク質発現レベルの定量免疫分析に用いることができる。
Ｆ．ＣＢＨ１の精製方法
【０１１６】
通常、細胞培養基内で生成した変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質は培養基内に分泌され、例えば細胞培養基から不要な成分を除去することにより精製または単離できる。しかしながら、場合によっては、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質は細胞溶解物から回収が必要な細胞型で生成できる。その場合、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質を細胞から精製し、当業者により通常用いられる技術を用いて生成した。例としては限定されないが、アフィニティクロマトグラフィー（Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ、他、１９８４）、イオン交換クロマトグラフィー法（Ｇｏｙａｌ、他、１９９１；Ｆｌｉｅｓｓ、他、１９８３；Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ、他、１９８４；Ｅｌｌｏｕｚ、他、１９８７）、例えば高い分解力を有する物質を用いたイオン交換（Ｍｅｄｖｅ、他、１９９８）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｔｏｍａｚ ａｎｄ Ｑｕｅｉｒｏｚ、１９９９）及び２相分離（Ｂｒｕｍｂａｕｅｒ、他、１９９９）が挙げられる。
【０１１７】
通常、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質は、特定の結合剤（例えば抗体または受容体）への結合親和性、または選択分子量範囲または等電点範囲を有するなどの選択特性を有するタンパク質を分離するために分画する。
【０１１８】
所定の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質発現が達成されると、生成した変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質を細胞または細胞培養基から精製する。このような精製に適した典型的な手順は以下を含む：抗体親和性カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥなどカチオン交換樹脂によるクロマトグラフィー；クロマト分画；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；及び例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いるゲルろ過。種々のタンパク質精製方法が用いることができ、当該方法は当業者に公知であり、例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，１９９０；Ｓｃｏｐｅｓ，１９８２に記載されている。選択する精製工程は例えば、用いる生成工程の性質及び生成される特定タンパク質に依存する。
Ｖ．ｃｂｈ１及びＣＢＨ１の活用
【０１１９】
当然のことながら、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ核酸、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質及び変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質活性を含む組成物は多種多様な用途で用いることができ、そのいくつかを下記に説明する。
【０１２０】
様々な量で変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼを含む新規で改善されたセルラーゼ組成物は高い洗浄能を示し、柔軟剤として作用し、及び／または綿織物の手触りを改善させる（例えば、“ストーンウォッシング”または“バイオポリッシング”）洗剤組成物、木材パルプを糖に分解する組成物（例えば、バイオ−エタノール生成）及び／または飼料組成物に用いることができる。各タイプのセルラーゼの単離及びキャラクタリゼーションにより当該組成物の特徴を制御する能力が提供される。
【０１２１】
減少した熱安定性を有する変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼは、例えば、存在すると考えられるその他の酵素に影響しないように酵素活性を低温で中和する必要がある場合に有用である。さらに、当該酵素はセルロース誘導体の限られた変換に有用であり、例えば結晶度またはセルロース誘導体の鎖長を制御するのに有用である。所望の変換範囲に達した後、糖化温度は不安定化されたＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１の生存温度以上に挙げることができる。ＣＢＨ１活性は結晶セルロースの加水分解に不可欠であるので、結晶セルロースの変換は高温で停止する。
【０１２２】
１の手段において、本発明の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼは洗剤組成物または手触り及び外観を改善するための織物処理に使用できる。
【０１２３】
セルロース誘導体生成物の加水分解速度は、複製可能プラスミドとして、またはゲノム内への挿入として少なくとも１の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ遺伝子のさらなるコピーを有する形質転換体を用いて増加させることができるので、セルロースまたはヘテログリカンを含む生成物がより速い速度でより大量に分解できる。紙、綿、セルロース系オムツ等のセルロースから作られる生成物は埋立て処理地においてより効果的に分解できる。従って、当該形質転換から得られる発酵生成物または形質転換自体は組成物中に使用でき、満杯の埋立て処理地にある多種多様のセルロース生成物を液化することにより分解を助けることができる。
【０１２４】
分離した糖化及び発酵は、バイオマス、例えば伐採残（コーンストーバー）中に存在するセルロースをグルコースに変換し、続いて酵母株がグルコースをエタノールに変換する方法である。同時糖化及び発酵は、バイオマス、例えば伐採残（コーンストーバー）中に存在するセルロースをグルコースに変換し、同時に同じ反応器内で酵母株がグルコースをエタノールに変換する方法である。従って、他の手段において、本発明の所望のセルラーゼはバイオマスからエタノールへの分解に利用できる。容易に入手可能なセルロース源からのエタノール生成は安定で再生可能な燃料源を提供する。
【０１２５】
セルロースベース供給原料は農業廃棄物、草及び木材及びその他の低価値バイオマス、例えば都市ゴミ（例えば、再生紙、庭伐採ゴミ（ｙａｒｄ ｃｌｉｐｐｉｎｇｓ）等）からなる。エタノールは任意のこれらセルロース系供給原料の発酵から生成できる。しかしながら、セルロースは、エタノール変換の前にまず糖に変換されなければならない。従って、ここに記載のＣＢＨ１セルラーゼはバイオマスから糖への変換に有用である。
【０１２６】
多種多様の供給原料が本発明の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼと用いることができ、使用する種類の選択は変換が行われる地域に依存する。例えば、アメリカ中西部では麦かん、伐採残（コーンストーバー）及びバガスなどの農業廃棄物が主流であり、一方、カリフォルニアでは稲わらが主流である。しかしながら、当然のことながらいかなる入手可能なセルロース系バイオマスも任意の地域で使用できる。
【０１２７】
増加した量でセロビオヒドロラーゼを含むセルラーゼ組成物はエタノール生成に利用することができる。この方法から得たエタノールはさらにオクタンエンハンサーとして用いることができ、またはガソリンの代わりに直接燃料として用いることができ、燃料源としてのエタノールは石油由来生成物よりもより環境に優しいので有用である。エタノールの使用は大気環境を改善し、局所オゾンレベル及びスモッグを減少させる可能性があることが知られている。さらに、ガソリンの代わりにエタノールを利用することは非再生エネルギー及び石油化学供給の突然移行の影響を緩衝するために戦略的に重要である。
【０１２８】
エタノールは糖化及び発酵プロセスにより木、葉状植物、都市固体ゴミ及び農業及び林業残留物などのセルロース系バイオマスから生成できる。しかしながら、微生物により生成される天然セロビオヒドロラーゼ混合物内の個々のセルラーゼ酵素の比率は、バイオマスからグルコースへのセルロース変換を速く行うために最も効果的な比率ではない。エンドグルカナーゼは新しいセルロース鎖末端の生成に作用し、それ自身はセロビオヒドロラーゼ活性の基質であり、それによってセルラーゼ系全体の加水分解効率が改善することが知られている。従って、増加した、または最適化されたセロビオヒドロラーゼ活性を使用してエタノール生成を大きく高めることができる。
【０１２９】
従って、本発明のセロビオヒドロラーゼはセルロースをその糖成分に加水分解する際に使用できる。１の実施態様において、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼは発酵生物添加前にバイオマスに添加する。第２の実施態様において、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼは発酵生物と同時にバイオマスに添加する。任意で、いずれの実施態様もその他のセルラーゼ成分が存在できる。高められたセルロース変換はここに記載のＣＢＨ１ポリペプチドを用いて高温で達成できる。
【０１３０】
他の実施態様において、セルロース系供給原料を前処理することができる。前処理は高温及び希酸、濃酸または希アルカリ溶液を添加することによる。前処理溶液はヘミセルロース成分を少なくとも部分的に加水分解するのに十分な時間で加え、それから中和する。
【０１３１】
本発明の洗剤組成物はセルラーゼ組成物に加えて（セロビオヒドロラーゼ含量に関係なく、すなわち、セロビオヒドロラーゼを含まない、実質的に含まないまたは増加した量のセロビオヒドロラーゼ）、界面活性剤、例えば陰イオン性、非イオン性及び両性イオン性界面活性剤、ヒドロラーゼ、ビルディング剤、漂白剤、青味剤及び蛍光剤、ケーキング防止剤、可溶化剤、カチオン性界面活性剤等を用いることができる。これら全ての成分は洗剤業界に公知である。上述のセルラーゼ組成物は、希釈液、顆粒、エマルジョン、ゲル、ペースト等の洗剤組成物に加えることができる。当該形態は当業者に公知である。固形洗剤組成物を用いる場合、セルラーゼ組成物は顆粒として処方するのが好ましい。好ましくは、顆粒はセルラーゼ保護剤を含むように処方される。さらに詳細な議論については、ここに引用する米国特許第６，１６２，７８２号、表題“Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ＣＢＨ Ｉ ｔｙｐｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（ＣＢＨ
Ｉ型成分が欠損したセルラーゼ組成物を含有する洗浄剤組成物）”を参照されたい。
【０１３２】
好ましくは、セルラーゼ組成物は洗剤組成物全体に関して約０．００００５重量％〜約５重量％で用いる。より好ましくは、セルラーゼ組成物は洗剤組成物全体に関して約０．０００２重量％〜約２重量％を用いる。
【０１３３】
さらに、所望のセルラーゼ核酸配列は関連核酸配列の同定及びキャラクタリゼーションに使用できる。関連遺伝子または遺伝子産物の機能の測定（予測または確認）に有用な多数の技術は、限定されないが、以下を含む、（Ａ）ＤＮＡ／ＲＮＡ分析、例えば（１）過剰発現、異所性発現及びその他の種における発現；（２）遺伝子ノックアウト（逆遺伝学、標的ノックアウト、ウイルスによる遺伝子抑制（ＶＩＧＳ、Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、１９９９を参照）；（３）遺伝子、特にフランキング調節領域のメチル化状態の分析；及び（４）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション；（Ｂ）遺伝子産物分析、例えば（１）組換えタンパク質発現；（２）抗血清生成、（３）免疫学的局在決定；（４）触媒的またはその他の活性の生化学分析；（５）リン酸化反応状態；及び（６）酵母２ハイブリッド分析によるその他のタンパク質との相互作用；（Ｃ）経路分析、例えば、過剰発現表現型に基づいた、または関連遺伝子との配列相同性による、特定生化学またはシグナリング経路内の遺伝子または遺伝子産物のプレイシング；及び（Ｄ）特定代謝またはシグナリング経路において単離遺伝子及びその産物の関与を測定または確認するために実施でき、遺伝子機能の測定に役立つ、その他の分析。
【実施例】
【０１３４】
実施例
本発明を以下の実施例においてより詳細に説明し、これらは本発明の範囲をいかなる形においても制限するものではない。添付の図は本発明の明細書及び説明の不可欠な要素として考慮される。ここに引用する全ての文献はここに明示的に引用されるものとする。
【０１３５】
実施例１
ＣＢＨ１．１変異体の同定
この実施例は変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１をエンコードする核酸の同定及びキャラクタリゼーションについて説明する。
ゲノムＤＮＡの同定
【０１３６】
ゲノムＤＮＡは当業界に公知の任意の方法を用いて単離できる。この一連の実験において、フミコーラ・グリセア ｖａｒ ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ（ＣＢＳ２２５．６３）のサンプルを得た。しかしながら、以下の手順も用いることができる：
細胞を２０ｍｌポテトデキストロース培養液（ＰＤＢ）中、４５℃で２４時間成長させる。当該細胞を新しいＰＤＢ培地中で１：２０に希釈し、一晩中成長させる。２ｍＬの細胞を遠心し、ペレットを１ｍＬ ＫＣ（６０ｇ、ＫＣｌ、２ｇクエン酸／Ｌ、ＫＯＨを用いてｐＨを６．２に調節）中で洗浄する。細胞ペレットを９００μＬ ＫＣ中で再懸濁させる。１００μＬ（２０ｍｇ／ｍＬ）ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ：登録商標）を加え、ゆっくりと混合し、次に９５％以上の原形質体が形成されるまで、微視的に３７℃、最大２時間でプロトプラステーション（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔａｔｉｏｎ）を行う。当該細胞を１５００ｒｐｍで（４６０ｇ）１０分間遠心する。２００μＬ ＴＥＳ／ＳＤＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ）を加え、混合し、室温で５分間培養する。ＤＮＡをキアゲンミニプレップ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離する。カラムを１００μＬのｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて溶出させ、ＤＮＡを収集する。
【０１３７】
これは４５℃で成長させたＰＤＡプレートからＨ．グリセア ｖａｒ ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａのゲノムＤＮＡを単離するために用いる方法である。もしくはＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）法を用いる方法も好ましい。当該システムは核酸単離のためのＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）機器及びＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）キットからなる。ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）はＱｂｉｏｇｅｎｅ社（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，２２５１ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ Ｒｏａｄ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州、９２００８）から入手可能である。
【０１３８】
プライマーの構築
ＰＣＲはＰＣＴ−２００ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）などの標準ＰＣＲ機械上で、以下の条件下で行った：
１）１分、９６℃で１サイクル
２）３０秒、９４℃
６０秒、５５℃
２分、７２℃
３）工程２繰り返し、３０サイクル
４）７分、７２℃、１サイクル、及び
５）保管及びさらなる分析、低温〜１５℃。
【０１３９】
以下のＤＮＡプライマーを種々の微生物から単離したゲノムＤＮＡ由来の相同体ＣＢＨ１遺伝子の増幅に使用するために構築した。タンパク質及びＤＮＡに関してここで用いる全ての記号はＩＵＰＡＣ ＩＵＢ生化学命名法割当てコードに対応する。
相同体５’（ＰＶＳ２０３）及び３’（ＰＶＳ２０４）プライマーをフミコーラ・グリセア ｖａｒ ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ（ＩＦＯ９８５４）由来ＣＢＨ１配列に基づいて開発した。この株はＤ６３５１５として配置図中に示した配列を発現する（図５）。両プライマーはインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））のＧａｔｅｗａｙクローニング配列をプライマーの５’に含む。プライマーＰＶＳ２０３はａｔｔＢ１配列を含み、プライマーＰＶＳ２０４はａｔｔＢ２配列を含む。
【式１】
【０１４０】
【０１４１】
ＰＣＲ条件は以下の通り：２０μＬの５Ｘ反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．５；８７．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４；６．２５ｍＭ ＭｇＣＬ２；２．５％ Ｔｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）７．５％ ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含む５Ｘ反応緩衝液）；各０．２ｍＭの、ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ（最終濃度）、１μＬの１００ｎｇ／μＬゲノムＤＮＡ、１μＬのＴｇｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｃａｔ＃３１８６１９９）、μＬ当たり１ユニット、各０．２μＭのプライマー、ＰＶＳ２０３及びＰＶＳ２０４（最終濃度）、及び水１００μＬまで。
【０１４２】
変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１遺伝子配列の単離
完全長配列をＮ末端（ＰＶＳ２０３）及びＣ末端（ＰＶＳ２０４）プライマーを用いることにより直接得た。完全長ＤＮＡ配列をベクターＮＴＩソフトウェアを用いる３つのオープンリーディングフレーム内に翻訳した。ＤＮＡ及びタンパク質配列とＨ．グリセア Ｃｅｌ７Ａ（Ｘ１７２５８及びＤ６３５１５）の２つの公知配列との比較を行い、推定上のイントロン配列を同定した。イントロン配列を含まないゲノムＤＮＡ配列の翻訳により変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１のタンパク質配列が明らかになった。完全長遺伝子が得られ、図１に示した（ゲノムＤＮＡ）。推定ｃＤＮＡを図２に表す。
【０１４３】
実施例２
ＣＢＨ１．１変異体発現
以下の実施例はどのように変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１遺伝子の発現が行われたかについて詳述する。
【０１４４】
実施例１の完全長遺伝子を目的地ベクターを適合性のあるＡ．ニガー Ｇａｔｅｗａｙ（ジェネンコーが開発）に移した。このベクターを骨格としてｐＲＡＸ１を用いることにより、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング・テクノロジー：バージョン１、第３４−３８頁の所定のマニュアルに従って構築した（図６に示す）。
新しく開発した発現ベクターを図７に示す。これは新しい遺伝子を目的地ベクターｐＲＡＸｄｅｓ２内に移すものである。これにより最終発現ベクターが得られ、ｐＲＡＸｄｅｓＣＢＨ１を呼ぶ（図８を参照）。
【０１４５】
当該構築体をＣａｏ、他に記載の方法に従ってＡ．ニガー ｖａｒ．アワモリ内に形質転換した（Ｃａｏ Ｑ−Ｎ、Ｓｔｕｂｂｓ Ｍ、Ｎｇｏ ＫＱＰ，Ｗａｒｄ Ｍ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ａ，Ｐａｉ ＥＦ，Ｔｕ Ｇ−Ｃ及びＨｏｆｍａｎｎ Ｔ（２０００）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｏｐｅｐｓｉｎ−ＪＴ２ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ
ｆｒｏｍ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ Ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄ ｉｎ ｓｕｂｓｉｔｅ Ｓ３
ｔｏ ｋｃａｔ（ペニシロペプシン−ＪＴ２、ペニシリウム・ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ由来の組換え酵素、及びサブサイトＳ３からｋｃａｔにおける水素結合の寄与） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：９９１−１００１）。
【０１４６】
形質転換を最小培地プレート（Ｂａｌｌａｎｃｅ ＤＪ，Ｂｕｘｔｏｎ ＦＰ、及びＴｕｒｎｅｒ Ｇ（１９８３）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ（アカパンカビのオロチジン−５’− リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子によるアスペルギルス・ニデュランスの形質転換） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １１２：２８４−２８９）上に筋上に加え、４日間、３０℃で成長させた。胞子を当業界に公知の方法を用いて回収した（<www.fgsc.net/fgn48/Kaminskyj.htm>を参照）。Ａ．ニデュランス分生子を水中で（胞子を取除くために殺菌湾曲ガラス棒を用いて分生子（ｃｏｎｉｄｉａｔｉｎｇ）培養物の表面を擦ることにより）収集し、生存に深刻な損失を生じることなく４℃で数週間から数ヶ月保存できる。しかしながら、新しく収集した胞子はより繁殖して発芽した。長期保存に関して、胞子は５０％グリセロール中、−２０℃で、または１５−２０％グリセロール中、−８０℃で保存できる。グリセロールは８０％水溶液としてより簡単にピペットで取られる。８００μＬの分生子懸濁水溶液（４℃保存用として作成）を２００μＬ ８０％グリセロールに加えたものを−８０℃保存用に用いる。４００μＬ懸濁液を６００μＬ ８０％グリセロールに加えたものを−２０℃保存用に用いる。凍結前に遠心（ｖｏｒｔｅｘ）する。変異体を回収するため、少量の分生子培養物を摘出し、２０％ グリセロール内に加え、遠心し、及び−８０℃保存として凍結させる。この場合、これらを５０％ グリセロール内、−８０℃で保存する。
【０１４７】
Ａ．ニガー ｖａｒ アワモリ形質転換体をウリジンが欠落した最小培地（Ｂａｌｌａｎｃｅ、他、１９８３）上で成長させた。形質転換体を、Ｃａｏ、他（２０００）に記載の通り、胞子形成成長寒天プレートからの１ｃｍ２の胞子懸濁液を１００ｍＬの振とうフラスコ中に３日間、３７℃で植菌することによりセルラーゼ活性をスクリーニングした。
ＣＢＨ１活性分析は非蛍光４−メチルウンベリフェリル−β−ラクトシドから生成物ラクトース及び７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンへの加水分解に基づき、後者の生成物は蛍光シグナルに関与する。１７０μＬ ５０ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液 ｐＨ４．５を９６ウェル・マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｆｌｕｏｔｒａｃ ２００、ａｒｔ．ｎｒ．６５５０７６）中にピペットで取り、蛍光に適している。１０μＬの上澄みを加え、それから１０μＬのＭＵＬ（１ｍＭ ４−メチルウンベリフェリル−β−ラクトシド（ＭＵＬ）のｍｉｌｌｉＱ水）を加え、ＭＴＰをＦｌｕｏｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｄ−７７６５６ Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ）中に置く。反応速度を１６分間（それぞれ１２０秒、８サイクル）、λ３２０ｎｍ（励起）及びλ４６０ｎｍ（発光）を用いて５０℃で測定する。ＣＢＨ活性を有する上澄みをそれから下記の実施例３の説明の通り、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供した。アミノ酸配列を上記実施例１の通り推定した。変異体ＣＢＨ１．１のアミノ酸配列を図３にシグナル配列を含めて、図４にシグナル配列を含まないで示した。シグナル配列を太字、下線書体で図３に示す。
【０１４８】
実施例３
ＣＢＨ１変異体の熱安定性
以下の実施例は変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１とＴ．リーゼイＣＢＨ１セルラーゼ酵素の熱安定性の差を詳述する。
【０１４９】
ＣＢＨ１セルラーゼ変異体を上述の通りクローン及び発現させた（実施例２を参照）。Ｃｅｌ７Ａ野生型及び変異体をそれからカラムクロマトグラフィーによりこれらの培養物の細胞を含まない（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）上澄みから精製した。タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて精製した。カラムをＢｉｏＣＡＤ（登録商標）Ｓｐｒｉｎｔ Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎクロマトグラフィーシステム上でＰｏｒｏｓ（登録商標）２０ＨＰ２樹脂を用いて操作し、これらは両方ともＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製である。
【０１５０】
ＨＩＣカラムを５カラム体積の０．０２０Ｍ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 硫酸アンモニウムを用いてｐＨ６．８で平衡にした。硫酸アンモニウムを上澄みに加え、最終濃度が約０．５Ｍになるようにし、及びｐＨを６．８に調節した。ろ過後、上澄みをカラム上に充填する。充填後、カラムを１０カラム量（ｖｏｌｕｍｅ）の平衡緩衝液で洗浄し、それから１０カラム量で０．５Ｍ硫酸アンモニウムからゼロ硫酸アンモニウム勾配で、ｐＨ６．８、０．０２Ｍリン酸ナトリウム中で溶出させた。Ｃｅｌ７Ａをおおよそ中間勾配で溶出させた。断片を収集し、還元、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析に基づいてプールした。
【０１５１】
融点をＬｕｏ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１０６６９及びＧｌｏｓｓ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：５６１２の方法に従って測定した。
【０１５２】
データをＡｖｉｖ ２１５円偏光二色性分光計により集めた。２１０〜２６０ナノメートルの変異体のスペクトルを２５℃で取った。緩衝液条件は５０ｍＭ ビス−トリス−プロパン／５０ｍＭ 酢酸アンモニウム／氷酢酸、ｐＨ５．５である。タンパク質濃度は０．２５〜０．５ｍｇｓ／ｍＬに維持した。非折り畳みを観測するための最適波長を測定した後、サンプルを同じ緩衝条件下、温度２５℃〜７５℃に傾斜させることにより熱変性させた。データを５秒間、２度毎に回収した。部分的に可逆的な非折り畳みを２３０ナノメートル、０．１ｃｍパス・レングス細胞中で観測した。
【０１５３】
変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１セルラーゼは野生型Ｔ．リーゼイＣＢＨ１と比較して高められた熱安定性プロファイルを有する。変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１のＴｍは７２．５℃であり、Ｔ．リーゼイのＴｍは６２．３℃である。
実施例４
ＣＢＨ１変異体の活性
【０１５４】
以下の実施例はＨ．グリセアＣＢＨ１．１変異体の活性の評価方法について詳述する。
【０１５５】
セルロース変換を当業界に公知の技術により評価した。例えば、Ｂａｋｅｒ、他、Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９８ Ｓｐｒｉｎｇ；７０−７２（）：３９５−４０３を参照されたい。
【０１５６】
標準セルロース誘導体変換分析を実験に用いた。この分析において、酵素及び緩衝基質を容器内に入れ、ある温度でゆっくり時間をかけて培養した。当該反応を十分な１００ｍＭ グリシン、ｐＨ１１．０で冷却し、反応混合物のｐＨを少なくともｐＨ１０にした。反応を抑えた後、反応混合物のアリコートを０．２ミクロン膜によりろ過し、固体を除去した。続いてろ過溶液を、Ｂａｋｅｒ、他、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７０−７２：３９５−４０３（１９９８）に記載の方法に従って、ＨＰＬＣにより可溶性糖について分析した。
【０１５７】
前処理伐採残（コーンストーバー）（ＰＣＳ）−伐採残（コーンストーバー）をＳｃｈｅｌｌ，Ｄ．他、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０５：６９−８６（２００３）に記載の通り２％ ｗ／ｗ Ｈ２ＳＯ４で前処理し、次に脱イオン水で複数回洗浄し、ｐＨ４．５となった。酢酸ナトリウムを加えて最終濃度５０ｍＭにし、これを滴定してｐＨ５．０とした。当該反応混合物中のセルロース濃度は約７％であった。
【０１５８】
リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）−ＰＡＳＣを、Ｗａｌｓｅｔｈ（１９７１）Ｔａｐｐｉ ３５：２２８（１９７１）及びＷｏｏｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１２１：３５３（１９７１）に記載の方法に従って、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）から調製した。この物質を緩衝液及び水を用いて希釈して０．６３％ ｗ／ｖ混合物を得て、酢酸ナトリウムの最終濃度が５０ｍＭ、ｐＨ５．０になるようにした。酵素はセルロース１グラム当たり全タンパク質１．６ｍｇで投与した。
【０１５９】
最初の一連の実験は１２．６６％の前処理伐採残（コーンストーバー）（ＰＣＳ）について３８℃、１日間での変換率を調べ（Ｓｃｈｅｌｌ，Ｄ．他、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３）１０５：６９−８６を参照）、１５．５ｍｇ酵素／ｇｍセルロースを用いた。サンプルを７００ｒｐｍで掻き混ぜた。以下の間で比較を行った：１）ＣＢＨ１欠失トリコデルマ株由来のセルラーゼ（ｄｅｌＣＢＨ１）；２）Ｔ．リーゼイＣＢＨ１遺伝子を挿入したＡ．ニガー株（ｒＣＢＨ１）；その天然ＣＢＨＢを過剰発現するＡ．ニガー株（Ａｎｉｇｅｒ）；４）Ｈ．シュワイニッチィＣＢＨ１遺伝子を挿入したＡ．ニガー株（Ｈシュワイニッチィ／Ａｎ）；５）Ｔ．プソイドコニンギＣＢＨ１遺伝子を挿入したＡ．ニガー株（Ｔプソイドコニンギ／Ａｎ）；６）Ｈ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１遺伝子を挿入したＡ．ニガー株（Ｈグリセア／Ａｎ−１）；７）Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１遺伝子を挿入したＡ．ニガー株（Ｈグリセア／Ａｎ−２）。Ｈグリセア／Ａｎ−１及びＨグリセア／Ａｎ−２はＡ．ニガーとＨ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１遺伝子の同じ形質転換から得た２つのクローンである。最初の一連の実験から得た結果を図９に表す。見ての通り、Ｈ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１は試験したその他のＣＢＨのいずれと比べても性能が高くない。図１１は同じ実験条件から得られるＴ．リーゼイｎＣＢＨ１に対するＨ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１との比較である。
【０１６０】
２番目の一連の実験は培養温度が３８℃でなく６５℃である以外は最初の実験と同様の条件下で変換率を調べた。この一連の実験の結果を図１０に示す。見ての通り、Ｈ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１は試験したその他のＣＢＨのより高い性能を有する。図１２は同じ実験条件から得られるＴ．リーゼイｒＣＢＨ１に対するＨ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１の比較である。
【０１６１】
３番目の一連の実験は前述の実験と同様の試験条件下、ＰＡＳＣからのセロビオース生成率を調べた。温度は３８℃、６５℃及び７０℃を用いた。結果を図１３に表す。見ての通り、Ｈ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１は全ての試験温度でＴ．リーゼイＣＢＨ１より性能が高かった。
【０１６２】
実施例５
スキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１の単離
この実験はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１をエンコードする核酸の単離及びキャラクタリゼーションを説明する。
【０１６３】
ゲノムＤＮＡの単離及びプライマーの構築
スキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１をクローニング、発現及び精製する方法はフミコーラ・グリセア ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ ＣＢＨ１．１に関して記載した通りである（実施例１を参照）。スキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ由来ＣＢＨ１遺伝子を公知株コレクション・エントリーＣＢＳ６７１．８８由来のゲノムＤＮＡから同じＰＣＲプライマー、フミコーラ・グリセア ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅ ＣＢＨ１．１を増幅するために用いたＰＶＳ２０３及びＰＶＳ２０４を用いて増幅した。
【０１６４】
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１遺伝子配列の単離
完全長配列をＮ末端（ＰＶＳ２０３）及びＣ末端（ＰＶＳ２０４）プライマーを用いて直接得た。完全長ＤＮＡ配列をベクターＮＴＩソフトウェアを用いて３つのリーディングフレーム内に翻訳した。イントロン配列を含まないゲノムＤＮＡ配列の翻訳によりＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１のタンパク質配列が明らかになった。完全長遺伝子が得られ、図１４Ａに示す（ゲノムＤＮＡ）。推測ｃＤＮＡを図１４Ｂに表す。シグナル配列を含むアミノ酸配列と含まないアミノ酸配列をそれぞれ図１４Ｃ及び１５に示す。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｏｉｕｍ ＣＢＨ１、フミコーラ・グリセア ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ ＣＢＨ１．１及びＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１タンパク質配列を配置させた。図１５を参照されたい。
【０１６５】
フミコーラ・グリセア ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ ＣＢＨ１．１及び非常に安定なスキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ１間の部位の差を同定し、次に図１５の配置を用いることによりヒポクレア・ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１中の対応位置を同定する。そして、これはフミコーラ・グリセア ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ ＣＢＨ１．１またはスキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ１のいずれよりもかなり不安定である。ヒポクレア・ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨＩ中の以下の部位（成熟タンパク質残基番号）を安定性に関して重要なものとして同定する：
Ｔｈｒ（Ｔ）５５、好ましくはＴｈｒ５５Ｇｌｕ（Ｔ５５Ｅ）及びＴｈｒ５５Ｌｙｓ（Ｔ５５Ｋ）
Ｓｅｒ（Ｓ）５８、好ましくはＳｅｒ５８Ｔｈｒ（Ｓ５８Ｔ）
Ｇｌｎ（Ｑ）１０１、好ましくはＧｌｎ１０１Ｔｙｒ（Ｑ１０１Ｙ）及びＧｌｎ１０１Ｈｉｓ（Ｑ１０１Ｈ）
Ａｓｎ（Ｎ）２５０、好ましくはＡｓｎ２５０Ａｓｐ（Ｎ２５０Ｄ）及びＡｓｎ２５０Ｇｌｕ（Ｎ２５０Ｅ）
Ｐｒｏ（Ｐ）２６５、好ましくはＰｒｏ２６５Ａｌａ（Ｐ２６５Ａ）及びＰｒｏ２６５Ｓｅｒ（Ｐ２６５Ｓ）
Ｌｅｕ（Ｌ）２８８、好ましくはＬｅｕ２８８Ｉｌｅ（Ｌ２８８Ｉ）。
【０１６６】
実施例６
スキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１の熱安定性
この実施例はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ１及びＨ．グリセア ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ ＣＢＨ１．１の熱安定性測定について説明する。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ１及びＨ．グリセア ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ ＣＢＨ１．１を実施例２に記載の方法を用いて発現し、実施例３の通り精製し、Ｍｉｃｒｏｃａｌ ＶＰ−ＤＳＣを用いて示差走査熱量測定により分析した。サンプルを３０〜９５℃、９０℃／時間でスキャンした。精製タンパク質を５０ｍＭ 酢酸アンモニウム及び５０ｍＭ ビストリス・プロパン内でｐＨ５．５で脱塩した。全てのサンプルの最終タンパク質濃度は０．０５〜０．２５ｍｇ／ｍＬだった。
【０１６７】
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍに関して観測された温度遷移の中間点は７８．３℃であった。Ｈ．グリセア ＣＢＨ１．１の温度遷移の中間点は７６．０℃だった。図１６を参照。
【０１６８】
ここに記載される実施例及び実施態様は説明目的のためのみであり、これに照らして種々の修正または変形が当業者に示唆され、本発明の概念及び精神及び請求の範囲の範囲内であることが理解される。ここに記載の全ての文献、特許及び特許出願はその全体を全ての目的においてここに引用するものとする。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２００３年４月１日に出願された米国仮出願番号６０／４５９，７３４号（代理人整理番号、ＧＣ７９４Ｐ）に基づく優先権を主張するものであり、これをここに引用する。
連邦政府後援による研究開発のもと行われた発明に対する権利に関する陳述
【０００２】
この研究の一部は、米国エネルギー省の元契約番号ＤＥ−ＡＣ３６−９９ＧＯ１０３３７の下、再生可能エネルギー研究所の下請け番号ＺＣＯ−０−３００１７−０１により資金援助されたものである。従って、米国政府は本発明における特定の権利を有し得る。
発明の分野
【０００３】
本発明はセロビオヒドロラーゼI（ＣＢＨ１またはＣＢＨＩともいう）活性を有するポリペプチド及び当該ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに関する。また、本発明は核酸構築体、ベクター、及び当該核酸構築体を含む宿主細胞、並びに当該ポリペプチドを生成及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
セルロースは重要な工業的原料であり、再生可能エネルギーの供給源である。天然セルロースの物理的構造及び形態は複雑であり、その構造の細部を実験的に測定することは難しい。しかしながら、セルロースの化学組成は単純であり、β−１，４−グリコシド結合により結合したＤ−グルコース残基からなり直鎖を形成する。
【０００５】
効率をよくするため、セルロース消化は協調的に作用する数種の酵素を必要とする。少なくとも３つの酵素カテゴリーがセルロースをグルコースに変換するために必要である：ランダムにセルロース鎖を切断するエンド（１，４）−β−Ｄ−グルカナーゼ（ＥＣ３ １．４）；セルロース鎖末端からセロビオシル単位を切断するセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３ １．９１）及びセロビオース及び可溶性セロデキストリンをグルコースに変換するβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３ １．２１）。セルロース生分解に関する酵素のこれら３つのカテゴリーの中で、セロビオヒドロラーゼは天然結晶セルロース分解のために主要な酵素である。エキソ−セロビオヒドロラーゼ（セロビオヒドロラーゼ１またはＣＢＨ１）は、セルロースポリマー鎖の非還元末端からセロビオースを加水分解することによりセルロースを分解するセロビオヒドロラーゼをいう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
セロビオヒドロラーゼＩ活性を有する改善されたポリペプチド及び当該ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを提供することが本発明の目的である。改善されたポリペプチドは改善された特異活性及び／または改善された安定性、特に改善された熱安定性を有することができる。
【０００７】
セルラーゼ組成物についての開示は従来からあるが、家庭用洗剤、ストーンウォッシュ組成物または洗濯用洗剤等に使用するための新規で改善されたセルラーゼ組成物の必要性が依然として残っている。改善された性能を示すセルラーゼは特に関心が高い。
[先行技術文献]
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１はＨ．グリセアＣＢＨ１．１のゲノムＤＮＡ配列である（配列番号１）。推測上のイントロンは太字、下線で示す。
【図２】図２はＨ．グリセアＣＢＨ１．１のｃＤＮＡ配列である（配列番号２）。推測上のイントロン配列（図１中のヌクレオチド４１３−４７２）は欠失させた。
【図３】図３はＨ．グリセアＣＢＨ１．１のシグナル配列及び成熟アミノ酸配列である（配列番号３）。シグナル配列は太字、下線で示す。
【図４】図４はＨ．グリセアＣＢＨ１．１の成熟アミノ酸配列である（配列番号４）。
【図５】図５は２つの公知及び変異体フミコーラ・グリセアＣＢＨ１．１成熟配列の配置を示す。２つの公知配列はＸ１７２５８（配列番号５）及びＤ６３５１５（配列番号６）である。
【図６】図６はｐＲＡＸ１プラスミドである。このベクターは、アスペルギルス・ニデュランスゲノムＤＮＡ断片ＡＭＡ１配列の５２５９ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９６ １９：５６５−５７４）を挿入した以外は、プラスミドｐＧＡＰＴ２に基づく。塩基１〜１１３４はアルペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼ遺伝子プロモーターを含む。塩基３０９８〜３３５６及び４９５０〜４９７１はアルペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼターミネーターを含む。アスペルギルス・ニデュランスｐｙｒＧ遺伝子を真菌形質転換のためのマーカーとして３３５７〜４９４９に挿入した。遺伝子を挿入できるマルチクローニング部位（ＭＣＳ）が存在する。
【図７】図７はｐＲＡＸｄｅｓ２ベクター骨格である。このベクターはプラスミドｐＲＡＸ１に基づく。ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）カセットをｐＲＡＸベクター内に導入した（環状プラスミド内部の矢印によって示す）。このカセットは組換え配列ａｔｔＲ１及びａｔｔＲ２及び選択マーカーｃａｔＨ及びｃｃｄＢを含む。当該ベクターはＧａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングテクノロジー：バージョン１、第３４−３８頁のマニュアルに従って作り、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の大腸菌ＤＢ３．１中でのみ複製でき、その他の大腸菌宿主中では、当該ｃｃｄＢ遺伝子は死滅する。まず、ＰＣＲ断片をａｔｔＢ１／２組換え配列を含むプライマーを用いて作る。この断片はｐＤＯＮＲ２０１（インビトロジェンから市販）で組換え、このベクターは組換え部位間にｃａｔＨ及びｃｃｄＢを有するａｔｔＰ１／２組換え配列を含む。インビトロジェンのＢＰクロナーゼ酵素はこのいわゆるＥＮＴＲＹ（エントリー）ベクター内のＰＣＲ断片を組換えるために用い、挿入されたＰＣＲ断片を有するクローンはｃｃｄＢを発現するクローンが生き残らないので５０μｇ／ｍｌカナマイシンで選択できる。ここでａｔｔ配列を変異し、ａｔｔＬ１及びａｔｔＬ２と呼ぶ。第２の工程はｐＲＡＸｄｅｓ２ベクターを用いたこのクローンの組換えである（組換え部位間にａｔｔＲ１及びａｔｔＲ２ ｃａｔＨ及びｃｃｄＢを含む）。インビトロジェンからのＬＲクロナーゼ酵素は目的ベクター内にＥＮＴＲＹベクターからの挿入を組込むために用いる。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを用いると、ｃｃｄＢは死滅し、ＥＮＴＲＹベクターはアンピシリンに感受性であるので、ｐＲＡＸＣＢＨ１ベクターのみが選択される。この方法により発現ベクターが調製され、Ａ．ニガーを形質転換するために用いることができる。Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１発現はアスペルギルス・グルコアミラーゼプロモーター及びターミネーター制御下にある。形質転換マーカーｐｙｒＧ遺伝子及びＡＭＡ１配列はアスペルギルス・ニデュランス由来である。
【図８】図８はアスペルギルス中、ＣＢＨ１．１をエンコードする核酸を発現するために用いたｐＲＡＸｄｅｓ２ｃｂｈ１ベクターの説明である。ＣＢＨ１．１酵素変異体をエンコードする核酸はａｔｔ配列の相同組換えによりベクター内にクローンした。
【図９】図９は、基質として前処理伐採残（コーンストーバー）（ＰＣＳ）を用いた１日、３８℃及び１５ｍｇの全酵素／ｇセルロースでの、セルロース変換分析における種々のＣＢＨ１セルラーゼ活性を示す。この分析は約５０：５０質量比で試験ＣＢＨ１．１サンプルとＣＢＨ１が欠失されたＴ．リーゼイ株成長から得た上澄みを混合する。この分析において３８℃でＨ．グリセアＣＢＨ１．１は特徴を示さない。 凡例：ｄｅｌＣＢＨＩはその内生ＣＢＨ１が欠失された株である；ＣＢＨ１欠失である。ｒＣＢＨ１はＴ．リーゼイＣＢＨ１遺伝子が挿入されたＡ．ニガー株由来の精製酵素である。Ａ．ニガーはその内生セルラーゼＣＢＨＣを過剰発現するＡ．ニガー株由来の精製ＣＢＨＢである。Ｈ．シュワイニッチィ／Ａｎは、挿入されたヒポクレア・シュワイニッチィ由来の異種ＣＢＨ１遺伝子を発現するＡ．ニガー株由来の精製ＣＢＨ１である。Ｔ．プソイドコニンギ／Ａｎは、挿入されたトリコデルマ・プソイドコニンギ由来の異種ＣＢＨ１遺伝子を発現するＡ．ニガー株由来の精製ＣＢＨ１である。Ｈ．グリセア／Ａｎ−１は挿入されたＨ．グリセア由来の異種ＣＢＨ１．１遺伝子を発現する第１のＡ．ニガークローン由来の精製ＣＢＨ１．１である。Ｈ．グリセア／Ａｎ−２は挿入されたＨ．グリセア由来の異種ＣＢＨ１．１遺伝子を発現する第２のＡ．ニガークローン由来の精製ＣＢＨ１．１である。Ｈ．グリセア／Ａｎ−１及びＨ．グリセア／Ａｎ−２はＨ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１遺伝子を含むＡ．ニガーの同じ形質転換由来の２つのクローンである。
【図１０】図１０は、基質として前処理伐採残（コーンストーバー）を用いた１日、６５℃及び１５ｍｇの全酵素／ｇセルロースでの、セルロース変換分析におけるＣＢＨ１セルラーゼ活性を示す。この分析は約５０：５０質量比で試験ＣＢＨ１サンプルとＣＢＨ１が欠失されたＴ．リーゼイ株成長から得た上澄みを混合する。この分析において３８℃でＨ．グリセアＣＢＨ１．１は特徴を示さない。３８℃の結果と異なり、Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１サンプルの両方ともその他のサンプルよりも明らかに良い。凡例：図９と同じ。
【図１１】図１１は、基質として前処理伐採残（コーンストーバー）（ＰＣＳ）を用いた１日、３８℃及び１５ｍｇの全酵素／ｇセルロースでの、セルロース変換分析におけるＨ．グリセアＣＢＨ１．１及びＴ．リーゼイＣＢＨ１セルラーゼ活性を示す。この分析は約５０：５０質量比で試験ＣＢＨ１．１サンプルとＣＢＨ１が欠失されたＴ．リーゼイ株成長から得た上澄みを混合する。この分析において３８℃でＨ．グリセアＣＢＨ１．１は特徴を示さない。天然ＣＢＨ１（ｎＣＢＨ１）を当業者に公知の方法を用いてＴ．リーゼイセルラーゼ全体から精製した（ここに記載のＣＢＨの精製方法を参照）。
【図１２】図１２は、基質として前処理伐採残（コーンストーバー）を用いた１日、６５℃及び１５ｍｇの全酵素／ｇセルロースでの、セルロース変換分析のみにおけるＨ．グリセア及びＴ．リーゼイｒＣＢＨ１酵素の活性の結果を示す。この分析は約５０：５０質量比で試験ＣＢＨ１サンプルとＣＢＨ１が欠失されたＴ．リーゼイ株成長から得た上澄みを混合する。３８℃の結果と異なり、Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１サンプルはＴ．リーゼイよりも良い。
【図１３Ａ】種々の時点で測定したリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）についてのセルロース変換分析におけるＣＢＨＩセルラーゼ活性を示す。パネルＡにおいて、温度３８℃、１２０分間にわたって測定する。
【図１３Ｂ】種々の時点で測定したリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）についてのセルロース変換分析におけるＣＢＨＩセルラーゼ活性を示す。パネルＢにおいて、温度６５℃で測定した。
【図１３Ｃ】種々の時点で測定したリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）についてのセルロース変換分析におけるＣＢＨＩセルラーゼ活性を示す。パネルＣにおいて、温度７０℃で測定した。変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１はどの測定時点においてもＴ．リーゼイＣＢＨ１よりもセロビオースを多く放出することがわかる。
【図１４Ａ】スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１のゲノムＤＮＡ（配列番号７）配列を示す。
【図１４Ｂ】スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１のｃＤＮＡ（配列番号８）配列を示す。
【図１４Ｃ】スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１のアミノ酸（配列番号９）配列を示す。当該アミノ酸配列はシグナル配列を含む。
【図１５】図１５は、Ｈ．グリセア ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１（配列番号１０）及びスキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１（配列番号１１）の成熟型配置（すなわち、シグナル配列を含まない）を示す。また、コンセンサス配列も示す（配列番号１２）。Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１触媒ドメイン中の６つの残基を太字、下線で示し、当該部位が高められた安定性に重要である可能性を示す。
【図１６】図１６はＨ．グリセア ＣＢＨ１．１及びＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１の熱安定性プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、参照目的のみにより以下の定義及び実施例を用いて詳細を説明する。ここに引用する全ての特許及び文献は、当該特許及び文献内に開示される全ての配列も含めて、明示的にここに引用するものとする。
特段に示す場合を除いて、ここで用いる全ての技術及び科学用語は、本発明の属する当業者にとって理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、他、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（微生物学及び分子生物学の辞典）、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ
Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は当業者に本発明で用いる多くの用語の一般的な辞書を提供するものである。ここに記載の方法及び物質に類似または同等のいかなる方法及び物質も本発明を実施及び試験する際に用いることができるが、好ましい方法及び物質を記載する。数値範囲は範囲を定める数字を含める。別に示す場合を除いて、それぞれ核酸は左から右に５’〜３’方向；アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載する。実務者は特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９、及びＡｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．、１９９３を当業界の定義及び用語のために参照できる。本発明は記載された特定の方法、手順及び試薬に限定されないことは、これらが種々多様であることから当然に理解される。
【００１０】
ここに提供する表題は、明細書全体を参照することにより得られる本発明の種々の側面または実施態様を限定するものではない。従って、下記に定義する用語は明細書全体を参照することによりさらに十分に定義される。
ここに引用する全ての文献は、本発明に関連し得る組成物及び方法を記載及び開示する目的のため参照することによりここに明示的に引用する。
Ｉ．定義
【００１１】
“セルラーゼ”、“セルロース分解酵素” “セルラーゼ酵素”は細菌性または真菌性エキソグルカナーゼまたはエキソセロビオヒドロラーゼ、及び／またはエンドグルカナーゼ、及び／またはβ−グルコシダーゼを意味する。
【００１２】
“セルラーゼ”の語は、セルロースポリマーをより短いセロ−オリゴ糖オリゴマー、セロビオース及び／またはグルコースに加水分解できる酵素カテゴリーをいう。多数のセルラーゼの例、例えばエキソグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びグルコシダーゼがセルロース分解性微生物、特に真菌及び細菌から得られる。これらの微生物から作られる酵素は、セルロースをグルコースに変換するのに有用な３種の作用を有するタンパク質の混合物：すなわち、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、及びβ−グルコシダーゼである。これらの３つの異なる種類のセルラーゼ酵素はセルロース及びその誘導体をグルコースに変換するために相乗的に作用する。
多くの微生物はセルロースを加水分解する酵素を生成し、例えば真菌トリコデルマ、土壌細菌Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、バチルス、及びセルロモナス；ストレプトマイセス；及び真菌フミコーラ、アルペルギルス及びフサリウムなどがある。
【００１３】
“セロビオヒドロラーゼ１活性”とは、セルロース１，４−β−セロビオシダーゼ（エキソ−グルカナーゼ、エキソ−セロビオヒドロラーゼ、ＣＢＨ１または１，４−β−セロビオヒドロラーゼとも呼ぶ）活性を意味し、酵素分類ＥＣ３．２．１．９１として定義され、セルロース及びセロテトラオース中の１，４−β−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒し、セルロース鎖の非還元末端からセロビオースを放出する。本発明では、ＣＢＨ１活性は実施例４に記載の手順に従って測定できる。
【００１４】
“宿主細胞”の語はベクターを含み、複製及び／または転写または発現構築体の転写及び翻訳（発現）を助ける細胞を意味する。本発明で用いる宿主細胞は大腸菌などの原核細胞または酵母などの真核細胞、植物、昆虫、両生類または哺乳類細胞などの細胞である。通常、宿主細胞は糸状菌である。
【００１５】
細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いる“組換え体”の語は、該細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の挿入により、または天然核酸またはタンパク質の変異により修飾されたこと、または該細胞がそのように修飾された細胞由来であることを示す。従って、例えば、組換え細胞は当該細胞の天然（非組換え）型内では見られない遺伝子を発現し、または発現、または全く発現しない条件下で、通常は異常発現される天然遺伝子を発現する。
【００１６】
“分泌シグナル配列”の語は、大ポリペプチドの構成要素として、ポリペプチドが合成される細胞の分泌経路から当該大ポリペプチドに導かれるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をエンコードするＤＮＡ配列を示す。当該大ペプチドは普通は分割されて、分泌経路を通過する際に分泌ペプチドが取り除かれる。
【００１７】
ここで用いる、“セルラーゼ調製物全体”及び“セルラーゼ組成物全体”の語句は交換可能に用いられ、天然及び非天然組成物の両方をいう。“天然”組成物は天然源により生成した組成物であり、１以上のセロビオヒドロラーゼ型、１以上のエンドグルカナーゼ型、及び１以上のβ−グルコシダーゼ成分を含み、これらの各成分は供給源より生じた比率で見られる。天然組成物はセルロース分解酵素が非修飾の微生物から生成したものであり、従って当該成分酵素の比率は天然微生物により生成したものから変更されていない。
【００１８】
“非天然”組成物は、（１）天然比率または非天然、すなわち変更された比率で成分をセルロース分解酵素と混合；または（２）１以上のセルロース分解酵素を過剰発現または過少発現するように微生物を修飾；または（３）少なくとも１のセルロース分解酵素が欠失するように微生物を修飾、または（４）異種成分セルロース分解性酵素を発現するように微生物を修飾することにより生成したこれらの組成物を包含する。
【００１９】
ここで用いる、“プロモーター”の語は下流遺伝子の転写に導くように作用する核酸配列をいう。プロモーターは通常、標的遺伝子が発現する宿主細胞に適したものである。プロモーターはその他の転写及び翻訳調節核酸配列（“制御配列”とも呼ぶ）と一緒に所定の遺伝子を発現するために必要である。通常、転写及び翻訳調節配列は、限定されないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列及びエンハンサーまたは活性化配列を含む。プロモーターは下流遺伝子に通常関係するプロモーターであってもよく、または遺伝子に直接機能する限り、異種、すなわち他の遺伝子または他の微生物由来のものであってもよい。１の側面において、プロモーターは誘導性プロモーターである。１の側面において、プロモーターはジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）にアクセッション番号Ｄ８６２３５で寄託されているＴ．リーゼイｃｂｈ１プロモーターである。他の側面において、プロモーターはＴ．リーゼイ由来のｃｂｈＩＩまたはキシラナーゼプロモーターである。
【００２０】
例としては、Ａ．アワモリまたはＡ．ニガーグルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｈ．他（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４、２３０６−２３１５；Ｂｏｅｌ，Ｅ．他（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３，１５８１−１５８５）、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ カルボキシル・プロテアーゼ遺伝子、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓ．Ｐ．他（１９８４）欧州特許出願番号第ＥＰＯ０１３７２８０Ａ１）由来のプロモーター、Ａ．ニデュランスｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．他（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１，１４７０−１４７４；Ｍｕｌｌａｎｅｙ，Ｅ．Ｊ．他（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９，３７−４５）、Ａ．ニデュランスａｌｃＡ遺伝子（Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ａ．他（１９８６）Ｇｅｎｅ３３、１３７−１４９）、Ａ．ニデュランスｔｐｉＡ遺伝子（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｇ．Ｌ．他（１９８６）Ｃｅｌｌ４６，１４３−１４７）、Ａ．ニデュランスａｍｄＳ遺伝子（Ｈｙｎｅｓ，Ｍ．Ｊ．他（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３，１４３０−１４３９）、Ｔ．リーゼイ ｘｌｎ１遺伝子、Ｔ．リーゼイ ｃｂｈ２遺伝子、Ｔ．リーゼイ ｅｇｌ１遺伝子、Ｔ．リーゼイ ｅｇｌ２遺伝子、Ｔ．リーゼイ ｅｇｌ３遺伝子、及びＳＶ４０早期プロモーターなどの高等真核プロモーター（Ｂａｒｃｌａｙ，Ｓ．Ｌ．とＥ．Ｍｅｌｌｅｒ（１９８３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３，２１１７−２１３０）を含む。
【００２１】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に位置する場合、“動作可能に連結”する。例えば、分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）をエンコードするＤＮＡ、すなわちシグナルペプチドは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに動作可能に連結し；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に動作可能に連結し；またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するために位置する場合、コード配列に動作可能に連結する。通常、“動作可能に連結する”とは、連結ＤＮＡ配列が隣接しており、及び分泌リーダーの場合、隣接し、かつリーディングフレーム内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は都合のよい制限部位で連結反応により達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチド・アダプタまたはリンカーを従来実務に従って用いる。
【００２２】
ここで用いる“遺伝子”の語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡ断片を意味し、コード領域の先行及び後の領域、例えば５’非翻訳（５’ＵＴＲ）または“リーダー”配列及び３’ＵＴＲまたは“トレーラー”配列、及び個々のコード断片（エキソン）間の介在配列（イントロン）などを含んでも含まなくてもよい。
【００２３】
当該遺伝子は治療上重要なタンパク質またはペプチド、例えば成長因子、サイトカイン、配位子、受容体及び阻害因子、並びにワクチン及び抗体などをエンコードできる。当該遺伝子は商業的に重要な酵素などの工業タンパク質またはペプチド、例えばＨ．グリセア
ＣＢＨ１．１変異体、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１などのセルラーゼをエンコードできる。目的遺伝子は天然遺伝子、変異遺伝子または合成遺伝子である。
【００２４】
本発明の“糸状菌”は真核微生物であり、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ細目の全ての糸状形態を含む（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ（入門菌類学），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙを参照）。これらの真菌はキチン、セルロース及びその他の複合多糖からなる細胞壁を有する栄養菌糸を特徴とする。本発明の糸状菌は形態学的、生理学的、及び遺伝学的に酵母とはっきりと区別される。糸状菌による栄養増殖は菌糸伸長によるものであり、炭素異化は偏性好気性である。対照的に、Ｓ．セレビシェなどの酵母による栄養増殖は単細胞性葉状体の発芽によるものであり、炭素異化は発酵性である。Ｓ．セレビシェは突出した、非常に安定な複相を有し、一方、複相は、例えばアスペルギルス及びニューロスポーラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）など糸状菌における減数分裂前のごく短期間だけに存在する。Ｓ．セレビシェは１７の染色体を有し、一方、Ａ．ニデュランス及びアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）はそれぞれ８及び７の染色体を有する。最近説明されているＳ．セレビシェと糸状菌間の違いとして、Ｓ．セレビシェはアスペルギルス及びトリコデルマ・イントロンを処理できず、糸状菌の多くの転写制御因子を認識できない（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．他．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，２１−２６）。
【００２５】
核酸の一部に言及して用いる“異種”の語は、当該核酸が、通常は天然で同じ関係では見られない２以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、当該核酸は通常、遺伝子組換えにより生成し、例えば新しい機能的核酸を作るために配置した関連性のない遺伝子から２以上の配列を有し、例えば、１の供給源からプロモーターを有し、他の供給源からコード領域を有する。同様に、異種タンパク質は天然ではお互いに同じ関係で見られない２以上のサブ配列をいうことが多い（例えば、融合タンパク質）。
【００２６】
ここで用いる“単離”または“精製”の語は、天然に結合する少なくとも１の成分から除去された核酸またはアミノ酸をいう。
【００２７】
本文において、“実質的に純粋なポリペプチド”の語は、天然に関係するその他のポリペプチド物質を最大１０重量％含むポリペプチド調製物をいう（その他のポリペプチド物質の割合はより低いほうが好ましく、例えば、最大８重量％、最大６重量％、最大５重量％、最大４重量％、最大３重量％、最大２重量％、最大１重量％、及び最大１／２重量％である）。従って、実質的に純粋なポリペプチドは少なくとも９２％純粋であることが好ましく、すなわち、当該ポリペプチドは調製物中に存在する全ポリペプチド物質が少なくとも９２重量％であり、より割合が高いほうが好ましく、例えば少なくとも９４％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９６％純粋、少なくとも９７％純粋、少なくとも９８％純粋、少なくとも９９％純粋及び最大９９．５％純粋である。ここに開示するポリペプチドは好ましくは実質的に純粋な形態である。特に、ここに開示するポリペプチドは“本質的に純粋形態”であることが好ましく、すなわち、当該ポリペプチド調製物は天然に関係するその他のポリペプチド物質を本質的に含まない。このことは、例えば公知の組換え方法により当該ポリペプチドを調製することにより達成できる。従って、“実質的に純粋なポリペプチド”の語は“単離ポリペプチド”及び“単離形態のポリペプチド”の語と同義である。
【００２８】
通常、Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１をエンコードする核酸分子は中から高ストリンジェンシー条件下で、ここに配列番号１として提供する配列（変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１）にハイブリダイズする。しかしながら、場合によっては、実質的に異なるコドン使用を有する、ＣＢＨ１−エンコードヌクレオチド配列を有するが、当該ＣＢＨ１−エンコードヌクレオチド配列によりエンコードされるタンパク質は天然タンパク質と同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する。例えば、コード配列は特定の原核または真核発現系中におけるＣＢＨ１発現を促進してより速くするために、宿主が利用する特定コドン頻度に従って修飾できる。例えば、Ｔｅ’ｏ、他（２０００）は糸状菌中での発現のための遺伝子最適化について記載している。
【００２９】
核酸配列は、２つの配列が特異的に中から高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下でお互いにハイブリダイズする場合、対照核酸配列に“選択的にハイブリダイズ”すると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）に基づく。例えば、“最大ストリンジェンシー”は通常、約Ｔｍ−５℃で起こり（プローブのＴｍより５℃低い）；“高ストリンジェンシー”はＴｍより約５−１０℃低く；“中程度”または“中ストリンジェンシー”はプローブのＴｍより約１０−２０℃低く；及び“低ストリンジェンシー”はＴｍより約２０−２５℃低い。機能的に、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションプローブと厳密に同一またはほぼ厳密に同一な配列を同定するために用いることができ、高ストリンジェンシー条件はプローブと約８０％以上の配列同一性を有する配列を同定するために用いる。
【００３０】
中から高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は当業界に公知である（例えば、明示的にここに引用するＳａｍｂｒｏｏｋ、他、１９８９、第９章及び１１章、及びＡｕｓｕｂｅｌ、他、１９９３を参照）。高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％ ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中、約４２℃でのハイブリダイゼーション、及び続いて２Ｘ ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳ中、室温で２回洗浄及びさらに０．１Ｘ ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳ、４２℃で２回洗浄を含む。
【００３１】
“％相同性”の語は、ここで“％同一性”の語と交換可能に用いられ、配列配置プログラムを用いて配置した場合の、Ｈ．グリセア ＣＢＨ１．１変異体、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ
ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１アミノ酸配列をエンコードする核酸配列間の核酸またはアミノ酸配列同一性レベルをいう。
【００３２】
例えば、ここで用いる、８０％相同性とは明確なアルゴリズムにより測定された８０％配列同一性と同じ意味を有し、従って、所定の配列の相同体が所定の配列長さにわたって８０％より大きい配列同一性を有する。配列同一性レベルの例としては、限定されないが、所定の配列、例えばここに記載のＨ．グリセアＣＢＨ１．１変異体、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１のコード配列に対して８０、８５、９０、９５、９８％以上の配列同一性を含む。
【００３３】
２つの配列間の同一性を測定するために使用できるコンピュータープログラムの例は、限定されないが、ＢＬＡＳＴプログラム一式、例えばＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ及びＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ及びＴＢＬＡＳＴＮが挙げられ、インターネット上で一般に利用可能である（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。また、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、他、１９９０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、他、１９９７を参照されたい。
【００３４】
配列サーチは所定の核酸配列をジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＤＮＡ配列及びその他の公のデータベース中の核酸配列と比較して評価する場合、通常、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行う。ＢＬＡＳＴＸプログラムはジェンバンクタンパク質配列及びその他の公のデータベース中のアミノ酸配列に対する全てのリーディングフレームにおいて翻訳された核酸配列のサーチに好ましい。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸは共に、オープンギャップペナルティが１１．０及び伸長ギャップペナルティが１．０の初期設定パラメーターを用いて行い、ＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックスを利用する（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、他、１９９７を参照）。
【００３５】
２つ以上の配列間の“％同一性”を測定するための選択配列の好ましい配置は例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒバージョン６．５のＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムで動作し、オープンギャップペナルティ１０．０、伸長ギャップペナルティ０．１及びＢＬＯＳＵＭ３０類似マトリックスなどの初期パラメーターを用いて操作する。
【００３６】
ここで用いる細胞に関する“形質転換”、“安定に形質転換された”または“トランスジェニック”の語は、細胞が、ゲノム内に統合された、または複数の世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして非天然（異種）核酸配列を有することを意味する。ここで用いる“発現”の語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成されるプロセスをいう。当該プロセスは転写及び翻訳の両方を含む。
【００３７】
細胞への核酸配列の挿入に関する“導入”の語は“トランスフェクション”または“形質転換”または“形質導入”を意味し、原核または真核細胞内への核酸配列の組込みに関する場合を含み、ここで核酸配列は細胞のゲノム内（例えば、染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれることができ、自己レプリコンに変換され、または一時的に発現される（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。
【００３８】
“ＣＢＨ１．１発現”の語は変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼ遺伝子の転写及び翻訳、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後処理ポリペプチドの生成物ということになる。例として、ＣＢＨ１．１発現の分析は、ＣＢＨ１．１タンパク質のウエスタンブロット、ＣＢＨ１ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析、及びＳｈｏｅｍａｋｅｒ Ｓ．Ｐ．及びＢｒｏｗｎ Ｒ．Ｄ．Ｊｒ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９７８，５２３：１３３−１４６）及びＳｃｈｕｌｅｉｎ（１９８８）に記載のエンドグルカナーゼ活性分析を含む。同様に、ここで用いる“ＣＢＨ１発現”はＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ遺伝子の転写及び翻訳、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後処理ポリペプチドの生成物をいう。
【００３９】
ここで用いる“界面活性剤”の語は、表面活性特性を有するものとして当業界で通常認識されている任意の化合物をいう。従って、例えば、界面活性剤は陰イオン性、陽イオン性及び非イオン性界面活性剤を含み、例えば洗剤において通常見られるものである。陰イオン性界面活性剤は、直鎖または分岐鎖アルキルベンゼンスルフォネート；直鎖または分岐鎖アルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまたはアルケニル硫酸塩；オレフィンスルフォネート；及びアルカンスルフォネートが挙げられる。両性界面活性剤は第４級アンモニウム塩スルフォネート及びベタイン型両性界面活性剤が挙げられる。当該両性界面活性剤は同じ分子内に正及び負電荷の両方の基を有する。非イオン性界面活性剤はポリオキシアルキレンエーテル及び高脂肪酸アルカノールアミドまたはその酸化アルキレン付加、脂肪酸グリセリンモノエステル等を含むことができる。
【００４０】
ここで用いる“セルロース含有繊維”の語は、セルロースを含有する綿または非綿、またはセルロースブレンド、例えば天然セルロース誘導体及び人工セルロース誘導体（例えば、ジュート（黄麻）、亜麻布、ラミー、レーヨン及びリヨセル）を含有する綿または非綿から作られた任意の織布または不織布、糸または繊維をいう。
【００４１】
ここで用いる、“綿含有繊維”の語は、純粋な綿または綿ブレンドから作られた織布または不織布、糸または繊維をいい、綿織物、綿ニット、綿デニム、綿糸、原綿等を含む。
【００４２】
ここで用いる、“ストーンウォッシュ組成物”の語は、セルロース含有繊維をストーンウォッシュする際に用いる製剤をいう。ストーンウォッシュ組成物は販売前、すなわち製造プロセス時にセルロース含有繊維を修正するために用いる。これに対し、洗剤組成物は汚れた衣類の洗浄を目的とするものであり、製造プロセス時には用いられない。
【００４３】
ここで用いる“洗剤組成物”の語は汚れたセルロース含有繊維を洗濯するための洗浄手段で用いることを意図した混合物をいう。本発明において、当該組成物はセルラーゼ及び界面活性剤に加えて、さらに加水分解酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、青味剤及び蛍光色素、ケーキング防止剤、マスキング剤、セルラーゼ活性化剤、酸化防止剤及び可溶化剤を含むことができる。
【００４４】
ここで用いる“ｃｂｈ１．１遺伝子発現の減少または除去”とは、ｃｂｈ１．１遺伝子がゲノムから欠失され、従って組換え宿主微生物により発現できないこと；またはｃｂｈ１．１遺伝子が修飾され、機能的ＣＢＨ１．１酵素が宿主微生物により生成されないことを意味する。
【００４５】
“変異ｃｂｈ１．１遺伝子”または“変異ＣＢＨ１．１”の語はそれぞれ、Ｈ．グリセア由来ｃｂｈ１．１遺伝子の核酸配列がコード配列を除去、付加及び／または操作することにより変異されたこと、または発現タンパク質のアミノ酸配列がここに記載の発明に一致するように修飾されたことを意味する。
【００４６】
“変異体ｃｂｈ１遺伝子”または“変異体ＣＢＨ１” の語はそれぞれ、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来ｃｂｈ１遺伝子の核酸配列がコード配列を除去、付加及び／または操作することにより変異されたこと、または発現タンパク質のアミノ酸配列がここに記載の発明に一致するように修飾されたことを意味する。
【００４７】
ここで用いる“活性”及び“生物活性”の語は、特定タンパク質に関する生物活性をいい、ここで交換可能に用いられる。例えばプロテアーゼに関する酵素活性はタンパク質分解性であり、従って、プロテアーゼはタンパク質分解活性を有する。従って、所定タンパク質の生物活性は通常、当業者とって当該タンパク質に起因する任意の生物活性をいうことになる。
【００４８】
酵素溶液中で用いる場合、相同体または変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１成分は通常、バイオマスからの可溶性糖の放出速度を最高にするために十分な量で加える。加える相同体または変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１成分の量は、糖化されるバイオマスの種類に依存し、当業者により容易に測定できる。しかしながら、使用時の、セルラーゼ組成物中に存在するＥＧ型成分と比較した、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１成分の重量％は、好ましくは約１、好ましくは約５、好ましくは約１０、好ましくは約１５、または好ましくは約２０重量％〜好ましくは約２５、好ましくは約３０、好ましくは約３５、好ましくは約４０、好ましくは約４５、または好ましくは約５０重量％である。さらに、好ましい範囲は約０．５〜約１５重量％、約０．５〜約２０重量％、約１〜約１０重量％、約１〜約１５重量％、約１〜約２０重量％、約１〜約２５重量％、約５〜約２０重量％、約５〜約２５重量％、約５〜約３０重量％、約５〜約３５重量％、約５〜約４０重量％、約５〜約４５重量％、約５〜約５０重量％、約１０〜約２０重量％、約１０〜約２５重量％、約１０〜約３０重量％、約１０〜約３５重量％、約１０〜約４０重量％、約１０〜約４５重量％、約１０〜約５０重量％、約１５〜約２０重量％、約１５〜約２５重量％、約１５〜約３０重量％、約１５〜約３５重量％、約１５〜約４０重量％、約１５〜約４５重量％、約１５〜約５０重量％である。
ＩＩ．宿主微生物
【００４９】
糸状菌は、細目の真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の全ての線状体を含む。糸状菌はキチン、グルカン、キトサン、マンナン及びその他の複合多糖類からなる細胞壁を有する栄養菌糸、及び菌糸伸長による栄養成長並びに偏性好気性の炭素異化を特徴とする。
【００５０】
本発明において、糸状菌親細胞は限定されないが、トリコデルマ、例えばトリコデルマ・ロンギブラチアタム、トリコデルマ・ビリディ、トリコデルマ・コニンギ、トリコデルマ・ハルジアナム；ペニシリン種；フミコーラ・インソレンス及びフミコーラｇｒｉｓｅａなどのフミコーラ種；Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅなどのクリソスポリウム種；グリオクラディウム種；アスペルギルス種；フサリウム種、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、ヒポクレア種及びエメリセラ種の一連の細胞である。ここで用いる“トリコデルマ”または“トリコデルマ種”の語は、既にトリコデルマとして分類されている、または最近トリコデルマとして分類された任意の真菌株をいう。
【００５１】
１の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞はアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ａｃｕｌｅａｔｕｓまたはアスペルギルス・ニデュランス細胞である。
他の好ましい実施態様において、糸状菌親細胞はトリコデルマ・リーゼイ細胞である。
ＩＩＩ．セルラーゼ
【００５２】
セルラーゼはセルロース（β−１，４−グルカンまたはβ−Ｄ−グルコシド結合）を加水分解してグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖などを生じる酵素として当業界に公知である。上述の通り、セルラーゼは従来から３つの主な分類に分けられる：エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）（“ＥＧ”）、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）（“ＣＢＨ”）及びβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）（“ＢＧ”）（Ｋｎｏｗｌｅｓ、他、１９８７；Ｓｃｈｕｌｅｉｎ、１９８８）。
【００５３】
特定の真菌は、エキソセロビオヒドロラーゼまたはＣＢＨ型セルラーゼ、エンドグルカナーゼまたはＥＧ型セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼまたはＢＧ型セルラーゼを含む完全なセルラーゼ系を生じる（Ｓｃｈｕｌｅｉｎ、１９８８）。しかしながら、これらの系はＣＢＨ型セルラーゼを欠く場合があり、また、細菌性セルラーゼは通常ＣＢＨ型セルラーゼを含まないか、またはほとんど含まない。さらに、ＥＧ成分及びＣＢＨ成分は相乗的に相互作用してより効果的にセルロースを分解することが示されている。例えば、Ｗｏｏｄ、１９８５を参照されたい。異なる成分、すなわち、複数成分または完全なセルラーゼ系中の種々のエンドグルカナーゼ及びエキソセロビオヒドロラーゼは通常、等電点、分子量、糖化度、基質特異性及び酵素作用パターンなど異なる性質を有する。
【００５４】
また、セルラーゼ組成物は綿含有織物を分解し、織物の強度を損なうことも示されており（米国特許第４，８２２，５１６号）、市販の洗剤用途にセルラーゼ組成物が用いにくい原因となっている。エンドグルカナーゼ成分を含むセルラーゼ組成物は完全なセルラーゼ系を含む組成物と比較して、綿含有織物の損失強度の減少を示すことが示唆されている。
【００５５】
また、セルラーゼはセルロースバイオマスからエタノールへの分解（ここでセルラーゼはセルロースをグルコースに分解し、酵母またはその他の微生物がさらにグルコースを発酵してエタノールになる）、機械パルプの処理（Ｐｅｒｅ、他、１９９６）、飼料添加物としての使用（ＷＯ９１／０４６７３）及び穀物湿式粉砕に有用であることが示されている。
【００５６】
ほとんどのＣＢＨ及びＥＧは、リンカーペプチドによりセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）から分離したコアドメインからなるマルチドメイン構造を有する（Ｓｕｕｒｎａｋｋｉ、他、２０００）。コアドメインは活性部位を含むのに対し、ＣＢＤは酵素をセルロースに結合させることによりセルロースと相互作用する（ｖａｎ Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ、他、１９８６；Ｔｏｍｍｅ、他、１９８８）。ＣＢＤは結晶セルロースの加水分解において特に重要である。結晶セルロースを分解するセロビオヒドロラーゼの能力はＣＢＤが不存在の場合には明確に減少することが示されている（Ｌｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｔｅｅｒｉ、１９９７）。しかしながら、ＣＢＤの正確な役割及び活性メカニズムは依然として推論のままである。ＣＢＤはセルロースの表面で効果的な酵素濃度を単に増加させることによって（Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ、他、１９９１）、及び／またはセルロース表面からセルロース一本鎖を解くことにより（Ｔｏｒｍｏ、他、１９９６）、酵素活性を高めることが示唆されている。異なる基質上のセルラーゼドメインの効果に関する研究の大部分はセロビオヒドロラーゼのコアタンパク質を用いて行われており、それらのコアタンパク質はパパインを用いた限定タンパク質分解により容易に生成できる（Ｔｏｍｍｅ、他、１９８８）。多数のセルラーゼが科学文献に記載されており、例として：トリコデルマ・リーゼイ由来：Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｓ、他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：６９１−６９６、１９８３（ＣＢＨＩについて記載）；Ｔｅｅｒｉ，Ｔ．他、Ｇｅｎｅ，５１：４３−５２、１９８７（ＣＢＨＩＩについて記載）が挙げられる。トリコデルマ以外の種由来のセルラーゼも例えば以下の文献に記載されている：Ｏｏｉ、他、１９９０（アスペルギルス・ａｃｕｌｅａｔｕｓにより生成されるエンドグルカナーゼＦ１−ＣＭＣをコードするｃＤＮＡ配列を記載）；Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｔ，他、１９９６（アスペルギルス・ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来β−グルコシダーゼ１をエンコードするｃＤＮＡのクローニング及びシーケンシングを開示）；Ｓａｋａｍｏｔｏ、他、１９９５（アスペルギルス・カワチＩＦＯ４３０８由来エンドグルカナーゼＣＭＣアーゼ１をエンコードするｃＤＮＡ配列を開示）；Ｓａａｒｉｌａｈｔｉ、他、１９９０（エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖａｒａ）由来エンドグルカナーゼを開示）；Ｓｐｉｌｌｉａｅｒｔ Ｒ．ｅｔ ａｌ．、１９９４（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ由来好熱性βグルカナーゼをコードする、ｂｇｌＡのクローニング及びシーケンシングを開示）；及びＨａｌｌｄｏｒｓｄｏｔｔｉｒ Ｓ、他、１９９８（グリコシル加水分解酵素群１２の熱安定性セルラーゼをエンコードするＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ遺伝子のクローニング、シーケンシング及び過剰発現を開示）。しかしながら、熱応力条件下、または界面活性剤の存在下での改善された特性、増加した特異活性、変異した基質開裂パターン、及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの高レベル発現など、改善された特性を有する新規なセルラーゼの同定及びキャラクタリゼーションの必要性が依然として存在する。
【００５７】
様々な量のＣＢＨ型セルラーゼを含む新規で改善されたセルラーゼ組成物の開発は以下の用途に注目されている：（１）洗浄能力の向上、柔軟剤としての機能及び／または綿織物の手触りの改善を示す洗剤組成物（例えば、“ストーンウォッシング”または“バイオポリッシング”）での使用；（２）木材パルプまたはその他のバイオマスを糖に分解する組成物での使用（例えば、バイオ−エタノール生成）；及び／または（３）飼料組成物での使用。
ＩＶ．分子生物学
【００５８】
１の実施態様において、本発明は糸状菌において機能的なプロモーターの制御下、変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１セルラーゼ遺伝子の発現を提供する。従って、本発明は組換え遺伝学の分野における一般的な技術に依拠する。本発明で使用する一般的な方法を開示する基本テキストは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（遺伝子導入及び発現）：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及びＡｕｓｕｂｅｌ、他、編集。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）が挙げられる。
Ａ．変異体ＣＢＨ１．１遺伝子の同定方法
【００５９】
２つの公に入手可能なＨ．グリセアＣＢＨ１．１核酸配列を図５に示す。１の側面において、本発明はここに記載の変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１をエンコードする核酸分子を包含する。核酸はＤＮＡ分子であってもよい。
【００６０】
変異体ＣＢＨ１．１−エンコードＤＮＡ配列を単離するために用いることができる技術は当業者に公知であり、限定されないが、相同ＤＮＡプローブを用いるｃＤＮＡ及び／またはゲノムライブラリースクリーニング及び活性分析またはＣＢＨ１に対する抗体を用いる発現スクリーニングを含む。これらのいずれの方法もＳａｍｂｒｏｏｋ、他、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ、他、編集、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）（“Ａｕｓｕｂｅｌ”）で見ることができる。
Ｂ．核酸構築体／発現ベクター
【００６１】
変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１セルラーゼをエンコードする天然または合成ポリヌクレオチド断片（“変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１セルラーゼ−エンコード核酸配列”）は異種核酸構築体またはベクター内に組込むことができ、糸状菌または酵母細菌内に導入でき、かつ複製できる。ここに開示するベクター及び方法は変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼを発現するための宿主細胞中で使用するのに適している。導入される細胞内で複製可能かつ生存可能である限り、任意のベクターが使用できる。多数の適当なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、市販されている。また、クローニング及び発現ベクターについてもここに明示的に引用するＳａｍｂｒｏｏｋ、他、１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ、他、１９８９及びＳｔｒａｔｈｅｒｎ、他、１９８１に記載されている。真菌に適切な発現ベクターはｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）：Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．及びＬａｓｕｒｅ，Ｌ．Ｌ．（編集）Ｍｏｒｅ
Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，第３９６〜４２８頁に記載されている。適当なＤＮＡ配列が種々の手順によりプラスミドまたはベクター（集合的にここで“ベクター”という）内に挿入できる。通常、ＤＮＡ配列は標準手順により、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。このような手順及び関連サブクローニング手順は当業者の知識の範囲内であると考えられる。
【００６２】
変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼのコード配列を含む組換え糸状菌は、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ−コード配列を含む異種核酸構築体を糸状菌の選択株細胞内に導入することにより生成できる。
【００６３】
所望の形態の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ核酸配列が得られると、それを種々の方法で修飾することができる。当該配列が非コードフランキング領域を含む場合、当該フランキング領域は切除、突然変異等に供することができる。従って、転移、塩基転換、欠失及び挿入を天然配列上で行うことができる。
【００６４】
選択した変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ−コード配列は公知の組換え技術に従って適切なベクター内に挿入でき、セルラーゼ発現が可能な糸状菌を形質転換するために用いることができる。遺伝コードの固有縮退のため、実質的に同じまたは機能的に同等なアミノ酸配列をエンコードするその他の核酸配列が変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ
ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをクローン及び発現するために用いることができる。そのため、コード領域内の当該置換は、本発明によりカバーされる配列変異体の範囲内に当然含まれる。
【００６５】
また、本発明は上述の１以上の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ−エンコード核酸配列を含む組換え核酸構築体を含むこともできる。当該構築体はプラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを含み、そこに本発明の配列がフォワードまたはリバース方向に挿入される。
【００６６】
異種核酸構築体は変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼのコード配列を含むことができ、それらは（ｉ）単離して（ｉｉ）融合タンパク質またはシグナルペプチドコード配列などの他のコード配列と組み合わせて（ここで所望のセルラーゼ−コード配列は優性コード配列）；（ｉｉｉ）イントロンなどの非コード配列、及び適当な宿主中でコード配列の発現に効果的な、プロモーター及びターミネーター因子または５’及び／または３’非翻訳領域など制御因子と組み合わせて；及び／または（ｉｖ）変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ−コード配列が異種遺伝子となるベクターまたは宿主環境において、含むことができる。
【００６７】
本発明の１の側面において、異種核酸構築体はｉｎ ｖｉｔｒｏで変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ−エンコード核酸配列を細胞内に移動させるために用いられ、確立された糸状菌及び酵母株が好ましい。変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼの長期間生成のために、安定な発現が好ましい。従って、安定な形質転換を生じるために効果的な任意の方法が本発明の実施に用いることができる。
【００６８】
適当なベクターは通常、選択マーカー−エンコード核酸配列、挿入部位及び適当な制御因子、例えばプロモーター及びターミネーター配列などを備える。当該ベクターは調節配列を含んでもよく、例えば、イントロンなどの非コード配列、及び制御因子、すなわち宿主細胞（及び／または修飾可溶性タンパク質抗原コード配列が通常は発現されないベクターまたは宿主細胞環境）内でコード配列の発現に効果的で、コード配列に動作可能に連結したプロモーター及びターミネーター因子または５’及び／または３’非翻訳領域を含むことができる。多数の適切なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、その多くが市販されており、及び／またはＳａｍｂｒｏｏｋ、他、（上記）に記載されている。典型的なプロモーターは保存プロモーター及び誘導性プロモーターの両方を含み、例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ｔｅｔ−ｏｎまたはｔｅｔ−ｏｆｆシステムにおいてｔｅｔ応答性因子（ＴＲＥ）を含むプロモーター（ＣｌｏｎＴｅｃｈ ａｎｄ ＢＡＳＦ）、β−アクチンプロモーター及び特定の金属塩の添加により非調節にできるメタロチオニンプロモーターが挙げられる。プロモーター配列は発現のために特定の糸状菌により認識されるＤＮＡ配列である。これは変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列に動作可能に連結する。当該連結は開示した発現ベクター中において変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列の開始コドンに関するプロモーターの位置決定を含む。プロモーター配列は、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１ポリペプチドの発現を媒介する転写及び翻訳制御配列を含む。例えば、アスペルギルス・ニガー、Ａ．アワモリまたはＡ．オリゼー・グルコアミラーゼ、α−アミラーゼまたはα−グルコシダーゼエンコード遺伝子；Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡまたはｔｒｐＣ遺伝子；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）ｃｂｈ１またはｔｒｐ１遺伝子；Ａ．ニガーまたはリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ−エンコード遺伝子；Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２またはその他のセルラーゼエンコード遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。
適当な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、種々の宿主の適当なマーカーは当業界に公知である。一般的な選択マーカー遺伝子はＡ．ニデュランスまたはＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来のａｒｇＢ、Ａ．ニデュランス由来のａｍｄＳ、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）またはＨ．ｊｏｃｏｒｉｎａ由来のｐｙｒ４、アスペルギルス・ニガーまたはＡ．ニデュランス由来のｐｙｒＧを含む。他の典型的な選択マーカーは、限定されないが、ｔｒｐｃ、ｔｒｐ１、ｏｌｉＣ３１、ｎｉａＤまたはｌｅｕ２が挙げられ、これらはｔｒｐ−、ｐｙｒ−、ｌｅｕ−等などの変異株を形質転換するために用いる異種核酸構築体に含まれる。
【００６９】
当該選択マーカーは形質転換体に、通常は糸状菌により代謝されない代謝産物を利用できる能力を与える。例えば、アセトアミダーゼ酵素をエンコードするＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ由来のａｍｄＳ遺伝子は、形質転換細胞が窒素源としてアセトアミド上で成長できるようにする。選択マーカー（例えば、ｐｙｒＧ）は栄養要求性変異株が選択最小培地上で成長する能力を回復させることができ、または選択マーカー（例えば、ｏｌｉｃ３１）は形質転換体に阻害薬または抗生物質の存在下で成長できる能力を与えることができる。
【００７０】
選択マーカーコード配列は当業界で用いられる一般的な方法を用いて適切なプラスミド内にクローンされる。典型的なプラスミドはｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＲＡＸ及びｐＵＣ１００が挙げられる。ｐＲＡＸプラスミドはＡ．ニデュランス由来のＡＭＡ１配列を含み、Ａ．ニガー中での複製を可能にする。
【００７１】
本発明の実施には他に指示がない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来技術を用い、当業者の技術の範囲内である。当該技術は文献中に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、他、１９８９；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７；Ａｕｓｕｂｅｌ、他、１９９３；及びＣｏｌｉｇａｎ、他、１９９１を参照されたい。ここで言及する全ての特許、特許出願、雑誌及び文献はここに明示的に引用される。
Ｃ．宿主細胞の形質転換方法
【００７２】
本発明において、糸状菌親細胞は、限定されないが、トリコデルマ、例えばトリコデルマ・ロンギブラチアタム（ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）（ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリディ、トリコデルマ・コニンギ、トリコデルマ・ハルジアナム；ペニシリン種；フミコーラ・インソレンスなどのフミコーラ種；Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅなどのクリソスポリウム種；グリオクラディウム種；アスペルギルス種；フサリウム種、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、ヒポクレア種及びエメリセラ種の細胞である。ここで用いる“トリコデルマ”または“トリコデルマ種”の語は、既にトリコデルマとして分類されている、または最近トリコデルマとして分類された任意の真菌株をいう。
【００７３】
変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１発現のために処理及び／または修飾できる親細胞株の例として、限定されないが、糸状菌細胞を含む。本発明の実施に用いる適当な主要な細胞種の例として、限定されないが、アスペルギルス及びトリコデルマが挙げられる。
【００７４】
１の実施態様において、糸状菌親細胞はアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ａｃｕｌｅａｔｕｓまたはアスペルギルス・ニデュランス細胞である。
【００７５】
第２の実施態様において、糸状菌親細胞はヒポクレア・ｊｅｃｏｒｉｎａ細胞である。この細胞はＴ．リーゼイとして前述した。
【００７６】
ＣＢＨ１．１変異体、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１をエンコードするＤＮＡ配列をＤＮＡ構築体内にクローンした後、当該ＤＮＡは微生物を形質転換するために用いる。変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１を本発明に従って発現する目的で形質転換される微生物はトリコデルマ種由来の株を含むことが有利である。従って、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼを本発明に従って調製する好ましい方法は、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１の一部または全部をエンコードするＤＮＡ断片を少なくとも含むＤＮＡ構築体を用いてトリコデルマ種宿主細胞を形質転換することを含む。当該ＤＮＡ構築体は通常、機能的に、すなわち動作可能にプロモーターに結合する。当該形質転換宿主細胞はそれから変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１を発現する条件下で成長させる。続いて、変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１を単離できる。実質的に純粋な形態で変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１を得ることが望ましい。同様に、本質的に純粋な形態で変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１を得ることが望ましい。
【００７７】
しかしながら、実際に、変異ＣＢＨ１．１をエンコードする所定ＤＮＡの最良の発現媒体がＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ（すなわち、Ｔ．リーゼイ）ではない場合も考えられる。従って、変異体ＣＢＨ１．１の微生物源と系統発生類似性を有する形質転換宿主で当該タンパク質を発現することが最も有利かもしれない。他の実施態様において、アスペルギルス・ニガーを発現媒体として用いることができる。Ａ．ニガーを用いる形質転換技術の記載に関しては、ここに開示の内容を引用するＷＯ９８／３１８２１を参照されたい。
【００７８】
従って、トリコデルマ種発現系の本発明の記載は説明目的のみのため提供するものであり、本発明の変異体ＣＢＨ１．１を発現する１の選択肢として提供するものである。しかしながら、当業者は適切な場合に種々の宿主細胞中で変異体ＣＢＨ１．１をエンコードするＤＮＡを発現させるものであると考えられ、最適な発現宿主を決定する際に変異体ＣＢＨ１．１の供給源を考慮すべきであることは当然である。さらに、本発明の分野の当業者は、当業界で利用可能な手段を利用して一般的な技術により特定遺伝子のために最良な発現系を選択することができる。
Ｄ．変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１の発現方法
【００７９】
本発明の方法は変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼを発現するために使用する細胞に依拠し、特定の発現方法を必要とするものではない。
【００８０】
本発明は、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いて変換、形質転換または核酸導入される宿主細胞を提供する。温度、ｐＨ等の培養条件は変換、形質転換または核酸導入前に親宿主細胞に既に用いた条件であり、当業者に明らかである。
【００８１】
１の手段において、糸状菌細胞または酵母細胞に、宿主細胞株で機能し、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ
ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードするＤＮＡ断片に動作可能に連結する、プロモーターまたは生物学的に活性なプロモーター断片または１以上の（例えば、一連の）エンハンサーを有する発現ベクターを用いて核酸導入し、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼが細胞株内で発現する。
【００８２】
従って、本発明は、対応する非形質転換親真菌と比較して変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ生成または発現を生じるために効果的な方法で修飾、選択及び培養された細胞を含む糸状菌を提供する。
【００８３】
所望のセルラーゼ発現のために処理及び／または修飾できる親糸状菌の種の例としては、限定されないが、トリコデルマ、ペニシリン種、フミコーラ種、例えばフミコーラ・インソレンス；アスペルギルス種、例えばアスペルギルス・ニガー、クリソスポリウム種、フサリウム種、ヒポクレア種及びエメリセラ種が挙げられる。
【００８４】
変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼを発現する細胞は通常、親真菌株を培養するために用いる条件下で培養する。一般的に、細胞はＰｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、編集、Ａｕｂｅｒｔ，Ｊ．Ｐ．他、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、第７７〜８６頁、１９８８及びＩｌｍｅｎ，Ｍ．他、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８−１３０６、１９９７に記載されるような生理食塩及び栄養物を含む標準培地内で培養する。また、培養条件も標準であり、例えば培養物は２８℃、振とう培養または発酵槽中で、所望レベルの変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼ発現が達成されるまで培養する。
【００８５】
所定の糸状菌の好ましい培養条件は科学文献及び／またはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；<www.atcc.org>）などの真菌源から見つけることができる。真菌成長の達成後、当該細胞は変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼの発現を生じるまたは可能にするために効果的な条件に曝す。
【００８６】
変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ−コード配列が誘導プロモーターの制御下にある場合、例えば糖、金属塩または抗生物質などの誘発剤を変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ発現を誘導するために有効な濃度で培地に加える。
【００８７】
１の実施態様において、株はアスペルギルス・ニガーを含み、当該株は過剰発現タンパク質を得るために有用な株である。例えば、Ａ．ニガー ｖａｒ アワモリ ｄｇｒ２４６は高められた量の分泌セルラーゼを分泌することが公知である（Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ、他、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ（２００２）４１：８９−９８）。ＧＣＤＡＰ３、ＧＣＤＡＰ４及びＧＡＰ３−４などのアスペルギルス・ニガー ｖａｒ アワモリのその他の株は公知である（Ｗａｒｄ，Ｍ，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．及びＫｏｄａｍａ，Ｋ．Ｈ．，１９９３，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８−７４３）。
【００８８】
他の実施態様において、株はトリコデルマ・リーゼイを含み、当該株は過剰発現タンパク質を得るために有用な株である。例えば、ＲＬ−Ｐ３７はＳｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ、他、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６−５３（１９８４）に記載されており、高められた量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られる。ＲＬ−Ｐ３７の機能的同等物としては、トリコデルマ・リーゼイ株ＲＵＴ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ番号５６７６５）及び株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ番号２６９２１）を含む。これらの株は変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１を過剰発現するのにも有用である。
【００８９】
潜在的に有害な天然セルロース分解活性がない所望のセルラーゼを得ることが望ましい場合、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ構築体またはプラスミドの導入前に、１以上の欠失したセルラーゼ遺伝子を持った宿主細胞株を得ることは有用である。このような株は、ここに開示の内容を引用する米国特許第５，２４６，８５３号及びＷＯ９２／０６２０９に開示の方法により調製できる。１以上のセルラーゼ遺伝子が欠落した宿主微生物中で変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼを発現することにより、同定及び次の精製手順が簡略化される。クローンしたトリコデルマ種由来のいかなる遺伝子も欠失することができ、例えば、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１及びｅｇｌ２遺伝子並びに変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１タンパク質をエンコードする遺伝子である（例えば、それぞれ米国特許第５，４７５，１０１号及びＷＯ９４／２８１１７を参照）。
【００９０】
遺伝子欠失は欠失または分離される所望の遺伝子形態を当業界に公知の方法によりプラスミド内に挿入することにより達成できる。次に、欠失プラスミドは所望の遺伝子コード領域及び遺伝子コード配列または選択マーカーで置換された当該配列の一部の内部にある適当な制限酵素部位で切断される。欠失または分離される遺伝子座由来のフランキングＤＮＡ配列は、好ましくは約０．５〜２．０ｋｂであり、両側の選択マーカー遺伝子を保持する。適当な欠失プラスミドは一般に、固有の制限酵素部位を有し、当該断片が欠失遺伝子を含み、フランキングＤＮＡ配列を含むことを可能にし、選択マーカー遺伝子が一本の線状片として除去される。
【００９１】
選択マーカーは形質転換微生物の検出が可能となるように選択しなければならない。選択した微生物中で発現する選択マーカー遺伝子は適している。例えば、アスペルギルス種を用いて選択マーカーを選択すると、形質転換体中の選択マーカーの存在はその特性に大きな影響を与えない。このような選択マーカーは分析可能な生成物をエンコードする遺伝子であると考えられる。例えば、アスペルギルス種遺伝子の機能的コピーは、宿主株中の欠失により栄養要求性表現型を示す宿主株を生じる場合、使用できる。
【００９２】
１の実施態様において、アスペルギルス種のｐｙｒＧ−誘導体株は機能的ｐｙｒＧ遺伝子を用いて形質転換し、従って、形質転換のための選択マーカーを提供する。ｐｙｒＧ−誘導体株はフルオロオロト酸（ＦＯＡ）に耐性のアスペルギルス種株を選択することにより得ることができる。ｐｙｒＧ遺伝子は、ウリジンの生合成に必要な酵素である、オロチジン−５’−モノリン酸デカルボキシラーゼをエンコードする。原型のｐｙｒＧ遺伝子を含む株はウリジン不足の培地中で成長するが、フルオロオロト酸に感受性である。機能的オロチジンモノリン酸デカルボキシラーゼ酵素を欠いており、ＦＯＲ耐性選択により成長のためにウリジンを必要とするｐｙｒＧ−誘導体株の選択が可能である。ＦＯＡ選択技術を用いて、機能的オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼが不足したウリジン要求性株を得ることも可能である。これらの細胞をこの酵素をエンコードする遺伝子の機能的コピーを用いて形質転換することが可能である（Ｂｅｒｇｅｓ＆Ｂａｒｒｅａｕ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３５９−３６５（１９９１）、及びｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔｅ、他（１９８６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｙｒＧ ｇｅｎｅ（ｐｙｒＧ遺伝子に基づくアスペルギルス・ニガーの相同形質転換系の進展）．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６：７１−７５）。誘導体株の選択は、上述のＦＯＡ耐性技術を用いて容易に行われ、従って、ｐｙｒＧ遺伝子は選択マーカーとして用いるのが好ましい。他の実施態様において、トリコデルマ種のｐｙｒ４−誘導体株を機能的ｐｙｒ４遺伝子を用いて形質転換し、それにより形質転換に用いる選択マーカーが提供される。以下はアスペルギルス系について論じるが、トリコデルマ及びその他の真菌系のため類似の手順が当業者により適切に用いられることができる。
【００９３】
１以上のセルラーゼ遺伝子の発現能力が欠落するようにｐｙｒＧ−アルペルギルス種を形質転換するために、分離または欠失したセルラーゼ遺伝子を含む一本鎖ＤＮＡ断片をそれから欠失プラスミドから単離し、適当なｐｙｒ−アスペルギルス宿主を形質転換するために用いる。次に、形質転換体はｐｙｒＧ遺伝子生成物を発現するそれらの能力に基づいて同定及び選択され、従って宿主株のウリジン栄養要求性を補う。サザンブロット分析を次に得られた形質転換体について行い、欠失する遺伝子のゲノムコピーのコード領域の一部または全部をｐｙｒ４選択マーカーで置換するダブルクロスオーバー融合イベントを同定及び確認する。
【００９４】
上述の特定プラスミドベクターはｐｙｒ−形質転換体の調製に関連するが、本発明はこれらのベクターに限定されない。種々の遺伝子がアスペルギルス種株内で上述の技術を用いて欠失及び置換できる。さらに、上述の通り、任意の入手可能な選択マーカーが使用できる。実際、クローンされ、そして同定された任意のアスペルギルス種遺伝子が上述の方法を用いてゲノムから欠失できる。
【００９５】
上述の通り、使用する宿主株は、選んだ選択マーカーに対応する非機能的遺伝子を欠く、または有するアスペルギルス種の誘導体である。例えば、ｐｙｒGの選択マーカーを選択した場合、それから形質転換手順において特定のｐｙｒＧ−誘導体株を受容体として用いる。同様に、アスペルギルス・ニデュランス遺伝子ａｍｄＤ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤに同等なアスペルギルス種遺伝子を含む選択マーカーが用いることができる。対応する受容体株は従って、それぞれａｒｇＢ−、ｔｒｐＣ−、ｎｉａＤ−などの誘導体株でなければならない。
【００９６】
変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼをエンコードするＤＮＡは次に、適当な微生物内に挿入するために調製する。本発明に従うと、変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼをエンコードするＤＮＡは機能的セルロース分解活性を有するタンパク質をエンコードするために必要なＤＮＡを含む。変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードするＤＮＡ断片は真菌プロモーター配列、例えばｇｌａＡ遺伝子のプロモーターに機能的に接合できる。
【００９７】
２以上の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードするＤＮＡのコピーが過剰発現を促進するために株内に組換えできることも本発明の範囲内である。変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードするＤＮＡは当該セルラーゼをエンコードするＤＮＡを運ぶ発現ベクターを構築することにより調製できる。変異体ＣＢＨ１．１セルラーゼをエンコードする挿入ＤＮＡ断片を運ぶ発現ベクターは所定の宿主微生物中で独立して複製できる、または宿主、一般的にはプラスミドのＤＮＡ内に統合できるベクターである。好ましい実施態様において、遺伝子発現が得られる２種の発現ベクターが考えられる。１つは、プロモーター、遺伝子コード領域、及びターミネーター配列の全てが発現する遺伝子由来であるＤＮＡ配列を含む。遺伝子切断は、自身の転写及び翻訳調節配列の制御下で発現されるドメインを残すために、望ましくないＤＮＡ配列（例えば、望ましくないドメインをコードする）を欠失することが望ましい場合に行うことができる。選択マーカーはベクター上に含むこともでき、宿主内に新規な遺伝子配列の複数コピーを統合するための選択が可能になる。
【００９８】
２つ目の発現ベクターはあらかじめ組立てられ、高レベル転写に必要な配列及び選択マーカーを含む。遺伝子またはその一部のコード領域はこの汎用性発現ベクター内に挿入できると考えられ、従って、発現カセットプロモーター及びターミネーター配列の転写制御下にある。例えば、ｐＲＡＸはそのような汎用性発現ベクターである。遺伝子またはその一部は強力なｇｌａＡプロモーターの下流に挿入できる。
【００９９】
ベクター中、本発明の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードするＤＮＡ配列は転写及び翻訳配列、すなわち、リーディングフレームから構造遺伝子中の適当なプロモーター配列及びシグナル配列に動作可能に連結するべきである。プロモーターは宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり、宿主細胞と同種または異種のタンパク質をエンコードする遺伝子由来である。任意のシグナルペプチドは変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼの細胞外生成を提供する。シグナル配列をエンコードするＤＮＡは発現する遺伝子に天然で関連していることが好ましいが、任意の適当な供給源由来のシグナル配列が本発明で使用できる。
【０１００】
本発明の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをコードするＤＮＡ配列とプロモーターを適当なベクター内に融合するために用いる手順は当業界に公知である。
【０１０１】
発現ベクター、ＤＮＡベクターまたは上述の構築体をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞内に運ぶために種々の方法を用いることができる。異種核酸配列を発現するために核酸を細胞内に導入する方法は当業者に公知であり、限定されないが、エレクトロポレーション；核マイクロインジェクションまたは１の細胞内への直接マイクロインジェクション；無傷細胞を用いる細菌原形質融合；ポリカチオンの使用、例えば、ポリブレンまたはポリオルニチン；リポソーム、リポフェクトアミンまたはリポフェクション媒介トランスフェクションを用いる膜融合；ＤＮＡコートマイクロプロジェクタイルを用いる高速照射；リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿を用いる培養；ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション；変異ウイルス核酸を用いる感染；ＤＮＡのアグロバクテリウム媒介移動等が挙げられる。さらに、変異体ＣＢＨ１．１−エンコード核酸配列を含む異種核酸構築体はｉｎ ｖｉｔｒｏで転写でき、得られたＲＮＡを公知の方法、例えばインジェクションにより宿主細胞内に導入できる。
【０１０２】
形質転換のためにアスペルギルス種を調製する本発明の好ましい方法は、真菌の菌糸体由来の原形質体の調製を含む。Ｃａｍｐｂｅｌｌ、他、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ａ．ｎｅｇｅｒ ｕｓｉｎｇ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｎｉａＤ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（硝酸還元酵素の相同体ｎｉａＤ遺伝子を用いたＡ．ニガーの改善された形質転換効率）．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６；１９８９を参照されたい。菌糸体は発芽植物性胞子から得ることができる。菌糸体は細胞壁を消化して原形質体を生じる酵素で処理する。原形質体は次に懸濁培地中、浸透圧安定化剤の存在により保護される。これらの安定化剤はソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含む。通常、これら安定化剤の濃度は０．８Ｍ〜１．２Ｍ間で様々である。懸濁培地中、約１．２Ｍのソルビトール溶液を用いることが好ましい。
【０１０３】
ＤＮＡの宿主アスペルギルス種株内への摂取はカルシウムイオン濃度に依存する。通常、約１０ｍＭのＣａＣｌ２及び５０ｍＭのＣａＣｌ２が摂取溶液内で用いられる。摂取溶液中でカルシウムイオンが必要であることに加え、通常含まれるその他の品目は緩衝系、例えばＴＥバッファ（１０Ｍｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４；１ｍＭ ＥＤＴＡ）または１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ６．０バッファ（モルホリンプロパンスルホン酸）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは細胞膜の融合に作用すると考えられており、従って培地の内容物がアスペルギルス種株の細胞質内に運ばれ、プラスミドＤＮＡが核に移動する。この融合により、宿主染色体内に穏やかに統合されるプラスミドＤＮＡの複数コピーが残ることが多い。
【０１０４】
通常、アスペルギルス種原形質体または細胞を含む、密度１０５〜１０６／ｍＬ、好ましくは２×１０５／ｍＬで浸透圧処理に供した懸濁液を形質転換に使用する。適当な溶液中（例えば、１．２Ｍソルビトール；５０ｍＭ ＣａＣｌ２）の１００μＬの量のこれら原形質体または細胞は所望のＤＮＡと混合する。通常、高濃度のＰＥＧを摂取溶液に加える。０．１〜１の量（ｖｏｌｕｍｅ）の２５％ ＰＥＧ ４０００は原形質体の懸濁液に加えることができる。しかしながら、約０．２５の量（ｖｏｌｕｍｅ）を原形質体の懸濁液に加えることが好ましい。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等の添加剤も摂取溶液に加えてもよく、形質転換を助ける。類似の手順がその他の真菌宿主細胞に用いることができる。例えば、その内容をここに引用する米国特許第６，２６８，３２８号を参照されたい。
【０１０５】
通常、混合物はそれから約０℃で１０〜３０分間培養する。追加のＰＥＧをそれから混合物に加え、所望の遺伝子またはＤＮＡ配列の摂取をさらに高める。２５％ ＰＥＧ ４０００は通常、形質転換混合物の体積の５〜１５倍の体積で加えるが、それより大きい体積または小さい体積も適している。２５％ ＰＥＧ ４０００は好ましくは形質転換混合物の体積の約１０倍である。ＰＥＧを加えた後、形質転換混合物をそれから室温または氷上で、ソルビトール及びＣａＣｌ２溶液を添加する前に培養する。原形質体懸濁液をそれからさらに成長培地の融解アリコートに加える。この成長培地により形質転換だけの成長が可能になる。所望の形質転換の成長に適した任意の成長培地が本発明で使用できる。しかしながら、Ｐｙｒ＋形質転換を選択した場合、ウリジンを含まない成長培地を使用することが好ましい。その結果生じたコロニーをウリジンを使い尽くした成長培地上で移動及び精製する。
【０１０６】
この段階で、速い成長速度及びウリジンが欠落した固体培養基上の不規則な外形よりもむしろ、順調な環状コロニーの形成により安定な形質転換が不安定な形質転換と区別できる。さらに、場合によっては安定性のさらなる試験を、固体非選択性培地（すなわち、ウリジンを含む）上の形質転換体を成長させる、この培養基から胞子を収集し、及び次にウリジンが欠落した選択培地上で発芽及び成長するこれらの胞子のパーセンテージを測定することにより、行うことができる。もしくは、形質転換体を選択するために当業界に公知のその他の方法を用いることができる。
【０１０７】
上記方法の特定の実施態様において、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼは液体培地中で成長後、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼの適当な翻訳後処理の結果として、宿主細胞から活性体で回収される。
Ｅ．ＣＢＨ１核酸コード配列及び／またはタンパク質発現の分析方法
【０１０８】
変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ−エンコード核酸構築体を用いて形質転換した細胞株により変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ発現を評価するために、タンパク質レベル、ＲＮＡレベルで分析を行うことができ、または特にグルコシダーゼ活性及び／または生成に対する機能的バイオアッセイを使用することにより分析を行うことができる。
【０１０９】
ここに記載の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ核酸及びタンパク質配列の１の典型的な用途において、糸状菌、例えばトリコデルマ・リーゼイの遺伝子組換え株は増加した量の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼを生成するように設計できる。このような遺伝子組換え糸状菌はセルロース分解能が大きく増加したセルラーゼ生成物を生成するのに有用である。１の手段においてこれは、適当な宿主、例えばアスペルギルス・ニガーなどの糸状菌内に変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをコードする配列を導入することにより達成される。
【０１１０】
従って、本発明は糸状菌またはその他の適当な宿主の細胞内に変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼをエンコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを導入することにより糸状菌またはその他の適当な宿主内で変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼを発現するための方法を含む。
【０１１１】
他の側面において、本発明は糸状菌またはその他の適当な宿主内での変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ発現を修飾するための方法を含む。当該修飾は内生ＣＢＨの発現の減少または除去を含む。
【０１１２】
通常、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ発現を分析するために用いる分析は、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、または適当な標識プローブ（核酸コード配列に基づく）を用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び従来のサザンブロッティング及びオートラジオグラフィーが挙げられる。
【０１１３】
さらに、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼの生成及び／または発現はサンプル内で直接測定でき、例えばセロビオヒドロラーゼ活性、発現及び／または生成の分析により測定できる。当該分析は例えば、それぞれここに明示的に引用するＢｅｃｋｅｒ，他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２００１）３５６：１９−３０及びＭｉｔｓｕｉｓｈｉ、他、ＦＥＢＳ（１９９０）２７５：１３５−１３８に記載されている。ＣＢＨ１の単離可溶性及び不溶性基質を加水分解する能力はＳｒｉｓｏｄｓｕｋ、他、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９７）５７：４９−５７及びＮｉｄｅｔｚｋｙ及びＣｌａｅｙｓｓｅｎｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９４）４４：９６１−９６６に記載の分析を用いて測定できる。セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼまたはβ−グルコシダーゼ活性を分析するために有用な基質は結晶性セルロース、ろ紙、リン酸膨潤セルロース、セロオリゴ糖、メチルウンベリフェリル・ラクトシド、メチルウンベリフェリル・セロビオシド、オルトニトロフェニル・ラクトシド、パラニトロフェニル・ラクトシド、オルトニトロフェニル・セロビオシド、パラニトロフェニル・セロビオシドが挙げられる。
【０１１４】
さらに、タンパク質発現は、細胞、組織切片の免疫組織化学的染色または組織培養基の免疫学的分析など免疫学的方法、例えばウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより評価できる。当該免疫分析は変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ発現を定性的及び定量的に評価するために用いることができる。当該方法の詳細は当業者に公知であり、当該方法を実施するための多くの試薬が市販されている。
【０１１５】
変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼの精製体は種々の免疫分析に用いるために発現タンパク質に特異なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を生成するために用いることができる（例えば、Ｈｕ、他、１９９１を参照）。典型的な分析はＥＬＩＳＡ、競合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、間接免疫蛍光試験などが挙げられる。通常、市販の抗体及び／またはキットはセロビオヒドロラーゼタンパク質発現レベルの定量免疫分析に用いることができる。
Ｆ．ＣＢＨ１の精製方法
【０１１６】
通常、細胞培養基内で生成した変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質は培養基内に分泌され、例えば細胞培養基から不要な成分を除去することにより精製または単離できる。しかしながら、場合によっては、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質は細胞溶解物から回収が必要な細胞型で生成できる。その場合、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質を細胞から精製し、当業者により通常用いられる技術を用いて生成した。例としては限定されないが、アフィニティクロマトグラフィー（Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ、他、１９８４）、イオン交換クロマトグラフィー法（Ｇｏｙａｌ、他、１９９１；Ｆｌｉｅｓｓ、他、１９８３；Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ、他、１９８４；Ｅｌｌｏｕｚ、他、１９８７）、例えば高い分解力を有する物質を用いたイオン交換（Ｍｅｄｖｅ、他、１９９８）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｔｏｍａｚ ａｎｄ Ｑｕｅｉｒｏｚ、１９９９）及び２相分離（Ｂｒｕｍｂａｕｅｒ、他、１９９９）が挙げられる。
【０１１７】
通常、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質は、特定の結合剤（例えば抗体または受容体）への結合親和性、または選択分子量範囲または等電点範囲を有するなどの選択特性を有するタンパク質を分離するために分画する。
【０１１８】
所定の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質発現が達成されると、生成した変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質を細胞または細胞培養基から精製する。このような精製に適した典型的な手順は以下を含む：抗体親和性カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥなどカチオン交換樹脂によるクロマトグラフィー；クロマト分画；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；及び例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いるゲルろ過。種々のタンパク質精製方法が用いることができ、当該方法は当業者に公知であり、例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，１９９０；Ｓｃｏｐｅｓ，１９８２に記載されている。選択する精製工程は例えば、用いる生成工程の性質及び生成される特定タンパク質に依存する。
Ｖ．ｃｂｈ１及びＣＢＨ１の活用
【０１１９】
当然のことながら、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ核酸、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質及び変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼタンパク質活性を含む組成物は多種多様な用途で用いることができ、そのいくつかを下記に説明する。
【０１２０】
様々な量で変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼを含む新規で改善されたセルラーゼ組成物は高い洗浄能を示し、柔軟剤として作用し、及び／または綿織物の手触りを改善させる（例えば、“ストーンウォッシング”または“バイオポリッシング”）洗剤組成物、木材パルプを糖に分解する組成物（例えば、バイオ−エタノール生成）及び／または飼料組成物に用いることができる。各タイプのセルラーゼの単離及びキャラクタリゼーションにより当該組成物の特徴を制御する能力が提供される。
【０１２１】
減少した熱安定性を有する変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼは、例えば、存在すると考えられるその他の酵素に影響しないように酵素活性を低温で中和する必要がある場合に有用である。さらに、当該酵素はセルロース誘導体の限られた変換に有用であり、例えば結晶度またはセルロース誘導体の鎖長を制御するのに有用である。所望の変換範囲に達した後、糖化温度は不安定化されたＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１の生存温度以上に挙げることができる。ＣＢＨ１活性は結晶セルロースの加水分解に不可欠であるので、結晶セルロースの変換は高温で停止する。
【０１２２】
１の手段において、本発明の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼは洗剤組成物または手触り及び外観を改善するための織物処理に使用できる。
【０１２３】
セルロース誘導体生成物の加水分解速度は、複製可能プラスミドとして、またはゲノム内への挿入として少なくとも１の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼ遺伝子のさらなるコピーを有する形質転換体を用いて増加させることができるので、セルロースまたはヘテログリカンを含む生成物がより速い速度でより大量に分解できる。紙、綿、セルロース系オムツ等のセルロースから作られる生成物は埋立て処理地においてより効果的に分解できる。従って、当該形質転換から得られる発酵生成物または形質転換自体は組成物中に使用でき、満杯の埋立て処理地にある多種多様のセルロース生成物を液化することにより分解を助けることができる。
【０１２４】
分離した糖化及び発酵は、バイオマス、例えば伐採残（コーンストーバー）中に存在するセルロースをグルコースに変換し、続いて酵母株がグルコースをエタノールに変換する方法である。同時糖化及び発酵は、バイオマス、例えば伐採残（コーンストーバー）中に存在するセルロースをグルコースに変換し、同時に同じ反応器内で酵母株がグルコースをエタノールに変換する方法である。従って、他の手段において、本発明の所望のセルラーゼはバイオマスからエタノールへの分解に利用できる。容易に入手可能なセルロース源からのエタノール生成は安定で再生可能な燃料源を提供する。
【０１２５】
セルロースベース供給原料は農業廃棄物、草及び木材及びその他の低価値バイオマス、例えば都市ゴミ（例えば、再生紙、庭伐採ゴミ（ｙａｒｄ ｃｌｉｐｐｉｎｇｓ）等）からなる。エタノールは任意のこれらセルロース系供給原料の発酵から生成できる。しかしながら、セルロースは、エタノール変換の前にまず糖に変換されなければならない。従って、ここに記載のＣＢＨ１セルラーゼはバイオマスから糖への変換に有用である。
【０１２６】
多種多様の供給原料が本発明の変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼと用いることができ、使用する種類の選択は変換が行われる地域に依存する。例えば、アメリカ中西部では麦かん、伐採残（コーンストーバー）及びバガスなどの農業廃棄物が主流であり、一方、カリフォルニアでは稲わらが主流である。しかしながら、当然のことながらいかなる入手可能なセルロース系バイオマスも任意の地域で使用できる。
【０１２７】
増加した量でセロビオヒドロラーゼを含むセルラーゼ組成物はエタノール生成に利用することができる。この方法から得たエタノールはさらにオクタンエンハンサーとして用いることができ、またはガソリンの代わりに直接燃料として用いることができ、燃料源としてのエタノールは石油由来生成物よりもより環境に優しいので有用である。エタノールの使用は大気環境を改善し、局所オゾンレベル及びスモッグを減少させる可能性があることが知られている。さらに、ガソリンの代わりにエタノールを利用することは非再生エネルギー及び石油化学供給の突然移行の影響を緩衝するために戦略的に重要である。
【０１２８】
エタノールは糖化及び発酵プロセスにより木、葉状植物、都市固体ゴミ及び農業及び林業残留物などのセルロース系バイオマスから生成できる。しかしながら、微生物により生成される天然セロビオヒドロラーゼ混合物内の個々のセルラーゼ酵素の比率は、バイオマスからグルコースへのセルロース変換を速く行うために最も効果的な比率ではない。エンドグルカナーゼは新しいセルロース鎖末端の生成に作用し、それ自身はセロビオヒドロラーゼ活性の基質であり、それによってセルラーゼ系全体の加水分解効率が改善することが知られている。従って、増加した、または最適化されたセロビオヒドロラーゼ活性を使用してエタノール生成を大きく高めることができる。
【０１２９】
従って、本発明のセロビオヒドロラーゼはセルロースをその糖成分に加水分解する際に使用できる。１の実施態様において、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼは発酵生物添加前にバイオマスに添加する。第２の実施態様において、変異体ＣＢＨ１．１、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１セルラーゼは発酵生物と同時にバイオマスに添加する。任意で、いずれの実施態様もその他のセルラーゼ成分が存在できる。高められたセルロース変換はここに記載のＣＢＨ１ポリペプチドを用いて高温で達成できる。
【０１３０】
他の実施態様において、セルロース系供給原料を前処理することができる。前処理は高温及び希酸、濃酸または希アルカリ溶液を添加することによる。前処理溶液はヘミセルロース成分を少なくとも部分的に加水分解するのに十分な時間で加え、それから中和する。
【０１３１】
本発明の洗剤組成物はセルラーゼ組成物に加えて（セロビオヒドロラーゼ含量に関係なく、すなわち、セロビオヒドロラーゼを含まない、実質的に含まないまたは増加した量のセロビオヒドロラーゼ）、界面活性剤、例えば陰イオン性、非イオン性及び両性イオン性界面活性剤、ヒドロラーゼ、ビルディング剤、漂白剤、青味剤及び蛍光剤、ケーキング防止剤、可溶化剤、カチオン性界面活性剤等を用いることができる。これら全ての成分は洗剤業界に公知である。上述のセルラーゼ組成物は、希釈液、顆粒、エマルジョン、ゲル、ペースト等の洗剤組成物に加えることができる。当該形態は当業者に公知である。固形洗剤組成物を用いる場合、セルラーゼ組成物は顆粒として処方するのが好ましい。好ましくは、顆粒はセルラーゼ保護剤を含むように処方される。さらに詳細な議論については、ここに引用する米国特許第６，１６２，７８２号、表題“Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ＣＢＨ Ｉ ｔｙｐｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（ＣＢＨ
Ｉ型成分が欠損したセルラーゼ組成物を含有する洗浄剤組成物）”を参照されたい。
【０１３２】
好ましくは、セルラーゼ組成物は洗剤組成物全体に関して約０．００００５重量％〜約５重量％で用いる。より好ましくは、セルラーゼ組成物は洗剤組成物全体に関して約０．０００２重量％〜約２重量％を用いる。
【０１３３】
さらに、所望のセルラーゼ核酸配列は関連核酸配列の同定及びキャラクタリゼーションに使用できる。関連遺伝子または遺伝子産物の機能の測定（予測または確認）に有用な多数の技術は、限定されないが、以下を含む、（Ａ）ＤＮＡ／ＲＮＡ分析、例えば（１）過剰発現、異所性発現及びその他の種における発現；（２）遺伝子ノックアウト（逆遺伝学、標的ノックアウト、ウイルスによる遺伝子抑制（ＶＩＧＳ、Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、１９９９を参照）；（３）遺伝子、特にフランキング調節領域のメチル化状態の分析；及び（４）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション；（Ｂ）遺伝子産物分析、例えば（１）組換えタンパク質発現；（２）抗血清生成、（３）免疫学的局在決定；（４）触媒的またはその他の活性の生化学分析；（５）リン酸化反応状態；及び（６）酵母２ハイブリッド分析によるその他のタンパク質との相互作用；（Ｃ）経路分析、例えば、過剰発現表現型に基づいた、または関連遺伝子との配列相同性による、特定生化学またはシグナリング経路内の遺伝子または遺伝子産物のプレイシング；及び（Ｄ）特定代謝またはシグナリング経路において単離遺伝子及びその産物の関与を測定または確認するために実施でき、遺伝子機能の測定に役立つ、その他の分析。
【実施例】
【０１３４】
実施例
本発明を以下の実施例においてより詳細に説明し、これらは本発明の範囲をいかなる形においても制限するものではない。添付の図は本発明の明細書及び説明の不可欠な要素として考慮される。ここに引用する全ての文献はここに明示的に引用されるものとする。
【０１３５】
実施例１
ＣＢＨ１．１変異体の同定
この実施例は変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１をエンコードする核酸の同定及びキャラクタリゼーションについて説明する。
ゲノムＤＮＡの同定
【０１３６】
ゲノムＤＮＡは当業界に公知の任意の方法を用いて単離できる。この一連の実験において、フミコーラ・グリセア ｖａｒ ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ（ＣＢＳ２２５．６３）のサンプルを得た。しかしながら、以下の手順も用いることができる：
細胞を２０ｍｌポテトデキストロース培養液（ＰＤＢ）中、４５℃で２４時間成長させる。当該細胞を新しいＰＤＢ培地中で１：２０に希釈し、一晩中成長させる。２ｍＬの細胞を遠心し、ペレットを１ｍＬ ＫＣ（６０ｇ、ＫＣｌ、２ｇクエン酸／Ｌ、ＫＯＨを用いてｐＨを６．２に調節）中で洗浄する。細胞ペレットを９００μＬ ＫＣ中で再懸濁させる。１００μＬ（２０ｍｇ／ｍＬ）ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ：登録商標）を加え、ゆっくりと混合し、次に９５％以上の原形質体が形成されるまで、微視的に３７℃、最大２時間でプロトプラステーション（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔａｔｉｏｎ）を行う。当該細胞を１５００ｒｐｍで（４６０ｇ）１０分間遠心する。２００μＬ ＴＥＳ／ＳＤＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ）を加え、混合し、室温で５分間培養する。ＤＮＡをキアゲンミニプレップ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離する。カラムを１００μＬのｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて溶出させ、ＤＮＡを収集する。
【０１３７】
これは４５℃で成長させたＰＤＡプレートからＨ．グリセア ｖａｒ ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａのゲノムＤＮＡを単離するために用いる方法である。もしくはＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）法を用いる方法も好ましい。当該システムは核酸単離のためのＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）機器及びＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）キットからなる。ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）はＱｂｉｏｇｅｎｅ社（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，２２５１ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ Ｒｏａｄ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州、９２００８）から入手可能である。
【０１３８】
プライマーの構築
ＰＣＲはＰＣＴ−２００ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）などの標準ＰＣＲ機械上で、以下の条件下で行った：
１）１分、９６℃で１サイクル
２）３０秒、９４℃
６０秒、５５℃
２分、７２℃
３）工程２繰り返し、３０サイクル
４）７分、７２℃、１サイクル、及び
５）保管及びさらなる分析、低温〜１５℃。
【０１３９】
以下のＤＮＡプライマーを種々の微生物から単離したゲノムＤＮＡ由来の相同体ＣＢＨ１遺伝子の増幅に使用するために構築した。タンパク質及びＤＮＡに関してここで用いる全ての記号はＩＵＰＡＣ ＩＵＢ生化学命名法割当てコードに対応する。
相同体５’（ＰＶＳ２０３）及び３’（ＰＶＳ２０４）プライマーをフミコーラ・グリセア ｖａｒ ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ（ＩＦＯ９８５４）由来ＣＢＨ１配列に基づいて開発した。この株はＤ６３５１５として配置図中に示した配列を発現する（図５）。両プライマーはインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））のＧａｔｅｗａｙクローニング配列をプライマーの５’に含む。プライマーＰＶＳ２０３はａｔｔＢ１配列を含み、プライマーＰＶＳ２０４はａｔｔＢ２配列を含む。
【式１】
【０１４０】
【０１４１】
ＰＣＲ条件は以下の通り：２０μＬの５Ｘ反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．５；８７．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４；６．２５ｍＭ ＭｇＣＬ２；２．５％ Ｔｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）７．５％ ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含む５Ｘ反応緩衝液）；各０．２ｍＭの、ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ（最終濃度）、１μＬの１００ｎｇ／μＬゲノムＤＮＡ、１μＬのＴｇｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｃａｔ＃３１８６１９９）、μＬ当たり１ユニット、各０．２μＭのプライマー、ＰＶＳ２０３及びＰＶＳ２０４（最終濃度）、及び水１００μＬまで。
【０１４２】
変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１遺伝子配列の単離
完全長配列をＮ末端（ＰＶＳ２０３）及びＣ末端（ＰＶＳ２０４）プライマーを用いることにより直接得た。完全長ＤＮＡ配列をベクターＮＴＩソフトウェアを用いる３つのオープンリーディングフレーム内に翻訳した。ＤＮＡ及びタンパク質配列とＨ．グリセア Ｃｅｌ７Ａ（Ｘ１７２５８及びＤ６３５１５）の２つの公知配列との比較を行い、推定上のイントロン配列を同定した。イントロン配列を含まないゲノムＤＮＡ配列の翻訳により変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１のタンパク質配列が明らかになった。完全長遺伝子が得られ、図１に示した（ゲノムＤＮＡ）。推定ｃＤＮＡを図２に表す。
【０１４３】
実施例２
ＣＢＨ１．１変異体発現
以下の実施例はどのように変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１遺伝子の発現が行われたかについて詳述する。
【０１４４】
実施例１の完全長遺伝子を目的地ベクターを適合性のあるＡ．ニガー Ｇａｔｅｗａｙ（ジェネンコーが開発）に移した。このベクターを骨格としてｐＲＡＸ１を用いることにより、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング・テクノロジー：バージョン１、第３４−３８頁の所定のマニュアルに従って構築した（図６に示す）。
新しく開発した発現ベクターを図７に示す。これは新しい遺伝子を目的地ベクターｐＲＡＸｄｅｓ２内に移すものである。これにより最終発現ベクターが得られ、ｐＲＡＸｄｅｓＣＢＨ１を呼ぶ（図８を参照）。
【０１４５】
当該構築体をＣａｏ、他に記載の方法に従ってＡ．ニガー ｖａｒ．アワモリ内に形質転換した（Ｃａｏ Ｑ−Ｎ、Ｓｔｕｂｂｓ Ｍ、Ｎｇｏ ＫＱＰ，Ｗａｒｄ Ｍ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ａ，Ｐａｉ ＥＦ，Ｔｕ Ｇ−Ｃ及びＨｏｆｍａｎｎ Ｔ（２０００）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｏｐｅｐｓｉｎ−ＪＴ２ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ
ｆｒｏｍ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ Ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄ ｉｎ ｓｕｂｓｉｔｅ Ｓ３
ｔｏ ｋｃａｔ（ペニシロペプシン−ＪＴ２、ペニシリウム・ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ由来の組換え酵素、及びサブサイトＳ３からｋｃａｔにおける水素結合の寄与） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：９９１−１００１）。
【０１４６】
形質転換を最小培地プレート（Ｂａｌｌａｎｃｅ ＤＪ，Ｂｕｘｔｏｎ ＦＰ、及びＴｕｒｎｅｒ Ｇ（１９８３）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｏｒｏｔｉｄｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ（アカパンカビのオロチジン−５’− リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子によるアスペルギルス・ニデュランスの形質転換） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １１２：２８４−２８９）上に筋上に加え、４日間、３０℃で成長させた。胞子を当業界に公知の方法を用いて回収した（<www.fgsc.net/fgn48/Kaminskyj.htm>を参照）。Ａ．ニデュランス分生子を水中で（胞子を取除くために殺菌湾曲ガラス棒を用いて分生子（ｃｏｎｉｄｉａｔｉｎｇ）培養物の表面を擦ることにより）収集し、生存に深刻な損失を生じることなく４℃で数週間から数ヶ月保存できる。しかしながら、新しく収集した胞子はより繁殖して発芽した。長期保存に関して、胞子は５０％グリセロール中、−２０℃で、または１５−２０％グリセロール中、−８０℃で保存できる。グリセロールは８０％水溶液としてより簡単にピペットで取られる。８００μＬの分生子懸濁水溶液（４℃保存用として作成）を２００μＬ ８０％グリセロールに加えたものを−８０℃保存用に用いる。４００μＬ懸濁液を６００μＬ ８０％グリセロールに加えたものを−２０℃保存用に用いる。凍結前に遠心（ｖｏｒｔｅｘ）する。変異体を回収するため、少量の分生子培養物を摘出し、２０％ グリセロール内に加え、遠心し、及び−８０℃保存として凍結させる。この場合、これらを５０％ グリセロール内、−８０℃で保存する。
【０１４７】
Ａ．ニガー ｖａｒ アワモリ形質転換体をウリジンが欠落した最小培地（Ｂａｌｌａｎｃｅ、他、１９８３）上で成長させた。形質転換体を、Ｃａｏ、他（２０００）に記載の通り、胞子形成成長寒天プレートからの１ｃｍ２の胞子懸濁液を１００ｍＬの振とうフラスコ中に３日間、３７℃で植菌することによりセルラーゼ活性をスクリーニングした。
ＣＢＨ１活性分析は非蛍光４−メチルウンベリフェリル−β−ラクトシドから生成物ラクトース及び７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンへの加水分解に基づき、後者の生成物は蛍光シグナルに関与する。１７０μＬ ５０ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液 ｐＨ４．５を９６ウェル・マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｆｌｕｏｔｒａｃ ２００、ａｒｔ．ｎｒ．６５５０７６）中にピペットで取り、蛍光に適している。１０μＬの上澄みを加え、それから１０μＬのＭＵＬ（１ｍＭ ４−メチルウンベリフェリル−β−ラクトシド（ＭＵＬ）のｍｉｌｌｉＱ水）を加え、ＭＴＰをＦｌｕｏｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｄ−７７６５６ Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ）中に置く。反応速度を１６分間（それぞれ１２０秒、８サイクル）、λ３２０ｎｍ（励起）及びλ４６０ｎｍ（発光）を用いて５０℃で測定する。ＣＢＨ活性を有する上澄みをそれから下記の実施例３の説明の通り、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供した。アミノ酸配列を上記実施例１の通り推定した。変異体ＣＢＨ１．１のアミノ酸配列を図３にシグナル配列を含めて、図４にシグナル配列を含まないで示した。シグナル配列を太字、下線書体で図３に示す。
【０１４８】
実施例３
ＣＢＨ１変異体の熱安定性
以下の実施例は変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１とＴ．リーゼイＣＢＨ１セルラーゼ酵素の熱安定性の差を詳述する。
【０１４９】
ＣＢＨ１セルラーゼ変異体を上述の通りクローン及び発現させた（実施例２を参照）。Ｃｅｌ７Ａ野生型及び変異体をそれからカラムクロマトグラフィーによりこれらの培養物の細胞を含まない（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）上澄みから精製した。タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて精製した。カラムをＢｉｏＣＡＤ（登録商標）Ｓｐｒｉｎｔ Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎクロマトグラフィーシステム上でＰｏｒｏｓ（登録商標）２０ＨＰ２樹脂を用いて操作し、これらは両方ともＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製である。
【０１５０】
ＨＩＣカラムを５カラム体積の０．０２０Ｍ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ 硫酸アンモニウムを用いてｐＨ６．８で平衡にした。硫酸アンモニウムを上澄みに加え、最終濃度が約０．５Ｍになるようにし、及びｐＨを６．８に調節した。ろ過後、上澄みをカラム上に充填する。充填後、カラムを１０カラム量（ｖｏｌｕｍｅ）の平衡緩衝液で洗浄し、それから１０カラム量で０．５Ｍ硫酸アンモニウムからゼロ硫酸アンモニウム勾配で、ｐＨ６．８、０．０２Ｍリン酸ナトリウム中で溶出させた。Ｃｅｌ７Ａをおおよそ中間勾配で溶出させた。断片を収集し、還元、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析に基づいてプールした。
【０１５１】
融点をＬｕｏ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１０６６９及びＧｌｏｓｓ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：５６１２の方法に従って測定した。
【０１５２】
データをＡｖｉｖ ２１５円偏光二色性分光計により集めた。２１０〜２６０ナノメートルの変異体のスペクトルを２５℃で取った。緩衝液条件は５０ｍＭ ビス−トリス−プロパン／５０ｍＭ 酢酸アンモニウム／氷酢酸、ｐＨ５．５である。タンパク質濃度は０．２５〜０．５ｍｇｓ／ｍＬに維持した。非折り畳みを観測するための最適波長を測定した後、サンプルを同じ緩衝条件下、温度２５℃〜７５℃に傾斜させることにより熱変性させた。データを５秒間、２度毎に回収した。部分的に可逆的な非折り畳みを２３０ナノメートル、０．１ｃｍパス・レングス細胞中で観測した。
【０１５３】
変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１セルラーゼは野生型Ｔ．リーゼイＣＢＨ１と比較して高められた熱安定性プロファイルを有する。変異体Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１のＴｍは７２．５℃であり、Ｔ．リーゼイのＴｍは６２．３℃である。
実施例４
ＣＢＨ１変異体の活性
【０１５４】
以下の実施例はＨ．グリセアＣＢＨ１．１変異体の活性の評価方法について詳述する。
【０１５５】
セルロース変換を当業界に公知の技術により評価した。例えば、Ｂａｋｅｒ、他、Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９８ Ｓｐｒｉｎｇ；７０−７２（）：３９５−４０３を参照されたい。
【０１５６】
標準セルロース誘導体変換分析を実験に用いた。この分析において、酵素及び緩衝基質を容器内に入れ、ある温度でゆっくり時間をかけて培養した。当該反応を十分な１００ｍＭ グリシン、ｐＨ１１．０で冷却し、反応混合物のｐＨを少なくともｐＨ１０にした。反応を抑えた後、反応混合物のアリコートを０．２ミクロン膜によりろ過し、固体を除去した。続いてろ過溶液を、Ｂａｋｅｒ、他、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７０−７２：３９５−４０３（１９９８）に記載の方法に従って、ＨＰＬＣにより可溶性糖について分析した。
【０１５７】
前処理伐採残（コーンストーバー）（ＰＣＳ）−伐採残（コーンストーバー）をＳｃｈｅｌｌ，Ｄ．他、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０５：６９−８６（２００３）に記載の通り２％ ｗ／ｗ Ｈ２ＳＯ４で前処理し、次に脱イオン水で複数回洗浄し、ｐＨ４．５となった。酢酸ナトリウムを加えて最終濃度５０ｍＭにし、これを滴定してｐＨ５．０とした。当該反応混合物中のセルロース濃度は約７％であった。
【０１５８】
リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）−ＰＡＳＣを、Ｗａｌｓｅｔｈ（１９７１）Ｔａｐｐｉ ３５：２２８（１９７１）及びＷｏｏｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１２１：３５３（１９７１）に記載の方法に従って、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）から調製した。この物質を緩衝液及び水を用いて希釈して０．６３％ ｗ／ｖ混合物を得て、酢酸ナトリウムの最終濃度が５０ｍＭ、ｐＨ５．０になるようにした。酵素はセルロース１グラム当たり全タンパク質１．６ｍｇで投与した。
【０１５９】
最初の一連の実験は１２．６６％の前処理伐採残（コーンストーバー）（ＰＣＳ）について３８℃、１日間での変換率を調べ（Ｓｃｈｅｌｌ，Ｄ．他、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３）１０５：６９−８６を参照）、１５．５ｍｇ酵素／ｇｍセルロースを用いた。サンプルを７００ｒｐｍで掻き混ぜた。以下の間で比較を行った：１）ＣＢＨ１欠失トリコデルマ株由来のセルラーゼ（ｄｅｌＣＢＨ１）；２）Ｔ．リーゼイＣＢＨ１遺伝子を挿入したＡ．ニガー株（ｒＣＢＨ１）；その天然ＣＢＨＢを過剰発現するＡ．ニガー株（Ａｎｉｇｅｒ）；４）Ｈ．シュワイニッチィＣＢＨ１遺伝子を挿入したＡ．ニガー株（Ｈシュワイニッチィ／Ａｎ）；５）Ｔ．プソイドコニンギＣＢＨ１遺伝子を挿入したＡ．ニガー株（Ｔプソイドコニンギ／Ａｎ）；６）Ｈ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１遺伝子を挿入したＡ．ニガー株（Ｈグリセア／Ａｎ−１）；７）Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１遺伝子を挿入したＡ．ニガー株（Ｈグリセア／Ａｎ−２）。Ｈグリセア／Ａｎ−１及びＨグリセア／Ａｎ−２はＡ．ニガーとＨ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１遺伝子の同じ形質転換から得た２つのクローンである。最初の一連の実験から得た結果を図９に表す。見ての通り、Ｈ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１は試験したその他のＣＢＨのいずれと比べても性能が高くない。図１１は同じ実験条件から得られるＴ．リーゼイｎＣＢＨ１に対するＨ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１との比較である。
【０１６０】
２番目の一連の実験は培養温度が３８℃でなく６５℃である以外は最初の実験と同様の条件下で変換率を調べた。この一連の実験の結果を図１０に示す。見ての通り、Ｈ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１は試験したその他のＣＢＨのより高い性能を有する。図１２は同じ実験条件から得られるＴ．リーゼイｒＣＢＨ１に対するＨ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１の比較である。
【０１６１】
３番目の一連の実験は前述の実験と同様の試験条件下、ＰＡＳＣからのセロビオース生成率を調べた。温度は３８℃、６５℃及び７０℃を用いた。結果を図１３に表す。見ての通り、Ｈ．グリセア変異体ＣＢＨ１．１は全ての試験温度でＴ．リーゼイＣＢＨ１より性能が高かった。
【０１６２】
実施例５
スキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１の単離
この実験はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１をエンコードする核酸の単離及びキャラクタリゼーションを説明する。
【０１６３】
ゲノムＤＮＡの単離及びプライマーの構築
スキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１をクローニング、発現及び精製する方法はフミコーラ・グリセア ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ ＣＢＨ１．１に関して記載した通りである（実施例１を参照）。スキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ由来ＣＢＨ１遺伝子を公知株コレクション・エントリーＣＢＳ６７１．８８由来のゲノムＤＮＡから同じＰＣＲプライマー、フミコーラ・グリセア ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅ ＣＢＨ１．１を増幅するために用いたＰＶＳ２０３及びＰＶＳ２０４を用いて増幅した。
【０１６４】
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１遺伝子配列の単離
完全長配列をＮ末端（ＰＶＳ２０３）及びＣ末端（ＰＶＳ２０４）プライマーを用いて直接得た。完全長ＤＮＡ配列をベクターＮＴＩソフトウェアを用いて３つのリーディングフレーム内に翻訳した。イントロン配列を含まないゲノムＤＮＡ配列の翻訳によりＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１のタンパク質配列が明らかになった。完全長遺伝子が得られ、図１４Ａに示す（ゲノムＤＮＡ）。推測ｃＤＮＡを図１４Ｂに表す。シグナル配列を含むアミノ酸配列と含まないアミノ酸配列をそれぞれ図１４Ｃ及び１５に示す。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｏｉｕｍ ＣＢＨ１、フミコーラ・グリセア ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ ＣＢＨ１．１及びＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１タンパク質配列を配置させた。図１５を参照されたい。
【０１６５】
フミコーラ・グリセア ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ ＣＢＨ１．１及び非常に安定なスキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ１間の部位の差を同定し、次に図１５の配置を用いることによりヒポクレア・ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１中の対応位置を同定する。そして、これはフミコーラ・グリセア ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ ＣＢＨ１．１またはスキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ１のいずれよりもかなり不安定である。ヒポクレア・ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨＩ中の以下の部位（成熟タンパク質残基番号）を安定性に関して重要なものとして同定する：
Ｔｈｒ（Ｔ）５５、好ましくはＴｈｒ５５Ｇｌｕ（Ｔ５５Ｅ）及びＴｈｒ５５Ｌｙｓ（Ｔ５５Ｋ）
Ｓｅｒ（Ｓ）５８、好ましくはＳｅｒ５８Ｔｈｒ（Ｓ５８Ｔ）
Ｇｌｎ（Ｑ）１０１、好ましくはＧｌｎ１０１Ｔｙｒ（Ｑ１０１Ｙ）及びＧｌｎ１０１Ｈｉｓ（Ｑ１０１Ｈ）
Ａｓｎ（Ｎ）２５０、好ましくはＡｓｎ２５０Ａｓｐ（Ｎ２５０Ｄ）及びＡｓｎ２５０Ｇｌｕ（Ｎ２５０Ｅ）
Ｐｒｏ（Ｐ）２６５、好ましくはＰｒｏ２６５Ａｌａ（Ｐ２６５Ａ）及びＰｒｏ２６５Ｓｅｒ（Ｐ２６５Ｓ）
Ｌｅｕ（Ｌ）２８８、好ましくはＬｅｕ２８８Ｉｌｅ（Ｌ２８８Ｉ）。
【０１６６】
実施例６
スキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１の熱安定性
この実施例はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ１及びＨ．グリセア ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ ＣＢＨ１．１の熱安定性測定について説明する。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＣＢＨ１及びＨ．グリセア ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ ＣＢＨ１．１を実施例２に記載の方法を用いて発現し、実施例３の通り精製し、Ｍｉｃｒｏｃａｌ ＶＰ−ＤＳＣを用いて示差走査熱量測定により分析した。サンプルを３０〜９５℃、９０℃／時間でスキャンした。精製タンパク質を５０ｍＭ 酢酸アンモニウム及び５０ｍＭ ビストリス・プロパン内でｐＨ５．５で脱塩した。全てのサンプルの最終タンパク質濃度は０．０５〜０．２５ｍｇ／ｍＬだった。
【０１６７】
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍに関して観測された温度遷移の中間点は７８．３℃であった。Ｈ．グリセア ＣＢＨ１．１の温度遷移の中間点は７６．０℃だった。図１６を参照。
【０１６８】
ここに記載される実施例及び実施態様は説明目的のためのみであり、これに照らして種々の修正または変形が当業者に示唆され、本発明の概念及び精神及び請求の範囲の範囲内であることが理解される。ここに記載の全ての文献、特許及び特許出願はその全体を全ての目的においてここに引用するものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択される、セロビオヒドロラーゼＩ活性を有するポリペプチド：
ａ）ＣＢＳ２２５．６３由来のＨ．グリセア（ｇｒｉｓｅａ）ＣＢＨ１．１変異体；
ｂ）図３（配列番号３）に示す配列を有するＨ．グリセアＣＢＨ１．１変異体；
ｃ）成熟型配列のＴ５５、Ｓ５８、Ｑ１０１、Ｎ２５０、Ｐ２６５及びＬ２８８からなる群より選択される少なくとも１の置換を含むヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）・ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体；及び
ｄ）ＣＢＳ６７１．８８由来のスキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１（配列番号１１）。
【請求項２】
ヒポクレア・ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体が、Ｔ５５Ｅ、Ｔ５５Ｋ、Ｓ５８Ｔ、Ｑ１０１Ｙ、Ｑ１０１Ｈ、Ｎ２５０Ｄ、Ｎ２５０Ｅ、Ｐ２６５Ａ、Ｐ２６５Ｓ及びＬ２８８Ｉの１以上に対応する位置で置換を含む、請求項１のポリペプチド。
【請求項３】
さらにシグナル配列を含む請求項１のポリペプチド。
【請求項４】
図４（配列番号４）に示す配列を有するＨ．グリセアＣＢＨ１．１変異体を含む、請求項３のポリペプチド。
【請求項５】
スキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１（配列番号９）を含む請求項３のポリペプチド。
【請求項６】
以下からなる群より選択されるセロビオヒドロラーゼをエンコードするポリヌクレオチド：
ａ）ＣＢＳ２２５．６３由来のＨ．グリセアＣＢＨ１．１変異体；
ｂ）成熟型配列のＴ５５、Ｓ５８、Ｑ１０１、Ｎ２５０、Ｐ２６５及びＬ２８８からなる群より選択される少なくとも１の置換を含むヒポクレア・ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体；及び
ｃ）ＣＢＳ６７１．８８由来のスキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１。
【請求項７】
セロビオヒドロラーゼがＨ．グリセアＣＢＨ１．１変異体であり、ＣＢＳ２２５．６３由来である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１変異体が配列番号３を含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１変異体が配列番号４を含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
セロビオヒドロラーゼが配列番号９を含むＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
セロビオヒドロラーゼが配列番号１１を含むＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
セロビオヒドロラーゼが、配列番号１０のＴ５５Ｅ、Ｔ５５Ｋ、Ｓ５８Ｔ、Ｑ１０１Ｙ、Ｑ１０１Ｈ、Ｎ２５０Ｄ、Ｎ２５０Ｅ、Ｐ２６５Ａ、Ｐ２６５Ｓ及びＬ２８８Ｉの１以上に対応する位置で置換を含むＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
１以上の制御配列に動作可能に連結した、請求項６に記載のヌクレオチド配列を含む核酸構築体。
【請求項１４】
請求項１３の核酸構築体を含む組換え発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４の核酸構築体を含む組換え宿主細胞。
【請求項１６】
以下の工程を含むＣＢＨ１ポリペプチドを生成する方法：
ａ）宿主細胞と請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む核酸とを形質転換する工程；
ｂ）当該ポリペプチドを生成する条件下で宿主細胞を培養する工程；及び
ｃ）当該ポリペプチドを回収する工程。
【請求項１７】
請求項１に記載のセロビオヒドロラーゼＩ活性を有するポリペプチドを含む組成物。
【請求項１８】
バイオマスを糖に変換する方法であって、当該バイオマスとセロビオヒドロラーゼＩ活性を有するポリペプチドとを接触させる工程を含み、前記ポリペプチドがＴ．リーゼイ（ｒｅｅｓｅｉ）と比べて、６５℃のＰＣＳ変換分析または３８℃のＰＡＳＣ分析いずれにおいても高い活性を有する、方法。
【請求項１９】
バイオマスを糖に変換する方法であって、前記バイオマスと請求項１に記載のセロビオヒドロラーゼＩ活性を有するポリペプチドとを接触させる工程を含む、方法。
【請求項１】
以下からなる群より選択される、セロビオヒドロラーゼＩ活性を有するポリペプチド：
ａ）ＣＢＳ２２５．６３由来のＨ．グリセア（ｇｒｉｓｅａ）ＣＢＨ１．１変異体；
ｂ）図３（配列番号３）に示す配列を有するＨ．グリセアＣＢＨ１．１変異体；
ｃ）成熟型配列のＴ５５、Ｓ５８、Ｑ１０１、Ｎ２５０、Ｐ２６５及びＬ２８８からなる群より選択される少なくとも１の置換を含むヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）・ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体；及び
ｄ）ＣＢＳ６７１．８８由来のスキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１（配列番号１１）。
【請求項２】
ヒポクレア・ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体が、Ｔ５５Ｅ、Ｔ５５Ｋ、Ｓ５８Ｔ、Ｑ１０１Ｙ、Ｑ１０１Ｈ、Ｎ２５０Ｄ、Ｎ２５０Ｅ、Ｐ２６５Ａ、Ｐ２６５Ｓ及びＬ２８８Ｉの１以上に対応する位置で置換を含む、請求項１のポリペプチド。
【請求項３】
さらにシグナル配列を含む請求項１のポリペプチド。
【請求項４】
図４（配列番号４）に示す配列を有するＨ．グリセアＣＢＨ１．１変異体を含む、請求項３のポリペプチド。
【請求項５】
スキタリジウム・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１（配列番号９）を含む請求項３のポリペプチド。
【請求項６】
以下からなる群より選択されるセロビオヒドロラーゼをエンコードするポリヌクレオチド：
ａ）ＣＢＳ２２５．６３由来のＨ．グリセアＣＢＨ１．１変異体；
ｂ）成熟型配列のＴ５５、Ｓ５８、Ｑ１０１、Ｎ２５０、Ｐ２６５及びＬ２８８からなる群より選択される少なくとも１の置換を含むヒポクレア・ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体；及び
ｃ）ＣＢＳ６７１．８８由来のスキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）・ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１。
【請求項７】
セロビオヒドロラーゼがＨ．グリセアＣＢＨ１．１変異体であり、ＣＢＳ２２５．６３由来である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１変異体が配列番号３を含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
Ｈ．グリセアＣＢＨ１．１変異体が配列番号４を含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
セロビオヒドロラーゼが配列番号９を含むＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
セロビオヒドロラーゼが配列番号１１を含むＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｍ ＣＢＨ１である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
セロビオヒドロラーゼが、配列番号１０のＴ５５Ｅ、Ｔ５５Ｋ、Ｓ５８Ｔ、Ｑ１０１Ｙ、Ｑ１０１Ｈ、Ｎ２５０Ｄ、Ｎ２５０Ｅ、Ｐ２６５Ａ、Ｐ２６５Ｓ及びＬ２８８Ｉの１以上に対応する位置で置換を含むＨ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ１変異体である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
１以上の制御配列に動作可能に連結した、請求項６に記載のヌクレオチド配列を含む核酸構築体。
【請求項１４】
請求項１３の核酸構築体を含む組換え発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４の核酸構築体を含む組換え宿主細胞。
【請求項１６】
以下の工程を含むＣＢＨ１ポリペプチドを生成する方法：
ａ）宿主細胞と請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む核酸とを形質転換する工程；
ｂ）当該ポリペプチドを生成する条件下で宿主細胞を培養する工程；及び
ｃ）当該ポリペプチドを回収する工程。
【請求項１７】
請求項１に記載のセロビオヒドロラーゼＩ活性を有するポリペプチドを含む組成物。
【請求項１８】
バイオマスを糖に変換する方法であって、当該バイオマスとセロビオヒドロラーゼＩ活性を有するポリペプチドとを接触させる工程を含み、前記ポリペプチドがＴ．リーゼイ（ｒｅｅｓｅｉ）と比べて、６５℃のＰＣＳ変換分析または３８℃のＰＡＳＣ分析いずれにおいても高い活性を有する、方法。
【請求項１９】
バイオマスを糖に変換する方法であって、前記バイオマスと請求項１に記載のセロビオヒドロラーゼＩ活性を有するポリペプチドとを接触させる工程を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１１−１２５３４１（Ｐ２０１１−１２５３４１Ａ）
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５６４８（Ｐ２０１１−５６４８）
【出願日】平成２３年１月１４日（２０１１．１．１４）
【分割の表示】特願２００６−５３２３４６（Ｐ２００６−５３２３４６）の分割
【原出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【出願人】（５００２８４５８０）ジェネンコー・インターナショナル・インク (67)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１４日（２０１１．１．１４）
【分割の表示】特願２００６−５３２３４６（Ｐ２００６−５３２３４６）の分割
【原出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【出願人】（５００２８４５８０）ジェネンコー・インターナショナル・インク (67)
【Ｆターム（参考）】
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