多孔質粒子、多孔質粒子の製造方法及び担体
【課題】直接体液灌流に使用可能で、血液、血漿をはじめとする体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去できる吸着材の担体及びその製造方法を提供すること。
【解決手段】多孔質粒子の製造方法であって、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン及びこれらの良溶媒を含み、且つエチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部に対するポリビニルピロリドンの割合が４５質量部以上の原液を調製する原液調製工程と、原液をノズルから吐出して、空走部を通過させた後に、貧溶媒中で粒子状に凝固させる成形工程とを備え、エチレン−ビニルアルコール共重合体のガラス転移温度をＴｇＥとしたときの貧溶媒の温度が（ＴｇＥ−２）℃以下であり、エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなり、排除限界分子量が２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下である、多孔質粒子の製造方法。
【解決手段】多孔質粒子の製造方法であって、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン及びこれらの良溶媒を含み、且つエチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部に対するポリビニルピロリドンの割合が４５質量部以上の原液を調製する原液調製工程と、原液をノズルから吐出して、空走部を通過させた後に、貧溶媒中で粒子状に凝固させる成形工程とを備え、エチレン−ビニルアルコール共重合体のガラス転移温度をＴｇＥとしたときの貧溶媒の温度が（ＴｇＥ−２）℃以下であり、エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなり、排除限界分子量が２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下である、多孔質粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質粒子、多孔質粒子の製造方法及び担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学、特に内科学、血液学、免疫学、臨床検査法の進歩により、疾患の原因あるいは進行と密接な関係を持っていると考えられる血液中の悪性物質が明らかになりつつある。例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等の自己免疫疾患に対する自己抗体や免疫複合体である。
【０００３】
体液中の悪性物質を除去する目的で従来知られている技術としては、（１）活性炭あるいは親水性高分子材料で表面を被覆した活性炭により血液から悪性物質を除去しようというもの、（２）血液を血球部分と血漿部分に分離し、自己免疫疾患における抗原、抗体、免疫複合体等の悪性物質を含む患者血漿を他の新鮮血漿と入れ替える血漿交換療法、（３）（２）と同様にして分離した血漿から、該血漿中に含まれる悪性物質を吸着材により吸着除去しようというもの、（４）（２）と同様にして分離した血漿を濾過器に通して、高分子量の悪性物質を除去しようとするもの等が挙げられる。
【０００４】
しかしながら、（１）の方法は直接血液を処理できるものの、活性炭は吸着選択性が悪く、また、細孔が小さいので高分子量の悪性物質をほとんど吸着できない。数多くの種類の疾患において、疾患の進行あるいは原因と密接な関係にある悪性物質が知られるようになり、この悪性物質を体液中より選択的に除去する要請が高まっているが、活性炭をベースとする吸着材では、この要求を満たすことができない。
【０００５】
また、（２）の方法は、（ｉ）多量の新鮮凍結血漿を必要とし、供給面の制約より一般的に普及できるものではない、（ｉｉ）他人の血漿を利用するため、ウィルスや未知の病原体、あるいはＨｂ抗原等の感染の危険が高い、といった欠点がある。
【０００６】
さらに、（３）の方法は、（２）が孕む欠点を克服するものではあるが、悪性物質の除去に用いる吸着材の存在により、（ｉｉｉ）プライミングボリュームが著しく増加せざるをえず、治療時の患者の生理的負担を増大させる、（ｉｖ）血液から血漿を分離する工程と、血漿から悪性物質を除去する工程とを同時に制御するための装置、及び高度に訓練された施術者を要する等の問題を内在している。
【０００７】
（４）の方法は高分子量の悪性物質を効果的に除去する目的においては重要な治療方法のひとつではあるが、技術要素の構成としては（３）の吸着除去工程が濾過工程に置き換わっているだけである。原理的には、濾過膜の孔径サイズを利用した分子篩効果で物質を分離しようとするものであり、ある特定の分子量範囲に限定した除去効果しか期待できず、選択的除去はできない。また、（３）が孕む問題を本質的に解決するものではない。
【０００８】
これらの問題点を解決する上で、直接血液灌流（Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｅｍｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）により血液から悪性物質を直接除去しうる血液浄化器あるいは血液浄化装置は意義深い。例えば、特許文献１に見られるような中空繊維の内表面や外表面に、抗体、抗原、酵素等を固定して対応する抗原、抗体等の悪性物質を吸着除去する試みにおいては、血漿分離工程と悪性物質の吸着除去工程がひとつのデバイスで同時に行われるため、プライミングボリューム増加や治療技術難易度の増加といった問題が解決しうると期待されるが、中空糸の細孔部分をも含めた多孔体全表面を利用したものは少なく、また、吸着能力が低いために実用化されたものはない。
【０００９】
体液中の悪性物質を除去可能な実用的且つ汎用性の高い吸着材を提供するための担体に求められる要素は、（Ｉ）直接血液灌流を行うことができる、（ＩＩ）除去対象となる悪性物質の分子量領域で効果的に分子篩効果を発揮して、悪性物質を担体内部に浸透させうる細孔を有する、（ＩＩＩ）除去対象となる悪性物質を十分に吸着するだけの担体全表面積を有する、といった特徴である。
【００１０】
元来、上記（ＩＩ）、（ＩＩＩ）のような特徴を有するものとしては、アフィニティクロマトグラフィ用の担体がよく知られるところであり、天然高分子系担体、ポリアクリルアミド系担体、ガラス系担体等がその代表例である。上記自己免疫疾患に深く関与していると考えられているＩｇＧ（分子量１５万Ｄａ）等、分子量２０万Ｄａ未満の分子を分離する技術としては、バイオプロセスにおける分離・精製工程で上記のごときアフィニティクロマトグラフィ用担体を用いる例が広く知られている。但し、バイオプロセスにおける分離・精製過程では、上記のごときアフィニティクロマトグラフィ用担体からなる分離材に供されるＩｇＧ等の分子量２０万Ｄａ未満の分子を含む試料は、数段階の前処理工程を経て粗精製されており、微粒子等の不溶物並びに不要な分子が除去されていることが一般的である。こうした前処理工程によって、ＩｇＧ等の分子量２０万Ｄａ未満の分子を含む試料が上記のごときアフィニティクロマトグラフィ用担体からなる分離材を流れる際の圧力損失等の問題は飛躍的に低減し、分離・精製の選択性は向上する。
【００１１】
一方、上記のようなアフィニティクロマトグラフィ用担体を体液中の悪性物質を吸着除去する体外循環治療に用いる場合には、次のような種々の問題点がある。すなわち、セルロースやデキストラン、あるいはアガロースに代表される天然系高分子担体は、ロイコペニア、スロンボサイトペニアを招来するといった化学的・生理学的な問題点の他、軟質ゲルであるためにゲル充填カラムに体液を高流速で流すことができないといった物理的問題がある。ポリアクリルアミド系担体は、物理的・化学的に比較的安定であるという長所を有するものの、血漿タンパクを非特異的に吸着し、アクリルアミドの残留毒性も無視し得ないという短所を有する。ガラス系担体も物理的・化学的安定性を有するものの、血漿タンパクの非特異吸着が著しく、また血液処理に用いる場合には血栓形成を引き起こすことから好ましくない。以上の問題点により、公知のアフィニティクロマトグラフィ用担体を体外循環治療用、とりわけ直接血液灌流用に使用することは困難であった。
【００１２】
他方、エチレン−ビニルアルコール共重合体は凝固・線溶系各因子や血小板に対する影響が軽度であり、優れた血液抗凝固性を有する材料であることが知られている。また補体・免疫系に対する影響も軽度であり、生体適合性の高い人工透析膜として実用化されている。
【００１３】
ここで、エチレン−ビニルアルコール共重合体からなる多孔質粒子を提供する方法としては、（Ａ）エチレンと酢酸ビニルを重合させ、エチレン−ビニルアルコール共重合体の多孔質粒子を得た後に、鹸化する方法、（Ｂ）エチレン−ビニルアルコール共重合体を直接加工し、多孔質粒子を得る方法、が考えられる。（Ａ）の方法において、多孔質粒子を得る重合方法としては、これまで、マイクロエマルション重合、乳化重合、ミニエマルション重合、分散重合、懸濁重合といった微粒子分散系ラジカル重合が一般的であった。しかし、これらはいずれも液相反応であり、エチレンのような気体を含めた気液二相系で微粒子の構造を制御することは困難であった。（Ｂ）の方法において、エチレン−ビニルアルコール共重合体の多孔性のフィルム、繊維又は粒子を得る方法としては、エチレン−ビニルアルコール共重合体を良溶媒に溶解させた原液を、貧溶媒中で相分離させる方法が知られている。
【００１４】
エチレン−ビニルアルコール共重合体以外では、例えばセルロースからなる多孔質球状粒子の作製において、チオシアン酸水溶液にセルロースを溶解させた原液を貧溶媒中で凝固させることで、排除限界分子量５０万Ｄａ以上５００万Ｄａ以下の多孔質球状粒子を得る方法が知られている（特許文献２）。
【００１５】
また、特許文献３によると、良溶媒にエチレン−ビニルアルコール共重合体を溶解させた溶液に、さらにポリビニルピロリドンと無機イオン吸着体とを混合したスラリーを原液とし、これを貧溶媒中で凝固させることで無機イオン吸着体が担持された多孔性（球状）成形体を得ることが開示されている。
【００１６】
さらに、特許文献４には、体外循環に用いることのできるエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む粒子が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特許２８１４３９９号公報
【特許文献２】特願平９−１７５８８号公報
【特許文献３】国際公開第２００５／０５６１７５号パンフレット
【特許文献４】特開２０１０−２３３８２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかしながら、これまで、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含み、直接体液灌流に使用可能で、分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去できる、吸着材の担体、並びにその製造方法は実用化されていなかった。
【００１９】
特許文献２には、セルロースからなる多孔質球状粒子を得る方法が開示されているものの、この方法を、セルロースとは異なり非水溶性の結晶性高分子であるエチレン−ビニルアルコール共重合体に適用することはできない。さらに、本発明者らの検討によれば、セルロースとは異なり、エチレン−ビニルアルコール共重合体は熱可塑性樹脂であると同時にガラス転移温度が比較的低いため、凝固過程において高分子鎖の収縮が起こりやすいという特徴を有する。エチレン−ビニルアルコール共重合体をフィルムや繊維に加工する際には、上述のような収縮は、外部から張力をかけることで容易に制御可能であるが、粒子を作製する過程では同様の張力を外部より働かせることは困難である。
【００２０】
この点に対する本発明者らの検討によると、特許文献３のような無機イオン吸着体が担持される多孔性成形体において、金属酸化物を主成分とする無機イオン吸着体は、排除体積効果を発揮するとともに、凝固により形成されるエチレン−ビニルアルコール共重合体の高分子フィブリル骨格の物理的強度を高めるため、結果的に凝固過程で起こる高分子鎖の収縮が抑制されることがわかった。しかし、特許文献３に記載されているエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む多孔質球状粒子は、水処理に適用されるものに過ぎないため無機イオンを吸着させることには適しているものの、体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を除去するために必要な排除限界分子量は有しておらず、さらに体液中から生命活動に必須なリン酸イオン等の無機イオンを吸着するおそれがあることから、体外循環用の担体には適さなかった。
【００２１】
また、特許文献４には、体外循環に用いることのできるエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む粒子が示されており、この粒子は、特許文献３のような無機イオン吸着体を含まず、血液から顆粒球及び単球を選択的に除去することはできるものの、血液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を除去するために必要なほどの排除限界分子量を有するものではなかった。
【００２２】
そこで、本発明は、直接体液灌流に使用可能で、血液、血漿をはじめとする体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去できる吸着材の担体として適用可能な多孔質粒子及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、鋭意検討の結果、エチレン−ビニルアルコール共重合体のごとき熱可塑性樹脂から排除限界分子量２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下の多孔質粒子を得るためには、驚くべきことに、多孔質粒子が有するエチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンの質量比と、エチレン−ビニルアルコール共重合体のガラス転移温度と凝固液温度との関係が重要であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２４】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１０］を提供するものである。
【００２５】
［１］ エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなる多孔質粒子の製造方法であって、
エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン及びこれらの良溶媒を含み、且つ前記エチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部に対する前記ポリビニルピロリドンの割合が４５質量部以上である原液を調製する原液調製工程と、
前記原液をノズルから吐出して、空走部を通過させた後に、前記エチレン−ビニルアルコール共重合体の貧溶媒中で粒子状に凝固させる成形工程と、
を備え、
前記エチレン−ビニルアルコール共重合体のガラス転移温度をＴｇＥとしたときの前記貧溶媒の温度が（ＴｇＥ−２）℃以下であり、
エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなり、排除限界分子量が２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下である多孔質粒子を製造する、多孔質粒子の製造方法。
［２］ 前記成形工程で得られた粒子を次亜塩素酸で表面改質する表面改質工程をさらに備える、［１］記載の製造方法。
［３］ 前記エチレン−ビニルアルコール共重合体は、エチレン含量が２０ｍｏｌ％以上５０ｍｏｌ％以下である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］ 前記良溶媒は、ジメチルスルホキシド及び／又はジメチルアセトアミドである、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］ 前記貧溶媒は、水、又は前記良溶媒を含む水である、［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］ ［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法で得ることのできる、多孔質粒子。
［７］ ［６］記載の多孔質粒子からなる、直接体液灌流吸着材用担体。
［８］ 前記体液は血液又は血漿である、［７］記載の担体。
［９］ 前記吸着材はＩｇＧ吸着材である、［７］又は［８］に記載の担体。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、直接体液灌流に使用可能で、血液、血漿などの体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去できる吸着材を製造するための多孔質粒子及びその製造方法を提供することができる。また、本発明の多孔質粒子を担体として、直接体液灌流に使用可能で、血液、血漿などの体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去できる吸着材を製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例２で製造した多孔質粒子の分画分子量曲線である。
【図２】実施例９で製造した多孔質粒子の分画分子量曲線である。
【図３】比較例１で製造した多孔質粒子の分画分子量曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明を限定するものではない。
【００２９】
本実施形態に係る、エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなり、排除限界分子量が２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下である、多孔質粒子の製造方法は、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン及び良溶媒の混合物からなる原液を調製する原液調製工程と、上記原液をノズルから吐出し、空走部を経た後（すなわち空走部を通過させた後）、貧溶媒の中に浸漬させ、溶媒交換によりポリマーのゲル化（粒子状の凝固）を行わせて多孔質体を形成する成形工程とを備える方法であり、かかる方法は湿式相分離法を原理とする。これらの過程で良溶媒の比率が減少し、それにつれてミクロ相分離が生じ、ポリマーの小球が形成され、成長し、絡み合い、フィブリルが形成され、フィブリルの隙間が連通孔となり、多孔質粒子が形成される。
【００３０】
ここで、多孔質粒子の排除限界分子量とは、多孔質粒子をカラムに充填し、このカラムに所定の物質を含む液体を通したときに、分離（排除）ができなくなる最小の分子量を表す。上記排除限界分子量より大きな分子量を有する物質は、多孔質粒子の微細孔の中に入ることができず、分離（排除）ができなくなるためである。
【００３１】
「エチレン−ビニルアルコール共重合体」とはエチレンとビニルアルコールとの共重合体であるが、一般的には酢酸ビニルモノマーとエチレンとを共重合させて得られるエチレン−酢酸ビニル共重合体を鹸化して製造される。エチレン−ビニルアルコール共重合体は、ランダム、ブロック、グラフト等いずれのタイプの共重合体であってもよい。
【００３２】
エチレン−ビニルアルコール共重合体のエチレン含量は、２０ｍｏｌ％以上５０ｍｏｌ％以下であることが好ましく、２４ｍｏｌ％以上４８ｍｏｌ％以下がより好ましい。エチレン−ビニルアルコール共重合体において、エチレン含量が２０ｍｏｌ％未満であると、親水性が高くなるため、後述する貧溶媒への溶解性が増してしまい、多孔質粒子の成形が困難になるおそれがある。また、エチレン含量が５０ｍｏｌ％を超えると、球状に造粒するのが困難になる傾向があると同時に、エチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンの後述する良溶媒への溶解性が低下する傾向がある。
【００３３】
エチレン−ビニルアルコール共重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）の範囲は、１万Ｄａ以上３００万Ｄａ以下であることが好ましく、１万５千Ｄａ以上１５０万Ｄａ以下であることがより好ましい。Ｍｗが１万Ｄａ未満の場合、滅菌処理、特に放射線滅菌処理を実施した際にポリマーの分子量が低下し、水等の貧溶媒に対する溶出量が増加する傾向にある。またＭｗが３００万Ｄａを超えると、溶剤への溶解度が低下する傾向にあり、さらに重合の際、安定して製造できない傾向にある等の懸念がある。なお、エチレン−ビニルアルコール共重合体のＭｗは種々の公知の方法により求められるが、本実施形態においては、ポリエチレンオキサイドを標準とするゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる測定を採用している。
【００３４】
エチレン−ビニルアルコール共重合体と共に多孔質粒子を構成するポリビニルピロリドンの重量平均分子量（Ｍｗ）は、２，０００Ｄａ以上２００万Ｄａ以下の範囲が好ましく、２，０００Ｄａ以上１００万Ｄａ以下の範囲がより好ましく、２，０００Ｄａ以上１０万Ｄａ以下の範囲がさらに好ましいほか、より大きい排除限界分子量を得る観点から、２万Ｄａ以上２００万Ｄａ以下の範囲がより好ましく、２０万Ｄａ以上２００万Ｄａ以下の範囲がさらに好ましい。重量平均分子量が２，０００Ｄａより小さいと、多孔質粒子がフィブリルを有する場合に、フィブリル内部に空隙を有する構造を発現させる効果が低くなる傾向にあり、２００万Ｄａを超えると、成形工程における粘度が上昇して、粒子の形成が難しくなる傾向にある。なお、ポリビニルピロリドンのＭｗは、エチレン−ビニルアルコール共重合体のＭｗと同様の方法により測定可能である。
【００３５】
水溶性高分子であるポリビニルピロリドンは、上述した相分離の過程においてフィブリルの表面からその分子鎖を一部、あたかもヒゲのように伸ばすため、これによってフィブリルの表面は親水性に保たれることにより、本実施形態の製造方法により得られる多孔質粒子における疎水的吸着の抑制効果が期待できる。
【００３６】
原液中のエチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンの比率（質量比）は、エチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部に対してポリビニルピロリドン４５質量部以上であり、好ましくは４５〜２００質量部であり、より好ましくは４５〜１００質量部である。エチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部に対する上記比率が、ポリビニルピロリドン４５質量部以上であることにより、成形工程中の凝固過程において発生するエチレン−ビニルアルコール共重合体高分子鎖の収縮が抑制され、得られる多孔質粒子の細孔サイズの縮小又は空孔率の減少が抑制される傾向がある。
【００３７】
原液調製工程で用いる良溶媒は、エチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンとを共に溶解するものであればよい。上記良溶媒は、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等であり、好ましくはジメチルスルホキシド及び／又はジメチルアセトアミドである。これらの良溶媒は単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。原液中の良溶媒の含有量は、原液の総質量を基準として、５０質量％以上９８質量％以下であることが好ましく、７０質量％以上９５質量％以下であることがより好ましい。良溶媒の温度は、エチレン−ビニルアルコール共重合体のガラス転移温度をＴｇＥとしたとき、（ＴｇＥ−１０）〜（ＴｇＥ＋２０）℃であると好ましく、（ＴｇＥ−５）〜（ＴｇＥ＋１０）℃であるとより好ましい。良溶媒がこのような温度であると、エチレン−ビニルアルコール共重合体およびポリビニルピロリドンが溶液中で十分に相溶した状態となる傾向にある。
【００３８】
成形工程で用いる貧溶媒は、エチレン−ビニルアルコール共重合体を溶解しないがポリビニルピロリドンを溶解するものであればよい。上記貧溶媒は、例えば、水、上記良溶媒を含む水等である。貧溶媒中に良溶媒を含有させることにより、凝固の速度を種々変化させることができ、エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドン混合物からのポリビニルピロリドンの溶出の程度を制御することができる。
【００３９】
上記多孔質粒子の製造方法における成形工程において、「空走部を通過させる」とは、ノズルから吐出された原液が、すぐに貧溶媒に接触しないように、一旦、空気中（又は不活性ガス等の気体中）を通過させることをいう。原液をノズルから吐出した後、空走部を通過させる距離は、５〜１５０ｃｍであると好ましく、２０〜１００ｃｍであるとより好ましい。また、通過時間は、０．１〜５秒であると好ましく、０．１４〜２秒であるとより好ましい。このような空走時間とすることで、吐出された原液からなる液滴が表面張力によって球状となる傾向にある。
【００４０】
また、多孔質粒子の製造において原液として使用するエチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン及び良溶媒の混合物は、５０℃における粘度が１０００ｍＰａ・ｓ以上６５００ｍＰａ・ｓ以下であることが好ましく、１０００ｍＰａ・ｓ以上５３００ｍＰａ・ｓ以下であることがより好ましい。１０００ｍＰａ・ｓ未満の場合、吐出される原液中のポリマー濃度が低いために貧溶媒中での凝固の進行が遅く、貧溶媒の中に浸漬される際の気液界面において受ける衝撃により粒子が変形し易くなり、特に６００ｍＰａ・ｓ以下では液滴の凝固が極めて困難になる。一方、６５００ｍＰａ・ｓを超えると、原液のノズルからの吐出が困難となる。なお、原液の粘度は、回転粘度計を用いて、回転数２０ｒｐｍとしたときの測定値である。
【００４１】
多孔質粒子の製造方法における成形工程において、上記貧溶媒の温度は、エチレン−ビニルアルコール共重合体のガラス転移温度をＴｇＥとしたとき、（ＴｇＥ−２）℃以下である。貧溶媒の温度は、５℃以上（ＴｇＥ−２）℃以下であることが好ましく、１０℃以上（ＴｇＥ−２）℃以下であることがより好ましい。５℃未満であると、貧溶媒の凝固点に近づくため粒子の製造が困難になる場合がある。また、（ＴｇＥ−２）℃よりも高い温度であると、エチレン−ビニルアルコール共重合体の収縮が進行し、排除限界分子量に影響を及ぼす細孔のサイズが縮小する（又は空孔率が減少する）傾向があり、血液、血漿をはじめとする体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質（病因物質）を高い効率、かつ高い選択性で除去できる吸着材に使用できる多孔質粒子を得ることが困難になる。
【００４２】
また、成形工程では、原液を貧溶媒中で凝固させて粒子状の成形体を得るが、その方法としては、ノズルからの吐出により形成された原液の液滴を貧溶媒に浸漬させる方法や、原液の液滴に貧溶媒を吹き付ける方法等が挙げられる。良好に粒子を形成する観点からは、原液の液滴を貧溶媒に浸漬させることが好ましく、その場合、浸漬時間は３００〜５４００秒とすることが好ましく、６００〜３６００秒とすることがより好ましい。
【００４３】
本実施形態に係る製造方法は、必要に応じて、上述した成形工程の後に、エッチング、アニーリング等の処理によって粒子表面を改質する表面改質工程をさらに備えていてもよい。表面改質方法としては、例えば、次亜塩素酸処理やポリマーのガラス転移温度以上結晶化温度未満の温度状況下でのインキュベート等がある。次亜塩素酸を用いる際の濃度は１００ｐｐｍ以上８０００ｐｐｍ以下であることが好ましい。多孔質粒子表面を次亜塩素酸処理にて改質することにより、多孔質粒子の空孔径、空孔率、比表面積を増大させることができる。
【００４４】
本実施形態に係る製造方法により得られる多孔質粒子は、エチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンからなり、排除限界分子量が２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下である。本実施形態に係る製造方法により得られる多孔質粒子を担体として吸着材を製造すれば、血液、血漿をはじめとする体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質（病因物質）を高い効率、かつ高い選択性で除去し得る。この際、粒子を一体型に加工してモノリス状にして用いてもよい。
【００４５】
多孔質粒子の「平均粒径」は、真球の場合は、任意に選んだ１０個の多孔質粒子の直径の平均値を指し、非真球の場合は、任意に選んだ１０個の多孔質粒子について、マイクロスコープで任意の方向の径を２回／個計測したときの平均値を指す。多孔質粒子の平均粒径は、好ましくは９０μｍ以上６００μｍ以下である。平均粒径が９０μｍより小さいと、粒子間の空隙が狭くなって血液が通りにくくなり、圧力損失が増加する傾向にある。平均粒径が６００μｍより大きいと、単位体積当たりの粒子表面積が小さくなり、吸着効率が低下しやすくなる傾向にある。
【００４６】
多孔質粒子の「比表面積」は、通常１０ｍ２／ｇ以上６５ｍ２／ｇ以下であることが好ましく、２５ｍ２／ｇ以上６５ｍ２／ｇ以下であることがより好ましく、４５ｍ２／ｇ以上６５ｍ２／ｇ以下であることがさらに好ましい。また、空孔率が７０％以上の多孔質粒子であることが好ましい。比表面積が１０ｍ２／ｇ未満になると、血液、血漿をはじめとする体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質（病因物質）を十分に吸着するための表面積を確保できない傾向がある。一方、６５ｍ２／ｇよりも大きい場合、上記多孔質粒子の空孔率が増大しすぎて血液、血漿をはじめとする体液を灌流した場合の圧力損失に耐えうるだけの強度を確保できなくなるか、あるいは排除限界分子量が２０万Ｄａ未満となる傾向がある。
【００４７】
比表面積は、乾燥粒子単位重量あたりに吸着した窒素ガスが占有する表面積で表される。つまり比表面積は単位重量の粒子を構成する物質が乾燥状態でいかに有効に表面を形成しているかを示している。多孔質粒子の比表面積は、高分子ゲルの比表面積を求める際に最も一般的な窒素ガスによるＢＥＴ法で求められる。一般に高分子ゲルは、そのゲルと親和性のある媒体中で膨潤し、乾燥すると収縮する。膨潤時に媒体が満たされているポアが架橋の網目のみで維持されている軟質ゲルの場合は、乾燥すると網目がつぶれてしまい、ポアはほとんど消失する。この場合の比表面積は、ほとんど粒子の外側だけの値になるため、一般に１ｍ２／ｇ以下の低い値を示す。従来アフィニティクロマトグラフィ用として知られているアガロースは軟質ゲルであるため、乾燥によってポアが消失してしまう。さらには、つぶれやすい軟質の網目を持っているために、カラムに充填し体外循環に用いる場合にも、体液を長時間、高流速で流すことはできない。一方、ポアがしっかりした構造を持ち、凍結乾燥に耐える硬質ゲルである場合には、乾燥した際にポアは多少収縮するものの膨潤時の状態をほとんど維持する。つまり、硬質ゲルはパーマネントポアを有し、比表面積は一般的に軟質ゲルよりも高い値を示す。
【００４８】
上述のように、多孔質粒子は複数のフィブリルから形成されているが、このフィブリルは内部に空隙を有し表面が開口していることが好ましい。フィブリルの平均径は通常０．０１μｍ〜５０μｍであり、フィブリル表面の開孔径は、通常０．００１μｍ〜５μｍである。また、フィブリル間の隙間は通常０．０１μｍ〜５μｍである。
【００４９】
このような多孔質粒子は、上述した製造方法、すなわち、原液調製工程、成形工程、及び、必要に応じて表面改質工程を経る方法により得ることができる。この方法では、原液調製工程においてエチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンの質量比を上記特定の範囲とし、成形工程において貧溶媒の温度を上記特定の範囲とし、さらに必要に応じて表面改質工程において適切な条件で表面改質することによって、２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下という特定範囲の排除限界分子量を有する多孔質粒子を得ることが可能となる。
【００５０】
多孔質粒子には公知の方法を用いて様々なリガンドを結合させて、直接体液灌流吸着材を製造することができる。リガンドとしては、抗体、抗体断片、タンパク質、ペプチド、低分子化合物が使用可能であり、目的に応じて適宜選択すればよい。多孔質粒子にリガンドを結合させることにより、分子量２０万Ｄａ未満の抗原、抗体等の悪性物質、特にＩｇＧを高い効率且つ高い選択性で除去できる吸着材を得ることができる。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明の実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。なお、実施例においては、多孔質粒子の種々の物性を、以下の方法で測定した。
【００５２】
（平均粒径）
マイクロスコープ（株式会社キーエンス製、商品名：ＶＨ７０００）を用いて、多孔質粒子の粒径を測定した。多孔質粒子が真球の場合は、任意に選んだ１０個の多孔質粒子について直径を測定し、その平均値を平均粒径とし、他方、非真球の場合は任意に選んだ１０個の多孔質粒子について、マイクロスコープで任意の方向の径を２回／個計測し、その平均値を平均粒径とした。
【００５３】
（比表面積）
ＴｒｉＳｔａｒ３０００（株式会社島津製作所製）を用いて、窒素ガス吸着によるＢＥＴ法により、多孔質粒子の比表面積を求めた。測定に用いるサンプルは乾燥している必要があるため、本発明では水で膨潤させた多孔質粒子を凍結乾燥し、これをサンプルとして測定に用いた。
【００５４】
（排除限界分子量）
実施例及び比較例で得られる多孔質粒子を純水で膨潤させ、超音波処理による脱気泡操作の後、内径７．６ｍｍφ、カラム長５ｃｍの高速液体クロマトグラフィー用空カラム（ジーエルサイエンス株式会社製）に充填し、スパナを用いてこれを閉じ、排除限界分子量評価用カラムとした。該カラムを高速液体クロマトグラフィー装置（株式会社島津製作所製、商品名：ＬＣ２０Ａ）に接続した後、流速０．１ｍＬ／分にてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を灌流し、ＲＩ検出器によるモニター画面にてベースラインが一定となるまで流し続けた。ベースラインが安定化した後、標準分子量物質としてプルランＰ８００（分子量７８８ＫＤａ）、Ｐ４００（分子量４０４ＫＤａ）、Ｐ２００（分子量２１２ＫＤａ）、Ｐ１００（分子量１１２ＫＤａ）、Ｐ５０（分子量４７．３ＫＤａ）、Ｐ２０（分子量２２．８ＫＤａ）、Ｐ１０（分子量１１．８ＫＤａ）、Ｐ５（分子量５．９ＫＤａ）（昭和電工株式会社製）、エチレングリコール（和光純薬工業株式会社製）、及びヒトＩｇＧ（シグマ・アルドリッチ株式会社製）を溶解させたＰＢＳ溶液を各々調製し、これら標準分子量物質溶液を順次注入して保持時間（分）を測定した。さらに、分子量に対し、下記式により算出される溶出容量（ｍＬ）を各々プロットして分画分子量曲線を得た。
溶出容量（ｍＬ）＝流速（ｍＬ／分）×保持時間（分）
【００５５】
上記分画分子量曲線中、グラフ縦軸に平行で且つプルランＰ８００の点を通る直線Ａと、直線Ａよりもグラフ右側に位置する点のうち最も溶出容量の小さな点における接線Ｂとの交点をＣとしたとき、交点Ｃの分子量を排除限界分子量とした。
【００５６】
排除限界分子量以上の分子量の物質は多孔質粒子の微細孔に入ることができず、また、分子量の高低によらず微細孔外の同一容積の空間を流れることになるので、同一の溶出容量を与える。一方、排除限界分子量未満の分子量の物質については、分子量の高低によって微細孔内への浸透し易さに差が生じるため、低分子量の物質ほど溶出容量が大きくなる。但し、ある分子量よりも低い分子量の物質になると、微細孔内に完全に浸透しきってしまうために同一の溶出容量を与える。
【００５７】
（実施例１）
エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（株式会社クラレ製、エバール（登録商標）Ｆ１０１（商品名）、エチレン含量３２ｍｏｌ％、ＴｇＥ５７℃）２００ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ Ｋ８５（商品名））９０ｇ、良溶媒であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）１７１０ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一な原液（混合液）を得た。
【００５８】
得られた原液をノズル（内径０．５５ｍｍ）から吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、５５℃の水（貧溶媒）からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径４１０μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。
【００５９】
得られた多孔質粒子をカラムに充填し、室温でヘパリン加生理食塩水（ヘパリン濃度５０００ＩＵ／Ｌ）を１０ｍＬ流し、プライミングを行った。その後、抗凝固剤としてヘパリンを添加したヒト新鮮血液（ヘパリン濃度５０００ＩＵ／Ｌ）１０．３ｍＬを、室温下、流速１２．３ｍＬ／ｈでシリンジポンプにより流したところ、溶血することなく流れることを確認した。この際、カラムに接続された回路の内圧は２．１ＫＰａ以下で推移した。
【００６０】
（実施例２）
５０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１と同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径４３３μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に、分画分子量曲線を図１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６１】
得られた多孔質粒子１０ｍＬを、２．６ｍＬの水酸化ナトリウム水溶液（濃度１６．７Ｍ）、１４ｍＬのＤＭＳＯ及び１２ｍＬのエピクロロヒドリンからなる反応溶液に添加し、３０℃で２時間攪拌した。反応後の多孔質粒子をグラスフィルター３Ｇで濾過回収し、純水で十分に洗浄した後、２−（２−アミノエチル）チオフェンを濃度５．９ｇ／Ｌで含むｐＨ９．６の炭酸水素ナトリウム緩衝液２０ｍＬ中、５０℃で１７時間攪拌し、反応させた。反応後の多孔質粒子をグラスフィルター３Ｇで濾過回収し、５０℃の温水で洗浄した。反応前後の反応溶液の紫外吸光度変化から、１ｍＬの多孔質粒子あたり２−（２−アミノエチル）チオフェンは８７μｍｏｌ固定化されたことがわかった。
【００６２】
得られた２−（２−アミノエチル）チオフェン固定化多孔質粒子１ｍＬを、室温でヘパリン加生理食塩水（ヘパリン濃度５０００ＩＵ／Ｌ）１０ｍＬで洗浄した後、ポリプロピレンチューブ中で抗凝固剤としてヘパリンを添加したヒト新鮮血液（ヘパリン濃度５０００ＩＵ／Ｌ）２ｍＬと混合し、ミックスローターを用いて室温下２時間攪拌した。攪拌終了後、多孔質粒子をコマフィルターで濾過して除き、回収された血液から３５００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理で血漿を分離した。得られた血漿に対して、アルブミン、ＩｇＧ、フィブリノーゲンの濃度測定を実施した。下記の式により定義される除去率は各々３４％、８２％、５％であった。
除去率（％）＝｛１−（処理後の濃度／処理前の濃度）｝×１００
【００６３】
（実施例３）
３０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径５９６μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６４】
（実施例４）
１０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径５５０μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６５】
（実施例５）
５℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径５６２μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６６】
（実施例６）
エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｆ１０１（商品名）、エチレン含量３２ｍｏｌ％、ＴｇＥ５７℃）４０ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ Ｋ８５（商品名））１８ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）４４２ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一な原液（混合液）を得た。
得られた原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、４０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径５３２μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６７】
（実施例７）
エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｍ１００Ｂ（商品名）、エチレン含量２４ｍｏｌ％、ＴｇＥ６０℃）３８．５ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製 Ｌｕｖｉｔｅｃ、Ｋ８５（商品名））３８．５ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）４２３ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一な原液（混合液）を得た。
得られた原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、４０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径４６０μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６８】
（実施例８）
エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｇ１５６Ｂ（商品名）、エチレン含量４８ｍｏｌ％、ＴｇＥ５０℃）２８．５ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ Ｋ８５（商品名））２８．５ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬株式会社製）４４３ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一な原液（混合液）を得た。
得られた原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、４０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径４９５μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６９】
（実施例９）
実施例２と同様の工程を経て得られた多孔質粒子１０ｍＬをファルコンチューブに移し入れ、５０００ｐｐｍの次亜塩素酸ナトリウム水溶液５ｍＬを添加した後、５０℃で２時間振盪した。振盪後の多孔質粒子を回収し、純水にて洗浄を行い、平均粒径４３３μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に、分画分子量曲線を図２に各々示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
上記で得られた多孔質粒子を用いて、実施例２と同様の方法にて２−（２−アミノエチル）チオフェン固定化多孔質粒子を作製し、血液中のアルブミン、ＩｇＧ、フィブリノーゲンの除去率を求めたところ、各々４０％、９０％、１０％であった。
【００７０】
（実施例１０）
２０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径５４９μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００７１】
（実施例１１）
内径０．１５ｍｍのノズルを用いて吐出した以外は実施例１０と同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径１０１μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００７２】
（比較例１）
６０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径４００μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に、分画分子量曲線を図３に各々示す。
上記で得られた多孔質粒子を用いて、実施例２と同様の方法により、２−（２−アミノエチル）チオフェン固定化多孔質粒子を得、同様の洗浄操作を行った。粒子１ｍＬ当たり、８０μｍｏｌの２−（２−アミノエチル）チオフェンが固定化された。この粒子を用いて、実施例２と同様の方法で血液中のアルブミン、ＩｇＧ、フィブリノーゲンの除去率を求めたところ、各々１０％、７％、５％であった。
【００７３】
（比較例２）
６０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例７同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径３５９μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。
【００７４】
（比較例３）
６０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例８同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径３９３μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。
【００７５】
（比較例４）
エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｆ１０１（商品名）、エチレン含量３２ｍｏｌ％、ＴｇＥ５７℃）５０ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ Ｋ８５（商品名））１３．５ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）４３６．５ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一な原液（混合液）を得た。
得られた原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、６０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径３９９μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。
【００７６】
（比較例５）
エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｆ１０１（商品名）、エチレン含量３２ｍｏｌ％、ＴｇＥ５７℃）５０ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ Ｋ８５（商品名））６ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）４４４ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一な原液（混合液）を得た。
得られた原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、６０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径３９８μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。
【００７７】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の多孔質粒子の製造方法は、血液、血漿などの体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去する直接体液灌流吸着材の担体の製造方法として有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質粒子、多孔質粒子の製造方法及び担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学、特に内科学、血液学、免疫学、臨床検査法の進歩により、疾患の原因あるいは進行と密接な関係を持っていると考えられる血液中の悪性物質が明らかになりつつある。例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等の自己免疫疾患に対する自己抗体や免疫複合体である。
【０００３】
体液中の悪性物質を除去する目的で従来知られている技術としては、（１）活性炭あるいは親水性高分子材料で表面を被覆した活性炭により血液から悪性物質を除去しようというもの、（２）血液を血球部分と血漿部分に分離し、自己免疫疾患における抗原、抗体、免疫複合体等の悪性物質を含む患者血漿を他の新鮮血漿と入れ替える血漿交換療法、（３）（２）と同様にして分離した血漿から、該血漿中に含まれる悪性物質を吸着材により吸着除去しようというもの、（４）（２）と同様にして分離した血漿を濾過器に通して、高分子量の悪性物質を除去しようとするもの等が挙げられる。
【０００４】
しかしながら、（１）の方法は直接血液を処理できるものの、活性炭は吸着選択性が悪く、また、細孔が小さいので高分子量の悪性物質をほとんど吸着できない。数多くの種類の疾患において、疾患の進行あるいは原因と密接な関係にある悪性物質が知られるようになり、この悪性物質を体液中より選択的に除去する要請が高まっているが、活性炭をベースとする吸着材では、この要求を満たすことができない。
【０００５】
また、（２）の方法は、（ｉ）多量の新鮮凍結血漿を必要とし、供給面の制約より一般的に普及できるものではない、（ｉｉ）他人の血漿を利用するため、ウィルスや未知の病原体、あるいはＨｂ抗原等の感染の危険が高い、といった欠点がある。
【０００６】
さらに、（３）の方法は、（２）が孕む欠点を克服するものではあるが、悪性物質の除去に用いる吸着材の存在により、（ｉｉｉ）プライミングボリュームが著しく増加せざるをえず、治療時の患者の生理的負担を増大させる、（ｉｖ）血液から血漿を分離する工程と、血漿から悪性物質を除去する工程とを同時に制御するための装置、及び高度に訓練された施術者を要する等の問題を内在している。
【０００７】
（４）の方法は高分子量の悪性物質を効果的に除去する目的においては重要な治療方法のひとつではあるが、技術要素の構成としては（３）の吸着除去工程が濾過工程に置き換わっているだけである。原理的には、濾過膜の孔径サイズを利用した分子篩効果で物質を分離しようとするものであり、ある特定の分子量範囲に限定した除去効果しか期待できず、選択的除去はできない。また、（３）が孕む問題を本質的に解決するものではない。
【０００８】
これらの問題点を解決する上で、直接血液灌流（Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｅｍｏｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）により血液から悪性物質を直接除去しうる血液浄化器あるいは血液浄化装置は意義深い。例えば、特許文献１に見られるような中空繊維の内表面や外表面に、抗体、抗原、酵素等を固定して対応する抗原、抗体等の悪性物質を吸着除去する試みにおいては、血漿分離工程と悪性物質の吸着除去工程がひとつのデバイスで同時に行われるため、プライミングボリューム増加や治療技術難易度の増加といった問題が解決しうると期待されるが、中空糸の細孔部分をも含めた多孔体全表面を利用したものは少なく、また、吸着能力が低いために実用化されたものはない。
【０００９】
体液中の悪性物質を除去可能な実用的且つ汎用性の高い吸着材を提供するための担体に求められる要素は、（Ｉ）直接血液灌流を行うことができる、（ＩＩ）除去対象となる悪性物質の分子量領域で効果的に分子篩効果を発揮して、悪性物質を担体内部に浸透させうる細孔を有する、（ＩＩＩ）除去対象となる悪性物質を十分に吸着するだけの担体全表面積を有する、といった特徴である。
【００１０】
元来、上記（ＩＩ）、（ＩＩＩ）のような特徴を有するものとしては、アフィニティクロマトグラフィ用の担体がよく知られるところであり、天然高分子系担体、ポリアクリルアミド系担体、ガラス系担体等がその代表例である。上記自己免疫疾患に深く関与していると考えられているＩｇＧ（分子量１５万Ｄａ）等、分子量２０万Ｄａ未満の分子を分離する技術としては、バイオプロセスにおける分離・精製工程で上記のごときアフィニティクロマトグラフィ用担体を用いる例が広く知られている。但し、バイオプロセスにおける分離・精製過程では、上記のごときアフィニティクロマトグラフィ用担体からなる分離材に供されるＩｇＧ等の分子量２０万Ｄａ未満の分子を含む試料は、数段階の前処理工程を経て粗精製されており、微粒子等の不溶物並びに不要な分子が除去されていることが一般的である。こうした前処理工程によって、ＩｇＧ等の分子量２０万Ｄａ未満の分子を含む試料が上記のごときアフィニティクロマトグラフィ用担体からなる分離材を流れる際の圧力損失等の問題は飛躍的に低減し、分離・精製の選択性は向上する。
【００１１】
一方、上記のようなアフィニティクロマトグラフィ用担体を体液中の悪性物質を吸着除去する体外循環治療に用いる場合には、次のような種々の問題点がある。すなわち、セルロースやデキストラン、あるいはアガロースに代表される天然系高分子担体は、ロイコペニア、スロンボサイトペニアを招来するといった化学的・生理学的な問題点の他、軟質ゲルであるためにゲル充填カラムに体液を高流速で流すことができないといった物理的問題がある。ポリアクリルアミド系担体は、物理的・化学的に比較的安定であるという長所を有するものの、血漿タンパクを非特異的に吸着し、アクリルアミドの残留毒性も無視し得ないという短所を有する。ガラス系担体も物理的・化学的安定性を有するものの、血漿タンパクの非特異吸着が著しく、また血液処理に用いる場合には血栓形成を引き起こすことから好ましくない。以上の問題点により、公知のアフィニティクロマトグラフィ用担体を体外循環治療用、とりわけ直接血液灌流用に使用することは困難であった。
【００１２】
他方、エチレン−ビニルアルコール共重合体は凝固・線溶系各因子や血小板に対する影響が軽度であり、優れた血液抗凝固性を有する材料であることが知られている。また補体・免疫系に対する影響も軽度であり、生体適合性の高い人工透析膜として実用化されている。
【００１３】
ここで、エチレン−ビニルアルコール共重合体からなる多孔質粒子を提供する方法としては、（Ａ）エチレンと酢酸ビニルを重合させ、エチレン−ビニルアルコール共重合体の多孔質粒子を得た後に、鹸化する方法、（Ｂ）エチレン−ビニルアルコール共重合体を直接加工し、多孔質粒子を得る方法、が考えられる。（Ａ）の方法において、多孔質粒子を得る重合方法としては、これまで、マイクロエマルション重合、乳化重合、ミニエマルション重合、分散重合、懸濁重合といった微粒子分散系ラジカル重合が一般的であった。しかし、これらはいずれも液相反応であり、エチレンのような気体を含めた気液二相系で微粒子の構造を制御することは困難であった。（Ｂ）の方法において、エチレン−ビニルアルコール共重合体の多孔性のフィルム、繊維又は粒子を得る方法としては、エチレン−ビニルアルコール共重合体を良溶媒に溶解させた原液を、貧溶媒中で相分離させる方法が知られている。
【００１４】
エチレン−ビニルアルコール共重合体以外では、例えばセルロースからなる多孔質球状粒子の作製において、チオシアン酸水溶液にセルロースを溶解させた原液を貧溶媒中で凝固させることで、排除限界分子量５０万Ｄａ以上５００万Ｄａ以下の多孔質球状粒子を得る方法が知られている（特許文献２）。
【００１５】
また、特許文献３によると、良溶媒にエチレン−ビニルアルコール共重合体を溶解させた溶液に、さらにポリビニルピロリドンと無機イオン吸着体とを混合したスラリーを原液とし、これを貧溶媒中で凝固させることで無機イオン吸着体が担持された多孔性（球状）成形体を得ることが開示されている。
【００１６】
さらに、特許文献４には、体外循環に用いることのできるエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む粒子が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特許２８１４３９９号公報
【特許文献２】特願平９−１７５８８号公報
【特許文献３】国際公開第２００５／０５６１７５号パンフレット
【特許文献４】特開２０１０−２３３８２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかしながら、これまで、エチレン−ビニルアルコール共重合体を含み、直接体液灌流に使用可能で、分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去できる、吸着材の担体、並びにその製造方法は実用化されていなかった。
【００１９】
特許文献２には、セルロースからなる多孔質球状粒子を得る方法が開示されているものの、この方法を、セルロースとは異なり非水溶性の結晶性高分子であるエチレン−ビニルアルコール共重合体に適用することはできない。さらに、本発明者らの検討によれば、セルロースとは異なり、エチレン−ビニルアルコール共重合体は熱可塑性樹脂であると同時にガラス転移温度が比較的低いため、凝固過程において高分子鎖の収縮が起こりやすいという特徴を有する。エチレン−ビニルアルコール共重合体をフィルムや繊維に加工する際には、上述のような収縮は、外部から張力をかけることで容易に制御可能であるが、粒子を作製する過程では同様の張力を外部より働かせることは困難である。
【００２０】
この点に対する本発明者らの検討によると、特許文献３のような無機イオン吸着体が担持される多孔性成形体において、金属酸化物を主成分とする無機イオン吸着体は、排除体積効果を発揮するとともに、凝固により形成されるエチレン−ビニルアルコール共重合体の高分子フィブリル骨格の物理的強度を高めるため、結果的に凝固過程で起こる高分子鎖の収縮が抑制されることがわかった。しかし、特許文献３に記載されているエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む多孔質球状粒子は、水処理に適用されるものに過ぎないため無機イオンを吸着させることには適しているものの、体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を除去するために必要な排除限界分子量は有しておらず、さらに体液中から生命活動に必須なリン酸イオン等の無機イオンを吸着するおそれがあることから、体外循環用の担体には適さなかった。
【００２１】
また、特許文献４には、体外循環に用いることのできるエチレン−ビニルアルコール共重合体を含む粒子が示されており、この粒子は、特許文献３のような無機イオン吸着体を含まず、血液から顆粒球及び単球を選択的に除去することはできるものの、血液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を除去するために必要なほどの排除限界分子量を有するものではなかった。
【００２２】
そこで、本発明は、直接体液灌流に使用可能で、血液、血漿をはじめとする体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去できる吸着材の担体として適用可能な多孔質粒子及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、鋭意検討の結果、エチレン−ビニルアルコール共重合体のごとき熱可塑性樹脂から排除限界分子量２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下の多孔質粒子を得るためには、驚くべきことに、多孔質粒子が有するエチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンの質量比と、エチレン−ビニルアルコール共重合体のガラス転移温度と凝固液温度との関係が重要であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２４】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１０］を提供するものである。
【００２５】
［１］ エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなる多孔質粒子の製造方法であって、
エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン及びこれらの良溶媒を含み、且つ前記エチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部に対する前記ポリビニルピロリドンの割合が４５質量部以上である原液を調製する原液調製工程と、
前記原液をノズルから吐出して、空走部を通過させた後に、前記エチレン−ビニルアルコール共重合体の貧溶媒中で粒子状に凝固させる成形工程と、
を備え、
前記エチレン−ビニルアルコール共重合体のガラス転移温度をＴｇＥとしたときの前記貧溶媒の温度が（ＴｇＥ−２）℃以下であり、
エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなり、排除限界分子量が２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下である多孔質粒子を製造する、多孔質粒子の製造方法。
［２］ 前記成形工程で得られた粒子を次亜塩素酸で表面改質する表面改質工程をさらに備える、［１］記載の製造方法。
［３］ 前記エチレン−ビニルアルコール共重合体は、エチレン含量が２０ｍｏｌ％以上５０ｍｏｌ％以下である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］ 前記良溶媒は、ジメチルスルホキシド及び／又はジメチルアセトアミドである、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］ 前記貧溶媒は、水、又は前記良溶媒を含む水である、［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］ ［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法で得ることのできる、多孔質粒子。
［７］ ［６］記載の多孔質粒子からなる、直接体液灌流吸着材用担体。
［８］ 前記体液は血液又は血漿である、［７］記載の担体。
［９］ 前記吸着材はＩｇＧ吸着材である、［７］又は［８］に記載の担体。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、直接体液灌流に使用可能で、血液、血漿などの体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去できる吸着材を製造するための多孔質粒子及びその製造方法を提供することができる。また、本発明の多孔質粒子を担体として、直接体液灌流に使用可能で、血液、血漿などの体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去できる吸着材を製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例２で製造した多孔質粒子の分画分子量曲線である。
【図２】実施例９で製造した多孔質粒子の分画分子量曲線である。
【図３】比較例１で製造した多孔質粒子の分画分子量曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明を限定するものではない。
【００２９】
本実施形態に係る、エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなり、排除限界分子量が２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下である、多孔質粒子の製造方法は、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン及び良溶媒の混合物からなる原液を調製する原液調製工程と、上記原液をノズルから吐出し、空走部を経た後（すなわち空走部を通過させた後）、貧溶媒の中に浸漬させ、溶媒交換によりポリマーのゲル化（粒子状の凝固）を行わせて多孔質体を形成する成形工程とを備える方法であり、かかる方法は湿式相分離法を原理とする。これらの過程で良溶媒の比率が減少し、それにつれてミクロ相分離が生じ、ポリマーの小球が形成され、成長し、絡み合い、フィブリルが形成され、フィブリルの隙間が連通孔となり、多孔質粒子が形成される。
【００３０】
ここで、多孔質粒子の排除限界分子量とは、多孔質粒子をカラムに充填し、このカラムに所定の物質を含む液体を通したときに、分離（排除）ができなくなる最小の分子量を表す。上記排除限界分子量より大きな分子量を有する物質は、多孔質粒子の微細孔の中に入ることができず、分離（排除）ができなくなるためである。
【００３１】
「エチレン−ビニルアルコール共重合体」とはエチレンとビニルアルコールとの共重合体であるが、一般的には酢酸ビニルモノマーとエチレンとを共重合させて得られるエチレン−酢酸ビニル共重合体を鹸化して製造される。エチレン−ビニルアルコール共重合体は、ランダム、ブロック、グラフト等いずれのタイプの共重合体であってもよい。
【００３２】
エチレン−ビニルアルコール共重合体のエチレン含量は、２０ｍｏｌ％以上５０ｍｏｌ％以下であることが好ましく、２４ｍｏｌ％以上４８ｍｏｌ％以下がより好ましい。エチレン−ビニルアルコール共重合体において、エチレン含量が２０ｍｏｌ％未満であると、親水性が高くなるため、後述する貧溶媒への溶解性が増してしまい、多孔質粒子の成形が困難になるおそれがある。また、エチレン含量が５０ｍｏｌ％を超えると、球状に造粒するのが困難になる傾向があると同時に、エチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンの後述する良溶媒への溶解性が低下する傾向がある。
【００３３】
エチレン−ビニルアルコール共重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）の範囲は、１万Ｄａ以上３００万Ｄａ以下であることが好ましく、１万５千Ｄａ以上１５０万Ｄａ以下であることがより好ましい。Ｍｗが１万Ｄａ未満の場合、滅菌処理、特に放射線滅菌処理を実施した際にポリマーの分子量が低下し、水等の貧溶媒に対する溶出量が増加する傾向にある。またＭｗが３００万Ｄａを超えると、溶剤への溶解度が低下する傾向にあり、さらに重合の際、安定して製造できない傾向にある等の懸念がある。なお、エチレン−ビニルアルコール共重合体のＭｗは種々の公知の方法により求められるが、本実施形態においては、ポリエチレンオキサイドを標準とするゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる測定を採用している。
【００３４】
エチレン−ビニルアルコール共重合体と共に多孔質粒子を構成するポリビニルピロリドンの重量平均分子量（Ｍｗ）は、２，０００Ｄａ以上２００万Ｄａ以下の範囲が好ましく、２，０００Ｄａ以上１００万Ｄａ以下の範囲がより好ましく、２，０００Ｄａ以上１０万Ｄａ以下の範囲がさらに好ましいほか、より大きい排除限界分子量を得る観点から、２万Ｄａ以上２００万Ｄａ以下の範囲がより好ましく、２０万Ｄａ以上２００万Ｄａ以下の範囲がさらに好ましい。重量平均分子量が２，０００Ｄａより小さいと、多孔質粒子がフィブリルを有する場合に、フィブリル内部に空隙を有する構造を発現させる効果が低くなる傾向にあり、２００万Ｄａを超えると、成形工程における粘度が上昇して、粒子の形成が難しくなる傾向にある。なお、ポリビニルピロリドンのＭｗは、エチレン−ビニルアルコール共重合体のＭｗと同様の方法により測定可能である。
【００３５】
水溶性高分子であるポリビニルピロリドンは、上述した相分離の過程においてフィブリルの表面からその分子鎖を一部、あたかもヒゲのように伸ばすため、これによってフィブリルの表面は親水性に保たれることにより、本実施形態の製造方法により得られる多孔質粒子における疎水的吸着の抑制効果が期待できる。
【００３６】
原液中のエチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンの比率（質量比）は、エチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部に対してポリビニルピロリドン４５質量部以上であり、好ましくは４５〜２００質量部であり、より好ましくは４５〜１００質量部である。エチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部に対する上記比率が、ポリビニルピロリドン４５質量部以上であることにより、成形工程中の凝固過程において発生するエチレン−ビニルアルコール共重合体高分子鎖の収縮が抑制され、得られる多孔質粒子の細孔サイズの縮小又は空孔率の減少が抑制される傾向がある。
【００３７】
原液調製工程で用いる良溶媒は、エチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンとを共に溶解するものであればよい。上記良溶媒は、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等であり、好ましくはジメチルスルホキシド及び／又はジメチルアセトアミドである。これらの良溶媒は単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。原液中の良溶媒の含有量は、原液の総質量を基準として、５０質量％以上９８質量％以下であることが好ましく、７０質量％以上９５質量％以下であることがより好ましい。良溶媒の温度は、エチレン−ビニルアルコール共重合体のガラス転移温度をＴｇＥとしたとき、（ＴｇＥ−１０）〜（ＴｇＥ＋２０）℃であると好ましく、（ＴｇＥ−５）〜（ＴｇＥ＋１０）℃であるとより好ましい。良溶媒がこのような温度であると、エチレン−ビニルアルコール共重合体およびポリビニルピロリドンが溶液中で十分に相溶した状態となる傾向にある。
【００３８】
成形工程で用いる貧溶媒は、エチレン−ビニルアルコール共重合体を溶解しないがポリビニルピロリドンを溶解するものであればよい。上記貧溶媒は、例えば、水、上記良溶媒を含む水等である。貧溶媒中に良溶媒を含有させることにより、凝固の速度を種々変化させることができ、エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドン混合物からのポリビニルピロリドンの溶出の程度を制御することができる。
【００３９】
上記多孔質粒子の製造方法における成形工程において、「空走部を通過させる」とは、ノズルから吐出された原液が、すぐに貧溶媒に接触しないように、一旦、空気中（又は不活性ガス等の気体中）を通過させることをいう。原液をノズルから吐出した後、空走部を通過させる距離は、５〜１５０ｃｍであると好ましく、２０〜１００ｃｍであるとより好ましい。また、通過時間は、０．１〜５秒であると好ましく、０．１４〜２秒であるとより好ましい。このような空走時間とすることで、吐出された原液からなる液滴が表面張力によって球状となる傾向にある。
【００４０】
また、多孔質粒子の製造において原液として使用するエチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン及び良溶媒の混合物は、５０℃における粘度が１０００ｍＰａ・ｓ以上６５００ｍＰａ・ｓ以下であることが好ましく、１０００ｍＰａ・ｓ以上５３００ｍＰａ・ｓ以下であることがより好ましい。１０００ｍＰａ・ｓ未満の場合、吐出される原液中のポリマー濃度が低いために貧溶媒中での凝固の進行が遅く、貧溶媒の中に浸漬される際の気液界面において受ける衝撃により粒子が変形し易くなり、特に６００ｍＰａ・ｓ以下では液滴の凝固が極めて困難になる。一方、６５００ｍＰａ・ｓを超えると、原液のノズルからの吐出が困難となる。なお、原液の粘度は、回転粘度計を用いて、回転数２０ｒｐｍとしたときの測定値である。
【００４１】
多孔質粒子の製造方法における成形工程において、上記貧溶媒の温度は、エチレン−ビニルアルコール共重合体のガラス転移温度をＴｇＥとしたとき、（ＴｇＥ−２）℃以下である。貧溶媒の温度は、５℃以上（ＴｇＥ−２）℃以下であることが好ましく、１０℃以上（ＴｇＥ−２）℃以下であることがより好ましい。５℃未満であると、貧溶媒の凝固点に近づくため粒子の製造が困難になる場合がある。また、（ＴｇＥ−２）℃よりも高い温度であると、エチレン−ビニルアルコール共重合体の収縮が進行し、排除限界分子量に影響を及ぼす細孔のサイズが縮小する（又は空孔率が減少する）傾向があり、血液、血漿をはじめとする体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質（病因物質）を高い効率、かつ高い選択性で除去できる吸着材に使用できる多孔質粒子を得ることが困難になる。
【００４２】
また、成形工程では、原液を貧溶媒中で凝固させて粒子状の成形体を得るが、その方法としては、ノズルからの吐出により形成された原液の液滴を貧溶媒に浸漬させる方法や、原液の液滴に貧溶媒を吹き付ける方法等が挙げられる。良好に粒子を形成する観点からは、原液の液滴を貧溶媒に浸漬させることが好ましく、その場合、浸漬時間は３００〜５４００秒とすることが好ましく、６００〜３６００秒とすることがより好ましい。
【００４３】
本実施形態に係る製造方法は、必要に応じて、上述した成形工程の後に、エッチング、アニーリング等の処理によって粒子表面を改質する表面改質工程をさらに備えていてもよい。表面改質方法としては、例えば、次亜塩素酸処理やポリマーのガラス転移温度以上結晶化温度未満の温度状況下でのインキュベート等がある。次亜塩素酸を用いる際の濃度は１００ｐｐｍ以上８０００ｐｐｍ以下であることが好ましい。多孔質粒子表面を次亜塩素酸処理にて改質することにより、多孔質粒子の空孔径、空孔率、比表面積を増大させることができる。
【００４４】
本実施形態に係る製造方法により得られる多孔質粒子は、エチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンからなり、排除限界分子量が２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下である。本実施形態に係る製造方法により得られる多孔質粒子を担体として吸着材を製造すれば、血液、血漿をはじめとする体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質（病因物質）を高い効率、かつ高い選択性で除去し得る。この際、粒子を一体型に加工してモノリス状にして用いてもよい。
【００４５】
多孔質粒子の「平均粒径」は、真球の場合は、任意に選んだ１０個の多孔質粒子の直径の平均値を指し、非真球の場合は、任意に選んだ１０個の多孔質粒子について、マイクロスコープで任意の方向の径を２回／個計測したときの平均値を指す。多孔質粒子の平均粒径は、好ましくは９０μｍ以上６００μｍ以下である。平均粒径が９０μｍより小さいと、粒子間の空隙が狭くなって血液が通りにくくなり、圧力損失が増加する傾向にある。平均粒径が６００μｍより大きいと、単位体積当たりの粒子表面積が小さくなり、吸着効率が低下しやすくなる傾向にある。
【００４６】
多孔質粒子の「比表面積」は、通常１０ｍ２／ｇ以上６５ｍ２／ｇ以下であることが好ましく、２５ｍ２／ｇ以上６５ｍ２／ｇ以下であることがより好ましく、４５ｍ２／ｇ以上６５ｍ２／ｇ以下であることがさらに好ましい。また、空孔率が７０％以上の多孔質粒子であることが好ましい。比表面積が１０ｍ２／ｇ未満になると、血液、血漿をはじめとする体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質（病因物質）を十分に吸着するための表面積を確保できない傾向がある。一方、６５ｍ２／ｇよりも大きい場合、上記多孔質粒子の空孔率が増大しすぎて血液、血漿をはじめとする体液を灌流した場合の圧力損失に耐えうるだけの強度を確保できなくなるか、あるいは排除限界分子量が２０万Ｄａ未満となる傾向がある。
【００４７】
比表面積は、乾燥粒子単位重量あたりに吸着した窒素ガスが占有する表面積で表される。つまり比表面積は単位重量の粒子を構成する物質が乾燥状態でいかに有効に表面を形成しているかを示している。多孔質粒子の比表面積は、高分子ゲルの比表面積を求める際に最も一般的な窒素ガスによるＢＥＴ法で求められる。一般に高分子ゲルは、そのゲルと親和性のある媒体中で膨潤し、乾燥すると収縮する。膨潤時に媒体が満たされているポアが架橋の網目のみで維持されている軟質ゲルの場合は、乾燥すると網目がつぶれてしまい、ポアはほとんど消失する。この場合の比表面積は、ほとんど粒子の外側だけの値になるため、一般に１ｍ２／ｇ以下の低い値を示す。従来アフィニティクロマトグラフィ用として知られているアガロースは軟質ゲルであるため、乾燥によってポアが消失してしまう。さらには、つぶれやすい軟質の網目を持っているために、カラムに充填し体外循環に用いる場合にも、体液を長時間、高流速で流すことはできない。一方、ポアがしっかりした構造を持ち、凍結乾燥に耐える硬質ゲルである場合には、乾燥した際にポアは多少収縮するものの膨潤時の状態をほとんど維持する。つまり、硬質ゲルはパーマネントポアを有し、比表面積は一般的に軟質ゲルよりも高い値を示す。
【００４８】
上述のように、多孔質粒子は複数のフィブリルから形成されているが、このフィブリルは内部に空隙を有し表面が開口していることが好ましい。フィブリルの平均径は通常０．０１μｍ〜５０μｍであり、フィブリル表面の開孔径は、通常０．００１μｍ〜５μｍである。また、フィブリル間の隙間は通常０．０１μｍ〜５μｍである。
【００４９】
このような多孔質粒子は、上述した製造方法、すなわち、原液調製工程、成形工程、及び、必要に応じて表面改質工程を経る方法により得ることができる。この方法では、原液調製工程においてエチレン−ビニルアルコール共重合体とポリビニルピロリドンの質量比を上記特定の範囲とし、成形工程において貧溶媒の温度を上記特定の範囲とし、さらに必要に応じて表面改質工程において適切な条件で表面改質することによって、２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下という特定範囲の排除限界分子量を有する多孔質粒子を得ることが可能となる。
【００５０】
多孔質粒子には公知の方法を用いて様々なリガンドを結合させて、直接体液灌流吸着材を製造することができる。リガンドとしては、抗体、抗体断片、タンパク質、ペプチド、低分子化合物が使用可能であり、目的に応じて適宜選択すればよい。多孔質粒子にリガンドを結合させることにより、分子量２０万Ｄａ未満の抗原、抗体等の悪性物質、特にＩｇＧを高い効率且つ高い選択性で除去できる吸着材を得ることができる。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明の実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。なお、実施例においては、多孔質粒子の種々の物性を、以下の方法で測定した。
【００５２】
（平均粒径）
マイクロスコープ（株式会社キーエンス製、商品名：ＶＨ７０００）を用いて、多孔質粒子の粒径を測定した。多孔質粒子が真球の場合は、任意に選んだ１０個の多孔質粒子について直径を測定し、その平均値を平均粒径とし、他方、非真球の場合は任意に選んだ１０個の多孔質粒子について、マイクロスコープで任意の方向の径を２回／個計測し、その平均値を平均粒径とした。
【００５３】
（比表面積）
ＴｒｉＳｔａｒ３０００（株式会社島津製作所製）を用いて、窒素ガス吸着によるＢＥＴ法により、多孔質粒子の比表面積を求めた。測定に用いるサンプルは乾燥している必要があるため、本発明では水で膨潤させた多孔質粒子を凍結乾燥し、これをサンプルとして測定に用いた。
【００５４】
（排除限界分子量）
実施例及び比較例で得られる多孔質粒子を純水で膨潤させ、超音波処理による脱気泡操作の後、内径７．６ｍｍφ、カラム長５ｃｍの高速液体クロマトグラフィー用空カラム（ジーエルサイエンス株式会社製）に充填し、スパナを用いてこれを閉じ、排除限界分子量評価用カラムとした。該カラムを高速液体クロマトグラフィー装置（株式会社島津製作所製、商品名：ＬＣ２０Ａ）に接続した後、流速０．１ｍＬ／分にてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を灌流し、ＲＩ検出器によるモニター画面にてベースラインが一定となるまで流し続けた。ベースラインが安定化した後、標準分子量物質としてプルランＰ８００（分子量７８８ＫＤａ）、Ｐ４００（分子量４０４ＫＤａ）、Ｐ２００（分子量２１２ＫＤａ）、Ｐ１００（分子量１１２ＫＤａ）、Ｐ５０（分子量４７．３ＫＤａ）、Ｐ２０（分子量２２．８ＫＤａ）、Ｐ１０（分子量１１．８ＫＤａ）、Ｐ５（分子量５．９ＫＤａ）（昭和電工株式会社製）、エチレングリコール（和光純薬工業株式会社製）、及びヒトＩｇＧ（シグマ・アルドリッチ株式会社製）を溶解させたＰＢＳ溶液を各々調製し、これら標準分子量物質溶液を順次注入して保持時間（分）を測定した。さらに、分子量に対し、下記式により算出される溶出容量（ｍＬ）を各々プロットして分画分子量曲線を得た。
溶出容量（ｍＬ）＝流速（ｍＬ／分）×保持時間（分）
【００５５】
上記分画分子量曲線中、グラフ縦軸に平行で且つプルランＰ８００の点を通る直線Ａと、直線Ａよりもグラフ右側に位置する点のうち最も溶出容量の小さな点における接線Ｂとの交点をＣとしたとき、交点Ｃの分子量を排除限界分子量とした。
【００５６】
排除限界分子量以上の分子量の物質は多孔質粒子の微細孔に入ることができず、また、分子量の高低によらず微細孔外の同一容積の空間を流れることになるので、同一の溶出容量を与える。一方、排除限界分子量未満の分子量の物質については、分子量の高低によって微細孔内への浸透し易さに差が生じるため、低分子量の物質ほど溶出容量が大きくなる。但し、ある分子量よりも低い分子量の物質になると、微細孔内に完全に浸透しきってしまうために同一の溶出容量を与える。
【００５７】
（実施例１）
エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（株式会社クラレ製、エバール（登録商標）Ｆ１０１（商品名）、エチレン含量３２ｍｏｌ％、ＴｇＥ５７℃）２００ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ Ｋ８５（商品名））９０ｇ、良溶媒であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）１７１０ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一な原液（混合液）を得た。
【００５８】
得られた原液をノズル（内径０．５５ｍｍ）から吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、５５℃の水（貧溶媒）からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径４１０μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。
【００５９】
得られた多孔質粒子をカラムに充填し、室温でヘパリン加生理食塩水（ヘパリン濃度５０００ＩＵ／Ｌ）を１０ｍＬ流し、プライミングを行った。その後、抗凝固剤としてヘパリンを添加したヒト新鮮血液（ヘパリン濃度５０００ＩＵ／Ｌ）１０．３ｍＬを、室温下、流速１２．３ｍＬ／ｈでシリンジポンプにより流したところ、溶血することなく流れることを確認した。この際、カラムに接続された回路の内圧は２．１ＫＰａ以下で推移した。
【００６０】
（実施例２）
５０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１と同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径４３３μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に、分画分子量曲線を図１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６１】
得られた多孔質粒子１０ｍＬを、２．６ｍＬの水酸化ナトリウム水溶液（濃度１６．７Ｍ）、１４ｍＬのＤＭＳＯ及び１２ｍＬのエピクロロヒドリンからなる反応溶液に添加し、３０℃で２時間攪拌した。反応後の多孔質粒子をグラスフィルター３Ｇで濾過回収し、純水で十分に洗浄した後、２−（２−アミノエチル）チオフェンを濃度５．９ｇ／Ｌで含むｐＨ９．６の炭酸水素ナトリウム緩衝液２０ｍＬ中、５０℃で１７時間攪拌し、反応させた。反応後の多孔質粒子をグラスフィルター３Ｇで濾過回収し、５０℃の温水で洗浄した。反応前後の反応溶液の紫外吸光度変化から、１ｍＬの多孔質粒子あたり２−（２−アミノエチル）チオフェンは８７μｍｏｌ固定化されたことがわかった。
【００６２】
得られた２−（２−アミノエチル）チオフェン固定化多孔質粒子１ｍＬを、室温でヘパリン加生理食塩水（ヘパリン濃度５０００ＩＵ／Ｌ）１０ｍＬで洗浄した後、ポリプロピレンチューブ中で抗凝固剤としてヘパリンを添加したヒト新鮮血液（ヘパリン濃度５０００ＩＵ／Ｌ）２ｍＬと混合し、ミックスローターを用いて室温下２時間攪拌した。攪拌終了後、多孔質粒子をコマフィルターで濾過して除き、回収された血液から３５００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理で血漿を分離した。得られた血漿に対して、アルブミン、ＩｇＧ、フィブリノーゲンの濃度測定を実施した。下記の式により定義される除去率は各々３４％、８２％、５％であった。
除去率（％）＝｛１−（処理後の濃度／処理前の濃度）｝×１００
【００６３】
（実施例３）
３０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径５９６μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６４】
（実施例４）
１０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径５５０μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６５】
（実施例５）
５℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径５６２μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６６】
（実施例６）
エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｆ１０１（商品名）、エチレン含量３２ｍｏｌ％、ＴｇＥ５７℃）４０ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ Ｋ８５（商品名））１８ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）４４２ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一な原液（混合液）を得た。
得られた原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、４０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径５３２μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６７】
（実施例７）
エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｍ１００Ｂ（商品名）、エチレン含量２４ｍｏｌ％、ＴｇＥ６０℃）３８．５ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製 Ｌｕｖｉｔｅｃ、Ｋ８５（商品名））３８．５ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）４２３ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一な原液（混合液）を得た。
得られた原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、４０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径４６０μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６８】
（実施例８）
エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｇ１５６Ｂ（商品名）、エチレン含量４８ｍｏｌ％、ＴｇＥ５０℃）２８．５ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ Ｋ８５（商品名））２８．５ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬株式会社製）４４３ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一な原液（混合液）を得た。
得られた原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、４０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径４９５μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００６９】
（実施例９）
実施例２と同様の工程を経て得られた多孔質粒子１０ｍＬをファルコンチューブに移し入れ、５０００ｐｐｍの次亜塩素酸ナトリウム水溶液５ｍＬを添加した後、５０℃で２時間振盪した。振盪後の多孔質粒子を回収し、純水にて洗浄を行い、平均粒径４３３μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に、分画分子量曲線を図２に各々示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
上記で得られた多孔質粒子を用いて、実施例２と同様の方法にて２−（２−アミノエチル）チオフェン固定化多孔質粒子を作製し、血液中のアルブミン、ＩｇＧ、フィブリノーゲンの除去率を求めたところ、各々４０％、９０％、１０％であった。
【００７０】
（実施例１０）
２０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径５４９μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００７１】
（実施例１１）
内径０．１５ｍｍのノズルを用いて吐出した以外は実施例１０と同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径１０１μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。また、実施例１と同様の方法にて血液が流れることを確認した。
【００７２】
（比較例１）
６０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例１同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径４００μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に、分画分子量曲線を図３に各々示す。
上記で得られた多孔質粒子を用いて、実施例２と同様の方法により、２−（２−アミノエチル）チオフェン固定化多孔質粒子を得、同様の洗浄操作を行った。粒子１ｍＬ当たり、８０μｍｏｌの２−（２−アミノエチル）チオフェンが固定化された。この粒子を用いて、実施例２と同様の方法で血液中のアルブミン、ＩｇＧ、フィブリノーゲンの除去率を求めたところ、各々１０％、７％、５％であった。
【００７３】
（比較例２）
６０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例７同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径３５９μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。
【００７４】
（比較例３）
６０℃の水からなる凝固浴槽中で凝固させること以外は、実施例８同様の方法にて原液を凝固させ、洗浄を行って平均粒径３９３μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。
【００７５】
（比較例４）
エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｆ１０１（商品名）、エチレン含量３２ｍｏｌ％、ＴｇＥ５７℃）５０ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ Ｋ８５（商品名））１３．５ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）４３６．５ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一な原液（混合液）を得た。
得られた原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、６０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径３９９μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。
【００７６】
（比較例５）
エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）（クラレ株式会社製、エバール（登録商標）Ｆ１０１（商品名）、エチレン含量３２ｍｏｌ％、ＴｇＥ５７℃）５０ｇ、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（ＢＡＳＦジャパン株式会社製、Ｌｕｖｉｔｅｃ Ｋ８５（商品名））６ｇ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業株式会社製）４４４ｇを、セパラフラスコ中にて、５０℃に加温して溶解し、均一な原液（混合液）を得た。
得られた原液をノズルから吐出し、生じたポリマー液滴を５０ｃｍ程度の空走部を通過させた後、６０℃の水からなる凝固浴槽中に着液、凝固させた。さらに、洗浄を行い、平均粒径３９８μｍの多孔質粒子を得た。物性を表１に示す。
【００７７】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の多孔質粒子の製造方法は、血液、血漿などの体液から分子量２０万Ｄａ未満の悪性物質を高い効率且つ高い選択性で除去する直接体液灌流吸着材の担体の製造方法として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなる多孔質粒子の製造方法であって、
エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン及びこれらの良溶媒を含み、且つ前記エチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部に対する前記ポリビニルピロリドンの割合が４５質量部以上である原液を調製する原液調製工程と、
前記原液をノズルから吐出して、空走部を通過させた後に、前記エチレン−ビニルアルコール共重合体の貧溶媒中で粒子状に凝固させる成形工程と、
を備え、
前記エチレン−ビニルアルコール共重合体のガラス転移温度をＴｇＥとしたときの前記貧溶媒の温度が（ＴｇＥ−２）℃以下であり、
エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなり、排除限界分子量が２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下である多孔質粒子を製造する、多孔質粒子の製造方法。
【請求項２】
前記成形工程で得られた粒子を次亜塩素酸で表面改質する表面改質工程をさらに備える、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記エチレン−ビニルアルコール共重合体は、エチレン含量が２０ｍｏｌ％以上５０ｍｏｌ％以下である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記良溶媒は、ジメチルスルホキシド及び／又はジメチルアセトアミドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記貧溶媒は、水、又は前記良溶媒を含む水である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法で得ることのできる、多孔質粒子。
【請求項７】
請求項６記載の多孔質粒子からなる、直接体液灌流吸着材用担体。
【請求項８】
前記体液は血液又は血漿である、請求項７記載の担体。
【請求項９】
前記吸着材はＩｇＧ吸着材である、請求項７又は８に記載の担体。
【請求項１】
エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなる多孔質粒子の製造方法であって、
エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン及びこれらの良溶媒を含み、且つ前記エチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部に対する前記ポリビニルピロリドンの割合が４５質量部以上である原液を調製する原液調製工程と、
前記原液をノズルから吐出して、空走部を通過させた後に、前記エチレン−ビニルアルコール共重合体の貧溶媒中で粒子状に凝固させる成形工程と、
を備え、
前記エチレン−ビニルアルコール共重合体のガラス転移温度をＴｇＥとしたときの前記貧溶媒の温度が（ＴｇＥ−２）℃以下であり、
エチレン−ビニルアルコール共重合体及びポリビニルピロリドンからなり、排除限界分子量が２０万Ｄａ以上６０万Ｄａ以下である多孔質粒子を製造する、多孔質粒子の製造方法。
【請求項２】
前記成形工程で得られた粒子を次亜塩素酸で表面改質する表面改質工程をさらに備える、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記エチレン−ビニルアルコール共重合体は、エチレン含量が２０ｍｏｌ％以上５０ｍｏｌ％以下である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記良溶媒は、ジメチルスルホキシド及び／又はジメチルアセトアミドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記貧溶媒は、水、又は前記良溶媒を含む水である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法で得ることのできる、多孔質粒子。
【請求項７】
請求項６記載の多孔質粒子からなる、直接体液灌流吸着材用担体。
【請求項８】
前記体液は血液又は血漿である、請求項７記載の担体。
【請求項９】
前記吸着材はＩｇＧ吸着材である、請求項７又は８に記載の担体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−２１４５５０（Ｐ２０１２−２１４５５０Ａ）
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−７９１４６（Ｐ２０１１−７９１４６）
【出願日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（５０７３６５２０４）旭化成メディカル株式会社 (65)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（５０７３６５２０４）旭化成メディカル株式会社 (65)
【Ｆターム（参考）】
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