悪性脳腫瘍マーカー遺伝子およびその用途
【課題】悪性脳腫瘍の指標となるマーカー遺伝子およびその用途を提供する。
【解決手段】提示した特定の塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子、特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有することを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質、これらの発現を指標とする悪性脳腫瘍の診断方法、これらの発現を抑制する物質のスクリーニング方法、及びこれらを利用する悪性脳腫瘍の診断キット。
【解決手段】提示した特定の塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子、特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有することを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質、これらの発現を指標とする悪性脳腫瘍の診断方法、これらの発現を抑制する物質のスクリーニング方法、及びこれらを利用する悪性脳腫瘍の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性脳腫瘍の指標となるマーカー遺伝子およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞は自己の遺伝子異常により厳密なプログラムが破綻し、秩序を失って増殖するものであり、本来これらの細胞の分子生物学的特性に基づいて治療法が選択されるのが理想である。腫瘍細胞の病理学的な特徴が同じでも、その進展形態、治療に関する感受性、予後などが大きく異なることは、日常臨床の場でしばしば遭遇する大きな問題点である。一方、腫瘍細胞の遺伝子異常は複数の遺伝子の異常が関与していることは言うまでもなく、それぞれの腫瘍細胞の分子生物学的特長を把握するには、多くの遺伝子の変化を同時に観察することが不可欠である。マイクロアレイ法は腫瘍細胞の転写レベルでの変化を同時にかつ大量にとらえるアプローチであり、腫瘍細胞の個性診断、治療に対する感受性、薬剤に対する耐性、副作用予測、新規標的分子同定などに応用可能と考えられる。これまで、さまざまなヒト癌種において、治療の選択を行うのに有用な分子マーカーを得るため、マイクロアレイを用いた分子発現プロファイルが用いられてきた。マイクロアレイ技術を用いて遺伝子発現プロファイルを調べることにより、多くの遺伝子が腫瘍の組織学的な型およびグレードにおいて、異なって発現されていることが確認されている。
【０００３】
各癌種に対しては、このような包括的遺伝子発現情報をもとにした治療標的遺伝子、マーカー遺伝子の選択は試みられているが、脳腫瘍に関して類似するような研究はまだ少ない（非特許文献１〜５）。
【非特許文献１】Freije WA, Castro-Vargas FE, Fang Z, Horvath S, Cloughesy T, Liau LM, Mischel PS, Nelson SF. Cancer Res. 2004 Sep 15;64(18):6503-10.
【非特許文献２】Rickman DS, Bobek MP, Misek DE, Kuick R, Blaivas M, Kurnit DM, Taylor J, Hanash SM. Cancer Res. 2001 Sep 15;61(18):6885-91.
【非特許文献３】Sallinen SL, Sallinen PK, Haapasalo HK, Helin HJ, Helen PT, Schraml P, Kallioniemi OP, Kononen J. Cancer Res. 2000 Dec 1;60(23):6617-22.
【非特許文献４】Kim S, Dougherty ER, Shmulevich I, Hess KR, Hamilton SR, Trent JM, Fuller GN, Zhang W. Mol Cancer Ther. 2002 Nov;1(13):1229-36.
【非特許文献５】van den Boom J, Wolter M, Kuick R, Misek DE, Youkilis AS, Wechsler DS, Sommer C, Reifenberger G, Hanash SM. Am J Pathol. 2003 Sep;163(3):1033-43.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
治療法の未だに確立されていない悪性脳腫瘍に対する、新たなる分子標的の探索は体系的遺伝子発現情報解析であるマイクロアレイ法により発展するものと期待される。また、この成果は悪性脳腫瘍に対する新たな治療法、診断学の開発に応用されることが期待される。本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、新たな治療法、診断学の開発のために悪性脳腫瘍の指標となるマーカー遺伝子およびその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、良性神経膠腫と悪性神経膠腫の遺伝子プロファイルを比較することにより、悪性神経膠腫のみに高発現する以下の表１に示す１７の脳腫瘍遺伝子を同定して、本発明を完成するに至った。
【０００６】
【表１】
本発明は、以下の通りである。
【０００７】
本発明の請求項１は、配列番号１〜１７のいずれか１記載の塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子である。
【０００８】
本発明の請求項２は、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブである。
【０００９】
本発明の請求項３は、請求項1記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続した脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーである。
【００１０】
本発明の請求項４は、請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも１を固定化させたことを特徴とするＤＮＡチップである。
【００１１】
本発明の請求項５は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断方法である：（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドにおける、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
【００１２】
本発明の請求項６は、下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法である：（ａ）被験物質と、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量と比較する工程、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００１３】
本発明の請求項７は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断キットである。：（ａ）請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも１、（ｂ）請求項３記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーの少なくとも１、（ｃ）請求項４記載のＤＮＡチップ。
【００１４】
本発明の請求項８は、配列番号１８〜３４のいずれか１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有することを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質である。
【００１５】
本発明の請求項９は、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質のいずれか１を特異的に認識することを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体である。
【００１６】
本発明の請求項１０は、請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体から選択された少なくとも１の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を固定化させたことを特徴とするプロテインチップである。
【００１７】
本発明の請求項１１は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断方法である：（ａ）被験者の生体試料から調製されるタンパク質における、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
【００１８】
本発明の請求項１２は、下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現を抑制する物質のスクリーニング方法である：（ａ）被験物質と、請請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカータンパク質の発現量と比較する工程、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００１９】
本発明の請求項１３は、以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断キットである：（ａ）請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも１、（ｂ）請求項１０記載のプロテインチップ。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、悪性脳腫瘍に対する腫瘍マーカーとなる脳腫瘍マーカー遺伝子が提供される。また、この脳腫瘍マーカー遺伝子に関わる各種の分子生物学的材料が提供され、これらを使用することによって、腫瘍マーカーとしての診断応用の他に、新規抗癌剤など創薬への応用が可能となる。脳腫瘍マーカー遺伝子に対する検出用プローブ等を作製することにより、脳腫瘍マーカー遺伝子を検出し、脳腫瘍の診断を広範囲にかつ確実に行うことができる。また、脳腫瘍を抑制する物質のスクリーニングを行い、新規抗癌剤の開発を進展させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の「脳腫瘍」は、頭蓋内に発生するすべての腫瘍をいう。このような脳腫瘍の中でも、発生頻度の高い代表的なものが神経膠腫であり、これはさらに、星細胞腫、神経膠芽腫等を含む。脳腫瘍には、この他、下垂体腺腫、神経鞘腫などがある。
【００２２】
本発明における「遺伝子」は、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えば、クローニング、化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡであっても、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖であってもよい。
【００２３】
本明細書における「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよび合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
【００２４】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００２５】
本発明者らは、良性神経膠腫と悪性神経膠腫の遺伝子プロファイルを比較することにより、悪性神経膠腫のみに高発現する上記の表１に示す１７の脳腫瘍マーカー遺伝子を同定した。
【００２６】
本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子とは、良性脳腫瘍若しくは正常脳組織ではほとんど又は全く発現せず、悪性脳腫瘍のみに高発現する遺伝子を言う。本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子は、配列番号１〜１７のいずれか１記載の塩基配列を有することを特徴とする。また、ＮＣＢＩの遺伝子データーベースにおいて、表１のＧｅｎｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒによりアプローチすることができる。本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子は、公知の遺伝子操作の手法により、取得することができる。
【００２７】
本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有することを特徴とするである。これらの脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、脳腫瘍マーカー遺伝子の塩基配列の全体又は部分配列を選択することによって、公知の方法を用いて適宜作製することができる。選択される部分配列はどの部分であってもよいが、脳腫瘍マーカー遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であることを特徴とする。また、脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、放射標識、蛍光標識等で標識してもよい。上記脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、選択された部分配列に基づいて、その配列に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡとすることができる。例えば、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子の塩基配列から適宜の長さのＤＮＡプローブを作成し、適宜蛍光標識等の標識を付与しておき、これを被検体とハイブリダイズすることにより、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現の多寡を検出し、脳腫瘍の検出を行う。
【００２８】
なお、上記脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの作製に際して、本発明の塩基配列において、「脳腫瘍マーカー遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。
【００２９】
本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーは、請求項1記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続した脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーである。脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーを用いることにより、ＰＣＲ等の公知の方法に基づいて目的の脳腫瘍マーカー遺伝子を増幅できる。プライマーは、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子の塩基配列（配列番号１〜１７）に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いる等、常法により容易に設計し、増幅することができる。また、プライマーは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、また、ビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。
【００３０】
本発明のＤＮＡチップは、請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも１を固定化させたことを特徴とする。ＤＮＡチップの作製方法は、当業者には公知である。ＤＮＡチップを用いることにより、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現レベルを検出、測定することができる。
【００３１】
本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする：（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドにおける、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
【００３２】
本発明の悪性脳腫瘍の診断方法において、「被験者」は、例えばＭＲＩ検査等によって脳腫瘍の疑いがあると診察されて患者であり、その「生体試料」とは患者脳からの切除組織あるいは血液等である。評価対象の生体試料は、マーカー遺伝子を含む任意の試料であり得る。患者脳からの切除組織あるいは血液等から常法に従って、生体試料からＲＮＡを調製することができる。また、患者脳からの切除組織あるいは血液等から常法に従って、該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを調製することができる。例えば、被験者の細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅する。その際に、標識ｄＮＴＰを取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることができる。
【００３３】
本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、前記生体試料における本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれかの発現レベルを検出し、測定することによって実施される。健常者の生体試料における請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を基準とし、被験者の生体試料における請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量が前記基準より高いと悪性脳腫瘍とする。具体的には、本発明の検出方法は、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法により前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する。このとき、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブや脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーを適宜用いることができる。また、本発明のＤＮＡチップを用いてもよい。
【００３４】
本発明の請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、本発明の請求項６は、下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする：（ａ）被験物質と、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量と比較する工程、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００３５】
本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を低下させる物質を探索することによって、悪性脳腫瘍を抑制する候補物質を提供するものである。
【００３６】
本発明のスクリーニングに用いられる細胞としては、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子を発現する培養細胞全般を挙げることができる。培養細胞においてこれら脳腫瘍マーカー遺伝子が発現しているか否かは、公知のウェスタンブロット法などにて検出することにより、容易に確認することができる。培養細胞としては、具体的には、例えば癌患者より単離、調製した生体組織や血球由来の細胞、または本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれかを導入した細胞等を挙げることができる。
【００３７】
また、本発明のスクリーニング方法に際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つ本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子を発現できる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択するのが好ましい。
【００３８】
脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１を発現している細胞からＲＮＡを調製して、脳腫瘍マーカー遺伝子を測定する。また、該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを調製して、脳腫瘍マーカー遺伝子を測定してもよい。具体的には、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法により前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する。このとき、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブや脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーを適宜用いることができる。また、本発明のＤＮＡチップを用いてもよい。
【００３９】
本発明の悪性脳腫瘍の診断キットは、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする：（ａ）請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも１、（ｂ）請求項３記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーの少なくとも１、（ｃ）請求項４記載のＤＮＡチップ。悪性脳腫瘍の診断キットを構成する（ａ）〜（ｃ）を上記のように用いることにより、悪性脳腫瘍の診断が可能となる。
【００４０】
本発明の脳腫瘍マーカータンパク質とは、良性脳腫瘍若しくは正常脳組織ではほとんど又は全く発現せず、悪性脳腫瘍のみに高発現するタンパク質を言う。本発明の脳腫瘍マーカータンパク質は、配列番号１８〜３４のいずれか１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有することを特徴とする。また、ＮＣＢＩの遺伝子データーベースにおいて、表１のＧｅｎｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒによりアプローチすることができる。
【００４１】
本発明の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体は、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質のいずれか１を特異的に認識することを特徴とする。本発明の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体は前記脳腫瘍マーカータンパク質に特異的に結合する性質を有することから、前記脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現した上記脳腫瘍マーカータンパク質を特異的に検出することができる。
【００４２】
抗体の製造方法は公知であり、本発明の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体も常法に従って製造することができる。具体的には、本発明の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した本発明の脳腫瘍マーカータンパク質を用いて、あるいは常法に従ってこれら本発明の脳腫瘍マーカータンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した本発明の脳腫瘍マーカータンパク質またはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる。該抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。
【００４３】
脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の作製に免疫抗原として使用される脳腫瘍マーカータンパク質は、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号１〜１７）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法に準じて行うことができる。
【００４４】
本発明のプロテインチップは、請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも１つ以上を固定化させたことを特徴とする。プロテインチップの作製方法は、当業者には公知である。
【００４５】
本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする：（ａ）被験者の生体試料から調整されるタンパク質における、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
【００４６】
本発明の悪性脳腫瘍の診断方法において、「被験者」は、例えばＭＲＩ検査等によって脳腫瘍の疑いがあると診察されて患者であり、その「生体試料」とは患者脳からの切除組織あるいは血液等である。患者脳からの切除組織あるいは血液等から常法に従って、生体試料からタンパク質を調製することができる。
【００４７】
本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、前記生体試料における脳腫瘍マーカータンパク質のいずれかの発現レベルを検出し、測定することによって実施される。健常者の生体試料における請求項１記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を基準とし、被験者の生体試料における請求項１記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量が前記基準より高いと悪性脳腫瘍とする。具体的には、公知の方法に基づいて、患者の組織の一部を採取し、そこから常法に従ってタンパク質を調製する。その後、例えば、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法など公知の検出方法に基づいて、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を検出することができる。このとき、上記脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を適宜用いることができる。また、上記プロテインチップを用いることにより、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を検出してもよい。
【００４８】
本発明の請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする：（ａ）被験物質と、請請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカータンパク質の発現量と比較する工程、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００４９】
本発明の脳腫瘍マーカータンパク質の発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を低下させる物質を探索することによって、悪性脳腫瘍を抑制する候補物質を提供するものである。
【００５０】
本発明のスクリーニングに用いられる細胞としては、請請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質を発現する培養細胞全般を挙げることができる。培養細胞においてこれら脳腫瘍マーカータンパク質が発現しているか否かは、公知のウェスタンブロット法などにて検出することにより、容易に確認することができる。培養細胞としては、具体的には、例えば癌患者より単離、調製した生体組織や血球由来の細胞、または本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれかを導入した細胞等を挙げることができる。
【００５１】
また、本発明のスクリーニング方法に際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つ本発明の脳腫瘍マーカータンパク質を発現できる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択するのが好ましい。
【００５２】
脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１を発現している細胞からタンパク質を調製して、脳腫瘍マーカー遺伝子を測定する。具体的には、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、タンパク質マイクロアレイ解析法などの公知の方法により前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する。このとき、上記脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を適宜用いることができる。また、上記プロテインチップを用いることにより、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を検出してもよい。
【００５３】
本発明の悪性脳腫瘍の診断キットは、以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする：（ａ）請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも１、（ｂ）請求項１０記載のプロテインチップ。悪性脳腫瘍の診断キットを構成する（ａ）〜（ｂ）を上記のように用いることにより、悪性脳腫瘍の診断が可能となる。
【００５４】
以下、具体的な実施例について説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
１． 対象症例
新潟大学脳研究所脳神経外科にて手術摘出された神経膠腫５２例 （ＷＨＯ ｇｒａｄｅＩＩ：１６例、ＩＩＩ：１４例、ＩＶ：２２例）を対象とした。高悪性度のものは術後、放射線治療（腫瘍局所４０Ｇｙ、全脳照射２０Ｇｙ）ならびにニトロソウレアを中心とした化学療法を施行した。生存期間は診断確定日より患者の死亡日、もしくは最終受診日とした。組織診断はＷＨＯ脳腫瘍組織分類に基づいて行った。なお、本明細書に記載の実験は、新潟大学倫理委員会の規定に則り、全ての対象患者からインフォームドコンセントを得ている。
【００５６】
２． ＲＮＡの抽出
凍結組織片はＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）中でポリトロンにより破砕された（最高速度で５秒間×２回）。クロロホルムを添加後、１５，０００×ｇで１０分間遠心し、ＲＮＡを含んだ水層を採取した。イソプロピルアルコールを用いトータルＲＮＡを沈殿させ、７０％エタノールで１度洗浄し、それをＤＥＰＣ処理Ｈ2Ｏに溶解した。トータルＲＮＡは１．５ユニットのＤNａｓｅ Ｉで処理し、再度、クロロホルム抽出を行った後に、エタノール沈殿し、ＤＥＰＣ処理Ｈ2Ｏに懸濁した。その後、Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使い、低分子の核酸を除去した。トータルＲＮＡの質はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）にてｒＲＮＡ ｒａｔｉｏ［２８ｓ／１８ｓ］を計測した。精製したトータルＲＮＡは７０％エタノール中で−８０℃に使用まで保存した。また、ヒト正常脳、副腎、骨髄、大腸、胎児肝、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、前立腺、だ液線、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、睾丸、胸腺、気管、甲状腺、子宮組織の各ｍＲＮＡはｃｌｏｎｔｅｃｈ社のものを使用した。
３． Ｃｙ３−、Ｃｙ５−標識化ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成はａｇｉｌｅｎｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｉｒｅｃｔ ｌａｂｅｌ ｋｉｔを用いて行った。１０μｇの精製したトータルＲＮＡとＴ７プロモーター配列を有するオリゴｄＴプライマーを用いて、１．２５μの１ｍＭのＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ ｄＣＴＰ（Ｃｙ3−ｄＣＴＰ又はＣｙ５−ｄＣＴＰ）、２００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素で４２℃１時間反応させ、第一鎖ｃＤＮＡを合成した後に第二鎖ｃＤＮＡを合成し、フェノール／クロロホルムで抽出し、Ｐｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌにて精製した。尚、腫瘍のＲＮＡはＣｙ５、正常脳組織のＲＮＡはＣｙ３を用いて標識した。得られたｃDＮＡはエタノール沈殿により回収し、使用まで７０％エタノール中で−８０℃で保存した。
４． ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ解析
脳腫瘍患者の原発癌の遺伝子発現はａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイを用いて試験した。ハイブリダイゼーションは、２×デポジションコントロールバッファー １２．５μｌ、Ｃｏｔ−１ＤＮＡ ２．５μｌ、ヌクレアーゼフリーの水 ７．５μｌ、ｃＤＮＡ ２．５μｌを含む２５μｌの溶液中で６５℃、１７時間行った。チップを０．5％ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄後、各ピクセルの蛍光強度はＨＰ社製レーザースキャナーにて測定し、画像化、さらに各遺伝子の正常脳組織に対する腫瘍組織での発現比に関して数値化を行った。この実験により、ヒト脳腫瘍患者の約１２７２９遺伝子の発現を測定した。
５． 統計解析
悪性神経膠腫と良性神経膠腫において異なる（発現をする）遺伝子群を同定するため、ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ解析を行った。遺伝子毎に１６検体の良性神経膠腫のａｖｅｒａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅの平均を求め、求めた平均の値と各々３６検体の悪性神経膠腫のａｖｅｒａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅを比較し、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−検定でｐ＜０．０１を示した遺伝子を選び出した。さらに、ヒト正常副腎、骨髄、大腸、胎児肝、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、前立腺、だ液線、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、睾丸、胸腺、気管、甲状腺、子宮組織でいずれも１．５以下の発現比の遺伝子を選択した。その結果、表１に示すように、Human mRNA for stac, complete cds、pituitary tumor-transforming 1(PTTG1)、RAS guanyl releasing protein 2 (calcium and DAG-regulated)、KIAA0561 protein (microtubule associated serine/threonine kinase 3)、KIAA0537 gene product ( AMP-activated protein kinase family member 5)、EphB6、EphA4、EphA5、kinesin family member 1C (KIF1C)、kinesin 2 (60-70kD)、kinesin family member 3C (KIF3C)、KIAA0449 protein (kinesin family member 21B)、serologically defined colon cancer antigen 31、sperm associated antigen 7、spermine synthase、Human mRNA for endosialin protein、Human ERGIC-53 mRNAの１7個の遺伝子を選び出した。
６． 免疫組織解析
対象症例について検討を行った。５ミクロン切片を作成し、脱パラフィン化の後に１０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ ６．０）中にて１２１℃、１０分間加温した。０．３％Ｈ2Ｏ2にて内因性ペルオキシダーゼ活性の阻害を行った。１０％ヤギ又はウサギ血清にてブロッキング後、各抗体（ＫＩＦ１Ｃヤギポリクローナル抗体、１：２０希釈；ＫＩＦ３Ｃヤギポリクローナル抗体、１：２０希釈；ＰＴＴＧヤギポリクロール抗体、１：２０希釈；ＥｐｈＡ４ ウサギポリクローナル抗体、１：２０希釈；ＥｐｈＢ６ヤギポリクローナル抗体、１：２０希釈）（いずれもＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）と４℃１２時間反応させた。洗浄後のＡｖｉｄｉｎｅ−ｂｉｏｔｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｅｃｔａｓｉｎ ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ， Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）を反応させ、０．０１％ ３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｓｉｇｍａ）とＰＢＳ０．１％過酸化水素にて発色させた。
【００５７】
図１に示すようにこれらの遺伝子産物は症例によって様々な程度に染色された。任意の３視野での各タンパクの発現強度を０−３、および発現面積を０、０．２５、０．５、０．７５、１．０と表示し、それらの積の平均値を求め発現レベルとした（図１）。各タンパクの発現レベルをネガティブ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）とポジティブ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の２群に分け、各群の生存曲線を描き、ログランク検定にて２群間の有為差を検討した（図２）。KIF1C, KIF3C, PTTG1, EphA4, EphB6はいずれも各タンパクが高発現すると予後が悪い結果であった。
７． ＳｉＲＮＡの細胞導入
各遺伝子に対する特異的なｓｉＲＮＡはＡＭＢＩＯＮ社およびＱＩＡＧＥＮ社のものを用いた。KIF3C、ＩＤ＃１１１１８； PTTG、ＩＤ＃４１９００； ARK5、ＩＤ＃９６４； STAC、ＩＤ＃１２７２０； RASGRP2、ＩＤ＃１６８５７（いずれもＡＭＢＩＯＮ社）、またKIF1Cに対するｓｉＲＮＡはＹＡＭＡ−１（センス： GGAGAAUCAGUACCGGAAA；アンチセンス： UUUCCGGUACUGAUUCUCC、ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。非サイレンシング コントロール（ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）を含めたこれらトランスフェクションにはＲＮＡｉＨｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、プロトコールに従って実験を行った。細胞株を９６ウェルプレート（１００μｌ／ｗｅｌｌ）に培養し８０％コンフレントに達した時点で培地を交換（７５μｌ／ｗｅｌｌ）し、ＳｉＲＮＡ１００ｎＭ／２５μｌを混和、トランスフェクションさせた。４８時間の培養後、Ｔｅｔｒａ ｃｏｌｏｒ ｏｎｅ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ社，Ｔｏｋｙｏ）を用いて発色し、ＭＴＴアッセイにより生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を評価した。これらの値は非サイレンシングｓｉＲＮＡによるネガティブコントロールと比較検討した。全て増殖試験は３回以上行い、結果は平均±標準偏差で表現した。
【００５８】
ARK5, RASGRP2, PTTG1, STAC, KIF1C, KIF3CのＳｉＲＮＡの細胞導入によりグリオーマ細胞株Ｕ２５１の増殖がコントロールｓｉＲＮＡに比し４０−６０％に抑制される事が示された（図３）。
８． 定量ＰＣＲ法
ＲＮＡは凍結組織よりＩｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ， Ｔｏｙａｍａ， Ｊａｐａｎ）を用いて抽出した。第一鎖ｃＤＮＡは試料から得られたｍＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）プライマー、逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＮａｓｅH, Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）を用いて作成した。定量ＰＣＲはＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ， ＵＴ）によるリアルタイムＰＣＲで行った。ＰＣＲ試薬の組成は１×ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｒｏｓｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、各プライマー０．５μＭ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、２μｌ ｃＤＮＡテンプレートにて行った。ＰＣＲは９５℃１０分間でｄｅｎａｔｕｒｅ後、９５℃１５分、５５℃５分、７２℃１０分の各サイクルを４０サイクル行った。反応産物はｐｏｓｔ−ＰＣＲ ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｙｃｌｅを経て各サイクルで蛍光強度を測定した。ＰＣＲ増幅の為のプライマーは以下のものを用いた。
KIF1C,Hs01034140-g1.;KIF3C,Hs00158482-m1: PTTG1,Hs00851754-g1,;ARK5,Hs00934230-m1,;STAC,Hs01070510-m1,;RASGRP2,Hs01057113-m1,;(いずれもＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ社)。
【００５９】
定量ＰＣＲ法による検討ではｓｉＲＮＡの導入により、ARK5, RAS, PTTG1, STAC, KIF1C, KIF3Cの各ｍＲＮＡの発現をコントロールｓｉＲＮＡに比し２０〜３０％に抑制できることが定量ＰＣＲ法を用いて示された（図４）。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】選択された遺伝子の神経膠腫組織におけるタンパク質レベルでの発現を免疫組織学的に解析した結果を示した図である。
【図２】タンパク質発現レベルと患者の生存期間との相関を示した図である。
【図３】グリオーマ細胞株に各遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入し、細胞増殖をＴｅｔｒａ ｃｏｌｏｒ ｏｎｅを用いて分析した結果を示した図である。
【図４】グリオーマ細胞株に各遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入し、各遺伝子の発現レベルを定量ＰＣＲ法で分析した結果を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性脳腫瘍の指標となるマーカー遺伝子およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞は自己の遺伝子異常により厳密なプログラムが破綻し、秩序を失って増殖するものであり、本来これらの細胞の分子生物学的特性に基づいて治療法が選択されるのが理想である。腫瘍細胞の病理学的な特徴が同じでも、その進展形態、治療に関する感受性、予後などが大きく異なることは、日常臨床の場でしばしば遭遇する大きな問題点である。一方、腫瘍細胞の遺伝子異常は複数の遺伝子の異常が関与していることは言うまでもなく、それぞれの腫瘍細胞の分子生物学的特長を把握するには、多くの遺伝子の変化を同時に観察することが不可欠である。マイクロアレイ法は腫瘍細胞の転写レベルでの変化を同時にかつ大量にとらえるアプローチであり、腫瘍細胞の個性診断、治療に対する感受性、薬剤に対する耐性、副作用予測、新規標的分子同定などに応用可能と考えられる。これまで、さまざまなヒト癌種において、治療の選択を行うのに有用な分子マーカーを得るため、マイクロアレイを用いた分子発現プロファイルが用いられてきた。マイクロアレイ技術を用いて遺伝子発現プロファイルを調べることにより、多くの遺伝子が腫瘍の組織学的な型およびグレードにおいて、異なって発現されていることが確認されている。
【０００３】
各癌種に対しては、このような包括的遺伝子発現情報をもとにした治療標的遺伝子、マーカー遺伝子の選択は試みられているが、脳腫瘍に関して類似するような研究はまだ少ない（非特許文献１〜５）。
【非特許文献１】Freije WA, Castro-Vargas FE, Fang Z, Horvath S, Cloughesy T, Liau LM, Mischel PS, Nelson SF. Cancer Res. 2004 Sep 15;64(18):6503-10.
【非特許文献２】Rickman DS, Bobek MP, Misek DE, Kuick R, Blaivas M, Kurnit DM, Taylor J, Hanash SM. Cancer Res. 2001 Sep 15;61(18):6885-91.
【非特許文献３】Sallinen SL, Sallinen PK, Haapasalo HK, Helin HJ, Helen PT, Schraml P, Kallioniemi OP, Kononen J. Cancer Res. 2000 Dec 1;60(23):6617-22.
【非特許文献４】Kim S, Dougherty ER, Shmulevich I, Hess KR, Hamilton SR, Trent JM, Fuller GN, Zhang W. Mol Cancer Ther. 2002 Nov;1(13):1229-36.
【非特許文献５】van den Boom J, Wolter M, Kuick R, Misek DE, Youkilis AS, Wechsler DS, Sommer C, Reifenberger G, Hanash SM. Am J Pathol. 2003 Sep;163(3):1033-43.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
治療法の未だに確立されていない悪性脳腫瘍に対する、新たなる分子標的の探索は体系的遺伝子発現情報解析であるマイクロアレイ法により発展するものと期待される。また、この成果は悪性脳腫瘍に対する新たな治療法、診断学の開発に応用されることが期待される。本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、新たな治療法、診断学の開発のために悪性脳腫瘍の指標となるマーカー遺伝子およびその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、良性神経膠腫と悪性神経膠腫の遺伝子プロファイルを比較することにより、悪性神経膠腫のみに高発現する以下の表１に示す１７の脳腫瘍遺伝子を同定して、本発明を完成するに至った。
【０００６】
【表１】
本発明は、以下の通りである。
【０００７】
本発明の請求項１は、配列番号１〜１７のいずれか１記載の塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子である。
【０００８】
本発明の請求項２は、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブである。
【０００９】
本発明の請求項３は、請求項1記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続した脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーである。
【００１０】
本発明の請求項４は、請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも１を固定化させたことを特徴とするＤＮＡチップである。
【００１１】
本発明の請求項５は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断方法である：（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドにおける、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
【００１２】
本発明の請求項６は、下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法である：（ａ）被験物質と、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量と比較する工程、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００１３】
本発明の請求項７は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断キットである。：（ａ）請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも１、（ｂ）請求項３記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーの少なくとも１、（ｃ）請求項４記載のＤＮＡチップ。
【００１４】
本発明の請求項８は、配列番号１８〜３４のいずれか１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有することを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質である。
【００１５】
本発明の請求項９は、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質のいずれか１を特異的に認識することを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体である。
【００１６】
本発明の請求項１０は、請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体から選択された少なくとも１の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を固定化させたことを特徴とするプロテインチップである。
【００１７】
本発明の請求項１１は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断方法である：（ａ）被験者の生体試料から調製されるタンパク質における、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
【００１８】
本発明の請求項１２は、下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現を抑制する物質のスクリーニング方法である：（ａ）被験物質と、請請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカータンパク質の発現量と比較する工程、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００１９】
本発明の請求項１３は、以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断キットである：（ａ）請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも１、（ｂ）請求項１０記載のプロテインチップ。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、悪性脳腫瘍に対する腫瘍マーカーとなる脳腫瘍マーカー遺伝子が提供される。また、この脳腫瘍マーカー遺伝子に関わる各種の分子生物学的材料が提供され、これらを使用することによって、腫瘍マーカーとしての診断応用の他に、新規抗癌剤など創薬への応用が可能となる。脳腫瘍マーカー遺伝子に対する検出用プローブ等を作製することにより、脳腫瘍マーカー遺伝子を検出し、脳腫瘍の診断を広範囲にかつ確実に行うことができる。また、脳腫瘍を抑制する物質のスクリーニングを行い、新規抗癌剤の開発を進展させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の「脳腫瘍」は、頭蓋内に発生するすべての腫瘍をいう。このような脳腫瘍の中でも、発生頻度の高い代表的なものが神経膠腫であり、これはさらに、星細胞腫、神経膠芽腫等を含む。脳腫瘍には、この他、下垂体腺腫、神経鞘腫などがある。
【００２２】
本発明における「遺伝子」は、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えば、クローニング、化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡであっても、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖であってもよい。
【００２３】
本明細書における「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよび合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
【００２４】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００２５】
本発明者らは、良性神経膠腫と悪性神経膠腫の遺伝子プロファイルを比較することにより、悪性神経膠腫のみに高発現する上記の表１に示す１７の脳腫瘍マーカー遺伝子を同定した。
【００２６】
本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子とは、良性脳腫瘍若しくは正常脳組織ではほとんど又は全く発現せず、悪性脳腫瘍のみに高発現する遺伝子を言う。本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子は、配列番号１〜１７のいずれか１記載の塩基配列を有することを特徴とする。また、ＮＣＢＩの遺伝子データーベースにおいて、表１のＧｅｎｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒによりアプローチすることができる。本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子は、公知の遺伝子操作の手法により、取得することができる。
【００２７】
本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有することを特徴とするである。これらの脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、脳腫瘍マーカー遺伝子の塩基配列の全体又は部分配列を選択することによって、公知の方法を用いて適宜作製することができる。選択される部分配列はどの部分であってもよいが、脳腫瘍マーカー遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であることを特徴とする。また、脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、放射標識、蛍光標識等で標識してもよい。上記脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、選択された部分配列に基づいて、その配列に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡとすることができる。例えば、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子の塩基配列から適宜の長さのＤＮＡプローブを作成し、適宜蛍光標識等の標識を付与しておき、これを被検体とハイブリダイズすることにより、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現の多寡を検出し、脳腫瘍の検出を行う。
【００２８】
なお、上記脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの作製に際して、本発明の塩基配列において、「脳腫瘍マーカー遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。
【００２９】
本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーは、請求項1記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続した脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーである。脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーを用いることにより、ＰＣＲ等の公知の方法に基づいて目的の脳腫瘍マーカー遺伝子を増幅できる。プライマーは、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子の塩基配列（配列番号１〜１７）に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いる等、常法により容易に設計し、増幅することができる。また、プライマーは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、また、ビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。
【００３０】
本発明のＤＮＡチップは、請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも１を固定化させたことを特徴とする。ＤＮＡチップの作製方法は、当業者には公知である。ＤＮＡチップを用いることにより、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現レベルを検出、測定することができる。
【００３１】
本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする：（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドにおける、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
【００３２】
本発明の悪性脳腫瘍の診断方法において、「被験者」は、例えばＭＲＩ検査等によって脳腫瘍の疑いがあると診察されて患者であり、その「生体試料」とは患者脳からの切除組織あるいは血液等である。評価対象の生体試料は、マーカー遺伝子を含む任意の試料であり得る。患者脳からの切除組織あるいは血液等から常法に従って、生体試料からＲＮＡを調製することができる。また、患者脳からの切除組織あるいは血液等から常法に従って、該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを調製することができる。例えば、被験者の細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅する。その際に、標識ｄＮＴＰを取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることができる。
【００３３】
本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、前記生体試料における本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれかの発現レベルを検出し、測定することによって実施される。健常者の生体試料における請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を基準とし、被験者の生体試料における請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量が前記基準より高いと悪性脳腫瘍とする。具体的には、本発明の検出方法は、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法により前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する。このとき、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブや脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーを適宜用いることができる。また、本発明のＤＮＡチップを用いてもよい。
【００３４】
本発明の請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、本発明の請求項６は、下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする：（ａ）被験物質と、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量と比較する工程、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００３５】
本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を低下させる物質を探索することによって、悪性脳腫瘍を抑制する候補物質を提供するものである。
【００３６】
本発明のスクリーニングに用いられる細胞としては、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子を発現する培養細胞全般を挙げることができる。培養細胞においてこれら脳腫瘍マーカー遺伝子が発現しているか否かは、公知のウェスタンブロット法などにて検出することにより、容易に確認することができる。培養細胞としては、具体的には、例えば癌患者より単離、調製した生体組織や血球由来の細胞、または本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれかを導入した細胞等を挙げることができる。
【００３７】
また、本発明のスクリーニング方法に際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つ本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子を発現できる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択するのが好ましい。
【００３８】
脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１を発現している細胞からＲＮＡを調製して、脳腫瘍マーカー遺伝子を測定する。また、該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを調製して、脳腫瘍マーカー遺伝子を測定してもよい。具体的には、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法により前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する。このとき、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブや脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーを適宜用いることができる。また、本発明のＤＮＡチップを用いてもよい。
【００３９】
本発明の悪性脳腫瘍の診断キットは、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする：（ａ）請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも１、（ｂ）請求項３記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーの少なくとも１、（ｃ）請求項４記載のＤＮＡチップ。悪性脳腫瘍の診断キットを構成する（ａ）〜（ｃ）を上記のように用いることにより、悪性脳腫瘍の診断が可能となる。
【００４０】
本発明の脳腫瘍マーカータンパク質とは、良性脳腫瘍若しくは正常脳組織ではほとんど又は全く発現せず、悪性脳腫瘍のみに高発現するタンパク質を言う。本発明の脳腫瘍マーカータンパク質は、配列番号１８〜３４のいずれか１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有することを特徴とする。また、ＮＣＢＩの遺伝子データーベースにおいて、表１のＧｅｎｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒによりアプローチすることができる。
【００４１】
本発明の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体は、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質のいずれか１を特異的に認識することを特徴とする。本発明の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体は前記脳腫瘍マーカータンパク質に特異的に結合する性質を有することから、前記脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現した上記脳腫瘍マーカータンパク質を特異的に検出することができる。
【００４２】
抗体の製造方法は公知であり、本発明の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体も常法に従って製造することができる。具体的には、本発明の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した本発明の脳腫瘍マーカータンパク質を用いて、あるいは常法に従ってこれら本発明の脳腫瘍マーカータンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した本発明の脳腫瘍マーカータンパク質またはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる。該抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。
【００４３】
脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の作製に免疫抗原として使用される脳腫瘍マーカータンパク質は、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号１〜１７）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法に準じて行うことができる。
【００４４】
本発明のプロテインチップは、請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも１つ以上を固定化させたことを特徴とする。プロテインチップの作製方法は、当業者には公知である。
【００４５】
本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする：（ａ）被験者の生体試料から調整されるタンパク質における、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
【００４６】
本発明の悪性脳腫瘍の診断方法において、「被験者」は、例えばＭＲＩ検査等によって脳腫瘍の疑いがあると診察されて患者であり、その「生体試料」とは患者脳からの切除組織あるいは血液等である。患者脳からの切除組織あるいは血液等から常法に従って、生体試料からタンパク質を調製することができる。
【００４７】
本発明の悪性脳腫瘍の診断方法は、前記生体試料における脳腫瘍マーカータンパク質のいずれかの発現レベルを検出し、測定することによって実施される。健常者の生体試料における請求項１記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を基準とし、被験者の生体試料における請求項１記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量が前記基準より高いと悪性脳腫瘍とする。具体的には、公知の方法に基づいて、患者の組織の一部を採取し、そこから常法に従ってタンパク質を調製する。その後、例えば、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法など公知の検出方法に基づいて、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を検出することができる。このとき、上記脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を適宜用いることができる。また、上記プロテインチップを用いることにより、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を検出してもよい。
【００４８】
本発明の請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする：（ａ）被験物質と、請請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカータンパク質の発現量と比較する工程、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００４９】
本発明の脳腫瘍マーカータンパク質の発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を低下させる物質を探索することによって、悪性脳腫瘍を抑制する候補物質を提供するものである。
【００５０】
本発明のスクリーニングに用いられる細胞としては、請請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質を発現する培養細胞全般を挙げることができる。培養細胞においてこれら脳腫瘍マーカータンパク質が発現しているか否かは、公知のウェスタンブロット法などにて検出することにより、容易に確認することができる。培養細胞としては、具体的には、例えば癌患者より単離、調製した生体組織や血球由来の細胞、または本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれかを導入した細胞等を挙げることができる。
【００５１】
また、本発明のスクリーニング方法に際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つ本発明の脳腫瘍マーカータンパク質を発現できる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択するのが好ましい。
【００５２】
脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１を発現している細胞からタンパク質を調製して、脳腫瘍マーカー遺伝子を測定する。具体的には、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、タンパク質マイクロアレイ解析法などの公知の方法により前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する。このとき、上記脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を適宜用いることができる。また、上記プロテインチップを用いることにより、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を検出してもよい。
【００５３】
本発明の悪性脳腫瘍の診断キットは、以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする：（ａ）請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも１、（ｂ）請求項１０記載のプロテインチップ。悪性脳腫瘍の診断キットを構成する（ａ）〜（ｂ）を上記のように用いることにより、悪性脳腫瘍の診断が可能となる。
【００５４】
以下、具体的な実施例について説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
１． 対象症例
新潟大学脳研究所脳神経外科にて手術摘出された神経膠腫５２例 （ＷＨＯ ｇｒａｄｅＩＩ：１６例、ＩＩＩ：１４例、ＩＶ：２２例）を対象とした。高悪性度のものは術後、放射線治療（腫瘍局所４０Ｇｙ、全脳照射２０Ｇｙ）ならびにニトロソウレアを中心とした化学療法を施行した。生存期間は診断確定日より患者の死亡日、もしくは最終受診日とした。組織診断はＷＨＯ脳腫瘍組織分類に基づいて行った。なお、本明細書に記載の実験は、新潟大学倫理委員会の規定に則り、全ての対象患者からインフォームドコンセントを得ている。
【００５６】
２． ＲＮＡの抽出
凍結組織片はＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）中でポリトロンにより破砕された（最高速度で５秒間×２回）。クロロホルムを添加後、１５，０００×ｇで１０分間遠心し、ＲＮＡを含んだ水層を採取した。イソプロピルアルコールを用いトータルＲＮＡを沈殿させ、７０％エタノールで１度洗浄し、それをＤＥＰＣ処理Ｈ2Ｏに溶解した。トータルＲＮＡは１．５ユニットのＤNａｓｅ Ｉで処理し、再度、クロロホルム抽出を行った後に、エタノール沈殿し、ＤＥＰＣ処理Ｈ2Ｏに懸濁した。その後、Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使い、低分子の核酸を除去した。トータルＲＮＡの質はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）にてｒＲＮＡ ｒａｔｉｏ［２８ｓ／１８ｓ］を計測した。精製したトータルＲＮＡは７０％エタノール中で−８０℃に使用まで保存した。また、ヒト正常脳、副腎、骨髄、大腸、胎児肝、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、前立腺、だ液線、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、睾丸、胸腺、気管、甲状腺、子宮組織の各ｍＲＮＡはｃｌｏｎｔｅｃｈ社のものを使用した。
３． Ｃｙ３−、Ｃｙ５−標識化ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成はａｇｉｌｅｎｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｉｒｅｃｔ ｌａｂｅｌ ｋｉｔを用いて行った。１０μｇの精製したトータルＲＮＡとＴ７プロモーター配列を有するオリゴｄＴプライマーを用いて、１．２５μの１ｍＭのＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ ｄＣＴＰ（Ｃｙ3−ｄＣＴＰ又はＣｙ５−ｄＣＴＰ）、２００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素で４２℃１時間反応させ、第一鎖ｃＤＮＡを合成した後に第二鎖ｃＤＮＡを合成し、フェノール／クロロホルムで抽出し、Ｐｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌにて精製した。尚、腫瘍のＲＮＡはＣｙ５、正常脳組織のＲＮＡはＣｙ３を用いて標識した。得られたｃDＮＡはエタノール沈殿により回収し、使用まで７０％エタノール中で−８０℃で保存した。
４． ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ解析
脳腫瘍患者の原発癌の遺伝子発現はａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイを用いて試験した。ハイブリダイゼーションは、２×デポジションコントロールバッファー １２．５μｌ、Ｃｏｔ−１ＤＮＡ ２．５μｌ、ヌクレアーゼフリーの水 ７．５μｌ、ｃＤＮＡ ２．５μｌを含む２５μｌの溶液中で６５℃、１７時間行った。チップを０．5％ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄後、各ピクセルの蛍光強度はＨＰ社製レーザースキャナーにて測定し、画像化、さらに各遺伝子の正常脳組織に対する腫瘍組織での発現比に関して数値化を行った。この実験により、ヒト脳腫瘍患者の約１２７２９遺伝子の発現を測定した。
５． 統計解析
悪性神経膠腫と良性神経膠腫において異なる（発現をする）遺伝子群を同定するため、ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ解析を行った。遺伝子毎に１６検体の良性神経膠腫のａｖｅｒａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅの平均を求め、求めた平均の値と各々３６検体の悪性神経膠腫のａｖｅｒａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅを比較し、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−検定でｐ＜０．０１を示した遺伝子を選び出した。さらに、ヒト正常副腎、骨髄、大腸、胎児肝、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、前立腺、だ液線、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、睾丸、胸腺、気管、甲状腺、子宮組織でいずれも１．５以下の発現比の遺伝子を選択した。その結果、表１に示すように、Human mRNA for stac, complete cds、pituitary tumor-transforming 1(PTTG1)、RAS guanyl releasing protein 2 (calcium and DAG-regulated)、KIAA0561 protein (microtubule associated serine/threonine kinase 3)、KIAA0537 gene product ( AMP-activated protein kinase family member 5)、EphB6、EphA4、EphA5、kinesin family member 1C (KIF1C)、kinesin 2 (60-70kD)、kinesin family member 3C (KIF3C)、KIAA0449 protein (kinesin family member 21B)、serologically defined colon cancer antigen 31、sperm associated antigen 7、spermine synthase、Human mRNA for endosialin protein、Human ERGIC-53 mRNAの１7個の遺伝子を選び出した。
６． 免疫組織解析
対象症例について検討を行った。５ミクロン切片を作成し、脱パラフィン化の後に１０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ ６．０）中にて１２１℃、１０分間加温した。０．３％Ｈ2Ｏ2にて内因性ペルオキシダーゼ活性の阻害を行った。１０％ヤギ又はウサギ血清にてブロッキング後、各抗体（ＫＩＦ１Ｃヤギポリクローナル抗体、１：２０希釈；ＫＩＦ３Ｃヤギポリクローナル抗体、１：２０希釈；ＰＴＴＧヤギポリクロール抗体、１：２０希釈；ＥｐｈＡ４ ウサギポリクローナル抗体、１：２０希釈；ＥｐｈＢ６ヤギポリクローナル抗体、１：２０希釈）（いずれもＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）と４℃１２時間反応させた。洗浄後のＡｖｉｄｉｎｅ−ｂｉｏｔｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｅｃｔａｓｉｎ ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ， Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）を反応させ、０．０１％ ３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｓｉｇｍａ）とＰＢＳ０．１％過酸化水素にて発色させた。
【００５７】
図１に示すようにこれらの遺伝子産物は症例によって様々な程度に染色された。任意の３視野での各タンパクの発現強度を０−３、および発現面積を０、０．２５、０．５、０．７５、１．０と表示し、それらの積の平均値を求め発現レベルとした（図１）。各タンパクの発現レベルをネガティブ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）とポジティブ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の２群に分け、各群の生存曲線を描き、ログランク検定にて２群間の有為差を検討した（図２）。KIF1C, KIF3C, PTTG1, EphA4, EphB6はいずれも各タンパクが高発現すると予後が悪い結果であった。
７． ＳｉＲＮＡの細胞導入
各遺伝子に対する特異的なｓｉＲＮＡはＡＭＢＩＯＮ社およびＱＩＡＧＥＮ社のものを用いた。KIF3C、ＩＤ＃１１１１８； PTTG、ＩＤ＃４１９００； ARK5、ＩＤ＃９６４； STAC、ＩＤ＃１２７２０； RASGRP2、ＩＤ＃１６８５７（いずれもＡＭＢＩＯＮ社）、またKIF1Cに対するｓｉＲＮＡはＹＡＭＡ−１（センス： GGAGAAUCAGUACCGGAAA；アンチセンス： UUUCCGGUACUGAUUCUCC、ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。非サイレンシング コントロール（ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）を含めたこれらトランスフェクションにはＲＮＡｉＨｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、プロトコールに従って実験を行った。細胞株を９６ウェルプレート（１００μｌ／ｗｅｌｌ）に培養し８０％コンフレントに達した時点で培地を交換（７５μｌ／ｗｅｌｌ）し、ＳｉＲＮＡ１００ｎＭ／２５μｌを混和、トランスフェクションさせた。４８時間の培養後、Ｔｅｔｒａ ｃｏｌｏｒ ｏｎｅ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ社，Ｔｏｋｙｏ）を用いて発色し、ＭＴＴアッセイにより生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を評価した。これらの値は非サイレンシングｓｉＲＮＡによるネガティブコントロールと比較検討した。全て増殖試験は３回以上行い、結果は平均±標準偏差で表現した。
【００５８】
ARK5, RASGRP2, PTTG1, STAC, KIF1C, KIF3CのＳｉＲＮＡの細胞導入によりグリオーマ細胞株Ｕ２５１の増殖がコントロールｓｉＲＮＡに比し４０−６０％に抑制される事が示された（図３）。
８． 定量ＰＣＲ法
ＲＮＡは凍結組織よりＩｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ， Ｔｏｙａｍａ， Ｊａｐａｎ）を用いて抽出した。第一鎖ｃＤＮＡは試料から得られたｍＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）プライマー、逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＮａｓｅH, Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）を用いて作成した。定量ＰＣＲはＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ， ＵＴ）によるリアルタイムＰＣＲで行った。ＰＣＲ試薬の組成は１×ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｒｏｓｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、各プライマー０．５μＭ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、２μｌ ｃＤＮＡテンプレートにて行った。ＰＣＲは９５℃１０分間でｄｅｎａｔｕｒｅ後、９５℃１５分、５５℃５分、７２℃１０分の各サイクルを４０サイクル行った。反応産物はｐｏｓｔ−ＰＣＲ ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｙｃｌｅを経て各サイクルで蛍光強度を測定した。ＰＣＲ増幅の為のプライマーは以下のものを用いた。
KIF1C,Hs01034140-g1.;KIF3C,Hs00158482-m1: PTTG1,Hs00851754-g1,;ARK5,Hs00934230-m1,;STAC,Hs01070510-m1,;RASGRP2,Hs01057113-m1,;(いずれもＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ社)。
【００５９】
定量ＰＣＲ法による検討ではｓｉＲＮＡの導入により、ARK5, RAS, PTTG1, STAC, KIF1C, KIF3Cの各ｍＲＮＡの発現をコントロールｓｉＲＮＡに比し２０〜３０％に抑制できることが定量ＰＣＲ法を用いて示された（図４）。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】選択された遺伝子の神経膠腫組織におけるタンパク質レベルでの発現を免疫組織学的に解析した結果を示した図である。
【図２】タンパク質発現レベルと患者の生存期間との相関を示した図である。
【図３】グリオーマ細胞株に各遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入し、細胞増殖をＴｅｔｒａ ｃｏｌｏｒ ｏｎｅを用いて分析した結果を示した図である。
【図４】グリオーマ細胞株に各遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入し、各遺伝子の発現レベルを定量ＰＣＲ法で分析した結果を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１７のいずれか１記載の塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子。
【請求項２】
請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブ。
【請求項３】
請求項1記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続した脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマー。
【請求項４】
請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも１を固定化させたことを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項５】
下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドにおける、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
【請求項６】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断キット：
（ａ）請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも１、
（ｂ）請求項３記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーの少なくとも１、
（ｃ）請求項４記載のＤＮＡチップ。
【請求項８】
配列番号１８〜３４のいずれか１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有することを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質。
【請求項９】
請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質のいずれか１を特異的に認識することを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体。
【請求項１０】
請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体から選択された少なくとも１の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を固定化させたことを特徴とするプロテインチップ。
【請求項１１】
下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されるタンパク質における、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定する工程、
（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
【請求項１２】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と、請請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカータンパク質の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断キット：
（ａ）請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも１、
（ｂ）請求項１０記載のプロテインチップ。
【請求項１】
配列番号１〜１７のいずれか１記載の塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子。
【請求項２】
請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブ。
【請求項３】
請求項1記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続した脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマー。
【請求項４】
請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも１を固定化させたことを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項５】
下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドにおける、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
【請求項６】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断キット：
（ａ）請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも１、
（ｂ）請求項３記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーの少なくとも１、
（ｃ）請求項４記載のＤＮＡチップ。
【請求項８】
配列番号１８〜３４のいずれか１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有することを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質。
【請求項９】
請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質のいずれか１を特異的に認識することを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体。
【請求項１０】
請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体から選択された少なくとも１の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を固定化させたことを特徴とするプロテインチップ。
【請求項１１】
下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されるタンパク質における、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定する工程、
（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を悪性脳腫瘍と診断する工程。
【請求項１２】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と、請請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカータンパク質の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする悪性脳腫瘍の診断キット：
（ａ）請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも１、
（ｂ）請求項１０記載のプロテインチップ。
【図２】
【図１】
【図３】
【図４】
【図１】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−８２４３３（Ｐ２００７−８２４３３Ａ）
【公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２７２７６４（Ｐ２００５−２７２７６４）
【出願日】平成１７年９月２０日（２００５．９．２０）
【出願人】（３０４０２７２７９）国立大学法人 新潟大学 (310)
【出願人】（５９０００１４５２）国立がんセンター総長 (80)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２０日（２００５．９．２０）
【出願人】（３０４０２７２７９）国立大学法人 新潟大学 (310)
【出願人】（５９０００１４５２）国立がんセンター総長 (80)
【Ｆターム（参考）】
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