完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法、及び融合ミエローマ細胞
【課題】安全な完全ヒト抗体を迅速且つ容易に得ることを可能にする、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法を提供すること。
【解決手段】ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る。次いで、この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを所定回数クローニングする。更に、クローニングされた完全抗体産生ハイブリドーマからＥＢＶゲノム陰性細胞株を選抜することにより、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを作製する。
【解決手段】ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る。次いで、この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを所定回数クローニングする。更に、クローニングされた完全抗体産生ハイブリドーマからＥＢＶゲノム陰性細胞株を選抜することにより、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを作製する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法、及び融合ミエローマ細胞に関し、より詳しくは、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ゲノムが除去されたハイブリドーマの作製方法、及びこの作製に用いられる融合ミエローマ細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
マウス等の実験動物種の抗体の一部をヒト抗体に置き換えた、キメラ抗体やヒト型化抗体が作製容易な抗体として、実用化されている。しかし、キメラ抗体やヒト型化抗体は、その一部にヒト以外の動物種の抗体が混在するため、ヒト免疫系において抗原として認識される。よって、キメラ抗体やヒト型化抗体を使用した医薬品は、重複投与できない等の欠点を有する。
【０００３】
従って、医薬品に使用する抗体としては、重複投与可能な点、更に、抗原に対する親和性が高いという点から、ヒト以外の動物種の抗体が混在しない抗体である、完全ヒト抗体が好ましい。ここで、従来から用いられている、完全ヒト抗体の作製方法としては、以下のようなものを挙げることができる。
【０００４】
第１番目は、大規模な抗体遺伝子ライブラリを用いたファージディスプレイ法である。ファージディスプレイ法は、抗体遺伝子ライブラリが形質転換されているファージを用い、繊維状のファージのコートタンパク質に抗体を融合させることにより、ファージ表面上に抗体を提示するシステムを応用したものである（非特許文献１〜４参照）。
【０００５】
ファージディスプレイ法によれば、予め用意されたヒト抗体遺伝子ライブラリを用いることで、特定の抗原に対する抗体遺伝子を迅速に回収できる。従って、この抗体遺伝子をヒト抗体発現ベクターに組み込むことにより、完全ヒト抗体を、迅速に得ることができる。
【０００６】
しかし、完全ヒト抗体の作製が成功する可能性は、ファージ抗体ライブラリの質に大きく依存しているところ、十分な質のファージ抗体ライブラリを作製するのは、技術的に容易でない。このため、通常、ファージディスプレイ法によって完全ヒト抗体を得るには、困難が伴う。
【０００７】
第２番目は、ヒト抗体遺伝子を組み込んだキメラ動物によるヒト抗体作製法である。この代表例として、完全ヒト抗体の産生能を有するトランスクロモマウスである「ＫＭマウス」（キリンビール社製）を用いた作製方法を挙げることができる（非特許文献５参照）。
【０００８】
この方法の手順は、抗原を「ＫＭマウス」に投与して、目的の完全ヒト抗体を産生するＢ細胞をこの「ＫＭマウス」から採取し、使用する点が異なる他は、マウスハイブリドーマ法によりマウス抗体を取得する公知の手順と同様である。
【０００９】
「ＫＭマウス」を抗原で免疫した後に脾臓等の免疫組織から得られるＢ細胞は、目的の完全ヒト抗体を産生する。このため、ヒト末梢血を扱う必要がないため、容易に、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを作製できる。従って、この方法によれば、完全ヒト抗体を、容易に得ることができる。
【００１０】
しかし、この方法では、目的の抗原が未知だった場合には、免疫の対象となる抗原決定基を有するポリペプチドを準備するための以下の作業が必要となる。
【００１１】
即ち、まず、抗原をコードするＤＮＡの塩基配列を解析する。次いで、この塩基配列に基づき抗原決定基を決定し、更に、大腸菌等で抗原決定基を有するポリペプチドを合成する。通常、このような作業の遂行には数ヶ月間かかるため、抗体作製には長時間を要することになる。従って、抗体作製に厳しい時間的制約がある場合（例えば、２００３年当時の重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の場合）に、この方法では対応しきれない。
【００１２】
そこで、以上のような欠点を補うことができる方法として注目を集めているのが、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）により形質転換したヒトＢ細胞を用いた完全ヒト抗体の作製法（以後、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法と呼ぶ）である。この方法の手順は以下の通りである。
【００１３】
即ち、まず、ヒトミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る。次いで、この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマをクローニングすることにより、クローン化された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る。更に、クローン化された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマにより完全ヒト抗体を産生させ、完全ヒト抗体を得る。
【００１４】
ある抗原に対する抗体を産生するヒトＢ細胞は、マウス等の実験動物ではなくヒトの末梢血等から採取するものであるため、少量しか得ることができない。しかし、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法によれば、ある抗原に対する抗体を産生するヒトＢ細胞として、ＥＢＶにより形質転換されたものを用いる。ＥＢＶにより形質転換されたヒトＢ細胞は、不死化し、増殖能力が増強される。このため、ヒト末梢血を扱うにもかかわらず、容易に、ハイブリドーマを作製できる。
【００１５】
また、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法によれば、ある抗原に対する抗体を産生するヒトＢ細胞を用いて、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを作製する。このため、たとえ目的の抗原が未知の場合にも、抗原決定基を有するポリペプチドの合成等を行う必要がないので、迅速に、目的の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを作製できる（例えば、非特許文献６参照）。従って、完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に作製できる。
【非特許文献１】Ｊ．Ｄ． Ｍａｒｋｓら、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９１年発行、２２２、ｐ．５８１〜５９７
【非特許文献２】Ｃ．Ｆ． Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩら、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．」、１９９２年発行、８９、ｐ．４４５７〜４４６１
【非特許文献３】Ａ．Ｄ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、「ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ」、１９９４年発行、１３、ｐ．３２４５〜３２６０
【非特許文献４】伊庭善孝、「実験医学別冊クローズアップ実験法総集編」、２００２年発行、ｐ．９９〜１０４
【非特許文献５】Ｋ． Ｔｏｍｉｚｕｋａら、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．」、２０００年発行、９７、ｐ．７２２〜７２７
【非特許文献６】Ｅ． Ｔｒａｇｇｉａｉら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、２００４年発行、１０、ｐ．８７１〜８７５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかし、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法によれば、ヒトＢ細胞として、ＥＢＶにより形質転換されたものを使用するから、作製された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマにＥＢＶゲノムが残存する。ＥＢＶは、欧米では白血病、アジアでは上皮性癌（例えば、上咽頭癌）の原因の一つと考えられている。このため、抗体を製剤化する際には、安全上の観点から、ＥＢＶゲノムを除去する必要がある。しかしながら、このような手段はいまだ確立されていない。
【００１７】
従って、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法により作製される完全ヒト抗体は、迅速且つ容易に得ることができるものの、安全上の大きな問題を残していた。
【００１８】
そこで、本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたもので、その目的は、安全な完全ヒト抗体を迅速且つ容易に得ることを可能にする、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法、及びその手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは前述の課題に鑑み鋭意研究した。その結果、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞を用いると、ハイブリドーマからＥＢＶゲノムを除去できることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【００２０】
（１） ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る融合工程と、この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを所定回数クローニングするクローニング工程と、前記クローニングされた完全抗体産生ハイブリドーマからＥＢＶゲノム陰性細胞株を選抜する選抜工程と、を含むＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法。
【００２１】
（１）の発明によれば、まず、融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを所定回数クローニングする。これにより、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマからＥＢＶゲノムが除去される。
次いで、このクローニングされた完全抗体産生ハイブリドーマから、ＥＢＶゲノム陰性細胞株を選抜することにより、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを選択的に作製できる。
【００２２】
一般に、マウスミエローマ細胞を用いて細胞融合すると、何らかの機構により、融合後の細胞から、ＥＢＶゲノムを除去できることが知られている。（１）の発明で用いる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマは、マウスミエローマ細胞を一つの由来としている。このため、この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを所定回数クローニングする過程で、ＥＢＶゲノムが除去されるものと推測される。
【００２３】
また、（１）の発明によれば、ＥＢＶハイブリドーマ法によって、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを作製する。このため、前述の通り、目的の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを、迅速且つ容易に作製できる。
【００２４】
このように、（１）の発明によれば、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを、迅速且つ容易に作製できる。従って、安全な完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に得ることができる。
【００２５】
更に、この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマは、完全ヒト抗体の産生能力が長期間に渡って持続する。このため、（１）の発明によれば、必要に応じて、完全ヒト抗体の大量生産にも対応できるという効果も得られる。
【００２６】
一般に、マウス由来細胞とヒト由来細胞とを細胞融合すると、融合後の細胞から、ヒト染色体が選択的に脱離する傾向がある。しかし、本発明で用いる融合ミエローマ細胞は、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合されているため、ヒト染色体が脱離しにくくなる。そして、この融合ミエローマ細胞に、ある抗原に対する抗体を産生するヒトＢ細胞を更に細胞融合するため、ヒト染色体が更に脱離しにくくなる。このため、完全ヒト抗体産生に関わるヒト遺伝子の脱離も防止できるため、抗体産生が持続すると推測される。
【００２７】
「所定回数」とは、以上のような効果を得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを作製するために必要なクローニングの回数を意味し、用いる抗原、細胞株等の条件により当業者が適宜選択することができる。
「ＥＢＶゲノムが除去された」とは、安全な完全ヒト抗体を得ることができる程度にまで、ＥＢＶゲノムが減少化されたことを意味する。
【００２８】
（２） 前記融合ミエローマ細胞は、受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である（１）記載の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法。
【００２９】
受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である融合ミエローマ細胞は、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞の一例である。
よって、（２）の発明によれば、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを、迅速且つ容易に作製できる。従って、安全な完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に得ることができる。
【００３０】
更に、（２）の発明により得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマによれば、完全ヒト抗体の産生能力が長期間に渡って持続する。このため、（２）の発明によれば、必要に応じて、完全ヒト抗体の大量生産にも対応できるという効果も得られる。
【００３１】
（３） （１）又は（２）記載の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【００３２】
（３）記載のモノクローナル抗体は、（１）又は（２）記載の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマにより産生させて得られる。前述した通り、迅速且つ容易に作製できる（１）又は（２）記載の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマは、ＥＢＶゲノムが除去されている。従って、（３）の発明によれば、安全な完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に得ることができる。
【００３３】
（４） （３）記載のモノクローナル抗体を有効成分とする医薬組成物。
【００３４】
（４）記載の医薬組成物は、（３）記載のモノクローナル抗体を有効成分とする。前述した通り、（３）記載のモノクローナル抗体は、迅速且つ容易に得ることができる、安全な完全ヒト抗体である。従って、（４）の発明によれば、安全で有効な医薬組成物を、迅速且つ容易に製造できる。
【００３５】
なお、「有効成分とする」とは、医薬組成物としての効果を得られる程度に、（３）記載のモノクローナル抗体が含まれ、且つ、医薬組成物としての効果を失わない限りにおいて、（３）記載のモノクローナル抗体以外の成分が含まれていてもよいことを意味する。医薬組成物の具体的組成等については、当業者が適宜選択することができる。
【００３６】
（５） ヒトミエローマ細胞とマウスミエローマ細胞とを細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞であって、ＥＢＶゲノムが除去されたハイブリドーマの作製に用いられることを特徴とする融合ミエローマ細胞。
【００３７】
（５）記載の融合ミエローマ細胞によれば、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と細胞融合する場合でも、前述の通り、ＥＢＶゲノムが除去されたハイブリドーマを、迅速且つ容易に作製できる。このため、安全な完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に得ることもできる。
【００３８】
（６） 受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である（５）記載の融合ミエローマ細胞。
【００３９】
受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である融合ミエローマ細胞は、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞の一例である。
従って、（６）の発明によれば、ＥＢＶゲノムが除去されたハイブリドーマを、迅速且つ容易に作製できる。このため、安全な完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に得ることもできる。
【００４０】
（７） ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶ陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合してハイブリドーマを得る融合工程と、このハイブリドーマを所定の回数クローニングすることでＥＢＶゲノムを減少させる減少化工程と、を含むＥＢＶゲノムの減少化方法。
【００４１】
（７）の発明によれば、前述したように、クローニングすることにより、ハイブリドーマからＥＢＶゲノムを、迅速且つ容易に減少化できる。ここで、「所定の回数」とは、ハイブリドーマの用途等に応じた所望のレベルにまで、ＥＢＶゲノムを減少化させるために必要なクローニングの回数を意味する。
また、ＥＢＶゲノムが除去までされたハイブリドーマを用いれば、安全な完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に得ることもできる。
【発明の効果】
【００４２】
本発明によれば、ＥＢＶ―ハイブリドーマ法において、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞を用いた。従って、安全な完全ヒト抗体を迅速且つ容易に得ることを可能にする、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法、及びその手段を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下、本発明の一実施形態を図面を参照しながら説明する。図１は、本発明の、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法の手順を示すフローチャートである。
【００４４】
本発明の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法は、融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る融合工程（Ｓ１００）と、この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを所定回数クローニングするクローニング工程（Ｓ２００）と、前記クローニングされた完全抗体産生ハイブリドーマからＥＢＶゲノム陰性細胞株を選抜する選抜工程（Ｓ３００）と、を含む。
【００４５】
次に、図２及び図３を参照して、Ｓ１００で用いられる、融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、の調整手順について説明する。
【００４６】
＜融合工程＞
［ヘテロハイブリドーマの作製］
まず、ヒトミエローマ細胞と、マウスミエローマ細胞と、を細胞融合し、ヘテロハイブリドーマを作製する（Ｓ１０）。
【００４７】
Ｓ１０においては、ヒトミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞としては、自己抗体産生能のない細胞を用いる。更に、ヒトミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞のいずれか一方として、例えば、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（以下、「ＨＧＰＲＴ」と表記する。）を欠損した６―チオグアニン耐性株を用いることができる。
【００４８】
６―チオグアニンを含有する培地において、生存できることを利用して、後述するＳ１４において、目的のヘテロハイブリドーマを選別できるからである。また、ＨＧＰＲＴは、サルベージ回路経由のヌクレオチド合成に必須な酵素であるため、ＨＧＰＲＴ欠損株はヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で生存できないことを利用して、後述するＳ１５０において、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを選出できるからである。
【００４９】
このようなヒトミエローマ細胞としては、特に限定されないが、通常、例えば、Ｕ−２６６株を挙げることができる。また、このようなマウスミエローマ細胞としては、特に限定されないが、通常、例えばＰ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３株を挙げることができる。
【００５０】
これらの細胞株は各々、適当な培地、例えばイスコフ改変ダルベッコ培地（以下、「ＩＭＤＭ培地」と表記する。）に、グルタミン、２−メルカプトエタノール、及びウシ胎児血清を加えた培地（ＩＭＤＭ改良培地）に６―チオグアニンを加えた培地、ＩＭＤＭ改良培地を用いて、継代培養する。そして、後述するＳ１２を行う当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【００５１】
このヒトミエローマ細胞と、マウスミエローマ細胞と、を細胞融合する（Ｓ１２）。細胞融合の方法としては、特に限定されないが、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合法等の常法を挙げることができ、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単な点からは、ＰＥＧ法が好ましい。
【００５２】
例えば、ＰＥＧ法によれば以下の手順となる（Ｓ１２’［図示はしていない］）。
即ち、ヒトミエローマ細胞と、マウスミエローマ細胞と、を、無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でよく洗浄した後、ヒトミエローマ細胞とマウスミエローマ細胞との細胞数の比が１：４〜１：５程度になるように混合し、遠心分離する。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下する。
【００５３】
次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離する。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、ＩＭＤＭ培地に６―チオグアニンを加えた培地中に懸濁する。この懸濁物を培養用プレート（以下「プレート」という）の各ウェルに分注し、７％炭酸ガスの存在下、適宜６―チオグアニンを含有するＩＭＤＭ培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養する。
【００５４】
次に、Ｓ１０を経て得られるヘテロハイブリドーマをクローニングする（Ｓ１４）。
クローニングの方法としては、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個ずつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する方法等を挙げることができる。このうち、操作が簡便な点から、限界希釈法がよく用いられる。
【００５５】
そして、抗体を産生していないことを確認できたものを選出する（Ｓ１６）。これにより、Ｓ１００において用いることができるヘテロハイブリドーマを、選択的に得ることができる。
【００５６】
選出の方法としては、特に限定されないが、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝縮反応法等の公知の方法を挙げることができる。このうち、検出感度、迅速性、正確性等の点からは、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。このＥＬＩＳＡ法は、一般的な競合法、サンドイッチ法等の手法に従って行うことができ、液相系でも、固相系でも行うことができる。
【００５７】
［融合ミエローマ細胞の作製］
【００５８】
このヘテロハイブリドーマと、ヒトＢ細胞と、を細胞融合し、融合ミエローマ細胞を作製する（Ｓ２０）。
【００５９】
ここで用いるヒトＢ細胞は、形質細胞又はその前駆細胞（リンパ球）であり、個体のいずれの部位から得てもよく、脾細胞、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、又はこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができる。このうち、採取が容易な点から、末梢血が最も一般的に用いられる。ここで用いるヒトＢ細胞は、自己抗体産生能のない細胞である。
【００６０】
ヘテロハイブリドーマは、例えば、６―チオグアニンを含有するＩＭＤＭ改良培地等を用いて継代培養し、後述するＳ２２を行う当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【００６１】
ヘテロハイブリドーマがＨＧＰＲＴを欠損した６―チオグアニン耐性株であった場合、６―チオグアニンを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いることで、目的の融合ミエローマ細胞を選別できる。即ち、融合しなかったヒトＢ細胞、及びヒトＢ細胞どうしの融合細胞は、培地に６―チオグアニンが含まれているため、生存できないからである。
【００６２】
このヘテロハイブリドーマと、ヒトＢ細胞と、を細胞融合する（Ｓ２２）。細胞融合は、例えばＰＥＧ法によれば、以下の手順となる（Ｓ２２’［図示はしていない］）。
このヘテロハイブリドーマと、ヒトＢ細胞と、を、無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ）又はＰＢＳでよく洗浄し、ヘテロハイブリドーマとヒトＢ細胞との細胞数の比が１：４〜１：５程度になるように混合し、遠心分離する。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下する。
【００６３】
次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離する。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、適量のヒトインターロイキン−６（ヒトＩＬ−６）を更に含むウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地中に懸濁する。この懸濁物をプレートの各ウェルに分注し、７％炭酸ガスの存在下、適宜ウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養する。
【００６４】
Ｓ２２を経て得られる融合ミエローマ細胞をクローニングする（Ｓ２４）。Ｓ２４は、Ｓ１４と同様の手順で行うことができる。
【００６５】
そして、抗体を産生していないことを確認できたものを選出する（Ｓ２６）。これにより、Ｓ１００において用いることができる融合ミエローマ細胞を、選択的に得ることができる。Ｓ２６は、Ｓ１６と同様の手順で行うことができる。
【００６６】
このようにして、Ｓ１００において用いられる融合ミエローマ細胞を得ることができる。この融合ミエローマ細胞の一例として、受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である融合ミエローマ細胞が寄託されている。
【００６７】
［完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞の調整］
完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞を調整する（Ｓ３０）。
【００６８】
完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞は、ワクチン接種を受けた又は疾患から回復したボランティア（ヒト）の形質細胞又はその前駆細胞（リンパ球）である。完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞は、ボランティアのいずれの部位から得てもよく、一般には脾細胞、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、又はこれらを適宜組み合わせたもの等から得る（Ｓ３２）ことができる。なお、採取が容易な点から、末梢血から完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞を得ることが、最も一般的である。
【００６９】
このヒトＢ細胞にＥＢＶを感染させることで、形質転換を行う（Ｓ３４）。
形質転換の方法としては、特に限定されないが、例えば以下の手順を挙げることができる。即ち、放射線照射したフィーダー細胞上で、ヒトＢ細胞の培養を行う。このヒトＢ細胞に、ＥＢＶ陽性マーモセット細胞株Ｂ９５−８の培養上清中のウイルスを添加し、更にヒトＢ細胞を培養することで、ＥＢＶに感染させる。
【００７０】
次いで、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞をクローニングする（Ｓ３６）。Ｓ３６は、図２のＳ１４と同様の手順で行うことができるが、形質転換されたＢ細胞の増殖を促進するため、ヒトＩＬ−６等の増殖因子を適量添加しつつ、行うことが好ましい。
【００７１】
更に、Ｓ３６を経て得られるクローニングされたＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞から、完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞を選出する（Ｓ３８）。これにより、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞を、選択的に得ることができる。Ｓ３８は、図２のＳ１６と同様の手順で行うことができる。
【００７２】
Ｓ３８は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下のような手順により行うことができる（Ｓ３８’［図示はしていない］）。
即ち、まず、抗原をＥＬＩＳＡ法用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により覆う。次いで、この表面を洗浄した後、一次抗体として、段階希釈した試料に接触させ、上記抗原に試料中の完全ヒト抗体を結合させる。更に、二次抗体として、酵素標識されたヒト抗体に対する抗体を加えて、ヒト抗体に結合させる。洗浄した後、この酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
【００７３】
＜完全ヒト抗体産生ハイブリドーマへの細胞融合＞
次に、Ｓ２０を経て得られる融合ミエローマ細胞と、Ｓ３０を経て得られる完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る（Ｓ１００）。
【００７４】
融合ミエローマ細胞は、例えば、６―チオグアニン及びウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いて継代培養する。完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞は、例えば、ＩＬ−６、２−メルカプトエタノール、ウシインスリン、ヒトトランスフェリンを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いて継代培養する。いずれの細胞も、後述するＳ１１０を行う当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【００７５】
上記融合ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴを欠損した６―チオグアニン耐性及びウアバイン耐性株であった場合、６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地を用いることで、目的のハイブリドーマを選別できる。即ち、融合しなかった完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞、及び完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞どうしの融合細胞は、培地に６―チオグアニン及びウアバインが含有されているため、生存できない。一方、融合しなかった融合ミエローマ細胞、及び融合ミエローマ細胞どうしの融合細胞は、培地にＨＡＴが含まれているため、生存できないからである。
【００７６】
この融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合する（Ｓ１１０）。Ｓ１１０は、図２のＳ１２と同様の手順で行うことができる。
【００７７】
細胞融合は、例えばＰＥＧ法によれば、以下の手順（Ｓ１１０’［図示はしていない］）となる。
即ち、融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を、無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ）又はＰＢＳでよく洗浄し、融合ミエローマ細胞と完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞との細胞数の比が１：４〜１：５程度になるように混合し、遠心分離する。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下する。
【００７８】
次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離する。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、適量のヒトＩＬ−６を更に含み、６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地中に懸濁する。この懸濁物をプレートの各ウェルに分注し、５％炭酸ガスの存在下、適宜６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養する。
【００７９】
次に、Ｓ１１０を経て得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマをクローニングする（Ｓ１３０）。Ｓ１３０は、図２のＳ１４と同様の手順で行うことができる。
【００８０】
次に、Ｓ１３０を経て得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの中から、抗体産生能及び細胞増殖能が高いものを選出する（Ｓ１５０）。
選出の方法としては、特に限定されないが、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝縮反応法等の公知の方法により抗体産生能が高いものを選出できる。
【００８１】
＜クローニング工程＞
次に、Ｓ１５０を経て選出された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに、後述するＳ２１０及びＳ２３０を所定回数施す（Ｓ２００）。
【００８２】
Ｓ１５０を経て選出された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う（Ｓ２１０［図示はしていない］）。Ｓ２１０は、図２のＳ１４と同様の手順で行うことができる。
【００８３】
Ｓ２１０を経て得られる株（サブクローン）の中から、Ｓ１５０と同様の手順で、抗体産生能及び細胞増殖能が高いことを指標に、次にクローニングを施す株を選出する（Ｓ２３０［図示はしていない］）。
【００８４】
このようなＳ２１０及びＳ２３０を所定回数行うことにより、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
【００８５】
＜選抜工程＞
得られた完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの中から、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを選抜する（Ｓ３００）。選抜の方法としては、特に限定されないが、例えば、定性的ＰＣＲ法、定量的ＰＣＲ法を挙げることができ、これらを併せて行うこともできる。
【００８６】
（定性的ＰＣＲ法）
定性的ＰＣＲ法によれば、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ内におけるＥＢＶゲノムの存否を確認する（Ｓ３１０［図示はしていない］）ことができる。
【００８７】
ＰＣＲにおいて鋳型となるＤＮＡは、培養された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマから、常法に従って、「ＱＩＡ ａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（キアゲン社製）等を用いて精製できる（Ｓ３１１［図示はしていない］）。
【００８８】
増幅させて検出する対象としては、特に限定されないが、検出感度を高めるという点で、例えば、ＢａｍＨＩ Ｗ領域等の繰り返し配列を有する領域が好ましい。例えば、ＢａｍＨＩ Ｗ領域は、ＥＢＶゲノム中、約１２回の繰り返し配列となっており、他の領域に比べて、より多量に増幅することができるからである。
【００８９】
定性的ＰＣＲ法においてＢａｍＨＩ Ｗ領域を増幅させるためのプライマーとしては、特に限定されないが、例えば、配列表の配列番号１及び２記載のプライマーを挙げることができる。
【００９０】
（定量的ＰＣＲ法）
定量的ＰＣＲ法によれば、ハイブリドーマ内におけるＥＢＶゲノムの存否及びコピー数を確認する（Ｓ３２０［図示はしていない］）ことができる。Ｓ３１１と同様の手順で、ＰＣＲにおいて鋳型となるＤＮＡを精製できる（Ｓ３２１［図示はしてない］）。増幅させて検出する対象としては、特に限定されないが、例えば、ＢＡＬＦ５（ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子領域）等の構造遺伝子領域が挙げられる。
【００９１】
定量的ＰＣＲ法においてＢＡＬＦ５領域を増幅させるためのプライマーとしては、特に限定されないが、例えば、配列表の配列番号３及び４記載のプライマーを挙げることができ、プローブとしては配列表の配列番号５記載のプローブを挙げることができる。
【００９２】
また、単位細胞当たりのコピー数を定量化するための内部標準としては、特に限定されないが、ヒトグリセルアルデヒド―３―リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）やマウスβ―アクチン等の構造遺伝子領域を挙げることができる。
【００９３】
なお、定量的ＰＣＲを簡便に行うため、「ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７０００」（アプライドバイオシステムズ社製）等によるＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を用いることもできる。
【００９４】
このようにして作製される、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することができ、また液体窒素中で長期間保存できる。
【００９５】
＜モノクローナル抗体＞
Ｓ３００を経て選抜された、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマにモノクローナル抗体を産生させる。
【００９６】
モノクローナル抗体の産生は、特に限定されないが、例えば、以下の手順からなる。
まず、Ｓ３００を経て選抜された、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを、ＨＡＴを除いたＨＹ培地又はＩＭＤＭ改良培地に接種し、培養する。次いで、培養後の培養上清を回収する。大量培養をするときは、大型培養瓶を用いた回転培養、スピナー培養、あるいはホローファイバーシステムを用いた培養を行うことができる。比較的高純度の目的抗体を培養上清として得ることができる点で、大量培養は有利である。
【００９７】
抗体産生ハイブリドーマの培養上清及びマウス等の腹水は、そのまま粗製抗体液として用いることができる。また、これらは常法に従って、硫酸アンミモニウム分画、塩析、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡカラムクロマトグラフィー等のアフィニテイクロマトグラフィー等により精製して、精製抗体とすることもできる。
【００９８】
＜医薬組成物＞
このようにして得られたモノクローナル抗体を有効量含有させ、モノクローナル抗体を有効成分とする医薬組成物を製造することができる。この医薬組成物には、モノクローナル抗体の他に、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアが含まれていてもよく、他の薬剤（他の抗体、抗生物質等）が含まれていてもよい。キャリアとしては、特に限定されないが、例えば、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水等の緩衝水溶液を挙げることができる。
【００９９】
本発明の医薬組成物は、凍結乾燥（フリーズドライ）させたモノクローナル抗体に前記の緩衝水溶液等を必要時に添加して再構成したものを含んでいてもよい。
【０１００】
本発明の医薬組成物は、種々の形態で投与することができ、投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、又は、注射剤、点滴剤、坐薬等による非経口投与を挙げることができる。
【０１０１】
なお、本発明は、上述のモノクローナル抗体又は医薬組成物を用いた疾患の予防方法又は治療方法をも包含するものである。
【実施例】
【０１０２】
次に、本発明を実施例及び比較例を挙げて説明する。具体的には、破傷風毒素に対する抗体の作製を行った。
【０１０３】
破傷風毒素のワクチン接種をしたボランティア（ヒト）から末梢血を採取し、破傷風毒素に対する抗体を産生するヒトＢ細胞を得た。このヒトＢ細胞に、Ｂ９５−８を添加することによりＥＢＶを感染させ、形質転換した。
【０１０４】
次いで、このＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞を、１Ｕ／ｍＬのＩＬ−６を添加しつつ、常法に従って限界希釈法により、クローニングした。そして、クローニングされたＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞から、常法に従ってＥＬＩＳＡ法により、破傷風毒素に対する完全ヒト抗体の産生が確認されたヒトＢ細胞を選出した。このようにして、破傷風毒素に対する完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞（５−１１Ｆ Ｄ１１）を得た。
【０１０５】
受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０として寄託されている融合ミエローマ細胞と、５−１１Ｆ Ｄ１１と、を各々、ウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地、ＢＳＡ、Ｌ−グルタミン、及び２−メルカプトエタノールを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いて、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保した。
【０１０６】
この融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を、ＤＭＥＭでよく洗浄し、ＦＥＲＭ Ａ−２０５９０と５−１１Ｆ Ｄ１１との細胞数の比が１：５程度になるように混合し、遠心分離した。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下した。次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離した。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、ウアバインを含有するＨＡＴ培地中に懸濁した。この懸濁物をプレートの各ウェルに分注し、７％炭酸ガスの存在下、適宜６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養した。
【０１０７】
このようにして得られた破傷風毒素に対する完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの中から、ＥＬＩＳＡ法により抗体産生能が高いもの（１Ｃ１１、２Ｂ５、３Ｃ７）を選出し、吸光度が比較的高いもの（１Ｃ１１）を細胞増殖能が高いものとして選出した。
【０１０８】
［クローニング工程］
（第１回目クローニング）
１Ｃ１１を、別のプレートに移し、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法によりクローニングを行った。クローニングされた株の中から、上述と同様の手順で、抗体産生能が高いもの（１Ｄ３、１Ｆ１０、２Ｅ３、２Ｅ７）を選出し、更に、細胞増殖能が高いもの（２Ｅ７）を選出した。
【０１０９】
（第２回目クローニング）
２Ｅ７を用いて第１回目クローニングと同じ手順でクローニングを行い、クローニングされた株の中から、上述と同様の手順で、抗体産生能が高いもの（１Ｆ５、２Ｄ４、１Ｂ４、１Ｇ７）を選出し、更に、細胞増殖能が高いもの（１Ｂ４、１Ｇ７）を選出し、次のクローニングを施すこととした。
【０１１０】
（第３回目クローニング）
１Ｂ４、１Ｇ７を用いて第１回目クローニングと同じ手順でクローニングを行い、破傷風毒素に対する特異的抗体を持続的に産生し、且つ、安定に増殖する６株のハイブリドーマ（１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２）を得た。
【０１１１】
なお、以上説明した各細胞株の関係は、図４に示す通りである。
【０１１２】
［選抜工程］
１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２の中から、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを選抜するため、以下の作業を行った。
【０１１３】
（定性的ＰＣＲ法）
これらの６株各々を、１０ｍｌのＨＹ培地に接種し、３７℃で３日間培養して得られたハイブリドーマ（細胞数５×１０６）から「ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用いて精製したＤＮＡを鋳型とし、ＥＢＶゲノム内のＢａｍＨＩ Ｗ領域を増幅可能なプライマー（配列表の配列番号１及び２記載のプライマー）を用いて、ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲにおける酵素は「Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（登録商標）」（ロシュ社製）を用い、装置は「Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００」（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）を用いた。この結果、これら６株はいずれもＥＢＶゲノムが除去されている（少なくとも、検出限界以下）ことが分かった（図５参照）。
【０１１４】
（定量的ＰＣＲ法）
前記の定性的ＰＣＲ法における手順と同じ手順により精製されたＤＮＡを鋳型とし、ＥＢＶゲノム内のＢＡＬＦ５領域を増幅可能なプライマー（配列表の配列番号３及び４記載のプライマー）を用いて、「ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７０００」（アプライドバイオシステムズ社製）等によるＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。また、プローブとして「ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標） Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ」（キアゲン社製）を使用し、内部標準としてヒトグリセルアルデヒド―３―リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びマウスβ―アクチンを用いた。その結果、これら６株はいずれもＥＢＶゲノムの単位細胞あたりのコピー数が０又は０に限りなく近く、ＥＢＶゲノムが除去されていることが分かった（図６参照）。
【０１１５】
［完全ヒト抗体の調整］
選抜された１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２の６株を、各々、５００ｍｌのＨＹ培地に接種し、スピナーフラスコ内、３７℃で培養した（大量培養）。この培養上清から、常法に従って、プロテインＡカラムクロマトグラフィーにより各々の抗体を精製することにより、破傷風毒素に対する完全ヒト抗体を得た。
【０１１６】
＜ＥＢＶゲノムの除去についての評価＞
（定性的ＰＣＲ法）
１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２及びその作製過程で得られたハイブリドーマ各々について、前述した手順と同じ手順の定性的ＰＣＲ法により、ＥＢＶゲノムの存否を確認した。その結果は、図５の通りであった。
【０１１７】
図５から、１Ｃ１１及び２Ｅ３を除き、ＥＢＶゲノムが、少なくとも検出限界以下にまで、除去されていることが分かった。
【０１１８】
（定量的ＰＣＲ法）
１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２及びその作製過程で得られたハイブリドーマ各々について、前述した手順と同じ手順の定性的ＰＣＲ法により、ＥＢＶゲノムの存否を確認した。その結果は、図６の通りであった。
【０１１９】
図６から、１Ｃ１１、２Ｅ３、１Ｆ８を除き、単位細胞当たりのＥＢＶゲノムコピー数が、０もしくは０とほぼ近似できる程度にまで、除去されていることが分かった。
【０１２０】
＜完全ヒト抗体についての評価＞
（抗体の精製状態）
１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２の６株各々から精製された抗体を、１２％ＳＤＳポリアミドゲルに、４００ｎｇ／ウェル添加し、電気泳動した。電気泳動後、常法に従って、銀染色した結果を図７に示す。
【０１２１】
図７に示されるように、いずれの株から得た抗体についても、５０ｋＤａ付近、及び２５ｋＤａ付近に、各々、抗体の重鎖及び軽鎖に各々相当すると思われる単一のバンドが発見された。このことから、各抗体は、いずれも単一のモノクローナル抗体であることが分かった。
【０１２２】
（抗原に対する特異的な結合活性）
１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２の６株各々から精製された抗体を１μｇ／ｍＬから段階的に１０倍希釈したものを試料とし、常法に従って、アルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ＋Ｍ抗体「ＡＨＩ１７０５」（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製）を用いて、ＥＬＩＳＡ法による結合活性の測定、及びウェスタン法による結合特異性の確認を行った。この結果を図８、図９に示す。
【０１２３】
図８のグラフにおいて、横軸は試料（抗体）濃度、縦軸は破傷風毒素（抗原）に対する抗体の特異的な結合活性を表す。図８に示されるように、破傷風毒素（抗原）に対する抗体の特異的な結合活性が、抗体濃度依存的であった。従って、各々の抗体間で差はあるものの、いずれの抗体も破傷風毒素特異的な結合活性を備えることが分かった。
【０１２４】
図９Ａの左側は、破傷風毒素が、標的細部への結合部位（Ｈ鎖）と、毒素活性部位（Ｌ鎖）とがジスルフィド結合により結合してなることを表す概略図である。この構造は、破傷風毒素をＳＤＳポリアミドゲル電気泳動法により電気泳動した後の図（図９Ａの右側）からも裏付けられる。これを踏まえ、図９Ｂのウェスタン解析図から、各々の抗体間で差はあるものの、いずれの抗体も破傷風毒素特異的な結合能力があることが分かった。
【０１２５】
（破傷風毒素の毒性緩和）
破傷風毒素約６２ＬＤ５０と、１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２の６株各々から精製された抗体を１００μｇ／ｍＬから段階的に希釈した（３０倍希釈、９０倍希釈）溶液と、を混合し、室温で３０分間放置した。放置後の混合液をｄｄＹマウス２匹の右大腿部皮下に４００μＬずつ投与し、投与後のマウスの生存率の時系列的変化を調べた。この結果を図１０に示す。
【０１２６】
図１０に示されるように、破傷風毒素と併せて抗体を投与したことにより、時系列的に、マウス生存率は改善されていた。従って、各々の抗体間で差はあるものの、いずれの抗体も破傷風毒素の毒性緩和能力を備えることが分かった。このことは、本発明で得られる抗体の医薬組成物としての有用性を強く示唆するものである。
【０１２７】
なお、本発明は上述の実施例に限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲での変形、改良等は本発明に含まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明により得られる、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法を経て作製された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマは、ＥＢＶゲノムが除去されているため、安全な完全ヒト抗体を迅速且つ容易に得ることができ、とりわけ医薬品分野において好ましく使用される。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】本発明に係る完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法の手順概略を示すフローチャート。
【図２】本発明で用いられる融合ミエローマ細胞の調整手順概略を示すフローチャート。
【図３】本発明で用いられる完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞の調整手順概略を示すフローチャート。
【図４】本発明実施例におけるクローニング工程の手順概略と、各細胞株との関係を示す図。
【図５】本発明実施例における定性的ＰＣＲ法による解析の結果を示す電気泳動図。
【図６】本発明実施例における定量的ＰＣＲ法による解析の結果を示す図。
【図７】本発明実施例における各細胞株から得られた抗体を解析した電気泳動図。
【図８】本発明実施例における各細胞株から得られた抗体の抗原への特異的結合活性を示すグラフ。
【図９】破傷風毒素の構造概略図及び破傷風毒素の電気泳動図（Ａ）と、本発明実施例における各細胞株から得られた抗体をウェスタン解析した図（Ｂ）。
【図１０】本発明実施例における各細胞株から得られた抗体をマウスに投与したときの、マウス生存率の経時的変化を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法、及び融合ミエローマ細胞に関し、より詳しくは、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ゲノムが除去されたハイブリドーマの作製方法、及びこの作製に用いられる融合ミエローマ細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
マウス等の実験動物種の抗体の一部をヒト抗体に置き換えた、キメラ抗体やヒト型化抗体が作製容易な抗体として、実用化されている。しかし、キメラ抗体やヒト型化抗体は、その一部にヒト以外の動物種の抗体が混在するため、ヒト免疫系において抗原として認識される。よって、キメラ抗体やヒト型化抗体を使用した医薬品は、重複投与できない等の欠点を有する。
【０００３】
従って、医薬品に使用する抗体としては、重複投与可能な点、更に、抗原に対する親和性が高いという点から、ヒト以外の動物種の抗体が混在しない抗体である、完全ヒト抗体が好ましい。ここで、従来から用いられている、完全ヒト抗体の作製方法としては、以下のようなものを挙げることができる。
【０００４】
第１番目は、大規模な抗体遺伝子ライブラリを用いたファージディスプレイ法である。ファージディスプレイ法は、抗体遺伝子ライブラリが形質転換されているファージを用い、繊維状のファージのコートタンパク質に抗体を融合させることにより、ファージ表面上に抗体を提示するシステムを応用したものである（非特許文献１〜４参照）。
【０００５】
ファージディスプレイ法によれば、予め用意されたヒト抗体遺伝子ライブラリを用いることで、特定の抗原に対する抗体遺伝子を迅速に回収できる。従って、この抗体遺伝子をヒト抗体発現ベクターに組み込むことにより、完全ヒト抗体を、迅速に得ることができる。
【０００６】
しかし、完全ヒト抗体の作製が成功する可能性は、ファージ抗体ライブラリの質に大きく依存しているところ、十分な質のファージ抗体ライブラリを作製するのは、技術的に容易でない。このため、通常、ファージディスプレイ法によって完全ヒト抗体を得るには、困難が伴う。
【０００７】
第２番目は、ヒト抗体遺伝子を組み込んだキメラ動物によるヒト抗体作製法である。この代表例として、完全ヒト抗体の産生能を有するトランスクロモマウスである「ＫＭマウス」（キリンビール社製）を用いた作製方法を挙げることができる（非特許文献５参照）。
【０００８】
この方法の手順は、抗原を「ＫＭマウス」に投与して、目的の完全ヒト抗体を産生するＢ細胞をこの「ＫＭマウス」から採取し、使用する点が異なる他は、マウスハイブリドーマ法によりマウス抗体を取得する公知の手順と同様である。
【０００９】
「ＫＭマウス」を抗原で免疫した後に脾臓等の免疫組織から得られるＢ細胞は、目的の完全ヒト抗体を産生する。このため、ヒト末梢血を扱う必要がないため、容易に、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを作製できる。従って、この方法によれば、完全ヒト抗体を、容易に得ることができる。
【００１０】
しかし、この方法では、目的の抗原が未知だった場合には、免疫の対象となる抗原決定基を有するポリペプチドを準備するための以下の作業が必要となる。
【００１１】
即ち、まず、抗原をコードするＤＮＡの塩基配列を解析する。次いで、この塩基配列に基づき抗原決定基を決定し、更に、大腸菌等で抗原決定基を有するポリペプチドを合成する。通常、このような作業の遂行には数ヶ月間かかるため、抗体作製には長時間を要することになる。従って、抗体作製に厳しい時間的制約がある場合（例えば、２００３年当時の重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の場合）に、この方法では対応しきれない。
【００１２】
そこで、以上のような欠点を補うことができる方法として注目を集めているのが、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）により形質転換したヒトＢ細胞を用いた完全ヒト抗体の作製法（以後、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法と呼ぶ）である。この方法の手順は以下の通りである。
【００１３】
即ち、まず、ヒトミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る。次いで、この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマをクローニングすることにより、クローン化された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る。更に、クローン化された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマにより完全ヒト抗体を産生させ、完全ヒト抗体を得る。
【００１４】
ある抗原に対する抗体を産生するヒトＢ細胞は、マウス等の実験動物ではなくヒトの末梢血等から採取するものであるため、少量しか得ることができない。しかし、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法によれば、ある抗原に対する抗体を産生するヒトＢ細胞として、ＥＢＶにより形質転換されたものを用いる。ＥＢＶにより形質転換されたヒトＢ細胞は、不死化し、増殖能力が増強される。このため、ヒト末梢血を扱うにもかかわらず、容易に、ハイブリドーマを作製できる。
【００１５】
また、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法によれば、ある抗原に対する抗体を産生するヒトＢ細胞を用いて、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを作製する。このため、たとえ目的の抗原が未知の場合にも、抗原決定基を有するポリペプチドの合成等を行う必要がないので、迅速に、目的の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを作製できる（例えば、非特許文献６参照）。従って、完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に作製できる。
【非特許文献１】Ｊ．Ｄ． Ｍａｒｋｓら、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９１年発行、２２２、ｐ．５８１〜５９７
【非特許文献２】Ｃ．Ｆ． Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩら、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．」、１９９２年発行、８９、ｐ．４４５７〜４４６１
【非特許文献３】Ａ．Ｄ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、「ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ」、１９９４年発行、１３、ｐ．３２４５〜３２６０
【非特許文献４】伊庭善孝、「実験医学別冊クローズアップ実験法総集編」、２００２年発行、ｐ．９９〜１０４
【非特許文献５】Ｋ． Ｔｏｍｉｚｕｋａら、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．」、２０００年発行、９７、ｐ．７２２〜７２７
【非特許文献６】Ｅ． Ｔｒａｇｇｉａｉら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、２００４年発行、１０、ｐ．８７１〜８７５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかし、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法によれば、ヒトＢ細胞として、ＥＢＶにより形質転換されたものを使用するから、作製された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマにＥＢＶゲノムが残存する。ＥＢＶは、欧米では白血病、アジアでは上皮性癌（例えば、上咽頭癌）の原因の一つと考えられている。このため、抗体を製剤化する際には、安全上の観点から、ＥＢＶゲノムを除去する必要がある。しかしながら、このような手段はいまだ確立されていない。
【００１７】
従って、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法により作製される完全ヒト抗体は、迅速且つ容易に得ることができるものの、安全上の大きな問題を残していた。
【００１８】
そこで、本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたもので、その目的は、安全な完全ヒト抗体を迅速且つ容易に得ることを可能にする、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法、及びその手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは前述の課題に鑑み鋭意研究した。その結果、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞を用いると、ハイブリドーマからＥＢＶゲノムを除去できることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【００２０】
（１） ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る融合工程と、この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを所定回数クローニングするクローニング工程と、前記クローニングされた完全抗体産生ハイブリドーマからＥＢＶゲノム陰性細胞株を選抜する選抜工程と、を含むＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法。
【００２１】
（１）の発明によれば、まず、融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを所定回数クローニングする。これにより、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマからＥＢＶゲノムが除去される。
次いで、このクローニングされた完全抗体産生ハイブリドーマから、ＥＢＶゲノム陰性細胞株を選抜することにより、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを選択的に作製できる。
【００２２】
一般に、マウスミエローマ細胞を用いて細胞融合すると、何らかの機構により、融合後の細胞から、ＥＢＶゲノムを除去できることが知られている。（１）の発明で用いる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマは、マウスミエローマ細胞を一つの由来としている。このため、この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを所定回数クローニングする過程で、ＥＢＶゲノムが除去されるものと推測される。
【００２３】
また、（１）の発明によれば、ＥＢＶハイブリドーマ法によって、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを作製する。このため、前述の通り、目的の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを、迅速且つ容易に作製できる。
【００２４】
このように、（１）の発明によれば、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを、迅速且つ容易に作製できる。従って、安全な完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に得ることができる。
【００２５】
更に、この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマは、完全ヒト抗体の産生能力が長期間に渡って持続する。このため、（１）の発明によれば、必要に応じて、完全ヒト抗体の大量生産にも対応できるという効果も得られる。
【００２６】
一般に、マウス由来細胞とヒト由来細胞とを細胞融合すると、融合後の細胞から、ヒト染色体が選択的に脱離する傾向がある。しかし、本発明で用いる融合ミエローマ細胞は、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合されているため、ヒト染色体が脱離しにくくなる。そして、この融合ミエローマ細胞に、ある抗原に対する抗体を産生するヒトＢ細胞を更に細胞融合するため、ヒト染色体が更に脱離しにくくなる。このため、完全ヒト抗体産生に関わるヒト遺伝子の脱離も防止できるため、抗体産生が持続すると推測される。
【００２７】
「所定回数」とは、以上のような効果を得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを作製するために必要なクローニングの回数を意味し、用いる抗原、細胞株等の条件により当業者が適宜選択することができる。
「ＥＢＶゲノムが除去された」とは、安全な完全ヒト抗体を得ることができる程度にまで、ＥＢＶゲノムが減少化されたことを意味する。
【００２８】
（２） 前記融合ミエローマ細胞は、受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である（１）記載の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法。
【００２９】
受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である融合ミエローマ細胞は、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞の一例である。
よって、（２）の発明によれば、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを、迅速且つ容易に作製できる。従って、安全な完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に得ることができる。
【００３０】
更に、（２）の発明により得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマによれば、完全ヒト抗体の産生能力が長期間に渡って持続する。このため、（２）の発明によれば、必要に応じて、完全ヒト抗体の大量生産にも対応できるという効果も得られる。
【００３１】
（３） （１）又は（２）記載の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【００３２】
（３）記載のモノクローナル抗体は、（１）又は（２）記載の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマにより産生させて得られる。前述した通り、迅速且つ容易に作製できる（１）又は（２）記載の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマは、ＥＢＶゲノムが除去されている。従って、（３）の発明によれば、安全な完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に得ることができる。
【００３３】
（４） （３）記載のモノクローナル抗体を有効成分とする医薬組成物。
【００３４】
（４）記載の医薬組成物は、（３）記載のモノクローナル抗体を有効成分とする。前述した通り、（３）記載のモノクローナル抗体は、迅速且つ容易に得ることができる、安全な完全ヒト抗体である。従って、（４）の発明によれば、安全で有効な医薬組成物を、迅速且つ容易に製造できる。
【００３５】
なお、「有効成分とする」とは、医薬組成物としての効果を得られる程度に、（３）記載のモノクローナル抗体が含まれ、且つ、医薬組成物としての効果を失わない限りにおいて、（３）記載のモノクローナル抗体以外の成分が含まれていてもよいことを意味する。医薬組成物の具体的組成等については、当業者が適宜選択することができる。
【００３６】
（５） ヒトミエローマ細胞とマウスミエローマ細胞とを細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞であって、ＥＢＶゲノムが除去されたハイブリドーマの作製に用いられることを特徴とする融合ミエローマ細胞。
【００３７】
（５）記載の融合ミエローマ細胞によれば、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と細胞融合する場合でも、前述の通り、ＥＢＶゲノムが除去されたハイブリドーマを、迅速且つ容易に作製できる。このため、安全な完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に得ることもできる。
【００３８】
（６） 受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である（５）記載の融合ミエローマ細胞。
【００３９】
受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である融合ミエローマ細胞は、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞の一例である。
従って、（６）の発明によれば、ＥＢＶゲノムが除去されたハイブリドーマを、迅速且つ容易に作製できる。このため、安全な完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に得ることもできる。
【００４０】
（７） ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶ陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合してハイブリドーマを得る融合工程と、このハイブリドーマを所定の回数クローニングすることでＥＢＶゲノムを減少させる減少化工程と、を含むＥＢＶゲノムの減少化方法。
【００４１】
（７）の発明によれば、前述したように、クローニングすることにより、ハイブリドーマからＥＢＶゲノムを、迅速且つ容易に減少化できる。ここで、「所定の回数」とは、ハイブリドーマの用途等に応じた所望のレベルにまで、ＥＢＶゲノムを減少化させるために必要なクローニングの回数を意味する。
また、ＥＢＶゲノムが除去までされたハイブリドーマを用いれば、安全な完全ヒト抗体を、迅速且つ容易に得ることもできる。
【発明の効果】
【００４２】
本発明によれば、ＥＢＶ―ハイブリドーマ法において、ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、ＥＢＶゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞を用いた。従って、安全な完全ヒト抗体を迅速且つ容易に得ることを可能にする、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法、及びその手段を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下、本発明の一実施形態を図面を参照しながら説明する。図１は、本発明の、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法の手順を示すフローチャートである。
【００４４】
本発明の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法は、融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る融合工程（Ｓ１００）と、この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを所定回数クローニングするクローニング工程（Ｓ２００）と、前記クローニングされた完全抗体産生ハイブリドーマからＥＢＶゲノム陰性細胞株を選抜する選抜工程（Ｓ３００）と、を含む。
【００４５】
次に、図２及び図３を参照して、Ｓ１００で用いられる、融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、の調整手順について説明する。
【００４６】
＜融合工程＞
［ヘテロハイブリドーマの作製］
まず、ヒトミエローマ細胞と、マウスミエローマ細胞と、を細胞融合し、ヘテロハイブリドーマを作製する（Ｓ１０）。
【００４７】
Ｓ１０においては、ヒトミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞としては、自己抗体産生能のない細胞を用いる。更に、ヒトミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞のいずれか一方として、例えば、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（以下、「ＨＧＰＲＴ」と表記する。）を欠損した６―チオグアニン耐性株を用いることができる。
【００４８】
６―チオグアニンを含有する培地において、生存できることを利用して、後述するＳ１４において、目的のヘテロハイブリドーマを選別できるからである。また、ＨＧＰＲＴは、サルベージ回路経由のヌクレオチド合成に必須な酵素であるため、ＨＧＰＲＴ欠損株はヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で生存できないことを利用して、後述するＳ１５０において、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを選出できるからである。
【００４９】
このようなヒトミエローマ細胞としては、特に限定されないが、通常、例えば、Ｕ−２６６株を挙げることができる。また、このようなマウスミエローマ細胞としては、特に限定されないが、通常、例えばＰ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３株を挙げることができる。
【００５０】
これらの細胞株は各々、適当な培地、例えばイスコフ改変ダルベッコ培地（以下、「ＩＭＤＭ培地」と表記する。）に、グルタミン、２−メルカプトエタノール、及びウシ胎児血清を加えた培地（ＩＭＤＭ改良培地）に６―チオグアニンを加えた培地、ＩＭＤＭ改良培地を用いて、継代培養する。そして、後述するＳ１２を行う当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【００５１】
このヒトミエローマ細胞と、マウスミエローマ細胞と、を細胞融合する（Ｓ１２）。細胞融合の方法としては、特に限定されないが、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合法等の常法を挙げることができ、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単な点からは、ＰＥＧ法が好ましい。
【００５２】
例えば、ＰＥＧ法によれば以下の手順となる（Ｓ１２’［図示はしていない］）。
即ち、ヒトミエローマ細胞と、マウスミエローマ細胞と、を、無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でよく洗浄した後、ヒトミエローマ細胞とマウスミエローマ細胞との細胞数の比が１：４〜１：５程度になるように混合し、遠心分離する。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下する。
【００５３】
次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離する。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、ＩＭＤＭ培地に６―チオグアニンを加えた培地中に懸濁する。この懸濁物を培養用プレート（以下「プレート」という）の各ウェルに分注し、７％炭酸ガスの存在下、適宜６―チオグアニンを含有するＩＭＤＭ培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養する。
【００５４】
次に、Ｓ１０を経て得られるヘテロハイブリドーマをクローニングする（Ｓ１４）。
クローニングの方法としては、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個ずつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する方法等を挙げることができる。このうち、操作が簡便な点から、限界希釈法がよく用いられる。
【００５５】
そして、抗体を産生していないことを確認できたものを選出する（Ｓ１６）。これにより、Ｓ１００において用いることができるヘテロハイブリドーマを、選択的に得ることができる。
【００５６】
選出の方法としては、特に限定されないが、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝縮反応法等の公知の方法を挙げることができる。このうち、検出感度、迅速性、正確性等の点からは、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。このＥＬＩＳＡ法は、一般的な競合法、サンドイッチ法等の手法に従って行うことができ、液相系でも、固相系でも行うことができる。
【００５７】
［融合ミエローマ細胞の作製］
【００５８】
このヘテロハイブリドーマと、ヒトＢ細胞と、を細胞融合し、融合ミエローマ細胞を作製する（Ｓ２０）。
【００５９】
ここで用いるヒトＢ細胞は、形質細胞又はその前駆細胞（リンパ球）であり、個体のいずれの部位から得てもよく、脾細胞、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、又はこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができる。このうち、採取が容易な点から、末梢血が最も一般的に用いられる。ここで用いるヒトＢ細胞は、自己抗体産生能のない細胞である。
【００６０】
ヘテロハイブリドーマは、例えば、６―チオグアニンを含有するＩＭＤＭ改良培地等を用いて継代培養し、後述するＳ２２を行う当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【００６１】
ヘテロハイブリドーマがＨＧＰＲＴを欠損した６―チオグアニン耐性株であった場合、６―チオグアニンを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いることで、目的の融合ミエローマ細胞を選別できる。即ち、融合しなかったヒトＢ細胞、及びヒトＢ細胞どうしの融合細胞は、培地に６―チオグアニンが含まれているため、生存できないからである。
【００６２】
このヘテロハイブリドーマと、ヒトＢ細胞と、を細胞融合する（Ｓ２２）。細胞融合は、例えばＰＥＧ法によれば、以下の手順となる（Ｓ２２’［図示はしていない］）。
このヘテロハイブリドーマと、ヒトＢ細胞と、を、無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ）又はＰＢＳでよく洗浄し、ヘテロハイブリドーマとヒトＢ細胞との細胞数の比が１：４〜１：５程度になるように混合し、遠心分離する。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下する。
【００６３】
次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離する。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、適量のヒトインターロイキン−６（ヒトＩＬ−６）を更に含むウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地中に懸濁する。この懸濁物をプレートの各ウェルに分注し、７％炭酸ガスの存在下、適宜ウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養する。
【００６４】
Ｓ２２を経て得られる融合ミエローマ細胞をクローニングする（Ｓ２４）。Ｓ２４は、Ｓ１４と同様の手順で行うことができる。
【００６５】
そして、抗体を産生していないことを確認できたものを選出する（Ｓ２６）。これにより、Ｓ１００において用いることができる融合ミエローマ細胞を、選択的に得ることができる。Ｓ２６は、Ｓ１６と同様の手順で行うことができる。
【００６６】
このようにして、Ｓ１００において用いられる融合ミエローマ細胞を得ることができる。この融合ミエローマ細胞の一例として、受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である融合ミエローマ細胞が寄託されている。
【００６７】
［完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞の調整］
完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞を調整する（Ｓ３０）。
【００６８】
完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞は、ワクチン接種を受けた又は疾患から回復したボランティア（ヒト）の形質細胞又はその前駆細胞（リンパ球）である。完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞は、ボランティアのいずれの部位から得てもよく、一般には脾細胞、リンパ節、骨髄、扁桃、末梢血、又はこれらを適宜組み合わせたもの等から得る（Ｓ３２）ことができる。なお、採取が容易な点から、末梢血から完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞を得ることが、最も一般的である。
【００６９】
このヒトＢ細胞にＥＢＶを感染させることで、形質転換を行う（Ｓ３４）。
形質転換の方法としては、特に限定されないが、例えば以下の手順を挙げることができる。即ち、放射線照射したフィーダー細胞上で、ヒトＢ細胞の培養を行う。このヒトＢ細胞に、ＥＢＶ陽性マーモセット細胞株Ｂ９５−８の培養上清中のウイルスを添加し、更にヒトＢ細胞を培養することで、ＥＢＶに感染させる。
【００７０】
次いで、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞をクローニングする（Ｓ３６）。Ｓ３６は、図２のＳ１４と同様の手順で行うことができるが、形質転換されたＢ細胞の増殖を促進するため、ヒトＩＬ−６等の増殖因子を適量添加しつつ、行うことが好ましい。
【００７１】
更に、Ｓ３６を経て得られるクローニングされたＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞から、完全ヒト抗体を産生するヒトＢ細胞を選出する（Ｓ３８）。これにより、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞を、選択的に得ることができる。Ｓ３８は、図２のＳ１６と同様の手順で行うことができる。
【００７２】
Ｓ３８は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下のような手順により行うことができる（Ｓ３８’［図示はしていない］）。
即ち、まず、抗原をＥＬＩＳＡ法用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により覆う。次いで、この表面を洗浄した後、一次抗体として、段階希釈した試料に接触させ、上記抗原に試料中の完全ヒト抗体を結合させる。更に、二次抗体として、酵素標識されたヒト抗体に対する抗体を加えて、ヒト抗体に結合させる。洗浄した後、この酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
【００７３】
＜完全ヒト抗体産生ハイブリドーマへの細胞融合＞
次に、Ｓ２０を経て得られる融合ミエローマ細胞と、Ｓ３０を経て得られる完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る（Ｓ１００）。
【００７４】
融合ミエローマ細胞は、例えば、６―チオグアニン及びウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いて継代培養する。完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞は、例えば、ＩＬ−６、２−メルカプトエタノール、ウシインスリン、ヒトトランスフェリンを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いて継代培養する。いずれの細胞も、後述するＳ１１０を行う当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【００７５】
上記融合ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴを欠損した６―チオグアニン耐性及びウアバイン耐性株であった場合、６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地を用いることで、目的のハイブリドーマを選別できる。即ち、融合しなかった完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞、及び完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞どうしの融合細胞は、培地に６―チオグアニン及びウアバインが含有されているため、生存できない。一方、融合しなかった融合ミエローマ細胞、及び融合ミエローマ細胞どうしの融合細胞は、培地にＨＡＴが含まれているため、生存できないからである。
【００７６】
この融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合する（Ｓ１１０）。Ｓ１１０は、図２のＳ１２と同様の手順で行うことができる。
【００７７】
細胞融合は、例えばＰＥＧ法によれば、以下の手順（Ｓ１１０’［図示はしていない］）となる。
即ち、融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を、無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ）又はＰＢＳでよく洗浄し、融合ミエローマ細胞と完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞との細胞数の比が１：４〜１：５程度になるように混合し、遠心分離する。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下する。
【００７８】
次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離する。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、適量のヒトＩＬ−６を更に含み、６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地中に懸濁する。この懸濁物をプレートの各ウェルに分注し、５％炭酸ガスの存在下、適宜６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養する。
【００７９】
次に、Ｓ１１０を経て得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマをクローニングする（Ｓ１３０）。Ｓ１３０は、図２のＳ１４と同様の手順で行うことができる。
【００８０】
次に、Ｓ１３０を経て得られる完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの中から、抗体産生能及び細胞増殖能が高いものを選出する（Ｓ１５０）。
選出の方法としては、特に限定されないが、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝縮反応法等の公知の方法により抗体産生能が高いものを選出できる。
【００８１】
＜クローニング工程＞
次に、Ｓ１５０を経て選出された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマに、後述するＳ２１０及びＳ２３０を所定回数施す（Ｓ２００）。
【００８２】
Ｓ１５０を経て選出された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う（Ｓ２１０［図示はしていない］）。Ｓ２１０は、図２のＳ１４と同様の手順で行うことができる。
【００８３】
Ｓ２１０を経て得られる株（サブクローン）の中から、Ｓ１５０と同様の手順で、抗体産生能及び細胞増殖能が高いことを指標に、次にクローニングを施す株を選出する（Ｓ２３０［図示はしていない］）。
【００８４】
このようなＳ２１０及びＳ２３０を所定回数行うことにより、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
【００８５】
＜選抜工程＞
得られた完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの中から、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを選抜する（Ｓ３００）。選抜の方法としては、特に限定されないが、例えば、定性的ＰＣＲ法、定量的ＰＣＲ法を挙げることができ、これらを併せて行うこともできる。
【００８６】
（定性的ＰＣＲ法）
定性的ＰＣＲ法によれば、完全ヒト抗体産生ハイブリドーマ内におけるＥＢＶゲノムの存否を確認する（Ｓ３１０［図示はしていない］）ことができる。
【００８７】
ＰＣＲにおいて鋳型となるＤＮＡは、培養された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマから、常法に従って、「ＱＩＡ ａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（キアゲン社製）等を用いて精製できる（Ｓ３１１［図示はしていない］）。
【００８８】
増幅させて検出する対象としては、特に限定されないが、検出感度を高めるという点で、例えば、ＢａｍＨＩ Ｗ領域等の繰り返し配列を有する領域が好ましい。例えば、ＢａｍＨＩ Ｗ領域は、ＥＢＶゲノム中、約１２回の繰り返し配列となっており、他の領域に比べて、より多量に増幅することができるからである。
【００８９】
定性的ＰＣＲ法においてＢａｍＨＩ Ｗ領域を増幅させるためのプライマーとしては、特に限定されないが、例えば、配列表の配列番号１及び２記載のプライマーを挙げることができる。
【００９０】
（定量的ＰＣＲ法）
定量的ＰＣＲ法によれば、ハイブリドーマ内におけるＥＢＶゲノムの存否及びコピー数を確認する（Ｓ３２０［図示はしていない］）ことができる。Ｓ３１１と同様の手順で、ＰＣＲにおいて鋳型となるＤＮＡを精製できる（Ｓ３２１［図示はしてない］）。増幅させて検出する対象としては、特に限定されないが、例えば、ＢＡＬＦ５（ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子領域）等の構造遺伝子領域が挙げられる。
【００９１】
定量的ＰＣＲ法においてＢＡＬＦ５領域を増幅させるためのプライマーとしては、特に限定されないが、例えば、配列表の配列番号３及び４記載のプライマーを挙げることができ、プローブとしては配列表の配列番号５記載のプローブを挙げることができる。
【００９２】
また、単位細胞当たりのコピー数を定量化するための内部標準としては、特に限定されないが、ヒトグリセルアルデヒド―３―リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）やマウスβ―アクチン等の構造遺伝子領域を挙げることができる。
【００９３】
なお、定量的ＰＣＲを簡便に行うため、「ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７０００」（アプライドバイオシステムズ社製）等によるＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を用いることもできる。
【００９４】
このようにして作製される、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することができ、また液体窒素中で長期間保存できる。
【００９５】
＜モノクローナル抗体＞
Ｓ３００を経て選抜された、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマにモノクローナル抗体を産生させる。
【００９６】
モノクローナル抗体の産生は、特に限定されないが、例えば、以下の手順からなる。
まず、Ｓ３００を経て選抜された、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを、ＨＡＴを除いたＨＹ培地又はＩＭＤＭ改良培地に接種し、培養する。次いで、培養後の培養上清を回収する。大量培養をするときは、大型培養瓶を用いた回転培養、スピナー培養、あるいはホローファイバーシステムを用いた培養を行うことができる。比較的高純度の目的抗体を培養上清として得ることができる点で、大量培養は有利である。
【００９７】
抗体産生ハイブリドーマの培養上清及びマウス等の腹水は、そのまま粗製抗体液として用いることができる。また、これらは常法に従って、硫酸アンミモニウム分画、塩析、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡカラムクロマトグラフィー等のアフィニテイクロマトグラフィー等により精製して、精製抗体とすることもできる。
【００９８】
＜医薬組成物＞
このようにして得られたモノクローナル抗体を有効量含有させ、モノクローナル抗体を有効成分とする医薬組成物を製造することができる。この医薬組成物には、モノクローナル抗体の他に、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアが含まれていてもよく、他の薬剤（他の抗体、抗生物質等）が含まれていてもよい。キャリアとしては、特に限定されないが、例えば、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水等の緩衝水溶液を挙げることができる。
【００９９】
本発明の医薬組成物は、凍結乾燥（フリーズドライ）させたモノクローナル抗体に前記の緩衝水溶液等を必要時に添加して再構成したものを含んでいてもよい。
【０１００】
本発明の医薬組成物は、種々の形態で投与することができ、投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、又は、注射剤、点滴剤、坐薬等による非経口投与を挙げることができる。
【０１０１】
なお、本発明は、上述のモノクローナル抗体又は医薬組成物を用いた疾患の予防方法又は治療方法をも包含するものである。
【実施例】
【０１０２】
次に、本発明を実施例及び比較例を挙げて説明する。具体的には、破傷風毒素に対する抗体の作製を行った。
【０１０３】
破傷風毒素のワクチン接種をしたボランティア（ヒト）から末梢血を採取し、破傷風毒素に対する抗体を産生するヒトＢ細胞を得た。このヒトＢ細胞に、Ｂ９５−８を添加することによりＥＢＶを感染させ、形質転換した。
【０１０４】
次いで、このＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞を、１Ｕ／ｍＬのＩＬ−６を添加しつつ、常法に従って限界希釈法により、クローニングした。そして、クローニングされたＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞から、常法に従ってＥＬＩＳＡ法により、破傷風毒素に対する完全ヒト抗体の産生が確認されたヒトＢ細胞を選出した。このようにして、破傷風毒素に対する完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞（５−１１Ｆ Ｄ１１）を得た。
【０１０５】
受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０として寄託されている融合ミエローマ細胞と、５−１１Ｆ Ｄ１１と、を各々、ウアバインを含有するＩＭＤＭ改良培地、ＢＳＡ、Ｌ−グルタミン、及び２−メルカプトエタノールを含有するＩＭＤＭ改良培地を用いて、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保した。
【０１０６】
この融合ミエローマ細胞と、完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を、ＤＭＥＭでよく洗浄し、ＦＥＲＭ Ａ−２０５９０と５−１１Ｆ Ｄ１１との細胞数の比が１：５程度になるように混合し、遠心分離した。遠心後の上清を除去し、沈殿した細胞群を十分にほぐした後、撹拌しながら０．６ｇ／ｍＬのＰＥＧ（分子量４０００）を含む無血清培地１ｍＬを滴下した。次いで、１０ｍＬの無血清培地をゆっくりと加えた後、遠心分離した。再び上清を捨て、沈殿した細胞を、ウアバインを含有するＨＡＴ培地中に懸濁した。この懸濁物をプレートの各ウェルに分注し、７％炭酸ガスの存在下、適宜６―チオグアニン及びウアバインを含有するＨＡＴ培地を補いながら、３７℃で２週間程度培養した。
【０１０７】
このようにして得られた破傷風毒素に対する完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの中から、ＥＬＩＳＡ法により抗体産生能が高いもの（１Ｃ１１、２Ｂ５、３Ｃ７）を選出し、吸光度が比較的高いもの（１Ｃ１１）を細胞増殖能が高いものとして選出した。
【０１０８】
［クローニング工程］
（第１回目クローニング）
１Ｃ１１を、別のプレートに移し、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法によりクローニングを行った。クローニングされた株の中から、上述と同様の手順で、抗体産生能が高いもの（１Ｄ３、１Ｆ１０、２Ｅ３、２Ｅ７）を選出し、更に、細胞増殖能が高いもの（２Ｅ７）を選出した。
【０１０９】
（第２回目クローニング）
２Ｅ７を用いて第１回目クローニングと同じ手順でクローニングを行い、クローニングされた株の中から、上述と同様の手順で、抗体産生能が高いもの（１Ｆ５、２Ｄ４、１Ｂ４、１Ｇ７）を選出し、更に、細胞増殖能が高いもの（１Ｂ４、１Ｇ７）を選出し、次のクローニングを施すこととした。
【０１１０】
（第３回目クローニング）
１Ｂ４、１Ｇ７を用いて第１回目クローニングと同じ手順でクローニングを行い、破傷風毒素に対する特異的抗体を持続的に産生し、且つ、安定に増殖する６株のハイブリドーマ（１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２）を得た。
【０１１１】
なお、以上説明した各細胞株の関係は、図４に示す通りである。
【０１１２】
［選抜工程］
１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２の中から、ＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを選抜するため、以下の作業を行った。
【０１１３】
（定性的ＰＣＲ法）
これらの６株各々を、１０ｍｌのＨＹ培地に接種し、３７℃で３日間培養して得られたハイブリドーマ（細胞数５×１０６）から「ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（キアゲン社製）を用いて精製したＤＮＡを鋳型とし、ＥＢＶゲノム内のＢａｍＨＩ Ｗ領域を増幅可能なプライマー（配列表の配列番号１及び２記載のプライマー）を用いて、ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲにおける酵素は「Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（登録商標）」（ロシュ社製）を用い、装置は「Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００」（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）を用いた。この結果、これら６株はいずれもＥＢＶゲノムが除去されている（少なくとも、検出限界以下）ことが分かった（図５参照）。
【０１１４】
（定量的ＰＣＲ法）
前記の定性的ＰＣＲ法における手順と同じ手順により精製されたＤＮＡを鋳型とし、ＥＢＶゲノム内のＢＡＬＦ５領域を増幅可能なプライマー（配列表の配列番号３及び４記載のプライマー）を用いて、「ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７０００」（アプライドバイオシステムズ社製）等によるＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。また、プローブとして「ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標） Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ」（キアゲン社製）を使用し、内部標準としてヒトグリセルアルデヒド―３―リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びマウスβ―アクチンを用いた。その結果、これら６株はいずれもＥＢＶゲノムの単位細胞あたりのコピー数が０又は０に限りなく近く、ＥＢＶゲノムが除去されていることが分かった（図６参照）。
【０１１５】
［完全ヒト抗体の調整］
選抜された１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２の６株を、各々、５００ｍｌのＨＹ培地に接種し、スピナーフラスコ内、３７℃で培養した（大量培養）。この培養上清から、常法に従って、プロテインＡカラムクロマトグラフィーにより各々の抗体を精製することにより、破傷風毒素に対する完全ヒト抗体を得た。
【０１１６】
＜ＥＢＶゲノムの除去についての評価＞
（定性的ＰＣＲ法）
１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２及びその作製過程で得られたハイブリドーマ各々について、前述した手順と同じ手順の定性的ＰＣＲ法により、ＥＢＶゲノムの存否を確認した。その結果は、図５の通りであった。
【０１１７】
図５から、１Ｃ１１及び２Ｅ３を除き、ＥＢＶゲノムが、少なくとも検出限界以下にまで、除去されていることが分かった。
【０１１８】
（定量的ＰＣＲ法）
１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２及びその作製過程で得られたハイブリドーマ各々について、前述した手順と同じ手順の定性的ＰＣＲ法により、ＥＢＶゲノムの存否を確認した。その結果は、図６の通りであった。
【０１１９】
図６から、１Ｃ１１、２Ｅ３、１Ｆ８を除き、単位細胞当たりのＥＢＶゲノムコピー数が、０もしくは０とほぼ近似できる程度にまで、除去されていることが分かった。
【０１２０】
＜完全ヒト抗体についての評価＞
（抗体の精製状態）
１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２の６株各々から精製された抗体を、１２％ＳＤＳポリアミドゲルに、４００ｎｇ／ウェル添加し、電気泳動した。電気泳動後、常法に従って、銀染色した結果を図７に示す。
【０１２１】
図７に示されるように、いずれの株から得た抗体についても、５０ｋＤａ付近、及び２５ｋＤａ付近に、各々、抗体の重鎖及び軽鎖に各々相当すると思われる単一のバンドが発見された。このことから、各抗体は、いずれも単一のモノクローナル抗体であることが分かった。
【０１２２】
（抗原に対する特異的な結合活性）
１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２の６株各々から精製された抗体を１μｇ／ｍＬから段階的に１０倍希釈したものを試料とし、常法に従って、アルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ＋Ｍ抗体「ＡＨＩ１７０５」（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製）を用いて、ＥＬＩＳＡ法による結合活性の測定、及びウェスタン法による結合特異性の確認を行った。この結果を図８、図９に示す。
【０１２３】
図８のグラフにおいて、横軸は試料（抗体）濃度、縦軸は破傷風毒素（抗原）に対する抗体の特異的な結合活性を表す。図８に示されるように、破傷風毒素（抗原）に対する抗体の特異的な結合活性が、抗体濃度依存的であった。従って、各々の抗体間で差はあるものの、いずれの抗体も破傷風毒素特異的な結合活性を備えることが分かった。
【０１２４】
図９Ａの左側は、破傷風毒素が、標的細部への結合部位（Ｈ鎖）と、毒素活性部位（Ｌ鎖）とがジスルフィド結合により結合してなることを表す概略図である。この構造は、破傷風毒素をＳＤＳポリアミドゲル電気泳動法により電気泳動した後の図（図９Ａの右側）からも裏付けられる。これを踏まえ、図９Ｂのウェスタン解析図から、各々の抗体間で差はあるものの、いずれの抗体も破傷風毒素特異的な結合能力があることが分かった。
【０１２５】
（破傷風毒素の毒性緩和）
破傷風毒素約６２ＬＤ５０と、１Ｃ４、１Ｆ８、２Ｄ３、２Ｆ１１、１Ｂ３、２Ｄ２の６株各々から精製された抗体を１００μｇ／ｍＬから段階的に希釈した（３０倍希釈、９０倍希釈）溶液と、を混合し、室温で３０分間放置した。放置後の混合液をｄｄＹマウス２匹の右大腿部皮下に４００μＬずつ投与し、投与後のマウスの生存率の時系列的変化を調べた。この結果を図１０に示す。
【０１２６】
図１０に示されるように、破傷風毒素と併せて抗体を投与したことにより、時系列的に、マウス生存率は改善されていた。従って、各々の抗体間で差はあるものの、いずれの抗体も破傷風毒素の毒性緩和能力を備えることが分かった。このことは、本発明で得られる抗体の医薬組成物としての有用性を強く示唆するものである。
【０１２７】
なお、本発明は上述の実施例に限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲での変形、改良等は本発明に含まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明により得られる、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法を経て作製された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマは、ＥＢＶゲノムが除去されているため、安全な完全ヒト抗体を迅速且つ容易に得ることができ、とりわけ医薬品分野において好ましく使用される。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】本発明に係る完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法の手順概略を示すフローチャート。
【図２】本発明で用いられる融合ミエローマ細胞の調整手順概略を示すフローチャート。
【図３】本発明で用いられる完全ヒト抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞の調整手順概略を示すフローチャート。
【図４】本発明実施例におけるクローニング工程の手順概略と、各細胞株との関係を示す図。
【図５】本発明実施例における定性的ＰＣＲ法による解析の結果を示す電気泳動図。
【図６】本発明実施例における定量的ＰＣＲ法による解析の結果を示す図。
【図７】本発明実施例における各細胞株から得られた抗体を解析した電気泳動図。
【図８】本発明実施例における各細胞株から得られた抗体の抗原への特異的結合活性を示すグラフ。
【図９】破傷風毒素の構造概略図及び破傷風毒素の電気泳動図（Ａ）と、本発明実施例における各細胞株から得られた抗体をウェスタン解析した図（Ｂ）。
【図１０】本発明実施例における各細胞株から得られた抗体をマウスに投与したときの、マウス生存率の経時的変化を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る融合工程と、
この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを所定回数クローニングするクローニング工程と、
前記クローニングされた完全抗体産生ハイブリドーマからＥＢＶゲノム陰性細胞株を選抜する選抜工程と、を含むＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法。
【請求項２】
前記融合ミエローマ細胞は、受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である請求項１記載の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項３記載のモノクローナル抗体を有効成分とする医薬組成物。
【請求項５】
ヒトミエローマ細胞とマウスミエローマ細胞とを細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞であって、
ＥＢＶゲノムが除去されたハイブリドーマの作製に用いられることを特徴とする融合ミエローマ細胞。
【請求項６】
受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である請求項５記載の融合ミエローマ細胞。
【請求項７】
ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合してハイブリドーマを得る融合工程と、
このハイブリドーマを所定の回数クローニングすることでＥＢＶゲノムを減少させる減少化工程と、を含むＥＢＶゲノムの減少化方法。
【請求項１】
ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ある抗原に対する抗体を産生するＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合して完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを得る融合工程と、
この完全ヒト抗体産生ハイブリドーマを所定回数クローニングするクローニング工程と、
前記クローニングされた完全抗体産生ハイブリドーマからＥＢＶゲノム陰性細胞株を選抜する選抜工程と、を含むＥＢＶゲノムが除去された完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法。
【請求項２】
前記融合ミエローマ細胞は、受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である請求項１記載の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマの作製方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の完全ヒト抗体産生ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項３記載のモノクローナル抗体を有効成分とする医薬組成物。
【請求項５】
ヒトミエローマ細胞とマウスミエローマ細胞とを細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ゲノム陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞であって、
ＥＢＶゲノムが除去されたハイブリドーマの作製に用いられることを特徴とする融合ミエローマ細胞。
【請求項６】
受託番号がＦＥＲＭ Ａ−２０５９０である請求項５記載の融合ミエローマ細胞。
【請求項７】
ヒトミエローマ細胞及びマウスミエローマ細胞を細胞融合して得られたヘテロハイブリドーマに、ヒトＢ細胞が更に細胞融合され、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）陰性であることを指標に選抜されて得られた融合ミエローマ細胞と、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞と、を細胞融合してハイブリドーマを得る融合工程と、
このハイブリドーマを所定の回数クローニングすることでＥＢＶゲノムを減少させる減少化工程と、を含むＥＢＶゲノムの減少化方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図８】
【図１０】
【図５】
【図７】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図８】
【図１０】
【図５】
【図７】
【図９】
【公開番号】特開２００７−１４１（Ｐ２００７−１４１Ａ）
【公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１４３４８３（Ｐ２００６−１４３４８３）
【出願日】平成１８年５月２４日（２００６．５．２４）
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月２４日（２００６．５．２４）
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【Ｆターム（参考）】
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