幹細胞由来血小板産生増加法
【課題】本発明の課題は、造血未分化細胞を培養し、巨核球系細胞、特に血小板を効率よく生産させた細胞製剤を製造する方法の開発にある。こうした細胞処理には、国内外の企業により病院外で行われることが期待されている。
【解決手段】本発明は、血小板を生産する方法であって：該方法は：Ａ）血小板前駆細胞におけるＬｎｋまたはその等価物の機能を阻害する工程；およびＢ）該血小板前駆細胞を分化させる工程、を包含する、方法を提供する。本発明はまた、このような方法によって生産される血小板およびその応用技術を提供する。
【解決手段】本発明は、血小板を生産する方法であって：該方法は：Ａ）血小板前駆細胞におけるＬｎｋまたはその等価物の機能を阻害する工程；およびＢ）該血小板前駆細胞を分化させる工程、を包含する、方法を提供する。本発明はまた、このような方法によって生産される血小板およびその応用技術を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板を効率よく生産する方法およびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体を構成する体細胞に不可欠な血液中には、赤血球、リンパ球、血小板等の血液細胞が存在する。血液細胞は、それぞれ固有の機能を分担して、生体を恒常的に保つ役割を担っている。近年、各種の血液細胞は、骨髄中の造血未分化細胞より分化、成熟すること、および、その分化、成熟の過程において各種の生体内液性因子が関与していること等の事実が明らかとなってきている。
【０００３】
血小板は、血液中に存在する直径２〜３μｍの細胞であり、生体における止血や血栓の形成に重要な役割を有する血液中の有形成分の一種である。骨髄中の造血未分化細胞から巨核球系前駆細胞を経て巨核球となり、巨核球の細胞質が断片化して生成された当該血小板が、血液中に放出されることが明らかとなっている。
【０００４】
最近になって、巨核球および血小板系についての研究成果も種々報告されており、例えば、巨核球増殖因子が、血小板を産生する巨核球の増幅を促進する作用を有することが報告されている（非特許文献１）。高投与量の化学療法や高線量の放射線照射の様な癌治療は、骨髄中の造血細胞を破壊し、該患者を血小板の激しく減少した状態に置く。このような治療の後は、血小板減少症を起こし血小板輸血を必要とする凝固作用の減少や出血性障害をもたらす。血小板の不足は、これらの癌治療の後の疾病と死亡の主な原因であり、癌治療のコストを上昇させる要因となっている。巨核球と血小板の回復には、一般的には１５日よりも長い時間が要求され、該患者の血液凝固能力がその間不足する。
【０００５】
近年、臍帯血バンクなどが設立され、採取された臍帯血が、採取された個人とは異なる患者に移植する同種造血幹細胞移植が普及し始めている。移植した患者の多くの場合において、血小板回復の遅れが問題となっている。
【０００６】
従って、血小板を簡便に製造することができる技術についての需要が存在する。
【非特許文献１】加藤俊一「臍帯血幹細胞移植」日常診療と血液Ｖｏｌ．７，Ｐ．４７９特集別刷、医薬ジャーナル社
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、造血未分化細胞を培養し、巨核球系細胞、特に血小板を効率よく生産させた細胞製剤を製造する方法の開発にある。こうした細胞処理には、国内外の企業により病院外で行われることが期待されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、造血未分化細胞に作用し、巨核球前駆細胞の分化を促進する培養方法の開発を目的として、鋭意研究を積み重ねた結果、その培養方法を明らかにすることに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は、Ｌｎｋの調節により、造血未分化細胞から巨核球前駆細胞、ひいては血小板への分化を促進させることにより、血小板への分化を促進する方法を提供する。
【０００９】
従って、本発明は、以下を提供する。
（１）血小板を生産する方法であって：上記方法は：
Ａ）血小板前駆細胞におけるＬｎｋまたはその等価物の機能を阻害する工程；および
Ｂ）上記血小板前駆細胞を分化させる工程、
を包含する、方法。
（２）上記血小板前駆細胞は、胚性幹細胞および巨核球を含む、項１に記載の方法。
（３）上記阻害は、上記Ｌｎｋまたはその等価物のドミナントネガティブ法による阻害を含む、項１に記載の方法。
（４）上記阻害は、レトロウイルスによって、Ｌｎｋ活性を抑制することのできる変異型Ｌｎｋを導入することにより達成される、項３に記載の方法。
（５）上記Ｌｎｋは配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするか、あるいはそれらの改変体または断片である、項１に記載の方法。
（６）上記Ｂ工程において、幹細胞因子（ＳＣＦ）に上記血小板前駆細胞を接触させる工程を包含する、項１に記載の方法。
（７）上記阻害は、Ｌｎｋの核酸レベルによる阻害によって達成される、項１に記載の方法。
（８）上記阻害は、ＬｎｋのアンチセンスまたはＲＮＡｉによる阻害によって達成される、項１に記載の方法。
（９）上記阻害は、Ｌｎｋの産物レベルによる阻害によって達成される、項１に記載の方法。
（１０）上記阻害は、Ｌｎｋの抗体による阻害によって達成される、項１に記載の方法。
（１１）上記血小板前駆細胞は、胚性幹細胞から誘導された巨核球を含む、項１に記載の方法。
（１２）上記誘導は、ＯＰ９間質細胞上での培養および二極性血管芽細胞との共培養によって達成される、項１１に記載の方法。
（１３）上記巨核球への分化において、Ａ）血管芽細胞（ＶＥＧＦタイプ２受容体；Ｆｌｋ−１，ＫＤＲ）かつｃ−ｋｉｔ陽性細胞から分化成熟すること；Ｂ）ＯＰ９ストローマ細胞との物理的な接触が、巨核球への分化成熟に必須であること；およびＣ）血小板産生はＯＰ９ストローマ細胞上においても可能であるが、ＯＰ９との接触を除いた条件にすることで促進されることからなる群より選択される、少なくとも１つの特徴を有する、項１１に記載の方法。
（１４）項１に記載の方法によって生産された、血小板。
（１５）血小板の生成の速度を調節する物質をスクリーニングする方法であって、
Ａ）ＬｎｋまたはＬｎｋプロモータと相互作用する物質を選ぶ工程；および
Ｂ）上記選ばれた物質を血小板前駆細胞に接触させて分化するかどうかを決定し、分化調節作用を有する上記物質を選択する工程
を包含する、方法。
（１６）Ｌｎｋまたはその機能が損傷した血小板を含む組成物。
（１７）上記組成物は、粘性の高い血液を有する患者の処置に使用される、項１６に記載の組成物。
（１８）Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子。
（１９）上記因子は、ドミナントネガティブ因子、プロモーターの結合因子、ＲＮＡｉ、抗体および低分子からなる群より選択される、項１８に記載の因子。
（２０）Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子を含む、血小板の生成の速度を調節するための組成物。
（２１）上記因子は、ドミナントネガティブ因子、プロモーターの結合因子、ＲＮＡｉ、抗体および低分子からなる群より選択される、項２０に記載の組成物。
（２２）上記因子は、Ｌｎｋまたはその遺伝子産物の機能的変異体である、項２０に記載の組成物。
（２３）上記因子は、配列番号３に記載されたヌクレオチド配列を有する改変体核酸である、項２０に記載の組成物。
（２４）Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子の、血小板生成の速度の調節のための使用。
（２５）Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子の、血小板生成の速度の調節のための組成物の製造のための、使用。
【００１０】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
【００１１】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、必要に応じて添付の図面等を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、血小板を産業レベルの量で提供する技術を提供する。その他の効果として
造血幹細胞や前駆細胞の増殖能や造血能を亢進させ、移植ドナー細胞としての機能を高める技術を提供すること、各種の幹細胞や前駆細胞より成熟血液細胞や免疫担当細胞を産業レベルの量で提供する技術を提供すること、などがあげられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１４】
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【００１５】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を記載する。
【００１６】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。
【００１７】
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄球系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄球系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
【００１８】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。
【００１９】
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
【００２０】
本明細書において、「分化」または「細胞分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的および／または機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生などはっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を，ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内あるいは細胞外の因子または条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では，別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。
【００２１】
本明細書において「多能性」または「多分化能」とは、互換可能に用いられ、細胞の性質をいい、１以上、好ましくは２以上の種々の組織または臓器に分化し得る能力をいう。従って、「多能性」および「多分化能」は、本明細書においては特に言及しない限り「未分化」と互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化することは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）と呼ばれる。しかし間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。胚性幹細胞は、多能性を有する。組織幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は全能性といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、体外培養系における、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ）の形成、分化誘導条件下での培養等が挙げられるがそれらに限定されない。また、生体を用いた多能性の有無についてのアッセイ法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形腫（テラトーマ）の形成、胚盤胞への注入によるキメラ胚の形成、生体組織への移植、腹水への注入による増殖等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００２２】
従って、本明細書において「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」とは、交換可能に用いられ、初期胚に由来する任意の多能性幹細胞をいう。通常胚性幹細胞は、全能性またはほぼ全能性を有するとされる。この胚性幹細胞を正常な宿主胚盤胞へ導入し仮親子宮へ戻すことによってキメラ作製を行ったところ、高いキメラ形成能を持つ、生殖系列キメラ（胚性幹細胞由来の機能的生殖細胞を持つキメラマウス）が得られた（Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，３０９，２５５，１９８４）。胚性幹細胞株は、培養下で、種々の遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、レトロウイルスベクター法、リポゾーム法、エレクトロポレーション法等）の適用が可能である。また、遺伝子が組込まれた細胞を選別する方法を工夫し、相同遺伝子組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を利用し、特定の遺伝子を狙って改変（置換、欠失、挿入）させた細胞のクローンを得ることもできる。インビトロでこのような処理をした胚性幹細胞株は生殖系列への分化能を保持することから、ある特定の遺伝子の機能を個体レベルで調べる研究が現在盛んに行われている（Ｍ．Ｒ．Ｃａｐｅｃｃｈｉ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８，１９８９）。胚性幹細胞を利用したトランスジェニックマウス作出法は、ある特定の遺伝子のみを任意に改変させた個体を得ることを可能にした点でマイクロインジェクション法によるトランスジェニック動物作出法にはない多くの利点が考えられる。特に、特定の遺伝子を不活化させたノックアウト動物を作出できるようになり、遺伝子の機能を解明したり、外来性の遺伝子のみを発現させることができる。従って、胚性幹細胞の樹立が容易になれば、その効果は図り知れない。このような胚性幹細胞は、受精３．５日目のマウス胚盤胞の内部細胞塊の細胞をインビトロ培養に移し，細胞塊の解離と継代を繰り返すことにより，多分化能を保持し，正常核型を維持したまま無制限に増殖しつづける幹細胞を樹立することに作製することができる。通常、胚性幹細胞の多分化能を維持するには、ＳＴＯ細胞株および／またはマウス胎仔から調製した初代培養繊維芽細胞などのフィーダー細胞層上で胚性幹細胞を培養することが好ましいとされる。
【００２３】
本発明に用いられる「造血幹細胞」とは、造血組織および腸上皮組織などの細胞新生系において細胞生産のもとになる細胞をいう。この造血幹細胞は、自己を保存するとともに、すべての血液系細胞に分化することができる。そのような血液細胞としては、例えば、単球系幹細胞、Ｂリンパ球系幹細胞、Ｔリンパ球系幹細胞、骨髄球系幹細胞、Ｔリンパ系細胞、Ｂリンパ系細胞、血小板系細胞、赤血球系細胞、単球系細胞などを挙げることができる。造血幹細胞は、あらゆる種類の血球に分化する能力を有するとともに造血再構築能を有する細胞であり、主に骨髄、臍帯血、脾臓あるいは肝臓中に存在し、微量ながら末梢血にも存在する。これら造血幹細胞は、通常ＣＤ３４強陽性細胞であり、本発明においては高増殖能コロニー形成細胞（Ｈｉｇｈ−Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｃｏｌｏｎｙ−Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ（ＨＰＰ−ＣＦＣ））もこれに包含される。
【００２４】
本明細書において「前駆細胞」とは、多能性造血幹細胞から各系統の血液細胞が分化形態学的には同定できないがすでに血小板系など一方向の血液細胞にしか分化し得ない細胞を意味する。具体的には血小板コロニー形成細胞（ＣＦＣ−ＭＥＧ）、好酸球コロニー形成細胞（ＥＯ−ＣＦＣ）、顆粒球単球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤血球形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ）、Ｔ前駆細胞、Ｂ前駆細胞などである。これらはいずれもＣＤ３４陽性細胞である。
【００２５】
本明細書において、「血小板前駆細胞」とは、血小板へと分化し得る任意の未分化細胞を総称する用語として使用される。血小板前駆細胞としては、例えば、巨核球およびその前駆細胞（造血幹細胞、胚性幹細胞を含む）、造血幹細胞、胚性幹細胞から誘導された巨核球（例えば、ＯＰ９間質細胞上での培養および二極性血管芽細胞との共培養によって達成され得る）などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００２６】
本明細書において胚性幹細胞から巨核球への誘導は、ＯＰ９間質細胞上での培養および二極性血管芽細胞との共培養によって達成され得るが、ここでは、特に、Ａ）血管芽細胞（ＶＥＧＦタイプ２受容体；Ｆｌｋ−１，ＫＤＲ）かつｃ−ｋｉｔ陽性細胞から分化成熟すること；Ｂ）ＯＰ９ストローマ細胞との物理的な接触が、巨核球への分化成熟に必須であること；およびＣ）血小板産生はＯＰ９ストローマ細胞上においても可能であるが、ＯＰ９との接触を除いた条件にすることで促進されることからなる群より選択されることが重要であり得る。
【００２７】
本明細書において「巨核球」とは、「巨核細胞」とも呼ばれ、巨核芽球（ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔ）から生じる際、核分裂はおこるが核は分離せずに巨大な分葉核を形成する。核は、高倍数性である。細胞質に形成された分画膜（ｄｅｍａｒｃａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）により細胞質が崩壊して放出され、それらの多数の断片は血小板となる．骨髄のほか脾臓の赤髄や胚期の肝臓などにもある。
【００２８】
巨核球の前駆細胞は、骨髄、臍帯血または末梢血のいずれからでも得ることができる。骨髄液および末梢血は正常な供与者から得ることができる。
【００２９】
本明細書において、造血幹細胞は、骨髄液、臍帯血、末梢血などから得た多分化能を有する造血多能性幹細胞、造血コロニーを形成し得る未分化細胞を総称していることから、ＣＤ３４陽性細胞表面抗原を有する造血細胞を含む。末梢血においては、ＣＤ３４陽性細胞の数は全白血球の約０．１％しか構成しない。臍帯血においては、ＣＤ３４陽性細胞は全白血球の約０．１〜１％を構成する。典型的には正常な骨髄は１〜２％のＣＤ３４陽性細胞を含むのみである。白血球は勾配による遠心分離のような標準的な方法によって骨髄または臍帯血または末梢血から分離される。〔Ｇｅｉｇｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔａｂｌｅｓ，Ｖｏｌ ３，Ｃ．Ｌｅｎｔｎｅｒ，ｅｄ．Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９８４）〕。ライト−ギムザ染色法の解析では、骨髄内の 成熟した巨核球は該白血球集団の約０．０５％しか構成していない一方、巨核球系細胞に特異的な免疫染色は、約０．２％まで標識した。健康な個体内では、巨 核球の前駆細胞は該骨髄内で完全に分化するので、前駆細胞は正常な血液中には極く稀にしか発見されない。分離後、白血球は無血清培地において直ちに培養してもよい。好ましくは、造血未分化細胞を、該白血球集団から単離する。造血未分化細胞の単離は、ＣＤ３４陽性に特異的な抗体へのそれらの結合、それに続く磁気ビーズを用いた抗体結合幹細胞の分離に基づくものであってもよい〔Ｈａｒｄｗｉｃｋ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．１，３７９−３８６（１９９２）〕。単離された造血未分化細胞は、５，０００〜５００，０００細胞／ｍｌの密度範囲、好ましくは１０，０００細胞／ｍｌで培養中におかれる。いかなる組織培養フラスコまたはバッグまたは中空糸モジュールまたはフィルターモジュールが、静的または灌流培養システムのいずれにおいても使用し得る〔Ｋｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１１，３５８−３６３，Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｇ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９２／１１３５５〕。静的な培養システムが使用された場合、該細胞は栄養物を補給し、老廃物を除去するために５日〜７日の間隔で培地を供給される。細胞は７〜１４日、より好ましくは９〜１２日間培養される。この時間において、該細胞懸濁液は血小板減少症の治療において使用されるに適した巨核球前駆細胞の集団を含む。
【００３０】
フローサイトメーター分析が細胞表面抗原による標識に基づいて細胞表現型を決定するために行われた。ＣＤ３４陽性細胞は、造血未分化細胞を示し、ＣＤ６１（インテグリンβ３）陽性細胞は、巨核球系細胞を示す〔ＣＤ分類ハンドブック、癌と化学療法社〕。フローサイトメーターによる分析によれば、成熟した巨核球は、細胞質の増大、多核化を呈することから容易に成熟度を解析することが可能である。造血未分化細胞の主たる形質は、ＣＤ３４陽性ＣＤ６１陰性である。造血未分化細胞は、本発明により処理することにより効率的にＣＤ３４陽性ＣＤ６１陽性の巨核球前駆細胞への分化を促進し、さらにＣＤ３４陰性ＣＤ６１陽性の未成熟巨核球系細胞が増幅し得る。ＦＬＴ３リガンドおよび巨核球増殖因子により巨核球前駆細胞への分化を促進し、幹細胞因子と巨核球増殖因子により該巨核球前駆細胞の増殖を促進して、未成熟な巨核球が増幅される。
【００３１】
本発明により生産される細胞懸濁液は、多種の血液細胞の前駆細胞を含むと共に、巨核球前駆細胞、未熟な巨核球を含むが、さらに多種の造血因子を含めて培養することで、必要とされる巨核球系の細胞への分化が促進される。
【００３２】
本発明の巨核球前駆細胞の濃縮された細胞懸濁液は、癌治療によって生じたものに加え、さまざまなタイプの血小板減少症に効果的な治療を可能にする。このた め、ここに与えられる細胞懸濁液は、血小板減少症の治療において血小板注入に置き換わる可能性も示唆するものである。該上記の細胞集団は、化学療法等の後 の患者に投与された場合、該投与された細胞は、最終的に血小板を生成する巨核球を生成するためにｉｎ ｖｉｖｏでさらに分化することが期待される。さらにフィブリン凝塊アッセイの中においた時、該巨核球前駆細胞は成熟した巨核球を形成しそして血小板を放出 することが観察される。これらのアッセイからの結果は、該無血清培養からの細胞はそれらがｉｎ ｖｉｖｏの条件に帰された後でもさらなる成熟をすることができることを示唆する。
【００３３】
本明細書において、「ＣＤ抗原」とは、哺乳動物の細胞表面上、好ましくはヒト血球細胞上に存在する分化抗原の表現型を意味する。通常、この種の抗原はＣＤの番号をもっ て分類される。ＣＤはｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎの略で、モノクローナル抗体によって認識される抗原の一かたまり（ｃｌｕｓｔｅｒ）を意味する。具体的にはＣＤ３４、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８などを挙げることができる。他にもＴｈｙ−１、ＨＬＡ−ＤＲなどを挙げることができる。
【００３４】
本明細書において「サイトカイン」とは、細胞から放出され、細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子で、免疫応答の制御作用、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖・分化の調節作用などを示す物質であって、具体的にはインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ−１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１６（ＩＬ−１６）、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、好酸球コロニー刺激因子、血小板コロニー刺激因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞増殖因子、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３−リガンド、白血病阻害（阻止）因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、マクロファージ由来炎症性タンパク１α（ＭＩＰ−１α）などが挙げられ、好ましくはインターロイキン−３、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３−リガンド、ＭＩＰ−１αまたはエリスロポエチンなどが挙げられる。
【００３５】
本明細書において使用される造血因子として使用され得るサイトカインとしては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ），インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、巨核球増殖因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＬＴ３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３結合タンパク質などが示される。巨核球増殖因子は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）として知られ、生体内において巨核球を増殖する因子として報告されている〔Ｗｅｎｄｌｉｎｇ，Ｆ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９、５７１（１９９４）、寺村正尚，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ 血液，（１９９６）〕。また、該巨核球増殖因子は、Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社（ＵＳＡ）などから市販されている。ＦＬＴ３リガンドは、ＦＬＫ２リガンドと同一分子であり、遺伝子がクローニングされ、造血未分化細胞への作 用が報告される〔Ｌｙｍａｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｂｌｏｏｄ，８３，２７９５（１９９４）、岩間厚志，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ 血液，１２−３２（１９９５））。幹細胞因子は、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）としてＺｓｅｂｏらにより報告（Ｃｅｌｌ，６３，１９５−２０１（１９９０））された。この分子は、チロシンキナーゼｃ−ｋｉｔのリガンドであるＫＬ（Ｈｕａｎ，Ｅ．、Ｃｅｌｌ６３、２２５−２３３）、肥満細胞増殖因子ＭＧＦ（Ｍａｓｔ ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｅ．、Ｃｅｌｌ、６３、１６７−１７４（１９９０）〕と同一の分子であり、造血未分化細胞への作用が報告される〔下坂、実験医学増刊「サイトカインと情報伝達」，１８５，（１９９２）〕。またこれらの因子は、通常１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌで使用し得るが、好ましくは、１０から１００ｎｇ／ｍｌで使用し得る。
特に、造血幹細胞の培養において、分化を最大限に抑制して、自己増殖を促進するためには、ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−６を添加して用いることが好ましい。そのときの添加量は、ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯについては、１〜２０ ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、ＩＬ−６については、５０〜２００ ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００３６】
本発明においては、その他の成分をさらに含むことができる。このような成分としては、特に制限は無いが、例えば、可溶性サイトカイン受容体タンパク質が挙げられる。可溶性サイトカイン受容体タンパク質は、培養する造血幹細胞に対し、未分化維持を増強するといった作用をする。
【００３７】
このような可溶性サイトカイン受容体タンパク質としては、具体的には、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）を用いることが好ましい。そのとき、培地への添加量が、１００〜１０００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。このような可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）は、前述のサイトカインであるＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−６とともに用いることが好ましい。ＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒが複合体を形成し、これらがＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯによる造血幹細胞の未分化維持作用を増強するからである。
【００３８】
本明細書において「細胞株」とは、初代培養以後の培養細胞をすべて指し、初代培養に存在した細胞または細胞群からの一連の系統を意味する。この培養細胞は初代細胞と共存していてもよいし、互いに触れ合っている状態で存在してもよいし、あるいは水、電解質などの液体、培地、培養液等の媒介物を介した状態で存在してもよい。
【００３９】
造血幹細胞は、分化して造血前駆細胞となり、さらに分化して前述の分化細胞となる。造血幹細胞も造血前駆細胞もいずれも多能性を有するものであるが、分化細胞は多能性を有しない。本来、造血幹細胞と造血前駆細胞は区別されるべきものであるが、概念上の定義であることもあり、しばしば区別せずに用いられる。本発明においても、造血幹細胞と造血前駆細胞の両方を併せて「造血幹細胞」という用語で標記している。用語の定義については、例えば「血液幹細胞の運命（羊土社）須田年生著」に詳しい記載がある。
【００４０】
本明細書において「ＣＤ３４陽性細胞」とは、抗原表現型の一つであるＣＤ３４を発現している細胞を意味し、具体的には多能性造血幹細胞、ＨＰＰ−ＣＦＣ等の造血幹細胞、リンパ球系幹細胞、骨髄系幹細胞等の幹細胞、Ｔ前駆細胞、Ｂ前駆細胞、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＭＥＧ、ＥＯ−ＣＦＣ、ＣＦＵ−ＧＭ等の前駆細胞が これに該当する。
【００４１】
本明細書において「ＣＤ３４強陽性細胞」とは、抗原表現型の一つであるＣＤ３４を特に強く発現している細胞を意味し、具体的には高増 殖能コロニー形成細胞（Ｈｉｇｈ−Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｃｏｌｏｎｙ−Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ （ＨＰＰ−ＣＦＣ））または多能性造血幹細胞それ自体、またはこれら細胞をより多く含んでいるＣＤ３４陽性細胞群を意味する。
【００４２】
本明細書において「ＣＤ３４陰性細胞」とは、抗原表現型の一つであるＣＤ３４を発現していない機能細胞を意味し、具体的にはＴ細胞を含むＴ前駆細胞以後のＴ細胞系列の細胞、Ｂ細胞を含むＢ前駆細胞以後のＢ細胞系列の細胞、赤血球を含むＣＦＵ−Ｅ以後の赤血球系列の細胞、血小板を含むＣＦＣ−ＭＥＧ以後の血小板系列の細胞、好酸球を含むＥＯ−ＣＦＣ以後の好酸球系列の細胞または単球、好中球もしくは好塩基球を含むＣＦＵ−ＧＭ以後の単球、好中球もしくは好塩基球系列の細胞である。本願において使用される、上述のような「陽性」、「強陽性」、「弱陽性」、および「陰性」なる用語は、場合によっては、各々単に「＋」（プラス）、「ｈｉｇｈ＋」、「ｌｏｗ」および「−」（マイナス）と表記される。例えば、「ＣＤ３４ｈｉｇｈ＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−」とは、ＣＤ３４を強く発現しており（強陽性）、かつＣＤ３８を弱く発現しているか若しくは発現していない（弱陽性または陰性）ことを意味する。
【００４３】
本明細書において「ストローマ細胞」とは、骨髄、脾臓などに由来する基質細胞または間質細胞を指し、本願発明においては、ヒトのＣＤ３４陽性細胞を増殖する能力を有するストローマ細胞であれば、どのようなストローマ細胞も用いることができる。例えば、ＨＥＳＳ−１、ＨＥＳＳ−５（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５７６８）、ＨＥＳＳ−１８（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８７）、ＨＥＳＳ−Ｍ２８（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８６）、ＳＳＸＬ ＣＬ．１、ＳＳＸＬ ＣＬ３、ＳＳＸＬ ＣＬ．７、ＳＳＸＬ ＣＬ．９およびＳＳＸＬ ＣＬ．１７と各々命名されたマウス由来のストローマ細胞が例示される。好ましくは、ＨＥＳＳ−５（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５７６８）、ＨＥＳＳ−１８（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８７）、ＨＥＳＳ−Ｍ２８（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８６）、またはＳＳＸＬ ＣＬ３であり、特に好ましくは、ＨＥＳＳ−５（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５７６８）、ＨＥＳＳ−１８（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８７）、ＨＥＳＳ−Ｍ２８（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８６）である。
【００４４】
造血幹細胞は、主として骨髄中に多く存在することが知られており、骨髄移植は、急性白血病をはじめとする腫瘍性血液疾患や、重症免疫不全、アデノシンデアミナーゼ欠損症、再生不良性貧血等の疾患に対する治療法として、中心的位置を占めている。近年、造血幹細胞が少量ながら末梢血にも存在することが明らかになった。そのため、造血幹細胞を含む末梢血に顆粒球コロニー刺激因子製剤（Ｇ−ＣＳＦ）を投与したものを用いた移植も普及しつつある（新しい造血幹細胞移植、南江堂、１９９８）。この方法は、骨髄移植が大量の骨髄細胞を必要とするためドナーの心身への負担が大きいのに対して、ドナーに対して心身への負担が軽減され、また白血球や血小板の回復が早いという利点がある。しかし、比較的高用量のＧ−ＣＳＦによる副作用もしばしば見られるため、骨髄採取よりは簡便であるが、決してドナーの安全性が高いとは言い切れない（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３，１０１−１０４，１９９７）。
【００４５】
また近年、臍帯血が骨髄と同程度の造血幹細胞を含むことが明らかにされ、移植治療に有用であることが明らかにされた（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２１，１１７４−１１７８，１９８９）。臍帯血は、骨髄や末梢血と比べて重症の急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生率が低く、その有用性が期待されている。しかしながら臍帯血の場合、採取量の少なさが問題とされ、１個体に由来する臍帯血の量では、体重４０ｋｇ程度までのレシピエントにのみ移植可能であることが問題である。（Ｂｌｏｏｄ，８７，３０８２，１９９６）。
【００４６】
本明細書において造血幹細胞は、ＣＤ３４陽性の細胞集団として濃縮することができる。しかも不要な細胞、具体的には、骨髄球系細胞には分化しないリンパ球系細胞等を除去できる可能性があることから（Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ａｎｎ．，２，７８，１９９４）、今日では、ＣＤ３４陽性細胞移植が行われるようになった（Ｂｌｏｏｄ，７７，１７１７，１９９１；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２，２８，１９９４）。このため、前記のとおり造血幹細胞を多く含む臍帯血の採取量が少ないという問題を解決すべく、造血幹細胞を生体外で効率的に増幅する試みは近年盛んに行われている（Ｂｌｏｏｄ，８７，３０８２−３０８８，１９９６）。ここで、造血幹細胞の増幅とは、造血幹細胞が分化により、多能性を有しない分化細胞に分化し、増殖していくことと、造血幹細胞の自己増殖との両方を含む意味で用いられる。
【００４７】
本明細書において、これまでに報告されたＣＤ３４陽性細胞の増幅においては、増殖を促進する物質として、サイトカインが用いられてきた。サイトカインの候補としては幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン１（ＩＬ−１β）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、顆粒球・マクロファージコロニー形成因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー形成因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー形成因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（ＰＩＸＹ３２１）などの種々のサイトカインを組み合わせた増幅法が研究されている。しかし、サイトカインの組み合わせによるＣＤ３４陽性細胞の増幅では、培養後の全血球細胞数は増加するものの、培養中に造血幹細胞の分化が誘導され、結果的には最終分化したＣＤ３４陰性の血球細胞が増加する一方で、ＣＤ３４陽性細胞自体はほとんど枯渇されてしまうと考えられている（Ｂｌｏｏｄ，８７，３０８２−３０８８，１９９６）。現時点では造血幹細胞を未分化の状態に維持したまま自己増殖を促進することが可能なサイトカインは単離されていない。
【００４８】
本発明において使用され得る、ＣＤ３４陽性細胞の他の増幅方法として、ヒト骨髄由来のストローマ細胞を株化し、この上で造血幹細胞・前駆細胞を維持・増殖させる方法が試みられている（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２２，４８２−４８７（１９９４））。また、特開平１０−２９５３６９号公報には、哺乳動物由来のストローマ細胞とＣＤ３４陽性細胞を、共培養することによりＣＤ３４陽性造血幹細胞を製造する方法が開示されている。しかし、この方法では、ＣＤ３４陽性細胞が分化していくために造血幹細胞自体はほとんど増幅しないか、むしろ最初の時点より減少してしまう。そのため、移植してもやがては血球細胞が枯渇するおそれがあり、移植のための技術としては不適当である。
【００４９】
本発明において使用され得る、さらに別の方法として、培養するＣＤ３４陽性細胞とストローマ細胞との接触がなくても、ストローマ細胞から産生される液性因子のみでＣＤ３４陽性細胞を培養することにより、ＣＤ３４陽性細胞を増幅することができるとの報告もある（国際特許出願公開第９３／２０１８４号公報）。しかし、この方法においても造血幹細胞は分化するのみで自己増殖しないために、上記方法と同様の理由で移植のための技術としては不適合である。
【００５０】
さらに別の局面においては、本発明は、細胞培養キットであって、前述の細胞培養器材のいずれかと、栄養培地と、サイトカインとを含み、ヒト由来のＣＤ３４陽性細胞を哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞と共に培養するために使用されるものである。
サイトカインとしては、ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−６を用いることが好ましく、これに加え、可溶性サイトカイン受容体タンパク質である可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）を加えることがさらに好ましい。栄養培地は、通常、細胞を培養するのに必要な栄養培地を用いることができる。
【００５１】
本明細書において使用され得る「培地」または「栄養培地」とは、天然培地、半合成培地、合成培地、固形培地、半固形培地、液体培地などが挙げられるが、前述に定義されるＣＤ３４陽性細胞を、自己を 含めた増殖、分化、成熟または保存させるために用いられるものであり、通常、細胞培養に用いられるようなものであれば如何なる培地であってもよい。例を挙げると、たとえばα−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地またはＭＥＭ基本培地などが挙げることができる。基本成分としてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有することもできる。
【００５２】
本発明において使用され得る培養容器は、所望の細胞が維持・生存でき、刺激に応じて分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる素材、形状のものを用いてもよい。具体的には培養容器の素材としてはガラス、合成樹脂、天然樹脂、金属、プラスチックなどが挙げられ、形状としては具体的には三角柱、立方体、直方体などの多角柱、三角錐、四角錐などの多角錘、ひょうたんのような任意の形状、球形、半球形、円柱（底面が円形、楕円形または半円形等を含む）などを挙げることができ、また例えば半球形から球形のように培養中に必要に応じて形状を変化させてもよい。培養は開放条件下であってもよいし、閉鎖（密閉）条件下であってもよい。
【００５３】
このような栄養培地としては、細胞培養に用いられるようなものであれば如何なる栄養培地を用いてもよく、栄養培地の種類としては、天然培地、半合成培地、合成培地、固形培地、半固形培地、液体培地などが挙げられる。具体的には、α−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地またはＭＥＭ基本培地などを挙げることができる。
【００５４】
培養するにあたり、温度、浸透圧、光などの物理的環境条件、酸素、炭酸ガス、ｐＨ、酸化還元電位などの化学的環境条件としては死滅処理前のストローマ細胞が維持・生存でき、ＣＤ３４陽性細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる環境条件であってもよい。好ましい条件を以下に示す。
【００５５】
温度については具体的には、３０℃〜４０℃であり、好ましくは３７℃である。浸透圧については具体的には生理条件における浸透圧であり、好ましくは生理食塩水と等しい浸透圧である。
【００５６】
光は暗室ほどの暗い条件であってもよいし、晴天時の外の明るさほどに明るくてもよい。
【００５７】
酸素濃度としては具体的には培養系が気相中の酸素濃度が１０％の気相と接触している状態での溶存酸素濃度〜気相中の酸素濃度が３０％の気相と接触している状態での酸素濃度であってもよく、好ましくは気相中の酸素濃度が２０％の気相と接触している状態での溶存酸素濃度の気相と接触している状態での酸素濃度である。
【００５８】
培養系において一般的にｐＨをコントロールするためのｐＨとして具体的にはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０であり、好ましくは生理条件と同等のｐＨである。ｐＨをコントロールする為には二酸化炭素を用いてもよいし、他のいかなる緩衝液を用いてもよい。炭酸ガスの濃度としては具体的には培養系が５％の気相と接触している状態での溶存炭酸ガス濃度である。
【００５９】
（Ｌｎｋ）
本明細書において、Ｌｎｋとは、ＳＣＦの受容体ｃ−Ｋｉｔのキナーゼドメインに結合するタンパク質をいう。Ｌｎｋ 欠損により生じるＢ細胞過剰産生の分子機構を明らかにし，さらに Ｌｎｋ が造血幹細胞の増殖およびその機能制御に深く関与していることは明らかになっているが、血小板産生に関わるかどうかは明らかではなかった。
【００６０】
そのようなＬｎｋ遺伝子としては、例えば、
（Ａ）（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含む、
核酸分子；あるいは
（Ｂ）（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
を含む、
ポリペプチドをコードする核酸分子、あるいはそれがコードするポリペプチドが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６１】
マウスLnk
ヌクレオチド配列
atgaacgagcccaccgtgcagccgtcccgcacatcctccgcacccgcctcgccggcatccccacgcggctggagcgacttctgcgagcagcacgcagcagcggcggcccgggagctggcccgccagtactggttgtttgcgcgcgcgcacccacagccgccgcgcgcggacctggtgtcgctgcagttcgcggagctcttccagcgccacttctgccgggaggtgcgcgagagcctcgcaggaccgccgggtcacgactaccgcgccactgctccgccccgccccgcgctgcccaaggcacgcagctccgaggacctgggcccgcggcccgcctgtgccctgcagcacctgcgccgcggcctgcgccagctcttccgccgccgctcggcaggggagctgcccggggctaccagtgacaccaatgacatcgacaccaccgcagccagcaggccgggcccggcccgcaagttgctaccctggggcctgcgagagccgcccactgaggcgctcaaggaggtcgtattgcgctatagcctggcggacgaggcagcaatggacagcggcgcacgctggcagcggggtcgcctggtgcttcggtctccaggtccgggccacagccactttctgcagctcttcgatccgcccaagagctcaaagcccaagctccaagaggcctgttccagcatccgggaggtccgaccatgtacacgcctggagatgcctgacaacctctacacctttgtgttgaaggtgcaggaccagacagacatcatctttgaggtgggagatgaacagcagctgaactcatggctggcagagctcagggcaagcacaggccttgggctggagcacccggacaccgagttacctctttccttagcggcagagcctggcccagctagatccccaaggggaagcactgactccctggaccaaggtgcttcacctggggtgttgctggacccagcctgccagaaaacagatcacttcctatcctgctacccctggttccacggccccatctccagggtgagggctgcacagctggtccagctccagggccctgatgcccacggcgtgttcctggtgcggcagagtgagtcccggagaggagagtatgtactcacattcaacttacagggcagagccaagcacttacgcctggtgctcacagagcgtggacagtgccgggtgcaacacctgcacttcccctcggtggtagatatgctccgccacttccagcgttctcctatcccactggaatgtggagcagcttgtgacgtccgactctctggctatgtggtagtcctctctcaggcaccaggttcctccaacaccgtcctcttccctttttcccttcctcactgggattcggagctgggtcatccccacctcagctctgttggctgtccccccagccatggtgcagaggctctccctggccaagtgacaccacctgagcagatcttccacctggtgccttctcctgaggaactggccaacagtctgcggcagctggagctcgagtctgtgagcagtgcccgggactcggactatgacatggactcctcttcacggggccaccttcgggccattgacaaccagtacacccctctctcacagctgtgcagagaggcagacgtg（配列番号１）
アミノ酸配列
MNEPTVQPSRTSSAPASPASPRGWSDFCEQHAAAAARELARQYWLFARAHPQPPRADLVSLQFAELFQRHFCREVRESLAGPPGHDYRATAPPRPALPKARSSEDLGPRPACALQHLRRGLRQLFRRRSAGELPGATSDTNDIDTTAASRPGPARKLLPWGLREPPTEALKEVVLRYSLADEAAMDSGARWQRGRLVLRSPGPGHSHFLQLFDPPKSSKPKLQEACSSIREVRPCTRLEMPDNLYTFVLKVQDQTDIIFEVGDEQQLNSWLAELRASTGLGLEHPDTELPLSLAAEPGPARSPRGSTDSLDQGASPGVLLDPACQKTDHFLSCYPWFHGPISRVRAAQLVQLQGPDAHGVFLVRQSESRRGEYVLTFNLQGRAKHLRLVLTERGQCRVQHLHFPSVVDMLRHFQRSPIPLECGAACDVRLSGYVVVLSQAPGSSNTVLFPFSLPHWDSELGHPHLSSVGCPPSHGAEALPGQVTPPEQIFHLVPSPEELANSLRQLELESVSSARDSDYDMDSSSRGHLRAIDNQYTPLSQLCREADV（配列番号２）。
【００６２】
リンパ系組織に発現するアダプター蛋白質でもある Ｌｎｋ およびそのファミリー蛋白質群に着目して解析している（医科研Ｎｏｗ，ｖｏｌ．１７，Ｐ４−５，１９９１）。Ｌｎｋは主にリンパ組織で発現されるＳＨ２ドメインを持つアダプター蛋白質である。Ｌｎｋ欠損マウスではＴ細胞分化に異常はないものの、脾臓での幼若Ｂ細胞の蓄積、ＳＣＦ反応性亢進による骨髄Ｂ前駆細胞の過剰産生が観察され、Ｌｎｋ がＢ 細胞の産生を制御していることがわかった。またＬｎｋ はＰＨ ドメインも持つ６８ ｋＤａ の蛋白質であることを明らかにしている（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：５９９，２０００）。Ｌｎｋはシグナル伝達の抑制分子として働くアダプター蛋白質ファミリーの一員と考えられる。
【００６３】
Ｌｎｋはｃ−Ｋｉｔシグナル伝達系を制御しＢ細胞産生の恒常性維持に重要な働きを持つこと、Ｌｎｋ 欠損マウスではｃ−ｋｉｔ を介する増殖シグナルが増強されていることが示された。Ｌｎｋ 遺伝子の過剰発現は前駆Ｂ細胞のみならずＢ細胞系列の増殖や分化の抑制、Ｔ細胞の分化の抑制も惹起する（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２８５０，２００３）。Ｌｎｋ は造血前駆細胞にも発現しており、その欠損により造血前駆細胞の増殖および造血能が著しく亢進する（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９５：１５１，２００２）。Ｌｎｋはｃ−Ｋｉｔ活性化によるＧａｂ２ のリン酸化、ＭＡＰＫの活性化を抑制する。これらの知見は造血前駆細胞の増殖・分化機構の理解および制御法開発に大きく貢献すると期待している。最近、Ｌｎｋ欠損マウスで造血幹細胞の比率が著明に増加していることが分かったので、造血幹細胞の増殖を負に調節するＬｎｋの研究インパクトは大きく拡がると考えている。Ｌｎｋの作用を阻害する変異体の作製にも成功しており、Ｌｎｋ機能の遮断により造血幹細胞の機能制御に応用できる可能性が示されている（図１２）。
【００６４】
Ｌｎｋファミリーアダプター蛋白質に属するＡＰＳの遺伝子欠損マウスはリンパ球や顆粒球にＬｎｋとは異なる異常が観察されている（未発表）。ＳＨ２−Ｂ欠損マウスはリンパ球の分化には異常が認められないものの、生殖細胞の分化に異常が観察されている（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２２：３０６６，２００２）。このように、Ｌｎｋファミリーアダプター蛋白質の研究は幹細胞や前駆Ｂ細胞の発生・増殖制御の研究に新しい機構解明に役立つ。
【００６５】
本明細書において「Ｌｎｋの産物レベルによる阻害」とは、Ｌｎｋの遺伝子産物であるタンパク質またはその翻訳後修飾物（例えば、糖タンパク質）の活性または量が減少することによってその発揮される機能が減少または無くなることをいう。そのような阻害には、機能しない改変体が天然物に置き換わって発現することも包含される。あるいは、Ｌｎｋの抗体による阻害により、そのような阻害が実現され得る。
【００６６】
本明細書において「因子」としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）であってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６７】
本明細書において「Ｌｎｋファミリーメンバーの阻害因子（インヒビター）」とは、Ｌｎｋファミリーの任意のメンバーを阻害することができる任意の因子をいう。そのような因子としては、例えば、Ｌｎｋファミリーの任意のメンバーの本来の機能を失った改変体のうち天然物と複合体を形成し天然物の働きを阻害する改変体、Ｌｎｋに対する抗体、Ｌｎｋに結合するタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子、これらの複合分子が挙げられる。また、Ｌｎｋファミリーの任意のメンバーの遺伝子発現を阻害するタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子、これらの複合分子を挙げることができる。
【００６８】
Ｌｎｋインヒビターであるかどうかは、以下の試験手法により確認することができる。ＳＣＦ依存性に増殖する細胞株に遺伝子導入によりＬｎｋを過剰発現させる。このＬｎｋ過剰発現によりＳＣＦ依存性増殖ができなくなった遺伝子導入細胞株に発現あるいは作用させて、ＳＣＦ依存性増殖の回復を指標としてＬｎｋインヒビターとしての作用を確認する。ＳＣＦ依存性に増殖する細胞株の代わりにＴＰＯ依存性に増殖する細胞株およびＥＰＯ依存性に増殖する細胞株を用いることもできる。
【００６９】
また、Ｌｎｋの発現を低下させるものかどうかについては、内因性にＬｎｋを発現しているＥＳ細胞に作用させ、Ｌｎｋの発現低下が生じるかどうかをウェスタンブロット法により検討する。
【００７０】
細胞内局在に影響を与えるかどうかについては、蛍光蛋白質とＬｎｋのキメラ蛋白質を遺伝子導入により発現させた線維芽細胞株に作用させ、Ｌｎｋの細胞内局在を蛍光顕微鏡により観察して検討する。
【００７１】
本明細書において「幹細胞因子（ＳＣＦ）」（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒまたはｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦともいう）は、造血幹細胞では注目されている因子である。ＳＣＦの代表例は、配列番号５（核酸配列）および配列番号６（アミノ酸配列）によって示される配列を有する。
【００７２】
ＳＣＦは、骨髄ストローマ細胞により生成され、多能性幹細胞、ＣＦＵ−ＧＭのＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−Ｍｅｇなどの骨髄系細胞、リンパ系幹細胞に作用し、これらの分化を支持する。すなわち造血幹細胞から分化細胞へのほぼすべての系統の分化段階の細胞に作用して、他のサイトカインによる最終分化段階への分化誘導する作用を助けるとされる（北村聖（Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ）、サイトカインの最前線、羊土社、平野俊夫（Ｔ．Ｈｉｒａｎｏ）編、１７４頁〜１８７頁、２０００）。しかし、ＳＣＦ単独の作用は弱く、他の因子と協働でなければ充分に機能しないようである。例えば、ＳＣＦは、インターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などの他のサイトカインの存在下で、造血幹細胞の分化・増殖を強く誘導する。また、肥満細胞、赤芽球系前駆細胞、顆粒球マクロファージ系前駆細胞、巨核球系前駆細胞などの分化・増殖も誘導する。
【００７３】
従って、ＳＣＦは分化そのものを制御するというよりは、多くの種類の造血系細胞の生存を支持しながら、種々のサイトカインに対する反応性を高めると位置づけることができる。
【００７４】
（遺伝子工学）
本発明において用いられるＬｎｋなどならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産および導入することができる。
【００７５】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドであり得る。
【００７６】
本明細書において「ウイルスベクター」とは、ベクターのうち、ウイルス由来のものをいう。本明細書において「ウイルス」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをゲノムとして有する、感染細胞内だけで増殖する感染性の微小構造体をいう。ウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科およびヘパドナウイルス科からなる群より選択される科に属するウイルスが挙げられる。本明細書において「レトロウイルス」とは、ＲＮＡの形で遺伝情報を有し、逆転写酵素によってＲＮＡの情報からＤＮＡを合成するウイルスをいう。
【００７７】
本明細書において「レトロウイルスベクター」とは、レトロウイルスを遺伝子の担い手（ベクター）として使用した形態をいう。本発明において使用される「レトロウイルスベクター」としては、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）、Ｍｕｒｉｎｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｖｉｒｕｓ（ＭＳＣＶ）にもとづいたレトロウイルス型発現ベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、レトロウイルスベクターとしては、ｐＧｅｎ−、ｐＭＳＣＶなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７８】
本明細書において「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。ヒトの場合、本発明に用いる発現ベクターはさらにｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ Ｈ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ；１０８：１９３−９（１９９１））を含み得る。
【００７９】
本発明は、任意の動物において利用され得る。そのような動物における利用のための技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
【００８０】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、動物細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。
【００８１】
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。
【００８２】
このようなスクリーニングまたは同定の方法は、当該分野において周知であり、例えば、そのようなスクリーニングまたは同定は、マイクロタイタープレート、ＤＮＡまたはプロテインなどの生体分子アレイまたはチップを用いて行うことができる。スクリーニングの試験因子を含む対象としては、例えば、遺伝子のライブラリー、コンビナトリアルライブラリーで合成した化合物ライブラリーなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８３】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、疾患または障害の調節因子を同定する方法を提供する。このような調節因子は、それぞれの疾患の医薬またはそのリード化合物として用いることができる。そのような調節因子ならびにその調節因子を含む医薬およびそれを利用する治療法もまた、本発明の範囲内にあることが意図される。
【００８４】
したがって、本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。
【００８５】
本発明は、他の実施形態において、本発明の化合物に対する調節活性についての有効性のスクリーニングの道具として、コンピュータによる定量的構造活性相関（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ＝ＱＳＡＲ）モデル化技術を使用して得られる化合物を包含する。ここで、コンピューター技術は、いくつかのコンピュータによって作成した基質鋳型、ファーマコフォア、ならびに本発明の活性部位の相同モデルの作製などを包含する。一般に、インビトロで得られたデータから、ある物質に対する相互作用物質の通常の特性基をモデル化することに対する方法は、最近ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭ ファーマコフォア法（Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：４７７〜４８９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８８：２１〜２９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９０：４２９〜４３８，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９１：４２４〜４３３，１９９９）および比較分子電界分析（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｉｅｌｄ ａｎａｌｙｓｉｓ；ＣｏＭＦＡ）（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ＆ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，２４：１〜６，１９９６）などを使用して示されている。本発明において、コンピュータモデリングは、分子モデル化ソフトウェア（例えば、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭバージョン４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）など）を使用して行われ得る。
【００８６】
活性部位に対する化合物のフィッティングは、当該分野で公知の種々のコンピュータモデリング技術のいずれかを使用してで行うことができる。視覚による検査および活性部位に対する化合物のマニュアルによる操作は、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，１９９２）、ＳＹＢＹＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，１９９２）、ＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６：７６５−７８４，１９８４）、ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，４：１８７〜２１７，１９８３）などのようなプログラムを使用して行うことができる。これに加え、ＣＨＡＲＭＭ、ＡＭＢＥＲなどのような標準的な力の場を使用してエネルギーの最小化を行うこともできる。他のさらに特殊化されたコンピュータモデリングは、ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８：８４９〜８５７，１９８５）、ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：２９〜３４，１９９１）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ ａｎｄ Ｏｌｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓ ｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：１９５〜２０２，１９９０）、ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１：２６９〜２８８，（１９８２））などを含む。さらなる構造の化合物は、空白の活性部位、既知の低分子化合物における活性部位などに、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６：６１〜７８，１９９２）、ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ ａｎｄ Ｉｔａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７：８９８５，１９９１）、ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などのようなコンピュータープログラムを使用して新規に構築することもできる。このようなモデリングは、当該分野において周知慣用されており、当業者は、本明細書の開示に従って、適宜本発明の範囲に入る化合物（例えば、所望の校正機能を付与する化合物など）を設計することができる。
【００８７】
本発明のスクリーニング方法によって使用される因子は、血小板分化の調節、同定、濃縮または増殖に使用され得る。
【００８８】
（遺伝子発現抑制）
本明細書においてドミナントネガティブ法とは、発現すると変異型の表現型（特に、もとの遺伝子の抑制型）になることになることをいう。例えば、転写因子の代わりに、抑制因子に機能変換した転写因子を用いると、機能重複する転写因子に優先して標的遺伝子の発現を抑制し、ドミナントネガティブ型の表現型をもたらす。ドミナントネガティブ技術においてリプレッションドメイン（例えば、アミノ酸配列LDLELRLGFA）を用いることによって、目的とする核酸分子の転写を抑制することができる。ドミナントネガティブ法は、実施例に記載されているような手法を用いることができる。
【００８９】
本明細書において「ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）」とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）によって配列特異的にｍＲＮＡが分解されることによって、タンパク質への翻訳が阻害され、遺伝子発現が抑制される現象をいう。ＲＮＡｉの利点の一つとして、弱いものから強いものまで様々なレベルの発現抑制が個々の遺伝子によって取得され得ること挙げられる。現在、ＲＮＡｉは、簡便かつ有効な遺伝子発現抑制法として利用されている。好ましい実施形態において、「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書においてＲＮＡｉはまた、場合によっては、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。
【００９０】
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【００９１】
理論に束縛されないが、ＲＮＡｉが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡｉを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にＲＮＡｉによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したｓｉＲＮＡを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡそのものをＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。
【００９２】
また、理論に束縛されることを希望しないが、ｓｉＲＮＡは、上記経路とは別に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子が有用であることが理解される。
【００９３】
本発明においてｓｉＲＮＡと呼ばれる、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患（例えば、血小板減少に伴う出血性疾患全般（例；抗ガン剤治療時の血小板減少症、本態性血小板減少症、など））の治療、予防、予後などに使用することができる。
【００９４】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態を採っていてもよい。
【００９５】
別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ；ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）であり得る。本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなｓｈＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【００９６】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
【００９７】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてＲＮＡｉが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【００９８】
本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子としてはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明の処置方法および組成物において有用である。
【００９９】
本明細書において「アンチセンス（活性）」とは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制または低減することができる活性をいう。アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列を有する分子を本明細書において「アンチセンス分子」、「アンチセンス核酸分子」または「アンチセンス核酸」と称し、これらは互換的に使用される。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、もっとも好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の５’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、１つまたは数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有するものもまた含まれる。本明細書中で開示される核酸配列（例えば、配列番号１または３）が与えられれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋ塩基対形成の法則またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成の法則に従い設計され得る。アンチセンス核酸分子は、シグナル伝達因子のｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学合成または酵素的連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはその分子の生物学的安定性を増加させるかもしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成された二本鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々の改変ヌクレオチドを用いて（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る）化学合成され得る。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例として、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１００】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
【０１０１】
プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
【０１０２】
（投与・注入・医薬）
本発明の因子によって調製された細胞（例えば、幹細胞、それから分化した細胞（例えば、血小板））または細胞組成物は、生物への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。投与経路としては経口投与、非経口投与、患部への直接投与などが挙げられる。
【０１０３】
注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法も使用され得る。
【０１０４】
１つの実施形態において、本発明の因子（例えば、Ｌｎｋインヒビターなど）は、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。
【０１０５】
本発明の組成物またはキットはまた、さらに生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、グリコール酸・乳酸の共重合体、エチレンビニル酢酸共重合体、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレートからなる群より選択される少なくとも１つを含み得る。成型が容易であることからシリコーンが好ましい。生分解性高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、α−ヒロドキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸など）およびヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸など）からなる群より選択される１種以上から無触媒脱水重縮合により合成された重合体、共重合体またはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸など）、無水マレイン酸系共重合体（例えば、スチレン−マレイン酸共重合体など）のポリ酸無水物などが挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよく、α−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−体、Ｌ−体、ＤＬ−体のいずれでも用いることが可能である。好ましくは、グリコール酸・乳酸の共重合体が使用され得る。
【０１０６】
核酸分子を含む本発明の組成物を投与する場合、核酸分子は、非ウイルスベクター形態またはウイルスベクター形態による投与、またはｎａｋｅｄ ＤＮＡでの直接投与の形態などで投与され得る。このような投与形態は、当該分野において周知であり、例えば、別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社、１９９６；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに詳説されている。
【０１０７】
特定の実施形態において、本発明の正常な遺伝子の核酸配列、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０１０８】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。
【０１０９】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０１１０】
非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクチン法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などが利用され得る。発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ １０８：１９３−９、Ｎｉｗａ Ｈ，Ｙａｍａｍｕｒａ Ｋ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｊ（１９９１））、ｐＢＪ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅなどから入手可能である）などが挙げられる。
【０１１１】
ＨＶＪ−リポソーム法は、脂質二重膜で作製されたリポソーム中に核酸分子を封入し、このリポソームと不活化したセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ、ＨＶＪ）とを融合させることを包含する。このＨＶＪ−リポソーム法は、従来のリポソーム法よりも、細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とする。ＨＶＪ−リポソーム調製法は、別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社、１９９６；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７に詳述されている。ＨＶＪとしては、任意の株が利用可能であり（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９０７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１０５など）、Ｚ株が好ましい。
【０１１２】
本発明の組成物は、ウイルスベクターの核酸形態で提供される場合、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターが利用される。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、Ｌｎｋ改変体をコードする核酸またはＬｎｋ改変体をコードする核酸を導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。これらウイルスベクターでは、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスベクターによる効率よりも遙かに高いことから、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。
【０１１３】
Ｎａｋｅｄ ＤＮＡ法の場合、上述の非ウイルスベクターである発現プラスミドを生理食塩水などに溶解し、そのまま投与する。例えば、Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ，Ｋｅａｒｎｅｙ Ｍ，Ｃｈｅｎ Ｄ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｍ，Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｓ，Ｙａｎｇ Ｊ，Ｓｙｍｅｓ ＪＦ，Ｉｓｎｅｒ ＪＭ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９８（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ）、３８２−３８８（１９９７）に記載される方法により、生物の器官の組織などに直接注入することができる。
【０１１４】
本発明において調製された細胞を含む組成物において含まれる細胞の量は、例えば、約１×１０３細胞〜約１×１０１１細胞、好ましくは約１×１０４細胞〜約１×１０１０細胞、より好ましくは約１×１０５細胞〜約１×１０９細胞などであり得る。これらの細胞は、例えば、約０．１ｍｌ、０．２ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌの生理食塩水のような溶液として存在し得る。細胞の量の範囲の上限としては、例えば、約１×１０１１細胞、約５×１０１０細胞、約２×１０１０細胞、約１×１０１０細胞、約５×１０９細胞、約２×１０９細胞、約１×１０９細胞、約５×１０８細胞、約２×１０８細胞、約１×１０８細胞、約５×１０７細胞、約２×１０７細胞、約１×１０７細胞などが挙げられる。細胞の量の下限としては、例えば、約１×１０３細胞、約２×１０３細胞、約５×１０３細胞、約１×１０４細胞、約２×１０４細胞、約５×１０４細胞、約１×１０５細胞、約２×１０５細胞、約５×１０５細胞、約１×１０６細胞などが挙げられる。
【０１１５】
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法を医師、患者など投与を行う人に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の血小板などの医薬を投与する方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０１１６】
（疾患）
本発明が対象とする「疾患」は、一定量の血小板を必要とするものであれば、どのようなものでもよい。本発明により処置され得る疾患または障害は、本発明の血小板の障害に関連する疾患または障害であり得る。 本明細書において、「粘性の高い血液」とは、粘性が高い血液一般をいい、このような血液は、通常、血栓を起こしやすい。例えば、動脈硬化などの原因になりやすいといわれる。そのような粘性の測定方法としては、例えば、血液流動性測定装置（たとえば、千代田パラメディカルケアーセンター株式会社；Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ Ｆｌｏｗ Ａｎａｌｙｚｅｒ （ＭＣ−ＦＡＮ））を用いることによって、チップ内の流路（幅７μｍ）を通過する全血の速度を測定し、血液の流動性（粘性）を測定することができる。
【０１１７】
本明細書において「粘性の高い血液に由来する疾患」には、例えば、高脂（質）血症、全身の動脈硬化、閉塞性動脈硬化症、糖尿病、脳梗塞、急性冠症候群（心筋梗塞、狭心症）などを挙げることができる。
【０１１８】
本発明はまた、血小板の異常に関連する任意の疾患を処置することができ、例えば血小板減少に伴う出血性疾患全般（例；抗ガン剤治療時の血小板減少症、本態性血小板減少症、など）などを挙げることができる。
【０１１９】
１つの実施形態において、上記疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：貧血（例えば、再生不良性貧血（特に重症再生不良性貧血）、腎性貧血、癌性貧血、二次性貧血、不応性貧血、外傷後出血など）、癌または腫瘍（例えば、白血病）およびその化学療法処置後の造血不全、血小板減少症、急性骨髄性白血病（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群）、第２寛解期以降の寛解期）、急性リンパ性白血病（特に、第１寛解期、第２寛解期以降の寛解期）、慢性骨髄性白血病（特に、慢性期、移行期）、悪性リンパ腫（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群）、第２寛解期以降の寛解期）、多発性骨髄腫（特に、発症後早期）など。
【０１２０】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ ＥＳ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１２１】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１２２】
（発明を実施するための好ましい形態）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。
【０１２３】
１つの局面において、本発明は、血小板を生産する方法を提供する。この方法は：Ａ）血小板前駆細胞におけるＬｎｋまたはその等価物（例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするか、あるいはそれらの改変体または断片）の機能を阻害する工程；およびＢ）該血小板前駆細胞を分化させる工程、を包含する。Ｌｎｋまたはその等価物の機能阻害は、例えば、核酸レベル（複製または転写レベル；これは、ＬｎｋのアンチセンスまたはＲＮＡｉによる阻害によって達成され得る）、タンパク質レベル（翻訳レベル、翻訳後修飾レベル；これは、糖鎖切断、抗体などによる阻害）でおこなうことができ、直接または間接的に行うことが可能である。代表的には、好ましくは、Ｌｎｋまたはその等価物のドミナントネガティブ法による阻害を用いること、レトロウイルスによって、Ｌｎｋ活性を失った変異型Ｌｎｋを導入すること、などにより達成され得ることが理解される。血小板前駆細胞は、生体からとったものを直接使用（初代培養）してもよく、あるいは、幹細胞をある程度分化させたり、増幅したりした細胞を使用できることができることが理解される。
【０１２４】
１つの実施形態では、本発明において使用される血小板前駆細胞は、胚性幹細胞および巨核球を含む。このような胚性幹細胞は、当該分野において公知の任意の技術を用いて調製することができることが理解され得る。
【０１２５】
１つの実施形態において、血小板前駆細胞分化工程（上記Ｂ工程）において、幹細胞因子（ＳＣＦ）に血小板前駆細胞を接触させることを包含してもよい。
【０１２６】
１つの実施形態では、血小板前駆細胞は、胚性幹細胞から誘導された巨核球を含み得る。巨核球の誘導は例えば、ＯＰ９間質細胞上での培養および二極性血管芽細胞との共培養によって達成され得るがそれに限定されない。巨核球への分化において、Ａ）血管芽細胞（ＶＥＧＦタイプ２受容体；Ｆｌｋ−１，ＫＤＲ）かつｃ−ｋｉｔ陽性細胞から分化成熟すること；Ｂ）ＯＰ９ストローマ細胞との物理的な接触が、巨核球への分化成熟に必須であること；およびＣ）血小板産生はＯＰ９ストローマ細胞上においても可能であるが、ＯＰ９との接触を除いた条件にすることで促進されることに留意すべきである。
【０１２７】
別の局面において、本発明はまた、本発明の上記方法（血小板前駆細胞におけるＬｎｋまたはその等価物の機能を阻害する工程；および該血小板前駆細胞を分化させる工程を含む）によって生産される血小板を提供する。
【０１２８】
別の局面において、本発明はまた、血小板の生成の速度を調節する物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、Ａ）ＬｎｋまたはＬｎｋプロモータと相互作用する物質を選ぶ工程；およびＢ）該選ばれた物質を血小板前駆細胞に接触させて分化するかどうかを決定し、分化調節作用を有する該物質を選択する工程を包含する。分化調節作用を有するかどうかは、コントロールとして分化因子に接触させるポジティブコントロールに対して、その分化速度が調節されていることを確認することによって、判定することができいる。
【０１２９】
別の局面において、本発明は、Ｌｎｋもしくはその等価物が損傷しているか、またはその機能が損傷した血小板を含む組成物を提供する。このような血小板は、粘性が低く、粘性の高い血液に起因する疾患を処置するのに適していると予期される。
【０１３０】
従って、好ましい実施形態では、本発明の組成物は、粘性の高い血液を有する患者の処置に使用され得る。このような患者は、例えば、糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞、高脂血症、脳梗塞などの症状または疾患に罹患している者であり得る。
【０１３１】
別の局面において、本発明は、Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子を提供する。この因子は、血小板の産生または産生促進のために用いることができる。このような因子は、ドミナントネガティブ因子、プロモーターの結合因子、ＲＮＡｉ、抗体および低分子などであり得る。
【０１３２】
従って、本発明は、好ましい実施形態では、Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子を含む、血小板の生成の速度を調節するための組成物を提供する。このような因子は、ドミナントネガティブ因子、プロモーターの結合因子、ＲＮＡｉ、抗体および低分子などであり得る。あるいは、別の実施形態では、この因子は、Ｌｎｋまたはその遺伝子産物の機能的変異体である。このような因子は、特定の実施形態では、配列番号３に記載されたヌクレオチド配列を有する改変体核酸であり得る。
【０１３３】
１つの局面において、本発明は、Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子の、血小板生成の速度の調節のための使用を提供する。ここで使用される因子は、本明細書において使用される任意の因子の実施形態が使用され得ることが理解され得る。
【０１３４】
別の局面において、本発明は、Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子の、血小板生成の速度の調節のための組成物の製造のための、使用を提供する。ここで使用される因子は、本明細書において使用される任意の因子の実施形態が使用され得ることが理解され得る。
【０１３５】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１３６】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１３７】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬、支持体などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ、和光純薬（大阪、日本）などから市販されるものを用いた。以下において使用した動物は、日本の大学において規定される飼育規準を遵守して飼育および実験した。
【０１３８】
（実施例１：Ｌｎｋ ＤＮ変異体遺伝子のスクリーニング）
（細胞、試薬およびマウス）
ＭＣ９細胞をＲＰＭＩ １６４０培地（８％の仔ウシ血清（ＦＢＳ）、抗生物質および１０ユニット／ｍｌのＩＬ−３を補充）中で培養した。Ｐｌａｔ−Ｅ細胞は、以前に記載したとおりに維持した（（Ｍｏｒｉｔａ，Ｓ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｔ．，ａｎｄ Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．２０００．Ｐｌａｔ−Ｅ： ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７：１０６３−１０６６．）。ＣＯＳ７細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地（８％ＦＢＳおよび抗生物質を補充）中で維持した。精製マウスＩＬ−３、ＳＣＦおよびＴＰＯは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｌｙ５．２＋）およびＣ．Ｂ−１７ ｓｃｉｄマウスは、日本クレア（神奈川、日本）から購入した。Ｌｙ５遺伝子座（Ｌｙ５，１＋）についてコンジェニックであるマウスとｌｎｋ−／−マウス（Ｔａｋａｋｉ，Ｓ．，Ｓａｕｅｒ，Ｋ．，Ｉｒｉｔａｎｉ，Ｂ．Ｍ．，Ｃｈｉｅｎ，Ｓ．，Ｅｂｉｈａｒａ，Ｙ．，Ｔｓｕｊｉ，Ｋ．，Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．，ａｎｄ Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ，Ｒ．Ｍ．２０００．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｎｋ．Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１３：５９９−６０９．； Ｔａｋａｋｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｈ．，Ｔｅｚｕｋａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．２００２．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｂｙ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｎｋ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１５１−１６０．）を、東京大学医科学研究所動物実験施設にて病原体フリーの特殊条件で交配させ維持した。
【０１３９】
（Ｌｎｋ変異体および発現構築物）
使用したＲ３６４Ｅ、ΔＰＨ、ΔＮおよびＹ５３６Ｆ Ｌｎｋ変異体の配列は、以下の通りである。
【０１４０】
Ｒ３６４Ｅ
ヌクレオチド配列
atgaacgagcccaccgtgcagccgtcccgcacatcctccgcacccgcctcgccggcatccccacgcggctggagcgacttctgcgagcagcacgcagcagcggcggcccgggagctggcccgccagtactggttgtttgcgcgcgcgcacccacagccgccgcgcgcggacctggtgtcgctgcagttcgcggagctcttccagcgccacttctgccgggaggtgcgcgagagcctcgcaggaccgccgggtcacgactaccgcgccactgctccgccccgccccgcgctgcccaaggcacgcagctccgaggacctgggcccgcggcccgcctgtgccctgcagcacctgcgccgcggcctgcgccagctcttccgccgccgctcggcaggggagctgcccggggctaccagtgacaccaatgacatcgacaccaccgcagccagcaggccgggcccggcccgcaagttgctaccctggggcctgcgagagccgcccactgaggcgctcaaggaggtcgtattgcgctatagcctggcggacgaggcagcaatggacagcggcgcacgctggcagcggggtcgcctggtgcttcggtctccaggtccgggccacagccactttctgcagctcttcgatccgcccaagagctcaaagcccaagctccaagaggcctgttccagcatccgggaggtccgaccatgtacacgcctggagatgcctgacaacctctacacctttgtgttgaaggtgcaggaccagacagacatcatctttgaggtgggagatgaacagcagctgaactcatggctggcagagctcagggcaagcacaggccttgggctggagcacccggacaccgagttacctctttccttagcggcagagcctggcccagctagatccccaaggggaagcactgactccctggaccaaggtgcttcacctggggtgttgctggacccagcctgccagaaaacagatcacttcctatcctgctacccctggttccacggccccatctccagggtgagggctgcacagctggtccagctccagggccctgatgcccacggcgtgttcctggtggagcagagtgagtcccggagaggagagtatgtactcacattcaacttacagggcagagccaagcacttacgcctggtgctcacagagcgtggacagtgccgggtgcaacacctgcacttcccctcggtggtagatatgctccgccacttccagcgttctcctatcccactggaatgtggagcagcttgtgacgtccgactctctggctatgtggtagtcctctctcaggcaccaggttcctccaacaccgtcctcttccctttttcccttcctcactgggattcggagctgggtcatccccacctcagctctgttggctgtccccccagccatggtgcagaggctctccctggccaagtgacaccacctgagcagatcttccacctggtgccttctcctgaggaactggccaacagtctgcggcagctggagctcgagtctgtgagcagtgcccgggactcggactatgacatggactcctcttcacggggccaccttcgggccattgacaaccagtacacccctctctcacagctgtgcagagaggcagacgtg（配列番号７）
アミノ酸配列
MNEPTVQPSRTSSAPASPASPRGWSDFCEQHAAAAARELARQYWLFARAHPQPPRADLVSLQFAELFQRHFCREVRESLAGPPGHDYRATAPPRPALPKARSSEDLGPRPACALQHLRRGLRQLFRRRSAGELPGATSDTNDIDTTAASRPGPARKLLPWGLREPPTEALKEVVLRYSLADEAAMDSGARWQRGRLVLRSPGPGHSHFLQLFDPPKSSKPKLQEACSSIREVRPCTRLEMPDNLYTFVLKVQDQTDIIFEVGDEQQLNSWLAELRASTGLGLEHPDTELPLSLAAEPGPARSPRGSTDSLDQGASPGVLLDPACQKTDHFLSCYPWFHGPISRVRAAQLVQLQGPDAHGVFLVEQSESRRGEYVLTFNLQGRAKHLRLVLTERGQCRVQHLHFPSVVDMLRHFQRSPIPLECGAACDVRLSGYVVVLSQAPGSSNTVLFPFSLPHWDSELGHPHLSSVGCPPSHGAEALPGQVTPPEQIFHLVPSPEELANSLRQLELESVSSARDSDYDMDSSSRGHLRAIDNQYTPLSQLCREADV（配列番号８）。
【０１４１】
ΔＰＨ
ヌクレオチド配列
atgaacgagcccaccgtgcagccgtcccgcacatcctccgcacccgcctcgccggcatccccacgcggctggagcgacttctgcgagcagcacgcagcagcggcggcccgggagctggcccgccagtactggttgtttgcgcgcgcgcacccacagccgccgcgcgcggacctggtgtcgctgcagttcgcggagctcttccagcgccacttctgccgggaggtgcgcgagagcctcgcaggaccgccgggtcacgactaccgcgccactgctccgccccgccccgcgctgcccaaggcacgcagctccgaggacctgggcccgcggcccgcctgtgccctgcagcacctgcgccgcggcctgcgccagctcttccgccgccgctcggcaggggagctgcccggggctaccagtgacaccaatgacatcgacaccaccgcagccagcaggccgggcccggcccgcaagttgctaccctggggcctgcgagagccgcccactgaggcgctcaaggaggtcgtatggctggcagagctcagggcaagcacaggccttgggctggagcacccggacaccgagttacctctttccttagcggcagagcctggcccagctagatccccaaggggaagcactgactccctggaccaaggtgcttcacctggggtgttgctggacccagcctgccagaaaacagatcacttcctatcctgctacccctggttccacggccccatctccagggtgagggctgcacagctggtccagctccagggccctgatgcccacggcgtgttcctggtgcggcagagtgagtcccggagaggagagtatgtactcacattcaacttacagggcagagccaagcacttacgcctggtgctcacagagcgtggacagtgccgggtgcaacacctgcacttcccctcggtggtagatatgctccgccacttccagcgttctcctatcccactggaatgtggagcagcttgtgacgtccgactctctggctatgtggtagtcctctctcaggcaccaggttcctccaacaccgtcctcttccctttttcccttcctcactgggattcggagctgggtcatccccacctcagctctgttggctgtccccccagccatggtgcagaggctctccctggccaagtgacaccacctgagcagatcttccacctggtgccttctcctgaggaactggccaacagtctgcggcagctggagctcgagtctgtgagcagtgcccgggactcggactatgacatggactcctcttcacggggccaccttcgggccattgacaaccagtacacccctctctcacagctgtgcagagaggcagacgtg（配列番号９）
アミノ酸配列
MNEPTVQPSRTSSAPASPASPRGWSDFCEQHAAAAARELARQYWLFARAHPQPPRADLVSLQFAELFQRHFCREVRESLAGPPGHDYRATAPPRPALPKARSSEDLGPRPACALQHLRRGLRQLFRRRSAGELPGATSDTNDIDTTAASRPGPARKLLPWGLREPPTEALKEVVWLAELRASTGLGLEHPDTELPLSLAAEPGPARSPRGSTDSLDQGASPGVLLDPACQKTDHFLSCYPWFHGPISRVRAAQLVQLQGPDAHGVFLVRQSESRRGEYVLTFNLQGRAKHLRLVLTERGQCRVQHLHFPSVVDMLRHFQRSPIPLECGAACDVRLSGYVVVLSQAPGSSNTVLFPFSLPHWDSELGHPHLSSVGCPPSHGAEALPGQVTPPEQIFHLVPSPEELANSLRQLELESVSSARDSDYDMDSSSRGHLRAIDNQYTPLSQLCREADV（配列番号１０）。
【０１４２】
ΔＮ
ヌクレオチド配列
atgaacgcctgtgccctgcagcacctgcgccgcggcctgcgccagctcttccgccgccgctcggcaggggagctgcccggggctaccagtgacaccaatgacatcgacaccaccgcagccagcaggccgggcccggcccgcaagttgctaccctggggcctgcgagagccgcccactgaggcgctcaaggaggtcgtattgcgctatagcctggcggacgaggcagcaatggacagcggcgcacgctggcagcggggtcgcctggtgcttcggtctccaggtccgggccacagccactttctgcagctcttcgatccgcccaagagctcaaagcccaagctccaagaggcctgttccagcatccgggaggtccgaccatgtacacgcctggagatgcctgacaacctctacacctttgtgttgaaggtgcaggaccagacagacatcatctttgaggtgggagatgaacagcagctgaactcatggctggcagagctcagggcaagcacaggccttgggctggagcacccggacaccgagttacctctttccttagcggcagagcctggcccagctagatccccaaggggaagcactgactccctggaccaaggtgcttcacctggggtgttgctggacccagcctgccagaaaacagatcacttcctatcctgctacccctggttccacggccccatctccagggtgagggctgcacagctggtccagctccagggccctgatgcccacggcgtgttcctggtgcggcagagtgagtcccggagaggagagtatgtactcacattcaacttacagggcagagccaagcacttacgcctggtgctcacagagcgtggacagtgccgggtgcaacacctgcacttcccctcggtggtagatatgctccgccacttccagcgttctcctatcccactggaatgtggagcagcttgtgacgtccgactctctggctatgtggtagtcctctctcaggcaccaggttcctccaacaccgtcctcttccctttttcccttcctcactgggattcggagctgggtcatccccacctcagctctgttggctgtccccccagccatggtgcagaggctctccctggccaagtgacaccacctgagcagatcttccacctggtgccttctcctgaggaactggccaacagtctgcggcagctggagctcgagtctgtgagcagtgcccgggactcggactatgacatggactcctcttcacggggccaccttcgggccattgacaaccagtacacccctctctcacagctgtgcagagaggcagacgtg（配列番号１１）
アミノ酸配列
MNACALQHLRRGLRQLFRRRSAGELPGATSDTNDIDTTAASRPGPARKLLPWGLREPPTEALKEVVLRYSLADEAAMDSGARWQRGRLVLRSPGPGHSHFLQLFDPPKSSKPKLQEACSSIREVRPCTRLEMPDNLYTFVLKVQDQTDIIFEVGDEQQLNSWLAELRASTGLGLEHPDTELPLSLAAEPGPARSPRGSTDSLDQGASPGVLLDPACQKTDHFLSCYPWFHGPISRVRAAQLVQLQGPDAHGVFLVRQSESRRGEYVLTFNLQGRAKHLRLVLTERGQCRVQHLHFPSVVDMLRHFQRSPIPLECGAACDVRLSGYVVVLSQAPGSSNTVLFPFSLPHWDSELGHPHLSSVGCPPSHGAEALPGQVTPPEQIFHLVPSPEELANSLRQLELESVSSARDSDYDMDSSSRGHLRAIDNQYTPLSQLCREADV（配列番号１２）。
【０１４３】
Ｙ５３６Ｆ
ヌクレオチド配列
atgaacgagcccaccgtgcagccgtcccgcacatcctccgcacccgcctcgccggcatccccacgcggctggagcgacttctgcgagcagcacgcagcagcggcggcccgggagctggcccgccagtactggttgtttgcgcgcgcgcacccacagccgccgcgcgcggacctggtgtcgctgcagttcgcggagctcttccagcgccacttctgccgggaggtgcgcgagagcctcgcaggaccgccgggtcacgactaccgcgccactgctccgccccgccccgcgctgcccaaggcacgcagctccgaggacctgggcccgcggcccgcctgtgccctgcagcacctgcgccgcggcctgcgccagctcttccgccgccgctcggcaggggagctgcccggggctaccagtgacaccaatgacatcgacaccaccgcagccagcaggccgggcccggcccgcaagttgctaccctggggcctgcgagagccgcccactgaggcgctcaaggaggtcgtattgcgctatagcctggcggacgaggcagcaatggacagcggcgcacgctggcagcggggtcgcctggtgcttcggtctccaggtccgggccacagccactttctgcagctcttcgatccgcccaagagctcaaagcccaagctccaagaggcctgttccagcatccgggaggtccgaccatgtacacgcctggagatgcctgacaacctctacacctttgtgttgaaggtgcaggaccagacagacatcatctttgaggtgggagatgaacagcagctgaactcatggctggcagagctcagggcaagcacaggccttgggctggagcacccggacaccgagttacctctttccttagcggcagagcctggcccagctagatccccaaggggaagcactgactccctggaccaaggtgcttcacctggggtgttgctggacccagcctgccagaaaacagatcacttcctatcctgctacccctggttccacggccccatctccagggtgagggctgcacagctggtccagctccagggccctgatgcccacggcgtgttcctggtgcggcagagtgagtcccggagaggagagtatgtactcacattcaacttacagggcagagccaagcacttacgcctggtgctcacagagcgtggacagtgccgggtgcaacacctgcacttcccctcggtggtagatatgctccgccacttccagcgttctcctatcccactggaatgtggagcagcttgtgacgtccgactctctggctatgtggtagtcctctctcaggcaccaggttcctccaacaccgtcctcttccctttttcccttcctcactgggattcggagctgggtcatccccacctcagctctgttggctgtccccccagccatggtgcagaggctctccctggccaagtgacaccacctgagcagatcttccacctggtgccttctcctgaggaactggccaacagtctgcggcagctggagctcgagtctgtgagcagtgcccgggactcggactatgacatggactcctcttcacggggccaccttcgggccattgacaaccagttcacccctctctcacagctgtgcagagaggcagacgtg（配列番号１３）
アミノ酸配列
MNEPTVQPSRTSSAPASPASPRGWSDFCEQHAAAAARELARQYWLFARAHPQPPRADLVSLQFAELFQRHFCREVRESLAGPPGHDYRATAPPRPALPKARSSEDLGPRPACALQHLRRGLRQLFRRRSAGELPGATSDTNDIDTTAASRPGPARKLLPWGLREPPTEALKEVVLRYSLADEAAMDSGARWQRGRLVLRSPGPGHSHFLQLFDPPKSSKPKLQEACSSIREVRPCTRLEMPDNLYTFVLKVQDQTDIIFEVGDEQQLNSWLAELRASTGLGLEHPDTELPLSLAAEPGPARSPRGSTDSLDQGASPGVLLDPACQKTDHFLSCYPWFHGPISRVRAAQLVQLQGPDAHGVFLVRQSESRRGEYVLTFNLQGRAKHLRLVLTERGQCRVQHLHFPSVVDMLRHFQRSPIPLECGAACDVRLSGYVVVLSQAPGSSNTVLFPFSLPHWDSELGHPHLSSVGCPPSHGAEALPGQVTPPEQIFHLVPSPEELANSLRQLELESVSSARDSDYDMDSSSRGHLRAIDNQFTPLSQLCREADV（配列番号１４）。
【０１４４】
上記変異体をコードするＤＮＡフラグメントは、以下のプライマーを用いたＰＣＲベースの部位特異的変異誘発によって生成され、そしてＤＮＡ配列決定によって確認した。
[Ｒ３６４Ｅの作製に用いたプライマー]
5’tggtggagcagagtgagtcccgga3’（配列番号１５）
5’tctgctccaccaggaacacgccgt3’（配列番号１６）
[ΔＰＨの作製に用いたプライマー]
5’tggctggcagagctcagggca3’（配列番号１７）
5’ctgccagccatacgacctccttgagcgcct3’（配列番号１８）
[ΔＮの作製に用いたプライマー]
5’gcctgtgccctgcagcacctg3’（配列番号１９）
5’gggcacaggcgttcatggtggagagcgagg3’（配列番号２０）
[Ｙ５３６Ｆの作製に用いたプライマー]
5’caaccagttcacccctctctca3’（配列番号２１）
5’aggggtgaactggttgtcaatgg3’（配列番号２２）。
【０１４５】
ｄＣをコードする変異ｃＤＮＡを、ｌｎｋ ｃＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントによって平滑化し次いで自己連結することによって構築した。種々の組み合わせで変異を含む他のｌｎｋ ｃＤＮＡは、適切なｃＤＮＡフラグメントを、制限酵素消化およびライゲーションを用いて変異フラグメントに置き換えることによって構築した。得られたｃＤＮＡフラグメントをｐｃＤＮＡ３哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＭＳＣＶレトロウイルスベクター（内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をマルチクローニング部位とｅＧＦＰコードｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）との間に含む）中にサブクローニングした。
【０１４６】
（レトロウイルス形質導入および骨髄移植）
ｐＭＹベクターを、ＦｕＧｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いたリポフェクションによりＰｌａｔ−Ｅ細胞中にトランスフェクトした。パッケージングしたレトロウイルス粒子を含む上清を採集し、そして微小遠心分離管中で４℃にて１６時間にわたり遠心分離した。形質導入のために、ＭＣ９細胞を、ポリブレーン（Ｓｉｇｍａ）８ｍｇ／ｍｌおよびレトロウイルス上清濃縮物を含む新鮮な培地中で３時間インキュベートした。細胞を洗浄し、そしてさらに、１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを含む新鮮な培地中で培養した。ＨＳＣ／ＨＰＣの形質導入のために、Ｌｉｎｅａｇｅマーカー（Ｂ２２０，ＣＤ３，Ｍａｃ−１，Ｇｒ−１ およびＴＥＲ−１１９）について陰性の骨髄（ＢＭ）細胞を、ＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて精製した。Ｌｉｎ−細胞（４×１０５）を、３時間にわたりレトロウイルス上清とともにインキュベートし、そしてＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎをコーティングしたディッシュ（ＴａＫａＲａ）上にＲＭＰＩ１６４０培地（８％ＦＢＳ、５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯおよび５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−３を含む）とともにプレートした。翌日、形質導入を、新鮮なレトロウイルス上清を用いて繰り返し、そして細胞をさらに２４時間にわたり培養した。形質転換したＬｉｎ−細胞（２．０×１０５）を洗浄し、そして致死量の照射を受けた（９．５Ｇｙ）レシピエントマウスに静脈注射した。
【０１４７】
（フローサイトメトリー）
レトロウイルス形質導入の後にｅＧＦＰを発現するＭＣ９細胞を、ＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｕｒＴＭ装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。抹消血脱核細胞をレシピエントマウスから得、これを所定の最適濃度のそれぞれの抗体を用いて染色し、ついでこれをＦＡＣＳ ＣａｌｂｉｕｒＴＭにより分析した。モノクローナル抗体としては以下を用いた。ＦＩＴＣ−結合体化の、抗Ｂ２２０（抗ＣＤ−４５Ｒ、ＲＡ３−６Ｂ２）、抗Ｍａｃ−１（抗ＣＤ１１ｂ、Ｍ１／７０）、および抗Ｓｃａ−１（Ｅ１３−１６１．７）；ＰＥ結合体化の、抗ＣＤ３ｅ（１４５−２Ｃ１１）、抗Ｇｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５）、抗ＴＥＲ１１９、抗Ｓｃａ−１および抗ｃ−Ｋｉｔ（抗ＣＤ１１７、２Ｂ８）；ビオチン結合体化の、抗Ｋｙ５．１（抗ＣＤ４５．１，Ａ２０）および抗Ｌｙ５．２（抗ＣＤ４５．２、１０４）；ＡＰＣ結合体化の、抗Ｂ２２０および抗ｃ−Ｋｉｔ（すべて、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）。ビオチン結合体化された抗体の結合は、ＡＰＣ結合体化またはＰｅｒＣＰ結合体化されたストレプトアビジン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて可視化した。死んだ細胞を、７アミノ酸アクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ）染色によってゲートアウトした。
【０１４８】
（化学架橋、免疫沈降およびイムノブロッティング）
ＣＯＳ７細胞を、野性型または変異型のＬｎｋタンパク質をコードするｐｃＤＮＡ３を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトランスフェクトし、そしてトランスフェクト後４８時間で採集した。細胞を溶解緩衝液（Ｔａｋａｋｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｈ．，Ｔｅｚｕｋａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．２００２．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｂｙ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｎｋ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１５１−１６０．）中に溶解し、そしてＢＳ３（Ｐｉｅｒｃｅ）を種々の濃度で用いて化学架橋させた。ついで、これを、抗Ｌｎｋ抗体を用いて免疫ブロットした。刺激実験のために、トランスフェクト体を１２時間血清枯渇させ、そして１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦで５分間刺激した。ついで、以前に記載されているように、細胞を溶解し、溶解液を免疫沈降させ、そして免疫ブロットした（Ｔａｋａｋｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｈ．，Ｔｅｚｕｋａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．２００２．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｂｙ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｎｋ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１５１−１６０．）。
【０１４９】
（ＥＳ細胞からの血小板の生成に対するＬｎｋ遺伝子のドミナントネガティブ変異の効果）
（ＥＳ細胞の増殖および分化）
マウスＥ１４ｔｇ２ａ細胞株を、１０００Ｕ／ｍｌマウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を補充した完全ＧＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で照射したマウスフィーダー細胞上で１０継代まで維持した。巨核芽球への分化のために、間質細胞株ＯＰ９ ｃｅｌｌｓ（Ｎａｋａｎｏ Ｔ，Ｋｏｄａｍａ Ｈ，Ｈｏｎｊｏ Ｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５；１０９８−１１０１，１９９４）を有する共培養システムを記載される（Ｅｔｏ Ｋ，Ｍｕｒｐｈｙ Ｒ，Ｋｅｒｒｉｇａｎ ＳＷ，Ｂｅｒｔｏｎｉ Ａ，Ｓｔｕｈｌｍａｎｎ Ｈ，Ｎａｋａｎｏ Ｔ，Ｌｅａｖｉｔｔ ＡＤ，Ｓｈａｔｔｉｌ ＳＪ （２００２） Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｅ ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．９９：１２８１９−１２８２４．）ように用いた。手短にいうと、ＥＳ細胞を、０．２５％ トリプシン／ＥＤＴＡで剥離させ、そして７５分間静置して、接着性フィーダー細胞を枯渇させた。ついで、１．５×１０４個の細胞を、コンフルエントなＯＰ９間質細胞を含む６ウェルプレートの各ウェルに播種した。ＯＰ９細胞は、新生児Ｍ−ＳＣＦ欠損Ｂ６Ｃ３Ｆ１−ｏｐ／ｏｐマウスの頭蓋冠に由来する。そして、各ウェル中の細胞を、１０−１２％仔ウシ胎児血清および５０ｍＭ ２−ＭＥ（Ｓｉｇｍａ）を補充したαＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。レトロウイルスで形質導入したタンパク質を発現する巨核球を得るために、分化プロトコールの５日目においてＦｌｋ−１およびＰＥＣＡＭ−１の両方を発現する二機能性血管芽細胞を２０ｎｇ／ｍｌを含むαＭＥＭ中に８×１０５／ｍｌに懸濁した。等量のウイルスストックおよび４ｍｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ）を加えた後、この細胞を３７℃で１７時間培養し、洗浄し、そして４×１０５細胞で新鮮なＯＰ９層上にまき、そして上記に記載されるように（Ｅｔｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００２）１５日目まで培養した。
【０１５０】
（巨核芽球のレトロウイルス感染）
Ｌｎｋ ｃＤＮＡおよびドミナントネガティブ変異体のｃＤＮＡをＩＲＥＳ−ＧＦＰカセットを含むレトロウイルスベクターより制限酵素消化して分離・精製し、ＭＳＣＶレトロウイルスベクター（ＭＩＧベクター：ＢＤ ｂｉｏ／ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より購入）のマルチクローニング部位にサブクローニングし、ＰＧＫ−ｎｅｏ遺伝子をｉｒｅｓ−ＥＧＦＰに置き換えた。関連する配列を、自動化されたＤＮＡ配列決定によって確認した。ウイルスを、２９３Ｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）へのリン酸カルシウムトランスフェクションによって生産した。この実験では、１５μｇのＭＩＧ発現ベクター、１２ μｇのエンベローププラスミドｐｃＤＮＡ−ＶＳＶＧ、を用いた。ウイルスの力価は、感染させたＮＩＨ ３Ｔ３細胞中でのＧＦＰ発現を測定することによって４８〜６０時間後に決定し、それは、０．４〜１．０×１０６ ＩＵ／ｍｌの範囲にあった。
【０１５１】
ドミナントネガティブ変異体の配列は以下の通りである。
【０１５２】
ドミナントネガティブマウスLnk
ヌクレオチド配列
atgaacgagcccaccgtgcagccgtcccgcacatcctccgcacccgcctcgccggcatccccacgcggctggagcgacttctgcgagcagcacgcagcagcggcggcccgggagctggcccgccagtactggttgtttgcgcgcgcgcacccacagccgccgcgcgcggacctggtgtcgctgcagttcgcggagctcttccagcgccacttctgccgggaggtgcgcgagagcctcgcaggaccgccgggtcacgactaccgcgccactgctccgccccgccccgcgctgcccaaggcacgcagctccgaggacctgggcccgcggcccgcctgtgccctgcagcacctgcgccgcggcctgcgccagctcttccgccgccgctcggcaggggagctgcccggggctaccagtgacaccaatgacatcgacaccaccgcagccagcaggccgggcccggcccgcaagttgctaccctggggcctgcgagagccgcccactgaggcgctcaaggaggtcgtatggctggcagagctcagggcaagcacaggccttgggctggagcacccggacaccgagttacctctttccttagcggcagagcctggcccagctagatccccaaggggaagcactgactccctggaccaaggtgcttcacctggggtgttgctggacccagcctgccagaaaacagatcacttcctatcctgctacccctggttccacggccccatctccagggtgagggctgcacagctggtccagctccagggccctgatgcccacggcgtgttcctggtggagcagagtgagtcccggagaggagagtatgtactcacattcaacttacagggcagagccaagcacttacgcctggtgctcacagagcgtggacagtgccgggtgcaacacctgcacttcccctcggtggtagatatgctccgccacttccagcgttctcctatcccactggaatgtggagcagcttgtgacgtccgactctctggctatgtggtagtcctctctcaggcaccaggttcctccaacaccgtcctcttccctttttcccttcctcactgggattcggagctgggtcatccccacctcagctctgttggctgtccccccagccatggtgcagaggctctccctggccaagtgacaccacctgagcagatc（配列番号３）
アミノ酸配列
MNEPTVQPSRTSSAPASPASPRGWSDFCEQHAAAAARELARQYWLFARAHPQPPRADLVSLQFAELFQRHFCREVRESLAGPPGHDYRATAPPRPALPKARSSEDLGPRPACALQHLRRGLRQLFRRRSAGELPGATSDTNDIDTTAASRPGPARKLLPWGLREPPTEALKEVVWLAELRASTGLGLEHPDTELPLSLAAEPGPARSPRGSTDSLDQGASPGVLLDPACQKTDHFLSCYPWFHGPISRVRAAQLVQLQGPDAHGVFLVEQSESRRGEYVLTFNLQGRAKHLRLVLTERGQCRVQHLHFPSVVDMLRHFQRSPIPLECGAACDVRLSGYVVVLSQAPGSSNTVLFPFSLPHWDSELGHPHLSSVGCPPSHGAEALPGQVTPPEQI（配列番号４）。
【０１５３】
（ＩＩｂ、ＧＰＩｂの発現に関する巨核芽球の特徴づけ、および前血小板の生成）
ＥＳ細胞分化の９日および１２日後、非接着性細胞を、６０分間３７℃にて重力沈降させた。巨核芽球の収率を最適化するために、ＯＰ９層になおも接着する造血細胞を、再度懸濁し、そしてメッシュを通して細胞塊を除去した。αＩＩｂβ３またはＧＰＩｂαの発現を、ＦＩＴＣを結合体化させたラット抗マウスαＩＩＢ（ＣＤ４１）を用いて測定した。
ＧＦＰを発現する前血小板の形成を位相蛍光顕微鏡（ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（Ｌｅｉｃａ ＤＭ ＩＲＢＥ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｓｙｓｔｅｍ）によりモニターし、そして計数した。手短に述べると、前血小板についての細胞の実数は、培養９日目および１２日目において、１培養ディッシュあたり１００個のＧＦＰ陽性巨核球中で計数した。培養１２日目から１４日目にかけて、ＥＳ細胞に由来する血小板の粒子数をフローサイトメトリーにより計数した。その結果は、１枚の６-ウエル培養皿から回収した３日間全体の合計ＧＦＰ陽性ＧＰＩｂα陽性数：コントロール（ＧＦＰのみ）発現６８２±４１８，Ｒ３６４Ｅ１アミノ酸置換遺伝子発現 ８９６±５１ Ｌｎｋドミナント陰性遺伝子発現３０２８±４４６であった。ＧＦＰおよびＧＰＩｂαの陽性粒子を、コントロールビーズ（ＢＤ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによって最終的に計数した。
【０１５４】
（実施例２：Ｌｎｋノックアウト血小板実験）
（材料）
すべての試薬は、特に言及する場合を除き、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。すべての動物および組み換えＤＮＡ実験は、東京大学医科学研究所、東海大学および北海道大学の動物実験施設協議会によって承認を得たものである。
【０１５５】
セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化された二次抗体は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ研究所から購入した。アルガトロバン（ａｒｇａｔｒｏｂａｎ）は三菱化学（東京、日本）から購入した。ローダミン−ファロイジン、ａｌｅｘａ４８８結合体化フィブリノゲンおよびａｌｅｘａ４８８結合体化抗マウスＩｇＧ抗体は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから購入した。
【０１５６】
精製したヒトフィブリノーゲンをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．（ＣＴ，ＵＳＡ）から入手した。ＦＩＴＣ結合体化抗マウスインテグリンαＩＩｂ（ＣＤ４１）およびＰＥ結合体化抗マウスＧＰＩｂαをＡｍｆｒｅｔ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。ヒトトロンボポイエチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１１をＰｅｐｒｏｔｅｃｈから入手した。
【０１５７】
（出血時間）
尾部出血アッセイを、８週齢のＬｎｋ欠損マウス（Ｔａｋａｋｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｈ．，Ｔｅｚｕｋａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．２００２．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｂｙ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｎｋ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１５１−１６０）またはコントロールマウスを用いて行った。マウスを５０μｇ／ｍｌのペントバルビタールを用いて麻酔した。尾部の２ｍｍの遠位先端を切除し、そして尾部をすぐに３７℃のＰＢＳに浴した。尾部の出血時間を、出血が停止するまでに必要な時間と定義した。
【０１５８】
（血液サンプルの調製）
１実験当たりの血液サンプルを、それぞれ８匹を超えるＬｎｋヌルマウスおよびそのコントロールから、心臓窃孔により得た。収集した血液検体をすぐに、その容積の１／６の酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）を含むプラスチックチューブに移し、インテグリンαＩＩβｂ３に対する特異的なフィブリノーゲン結合または血小板拡散の実験に用いた。別のサンプルを、その容積の１／６の３．８％クエン酸を含むチューブに移して最終濃度を０．３８％として血小板凝集の実験に用いた。血小板濃縮血漿（ＰＲＰ）を、全血を１５０×ｇで１５分間遠心分離することによって得た。洗浄した血小板を得るために、１０ｍＭのプラスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）および５Ｕ／ｍＬのアピラーゼを加え、そして７５０×ｇで１０分間遠心分離し、一回１ｍＭＰＧＥ１および１Ｕ／ｍＬのアピラーゼを含むクエン酸緩衝液で洗浄した。血小板ペレットを、適切な容量の、Ｃａ２＋なしの改変したタイロード−Ｈｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．４（１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１２ ｍＭ ＮａＨＣＯ３，１３８ ｍＭ ＮａＣｌ，５．５ ｍＭ グルコース，２．９ｍＭ ＫＣｌおよび１ ｍＭ ＭｇＣｌ２）中に再懸濁した。
【０１５９】
（エキソビボフローチャンバー実験）
エキソビボ灌流実験のために、収集した血液検体を、すぐに、その容量の１／１０の特異的トロンビンインヒビターアルガトロバンを最終濃度１００μＭで含むプラスチックチューブに移し、実験の間の血液サンプルの流動性を維持した（アルガトロバンは、クエン酸またはヘパリンよりも抗凝固剤としてより一般的に使用されており、これをカチオン濃度の減少または改変されたフォンビルブラント因子Ｉβａの相互作用を通じて、多面的な効果を回避した。）。
【０１６０】
ついで、全血検体中の血小板を、最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌのメパクリン（Ｓｉｇｍａ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を加え、以前に記載されている手順（Ｅｔｏ Ｋ，Ｇｏｔｏ Ｓ，Ｓｈｉｍａｚａｋｉ Ｔ，Ｓａｋａｋｉｂａｒａ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｍ，Ｉｓｓｈｉｋｉ Ｔ，Ｈａｎｄａ Ｓ （２００１） Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｔｅｎｔ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｕｎｄｅｒ ｆｌｏｗ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ １２：２２８−２３５．）を用いることによって蛍光を発光させた。いくつかの実験において、全血検体を、遠心分離によってＰＲＰおよび残りの検体に分割して、コントロールＰＲＰまたはＬｎｋヌルＰＲＰと、コントロール赤血球および血漿を含む、コントロール血液由来の残りの検体とからなる再構成した全血を作製した。血小板数をさらに調整するために、コントロールＰＲＰまたはＬｎｋ−ＰＲＰをＨＥＰＥＳ−タイロード緩衝液中に希釈し、そしてコントロール赤血球および血漿を含むコントロール血液と混合した。
【０１６１】
Ｉ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を固定した長方形のフローチャンバーを以前に記載されるように調製した（Ｅｔｏ Ｋ，Ｇｏｔｏ Ｓ，Ｓｈｉｍａｚａｋｉ Ｔ，Ｓａｋａｋｉｂａｒａ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｍ，Ｉｓｓｈｉｋｉ Ｔ，Ｈａｎｄａ Ｓ （２００１） Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｔｅｎｔ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｕｎｄｅｒ ｆｌｏｗ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ １２：２２８−２３５．）。血液サンプルを、シリンジポンプを備えるチャンバーを通じて、１１６．１ｍｌ／時間の速度で吸引して１，５００ｓ−１の最大の壁剪断速度を達成した（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ ０１７４６，Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．，ＵＳＡ） 。表面上でコラーゲンと相互作用し、血栓を形成する血小板を、４８０ｎｍ励起光源（ＤＭＩＲＢ，１ＲＢ−ＦＬＵＯ，Ｌｅｉｃａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備える倒立ステージｅｐｉ蛍光ビデオ顕微鏡システムを用いて可視化した。顕微鏡像を、感光性カラーＣＣＤカメラ（Ｌ−６００，Ｌｅｉｃａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてオンラインでデジタル化した。二次元での血小板血栓成長を定量するために、血小板による表面積カバー率を以前に報告されているように算出した（Ｇｏｔｏ Ｓ， Ｔａｍｕｒａ Ｎ， Ｉｓｈｉｄａ Ｈ （２００４）Ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＩＩｂ／ＩＩＩａ ａｇｅｎｔｓ ｔｏ ｄｉｓｓｏｌｖｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｈｒｏｍｂｉ ｆｏｒｍｅｄ ｏｎ ａ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｕｎｄｅｒ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ４４：３１６−２３．）。血小板血栓の溶解を、ビデオ画像で示した。このビデオ画像では、時間感覚を３分の１にまで減らした（すなわち、実時間３分はビデオでは１秒で表される。）。血小板血栓の三次元構造を、超高速レーザ共焦点顕微鏡で分析し、対物レンズの位置を上げ、そして誘電モーター制御ユニットによって制御して定速を２０μｍ／５０秒にまで減速し、血栓の走査画像を得ることができるようにした（図８）。マイクロレンズによって覆われた２０，０００ピンホールを有する迅速に回転するディスクの共焦点ユニット（ＣＳＵ１０，Ｙｏｋｏｇａｗａ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を用いることによって、１片の共焦点画像を、１０ミリ秒内に得ることができた。共焦点画像を画像拡大器（ＳＲＵＢ ＧＥＮ ＩＩＩ＋，Ｓｏｌａｍｅｒ，Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を用いて拡大し、拡大画像をデジタルビデオレコーダー（Ｈａｎｄｙｃａｍ，Ｓｏｎｙ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）に記録した。記録した画像をパーソナルコンピュータ（ＰｏｗｅｒＭａｃｈｉｎｔｏｓｈ Ｇ４，Ａｐｐｌｅ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に移し、シェアウェアＮＩＨ ｉｍａｇｅｓ/Ｉｍａｇｅ Ｊ １．３２を用いて三次元投影画像を得、そして上面から、６０℃斜め上および側方からのＱｕｉｃｋＴｉｍｅ動画および投影図として記録した。
【０１６２】
（血小板凝集研究）
１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む改変したタイロード−Ｈｅｐｅｓ緩衝液中に洗浄血小板を２×１０５／ｍｌの濃度で入れた。最終濃度１ｍＭでＣａＣｌ２を加え、３７℃で１分間インキュベートした後、種々の濃度のマウストロンビンおよびコラーゲンＩを加えて攪拌を行った。凝集プロファイルをＣｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ血小板凝集計中で３７℃で攪拌しながら生成した。
【０１６３】
（種々のアゴニストによるフィブリノーゲン結合（インテグリンαＩＩβｂ３の活性化）およびＦＡＣＳ分析）
洗浄し、静止させた血小板を、室温で３００ｍｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ４８８結合体化したフィブリノーゲンと、ＡＤＰ、ＰＡＲ４アゴニストペプチド、マウストロンビンまたはＰＭＡ（各々５０ｍＬの最終溶液の０．２ｍＭ ＣａＣｌ２を有する改変したタイロード−Ｈｅｐｅｓ緩衝液に溶解した）とともに３０分間インキュベートした。
【０１６４】
共焦点顕微鏡：１ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．２ｍＭＣａＣｌ２を含む改変したタイロード−Ｈｅｐｅｓ緩衝液中の洗浄血小板（１０７／５００μｌ）を、３７℃で４５分にわたり１２ウェルプレートのフィブリノーゲンコーティングカバースリップに播いた。接着性の細胞を４％ホルムアミド中に固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過させ、そして一次抗体およびＡｌｅｘａ ４８８結合体化させた二次抗体を用いて染色した。
【０１６５】
（結果および考察）
図１は、Ｌｎｋの機能的ドメインは、細胞増殖調節のために重要であることを示す図である。（Ａ）Ｌｎｋ変異体、および内部リポソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有する単一のｍＲＮＡからのｅＧＦＰを共発現するために使用されるＭＳＣＶベクターの代表的な模式図である。そのプロリンリッチ部分（ｓｔｒｅｔｃｈ；黒いバーを有する白いボックスで示す。）、ＳＨ２ドメイン（白いボックス）、およびＣ末端にチロシンリン酸化部位（Ｙ）を有するＮ末端ドメインを示す。Ｎ末端ドメイン（ＤＮ）、ＰＨドメイン（ＤＰＨ）およびＣ末端テイル（ＤＣ）の欠失、ならびにＹ５３６のフェニルアラニン置換（Ｙ５４６Ｆ）およびＲ３６４のグルタミン酸置換（Ｒ３６４Ｅ；ＳＨ２ドメイン中のＸとして示す）を示す。（Ｂ）コントロールベクターで形質導入したＭＣ９細胞（左欄、ベクター）またはＬｎｋ発現ベクターで形質導入したＭＣ９細胞（右欄、ＷＴ）をＳＣＦの存在下で培養し、そして所定の時点で生きているｅＧＦＰ＋細胞の割合を、フローサイトメトリーにより決定した。（Ｃ）ＳＣＦにより誘導される、指示されたＬｎｋ変異体を発現するＭＣ９細胞の増殖速度を、各々の所定の時点におけるｅＧＦＰ＋細胞の割合を培養開始（０日目）で除することによって形質導入していない細胞と比較した。示されているのは、複数の独立実験の代表的結果である。
【０１６６】
図２は、Ｌｎｋ ＳＨ２変異体が、細胞増殖においてＬｎｋの負の調節機能をドミナントネガティブ的に阻害することを示す図である。（Ａ）Ｌｎｋは、ＳＨ２ドメインを介してｃ−Ｋｉｔと会合する。示されたＬｎｋ変異体およびｃ−Ｋｉｔを共発現するＣＯＳ７トランスフェクト体を、ＳＣＦで刺激し、そして溶解した。抗Ｌｎｋ抗体で免疫沈降したタンパク質を分離し、そして抗ホスホチロシン抗体を用いて免疫ブロットして、ｃ−Ｋｉｔを検出し（上パネル）、そして抗Ｌｎｋ抗体を用いて免疫ブロットしたＬｎｋを検出した（下パネル）。ｃ−ＫｉｔとＬｎｋとの会合は、Ｒ３６４Ｅ ＳＨ２変異によって消えていた。（Ｂ）Ｎ末端領域を介したＬｎｋのマルチマー形成。指示されたＬｎｋ変異体を発現するＣＯＳ７形質転換細胞の細胞溶解物全体を、種々の濃度の化学架橋剤ＢＳ３で処理し、ついで抗Ｌｎｋ抗体を用いて免疫ブロットに供した。Ｌｎｋは、マルチマー複合体を形成した。これは、より遅い移動度を示した（矢頭）。マルチマー化した複合体は、ｄＮＬｎｋ変異体では検出できなかった。（ＣおよびＤ）Ｌｎｋ ＳＨ２変異体は、レトロウイルスで野性型Ｌｎｋを発現するＭＣ９−Ｌｎｋ細胞中に形質導入した。形質導入した細胞をＳＣＦの存在下で培養し、そしてその増殖を、形質導入していないＭＣ９−Ｌｎｋ細胞のものと比較した。比較は、所定の時点でのｅＧＦＰ＋細胞を、培養時（０日目）のもので徐することによって求めた。示されるのは３つの独立した実験の代表的なデータである。最後に、Ｒ３６４Ｅ ＳＨ２変異に加えてＤＰＨおよびＤＣの変異（ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ）を、ｗｔ Ｌｎｋに対する阻害作用を有する最も強力なドミナントネガティブ変異体として決定した。
【０１６７】
図３は、ＳＨ２ Ｒ３６４Ｅ単独ではなく、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体の異所性発現は、ＥＳ細胞由来の造巨核球能（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｐｏｉｅｓｉｓ）の成熟を容易にすることを示す図である。
【０１６８】
（Ａ）Ｌｎｋ ｗｔ、ＳＨ２ Ｒ３６４Ｅ単独と、ｃＤＮＡのΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体との間の相違。プロリンリッチ領域を伴うＮ末端ドメイン（黒バーを伴う白ボックス）、ＰＨドメイン（斜線ボックス）、ＳＨ２ドメイン（白ボックス）およびＣ末端のチロシンリン酸化部位（Ｙ）を示す。２つの変異遺伝子のこうかをＥＳ細胞に由来する巨核球において実験した。（Ｂ）分化プロトコールの５日目に、造血前駆細胞を１８時間にわたって、ＧＦＰ単独をコードするウイルス、Ｒ３６４Ｅ変異体およびＧＦＰ（Ｒ３６４Ｅ−ＧＦＰ）またはΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体をコードするウイルスおよびＧＦＰ （ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰ）をコードするウイルスに感染させた。さらなる分化を、２０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯの存在下でＯＰ９とともに共培養することによって維持した。７日目に、細胞を、形質導入した（ＧＦＰ陽性）細胞および非形質導入細胞（ＧＦＰ陰性）におけるＣＤ４１（インテグリンαＩＩｂ）の発現によって分析した。ＧＦＰ陰性細胞におけるＣＤ４１陽性細胞の平均数を１．０と定義した。成熟を研究するために、ＧＰＩβａ発現もまた試験した。示されているのは、３つの独立した実験の平均±ＳＤである。（結果）ＧＦＰ単独、ＳＨ２ Ｒ３６４ＥおよびΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰの間ではＣＤ４１発現細胞の数には変化はなかった。他方、造巨核球における成熟プロセスの特徴であるＧＰＩβａの発現は、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ形質導入した巨核球において増加したが、ＳＨ２ Ｒ３６４Ｅ単独を形質導入した細胞では見られなかった。このことは、ＤＰＨおよびＤＣが、ＳＨ２変異体に加えて、内因性Ｌｎｋに対して阻害し得、そしてこの培養系においての成熟を促すことを示す。
【０１６９】
図４は、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体は成熟巨核球の数および前血小板の生成を増加させることを示す図である。
【０１７０】
（Ａ）ＥＳ細胞から誘導された巨核球においてレトロウイルスによって媒介されたＧＦＰ発現。５日目の造血前駆細胞に、ＧＦＰ単独をコードするかまたはΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰをコードするレトロウイルスを感染させた。９日目および１２日目において、多数の延長を示すＧＦＰ陽性細胞の蛍光画像を、倒立蛍光顕微鏡／コンピュータシステムを用いて所定の暴露時間で得た。そして、１００細胞中の前血小板の数を算出した。（Ａ）のバーの寸法は、１００ｍｍである。（Ｂ左）９日目のＣＤ４１＋ＧＦＰ＋細胞数を、フローサイトメトリーで算出した。フローサイトメトリーにおけるドットプロットの側方散乱および前方散乱にしたがって、２つの任意の分析のゲートを以前に記載されるように適用した（Ｅｔｏ Ｋ，Ｍｕｒｐｈｙ Ｒ，Ｋｅｒｒｉｇａｎ ＳＷ，Ｂｅｒｔｏｎｉ Ａ，Ｓｔｕｈｌｍａｎｎ Ｈ，Ｎａｋａｎｏ Ｔ，Ｌｅａｖｉｔｔ ＡＤ，Ｓｈａｔｔｉｌ ＳＪ （２００２） Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｅ ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．９９：１２８１９−１２８２４．）。示されているでーたは、３つの独立した実験の平均±ＳＤである。（Ｂ）に示されるように、ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰ形質導入された細胞は、成熟した巨核球を示し、そしてレトロウイルス感染の３日後前血小板の数が増えていた。さらに３日後、ＯＰ９細胞との共培養によって、（Ｂ右）に示されるように、前血小板の生成の増強を維持した。
【０１７１】
図５は、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体は、ＥＳ細胞に由来する巨核球からの血小板フラグメンテーションを増加させることを示す図である。１２日目から１４日目の成熟した巨核球から誘導されるフラグメント化した粒子を、本明細書における方法の欄に記載されるようにフローサイトメトリーによって計数した。示されているのは、ＧＰＩβａ＋ＧＦＰ＋の粒子の３日間の合計である。グラフの挿入箇所は、ドットプロットの例を示す。（結果）Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体は、ＥＳ細胞由来のＧＰＩβａ＋血小板粒子の数を増加させたが、ＳＨ２変異体単独では増加させなかった。
【０１７２】
図６は、マウス血小板におけるＬｎｋ発現およびＬｎｋヌルマウスにおける尾部における出血時間の延長を示す図である。（Ａ）マウスｌｎｋのｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞におけるタンパク質発現のウェスタンブロットおよび示された遺伝子型の血小板の分析。２％ＳＤＳ含有ＲＩＰＡ緩衝液によって調製された２５ｍｇの各々の溶解物を、マウスＬｎｋに対するポリクローナル抗体で評価した（Ｔａｋａｋｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｈ．，Ｔｅｚｕｋａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．２００２．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｂｙ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｎｋ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１５１−１６０）。（Ｂ）出血時間を、本明細書において方法の欄に記載されているように決定した。プロットされたデータは、正常なマウス（ｎ＝５）およびＬｎｋヌルマウス（ｎ＝７）であった。
図７は、トロンビンおよびコラーゲンによる血小板凝集を示す図である。
【０１７３】
洗浄し、静止させた血小板を、血小板凝集計に適用し、そしてトロンビン（０．１Ｕ／ｍｌ）またはコラーゲンI（０．５μｇ／ｍｌ）で活性化した。矢印は、アゴニストの添加を示す。示されるのは、３つの独立の実験の代表的な結果である。
【０１７４】
図８は、表面に結合したコラーゲンのエキソビボの血栓形成を示す図である。血液を、抗凝固剤としてアルガトロバンを用いてコントロールマウスまたはＬｎｋ欠損マウスから収集した。硝子製カバースリップを、不溶性の繊維型Ｉ型コラーゲンでコーティングし、そして平行のプレートフローチャンバー中に配置した。（Ａ）コントロール（１０匹のマウス）またはＬｎｋ欠損マウス（１０匹のマウス）からの血小板数を調整なしで全血を、比較的高い剪断速度（１５００ｓ−１）でフローチャンバー中に適用した。連続記録からのコントロール（Ｌｎｋ＋／＋）またはＬｎｋ欠損（Ｌｎｋ−／−）における左の３つのフレームは、血液灌流の２分後、４分後および７分後における、コラーゲンコーティングされた表面（２次元；ＸＹ軸）を示す。コントロールおよびＬｎｋ欠損から形成された血栓が示されている。他方、Ｌｎｋ欠損血液の三次元の画像（右フレーム：Ｚ軸）は、コントロールのものの高さよりも比較的低い血栓を示した。（Ｂ）コントロールの血液に由来する赤血球および血漿とともにコントロールＰＲＰまたはＬｎｋヌルＰＲＰからなる再構成した血液を、高い剪断速度（１５００ｓ−１）でフローチャンバーに適用した。Ｌｎｋ欠損血小板を含有するサンプルにおける三次元画像（Ｚ軸）は、血小板数をコントロールに５×１０５／ｍｌに調整した場合でも、コントロールのものよりも低い血栓高さを示した。
【０１７５】
図９は、Ｌｎｋ欠損血液における灌流後の血栓表面積、血栓高さおよび血栓容量を示す図である。（Ａ）表面積率を、連続的なｚ軸切片から決定した。データは、１−２μｍの高さの血栓における３つの独立した実験の平均を示す。（Ｂ）データは、最大高さ（μｍ）における３つの独立した実験の平均を示す。
【０１７６】
図１０は、Ｌｎｋ欠損血小板における種々のアゴニストによるインテグリンαＩＩβｂ３の活性化を示す図である。種々のアゴニストの添加後に活性化されたαＩＩβｂ３を、フローサイトメトリーにおいて、インテグリンαＩＩβｂ３に結合したＡｌｅｘａ４８８結合体化フィブリノーゲン結合によって分析した。非特異的な結合を、１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で決定した。データは、５〜８回の独立した実験からの平均蛍光強度（ＦＬ−１チャネル）を示す。
【０１７７】
図１１は葉状仮足形成の欠損が、Ｌｎｋ欠損血小板においてフィブリノーゲンに対して見られたことを示す図である。血小板をＬｎｋ−／−およびコントロールマウスから得、そしてアゴニストなし；ＡＤＰ（５０μＭ）；ＰＡＲ４レセプター活性化ペプチド（１ｍＭ）とともに４５分間にわたりフィブリノーゲン上に播いた。ついで、細胞を固定させ、透過させ、そしてＦアクチン（赤）およびホスホチロシン（緑）について染色した。これを共焦点顕微鏡により分析した。矢頭は、糸状仮足を示す。バーは、１０μＭを示す。
【０１７８】
このように、Ｌｎｋのドミナントネガティブによって、血小板の生成が活性化するとともに、生成された血小板は、粘性が高い血液の補充のために適していると予期されることが明らかになった。
【０１７９】
（実施例３：ヒトでの実証）
臍帯血より調製したＣＤ３４＋多能性幹細胞分画をＳｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ （ＳＣＦ） （５０ ｎｇ／ｍｌ）， ＦＬＴ−３Ｌ （５０ ｎｇ／ｍｌ）， ＩＬ−６ （５０ ｎｇ／ｍｌ）の存在下に１〜２日間培養する。この間に、ＬｎｋインヒビターとＧＦＰを共発現するレトロウイルスベクター、ＧＦＰのみを発現するコントロールベクターより調製したウイルス粒子を加えて感染導入する。実験群及びコントロールのＧＦＰ＋感染細胞をフローサイトメーターにてソーティング精製し、各種サイトカイン存在下で培養しコロニー形成能を検討する。巨核球系細胞コロニーについてはコロニー数とともに１コロニーあたりのサイズにも注目する。臍帯血幹細胞の生存あるいは増殖をサポートするストローマ細胞株と共培養を行い、遺伝子導入細胞にて生存あるいは増幅促進効果がみられるかどうかを検討する。これらの培養系において、Ｌｎｋインヒビターの発現により、巨核球系細胞および血小板、各種造血前駆細胞の増殖能が亢進することが予想される。
【０１８０】
同じ細胞数の実験群及びコントロールのＧＦＰ＋感染臍帯血前駆細胞を一定量（感染細胞と同数または半数程度）の非感染細胞（または非処理臍帯血）と混じ、非致死量の放射線照射（３．５ Ｇｙ程度）したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへ移入する。２〜３ヶ月後にレシピエントマウスの抹消血を採取し、ＣＤ１９＋Ｂ細胞分画、ＣＤ３＋Ｔ細胞分画、ＣＤ１１ｂ＋骨髄球分画のＧＦＰ陽性率をフローサイトメトリーにより検討し、感染細胞と非感染細胞の競合条件下での造血能を比較する。Ｌｎｋインヒビターを発現させることにより、移植したドナー臍帯血前駆細胞の生着率、それより産生される巨核球系細胞および血小板、各種造血系細胞、リンパ球の産生量が高まることを確認することができる。
【０１８１】
（実施例４：インヒビタースクリーニング）
次に、Ｌｎｋインヒビタースクリーニングにより血小板生成促進因子のスクリーニングを行う。以下にそのプロトコールを示す。
【０１８２】
ＴＰＯ依存性に増殖する細胞株に遺伝子導入によりＬｎｋを過剰発現させる。このＬｎｋ過剰発現によりＴＰＯ依存性増殖ができなくなった遺伝子導入細胞株に発現あるいは作用させて、Ｌｎｋインヒビターとしての作用をＴＰＯ依存性増殖の回復を指標としてスクリーニングする。Ｌｎｋインヒビターとして作用する可能性が考えられる因子については、ＥＳ細胞株から巨核球及び血小板を分化誘導する分化系での効果を検討し、血小板生成促進因子としての効果を確認する。
【０１８３】
（実施例５：自動化）
実施例４などで実施するスクリーニングは、ロボットを用いて自動化することができる。この場合、例えば、ベックマンコールターのＢｉｏｍｅｋシリーズを用いて、マイクロプレートを用いたシステムを構築するか、またはＺｙｍａｒｋのＳｔａｃｃａｔｏ Ｍｉｎｉ−Ｓｙｓｔｅｍシリーズを用いてシステムを構築することができる。
【０１８４】
このようにして得られたリード化合物は、動物実験に用いることができる。あるいは、このようなリード化合物をもとに、他の化合物を設計することができる。
【０１８５】
（実施例６：動物実験）
実施例４または５などで、Ｌｎｋインヒビターであることが判明した化合物について、マウス、ラットまたはサルなどの動物に投与して血小板生成を調節する化合物をスクリーニングする。
【０１８６】
このようなスクリーニングにより、血小板生成を実際に調節する物質をスクリーニングすることができる。
【０１８７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１８８】
本発明は、血小板の生成を調節する方法、組成物およびシステムを提供する。このような調節により、血小板の生成をコントロールすることが容易になり、その維持・増殖を容易にかつ計画的にすることができるようになった。これらの有用性は、バイオ関連の産業において有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】図１は、Ｌｎｋの機能的ドメインは、細胞増殖調節のために重要であることを示す図である。 （Ａ）Ｌｎｋ変異体、および内部リポソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有する単一のｍＲＮＡからのｅＧＦＰを共発現するために使用されるｐＭＹベクターの代表的な模式図である。そのプロリンリッチ部分（ｓｔｒｅｔｃｈ；黒いバーを有する白いボックスで示す。）、ＳＨ２ドメイン（白いボックス）、およびＣ末端にチロシンリン酸化部位（Ｙ）を有するＮ末端ドメインを示す。Ｎ末端ドメイン（ＤＮ）、ＰＨドメイン（ＤＰＨ）およびＣ末端テイル（ＤＣ）の欠失、ならびにＹ５３６のフェニルアラニン置換（Ｙ５４６Ｆ）およびＲ３６４のグルタミン酸置換（Ｒ３６４Ｅ；ＳＨ２ドメイン中のＸとして示す）を示す。 （Ｂ）コントロールベクターで形質導入したＭＣ９細胞（左欄、ベクター）またはＬｎｋ発現ベクターで形質導入したＭＣ９細胞（右欄、ＷＴ）をＳＣＦの存在下で培養し、そして所定の時点で生きているｅＧＦＰ＋細胞の割合を、フローサイトメトリーにより決定した。 （Ｃ）ＳＣＦにより誘導される、指示されたＬｎｋ変異体を発現するＭＣ９細胞の増殖速度を、各々の所定の時点におけるｅＧＦＰ＋細胞の割合を培養開始（０日目）で除することによって形質導入していない細胞と比較した。示されているのは、複数の独立実験の代表的結果である。
【図２】図２は、Ｌｎｋ ＳＨ２変異体が、細胞増殖においてＬｎｋの負の調節機能をドミナントネガティブ的に阻害することを示す図である。（Ａ）Ｌｎｋは、ＳＨ２ドメインを介してｃ−Ｋｉｔと会合する。示されたＬｎｋ変異体およびｃ−Ｋｉｔを共発現するＣＯＳ７トランスフェクト体を、ＳＣＦで刺激し、そして溶解した。抗Ｌｎｋ抗体で免疫沈降したタンパク質を分離し、そして抗ホスホチロシン抗体を用いて免疫ブロットして、ｃ−Ｋｉｔを検出し（上パネル）、そして抗Ｌｎｋ抗体を用いて免疫ブロットしたＬｎｋを検出した（下パネル）。ｃ−ＫｉｔとＬｎｋとの会合は、Ｒ３６４Ｅ ＳＨ２変異によって消えていた。（Ｂ）Ｎ末端領域を介したＬｎｋのマルチマー形成。指示されたＬｎｋ変異体を発現するＣＯＳ７形質転換細胞の細胞溶解物全体を、種々の濃度の化学架橋剤ＢＳ３で処理し、ついで抗Ｌｎｋ抗体を用いて免疫ブロットに供した。Ｌｎｋは、マルチマー複合体を形成した。これは、より遅い移動度を示した（矢頭）。マルチマー化した複合体は、ｄＮＬｎｋ変異体では検出できなかった。（ＣおよびＤ）Ｌｎｋ ＳＨ２変異体は、レトロウイルスで野性型Ｌｎｋを発現するＭＣ９−Ｌｎｋ細胞中に形質導入した。形質導入した細胞をＳＣＦの存在下で培養し、そしてその増殖を、形質導入していないＭＣ９−Ｌｎｋ細胞のものと比較した。比較は、所定の時点でのｅＧＦＰ＋細胞を、培養時（０日目）のもので徐することによって求めた。示されるのは３つの独立した実験の代表的なデータである。最後に、Ｒ３６４Ｅ ＳＨ２変異に加えてＤＰＨおよびＤＣの変異（ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ）を、ｗｔ Ｌｎｋに対する阻害作用を有する最も強力なドミナントネガティブ変異体として決定した。
【図３】図３は、ＳＨ２ Ｒ３６４Ｅ単独ではなく、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体の異所性発現は、ＥＳ細胞由来の造巨核球能（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｐｏｉｅｓｉｓ）の成熟を容易にすることを示す図である。 （Ａ）Ｌｎｋ ｗｔ、ＳＨ２ Ｒ３６４Ｅ単独と、ｃＤＮＡのΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体との間の相違。プロリンリッチ領域を伴うＮ末端ドメイン（黒バーを伴う白ボックス）、ＰＨドメイン（斜線ボックス）、ＳＨ２ドメイン（白ボックス）およびＣ末端のチロシンリン酸化部位（Ｙ）を示す。２つの変異遺伝子のこうかをＥＳ細胞に由来する巨核球において実験した。（Ｂ）分化プロトコールの５日目に、ＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を１８時間にわたって、ＧＦＰ単独をコードするウイルス、Ｒ３６４Ｅ変異体およびＧＦＰ（Ｒ３６４Ｅ−ＧＦＰ）またはΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体をコードするウイルスおよびＧＦＰ （ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰ）をコードするウイルスに感染させた。さらなる分化を、２０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯの存在下でＯＰ９とともに共培養することによって維持した。７日目に、細胞を、形質導入した（ＧＦＰ陽性）細胞および非形質導入細胞（ＧＦＰ陰性）におけるＣＤ４１（インテグリンαＩＩｂ）の発現によって分析した。ＧＦＰ陰性細胞におけるＣＤ４１陽性細胞の平均数を１．０と定義した。成熟を研究するために、ＧＰＩｂα発現もまた試験した。示されているのは、３つの独立した実験の平均±ＳＤである。（結果）ＧＦＰ単独、ＳＨ２ Ｒ３６４ＥおよびΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰの間ではＣＤ４１発現細胞の数には変化はなかった。他方、造巨核球における成熟プロセスの特徴であるＧＰＩｂα発現は、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ形質導入した巨核球において増加したが、ＳＨ２ Ｒ３６４Ｅ単独を形質導入した細胞では見られなかった。このことは、ΔＰＨおよびΔＣが、ＳＨ２変異体に加えて、内因性Ｌｎｋに対して阻害し得、そしてこの培養系においての成熟を促すことを示す。
【図４】図４は、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体は成熟巨核球の数および前血小板の生成を増加させることを示す図である。 （Ａ）ＥＳ細胞から誘導された巨核球においてレトロウイルスによって媒介されたＧＦＰ発現。５日目の造血前駆細胞に、ＧＦＰ単独をコードするかまたはΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰをコードするレトロウイルスを感染させた。９日目および１２日目において、多数の延長を示すＧＦＰ陽性細胞の蛍光画像を、倒立蛍光顕微鏡／コンピュータシステムを用いて所定の暴露時間で得た。そして、１００細胞中の前血小板の数を算出した。（Ａ）のバーの寸法は、１００μｍである。（Ｂ左）９日目のＣＤ４１＋ＧＦＰ＋細胞数を、フローサイトメトリーで算出した。フローサイトメトリーにおけるドットプロットの側方散乱および前方散乱にしたがって、２つの任意の分析のゲートを以前に記載されるように適用した（Ｅｔｏ Ｋ，Ｍｕｒｐｈｙ Ｒ，Ｋｅｒｒｉｇａｎ ＳＷ，Ｂｅｒｔｏｎｉ Ａ，Ｓｔｕｈｌｍａｎｎ Ｈ，Ｎａｋａｎｏ Ｔ，Ｌｅａｖｉｔｔ ＡＤ，Ｓｈａｔｔｉｌ ＳＪ （２００２） Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｅ ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．９９：１２８１９−１２８２４．）。示されている結果は、３つの独立した実験の平均±ＳＤである。（Ｂ）に示されるように、ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰ形質導入された細胞は、成熟した巨核球を示し、そしてレトロウイルス感染の３日後前血小板の数が増えていた。さらに３日後、ＯＰ９細胞との共培養によって、（Ｂ右）に示されるように、前血小板の生成の増強を維持した。
【図５】図５は、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体は、ＥＳ細胞に由来する巨核球からの血小板フラグメンテーションを増加させることを示す図である。 １２日目から１４日目の成熟した巨核球から誘導されるフラグメント化した粒子を、本明細書における方法の欄に記載されるようにフローサイトメトリーによって計数した。示されているのは、ＧＰＩｂα＋ＧＦＰ＋の粒子の３日間の合計である。グラフの挿入箇所は、ドットプロットの例を示す。（結果）Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体は、ＥＳ細胞由来のＧＰＩｂα＋血小板粒子の数を増加させたが、ＳＨ２変異体単独では増加させなかった。
【図６】図６は、マウス血小板におけるＬｎｋ発現およびＬｎｋ欠損マウスにおける尾部における出血時間の延長を示す図である。 （Ａ）マウスｌｎｋのｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞におけるタンパク質発現のウェスタンブロットおよび示された遺伝子型の血小板の分析。２％ＳＤＳ含有ＲＩＰＡ緩衝液によって調製された２５μｇの各々の溶解物を、マウスＬｎｋに対するポリクローナル抗体で評価した（Ｔａｋａｋｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｈ．，Ｔｅｚｕｋａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．２００２．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｂｙ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｎｋ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１５１−１６０．）。（Ｂ）出血時間を、本明細書において方法の欄に記載されているように決定した。プロットされたデータは、正常なマウス（ｎ＝５）およびＬｎｋ欠損マウス（ｎ＝７）であった。
【図７】図７は、トロンビンおよびコラーゲンによる血小板凝集を示す図である。 洗浄し、静止させた血小板を、血小板凝集計に適用し、そしてトロンビン（０．１Ｕ／ｍｌ）またはコラーゲンI（０．５μｇ／ｍｌ）で活性化した。矢印は、アゴニストの添加を示す。示されるのは、３つの独立の実験の代表的な結果である。
【図８】図８は、表面に結合したコラーゲンのエキソビボの血栓形成を示す図である。 血液を、抗凝固剤としてアルガトロバンを用いてコントロールマウスまたはＬｎｋヌルマウスから収集した。硝子製カバースリップを、不溶性の繊維型Ｉ型コラーゲンでコーティングし、そして平行のプレートフローチャンバー中に配置した。（Ａ）コントロール（１０匹のマウス）またはＬｎｋ欠損マウス（１０匹のマウス）からの血小板数を調整なしで全血を、比較的高い剪断速度（１５００ｓ−１）でフローチャンバー中に適用した。連続記録からのコントロール（Ｌｎｋ＋／＋）またはＬｎｋ欠損（Ｌｎｋ−／−）における左の３つのフレームは、血液灌流の２分後、４分後および７分後における、コラーゲンコーティングされた表面（２次元；ＸＹ軸）を示す。コントロールおよびＬｎｋヌルから形成された血栓が示されている。他方、Ｌｎｋ欠損血液の三次元の画像（右フレーム：Ｚ軸）は、コントロールのものの高さよりも比較的低い血栓を示した。（Ｂ）コントロールの血液に由来する赤血球および血漿とともにコントロールＰＲＰまたはＬｎｋヌルＰＲＰからなる再構成した血液を、高い剪断速度（１５００ｓ−１）でフローチャンバーに適用した。Ｌｎｋ欠損血小板を含有するサンプルにおける三次元画像（Ｚ軸）は、血小板数をコントロールに５×１０５／μｌに調整した場合でも、コントロールのものよりも低い血栓高さを示した。
【図９】図９は、Ｌｎｋ欠損血液における灌流後の血栓表面積率、血栓高さを示す図である。 （Ａ）表面積を、連続的なｚ軸切片から決定した。データは、１−２μmの高さの血栓における３つの独立した実験の平均を示す。 （Ｂ）データは、最大高さ（μｍ）における３つの独立した実験の平均を示す。
【図１０】図１０は、Ｌｎｋヌル血小板における種々のアゴニストによるインテグリンαＩＩβｂ３の活性化を示す図である。種々のアゴニストの添加後に活性化されたαＩＩβｂ３を、フローサイトメトリーにおいて、インテグリンαＩＩβｂ３に結合したＡｌｅｘａ４８８結合体化フィブリノーゲン結合によって分析した。非特異的な結合を、１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で決定した。データは、５〜８回の独立した実験からの平均蛍光強度（ＦＬ−１チャネル）を示す。
【図１１】図１１は葉状仮足形成の欠損が、Ｌｎｋヌル血小板においてフィブリノーゲンに対して見られたことを示す図である。 血小板をＬｎｋ−／−およびコントロールマウスから得、そしてアゴニストなし；ＡＤＰ（５０μＭ）あるいはＰＡＲ４レセプター活性化ペプチド（１ｍＭ）とともに４５分間にわたりフィブリノーゲン上に播いた。ついで、細胞を固定させ、透過させ、そしてＦアクチン（赤）およびホスホチロシン（チロシンリン酸化；緑）について染色した。これを共焦点顕微鏡により分析した。矢頭は、糸状仮足を示す。バーは、１０μｍを示す。
【図１２】図１２は、Ｌｎｋ機能の遮断により可能な造血幹細胞の機能制御の説明図。
【配列表フリーテキスト】
【０１９０】
（配列表の説明）
配列番号１は、Ｌｎｋの核酸配列である。
配列番号２は、Ｌｎｋのアミノ酸配列である。
配列番号３は、Ｌｎｋのドミナントネガティブ変異体の核酸配列である。
配列番号４は、Ｌｎｋのドミナントネガティブ変異体のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ＳＣＦの核酸配列である。
配列番号６は、ＳＣＦのアミノ酸配列である。
配列番号７は、Ｌｎｋ変異体Ｒ３６４Ｅの核酸配列である。
配列番号８は、Ｌｎｋ変異体Ｒ３６４Ｅのアミノ酸配列である。
配列番号９は、Ｌｎｋ変異体ΔＰＨの核酸配列である。
配列番号１０は、Ｌｎｋ変異体ΔＰＨのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、Ｌｎｋ変異体ΔＮの核酸配列である。
配列番号１２は、Ｌｎｋ変異体ΔＮのアミノ酸配列である。
配列番号１３は、Ｌｎｋ変異体Ｙ５３６Ｆの核酸配列である。
配列番号１４は、Ｌｎｋ変異体Ｙ５３６Ｆのアミノ酸配列である。
配列番号１５は、Ｒ３６４Ｅの作製に用いたプライマーである。
配列番号１６は、Ｒ３６４Ｅの作製に用いたプライマーである。
配列番号１７は、ΔＰＨの作製に用いたプライマーである。
配列番号１８は、ΔＰＨの作製に用いたプライマーである。
配列番号１９は、ΔＮの作製に用いたプライマーである。
配列番号２０は、ΔＮの作製に用いたプライマーである。
配列番号２１は、Ｙ５３６Ｆの作製に用いたプライマーである。
配列番号２２は、Ｙ５３６Ｆの作製に用いたプライマーである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板を効率よく生産する方法およびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体を構成する体細胞に不可欠な血液中には、赤血球、リンパ球、血小板等の血液細胞が存在する。血液細胞は、それぞれ固有の機能を分担して、生体を恒常的に保つ役割を担っている。近年、各種の血液細胞は、骨髄中の造血未分化細胞より分化、成熟すること、および、その分化、成熟の過程において各種の生体内液性因子が関与していること等の事実が明らかとなってきている。
【０００３】
血小板は、血液中に存在する直径２〜３μｍの細胞であり、生体における止血や血栓の形成に重要な役割を有する血液中の有形成分の一種である。骨髄中の造血未分化細胞から巨核球系前駆細胞を経て巨核球となり、巨核球の細胞質が断片化して生成された当該血小板が、血液中に放出されることが明らかとなっている。
【０００４】
最近になって、巨核球および血小板系についての研究成果も種々報告されており、例えば、巨核球増殖因子が、血小板を産生する巨核球の増幅を促進する作用を有することが報告されている（非特許文献１）。高投与量の化学療法や高線量の放射線照射の様な癌治療は、骨髄中の造血細胞を破壊し、該患者を血小板の激しく減少した状態に置く。このような治療の後は、血小板減少症を起こし血小板輸血を必要とする凝固作用の減少や出血性障害をもたらす。血小板の不足は、これらの癌治療の後の疾病と死亡の主な原因であり、癌治療のコストを上昇させる要因となっている。巨核球と血小板の回復には、一般的には１５日よりも長い時間が要求され、該患者の血液凝固能力がその間不足する。
【０００５】
近年、臍帯血バンクなどが設立され、採取された臍帯血が、採取された個人とは異なる患者に移植する同種造血幹細胞移植が普及し始めている。移植した患者の多くの場合において、血小板回復の遅れが問題となっている。
【０００６】
従って、血小板を簡便に製造することができる技術についての需要が存在する。
【非特許文献１】加藤俊一「臍帯血幹細胞移植」日常診療と血液Ｖｏｌ．７，Ｐ．４７９特集別刷、医薬ジャーナル社
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、造血未分化細胞を培養し、巨核球系細胞、特に血小板を効率よく生産させた細胞製剤を製造する方法の開発にある。こうした細胞処理には、国内外の企業により病院外で行われることが期待されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、造血未分化細胞に作用し、巨核球前駆細胞の分化を促進する培養方法の開発を目的として、鋭意研究を積み重ねた結果、その培養方法を明らかにすることに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は、Ｌｎｋの調節により、造血未分化細胞から巨核球前駆細胞、ひいては血小板への分化を促進させることにより、血小板への分化を促進する方法を提供する。
【０００９】
従って、本発明は、以下を提供する。
（１）血小板を生産する方法であって：上記方法は：
Ａ）血小板前駆細胞におけるＬｎｋまたはその等価物の機能を阻害する工程；および
Ｂ）上記血小板前駆細胞を分化させる工程、
を包含する、方法。
（２）上記血小板前駆細胞は、胚性幹細胞および巨核球を含む、項１に記載の方法。
（３）上記阻害は、上記Ｌｎｋまたはその等価物のドミナントネガティブ法による阻害を含む、項１に記載の方法。
（４）上記阻害は、レトロウイルスによって、Ｌｎｋ活性を抑制することのできる変異型Ｌｎｋを導入することにより達成される、項３に記載の方法。
（５）上記Ｌｎｋは配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするか、あるいはそれらの改変体または断片である、項１に記載の方法。
（６）上記Ｂ工程において、幹細胞因子（ＳＣＦ）に上記血小板前駆細胞を接触させる工程を包含する、項１に記載の方法。
（７）上記阻害は、Ｌｎｋの核酸レベルによる阻害によって達成される、項１に記載の方法。
（８）上記阻害は、ＬｎｋのアンチセンスまたはＲＮＡｉによる阻害によって達成される、項１に記載の方法。
（９）上記阻害は、Ｌｎｋの産物レベルによる阻害によって達成される、項１に記載の方法。
（１０）上記阻害は、Ｌｎｋの抗体による阻害によって達成される、項１に記載の方法。
（１１）上記血小板前駆細胞は、胚性幹細胞から誘導された巨核球を含む、項１に記載の方法。
（１２）上記誘導は、ＯＰ９間質細胞上での培養および二極性血管芽細胞との共培養によって達成される、項１１に記載の方法。
（１３）上記巨核球への分化において、Ａ）血管芽細胞（ＶＥＧＦタイプ２受容体；Ｆｌｋ−１，ＫＤＲ）かつｃ−ｋｉｔ陽性細胞から分化成熟すること；Ｂ）ＯＰ９ストローマ細胞との物理的な接触が、巨核球への分化成熟に必須であること；およびＣ）血小板産生はＯＰ９ストローマ細胞上においても可能であるが、ＯＰ９との接触を除いた条件にすることで促進されることからなる群より選択される、少なくとも１つの特徴を有する、項１１に記載の方法。
（１４）項１に記載の方法によって生産された、血小板。
（１５）血小板の生成の速度を調節する物質をスクリーニングする方法であって、
Ａ）ＬｎｋまたはＬｎｋプロモータと相互作用する物質を選ぶ工程；および
Ｂ）上記選ばれた物質を血小板前駆細胞に接触させて分化するかどうかを決定し、分化調節作用を有する上記物質を選択する工程
を包含する、方法。
（１６）Ｌｎｋまたはその機能が損傷した血小板を含む組成物。
（１７）上記組成物は、粘性の高い血液を有する患者の処置に使用される、項１６に記載の組成物。
（１８）Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子。
（１９）上記因子は、ドミナントネガティブ因子、プロモーターの結合因子、ＲＮＡｉ、抗体および低分子からなる群より選択される、項１８に記載の因子。
（２０）Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子を含む、血小板の生成の速度を調節するための組成物。
（２１）上記因子は、ドミナントネガティブ因子、プロモーターの結合因子、ＲＮＡｉ、抗体および低分子からなる群より選択される、項２０に記載の組成物。
（２２）上記因子は、Ｌｎｋまたはその遺伝子産物の機能的変異体である、項２０に記載の組成物。
（２３）上記因子は、配列番号３に記載されたヌクレオチド配列を有する改変体核酸である、項２０に記載の組成物。
（２４）Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子の、血小板生成の速度の調節のための使用。
（２５）Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子の、血小板生成の速度の調節のための組成物の製造のための、使用。
【００１０】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
【００１１】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、必要に応じて添付の図面等を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、血小板を産業レベルの量で提供する技術を提供する。その他の効果として
造血幹細胞や前駆細胞の増殖能や造血能を亢進させ、移植ドナー細胞としての機能を高める技術を提供すること、各種の幹細胞や前駆細胞より成熟血液細胞や免疫担当細胞を産業レベルの量で提供する技術を提供すること、などがあげられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１４】
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【００１５】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を記載する。
【００１６】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。
【００１７】
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄球系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄球系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
【００１８】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。
【００１９】
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
【００２０】
本明細書において、「分化」または「細胞分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的および／または機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生などはっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を，ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内あるいは細胞外の因子または条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では，別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。
【００２１】
本明細書において「多能性」または「多分化能」とは、互換可能に用いられ、細胞の性質をいい、１以上、好ましくは２以上の種々の組織または臓器に分化し得る能力をいう。従って、「多能性」および「多分化能」は、本明細書においては特に言及しない限り「未分化」と互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化することは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）と呼ばれる。しかし間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。胚性幹細胞は、多能性を有する。組織幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は全能性といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、体外培養系における、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ）の形成、分化誘導条件下での培養等が挙げられるがそれらに限定されない。また、生体を用いた多能性の有無についてのアッセイ法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形腫（テラトーマ）の形成、胚盤胞への注入によるキメラ胚の形成、生体組織への移植、腹水への注入による増殖等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００２２】
従って、本明細書において「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」とは、交換可能に用いられ、初期胚に由来する任意の多能性幹細胞をいう。通常胚性幹細胞は、全能性またはほぼ全能性を有するとされる。この胚性幹細胞を正常な宿主胚盤胞へ導入し仮親子宮へ戻すことによってキメラ作製を行ったところ、高いキメラ形成能を持つ、生殖系列キメラ（胚性幹細胞由来の機能的生殖細胞を持つキメラマウス）が得られた（Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，３０９，２５５，１９８４）。胚性幹細胞株は、培養下で、種々の遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、レトロウイルスベクター法、リポゾーム法、エレクトロポレーション法等）の適用が可能である。また、遺伝子が組込まれた細胞を選別する方法を工夫し、相同遺伝子組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を利用し、特定の遺伝子を狙って改変（置換、欠失、挿入）させた細胞のクローンを得ることもできる。インビトロでこのような処理をした胚性幹細胞株は生殖系列への分化能を保持することから、ある特定の遺伝子の機能を個体レベルで調べる研究が現在盛んに行われている（Ｍ．Ｒ．Ｃａｐｅｃｃｈｉ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８，１９８９）。胚性幹細胞を利用したトランスジェニックマウス作出法は、ある特定の遺伝子のみを任意に改変させた個体を得ることを可能にした点でマイクロインジェクション法によるトランスジェニック動物作出法にはない多くの利点が考えられる。特に、特定の遺伝子を不活化させたノックアウト動物を作出できるようになり、遺伝子の機能を解明したり、外来性の遺伝子のみを発現させることができる。従って、胚性幹細胞の樹立が容易になれば、その効果は図り知れない。このような胚性幹細胞は、受精３．５日目のマウス胚盤胞の内部細胞塊の細胞をインビトロ培養に移し，細胞塊の解離と継代を繰り返すことにより，多分化能を保持し，正常核型を維持したまま無制限に増殖しつづける幹細胞を樹立することに作製することができる。通常、胚性幹細胞の多分化能を維持するには、ＳＴＯ細胞株および／またはマウス胎仔から調製した初代培養繊維芽細胞などのフィーダー細胞層上で胚性幹細胞を培養することが好ましいとされる。
【００２３】
本発明に用いられる「造血幹細胞」とは、造血組織および腸上皮組織などの細胞新生系において細胞生産のもとになる細胞をいう。この造血幹細胞は、自己を保存するとともに、すべての血液系細胞に分化することができる。そのような血液細胞としては、例えば、単球系幹細胞、Ｂリンパ球系幹細胞、Ｔリンパ球系幹細胞、骨髄球系幹細胞、Ｔリンパ系細胞、Ｂリンパ系細胞、血小板系細胞、赤血球系細胞、単球系細胞などを挙げることができる。造血幹細胞は、あらゆる種類の血球に分化する能力を有するとともに造血再構築能を有する細胞であり、主に骨髄、臍帯血、脾臓あるいは肝臓中に存在し、微量ながら末梢血にも存在する。これら造血幹細胞は、通常ＣＤ３４強陽性細胞であり、本発明においては高増殖能コロニー形成細胞（Ｈｉｇｈ−Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｃｏｌｏｎｙ−Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ（ＨＰＰ−ＣＦＣ））もこれに包含される。
【００２４】
本明細書において「前駆細胞」とは、多能性造血幹細胞から各系統の血液細胞が分化形態学的には同定できないがすでに血小板系など一方向の血液細胞にしか分化し得ない細胞を意味する。具体的には血小板コロニー形成細胞（ＣＦＣ−ＭＥＧ）、好酸球コロニー形成細胞（ＥＯ−ＣＦＣ）、顆粒球単球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤血球形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ）、Ｔ前駆細胞、Ｂ前駆細胞などである。これらはいずれもＣＤ３４陽性細胞である。
【００２５】
本明細書において、「血小板前駆細胞」とは、血小板へと分化し得る任意の未分化細胞を総称する用語として使用される。血小板前駆細胞としては、例えば、巨核球およびその前駆細胞（造血幹細胞、胚性幹細胞を含む）、造血幹細胞、胚性幹細胞から誘導された巨核球（例えば、ＯＰ９間質細胞上での培養および二極性血管芽細胞との共培養によって達成され得る）などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００２６】
本明細書において胚性幹細胞から巨核球への誘導は、ＯＰ９間質細胞上での培養および二極性血管芽細胞との共培養によって達成され得るが、ここでは、特に、Ａ）血管芽細胞（ＶＥＧＦタイプ２受容体；Ｆｌｋ−１，ＫＤＲ）かつｃ−ｋｉｔ陽性細胞から分化成熟すること；Ｂ）ＯＰ９ストローマ細胞との物理的な接触が、巨核球への分化成熟に必須であること；およびＣ）血小板産生はＯＰ９ストローマ細胞上においても可能であるが、ＯＰ９との接触を除いた条件にすることで促進されることからなる群より選択されることが重要であり得る。
【００２７】
本明細書において「巨核球」とは、「巨核細胞」とも呼ばれ、巨核芽球（ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔ）から生じる際、核分裂はおこるが核は分離せずに巨大な分葉核を形成する。核は、高倍数性である。細胞質に形成された分画膜（ｄｅｍａｒｃａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）により細胞質が崩壊して放出され、それらの多数の断片は血小板となる．骨髄のほか脾臓の赤髄や胚期の肝臓などにもある。
【００２８】
巨核球の前駆細胞は、骨髄、臍帯血または末梢血のいずれからでも得ることができる。骨髄液および末梢血は正常な供与者から得ることができる。
【００２９】
本明細書において、造血幹細胞は、骨髄液、臍帯血、末梢血などから得た多分化能を有する造血多能性幹細胞、造血コロニーを形成し得る未分化細胞を総称していることから、ＣＤ３４陽性細胞表面抗原を有する造血細胞を含む。末梢血においては、ＣＤ３４陽性細胞の数は全白血球の約０．１％しか構成しない。臍帯血においては、ＣＤ３４陽性細胞は全白血球の約０．１〜１％を構成する。典型的には正常な骨髄は１〜２％のＣＤ３４陽性細胞を含むのみである。白血球は勾配による遠心分離のような標準的な方法によって骨髄または臍帯血または末梢血から分離される。〔Ｇｅｉｇｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔａｂｌｅｓ，Ｖｏｌ ３，Ｃ．Ｌｅｎｔｎｅｒ，ｅｄ．Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９８４）〕。ライト−ギムザ染色法の解析では、骨髄内の 成熟した巨核球は該白血球集団の約０．０５％しか構成していない一方、巨核球系細胞に特異的な免疫染色は、約０．２％まで標識した。健康な個体内では、巨 核球の前駆細胞は該骨髄内で完全に分化するので、前駆細胞は正常な血液中には極く稀にしか発見されない。分離後、白血球は無血清培地において直ちに培養してもよい。好ましくは、造血未分化細胞を、該白血球集団から単離する。造血未分化細胞の単離は、ＣＤ３４陽性に特異的な抗体へのそれらの結合、それに続く磁気ビーズを用いた抗体結合幹細胞の分離に基づくものであってもよい〔Ｈａｒｄｗｉｃｋ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．１，３７９−３８６（１９９２）〕。単離された造血未分化細胞は、５，０００〜５００，０００細胞／ｍｌの密度範囲、好ましくは１０，０００細胞／ｍｌで培養中におかれる。いかなる組織培養フラスコまたはバッグまたは中空糸モジュールまたはフィルターモジュールが、静的または灌流培養システムのいずれにおいても使用し得る〔Ｋｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１１，３５８−３６３，Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｇ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９２／１１３５５〕。静的な培養システムが使用された場合、該細胞は栄養物を補給し、老廃物を除去するために５日〜７日の間隔で培地を供給される。細胞は７〜１４日、より好ましくは９〜１２日間培養される。この時間において、該細胞懸濁液は血小板減少症の治療において使用されるに適した巨核球前駆細胞の集団を含む。
【００３０】
フローサイトメーター分析が細胞表面抗原による標識に基づいて細胞表現型を決定するために行われた。ＣＤ３４陽性細胞は、造血未分化細胞を示し、ＣＤ６１（インテグリンβ３）陽性細胞は、巨核球系細胞を示す〔ＣＤ分類ハンドブック、癌と化学療法社〕。フローサイトメーターによる分析によれば、成熟した巨核球は、細胞質の増大、多核化を呈することから容易に成熟度を解析することが可能である。造血未分化細胞の主たる形質は、ＣＤ３４陽性ＣＤ６１陰性である。造血未分化細胞は、本発明により処理することにより効率的にＣＤ３４陽性ＣＤ６１陽性の巨核球前駆細胞への分化を促進し、さらにＣＤ３４陰性ＣＤ６１陽性の未成熟巨核球系細胞が増幅し得る。ＦＬＴ３リガンドおよび巨核球増殖因子により巨核球前駆細胞への分化を促進し、幹細胞因子と巨核球増殖因子により該巨核球前駆細胞の増殖を促進して、未成熟な巨核球が増幅される。
【００３１】
本発明により生産される細胞懸濁液は、多種の血液細胞の前駆細胞を含むと共に、巨核球前駆細胞、未熟な巨核球を含むが、さらに多種の造血因子を含めて培養することで、必要とされる巨核球系の細胞への分化が促進される。
【００３２】
本発明の巨核球前駆細胞の濃縮された細胞懸濁液は、癌治療によって生じたものに加え、さまざまなタイプの血小板減少症に効果的な治療を可能にする。このた め、ここに与えられる細胞懸濁液は、血小板減少症の治療において血小板注入に置き換わる可能性も示唆するものである。該上記の細胞集団は、化学療法等の後 の患者に投与された場合、該投与された細胞は、最終的に血小板を生成する巨核球を生成するためにｉｎ ｖｉｖｏでさらに分化することが期待される。さらにフィブリン凝塊アッセイの中においた時、該巨核球前駆細胞は成熟した巨核球を形成しそして血小板を放出 することが観察される。これらのアッセイからの結果は、該無血清培養からの細胞はそれらがｉｎ ｖｉｖｏの条件に帰された後でもさらなる成熟をすることができることを示唆する。
【００３３】
本明細書において、「ＣＤ抗原」とは、哺乳動物の細胞表面上、好ましくはヒト血球細胞上に存在する分化抗原の表現型を意味する。通常、この種の抗原はＣＤの番号をもっ て分類される。ＣＤはｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎの略で、モノクローナル抗体によって認識される抗原の一かたまり（ｃｌｕｓｔｅｒ）を意味する。具体的にはＣＤ３４、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８などを挙げることができる。他にもＴｈｙ−１、ＨＬＡ−ＤＲなどを挙げることができる。
【００３４】
本明細書において「サイトカイン」とは、細胞から放出され、細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子で、免疫応答の制御作用、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖・分化の調節作用などを示す物質であって、具体的にはインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ−１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１６（ＩＬ−１６）、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、好酸球コロニー刺激因子、血小板コロニー刺激因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞増殖因子、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３−リガンド、白血病阻害（阻止）因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、マクロファージ由来炎症性タンパク１α（ＭＩＰ−１α）などが挙げられ、好ましくはインターロイキン−３、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３−リガンド、ＭＩＰ−１αまたはエリスロポエチンなどが挙げられる。
【００３５】
本明細書において使用される造血因子として使用され得るサイトカインとしては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ），インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、巨核球増殖因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＬＴ３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３結合タンパク質などが示される。巨核球増殖因子は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）として知られ、生体内において巨核球を増殖する因子として報告されている〔Ｗｅｎｄｌｉｎｇ，Ｆ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９、５７１（１９９４）、寺村正尚，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ 血液，（１９９６）〕。また、該巨核球増殖因子は、Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社（ＵＳＡ）などから市販されている。ＦＬＴ３リガンドは、ＦＬＫ２リガンドと同一分子であり、遺伝子がクローニングされ、造血未分化細胞への作 用が報告される〔Ｌｙｍａｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｂｌｏｏｄ，８３，２７９５（１９９４）、岩間厚志，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ 血液，１２−３２（１９９５））。幹細胞因子は、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）としてＺｓｅｂｏらにより報告（Ｃｅｌｌ，６３，１９５−２０１（１９９０））された。この分子は、チロシンキナーゼｃ−ｋｉｔのリガンドであるＫＬ（Ｈｕａｎ，Ｅ．、Ｃｅｌｌ６３、２２５−２３３）、肥満細胞増殖因子ＭＧＦ（Ｍａｓｔ ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｅ．、Ｃｅｌｌ、６３、１６７−１７４（１９９０）〕と同一の分子であり、造血未分化細胞への作用が報告される〔下坂、実験医学増刊「サイトカインと情報伝達」，１８５，（１９９２）〕。またこれらの因子は、通常１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌで使用し得るが、好ましくは、１０から１００ｎｇ／ｍｌで使用し得る。
特に、造血幹細胞の培養において、分化を最大限に抑制して、自己増殖を促進するためには、ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−６を添加して用いることが好ましい。そのときの添加量は、ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯについては、１〜２０ ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、ＩＬ−６については、５０〜２００ ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００３６】
本発明においては、その他の成分をさらに含むことができる。このような成分としては、特に制限は無いが、例えば、可溶性サイトカイン受容体タンパク質が挙げられる。可溶性サイトカイン受容体タンパク質は、培養する造血幹細胞に対し、未分化維持を増強するといった作用をする。
【００３７】
このような可溶性サイトカイン受容体タンパク質としては、具体的には、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）を用いることが好ましい。そのとき、培地への添加量が、１００〜１０００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。このような可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）は、前述のサイトカインであるＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−６とともに用いることが好ましい。ＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒが複合体を形成し、これらがＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯによる造血幹細胞の未分化維持作用を増強するからである。
【００３８】
本明細書において「細胞株」とは、初代培養以後の培養細胞をすべて指し、初代培養に存在した細胞または細胞群からの一連の系統を意味する。この培養細胞は初代細胞と共存していてもよいし、互いに触れ合っている状態で存在してもよいし、あるいは水、電解質などの液体、培地、培養液等の媒介物を介した状態で存在してもよい。
【００３９】
造血幹細胞は、分化して造血前駆細胞となり、さらに分化して前述の分化細胞となる。造血幹細胞も造血前駆細胞もいずれも多能性を有するものであるが、分化細胞は多能性を有しない。本来、造血幹細胞と造血前駆細胞は区別されるべきものであるが、概念上の定義であることもあり、しばしば区別せずに用いられる。本発明においても、造血幹細胞と造血前駆細胞の両方を併せて「造血幹細胞」という用語で標記している。用語の定義については、例えば「血液幹細胞の運命（羊土社）須田年生著」に詳しい記載がある。
【００４０】
本明細書において「ＣＤ３４陽性細胞」とは、抗原表現型の一つであるＣＤ３４を発現している細胞を意味し、具体的には多能性造血幹細胞、ＨＰＰ−ＣＦＣ等の造血幹細胞、リンパ球系幹細胞、骨髄系幹細胞等の幹細胞、Ｔ前駆細胞、Ｂ前駆細胞、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＭＥＧ、ＥＯ−ＣＦＣ、ＣＦＵ−ＧＭ等の前駆細胞が これに該当する。
【００４１】
本明細書において「ＣＤ３４強陽性細胞」とは、抗原表現型の一つであるＣＤ３４を特に強く発現している細胞を意味し、具体的には高増 殖能コロニー形成細胞（Ｈｉｇｈ−Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｃｏｌｏｎｙ−Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ （ＨＰＰ−ＣＦＣ））または多能性造血幹細胞それ自体、またはこれら細胞をより多く含んでいるＣＤ３４陽性細胞群を意味する。
【００４２】
本明細書において「ＣＤ３４陰性細胞」とは、抗原表現型の一つであるＣＤ３４を発現していない機能細胞を意味し、具体的にはＴ細胞を含むＴ前駆細胞以後のＴ細胞系列の細胞、Ｂ細胞を含むＢ前駆細胞以後のＢ細胞系列の細胞、赤血球を含むＣＦＵ−Ｅ以後の赤血球系列の細胞、血小板を含むＣＦＣ−ＭＥＧ以後の血小板系列の細胞、好酸球を含むＥＯ−ＣＦＣ以後の好酸球系列の細胞または単球、好中球もしくは好塩基球を含むＣＦＵ−ＧＭ以後の単球、好中球もしくは好塩基球系列の細胞である。本願において使用される、上述のような「陽性」、「強陽性」、「弱陽性」、および「陰性」なる用語は、場合によっては、各々単に「＋」（プラス）、「ｈｉｇｈ＋」、「ｌｏｗ」および「−」（マイナス）と表記される。例えば、「ＣＤ３４ｈｉｇｈ＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−」とは、ＣＤ３４を強く発現しており（強陽性）、かつＣＤ３８を弱く発現しているか若しくは発現していない（弱陽性または陰性）ことを意味する。
【００４３】
本明細書において「ストローマ細胞」とは、骨髄、脾臓などに由来する基質細胞または間質細胞を指し、本願発明においては、ヒトのＣＤ３４陽性細胞を増殖する能力を有するストローマ細胞であれば、どのようなストローマ細胞も用いることができる。例えば、ＨＥＳＳ−１、ＨＥＳＳ−５（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５７６８）、ＨＥＳＳ−１８（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８７）、ＨＥＳＳ−Ｍ２８（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８６）、ＳＳＸＬ ＣＬ．１、ＳＳＸＬ ＣＬ３、ＳＳＸＬ ＣＬ．７、ＳＳＸＬ ＣＬ．９およびＳＳＸＬ ＣＬ．１７と各々命名されたマウス由来のストローマ細胞が例示される。好ましくは、ＨＥＳＳ−５（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５７６８）、ＨＥＳＳ−１８（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８７）、ＨＥＳＳ−Ｍ２８（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８６）、またはＳＳＸＬ ＣＬ３であり、特に好ましくは、ＨＥＳＳ−５（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５７６８）、ＨＥＳＳ−１８（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８７）、ＨＥＳＳ−Ｍ２８（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６１８６）である。
【００４４】
造血幹細胞は、主として骨髄中に多く存在することが知られており、骨髄移植は、急性白血病をはじめとする腫瘍性血液疾患や、重症免疫不全、アデノシンデアミナーゼ欠損症、再生不良性貧血等の疾患に対する治療法として、中心的位置を占めている。近年、造血幹細胞が少量ながら末梢血にも存在することが明らかになった。そのため、造血幹細胞を含む末梢血に顆粒球コロニー刺激因子製剤（Ｇ−ＣＳＦ）を投与したものを用いた移植も普及しつつある（新しい造血幹細胞移植、南江堂、１９９８）。この方法は、骨髄移植が大量の骨髄細胞を必要とするためドナーの心身への負担が大きいのに対して、ドナーに対して心身への負担が軽減され、また白血球や血小板の回復が早いという利点がある。しかし、比較的高用量のＧ−ＣＳＦによる副作用もしばしば見られるため、骨髄採取よりは簡便であるが、決してドナーの安全性が高いとは言い切れない（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３，１０１−１０４，１９９７）。
【００４５】
また近年、臍帯血が骨髄と同程度の造血幹細胞を含むことが明らかにされ、移植治療に有用であることが明らかにされた（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２１，１１７４−１１７８，１９８９）。臍帯血は、骨髄や末梢血と比べて重症の急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生率が低く、その有用性が期待されている。しかしながら臍帯血の場合、採取量の少なさが問題とされ、１個体に由来する臍帯血の量では、体重４０ｋｇ程度までのレシピエントにのみ移植可能であることが問題である。（Ｂｌｏｏｄ，８７，３０８２，１９９６）。
【００４６】
本明細書において造血幹細胞は、ＣＤ３４陽性の細胞集団として濃縮することができる。しかも不要な細胞、具体的には、骨髄球系細胞には分化しないリンパ球系細胞等を除去できる可能性があることから（Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ａｎｎ．，２，７８，１９９４）、今日では、ＣＤ３４陽性細胞移植が行われるようになった（Ｂｌｏｏｄ，７７，１７１７，１９９１；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２，２８，１９９４）。このため、前記のとおり造血幹細胞を多く含む臍帯血の採取量が少ないという問題を解決すべく、造血幹細胞を生体外で効率的に増幅する試みは近年盛んに行われている（Ｂｌｏｏｄ，８７，３０８２−３０８８，１９９６）。ここで、造血幹細胞の増幅とは、造血幹細胞が分化により、多能性を有しない分化細胞に分化し、増殖していくことと、造血幹細胞の自己増殖との両方を含む意味で用いられる。
【００４７】
本明細書において、これまでに報告されたＣＤ３４陽性細胞の増幅においては、増殖を促進する物質として、サイトカインが用いられてきた。サイトカインの候補としては幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン１（ＩＬ−１β）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、顆粒球・マクロファージコロニー形成因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー形成因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー形成因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（ＰＩＸＹ３２１）などの種々のサイトカインを組み合わせた増幅法が研究されている。しかし、サイトカインの組み合わせによるＣＤ３４陽性細胞の増幅では、培養後の全血球細胞数は増加するものの、培養中に造血幹細胞の分化が誘導され、結果的には最終分化したＣＤ３４陰性の血球細胞が増加する一方で、ＣＤ３４陽性細胞自体はほとんど枯渇されてしまうと考えられている（Ｂｌｏｏｄ，８７，３０８２−３０８８，１９９６）。現時点では造血幹細胞を未分化の状態に維持したまま自己増殖を促進することが可能なサイトカインは単離されていない。
【００４８】
本発明において使用され得る、ＣＤ３４陽性細胞の他の増幅方法として、ヒト骨髄由来のストローマ細胞を株化し、この上で造血幹細胞・前駆細胞を維持・増殖させる方法が試みられている（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２２，４８２−４８７（１９９４））。また、特開平１０−２９５３６９号公報には、哺乳動物由来のストローマ細胞とＣＤ３４陽性細胞を、共培養することによりＣＤ３４陽性造血幹細胞を製造する方法が開示されている。しかし、この方法では、ＣＤ３４陽性細胞が分化していくために造血幹細胞自体はほとんど増幅しないか、むしろ最初の時点より減少してしまう。そのため、移植してもやがては血球細胞が枯渇するおそれがあり、移植のための技術としては不適当である。
【００４９】
本発明において使用され得る、さらに別の方法として、培養するＣＤ３４陽性細胞とストローマ細胞との接触がなくても、ストローマ細胞から産生される液性因子のみでＣＤ３４陽性細胞を培養することにより、ＣＤ３４陽性細胞を増幅することができるとの報告もある（国際特許出願公開第９３／２０１８４号公報）。しかし、この方法においても造血幹細胞は分化するのみで自己増殖しないために、上記方法と同様の理由で移植のための技術としては不適合である。
【００５０】
さらに別の局面においては、本発明は、細胞培養キットであって、前述の細胞培養器材のいずれかと、栄養培地と、サイトカインとを含み、ヒト由来のＣＤ３４陽性細胞を哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞と共に培養するために使用されるものである。
サイトカインとしては、ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−６を用いることが好ましく、これに加え、可溶性サイトカイン受容体タンパク質である可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）を加えることがさらに好ましい。栄養培地は、通常、細胞を培養するのに必要な栄養培地を用いることができる。
【００５１】
本明細書において使用され得る「培地」または「栄養培地」とは、天然培地、半合成培地、合成培地、固形培地、半固形培地、液体培地などが挙げられるが、前述に定義されるＣＤ３４陽性細胞を、自己を 含めた増殖、分化、成熟または保存させるために用いられるものであり、通常、細胞培養に用いられるようなものであれば如何なる培地であってもよい。例を挙げると、たとえばα−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地またはＭＥＭ基本培地などが挙げることができる。基本成分としてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有することもできる。
【００５２】
本発明において使用され得る培養容器は、所望の細胞が維持・生存でき、刺激に応じて分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる素材、形状のものを用いてもよい。具体的には培養容器の素材としてはガラス、合成樹脂、天然樹脂、金属、プラスチックなどが挙げられ、形状としては具体的には三角柱、立方体、直方体などの多角柱、三角錐、四角錐などの多角錘、ひょうたんのような任意の形状、球形、半球形、円柱（底面が円形、楕円形または半円形等を含む）などを挙げることができ、また例えば半球形から球形のように培養中に必要に応じて形状を変化させてもよい。培養は開放条件下であってもよいし、閉鎖（密閉）条件下であってもよい。
【００５３】
このような栄養培地としては、細胞培養に用いられるようなものであれば如何なる栄養培地を用いてもよく、栄養培地の種類としては、天然培地、半合成培地、合成培地、固形培地、半固形培地、液体培地などが挙げられる。具体的には、α−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地またはＭＥＭ基本培地などを挙げることができる。
【００５４】
培養するにあたり、温度、浸透圧、光などの物理的環境条件、酸素、炭酸ガス、ｐＨ、酸化還元電位などの化学的環境条件としては死滅処理前のストローマ細胞が維持・生存でき、ＣＤ３４陽性細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる環境条件であってもよい。好ましい条件を以下に示す。
【００５５】
温度については具体的には、３０℃〜４０℃であり、好ましくは３７℃である。浸透圧については具体的には生理条件における浸透圧であり、好ましくは生理食塩水と等しい浸透圧である。
【００５６】
光は暗室ほどの暗い条件であってもよいし、晴天時の外の明るさほどに明るくてもよい。
【００５７】
酸素濃度としては具体的には培養系が気相中の酸素濃度が１０％の気相と接触している状態での溶存酸素濃度〜気相中の酸素濃度が３０％の気相と接触している状態での酸素濃度であってもよく、好ましくは気相中の酸素濃度が２０％の気相と接触している状態での溶存酸素濃度の気相と接触している状態での酸素濃度である。
【００５８】
培養系において一般的にｐＨをコントロールするためのｐＨとして具体的にはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０であり、好ましくは生理条件と同等のｐＨである。ｐＨをコントロールする為には二酸化炭素を用いてもよいし、他のいかなる緩衝液を用いてもよい。炭酸ガスの濃度としては具体的には培養系が５％の気相と接触している状態での溶存炭酸ガス濃度である。
【００５９】
（Ｌｎｋ）
本明細書において、Ｌｎｋとは、ＳＣＦの受容体ｃ−Ｋｉｔのキナーゼドメインに結合するタンパク質をいう。Ｌｎｋ 欠損により生じるＢ細胞過剰産生の分子機構を明らかにし，さらに Ｌｎｋ が造血幹細胞の増殖およびその機能制御に深く関与していることは明らかになっているが、血小板産生に関わるかどうかは明らかではなかった。
【００６０】
そのようなＬｎｋ遺伝子としては、例えば、
（Ａ）（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体である、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含む、
核酸分子；あるいは
（Ｂ）（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
を含む、
ポリペプチドをコードする核酸分子、あるいはそれがコードするポリペプチドが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６１】
マウスLnk
ヌクレオチド配列
atgaacgagcccaccgtgcagccgtcccgcacatcctccgcacccgcctcgccggcatccccacgcggctggagcgacttctgcgagcagcacgcagcagcggcggcccgggagctggcccgccagtactggttgtttgcgcgcgcgcacccacagccgccgcgcgcggacctggtgtcgctgcagttcgcggagctcttccagcgccacttctgccgggaggtgcgcgagagcctcgcaggaccgccgggtcacgactaccgcgccactgctccgccccgccccgcgctgcccaaggcacgcagctccgaggacctgggcccgcggcccgcctgtgccctgcagcacctgcgccgcggcctgcgccagctcttccgccgccgctcggcaggggagctgcccggggctaccagtgacaccaatgacatcgacaccaccgcagccagcaggccgggcccggcccgcaagttgctaccctggggcctgcgagagccgcccactgaggcgctcaaggaggtcgtattgcgctatagcctggcggacgaggcagcaatggacagcggcgcacgctggcagcggggtcgcctggtgcttcggtctccaggtccgggccacagccactttctgcagctcttcgatccgcccaagagctcaaagcccaagctccaagaggcctgttccagcatccgggaggtccgaccatgtacacgcctggagatgcctgacaacctctacacctttgtgttgaaggtgcaggaccagacagacatcatctttgaggtgggagatgaacagcagctgaactcatggctggcagagctcagggcaagcacaggccttgggctggagcacccggacaccgagttacctctttccttagcggcagagcctggcccagctagatccccaaggggaagcactgactccctggaccaaggtgcttcacctggggtgttgctggacccagcctgccagaaaacagatcacttcctatcctgctacccctggttccacggccccatctccagggtgagggctgcacagctggtccagctccagggccctgatgcccacggcgtgttcctggtgcggcagagtgagtcccggagaggagagtatgtactcacattcaacttacagggcagagccaagcacttacgcctggtgctcacagagcgtggacagtgccgggtgcaacacctgcacttcccctcggtggtagatatgctccgccacttccagcgttctcctatcccactggaatgtggagcagcttgtgacgtccgactctctggctatgtggtagtcctctctcaggcaccaggttcctccaacaccgtcctcttccctttttcccttcctcactgggattcggagctgggtcatccccacctcagctctgttggctgtccccccagccatggtgcagaggctctccctggccaagtgacaccacctgagcagatcttccacctggtgccttctcctgaggaactggccaacagtctgcggcagctggagctcgagtctgtgagcagtgcccgggactcggactatgacatggactcctcttcacggggccaccttcgggccattgacaaccagtacacccctctctcacagctgtgcagagaggcagacgtg（配列番号１）
アミノ酸配列
MNEPTVQPSRTSSAPASPASPRGWSDFCEQHAAAAARELARQYWLFARAHPQPPRADLVSLQFAELFQRHFCREVRESLAGPPGHDYRATAPPRPALPKARSSEDLGPRPACALQHLRRGLRQLFRRRSAGELPGATSDTNDIDTTAASRPGPARKLLPWGLREPPTEALKEVVLRYSLADEAAMDSGARWQRGRLVLRSPGPGHSHFLQLFDPPKSSKPKLQEACSSIREVRPCTRLEMPDNLYTFVLKVQDQTDIIFEVGDEQQLNSWLAELRASTGLGLEHPDTELPLSLAAEPGPARSPRGSTDSLDQGASPGVLLDPACQKTDHFLSCYPWFHGPISRVRAAQLVQLQGPDAHGVFLVRQSESRRGEYVLTFNLQGRAKHLRLVLTERGQCRVQHLHFPSVVDMLRHFQRSPIPLECGAACDVRLSGYVVVLSQAPGSSNTVLFPFSLPHWDSELGHPHLSSVGCPPSHGAEALPGQVTPPEQIFHLVPSPEELANSLRQLELESVSSARDSDYDMDSSSRGHLRAIDNQYTPLSQLCREADV（配列番号２）。
【００６２】
リンパ系組織に発現するアダプター蛋白質でもある Ｌｎｋ およびそのファミリー蛋白質群に着目して解析している（医科研Ｎｏｗ，ｖｏｌ．１７，Ｐ４−５，１９９１）。Ｌｎｋは主にリンパ組織で発現されるＳＨ２ドメインを持つアダプター蛋白質である。Ｌｎｋ欠損マウスではＴ細胞分化に異常はないものの、脾臓での幼若Ｂ細胞の蓄積、ＳＣＦ反応性亢進による骨髄Ｂ前駆細胞の過剰産生が観察され、Ｌｎｋ がＢ 細胞の産生を制御していることがわかった。またＬｎｋ はＰＨ ドメインも持つ６８ ｋＤａ の蛋白質であることを明らかにしている（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：５９９，２０００）。Ｌｎｋはシグナル伝達の抑制分子として働くアダプター蛋白質ファミリーの一員と考えられる。
【００６３】
Ｌｎｋはｃ−Ｋｉｔシグナル伝達系を制御しＢ細胞産生の恒常性維持に重要な働きを持つこと、Ｌｎｋ 欠損マウスではｃ−ｋｉｔ を介する増殖シグナルが増強されていることが示された。Ｌｎｋ 遺伝子の過剰発現は前駆Ｂ細胞のみならずＢ細胞系列の増殖や分化の抑制、Ｔ細胞の分化の抑制も惹起する（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２８５０，２００３）。Ｌｎｋ は造血前駆細胞にも発現しており、その欠損により造血前駆細胞の増殖および造血能が著しく亢進する（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９５：１５１，２００２）。Ｌｎｋはｃ−Ｋｉｔ活性化によるＧａｂ２ のリン酸化、ＭＡＰＫの活性化を抑制する。これらの知見は造血前駆細胞の増殖・分化機構の理解および制御法開発に大きく貢献すると期待している。最近、Ｌｎｋ欠損マウスで造血幹細胞の比率が著明に増加していることが分かったので、造血幹細胞の増殖を負に調節するＬｎｋの研究インパクトは大きく拡がると考えている。Ｌｎｋの作用を阻害する変異体の作製にも成功しており、Ｌｎｋ機能の遮断により造血幹細胞の機能制御に応用できる可能性が示されている（図１２）。
【００６４】
Ｌｎｋファミリーアダプター蛋白質に属するＡＰＳの遺伝子欠損マウスはリンパ球や顆粒球にＬｎｋとは異なる異常が観察されている（未発表）。ＳＨ２−Ｂ欠損マウスはリンパ球の分化には異常が認められないものの、生殖細胞の分化に異常が観察されている（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２２：３０６６，２００２）。このように、Ｌｎｋファミリーアダプター蛋白質の研究は幹細胞や前駆Ｂ細胞の発生・増殖制御の研究に新しい機構解明に役立つ。
【００６５】
本明細書において「Ｌｎｋの産物レベルによる阻害」とは、Ｌｎｋの遺伝子産物であるタンパク質またはその翻訳後修飾物（例えば、糖タンパク質）の活性または量が減少することによってその発揮される機能が減少または無くなることをいう。そのような阻害には、機能しない改変体が天然物に置き換わって発現することも包含される。あるいは、Ｌｎｋの抗体による阻害により、そのような阻害が実現され得る。
【００６６】
本明細書において「因子」としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）であってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６７】
本明細書において「Ｌｎｋファミリーメンバーの阻害因子（インヒビター）」とは、Ｌｎｋファミリーの任意のメンバーを阻害することができる任意の因子をいう。そのような因子としては、例えば、Ｌｎｋファミリーの任意のメンバーの本来の機能を失った改変体のうち天然物と複合体を形成し天然物の働きを阻害する改変体、Ｌｎｋに対する抗体、Ｌｎｋに結合するタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子、これらの複合分子が挙げられる。また、Ｌｎｋファミリーの任意のメンバーの遺伝子発現を阻害するタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子、これらの複合分子を挙げることができる。
【００６８】
Ｌｎｋインヒビターであるかどうかは、以下の試験手法により確認することができる。ＳＣＦ依存性に増殖する細胞株に遺伝子導入によりＬｎｋを過剰発現させる。このＬｎｋ過剰発現によりＳＣＦ依存性増殖ができなくなった遺伝子導入細胞株に発現あるいは作用させて、ＳＣＦ依存性増殖の回復を指標としてＬｎｋインヒビターとしての作用を確認する。ＳＣＦ依存性に増殖する細胞株の代わりにＴＰＯ依存性に増殖する細胞株およびＥＰＯ依存性に増殖する細胞株を用いることもできる。
【００６９】
また、Ｌｎｋの発現を低下させるものかどうかについては、内因性にＬｎｋを発現しているＥＳ細胞に作用させ、Ｌｎｋの発現低下が生じるかどうかをウェスタンブロット法により検討する。
【００７０】
細胞内局在に影響を与えるかどうかについては、蛍光蛋白質とＬｎｋのキメラ蛋白質を遺伝子導入により発現させた線維芽細胞株に作用させ、Ｌｎｋの細胞内局在を蛍光顕微鏡により観察して検討する。
【００７１】
本明細書において「幹細胞因子（ＳＣＦ）」（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒまたはｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦともいう）は、造血幹細胞では注目されている因子である。ＳＣＦの代表例は、配列番号５（核酸配列）および配列番号６（アミノ酸配列）によって示される配列を有する。
【００７２】
ＳＣＦは、骨髄ストローマ細胞により生成され、多能性幹細胞、ＣＦＵ−ＧＭのＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−Ｍｅｇなどの骨髄系細胞、リンパ系幹細胞に作用し、これらの分化を支持する。すなわち造血幹細胞から分化細胞へのほぼすべての系統の分化段階の細胞に作用して、他のサイトカインによる最終分化段階への分化誘導する作用を助けるとされる（北村聖（Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ）、サイトカインの最前線、羊土社、平野俊夫（Ｔ．Ｈｉｒａｎｏ）編、１７４頁〜１８７頁、２０００）。しかし、ＳＣＦ単独の作用は弱く、他の因子と協働でなければ充分に機能しないようである。例えば、ＳＣＦは、インターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などの他のサイトカインの存在下で、造血幹細胞の分化・増殖を強く誘導する。また、肥満細胞、赤芽球系前駆細胞、顆粒球マクロファージ系前駆細胞、巨核球系前駆細胞などの分化・増殖も誘導する。
【００７３】
従って、ＳＣＦは分化そのものを制御するというよりは、多くの種類の造血系細胞の生存を支持しながら、種々のサイトカインに対する反応性を高めると位置づけることができる。
【００７４】
（遺伝子工学）
本発明において用いられるＬｎｋなどならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産および導入することができる。
【００７５】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドであり得る。
【００７６】
本明細書において「ウイルスベクター」とは、ベクターのうち、ウイルス由来のものをいう。本明細書において「ウイルス」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをゲノムとして有する、感染細胞内だけで増殖する感染性の微小構造体をいう。ウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科およびヘパドナウイルス科からなる群より選択される科に属するウイルスが挙げられる。本明細書において「レトロウイルス」とは、ＲＮＡの形で遺伝情報を有し、逆転写酵素によってＲＮＡの情報からＤＮＡを合成するウイルスをいう。
【００７７】
本明細書において「レトロウイルスベクター」とは、レトロウイルスを遺伝子の担い手（ベクター）として使用した形態をいう。本発明において使用される「レトロウイルスベクター」としては、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）、Ｍｕｒｉｎｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｖｉｒｕｓ（ＭＳＣＶ）にもとづいたレトロウイルス型発現ベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、レトロウイルスベクターとしては、ｐＧｅｎ−、ｐＭＳＣＶなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７８】
本明細書において「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。ヒトの場合、本発明に用いる発現ベクターはさらにｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ Ｈ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ；１０８：１９３−９（１９９１））を含み得る。
【００７９】
本発明は、任意の動物において利用され得る。そのような動物における利用のための技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
【００８０】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、動物細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。
【００８１】
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。
【００８２】
このようなスクリーニングまたは同定の方法は、当該分野において周知であり、例えば、そのようなスクリーニングまたは同定は、マイクロタイタープレート、ＤＮＡまたはプロテインなどの生体分子アレイまたはチップを用いて行うことができる。スクリーニングの試験因子を含む対象としては、例えば、遺伝子のライブラリー、コンビナトリアルライブラリーで合成した化合物ライブラリーなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８３】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、疾患または障害の調節因子を同定する方法を提供する。このような調節因子は、それぞれの疾患の医薬またはそのリード化合物として用いることができる。そのような調節因子ならびにその調節因子を含む医薬およびそれを利用する治療法もまた、本発明の範囲内にあることが意図される。
【００８４】
したがって、本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。
【００８５】
本発明は、他の実施形態において、本発明の化合物に対する調節活性についての有効性のスクリーニングの道具として、コンピュータによる定量的構造活性相関（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ＝ＱＳＡＲ）モデル化技術を使用して得られる化合物を包含する。ここで、コンピューター技術は、いくつかのコンピュータによって作成した基質鋳型、ファーマコフォア、ならびに本発明の活性部位の相同モデルの作製などを包含する。一般に、インビトロで得られたデータから、ある物質に対する相互作用物質の通常の特性基をモデル化することに対する方法は、最近ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭ ファーマコフォア法（Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：４７７〜４８９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８８：２１〜２９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９０：４２９〜４３８，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９１：４２４〜４３３，１９９９）および比較分子電界分析（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｉｅｌｄ ａｎａｌｙｓｉｓ；ＣｏＭＦＡ）（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ＆ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，２４：１〜６，１９９６）などを使用して示されている。本発明において、コンピュータモデリングは、分子モデル化ソフトウェア（例えば、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭバージョン４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）など）を使用して行われ得る。
【００８６】
活性部位に対する化合物のフィッティングは、当該分野で公知の種々のコンピュータモデリング技術のいずれかを使用してで行うことができる。視覚による検査および活性部位に対する化合物のマニュアルによる操作は、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，１９９２）、ＳＹＢＹＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，１９９２）、ＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６：７６５−７８４，１９８４）、ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，４：１８７〜２１７，１９８３）などのようなプログラムを使用して行うことができる。これに加え、ＣＨＡＲＭＭ、ＡＭＢＥＲなどのような標準的な力の場を使用してエネルギーの最小化を行うこともできる。他のさらに特殊化されたコンピュータモデリングは、ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８：８４９〜８５７，１９８５）、ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：２９〜３４，１９９１）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ ａｎｄ Ｏｌｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓ ｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：１９５〜２０２，１９９０）、ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１：２６９〜２８８，（１９８２））などを含む。さらなる構造の化合物は、空白の活性部位、既知の低分子化合物における活性部位などに、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６：６１〜７８，１９９２）、ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ ａｎｄ Ｉｔａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７：８９８５，１９９１）、ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などのようなコンピュータープログラムを使用して新規に構築することもできる。このようなモデリングは、当該分野において周知慣用されており、当業者は、本明細書の開示に従って、適宜本発明の範囲に入る化合物（例えば、所望の校正機能を付与する化合物など）を設計することができる。
【００８７】
本発明のスクリーニング方法によって使用される因子は、血小板分化の調節、同定、濃縮または増殖に使用され得る。
【００８８】
（遺伝子発現抑制）
本明細書においてドミナントネガティブ法とは、発現すると変異型の表現型（特に、もとの遺伝子の抑制型）になることになることをいう。例えば、転写因子の代わりに、抑制因子に機能変換した転写因子を用いると、機能重複する転写因子に優先して標的遺伝子の発現を抑制し、ドミナントネガティブ型の表現型をもたらす。ドミナントネガティブ技術においてリプレッションドメイン（例えば、アミノ酸配列LDLELRLGFA）を用いることによって、目的とする核酸分子の転写を抑制することができる。ドミナントネガティブ法は、実施例に記載されているような手法を用いることができる。
【００８９】
本明細書において「ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）」とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）によって配列特異的にｍＲＮＡが分解されることによって、タンパク質への翻訳が阻害され、遺伝子発現が抑制される現象をいう。ＲＮＡｉの利点の一つとして、弱いものから強いものまで様々なレベルの発現抑制が個々の遺伝子によって取得され得ること挙げられる。現在、ＲＮＡｉは、簡便かつ有効な遺伝子発現抑制法として利用されている。好ましい実施形態において、「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書においてＲＮＡｉはまた、場合によっては、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。
【００９０】
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【００９１】
理論に束縛されないが、ＲＮＡｉが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡｉを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にＲＮＡｉによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したｓｉＲＮＡを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡそのものをＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。
【００９２】
また、理論に束縛されることを希望しないが、ｓｉＲＮＡは、上記経路とは別に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子が有用であることが理解される。
【００９３】
本発明においてｓｉＲＮＡと呼ばれる、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患（例えば、血小板減少に伴う出血性疾患全般（例；抗ガン剤治療時の血小板減少症、本態性血小板減少症、など））の治療、予防、予後などに使用することができる。
【００９４】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態を採っていてもよい。
【００９５】
別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ；ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）であり得る。本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなｓｈＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【００９６】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
【００９７】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてＲＮＡｉが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【００９８】
本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子としてはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明の処置方法および組成物において有用である。
【００９９】
本明細書において「アンチセンス（活性）」とは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制または低減することができる活性をいう。アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列を有する分子を本明細書において「アンチセンス分子」、「アンチセンス核酸分子」または「アンチセンス核酸」と称し、これらは互換的に使用される。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、もっとも好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の５’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、１つまたは数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有するものもまた含まれる。本明細書中で開示される核酸配列（例えば、配列番号１または３）が与えられれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋ塩基対形成の法則またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成の法則に従い設計され得る。アンチセンス核酸分子は、シグナル伝達因子のｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学合成または酵素的連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはその分子の生物学的安定性を増加させるかもしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成された二本鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々の改変ヌクレオチドを用いて（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る）化学合成され得る。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例として、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１００】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
【０１０１】
プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
【０１０２】
（投与・注入・医薬）
本発明の因子によって調製された細胞（例えば、幹細胞、それから分化した細胞（例えば、血小板））または細胞組成物は、生物への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。投与経路としては経口投与、非経口投与、患部への直接投与などが挙げられる。
【０１０３】
注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法も使用され得る。
【０１０４】
１つの実施形態において、本発明の因子（例えば、Ｌｎｋインヒビターなど）は、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。
【０１０５】
本発明の組成物またはキットはまた、さらに生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、グリコール酸・乳酸の共重合体、エチレンビニル酢酸共重合体、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレートからなる群より選択される少なくとも１つを含み得る。成型が容易であることからシリコーンが好ましい。生分解性高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、α−ヒロドキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸など）およびヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸など）からなる群より選択される１種以上から無触媒脱水重縮合により合成された重合体、共重合体またはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸など）、無水マレイン酸系共重合体（例えば、スチレン−マレイン酸共重合体など）のポリ酸無水物などが挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよく、α−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−体、Ｌ−体、ＤＬ−体のいずれでも用いることが可能である。好ましくは、グリコール酸・乳酸の共重合体が使用され得る。
【０１０６】
核酸分子を含む本発明の組成物を投与する場合、核酸分子は、非ウイルスベクター形態またはウイルスベクター形態による投与、またはｎａｋｅｄ ＤＮＡでの直接投与の形態などで投与され得る。このような投与形態は、当該分野において周知であり、例えば、別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社、１９９６；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに詳説されている。
【０１０７】
特定の実施形態において、本発明の正常な遺伝子の核酸配列、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０１０８】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。
【０１０９】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０１１０】
非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクチン法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などが利用され得る。発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ １０８：１９３−９、Ｎｉｗａ Ｈ，Ｙａｍａｍｕｒａ Ｋ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｊ（１９９１））、ｐＢＪ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅなどから入手可能である）などが挙げられる。
【０１１１】
ＨＶＪ−リポソーム法は、脂質二重膜で作製されたリポソーム中に核酸分子を封入し、このリポソームと不活化したセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ、ＨＶＪ）とを融合させることを包含する。このＨＶＪ−リポソーム法は、従来のリポソーム法よりも、細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とする。ＨＶＪ−リポソーム調製法は、別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社、１９９６；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７に詳述されている。ＨＶＪとしては、任意の株が利用可能であり（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９０７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１０５など）、Ｚ株が好ましい。
【０１１２】
本発明の組成物は、ウイルスベクターの核酸形態で提供される場合、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターが利用される。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、Ｌｎｋ改変体をコードする核酸またはＬｎｋ改変体をコードする核酸を導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。これらウイルスベクターでは、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスベクターによる効率よりも遙かに高いことから、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。
【０１１３】
Ｎａｋｅｄ ＤＮＡ法の場合、上述の非ウイルスベクターである発現プラスミドを生理食塩水などに溶解し、そのまま投与する。例えば、Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ，Ｋｅａｒｎｅｙ Ｍ，Ｃｈｅｎ Ｄ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｍ，Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｓ，Ｙａｎｇ Ｊ，Ｓｙｍｅｓ ＪＦ，Ｉｓｎｅｒ ＪＭ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９８（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ）、３８２−３８８（１９９７）に記載される方法により、生物の器官の組織などに直接注入することができる。
【０１１４】
本発明において調製された細胞を含む組成物において含まれる細胞の量は、例えば、約１×１０３細胞〜約１×１０１１細胞、好ましくは約１×１０４細胞〜約１×１０１０細胞、より好ましくは約１×１０５細胞〜約１×１０９細胞などであり得る。これらの細胞は、例えば、約０．１ｍｌ、０．２ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌの生理食塩水のような溶液として存在し得る。細胞の量の範囲の上限としては、例えば、約１×１０１１細胞、約５×１０１０細胞、約２×１０１０細胞、約１×１０１０細胞、約５×１０９細胞、約２×１０９細胞、約１×１０９細胞、約５×１０８細胞、約２×１０８細胞、約１×１０８細胞、約５×１０７細胞、約２×１０７細胞、約１×１０７細胞などが挙げられる。細胞の量の下限としては、例えば、約１×１０３細胞、約２×１０３細胞、約５×１０３細胞、約１×１０４細胞、約２×１０４細胞、約５×１０４細胞、約１×１０５細胞、約２×１０５細胞、約５×１０５細胞、約１×１０６細胞などが挙げられる。
【０１１５】
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法を医師、患者など投与を行う人に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の血小板などの医薬を投与する方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０１１６】
（疾患）
本発明が対象とする「疾患」は、一定量の血小板を必要とするものであれば、どのようなものでもよい。本発明により処置され得る疾患または障害は、本発明の血小板の障害に関連する疾患または障害であり得る。 本明細書において、「粘性の高い血液」とは、粘性が高い血液一般をいい、このような血液は、通常、血栓を起こしやすい。例えば、動脈硬化などの原因になりやすいといわれる。そのような粘性の測定方法としては、例えば、血液流動性測定装置（たとえば、千代田パラメディカルケアーセンター株式会社；Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ Ｆｌｏｗ Ａｎａｌｙｚｅｒ （ＭＣ−ＦＡＮ））を用いることによって、チップ内の流路（幅７μｍ）を通過する全血の速度を測定し、血液の流動性（粘性）を測定することができる。
【０１１７】
本明細書において「粘性の高い血液に由来する疾患」には、例えば、高脂（質）血症、全身の動脈硬化、閉塞性動脈硬化症、糖尿病、脳梗塞、急性冠症候群（心筋梗塞、狭心症）などを挙げることができる。
【０１１８】
本発明はまた、血小板の異常に関連する任意の疾患を処置することができ、例えば血小板減少に伴う出血性疾患全般（例；抗ガン剤治療時の血小板減少症、本態性血小板減少症、など）などを挙げることができる。
【０１１９】
１つの実施形態において、上記疾患または障害としては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：貧血（例えば、再生不良性貧血（特に重症再生不良性貧血）、腎性貧血、癌性貧血、二次性貧血、不応性貧血、外傷後出血など）、癌または腫瘍（例えば、白血病）およびその化学療法処置後の造血不全、血小板減少症、急性骨髄性白血病（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群）、第２寛解期以降の寛解期）、急性リンパ性白血病（特に、第１寛解期、第２寛解期以降の寛解期）、慢性骨髄性白血病（特に、慢性期、移行期）、悪性リンパ腫（特に、第１寛解期（Ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ群）、第２寛解期以降の寛解期）、多発性骨髄腫（特に、発症後早期）など。
【０１２０】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ ＥＳ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１２１】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１２２】
（発明を実施するための好ましい形態）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。
【０１２３】
１つの局面において、本発明は、血小板を生産する方法を提供する。この方法は：Ａ）血小板前駆細胞におけるＬｎｋまたはその等価物（例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするか、あるいはそれらの改変体または断片）の機能を阻害する工程；およびＢ）該血小板前駆細胞を分化させる工程、を包含する。Ｌｎｋまたはその等価物の機能阻害は、例えば、核酸レベル（複製または転写レベル；これは、ＬｎｋのアンチセンスまたはＲＮＡｉによる阻害によって達成され得る）、タンパク質レベル（翻訳レベル、翻訳後修飾レベル；これは、糖鎖切断、抗体などによる阻害）でおこなうことができ、直接または間接的に行うことが可能である。代表的には、好ましくは、Ｌｎｋまたはその等価物のドミナントネガティブ法による阻害を用いること、レトロウイルスによって、Ｌｎｋ活性を失った変異型Ｌｎｋを導入すること、などにより達成され得ることが理解される。血小板前駆細胞は、生体からとったものを直接使用（初代培養）してもよく、あるいは、幹細胞をある程度分化させたり、増幅したりした細胞を使用できることができることが理解される。
【０１２４】
１つの実施形態では、本発明において使用される血小板前駆細胞は、胚性幹細胞および巨核球を含む。このような胚性幹細胞は、当該分野において公知の任意の技術を用いて調製することができることが理解され得る。
【０１２５】
１つの実施形態において、血小板前駆細胞分化工程（上記Ｂ工程）において、幹細胞因子（ＳＣＦ）に血小板前駆細胞を接触させることを包含してもよい。
【０１２６】
１つの実施形態では、血小板前駆細胞は、胚性幹細胞から誘導された巨核球を含み得る。巨核球の誘導は例えば、ＯＰ９間質細胞上での培養および二極性血管芽細胞との共培養によって達成され得るがそれに限定されない。巨核球への分化において、Ａ）血管芽細胞（ＶＥＧＦタイプ２受容体；Ｆｌｋ−１，ＫＤＲ）かつｃ−ｋｉｔ陽性細胞から分化成熟すること；Ｂ）ＯＰ９ストローマ細胞との物理的な接触が、巨核球への分化成熟に必須であること；およびＣ）血小板産生はＯＰ９ストローマ細胞上においても可能であるが、ＯＰ９との接触を除いた条件にすることで促進されることに留意すべきである。
【０１２７】
別の局面において、本発明はまた、本発明の上記方法（血小板前駆細胞におけるＬｎｋまたはその等価物の機能を阻害する工程；および該血小板前駆細胞を分化させる工程を含む）によって生産される血小板を提供する。
【０１２８】
別の局面において、本発明はまた、血小板の生成の速度を調節する物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、Ａ）ＬｎｋまたはＬｎｋプロモータと相互作用する物質を選ぶ工程；およびＢ）該選ばれた物質を血小板前駆細胞に接触させて分化するかどうかを決定し、分化調節作用を有する該物質を選択する工程を包含する。分化調節作用を有するかどうかは、コントロールとして分化因子に接触させるポジティブコントロールに対して、その分化速度が調節されていることを確認することによって、判定することができいる。
【０１２９】
別の局面において、本発明は、Ｌｎｋもしくはその等価物が損傷しているか、またはその機能が損傷した血小板を含む組成物を提供する。このような血小板は、粘性が低く、粘性の高い血液に起因する疾患を処置するのに適していると予期される。
【０１３０】
従って、好ましい実施形態では、本発明の組成物は、粘性の高い血液を有する患者の処置に使用され得る。このような患者は、例えば、糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞、高脂血症、脳梗塞などの症状または疾患に罹患している者であり得る。
【０１３１】
別の局面において、本発明は、Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子を提供する。この因子は、血小板の産生または産生促進のために用いることができる。このような因子は、ドミナントネガティブ因子、プロモーターの結合因子、ＲＮＡｉ、抗体および低分子などであり得る。
【０１３２】
従って、本発明は、好ましい実施形態では、Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子を含む、血小板の生成の速度を調節するための組成物を提供する。このような因子は、ドミナントネガティブ因子、プロモーターの結合因子、ＲＮＡｉ、抗体および低分子などであり得る。あるいは、別の実施形態では、この因子は、Ｌｎｋまたはその遺伝子産物の機能的変異体である。このような因子は、特定の実施形態では、配列番号３に記載されたヌクレオチド配列を有する改変体核酸であり得る。
【０１３３】
１つの局面において、本発明は、Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子の、血小板生成の速度の調節のための使用を提供する。ここで使用される因子は、本明細書において使用される任意の因子の実施形態が使用され得ることが理解され得る。
【０１３４】
別の局面において、本発明は、Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子の、血小板生成の速度の調節のための組成物の製造のための、使用を提供する。ここで使用される因子は、本明細書において使用される任意の因子の実施形態が使用され得ることが理解され得る。
【０１３５】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１３６】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１３７】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬、支持体などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ、和光純薬（大阪、日本）などから市販されるものを用いた。以下において使用した動物は、日本の大学において規定される飼育規準を遵守して飼育および実験した。
【０１３８】
（実施例１：Ｌｎｋ ＤＮ変異体遺伝子のスクリーニング）
（細胞、試薬およびマウス）
ＭＣ９細胞をＲＰＭＩ １６４０培地（８％の仔ウシ血清（ＦＢＳ）、抗生物質および１０ユニット／ｍｌのＩＬ−３を補充）中で培養した。Ｐｌａｔ−Ｅ細胞は、以前に記載したとおりに維持した（（Ｍｏｒｉｔａ，Ｓ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｔ．，ａｎｄ Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．２０００．Ｐｌａｔ−Ｅ： ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７：１０６３−１０６６．）。ＣＯＳ７細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地（８％ＦＢＳおよび抗生物質を補充）中で維持した。精製マウスＩＬ−３、ＳＣＦおよびＴＰＯは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｌｙ５．２＋）およびＣ．Ｂ−１７ ｓｃｉｄマウスは、日本クレア（神奈川、日本）から購入した。Ｌｙ５遺伝子座（Ｌｙ５，１＋）についてコンジェニックであるマウスとｌｎｋ−／−マウス（Ｔａｋａｋｉ，Ｓ．，Ｓａｕｅｒ，Ｋ．，Ｉｒｉｔａｎｉ，Ｂ．Ｍ．，Ｃｈｉｅｎ，Ｓ．，Ｅｂｉｈａｒａ，Ｙ．，Ｔｓｕｊｉ，Ｋ．，Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．，ａｎｄ Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ，Ｒ．Ｍ．２０００．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｎｋ．Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１３：５９９−６０９．； Ｔａｋａｋｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｈ．，Ｔｅｚｕｋａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．２００２．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｂｙ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｎｋ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１５１−１６０．）を、東京大学医科学研究所動物実験施設にて病原体フリーの特殊条件で交配させ維持した。
【０１３９】
（Ｌｎｋ変異体および発現構築物）
使用したＲ３６４Ｅ、ΔＰＨ、ΔＮおよびＹ５３６Ｆ Ｌｎｋ変異体の配列は、以下の通りである。
【０１４０】
Ｒ３６４Ｅ
ヌクレオチド配列
atgaacgagcccaccgtgcagccgtcccgcacatcctccgcacccgcctcgccggcatccccacgcggctggagcgacttctgcgagcagcacgcagcagcggcggcccgggagctggcccgccagtactggttgtttgcgcgcgcgcacccacagccgccgcgcgcggacctggtgtcgctgcagttcgcggagctcttccagcgccacttctgccgggaggtgcgcgagagcctcgcaggaccgccgggtcacgactaccgcgccactgctccgccccgccccgcgctgcccaaggcacgcagctccgaggacctgggcccgcggcccgcctgtgccctgcagcacctgcgccgcggcctgcgccagctcttccgccgccgctcggcaggggagctgcccggggctaccagtgacaccaatgacatcgacaccaccgcagccagcaggccgggcccggcccgcaagttgctaccctggggcctgcgagagccgcccactgaggcgctcaaggaggtcgtattgcgctatagcctggcggacgaggcagcaatggacagcggcgcacgctggcagcggggtcgcctggtgcttcggtctccaggtccgggccacagccactttctgcagctcttcgatccgcccaagagctcaaagcccaagctccaagaggcctgttccagcatccgggaggtccgaccatgtacacgcctggagatgcctgacaacctctacacctttgtgttgaaggtgcaggaccagacagacatcatctttgaggtgggagatgaacagcagctgaactcatggctggcagagctcagggcaagcacaggccttgggctggagcacccggacaccgagttacctctttccttagcggcagagcctggcccagctagatccccaaggggaagcactgactccctggaccaaggtgcttcacctggggtgttgctggacccagcctgccagaaaacagatcacttcctatcctgctacccctggttccacggccccatctccagggtgagggctgcacagctggtccagctccagggccctgatgcccacggcgtgttcctggtggagcagagtgagtcccggagaggagagtatgtactcacattcaacttacagggcagagccaagcacttacgcctggtgctcacagagcgtggacagtgccgggtgcaacacctgcacttcccctcggtggtagatatgctccgccacttccagcgttctcctatcccactggaatgtggagcagcttgtgacgtccgactctctggctatgtggtagtcctctctcaggcaccaggttcctccaacaccgtcctcttccctttttcccttcctcactgggattcggagctgggtcatccccacctcagctctgttggctgtccccccagccatggtgcagaggctctccctggccaagtgacaccacctgagcagatcttccacctggtgccttctcctgaggaactggccaacagtctgcggcagctggagctcgagtctgtgagcagtgcccgggactcggactatgacatggactcctcttcacggggccaccttcgggccattgacaaccagtacacccctctctcacagctgtgcagagaggcagacgtg（配列番号７）
アミノ酸配列
MNEPTVQPSRTSSAPASPASPRGWSDFCEQHAAAAARELARQYWLFARAHPQPPRADLVSLQFAELFQRHFCREVRESLAGPPGHDYRATAPPRPALPKARSSEDLGPRPACALQHLRRGLRQLFRRRSAGELPGATSDTNDIDTTAASRPGPARKLLPWGLREPPTEALKEVVLRYSLADEAAMDSGARWQRGRLVLRSPGPGHSHFLQLFDPPKSSKPKLQEACSSIREVRPCTRLEMPDNLYTFVLKVQDQTDIIFEVGDEQQLNSWLAELRASTGLGLEHPDTELPLSLAAEPGPARSPRGSTDSLDQGASPGVLLDPACQKTDHFLSCYPWFHGPISRVRAAQLVQLQGPDAHGVFLVEQSESRRGEYVLTFNLQGRAKHLRLVLTERGQCRVQHLHFPSVVDMLRHFQRSPIPLECGAACDVRLSGYVVVLSQAPGSSNTVLFPFSLPHWDSELGHPHLSSVGCPPSHGAEALPGQVTPPEQIFHLVPSPEELANSLRQLELESVSSARDSDYDMDSSSRGHLRAIDNQYTPLSQLCREADV（配列番号８）。
【０１４１】
ΔＰＨ
ヌクレオチド配列
atgaacgagcccaccgtgcagccgtcccgcacatcctccgcacccgcctcgccggcatccccacgcggctggagcgacttctgcgagcagcacgcagcagcggcggcccgggagctggcccgccagtactggttgtttgcgcgcgcgcacccacagccgccgcgcgcggacctggtgtcgctgcagttcgcggagctcttccagcgccacttctgccgggaggtgcgcgagagcctcgcaggaccgccgggtcacgactaccgcgccactgctccgccccgccccgcgctgcccaaggcacgcagctccgaggacctgggcccgcggcccgcctgtgccctgcagcacctgcgccgcggcctgcgccagctcttccgccgccgctcggcaggggagctgcccggggctaccagtgacaccaatgacatcgacaccaccgcagccagcaggccgggcccggcccgcaagttgctaccctggggcctgcgagagccgcccactgaggcgctcaaggaggtcgtatggctggcagagctcagggcaagcacaggccttgggctggagcacccggacaccgagttacctctttccttagcggcagagcctggcccagctagatccccaaggggaagcactgactccctggaccaaggtgcttcacctggggtgttgctggacccagcctgccagaaaacagatcacttcctatcctgctacccctggttccacggccccatctccagggtgagggctgcacagctggtccagctccagggccctgatgcccacggcgtgttcctggtgcggcagagtgagtcccggagaggagagtatgtactcacattcaacttacagggcagagccaagcacttacgcctggtgctcacagagcgtggacagtgccgggtgcaacacctgcacttcccctcggtggtagatatgctccgccacttccagcgttctcctatcccactggaatgtggagcagcttgtgacgtccgactctctggctatgtggtagtcctctctcaggcaccaggttcctccaacaccgtcctcttccctttttcccttcctcactgggattcggagctgggtcatccccacctcagctctgttggctgtccccccagccatggtgcagaggctctccctggccaagtgacaccacctgagcagatcttccacctggtgccttctcctgaggaactggccaacagtctgcggcagctggagctcgagtctgtgagcagtgcccgggactcggactatgacatggactcctcttcacggggccaccttcgggccattgacaaccagtacacccctctctcacagctgtgcagagaggcagacgtg（配列番号９）
アミノ酸配列
MNEPTVQPSRTSSAPASPASPRGWSDFCEQHAAAAARELARQYWLFARAHPQPPRADLVSLQFAELFQRHFCREVRESLAGPPGHDYRATAPPRPALPKARSSEDLGPRPACALQHLRRGLRQLFRRRSAGELPGATSDTNDIDTTAASRPGPARKLLPWGLREPPTEALKEVVWLAELRASTGLGLEHPDTELPLSLAAEPGPARSPRGSTDSLDQGASPGVLLDPACQKTDHFLSCYPWFHGPISRVRAAQLVQLQGPDAHGVFLVRQSESRRGEYVLTFNLQGRAKHLRLVLTERGQCRVQHLHFPSVVDMLRHFQRSPIPLECGAACDVRLSGYVVVLSQAPGSSNTVLFPFSLPHWDSELGHPHLSSVGCPPSHGAEALPGQVTPPEQIFHLVPSPEELANSLRQLELESVSSARDSDYDMDSSSRGHLRAIDNQYTPLSQLCREADV（配列番号１０）。
【０１４２】
ΔＮ
ヌクレオチド配列
atgaacgcctgtgccctgcagcacctgcgccgcggcctgcgccagctcttccgccgccgctcggcaggggagctgcccggggctaccagtgacaccaatgacatcgacaccaccgcagccagcaggccgggcccggcccgcaagttgctaccctggggcctgcgagagccgcccactgaggcgctcaaggaggtcgtattgcgctatagcctggcggacgaggcagcaatggacagcggcgcacgctggcagcggggtcgcctggtgcttcggtctccaggtccgggccacagccactttctgcagctcttcgatccgcccaagagctcaaagcccaagctccaagaggcctgttccagcatccgggaggtccgaccatgtacacgcctggagatgcctgacaacctctacacctttgtgttgaaggtgcaggaccagacagacatcatctttgaggtgggagatgaacagcagctgaactcatggctggcagagctcagggcaagcacaggccttgggctggagcacccggacaccgagttacctctttccttagcggcagagcctggcccagctagatccccaaggggaagcactgactccctggaccaaggtgcttcacctggggtgttgctggacccagcctgccagaaaacagatcacttcctatcctgctacccctggttccacggccccatctccagggtgagggctgcacagctggtccagctccagggccctgatgcccacggcgtgttcctggtgcggcagagtgagtcccggagaggagagtatgtactcacattcaacttacagggcagagccaagcacttacgcctggtgctcacagagcgtggacagtgccgggtgcaacacctgcacttcccctcggtggtagatatgctccgccacttccagcgttctcctatcccactggaatgtggagcagcttgtgacgtccgactctctggctatgtggtagtcctctctcaggcaccaggttcctccaacaccgtcctcttccctttttcccttcctcactgggattcggagctgggtcatccccacctcagctctgttggctgtccccccagccatggtgcagaggctctccctggccaagtgacaccacctgagcagatcttccacctggtgccttctcctgaggaactggccaacagtctgcggcagctggagctcgagtctgtgagcagtgcccgggactcggactatgacatggactcctcttcacggggccaccttcgggccattgacaaccagtacacccctctctcacagctgtgcagagaggcagacgtg（配列番号１１）
アミノ酸配列
MNACALQHLRRGLRQLFRRRSAGELPGATSDTNDIDTTAASRPGPARKLLPWGLREPPTEALKEVVLRYSLADEAAMDSGARWQRGRLVLRSPGPGHSHFLQLFDPPKSSKPKLQEACSSIREVRPCTRLEMPDNLYTFVLKVQDQTDIIFEVGDEQQLNSWLAELRASTGLGLEHPDTELPLSLAAEPGPARSPRGSTDSLDQGASPGVLLDPACQKTDHFLSCYPWFHGPISRVRAAQLVQLQGPDAHGVFLVRQSESRRGEYVLTFNLQGRAKHLRLVLTERGQCRVQHLHFPSVVDMLRHFQRSPIPLECGAACDVRLSGYVVVLSQAPGSSNTVLFPFSLPHWDSELGHPHLSSVGCPPSHGAEALPGQVTPPEQIFHLVPSPEELANSLRQLELESVSSARDSDYDMDSSSRGHLRAIDNQYTPLSQLCREADV（配列番号１２）。
【０１４３】
Ｙ５３６Ｆ
ヌクレオチド配列
atgaacgagcccaccgtgcagccgtcccgcacatcctccgcacccgcctcgccggcatccccacgcggctggagcgacttctgcgagcagcacgcagcagcggcggcccgggagctggcccgccagtactggttgtttgcgcgcgcgcacccacagccgccgcgcgcggacctggtgtcgctgcagttcgcggagctcttccagcgccacttctgccgggaggtgcgcgagagcctcgcaggaccgccgggtcacgactaccgcgccactgctccgccccgccccgcgctgcccaaggcacgcagctccgaggacctgggcccgcggcccgcctgtgccctgcagcacctgcgccgcggcctgcgccagctcttccgccgccgctcggcaggggagctgcccggggctaccagtgacaccaatgacatcgacaccaccgcagccagcaggccgggcccggcccgcaagttgctaccctggggcctgcgagagccgcccactgaggcgctcaaggaggtcgtattgcgctatagcctggcggacgaggcagcaatggacagcggcgcacgctggcagcggggtcgcctggtgcttcggtctccaggtccgggccacagccactttctgcagctcttcgatccgcccaagagctcaaagcccaagctccaagaggcctgttccagcatccgggaggtccgaccatgtacacgcctggagatgcctgacaacctctacacctttgtgttgaaggtgcaggaccagacagacatcatctttgaggtgggagatgaacagcagctgaactcatggctggcagagctcagggcaagcacaggccttgggctggagcacccggacaccgagttacctctttccttagcggcagagcctggcccagctagatccccaaggggaagcactgactccctggaccaaggtgcttcacctggggtgttgctggacccagcctgccagaaaacagatcacttcctatcctgctacccctggttccacggccccatctccagggtgagggctgcacagctggtccagctccagggccctgatgcccacggcgtgttcctggtgcggcagagtgagtcccggagaggagagtatgtactcacattcaacttacagggcagagccaagcacttacgcctggtgctcacagagcgtggacagtgccgggtgcaacacctgcacttcccctcggtggtagatatgctccgccacttccagcgttctcctatcccactggaatgtggagcagcttgtgacgtccgactctctggctatgtggtagtcctctctcaggcaccaggttcctccaacaccgtcctcttccctttttcccttcctcactgggattcggagctgggtcatccccacctcagctctgttggctgtccccccagccatggtgcagaggctctccctggccaagtgacaccacctgagcagatcttccacctggtgccttctcctgaggaactggccaacagtctgcggcagctggagctcgagtctgtgagcagtgcccgggactcggactatgacatggactcctcttcacggggccaccttcgggccattgacaaccagttcacccctctctcacagctgtgcagagaggcagacgtg（配列番号１３）
アミノ酸配列
MNEPTVQPSRTSSAPASPASPRGWSDFCEQHAAAAARELARQYWLFARAHPQPPRADLVSLQFAELFQRHFCREVRESLAGPPGHDYRATAPPRPALPKARSSEDLGPRPACALQHLRRGLRQLFRRRSAGELPGATSDTNDIDTTAASRPGPARKLLPWGLREPPTEALKEVVLRYSLADEAAMDSGARWQRGRLVLRSPGPGHSHFLQLFDPPKSSKPKLQEACSSIREVRPCTRLEMPDNLYTFVLKVQDQTDIIFEVGDEQQLNSWLAELRASTGLGLEHPDTELPLSLAAEPGPARSPRGSTDSLDQGASPGVLLDPACQKTDHFLSCYPWFHGPISRVRAAQLVQLQGPDAHGVFLVRQSESRRGEYVLTFNLQGRAKHLRLVLTERGQCRVQHLHFPSVVDMLRHFQRSPIPLECGAACDVRLSGYVVVLSQAPGSSNTVLFPFSLPHWDSELGHPHLSSVGCPPSHGAEALPGQVTPPEQIFHLVPSPEELANSLRQLELESVSSARDSDYDMDSSSRGHLRAIDNQFTPLSQLCREADV（配列番号１４）。
【０１４４】
上記変異体をコードするＤＮＡフラグメントは、以下のプライマーを用いたＰＣＲベースの部位特異的変異誘発によって生成され、そしてＤＮＡ配列決定によって確認した。
[Ｒ３６４Ｅの作製に用いたプライマー]
5’tggtggagcagagtgagtcccgga3’（配列番号１５）
5’tctgctccaccaggaacacgccgt3’（配列番号１６）
[ΔＰＨの作製に用いたプライマー]
5’tggctggcagagctcagggca3’（配列番号１７）
5’ctgccagccatacgacctccttgagcgcct3’（配列番号１８）
[ΔＮの作製に用いたプライマー]
5’gcctgtgccctgcagcacctg3’（配列番号１９）
5’gggcacaggcgttcatggtggagagcgagg3’（配列番号２０）
[Ｙ５３６Ｆの作製に用いたプライマー]
5’caaccagttcacccctctctca3’（配列番号２１）
5’aggggtgaactggttgtcaatgg3’（配列番号２２）。
【０１４５】
ｄＣをコードする変異ｃＤＮＡを、ｌｎｋ ｃＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントによって平滑化し次いで自己連結することによって構築した。種々の組み合わせで変異を含む他のｌｎｋ ｃＤＮＡは、適切なｃＤＮＡフラグメントを、制限酵素消化およびライゲーションを用いて変異フラグメントに置き換えることによって構築した。得られたｃＤＮＡフラグメントをｐｃＤＮＡ３哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＭＳＣＶレトロウイルスベクター（内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をマルチクローニング部位とｅＧＦＰコードｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）との間に含む）中にサブクローニングした。
【０１４６】
（レトロウイルス形質導入および骨髄移植）
ｐＭＹベクターを、ＦｕＧｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いたリポフェクションによりＰｌａｔ−Ｅ細胞中にトランスフェクトした。パッケージングしたレトロウイルス粒子を含む上清を採集し、そして微小遠心分離管中で４℃にて１６時間にわたり遠心分離した。形質導入のために、ＭＣ９細胞を、ポリブレーン（Ｓｉｇｍａ）８ｍｇ／ｍｌおよびレトロウイルス上清濃縮物を含む新鮮な培地中で３時間インキュベートした。細胞を洗浄し、そしてさらに、１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを含む新鮮な培地中で培養した。ＨＳＣ／ＨＰＣの形質導入のために、Ｌｉｎｅａｇｅマーカー（Ｂ２２０，ＣＤ３，Ｍａｃ−１，Ｇｒ−１ およびＴＥＲ−１１９）について陰性の骨髄（ＢＭ）細胞を、ＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて精製した。Ｌｉｎ−細胞（４×１０５）を、３時間にわたりレトロウイルス上清とともにインキュベートし、そしてＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎをコーティングしたディッシュ（ＴａＫａＲａ）上にＲＭＰＩ１６４０培地（８％ＦＢＳ、５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯおよび５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−３を含む）とともにプレートした。翌日、形質導入を、新鮮なレトロウイルス上清を用いて繰り返し、そして細胞をさらに２４時間にわたり培養した。形質転換したＬｉｎ−細胞（２．０×１０５）を洗浄し、そして致死量の照射を受けた（９．５Ｇｙ）レシピエントマウスに静脈注射した。
【０１４７】
（フローサイトメトリー）
レトロウイルス形質導入の後にｅＧＦＰを発現するＭＣ９細胞を、ＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｕｒＴＭ装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。抹消血脱核細胞をレシピエントマウスから得、これを所定の最適濃度のそれぞれの抗体を用いて染色し、ついでこれをＦＡＣＳ ＣａｌｂｉｕｒＴＭにより分析した。モノクローナル抗体としては以下を用いた。ＦＩＴＣ−結合体化の、抗Ｂ２２０（抗ＣＤ−４５Ｒ、ＲＡ３−６Ｂ２）、抗Ｍａｃ−１（抗ＣＤ１１ｂ、Ｍ１／７０）、および抗Ｓｃａ−１（Ｅ１３−１６１．７）；ＰＥ結合体化の、抗ＣＤ３ｅ（１４５−２Ｃ１１）、抗Ｇｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５）、抗ＴＥＲ１１９、抗Ｓｃａ−１および抗ｃ−Ｋｉｔ（抗ＣＤ１１７、２Ｂ８）；ビオチン結合体化の、抗Ｋｙ５．１（抗ＣＤ４５．１，Ａ２０）および抗Ｌｙ５．２（抗ＣＤ４５．２、１０４）；ＡＰＣ結合体化の、抗Ｂ２２０および抗ｃ−Ｋｉｔ（すべて、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）。ビオチン結合体化された抗体の結合は、ＡＰＣ結合体化またはＰｅｒＣＰ結合体化されたストレプトアビジン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて可視化した。死んだ細胞を、７アミノ酸アクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ）染色によってゲートアウトした。
【０１４８】
（化学架橋、免疫沈降およびイムノブロッティング）
ＣＯＳ７細胞を、野性型または変異型のＬｎｋタンパク質をコードするｐｃＤＮＡ３を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトランスフェクトし、そしてトランスフェクト後４８時間で採集した。細胞を溶解緩衝液（Ｔａｋａｋｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｈ．，Ｔｅｚｕｋａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．２００２．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｂｙ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｎｋ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１５１−１６０．）中に溶解し、そしてＢＳ３（Ｐｉｅｒｃｅ）を種々の濃度で用いて化学架橋させた。ついで、これを、抗Ｌｎｋ抗体を用いて免疫ブロットした。刺激実験のために、トランスフェクト体を１２時間血清枯渇させ、そして１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦで５分間刺激した。ついで、以前に記載されているように、細胞を溶解し、溶解液を免疫沈降させ、そして免疫ブロットした（Ｔａｋａｋｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｈ．，Ｔｅｚｕｋａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．２００２．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｂｙ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｎｋ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１５１−１６０．）。
【０１４９】
（ＥＳ細胞からの血小板の生成に対するＬｎｋ遺伝子のドミナントネガティブ変異の効果）
（ＥＳ細胞の増殖および分化）
マウスＥ１４ｔｇ２ａ細胞株を、１０００Ｕ／ｍｌマウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を補充した完全ＧＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で照射したマウスフィーダー細胞上で１０継代まで維持した。巨核芽球への分化のために、間質細胞株ＯＰ９ ｃｅｌｌｓ（Ｎａｋａｎｏ Ｔ，Ｋｏｄａｍａ Ｈ，Ｈｏｎｊｏ Ｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５；１０９８−１１０１，１９９４）を有する共培養システムを記載される（Ｅｔｏ Ｋ，Ｍｕｒｐｈｙ Ｒ，Ｋｅｒｒｉｇａｎ ＳＷ，Ｂｅｒｔｏｎｉ Ａ，Ｓｔｕｈｌｍａｎｎ Ｈ，Ｎａｋａｎｏ Ｔ，Ｌｅａｖｉｔｔ ＡＤ，Ｓｈａｔｔｉｌ ＳＪ （２００２） Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｅ ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．９９：１２８１９−１２８２４．）ように用いた。手短にいうと、ＥＳ細胞を、０．２５％ トリプシン／ＥＤＴＡで剥離させ、そして７５分間静置して、接着性フィーダー細胞を枯渇させた。ついで、１．５×１０４個の細胞を、コンフルエントなＯＰ９間質細胞を含む６ウェルプレートの各ウェルに播種した。ＯＰ９細胞は、新生児Ｍ−ＳＣＦ欠損Ｂ６Ｃ３Ｆ１−ｏｐ／ｏｐマウスの頭蓋冠に由来する。そして、各ウェル中の細胞を、１０−１２％仔ウシ胎児血清および５０ｍＭ ２−ＭＥ（Ｓｉｇｍａ）を補充したαＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。レトロウイルスで形質導入したタンパク質を発現する巨核球を得るために、分化プロトコールの５日目においてＦｌｋ−１およびＰＥＣＡＭ−１の両方を発現する二機能性血管芽細胞を２０ｎｇ／ｍｌを含むαＭＥＭ中に８×１０５／ｍｌに懸濁した。等量のウイルスストックおよび４ｍｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ）を加えた後、この細胞を３７℃で１７時間培養し、洗浄し、そして４×１０５細胞で新鮮なＯＰ９層上にまき、そして上記に記載されるように（Ｅｔｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００２）１５日目まで培養した。
【０１５０】
（巨核芽球のレトロウイルス感染）
Ｌｎｋ ｃＤＮＡおよびドミナントネガティブ変異体のｃＤＮＡをＩＲＥＳ−ＧＦＰカセットを含むレトロウイルスベクターより制限酵素消化して分離・精製し、ＭＳＣＶレトロウイルスベクター（ＭＩＧベクター：ＢＤ ｂｉｏ／ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より購入）のマルチクローニング部位にサブクローニングし、ＰＧＫ−ｎｅｏ遺伝子をｉｒｅｓ−ＥＧＦＰに置き換えた。関連する配列を、自動化されたＤＮＡ配列決定によって確認した。ウイルスを、２９３Ｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）へのリン酸カルシウムトランスフェクションによって生産した。この実験では、１５μｇのＭＩＧ発現ベクター、１２ μｇのエンベローププラスミドｐｃＤＮＡ−ＶＳＶＧ、を用いた。ウイルスの力価は、感染させたＮＩＨ ３Ｔ３細胞中でのＧＦＰ発現を測定することによって４８〜６０時間後に決定し、それは、０．４〜１．０×１０６ ＩＵ／ｍｌの範囲にあった。
【０１５１】
ドミナントネガティブ変異体の配列は以下の通りである。
【０１５２】
ドミナントネガティブマウスLnk
ヌクレオチド配列
atgaacgagcccaccgtgcagccgtcccgcacatcctccgcacccgcctcgccggcatccccacgcggctggagcgacttctgcgagcagcacgcagcagcggcggcccgggagctggcccgccagtactggttgtttgcgcgcgcgcacccacagccgccgcgcgcggacctggtgtcgctgcagttcgcggagctcttccagcgccacttctgccgggaggtgcgcgagagcctcgcaggaccgccgggtcacgactaccgcgccactgctccgccccgccccgcgctgcccaaggcacgcagctccgaggacctgggcccgcggcccgcctgtgccctgcagcacctgcgccgcggcctgcgccagctcttccgccgccgctcggcaggggagctgcccggggctaccagtgacaccaatgacatcgacaccaccgcagccagcaggccgggcccggcccgcaagttgctaccctggggcctgcgagagccgcccactgaggcgctcaaggaggtcgtatggctggcagagctcagggcaagcacaggccttgggctggagcacccggacaccgagttacctctttccttagcggcagagcctggcccagctagatccccaaggggaagcactgactccctggaccaaggtgcttcacctggggtgttgctggacccagcctgccagaaaacagatcacttcctatcctgctacccctggttccacggccccatctccagggtgagggctgcacagctggtccagctccagggccctgatgcccacggcgtgttcctggtggagcagagtgagtcccggagaggagagtatgtactcacattcaacttacagggcagagccaagcacttacgcctggtgctcacagagcgtggacagtgccgggtgcaacacctgcacttcccctcggtggtagatatgctccgccacttccagcgttctcctatcccactggaatgtggagcagcttgtgacgtccgactctctggctatgtggtagtcctctctcaggcaccaggttcctccaacaccgtcctcttccctttttcccttcctcactgggattcggagctgggtcatccccacctcagctctgttggctgtccccccagccatggtgcagaggctctccctggccaagtgacaccacctgagcagatc（配列番号３）
アミノ酸配列
MNEPTVQPSRTSSAPASPASPRGWSDFCEQHAAAAARELARQYWLFARAHPQPPRADLVSLQFAELFQRHFCREVRESLAGPPGHDYRATAPPRPALPKARSSEDLGPRPACALQHLRRGLRQLFRRRSAGELPGATSDTNDIDTTAASRPGPARKLLPWGLREPPTEALKEVVWLAELRASTGLGLEHPDTELPLSLAAEPGPARSPRGSTDSLDQGASPGVLLDPACQKTDHFLSCYPWFHGPISRVRAAQLVQLQGPDAHGVFLVEQSESRRGEYVLTFNLQGRAKHLRLVLTERGQCRVQHLHFPSVVDMLRHFQRSPIPLECGAACDVRLSGYVVVLSQAPGSSNTVLFPFSLPHWDSELGHPHLSSVGCPPSHGAEALPGQVTPPEQI（配列番号４）。
【０１５３】
（ＩＩｂ、ＧＰＩｂの発現に関する巨核芽球の特徴づけ、および前血小板の生成）
ＥＳ細胞分化の９日および１２日後、非接着性細胞を、６０分間３７℃にて重力沈降させた。巨核芽球の収率を最適化するために、ＯＰ９層になおも接着する造血細胞を、再度懸濁し、そしてメッシュを通して細胞塊を除去した。αＩＩｂβ３またはＧＰＩｂαの発現を、ＦＩＴＣを結合体化させたラット抗マウスαＩＩＢ（ＣＤ４１）を用いて測定した。
ＧＦＰを発現する前血小板の形成を位相蛍光顕微鏡（ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（Ｌｅｉｃａ ＤＭ ＩＲＢＥ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｓｙｓｔｅｍ）によりモニターし、そして計数した。手短に述べると、前血小板についての細胞の実数は、培養９日目および１２日目において、１培養ディッシュあたり１００個のＧＦＰ陽性巨核球中で計数した。培養１２日目から１４日目にかけて、ＥＳ細胞に由来する血小板の粒子数をフローサイトメトリーにより計数した。その結果は、１枚の６-ウエル培養皿から回収した３日間全体の合計ＧＦＰ陽性ＧＰＩｂα陽性数：コントロール（ＧＦＰのみ）発現６８２±４１８，Ｒ３６４Ｅ１アミノ酸置換遺伝子発現 ８９６±５１ Ｌｎｋドミナント陰性遺伝子発現３０２８±４４６であった。ＧＦＰおよびＧＰＩｂαの陽性粒子を、コントロールビーズ（ＢＤ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによって最終的に計数した。
【０１５４】
（実施例２：Ｌｎｋノックアウト血小板実験）
（材料）
すべての試薬は、特に言及する場合を除き、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。すべての動物および組み換えＤＮＡ実験は、東京大学医科学研究所、東海大学および北海道大学の動物実験施設協議会によって承認を得たものである。
【０１５５】
セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化された二次抗体は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ研究所から購入した。アルガトロバン（ａｒｇａｔｒｏｂａｎ）は三菱化学（東京、日本）から購入した。ローダミン−ファロイジン、ａｌｅｘａ４８８結合体化フィブリノゲンおよびａｌｅｘａ４８８結合体化抗マウスＩｇＧ抗体は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから購入した。
【０１５６】
精製したヒトフィブリノーゲンをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．（ＣＴ，ＵＳＡ）から入手した。ＦＩＴＣ結合体化抗マウスインテグリンαＩＩｂ（ＣＤ４１）およびＰＥ結合体化抗マウスＧＰＩｂαをＡｍｆｒｅｔ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。ヒトトロンボポイエチン、ＩＬ−６およびＩＬ−１１をＰｅｐｒｏｔｅｃｈから入手した。
【０１５７】
（出血時間）
尾部出血アッセイを、８週齢のＬｎｋ欠損マウス（Ｔａｋａｋｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｈ．，Ｔｅｚｕｋａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．２００２．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｂｙ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｎｋ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１５１−１６０）またはコントロールマウスを用いて行った。マウスを５０μｇ／ｍｌのペントバルビタールを用いて麻酔した。尾部の２ｍｍの遠位先端を切除し、そして尾部をすぐに３７℃のＰＢＳに浴した。尾部の出血時間を、出血が停止するまでに必要な時間と定義した。
【０１５８】
（血液サンプルの調製）
１実験当たりの血液サンプルを、それぞれ８匹を超えるＬｎｋヌルマウスおよびそのコントロールから、心臓窃孔により得た。収集した血液検体をすぐに、その容積の１／６の酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）を含むプラスチックチューブに移し、インテグリンαＩＩβｂ３に対する特異的なフィブリノーゲン結合または血小板拡散の実験に用いた。別のサンプルを、その容積の１／６の３．８％クエン酸を含むチューブに移して最終濃度を０．３８％として血小板凝集の実験に用いた。血小板濃縮血漿（ＰＲＰ）を、全血を１５０×ｇで１５分間遠心分離することによって得た。洗浄した血小板を得るために、１０ｍＭのプラスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）および５Ｕ／ｍＬのアピラーゼを加え、そして７５０×ｇで１０分間遠心分離し、一回１ｍＭＰＧＥ１および１Ｕ／ｍＬのアピラーゼを含むクエン酸緩衝液で洗浄した。血小板ペレットを、適切な容量の、Ｃａ２＋なしの改変したタイロード−Ｈｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．４（１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１２ ｍＭ ＮａＨＣＯ３，１３８ ｍＭ ＮａＣｌ，５．５ ｍＭ グルコース，２．９ｍＭ ＫＣｌおよび１ ｍＭ ＭｇＣｌ２）中に再懸濁した。
【０１５９】
（エキソビボフローチャンバー実験）
エキソビボ灌流実験のために、収集した血液検体を、すぐに、その容量の１／１０の特異的トロンビンインヒビターアルガトロバンを最終濃度１００μＭで含むプラスチックチューブに移し、実験の間の血液サンプルの流動性を維持した（アルガトロバンは、クエン酸またはヘパリンよりも抗凝固剤としてより一般的に使用されており、これをカチオン濃度の減少または改変されたフォンビルブラント因子Ｉβａの相互作用を通じて、多面的な効果を回避した。）。
【０１６０】
ついで、全血検体中の血小板を、最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌのメパクリン（Ｓｉｇｍａ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を加え、以前に記載されている手順（Ｅｔｏ Ｋ，Ｇｏｔｏ Ｓ，Ｓｈｉｍａｚａｋｉ Ｔ，Ｓａｋａｋｉｂａｒａ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｍ，Ｉｓｓｈｉｋｉ Ｔ，Ｈａｎｄａ Ｓ （２００１） Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｔｅｎｔ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｕｎｄｅｒ ｆｌｏｗ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ １２：２２８−２３５．）を用いることによって蛍光を発光させた。いくつかの実験において、全血検体を、遠心分離によってＰＲＰおよび残りの検体に分割して、コントロールＰＲＰまたはＬｎｋヌルＰＲＰと、コントロール赤血球および血漿を含む、コントロール血液由来の残りの検体とからなる再構成した全血を作製した。血小板数をさらに調整するために、コントロールＰＲＰまたはＬｎｋ−ＰＲＰをＨＥＰＥＳ−タイロード緩衝液中に希釈し、そしてコントロール赤血球および血漿を含むコントロール血液と混合した。
【０１６１】
Ｉ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を固定した長方形のフローチャンバーを以前に記載されるように調製した（Ｅｔｏ Ｋ，Ｇｏｔｏ Ｓ，Ｓｈｉｍａｚａｋｉ Ｔ，Ｓａｋａｋｉｂａｒａ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｍ，Ｉｓｓｈｉｋｉ Ｔ，Ｈａｎｄａ Ｓ （２００１） Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｔｅｎｔ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｕｎｄｅｒ ｆｌｏｗ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ １２：２２８−２３５．）。血液サンプルを、シリンジポンプを備えるチャンバーを通じて、１１６．１ｍｌ／時間の速度で吸引して１，５００ｓ−１の最大の壁剪断速度を達成した（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ ０１７４６，Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．，ＵＳＡ） 。表面上でコラーゲンと相互作用し、血栓を形成する血小板を、４８０ｎｍ励起光源（ＤＭＩＲＢ，１ＲＢ−ＦＬＵＯ，Ｌｅｉｃａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備える倒立ステージｅｐｉ蛍光ビデオ顕微鏡システムを用いて可視化した。顕微鏡像を、感光性カラーＣＣＤカメラ（Ｌ−６００，Ｌｅｉｃａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてオンラインでデジタル化した。二次元での血小板血栓成長を定量するために、血小板による表面積カバー率を以前に報告されているように算出した（Ｇｏｔｏ Ｓ， Ｔａｍｕｒａ Ｎ， Ｉｓｈｉｄａ Ｈ （２００４）Ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＩＩｂ／ＩＩＩａ ａｇｅｎｔｓ ｔｏ ｄｉｓｓｏｌｖｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｈｒｏｍｂｉ ｆｏｒｍｅｄ ｏｎ ａ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｕｎｄｅｒ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ４４：３１６−２３．）。血小板血栓の溶解を、ビデオ画像で示した。このビデオ画像では、時間感覚を３分の１にまで減らした（すなわち、実時間３分はビデオでは１秒で表される。）。血小板血栓の三次元構造を、超高速レーザ共焦点顕微鏡で分析し、対物レンズの位置を上げ、そして誘電モーター制御ユニットによって制御して定速を２０μｍ／５０秒にまで減速し、血栓の走査画像を得ることができるようにした（図８）。マイクロレンズによって覆われた２０，０００ピンホールを有する迅速に回転するディスクの共焦点ユニット（ＣＳＵ１０，Ｙｏｋｏｇａｗａ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を用いることによって、１片の共焦点画像を、１０ミリ秒内に得ることができた。共焦点画像を画像拡大器（ＳＲＵＢ ＧＥＮ ＩＩＩ＋，Ｓｏｌａｍｅｒ，Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を用いて拡大し、拡大画像をデジタルビデオレコーダー（Ｈａｎｄｙｃａｍ，Ｓｏｎｙ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）に記録した。記録した画像をパーソナルコンピュータ（ＰｏｗｅｒＭａｃｈｉｎｔｏｓｈ Ｇ４，Ａｐｐｌｅ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に移し、シェアウェアＮＩＨ ｉｍａｇｅｓ/Ｉｍａｇｅ Ｊ １．３２を用いて三次元投影画像を得、そして上面から、６０℃斜め上および側方からのＱｕｉｃｋＴｉｍｅ動画および投影図として記録した。
【０１６２】
（血小板凝集研究）
１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む改変したタイロード−Ｈｅｐｅｓ緩衝液中に洗浄血小板を２×１０５／ｍｌの濃度で入れた。最終濃度１ｍＭでＣａＣｌ２を加え、３７℃で１分間インキュベートした後、種々の濃度のマウストロンビンおよびコラーゲンＩを加えて攪拌を行った。凝集プロファイルをＣｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ血小板凝集計中で３７℃で攪拌しながら生成した。
【０１６３】
（種々のアゴニストによるフィブリノーゲン結合（インテグリンαＩＩβｂ３の活性化）およびＦＡＣＳ分析）
洗浄し、静止させた血小板を、室温で３００ｍｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ４８８結合体化したフィブリノーゲンと、ＡＤＰ、ＰＡＲ４アゴニストペプチド、マウストロンビンまたはＰＭＡ（各々５０ｍＬの最終溶液の０．２ｍＭ ＣａＣｌ２を有する改変したタイロード−Ｈｅｐｅｓ緩衝液に溶解した）とともに３０分間インキュベートした。
【０１６４】
共焦点顕微鏡：１ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．２ｍＭＣａＣｌ２を含む改変したタイロード−Ｈｅｐｅｓ緩衝液中の洗浄血小板（１０７／５００μｌ）を、３７℃で４５分にわたり１２ウェルプレートのフィブリノーゲンコーティングカバースリップに播いた。接着性の細胞を４％ホルムアミド中に固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過させ、そして一次抗体およびＡｌｅｘａ ４８８結合体化させた二次抗体を用いて染色した。
【０１６５】
（結果および考察）
図１は、Ｌｎｋの機能的ドメインは、細胞増殖調節のために重要であることを示す図である。（Ａ）Ｌｎｋ変異体、および内部リポソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有する単一のｍＲＮＡからのｅＧＦＰを共発現するために使用されるＭＳＣＶベクターの代表的な模式図である。そのプロリンリッチ部分（ｓｔｒｅｔｃｈ；黒いバーを有する白いボックスで示す。）、ＳＨ２ドメイン（白いボックス）、およびＣ末端にチロシンリン酸化部位（Ｙ）を有するＮ末端ドメインを示す。Ｎ末端ドメイン（ＤＮ）、ＰＨドメイン（ＤＰＨ）およびＣ末端テイル（ＤＣ）の欠失、ならびにＹ５３６のフェニルアラニン置換（Ｙ５４６Ｆ）およびＲ３６４のグルタミン酸置換（Ｒ３６４Ｅ；ＳＨ２ドメイン中のＸとして示す）を示す。（Ｂ）コントロールベクターで形質導入したＭＣ９細胞（左欄、ベクター）またはＬｎｋ発現ベクターで形質導入したＭＣ９細胞（右欄、ＷＴ）をＳＣＦの存在下で培養し、そして所定の時点で生きているｅＧＦＰ＋細胞の割合を、フローサイトメトリーにより決定した。（Ｃ）ＳＣＦにより誘導される、指示されたＬｎｋ変異体を発現するＭＣ９細胞の増殖速度を、各々の所定の時点におけるｅＧＦＰ＋細胞の割合を培養開始（０日目）で除することによって形質導入していない細胞と比較した。示されているのは、複数の独立実験の代表的結果である。
【０１６６】
図２は、Ｌｎｋ ＳＨ２変異体が、細胞増殖においてＬｎｋの負の調節機能をドミナントネガティブ的に阻害することを示す図である。（Ａ）Ｌｎｋは、ＳＨ２ドメインを介してｃ−Ｋｉｔと会合する。示されたＬｎｋ変異体およびｃ−Ｋｉｔを共発現するＣＯＳ７トランスフェクト体を、ＳＣＦで刺激し、そして溶解した。抗Ｌｎｋ抗体で免疫沈降したタンパク質を分離し、そして抗ホスホチロシン抗体を用いて免疫ブロットして、ｃ−Ｋｉｔを検出し（上パネル）、そして抗Ｌｎｋ抗体を用いて免疫ブロットしたＬｎｋを検出した（下パネル）。ｃ−ＫｉｔとＬｎｋとの会合は、Ｒ３６４Ｅ ＳＨ２変異によって消えていた。（Ｂ）Ｎ末端領域を介したＬｎｋのマルチマー形成。指示されたＬｎｋ変異体を発現するＣＯＳ７形質転換細胞の細胞溶解物全体を、種々の濃度の化学架橋剤ＢＳ３で処理し、ついで抗Ｌｎｋ抗体を用いて免疫ブロットに供した。Ｌｎｋは、マルチマー複合体を形成した。これは、より遅い移動度を示した（矢頭）。マルチマー化した複合体は、ｄＮＬｎｋ変異体では検出できなかった。（ＣおよびＤ）Ｌｎｋ ＳＨ２変異体は、レトロウイルスで野性型Ｌｎｋを発現するＭＣ９−Ｌｎｋ細胞中に形質導入した。形質導入した細胞をＳＣＦの存在下で培養し、そしてその増殖を、形質導入していないＭＣ９−Ｌｎｋ細胞のものと比較した。比較は、所定の時点でのｅＧＦＰ＋細胞を、培養時（０日目）のもので徐することによって求めた。示されるのは３つの独立した実験の代表的なデータである。最後に、Ｒ３６４Ｅ ＳＨ２変異に加えてＤＰＨおよびＤＣの変異（ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ）を、ｗｔ Ｌｎｋに対する阻害作用を有する最も強力なドミナントネガティブ変異体として決定した。
【０１６７】
図３は、ＳＨ２ Ｒ３６４Ｅ単独ではなく、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体の異所性発現は、ＥＳ細胞由来の造巨核球能（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｐｏｉｅｓｉｓ）の成熟を容易にすることを示す図である。
【０１６８】
（Ａ）Ｌｎｋ ｗｔ、ＳＨ２ Ｒ３６４Ｅ単独と、ｃＤＮＡのΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体との間の相違。プロリンリッチ領域を伴うＮ末端ドメイン（黒バーを伴う白ボックス）、ＰＨドメイン（斜線ボックス）、ＳＨ２ドメイン（白ボックス）およびＣ末端のチロシンリン酸化部位（Ｙ）を示す。２つの変異遺伝子のこうかをＥＳ細胞に由来する巨核球において実験した。（Ｂ）分化プロトコールの５日目に、造血前駆細胞を１８時間にわたって、ＧＦＰ単独をコードするウイルス、Ｒ３６４Ｅ変異体およびＧＦＰ（Ｒ３６４Ｅ−ＧＦＰ）またはΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体をコードするウイルスおよびＧＦＰ （ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰ）をコードするウイルスに感染させた。さらなる分化を、２０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯの存在下でＯＰ９とともに共培養することによって維持した。７日目に、細胞を、形質導入した（ＧＦＰ陽性）細胞および非形質導入細胞（ＧＦＰ陰性）におけるＣＤ４１（インテグリンαＩＩｂ）の発現によって分析した。ＧＦＰ陰性細胞におけるＣＤ４１陽性細胞の平均数を１．０と定義した。成熟を研究するために、ＧＰＩβａ発現もまた試験した。示されているのは、３つの独立した実験の平均±ＳＤである。（結果）ＧＦＰ単独、ＳＨ２ Ｒ３６４ＥおよびΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰの間ではＣＤ４１発現細胞の数には変化はなかった。他方、造巨核球における成熟プロセスの特徴であるＧＰＩβａの発現は、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ形質導入した巨核球において増加したが、ＳＨ２ Ｒ３６４Ｅ単独を形質導入した細胞では見られなかった。このことは、ＤＰＨおよびＤＣが、ＳＨ２変異体に加えて、内因性Ｌｎｋに対して阻害し得、そしてこの培養系においての成熟を促すことを示す。
【０１６９】
図４は、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体は成熟巨核球の数および前血小板の生成を増加させることを示す図である。
【０１７０】
（Ａ）ＥＳ細胞から誘導された巨核球においてレトロウイルスによって媒介されたＧＦＰ発現。５日目の造血前駆細胞に、ＧＦＰ単独をコードするかまたはΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰをコードするレトロウイルスを感染させた。９日目および１２日目において、多数の延長を示すＧＦＰ陽性細胞の蛍光画像を、倒立蛍光顕微鏡／コンピュータシステムを用いて所定の暴露時間で得た。そして、１００細胞中の前血小板の数を算出した。（Ａ）のバーの寸法は、１００ｍｍである。（Ｂ左）９日目のＣＤ４１＋ＧＦＰ＋細胞数を、フローサイトメトリーで算出した。フローサイトメトリーにおけるドットプロットの側方散乱および前方散乱にしたがって、２つの任意の分析のゲートを以前に記載されるように適用した（Ｅｔｏ Ｋ，Ｍｕｒｐｈｙ Ｒ，Ｋｅｒｒｉｇａｎ ＳＷ，Ｂｅｒｔｏｎｉ Ａ，Ｓｔｕｈｌｍａｎｎ Ｈ，Ｎａｋａｎｏ Ｔ，Ｌｅａｖｉｔｔ ＡＤ，Ｓｈａｔｔｉｌ ＳＪ （２００２） Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｅ ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．９９：１２８１９−１２８２４．）。示されているでーたは、３つの独立した実験の平均±ＳＤである。（Ｂ）に示されるように、ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰ形質導入された細胞は、成熟した巨核球を示し、そしてレトロウイルス感染の３日後前血小板の数が増えていた。さらに３日後、ＯＰ９細胞との共培養によって、（Ｂ右）に示されるように、前血小板の生成の増強を維持した。
【０１７１】
図５は、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体は、ＥＳ細胞に由来する巨核球からの血小板フラグメンテーションを増加させることを示す図である。１２日目から１４日目の成熟した巨核球から誘導されるフラグメント化した粒子を、本明細書における方法の欄に記載されるようにフローサイトメトリーによって計数した。示されているのは、ＧＰＩβａ＋ＧＦＰ＋の粒子の３日間の合計である。グラフの挿入箇所は、ドットプロットの例を示す。（結果）Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体は、ＥＳ細胞由来のＧＰＩβａ＋血小板粒子の数を増加させたが、ＳＨ２変異体単独では増加させなかった。
【０１７２】
図６は、マウス血小板におけるＬｎｋ発現およびＬｎｋヌルマウスにおける尾部における出血時間の延長を示す図である。（Ａ）マウスｌｎｋのｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞におけるタンパク質発現のウェスタンブロットおよび示された遺伝子型の血小板の分析。２％ＳＤＳ含有ＲＩＰＡ緩衝液によって調製された２５ｍｇの各々の溶解物を、マウスＬｎｋに対するポリクローナル抗体で評価した（Ｔａｋａｋｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｈ．，Ｔｅｚｕｋａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．２００２．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｂｙ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｎｋ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１５１−１６０）。（Ｂ）出血時間を、本明細書において方法の欄に記載されているように決定した。プロットされたデータは、正常なマウス（ｎ＝５）およびＬｎｋヌルマウス（ｎ＝７）であった。
図７は、トロンビンおよびコラーゲンによる血小板凝集を示す図である。
【０１７３】
洗浄し、静止させた血小板を、血小板凝集計に適用し、そしてトロンビン（０．１Ｕ／ｍｌ）またはコラーゲンI（０．５μｇ／ｍｌ）で活性化した。矢印は、アゴニストの添加を示す。示されるのは、３つの独立の実験の代表的な結果である。
【０１７４】
図８は、表面に結合したコラーゲンのエキソビボの血栓形成を示す図である。血液を、抗凝固剤としてアルガトロバンを用いてコントロールマウスまたはＬｎｋ欠損マウスから収集した。硝子製カバースリップを、不溶性の繊維型Ｉ型コラーゲンでコーティングし、そして平行のプレートフローチャンバー中に配置した。（Ａ）コントロール（１０匹のマウス）またはＬｎｋ欠損マウス（１０匹のマウス）からの血小板数を調整なしで全血を、比較的高い剪断速度（１５００ｓ−１）でフローチャンバー中に適用した。連続記録からのコントロール（Ｌｎｋ＋／＋）またはＬｎｋ欠損（Ｌｎｋ−／−）における左の３つのフレームは、血液灌流の２分後、４分後および７分後における、コラーゲンコーティングされた表面（２次元；ＸＹ軸）を示す。コントロールおよびＬｎｋ欠損から形成された血栓が示されている。他方、Ｌｎｋ欠損血液の三次元の画像（右フレーム：Ｚ軸）は、コントロールのものの高さよりも比較的低い血栓を示した。（Ｂ）コントロールの血液に由来する赤血球および血漿とともにコントロールＰＲＰまたはＬｎｋヌルＰＲＰからなる再構成した血液を、高い剪断速度（１５００ｓ−１）でフローチャンバーに適用した。Ｌｎｋ欠損血小板を含有するサンプルにおける三次元画像（Ｚ軸）は、血小板数をコントロールに５×１０５／ｍｌに調整した場合でも、コントロールのものよりも低い血栓高さを示した。
【０１７５】
図９は、Ｌｎｋ欠損血液における灌流後の血栓表面積、血栓高さおよび血栓容量を示す図である。（Ａ）表面積率を、連続的なｚ軸切片から決定した。データは、１−２μｍの高さの血栓における３つの独立した実験の平均を示す。（Ｂ）データは、最大高さ（μｍ）における３つの独立した実験の平均を示す。
【０１７６】
図１０は、Ｌｎｋ欠損血小板における種々のアゴニストによるインテグリンαＩＩβｂ３の活性化を示す図である。種々のアゴニストの添加後に活性化されたαＩＩβｂ３を、フローサイトメトリーにおいて、インテグリンαＩＩβｂ３に結合したＡｌｅｘａ４８８結合体化フィブリノーゲン結合によって分析した。非特異的な結合を、１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で決定した。データは、５〜８回の独立した実験からの平均蛍光強度（ＦＬ−１チャネル）を示す。
【０１７７】
図１１は葉状仮足形成の欠損が、Ｌｎｋ欠損血小板においてフィブリノーゲンに対して見られたことを示す図である。血小板をＬｎｋ−／−およびコントロールマウスから得、そしてアゴニストなし；ＡＤＰ（５０μＭ）；ＰＡＲ４レセプター活性化ペプチド（１ｍＭ）とともに４５分間にわたりフィブリノーゲン上に播いた。ついで、細胞を固定させ、透過させ、そしてＦアクチン（赤）およびホスホチロシン（緑）について染色した。これを共焦点顕微鏡により分析した。矢頭は、糸状仮足を示す。バーは、１０μＭを示す。
【０１７８】
このように、Ｌｎｋのドミナントネガティブによって、血小板の生成が活性化するとともに、生成された血小板は、粘性が高い血液の補充のために適していると予期されることが明らかになった。
【０１７９】
（実施例３：ヒトでの実証）
臍帯血より調製したＣＤ３４＋多能性幹細胞分画をＳｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ （ＳＣＦ） （５０ ｎｇ／ｍｌ）， ＦＬＴ−３Ｌ （５０ ｎｇ／ｍｌ）， ＩＬ−６ （５０ ｎｇ／ｍｌ）の存在下に１〜２日間培養する。この間に、ＬｎｋインヒビターとＧＦＰを共発現するレトロウイルスベクター、ＧＦＰのみを発現するコントロールベクターより調製したウイルス粒子を加えて感染導入する。実験群及びコントロールのＧＦＰ＋感染細胞をフローサイトメーターにてソーティング精製し、各種サイトカイン存在下で培養しコロニー形成能を検討する。巨核球系細胞コロニーについてはコロニー数とともに１コロニーあたりのサイズにも注目する。臍帯血幹細胞の生存あるいは増殖をサポートするストローマ細胞株と共培養を行い、遺伝子導入細胞にて生存あるいは増幅促進効果がみられるかどうかを検討する。これらの培養系において、Ｌｎｋインヒビターの発現により、巨核球系細胞および血小板、各種造血前駆細胞の増殖能が亢進することが予想される。
【０１８０】
同じ細胞数の実験群及びコントロールのＧＦＰ＋感染臍帯血前駆細胞を一定量（感染細胞と同数または半数程度）の非感染細胞（または非処理臍帯血）と混じ、非致死量の放射線照射（３．５ Ｇｙ程度）したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへ移入する。２〜３ヶ月後にレシピエントマウスの抹消血を採取し、ＣＤ１９＋Ｂ細胞分画、ＣＤ３＋Ｔ細胞分画、ＣＤ１１ｂ＋骨髄球分画のＧＦＰ陽性率をフローサイトメトリーにより検討し、感染細胞と非感染細胞の競合条件下での造血能を比較する。Ｌｎｋインヒビターを発現させることにより、移植したドナー臍帯血前駆細胞の生着率、それより産生される巨核球系細胞および血小板、各種造血系細胞、リンパ球の産生量が高まることを確認することができる。
【０１８１】
（実施例４：インヒビタースクリーニング）
次に、Ｌｎｋインヒビタースクリーニングにより血小板生成促進因子のスクリーニングを行う。以下にそのプロトコールを示す。
【０１８２】
ＴＰＯ依存性に増殖する細胞株に遺伝子導入によりＬｎｋを過剰発現させる。このＬｎｋ過剰発現によりＴＰＯ依存性増殖ができなくなった遺伝子導入細胞株に発現あるいは作用させて、Ｌｎｋインヒビターとしての作用をＴＰＯ依存性増殖の回復を指標としてスクリーニングする。Ｌｎｋインヒビターとして作用する可能性が考えられる因子については、ＥＳ細胞株から巨核球及び血小板を分化誘導する分化系での効果を検討し、血小板生成促進因子としての効果を確認する。
【０１８３】
（実施例５：自動化）
実施例４などで実施するスクリーニングは、ロボットを用いて自動化することができる。この場合、例えば、ベックマンコールターのＢｉｏｍｅｋシリーズを用いて、マイクロプレートを用いたシステムを構築するか、またはＺｙｍａｒｋのＳｔａｃｃａｔｏ Ｍｉｎｉ−Ｓｙｓｔｅｍシリーズを用いてシステムを構築することができる。
【０１８４】
このようにして得られたリード化合物は、動物実験に用いることができる。あるいは、このようなリード化合物をもとに、他の化合物を設計することができる。
【０１８５】
（実施例６：動物実験）
実施例４または５などで、Ｌｎｋインヒビターであることが判明した化合物について、マウス、ラットまたはサルなどの動物に投与して血小板生成を調節する化合物をスクリーニングする。
【０１８６】
このようなスクリーニングにより、血小板生成を実際に調節する物質をスクリーニングすることができる。
【０１８７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１８８】
本発明は、血小板の生成を調節する方法、組成物およびシステムを提供する。このような調節により、血小板の生成をコントロールすることが容易になり、その維持・増殖を容易にかつ計画的にすることができるようになった。これらの有用性は、バイオ関連の産業において有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】図１は、Ｌｎｋの機能的ドメインは、細胞増殖調節のために重要であることを示す図である。 （Ａ）Ｌｎｋ変異体、および内部リポソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有する単一のｍＲＮＡからのｅＧＦＰを共発現するために使用されるｐＭＹベクターの代表的な模式図である。そのプロリンリッチ部分（ｓｔｒｅｔｃｈ；黒いバーを有する白いボックスで示す。）、ＳＨ２ドメイン（白いボックス）、およびＣ末端にチロシンリン酸化部位（Ｙ）を有するＮ末端ドメインを示す。Ｎ末端ドメイン（ＤＮ）、ＰＨドメイン（ＤＰＨ）およびＣ末端テイル（ＤＣ）の欠失、ならびにＹ５３６のフェニルアラニン置換（Ｙ５４６Ｆ）およびＲ３６４のグルタミン酸置換（Ｒ３６４Ｅ；ＳＨ２ドメイン中のＸとして示す）を示す。 （Ｂ）コントロールベクターで形質導入したＭＣ９細胞（左欄、ベクター）またはＬｎｋ発現ベクターで形質導入したＭＣ９細胞（右欄、ＷＴ）をＳＣＦの存在下で培養し、そして所定の時点で生きているｅＧＦＰ＋細胞の割合を、フローサイトメトリーにより決定した。 （Ｃ）ＳＣＦにより誘導される、指示されたＬｎｋ変異体を発現するＭＣ９細胞の増殖速度を、各々の所定の時点におけるｅＧＦＰ＋細胞の割合を培養開始（０日目）で除することによって形質導入していない細胞と比較した。示されているのは、複数の独立実験の代表的結果である。
【図２】図２は、Ｌｎｋ ＳＨ２変異体が、細胞増殖においてＬｎｋの負の調節機能をドミナントネガティブ的に阻害することを示す図である。（Ａ）Ｌｎｋは、ＳＨ２ドメインを介してｃ−Ｋｉｔと会合する。示されたＬｎｋ変異体およびｃ−Ｋｉｔを共発現するＣＯＳ７トランスフェクト体を、ＳＣＦで刺激し、そして溶解した。抗Ｌｎｋ抗体で免疫沈降したタンパク質を分離し、そして抗ホスホチロシン抗体を用いて免疫ブロットして、ｃ−Ｋｉｔを検出し（上パネル）、そして抗Ｌｎｋ抗体を用いて免疫ブロットしたＬｎｋを検出した（下パネル）。ｃ−ＫｉｔとＬｎｋとの会合は、Ｒ３６４Ｅ ＳＨ２変異によって消えていた。（Ｂ）Ｎ末端領域を介したＬｎｋのマルチマー形成。指示されたＬｎｋ変異体を発現するＣＯＳ７形質転換細胞の細胞溶解物全体を、種々の濃度の化学架橋剤ＢＳ３で処理し、ついで抗Ｌｎｋ抗体を用いて免疫ブロットに供した。Ｌｎｋは、マルチマー複合体を形成した。これは、より遅い移動度を示した（矢頭）。マルチマー化した複合体は、ｄＮＬｎｋ変異体では検出できなかった。（ＣおよびＤ）Ｌｎｋ ＳＨ２変異体は、レトロウイルスで野性型Ｌｎｋを発現するＭＣ９−Ｌｎｋ細胞中に形質導入した。形質導入した細胞をＳＣＦの存在下で培養し、そしてその増殖を、形質導入していないＭＣ９−Ｌｎｋ細胞のものと比較した。比較は、所定の時点でのｅＧＦＰ＋細胞を、培養時（０日目）のもので徐することによって求めた。示されるのは３つの独立した実験の代表的なデータである。最後に、Ｒ３６４Ｅ ＳＨ２変異に加えてＤＰＨおよびＤＣの変異（ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ）を、ｗｔ Ｌｎｋに対する阻害作用を有する最も強力なドミナントネガティブ変異体として決定した。
【図３】図３は、ＳＨ２ Ｒ３６４Ｅ単独ではなく、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体の異所性発現は、ＥＳ細胞由来の造巨核球能（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｐｏｉｅｓｉｓ）の成熟を容易にすることを示す図である。 （Ａ）Ｌｎｋ ｗｔ、ＳＨ２ Ｒ３６４Ｅ単独と、ｃＤＮＡのΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体との間の相違。プロリンリッチ領域を伴うＮ末端ドメイン（黒バーを伴う白ボックス）、ＰＨドメイン（斜線ボックス）、ＳＨ２ドメイン（白ボックス）およびＣ末端のチロシンリン酸化部位（Ｙ）を示す。２つの変異遺伝子のこうかをＥＳ細胞に由来する巨核球において実験した。（Ｂ）分化プロトコールの５日目に、ＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を１８時間にわたって、ＧＦＰ単独をコードするウイルス、Ｒ３６４Ｅ変異体およびＧＦＰ（Ｒ３６４Ｅ−ＧＦＰ）またはΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体をコードするウイルスおよびＧＦＰ （ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰ）をコードするウイルスに感染させた。さらなる分化を、２０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＯの存在下でＯＰ９とともに共培養することによって維持した。７日目に、細胞を、形質導入した（ＧＦＰ陽性）細胞および非形質導入細胞（ＧＦＰ陰性）におけるＣＤ４１（インテグリンαＩＩｂ）の発現によって分析した。ＧＦＰ陰性細胞におけるＣＤ４１陽性細胞の平均数を１．０と定義した。成熟を研究するために、ＧＰＩｂα発現もまた試験した。示されているのは、３つの独立した実験の平均±ＳＤである。（結果）ＧＦＰ単独、ＳＨ２ Ｒ３６４ＥおよびΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰの間ではＣＤ４１発現細胞の数には変化はなかった。他方、造巨核球における成熟プロセスの特徴であるＧＰＩｂα発現は、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ形質導入した巨核球において増加したが、ＳＨ２ Ｒ３６４Ｅ単独を形質導入した細胞では見られなかった。このことは、ΔＰＨおよびΔＣが、ＳＨ２変異体に加えて、内因性Ｌｎｋに対して阻害し得、そしてこの培養系においての成熟を促すことを示す。
【図４】図４は、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体は成熟巨核球の数および前血小板の生成を増加させることを示す図である。 （Ａ）ＥＳ細胞から誘導された巨核球においてレトロウイルスによって媒介されたＧＦＰ発現。５日目の造血前駆細胞に、ＧＦＰ単独をコードするかまたはΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰをコードするレトロウイルスを感染させた。９日目および１２日目において、多数の延長を示すＧＦＰ陽性細胞の蛍光画像を、倒立蛍光顕微鏡／コンピュータシステムを用いて所定の暴露時間で得た。そして、１００細胞中の前血小板の数を算出した。（Ａ）のバーの寸法は、１００μｍである。（Ｂ左）９日目のＣＤ４１＋ＧＦＰ＋細胞数を、フローサイトメトリーで算出した。フローサイトメトリーにおけるドットプロットの側方散乱および前方散乱にしたがって、２つの任意の分析のゲートを以前に記載されるように適用した（Ｅｔｏ Ｋ，Ｍｕｒｐｈｙ Ｒ，Ｋｅｒｒｉｇａｎ ＳＷ，Ｂｅｒｔｏｎｉ Ａ，Ｓｔｕｈｌｍａｎｎ Ｈ，Ｎａｋａｎｏ Ｔ，Ｌｅａｖｉｔｔ ＡＤ，Ｓｈａｔｔｉｌ ＳＪ （２００２） Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｅ ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．９９：１２８１９−１２８２４．）。示されている結果は、３つの独立した実験の平均±ＳＤである。（Ｂ）に示されるように、ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ−ＧＦＰ形質導入された細胞は、成熟した巨核球を示し、そしてレトロウイルス感染の３日後前血小板の数が増えていた。さらに３日後、ＯＰ９細胞との共培養によって、（Ｂ右）に示されるように、前血小板の生成の増強を維持した。
【図５】図５は、Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体は、ＥＳ細胞に由来する巨核球からの血小板フラグメンテーションを増加させることを示す図である。 １２日目から１４日目の成熟した巨核球から誘導されるフラグメント化した粒子を、本明細書における方法の欄に記載されるようにフローサイトメトリーによって計数した。示されているのは、ＧＰＩｂα＋ＧＦＰ＋の粒子の３日間の合計である。グラフの挿入箇所は、ドットプロットの例を示す。（結果）Ｌｎｋ ΔＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ΔＣ変異体は、ＥＳ細胞由来のＧＰＩｂα＋血小板粒子の数を増加させたが、ＳＨ２変異体単独では増加させなかった。
【図６】図６は、マウス血小板におけるＬｎｋ発現およびＬｎｋ欠損マウスにおける尾部における出血時間の延長を示す図である。 （Ａ）マウスｌｎｋのｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞におけるタンパク質発現のウェスタンブロットおよび示された遺伝子型の血小板の分析。２％ＳＤＳ含有ＲＩＰＡ緩衝液によって調製された２５μｇの各々の溶解物を、マウスＬｎｋに対するポリクローナル抗体で評価した（Ｔａｋａｋｉ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｈ．，Ｔｅｚｕｋａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．２００２．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｂｙ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｎｋ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１５１−１６０．）。（Ｂ）出血時間を、本明細書において方法の欄に記載されているように決定した。プロットされたデータは、正常なマウス（ｎ＝５）およびＬｎｋ欠損マウス（ｎ＝７）であった。
【図７】図７は、トロンビンおよびコラーゲンによる血小板凝集を示す図である。 洗浄し、静止させた血小板を、血小板凝集計に適用し、そしてトロンビン（０．１Ｕ／ｍｌ）またはコラーゲンI（０．５μｇ／ｍｌ）で活性化した。矢印は、アゴニストの添加を示す。示されるのは、３つの独立の実験の代表的な結果である。
【図８】図８は、表面に結合したコラーゲンのエキソビボの血栓形成を示す図である。 血液を、抗凝固剤としてアルガトロバンを用いてコントロールマウスまたはＬｎｋヌルマウスから収集した。硝子製カバースリップを、不溶性の繊維型Ｉ型コラーゲンでコーティングし、そして平行のプレートフローチャンバー中に配置した。（Ａ）コントロール（１０匹のマウス）またはＬｎｋ欠損マウス（１０匹のマウス）からの血小板数を調整なしで全血を、比較的高い剪断速度（１５００ｓ−１）でフローチャンバー中に適用した。連続記録からのコントロール（Ｌｎｋ＋／＋）またはＬｎｋ欠損（Ｌｎｋ−／−）における左の３つのフレームは、血液灌流の２分後、４分後および７分後における、コラーゲンコーティングされた表面（２次元；ＸＹ軸）を示す。コントロールおよびＬｎｋヌルから形成された血栓が示されている。他方、Ｌｎｋ欠損血液の三次元の画像（右フレーム：Ｚ軸）は、コントロールのものの高さよりも比較的低い血栓を示した。（Ｂ）コントロールの血液に由来する赤血球および血漿とともにコントロールＰＲＰまたはＬｎｋヌルＰＲＰからなる再構成した血液を、高い剪断速度（１５００ｓ−１）でフローチャンバーに適用した。Ｌｎｋ欠損血小板を含有するサンプルにおける三次元画像（Ｚ軸）は、血小板数をコントロールに５×１０５／μｌに調整した場合でも、コントロールのものよりも低い血栓高さを示した。
【図９】図９は、Ｌｎｋ欠損血液における灌流後の血栓表面積率、血栓高さを示す図である。 （Ａ）表面積を、連続的なｚ軸切片から決定した。データは、１−２μmの高さの血栓における３つの独立した実験の平均を示す。 （Ｂ）データは、最大高さ（μｍ）における３つの独立した実験の平均を示す。
【図１０】図１０は、Ｌｎｋヌル血小板における種々のアゴニストによるインテグリンαＩＩβｂ３の活性化を示す図である。種々のアゴニストの添加後に活性化されたαＩＩβｂ３を、フローサイトメトリーにおいて、インテグリンαＩＩβｂ３に結合したＡｌｅｘａ４８８結合体化フィブリノーゲン結合によって分析した。非特異的な結合を、１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で決定した。データは、５〜８回の独立した実験からの平均蛍光強度（ＦＬ−１チャネル）を示す。
【図１１】図１１は葉状仮足形成の欠損が、Ｌｎｋヌル血小板においてフィブリノーゲンに対して見られたことを示す図である。 血小板をＬｎｋ−／−およびコントロールマウスから得、そしてアゴニストなし；ＡＤＰ（５０μＭ）あるいはＰＡＲ４レセプター活性化ペプチド（１ｍＭ）とともに４５分間にわたりフィブリノーゲン上に播いた。ついで、細胞を固定させ、透過させ、そしてＦアクチン（赤）およびホスホチロシン（チロシンリン酸化；緑）について染色した。これを共焦点顕微鏡により分析した。矢頭は、糸状仮足を示す。バーは、１０μｍを示す。
【図１２】図１２は、Ｌｎｋ機能の遮断により可能な造血幹細胞の機能制御の説明図。
【配列表フリーテキスト】
【０１９０】
（配列表の説明）
配列番号１は、Ｌｎｋの核酸配列である。
配列番号２は、Ｌｎｋのアミノ酸配列である。
配列番号３は、Ｌｎｋのドミナントネガティブ変異体の核酸配列である。
配列番号４は、Ｌｎｋのドミナントネガティブ変異体のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ＳＣＦの核酸配列である。
配列番号６は、ＳＣＦのアミノ酸配列である。
配列番号７は、Ｌｎｋ変異体Ｒ３６４Ｅの核酸配列である。
配列番号８は、Ｌｎｋ変異体Ｒ３６４Ｅのアミノ酸配列である。
配列番号９は、Ｌｎｋ変異体ΔＰＨの核酸配列である。
配列番号１０は、Ｌｎｋ変異体ΔＰＨのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、Ｌｎｋ変異体ΔＮの核酸配列である。
配列番号１２は、Ｌｎｋ変異体ΔＮのアミノ酸配列である。
配列番号１３は、Ｌｎｋ変異体Ｙ５３６Ｆの核酸配列である。
配列番号１４は、Ｌｎｋ変異体Ｙ５３６Ｆのアミノ酸配列である。
配列番号１５は、Ｒ３６４Ｅの作製に用いたプライマーである。
配列番号１６は、Ｒ３６４Ｅの作製に用いたプライマーである。
配列番号１７は、ΔＰＨの作製に用いたプライマーである。
配列番号１８は、ΔＰＨの作製に用いたプライマーである。
配列番号１９は、ΔＮの作製に用いたプライマーである。
配列番号２０は、ΔＮの作製に用いたプライマーである。
配列番号２１は、Ｙ５３６Ｆの作製に用いたプライマーである。
配列番号２２は、Ｙ５３６Ｆの作製に用いたプライマーである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板を生産する方法であって：該方法は：
Ａ）血小板前駆細胞におけるＬｎｋまたはその等価物の機能を阻害する工程；および
Ｂ）該血小板前駆細胞を分化させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記血小板前駆細胞は、胚性幹細胞および巨核球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記阻害は、前記Ｌｎｋまたはその等価物のドミナントネガティブ法による阻害を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記阻害は、レトロウイルスによって、Ｌｎｋ活性を抑制することのできる変異型Ｌｎｋを導入することにより達成される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｌｎｋは配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするか、あるいはそれらの改変体または断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｂ工程において、幹細胞因子（ＳＣＦ）に前記血小板前駆細胞を接触させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記阻害は、Ｌｎｋの核酸レベルによる阻害によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記阻害は、ＬｎｋのアンチセンスまたはＲＮＡｉによる阻害によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記阻害は、Ｌｎｋの産物レベルによる阻害によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記阻害は、Ｌｎｋの抗体による阻害によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記血小板前駆細胞は、胚性幹細胞から誘導された巨核球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記誘導は、ＯＰ９間質細胞上での培養および二極性血管芽細胞との共培養によって達成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記巨核球への分化において、Ａ）血管芽細胞（ＶＥＧＦタイプ２受容体；Ｆｌｋ−１，ＫＤＲ）かつｃ−ｋｉｔ陽性細胞から分化成熟すること；Ｂ）ＯＰ９ストローマ細胞との物理的な接触が、巨核球への分化成熟に必須であること；およびＣ）血小板産生はＯＰ９ストローマ細胞上においても可能であるが、ＯＰ９との接触を除いた条件にすることで促進されることからなる群より選択される、少なくとも１つの特徴を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法によって生産された、血小板。
【請求項１５】
血小板の生成の速度を調節する物質をスクリーニングする方法であって、
Ａ）ＬｎｋまたはＬｎｋプロモータと相互作用する物質を選ぶ工程；および
Ｂ）該選ばれた物質を血小板前駆細胞に接触させて分化するかどうかを決定し、分化調節作用を有する該物質を選択する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
Ｌｎｋまたはその機能が損傷した血小板を含む組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、粘性の高い血液を有する患者の処置に使用される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子。
【請求項１９】
前記因子は、ドミナントネガティブ因子、プロモーターの結合因子、ＲＮＡｉ、抗体および低分子からなる群より選択される、請求項１８に記載の因子。
【請求項２０】
Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子を含む、血小板の生成の速度を調節するための組成物。
【請求項２１】
前記因子は、ドミナントネガティブ因子、プロモーターの結合因子、ＲＮＡｉ、抗体および低分子からなる群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記因子は、Ｌｎｋまたはその遺伝子産物の機能的変異体である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記因子は、配列番号３に記載されたヌクレオチド配列を有する改変体核酸である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子の、血小板生成の速度の調節のための使用。
【請求項２５】
Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子の、血小板生成の速度の調節のための組成物の製造のための、使用。
【請求項１】
血小板を生産する方法であって：該方法は：
Ａ）血小板前駆細胞におけるＬｎｋまたはその等価物の機能を阻害する工程；および
Ｂ）該血小板前駆細胞を分化させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記血小板前駆細胞は、胚性幹細胞および巨核球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記阻害は、前記Ｌｎｋまたはその等価物のドミナントネガティブ法による阻害を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記阻害は、レトロウイルスによって、Ｌｎｋ活性を抑制することのできる変異型Ｌｎｋを導入することにより達成される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｌｎｋは配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするか、あるいはそれらの改変体または断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｂ工程において、幹細胞因子（ＳＣＦ）に前記血小板前駆細胞を接触させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記阻害は、Ｌｎｋの核酸レベルによる阻害によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記阻害は、ＬｎｋのアンチセンスまたはＲＮＡｉによる阻害によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記阻害は、Ｌｎｋの産物レベルによる阻害によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記阻害は、Ｌｎｋの抗体による阻害によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記血小板前駆細胞は、胚性幹細胞から誘導された巨核球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記誘導は、ＯＰ９間質細胞上での培養および二極性血管芽細胞との共培養によって達成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記巨核球への分化において、Ａ）血管芽細胞（ＶＥＧＦタイプ２受容体；Ｆｌｋ−１，ＫＤＲ）かつｃ−ｋｉｔ陽性細胞から分化成熟すること；Ｂ）ＯＰ９ストローマ細胞との物理的な接触が、巨核球への分化成熟に必須であること；およびＣ）血小板産生はＯＰ９ストローマ細胞上においても可能であるが、ＯＰ９との接触を除いた条件にすることで促進されることからなる群より選択される、少なくとも１つの特徴を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法によって生産された、血小板。
【請求項１５】
血小板の生成の速度を調節する物質をスクリーニングする方法であって、
Ａ）ＬｎｋまたはＬｎｋプロモータと相互作用する物質を選ぶ工程；および
Ｂ）該選ばれた物質を血小板前駆細胞に接触させて分化するかどうかを決定し、分化調節作用を有する該物質を選択する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
Ｌｎｋまたはその機能が損傷した血小板を含む組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、粘性の高い血液を有する患者の処置に使用される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子。
【請求項１９】
前記因子は、ドミナントネガティブ因子、プロモーターの結合因子、ＲＮＡｉ、抗体および低分子からなる群より選択される、請求項１８に記載の因子。
【請求項２０】
Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子を含む、血小板の生成の速度を調節するための組成物。
【請求項２１】
前記因子は、ドミナントネガティブ因子、プロモーターの結合因子、ＲＮＡｉ、抗体および低分子からなる群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記因子は、Ｌｎｋまたはその遺伝子産物の機能的変異体である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記因子は、配列番号３に記載されたヌクレオチド配列を有する改変体核酸である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子の、血小板生成の速度の調節のための使用。
【請求項２５】
Ｌｎｋまたはその遺伝子産物を阻害する因子の、血小板生成の速度の調節のための組成物の製造のための、使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００７−８９４３２（Ｐ２００７−８９４３２Ａ）
【公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２８０９９０（Ｐ２００５−２８０９９０）
【出願日】平成１７年９月２７日（２００５．９．２７）
【出願人】（５０３３４１６７５）株式会社リプロセル (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２７日（２００５．９．２７）
【出願人】（５０３３４１６７５）株式会社リプロセル (13)
【Ｆターム（参考）】
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