微生物の検出方法、装置およびプログラム
【課題】 対象となる微生物を精度良く検出することができる微生物の検出方法を提供する。
【解決手段】 培養された微生物を検出する方法であって、微生物を培養した培地を撮像して画像データを取得する撮像ステップと、前記画像データから検出対象となる微生物のコロニーを抽出して判別するコロニー判別ステップとを備え、前記コロニー判別ステップは、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニーの判別を行う。
【解決手段】 培養された微生物を検出する方法であって、微生物を培養した培地を撮像して画像データを取得する撮像ステップと、前記画像データから検出対象となる微生物のコロニーを抽出して判別するコロニー判別ステップとを備え、前記コロニー判別ステップは、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニーの判別を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養された微生物を検出する微生物の検出方法、装置およびプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
食品を直接取り扱う製造および営業従事者に対しては、サルモネラ、シゲラおよび腸管出血性大腸菌などによる感染症の発生を防止するため、定期的な検便（糞便細菌検査）が行われている。このような検査は、培地への接種→培養→判定という流れで行われ、陽性と判定されたコロニーが釣菌されて、確認試験が行われる。
【０００３】
コロニーの判定は、その重要性から通常は熟練した技術者の目視により行われるが、検体数が非常に多いことから、微生物の検出を自動化することが従来から検討されている。例えば、特許文献１には、微生物を撮像した画像から色などの特徴を数値化し、統計的手法を用いて得られた数値と比較して、菌種判定を行うことが記載されている。
【特許文献１】特開２００３−１１６５９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところが、撮像画像に基づく従来の微生物検出方法は、検出対象となるコロニーを類似のコロニーから判別することが困難な場合が多く、汎用性の高い検出ができないという問題があった。
【０００５】
そこで、本発明は、対象となる微生物を精度良く検出することができる微生物の検出方法、装置およびプログラムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の前記目的は、培養された微生物を検出する方法であって、微生物を培養した培地を撮像して画像データを取得する撮像ステップと、前記画像データから検出対象となる微生物のコロニーを抽出して判別するコロニー判別ステップとを備え、前記コロニー判別ステップは、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニーの判別を行う微生物の検出方法により達成される。
【０００７】
また、本発明の前記目的は、培養された微生物を検出する装置であって、微生物を培養した培地を撮像して画像データを取得する撮像装置と、前記画像データから検出対象となる微生物のコロニーを抽出して判別する画像処理装置とを備え、前記画像処理装置は、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニーの判別を行う微生物の検出装置により達成される。
【０００８】
また、本発明の前記目的は、微生物を培養した培地を撮像して取得した画像データから、対象となる微生物のコロニーを抽出して判別する画像処理ステップをコンピュータに実行させるためのプログラムであって、前記画像処理ステップは、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニーの判別を行うステップを含む微生物の検出プログラムにより達成される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、対象となる微生物を精度良く検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。図１は、本発明の一実施形態に係る微生物検出装置の概略構成図である。図１に示すように、微生物検出装置１は、糞便などの検体が塗布された培地を含むシャーレ２を複数収容する検体ストッカー１０と、収容されたシャーレ２を矢示方向に順次搬送する搬送路２０ａを上面に有する搬送コンベア２０と、撮像エリアＡに搬送されたシャーレ２を撮像する撮像装置３０と、撮像エリアＡのシャーレ２を照明する照明装置４０と、撮像された画像データから検出対象となる微生物のコロニーを抽出して判別する画像処理装置５０と、コロニーの判別結果に基づきシャーレ２を振り分けて収容する回収ストッカー６０と、装置全体の作動制御を行う制御装置７０とを備えている。シャーレ２は、透明ガラスや透明プラスチック等からなり、培地を収容する本体部２ａの開口が、蓋体２ｂにより覆われて構成されている。
【００１１】
検体ストッカー１０は、シャーレ２を鉛直方向に整列させた状態で収容し、下部に配置されたストッパ（図示せず）の進退により、搬送路２０ａ上に等間隔で配置された透明な受け台２０１ａにシャーレ２を供給することができる。
【００１２】
搬送コンベア２０は、例えばベルトコンベアであり、搬送路２０ａがフッ素樹脂ベルトなどの透明な材料により構成される。搬送路２０ａの上方には、複数の開閉アーム２２が設けられている。各開閉アーム２２は、搬送路２０ａに沿ってシャーレ２と同じ速度で移動するように無端状ベルト（図示せず）に支持されている。開閉アーム２２は、回動動作により蓋体２ｂの開放および閉塞を行う。
【００１３】
撮像装置３０は、例えばＲＧＢ出力などの色信号を出力することが可能なカラーカメラであり、微生物の検出精度を高めるために、高解像度のものを好ましく用いることができる。撮像装置３０で撮像された画像データは、画像処理装置５０に入力される。
【００１４】
照明装置４０は、搬送路２０ａにより搬送されるシャーレ２の上方に配置されて培地ｍの表面側を照明する表面側光源４２と、シャーレ２の下方に配置されて培地ｍの裏面側を照明する裏面側光源４４とを備えている。
【００１５】
表面側光源４２は、図２に示すように、筐体４２１の内部に面状ＬＥＤ光源からなる照明器４２２およびハーフミラー４２３を備えており、筐体４２１の内側面に設置された照明器４２２からの照射光が、ハーフミラー４２３の表面で反射して搬送路２０ａ上のシャーレ２に向けて照射されるように構成されている。また、筐体４２１の上部には開口４２４が形成されており、撮像装置３０は、開口４２４およびハーフミラー４２３を介して、直下に位置するシャーレ２を撮像する。このように、本実施形態の表面側光源４２は、同軸落射型光源であり、照明光の光軸が撮像装置３０の光軸と同軸になるように、シャーレ２に対する照明を行う。裏面側光源４４は、面状ＬＥＤ光源であり、搬送路２０ａを介してシャーレ２の裏面側全体を照射する。
【００１６】
画像処理装置５０は、例えば汎用のパーソナルコンピュータから構成することができ、制御部（ＣＰＵ）、記憶部（メモリ）、入力部（キーボード、マウス）、出力部（モニタ）などを備えている。画像処理装置５０における判別結果は、制御装置７０に入力される。
【００１７】
回収ストッカー６０は、画像処理装置５０により陰性と判定されたシャーレ２を収容する第１収容部６２と、陽性と判定されたシャーレ２を収容する第２収容部６４とを備えており、搬送路２０ａを搬送されるシャーレ２は、リフト機構（図示せず）の作動により上方に持ち上げられ、第１収容部６２または第２収容部６４のいずれかに収容される。
【００１８】
制御装置７０は、検出動作のオンオフや検出条件の入力などを行うための操作部を備えており、微生物検出装置１の各構成要素の作動を制御する。制御装置７０は、画像処理装置５０と一体化することも可能である。
【００１９】
上記の構成を備える微生物検出装置１によれば、検体を培養したシャーレ２を検体ストッカー１０に収容すると、このシャーレ２は搬送路２０ａ上に順次供給されて搬送される。そして、シャーレ２は、開閉アーム２２の作動により蓋体２ｂが開けられた後、撮像装置３０の直下である撮像エリアＡを通過する際に、照明装置４０により上下方向から照明された状態で、撮像装置３０により撮像される。撮像された画像データは、画像処理装置５０に送信され、検出対象となるコロニーの判別が行われる。画像処理装置５０における画像処理の詳細については、後述する。
【００２０】
撮像エリアＡを通過したシャーレ２は、開閉アーム２２の作動により蓋体２ｂが再び閉じられた後、回収ストッカー６０まで搬送され、画像処理装置５０による判別結果に基づき、第１収容部６２または第２収容部６４に振り分けられて、収容される。こうして、各検体の微生物の検出を連続的に行うことができる。
【００２１】
図３に示すように、培養されたコロニーｃは、培地ｍの表面からドーム状に膨出した形状を有するものが多い。このため、撮像エリアＡにおいては、表面側光源４２からの同軸落射照明光Ｌ１により、主としてコロニーの表面中心部で反射した光が直上の撮像装置３０に到達し、コロニーの表面外縁部で反射した光は側方に散乱する。撮像装置３０に到達する反射光の光量は、コロニーｃの立体形状によって変化し、平坦な形状であるほど多く、急峻であるほど少なくなることから、撮像装置３０で撮像する画像データは、コロニーの三次元形状の情報を含んだものとなる。
【００２２】
また、培地ｍやコロニーｃが透明度を有する場合には、表面側光源４２からの照明によりコロニーｃの下方に生じる影を検出するおそれがあるが、裏面側光源４４からの透過照明光Ｌ２により、撮像装置３０は、コロニーｃの影の影響を受けることなく撮像することができる。
【００２３】
このように、表面側光源４２および裏面側光源４４から培地ｍに対して照明光を同時に照射した状態で撮像することにより、検出対象となるコロニーの特徴をより顕在化させることができ、コロニーの判別を容易に行うことができる。
【００２４】
表面側光源４２および裏面側光源４４から照明光を同時に照射する場合には、これらの光量バランスも重要な要素となり得る。培地ｍの表面の照度で比較した場合、表面側光源４２の照明光（同軸落射照明）の照度Ｌａに対して、裏面側光源４４の照明光（透過照明）の照度Ｌｂが大きすぎると、コロニーｃの外縁部における色情報が失われやすい一方、裏面側光源４４の照明光（透過照明）の照度Ｌｂが小さすぎると、コロニーｃの中心部における色情報が失われやすくなる。後述する実施例に示すように、この照度比（Ｌａ／Ｌｂ）は、２．１×１０―５〜２．３×１０３であることが好ましく、２．７×１０―５〜１．４×１０３であることがより好ましく、０．９〜３．５であることが更に好ましい。
【００２５】
検出対象となるコロニーによっては、表面側光源４２または裏面側光源４４のいずれか一方のみの照明によっても類似のコロニーから判別することが可能であり、この場合の微生物検出装置は、表面側光源４２または裏面側光源４４のいずれかのみを備える構成であってもよい。また、表面側光源４２は、本実施形態においては、培地ｍに対して垂直方向に照明光を照射する同軸落射照明型の光源を使用しているが、シャーレ２に対して斜め上方から照射するリング照明型やライン照明型の光源を使用してもよく、これらは同軸落射照明型の光源と適宜交換するか、或いは、同軸落射照明型の光源と同時に併用することができる。
【００２６】
次に、画像処理装置５０において画像データに基づきコロニーを判別する処理手順を、図４に示すフローチャートを参照しながら説明する。
【００２７】
まず、作業者は、検査目的を明らかにするために、検査対象物を特定するための対象物情報を入力する（ステップＳ１）。対象物情報としては、培地名、ロット番号、有効期間などの培地情報や、試験方法、検体名、接種菌名、検体番号、培養条件、培養温度、培養時間などの検体情報などが挙げられる。これらの情報の一部は、予め画像処理装置５０に入力しておくことが可能であり、作業者が最小限の情報のみを入力するようにしてもよい。
【００２８】
こうして対象物情報の入力が行われると、画像処理装置５０は、この対象物情報に基づき、特定の微生物のコロニーを判別するための検査情報を設定する（ステップＳ２）。検査情報としては、撮像情報（例えば、同軸落射照明、透過照明、リング照明などからの１又は複数の選択、各照明光の照度、撮像装置３０の絞り値やシャッター速度）、変換する色空間（例えば、ＨＬＳ空間）、色要素値（例えば、ＨＬＳ値）の基準値、形状情報（例えば、コロニーの大きさ、真円度）などを挙げることができる。検査情報は、対象物情報に対応して画像処理装置５０に予め格納されており、作業者が入力した対象物情報に応じて自動的に設定されるが、作業者が検査情報の一部または全部を手動で入力、修正することも可能である。
【００２９】
この後、画像処理装置５０は、撮像装置３０から画像データが順次入力されると、検体番号などの識別情報と対応付けて、画像データをメモリに格納する（ステップＳ３）。そして、取り込まれた各画像データに対し、検査情報に基づき、コロニーの抽出、判別を行う。
【００３０】
まず、画像データに含まれる微生物のコロニーを、色要素値に基づき抽出する（ステップＳ４）。画像データを構成する各画素の色情報は、Ｒ，Ｇ，Ｂの色要素値で表現されており、画像処理装置５０は、画素毎にＲＧＢ値を取得して、これを所定の色空間の各軸を構成する色要素の値に変換する。色空間としては、ＨＬＳ色空間、ＹＣＣ色空間、ＨＳＶ空間、Ｌ*ａ*ｂ空間、ＣＭＹＫ色空間、ＲＧＢ色空間など公知の各種色空間とすることが可能であり、色要素の種類は、３種類だけでなく、２種類や４種類以上であってもよい。こうして、画像データ全体の各色要素値を色要素ごとに予め設定された基準値と比較し、全ての色要素値が基準値を満足する場合に、当該画素を検出対象のコロニー色として抽出することができる。色要素の基準値は、閾値として設定してもよく、或いは、所定の数値範囲で設定することが可能である。
【００３１】
本実施形態においては、色相（Hue）、彩度（Saturation）および輝度（Luminance）の３つの色要素から構成されるＨＬＳ色空間に基づき、それぞれの色要素値を、色要素ごとに予め設定された基準値と比較して、検出対象となるコロニーの判別を行う。ＨＬＳ色空間による画像データの表現は、人が色を知覚する方法に近いことから、コロニーの判別基準を技術者の判断基準により近づけることが可能であり、検出精度をより高めることができる。
【００３２】
検出対象のコロニー色と判別された画素群は、検出対象とするコロニー形状にほぼ一致する領域（コロニー領域）を占めることになり、画像データに複数のコロニーが存在する場合には、コロニー領域と判別された画素群を個別に抽出し、それぞれの位置を特定することができる。
【００３３】
次に、抽出されたコロニー領域の形状を、予め設定された形状情報と比較することにより、コロニー領域が真のコロニーであるか否かを判別する（ステップＳ５）。
【００３４】
形状情報は、検出対象となるコロニーの菌種や培養条件などに基づいて、コロニーの大きさ（直径）や真円度などが予め所定の数値範囲で設定されており、この数値範囲に合致するものを、真のコロニーと判定する。例えば、形状情報にコロニーの大きさ（直径）が含まれている場合には、微細なゴミなどが除去され、形状情報に真円度が含まれている場合には、遊走の有無の判別や、コロニーとは明らかに形状が異なるものの除去が行われる。形状情報としては、培地に対するコロニーの疎密度など他の情報を含んでいてもよい。コロニー領域と形状情報とを比較する工程は、より精度の高いコロニー判定を行うために有効であるが、本発明において必須のものではなく、この工程を省略して、抽出されたコロニー領域をそのままコロニーと判定することも可能である。
【００３５】
コロニーの形状情報は、コロニーの全体形状に必ずしも合致する必要はない。例えば、図５に示すように、１つのコロニーｃを、中心から外方に向けてコロニー中心部ｃ１、コロニー外縁部ｃ２およびコロニー周辺部ｃ３と同心円状に分割し、分割された領域の１又は複数を形状情報とすることができる。コロニーの特徴的な色情報は、通常はコロニー中心部ｃ１やコロニー外縁部ｃ２に現れるが、例えば血液寒天培地上のStreptococcus属のように、発育コロニー周辺の培地成分の性状/外観を変化させる菌の鑑別を行うような場合には、コロニー周辺部ｃ３を形状情報に含めることが有効である。このように、対象となるコロニーに応じた特徴的な色要素の基準値および形状情報を設定することにより、コロニーの判別を容易に行うことができる。
【００３６】
コロニーを分割した複数領域を形状情報とする場合、上記ステップＳ４におけるコロニー領域の抽出は、各分割領域に対応して設定された基準値に基づいてそれぞれ行われ、上記ステップＳ５においては、各分割領域を、それぞれが対応する形状情報と比較することにより、コロニーか否かの判別を行う。但し、上記のように、領域の分割は本発明において必須のものではない。
【００３７】
ついで、画像処理装置５０は、得られた判別結果を、画像データや対象物情報に関連付けてメモリに格納する（ステップＳ６）。画像データから検出対象のコロニーが抽出された場合には、当該コロニーの座標値も併せて格納することが可能であり、更には当該コロニーを画像データにマーキングし、モニタなどに出力したときに作業者が認識し易いようにすることもできる。
【００３８】
こうして画像データに対する一連の処理が終了した後、次の画像データが画像処理装置５０に送信されると、上記のステップＳ３からＳ６を繰り返し行い、撮像装置３０からの画像データの送信が終了すると、画像処理装置５０の作業が終了する（ステップＳ７）。
【００３９】
このように、本実施形態の微生物検出装置１によれば、培地を撮像した画像データから、複数の色要素値を基準値とそれぞれ比較してコロニーの判別を行うため、熟練者の目視判定に近い精度で機械判定を行うことができ、検出精度を高めることができる。
【００４０】
また、検出対象となるコロニーに応じて色空間、撮影情報、形状情報などを適宜選択することにより、類似のコロニーからの判別が容易になり、検出精度を更に高めることができる。例えば、後述する実施例に示すように、サルモネラ、シゲラ、腸管出血性大腸菌のような菌種のコロニーを類似のコロニーから精度良く判別することが可能であり、検便検査の処理能力を高めて省力化や人件費の低減を図ることができる。更に、検出対象がサルモネラ、シゲラ、腸管出血性大腸菌などから選択される複数の菌種のコロニーである場合には、各菌種に対応する基準値を使用することにより、選択された複数の菌種を同時に判別することが可能である。
【００４１】
以上、本発明の一実施形態について詳述したが、本発明の具体的な態様は上記実施形態に限定されない。例えば、本実施形態の微生物検出装置は、検体を連続的に処理可能な構成としているが、バッチ式の構成にすることも可能である。
【００４２】
また、微生物を培養する培地は、寒天などの固形状の培地の他に、半流動状の培地や液状の培地などであってもよい。培地は必ずしもシャーレや試験管などの容器に収容する必要はなく、例えばフィルターに培養液を含浸させたものを培地として使用することもできる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明の実施例に基づき、本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されるものではい。
【００４４】
［実施例１：色空間によるコロニー分離能］
腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の検出用培地であるＣＴ−ＳＭＡＣＳＰ寒天培地（栄研化学製）を使用して、Ｏ１５７と、他の腸内グラム陰性桿菌であるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとを培養し、これを撮像して得られた画像データの各画素のＲＧＢ値をＨＬＳ値に変換した。撮像装置としては、カラーＣＣＤカメラを使用した。
【００４５】
図６（ａ）は、培地を収容するシャーレを白色板上に配置し、上方から撮像する撮像装置と光軸が一致するように同軸落射照明を行った場合において、Ｏ１５７およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニーのＨＬＳ値を、ＨＬＳ色空間にプロットした結果を示している。各コロニーは作業者が目視で判別し、Ｏ１５７を菱形、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを十字で表している。同軸落射照明光の照度は、白色板の表面（シャーレの載置面）付近において、約４０００（lux）となるように設定した。
【００４６】
図６（ａ）に示すように、Ｏ１５７のコロニーは、ＨＬＳ空間において互いに近接する位置に配置されており、破線で示す２つの直方体状の空間Ｓａ，Ｓｂのいずれかに収まっている（実際には、空間ＳａおよびＳｂは、Ｈ値０°を介して一体の空間を構成している）。したがって、コロニーのＨＬＳ値とそれぞれ比較する基準値を、これら直方体状の空間Ｓａ，Ｓｂを構成するように数値範囲の設定を行うことで、Ｏ１５７のコロニーをＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニーから分離して判別することができる。
【００４７】
図６（ｂ）は、照射条件を変える他は、図６（ａ）の場合と同様の条件で試験を行ったプロット結果を示すものである。照射条件は、培地を収容するシャーレを透明板上に配置し、上方から撮像する撮像装置と光軸が一致するように同軸落射照明を行うと共に、シャーレの直下位置において透明板の下方から透過照明を行った（図３参照）。同軸落射照明光および透過照明の照度は、透明板の表面（シャーレの載置面）付近において、それぞれ２０００（lux）、１０００（lux）とした。
【００４８】
図６（ｂ）に示すように、Ｏ１５７のコロニーは、図６（ａ）の結果と比較して、より小さな直方体状の空間Ｓｃ内に収まっており、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニー群からの距離も遠くなっていることから、判別をより容易に行うことができる。
【００４９】
次に、サルモネラ、シゲラの検出用培地である５Ｓ＋Ａ寒天培地（栄研化学製）を使用して、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓと、他の腸内グラム陰性桿菌であるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ＴｙｐｈｉおよびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとを培養し、これを撮像して得られた画像データの各画素のＲＧＢ値をＨＬＳ値に変換した。
【００５０】
図７（ａ）および（ｂ）は、照射条件をそれぞれ図６（ａ）および（ｂ）に対応させたものであり、図７（ａ）が同軸落射照明のみ、図７（ｂ）が同軸落射照明＋透過照明の場合のＨＬＳ色空間におけるプロット結果を示している。各コロニーは作業者が目視で判別し、Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを菱形、Ｓ．Ｔｙｐｈｉを十字、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを正方形で表している。図７（ａ）および（ｂ）から明らかなように、Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよびＳ．Ｔｙｐｈｉは、他の菌から分離して判別可能である。
【００５１】
図８（ａ）および（ｂ）は、照射条件を同軸落射＋透過照明で撮像したものであり、それぞれ図８（ａ）はＯ１５７およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニーをＲＧＢ色空間でプロットしたものであり、図８（ｂ）はＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．Ｔｙｐｈｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニーをＲＧＢ色空間でプロットしたものである。図８（ａ）および（ｂ）は、それぞれ図６（ｂ）および図７（ｂ）に対応しており、図８（ａ）および（ｂ）に示すＲＧＢ色空間をＨＬＳ色空間に変換したものが、図６（ｂ）および図７（ｂ）である。
【００５２】
図８（ａ）および（ｂ）に示すように、本実施例においては、ＨＬＳ色空間に変換する前のＲＧＢ色空間においても、それぞれＯ１５７およびＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．Ｔｙｐｈｉのコロニーを判別可能である。
【００５３】
［実施例２：照度比とコロニー分離能］
図７（ｂ）のプロット結果に対応する試験条件において、同軸落射照明光の照度Ｌａと、透過照明光の照度Ｌｂとの照度比（Ｌａ／Ｌｂ）をパラメータとして、ＨＬＳ色空間における各コロニーのプロット分布がどのように変化するかを調べた。この結果を、図９（ａ），（ｂ）、図１０（ａ），（ｂ）、図１１（ａ），（ｂ）および図１２（ａ），（ｂ）に示す。
【００５４】
図９（ａ），（ｂ）および図１０（ａ），（ｂ）の照度条件は、透過照明光の照度Ｌｂを１１６０（lux）で一定とした上で、同軸落射照明光の照度Ｌａを、それぞれ８１０、１０２０、４０７０、４２９０（lux）としている。図９（ａ）のプロット結果は、図９（ｂ）と比較した場合に、Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓとＳ．Ｔｙｐｈｉのそれぞれのプロット群が非常に近接している一方、図１０（ｂ）のプロット結果は、図１０（ａ）と比較した場合に、Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓとＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのそれぞれそれぞれのプロット群が非常に近接していることから、Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよびＳ.Ｔｙｐｈｉの判別はいずれも困難になる傾向にある。
【００５５】
このような現象は、同軸落射照明光の照度Ｌａおよび透過照明光の照度Ｌｂの絶対値よりも、両者のバランス、すなわち照度比（Ｌａ／Ｌｂ）の影響が大きいと考えられることから、照度比（Ｌａ／Ｌｂ）を、図９（ｂ）および図１０（ａ）の場合の照度比の範囲に設定することが好ましい。より具体的に算出すると、照度比（Ｌａ／Ｌｂ）を、約０．９〜３．５の範囲に設定することが好ましい。
【００５６】
ここで、同軸落射照明光の照度Ｌａおよび透過照明光の照度Ｌｂは、いずれもシャーレの載置面付近で測定した結果であり、照度計は、3423 LUX HiTESTER (HIOKI)を使用した。
【００５７】
上記の好ましい照度比は、２種類以上で、特に３種類のコロニーを分類する場合に適しているが、２種類のみのコロニーを分類する場合には、好ましい照度比の範囲をより拡げることが可能である。
【００５８】
図１１（ａ），（ｂ）は、Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓとＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニーについて、照度比（Ｌａ／Ｌｂ）をそれぞれ２．１×１０―５および２．３×１０３としたときのプロット結果である。図１１（ａ）は、同軸落射La=0.3(lux)、透過Lb=14285(lux)の場合であり、図１１（ｂ）は、同軸落射La=22100(lux)、透過Lb=9.6(lux)の場合である。Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを菱形、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを十字で表している。この結果から、上記照度比の範囲では、Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓとＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとの分離が可能であることがわかる。
【００５９】
図１２（ａ），（ｂ）は、Ｓ.ＴｙｐｈｉとＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニーについて、照度比（Ｌａ／Ｌｂ）をそれぞれ２．７×１０−５および１．４×１０３としたときのプロット結果である。図１２（ａ）は、同軸落射La=0.3(lux) 、透過Lb=11130(lux)の場合であり、図１２（ｂ）は、同軸落射La=13490(lux)、透過Lb=9.6(lux)の場合である。Ｓ.Ｔｙｐｈｉを菱形、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを十字で表している。この結果から、上記照度比の範囲では、Ｓ.ＴｙｐｈｉとＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとの分離が可能であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の一実施形態に係る微生物検出装置の概略構成図である。
【図２】図１に示す微生物検出装置の要部拡大図である。
【図３】培地への照明を模式的に示す図である。
【図４】画像データに基づきコロニーを判別する処理手順を説明するためのフローチャートである。
【図５】コロニーの特徴領域の一例を説明するための図である。
【図６】本発明の実施例による試験結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例による試験結果を示す図である。
【図８】本発明の実施例による試験結果を示す図である。
【図９】本発明の実施例による試験結果を示す図である。
【図１０】本発明の実施例による試験結果を示す図である。
【図１１】本発明の実施例による試験結果を示す図である。
【図１２】本発明の実施例による試験結果を示す図である。
【符号の説明】
【００６１】
１ 微生物検出装置
２ シャーレ
１０ 検体ストッカー
２０ 搬送コンベア
３０ 撮像装置
４０ 照明装置
４２ 表面側光源
４４ 裏面側光源
５０ 画像処理装置
６０ 回収ストッカー
７０ 制御装置
ｍ 培地
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養された微生物を検出する微生物の検出方法、装置およびプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
食品を直接取り扱う製造および営業従事者に対しては、サルモネラ、シゲラおよび腸管出血性大腸菌などによる感染症の発生を防止するため、定期的な検便（糞便細菌検査）が行われている。このような検査は、培地への接種→培養→判定という流れで行われ、陽性と判定されたコロニーが釣菌されて、確認試験が行われる。
【０００３】
コロニーの判定は、その重要性から通常は熟練した技術者の目視により行われるが、検体数が非常に多いことから、微生物の検出を自動化することが従来から検討されている。例えば、特許文献１には、微生物を撮像した画像から色などの特徴を数値化し、統計的手法を用いて得られた数値と比較して、菌種判定を行うことが記載されている。
【特許文献１】特開２００３−１１６５９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところが、撮像画像に基づく従来の微生物検出方法は、検出対象となるコロニーを類似のコロニーから判別することが困難な場合が多く、汎用性の高い検出ができないという問題があった。
【０００５】
そこで、本発明は、対象となる微生物を精度良く検出することができる微生物の検出方法、装置およびプログラムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の前記目的は、培養された微生物を検出する方法であって、微生物を培養した培地を撮像して画像データを取得する撮像ステップと、前記画像データから検出対象となる微生物のコロニーを抽出して判別するコロニー判別ステップとを備え、前記コロニー判別ステップは、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニーの判別を行う微生物の検出方法により達成される。
【０００７】
また、本発明の前記目的は、培養された微生物を検出する装置であって、微生物を培養した培地を撮像して画像データを取得する撮像装置と、前記画像データから検出対象となる微生物のコロニーを抽出して判別する画像処理装置とを備え、前記画像処理装置は、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニーの判別を行う微生物の検出装置により達成される。
【０００８】
また、本発明の前記目的は、微生物を培養した培地を撮像して取得した画像データから、対象となる微生物のコロニーを抽出して判別する画像処理ステップをコンピュータに実行させるためのプログラムであって、前記画像処理ステップは、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニーの判別を行うステップを含む微生物の検出プログラムにより達成される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、対象となる微生物を精度良く検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。図１は、本発明の一実施形態に係る微生物検出装置の概略構成図である。図１に示すように、微生物検出装置１は、糞便などの検体が塗布された培地を含むシャーレ２を複数収容する検体ストッカー１０と、収容されたシャーレ２を矢示方向に順次搬送する搬送路２０ａを上面に有する搬送コンベア２０と、撮像エリアＡに搬送されたシャーレ２を撮像する撮像装置３０と、撮像エリアＡのシャーレ２を照明する照明装置４０と、撮像された画像データから検出対象となる微生物のコロニーを抽出して判別する画像処理装置５０と、コロニーの判別結果に基づきシャーレ２を振り分けて収容する回収ストッカー６０と、装置全体の作動制御を行う制御装置７０とを備えている。シャーレ２は、透明ガラスや透明プラスチック等からなり、培地を収容する本体部２ａの開口が、蓋体２ｂにより覆われて構成されている。
【００１１】
検体ストッカー１０は、シャーレ２を鉛直方向に整列させた状態で収容し、下部に配置されたストッパ（図示せず）の進退により、搬送路２０ａ上に等間隔で配置された透明な受け台２０１ａにシャーレ２を供給することができる。
【００１２】
搬送コンベア２０は、例えばベルトコンベアであり、搬送路２０ａがフッ素樹脂ベルトなどの透明な材料により構成される。搬送路２０ａの上方には、複数の開閉アーム２２が設けられている。各開閉アーム２２は、搬送路２０ａに沿ってシャーレ２と同じ速度で移動するように無端状ベルト（図示せず）に支持されている。開閉アーム２２は、回動動作により蓋体２ｂの開放および閉塞を行う。
【００１３】
撮像装置３０は、例えばＲＧＢ出力などの色信号を出力することが可能なカラーカメラであり、微生物の検出精度を高めるために、高解像度のものを好ましく用いることができる。撮像装置３０で撮像された画像データは、画像処理装置５０に入力される。
【００１４】
照明装置４０は、搬送路２０ａにより搬送されるシャーレ２の上方に配置されて培地ｍの表面側を照明する表面側光源４２と、シャーレ２の下方に配置されて培地ｍの裏面側を照明する裏面側光源４４とを備えている。
【００１５】
表面側光源４２は、図２に示すように、筐体４２１の内部に面状ＬＥＤ光源からなる照明器４２２およびハーフミラー４２３を備えており、筐体４２１の内側面に設置された照明器４２２からの照射光が、ハーフミラー４２３の表面で反射して搬送路２０ａ上のシャーレ２に向けて照射されるように構成されている。また、筐体４２１の上部には開口４２４が形成されており、撮像装置３０は、開口４２４およびハーフミラー４２３を介して、直下に位置するシャーレ２を撮像する。このように、本実施形態の表面側光源４２は、同軸落射型光源であり、照明光の光軸が撮像装置３０の光軸と同軸になるように、シャーレ２に対する照明を行う。裏面側光源４４は、面状ＬＥＤ光源であり、搬送路２０ａを介してシャーレ２の裏面側全体を照射する。
【００１６】
画像処理装置５０は、例えば汎用のパーソナルコンピュータから構成することができ、制御部（ＣＰＵ）、記憶部（メモリ）、入力部（キーボード、マウス）、出力部（モニタ）などを備えている。画像処理装置５０における判別結果は、制御装置７０に入力される。
【００１７】
回収ストッカー６０は、画像処理装置５０により陰性と判定されたシャーレ２を収容する第１収容部６２と、陽性と判定されたシャーレ２を収容する第２収容部６４とを備えており、搬送路２０ａを搬送されるシャーレ２は、リフト機構（図示せず）の作動により上方に持ち上げられ、第１収容部６２または第２収容部６４のいずれかに収容される。
【００１８】
制御装置７０は、検出動作のオンオフや検出条件の入力などを行うための操作部を備えており、微生物検出装置１の各構成要素の作動を制御する。制御装置７０は、画像処理装置５０と一体化することも可能である。
【００１９】
上記の構成を備える微生物検出装置１によれば、検体を培養したシャーレ２を検体ストッカー１０に収容すると、このシャーレ２は搬送路２０ａ上に順次供給されて搬送される。そして、シャーレ２は、開閉アーム２２の作動により蓋体２ｂが開けられた後、撮像装置３０の直下である撮像エリアＡを通過する際に、照明装置４０により上下方向から照明された状態で、撮像装置３０により撮像される。撮像された画像データは、画像処理装置５０に送信され、検出対象となるコロニーの判別が行われる。画像処理装置５０における画像処理の詳細については、後述する。
【００２０】
撮像エリアＡを通過したシャーレ２は、開閉アーム２２の作動により蓋体２ｂが再び閉じられた後、回収ストッカー６０まで搬送され、画像処理装置５０による判別結果に基づき、第１収容部６２または第２収容部６４に振り分けられて、収容される。こうして、各検体の微生物の検出を連続的に行うことができる。
【００２１】
図３に示すように、培養されたコロニーｃは、培地ｍの表面からドーム状に膨出した形状を有するものが多い。このため、撮像エリアＡにおいては、表面側光源４２からの同軸落射照明光Ｌ１により、主としてコロニーの表面中心部で反射した光が直上の撮像装置３０に到達し、コロニーの表面外縁部で反射した光は側方に散乱する。撮像装置３０に到達する反射光の光量は、コロニーｃの立体形状によって変化し、平坦な形状であるほど多く、急峻であるほど少なくなることから、撮像装置３０で撮像する画像データは、コロニーの三次元形状の情報を含んだものとなる。
【００２２】
また、培地ｍやコロニーｃが透明度を有する場合には、表面側光源４２からの照明によりコロニーｃの下方に生じる影を検出するおそれがあるが、裏面側光源４４からの透過照明光Ｌ２により、撮像装置３０は、コロニーｃの影の影響を受けることなく撮像することができる。
【００２３】
このように、表面側光源４２および裏面側光源４４から培地ｍに対して照明光を同時に照射した状態で撮像することにより、検出対象となるコロニーの特徴をより顕在化させることができ、コロニーの判別を容易に行うことができる。
【００２４】
表面側光源４２および裏面側光源４４から照明光を同時に照射する場合には、これらの光量バランスも重要な要素となり得る。培地ｍの表面の照度で比較した場合、表面側光源４２の照明光（同軸落射照明）の照度Ｌａに対して、裏面側光源４４の照明光（透過照明）の照度Ｌｂが大きすぎると、コロニーｃの外縁部における色情報が失われやすい一方、裏面側光源４４の照明光（透過照明）の照度Ｌｂが小さすぎると、コロニーｃの中心部における色情報が失われやすくなる。後述する実施例に示すように、この照度比（Ｌａ／Ｌｂ）は、２．１×１０―５〜２．３×１０３であることが好ましく、２．７×１０―５〜１．４×１０３であることがより好ましく、０．９〜３．５であることが更に好ましい。
【００２５】
検出対象となるコロニーによっては、表面側光源４２または裏面側光源４４のいずれか一方のみの照明によっても類似のコロニーから判別することが可能であり、この場合の微生物検出装置は、表面側光源４２または裏面側光源４４のいずれかのみを備える構成であってもよい。また、表面側光源４２は、本実施形態においては、培地ｍに対して垂直方向に照明光を照射する同軸落射照明型の光源を使用しているが、シャーレ２に対して斜め上方から照射するリング照明型やライン照明型の光源を使用してもよく、これらは同軸落射照明型の光源と適宜交換するか、或いは、同軸落射照明型の光源と同時に併用することができる。
【００２６】
次に、画像処理装置５０において画像データに基づきコロニーを判別する処理手順を、図４に示すフローチャートを参照しながら説明する。
【００２７】
まず、作業者は、検査目的を明らかにするために、検査対象物を特定するための対象物情報を入力する（ステップＳ１）。対象物情報としては、培地名、ロット番号、有効期間などの培地情報や、試験方法、検体名、接種菌名、検体番号、培養条件、培養温度、培養時間などの検体情報などが挙げられる。これらの情報の一部は、予め画像処理装置５０に入力しておくことが可能であり、作業者が最小限の情報のみを入力するようにしてもよい。
【００２８】
こうして対象物情報の入力が行われると、画像処理装置５０は、この対象物情報に基づき、特定の微生物のコロニーを判別するための検査情報を設定する（ステップＳ２）。検査情報としては、撮像情報（例えば、同軸落射照明、透過照明、リング照明などからの１又は複数の選択、各照明光の照度、撮像装置３０の絞り値やシャッター速度）、変換する色空間（例えば、ＨＬＳ空間）、色要素値（例えば、ＨＬＳ値）の基準値、形状情報（例えば、コロニーの大きさ、真円度）などを挙げることができる。検査情報は、対象物情報に対応して画像処理装置５０に予め格納されており、作業者が入力した対象物情報に応じて自動的に設定されるが、作業者が検査情報の一部または全部を手動で入力、修正することも可能である。
【００２９】
この後、画像処理装置５０は、撮像装置３０から画像データが順次入力されると、検体番号などの識別情報と対応付けて、画像データをメモリに格納する（ステップＳ３）。そして、取り込まれた各画像データに対し、検査情報に基づき、コロニーの抽出、判別を行う。
【００３０】
まず、画像データに含まれる微生物のコロニーを、色要素値に基づき抽出する（ステップＳ４）。画像データを構成する各画素の色情報は、Ｒ，Ｇ，Ｂの色要素値で表現されており、画像処理装置５０は、画素毎にＲＧＢ値を取得して、これを所定の色空間の各軸を構成する色要素の値に変換する。色空間としては、ＨＬＳ色空間、ＹＣＣ色空間、ＨＳＶ空間、Ｌ*ａ*ｂ空間、ＣＭＹＫ色空間、ＲＧＢ色空間など公知の各種色空間とすることが可能であり、色要素の種類は、３種類だけでなく、２種類や４種類以上であってもよい。こうして、画像データ全体の各色要素値を色要素ごとに予め設定された基準値と比較し、全ての色要素値が基準値を満足する場合に、当該画素を検出対象のコロニー色として抽出することができる。色要素の基準値は、閾値として設定してもよく、或いは、所定の数値範囲で設定することが可能である。
【００３１】
本実施形態においては、色相（Hue）、彩度（Saturation）および輝度（Luminance）の３つの色要素から構成されるＨＬＳ色空間に基づき、それぞれの色要素値を、色要素ごとに予め設定された基準値と比較して、検出対象となるコロニーの判別を行う。ＨＬＳ色空間による画像データの表現は、人が色を知覚する方法に近いことから、コロニーの判別基準を技術者の判断基準により近づけることが可能であり、検出精度をより高めることができる。
【００３２】
検出対象のコロニー色と判別された画素群は、検出対象とするコロニー形状にほぼ一致する領域（コロニー領域）を占めることになり、画像データに複数のコロニーが存在する場合には、コロニー領域と判別された画素群を個別に抽出し、それぞれの位置を特定することができる。
【００３３】
次に、抽出されたコロニー領域の形状を、予め設定された形状情報と比較することにより、コロニー領域が真のコロニーであるか否かを判別する（ステップＳ５）。
【００３４】
形状情報は、検出対象となるコロニーの菌種や培養条件などに基づいて、コロニーの大きさ（直径）や真円度などが予め所定の数値範囲で設定されており、この数値範囲に合致するものを、真のコロニーと判定する。例えば、形状情報にコロニーの大きさ（直径）が含まれている場合には、微細なゴミなどが除去され、形状情報に真円度が含まれている場合には、遊走の有無の判別や、コロニーとは明らかに形状が異なるものの除去が行われる。形状情報としては、培地に対するコロニーの疎密度など他の情報を含んでいてもよい。コロニー領域と形状情報とを比較する工程は、より精度の高いコロニー判定を行うために有効であるが、本発明において必須のものではなく、この工程を省略して、抽出されたコロニー領域をそのままコロニーと判定することも可能である。
【００３５】
コロニーの形状情報は、コロニーの全体形状に必ずしも合致する必要はない。例えば、図５に示すように、１つのコロニーｃを、中心から外方に向けてコロニー中心部ｃ１、コロニー外縁部ｃ２およびコロニー周辺部ｃ３と同心円状に分割し、分割された領域の１又は複数を形状情報とすることができる。コロニーの特徴的な色情報は、通常はコロニー中心部ｃ１やコロニー外縁部ｃ２に現れるが、例えば血液寒天培地上のStreptococcus属のように、発育コロニー周辺の培地成分の性状/外観を変化させる菌の鑑別を行うような場合には、コロニー周辺部ｃ３を形状情報に含めることが有効である。このように、対象となるコロニーに応じた特徴的な色要素の基準値および形状情報を設定することにより、コロニーの判別を容易に行うことができる。
【００３６】
コロニーを分割した複数領域を形状情報とする場合、上記ステップＳ４におけるコロニー領域の抽出は、各分割領域に対応して設定された基準値に基づいてそれぞれ行われ、上記ステップＳ５においては、各分割領域を、それぞれが対応する形状情報と比較することにより、コロニーか否かの判別を行う。但し、上記のように、領域の分割は本発明において必須のものではない。
【００３７】
ついで、画像処理装置５０は、得られた判別結果を、画像データや対象物情報に関連付けてメモリに格納する（ステップＳ６）。画像データから検出対象のコロニーが抽出された場合には、当該コロニーの座標値も併せて格納することが可能であり、更には当該コロニーを画像データにマーキングし、モニタなどに出力したときに作業者が認識し易いようにすることもできる。
【００３８】
こうして画像データに対する一連の処理が終了した後、次の画像データが画像処理装置５０に送信されると、上記のステップＳ３からＳ６を繰り返し行い、撮像装置３０からの画像データの送信が終了すると、画像処理装置５０の作業が終了する（ステップＳ７）。
【００３９】
このように、本実施形態の微生物検出装置１によれば、培地を撮像した画像データから、複数の色要素値を基準値とそれぞれ比較してコロニーの判別を行うため、熟練者の目視判定に近い精度で機械判定を行うことができ、検出精度を高めることができる。
【００４０】
また、検出対象となるコロニーに応じて色空間、撮影情報、形状情報などを適宜選択することにより、類似のコロニーからの判別が容易になり、検出精度を更に高めることができる。例えば、後述する実施例に示すように、サルモネラ、シゲラ、腸管出血性大腸菌のような菌種のコロニーを類似のコロニーから精度良く判別することが可能であり、検便検査の処理能力を高めて省力化や人件費の低減を図ることができる。更に、検出対象がサルモネラ、シゲラ、腸管出血性大腸菌などから選択される複数の菌種のコロニーである場合には、各菌種に対応する基準値を使用することにより、選択された複数の菌種を同時に判別することが可能である。
【００４１】
以上、本発明の一実施形態について詳述したが、本発明の具体的な態様は上記実施形態に限定されない。例えば、本実施形態の微生物検出装置は、検体を連続的に処理可能な構成としているが、バッチ式の構成にすることも可能である。
【００４２】
また、微生物を培養する培地は、寒天などの固形状の培地の他に、半流動状の培地や液状の培地などであってもよい。培地は必ずしもシャーレや試験管などの容器に収容する必要はなく、例えばフィルターに培養液を含浸させたものを培地として使用することもできる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明の実施例に基づき、本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されるものではい。
【００４４】
［実施例１：色空間によるコロニー分離能］
腸管出血性大腸菌Ｏ１５７の検出用培地であるＣＴ−ＳＭＡＣＳＰ寒天培地（栄研化学製）を使用して、Ｏ１５７と、他の腸内グラム陰性桿菌であるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとを培養し、これを撮像して得られた画像データの各画素のＲＧＢ値をＨＬＳ値に変換した。撮像装置としては、カラーＣＣＤカメラを使用した。
【００４５】
図６（ａ）は、培地を収容するシャーレを白色板上に配置し、上方から撮像する撮像装置と光軸が一致するように同軸落射照明を行った場合において、Ｏ１５７およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニーのＨＬＳ値を、ＨＬＳ色空間にプロットした結果を示している。各コロニーは作業者が目視で判別し、Ｏ１５７を菱形、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを十字で表している。同軸落射照明光の照度は、白色板の表面（シャーレの載置面）付近において、約４０００（lux）となるように設定した。
【００４６】
図６（ａ）に示すように、Ｏ１５７のコロニーは、ＨＬＳ空間において互いに近接する位置に配置されており、破線で示す２つの直方体状の空間Ｓａ，Ｓｂのいずれかに収まっている（実際には、空間ＳａおよびＳｂは、Ｈ値０°を介して一体の空間を構成している）。したがって、コロニーのＨＬＳ値とそれぞれ比較する基準値を、これら直方体状の空間Ｓａ，Ｓｂを構成するように数値範囲の設定を行うことで、Ｏ１５７のコロニーをＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニーから分離して判別することができる。
【００４７】
図６（ｂ）は、照射条件を変える他は、図６（ａ）の場合と同様の条件で試験を行ったプロット結果を示すものである。照射条件は、培地を収容するシャーレを透明板上に配置し、上方から撮像する撮像装置と光軸が一致するように同軸落射照明を行うと共に、シャーレの直下位置において透明板の下方から透過照明を行った（図３参照）。同軸落射照明光および透過照明の照度は、透明板の表面（シャーレの載置面）付近において、それぞれ２０００（lux）、１０００（lux）とした。
【００４８】
図６（ｂ）に示すように、Ｏ１５７のコロニーは、図６（ａ）の結果と比較して、より小さな直方体状の空間Ｓｃ内に収まっており、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニー群からの距離も遠くなっていることから、判別をより容易に行うことができる。
【００４９】
次に、サルモネラ、シゲラの検出用培地である５Ｓ＋Ａ寒天培地（栄研化学製）を使用して、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓと、他の腸内グラム陰性桿菌であるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ＴｙｐｈｉおよびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとを培養し、これを撮像して得られた画像データの各画素のＲＧＢ値をＨＬＳ値に変換した。
【００５０】
図７（ａ）および（ｂ）は、照射条件をそれぞれ図６（ａ）および（ｂ）に対応させたものであり、図７（ａ）が同軸落射照明のみ、図７（ｂ）が同軸落射照明＋透過照明の場合のＨＬＳ色空間におけるプロット結果を示している。各コロニーは作業者が目視で判別し、Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを菱形、Ｓ．Ｔｙｐｈｉを十字、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを正方形で表している。図７（ａ）および（ｂ）から明らかなように、Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよびＳ．Ｔｙｐｈｉは、他の菌から分離して判別可能である。
【００５１】
図８（ａ）および（ｂ）は、照射条件を同軸落射＋透過照明で撮像したものであり、それぞれ図８（ａ）はＯ１５７およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニーをＲＧＢ色空間でプロットしたものであり、図８（ｂ）はＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．Ｔｙｐｈｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニーをＲＧＢ色空間でプロットしたものである。図８（ａ）および（ｂ）は、それぞれ図６（ｂ）および図７（ｂ）に対応しており、図８（ａ）および（ｂ）に示すＲＧＢ色空間をＨＬＳ色空間に変換したものが、図６（ｂ）および図７（ｂ）である。
【００５２】
図８（ａ）および（ｂ）に示すように、本実施例においては、ＨＬＳ色空間に変換する前のＲＧＢ色空間においても、それぞれＯ１５７およびＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．Ｔｙｐｈｉのコロニーを判別可能である。
【００５３】
［実施例２：照度比とコロニー分離能］
図７（ｂ）のプロット結果に対応する試験条件において、同軸落射照明光の照度Ｌａと、透過照明光の照度Ｌｂとの照度比（Ｌａ／Ｌｂ）をパラメータとして、ＨＬＳ色空間における各コロニーのプロット分布がどのように変化するかを調べた。この結果を、図９（ａ），（ｂ）、図１０（ａ），（ｂ）、図１１（ａ），（ｂ）および図１２（ａ），（ｂ）に示す。
【００５４】
図９（ａ），（ｂ）および図１０（ａ），（ｂ）の照度条件は、透過照明光の照度Ｌｂを１１６０（lux）で一定とした上で、同軸落射照明光の照度Ｌａを、それぞれ８１０、１０２０、４０７０、４２９０（lux）としている。図９（ａ）のプロット結果は、図９（ｂ）と比較した場合に、Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓとＳ．Ｔｙｐｈｉのそれぞれのプロット群が非常に近接している一方、図１０（ｂ）のプロット結果は、図１０（ａ）と比較した場合に、Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓとＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのそれぞれそれぞれのプロット群が非常に近接していることから、Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよびＳ.Ｔｙｐｈｉの判別はいずれも困難になる傾向にある。
【００５５】
このような現象は、同軸落射照明光の照度Ｌａおよび透過照明光の照度Ｌｂの絶対値よりも、両者のバランス、すなわち照度比（Ｌａ／Ｌｂ）の影響が大きいと考えられることから、照度比（Ｌａ／Ｌｂ）を、図９（ｂ）および図１０（ａ）の場合の照度比の範囲に設定することが好ましい。より具体的に算出すると、照度比（Ｌａ／Ｌｂ）を、約０．９〜３．５の範囲に設定することが好ましい。
【００５６】
ここで、同軸落射照明光の照度Ｌａおよび透過照明光の照度Ｌｂは、いずれもシャーレの載置面付近で測定した結果であり、照度計は、3423 LUX HiTESTER (HIOKI)を使用した。
【００５７】
上記の好ましい照度比は、２種類以上で、特に３種類のコロニーを分類する場合に適しているが、２種類のみのコロニーを分類する場合には、好ましい照度比の範囲をより拡げることが可能である。
【００５８】
図１１（ａ），（ｂ）は、Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓとＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニーについて、照度比（Ｌａ／Ｌｂ）をそれぞれ２．１×１０―５および２．３×１０３としたときのプロット結果である。図１１（ａ）は、同軸落射La=0.3(lux)、透過Lb=14285(lux)の場合であり、図１１（ｂ）は、同軸落射La=22100(lux)、透過Lb=9.6(lux)の場合である。Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを菱形、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを十字で表している。この結果から、上記照度比の範囲では、Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓとＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとの分離が可能であることがわかる。
【００５９】
図１２（ａ），（ｂ）は、Ｓ.ＴｙｐｈｉとＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニーについて、照度比（Ｌａ／Ｌｂ）をそれぞれ２．７×１０−５および１．４×１０３としたときのプロット結果である。図１２（ａ）は、同軸落射La=0.3(lux) 、透過Lb=11130(lux)の場合であり、図１２（ｂ）は、同軸落射La=13490(lux)、透過Lb=9.6(lux)の場合である。Ｓ.Ｔｙｐｈｉを菱形、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを十字で表している。この結果から、上記照度比の範囲では、Ｓ.ＴｙｐｈｉとＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとの分離が可能であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の一実施形態に係る微生物検出装置の概略構成図である。
【図２】図１に示す微生物検出装置の要部拡大図である。
【図３】培地への照明を模式的に示す図である。
【図４】画像データに基づきコロニーを判別する処理手順を説明するためのフローチャートである。
【図５】コロニーの特徴領域の一例を説明するための図である。
【図６】本発明の実施例による試験結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例による試験結果を示す図である。
【図８】本発明の実施例による試験結果を示す図である。
【図９】本発明の実施例による試験結果を示す図である。
【図１０】本発明の実施例による試験結果を示す図である。
【図１１】本発明の実施例による試験結果を示す図である。
【図１２】本発明の実施例による試験結果を示す図である。
【符号の説明】
【００６１】
１ 微生物検出装置
２ シャーレ
１０ 検体ストッカー
２０ 搬送コンベア
３０ 撮像装置
４０ 照明装置
４２ 表面側光源
４４ 裏面側光源
５０ 画像処理装置
６０ 回収ストッカー
７０ 制御装置
ｍ 培地
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養された微生物を検出する方法であって、
微生物を培養した培地を撮像して画像データを取得する撮像ステップと、
前記画像データから検出対象となる微生物のコロニーを抽出して判別するコロニー判別ステップとを備え、
前記コロニー判別ステップは、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニーの判別を行う微生物の検出方法。
【請求項２】
前記コロニー判別ステップは、前記画像データの画素毎に、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニー領域を抽出するステップと、
抽出された前記コロニー領域の形状を、予め設定された形状情報と比較することにより、前記コロニー領域が判別対象のコロニーのものか否かを判定するステップとを備える請求項１に記載の微生物の検出方法。
【請求項３】
前記形状情報は、少なくともコロニー領域の大きさおよび真円度に関する情報を含む請求項２に記載の微生物の検出方法。
【請求項４】
前記形状情報は、コロニー中心部を画定する情報およびコロニー外縁部を画定する情報の一方または双方を含む請求項２または３に記載の微生物の検出方法。
【請求項５】
前記形状情報は、前記コロニー外縁部の外側に位置するコロニー周辺部を画定する情報を更に含む請求項４に記載の微生物の検出方法。
【請求項６】
前記色空間は、ＨＬＳ色空間である請求項１から５のいずれかに記載の微生物の検出方法。
【請求項７】
前記色空間は、ＲＧＢ色空間である請求項１から５のいずれかに記載の微生物の検出方法。
【請求項８】
前記撮像ステップは、培地の表面側および裏面側にそれぞれ設置された表面側光源および裏面側光源から、培地に対して照明光を同時に照射した状態で撮像する請求項１から７のいずれかに記載の微生物の検出方法。
【請求項９】
前記表面側光源からの照明は、撮像軸と同軸の落射照明である請求項８に記載の微生物の検出方法。
【請求項１０】
前記表面側光源から培地に照射される照明光の照度Ｌａと、前記裏面側光源から培地に照射される照明光の照度Ｌｂとの照度比Ｌａ／Ｌｂが、２．１×１０―５〜２．３×１０３である請求項８または９に記載の微生物の検出方法。
【請求項１１】
判別対象となるコロニーは、腸管出血性大腸菌、サルモネラおよびシゲラのいずれかを含む請求項１から１０のいずれかに記載の微生物の検出方法。
【請求項１２】
判別対象となるコロニーは、腸管出血性大腸菌、サルモネラおよびシゲラから選択された複数の菌種を含み、
前記コロニー判別ステップは、選択された複数の菌種を同時に判別する請求項１から１０のいずれかに記載の微生物の検出方法。
【請求項１３】
培養された微生物を検出する装置であって、
微生物を培養した培地を撮像して画像データを取得する撮像装置と、
前記画像データから検出対象となる微生物のコロニーを抽出して判別する画像処理装置とを備え、
前記画像処理装置は、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニーの判別を行う微生物の検出装置。
【請求項１４】
前記画像処理装置は、前記画像データの画素毎に、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較してコロニー領域を抽出し、抽出された前記コロニー領域の形状を、予め設定された形状情報と比較することにより、前記コロニー領域が判別対象のコロニーのものか否かを判定する請求項１３に記載の微生物の検出装置。
【請求項１５】
微生物を培養した培地を撮像して取得した画像データから、対象となる微生物のコロニーを抽出して判別する画像処理ステップをコンピュータに実行させるためのプログラムであって、
前記画像処理ステップは、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニーの判別を行うステップを含む微生物の検出プログラム。
【請求項１６】
前記画像処理ステップは、前記画像データの画素毎に、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニー領域を抽出するステップと、
抽出された前記コロニー領域の形状を、予め設定された形状情報と比較することにより、前記コロニー領域が判別対象のコロニーのものか否かを判定するステップとを備える請求項１５に記載の微生物の検出プログラム。
【請求項１】
培養された微生物を検出する方法であって、
微生物を培養した培地を撮像して画像データを取得する撮像ステップと、
前記画像データから検出対象となる微生物のコロニーを抽出して判別するコロニー判別ステップとを備え、
前記コロニー判別ステップは、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニーの判別を行う微生物の検出方法。
【請求項２】
前記コロニー判別ステップは、前記画像データの画素毎に、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニー領域を抽出するステップと、
抽出された前記コロニー領域の形状を、予め設定された形状情報と比較することにより、前記コロニー領域が判別対象のコロニーのものか否かを判定するステップとを備える請求項１に記載の微生物の検出方法。
【請求項３】
前記形状情報は、少なくともコロニー領域の大きさおよび真円度に関する情報を含む請求項２に記載の微生物の検出方法。
【請求項４】
前記形状情報は、コロニー中心部を画定する情報およびコロニー外縁部を画定する情報の一方または双方を含む請求項２または３に記載の微生物の検出方法。
【請求項５】
前記形状情報は、前記コロニー外縁部の外側に位置するコロニー周辺部を画定する情報を更に含む請求項４に記載の微生物の検出方法。
【請求項６】
前記色空間は、ＨＬＳ色空間である請求項１から５のいずれかに記載の微生物の検出方法。
【請求項７】
前記色空間は、ＲＧＢ色空間である請求項１から５のいずれかに記載の微生物の検出方法。
【請求項８】
前記撮像ステップは、培地の表面側および裏面側にそれぞれ設置された表面側光源および裏面側光源から、培地に対して照明光を同時に照射した状態で撮像する請求項１から７のいずれかに記載の微生物の検出方法。
【請求項９】
前記表面側光源からの照明は、撮像軸と同軸の落射照明である請求項８に記載の微生物の検出方法。
【請求項１０】
前記表面側光源から培地に照射される照明光の照度Ｌａと、前記裏面側光源から培地に照射される照明光の照度Ｌｂとの照度比Ｌａ／Ｌｂが、２．１×１０―５〜２．３×１０３である請求項８または９に記載の微生物の検出方法。
【請求項１１】
判別対象となるコロニーは、腸管出血性大腸菌、サルモネラおよびシゲラのいずれかを含む請求項１から１０のいずれかに記載の微生物の検出方法。
【請求項１２】
判別対象となるコロニーは、腸管出血性大腸菌、サルモネラおよびシゲラから選択された複数の菌種を含み、
前記コロニー判別ステップは、選択された複数の菌種を同時に判別する請求項１から１０のいずれかに記載の微生物の検出方法。
【請求項１３】
培養された微生物を検出する装置であって、
微生物を培養した培地を撮像して画像データを取得する撮像装置と、
前記画像データから検出対象となる微生物のコロニーを抽出して判別する画像処理装置とを備え、
前記画像処理装置は、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニーの判別を行う微生物の検出装置。
【請求項１４】
前記画像処理装置は、前記画像データの画素毎に、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較してコロニー領域を抽出し、抽出された前記コロニー領域の形状を、予め設定された形状情報と比較することにより、前記コロニー領域が判別対象のコロニーのものか否かを判定する請求項１３に記載の微生物の検出装置。
【請求項１５】
微生物を培養した培地を撮像して取得した画像データから、対象となる微生物のコロニーを抽出して判別する画像処理ステップをコンピュータに実行させるためのプログラムであって、
前記画像処理ステップは、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニーの判別を行うステップを含む微生物の検出プログラム。
【請求項１６】
前記画像処理ステップは、前記画像データの画素毎に、所定の色空間の各軸を構成する色要素の値を、色要素毎に予め設定された基準値とそれぞれ比較して、コロニー領域を抽出するステップと、
抽出された前記コロニー領域の形状を、予め設定された形状情報と比較することにより、前記コロニー領域が判別対象のコロニーのものか否かを判定するステップとを備える請求項１５に記載の微生物の検出プログラム。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−１０４３０１（Ｐ２０１０−１０４３０１Ａ）
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８０１８７（Ｐ２００８−２８０１８７）
【出願日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【出願人】（５９７１４３９６０）テクノシステム株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【出願人】（５９７１４３９６０）テクノシステム株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
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