説明

多価不飽和脂肪酸シンターゼの核酸分子およびポリペプチド、組成物、ならびにそれらの作製方法および使用

本発明は、ドコサヘキサエン酸(DHA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、またはそれらの組み合わせに富む多価不飽和脂肪酸(PUFA)を含むPUFAの産生に関与する、ヤブレツボカビ(thraustochytrid)PUFAシンターゼの単離された核酸分子およびポリペプチドを対象とする。本発明は、それらの核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞、それらの核酸分子によってコードされるポリペプチド、それらの核酸分子またはポリペプチドを含む組成物、ならびにそれらの作製方法および使用を対象とする。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)SEQ ID NO:1に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列が、β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)活性、マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)活性、アシルキャリアータンパク質(ACP)活性、ケトレダクターゼ(KR)活性、β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される多価不飽和脂肪酸(PUFA)シンターゼ活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(b)SEQ ID NO:7に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がKS活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(c)SEQ ID NO:9に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がMAT活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(d)SEQ ID NO:13、15、17、19、21または23のいずれか1つに対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がACP活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(e)SEQ ID NO:11に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がACP活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(f)SEQ ID NO:25に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がKR活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;ならびに
(g)SEQ ID NO:27に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がDH活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項2】
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25および27に対して少なくとも90%同一である、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項3】
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25および27に対して少なくとも95%同一である、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項4】
それぞれ、SEQ ID NO:1、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25および27のポリヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項5】
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:2に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドが、KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、DH活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含む、核酸分子;
(b)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:8に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがKS活性を含む、核酸分子;
(c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:10に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがMAT活性を含む、核酸分子;
(d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:14、16、18、20、22または24のいずれか1つに対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがACP活性を含む、核酸分子;
(e)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:12に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがACP活性を含む、核酸分子;
(f)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:26に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがKR活性を含む、核酸分子;ならびに
(g)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:28に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがDH活性を含む、核酸分子。
【請求項6】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26および28に対して少なくとも90%同一である、請求項5記載の単離された核酸分子。
【請求項7】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26および28に対して少なくとも95%同一である、請求項5記載の単離された核酸分子。
【請求項8】
ポリペプチドがそれぞれ、SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26および28のアミノ酸配列を含む、請求項5記載の単離された核酸分子。
【請求項9】
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)SEQ ID NO:3に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列が、KS活性、鎖長因子(chain length factor)(CLF)活性、アシルトランスフェラーゼ(AT)活性、エノイル-ACPレダクターゼ(ER)活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(b)SEQ ID NO:29に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がKS活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(c)SEQ ID NO:31に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がCLF活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(d)SEQ ID NO:33に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がAT活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;ならびに
(e)SEQ ID NO:35に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がER活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項10】
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:3、29、31、33および35に対して少なくとも90%同一である、請求項9記載の単離された核酸分子。
【請求項11】
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:3、29、31、33および35に対して少なくとも95%同一である、請求項9記載の単離された核酸分子。
【請求項12】
それぞれ、SEQ ID NO:3、29、31、33および35のポリヌクレオチド配列を含む、請求項9記載の単離された核酸分子。
【請求項13】
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:4に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドが、KS活性、CLF活性、AT活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含む、核酸分子;
(b)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:30に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがKS活性を含む、核酸分子;
(c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:32に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがCLF活性を含む、核酸分子;
(d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:34に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがAT活性を含む、核酸分子;ならびに
(e)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:36に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがER活性を含む、核酸分子。
【請求項14】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:4、30、32、34および36に対して少なくとも90%同一である、請求項13記載の単離された核酸分子。
【請求項15】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:4、30、32、34および36に対して少なくとも95%同一である、請求項13記載の単離された核酸分子。
【請求項16】
ポリペプチドがそれぞれ、SEQ ID NO:4、30、32、34および36のアミノ酸配列を含む、請求項13記載の単離された核酸分子。
【請求項17】
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)SEQ ID NO:5に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列が、DH活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(b)SEQ ID NO:37に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がDH活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(c)SEQ ID NO:39に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がDH活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;ならびに
(d)SEQ ID NO:41に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がER活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項18】
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:5、37、39および41に対して少なくとも90%同一である、請求項17記載の単離された核酸分子。
【請求項19】
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:5、37、39および41に対して少なくとも95%同一である、請求項17記載の単離された核酸分子。
【請求項20】
それぞれ、SEQ ID NO:5、37、39および41のポリヌクレオチド配列を含む、請求項17記載の単離された核酸分子。
【請求項21】
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:6に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドが、DH活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含む、核酸分子;
(b)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:38に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがDH活性を含む、核酸分子;
(c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:40に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがDH活性を含む、核酸分子;ならびに
(d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:42に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがER活性を含む、核酸分子。
【請求項22】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:6、38、40および42に対して少なくとも90%同一である、請求項21記載の単離された核酸分子。
【請求項23】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:6、38、40および42に対して少なくとも95%同一である、請求項21記載の単離された核酸分子。
【請求項24】
ポリペプチドがそれぞれ、SEQ ID NO:6、38、40および42のアミノ酸配列を含む、請求項21記載の単離された核酸分子。
【請求項25】
KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、CLF活性、AT活性、ER活性、DH活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子であって、
該ポリヌクレオチドが、請求項1〜24のいずれか一項記載のポリヌクレオチド配列の相補物と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子。
【請求項26】
請求項1〜24のいずれか一項記載のポリヌクレオチド配列に対して完全に相補的なポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項27】
請求項1〜25のいずれか一項記載の核酸分子またはそれらの組み合わせと、転写制御配列とを含む、組換え核酸分子。
【請求項28】
組換えベクターである、請求項27記載の組換え核酸分子。
【請求項29】
請求項1〜25のいずれか一項記載の核酸分子、請求項27もしくは請求項28記載の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを発現する、宿主細胞。
【請求項30】
植物細胞、微生物細胞、および動物細胞からなる群より選択される、請求項29記載の宿主細胞。
【請求項31】
微生物細胞である、請求項30記載の宿主細胞。
【請求項32】
細菌である、請求項31記載の微生物細胞。
【請求項33】
ヤブレツボカビ(thraustochytrid)である、請求項31記載の微生物細胞。
【請求項34】
ヤブレツボカビがシゾキトリウム属(Schizochytrium)であるか、またはヤブレツボカビ属(Thraustochytrium)である、請求項33記載の微生物細胞。
【請求項35】
以下の段階を含む、少なくとも1つのPUFAを産生するための方法:
宿主細胞において、PUFAを産生させるのに有効な条件下でPUFAシンターゼ遺伝子を発現させる段階であって、
該PUFAシンターゼ遺伝子が、請求項1〜25のいずれか一項記載の単離された核酸分子、請求項27もしくは請求項28記載の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを含み、かつ
少なくとも1種類のPUFAが産生される、段階。
【請求項36】
宿主細胞が、植物細胞、単離された動物細胞、および微生物細胞からなる群より選択される、請求項35記載の方法。
【請求項37】
少なくとも1種類のPUFAがドコサヘキサエン酸(DHA)を含む、請求項35記載の方法。
【請求項38】
以下の段階を含む、DHAに富む脂質を産生するための方法:
宿主細胞において、脂質を産生させるのに有効な条件下でPUFAシンターゼ遺伝子を発現させる段階であって、該PUFAシンターゼ遺伝子が、宿主細胞において、請求項1〜25のいずれか一項記載の単離された核酸分子、請求項27もしくは請求項28記載の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを含み、かつ
DHAに富む脂質が産生される、段階。
【請求項39】
請求項1〜25のいずれか一項記載の単離された核酸分子をベクター中に挿入する段階を含む、組換えベクターを作製する方法。
【請求項40】
請求項39記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する段階を含む、組換え宿主細胞を作製する方法。
【請求項41】
宿主細胞が、植物細胞、単離された動物細胞、および微生物細胞からなる群より選択される、請求項40記載の方法。
【請求項42】
請求項1〜25のいずれか一項記載のポリヌクレオチド配列によってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項43】
以下のものからなる群より選択される、単離されたポリペプチド:
(a)SEQ ID NO:2に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、DH活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチド;
(b)SEQ ID NO:8に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性を含むポリペプチド;
(c)SEQ ID NO:10に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、MAT活性を含むポリペプチド;
(d)SEQ ID NO:14、16、18、20、22または24のいずれか1つに対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ACP活性を含むポリペプチド;
(e)SEQ ID NO:12に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ACP活性を含むポリペプチド;
(f)SEQ ID NO:26に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KR活性を含むポリペプチド;ならびに
(g)SEQ ID NO:28に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性を含むポリペプチド。
【請求項44】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26および28に対して少なくとも90%同一である、請求項43記載の単離されたポリペプチド。
【請求項45】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26および28に対して少なくとも95%同一である、請求項43記載の単離されたポリペプチド。
【請求項46】
それぞれ、SEQ ID NO:2、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26および28のアミノ酸配列を含む、請求項43記載の単離されたポリペプチド。
【請求項47】
以下のものからなる群より選択される、単離されたポリペプチド:
(a)SEQ ID NO:4に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性、CLF活性、AT活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチド;
(b)SEQ ID NO:30に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性を含むポリペプチド;
(c)SEQ ID NO:32に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、CLF活性を含むポリペプチド;
(d)SEQ ID NO:34に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、AT活性を含むポリペプチド;ならびに
(e)SEQ ID NO:36に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ER活性を含むポリペプチド。
【請求項48】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:4、30、32、34および36に対して少なくとも90%同一である、請求項47記載の単離されたポリペプチド。
【請求項49】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:4、30、32、34および36に対して少なくとも95%同一である、請求項47記載の単離されたポリペプチド。
【請求項50】
それぞれ、SEQ ID NO:4、30、32、34および36のアミノ酸配列を含む、請求項47記載の単離されたポリペプチド。
【請求項51】
以下のものからなる群より選択される、単離されたポリペプチド:
(a)SEQ ID NO:6に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチド;
(b)SEQ ID NO:38に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性を含むポリペプチド;
(c)SEQ ID NO:40に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性を含むポリペプチド;ならびに
(d)SEQ ID NO:42に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ER活性を含むポリペプチド。
【請求項52】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:6、38、40および42に対して少なくとも90%同一である、請求項51記載の単離されたポリペプチド。
【請求項53】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:6、38、40および42に対して少なくとも95%同一である、請求項51記載の単離されたポリペプチド。
【請求項54】
それぞれ、SEQ ID NO:6、38、40および42のアミノ酸配列を含む、請求項51記載の単離されたポリペプチド。
【請求項55】
融合ポリペプチドである、請求項42〜54のいずれか一項記載の単離されたポリペプチド。
【請求項56】
請求項42〜54のいずれか一項記載のポリペプチドと、生物学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項57】
以下の段階を含む、PUFAシンターゼ活性を有する生物におけるDHAの産生を増加させる方法:
生物において、請求項1〜25のいずれか一項記載の単離された核酸分子、請求項27もしくは請求項28記載の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを、DHAを産生させるのに有効な条件下で発現させる段階であって、
該PUFAシンターゼ活性が、該生物において、不活性な活性もしくは消失した活性に取って代わるか、新たな活性を導入するか、または既存の活性を増強し、かつ
該生物におけるDHAの産生が増加する、段階。
【請求項58】
以下の段階を含む、宿主細胞から脂質を単離する方法:
(a)宿主細胞において、脂質を産生させるのに有効な条件下でPUFAシンターゼ遺伝子を発現させる段階であって、PKS系が、宿主細胞において、請求項1〜25のいずれか一項記載の単離された核酸分子、請求項27もしくは請求項28記載の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを含む、段階、および
(b)宿主細胞から脂質を単離する段階。
【請求項59】
宿主細胞が、植物細胞、単離された動物細胞、および微生物細胞からなる群より選択される、請求項58記載の方法。
【請求項60】
脂質がDHAを含む、請求項58記載の方法。
【請求項61】
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)SEQ ID NO:68またはSEQ ID NO:120に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列が、KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、DH活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(b)SEQ ID NO:74に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がKS活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(c)SEQ ID NO:76に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がMAT活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(d)SEQ ID NO:80、82、84、86、88、90、92、94、96または98のいずれか1つに対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がACP活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(e)SEQ ID NO:78に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がACP活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(f)SEQ ID NO:100に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がKR活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;ならびに
(g)SEQ ID NO:118に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がDH活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項62】
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:68、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、118および120に対して少なくとも90%同一である、請求項61記載の単離された核酸分子。
【請求項63】
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:68、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、118および120に対して少なくとも95%同一である、請求項61記載の単離された核酸分子。
【請求項64】
それぞれ、SEQ ID NO:68、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、118および120のポリヌクレオチド配列を含む、請求項61記載の単離された核酸分子。
【請求項65】
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:69に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドが、KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、DH活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含む、核酸分子;
(b)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:75に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがKS活性を含む、核酸分子;
(c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:77に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがMAT活性を含む、核酸分子;
(d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:81、83、85、87、89、91、93、95、97または99のいずれか1つに対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがACP活性を含む、核酸分子;
(e)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:79に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがACP活性を含む、核酸分子;
(f)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:101に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがKR活性を含む、核酸分子;ならびに
(g)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:119に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがDH活性を含む、核酸分子。
【請求項66】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:69、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101および119に対して少なくとも90%同一である、請求項65記載の単離された核酸分子。
【請求項67】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:69、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101および119に対して少なくとも95%同一である、請求項65記載の単離された核酸分子。
【請求項68】
ポリペプチドがそれぞれ、SEQ ID NO:69、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101および119のアミノ酸配列を含む、請求項65記載の単離された核酸分子。
【請求項69】
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)SEQ ID NO:70またはSEQ ID NO:121に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列が、KS活性、CLF活性、AT活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(b)SEQ ID NO:102に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がKS活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(c)SEQ ID NO:104に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がCLF活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(d)SEQ ID NO:106に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がAT活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;ならびに
(e)SEQ ID NO:108に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がER活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項70】
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:70、102、104、106、108および121に対して少なくとも90%同一である、請求項69記載の単離された核酸分子。
【請求項71】
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:70、102、104、106、108および121に対して少なくとも95%同一である、請求項69記載の単離された核酸分子。
【請求項72】
それぞれ、SEQ ID NO:70、102、104、106、108および121のポリヌクレオチド配列を含む、請求項69記載の単離された核酸分子。
【請求項73】
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:71に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドが、KS活性、CLF活性、AT活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含む、核酸分子;
(b)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:103に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがKS活性を含む、核酸分子;
(c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:105に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがCLF活性を含む、核酸分子;
(d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:107に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがAT活性を含む、核酸分子;ならびに
(e)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:109に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがER活性を含む、核酸分子。
【請求項74】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:71、103、105、107および109に対して少なくとも90%同一である、請求項73記載の単離された核酸分子。
【請求項75】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:71、103、105、107および109に対して少なくとも95%同一である、請求項73記載の単離された核酸分子。
【請求項76】
ポリペプチドがそれぞれ、SEQ ID NO:71、103、105、107および109のアミノ酸配列を含む、請求項73記載の単離された核酸分子。
【請求項77】
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)SEQ ID NO:72またはSEQ ID NO:122に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列が、DH活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(b)SEQ ID NO:110に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がDH活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;
(c)SEQ ID NO:112に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がDH活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子;ならびに
(d)SEQ ID NO:114に対して少なくとも80%同一なポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリヌクレオチド配列がER活性を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項78】
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:72、110、112、114および122に対して少なくとも90%同一である、請求項77記載の単離された核酸分子。
【請求項79】
ポリヌクレオチド配列がそれぞれ、SEQ ID NO:72、110、112、114および122に対して少なくとも95%同一である、請求項77記載の単離された核酸分子。
【請求項80】
それぞれ、SEQ ID NO:72、110、112、114および122のポリヌクレオチド配列を含む、請求項77記載の単離された核酸分子。
【請求項81】
以下のものからなる群より選択される、単離された核酸分子:
(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:73に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドが、DH活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含む、核酸分子;
(b)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:111に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがDH活性を含む、核酸分子;
(c)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:113に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがDH活性を含む、核酸分子;ならびに
(d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ポリペプチドがSEQ ID NO:115に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、かつ該ポリペプチドがER活性を含む、核酸分子。
【請求項82】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:73、111、113および115に対して少なくとも90%同一である、請求項81記載の単離された核酸分子。
【請求項83】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:73、111、113および115に対して少なくとも95%同一である、請求項81記載の単離された核酸分子。
【請求項84】
ポリペプチドがそれぞれ、SEQ ID NO:73、111、113および115のアミノ酸配列を含む、請求項81記載の単離された核酸分子。
【請求項85】
KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、CLF活性、AT活性、ER活性、DH活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子であって、
該ポリヌクレオチドが、請求項61〜84のいずれか一項記載のポリヌクレオチド配列の相補物と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子。
【請求項86】
請求項61〜84のいずれか一項記載のポリヌクレオチド配列に対して完全に相補的なポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項87】
請求項61〜85のいずれか一項記載の核酸分子またはそれらの組み合わせと、転写制御配列とを含む、組換え核酸分子。
【請求項88】
組換えベクターである、請求項87記載の組換え核酸分子。
【請求項89】
請求項61〜85のいずれか一項記載の核酸分子、請求項87もしくは請求項88記載の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを発現する、宿主細胞。
【請求項90】
植物細胞、微生物細胞、および動物細胞からなる群より選択される、請求項89記載の宿主細胞。
【請求項91】
微生物細胞である、請求項90記載の宿主細胞。
【請求項92】
細菌である、請求項91記載の微生物細胞。
【請求項93】
ヤブレツボカビである、請求項91記載の微生物細胞。
【請求項94】
ヤブレツボカビがシゾキトリウム属であるか、またはヤブレツボカビ属である、請求項93記載の微生物細胞。
【請求項95】
以下の段階を含む、少なくとも1種類のPUFAを産生するための方法:
宿主細胞において、PUFAを産生させるのに有効な条件下でPUFAシンターゼ遺伝子を発現させる段階であって、
該PUFAシンターゼ遺伝子が、請求項61〜85のいずれか一項記載の単離された核酸分子、請求項87もしくは請求項88記載の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを含み、かつ
少なくとも1種類のPUFAが産生される、段階。
【請求項96】
宿主細胞が、植物細胞、単離された動物細胞、および微生物細胞からなる群より選択される、請求項95記載の方法。
【請求項97】
少なくとも1種類のPUFAがDHAまたはエイコサペンタエン酸(EPA)を含む、請求項95記載の方法。
【請求項98】
以下の段階を含む、DHA、EPA、またはそれらの組み合わせに富む脂質を産生するための方法:
宿主細胞において、脂質を産生させるのに有効な条件下でPUFAシンターゼ遺伝子を発現させる段階であって、該PUFAシンターゼ遺伝子が、宿主細胞において、請求項61〜85のいずれか一項記載の単離された核酸分子、請求項87もしくは請求項88記載の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを含み、かつ
DHA、EPA、またはそれらの組み合わせに富む脂質が産生される、段階。
【請求項99】
請求項61〜85のいずれか一項記載の単離された核酸分子をベクター中に挿入する段階を含む、組換えベクターを作製する方法。
【請求項100】
請求項99記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する段階を含む、組換え宿主細胞を作製する方法。
【請求項101】
宿主細胞が、植物細胞、単離された動物細胞、および微生物細胞からなる群より選択される、請求項100記載の方法。
【請求項102】
請求項61〜85のいずれか一項記載のポリヌクレオチド配列によってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項103】
以下のものからなる群より選択される、単離されたポリペプチド:
(a)SEQ ID NO:69に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性、MAT活性、ACP活性、KR活性、DH活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチド;
(b)SEQ ID NO:75に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性を含むポリペプチド;
(c)SEQ ID NO:77に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、MAT活性を含むポリペプチド;
(d)SEQ ID NO:81、83、85、87、89、91、93、95、97または99のいずれか1つに対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ACP活性を含むポリペプチド;
(e)SEQ ID NO:79に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ACP活性を含むポリペプチド;
(f)SEQ ID NO:101に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KR活性を含むポリペプチド;ならびに
(g)SEQ ID NO:119に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性を含むポリペプチド。
【請求項104】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:69、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101および119に対して少なくとも90%同一である、請求項103記載の単離されたポリペプチド。
【請求項105】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:69、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101および119に対して少なくとも95%同一である、請求項103記載の単離されたポリペプチド。
【請求項106】
それぞれ、SEQ ID NO:69、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101および119のアミノ酸配列を含む、請求項103記載の単離されたポリペプチド。
【請求項107】
以下のものからなる群より選択される、単離されたポリペプチド:
(a)SEQ ID NO:71に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性、CLF活性、AT活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチド;
(b)SEQ ID NO:103に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KS活性を含むポリペプチド;
(c)SEQ ID NO:105に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、CLF活性を含むポリペプチド;
(d)SEQ ID NO:107に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、AT活性を含むポリペプチド;ならびに
(e)SEQ ID NO:109に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ER活性を含むポリペプチド。
【請求項108】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:71、103、105、107および109に対して少なくとも90%同一である、請求項107記載の単離されたポリペプチド。
【請求項109】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:71、103、105、107および109に対して少なくとも95%同一である、請求項107記載の単離されたポリペプチド。
【請求項110】
それぞれ、SEQ ID NO:71、103、105、107および109のアミノ酸配列を含む、請求項107記載の単離されたポリペプチド。
【請求項111】
以下のものからなる群より選択される、単離されたポリペプチド:
(a)SEQ ID NO:73に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性、ER活性、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPUFAシンターゼ活性を含むポリペプチド;
(b)SEQ ID NO:111に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性を含むポリペプチド;
(c)SEQ ID NO:113に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、DH活性を含むポリペプチド;ならびに
(d)SEQ ID NO:115に対して少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ER活性を含むポリペプチド。
【請求項112】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:73、111、113および115に対して少なくとも90%同一である、請求項111記載の単離されたポリペプチド。
【請求項113】
アミノ酸配列がそれぞれ、SEQ ID NO:73、111、113および115に対して少なくとも95%同一である、請求項111記載の単離されたポリペプチド。
【請求項114】
それぞれ、SEQ ID NO:73、111、113および115のアミノ酸配列を含む、請求項111記載の単離されたポリペプチド。
【請求項115】
融合ポリペプチドである、請求項102〜114のいずれか一項記載の単離されたポリペプチド。
【請求項116】
請求項102〜114のいずれか一項記載のポリペプチドと、生物学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項117】
以下の段階を含む、PUFAシンターゼ活性を有する生物におけるDHA、EPA、またはそれらの組み合わせの産生を増加させる方法:
生物において、請求項61〜85のいずれか一項記載の単離された核酸分子、請求項87もしくは請求項88記載の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを、DHA、EPA、またはそれらの組み合わせを産生させるのに有効な条件下で発現させる段階であって、
該PUFAシンターゼ活性が、該生物において、不活性な活性もしくは消失した活性に取って代わるか、新たな活性を導入するか、または既存の活性を増強し、かつ
該生物におけるDHA、EPA、またはそれらの組み合わせの産生が増加する、段階。
【請求項118】
以下の段階を含む、宿主細胞から脂質を単離する方法:
(a)宿主細胞において脂質を産生させるのに有効な条件下でPUFAシンターゼ遺伝子を発現させる段階であって、PKS系が、宿主細胞において、請求項61〜85のいずれか一項記載の単離された核酸分子、請求項87もしくは請求項88記載の組換え核酸分子、またはそれらの組み合わせを含む、段階、および
(b)宿主細胞から脂質を単離する段階。
【請求項119】
宿主細胞が、植物細胞、単離された動物細胞、および微生物細胞からなる群より選択される、請求項118記載の方法。
【請求項120】
脂質がDHA、EPA、またはそれらの組み合わせを含む、請求項118記載の方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4−1】
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【図4−2】
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【図4−3】
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【図4−4】
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【図4−5】
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【図4−6】
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【図4−7】
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【図5−1】
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【図5−2】
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【図5−3】
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【図5−4】
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【図5−5】
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【図6−1】
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【図6−2】
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【図6−3】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13−1】
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【図13−2】
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【図14−1】
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【図14−2】
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【図15】
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【図16−1】
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【図16−2】
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【図17−1】
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【図17−2】
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【図18】
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【図19】
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【図20】
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【図21】
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【図22】
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【公表番号】特表2012−521195(P2012−521195A)
【公表日】平成24年9月13日(2012.9.13)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−501000(P2012−501000)
【出願日】平成22年3月19日(2010.3.19)
【国際出願番号】PCT/US2010/028009
【国際公開番号】WO2010/108114
【国際公開日】平成22年9月23日(2010.9.23)
【出願人】(508004410)マーテック バイオサイエンシーズ コーポレーション (26)
【Fターム(参考)】