大腸菌におけるグリコシル化マクロライドの産生
【課題】 デオキシ糖による種々のアグリコンの修飾を可能とするシステムを提供すること。
【解決手段】 少なくとも１つのヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖を産生するための発現システムを有する組換え大腸菌宿主細胞。
【解決手段】 少なくとも１つのヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖を産生するための発現システムを有する組換え大腸菌宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、米国特許法１１９条（ｅ）に基づき、２００２年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／４００,１２２号に基づく優先権の利益を主張する。この仮出願の開示内容は全て引用を以って本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ヌクレオチド二リン酸6-デオキシ−糖を産生するための発現システムを含む組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞に関する方法及び物質に関する。該宿主細胞は、６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼを産生するための発現システム、及びグリコシル化ポリケチドを産生するための発現システムも含み得る。とりわけ、本発明は、エリスロマイシン又はその中間体を産生するための１又は２以上の発現システムを含む大腸菌宿主細胞に関する。
【連邦政府助成研究発明に対する権利の主張】
【０００３】
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ−Ｒ０１ ＣＡ６６７３６）から合衆国政府の助成を受けたものである。従って、合衆国政府は、本発明に対し一定の権利を留保する。
【背景技術】
【０００４】
ポリケチド（ＰＫ）は、医学・農学分野で多くの有用性を有する天然産物のクラスに属する。近年、ＰＫのコア炭素骨格（アグリコン）の多様化が、合理的かつコンビナトリアルなタンパク工学技術によりＰＫの生物学的及び化学的性質の範囲の拡大を試みるなかで達成された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＰＫの非アグリコン部分もまた、ＰＫの性質を決定する上で重要な役割を有する場合がある。例えば、広く使用されている抗生物質エリスロマイシンＡ（１）は、その完全な抗菌能を示すために２つのデオキシ糖、即ちＬ−クラジノース及びＤ−デソサミンの存在を必要とする；対応するアグリコン、即ち６−デオキシエリスロノリドＢ（６−ｄＥＢ３）は、抗菌活性を示さない。従って、デオキシ糖による種々のアグリコンの修飾を可能とする簡便な技術は、天然及び合成ＰＫの新規な生物学的活性の探索に非常に有用であろう。大腸菌のような工業的に利用しやすい生物中でこれら修飾ポリケチドを産生する能力もまた非常に有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖を産生するための発現システムを有する組換え大腸菌宿主細胞に関する。好ましい一実施形態では、糖は、デソサミン（desosamine）、クラジノース（cladinose）、ミカミノース（mycamonose）、オレアンドロース（oleandrose）、フォロサミン（forosamine）、ダウノサミン（daunosamine）、ミカロース（mycarose）、アスカリロース（ascarylose）、ラムノース、及びミコサミン（mycosamine）からなる群から選択され、最も好ましくは、糖は、Ｄ−デソサミン又はミカロースであるが、その両者であると一層好ましい。これらの糖は、ストレプトミセス・ベネズエラエ、サッカロポリスポラ・エリトラエア、ストレプトミセス・ナルボネンシス、ストレプトミセス・アンチビオチクス、ストレプトミセス・フラジアエ、エルシニア・プソイドツベルクロシス、サルモネラ・エンテリカ、ストレプトミセス・ノウルセイ又はストレプトミセス・ノドススのような生物に由来する生合成遺伝子を用いて産生され得る。好ましい一実施形態では、デソサミンは、ストレプトミセス・ベネズエラエ、サッカロポリスポラ・エリトラエア、ストレプトミセス・アンチビオチクス、又はストレプトミセス・ナルボネンシスのような生物に由来する生合成遺伝子を用いて産生することができるが、最も好ましくは、デソサミン生合成遺伝子は、ストレプトミセス・ベネズエラエ又はストレプトミセス・ナルボネンシスに由来する。好ましい一実施形態では、デソサミン生合成遺伝子は、ストレプトミセス・ベネズエラエに由来するdesI−desVI及びdesVIII遺伝子を含む。
【０００７】
発現システムは、更に、デソサミニルトランスフェラーゼ又はミカロシルトランスフェラーゼのような６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼを発現するための遺伝子を含み得る。好ましい一実施形態では、６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼ発現システムは、ストレプトミセス・ベネズエラエに由来するdesVII遺伝子のようなデソサミニルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。
【０００８】
発現システムは、更に、６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ、６−デオキシエリスロノリドＢ６−ヒドロキシラーゼ、エリスロマイシンＤ１２−ヒドロキシラーゼ及び／又はエリスロマイシンＣ３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含み得るポリケチドの合成及び修飾のための発現システムも含み得るが、これを培養することにより６−デオキシエリスロノリドＢの産生が可能である。本発明のある実施形態では、宿主細胞は、マクロライド系抗生物質に対する耐性を付与する発現システムの導入によって修飾される。一実施形態では、宿主細胞は、ermリボソームメチルトランスフェラーゼをコードする１又は２以上の遺伝子を含む発現システムの導入によって修飾される。
【０００９】
また、本発明は、ヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖が産生される条件下において宿主細胞の培地にポリケチドを供給すること、を含むグリコシル化ポリケチドを産生するための方法も対象とするが、該条件は、更に、６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼを発現することを含むことがあり、ポリケチドは、好ましくは、６−デオキシエリスロノリドＢ（そのアナログも含む。）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖を産生するための発現システムを含む組換え大腸菌宿主細胞に関する。ヌクレオチド二リン酸糖は当業者には既知であり、例えば、チミジン−、シトシン−又はウラシル−二リン酸６−デオキシ糖、例えばＴＤＰ−ミカロース又はＴＤＰ−デソサミンを含み得る。
【００１１】
好ましい糖は、グリコシル化ポリケチドに見出される糖である。好ましい一実施形態では、糖は、デソサミン、クラジノース、ミカミノース、オレアンドロース、フォロサミン、ダウノサミン、ミカロース、アスカリロース、ラムノース、及びミコサミンからなる群の少なくとも１つの分子から選択され得るが、最も好ましくは、糖は、Ｄ−デソサミン及び／又はミカロースである。
【００１２】
種々のポリケチド及び生物に関するデソサミン生合成及び転移遺伝子は、例えば、サッカロポリスポラ・エリトラエア由来のエリスロマイシンに関する遺伝子（eryC）についてはＰＣＴ刊行物WO97／23630に、ストレプトミセス・ベネズエラエ由来のピクロマイシンに関する遺伝子（pikC）については米国特許第6,509,455号に、ストレプトミセス・アンチビオチクス由来のオレアンドマイシンに関する遺伝子（oleG1）についてはアギレスバラガ（Aguirrezbalaga）（後掲）に、及びストレプトミセス・ナルボネンシス由来のナルボマイシンに関する遺伝子については米国特許第6,303,767号に記載されている。ストレプトミセス・フラジアエ由来のチロシンに関するミカミノース生合成及び転移遺伝子は、tylA、tylB、tylM1、tylM2、及びtylM3を含む。サッカロポリスポラ・エリトラエア由来のエリスロマイシンに関するミカロース生合成及び転移遺伝子（eryB）は、ＰＣＴ刊行物WO97／23630に記載されている。ストレプトミセス・アンチビオチクスのオレアンドマイシンに関するオレアンドロース及びオリボース生合成及び転移遺伝子は、アギレスバラガ（後掲）に記載されている。
【００１３】
デソサミンは、ストレプトミセス・ベネズエラエ、サッカロポリスポラ・エリトラエア、ストレプトミセス・アンチビオチクス又はストレプトミセス・ナルボネンシスに由来するもののような生合成遺伝子から産生され得るが、最も好ましくは、デソサミン生合成遺伝子は、ストレプトミセス・ベネズエラエに由来する。とりわけ好ましい一実施形態では、デソサミン生合成遺伝子は、本来的にピクロマイシン産生するストレプトミセス・ベネズエラエ由来のdesI−desVI及びdesVIII遺伝子を含む。このデソサミン発現システムの遺伝子配列は、米国特許第6,117,659号に開示されている。この米国特許の開示内容は全て引用を以って本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。デソサミンを産生するための生合成及び転移遺伝子を含むコスミドpKOS023-26は、ブダペスト条約に基づき１９９８年８月２０日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＡＴＣＣ２０３１４１により現在分譲可能となっている。
【００１４】
Ｓ．ナルボネンシスは、本来的に、デソサミンを産生し、例えばナルボマイシンを生成する。ナルボマイシン遺伝子クラスターは、米国特許第6,303,767号に記載されている。Ｓ．ベネズラエ由来の遺伝子の場合と同様に、Ｓ．ナルボネンシスにおけるデソサミン生合成に伴う遺伝子は、desI−desVI及びdesVIIIであり、他方、desVII遺伝子は、デソサミニルトランスフェラーゼである。これらの遺伝子は、Ｓ．ベネズラエに見出されるものと相同性が大きい。
【００１５】
Ｓ．ベネズラエ及びストレプトミセス・ナルボネンシスの他にも、本来的にデソサミンを産生する生物も存在する。例えば、サッカロポリスポラ・エリトラエアは、Ｓ．ベネズラエ由来のデソサミン遺伝子に相同な遺伝子を有し、そのため大腸菌中で同様に発現されることが予想される。同様に、ストレプトミセス・アンチビオチクス由来のデソサミン生合成遺伝子は、以下に詳細に説明するように、同じく相同性がある。
【００１６】
とりわけ、eryCIIは、desVIIIとしても知られているpicCII遺伝子のホモログであり、４−ケト−６−デオキシグルコースイソメラーゼをコードしていると考えられている。
【００１７】
eryCVIは、desVIとしても知られているpicCVI遺伝子のホモログであり、３−アミノジメチルトランスフェラーゼをコードしている。
【００１８】
eryCIは、desVとしても知られているpicCI遺伝子のホモログである。ストレプトミセス・アンチビオチクス・オレアンドマイシン遺伝子クラスターから産生されるＯｌｅＮ２タンパク質とＥｒｙＣＩとがホモログであることも報告されている。アギレスバラガ, I., et al., 44 Antimicrobial Agents and Chemotherapy, No.5, 1266-75 (2000) を参照されたい。
【００１９】
eryCVは、desIIとしても知られているpicCV遺伝子のホモログであり、デソサミン生合成に必要とされる。アギレスバラガは、ストレプトミセス・アンチビオチクス・オレアンドマイシン遺伝子クラスター由来のoleTがメチマイシン及びピクロマイシン経路からのＤｅｓＩＩとeryCVとに相同なタンパク質（このタンパク質は３，４−レダクターゼであり得る）をコードしているということも報告している。更に、バトラー（Butler）, A. et al., Nature Biotechnology, 20, 713-16 (2002) は、Ｓ．ナルボネンシスのナルボマイシン-生合成遺伝子クラスターから発現されるＮｂｍＪとeryCVとの間の相同性について報告している。
【００２０】
eryCIVは、desIとしても知られているpicCIV遺伝子のホモログであり、３，４−デヒドラターゼであると考えられている。アギレスバラガは、ストレプトミセス・アンチビオチクス・オレアンドマイシン遺伝子クラスター由来の、ＯｌｅＮＩタンパク質をコードするoleNI遺伝子とeryCIVタンパク質とが相同であることも報告している。更に、上掲バトラー, et al. は、Ｓ．ナルボネンシスのナルボマイシン−生合成遺伝子クラスターから発現されるＮｂｍＫとeryCIVとの間の相同性について報告している。
【００２１】
desIVは、既知のery遺伝子ホモログを持たないが、ＮＤＰグルコース４，６−デヒドラターゼをコードしている。エリスロマイシン生合成遺伝子クラスターの外部に存在するＳａｃ．エリトラエア中のgdh遺伝子によって代表されると考えられている。ＮＤＰ-グルコース４，６−デヒドラターゼは、多くの種類のＮＤＰ−６−デオキシ糖の産生において一般的に使用され、そのようなものとして１つの遺伝子が多くの生合成経路で作用し得る。
【００２２】
desIIIは、既知のery遺伝子ホモログを持たないが、ＮＤＰグルコースシンターゼをコードしている。Ｓａｃ．エリトラエア中の当該遺伝子のホモログがエリスロマイシン生合成遺伝子クラスターの外部に存在すると考えられている。ＮＤＰ-グルコースシンターゼは、糖生合成における遍在性の中間体であり、そのようなものとして１つの遺伝子が多くの生合成経路で作用し得る。
【００２３】
デソサミン生合成に関与するストレプトミセス・アンチビオチクス・オレアンドマイシン遺伝子クラスター由来のOleS及びOleE遺伝子についても報告されているが、これらはデソサミン及びオレアンドロースの両方の生合成に関与する。上掲アギレスバラガ, J.を参照されたい。oleSに関しては、ストレプトミセス科の放線菌由来のｄＴＤＰ-Ｄ-グルコースシンターゼ間における類似性が報告されている。例えば、ストレプトミセス・アルギラセウスのミトラマイシン経路からのＭｔｍＤ、Ｓ．グリセウスのストレプトマイシン経路からのＳｔｒＤ、及びＳ．ペウセチウスのダウノルビシン経路からのＤｎｍＬ（間における類似性）である。ミトラマイシンは、糖Ｄ-ミカロース及びＤ-オリボースを含むのに対し、ダウノルビシンは、アミノ糖Ｌ-ダウノサミンを含む。
【００２４】
ストレプトミセス・フラジアエ（tylAl）からも産生され得る（メルソン−デビアス・アンド・カンドリフ（Merson-Davies & Cundliffe）(1994)）ＴＤＰ-グルコースシンターゼの他にも、異なる複数の糖生合成経路に共通の機能を有する遺伝子も幾つか存在するが、細胞内の多くの経路でしばしば作用するように同様に必ずしも他の生合成遺伝子と関係するわけではない。例えば、ＴＤＰ-グルコースデヒドラターゼは、ストレプトミセス・フラジアエ（tylA2）（メルソン−デビアス・アンド・カンドリフ(1994)）又はサッカロポリスポラ・エリトラエア（gdh）（リントン（Linton）et al., Gene 1995 Feb 3; 153 (1): 33-40）において本来的に産生される。更に、ＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシグルコース３，５−エピメラーゼは、サッカロポリスポラ・エリトラエア（kde）において本来的に産生される（リントン et al., Gene, 1995 Feb 3; 153(1): 33-40）。更に、Ｃ5-エピメラーゼは、サッカロポリスポラ・エリトラエア（eryB7）（WO97/23630）において本来的に産生されるが、Ｌ型糖の産生のみに使用される。
【００２５】
そのような相同性及び機能の共通性に基づき、類似するデソサミン生合成経路遺伝子（異なる経路に共通の機能を有する遺伝子を含む。）は、同様に大腸菌において発現及び使用されると期待されている。とりわけ、ポリケチド天然産物中に共通に見出されるＮＤＰ−６−デオキシ糖の生合成は、多くの共通の機能を共有する。標識した前駆体を供給した実験から、全てのものが究極的に共通の一次代謝産物Ｄ-グルコース−１−リン酸に由来することが知られている。初期の段階の幾つかは、同様に既知の複数の経路に共通である。例えば、グルコース−１−リン酸は、まず、酵素ＮＤＰ−Ｄ−グルコースシンターゼによってＮＤＰ-グルコースに変換され、次いで、酵素ＮＤＰ−Ｄ−グルコース４，６−デヒドラターゼによってＣ-４及びＣ-６において脱水される。生成した中間体、即ちＮＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコースは、既知のＮＤＰ−６−デオキシ糖に対する共通の前駆体として作用する。
【００２６】
Ｄ−デソサミン及びＤ−ミカミノースのようなアミノ糖については、ＮＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコースは、まず、ＮＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコースイソメラーゼの作用によって３−ケト糖に変換され、３−ケト糖は、３−アミノトランスフェラーゼによってＮＤＰ−３−アミノ−６−デオキシ−Ｄ−グルコースに変換される。ＮＤＰ−Ｄ−ミカミノースの合成については、残りの全てが、３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼによってＮ,Ｎ−ジメチル化を受ける。ＮＤＰ−Ｄ−デソサミンの合成については、４位がＮ,Ｎ−ジメチル化ステップの前に３，４−デヒドラターゼ及び３，４−レダクターゼによって脱酸素化される。
【００２７】
Ｌ-ミカロース、Ｌ−オレアンドロース及びＬ−クラジノースのようなＬ型の２，６−ジデオキシ糖については、ＮＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコースは、３，５−エピメラーゼの作用によってＬ型糖に変換される。次いで、２−ヒドロキシルが、上述したＤ−デソサミンの生合成における４−ヒドロキシルの脱離と同様に、２，３−デヒドラターゼ及び２，３−レダクターゼの作用によって脱離される。
【００２８】
前駆体及び中間体のこの共通性及び酵素変換における類似性は、特定の異種宿主における特定のＮＤＰ−６−デオキシ糖の生合成に対して成功することが示された遺伝子学的方法は、当該同じ宿主における他のＮＤＰ−６−デオキシ糖の生合成に拡張することができることを示唆している。
【００２９】
そのようなものとして、宿主細胞は、ストレプトミセス・フラジアエ、エルシニア・プソイドツベルクロシス、サルモネラ・エンテリカ、ストレプトミセス・ノウルセイ又はストレプトミセス・ノドススのような種々の生物に由来する６−デオキシ−糖生合成遺伝子を用いて（デソサミン以外の）６−デオキシ−糖を産生することが期待されている。一例では、上掲アギレスバラガは、タイロシン生合成経路からのＴｙｌｂタンパク質及びストレプトミセス・ペウセチウスのダウノルビシン生合成経路からのＤｎｒＪ、並びにストレプトミセス・リンコルネンシスのリンコマイシン生合成経路からのＬｍｂＳは、eryCIVのホモログであることを報告している。Ｓ．フラジアエのミカロース生合成遺伝子は、ベイト（Bate）, N. et al., Microbiology, 146,139-46 (2000)に記載されているようにタイロシンを産生する。
【００３０】
発現システムは、更に、６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼを発現するための遺伝子を含み得る。グリコシルトランスフェラーゼ間における大きな構造類似性を示すグリコシルトランスフェラーゼの特定の折りたたみ（folds）に対応する保存モチーフを例証する配列アラインメントが報告されており、従って、広範囲のグリコシルトランスフェラーゼ本発明に応じて使用可能であることが期待されている。例えば、フー（Hu）, Y., et al., Chez. and Biol, 9: 1287-96 (2002)参照。６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の例としては、Ｓ．フラジアエ由来のミカミノシルトランスフェラーゼ遺伝子（tylM2）、Ｓ．エリトラエア由来のミカロシルトランスフェラーゼ（eryB5）、及びストレプトミセス・アンチビオチクスのオリボシルトランスフェラーゼ（oleG2）がある。好ましい一実施形態では、デソサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及び遺伝子産物は、本書に記載されたピクロマイシン遺伝子クラスター（des VII）に由来し得るし、異なる遺伝子クラスターにも由来し得る。例えば、デソサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及び遺伝子産物は、WO97/23630、上掲アギレスバラガ、米国特許第6,303,767号に記載されたようなエリスロマイシン（例えばeryC3）、オレアンドマイシン（例えばoleGl）、ナルボマイシン（例えばdes VI1）遺伝子クラスターに由来し得る。しかしながら、６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼは、Ｍ．メガロミセア由来の遺伝子から産生されないことが好ましい。
【００３１】
宿主細胞は、更に、ポリケチド、好ましくは６−デオキシエリスロノリドＢ（６−ｄＥＢ）の合成のための発現システムも含み得る。ポリケチド発現システムは、Ｍ．メガロミシア由来でないことが好ましい。“６−デオキシエリスロノリドＢ”は、６−デオキシ-エリスロノリドＢシンターゼ又は変異体又はそれらの突然変異体によって産生されるポリケチドを意味する。そのような変異体又は突然変異体は、例えば米国特許第6,403,775号;同第6,399,789号;同第6,391,594号;及び同第6,558,942号、及びＰＣＴ刊行物WO03/014312に記載されているようなアルキル置換のパターンが変化された及び／又は酸化度が変化された６−デオキシエリスロノリドＢのアナログを産生し得る。これらは、米国特許第6,066,721号;同第6,500,960号;及び同第6,492,562号、及びＰＣＴ刊行物WO01/31049に記載されたような１３−エチル基の代わりに異なる置換基を有する６−デオキシエリスロノリドＢのアナログを産生し得る。例えば、6-デオキシエリスロノリドＢは、１３−メチル−６−デオキシエリスロノリドＢ（１３−メチル−ｄ−ｄＥＢ）、ｌｌ−デオキシ−６−デオキシエリスロノリドＢ、８−デスメチル（desmethyl）−６−デオキシエリスロノリドＢ、１５−フルオロ−６−デオキシエリスロノリドＢ、１３−プロピル−６−デオキシエリスロノリドＢ（１３−プロピル−６−ｄＥＢ）、及び類似の化合物のようなアナログを含み得る。
【００３２】
従って、宿主細胞は、６−デオキシエリスロノリドＢの合成及び修飾に関与する酵素、例えば６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ、６−デオキシエリスロノリドＢ６−ヒドロキシラーゼ、エリスロマイシンＤ１２ヒドロキシラーゼ、エリスロマイシンＣ３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードする１又は２以上の遺伝子を全て含み得るが、好ましくはそのよう酵素をコードする遺伝子を全て含み得る。
【００３３】
エリスロマイシンを生成するための生合成経路は、ポリケチドシンターゼ（６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ、ＤＥＢＳ）によるポリケチド、とりわけ６−デオキシエリスロノリドＢ（６−ｄＥＢ）の産生から開始する。エリスロマイシン産生生物サッカロポリスポラ・エリトラエアにおいては、ＤＥＢＳは、eryA遺伝子によってコードされている。eryA遺伝子のホモログは、例えばストレプトミセス・ベネズエラエ及びＳ．ナルボネンシスに見出される。次のステップでは、Ｓａｃ．エリトラエアのeryF遺伝子及び他の生物におけるそのホモログによってコードされたＣ−６ヒドロキシラーゼの作用によって、６−ｄＥＢがＣ−６においてヒドロキシル化されてエリスロノリドＢが産生される。このステップは、不活性eryF遺伝子を有する菌株における６−デオキシエリスロマイシンの産生によって示されたように、任意的である。次いで、残余のeryB遺伝子又は他の生物由来のそのホモログによってコードされた酵素によって調製されるヌクレオチド糖ＴＤＰ−Ｌ−ミカロースを用い、eryBV遺伝子又は他の生物由来のそのホモログの作用により、Ｌ−ミカロースが３−ヒドロキシル基に付着する。第２の糖、即ちＤ−デソサミンは、eryCIIIデソサミニルトランスフェラーゼ及び他の生物由来のそのホモログの作用によって産生されるような３−Ｏ−α−ミカロシル−エリスロノリドＢに付着し、エリスロマイシンＤが産生される。エリスロマイシンＤは、eryK又は他の生物由来のそのホモログによってコードされたＣ-１２ヒドロキシラーゼの作用によってＣ-１２においてヒドロキシル化され、エリスロマイシンＣが産生される。最後のステップでは、eryG又は他の生物由来のそのホモログによってコードされた３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼがメチル基をミカロシル単位に付加してクラジノースに変換し、かくしてエリスロマイシンＡができる。十分なＣ−１２ヒドロキシラーゼ活性がない場合、３”−Ｏ−メチル-トランスフェラーゼの産物は、１２−デオキシ化合物、即ちエリスロマイシンＢである。
【００３４】
エリスロマイシンは原核生物のリボソームを標的とし、タンパク質翻訳を妨害し、究極的には細胞死に至らしめるので、エリスロマイシン産生生物は、当該生物自身が産生するエリスロマイシンに対する適切な抵抗機構を有しなければならない。典型的には、臨界（クリティカル）アデノシン残基（大腸菌のA2058）のＮ６−メチル化は、当該産生細胞の保護を供するのに十分であるが、流出（efflux）及びエステラーゼのような他の機構も利用することができる。従って、エリスロマイシンを産生する本発明の宿主細胞は、A2058のメチル化が可能な従って宿主細胞のための保護を提供可能なリボソームメチルトランスフェラーゼを産生するための発現システムを有する。一実施形態では、リボソームメチルトランスフェラーゼは、耐性遺伝子のermファミリーの恒常的に発現されるメンバー、例えばサッカロポリスポラ・エリトラエアのerm遺伝子又はストレプトミセス・フラジアエのermSF遺伝子である。
【００３５】
本発明のより好ましい一実施形態では、宿主細胞は、上記の酵素、並びにＴＤＰミカロース及びミカロシルトランスフェラーゼを産生する酵素をコードする遺伝子を含み、一層好ましくは、ＴＤＰ−デソサミン及びデソサミニルトランスフェラーゼを産生するための発現システムも含む。
【００３６】
本発明は、エリスロマイシンのアナログを産生するための方法であって、当該エリスロマイシンアナログが産生される条件下において糖及びポリケチドの両方を産生するための発現システムを含む宿主細胞を培養することを含む方法も対象とする。そのような条件の例は、以下の実施例に示した。
【００３７】
以下の実施例は、上記の本発明の実施の態様をより完全に説明するためのものであり、本発明の種々の側面を実施のために企図されたベストモードを開示するためのものである。以下の実施例は如何なる意味においても本発明の範囲を限定するものではなく、単に説明のためのものに過ぎないと理解されるべきである。本書で引用した文献は全て引用を以って本書に繰り込みその開示内容がここに記載されているものとみなす。
【実施例１】
【００３８】
大腸菌中における可溶性desI〜desVIIIの個別発現
【００３９】
デソサミンは、エリスロマイシンＡ（１）（後掲構造参照）の生物活性に対して本質的であることが示されており、従ってデソサミニル化経路が標的として選択された。大腸菌（E.coli）は、バイオエンジニアリングにおいてそのコスト及び利便性の観点から選択される宿主生物なので、大腸菌内におけるストレプトミセス・ベネズエラエ（Ｓ．ベネズエラエ）由来のデソサミン生合成経路の再構成が試みられた。
【００４０】
既に、８つの遺伝子が、ＴＤＰ-デソサミンの生合成及び当該デオキシ糖のアグリコンへの転移に関与するものとして同定されている（シュエ（Xue）, et al., PNAS 95, 12111, 1998；２００１年２月２２日出願の米国特許出願第09/793,708号（代理人整理番号（Docket）第30062-20021.00号）これらの文献は引用を以って本種に繰り込みここに記載されているものとみなす。）。Ｓ．ベネズエラエ由来のこれらの８つの遺伝子を含むクローンは、コーサン・バイオサイエンシーズ社から入手した。８つのdes遺伝子の各々、即ちdesI、desII、desIII、desIV、desV、desVI、desVII又はdesVIIIは、まず、ｐＥＴ２８ａｃ（ノヴァジェン社、マディソン、ウィスコンシン州）にサブクローニングし、これらのタンパク質が大腸菌株ＢＬ２１の可溶性タンパク質として発現可能か否かを検査した。培養物は、アンピシリン５０μｇ/ｍｌを含む標準ルリア-ベルターニ（ＬＢ）培地において３７℃、２３０ｒｐｍでＯＤ６００が０．６となるまで増殖させた。個々の標的遺伝子の発現は、培養物に、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１００μＭとなるまで添加することにより誘導した。ＤｅｓＩ、ＩＩ、ＩＶ及びＶＩを産生するために、培養物は、３０℃で更に６時間インキュベートしたのち細胞を遠心分離で収集した。ＤｅｓＩＶ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩに対しては、培養物は１５℃で２０時間インキュベートした。細胞ライセートは、氷冷下超音波処理により調製し、不溶性物質は遠心分離で除去した。標的酵素の各々にはヘキサヒスタグが存在したので、ニッケル−ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）金属アフィニティクロマトグラフィ（キアゲン社、ヴァレンシア、カリフォルニア州）を用いたこれら酵素の濃縮は容易に行うことができた。精製は、推奨プロトコールに従った。全ての遺伝子産物は可溶形態で発現したが、その発現レベルは酵素毎に相違が見られた（図１）。タンパク質は全て予想分子量に泳動した。この結果は、Ｓ．ベネズエラエdes遺伝子は大腸菌中で可溶形態で発現可能であったことを示した。
【実施例２】
【００４１】
大腸菌中における８つのすべてのdes遺伝子の同時発現
【００４２】
上記の結果をえて、８つのすべてのdes遺伝子からただ１つのｐＥＴ２８構築物（ｐＫＨ２６）を構築した。この構築物では、全ての遺伝子がただ１つのlacプロモータの制御下にあり、個々の遺伝子には、それらの５’末端においてヘキサヒスタグと共にリボソーム結合部位が隣接していた。培養物を誘導後１５℃で２０時間インキュベートしたこと以外は同じ培養条件を用いて、このマルチシストロン構築物からのdes遺伝子発現を行った。ライセートの調製及びタンパク質の濃縮は、上述のように行った。８つのＤｅｓタンパク質は互いに分子量が類似していたので、８つのすべての遺伝子が発現しているのか否かを確定的に決定することは困難であった。しかしながら、Ｎｉ-ＮＴＡカラム溶出液のＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、遺伝子は全て可溶形態で発現された可能性があることが示された（図２）。
【実施例３】
【００４３】
１３−メチル−、１３−エチル−及び１３−プロピル−６−ｄＥＢのデソサミニル化産物への生物変換
【００４４】
８つのすべてのdes遺伝子が単に発現されるだけではなく代謝的に活性であることを検証するために、インビボ摂食（feeding）実験を行った。この実験では、ｐＫＨ２６で形質転換した大腸菌ＢＬ２１は、１）種々の６-デオキシエリスロノリドＢアグリコンを培養物に与えたこと及び２）誘導された培養物を１８℃で２４時間増殖させたこと以外は上記タンパク質産生実験と同じ条件下で増殖させた。培養物の上清を３（倍）体積の酢酸エチル／トリエチルアミン（９９：１）で抽出した。抽出物を蒸発乾固し、デソサミニル化アグリコンの存在を確かめるための液体クロマトグラフィ／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）による分析のために少量のメタノールに溶解した。産物抽出スキームの有効性を確認するための対照として、エリスロマイシンＡ（１）（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）の標準品を与えた培養物からの抽出物のＬＣ／ＭＳ分析を行った。１の質量ピークに対応する質量ピークは明確に同定された（表１）。次に、１３−メチル（２）−、１３−エチル（３）−及び１３−プロピル−６−ｄＥＢ（４）の混合物を含む培養物からの抽出物を分析した。化合物２及び３は当所（研究室）で生産したが、化合物４はコーサン・バイオサイエンシーズ社から提供を受けた。何れの場合も、対応するアグリコンの予想５−デソサミニル化産物の分子量に対応する質量ピーク（複数）が存在した。これに対し、４のみが供給された培養物からの抽出物は、５−デソサミニル−１３−プロピル−６−ｄＥＢに対応する質量ピークのみを示した。これは、観察されたピーク（複数）はデソサミニル化アグリコンに対応するピークであることを一層強く支持している。アグリコンが供給されなかった培養物からは、デソサミニル化アグリコンのピークは１つも観察されなかった。
【００４５】
実施例で検討される化合物の化学構造
【００４６】
表１
デソサミニル化アグリコンの予想分子量と、（ａ）１３−メチル−、１３−エチル−及び１３−プロピル−６−ｄＥＢの混合物及び（ｂ）１３−プロピル−６−ｄＥＢのみが供給された大腸菌培養物からの抽出物のＬＣ／ＭＳ分析で観察された分子量との比較
【００４７】
上記の実験により、大腸菌はＴＤＰ−デソサミンを良好に合成可能であり、かつ適切なアグリコン基質のグリコシル化も可能であることが示された。我々の研究室での以前の研究（プァイファ（Pfeifer）, et .al. Science 291, 1790, 2001）により、大腸菌ＢＬ２１の改変誘導体もアグリコンを産生できること、及びポリケチド産生のための至適温度はＴＤＰ−デソサミン生合成及び転移のための上述の至適温度とほぼ同等であることが実証されている。従って、２つの技術を併用することにより、実施例４で説明するように大腸菌において生理活性エリスロマイシンを産生できるであろう。同様のアプローチを用いることにより、ヌクレオチド二リン酸糖が産生されかつ６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼが発現される条件下におけるクラジノース、ミカミノース、オレアンドロース、フォロサミン、ダウノサミン、ミカロース、アスカリロース、ラムノース又はミコサミンの生合成を含む、大腸菌へのデオキシ糖生合成及び／又は転移経路を改変することができるであろう。そのような糖は、それ自体有用な代謝産物である。更に、タイロシン(tylosin)、ミデカマイシン、アヴェルメクチン（avermectin）及びカンジシジンのような商業的に重要な他の幾つかの抗生物質もまたグリコシル化を必要とするので、我々の研究は、大腸菌における種々のＰＫの産生及び生合成的改変に広く応用され得るであろう。更に、宿主としての大腸菌の使用は、ポリケチド及びデオキシ糖経路の改変を一層容易にするであろう。例えば、高スループットの菌株改善プログラムは、（化学構造に対する分析的アッセイに対して）生物学的機能に対する抗菌性アッセイを用いて、遺伝子的に改変されたＰＫＳに対して設定することができるであろう。或いは、アグリコン経路を大腸菌の１つの菌株に導入しかつデオキシ糖経路を大腸菌の別の菌株に導入することにより、転換体（converter）菌株の殺菌が可能な新規なＰＫを産生する変異型分泌体（secretor）菌株の選択を容易にする、ペトリ皿における分泌体−転換体実験を実施することも可能であろう。更に、臨床的に関連する抗生物質耐性機構を転換体宿主へ導入する場合、そのような定方向進化（directed evolution）実験は、耐性病原体に対し活性な新規な抗生物質の発見に使用することもできるであろう。
【実施例４】
【００４８】
大腸菌中における３−Ｏ−α−ミカロシル-エリスロノリドＢの産生
【００４９】
ミカロースの生合成に関与する遺伝子をミカロース産生生物の染色体ＤＮＡ由来のディープ・ヴェント（Deep Vent）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いたＰＣＲによって個別に増幅する。ミカロース生合成遺伝子源としては、例えば、（Ｎ．ベイト et al., ''The mycarose-biosynthetic genes of Streptomyces fradiae, producer of tylosin,'' Microbiology (2000) 146, 139-146に記載された）tylAI及びtylAII遺伝子と共にストレプトミセス・フラジアエのtylC遺伝子（tylCII-tylCVII）がある。適切なミカロシルトランスフェラーゼ遺伝子は、例えば、サッカロポリスポラ・エリトラエア（eryCV）又は他の生物から取得可能である。
【００５０】
ＰＣＲプライマーの各ペアを設計して、増幅した遺伝子の５’末端にNdeI部位を導入し、３’末端にSpeI部位を導入する。ＰＣＲ産物をpCR-Blunt II-TOPOベクターにクローン化し、得られたプラスミドを使用して大腸菌ＤＨ５αを形質転換する。プラスミドを酵素NdeI及びSpeIで消化し、各遺伝子に対応するフラグメントを、当該同じ酵素で予め消化した修飾ｐＥＴ-２４ｂ（マルチクローニングカセット内のXbaI部位とEcoRI部位との間の領域を配列５’-ＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＧＡＡＣＴＡＧＴＧＡＡＴＴＣ-３’で置換された修飾体）にクローン化する。
【００５１】
以下のようにして個々の複数のミカロース生合成遺伝子から１つの合成オペロンを構築する。合成オペロンの１つの遺伝子を含むベクターを酵素XbaI及びSpeIで消化し、得られたミカロース遺伝子含有フラグメントを、酵素SpeIで消化した第２の遺伝子を含むベクターに結合する。（制限酵素マッピングによって決定されるような）同一の配向性を有する２つの遺伝子を含むプラスミドを選択してSpeIで消化し、酵素XbaI及びSpeIで消化した第３のミカロース遺伝子含有ベクターからのミカロース遺伝子含有フラグメントに結合する。（制限酵素マッピングによって決定されるような）同一の配向性を有する３つの遺伝子を含むプラスミドを選択する。必要な全てのミカロース生合成遺伝子から（１つの）（目的の）合成オペロンが構築されるまでこのようなサイクルを繰り返す。ミカロシルトランスフェラーゼのための遺伝子（tylCV）及び６−デオキシエリスロノリドＢ６−ヒドロキシラーゼのための遺伝子（eryF）を同様にして加える。
【００５２】
得られたベクターを用いて大腸菌株ＢＬ２１コドン・プラス（Codon Plus）（ストラタジーン社）を形質転換する。個々の形質転換体を、５０μｇ／ｍｌカナマイシン及び０．５μｇ／ｍｌの６−デオキシエリスロノリドＢを含む１５ｍｌＬＢ培地に接種し、３７℃でＡ６００ ０．５〜０．８になるまで増殖したのち、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるまで添加する。次に、培養物を２５℃で４０時間増殖して遠心分離する。上清を等量の酢酸エチルで抽出し、有機物層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発乾固し、エタノールで再溶解する。ミカロシル−ＥＢの存在は、ＬＣ／ＭＳ（［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ ５４７）で確認する。
【００５３】
上記の実験により、大腸菌はＴＤＰ−デソサミンを良好に合成可能であり、かつ適切なアグリコン基質のグリコシル化も可能であることが示された。我々の研究室での以前の研究（プァイファ, et .al. Science 291, 1790, 2001）により、大腸菌ＢＬ２１の改変誘導体もアグリコンを産生できること、及びポリケチド産生のための至適温度はＴＤＰ-デソサミン生合成及び転移のための上述の至適温度とほぼ同等であることが実証されている。従って、２つの技術を併用することにより、実施例４で説明するように大腸菌において生理活性エリスロマイシンを産生できるであろう。同様のアプローチを用いることにより、ヌクレオチド二リン酸糖が産生されかつ6-デオキシグリコシルトランスフェラーゼが発現される条件下におけるクラジノース、ミカミノース、オレアンドロース、フォロサミン、ダウノサミン、ミカロース、アスカリロース、ラムノース又はミコサミンの生合成を含む、大腸菌へのデオキシ糖生合成及び／又は転移経路を改変することができるであろう。そのような糖は、それ自体有用な代謝産物である。更に、タイロシン、ミデカマイシン、アヴェルメクチン及びカンジシジンのような商業的に重要な他の幾つかの抗生物質もまたグリコシル化を必要とするので、我々の研究は、大腸菌における種々のＰＫの産生及び生合成的改変に広く応用され得るであろう。更に、宿主としての大腸菌の使用は、ポリケチド及びデオキシ糖経路の改変を一層容易にするであろう。例えば、高スループットの菌株改善プログラムは、（化学構造に対する分析的アッセイに対して）生物学的機能に対する抗菌性アッセイを用いて、遺伝子的に改変されたＰＫＳに対して設定することができるであろう。或いは、アグリコン経路を大腸菌の１つの菌株に導入しかつデオキシ糖経路を大腸菌の別の菌株に導入することにより、転換体菌株の殺菌が可能な新規なＰＫを産生する変異型分泌体菌株の選択を容易にする、ペトリ皿における分泌体−転換体実験を実施することも可能であろう。更に、臨床的に関連する抗生物質耐性機構を転換体宿主へ導入する場合、そのような定方向進化実験は、耐性病原体に対し活性な新規な抗生物質の発見に使用することもできるであろう。
【実施例５】
【００５４】
大腸菌中におけるエリスロマイシンの調製
【００５５】
エリスロマイシンを産生する大腸菌株は、以下のようにして構築する。好適な宿主細胞は、例えば、ブリッソン−ノエル（Brisson-Noel）et al., ''Evidence for natural gene transfer from gram-positive cocci to Escherichia coli,'' J. Bacteriology (1988) 170(4): 1739-45に記載されたようなermBCを発現する大腸菌株ＢＭ２５７０のような、エリスロマイシン耐性を付与する１又は２以上の遺伝子を発現する大腸菌細胞を含む。最終菌株は、Ｌ−ミカロース及びＤ−デソサミンの生合成及び転移をコードする遺伝子、Ｃ−６及びＣ−１２ヒドロキシラーゼ及び３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子と共に、６−デオキシエリスロノリドＢポリケチドシンターゼ又はその変異体のための遺伝子を含むであろう。また、最終菌株は、ＰＣＴ刊行物WO01/27306及びWO01/31049（これら刊行物の記載内容は引用を以って本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。）に記載されたような適切なスターターユニット（starter unit）及び必要なメチルマロニル−ＣｏＡエキステンダーユニット（extender units）の生合成ための遺伝子も含むであろう。Ｌ−ミカロース及びＤ−デソサミンの生合成及び転移のための遺伝子を導入するための技術は、上記実施例に記載されている。ポリケチドシンターゼ遺伝子を導入するための技術は、ＰＣＴ刊行物WO01/31035（この刊行物の記載内容は引用を以って本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。）に記載されている。例えばアシルトランスフェラーゼ又はβ−ケト−修飾ドメインの選択性を変化するためのドメイン交換によるような、ポリケチドシンターゼの変異型を産生するための技術は、米国特許第6,391,594号；同第6,403,775号；及び同第6,399,789号（これら公報の記載内容は引用を以って本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。）に記載されている。Ｃ−６及びＣ−１２ヒドロキシラーゼのための遺伝子を導入するための技術は、上記実施例に記載されている。３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼのための遺伝子を発現するための技術は、パウルス（Paulus）et al., ''Mutation and cloning of eryG, the structural gene for erythromycin O-methyltransferase from Saccharopolyspora erythraea, and expression of eryG in Escherichia coli,'' J. Bacteriology (1990) 172(5): 2541-6に記載されている。好適に修飾されたエリスロマイシン誘導体は、産生性宿主中の遺伝子の適切な選択によって得ることができる。例えば、６−デオキシエリスロマイシンは、６−ヒドロキシラーゼ遺伝子の排除によって産生することができる。導入された生合成遺伝子は、一般的には、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の付加によって誘導されるlacプロモータのような誘導性プロモータの制御下に置かれる。
【００５６】
これらの宿主細胞を用いてエリスロマイシンを産生するために、細胞の培養物は、適切な培地、例えばＬＢブロスにおいて、温度３０〜４０℃、好ましくは３７℃で、細胞が生合成遺伝子の発現の誘導に好適な密度に達するまで増殖させる。典型的には、この細胞密度は、６００ｎｍの光散乱で測定した場合で凡そ１．０光学密度単位である。この時点で、培養物を２０℃に冷却し、誘導剤、例えばＩＰＴＧを添加する。この比較的低い温度で培養物を増殖させ、定期的にアリコートを採取し、エリスロマイシン産生のためのアッセイにかける。好適なアッセイには、例えばエリスロマイシン標準（erythromycin standards）及び蒸発光散乱法（evaporative light scattering）又は質量分析法による検出を用いるＨＰＬＣ系アッセイ、又は適切な試験菌株、例えばミクロコッカス・ルテウスに対する抗菌活性のような生物学的アッセイが含まれる。エリスロマイシンの産生速度が一定水準に達したことが観察されたら、培養物を遠心分離で収集する。上清をｐＨ９に調節し、ジクロロメタン又は酢酸エチルのような有機溶媒で抽出する。有機層の抽出物を、例えば硫酸ナトリウムによって乾燥し、濾過し、蒸発して粗製エリスロマイシンを得る。精製エリスロマイシンは、既知の方法、例えばクロマトグラフィ又は晶出を用いて得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】各別に発現されたＤｅｓ酵素のＮｉ−ＮＴＡカラムフラクションの４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。左側の数値は、マーカータンパク質の分子量（単位ｋＤａ）を示す。Ｍは分子量マーカー；Ｐはフロー・スルー；Ｗはカラム・ウォッシュ；Ｅは溶出液である。個々の酵素に対して予想される分子量は、ＤｅｓＩは４４ｋＤａ；ＤｅｓＩＩは５３ｋＤａ；ＤｅｓＩＩＩは３０ｋＤａ；ＤｅｓＩＶは３６ｋＤａ；ＤｅｓＶは４１ｋＤａ；ＤｅｓＶＩは２６ｋＤａ；ＤｅｓＶＩＩは４６ｋＤａ；ＤｅｓＶＩＩＩは４２ｋＤａである。
【図２】同時に発現された８つのＤｅｓ酵素のＮｉ−ＮＴＡカラムフラクションの４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｍは分子量マーカー；１は清澄化細胞ライセート；２はフロー・スルー；３はカラム・ウォッシュ；４は溶出液である。左側の数値は、マーカータンパク質の分子量（単位ｋＤａ）を示す。
【関連出願】
【０００１】
本出願は、米国特許法１１９条（ｅ）に基づき、２００２年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／４００,１２２号に基づく優先権の利益を主張する。この仮出願の開示内容は全て引用を以って本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ヌクレオチド二リン酸6-デオキシ−糖を産生するための発現システムを含む組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞に関する方法及び物質に関する。該宿主細胞は、６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼを産生するための発現システム、及びグリコシル化ポリケチドを産生するための発現システムも含み得る。とりわけ、本発明は、エリスロマイシン又はその中間体を産生するための１又は２以上の発現システムを含む大腸菌宿主細胞に関する。
【連邦政府助成研究発明に対する権利の主張】
【０００３】
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ−Ｒ０１ ＣＡ６６７３６）から合衆国政府の助成を受けたものである。従って、合衆国政府は、本発明に対し一定の権利を留保する。
【背景技術】
【０００４】
ポリケチド（ＰＫ）は、医学・農学分野で多くの有用性を有する天然産物のクラスに属する。近年、ＰＫのコア炭素骨格（アグリコン）の多様化が、合理的かつコンビナトリアルなタンパク工学技術によりＰＫの生物学的及び化学的性質の範囲の拡大を試みるなかで達成された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＰＫの非アグリコン部分もまた、ＰＫの性質を決定する上で重要な役割を有する場合がある。例えば、広く使用されている抗生物質エリスロマイシンＡ（１）は、その完全な抗菌能を示すために２つのデオキシ糖、即ちＬ−クラジノース及びＤ−デソサミンの存在を必要とする；対応するアグリコン、即ち６−デオキシエリスロノリドＢ（６−ｄＥＢ３）は、抗菌活性を示さない。従って、デオキシ糖による種々のアグリコンの修飾を可能とする簡便な技術は、天然及び合成ＰＫの新規な生物学的活性の探索に非常に有用であろう。大腸菌のような工業的に利用しやすい生物中でこれら修飾ポリケチドを産生する能力もまた非常に有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖を産生するための発現システムを有する組換え大腸菌宿主細胞に関する。好ましい一実施形態では、糖は、デソサミン（desosamine）、クラジノース（cladinose）、ミカミノース（mycamonose）、オレアンドロース（oleandrose）、フォロサミン（forosamine）、ダウノサミン（daunosamine）、ミカロース（mycarose）、アスカリロース（ascarylose）、ラムノース、及びミコサミン（mycosamine）からなる群から選択され、最も好ましくは、糖は、Ｄ−デソサミン又はミカロースであるが、その両者であると一層好ましい。これらの糖は、ストレプトミセス・ベネズエラエ、サッカロポリスポラ・エリトラエア、ストレプトミセス・ナルボネンシス、ストレプトミセス・アンチビオチクス、ストレプトミセス・フラジアエ、エルシニア・プソイドツベルクロシス、サルモネラ・エンテリカ、ストレプトミセス・ノウルセイ又はストレプトミセス・ノドススのような生物に由来する生合成遺伝子を用いて産生され得る。好ましい一実施形態では、デソサミンは、ストレプトミセス・ベネズエラエ、サッカロポリスポラ・エリトラエア、ストレプトミセス・アンチビオチクス、又はストレプトミセス・ナルボネンシスのような生物に由来する生合成遺伝子を用いて産生することができるが、最も好ましくは、デソサミン生合成遺伝子は、ストレプトミセス・ベネズエラエ又はストレプトミセス・ナルボネンシスに由来する。好ましい一実施形態では、デソサミン生合成遺伝子は、ストレプトミセス・ベネズエラエに由来するdesI−desVI及びdesVIII遺伝子を含む。
【０００７】
発現システムは、更に、デソサミニルトランスフェラーゼ又はミカロシルトランスフェラーゼのような６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼを発現するための遺伝子を含み得る。好ましい一実施形態では、６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼ発現システムは、ストレプトミセス・ベネズエラエに由来するdesVII遺伝子のようなデソサミニルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。
【０００８】
発現システムは、更に、６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ、６−デオキシエリスロノリドＢ６−ヒドロキシラーゼ、エリスロマイシンＤ１２−ヒドロキシラーゼ及び／又はエリスロマイシンＣ３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含み得るポリケチドの合成及び修飾のための発現システムも含み得るが、これを培養することにより６−デオキシエリスロノリドＢの産生が可能である。本発明のある実施形態では、宿主細胞は、マクロライド系抗生物質に対する耐性を付与する発現システムの導入によって修飾される。一実施形態では、宿主細胞は、ermリボソームメチルトランスフェラーゼをコードする１又は２以上の遺伝子を含む発現システムの導入によって修飾される。
【０００９】
また、本発明は、ヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖が産生される条件下において宿主細胞の培地にポリケチドを供給すること、を含むグリコシル化ポリケチドを産生するための方法も対象とするが、該条件は、更に、６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼを発現することを含むことがあり、ポリケチドは、好ましくは、６−デオキシエリスロノリドＢ（そのアナログも含む。）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖を産生するための発現システムを含む組換え大腸菌宿主細胞に関する。ヌクレオチド二リン酸糖は当業者には既知であり、例えば、チミジン−、シトシン−又はウラシル−二リン酸６−デオキシ糖、例えばＴＤＰ−ミカロース又はＴＤＰ−デソサミンを含み得る。
【００１１】
好ましい糖は、グリコシル化ポリケチドに見出される糖である。好ましい一実施形態では、糖は、デソサミン、クラジノース、ミカミノース、オレアンドロース、フォロサミン、ダウノサミン、ミカロース、アスカリロース、ラムノース、及びミコサミンからなる群の少なくとも１つの分子から選択され得るが、最も好ましくは、糖は、Ｄ−デソサミン及び／又はミカロースである。
【００１２】
種々のポリケチド及び生物に関するデソサミン生合成及び転移遺伝子は、例えば、サッカロポリスポラ・エリトラエア由来のエリスロマイシンに関する遺伝子（eryC）についてはＰＣＴ刊行物WO97／23630に、ストレプトミセス・ベネズエラエ由来のピクロマイシンに関する遺伝子（pikC）については米国特許第6,509,455号に、ストレプトミセス・アンチビオチクス由来のオレアンドマイシンに関する遺伝子（oleG1）についてはアギレスバラガ（Aguirrezbalaga）（後掲）に、及びストレプトミセス・ナルボネンシス由来のナルボマイシンに関する遺伝子については米国特許第6,303,767号に記載されている。ストレプトミセス・フラジアエ由来のチロシンに関するミカミノース生合成及び転移遺伝子は、tylA、tylB、tylM1、tylM2、及びtylM3を含む。サッカロポリスポラ・エリトラエア由来のエリスロマイシンに関するミカロース生合成及び転移遺伝子（eryB）は、ＰＣＴ刊行物WO97／23630に記載されている。ストレプトミセス・アンチビオチクスのオレアンドマイシンに関するオレアンドロース及びオリボース生合成及び転移遺伝子は、アギレスバラガ（後掲）に記載されている。
【００１３】
デソサミンは、ストレプトミセス・ベネズエラエ、サッカロポリスポラ・エリトラエア、ストレプトミセス・アンチビオチクス又はストレプトミセス・ナルボネンシスに由来するもののような生合成遺伝子から産生され得るが、最も好ましくは、デソサミン生合成遺伝子は、ストレプトミセス・ベネズエラエに由来する。とりわけ好ましい一実施形態では、デソサミン生合成遺伝子は、本来的にピクロマイシン産生するストレプトミセス・ベネズエラエ由来のdesI−desVI及びdesVIII遺伝子を含む。このデソサミン発現システムの遺伝子配列は、米国特許第6,117,659号に開示されている。この米国特許の開示内容は全て引用を以って本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。デソサミンを産生するための生合成及び転移遺伝子を含むコスミドpKOS023-26は、ブダペスト条約に基づき１９９８年８月２０日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＡＴＣＣ２０３１４１により現在分譲可能となっている。
【００１４】
Ｓ．ナルボネンシスは、本来的に、デソサミンを産生し、例えばナルボマイシンを生成する。ナルボマイシン遺伝子クラスターは、米国特許第6,303,767号に記載されている。Ｓ．ベネズラエ由来の遺伝子の場合と同様に、Ｓ．ナルボネンシスにおけるデソサミン生合成に伴う遺伝子は、desI−desVI及びdesVIIIであり、他方、desVII遺伝子は、デソサミニルトランスフェラーゼである。これらの遺伝子は、Ｓ．ベネズラエに見出されるものと相同性が大きい。
【００１５】
Ｓ．ベネズラエ及びストレプトミセス・ナルボネンシスの他にも、本来的にデソサミンを産生する生物も存在する。例えば、サッカロポリスポラ・エリトラエアは、Ｓ．ベネズラエ由来のデソサミン遺伝子に相同な遺伝子を有し、そのため大腸菌中で同様に発現されることが予想される。同様に、ストレプトミセス・アンチビオチクス由来のデソサミン生合成遺伝子は、以下に詳細に説明するように、同じく相同性がある。
【００１６】
とりわけ、eryCIIは、desVIIIとしても知られているpicCII遺伝子のホモログであり、４−ケト−６−デオキシグルコースイソメラーゼをコードしていると考えられている。
【００１７】
eryCVIは、desVIとしても知られているpicCVI遺伝子のホモログであり、３−アミノジメチルトランスフェラーゼをコードしている。
【００１８】
eryCIは、desVとしても知られているpicCI遺伝子のホモログである。ストレプトミセス・アンチビオチクス・オレアンドマイシン遺伝子クラスターから産生されるＯｌｅＮ２タンパク質とＥｒｙＣＩとがホモログであることも報告されている。アギレスバラガ, I., et al., 44 Antimicrobial Agents and Chemotherapy, No.5, 1266-75 (2000) を参照されたい。
【００１９】
eryCVは、desIIとしても知られているpicCV遺伝子のホモログであり、デソサミン生合成に必要とされる。アギレスバラガは、ストレプトミセス・アンチビオチクス・オレアンドマイシン遺伝子クラスター由来のoleTがメチマイシン及びピクロマイシン経路からのＤｅｓＩＩとeryCVとに相同なタンパク質（このタンパク質は３，４−レダクターゼであり得る）をコードしているということも報告している。更に、バトラー（Butler）, A. et al., Nature Biotechnology, 20, 713-16 (2002) は、Ｓ．ナルボネンシスのナルボマイシン-生合成遺伝子クラスターから発現されるＮｂｍＪとeryCVとの間の相同性について報告している。
【００２０】
eryCIVは、desIとしても知られているpicCIV遺伝子のホモログであり、３，４−デヒドラターゼであると考えられている。アギレスバラガは、ストレプトミセス・アンチビオチクス・オレアンドマイシン遺伝子クラスター由来の、ＯｌｅＮＩタンパク質をコードするoleNI遺伝子とeryCIVタンパク質とが相同であることも報告している。更に、上掲バトラー, et al. は、Ｓ．ナルボネンシスのナルボマイシン−生合成遺伝子クラスターから発現されるＮｂｍＫとeryCIVとの間の相同性について報告している。
【００２１】
desIVは、既知のery遺伝子ホモログを持たないが、ＮＤＰグルコース４，６−デヒドラターゼをコードしている。エリスロマイシン生合成遺伝子クラスターの外部に存在するＳａｃ．エリトラエア中のgdh遺伝子によって代表されると考えられている。ＮＤＰ-グルコース４，６−デヒドラターゼは、多くの種類のＮＤＰ−６−デオキシ糖の産生において一般的に使用され、そのようなものとして１つの遺伝子が多くの生合成経路で作用し得る。
【００２２】
desIIIは、既知のery遺伝子ホモログを持たないが、ＮＤＰグルコースシンターゼをコードしている。Ｓａｃ．エリトラエア中の当該遺伝子のホモログがエリスロマイシン生合成遺伝子クラスターの外部に存在すると考えられている。ＮＤＰ-グルコースシンターゼは、糖生合成における遍在性の中間体であり、そのようなものとして１つの遺伝子が多くの生合成経路で作用し得る。
【００２３】
デソサミン生合成に関与するストレプトミセス・アンチビオチクス・オレアンドマイシン遺伝子クラスター由来のOleS及びOleE遺伝子についても報告されているが、これらはデソサミン及びオレアンドロースの両方の生合成に関与する。上掲アギレスバラガ, J.を参照されたい。oleSに関しては、ストレプトミセス科の放線菌由来のｄＴＤＰ-Ｄ-グルコースシンターゼ間における類似性が報告されている。例えば、ストレプトミセス・アルギラセウスのミトラマイシン経路からのＭｔｍＤ、Ｓ．グリセウスのストレプトマイシン経路からのＳｔｒＤ、及びＳ．ペウセチウスのダウノルビシン経路からのＤｎｍＬ（間における類似性）である。ミトラマイシンは、糖Ｄ-ミカロース及びＤ-オリボースを含むのに対し、ダウノルビシンは、アミノ糖Ｌ-ダウノサミンを含む。
【００２４】
ストレプトミセス・フラジアエ（tylAl）からも産生され得る（メルソン−デビアス・アンド・カンドリフ（Merson-Davies & Cundliffe）(1994)）ＴＤＰ-グルコースシンターゼの他にも、異なる複数の糖生合成経路に共通の機能を有する遺伝子も幾つか存在するが、細胞内の多くの経路でしばしば作用するように同様に必ずしも他の生合成遺伝子と関係するわけではない。例えば、ＴＤＰ-グルコースデヒドラターゼは、ストレプトミセス・フラジアエ（tylA2）（メルソン−デビアス・アンド・カンドリフ(1994)）又はサッカロポリスポラ・エリトラエア（gdh）（リントン（Linton）et al., Gene 1995 Feb 3; 153 (1): 33-40）において本来的に産生される。更に、ＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシグルコース３，５−エピメラーゼは、サッカロポリスポラ・エリトラエア（kde）において本来的に産生される（リントン et al., Gene, 1995 Feb 3; 153(1): 33-40）。更に、Ｃ5-エピメラーゼは、サッカロポリスポラ・エリトラエア（eryB7）（WO97/23630）において本来的に産生されるが、Ｌ型糖の産生のみに使用される。
【００２５】
そのような相同性及び機能の共通性に基づき、類似するデソサミン生合成経路遺伝子（異なる経路に共通の機能を有する遺伝子を含む。）は、同様に大腸菌において発現及び使用されると期待されている。とりわけ、ポリケチド天然産物中に共通に見出されるＮＤＰ−６−デオキシ糖の生合成は、多くの共通の機能を共有する。標識した前駆体を供給した実験から、全てのものが究極的に共通の一次代謝産物Ｄ-グルコース−１−リン酸に由来することが知られている。初期の段階の幾つかは、同様に既知の複数の経路に共通である。例えば、グルコース−１−リン酸は、まず、酵素ＮＤＰ−Ｄ−グルコースシンターゼによってＮＤＰ-グルコースに変換され、次いで、酵素ＮＤＰ−Ｄ−グルコース４，６−デヒドラターゼによってＣ-４及びＣ-６において脱水される。生成した中間体、即ちＮＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコースは、既知のＮＤＰ−６−デオキシ糖に対する共通の前駆体として作用する。
【００２６】
Ｄ−デソサミン及びＤ−ミカミノースのようなアミノ糖については、ＮＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコースは、まず、ＮＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコースイソメラーゼの作用によって３−ケト糖に変換され、３−ケト糖は、３−アミノトランスフェラーゼによってＮＤＰ−３−アミノ−６−デオキシ−Ｄ−グルコースに変換される。ＮＤＰ−Ｄ−ミカミノースの合成については、残りの全てが、３−Ｎ−メチルトランスフェラーゼによってＮ,Ｎ−ジメチル化を受ける。ＮＤＰ−Ｄ−デソサミンの合成については、４位がＮ,Ｎ−ジメチル化ステップの前に３，４−デヒドラターゼ及び３，４−レダクターゼによって脱酸素化される。
【００２７】
Ｌ-ミカロース、Ｌ−オレアンドロース及びＬ−クラジノースのようなＬ型の２，６−ジデオキシ糖については、ＮＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコースは、３，５−エピメラーゼの作用によってＬ型糖に変換される。次いで、２−ヒドロキシルが、上述したＤ−デソサミンの生合成における４−ヒドロキシルの脱離と同様に、２，３−デヒドラターゼ及び２，３−レダクターゼの作用によって脱離される。
【００２８】
前駆体及び中間体のこの共通性及び酵素変換における類似性は、特定の異種宿主における特定のＮＤＰ−６−デオキシ糖の生合成に対して成功することが示された遺伝子学的方法は、当該同じ宿主における他のＮＤＰ−６−デオキシ糖の生合成に拡張することができることを示唆している。
【００２９】
そのようなものとして、宿主細胞は、ストレプトミセス・フラジアエ、エルシニア・プソイドツベルクロシス、サルモネラ・エンテリカ、ストレプトミセス・ノウルセイ又はストレプトミセス・ノドススのような種々の生物に由来する６−デオキシ−糖生合成遺伝子を用いて（デソサミン以外の）６−デオキシ−糖を産生することが期待されている。一例では、上掲アギレスバラガは、タイロシン生合成経路からのＴｙｌｂタンパク質及びストレプトミセス・ペウセチウスのダウノルビシン生合成経路からのＤｎｒＪ、並びにストレプトミセス・リンコルネンシスのリンコマイシン生合成経路からのＬｍｂＳは、eryCIVのホモログであることを報告している。Ｓ．フラジアエのミカロース生合成遺伝子は、ベイト（Bate）, N. et al., Microbiology, 146,139-46 (2000)に記載されているようにタイロシンを産生する。
【００３０】
発現システムは、更に、６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼを発現するための遺伝子を含み得る。グリコシルトランスフェラーゼ間における大きな構造類似性を示すグリコシルトランスフェラーゼの特定の折りたたみ（folds）に対応する保存モチーフを例証する配列アラインメントが報告されており、従って、広範囲のグリコシルトランスフェラーゼ本発明に応じて使用可能であることが期待されている。例えば、フー（Hu）, Y., et al., Chez. and Biol, 9: 1287-96 (2002)参照。６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の例としては、Ｓ．フラジアエ由来のミカミノシルトランスフェラーゼ遺伝子（tylM2）、Ｓ．エリトラエア由来のミカロシルトランスフェラーゼ（eryB5）、及びストレプトミセス・アンチビオチクスのオリボシルトランスフェラーゼ（oleG2）がある。好ましい一実施形態では、デソサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及び遺伝子産物は、本書に記載されたピクロマイシン遺伝子クラスター（des VII）に由来し得るし、異なる遺伝子クラスターにも由来し得る。例えば、デソサミニルトランスフェラーゼ遺伝子及び遺伝子産物は、WO97/23630、上掲アギレスバラガ、米国特許第6,303,767号に記載されたようなエリスロマイシン（例えばeryC3）、オレアンドマイシン（例えばoleGl）、ナルボマイシン（例えばdes VI1）遺伝子クラスターに由来し得る。しかしながら、６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼは、Ｍ．メガロミセア由来の遺伝子から産生されないことが好ましい。
【００３１】
宿主細胞は、更に、ポリケチド、好ましくは６−デオキシエリスロノリドＢ（６−ｄＥＢ）の合成のための発現システムも含み得る。ポリケチド発現システムは、Ｍ．メガロミシア由来でないことが好ましい。“６−デオキシエリスロノリドＢ”は、６−デオキシ-エリスロノリドＢシンターゼ又は変異体又はそれらの突然変異体によって産生されるポリケチドを意味する。そのような変異体又は突然変異体は、例えば米国特許第6,403,775号;同第6,399,789号;同第6,391,594号;及び同第6,558,942号、及びＰＣＴ刊行物WO03/014312に記載されているようなアルキル置換のパターンが変化された及び／又は酸化度が変化された６−デオキシエリスロノリドＢのアナログを産生し得る。これらは、米国特許第6,066,721号;同第6,500,960号;及び同第6,492,562号、及びＰＣＴ刊行物WO01/31049に記載されたような１３−エチル基の代わりに異なる置換基を有する６−デオキシエリスロノリドＢのアナログを産生し得る。例えば、6-デオキシエリスロノリドＢは、１３−メチル−６−デオキシエリスロノリドＢ（１３−メチル−ｄ−ｄＥＢ）、ｌｌ−デオキシ−６−デオキシエリスロノリドＢ、８−デスメチル（desmethyl）−６−デオキシエリスロノリドＢ、１５−フルオロ−６−デオキシエリスロノリドＢ、１３−プロピル−６−デオキシエリスロノリドＢ（１３−プロピル−６−ｄＥＢ）、及び類似の化合物のようなアナログを含み得る。
【００３２】
従って、宿主細胞は、６−デオキシエリスロノリドＢの合成及び修飾に関与する酵素、例えば６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ、６−デオキシエリスロノリドＢ６−ヒドロキシラーゼ、エリスロマイシンＤ１２ヒドロキシラーゼ、エリスロマイシンＣ３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードする１又は２以上の遺伝子を全て含み得るが、好ましくはそのよう酵素をコードする遺伝子を全て含み得る。
【００３３】
エリスロマイシンを生成するための生合成経路は、ポリケチドシンターゼ（６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ、ＤＥＢＳ）によるポリケチド、とりわけ６−デオキシエリスロノリドＢ（６−ｄＥＢ）の産生から開始する。エリスロマイシン産生生物サッカロポリスポラ・エリトラエアにおいては、ＤＥＢＳは、eryA遺伝子によってコードされている。eryA遺伝子のホモログは、例えばストレプトミセス・ベネズエラエ及びＳ．ナルボネンシスに見出される。次のステップでは、Ｓａｃ．エリトラエアのeryF遺伝子及び他の生物におけるそのホモログによってコードされたＣ−６ヒドロキシラーゼの作用によって、６−ｄＥＢがＣ−６においてヒドロキシル化されてエリスロノリドＢが産生される。このステップは、不活性eryF遺伝子を有する菌株における６−デオキシエリスロマイシンの産生によって示されたように、任意的である。次いで、残余のeryB遺伝子又は他の生物由来のそのホモログによってコードされた酵素によって調製されるヌクレオチド糖ＴＤＰ−Ｌ−ミカロースを用い、eryBV遺伝子又は他の生物由来のそのホモログの作用により、Ｌ−ミカロースが３−ヒドロキシル基に付着する。第２の糖、即ちＤ−デソサミンは、eryCIIIデソサミニルトランスフェラーゼ及び他の生物由来のそのホモログの作用によって産生されるような３−Ｏ−α−ミカロシル−エリスロノリドＢに付着し、エリスロマイシンＤが産生される。エリスロマイシンＤは、eryK又は他の生物由来のそのホモログによってコードされたＣ-１２ヒドロキシラーゼの作用によってＣ-１２においてヒドロキシル化され、エリスロマイシンＣが産生される。最後のステップでは、eryG又は他の生物由来のそのホモログによってコードされた３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼがメチル基をミカロシル単位に付加してクラジノースに変換し、かくしてエリスロマイシンＡができる。十分なＣ−１２ヒドロキシラーゼ活性がない場合、３”−Ｏ−メチル-トランスフェラーゼの産物は、１２−デオキシ化合物、即ちエリスロマイシンＢである。
【００３４】
エリスロマイシンは原核生物のリボソームを標的とし、タンパク質翻訳を妨害し、究極的には細胞死に至らしめるので、エリスロマイシン産生生物は、当該生物自身が産生するエリスロマイシンに対する適切な抵抗機構を有しなければならない。典型的には、臨界（クリティカル）アデノシン残基（大腸菌のA2058）のＮ６−メチル化は、当該産生細胞の保護を供するのに十分であるが、流出（efflux）及びエステラーゼのような他の機構も利用することができる。従って、エリスロマイシンを産生する本発明の宿主細胞は、A2058のメチル化が可能な従って宿主細胞のための保護を提供可能なリボソームメチルトランスフェラーゼを産生するための発現システムを有する。一実施形態では、リボソームメチルトランスフェラーゼは、耐性遺伝子のermファミリーの恒常的に発現されるメンバー、例えばサッカロポリスポラ・エリトラエアのerm遺伝子又はストレプトミセス・フラジアエのermSF遺伝子である。
【００３５】
本発明のより好ましい一実施形態では、宿主細胞は、上記の酵素、並びにＴＤＰミカロース及びミカロシルトランスフェラーゼを産生する酵素をコードする遺伝子を含み、一層好ましくは、ＴＤＰ−デソサミン及びデソサミニルトランスフェラーゼを産生するための発現システムも含む。
【００３６】
本発明は、エリスロマイシンのアナログを産生するための方法であって、当該エリスロマイシンアナログが産生される条件下において糖及びポリケチドの両方を産生するための発現システムを含む宿主細胞を培養することを含む方法も対象とする。そのような条件の例は、以下の実施例に示した。
【００３７】
以下の実施例は、上記の本発明の実施の態様をより完全に説明するためのものであり、本発明の種々の側面を実施のために企図されたベストモードを開示するためのものである。以下の実施例は如何なる意味においても本発明の範囲を限定するものではなく、単に説明のためのものに過ぎないと理解されるべきである。本書で引用した文献は全て引用を以って本書に繰り込みその開示内容がここに記載されているものとみなす。
【実施例１】
【００３８】
大腸菌中における可溶性desI〜desVIIIの個別発現
【００３９】
デソサミンは、エリスロマイシンＡ（１）（後掲構造参照）の生物活性に対して本質的であることが示されており、従ってデソサミニル化経路が標的として選択された。大腸菌（E.coli）は、バイオエンジニアリングにおいてそのコスト及び利便性の観点から選択される宿主生物なので、大腸菌内におけるストレプトミセス・ベネズエラエ（Ｓ．ベネズエラエ）由来のデソサミン生合成経路の再構成が試みられた。
【００４０】
既に、８つの遺伝子が、ＴＤＰ-デソサミンの生合成及び当該デオキシ糖のアグリコンへの転移に関与するものとして同定されている（シュエ（Xue）, et al., PNAS 95, 12111, 1998；２００１年２月２２日出願の米国特許出願第09/793,708号（代理人整理番号（Docket）第30062-20021.00号）これらの文献は引用を以って本種に繰り込みここに記載されているものとみなす。）。Ｓ．ベネズエラエ由来のこれらの８つの遺伝子を含むクローンは、コーサン・バイオサイエンシーズ社から入手した。８つのdes遺伝子の各々、即ちdesI、desII、desIII、desIV、desV、desVI、desVII又はdesVIIIは、まず、ｐＥＴ２８ａｃ（ノヴァジェン社、マディソン、ウィスコンシン州）にサブクローニングし、これらのタンパク質が大腸菌株ＢＬ２１の可溶性タンパク質として発現可能か否かを検査した。培養物は、アンピシリン５０μｇ/ｍｌを含む標準ルリア-ベルターニ（ＬＢ）培地において３７℃、２３０ｒｐｍでＯＤ６００が０．６となるまで増殖させた。個々の標的遺伝子の発現は、培養物に、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１００μＭとなるまで添加することにより誘導した。ＤｅｓＩ、ＩＩ、ＩＶ及びＶＩを産生するために、培養物は、３０℃で更に６時間インキュベートしたのち細胞を遠心分離で収集した。ＤｅｓＩＶ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩに対しては、培養物は１５℃で２０時間インキュベートした。細胞ライセートは、氷冷下超音波処理により調製し、不溶性物質は遠心分離で除去した。標的酵素の各々にはヘキサヒスタグが存在したので、ニッケル−ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）金属アフィニティクロマトグラフィ（キアゲン社、ヴァレンシア、カリフォルニア州）を用いたこれら酵素の濃縮は容易に行うことができた。精製は、推奨プロトコールに従った。全ての遺伝子産物は可溶形態で発現したが、その発現レベルは酵素毎に相違が見られた（図１）。タンパク質は全て予想分子量に泳動した。この結果は、Ｓ．ベネズエラエdes遺伝子は大腸菌中で可溶形態で発現可能であったことを示した。
【実施例２】
【００４１】
大腸菌中における８つのすべてのdes遺伝子の同時発現
【００４２】
上記の結果をえて、８つのすべてのdes遺伝子からただ１つのｐＥＴ２８構築物（ｐＫＨ２６）を構築した。この構築物では、全ての遺伝子がただ１つのlacプロモータの制御下にあり、個々の遺伝子には、それらの５’末端においてヘキサヒスタグと共にリボソーム結合部位が隣接していた。培養物を誘導後１５℃で２０時間インキュベートしたこと以外は同じ培養条件を用いて、このマルチシストロン構築物からのdes遺伝子発現を行った。ライセートの調製及びタンパク質の濃縮は、上述のように行った。８つのＤｅｓタンパク質は互いに分子量が類似していたので、８つのすべての遺伝子が発現しているのか否かを確定的に決定することは困難であった。しかしながら、Ｎｉ-ＮＴＡカラム溶出液のＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、遺伝子は全て可溶形態で発現された可能性があることが示された（図２）。
【実施例３】
【００４３】
１３−メチル−、１３−エチル−及び１３−プロピル−６−ｄＥＢのデソサミニル化産物への生物変換
【００４４】
８つのすべてのdes遺伝子が単に発現されるだけではなく代謝的に活性であることを検証するために、インビボ摂食（feeding）実験を行った。この実験では、ｐＫＨ２６で形質転換した大腸菌ＢＬ２１は、１）種々の６-デオキシエリスロノリドＢアグリコンを培養物に与えたこと及び２）誘導された培養物を１８℃で２４時間増殖させたこと以外は上記タンパク質産生実験と同じ条件下で増殖させた。培養物の上清を３（倍）体積の酢酸エチル／トリエチルアミン（９９：１）で抽出した。抽出物を蒸発乾固し、デソサミニル化アグリコンの存在を確かめるための液体クロマトグラフィ／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）による分析のために少量のメタノールに溶解した。産物抽出スキームの有効性を確認するための対照として、エリスロマイシンＡ（１）（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）の標準品を与えた培養物からの抽出物のＬＣ／ＭＳ分析を行った。１の質量ピークに対応する質量ピークは明確に同定された（表１）。次に、１３−メチル（２）−、１３−エチル（３）−及び１３−プロピル−６−ｄＥＢ（４）の混合物を含む培養物からの抽出物を分析した。化合物２及び３は当所（研究室）で生産したが、化合物４はコーサン・バイオサイエンシーズ社から提供を受けた。何れの場合も、対応するアグリコンの予想５−デソサミニル化産物の分子量に対応する質量ピーク（複数）が存在した。これに対し、４のみが供給された培養物からの抽出物は、５−デソサミニル−１３−プロピル−６−ｄＥＢに対応する質量ピークのみを示した。これは、観察されたピーク（複数）はデソサミニル化アグリコンに対応するピークであることを一層強く支持している。アグリコンが供給されなかった培養物からは、デソサミニル化アグリコンのピークは１つも観察されなかった。
【００４５】
実施例で検討される化合物の化学構造
【００４６】
表１
デソサミニル化アグリコンの予想分子量と、（ａ）１３−メチル−、１３−エチル−及び１３−プロピル−６−ｄＥＢの混合物及び（ｂ）１３−プロピル−６−ｄＥＢのみが供給された大腸菌培養物からの抽出物のＬＣ／ＭＳ分析で観察された分子量との比較
【００４７】
上記の実験により、大腸菌はＴＤＰ−デソサミンを良好に合成可能であり、かつ適切なアグリコン基質のグリコシル化も可能であることが示された。我々の研究室での以前の研究（プァイファ（Pfeifer）, et .al. Science 291, 1790, 2001）により、大腸菌ＢＬ２１の改変誘導体もアグリコンを産生できること、及びポリケチド産生のための至適温度はＴＤＰ−デソサミン生合成及び転移のための上述の至適温度とほぼ同等であることが実証されている。従って、２つの技術を併用することにより、実施例４で説明するように大腸菌において生理活性エリスロマイシンを産生できるであろう。同様のアプローチを用いることにより、ヌクレオチド二リン酸糖が産生されかつ６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼが発現される条件下におけるクラジノース、ミカミノース、オレアンドロース、フォロサミン、ダウノサミン、ミカロース、アスカリロース、ラムノース又はミコサミンの生合成を含む、大腸菌へのデオキシ糖生合成及び／又は転移経路を改変することができるであろう。そのような糖は、それ自体有用な代謝産物である。更に、タイロシン(tylosin)、ミデカマイシン、アヴェルメクチン（avermectin）及びカンジシジンのような商業的に重要な他の幾つかの抗生物質もまたグリコシル化を必要とするので、我々の研究は、大腸菌における種々のＰＫの産生及び生合成的改変に広く応用され得るであろう。更に、宿主としての大腸菌の使用は、ポリケチド及びデオキシ糖経路の改変を一層容易にするであろう。例えば、高スループットの菌株改善プログラムは、（化学構造に対する分析的アッセイに対して）生物学的機能に対する抗菌性アッセイを用いて、遺伝子的に改変されたＰＫＳに対して設定することができるであろう。或いは、アグリコン経路を大腸菌の１つの菌株に導入しかつデオキシ糖経路を大腸菌の別の菌株に導入することにより、転換体（converter）菌株の殺菌が可能な新規なＰＫを産生する変異型分泌体（secretor）菌株の選択を容易にする、ペトリ皿における分泌体−転換体実験を実施することも可能であろう。更に、臨床的に関連する抗生物質耐性機構を転換体宿主へ導入する場合、そのような定方向進化（directed evolution）実験は、耐性病原体に対し活性な新規な抗生物質の発見に使用することもできるであろう。
【実施例４】
【００４８】
大腸菌中における３−Ｏ−α−ミカロシル-エリスロノリドＢの産生
【００４９】
ミカロースの生合成に関与する遺伝子をミカロース産生生物の染色体ＤＮＡ由来のディープ・ヴェント（Deep Vent）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いたＰＣＲによって個別に増幅する。ミカロース生合成遺伝子源としては、例えば、（Ｎ．ベイト et al., ''The mycarose-biosynthetic genes of Streptomyces fradiae, producer of tylosin,'' Microbiology (2000) 146, 139-146に記載された）tylAI及びtylAII遺伝子と共にストレプトミセス・フラジアエのtylC遺伝子（tylCII-tylCVII）がある。適切なミカロシルトランスフェラーゼ遺伝子は、例えば、サッカロポリスポラ・エリトラエア（eryCV）又は他の生物から取得可能である。
【００５０】
ＰＣＲプライマーの各ペアを設計して、増幅した遺伝子の５’末端にNdeI部位を導入し、３’末端にSpeI部位を導入する。ＰＣＲ産物をpCR-Blunt II-TOPOベクターにクローン化し、得られたプラスミドを使用して大腸菌ＤＨ５αを形質転換する。プラスミドを酵素NdeI及びSpeIで消化し、各遺伝子に対応するフラグメントを、当該同じ酵素で予め消化した修飾ｐＥＴ-２４ｂ（マルチクローニングカセット内のXbaI部位とEcoRI部位との間の領域を配列５’-ＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＧＡＡＣＴＡＧＴＧＡＡＴＴＣ-３’で置換された修飾体）にクローン化する。
【００５１】
以下のようにして個々の複数のミカロース生合成遺伝子から１つの合成オペロンを構築する。合成オペロンの１つの遺伝子を含むベクターを酵素XbaI及びSpeIで消化し、得られたミカロース遺伝子含有フラグメントを、酵素SpeIで消化した第２の遺伝子を含むベクターに結合する。（制限酵素マッピングによって決定されるような）同一の配向性を有する２つの遺伝子を含むプラスミドを選択してSpeIで消化し、酵素XbaI及びSpeIで消化した第３のミカロース遺伝子含有ベクターからのミカロース遺伝子含有フラグメントに結合する。（制限酵素マッピングによって決定されるような）同一の配向性を有する３つの遺伝子を含むプラスミドを選択する。必要な全てのミカロース生合成遺伝子から（１つの）（目的の）合成オペロンが構築されるまでこのようなサイクルを繰り返す。ミカロシルトランスフェラーゼのための遺伝子（tylCV）及び６−デオキシエリスロノリドＢ６−ヒドロキシラーゼのための遺伝子（eryF）を同様にして加える。
【００５２】
得られたベクターを用いて大腸菌株ＢＬ２１コドン・プラス（Codon Plus）（ストラタジーン社）を形質転換する。個々の形質転換体を、５０μｇ／ｍｌカナマイシン及び０．５μｇ／ｍｌの６−デオキシエリスロノリドＢを含む１５ｍｌＬＢ培地に接種し、３７℃でＡ６００ ０．５〜０．８になるまで増殖したのち、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるまで添加する。次に、培養物を２５℃で４０時間増殖して遠心分離する。上清を等量の酢酸エチルで抽出し、有機物層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発乾固し、エタノールで再溶解する。ミカロシル−ＥＢの存在は、ＬＣ／ＭＳ（［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ ５４７）で確認する。
【００５３】
上記の実験により、大腸菌はＴＤＰ−デソサミンを良好に合成可能であり、かつ適切なアグリコン基質のグリコシル化も可能であることが示された。我々の研究室での以前の研究（プァイファ, et .al. Science 291, 1790, 2001）により、大腸菌ＢＬ２１の改変誘導体もアグリコンを産生できること、及びポリケチド産生のための至適温度はＴＤＰ-デソサミン生合成及び転移のための上述の至適温度とほぼ同等であることが実証されている。従って、２つの技術を併用することにより、実施例４で説明するように大腸菌において生理活性エリスロマイシンを産生できるであろう。同様のアプローチを用いることにより、ヌクレオチド二リン酸糖が産生されかつ6-デオキシグリコシルトランスフェラーゼが発現される条件下におけるクラジノース、ミカミノース、オレアンドロース、フォロサミン、ダウノサミン、ミカロース、アスカリロース、ラムノース又はミコサミンの生合成を含む、大腸菌へのデオキシ糖生合成及び／又は転移経路を改変することができるであろう。そのような糖は、それ自体有用な代謝産物である。更に、タイロシン、ミデカマイシン、アヴェルメクチン及びカンジシジンのような商業的に重要な他の幾つかの抗生物質もまたグリコシル化を必要とするので、我々の研究は、大腸菌における種々のＰＫの産生及び生合成的改変に広く応用され得るであろう。更に、宿主としての大腸菌の使用は、ポリケチド及びデオキシ糖経路の改変を一層容易にするであろう。例えば、高スループットの菌株改善プログラムは、（化学構造に対する分析的アッセイに対して）生物学的機能に対する抗菌性アッセイを用いて、遺伝子的に改変されたＰＫＳに対して設定することができるであろう。或いは、アグリコン経路を大腸菌の１つの菌株に導入しかつデオキシ糖経路を大腸菌の別の菌株に導入することにより、転換体菌株の殺菌が可能な新規なＰＫを産生する変異型分泌体菌株の選択を容易にする、ペトリ皿における分泌体−転換体実験を実施することも可能であろう。更に、臨床的に関連する抗生物質耐性機構を転換体宿主へ導入する場合、そのような定方向進化実験は、耐性病原体に対し活性な新規な抗生物質の発見に使用することもできるであろう。
【実施例５】
【００５４】
大腸菌中におけるエリスロマイシンの調製
【００５５】
エリスロマイシンを産生する大腸菌株は、以下のようにして構築する。好適な宿主細胞は、例えば、ブリッソン−ノエル（Brisson-Noel）et al., ''Evidence for natural gene transfer from gram-positive cocci to Escherichia coli,'' J. Bacteriology (1988) 170(4): 1739-45に記載されたようなermBCを発現する大腸菌株ＢＭ２５７０のような、エリスロマイシン耐性を付与する１又は２以上の遺伝子を発現する大腸菌細胞を含む。最終菌株は、Ｌ−ミカロース及びＤ−デソサミンの生合成及び転移をコードする遺伝子、Ｃ−６及びＣ−１２ヒドロキシラーゼ及び３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子と共に、６−デオキシエリスロノリドＢポリケチドシンターゼ又はその変異体のための遺伝子を含むであろう。また、最終菌株は、ＰＣＴ刊行物WO01/27306及びWO01/31049（これら刊行物の記載内容は引用を以って本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。）に記載されたような適切なスターターユニット（starter unit）及び必要なメチルマロニル−ＣｏＡエキステンダーユニット（extender units）の生合成ための遺伝子も含むであろう。Ｌ−ミカロース及びＤ−デソサミンの生合成及び転移のための遺伝子を導入するための技術は、上記実施例に記載されている。ポリケチドシンターゼ遺伝子を導入するための技術は、ＰＣＴ刊行物WO01/31035（この刊行物の記載内容は引用を以って本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。）に記載されている。例えばアシルトランスフェラーゼ又はβ−ケト−修飾ドメインの選択性を変化するためのドメイン交換によるような、ポリケチドシンターゼの変異型を産生するための技術は、米国特許第6,391,594号；同第6,403,775号；及び同第6,399,789号（これら公報の記載内容は引用を以って本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。）に記載されている。Ｃ−６及びＣ−１２ヒドロキシラーゼのための遺伝子を導入するための技術は、上記実施例に記載されている。３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼのための遺伝子を発現するための技術は、パウルス（Paulus）et al., ''Mutation and cloning of eryG, the structural gene for erythromycin O-methyltransferase from Saccharopolyspora erythraea, and expression of eryG in Escherichia coli,'' J. Bacteriology (1990) 172(5): 2541-6に記載されている。好適に修飾されたエリスロマイシン誘導体は、産生性宿主中の遺伝子の適切な選択によって得ることができる。例えば、６−デオキシエリスロマイシンは、６−ヒドロキシラーゼ遺伝子の排除によって産生することができる。導入された生合成遺伝子は、一般的には、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の付加によって誘導されるlacプロモータのような誘導性プロモータの制御下に置かれる。
【００５６】
これらの宿主細胞を用いてエリスロマイシンを産生するために、細胞の培養物は、適切な培地、例えばＬＢブロスにおいて、温度３０〜４０℃、好ましくは３７℃で、細胞が生合成遺伝子の発現の誘導に好適な密度に達するまで増殖させる。典型的には、この細胞密度は、６００ｎｍの光散乱で測定した場合で凡そ１．０光学密度単位である。この時点で、培養物を２０℃に冷却し、誘導剤、例えばＩＰＴＧを添加する。この比較的低い温度で培養物を増殖させ、定期的にアリコートを採取し、エリスロマイシン産生のためのアッセイにかける。好適なアッセイには、例えばエリスロマイシン標準（erythromycin standards）及び蒸発光散乱法（evaporative light scattering）又は質量分析法による検出を用いるＨＰＬＣ系アッセイ、又は適切な試験菌株、例えばミクロコッカス・ルテウスに対する抗菌活性のような生物学的アッセイが含まれる。エリスロマイシンの産生速度が一定水準に達したことが観察されたら、培養物を遠心分離で収集する。上清をｐＨ９に調節し、ジクロロメタン又は酢酸エチルのような有機溶媒で抽出する。有機層の抽出物を、例えば硫酸ナトリウムによって乾燥し、濾過し、蒸発して粗製エリスロマイシンを得る。精製エリスロマイシンは、既知の方法、例えばクロマトグラフィ又は晶出を用いて得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】各別に発現されたＤｅｓ酵素のＮｉ−ＮＴＡカラムフラクションの４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。左側の数値は、マーカータンパク質の分子量（単位ｋＤａ）を示す。Ｍは分子量マーカー；Ｐはフロー・スルー；Ｗはカラム・ウォッシュ；Ｅは溶出液である。個々の酵素に対して予想される分子量は、ＤｅｓＩは４４ｋＤａ；ＤｅｓＩＩは５３ｋＤａ；ＤｅｓＩＩＩは３０ｋＤａ；ＤｅｓＩＶは３６ｋＤａ；ＤｅｓＶは４１ｋＤａ；ＤｅｓＶＩは２６ｋＤａ；ＤｅｓＶＩＩは４６ｋＤａ；ＤｅｓＶＩＩＩは４２ｋＤａである。
【図２】同時に発現された８つのＤｅｓ酵素のＮｉ−ＮＴＡカラムフラクションの４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｍは分子量マーカー；１は清澄化細胞ライセート；２はフロー・スルー；３はカラム・ウォッシュ；４は溶出液である。左側の数値は、マーカータンパク質の分子量（単位ｋＤａ）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖を産生するための発現システムを有する組換え大腸菌宿主細胞。
【請求項２】
６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼを発現するための発現システムを更に含む請求項１の宿主細胞。
【請求項３】
ポリケチドの合成のための発現システムを更に含む請求項２の宿主細胞。
【請求項４】
前記糖は、前記ヌクレオチド二リン酸糖が産生されかつ前記６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼが発現される条件下においてデソサミン、クラジノース、ミカミノース、オレアンドロース、フォロサミン、ダウノサミン、ミカロース、アスカリロース、ラムノース、及びミコサミンからなる群から選択される請求項１の宿主細胞。
【請求項５】
前記糖は、Ｄ−デソサミンである請求項４の宿主細胞。
【請求項６】
前記発現システムは、ストレプトミセス・ベネズエラエ、サッカロポリスポラ・エリトラエア、ストレプトミセス・ナルボネシス、又はストレプトミセス・アンチビオチクスに由来するデソサミン生合成遺伝子を含む請求項１の宿主細胞。
【請求項７】
前記デソサミン生合成遺伝子は、ストレプトミセス・ベネズエラエに由来する請求項６の宿主細胞。
【請求項８】
前記デソサミン生合成遺伝子は、desI-desVI及びdesVIII遺伝子を含む請求項７の宿主細胞。
【請求項９】
デソサミニルトランスフェラーゼを発現するための発現システムを更に含む請求項８の宿主細胞。
【請求項１０】
前記ポリケチドの合成のための発現システムは、６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼをコードする遺伝子を含む請求項３の宿主細胞。
【請求項１１】
６−エリスロノリドＢ６−ヒドロキシラーゼのための発現システムを更に含む請求項１０の宿主細胞。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖を産生するための発現システムは、ＴＤＰ−ミカロースを産生する酵素をコードする遺伝子を含み、及び前記６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼを発現するための発現システムは、ミカロシルトランスフェラーゼを発現する請求項１１の宿主細胞。
【請求項１３】
ｅｒｍリボソームメチルトランスフェラーゼのための発現システムによって更に修飾される請求項１１の宿主細胞。
【請求項１４】
ＴＤＰ−デソサミン及びデソサミニルトランスフェラーゼを産生するための発現システムを更に含む請求項１３の宿主細胞。
【請求項１５】
エリスロマイシンＤ１２−ヒドロキシラーゼための発現システムを更に含む請求項１４の宿主細胞。
【請求項１６】
エリスロマイシンＣ３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼのための発現システムを更に含む請求項１５の宿主細胞。
【請求項１７】
前記ヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖が産生されかつ前記６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼが発現される条件下において請求項２の宿主細胞の培地にポリケチドを供給すること、を含むグリコシル化ポリケチドを産生するための方法。
【請求項１８】
前記ポリケチドは、６−デオキシエリスロノリドＢである、請求項１７の方法。
【請求項１９】
請求項１６の宿主細胞を、各発現システム中の遺伝子が発現されて機能性酵素が産生される条件下において培養すること、を含むエリスロマイシンアナログを産生するための方法。
【請求項２０】
前記ヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖を産生するための発現システムは、ミクロモノスポラ・メガロミセアに由来する生合成遺伝子を含まない請求項１の宿主細胞。
【請求項１】
少なくとも１つのヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖を産生するための発現システムを有する組換え大腸菌宿主細胞。
【請求項２】
６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼを発現するための発現システムを更に含む請求項１の宿主細胞。
【請求項３】
ポリケチドの合成のための発現システムを更に含む請求項２の宿主細胞。
【請求項４】
前記糖は、前記ヌクレオチド二リン酸糖が産生されかつ前記６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼが発現される条件下においてデソサミン、クラジノース、ミカミノース、オレアンドロース、フォロサミン、ダウノサミン、ミカロース、アスカリロース、ラムノース、及びミコサミンからなる群から選択される請求項１の宿主細胞。
【請求項５】
前記糖は、Ｄ−デソサミンである請求項４の宿主細胞。
【請求項６】
前記発現システムは、ストレプトミセス・ベネズエラエ、サッカロポリスポラ・エリトラエア、ストレプトミセス・ナルボネシス、又はストレプトミセス・アンチビオチクスに由来するデソサミン生合成遺伝子を含む請求項１の宿主細胞。
【請求項７】
前記デソサミン生合成遺伝子は、ストレプトミセス・ベネズエラエに由来する請求項６の宿主細胞。
【請求項８】
前記デソサミン生合成遺伝子は、desI-desVI及びdesVIII遺伝子を含む請求項７の宿主細胞。
【請求項９】
デソサミニルトランスフェラーゼを発現するための発現システムを更に含む請求項８の宿主細胞。
【請求項１０】
前記ポリケチドの合成のための発現システムは、６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼをコードする遺伝子を含む請求項３の宿主細胞。
【請求項１１】
６−エリスロノリドＢ６−ヒドロキシラーゼのための発現システムを更に含む請求項１０の宿主細胞。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖を産生するための発現システムは、ＴＤＰ−ミカロースを産生する酵素をコードする遺伝子を含み、及び前記６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼを発現するための発現システムは、ミカロシルトランスフェラーゼを発現する請求項１１の宿主細胞。
【請求項１３】
ｅｒｍリボソームメチルトランスフェラーゼのための発現システムによって更に修飾される請求項１１の宿主細胞。
【請求項１４】
ＴＤＰ−デソサミン及びデソサミニルトランスフェラーゼを産生するための発現システムを更に含む請求項１３の宿主細胞。
【請求項１５】
エリスロマイシンＤ１２−ヒドロキシラーゼための発現システムを更に含む請求項１４の宿主細胞。
【請求項１６】
エリスロマイシンＣ３”−Ｏ−メチルトランスフェラーゼのための発現システムを更に含む請求項１５の宿主細胞。
【請求項１７】
前記ヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖が産生されかつ前記６−デオキシグリコシルトランスフェラーゼが発現される条件下において請求項２の宿主細胞の培地にポリケチドを供給すること、を含むグリコシル化ポリケチドを産生するための方法。
【請求項１８】
前記ポリケチドは、６−デオキシエリスロノリドＢである、請求項１７の方法。
【請求項１９】
請求項１６の宿主細胞を、各発現システム中の遺伝子が発現されて機能性酵素が産生される条件下において培養すること、を含むエリスロマイシンアナログを産生するための方法。
【請求項２０】
前記ヌクレオチド二リン酸６−デオキシ−糖を産生するための発現システムは、ミクロモノスポラ・メガロミセアに由来する生合成遺伝子を含まない請求項１の宿主細胞。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５００９２８（Ｐ２００６−５００９２８Ａ）
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３５９９５（Ｐ２００４−５３５９９５）
【出願日】平成１５年７月３１日（２００３．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２４１０９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２４７４４
【国際公開日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【出願人】（５０１２４３０３０）ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー (17)
【出願人】（５０００１７８３０）コーサン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年７月３１日（２００３．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２４１０９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２４７４４
【国際公開日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【出願人】（５０１２４３０３０）ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー (17)
【出願人】（５０００１７８３０）コーサン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
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