成長因子を含有するリポソームを含む皮膚外用剤及びその製造方法
【課題】老化防止効果、育毛効果に優れた皮膚外用剤の成分として最適である成長因子をリポソーム中に固定化させた成長因子固定化リポソーム並びにその化粧料さらにその製造方法の提供。
【解決手段】老化防止効果、育毛効果に優れた皮膚外用剤の成分として最適である成長因子（繊維芽細胞増殖因子等）をリポソーム中に固定化させることにより成長因子固定化リポソームを調製する製造方法、並びに、この成長因子固定化リポソームを皮膚外用剤に含有させる。
【解決手段】老化防止効果、育毛効果に優れた皮膚外用剤の成分として最適である成長因子（繊維芽細胞増殖因子等）をリポソーム中に固定化させることにより成長因子固定化リポソームを調製する製造方法、並びに、この成長因子固定化リポソームを皮膚外用剤に含有させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧品分野における成長因子を含有するリポソームを含む皮膚外用剤及びその製造方法に関する。より詳しくは、細胞を増殖、活性化させる成長因子をリポソーム中に含有させた成長因子固定化リポソームを含む皮膚外用剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質の自己組立(self-assembling process)により生成されるリポソームは、リン脂質分子の疎水性二重層で遮断された内部の水相を有する水分散型コロイド粒子である。リポソームは、１９６５年に人工生体膜研究のために試みられ（非特許文献１）、以後、医薬伝達体(drug delivery carriers)として１９７０年代から今まで研究されてきている。リポソームのコロイド、表面、医薬伝達体及び化学的性質を基盤として多様な製品が開発され、このうち医薬分野では、抗菌剤、抗ガン剤、ワクチン開発等があり、化粧品分野では、スキンケア製品とヘアコンディショニング製品等に応用された。
【０００３】
リポソームは、カプセル的性質を用いて疎水性脂質二重層間に疎水性化合物を捕獲する。あるいは、水相内部に親水性化合物を捕獲することによって、各種物質をカプセル化する伝達体として使われる。リポソームは、それ自体として、難溶性を示すか治療的投与量で許容されない毒性を持つ化合物を自体内に捕獲することで、毒性を低減し、長期的に生理活性物質を伝達するにも有用である。
【０００４】
一方、微小化したリポソームを製造する方法は、大きく２種類に分けられる。
第一は、脂質分子の自己組合(self-assembly)現象を用いて自発的にリポソームを形成する方法であって、例えば、水素イオン濃度の調節及び界面活性剤の添加による自発的小胞製造法、混合ミセル系から界面活性剤除去による小胞形成法が挙げられる。先ず、水素イオン濃度の調節による自発的小胞製造法は、水素イオン濃度によって溶解度が異なる特定のリン脂質類に限定される方法であって、リポソーム内部の水素イオン濃度と外部の水素イオン濃度の差をおいてリポソーム内部及び外部の曲率を異ならせて自発的に微小なリポソームを製造することが特徴であるが、一般的に、リポソームを製造するのに最も多く使われているホスファチジルコリン系のリン脂質類には使用できないという短所がある。また、界面活性剤の添加により微小なリポソームを製造する方法は、界面活性剤を除去できる別の設備が必要となり、大量調製が困難であり、製造時間が長いという短所がある。
【０００５】
第二に、押出、フレンチプレス(French press)、高圧乳化、超音波処理等の方法で、機械的な力やエネルギーを通じて水和及び膨潤された巨大なリポソームを微小化させる製造法である。この製造方法は、巨大なリポソームを作る第１工程と、これを微小化させる第２工程とを含む。先ず、第１工程では、脂質を揮発性有機溶媒に溶かした後、溶媒を減圧乾燥し、容器内壁に脂質等よりなる薄膜を形成させ、水性分散溶媒を加え、脂質膜を水和及び膨潤させることにより、リポソームを製造する。水和膨潤後のリポソームは、多層小包体であり、粒子のサイズが数〜数百ミクロンと比較的大きいことから、これを微小化するために、機械的な力やエネルギーを加える第２工程を進行するようになる。第２工程は、エネルギーを加える方式と形態が異なるだけで、粒径を微小化させるために高いエネルギーを加える点において両者は同一である。
【０００６】
リポソーム作成法の例として、ホスファチジルコリン等の膜構成脂質成分を水溶液中に５５度にて攪拌しながら添加、混合して、さらに超音波処理することによりリポソーム懸濁液を得ることが報告されている（特許文献１）が、成長因子固定化リポソームについては、これまで報告されてこなかった。
【０００７】
さらに、リポソーム形成には、脂質膜水和法が広く知られている（非特許文献２）。すなわち、フォスファチジルコリン、コレステロール等の脂質をエタノールに丸底フラスコ中に溶解させる。その後、乾燥窒素を吹き付けることにより、溶媒を蒸発させ、脂質フィルムを作成する。得られた脂質フィルムを緩衝水溶液中に導入し、超音波照射下あるいは非照射下化で攪拌することにより数百ナノメートルの直径を有するリポソームを調製することが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、これまで成長因子固定化リポソームの作成を試みられてこなかった。
【０００８】
一方、細胞の増殖、分化を促進させる成長因子の産生を促進させる物質を化粧品中に含有させたものが開発されてきてきる。例えば、ロイヤルゼリー中に含まれる分子量５７キロダルトンの糖蛋白質を含有させた育毛促進剤は、血管内皮増殖因子（VEGF）を産生促進し、これにより内皮細胞分裂促進活性を促し、これにより血管新生につながる管腔形成を促すことにより育毛を促進させることが報告されている（特許文献２）。
【０００９】
また、上皮細胞成長因子（epidermal growth factor, EGF）を有効成分とし、酸性高分子であるカルボキシビニルポリマーを基剤に用いたＥＧＦ製剤を製造し、皮膚外用剤並びに化粧品として、有用に使用することが報告されている（特許文献３、特開２００３−５２３３９９）。
【００１０】
しかしながら、これまでに成長因子をリポソーム化させた化粧品は開発されてこなかった。この原因として、成長因子が高価であり、成長因子をリポソーム化させた時の成長因子の固定化効率が低く成長因子を浪費してしまう恐れがあるためである。さらに、成長因子をリポソーム化させることを考えたときに、機械的な力やエネルギーを成長因子含有水溶液に加えることにより、蛋白質よりなる成長因子の変性を引き起こしてしまうことが予想されるためである。すなわち、成長因子含有リポソーム中の成長因子の生物活性は著しく減少してしまう恐れがあるからである。従って、機械的な力やエネルギーを成長因子に負荷させずに、成長因子含有リポソームを製造することが望まれてきた。
【００１１】
一方、エタノールに脂質を溶かした後、徐々に水性分散溶媒に添加し、微小なリポソームを製造する方法も開発されているが、高価な成長因子を用いてリポソーム化成長因子の作成は試みられてこなかった。この原因は、水性分散溶媒中に成長因子を大量に溶解させなければならず、さらに、水性分散溶媒に比べて、リポソームの体積は極微量であり、体積的な計算からは、大部分の成長因子は、リポソーム内にトラップされておらず、水性分散溶媒中に存在すると考えられてきたからである。
【００１２】
もし、成長因子固定化リポソームを調製することが可能であれば、蛋白質であり、高い分子量を有する成長因子を、上皮細胞下の皮膚にも成長因子を運ぶことが可能であり、皮膚の新生並びに若返り、発毛の促進が期待される。
【特許文献１】特開２００２−１４５７２１号公報
【特許文献２】特開２００１−３９３７７７号公報
【００１３】
【特許文献３】特開２００３−５２３３９９号公報
【００１４】
【非特許文献１】A.D. Bangham, M. M. Standish, J. C. Watkins, J. Mol. Biol. 13 238-252 (1965).
【００１５】
【非特許文献２】T. Yang, M.-K. Choi, F.-D. Cui, J. S. Kim, S.-J. Chung, C.-K. Shim, D.-D. Kim, J. Control. Release, 120, 169 (2007).
【００１６】
【非特許文献３】B. Romberg, C. Oussoren, C.J. Snel, W.E. Hennink, G. Storm, Pharm. Res., 24, 2394-2401 (2007).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
皮膚の白色化、新生並びに若返り、発毛の促進に優れた効果を発揮する成長因子をリポソームに固定化させて、上記効果をより発揮させる皮膚外用剤並びにその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、以上のような点に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、成長因子をリポソームに固定化させた成長因子固定化リポソームは、皮膚の白色化、新生並びに若返り、並びに育毛を促進させる効果を有することを見出した。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、成長因子固定化リポソームを製造することが可能である。この成長因子固定化リポソームは、容易に製造でき、老化防止効果、育毛効果に優れた皮膚外用剤の成分として最適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明にかかわる成長因子は、（１）繊維芽細胞成長因子であるFGF-1（酸性FGF:aFGF）、FGF-2（塩基性FGF:bFGF）、FGF-3（int-2）、FGF-4（hst-1/kaposi-FGF）、FGF-5, FGF-6(hst-2), FGF-7（KGF）、FGF-8、FGF-9、FGF-10、（２）血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、（３）肝細胞増殖因子（４）血小板由来増殖因子等である。
【００２１】
リポソームを作成する原料として、好ましくはレシチンを使用する。本発明で用いられるレシチンは、大豆又はタマゴから抽出したもので、炭素数が１２〜２４個である脂肪酸鎖を有するリン脂質類、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸及びこれらの加水分解されたその他の脂肪酸等の混合物である。抽出されたレシチンの疎水性基を構成する脂肪酸鎖は、二重結合が０〜３個程度平均的に分布する不飽和レシチンで、精製の度合によってホスファチジルコリンの含量が７０〜９５%に該当する混合物が用いられる。脂肪酸鎖の二重結合は、水や活性酸素により容易に酸化が起きるので、レシチンの化学的安定度を増加させるために、部分的に水添して二重結合の数を減少させたレシチンを使用することも可能である。
【００２２】
より具体的に、本発明に用いられるレシチンは、大豆から抽出されたリン脂質で、ホスファチジルコリンの含量が９０〜９５%に該当する不飽和レシチンである。全体含量の０.０１〜１５重量%を使用することができ、好ましくは、0.1〜5重量%を使用する。全体含量の５重量%を超えるレシチンを用いた場合、粘性の高いリポソーム水溶液となり、相分離を引き起こしやすくなり皮膚外用剤としては、外見が劣ることになるからである。また、０.０1重量%以下のレシチンを用いた場合には、成長因子の全体濃度が低くなり、皮膚の白色化、新生並びに若返り、発毛の促進効果があまり期待できないためである。
リポソームを安定化させる原料として、コレステロールをレシチン等のリン脂質あたり０〜２０重量%添加させることができ、好ましくは、0〜１０重量%を使用する。２０重量%以上の高濃度のコレステロールの添加は、逆にリポソームを不安定化させる要因となる。
【００２３】
成長因子固定化リポソームの作成方法として、（Ａ）リポソーム形成時に成長因子を固定化させる方法、と（Ｂ）リポソームを形成させた後に成長因子を物理吸着により固定化させる方法の２通りが考えられる。（Ａ）リポソーム形成時に成長因子を固定化させる方法では、リン脂質等の脂質をあらかじめエタノールに溶解させてリン脂質含有エタノール溶液を調製し、このリン脂質含有エタノール溶液を成長因子含有水溶液中に投入して乳化させることによりリポソームを調製することが可能である。乳化法としては、リン脂質含有エタノール溶液と成長因子含有水溶液中を機械的に攪拌させる方法と超音波処理を行う方法が可能であるが、成長因子の活性を保持させるためには、機械的に攪拌させる乳化法が通常は好ましい。
【００２４】
さらに、（Ｂ）リポソームを形成させた後に成長因子を物理吸着により固定化させる方法、においては、リン脂質等の脂質をクロロホルムに丸底フラスコ中で溶解させ、その後クロロホルムをエバポレーター等により蒸発させて、フラスコ内に脂質膜を作成させる。その後、緩衝溶液をフラスコ内に添加し、機械的あるいは超音波処理により乳化させてリポソームを調製する。その後、このリポソームを成長因子含有水溶液中に投入して、成長因子をリポソーム中に物理吸着させて成長因子固定化リポソームを調製させることも可能である。
【００２５】
リポソーム形成後、１０μｍから0.1μmのメンブレンフィルターを用いて、リポソームの外形を整えることも可能である。この場合、孔径の大きなメンブレンフィルターから順次孔径の小さなメンブレンフィルターを用いることにより小さな径のリポソームにすることが可能である。
【００２６】
以下、本発明を実施例により説明するが本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
表１に示す分量でレシチン（シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入）をエタノール中に溶解した。その後、表１に示す分量の繊維芽細胞成長因子(FGF-1)含有水溶液（１．６７μｇ/ｍLのFGF-1含有水溶液、エキストラディープエッセンス、株式会社パース製）中に上記のレシチンーエタノール溶液を徐々に加え、機械的に300rpmの速度で３０分間常温で攪拌させて繊維芽細胞成長因子固定化リポソームを作成した。その後、孔径５μｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（TMTP04700、日本ミリポア社製）で濾過することにより均一な繊維芽細胞成長因子固定化リポソームを作成した。得られた繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム水溶液を希釈して、位相差顕微鏡を用いて繊維芽細胞成長因子固定化リポソームの形態観察を行い、繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム形成の確認を行った。表１中の試料２で調製した繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム水溶液の位相差顕微鏡観察像を図１に示す。球形の繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム像を観察することができたことから、球形５μ前後の繊維芽細胞成長因子固定化リポソームが形成されていることが確認された。繊維芽細胞成長因子(FGF-1)は、蛋白質であり、この１次化学構造中には、トリプトファン、フェニルアラニン等の芳香族アミノ酸が含まれ、蛍光を発することが可能である。従って、繊維芽細胞成長因子固定化リポソームの確認には、この繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム水溶液の蛍光顕微鏡観察を行うことにより可能である。表１中の試料１−５で調製した繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム水溶液の蛍光顕微鏡像を観察したところ、球形の繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム像が蛍光像として観察することが可能であった。すなわち、水溶液中よりも、繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム上の方が強い蛍光像が観察されたことから、繊維芽細胞成長因子は、リポソーム中に濃縮固定化されていることが明らかとなった。
【００２８】
【表１】
【実施例２】
【００２９】
実施例１の表１中の試料４と同様な方法で繊維芽細胞成長因子固定化リポソームを調製した。その後、孔径０．２２μｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（GTBP04700、日本ミリポア社製）を用いてろ過した（試料６）。その後、得られたリポソーム水溶液を１０倍希釈して、動的光散乱法によりリポソーム形成の確認を行った所、球径１００〜２００ｎｍ前後のリポソームが形成されていることが確認された。繊維芽細胞成長因子固定化リポソームの確認のために、このリポソーム水溶液の蛍光顕微鏡観察を行った所、球形のリポソーム像が蛍光像として観察することが可能であった。すなわち、水溶液中よりも、リポソーム上の方が強い蛍光像が観察されたことから、繊維芽細胞成長因子は、リポソーム中に濃縮固定化されていることが明らかとなった。
【実施例３】
【００３０】
レシチン０.２５ｇの代わりに、レシチン０.２３ｇとコレステロール０.０２ｇを用いた以外は、実施例１の表１中の試料４と同様な方法で繊維芽細胞成長因子固定化リポソームを調製した。その後、孔径０．２２μｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（GTBP04700、日本ミリポア社製）を用いてろ過した（試料７）。
【００３１】
その後、得られたリポソーム水溶液を１０倍希釈して、動的光散乱法によりリポソーム形成の確認を行った所、球径１００〜２００ｎｍ前後のリポソームが形成されていることが確認された。繊維芽細胞成長因子固定化リポソームの確認のために、このリポソーム水溶液の蛍光顕微鏡観察を行った所、球形のリポソーム像が蛍光像として観察することが可能であった。すなわち、水溶液中よりも、リポソーム上の方が強い蛍光像が観察されたことから、繊維芽細胞成長因子は、リポソーム中に濃縮固定化されていることが明らかとなった。
【実施例４】
【００３２】
レシチン１ｇを精製水９９ｇに５５℃にて攪拌しながら添加、混合した。次に、１０分間超音波処理してリポソーム懸濁液を作成した。その後、常温にて、エバポレーターを用いて水分を蒸発させてリポソーム懸濁液量を２０ｇまで濃縮した。その後、このリポソーム懸濁液２０ｇを繊維芽細胞成長因子(FGF-1)含有水溶液（１．６７μｇ/ｍLのFGF-1含有水溶液、エキストラディープエッセンス、株式会社パース製）８０ｇ中に添加、混合した。その後、孔径５μｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（TMTP04700、日本ミリポア社製）続いて、孔径０．２２μｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（GTTP004700、日本ミリポア社製）を用いてろ過した（試料８）。１日間このリポソーム懸濁液をゆるやかに攪拌して、繊維芽細胞成長因子(FGF-1)をリポソーム中に、吸着させた。得られたリポソーム水溶液を１０倍希釈して、動的光散乱法によりリポソーム形成の確認を行った所、球径５０〜１００ｎｍ前後のリポソームが形成されていることが確認された。繊維芽細胞成長因子固定化リポソームの確認のために、このリポソーム水溶液の蛍光顕微鏡観察を行った所、球形のリポソーム像が蛍光像として観察することが可能であった。すなわち、水溶液中よりも、リポソーム上の方が強い蛍光像が観察されたことから、繊維芽細胞成長因子は、リポソーム中に濃縮固定化されていることが明らかとなった。
【比較例１】
【００３３】
FGF-1含有水溶液の代わりに純水を用いた以外は実施例１の表１中の試料４と同様にしてリポソームを調製した（比較試料１）。さらに、この比較試料１を新たに作成し、その後、孔径０．２２μｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（GTTP004700、日本ミリポア社製）を用いてろ過した（比較試料２）。FGF-1含有水溶液の代わりに精製水を用いた以外は実施例４と同様にしてリポソームを調製した（比較試料３）。
その後、得られたそれぞれのリポソーム水溶液を１０倍希釈して、動的光散乱法によりリポソーム形成の確認を行った所、比較試料１の試料では、球形約５μｍのリポソーム、比較試料２の試料では、球径１００〜２００ｎｍ前後のリポソーム、比較試料３の試料では、球径５０〜１００ｎｍ前後のリポソームが観察された。これらリポソーム水溶液の蛍光顕微鏡観察を行った所、いかなる蛍光像も観察することができなかった。
【実施例５】
【００３４】
実施例１中の試料４、実施例２中の試料６，実施例４中の試料８，比較例１中の比較試料１、比較試料２、比較試料３、比較試料４を用いて皮膚老化抑制効果を検討した。なお、比較試料４は、リポソーム化されていない繊維芽細胞成長因子(FGF-1)含有水溶液（１.６７μｇ/ｍLのFGF-1含有水溶液、エキストラディープエッセンス、株式会社パース製）を用いた。皮膚老化抑制効果の計測として、米国特許5618544の方法に準じ、真皮中のヒドロキシプロリン量を測定した。ヒドロキシプロリンは、コラーゲン合成に必要なアミノ酸であり、コラーゲン中のアミノ酸全体の１０％を占めている。従って、ヒドロキシプロリンは、組織中のコラーゲン量を調べる際のマーカー分子として利用することが可能であり、真皮中のヒドロキシプロリン量の増大は、コラーゲン産生する繊維芽細胞数が増えていることを意味し、皮膚老化の抑制効果として評価することができる。
８名の被験者の前腕部分に、５種類の試料を０.２ｍＬずつ１日２回、６０日間塗布した。６０日の期間が終了後、各試験部位から２mm分のパンチ生検標本を採取し、真皮中のヒドロキシプロリン量をアミノ酸分析装置により測定した。対照（未処理部分）を基準値（１.０）として、他の測定値を基準化させてヒドロキシプロリン量を計測した結果を表２に示す。また、パンチ生検標本前の皮膚粘弾性を皮膚粘弾性測定装置（MPA580、株式会社インテグラル製）で計測した。ここで、対照（未処理部分）を基準値（１.０）として、他の測定値を基準化させた皮膚粘弾性の結果を表２中に示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】
表２の結果から、試料４、試料６並びに試料８を塗布した皮膚は、比較試料１、比較試料２並びに比較試料３を塗布した皮膚に比べてヒドロキシプロリン量が増大していることが明らかとなった。比較試料４を塗布した皮膚は、比較試料１、比較試料２並びに比較試料３を塗布した皮膚に比べると、ヒドロキシプロリン量は高くなることが明らかとなったが、試料４、試料６並びに試料８を塗布した皮膚に比べて、比較試料４を塗布した皮膚のヒドロキシプロリン量は、低いことが明らかとなった。
また、表２の結果から、試料４、試料６並びに試料８を塗布した皮膚は、比較試料１、比較試料２並びに比較試料３を塗布した皮膚に比べて皮膚の粘弾性が増大していることが明らかとなった。比較試料４を塗布した皮膚は、比較試料１、比較試料２並びに比較試料３を塗布した皮膚に比べると、皮膚の粘弾性は高くなることが明らかとなったが、試料４、試料６並びに試料８を塗布した皮膚に比べて、比較試料４を塗布した皮膚の粘弾性は、低いことが明らかとなった。
【００３７】
以上より、繊維芽細胞成長因子(FGF-１)固定化リポソームは、リポソームのみの水溶液さらには、繊維芽細胞成長因子(FGF-１)水溶液よりも皮膚老化防止効果が高いことが明らとなった。
【実施例６】
【００３８】
FGF-1含有水溶液の代わりに繊維芽細胞成長因子(FGF-7, KGF)含有水溶液（０.４２μｇ/ｍLのFGF-７含有水溶液、エキストラスカルプエッセンス、株式会社パース製）を用いた以外は実施例１の表１中の試料４と同様にしてリポソームを調製した（試料９）。さらに、試料９を新たに作成し、その後、孔径０．２２μｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（GTTP004700、日本ミリポア社製）を用いてろ過した（試料１０）。その後、得られたリポソーム水溶液を希釈して、動的光散乱法を用いてリポソーム形成の確認を行った所、試料９では、球径約５μｍのリポソーム、試料１０では、球径１００〜２００ｎｍ前後のリポソームが観察された。繊維芽細胞成長因子固定化リポソームの確認のために、このリポソーム水溶液の蛍光顕微鏡観察を行った所、球形のリポソーム像が蛍光像として観察することが可能であった。すなわち、水溶液中よりも、リポソーム上の方が強い蛍光像が観察されたことから、繊維芽細胞成長因子は、リポソーム中に濃縮固定化されていることが明らかとなった。
上記の調製した試料９、試料１０、比較試料１、比較試料２、比較試料３、比較試料５の育毛効果を、次の方法で評価した。なお、比較試料５は、リポソーム化されていない繊維芽細胞成長因子(FGF-7, KGF)含有水溶液（０.４２μｇ/ｍLのFGF-７含有水溶液、エキストラスカルプエッセンス、株式会社パース製）を用いた。
７週齢のＣ３Ｈマウス（日本チャールズリバー株式会社）３０匹を、基本飼料（ＭＦ飼料、オリエンタル酵母工業株式会社）で１週間馴化した。次に、マウスの背部をバリカンおよびシェーバーで刈り取り、剃毛後に１群５匹の６群に分けた。そして、それら群別に試料９、試料１０、比較試料１、比較試料２、比較試料３、比較試料５を塗布して、これら試料の育毛効果を評価した。具体的には、１日１回、０．２ｍＬの各試料をガラス棒にて均一に塗布する操作を２週間行った。その後、塗布開始から２週間後の各マウスを写真撮影し、画像処理装置（ＮＩＨＩｍａｇｅ）を用いて、背部皮膚全面積に対する発毛部の面積の割合（発毛率）を算出した。結果を表３に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
表３の結果から、試料９と試料１０は、比較試料１、比較試料２、比較試料３に比べて育毛活性（育毛効果）があることが明らかとなった。比較試料５は、比較試料１、比較試料２、比較試料３に比べると、育毛活性（育毛効果）が高いことが明らかであるが、試料９と試料１０に比べて、比較試料５の育毛活性（育毛効果）は、低いことが明らかとなった。以上より、繊維芽細胞成長因子(FGF-7)固定化リポソームは、リポソームのみの水溶液さらには、繊維芽細胞成長因子(FGF-7)水溶液よりも育毛活性（育毛効果）が高いことが明らとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】実施例1に係る試料２で調製したリポソーム水溶液の位相差顕微鏡観察像を示す図である。なお、図中の矢印は、典型的なリポソーム像を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧品分野における成長因子を含有するリポソームを含む皮膚外用剤及びその製造方法に関する。より詳しくは、細胞を増殖、活性化させる成長因子をリポソーム中に含有させた成長因子固定化リポソームを含む皮膚外用剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質の自己組立(self-assembling process)により生成されるリポソームは、リン脂質分子の疎水性二重層で遮断された内部の水相を有する水分散型コロイド粒子である。リポソームは、１９６５年に人工生体膜研究のために試みられ（非特許文献１）、以後、医薬伝達体(drug delivery carriers)として１９７０年代から今まで研究されてきている。リポソームのコロイド、表面、医薬伝達体及び化学的性質を基盤として多様な製品が開発され、このうち医薬分野では、抗菌剤、抗ガン剤、ワクチン開発等があり、化粧品分野では、スキンケア製品とヘアコンディショニング製品等に応用された。
【０００３】
リポソームは、カプセル的性質を用いて疎水性脂質二重層間に疎水性化合物を捕獲する。あるいは、水相内部に親水性化合物を捕獲することによって、各種物質をカプセル化する伝達体として使われる。リポソームは、それ自体として、難溶性を示すか治療的投与量で許容されない毒性を持つ化合物を自体内に捕獲することで、毒性を低減し、長期的に生理活性物質を伝達するにも有用である。
【０００４】
一方、微小化したリポソームを製造する方法は、大きく２種類に分けられる。
第一は、脂質分子の自己組合(self-assembly)現象を用いて自発的にリポソームを形成する方法であって、例えば、水素イオン濃度の調節及び界面活性剤の添加による自発的小胞製造法、混合ミセル系から界面活性剤除去による小胞形成法が挙げられる。先ず、水素イオン濃度の調節による自発的小胞製造法は、水素イオン濃度によって溶解度が異なる特定のリン脂質類に限定される方法であって、リポソーム内部の水素イオン濃度と外部の水素イオン濃度の差をおいてリポソーム内部及び外部の曲率を異ならせて自発的に微小なリポソームを製造することが特徴であるが、一般的に、リポソームを製造するのに最も多く使われているホスファチジルコリン系のリン脂質類には使用できないという短所がある。また、界面活性剤の添加により微小なリポソームを製造する方法は、界面活性剤を除去できる別の設備が必要となり、大量調製が困難であり、製造時間が長いという短所がある。
【０００５】
第二に、押出、フレンチプレス(French press)、高圧乳化、超音波処理等の方法で、機械的な力やエネルギーを通じて水和及び膨潤された巨大なリポソームを微小化させる製造法である。この製造方法は、巨大なリポソームを作る第１工程と、これを微小化させる第２工程とを含む。先ず、第１工程では、脂質を揮発性有機溶媒に溶かした後、溶媒を減圧乾燥し、容器内壁に脂質等よりなる薄膜を形成させ、水性分散溶媒を加え、脂質膜を水和及び膨潤させることにより、リポソームを製造する。水和膨潤後のリポソームは、多層小包体であり、粒子のサイズが数〜数百ミクロンと比較的大きいことから、これを微小化するために、機械的な力やエネルギーを加える第２工程を進行するようになる。第２工程は、エネルギーを加える方式と形態が異なるだけで、粒径を微小化させるために高いエネルギーを加える点において両者は同一である。
【０００６】
リポソーム作成法の例として、ホスファチジルコリン等の膜構成脂質成分を水溶液中に５５度にて攪拌しながら添加、混合して、さらに超音波処理することによりリポソーム懸濁液を得ることが報告されている（特許文献１）が、成長因子固定化リポソームについては、これまで報告されてこなかった。
【０００７】
さらに、リポソーム形成には、脂質膜水和法が広く知られている（非特許文献２）。すなわち、フォスファチジルコリン、コレステロール等の脂質をエタノールに丸底フラスコ中に溶解させる。その後、乾燥窒素を吹き付けることにより、溶媒を蒸発させ、脂質フィルムを作成する。得られた脂質フィルムを緩衝水溶液中に導入し、超音波照射下あるいは非照射下化で攪拌することにより数百ナノメートルの直径を有するリポソームを調製することが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、これまで成長因子固定化リポソームの作成を試みられてこなかった。
【０００８】
一方、細胞の増殖、分化を促進させる成長因子の産生を促進させる物質を化粧品中に含有させたものが開発されてきてきる。例えば、ロイヤルゼリー中に含まれる分子量５７キロダルトンの糖蛋白質を含有させた育毛促進剤は、血管内皮増殖因子（VEGF）を産生促進し、これにより内皮細胞分裂促進活性を促し、これにより血管新生につながる管腔形成を促すことにより育毛を促進させることが報告されている（特許文献２）。
【０００９】
また、上皮細胞成長因子（epidermal growth factor, EGF）を有効成分とし、酸性高分子であるカルボキシビニルポリマーを基剤に用いたＥＧＦ製剤を製造し、皮膚外用剤並びに化粧品として、有用に使用することが報告されている（特許文献３、特開２００３−５２３３９９）。
【００１０】
しかしながら、これまでに成長因子をリポソーム化させた化粧品は開発されてこなかった。この原因として、成長因子が高価であり、成長因子をリポソーム化させた時の成長因子の固定化効率が低く成長因子を浪費してしまう恐れがあるためである。さらに、成長因子をリポソーム化させることを考えたときに、機械的な力やエネルギーを成長因子含有水溶液に加えることにより、蛋白質よりなる成長因子の変性を引き起こしてしまうことが予想されるためである。すなわち、成長因子含有リポソーム中の成長因子の生物活性は著しく減少してしまう恐れがあるからである。従って、機械的な力やエネルギーを成長因子に負荷させずに、成長因子含有リポソームを製造することが望まれてきた。
【００１１】
一方、エタノールに脂質を溶かした後、徐々に水性分散溶媒に添加し、微小なリポソームを製造する方法も開発されているが、高価な成長因子を用いてリポソーム化成長因子の作成は試みられてこなかった。この原因は、水性分散溶媒中に成長因子を大量に溶解させなければならず、さらに、水性分散溶媒に比べて、リポソームの体積は極微量であり、体積的な計算からは、大部分の成長因子は、リポソーム内にトラップされておらず、水性分散溶媒中に存在すると考えられてきたからである。
【００１２】
もし、成長因子固定化リポソームを調製することが可能であれば、蛋白質であり、高い分子量を有する成長因子を、上皮細胞下の皮膚にも成長因子を運ぶことが可能であり、皮膚の新生並びに若返り、発毛の促進が期待される。
【特許文献１】特開２００２−１４５７２１号公報
【特許文献２】特開２００１−３９３７７７号公報
【００１３】
【特許文献３】特開２００３−５２３３９９号公報
【００１４】
【非特許文献１】A.D. Bangham, M. M. Standish, J. C. Watkins, J. Mol. Biol. 13 238-252 (1965).
【００１５】
【非特許文献２】T. Yang, M.-K. Choi, F.-D. Cui, J. S. Kim, S.-J. Chung, C.-K. Shim, D.-D. Kim, J. Control. Release, 120, 169 (2007).
【００１６】
【非特許文献３】B. Romberg, C. Oussoren, C.J. Snel, W.E. Hennink, G. Storm, Pharm. Res., 24, 2394-2401 (2007).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
皮膚の白色化、新生並びに若返り、発毛の促進に優れた効果を発揮する成長因子をリポソームに固定化させて、上記効果をより発揮させる皮膚外用剤並びにその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、以上のような点に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、成長因子をリポソームに固定化させた成長因子固定化リポソームは、皮膚の白色化、新生並びに若返り、並びに育毛を促進させる効果を有することを見出した。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、成長因子固定化リポソームを製造することが可能である。この成長因子固定化リポソームは、容易に製造でき、老化防止効果、育毛効果に優れた皮膚外用剤の成分として最適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明にかかわる成長因子は、（１）繊維芽細胞成長因子であるFGF-1（酸性FGF:aFGF）、FGF-2（塩基性FGF:bFGF）、FGF-3（int-2）、FGF-4（hst-1/kaposi-FGF）、FGF-5, FGF-6(hst-2), FGF-7（KGF）、FGF-8、FGF-9、FGF-10、（２）血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、（３）肝細胞増殖因子（４）血小板由来増殖因子等である。
【００２１】
リポソームを作成する原料として、好ましくはレシチンを使用する。本発明で用いられるレシチンは、大豆又はタマゴから抽出したもので、炭素数が１２〜２４個である脂肪酸鎖を有するリン脂質類、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸及びこれらの加水分解されたその他の脂肪酸等の混合物である。抽出されたレシチンの疎水性基を構成する脂肪酸鎖は、二重結合が０〜３個程度平均的に分布する不飽和レシチンで、精製の度合によってホスファチジルコリンの含量が７０〜９５%に該当する混合物が用いられる。脂肪酸鎖の二重結合は、水や活性酸素により容易に酸化が起きるので、レシチンの化学的安定度を増加させるために、部分的に水添して二重結合の数を減少させたレシチンを使用することも可能である。
【００２２】
より具体的に、本発明に用いられるレシチンは、大豆から抽出されたリン脂質で、ホスファチジルコリンの含量が９０〜９５%に該当する不飽和レシチンである。全体含量の０.０１〜１５重量%を使用することができ、好ましくは、0.1〜5重量%を使用する。全体含量の５重量%を超えるレシチンを用いた場合、粘性の高いリポソーム水溶液となり、相分離を引き起こしやすくなり皮膚外用剤としては、外見が劣ることになるからである。また、０.０1重量%以下のレシチンを用いた場合には、成長因子の全体濃度が低くなり、皮膚の白色化、新生並びに若返り、発毛の促進効果があまり期待できないためである。
リポソームを安定化させる原料として、コレステロールをレシチン等のリン脂質あたり０〜２０重量%添加させることができ、好ましくは、0〜１０重量%を使用する。２０重量%以上の高濃度のコレステロールの添加は、逆にリポソームを不安定化させる要因となる。
【００２３】
成長因子固定化リポソームの作成方法として、（Ａ）リポソーム形成時に成長因子を固定化させる方法、と（Ｂ）リポソームを形成させた後に成長因子を物理吸着により固定化させる方法の２通りが考えられる。（Ａ）リポソーム形成時に成長因子を固定化させる方法では、リン脂質等の脂質をあらかじめエタノールに溶解させてリン脂質含有エタノール溶液を調製し、このリン脂質含有エタノール溶液を成長因子含有水溶液中に投入して乳化させることによりリポソームを調製することが可能である。乳化法としては、リン脂質含有エタノール溶液と成長因子含有水溶液中を機械的に攪拌させる方法と超音波処理を行う方法が可能であるが、成長因子の活性を保持させるためには、機械的に攪拌させる乳化法が通常は好ましい。
【００２４】
さらに、（Ｂ）リポソームを形成させた後に成長因子を物理吸着により固定化させる方法、においては、リン脂質等の脂質をクロロホルムに丸底フラスコ中で溶解させ、その後クロロホルムをエバポレーター等により蒸発させて、フラスコ内に脂質膜を作成させる。その後、緩衝溶液をフラスコ内に添加し、機械的あるいは超音波処理により乳化させてリポソームを調製する。その後、このリポソームを成長因子含有水溶液中に投入して、成長因子をリポソーム中に物理吸着させて成長因子固定化リポソームを調製させることも可能である。
【００２５】
リポソーム形成後、１０μｍから0.1μmのメンブレンフィルターを用いて、リポソームの外形を整えることも可能である。この場合、孔径の大きなメンブレンフィルターから順次孔径の小さなメンブレンフィルターを用いることにより小さな径のリポソームにすることが可能である。
【００２６】
以下、本発明を実施例により説明するが本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
表１に示す分量でレシチン（シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入）をエタノール中に溶解した。その後、表１に示す分量の繊維芽細胞成長因子(FGF-1)含有水溶液（１．６７μｇ/ｍLのFGF-1含有水溶液、エキストラディープエッセンス、株式会社パース製）中に上記のレシチンーエタノール溶液を徐々に加え、機械的に300rpmの速度で３０分間常温で攪拌させて繊維芽細胞成長因子固定化リポソームを作成した。その後、孔径５μｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（TMTP04700、日本ミリポア社製）で濾過することにより均一な繊維芽細胞成長因子固定化リポソームを作成した。得られた繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム水溶液を希釈して、位相差顕微鏡を用いて繊維芽細胞成長因子固定化リポソームの形態観察を行い、繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム形成の確認を行った。表１中の試料２で調製した繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム水溶液の位相差顕微鏡観察像を図１に示す。球形の繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム像を観察することができたことから、球形５μ前後の繊維芽細胞成長因子固定化リポソームが形成されていることが確認された。繊維芽細胞成長因子(FGF-1)は、蛋白質であり、この１次化学構造中には、トリプトファン、フェニルアラニン等の芳香族アミノ酸が含まれ、蛍光を発することが可能である。従って、繊維芽細胞成長因子固定化リポソームの確認には、この繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム水溶液の蛍光顕微鏡観察を行うことにより可能である。表１中の試料１−５で調製した繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム水溶液の蛍光顕微鏡像を観察したところ、球形の繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム像が蛍光像として観察することが可能であった。すなわち、水溶液中よりも、繊維芽細胞成長因子固定化リポソーム上の方が強い蛍光像が観察されたことから、繊維芽細胞成長因子は、リポソーム中に濃縮固定化されていることが明らかとなった。
【００２８】
【表１】
【実施例２】
【００２９】
実施例１の表１中の試料４と同様な方法で繊維芽細胞成長因子固定化リポソームを調製した。その後、孔径０．２２μｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（GTBP04700、日本ミリポア社製）を用いてろ過した（試料６）。その後、得られたリポソーム水溶液を１０倍希釈して、動的光散乱法によりリポソーム形成の確認を行った所、球径１００〜２００ｎｍ前後のリポソームが形成されていることが確認された。繊維芽細胞成長因子固定化リポソームの確認のために、このリポソーム水溶液の蛍光顕微鏡観察を行った所、球形のリポソーム像が蛍光像として観察することが可能であった。すなわち、水溶液中よりも、リポソーム上の方が強い蛍光像が観察されたことから、繊維芽細胞成長因子は、リポソーム中に濃縮固定化されていることが明らかとなった。
【実施例３】
【００３０】
レシチン０.２５ｇの代わりに、レシチン０.２３ｇとコレステロール０.０２ｇを用いた以外は、実施例１の表１中の試料４と同様な方法で繊維芽細胞成長因子固定化リポソームを調製した。その後、孔径０．２２μｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（GTBP04700、日本ミリポア社製）を用いてろ過した（試料７）。
【００３１】
その後、得られたリポソーム水溶液を１０倍希釈して、動的光散乱法によりリポソーム形成の確認を行った所、球径１００〜２００ｎｍ前後のリポソームが形成されていることが確認された。繊維芽細胞成長因子固定化リポソームの確認のために、このリポソーム水溶液の蛍光顕微鏡観察を行った所、球形のリポソーム像が蛍光像として観察することが可能であった。すなわち、水溶液中よりも、リポソーム上の方が強い蛍光像が観察されたことから、繊維芽細胞成長因子は、リポソーム中に濃縮固定化されていることが明らかとなった。
【実施例４】
【００３２】
レシチン１ｇを精製水９９ｇに５５℃にて攪拌しながら添加、混合した。次に、１０分間超音波処理してリポソーム懸濁液を作成した。その後、常温にて、エバポレーターを用いて水分を蒸発させてリポソーム懸濁液量を２０ｇまで濃縮した。その後、このリポソーム懸濁液２０ｇを繊維芽細胞成長因子(FGF-1)含有水溶液（１．６７μｇ/ｍLのFGF-1含有水溶液、エキストラディープエッセンス、株式会社パース製）８０ｇ中に添加、混合した。その後、孔径５μｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（TMTP04700、日本ミリポア社製）続いて、孔径０．２２μｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（GTTP004700、日本ミリポア社製）を用いてろ過した（試料８）。１日間このリポソーム懸濁液をゆるやかに攪拌して、繊維芽細胞成長因子(FGF-1)をリポソーム中に、吸着させた。得られたリポソーム水溶液を１０倍希釈して、動的光散乱法によりリポソーム形成の確認を行った所、球径５０〜１００ｎｍ前後のリポソームが形成されていることが確認された。繊維芽細胞成長因子固定化リポソームの確認のために、このリポソーム水溶液の蛍光顕微鏡観察を行った所、球形のリポソーム像が蛍光像として観察することが可能であった。すなわち、水溶液中よりも、リポソーム上の方が強い蛍光像が観察されたことから、繊維芽細胞成長因子は、リポソーム中に濃縮固定化されていることが明らかとなった。
【比較例１】
【００３３】
FGF-1含有水溶液の代わりに純水を用いた以外は実施例１の表１中の試料４と同様にしてリポソームを調製した（比較試料１）。さらに、この比較試料１を新たに作成し、その後、孔径０．２２μｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（GTTP004700、日本ミリポア社製）を用いてろ過した（比較試料２）。FGF-1含有水溶液の代わりに精製水を用いた以外は実施例４と同様にしてリポソームを調製した（比較試料３）。
その後、得られたそれぞれのリポソーム水溶液を１０倍希釈して、動的光散乱法によりリポソーム形成の確認を行った所、比較試料１の試料では、球形約５μｍのリポソーム、比較試料２の試料では、球径１００〜２００ｎｍ前後のリポソーム、比較試料３の試料では、球径５０〜１００ｎｍ前後のリポソームが観察された。これらリポソーム水溶液の蛍光顕微鏡観察を行った所、いかなる蛍光像も観察することができなかった。
【実施例５】
【００３４】
実施例１中の試料４、実施例２中の試料６，実施例４中の試料８，比較例１中の比較試料１、比較試料２、比較試料３、比較試料４を用いて皮膚老化抑制効果を検討した。なお、比較試料４は、リポソーム化されていない繊維芽細胞成長因子(FGF-1)含有水溶液（１.６７μｇ/ｍLのFGF-1含有水溶液、エキストラディープエッセンス、株式会社パース製）を用いた。皮膚老化抑制効果の計測として、米国特許5618544の方法に準じ、真皮中のヒドロキシプロリン量を測定した。ヒドロキシプロリンは、コラーゲン合成に必要なアミノ酸であり、コラーゲン中のアミノ酸全体の１０％を占めている。従って、ヒドロキシプロリンは、組織中のコラーゲン量を調べる際のマーカー分子として利用することが可能であり、真皮中のヒドロキシプロリン量の増大は、コラーゲン産生する繊維芽細胞数が増えていることを意味し、皮膚老化の抑制効果として評価することができる。
８名の被験者の前腕部分に、５種類の試料を０.２ｍＬずつ１日２回、６０日間塗布した。６０日の期間が終了後、各試験部位から２mm分のパンチ生検標本を採取し、真皮中のヒドロキシプロリン量をアミノ酸分析装置により測定した。対照（未処理部分）を基準値（１.０）として、他の測定値を基準化させてヒドロキシプロリン量を計測した結果を表２に示す。また、パンチ生検標本前の皮膚粘弾性を皮膚粘弾性測定装置（MPA580、株式会社インテグラル製）で計測した。ここで、対照（未処理部分）を基準値（１.０）として、他の測定値を基準化させた皮膚粘弾性の結果を表２中に示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】
表２の結果から、試料４、試料６並びに試料８を塗布した皮膚は、比較試料１、比較試料２並びに比較試料３を塗布した皮膚に比べてヒドロキシプロリン量が増大していることが明らかとなった。比較試料４を塗布した皮膚は、比較試料１、比較試料２並びに比較試料３を塗布した皮膚に比べると、ヒドロキシプロリン量は高くなることが明らかとなったが、試料４、試料６並びに試料８を塗布した皮膚に比べて、比較試料４を塗布した皮膚のヒドロキシプロリン量は、低いことが明らかとなった。
また、表２の結果から、試料４、試料６並びに試料８を塗布した皮膚は、比較試料１、比較試料２並びに比較試料３を塗布した皮膚に比べて皮膚の粘弾性が増大していることが明らかとなった。比較試料４を塗布した皮膚は、比較試料１、比較試料２並びに比較試料３を塗布した皮膚に比べると、皮膚の粘弾性は高くなることが明らかとなったが、試料４、試料６並びに試料８を塗布した皮膚に比べて、比較試料４を塗布した皮膚の粘弾性は、低いことが明らかとなった。
【００３７】
以上より、繊維芽細胞成長因子(FGF-１)固定化リポソームは、リポソームのみの水溶液さらには、繊維芽細胞成長因子(FGF-１)水溶液よりも皮膚老化防止効果が高いことが明らとなった。
【実施例６】
【００３８】
FGF-1含有水溶液の代わりに繊維芽細胞成長因子(FGF-7, KGF)含有水溶液（０.４２μｇ/ｍLのFGF-７含有水溶液、エキストラスカルプエッセンス、株式会社パース製）を用いた以外は実施例１の表１中の試料４と同様にしてリポソームを調製した（試料９）。さらに、試料９を新たに作成し、その後、孔径０．２２μｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（GTTP004700、日本ミリポア社製）を用いてろ過した（試料１０）。その後、得られたリポソーム水溶液を希釈して、動的光散乱法を用いてリポソーム形成の確認を行った所、試料９では、球径約５μｍのリポソーム、試料１０では、球径１００〜２００ｎｍ前後のリポソームが観察された。繊維芽細胞成長因子固定化リポソームの確認のために、このリポソーム水溶液の蛍光顕微鏡観察を行った所、球形のリポソーム像が蛍光像として観察することが可能であった。すなわち、水溶液中よりも、リポソーム上の方が強い蛍光像が観察されたことから、繊維芽細胞成長因子は、リポソーム中に濃縮固定化されていることが明らかとなった。
上記の調製した試料９、試料１０、比較試料１、比較試料２、比較試料３、比較試料５の育毛効果を、次の方法で評価した。なお、比較試料５は、リポソーム化されていない繊維芽細胞成長因子(FGF-7, KGF)含有水溶液（０.４２μｇ/ｍLのFGF-７含有水溶液、エキストラスカルプエッセンス、株式会社パース製）を用いた。
７週齢のＣ３Ｈマウス（日本チャールズリバー株式会社）３０匹を、基本飼料（ＭＦ飼料、オリエンタル酵母工業株式会社）で１週間馴化した。次に、マウスの背部をバリカンおよびシェーバーで刈り取り、剃毛後に１群５匹の６群に分けた。そして、それら群別に試料９、試料１０、比較試料１、比較試料２、比較試料３、比較試料５を塗布して、これら試料の育毛効果を評価した。具体的には、１日１回、０．２ｍＬの各試料をガラス棒にて均一に塗布する操作を２週間行った。その後、塗布開始から２週間後の各マウスを写真撮影し、画像処理装置（ＮＩＨＩｍａｇｅ）を用いて、背部皮膚全面積に対する発毛部の面積の割合（発毛率）を算出した。結果を表３に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
表３の結果から、試料９と試料１０は、比較試料１、比較試料２、比較試料３に比べて育毛活性（育毛効果）があることが明らかとなった。比較試料５は、比較試料１、比較試料２、比較試料３に比べると、育毛活性（育毛効果）が高いことが明らかであるが、試料９と試料１０に比べて、比較試料５の育毛活性（育毛効果）は、低いことが明らかとなった。以上より、繊維芽細胞成長因子(FGF-7)固定化リポソームは、リポソームのみの水溶液さらには、繊維芽細胞成長因子(FGF-7)水溶液よりも育毛活性（育毛効果）が高いことが明らとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】実施例1に係る試料２で調製したリポソーム水溶液の位相差顕微鏡観察像を示す図である。なお、図中の矢印は、典型的なリポソーム像を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長因子を含有するリポソームを含む皮膚外用剤
【請求項２】
成長因子が繊維芽細胞増殖因子である請求項１の皮膚外用剤
【請求項３】
リン脂質を主成分として用いてリポソームを調製した請求項１の皮膚外用剤
【請求項４】
レシチンを主成分として用いてリポソームを調製した請求項１の皮膚外用剤
【請求項５】
皮膚外用剤が、化粧品、化粧水、毛髪剤、育毛促進剤、毛髪水、毛髪クリーム、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディーエッセンス、メイカップベース、ファウンデーション、シャンプー、リンス、ボディーソープであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤
【請求項６】
リン脂質をエタノールに溶解させてリン脂質含有エタノール溶液を調製し、このリン脂質含有エタノール溶液を成長因子含有水溶液中に投入して乳化させることによりリポソームを調製する製造方法
【請求項７】
成長因子が繊維芽細胞増殖因子である請求項６の製造方法
【請求項８】
リン脂質を主成分として用いてリポソームを調製した請求項６の製造方法
【請求項９】
レシチンを主成分として用いてリポソームを調製した請求項６の製造方法
【請求項１】
成長因子を含有するリポソームを含む皮膚外用剤
【請求項２】
成長因子が繊維芽細胞増殖因子である請求項１の皮膚外用剤
【請求項３】
リン脂質を主成分として用いてリポソームを調製した請求項１の皮膚外用剤
【請求項４】
レシチンを主成分として用いてリポソームを調製した請求項１の皮膚外用剤
【請求項５】
皮膚外用剤が、化粧品、化粧水、毛髪剤、育毛促進剤、毛髪水、毛髪クリーム、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディーエッセンス、メイカップベース、ファウンデーション、シャンプー、リンス、ボディーソープであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤
【請求項６】
リン脂質をエタノールに溶解させてリン脂質含有エタノール溶液を調製し、このリン脂質含有エタノール溶液を成長因子含有水溶液中に投入して乳化させることによりリポソームを調製する製造方法
【請求項７】
成長因子が繊維芽細胞増殖因子である請求項６の製造方法
【請求項８】
リン脂質を主成分として用いてリポソームを調製した請求項６の製造方法
【請求項９】
レシチンを主成分として用いてリポソームを調製した請求項６の製造方法
【図１】
【公開番号】特開２００９−１９１００４（Ｐ２００９−１９１００４Ａ）
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３２６０８（Ｐ２００８−３２６０８）
【出願日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（３０８００６２１０）株式会社パース (2)
【出願人】（５０８０４７２３３）
【出願人】（５９７０３８０７９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（３０８００６２１０）株式会社パース (2)
【出願人】（５０８０４７２３３）
【出願人】（５９７０３８０７９）
【Ｆターム（参考）】
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