大豆ホエー蛋白及び大豆ホエー蛋白分解物の製造法
大豆ホエー中に含まれる蛋白質を、効率よく、高純度で回収し、製造する方法を提供する。 分離大豆蛋白を豆乳あるいは脱脂豆乳から等電点沈澱によって、採取する際にバイプロとされる大豆ホエー中に含まれる蛋白質を効率的に回収することは、これまで困難であり、回収しても蛋白質純度が低いなどの欠点があった。本製造法は、大豆ホエーをＣａイオン共存下で加熱し、沈澱物として回収した後、沈澱物を酸性下で洗浄し、中和することによって効率よく、高純度の大豆ホエー蛋白質を得るものであり、上記の課題を解決したものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大豆ホエーから効率的に、しかも高純度で回収することのできる大豆ホエー蛋白及び大豆ホエー蛋白分解物の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆の主要な貯蔵蛋白である７Ｓグロブリン（β−コングリシニンともいう。）や１１Ｓグロブリン（グリシニンともいう。）等は豆乳や脱脂豆乳等から等電点沈澱や加熱によって分離される。その際に副産物として生成する大豆ホエー中には、大豆の微量蛋白質であるレクチン（ヘマグルチニンともいう。）やクニッツ型トリプシンインヒビターなどが含まれる。これらの大豆ホエー蛋白は種々の生理活性を有することが報告されており、新たな健康栄養素材として期待されている。
【０００３】
しかし、これらは微量成分であるため、蛋白素材として利用するためには、高純度かつ効率的に回収することが必須である。従来、カルシウムイオンの共存下で大豆ホエーを加熱すると生成する凝集物（大豆ホエー蛋白が含まれる。）を除去し、上清側の大豆オリゴ糖を回収する知見はいくつか報告されている（特許文献１，２）。
【０００４】
しかしこれらの報告は大豆オリゴ糖の回収を目的とするため、その副産物である大豆ホエー蛋白をいかに高純度化し、有効利用しようとするか、という思想には及んでいない。そのため特許文献１や２に示された方法により大豆ホエーの加熱凝集物を回収しても、蛋白質純度が非常に低い問題があった。さらにカルシウムイオンを用いるために灰分の含量が増加してしまい、塩味が強く感じられる等、蛋白質素材とするには課題が残っていた。
【０００５】
【特許文献１】特開平３−２２９７１号公報
【特許文献２】特開昭５９−１７９０６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、大豆ホエーから大豆の微量蛋白質である大豆ホエー蛋白（レクチンやクニッツ型トリプシンインヒビターなど）を効率的かつ高純度に回収することのできる大豆ホエー蛋白の製造法を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は鋭意研究を重ねた結果、大豆ホエーから得られた加熱凝集物を酸性下にさらし、可溶性物を除去することによって、大豆ホエー蛋白の純度が上昇傾向となる知見が得られた。そしてさらなる研究の結果、その洗浄時のｐＨを特定のｐＨ域に調整することによって、大豆ホエー蛋白の蛋白質純度が飛躍的に高くなるという知見を得て、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち本発明は、大豆ホエーを加熱して生ずる加熱凝集物をｐＨ４以下の酸性下にさらし、可溶性物を除去することを特徴とする大豆ホエー蛋白の製造法である。上記製造法において、大豆ホエーを加熱する温度は８０〜１２０℃であるのが好ましい。加熱はアルカリ土類金属イオンの共存下で行うのが好ましい。大豆ホエーを加熱する際のｐＨは２〜９が好ましい。得られた大豆ホエー蛋白中には、蛋白質がケルダール法による窒素量として固形分１ｇあたり９６ｍｇ以上（窒素換算係数を６．２５とした場合、蛋白質として６０重量％以上）含まれるのが好ましい。さらに本発明は、上記製造法で得られる大豆ホエー蛋白をさらに中和後、加熱（１００〜１５０℃）することを特徴とする可溶化大豆ホエー蛋白の製造法である。さらに本発明は、上記製造法で得られる大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させることを特徴とする大豆ホエー蛋白分解物の製造法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により工業的に可能な製造方法で純度の高い大豆レクチンやトリプシンインヒビターなどの大豆ホエー蛋白を提供することができる。本発明のごとく効率的に高純度の大豆ホエー蛋白を調製できる製造法は、大豆ホエー蛋白を大豆蛋白素材として供給する技術として非常に有望である。
大豆ホエー中に含まれる蛋白質は、主要貯蔵大豆蛋白質と異なり微量にしか含まれておらず、回収することが容易ではなかった。本製法を採用することによって、この大豆ホエー蛋白を効率良く、高純度で回収でき、また所望により溶解性を持たせることも可能である。これまで利用されてこなかった大豆ホエー蛋白の加工・利用を広げていくことが、この製造法を採用することによって可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、大豆ホエーを加熱して生ずる加熱凝集物をｐＨ４以下の酸性下にさらし、可溶性物を除去することを特徴とする大豆ホエー蛋白の製造法である。
【００１１】
本発明において使用する大豆ホエーは、脱脂大豆や大豆から水抽出時又は水抽出後に、大豆の主要な貯蔵蛋白質である７Ｓグロブリンや１１Ｓグロブリンが除去され、蛋白質としてレクチンやトリプシンインヒビターなどの微量成分が含まれるものである。好適には脱脂大豆を水性溶媒で抽出しオカラを除いて豆乳を得、等電点沈殿（ｐＨ４．４〜４．６）により７Ｓグロブリンや１１Ｓグロブリンを主成分とする分離大豆蛋白を回収し、副産物として得られる大豆ホエーが用いられる。もちろん脱脂大豆を酸性水溶液やアルコールで洗浄して濃縮大豆蛋白を得る際に副産物として得られる大豆ホエー、あるいは豆腐、豆乳、醤油、納豆などの製造工程中に得られる副産物として得られる大豆ホエーなども用いることができ、特に限定はされない。
【００１２】
上記大豆ホエーには、調製方法にもよるが、粗蛋白質が全固形分あたり約１５〜３０重量％程度含まれる。その組成は大豆の主要な貯蔵蛋白質とは異なり、全蛋白質中レクチンが１０〜２０％、クニッツ型トリプシンインヒビターが３０〜５０％、その他βアミラーゼ、リポキシゲナーゼなどの微量蛋白質が主成分となっている。そして大豆の主要な貯蔵蛋白質であるβ−コングリシニン及びグリシニンの組成は全蛋白質中１０％にも満たない。
【００１３】
本発明はまず大豆ホエーを加熱し、凝集する物質（加熱凝集物）を回収する工程を経る。加熱することにより、大豆ホエー中の蛋白質が熱変性を起こし、凝集する。加熱温度は大豆ホエー蛋白が変性するに十分な温度とし、好ましくは８０〜１２０℃、より好ましくは８５〜１００℃で行う。加熱温度が８０℃未満であると凝集塊への成長が不十分であり、加熱温度が１２０℃を超えると褐変などによる着色が生じやすい。加熱時間は凝集の形成に十分な時間とすればよく、温度により異なるが、５〜６０分の範囲で行えば十分である。
【００１４】
また、大豆ホエーを加熱する際に、予めアルカリ土類金属イオンを共存させると大豆ホエー蛋白の凝集が促進されるため、効率的に加熱凝集物を回収するのに好ましい。アルカリ土類金属イオンは大豆ホエー量に対して０．０２〜１重量％添加すればよい。アルカリ土類金属の種類は、ＣａやＭｇを含む塩や水酸化物であれば特に限定されない。
【００１５】
加熱を行う際の大豆ホエーのｐＨは２〜９とすることが好ましい。ｐＨが２未満であると酸による好ましくない風味の悪化が起こり、ｐＨが９を超えるとアルカリによる風味の悪化が懸念される。より好ましくはｐＨ４〜７、さらに好ましくは５〜６とすることが適当である。ｐＨ４未満になるとｐＨ調整に多量の酸が必要となるため、加熱凝集物の灰分が増加し、後の蛋白質の高純度化がしにくくなる。またｐＨ７を超えると加熱凝集物がしまりが良くなく、分離がしづらい傾向となる。
【００１６】
次に、加熱凝集物を遠心分離や膜分離などの分離手段によって回収する。この段階で大豆ホエーに含まれるスタキオースやラフィノースなどの大豆オリゴ糖が除去され、大豆ホエー中に含まれる窒素含有量の約５０％が沈降する。この加熱凝集物の中には、レクチンやトリプシンインヒビターなどが主要な蛋白質成分として認められ、その他リポキシゲナーゼや分子量２万以下の低分子成分などの微量蛋白質成分も含まれる。しかし、加熱凝集物中の蛋白質純度は、ケルダール法測定によれば、窒素量として固形分１ｇあたり８０ｍｇ／ｇ（固形分）（窒素換算係数を６．２５とした場合、蛋白質として５０重量％）程度しかなく、大豆蛋白素材として扱うには純度が低すぎて好ましくない。またこのままでは固形分当たり、３０％前後の灰分が含まれ、塩味が強い。
【００１７】
蛋白質の純度がこのように低い原因は、上記の通り、Ｃａなどの灰分が固形分あたりい３０％程度も含まれていることによる。この灰分はフィチン酸などとの錯体を形成しており、これが加熱によって大豆ホエー蛋白質と共に凝集してくると考えられる。この加熱凝集物は純水でいくら洗浄しても、蛋白質純度が低いままである。
【００１８】
本発明は、大豆ホエーの加熱凝集物にさらに水を加えて強酸性下にさらし、可溶化した不純物を洗浄することに特徴を有する。ここで強酸性下にさらすとは、ｐＨ４以下、好ましくはｐＨ３以下、さらに好ましくはｐＨ１．５〜２．５にさらすことである。ｐＨ４を超えると蛋白質以外の不純物を十分に可溶化することができない。例えばｐＨ５．３程度で加熱沈澱させたものを、ｐＨ５．３〜４．５付近で水でいくら洗浄してもタンパク質純度が上がらない。すなわち、微酸性〜強アルカリ性下にさらしても、加熱凝集物の蛋白質組成にほとんど変化が無いのに対し、強酸性下にその沈澱物をさらすことによって、蛋白質以外の不純物を可及的に可溶化させることができる。酸性下に調整する際の酸の種類は特に限定されず、塩酸やリン酸等を用いればよい。
【００１９】
蛋白質はこの際不溶性を維持しているため、この双方の溶解挙動を利用し、酸による可溶性物（灰分やフィチン酸が主体と考えられる）を洗浄し、除去することによって、加熱凝集物中の蛋白質純度を飛躍的に増加させることができる。洗浄する際は、前記さらし工程よりもｐＨは高くても良く、ｐＨ５以下、より好ましくはｐＨ１．５〜４に調整して洗浄すればよい。ｐＨが５を超えると酸で一旦可溶化していた不純物が再度不溶化し、沈澱してくるため、避けた方が良い。
【００２０】
得られた大豆ホエー蛋白は、窒素量として固形分１ｇあたり９６ｍｇ以上、好ましくは１１２ｍｇ以上（窒素換算係数を６．２５した場合、蛋白質として６０重量％以上、好ましくは７０重量％以上、より好ましくは７５重量％以上）の純度を有する。また大豆ホエー蛋白中には蛋白質あたり、レクチンが１５〜３０重量％、クニッツ型トリプシンインヒビターが４０〜８０重量％含まれる。酸による可溶性物と不溶性となった大豆ホエー蛋白の分離は遠心分離や膜分離などの分離手段を用いればよい。
【００２１】
得られた高純度の大豆ホエー蛋白は、不溶性となっているが、所望により、これをｐＨ６．５〜９、好ましくはｐＨ７〜８に中和後、１００〜１５０℃、好ましくは１１０〜１２０℃の強加熱をすることによって可溶化されるため、可溶性であり、かつ高純度の大豆ホエー蛋白を提供することもできる。加熱手段は間接加熱でも直接加熱でも使用できるが、風味や着色の点で蒸気吹き込み式の直接加熱を行うことが好ましい。
【００２２】
さらに、所望により、上記により得られた大豆ホエー蛋白を原料として、プロテアーゼによって加水分解を施し、必要により不溶性画分を除去して大豆ホエー蛋白分解物を提供することができる。使用するプロテアーゼとしては特に限定されないが、アンジオテンシン変換酵素阻害活性などのより高い生理活性を得るために、微生物由来、植物由来又は動物由来のエンド型プロテアーゼの使用が好ましい。具体的には金属プロテアーゼ（サーモライシンなど）、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、プラスミン、エラスターゼ、ズブチリシンなど）、チオールプロテアーゼ（パパイン、フィシン、ブロメライン、カテプシンＢなど）、アスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシン、キモシン、カテプシンＤなど）などを用いることができる。得られた大豆ホエー蛋白分解物には、アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドや、抗酸化活性ペプチドなど、種々の生理活性ペプチドが含まれていると考えられる。したがってこの分解物をそのまま、あるいは特定の生理活性ペプチドを含む画分を分画して、生理活性ペプチド含有組成物として医薬品や特定保健用食品などの健康食品にも適用することもできる。
【００２３】
大豆ホエーに含まれるレクチンやトリプシンインヒビターは、非栄養蛋白質であるとして、従来は敬遠されてきた。しかし、本発明の製造法により得られた大豆ホエー蛋白や大豆ホエー蛋白分解物は、これらの蛋白質を充分に熱変性させ、また加水分解物にすることによって、トリプシン阻害作用等は消失している。さらに、分離大豆蛋白などに比べ、システインやメチオニン等の含硫アミノ酸の量も高いことから、アミノ酸組成バランスの指標であるアミノ酸スコアも優れており、栄養的にはさらに望ましいものである。したがって栄養源や生理機能に優れた大豆蛋白素材又はペプチド含有組成物として新たに利用が可能である。この大豆ホエー蛋白やその分解物は、また、ロイシン、イソロイシンン、バリン等の分岐鎖アミノ酸も分離大豆蛋白由来のペプチドよりも豊富に含まれるため、アスリート向けサプリメントとしての利点もある。
【実施例】
【００２４】
以下に、実施例および比較例を例示して本発明効果をより明瞭にするが、本発明はこれらの例示に制約されるものではない。
【００２５】
〔比較例１〕
脱脂大豆１部に１０倍の水を加え、よく攪拌し、これに塩酸を加えてｐＨを４．５に調整した。等電点沈澱によって凝集する７Ｓグロブリンや１１Ｓグロブリンなどの不溶物を遠心分離によって除去し、大豆ホエーを得た。この大豆ホエーに消石灰を加え、ｐＨを５．３に調整し、９０〜９５℃で１５分ほど放置して凝集する画分を遠心分離にて採取した。これをカルシウム加熱凝集タイプの大豆ホエー蛋白とした。この画分を凍結乾燥し、その窒素含有量を求めた。結果を表１に示す。
【実施例１】
【００２６】
比較例１のカルシウム加熱凝集タイプの大豆ホエー蛋白の固形分重量１部に対し、水を１０倍量加え、塩酸を添加して、ｐＨを２．０に調整し、ホモミキサー５０００ｒｐｍ、１０分攪拌して遠心分離（１０００Ｇ×１０分）を行い、その沈澱物を回収した。回収した沈澱物を凍結乾燥し、固形分の重量回収率と窒素含有量を求めた。結果を表１に示す。また回収物のアミノ酸組成を調べ、分離大豆タンパク質のそれと比較した。結果を表２に示す。
【００２７】
〔比較例２〕
比較例１のカルシウム加熱凝集タイプの大豆ホエー蛋白の固形分重量１部に対し、水を１０倍量加え、ホモミキサー５０００ｒｐｍ、１０分攪拌して遠心分離（１０００Ｇ×１０分）を行い、その沈澱物を回収した。このとき加水後のｐＨは５．５であった。回収した沈澱物を凍結乾燥し、固形分の重量回収率と窒素含有量を求めた。結果を表１に示す。
【００２８】
〔比較例３〕
比較例１のカルシウム加熱凝集タイプの大豆ホエー蛋白の固形分重量１部に対し、水を１０倍加え、水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨを１０．０に調整し、ホモミキサー５０００ｒｐｍ、１０分攪拌して遠心分離（１０００Ｇ×１０分）を行い、その沈澱物を回収した。回収した沈澱物を凍結乾燥し、固形分の重量回収率と窒素含有量を求めた。結果を表１に示す。
【００２９】
【００３０】
【００３１】
この結果、実施例１にみられるように、強酸性下で可溶化する画分を除くことによって蛋白質純度が飛躍的に向上し、灰分も可及的に低減できることがわかる。次に、この蛋白質純度が向上した実施例１の蛋白質の可溶化を実施した。
【実施例２】
【００３２】
実施例１で調製したものの５％混合液を作製し、水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨを７．８に調整し、１２０℃、１５分の加熱を行い、遠心分離（１０００Ｇ×１０分）を行い、上澄みに残る蛋白質、つまり全体の窒素量に対する上澄みの窒素含有率を求めた。その結果を表３に示す。
【００３３】
〔比較例４〕
実施例１で調製したものの５％混合液を作製し、水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨを６．５に調整し、９５℃、１５分の加熱を行い、遠心分離（１０００Ｇ×１０分）を行い、上澄みに残る蛋白質、つまり全体の窒素量に対する上澄みの窒素含有率を求めた。その結果を表３に示す。
【００３４】
【００３５】
この結果から、不溶性である大豆ホエー蛋白の再可溶化は、中和後、強加熱することによって可能であった。
【実施例３】
【００３６】
実施例１で調製した大豆ホエー蛋白の５％混合液を調製し、水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨを７．８に調整し、１２０℃、１５分の加熱を行った。その後、これを水酸化ナトリウムでｐＨ８に調製し、大豆ホエー蛋白質当たり１％の「プロテアーゼＳ」（大和化成製、枯草菌由来エンド型プロテアーゼ）を加え、６０℃、４時間反応し、リン酸でｐＨ４．５に調製して、１００℃で２０分加熱して反応を止め、遠心分離（１０００Ｇ×５分）を行い、上澄みを回収し、大豆ホエー蛋白分解物を得た。この分解物の分子量をゲルろ過によって測定すると、ペプチドの７０％以上が分子量１０００以下であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大豆ホエーから効率的に、しかも高純度で回収することのできる大豆ホエー蛋白及び大豆ホエー蛋白分解物の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆の主要な貯蔵蛋白である７Ｓグロブリン（β−コングリシニンともいう。）や１１Ｓグロブリン（グリシニンともいう。）等は豆乳や脱脂豆乳等から等電点沈澱や加熱によって分離される。その際に副産物として生成する大豆ホエー中には、大豆の微量蛋白質であるレクチン（ヘマグルチニンともいう。）やクニッツ型トリプシンインヒビターなどが含まれる。これらの大豆ホエー蛋白は種々の生理活性を有することが報告されており、新たな健康栄養素材として期待されている。
【０００３】
しかし、これらは微量成分であるため、蛋白素材として利用するためには、高純度かつ効率的に回収することが必須である。従来、カルシウムイオンの共存下で大豆ホエーを加熱すると生成する凝集物（大豆ホエー蛋白が含まれる。）を除去し、上清側の大豆オリゴ糖を回収する知見はいくつか報告されている（特許文献１，２）。
【０００４】
しかしこれらの報告は大豆オリゴ糖の回収を目的とするため、その副産物である大豆ホエー蛋白をいかに高純度化し、有効利用しようとするか、という思想には及んでいない。そのため特許文献１や２に示された方法により大豆ホエーの加熱凝集物を回収しても、蛋白質純度が非常に低い問題があった。さらにカルシウムイオンを用いるために灰分の含量が増加してしまい、塩味が強く感じられる等、蛋白質素材とするには課題が残っていた。
【０００５】
【特許文献１】特開平３−２２９７１号公報
【特許文献２】特開昭５９−１７９０６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、大豆ホエーから大豆の微量蛋白質である大豆ホエー蛋白（レクチンやクニッツ型トリプシンインヒビターなど）を効率的かつ高純度に回収することのできる大豆ホエー蛋白の製造法を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は鋭意研究を重ねた結果、大豆ホエーから得られた加熱凝集物を酸性下にさらし、可溶性物を除去することによって、大豆ホエー蛋白の純度が上昇傾向となる知見が得られた。そしてさらなる研究の結果、その洗浄時のｐＨを特定のｐＨ域に調整することによって、大豆ホエー蛋白の蛋白質純度が飛躍的に高くなるという知見を得て、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち本発明は、大豆ホエーを加熱して生ずる加熱凝集物をｐＨ４以下の酸性下にさらし、可溶性物を除去することを特徴とする大豆ホエー蛋白の製造法である。上記製造法において、大豆ホエーを加熱する温度は８０〜１２０℃であるのが好ましい。加熱はアルカリ土類金属イオンの共存下で行うのが好ましい。大豆ホエーを加熱する際のｐＨは２〜９が好ましい。得られた大豆ホエー蛋白中には、蛋白質がケルダール法による窒素量として固形分１ｇあたり９６ｍｇ以上（窒素換算係数を６．２５とした場合、蛋白質として６０重量％以上）含まれるのが好ましい。さらに本発明は、上記製造法で得られる大豆ホエー蛋白をさらに中和後、加熱（１００〜１５０℃）することを特徴とする可溶化大豆ホエー蛋白の製造法である。さらに本発明は、上記製造法で得られる大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させることを特徴とする大豆ホエー蛋白分解物の製造法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により工業的に可能な製造方法で純度の高い大豆レクチンやトリプシンインヒビターなどの大豆ホエー蛋白を提供することができる。本発明のごとく効率的に高純度の大豆ホエー蛋白を調製できる製造法は、大豆ホエー蛋白を大豆蛋白素材として供給する技術として非常に有望である。
大豆ホエー中に含まれる蛋白質は、主要貯蔵大豆蛋白質と異なり微量にしか含まれておらず、回収することが容易ではなかった。本製法を採用することによって、この大豆ホエー蛋白を効率良く、高純度で回収でき、また所望により溶解性を持たせることも可能である。これまで利用されてこなかった大豆ホエー蛋白の加工・利用を広げていくことが、この製造法を採用することによって可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、大豆ホエーを加熱して生ずる加熱凝集物をｐＨ４以下の酸性下にさらし、可溶性物を除去することを特徴とする大豆ホエー蛋白の製造法である。
【００１１】
本発明において使用する大豆ホエーは、脱脂大豆や大豆から水抽出時又は水抽出後に、大豆の主要な貯蔵蛋白質である７Ｓグロブリンや１１Ｓグロブリンが除去され、蛋白質としてレクチンやトリプシンインヒビターなどの微量成分が含まれるものである。好適には脱脂大豆を水性溶媒で抽出しオカラを除いて豆乳を得、等電点沈殿（ｐＨ４．４〜４．６）により７Ｓグロブリンや１１Ｓグロブリンを主成分とする分離大豆蛋白を回収し、副産物として得られる大豆ホエーが用いられる。もちろん脱脂大豆を酸性水溶液やアルコールで洗浄して濃縮大豆蛋白を得る際に副産物として得られる大豆ホエー、あるいは豆腐、豆乳、醤油、納豆などの製造工程中に得られる副産物として得られる大豆ホエーなども用いることができ、特に限定はされない。
【００１２】
上記大豆ホエーには、調製方法にもよるが、粗蛋白質が全固形分あたり約１５〜３０重量％程度含まれる。その組成は大豆の主要な貯蔵蛋白質とは異なり、全蛋白質中レクチンが１０〜２０％、クニッツ型トリプシンインヒビターが３０〜５０％、その他βアミラーゼ、リポキシゲナーゼなどの微量蛋白質が主成分となっている。そして大豆の主要な貯蔵蛋白質であるβ−コングリシニン及びグリシニンの組成は全蛋白質中１０％にも満たない。
【００１３】
本発明はまず大豆ホエーを加熱し、凝集する物質（加熱凝集物）を回収する工程を経る。加熱することにより、大豆ホエー中の蛋白質が熱変性を起こし、凝集する。加熱温度は大豆ホエー蛋白が変性するに十分な温度とし、好ましくは８０〜１２０℃、より好ましくは８５〜１００℃で行う。加熱温度が８０℃未満であると凝集塊への成長が不十分であり、加熱温度が１２０℃を超えると褐変などによる着色が生じやすい。加熱時間は凝集の形成に十分な時間とすればよく、温度により異なるが、５〜６０分の範囲で行えば十分である。
【００１４】
また、大豆ホエーを加熱する際に、予めアルカリ土類金属イオンを共存させると大豆ホエー蛋白の凝集が促進されるため、効率的に加熱凝集物を回収するのに好ましい。アルカリ土類金属イオンは大豆ホエー量に対して０．０２〜１重量％添加すればよい。アルカリ土類金属の種類は、ＣａやＭｇを含む塩や水酸化物であれば特に限定されない。
【００１５】
加熱を行う際の大豆ホエーのｐＨは２〜９とすることが好ましい。ｐＨが２未満であると酸による好ましくない風味の悪化が起こり、ｐＨが９を超えるとアルカリによる風味の悪化が懸念される。より好ましくはｐＨ４〜７、さらに好ましくは５〜６とすることが適当である。ｐＨ４未満になるとｐＨ調整に多量の酸が必要となるため、加熱凝集物の灰分が増加し、後の蛋白質の高純度化がしにくくなる。またｐＨ７を超えると加熱凝集物がしまりが良くなく、分離がしづらい傾向となる。
【００１６】
次に、加熱凝集物を遠心分離や膜分離などの分離手段によって回収する。この段階で大豆ホエーに含まれるスタキオースやラフィノースなどの大豆オリゴ糖が除去され、大豆ホエー中に含まれる窒素含有量の約５０％が沈降する。この加熱凝集物の中には、レクチンやトリプシンインヒビターなどが主要な蛋白質成分として認められ、その他リポキシゲナーゼや分子量２万以下の低分子成分などの微量蛋白質成分も含まれる。しかし、加熱凝集物中の蛋白質純度は、ケルダール法測定によれば、窒素量として固形分１ｇあたり８０ｍｇ／ｇ（固形分）（窒素換算係数を６．２５とした場合、蛋白質として５０重量％）程度しかなく、大豆蛋白素材として扱うには純度が低すぎて好ましくない。またこのままでは固形分当たり、３０％前後の灰分が含まれ、塩味が強い。
【００１７】
蛋白質の純度がこのように低い原因は、上記の通り、Ｃａなどの灰分が固形分あたりい３０％程度も含まれていることによる。この灰分はフィチン酸などとの錯体を形成しており、これが加熱によって大豆ホエー蛋白質と共に凝集してくると考えられる。この加熱凝集物は純水でいくら洗浄しても、蛋白質純度が低いままである。
【００１８】
本発明は、大豆ホエーの加熱凝集物にさらに水を加えて強酸性下にさらし、可溶化した不純物を洗浄することに特徴を有する。ここで強酸性下にさらすとは、ｐＨ４以下、好ましくはｐＨ３以下、さらに好ましくはｐＨ１．５〜２．５にさらすことである。ｐＨ４を超えると蛋白質以外の不純物を十分に可溶化することができない。例えばｐＨ５．３程度で加熱沈澱させたものを、ｐＨ５．３〜４．５付近で水でいくら洗浄してもタンパク質純度が上がらない。すなわち、微酸性〜強アルカリ性下にさらしても、加熱凝集物の蛋白質組成にほとんど変化が無いのに対し、強酸性下にその沈澱物をさらすことによって、蛋白質以外の不純物を可及的に可溶化させることができる。酸性下に調整する際の酸の種類は特に限定されず、塩酸やリン酸等を用いればよい。
【００１９】
蛋白質はこの際不溶性を維持しているため、この双方の溶解挙動を利用し、酸による可溶性物（灰分やフィチン酸が主体と考えられる）を洗浄し、除去することによって、加熱凝集物中の蛋白質純度を飛躍的に増加させることができる。洗浄する際は、前記さらし工程よりもｐＨは高くても良く、ｐＨ５以下、より好ましくはｐＨ１．５〜４に調整して洗浄すればよい。ｐＨが５を超えると酸で一旦可溶化していた不純物が再度不溶化し、沈澱してくるため、避けた方が良い。
【００２０】
得られた大豆ホエー蛋白は、窒素量として固形分１ｇあたり９６ｍｇ以上、好ましくは１１２ｍｇ以上（窒素換算係数を６．２５した場合、蛋白質として６０重量％以上、好ましくは７０重量％以上、より好ましくは７５重量％以上）の純度を有する。また大豆ホエー蛋白中には蛋白質あたり、レクチンが１５〜３０重量％、クニッツ型トリプシンインヒビターが４０〜８０重量％含まれる。酸による可溶性物と不溶性となった大豆ホエー蛋白の分離は遠心分離や膜分離などの分離手段を用いればよい。
【００２１】
得られた高純度の大豆ホエー蛋白は、不溶性となっているが、所望により、これをｐＨ６．５〜９、好ましくはｐＨ７〜８に中和後、１００〜１５０℃、好ましくは１１０〜１２０℃の強加熱をすることによって可溶化されるため、可溶性であり、かつ高純度の大豆ホエー蛋白を提供することもできる。加熱手段は間接加熱でも直接加熱でも使用できるが、風味や着色の点で蒸気吹き込み式の直接加熱を行うことが好ましい。
【００２２】
さらに、所望により、上記により得られた大豆ホエー蛋白を原料として、プロテアーゼによって加水分解を施し、必要により不溶性画分を除去して大豆ホエー蛋白分解物を提供することができる。使用するプロテアーゼとしては特に限定されないが、アンジオテンシン変換酵素阻害活性などのより高い生理活性を得るために、微生物由来、植物由来又は動物由来のエンド型プロテアーゼの使用が好ましい。具体的には金属プロテアーゼ（サーモライシンなど）、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、プラスミン、エラスターゼ、ズブチリシンなど）、チオールプロテアーゼ（パパイン、フィシン、ブロメライン、カテプシンＢなど）、アスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシン、キモシン、カテプシンＤなど）などを用いることができる。得られた大豆ホエー蛋白分解物には、アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドや、抗酸化活性ペプチドなど、種々の生理活性ペプチドが含まれていると考えられる。したがってこの分解物をそのまま、あるいは特定の生理活性ペプチドを含む画分を分画して、生理活性ペプチド含有組成物として医薬品や特定保健用食品などの健康食品にも適用することもできる。
【００２３】
大豆ホエーに含まれるレクチンやトリプシンインヒビターは、非栄養蛋白質であるとして、従来は敬遠されてきた。しかし、本発明の製造法により得られた大豆ホエー蛋白や大豆ホエー蛋白分解物は、これらの蛋白質を充分に熱変性させ、また加水分解物にすることによって、トリプシン阻害作用等は消失している。さらに、分離大豆蛋白などに比べ、システインやメチオニン等の含硫アミノ酸の量も高いことから、アミノ酸組成バランスの指標であるアミノ酸スコアも優れており、栄養的にはさらに望ましいものである。したがって栄養源や生理機能に優れた大豆蛋白素材又はペプチド含有組成物として新たに利用が可能である。この大豆ホエー蛋白やその分解物は、また、ロイシン、イソロイシンン、バリン等の分岐鎖アミノ酸も分離大豆蛋白由来のペプチドよりも豊富に含まれるため、アスリート向けサプリメントとしての利点もある。
【実施例】
【００２４】
以下に、実施例および比較例を例示して本発明効果をより明瞭にするが、本発明はこれらの例示に制約されるものではない。
【００２５】
〔比較例１〕
脱脂大豆１部に１０倍の水を加え、よく攪拌し、これに塩酸を加えてｐＨを４．５に調整した。等電点沈澱によって凝集する７Ｓグロブリンや１１Ｓグロブリンなどの不溶物を遠心分離によって除去し、大豆ホエーを得た。この大豆ホエーに消石灰を加え、ｐＨを５．３に調整し、９０〜９５℃で１５分ほど放置して凝集する画分を遠心分離にて採取した。これをカルシウム加熱凝集タイプの大豆ホエー蛋白とした。この画分を凍結乾燥し、その窒素含有量を求めた。結果を表１に示す。
【実施例１】
【００２６】
比較例１のカルシウム加熱凝集タイプの大豆ホエー蛋白の固形分重量１部に対し、水を１０倍量加え、塩酸を添加して、ｐＨを２．０に調整し、ホモミキサー５０００ｒｐｍ、１０分攪拌して遠心分離（１０００Ｇ×１０分）を行い、その沈澱物を回収した。回収した沈澱物を凍結乾燥し、固形分の重量回収率と窒素含有量を求めた。結果を表１に示す。また回収物のアミノ酸組成を調べ、分離大豆タンパク質のそれと比較した。結果を表２に示す。
【００２７】
〔比較例２〕
比較例１のカルシウム加熱凝集タイプの大豆ホエー蛋白の固形分重量１部に対し、水を１０倍量加え、ホモミキサー５０００ｒｐｍ、１０分攪拌して遠心分離（１０００Ｇ×１０分）を行い、その沈澱物を回収した。このとき加水後のｐＨは５．５であった。回収した沈澱物を凍結乾燥し、固形分の重量回収率と窒素含有量を求めた。結果を表１に示す。
【００２８】
〔比較例３〕
比較例１のカルシウム加熱凝集タイプの大豆ホエー蛋白の固形分重量１部に対し、水を１０倍加え、水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨを１０．０に調整し、ホモミキサー５０００ｒｐｍ、１０分攪拌して遠心分離（１０００Ｇ×１０分）を行い、その沈澱物を回収した。回収した沈澱物を凍結乾燥し、固形分の重量回収率と窒素含有量を求めた。結果を表１に示す。
【００２９】
【００３０】
【００３１】
この結果、実施例１にみられるように、強酸性下で可溶化する画分を除くことによって蛋白質純度が飛躍的に向上し、灰分も可及的に低減できることがわかる。次に、この蛋白質純度が向上した実施例１の蛋白質の可溶化を実施した。
【実施例２】
【００３２】
実施例１で調製したものの５％混合液を作製し、水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨを７．８に調整し、１２０℃、１５分の加熱を行い、遠心分離（１０００Ｇ×１０分）を行い、上澄みに残る蛋白質、つまり全体の窒素量に対する上澄みの窒素含有率を求めた。その結果を表３に示す。
【００３３】
〔比較例４〕
実施例１で調製したものの５％混合液を作製し、水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨを６．５に調整し、９５℃、１５分の加熱を行い、遠心分離（１０００Ｇ×１０分）を行い、上澄みに残る蛋白質、つまり全体の窒素量に対する上澄みの窒素含有率を求めた。その結果を表３に示す。
【００３４】
【００３５】
この結果から、不溶性である大豆ホエー蛋白の再可溶化は、中和後、強加熱することによって可能であった。
【実施例３】
【００３６】
実施例１で調製した大豆ホエー蛋白の５％混合液を調製し、水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨを７．８に調整し、１２０℃、１５分の加熱を行った。その後、これを水酸化ナトリウムでｐＨ８に調製し、大豆ホエー蛋白質当たり１％の「プロテアーゼＳ」（大和化成製、枯草菌由来エンド型プロテアーゼ）を加え、６０℃、４時間反応し、リン酸でｐＨ４．５に調製して、１００℃で２０分加熱して反応を止め、遠心分離（１０００Ｇ×５分）を行い、上澄みを回収し、大豆ホエー蛋白分解物を得た。この分解物の分子量をゲルろ過によって測定すると、ペプチドの７０％以上が分子量１０００以下であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆ホエーを加熱して生ずる加熱凝集物をｐＨ４以下の酸性下にさらし、可溶性物を除去することを特徴とする大豆ホエー蛋白の製造法。
【請求項２】
大豆ホエーを加熱する温度が８０〜１２０℃である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
アルカリ土類金属イオンの共存下で加熱する請求項１記載の製造法。
【請求項４】
大豆ホエーを加熱する際のｐＨが２〜９である請求項１記載の製造法。
【請求項５】
得られた大豆ホエー蛋白中に、蛋白質がケルダール法による窒素量として固形分１ｇあたり９６ｍｇ以上（窒素換算係数を６．２５とした場合、蛋白質として６０重量％以上）含まれる請求項１記載の製造法。
【請求項６】
請求項１記載の方法で得られる大豆ホエー蛋白を中和後、加熱（１００〜１５０℃）することを特徴とする可溶化大豆ホエー蛋白の製造法。
【請求項７】
請求項１記載の方法で得られる大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させることを特徴とする大豆ホエー蛋白分解物の製造法。
【請求項１】
大豆ホエーを加熱して生ずる加熱凝集物をｐＨ４以下の酸性下にさらし、可溶性物を除去することを特徴とする大豆ホエー蛋白の製造法。
【請求項２】
大豆ホエーを加熱する温度が８０〜１２０℃である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
アルカリ土類金属イオンの共存下で加熱する請求項１記載の製造法。
【請求項４】
大豆ホエーを加熱する際のｐＨが２〜９である請求項１記載の製造法。
【請求項５】
得られた大豆ホエー蛋白中に、蛋白質がケルダール法による窒素量として固形分１ｇあたり９６ｍｇ以上（窒素換算係数を６．２５とした場合、蛋白質として６０重量％以上）含まれる請求項１記載の製造法。
【請求項６】
請求項１記載の方法で得られる大豆ホエー蛋白を中和後、加熱（１００〜１５０℃）することを特徴とする可溶化大豆ホエー蛋白の製造法。
【請求項７】
請求項１記載の方法で得られる大豆ホエー蛋白にプロテアーゼを作用させることを特徴とする大豆ホエー蛋白分解物の製造法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０４０３６
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【発行日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０６３２８（Ｐ２００５−５０６３２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６５３１
【国際出願日】平成１６年５月１４日（２００４．５．１４）
【出願人】（０００２３６７６８）不二製油株式会社 (386)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【発行日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６５３１
【国際出願日】平成１６年５月１４日（２００４．５．１４）
【出願人】（０００２３６７６８）不二製油株式会社 (386)
【Ｆターム（参考）】
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