抗原に対し霊長類を免疫寛容化する組成物と方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した際にある特性を持つ化合物、または少なくとも２個の化合物の組合せでの使用による霊長類への免疫寛容の誘導。単独または組合せて使用される化合物は、望ましくはＴＲＸ１抗体であり、化合物またはその組合せは、望ましくは特定の用量処方に基づいて使用される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年６月１４日付け英国出願番号０１１４５１７．６号の優先権を主張する合衆国出願番号１０／１７１，４５２号（係属中），２００１年９月２０日付英国出願番号０１２２７２４．８号，２００１年１０月１９日付合衆国暫定出願番号６０／３４５，１９４号，２００２年４月１８日付合衆国暫定出願番号６０／３７３，４７０号，および２００２年４月１８日付合衆国暫定出願番号６０／３７３，４７１号の継続出願であり、これらの内容は本発明の引用例としてここに組み込まれている。
【０００２】
本発明は、抗原に対する免疫応答を阻害し、予防しまたは改善するために適用可能である。このような抗原に対する免疫応答の阻害、予防または改善は、抗原に対する免疫寛容を誘導することを含む。本発明は、更に免疫寛容誘導、およびまたはＴ細胞活性化および増殖の予防または阻害および、より詳細には霊長類への免疫寛容の誘導を含む。
【０００３】
外来抗原または組織、あるいは自己抗原または組織に対する免疫寛容は、さもなくば正常、成熟免疫系が特異的にその抗原／組織に攻撃的に応答できず、従って、それは正常（非疾病）体組織／成分のように扱う状態であり、しかも同時にそれは、外来または疾病抗原／組織に対し攻撃的に応答することができ、それらに対し免疫系は、自己免疫寛容の自然な過程により、またはｉｎ ｖｉｖｏでの免疫寛容許容環境を創出することにより、特異的に免疫寛容化されてきていなかった。
【発明の開示】
【０００４】
本発明の一つの見地に従って、１個の化合物、または少なくとも２個の化合物の組合せの使用により、免疫寛容を誘導する一つのプロセスが提供され、ここで化合物または組合わせは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験された場合にある種の特性を有し、望ましい実施例における前記化合物の限定されない例としては、ＣＤ４抗体が存在する。
【０００５】
「少なくとも２個の化合物の組合せ」という用語は、化合物が相互に混合されて投与されねばならない、ということを意味するものではないことは理解されねばならない。かくして、このような組合せでの、またはそれを使用することによる処置は、化合物の混合物、または化合物の別個の投与を包含するものであり、また同じ日あるいは別の日での投与も含む。かくして「組合せ」という用語は、２個またはそれ以上の化合物が、個別にあるいは相互に混合されるかのいずれかで処置のために使用されることを意味する。「化合物」という用語は、広い感覚で使用されており、遺伝子治療で使用されるような物質（例えば治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター）などの物質を包含する。
【０００６】
本発明のもう一つの見地に従って、新規なＣＤ４抗体およびその使用法が提供される。
【０００７】
本発明の更なる見地に従って、霊長類に免疫寛容を誘導するための１個の化合物または少なくとも２個の化合物の組合せが提供される。
【０００８】
本発明の更なる見地に従って、薬剤、処置または方法と組合せた新規なＣＤ４抗体が提供される。
【０００９】
本発明の更なる見地に従って、１個の化合物または少なくとも２個の化合物の組合せの使用により、霊長類での免疫寛容を誘導するプロセスが提供され、ここで化合物または組合せは、霊長類でのこのような免疫寛容を誘導する用量処方の使用によるある特性を持ち、望ましい実施例での前記化合物の限定されない例としてはＣＤ４抗体がある。
【００１０】
本発明の更なる見地に従って、１個またはそれ以上の抗原に対する免疫寛容を誘導するのに有用な化合物、または化合物の組合せを同定するためのスクリーニングまたは試験が提供される。
【００１１】
本発明の更なる見地に従って、必ずしもそれに限定されないが、移植片拒絶、移植片対宿主病、必ずしもそれに限定されないが、慢性関節リュウマチ、糖尿病、および多発性硬化などを含む自己免疫疾患、炎症性過程と関連する炎症性疾病と疾患、アレルギー、アナフィラキシー、およびアナフィラキシーと関連する疾病、喘息、がん、および必ずしもそれに限定されないが、ウイルス性感染を含む感染症などを含む疾病または病的状態と関連する症状を処置し、治療しまたは改善する新規な方法が提供される。
【００１２】
本発明の更なる見地に従って、治療薬、例えばタンパク質、ペプチド、細胞、遺伝子治療薬などの治療薬に免疫寛容を誘導する新規な方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の一つの見地に従って、以下に記載の通り１個の化合物または少なくとも２個の化合物の組合せの使用により、抗原に対し霊長類を免疫寛容にするプロセスが提供される。化合物、または組合せは、霊長類に免疫寛容を誘導するのに有効な量および有効な用量処方に従って投与される。化合物、または少なくとも２個の化合物の組合せは、化合物、または前記組合せが不在の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）と比較して一次混合リンパ球反応に存在する場合に、混合リンパ球反応から生じるＣＤ４およびＣＤ２５（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞）両方に正である細胞量を減少させる化合物、または組合せである。望ましい実施例において、化合物、または前記組合せは、このようなＣＤ４＋ＣＤ２５細胞を少なくとも４０％および望ましくは少なくとも６０％、またより望ましくは少なくとも７０％減少させる化合物、または前記組合せである。
【００１４】
望ましい実施例におい、このような化合物、または前記組合せは、一次ＭＬＲで産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を減少させることで（化合物、または薬剤、処置あるいは方法と組合せた前記化合物にこれまで露出されなかった細胞で実行された）一次混合リンパ球反応を阻害する細胞集団を産生する。望ましい実施例において、少なくと１０％の減少があり、望ましく少なくとも２０％の減少がある。ここで記載された混合リンパ球反応を行うプロトコルは、実施例５に記載されている。
【００１５】
更に、望ましい実施例において、化合物、または前記組合せは、一次混合リンパ球反応で産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量を減少させ、細胞集団が二次混合リンパ球反応を阻害するそのような一次混合リンパ球反応で細胞集団を生成する化合物、または前記組合せである。望ましい実施例において、細胞は、化合物、または前記組合せの存在下で実行される一次混合リンパ球反応で生成され、その細胞は、二次混合リンパ球反応に加えられた場合に、付加される細胞が不在である二次混合リンパ球反応の場合と比較して、少なくとも２０％、より望ましくは少なくとも３５％、またより望ましくは少なくとも５０％、このような二次混合リンパ球反応で生成されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を減少させる。
【００１６】
このような細胞集団による一次または二次ＭＬＲのいずれかの阻害は、その細胞集団の不在下で行われるＭＬＲと比較して、ＭＬＲで産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量の減少により立証される。
【００１７】
かくして本発明の一つの見地に従って、霊長類は前に記載の特性（一次およびまたは二次ＭＬＲでｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を減少し、また一次および二次ＭＬＲ両方でこのような減少を望ましくはもたらす細胞集団を生成するこのような一次ＭＬＲで、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの一次ＭＬＲで産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量の減少）を持つ１個の化合物または少なくとも２個の化合物の組合せで処置される。
【００１８】
一つの実施例において、化合物、または前記組合せの存在下で一次ＭＬＲで生成される細胞は、二次ＭＬＲに加えられる時（付加される細胞なしでの二次ＭＬＲと比較すると）、１個またはそれ以上のサイトカイン、とりわけ二次ＭＬＲで１個またはそれ以上のＩＬ−２，ＩＬ−４およびＩＬ−１２の生成を減少し、およびまたは排除する細胞である。一般にＩＬ−２，ＩＬ−４およびＩＬ−１２のこのような少なくとも１個の減少は、少なくとも４０％、望ましくは少なくとも６０％である。
【００１９】
かくして望ましい化合物、または望ましい組合せは、一次ＭＬＲで細胞を生成し、対照と比較して二次ＭＬＲでＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞またはＩＬ−２，ＩＬ−４およびＩＬ−１２の１個またはそれ以上あるいはすべて（望ましくはすべて）の産生を減少させ、また望ましくはこのような細胞およびサイトカイン両方の産生を減少させるものである。
【００２０】
更なる見地に従って、Ｔ細胞を刺激し、増殖を起こす条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞が物質または化合物に露出され、免疫寛容を誘導する能力を試験される化合物、または少なくとも２個の化合物の存在下でこのような露出が行われるスクリーニングまたは試験が提供される。Ｔ細胞増殖試験は、混合リンパ球反応であり、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）あるいはＴＣＲ複合体の成分、例えばＣＤ３成分を通じて非抗原特異的刺激によりＴ細胞が増殖を起こす試験である。典型的には、Ｔ細胞を刺激し、それに増殖を起こすために使用されるのは、抗ＣＤ３モノクローナル抗体である。ＴＣＲ複合体を経由する刺激に加えて、ＣＤ２８などの共刺激分子と結合する抗体の付加により、共刺激シグナルが時には提供される。試験される化合物または薬剤、処置または方法と組合される前記化合物の存在下または不在下で増殖を起こす原因となったＴ細胞は、化合物、または前記組合せの存在が、Ｔ細胞サブセットの産生を阻害したかどうかを確認するために、ＣＤ４正（ＣＤ４＋）およびＣＤ２５正（ＣＤ２５＋）であるＴ細胞のサブセットを確認するように試験される。
【００２１】
免疫寛容誘導活性のための化合物、または前記組合せを試験するために使用されるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、望ましくは混合リンパ球反応（ＭＬＲ）である。混合リンパ球反応は、一般に従来の技術で公知であり、そのプロトコルは実施例５で以下に記載されているが、発明の範囲はそれにより限定されるものではない。
【００２２】
最初の試験で産生される細胞集団は、次いで更に少なくとも１回試験され、ここでｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞は、このような細胞集団がＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の産生を阻害するかどうかを確認するために、増殖を起こしている試験である。
【００２３】
少なくとも更なる１回の試験は、混合リンパ球反応（一次または二次リンパ球反応）であってもよく、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）あるいはＴＣＲ複合体の成分を通じて、もしくはＴＣＲを通じて抗原特異的刺激を擬態する共刺激での非抗原特異的刺激に応答してＴ細胞が増殖を起こす試験であってもよい。
【００２４】
このような試験のプロトコルは、実施例５に記載されているが、本発明の範囲はそれにより限定されるものではない。
【００２５】
望ましい実施例において、免疫寛容を誘導するために使用される化合物、または少なくとも２個の異なる化合物の組合せを確認するスクリーニングまたは試験は、ＭＬＲなどのようなｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖試験で、化合物、または前記組合せが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を減少させるかどうかを確認する最初の試験、および最初の試験で産生された細胞が、一次およびまたは二次ＭＬＲ、更にとりわけ二次ＭＬＲおよびまたは二次ＭＬＲでのサイトカインの産生などの二次Ｔ細胞増殖試験でＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の産生を阻害するかどうかを確認する次の試験、の両方を含む。
【００２６】
望ましい実施例に従って、免疫寛容を誘導するために選択される化合物、または前記組合せは、最初の試験でＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の産生の減少を起こし、前に記載したように第２の試験でこのようなＴ細胞サブセットの産生を減少させる細胞集団を産生し、およびまたはサイトカインの産生および、とりわけ第２試験で１個またはそれ以上のＩＬ−２，ＩＬ−４およびＩＬ−１２を削減する化合物または前記化合物の組合せである。
【００２７】
かくして本発明の一つの見地に従って、選択された化合物、または少なくとも２個の化合物の組合せは、化合物、または前記組合せの不在下での混合リンパ球反応と比較して、一時混合リンパ球反応（ＭＬＲ）などのＴ細胞増殖検定で存在する場合に、混合リンパ球反応から生じるＣＤ４およびＣＤ２５（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞）両方に正である細胞量を減少させる化合物、または組合せである。望ましい実施例において、化合物、または前記組合せは、そのようなＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を少なくとも４０％、また望ましくは少なくとも６０％、また更により望ましくは少なくとも７０％減少させる化合物、または組合せである。
【００２８】
加えて、望ましい実施例において、選択された化合物または組合せは、一次混合リンパ球反応で産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量を減少させ、そのような一次混合リンパ球反応で細胞集団を生成し、その細胞集団が二次混合リンパ球反応を阻害する化合物または組合せである。望ましい実施例において、細胞は、化合物、または前記組合せの存在下で行われる一次混合リンパ球反応で生成され、その細胞は、二次混合リンパ球反応に加えられた時に（付加される細胞の不在下での二次混合リンパ球反応と比較して）、少なくとも２０％、より望ましくは少なくとも３５％、またより望ましくは少なくとも５０％、このような二次混合リンパ球反応で生成されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を望ましくは減少させる。望ましい実施例において、二次ＭＬＲでのこのような細胞は、対照と比較して、ＩＬ−２，ＩＬ−４およびＩＬ−１２の少なくとも１個の産生を少なくとも４０％、また望ましくは少なくとも６０％減少させる。
【００２９】
このような細胞集団による一次ＭＬＲまたは二次ＭＬＲのいずれかの阻害は、このような細胞集団の存在下で行われるＭＬＲと比較してＭＬＲで産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の減少により立証され、また二次ＭＬＲに関連してＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の減少またはサイトカイン産生の減少および望ましくはその両方により立証される。
【００３０】
一つの実施例において、霊長類に免疫寛容を誘導するのに使用される化合物は、抗体（またはその断片）あいは抗体（またはその断片）ともう一つの抗体との組合せ、もしくは抗体以外の化合物である。しかし本発明は、このような抗体の使用に限定させるものではない。
【００３１】
かくして霊長類に免疫寛容を誘導する一つの見地と関連する本発明は、前記特性を持ち、霊長類に免疫寛容を誘導できる化合物の使用を考慮し、その化合物は、単独でまたは１個あるいはそれ以上の他の化合物と組合せて使用することができ、この１個あるいはそれ以上の他の化合物は前記の特性を持つこともあり、または持たないこともあり得る。加えて本発明は、少なくとも２個の化合物の組合せの使用を考慮し、ここで１個またはそれ以上の化合物は、前記の特性を持ち、またはここでこのような組合せの化合物のいずれもが個別には前記の特性を持たないが、組合せられた場合にはこのような特性を持つ。かくして少なくとも２個の化合物の組合せは、その１個またはそれ以上の化合物がそのような特性を持つ結果として、あるいは２個またはそれ以上の化合物の組合せがこのような特性を与える結果として、前記の特性を持つことができる。
【００３２】
ある場合には、本発明の化合物は、免疫抑制剤である化合物と組合せて使用される。免疫抑制剤である化合物は、一般化された免疫抑制をもたらすのに必要な量以下の用量で使用でき、または一般免疫抑制をもたらす用量で使用される。使用される化合物の組合せおよび化合物の相対的量は、霊長類に免疫寛容を誘導するのに有効である。
【００３３】
霊長類に免疫寛容を誘導する前に記載の特性を持つ化合物と組合せて使用される化合物のいくつかの例は、必ずしもそれに限定されないが、リツキサンＴＭ（ジェネンテク）；Ｂ細胞と特異的に結合する抗体；ＩＤ４（リサーチ・ダイアグノスティックス）に限定されないが、それを含むプラズマ細胞に特異的な抗体；セルセプトＴＭ（ロシュ）；シクロスポリン；抗ＣＤ４０Ｌ；抗ＩＬ１２；抗ＩＬ１８；抗インターフェロンガンマ；プロテオソーム阻害薬；ＣＸＣＲ３拮抗薬；１５デオキシスペルグアリン：ＦＫ５０６；ＣＤ２，ＣＤ８およびＣＤ２８などの共刺激分子に向けられる抗モノクローナル抗体、ならびに付着分子に向けられるモノクローナル抗体を含む。
【００３４】
組合せで使用される化合物の更なる限定されない例は、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質を発現する遺伝子治療物質、ペプチド擬似体、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー、ペプチド、小有機分子および抗体を含む。
【００３５】
ここで使用されるように、抗原と関連して「免疫寛容化する」または「免疫寛容である」という用語は、全総合免疫抑制を必要とせずに、処置が停止し、抗原での続く攻撃誘発がなされ、およびまたは抗原が霊長類に存在していても、一定期間にわたり抗原に対する逆免疫応答を産生せず、他の抗原に対する免疫応答を提供できることを意味する。
【００３６】
免疫寛容化または免疫寛容状態は、前に記載のように、本発明の化合物または少なくとも２個の化合物の組合せの有効用量を投与することにより、霊長類に導入することができる。前に記載のように、化合物の組合せを用いる場合には、それらは同時にまたは順次に投与される。
【００３７】
免疫寛容を導入させる抗原は、自己抗原または外来抗原である。
【００３８】
外来抗原は、１個またはそれ以上の下記の型の抗原である。
【００３９】
（ｉ）移植片が同種または異種である器官に存在する組織または細胞を含む移植組織または細胞に存在する外来抗原、
（ｉｉ）霊長類に免疫応答を産生する治療薬（疾病予防に使用される治療薬も含む）であり、その免疫応答が治療薬として機能する薬剤の性能を減少させる治療薬。このような薬剤には、必ずしもそれに限定されないが、遺伝子治療に使用されるベクターなどの送達担体、モノクローナル抗体などの組換えタンパク質、酵素、凝固因子およびいくつかの小分子薬剤、または遺伝子治療薬などの霊長類に送達される薬剤から産生されるタンパク質、
がそれである。
【００４０】
本発明に従って、免疫寛容が誘導される外来抗原は、宿主に感染する疾病の原因となる細菌、真菌、ウイルスなどに存在する外来抗原ではなく、すなわち外来抗原という用語は、霊長類に感染し疾病または疾患を起こす生体の部分としての外来抗原を含まない。
【００４１】
一つの見地に従って、霊長類は、そのような免疫寛容を提供するのに有効な量と時間で、少なくとも１個のＣＤ４抗体またはその断片で、またはもう一つの化合物（ＣＤ４抗体以外の化合物あるいは異なるＣＤ４抗体）と組合せる少なくとも１個のＣＤ４抗体またはその断片で、霊長類を処置することにより、抗原に対し免疫寛容を産生するように処置され、そのような抗原が霊長類に更に存在する場合に霊長類に抗体が存在し、そのような処置で霊長類が抗原に免疫寛容になるようにする。このようなＣＤ４抗体またはその断片、あるいはもう一つの化合物と組合されるＣＤ４抗体またはその断片は、ＭＬＲでｉｎ ｖｉｔｒｏで試験された際に（一次または二次ＭＬＲの少なくとも一つでｉｎ ｖｉｔｒｏで試験された際にそこに産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量を減少させる一次ＭＬＲで産生される細胞集団で、一次ＭＬＲで産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量を減少させる）前に記載の特性を持つ。
【００４２】
ＣＤ４抗体は、望ましくはモノクローナル抗体（またはＣＤ４に結合する能力を持つその断片）である。抗体はヒト抗体または非ヒト抗体であることができ、非ヒト抗体はヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体などを含む。
【００４３】
ＣＤ４抗体またはその断片、あるいはもう一つの化合物と組合される少なくとも１個のＣＤ４抗体またはその断片は、外来抗原または自己抗原および望ましくは外来抗原に免疫寛容を誘導するのに有効な量と時間で霊長類に投与される。
【００４４】
望ましい実施例に従って、ＣＤ４抗体またはその断片は、このような抗体または断片の適切な水準を霊長類で維持するために、あるいは前記抗体または断片が前に記載のもう一つの化合物と組合せて免疫寛容を誘導するのに十分な期間にわたり前記組合せの有効用量で使用される場合にその期間にわたり投与される。
【００４５】
一般に抗体（またはその断片）は、少なくとも約４０ｍｇ、望ましくは少なくとも約５０ｍｇおよびより望ましくは少なくとも約７０ｍｇを単独で、またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて最初の用量で投与される。
【００４６】
望ましい実施例において、当初用量は少なくとも４００ｍｇ，望ましくは少なくとも約５００ｍｇ、および特定の実施例で少なくとも約７００ｍｇの量であり、単独、または前に記載のもう一つの化合物と組合される。
【００４７】
当初の用量は２４時間に１回またはそれ以上の用量で、および望ましくは２４時間に１回の用量で、単独または前に記載のもう一つの化合物と組合せて投与される。
【００４８】
用量がここで使用されるように、２４時間に１回以上単独またはここで記載のもう一つの化合物と組合せて投与される場合であっても、用量は２４時間にわたり投与される抗体の全量である。
【００４９】
大抵の場合、当初用量の後に、ＣＤ４抗体（またはその適当な断片）は、数日間１個もしくはそれ以上の追跡用量で投与され、各追跡用量は２４時間で１個またはそれ以上の用量で単独またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて投与される。追跡用量は、抗体の血清水準を当初用量で達成された水準に戻す量で単独またはここに記載されたもう一つの化合物と組合せて提供される。
【００５０】
望ましい実施例において、最小追跡用量は、ここに記載の量に少なくとも等しい量であり、もとのまたは当初用量単独あるいはここに記載のもう一つの化合物と組合せて与えられる用量と同じであり、またはそうでない場合もある。かくして追跡用量は、一般に少なくとも４０ｍｇ、望ましくは少なくとも５０ｍｇ、およびより望ましくは少なくとも７０ｍｇを単独であるいはここに記載のもう一つの化合物と組合せる量である。前に記載の通り、一つの望ましい実施例において、追跡用量は少なくとも４００ｍｇ、望ましくは少なくとも５００ｍｇ、また特定の実施例では、少なくとも７００ｍｇ、単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合された量である。ある場合には、追跡用量は、単独またはここで記載されたもう一つの化合物と併用して最小量以下の場合もある。
【００５１】
１個以上の追跡用量がある場合には、２４時間にわたるこのような各追跡用量は、単独またはここで記載のもう一つの化合物と組合されるもう一つの追跡用量と同じまたは異なる場合もある。
【００５２】
追跡用量の回数は変化するが、望ましい実施例において、一般に少なくとも１回の追跡用量、および大抵の場合７回以下の追跡用量があり、すなわち用量の回数は単独でまたはここで記載されたもう一つの化合物との組合せで８回の用量を越えることはない。
【００５３】
抗体が投与される全期間は、一般に４週を越えることはなく、より望ましくは単独でまたはここで記載されたもう一つの化合物との組合せで３週を越えない。多くの場合免疫寛容は、当初用量および１回またはそれ以上の追跡用量を、単独またはここで記載されたもう一つの化合物との組合せで２週間を越えない期間に使用することで達成される。
【００５４】
本発明に従って、抗原に対する当初の免疫寛容は４週以下の期間で霊長類で達成できるけれども、ある場合には免疫寛容を維持するために、抗体単独でまたはここで記載されたもう一つの化合物と組合せで周期的な追跡処置が必要とされる場合もある。
【００５５】
前に記載されたように、少なくとも１個のＣＤ４抗体（またはその適切な断片）は、抗原に対し、また望ましい実施例では外来抗原に対し、単独でまたはここに記載したもう一つの化合物と組合せて、霊長類に免疫寛容を誘導するのに十分な量で送達される。最大量は勿論安全を考慮して限定される。一般に抗体の１日用量は、単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合せて６０００ｍｇ以下となるであろう。
【００５６】
追跡用量の回数とその間隔とりは、部分的には少なくとも１個のＣＤ４抗体の半減期により決定される。本発明はそれにより限定されるものではないが、ＣＤ４抗体は処置される霊長類のすべてのＣＤ４を飽和するのに必要な量を超える抗体血清水準を達成する量で当初送達され、追跡用量は単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合せて抗原に対し霊長類に免疫寛容を誘導する期間にわたりそのような超過を維持するために時々与えられる。
【００５７】
望ましい実施例において、ＣＤ４抗体は、ヒトＩｇＧ１と比較して減少エフェクター（すなわち溶解）機能を持つＣＤ４抗体である。減少エフェクター機能を持つ代表的な例としては、非糖鎖付加Ｆｃ部分を持ち、およびまたはＦｃ受容体へ結合が減少し、およびまたは非溶解性である抗体を挙げることができる。
【００５８】
一つの実施例では、減少エフェクター機能を持つＣＤ４抗体は、非枯渇ＣＤ４抗体である。ここで使用されるように、「非枯渇Ｃ４抗体」はＣＤ４細胞を５０％以下枯渇する抗体であり、望ましくはＣＤ４細胞を１０％以下枯渇する抗体である。
【００５９】
霊長類、およびとりわけヒトを処置する場合、ＣＤ４抗体は薬理許容担体のみと組合せ、あるいはここに記載のもう一つの化合物と組合せて採用される。ＣＤ４抗体を含む組成物は、他の成分、例えば安定剤およびまたは他の活性剤単独であるいはここに記載のもう一つの化合物を組合せて含むこともある。
【００６０】
本発明に従って、霊長類の抗原に免疫寛容を誘導するＣＤ４抗体単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合わせるＣＤ４抗体の使用法は、１個またはそれ以上の抗原に免疫寛容を提供し、霊長類は他の抗原に免疫学的に応答することができる。かくしてこの点に関し、霊長類は、１個またはそれ以上の抗原に免疫寛容化され、また免疫系は、他の外来抗原に対し免疫応答を提供することが可能となり、このため霊長類な免疫無防備ではなくなる。
【００６１】
免疫寛容が抗原に対して導入される望ましい実施例において、ＣＤ４抗体は、抗原が単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合せて送達される前に、それと同時に、または送達後に霊長類に投与される。望ましい実施例において、霊長類は、抗体が霊長類に存在するようにＣＤ４抗体を単独で、またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて一度に投与される。とりわけ望ましい実施例において、単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合されるＣＤ４抗体（またはその断片）は、その後、数時間または１日以下で霊長類が免疫寛容になる抗原に霊長類を接触させる前に霊長類に送達される。望ましい実施例において、抗体単独またはここに記載されたもう一つの化合物と併用された抗体は、抗原を受け入れる霊長類に対し、約２日前、望ましくは１日前に投与される。
【００６２】
前に記載したように、一つの実施例において、霊長類は、霊長類を処置するのに使用される治療用タンパク質に対し免疫寛容化される。このような治療用タンパク質は（ＣＤ４抗体以外の）治療用抗体であり、この治療用抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または非ヒト抗体；代償療法で使用されるものなどの酵素；ホルモン；凝固因子；遺伝子治療で産生されるタンパク質；単独またはここで記載されたもう一つの化合物と組合せて遺伝子治療で使用されるベクターなどの遺伝子治療送達伝達体（例えばアデノウイルスベクター）などであることができる。
【００６３】
本発明は、更に免疫寛容が、化合物またはここに記載された２個またはそれ以上の化合物の組合せで誘導され、そのような化合物または組合せが治療用タンパク質に対し免疫寛容を誘導するような治療用タンパク質を含むキットまたはパッケージを考慮する。
【００６４】
外来抗原は、移植された器官，細胞治療に使用された移植細胞、または皮膚などの他の組織移植片に存在する。
【００６５】
霊長類をＣＤ４の使用により外来抗原に対し免疫寛容にするために、霊長類、とりわけヒトの処置は、外来抗原の免疫およびまたはＴ細胞の枯渇およびまたは免疫抑制を促進するための骨髄移植などのようなアジュバンド治療なしである場合には達成することができる。
【００６６】
限定されない一つの実施例において、抗体は望ましくはＴＲＸ１抗体（ここで以下に記載したもの）、すなわちここで以下に記載されているＴＲＸ１と同じエピトープに結合する抗体であり、このような抗体は、単独でまたはここで記載された薬剤、処置または方法と組合せてここで記載された用量処方で望ましくは使用される。
【００６７】
本発明の見地に従って、図１で示されるヒト化抗体、および図２で示されるヒト化抗体、更に図３で示されるヒト化抗体、また図４で示されるヒト化抗体より成るグループから選択されるヒト化抗体としてヒトリンパ球と同じエピトープ（またはその部分）と結合する分子（望ましくはヒト化抗体またはその断片）が提供される。
【００６８】
抗体は、以下で時々ＴＲＸ１として引用される。「分子」または「ＴＲＸ１と同じエピトープに結合する抗体」はＴＲＸ１を含む。「ＴＲＸ１」という用語は、図１で示される抗体、図２で示される抗体、および図３で示される抗体の一つおよび図４で示される抗体の一つを含み、例えば組み換え技術で産生されるそれらと同一のものを含む。
【００６９】
望ましい抗体はＴＲＸ１であるけれども、ここでの教示から当業者はＴＲＸ１に同等の抗体を産生することができる。そのようなＴＲＸ１同等抗体の代表的で限定されない例として、以下のものがある。
【００７０】
１）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するヒト化抗体、
２）ＴＲＸ１と同じＣＤＲｓを持つが、異なるヒト化フレームワークおよびまたは異なるヒト定常領域を持つヒト化抗体、
３）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するヒト化抗体であって、ここで、ＴＲＸ１の１個またはそれ以上のＣＤＲｓの１個またはそれ以上のアミノ酸が変化しており（望ましくは必ずしも保存アミノ酸置換である必要はなく）、またここで、フレームワークは、ＴＲＸ１と同じフレームワークであってもよく、あるいは異なるヒト化フレームワークを持つこともあり、あるいはここでＴＲＸ１のフレームワーク領域の１個またはそれ以上のアミノ酸が変化しており、およびまたはここで、定常領域がＴＲＸ１と同じまたは異なっていてもよいヒト化抗体、
４）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するヒト化抗体であって、ここで抗体が受容体のＦｃ領域に結合しないヒト化抗体、
５）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するヒト化抗体であって、ここでそのＣＤＲｓがグリコシル化（糖鎖付加）部位を含まないヒト化抗体、
６）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合し、また受容体のＦｃ領域と結合せず、更に、ＣＤＲｓはグリコシル化（糖鎖付加）部位を含まないヒト化抗体、
７）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するキメラ抗体、および
８）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するマウス抗体。
【００７１】
ＴＲＸ１と同等である抗体は、ＴＲＸ１と同じやり方でまた同じ目的に使用することができる。
【００７２】
本発明の分子または抗体は、動物、とりわけヒトを処置する方法に使用され、とりわけ抗原に免疫応答に誘導することを含む、外来抗原または自己抗原である抗原への免疫応答を阻害し、改善し、または減少する用途に使用することができる。分子または抗体は、クラスＩ提示抗原およびまたはクラスＩＩ提示抗原への免疫応答を阻害し、改善し、または減少するのに使用できる。分子または抗体は、このような抗原への免疫応答を阻害し、改善し、または減少するのに使用される。移植片の場合、例えばクラスＩおよびクラスＩＩ主要組織適合（ＭＨＣ）抗原および非ＭＨＣまたは副組織適合抗原が提示される。移植抗原とは別に、分子または抗体は、球状タンパク質、免疫グロブリンなどの糖タンパク質、花粉タンパク質などの粒子を運搬する物質、インターフェロン、インターロイキン２または腫瘍懐死因子などの治療用途を意図したポリペプチド、または黄体ホルモン、その類似体および拮抗薬などのホルモン置換物、などの免疫応答を阻害し、改善し、または減少するために使用することができる。免疫応答が阻害され、改善され、または減少されることのできる更なる特異的抗原は、受容体遮断を助けるために使用されるタンパク質治療薬の合成ペプチド相似体、および同種抗原は、組織移植または皮膚移植における外来組織の拒絶の原因となる。ここで使用される「抗原」という用語は、動物、望ましく霊長類、より望ましくはヒトにおける免疫応答に免疫寛容を誘導するサブスタンス物質である。免疫応答は、体液性応答を伴い、または伴わないＴ細胞応答である。
【００７３】
本発明の分子または抗体は、Ｔ細胞活性化および増殖を阻害し、およびまたは変更し、また出願人は、Ｔ細胞活性化を刺激する薬剤を単独で、あるいはここに記載の薬剤、処置または方法と組合せる薬剤の前または後のいずれかに本発明の分子または抗体を加えることで、そのような阻害を実現できることを発見した。
【００７４】
本発明の分子または抗体は、ＣＤ４抗原（ＣＤ４正ヒトＴ細胞）のエピトープに結合する特性を持つが、しかし抗体がＴ細胞上でＣＤ４抗原に結合するというように機能するものと考えられているけれども、抗体は他の細胞、例えば単球上のＣＤ４抗原と結合することで機能する、ということは理解されねばならない。結果として、Ｔ細胞の活性化または増殖を阻害し、およびまたは変更するこのような分子または抗体の能力は、ＣＤ４正細胞との結合を通して実行される場合もあり、そうでない場合もある。
【００７５】
本発明のもう一つの見地に従って、以下でＴＲＸ１（またはその断片あるいは誘導体）として引用する抗体、またはＴＲＸ１と同じエピトープに結合するこのような抗体または誘導体あるいはその断片を擬態するいずれかの分子の患者への投与を通じて、ヒト患者に進行中の免疫応答を予防しおよびまたは阻害する方法が提供される。
【００７６】
本出願を通じてここで使用される「阻害する」という用語は、一つまたはそれ以上の抗原に対する免疫応答の予防、または阻害、あるいは発病度の減少、もしくは改善を意味することを意図する。抗原は、外来抗原または自己抗原である。本出願の目的のためにここで使用される「移植」という用語は、必ずしもそれに限定されないが、同種移植または異種移植を含むいずれかまたはすべての移植を意味する。このような移植は、例として必ずしもそれに限定されないが、細胞、骨髄、組織、固形器官、骨などの移植を含む。
【００７７】
ここで使用される「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞活性化および増殖に依存する免疫応答を意味することを意図し、それは細胞性効果とＴ細胞依存性抗体の両方を含み、例としてまた限定されないものとして、（ｉ）移植片、（ｉｉ）移植片対宿主病、（ｉｉｉ）例によりまた必ずしもそれに限定されないが、慢性関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性硬化、真性糖尿病などを含む自己免疫疾患で生じる自己抗原などに対し応答して引出されるものである。
【００７８】
本発明で採用される化合物は、ＴＲＸ１ヒト化抗体と同じエピトープ（またはそのエピトープの一部）と結合する化合物である。「ＴＲＸ１ヒト化抗体と同じエピトープに結合する」という用語は、必ずしもＴＲＸ１ヒト化抗体だけでなく、ＴＲＸ１ヒト化抗体と同じエピトープに結合する他の抗体、その断片または誘導体あるいは分子を記載するものと意図される。
【００７９】
このような分子は望ましくは抗体であるが、核酸アプタマーも含む。望ましい実施例において、抗体は抗体のＦｃ領域を通じてＦｃ受容体と結合せず、またＣＤＲｓはグリコシル化部位を含まない。
【００８０】
定常領域は、グリコシル化部位を含むことができ、または含まないこともある。一つの実施例において、定常領域はグリコシル化部位を含む。グリコシル化部位を含む重鎖配列の一つの例は、図１Ｄおよび図１Ｆまた図３Ｄならびに図３Ｆで示される。もう一つの実施例において、定常領域はグリコシル化部位を含まない。グリコシル化部位を含まない重鎖配列の１例は、図２Ｄおよび図２Ｆまたは図４Ｄならびに図４Ｆで示される。
【００８１】
このような他の抗体は、例によってまたそれに限定されないが、ラット、マウス、ブタ、ウシ、ヒト、キメラ、ヒト化などの抗体、またはその断片あるいは誘導体である。
【００８２】
ここで使用される「断片」という用語は、抗体の部分を意味するが、例に従ってこのような抗体の部分は、必ずしもそれに限定されないが、ＴＲＸ１で認識される同じエピトープまたはそのいずれかの部分に結合するＣＤＲ、Ｆａｂ、またはそのような他の部分を含む。
【００８３】
ここで使用される「抗体」という用語は、ヒト化抗体ＴＲＸ１により認識される同じエピトープまたはその部分に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体、同じく抗体断片および誘導体、同じく組換え技術により調製される抗体、例えばキメラまたはヒト化抗体、一本鎖または二重特異性抗体、などを含む。「分子」という用語は、例に従いまた限定されることなく、抗体を擬態し、または抗体断片あるいはその誘導体の同じエピトープまたはその部分と結合するいずれかの源から誘導されるペプチド、オリゴヌクレオチドまたは他のそのような化合物を含む。
【００８４】
本発明のもう一つの実施例は、ＴＲＸ１抗体単独で、またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて同じエピトープ（またはその部分）と結合するＴＲＸ１抗体、または抗体、あるいはその誘導体または断片もしくは分子と同じエピトープ（またはその部分）より成るグループから選択される少なくとも１個の部材の有効量で移植片移植を受けるまたは既に受けている患者を処置する方法が提供されている。この処置は、望ましくは全あるいは無償ＴＲＸ１抗体単独で、またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて実行される。
【００８５】
一つの実施例において、抗体は、ヒト抗体の修飾された定常領域および軽鎖と重鎖フレームワーク領域およびＣＤＲ領域を含むヒト化抗体であるＴＲＸ１であり、ここで軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域として一致し、またマウスモノクローナル抗体から誘導されるＣＤＲｓは、ＮＳＭ４．７．２．４と名付けられる。ＴＲＸ１抗体は図１で示される。図１Ａは、ＴＲＸ１軽鎖のアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図１Ｂは、ＴＲＸ１軽鎖核酸配列を示す。図１Ｃは、ハイライトＣＤＲｓを持つＴＲＸ１軽鎖アミノ酸配列を示す。図１Ｄは、グリコシル化部位を含むＴＲＸ１重鎖のアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図１Ｅは、ＴＲＸ１重鎖ヌクレオチド配列を示す。図１Ｆは、ＴＲＸ１重鎖アミノ酸配列を示し、それはハイライトＣＤＲｓを持つグリコシル化部位を含む。
【００８６】
もう一つの実施例において、抗体はＴＲＸ１であり、これはヒト抗体の修飾定常領域および軽鎖、重鎖フレームワーク更にＣＤＲ領域を含み、ここで軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域のフレームワークに一致し、またマウスモノクローナル抗体から誘導されたＣＤＲは、ＮＳＭ４．７．２．４と名付けられる。ＴＲＸ１抗体は、図３で示される。図３Ａは、ＴＲＸ１軽鎖のアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図３Ｂは、ＴＲＸ１軽鎖核酸配列を示す。図３Ｃは、ハイライトＣＤＲｓを持つＴＲＸ１軽鎖アミノ酸配列を示す。図３Ｄは、グリコシル化部位を含むＴＲＸ１重鎖のアミノ酸およびＤＮＡ配列を含む。図３Ｅは、ＴＲＸ１重鎖ヌクレオチド配列を示す。図３ＦはＴＲＸ１重鎖アミノ酸配列を示し、それはハイライトＣＤＲｓを持つグリコシル化部位を含む。
【００８７】
ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例は、図２で示される。図２Ａは軽鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図２Ｂは、軽鎖核酸配列を示す。図２Ｃは、ハイライトＣＤＲｓを持つ軽鎖アミノ酸配列を示す。図２Ｄは、重鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図２Ｅは、重鎖ヌクレオチド配列を示す。図２Ｆは、ハイライトＣＤＲｓを持つ重鎖アミノ酸配列を示す。
【００８８】
ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例は、図４で示される。図４Ａは、軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図４Ｂは、軽鎖核酸配列を示す。図４Ｃは、ハイライトＣＤＲｓを持つ軽鎖アミノ酸配列を示す。図４Ｄは、重鎖のアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図４Ｅは、重鎖ヌクレオチド配列を示す。図４Ｆは、ハイライトＣＤＲｓを持つ重鎖アミノ酸配列を示す。
【００８９】
各図においては、アミノ酸残基１は、各重鎖および軽鎖でリーダー配列後の第１アミノ酸である。それは更に配列内でのＦＲ１の第１残基である。
【００９０】
本発明の目的に適したＴＲＸ１ヒト化抗体の調製は、ここでの教示から従来の技術に習熟した人にとっては明らかなものである。このような抗体は、当業者に公知の組換え技術により調製することができる。
【００９１】
本発明の抗体は、単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合せてこのような免疫応答を阻害する有効量で抗体（またはその断片）を投与することで動物の免疫応答を阻害するのに使用することができる。
【００９２】
例えばある場合には、治療薬を用いる処置は、治療薬に対する免疫応答を含む。このような治療薬の代表的な例として、レオプロおよびＯＫＴ３などのモノクローナル抗体、必ずしもそれに限定されないが、ゴシエ病用グルコセレブロシダーゼなどの代償療法のための酵素および因子ＶＩＩＩなどの凝固因子、およびアデノウイルス誘導ベクターなどの遺伝子治療および遺伝子治療送達伝達体などがあげられる。
【００９３】
本発明の一つの見地に従って、前に記載の抗体（またはこのような抗体の断片）は、このような治療薬で処置される患者に投与され、抗体（または断片）は治療薬に対し免疫応答を阻害する有効量で投与される。抗体は治療薬の投与の前に、またはそれと組合わせて、あるいはその投与の後で投与される。投与の方法は、必ずしもそれに限定されないが、特異的な徴候、特異的な治療薬および最適用量スケジュールを含む各種の因子に依存する。治療薬の投与の前に投与される場合には、抗体は治療薬の投与の約１時間乃至約１０日前、望ましくは治療薬投与の約１時間乃至約２４時間前に投与される。治療薬の投与の後に投与される場合には、抗体は治療薬投与の約１時間乃至約１０日後、望ましくは治療薬投与の約１時間乃至約２４時間後に投与される。
【００９４】
投与される抗体の量、抗体が投与される用量スケジュールおよび回数は、治療薬および治療薬で患者を処置するために使用される処方に依存する。
【００９５】
一般に抗体は、提供される用量当り０．１ｍｇ乃至３ｍｇの量で使用されるが、霊長類に免疫寛容を誘導するに際しては、抗体は望ましくは前に記載の量で使用される。
【００９６】
本発明の抗体は、更に自己抗原およびまたは外来抗原に対し、例えば移植片（例えば移植片拒絶）に対し、免疫応答を阻害するため、およびまたは移植片対宿主の免疫応答を阻害または改善するために使用することができる。
【００９７】
本発明の抗体は、更に遺伝子治療産物に対する免疫応答、同じく遺伝子治療の有効性を制限するアデノウイルス誘導ベクターなどの遺伝子治療送達伝達体に対する免疫応答を阻害するために使用することができる。
【００９８】
かくして宿主にある抗原への免疫応答は、ＴＲＸ１抗体を抗原と共に投与することにより、阻害し、改善しまたは減少することができる。患者は器官移植片または骨髄移植片などの組織移植片を与えられ、およびその拒絶を阻害するために、移植片と共にＴＲＸ１抗体を与えられる。長期の特異的免疫寛容は、自己免役疾病を処置するために自己抗原または抗原に誘導することができる。
【００９９】
免疫寛容を維持するために、持続的または周期的な抗原の存在が必要とされる。例えば、組織移植片は、それ自身に免疫寛容を維持するために抗原を供給する。アレルゲンなどの異質外来抗原の場合には、抗原「催促状」（抗原継続投与）を決まった間隔で与えることができる。
【０１００】
本発明に従って、前に記載のタイプの抗体またはその断片あるいは分子は、Ｔ細胞の活性化および増殖を阻害し、細胞表面の機能的ＣＤ４発現の密度を減少させ、およびまたはシグナル伝達に影響を与えてこれによりＣＤ４＋Ｔリンパ球の機能性およびまたはＣＤ４＋Ｔリンパ球数を減少させるために、ｉｎ ｖｉｖｏ単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合せて投与することができる。
【０１０１】
かくして例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの手順において、このような抗体は、免疫応答を予防およびまたは阻害し、それによりＴ細胞活性化おえび増殖を阻害するために投与される。
【０１０２】
本発明の一つの見地に従って、前に記載のタイプの抗体またはその断片あるいは分子は、細胞表面の機能的ＣＤ４＋発現の密度を減少しおよびまたはシグナル伝達に影響を与え、かくしてＣＤ４＋Ｔリンパ球の機能性およびまたは供与者体細胞のＣＤ４＋細胞数を減少するために、ｅｘ ｖｉｖｏで単独またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて投与することができる。例に従い、また制限することなく、ｅｘ ｖｉｖｏでの手順において、このような抗体またはその断片あるいは誘導体もしくは分子は、移植にあたり移植片対宿主病の発症を予防するために、移植の前に供与体の骨髄に注入されることとなる。
【０１０３】
抗体またはその断片は、単独またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて薬理許容担体で一般に投与される。このような薬理担体の代表的な例として、通常の生理食塩水、緩衝液などを言及することができる。このような薬理担体は、従来の技術で公知であり、適切な担体の選択は、ここに含まれる教示から通常の知識を有する人の範囲内にあるものと見做される。
【０１０４】
本発明のＴＲＸ１抗体または他の抗体は、単独またはここに記載の薬剤、処置または方法と組合せて静脈内、皮下、または筋肉内投与でｉｎ ｖｉｖｏで投与される。
【０１０５】
前に記載したように、本発明のＴＲＸ１抗体または他の抗体は、単独またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて抗原に対する免疫応答を阻害する有効量でｉｎ ｖｉｖｏで投与される。本出願の目的のための「有効量」という用語は、望ましい効果を産生できる抗体量を意味する。一般にこのような抗体は、用量当り少なくとも０．１ｍｇの量で投与される。それより少ない量でも使用できることも理解されねばならない。当初の処置後更に、前に記載の量は、続く処置の段階がもし必要であればその段階で減少される。発明の範囲は、このような量で限定されるものではない。しかし霊長類に免疫寛容を誘導するために、抗体は前に記載の量で使用されねばならない。
【０１０６】
本発明のＴＲＸ１抗体または他の抗体は、抗原に免疫寛容を誘導するために、単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合せて採用することができる。ここで使用される「免疫寛容」という用語は、Ｔ細胞非応答が、攻撃誘発の場合にあってさえ、抗体処置の停止後においても抗原に対して持続することを意味する。しかしもし必要である場合には、このような免疫寛容を維持するために、抗体のブースターまたは追加抗原投与用量を与えることができる。
【０１０７】
Ｔ細胞の活性化を阻害する本発明の技術は、単独でまたは他の処置、薬剤、方法、例えばＴ細胞の活性化を阻害する他の処置、薬剤または方法、あるいは移植体拒絶または移植片対宿主病を阻害し、あるいは各種の自己免役疾病を処置する、などの他の処置、薬剤または方法と組合せて採用することができる。霊長類に免疫寛容を誘導する化合物と組合わせて使用されるこのような薬剤、処置または方法のいくつかの例は、必ずしもそれに限定されないが、リツキサンＴＭ（ジェネテック）；Ｂ細胞に特異的な抗体；限定されないがＩＤ４（リサーチ・ダイアグノスティクスを含むプラズマ細胞に特異的な抗体；セルセプトＴＭ（ロシュ）；シクロスポリン；ラパマイシン；抗ＣＤ４０Ｌ；抗ＩＬ１２；抗ＩＬ１８；抗インターフェロンガンマ；プロテオソーム阻害薬；ＣＸＣＲ３拮抗薬；１５デオキシスペルグアリン；ＦＫ５０６；ＣＤ２，ＣＤ８およびＣＤ２８などの共刺激分子に向けられるモノクローナル抗体並びに付着分子に向けられるモノクローナル抗体を含む。
【０１０８】
本発明の抗体は、更に例えば血液試料などの試料でＣＤ４正細胞の存在を決定するための選択方法で採用される。このような方法においては、試料は分子または抗体と接触され、またＣＤ４正細胞の存在が確認され、およびまたはＣＤ４正細胞は、次いで試料から選択または単離することができる。
【０１０９】
望ましい実施例において、ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するＴＲＸ１抗体または抗体は、霊長類（とりわけヒト）での抗原に対する免疫寛容を誘導するために、単独またはここで記載の薬剤、処置または方法と組合せて採用される。
【実施例】
【０１１０】
本発明は、これから以下の実施例と関連して記載される。しかし本発明の範囲は、それにより制限されることを意図するものではない。
【０１１１】
実施例１
ｃＤＮＡライブラリーが、製造メーカの示唆するプロトコルに従って、スーパースクリプトプラスミドシステム（ジブコ／ＢＲＬ，カタログ番号８２４８５Ａ）を用いてマウスハイブリドーマＮＳＭ４．７．２．４から構築された。重鎖および軽鎖ｃＤＮＡは、ラットハイブリドーマＹＴＳ１７７からのラット重鎖および軽鎖遺伝子ｃＤＮＡをプローブとして使用するＤＮＡハイブリダイゼーションにより、ライブラリーからクローンされた。
【０１１２】
ＹＴＳ１７７のラット重鎖および軽鎖遺伝子ｃＤＮＡｓは、ＢａｍＨＩ／Ｓａ１Ｉ断片として発現ベクターｐＨＡ Ｐｒ−１から単離され、３２Ｐで標識され、標準分子生物学的手法を用いてＮＳＭ４．７．２．４．ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために個別に使用された（サムブルック，他，分子クローニング，実験室マニュアル，第３版，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（２００１年）；オースベル，他、分子生物学における現行のプロトコル，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ，ニューヨーク（２００１年）．ＮＳＭ４．７．２．４．ｃＤＮＡライブラリーから誘導されたｃＤＮＡｓの配列分析は、ＮＳＭ４．７．２．４重鎖がマウスガンマ−１サブクラスであり、ＮＳＭ４．７．２．４軽鎖がカッパであることを確認した。ＮＳＭ４．７．２．４重鎖および軽鎖Ｖ領域（それぞれＶＨおよびＶＬ）はヒトＶＨおよびＶＬ領域に「ベストフィット」すなわちマウスのそれとフレームワーク領域で最高の類似性を持つように変形された。軽鎖として、７９％の配列類似性を持つヒト抗体ＨＳＩＧＫＡＷ（ＥＭＢＬよりのもの）が使用された（ＬＡ スパッツ他，１９９０年，免疫学ジャーナル，１４４巻：２８２１−２８２８ページ）．ＨＳＩＧＫＡＷ ＶＬの配列は以下の通りである。
【０１１３】
【０１１４】
フレームワーク１の出発点Ｄ（アミノ酸残基）
ＱのＧへの変化
重鎖として、７４％の配列類似性を持つヒト抗体Ａ３２４８３（ジェンバンクよりのもの）が使用された（ラリック，他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１６０巻；１２５０−１２５６ページ（１９８９年））。Ａ３２４８３ ＶＨの配列は以下の通りである。
【０１１５】
【０１１６】
フレームワーク１の出発点Ｑ（アミノ酸残基）
ヒト化過程として、抗ＣＤ４軽鎖クローン７７．５３．１．２（１キロベースの挿入サイズ）および抗ＣＤ４重鎖クローン５８．５９．１（１．７キロベースの挿入サイズ）が、Ｓａ１Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ断片としてｐＳｐｏｒｔベクターから単離されたｃＤＮＡライブラリーおよび挿入片から選択され、配列化のための一本鎖ＤＮＡおよび突然変異誘発のための鋳型を産生するために、Ｍ１３ｍｐ１８ベクターにクローンされた。ＮＳＭ４．７．２．４のヒト化は、製造業者指示のプロトコルに従って、エイマシャム・インターナショナルのキット（ＲＰＮ１５２３）を用いてマウスｃＤＮＡの部位指向突然変異誘発で行われた。
【０１１７】
ＶＬ遺伝子フレームワーク領域の突然変異誘発は、２９乃至７６塩基の長さにわたる５個のオリゴヌクレオチドを用いて行われた。使用されたオリゴヌクレオチドは以下のものであった。
【０１１８】
【０１１９】
オリゴヌクレオチドは、リン酸化され、下記の手順に従って変化を導入するために、突然変異誘発が各ステップで２個以下のオリゴヌクレオチドを用いて３ステップで行われた。
【０１２０】
（１）リン酸化突然変異体オリゴヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡ鋳型へのアニーリング
（２）重合
（３）一本鎖ＤＮＡを除去するための濾過
（４）Ｎｃｉ Ｉでの非突然変異鎖のニッキング
（５）Ｅｘｏ ＩＩＩでの非突然変異鎖の消化
（６）ギャップＤＮＡの再重合
（７）コンピテントＪＭ１０１の形質転換
（８）クローンの配列化
突然変異は、Ｍ１３プライマー−２０および−４０、ならびに突然変異誘発プライマー＃１９９９および＃２０００を用いて、一本鎖ＤＮＡ配列化により確認された。
【０１２１】
可変領域の５′末端でのＳａｌ Ｉ部位は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｋｐｎ Ｉ他断片としての可変領域のＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈの軽鎖定常領域へのクローニングを許すことで、リンカーオリゴヌクレオチド＃２３３４および＃２３３５によりＨｉｎｄ ＩＩＩに変更された。
【０１２２】
【０１２３】
ＶＨ遺伝子フレームワーク領域の突然変異誘発は、２４乃至７５塩基長にわたる５個のオリゴヌクレオチドを用いて行われた。使用されるオリゴヌクレオチドは以下の通りである。
【０１２４】
【０１２５】
突然変異誘発は、変化を導入するため時に応じて２個以下のオリゴヌクレオチドを用いて、前に記載のように再び軽鎖に対して行われた。突然変異は、Ｍ１３プライマー−２０および−４０同じく突然変異誘発プライマー＃２００２および＃２００４を用いる一本鎖ＤＮＡ配列化により確認された。
【０１２６】
プライマー＃２００２は、開始クローン５８．５９．１でのリーディングフレームワークのエラーを訂正するために使用された。
【０１２７】
【０１２８】
プライマー＃２３８０は、最初の配列化で外された＃２００４を加えた余分の突然変異を訂正するために使用された。
【０１２９】
【０１３０】
軽鎖と同じように、重鎖５′Ｓａ１ Ｉ部位は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｓｐｅ Ｉ（プライマー＃２００７により導入された部位）断片として重鎖可変領域のＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈの重鎖定常領域へのクローニングを許すことで、リンカーオリゴヌクレオチド＃２３３４および＃２３３５を用いてＨｉｎｄ ＩＩＩに変更された。
【０１３１】
重鎖の構築
ＤＮＡの下記の試料が使用された。
【０１３２】
１．プラスミド１９９０
ｐＵＣ１８にクローンされたヒトガンマ−１重鎖定常領域遺伝子
（ウエルカム・ファンデーション・リミテッド；マーティン・シムズより入手）
２．プラスミド２３８７
ヒトフレームワーク領域およびマウスガンマ１定常領域を含むＮＳＭ４．７．２．４の再形成重鎖
【０１３３】
再形成ＣＤ４重鎖でのＳａｌ Ｉ部位は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位に変更された。可変領域遺伝子は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｓｐｅ Ｉでの消化により切りとられ、完全なヒト化重鎖（プラスミド２４８６）を与えるためにプラスミド１９９０の定常領域遺伝子と結合された。重鎖遺伝子はＨｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲ Ｉでこのプラスミドから切断され、発現ベクターｐＥＥ６と結合された。
【０１３４】
軽鎖の構築
ＤＮＡの下記の試料が使用された
１．プラスミド２０２８
ＳａｌＩ／ＢａｎＨ Ｉ制限部位でＭ１３ｍｐ１８にクローンされたＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ軽鎖遺伝子
２．プラスミド２１９７
ヒトフレームワーク領域およびマウスカッパ定常領域を含むＮＳＭ４．７．２．４の再形成軽鎖のＫｐｎ Ｉ部位は既にこの遺伝子の可変部分と定常部分の間に導入されている。
【０１３５】
Ｋｐｎ Ｉ制限部位は、プラスミド２１９７にある部位と対応するＣＡＭＰＡＴＨ １Ｈ軽鎖遺伝子に導入され、ＥｃｏＲ Ｉ部位は定常領域の３′末端で導入された。定常領域遺伝子は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｋｐｎ Ｉの消化によりこのプラスミド（２５０２）から切り取られた。
【０１３６】
その間にプラスミド２１９７のＳａｌ Ｉ部位は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位に変更された（このステップは繰り返されねばならなかったが、その理由は、フレームシフト突然変異が故意にではなく初めて導入されたためであった）。新プラスミド（２７３６）は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｋｐｎ Ｉで消化された。ＣＤ４可変領域断片は、完全ヒト化軽鎖（プラスミド２５４８）を与えるために、プラスミド２５０２からのカッパ定常領域遺伝子を含むプラスミドにクローンされた。軽鎖遺伝子はＨｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲ Ｉでこのプラスミドから切断され、プラスミド２７９８を与えるために発現ベクターｐＥＥと結合された。
【０１３７】
重鎖と軽鎖の結合およびＮＳＯ細胞での発現
重鎖遺伝子はＳａｌ Ｉ／Ｂｇｌ ＩＩでの消化によりｐＥＥ６ベクターから切り取られ、ＢａｍＨ Ｉ／Ｓａｌ Ｉで消化された軽鎖ｐＥＥ１２にクローンされた。
【０１３８】
最終ベクター構築物は、７００塩基対軽鎖、１４００塩基対重鎖、ｐＥＥ６の２３００塩基対断片およびｐＥＥ１２の７０００塩基対断片を含む予期された断片の存在を知るために、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ，ＥｃｏＲ Ｉ，Ｓａｌ Ｉ，ＢａｎＨ Ｉ，Ｂｇ Ｉ ＩＩおよびＳｐｅ Ｉでの制限消化により調べられた。
【０１３９】
ｐＥＥ１２ベクターは、Ｓａｌ Ｉでの消化により線形化され、標準プロトコル（セルテック、１９９１）に従って電気穿孔法によりＮＳＯ細胞に形質移入されたが、ＤＭＥＭよりもＩＭＤＭをベースとして選択培地は若干修飾された。形質移入物はグルタミンを欠いた培地で、推奨されたように透析ＦＣＳ，リボヌクレオシド、グルタミン酸、およびアスパラギンを補充して選択された。
【０１４０】
形質移入混合物は３個の９６ウエル平板で培養され、内３６個の増殖中のウエルが試験され、５個はヒト重鎖および軽鎖の産生が強く正であった（他の１８個は一方または他方が正であるか、または両方について僅かに正であった。）。
【０１４１】
ＳＤＧ／Ｂ７Ｂ．Ａ．７と名付けられたクローンが選択され、凍結保存されたが、この野生型抗体にはこれ以上の特徴付けは行われなかった。
【０１４２】
エフェクター機能を廃止するよう指示された突然変位体ＩｇＧｌ抗体の構築
各種臨床試験で報告された他のＣＤ４抗体の副作用に関する懸念の理由から、Ｆｃ受容体と係合する可能性を避けることが望ましいと考えられた。ヒトＩｇＧ４は、最小のＦｃ結合能力または補体活性能を持つものと考えられる。しかし実験によれば、それはいくつかの個体にあるＦｃ受容体と係合し（グリーンウッド，他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３巻，１０９８−１１０４ページ，１９９３年）、またＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈに対するヒトＩｇＧ４変異体についての臨床研究は、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞を死滅させる能力を提示した（アイザック，他，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０６巻、４２７−４３３ページ（１９９６年））ことが示された。Ｆｃ受容体への結合の可能性を排除するために、構築物はＩｇＧｌ重鎖定常領域で突然変異が作られた。
【０１４３】
ＴＲＸ１は、図１Ｄおよび図１Ｅ、また図３Ｄおよび図３Ｅで示されるように、Ｌｅｕ２３６からＡｌａ、およびＧｌｙ２３８からＡｌａへの突然変異体を持つ。これらの特殊な残基が選ばれたのは、ＩｇＧに対するヒトＦｃ受容体の３個の型すべてへの結合を最大限途絶させると予測されたためであった。いずれかの突然変異はＦｃＲＩ（ウーフ、他、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３２巻，５６３−５６４ページ，１９８６；ダンカン，他，Ｎａｔｕｒｅ，３３２巻、５６３−５６４ページ，１９８８年；ランド，他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７巻，２６５７−２６６２ページ，１９９１）またはＦｃＲＩＩ（ランド，他，１９９１；サーメイ、他、Ｍｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９巻、６３３−６３９ページ、１９９２年）への結合を減少させるのに十分であったが、一方Ｇｌｙ２３８からＡｌａへの突然変異は、Ｆｃ ＲＩＩＩ（サーメイ、他、１９９２年）への結合に最大の効果を有している。
【０１４４】
ＤＮＡの下記の試料が使用された
１．プラスミド２５５５およびプラスミド２５５５Ｍｕｔ
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｓｐｅ Ｉ制限部位でｐＥＥ６発現ベクターにクローンされたＮＳＭ４．７．２．４のヒト化ＶＨ領域。プラスミド２５５５は、次いで図１Ｄおよび図１Ｅ、または図３Ｄおよび図３Ｅで示されるアミノ酸残基Ａｓｎ１０１がＡｓｐ１０１に変化するように、部位指向突然変異誘発により突然変異された。
【０１４５】
２．プラスミド２７９８
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲ ＩでｐＥＥ１２発現ベクターにクローンされた約７００塩基対を与えるヒトカッパ定常領域に会合されたＮＳＭ４．７．２．４のヒト化ＶＨ領域。
【０１４６】
３．プラスミドＭＦ４２６０
Ｌｅｕ２３６からＡｌａ、およびＧｌｙ２３８からＡｌａへの突然変異並びにフレームワーク領域４に導入されｐＵＣ１８にクローンされたＳｐｅ Ｉ制限部位を持ちヒト化ＣＤ１８ＶＨ領域と会合されたヒトＩｇＧｌ重鎖。
【０１４７】
ＳｐｅＩ制限部位の目的は、異なる可変領域の分離と組換えを可能にすることであろう。
【０１４８】
ＣＤ１８ＶＨ領域は、Ｓｐｅ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩでの消化によりプラスミドＭＦ４２６０から切り取られ、今や関連重鎖定常領域のみを持つ残存ベクターは、ジェネクリーンを用いて精製された。それは、同じようにプラスミド２５５５Ｍｕｔから単離されたＮＳＭ４．７．２．４のヒト化ＶＨ領域ＤＮＡと連結された。産物は「シュア（Ｓｕｒｅ）」細胞に形質転換するために使用され、またコロニーは予期された１４００塩基対完全重鎖挿入断片の存在を調べられた。
【０１４９】
完全ＶＨおよび定常領域挿入断片は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉでの消化によりｐＵＣベクターから切り取られた。１４００塩基対断片はキエックスＩＩ（キアーゲン）を用いて精製され、次いで前に同じ酵素から切断されたベクターｐＥＥ６に連結された。
【０１５０】
次ぎのステップは、ｐＥＥ６ベクターからＣＤ４重鎖遺伝子を切除し、それを、ヒト化ＣＤ４軽鎖遺伝子を既に含むｐＥＥ１２（プラスミド２７９８）にクローンすることであった。ｐＥＥ６ベクターはＳａｌ ＩおよびＢｇＩ ＩＩで消化され、ｐＥＥ１２ベクターは再結合に適切な部位を創り出すためにＳａｌ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで消化された。
【０１５１】
最終ベクター構築物は、予期される断片、すなわちｐＥＥ６の７００塩基対軽鎖、１４００塩基対重鎖、２３００塩基対断片、およびｐＥＥ１２の７０００塩基対断片の存在を確認するために、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ，ＥｃｏＲ Ｉ，Ｓａｌ ＩおよびＳｐｅ Ｉの制限消化で調べられた。
【０１５２】
ｐＥＥ１２ベクターは、Ｓａｌ Ｉでの消化により線形化された、前記の電気穿孔法でＮＳＯ細胞に形質移入された。形質移入混合物は、６個の９６ウエル平板で培養され、試験された９０増殖ウエルですべてがヒト重鎖および軽鎖の産生に正であった。この段階でｐＥＥ１２ベクターＤＮＡの試料はＳａｌ Ｉで消化され、エタノールで沈殿し、セラピューティック・アンティボディ・センター（ＴＡＣ）に移された。
【０１５３】
最終形質移入のための標的細胞
ＮＳＯ細胞は、ＥＣＡＣＣから直接得られた（クローンＣＢ１７８２，マクセッション番号８５１１０５０３）。マスターセルバンク（ＭＣＢ）は、英国、オクスフォード、チャーチヒルホスピタル、セラピューティック・アンティボディ・センターで調製された。
【０１５４】
形質移入および最終トランスフェクタントの選択
ｐＥＥ１２ベクターは前に記載の電気穿孔法により、ＭＣＢからＮＳＯ細胞に形質移入された。２ｘ１０７細胞全体が８０μｇの線形プラスミドＤＮＡで形質移入され、最終量は２．０ｍｌであった。形質移入混合物は１２個の９６ウエル平板に移され、標準プロトコルに従って、選択培地で培養された（セルテック，グルタミンシンセターゼ遺伝子発現システム、バージョン２−骨髄腫細胞からの発現、改訂６版）。６個の平板は１０メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を含む選択培地を受け入れた。
【０１５５】
抗体の精製
培地上澄みは下記の３ステップでバイオパイロットクロマトグラフィーシステムを用いて精製される。
【０１５６】
（１）タンパク質Ａ−セファローズ・ファスト・フローカラムでのアフィニティークロマトグラフィー
（２）Ｓ−セファロース・ファスト・フローでのイオン交換クロマトグラフィー
（３）スーパーデックス２０でのサイズ排除クロマトグラフィー
精製産物は濾過され、単一バイオコンテナーにプールされた。
【０１５７】
精製工程を通して、システムが無菌を保つように注意が払われる。すべての緩衝液と試薬は０．２ミクロン膜フィルターを通され、精製産物もプールの前に０．２ミクロンフィルターを通される。抗体１バッチが加工された後、全クロマトグラフィーシステムおよびカラムは０．５ＭのＮａＯＨで殺菌され、無菌ＰＢＳで洗浄され、２０％エタノールに貯蔵される。それが再使用される前に、エタノールは無菌ＰＢＳで洗浄され、完全な試験走行が行われる。緩衝液の試料とカラム溶離液は内毒素水準で調べられる。
【０１５８】
実施例２
ヌクレオチド配列から出発するＴＲＸ１抗体の構築
ヒト定常領域のクローニング
重鎖定常領域
ヒトガンマ１重鎖定常領域（Ｉｇ Ｇｌ）は、下記のプライマーセットを使用してヒト白血球ｃＤＮＡ（ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ＴＭ ｃＤＮＡ，カタログ番号７１８２−１，クロンテック）から増幅され、ｐＣＲ−スクリプト（ストラータジーン）にクローンされる。ｐＣＲ−スクリプトにヒトガンマ１重鎖定常領域を含むプラスミドは、ｐＨＣγ−１と命名される。
【０１５９】
【０１６０】
非Ｆｃ結合突然変異（Ｌｅｕ２３６Ａｌａ，Ｇｌｙ２３８Ａｌａ）は、下記のプライマーおよびクロンテックからのトランスフォーマーＴＭ部位指向突然変異誘発キット（カタログ番号Ｋ１６００−１）を使用する部位指向突然変異誘発により重鎖定常領域で作られる。ｐＣＲ−スクリプトにヒトガンマ１重鎖非Ｆｃ結合突然変異体定常領域を含むプラスミドは、ｐＨＣγ−１Ｆｃｍｕｔと命名される。
【０１６１】
【０１６２】
軽鎖定常領域
ヒトカッパ軽鎖定常領域は、下記のプライマーセットを使用してヒト白血球ｃＤＮＡ（Ｑｕｉｃｋ−ＣｌｏｎｅＴＭ ｃＤＮＡ，カタログ番号７１８２−１，クロンテック）から増幅され、ｐＣＲ−スクリプト（ストラータジーン）にクローンされる。ｐＣＲ−スクリプトにヒトカッパ軽鎖定常領域を含むプラスミドは、ｐＬＣκ−１と命名される。
【０１６３】
【０１６４】
ＴＲＸ１可変領域の合成、構築およびクローニング
重鎖および軽鎖可変領域は、全可変領域を含む一連の部分的にオーバーラップする相補的合成オリゴヌクレオチドから構築される。各可変領域で使用されるオリゴヌクレオチドは、以下で示される。
【０１６５】
重鎖可変領域合成オリゴヌクレオチド
【０１６６】
【０１６７】
【０１６８】
ＨＰＬＣ精製と有機溶媒の除去の後、オリゴヌクレオチドはＴＥｐＨ８．０に再懸濁されリン酸化される。それぞれの可変領域セットでの各オリゴヌクレオチドのアリコートは、次いで等モル量に組合される。オリゴヌクレオチド混合物は、６８℃で１０分加熱され、その後ゆっくりと室温まで冷却される。アニーリングされたオリゴヌクレオチドは、ついで二本鎖可変領域ＤＮＡを産生するよう拡張される。この拡張のため、ｄＮＴＰｓが０．２５ｍＭの最終濃度に加えられ、次いで５Ｘ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの適当量［トリスアセテート，ｐＨ７．９，１６５ｎＭ，酢酸ナトリウム３３０ｍＭ，酢酸マグネシウム５０ｍＭ，ＢＳＡ５００ｇ／ｍｌ，ＤＴＴ２．５ｍＭ］およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ，４ユニットが続けて加える。混合物は３７℃で１時間培養され、次いでＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの熱不活化が６５℃で５分続く。
【０１６９】
二本鎖ＤＮＡはエタノール沈殿させ、同量のＴＥ ｐＨ８．０で再懸濁される。適当量の５Ｘ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液［トリス塩酸，ｐＨ７．６，２５０ｍＭ，塩化マグネシウム５０ｍＭ，ＡＴＰ５ｍＭ，ＤＴＴ５ｍＭ，２５％ ｗ／ｖポリエチレングリコール−８０００］が次いで二本鎖ＤＮＡに加えられ、またＴ４ ＤＮＡリガーゼ２ユニットが続き、混合物は拡張断片を連結するために１時間３７℃で培養された。次いでＴ４ ＤＮＡリガーゼは、６５℃で１０分加熱不活化される。可変領域ＤＮＡ断片は、次いでフェノール抽出、エタノール沈殿、ＴＥ，ｐＨ８．０に再懸濁され、ｐＣＲ−スクリプト（ストラータジーン）にクローンされる。重鎖可変領域を含む生成プラスミドはｐＨＶ−１と命名され、軽鎖可変領域を含むプラスミドはｐＬＶ−１と命名された。
【０１７０】
最終重鎖および軽鎖発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１で構築される（インバイトロジェン）。重鎖発現ベクターについては、Ｆｃ突然変異定常領域は、Ｓｐｅ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉでの消化によりプラスミドｐＨＣ−１Ｆｃｍｕｔから放出され、アガロースゲル電気泳動により単離される。重鎖可変領域は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＳｐｅ Ｉでの消化によりプラスミドｐＨＶ−１から放出され、アガロースゲル電子泳動により単離される。同一モル量の２個の断片は、通常の分子生物学手法を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インバイトロジェン）のＨｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲ Ｉ部位に連結される。生成ＴＲＸ１重鎖発現ベクターは、ｐＴＲＸ１／ＨＣと命名される。
【０１７１】
同様に、軽鎖発現ベクターについては、軽鎖定常領域は、Ｋｐｎ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩでの消化によりプラスミドｐＬＣ−１から放出され、次いでアガロースゲル精製が行われる。軽鎖可変領域は、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎ Ｉでの消化によりｐＬＶ−１から放出され、次いでアガロースゲル精製が続く。等モル量の２個の軽鎖断片は、通常の分子生物学手法を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（インバイトロジェン）のＥｃｏＲ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位に連結され、ＴＲＸ１軽鎖発現ベクターｐＴＲＸ１／ＬＣを産出する。
【０１７２】
ＴＲＸ１抗体の産生については、ＴＲＸ１重鎖およびＴＲＸ１軽鎖発現プラスミドは通常の分子生物学手法を用いてＣＨＯ細胞に同時形質移入される。
【０１７３】
実施例３
図２Ａ，図２Ｃ，図２Ｄおよび、図２Ｆで示されるヒト化抗体は、実施例１のものと同じ手順で産生される。ヒト化抗体は、非グリコシル化（非糖鎖付加）抗体である。
【０１７４】
実施例４
図４Ａ，図４Ｃ，図４Ｄおよび、また図４Ｆで示されるヒト化抗体は、実施例１のものと同じ手順で産生される。ヒト化抗体は、非グリコシル化（非糖鎖付加）抗体である。
【０１７５】
実施例５
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、外来ヒト組織適合抗原を認識する特発されたヒトリンパ球を生成するために使用される。この反応を創り出すために、ヒト末梢血リンパ球がフィコール密度勾配遠心分離法または類似の方法を用いて異なる２個の個体（供与体Ａと供与体Ｂ）からヘパリン化全血から単離された。供与体Ｂからのリンパ球は、血清はないがマイトマイシンＣ５０ｕｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ １６４０培地で１０７／ｍｌに調節される。細胞は３７℃で３０分培養され、次いで供与体Ａ血漿１０％でＲＰＭＩ １６４０で３回遠心分離でマイトマイシンＣを持つ培地を洗浄される。マイトマイシンＣで処理されなかった供与体Ａからの細胞は、供与体Ａ血漿１０％でＲＰＭＩ １６４０で４ｘ１０６／ｍｌに調節される。洗浄後、供与体ＢからのマイトマイシンＣ処理リンパ球は、供与体Ａ血漿１０％でＲＰＭＩで４ｘ１０６／ｍｌに調節される。供与体Ａと供与体Ｂの細胞の等量が混合され、適切な大きさの組織培養フラスコで試験される化合物、あるいは薬剤、処置または方法と組み合わされた前記化合物（「試験化合物」）に配置される。試験化合物のあるまたはないフラスコは、次いで３７℃で空気中炭酸ガス濃度５％で７−１０日間培養される。これは一次混合リンパ球反応である。
【０１７６】
一次ＭＬＲにおける細胞が活性化され、３−７日の間に分裂を開始し、活性増殖の期間に続いて細胞がより休止状態に戻るのを観察することができる。この期間は変化させることができるが、細胞は通常７−１０日の間に休止に戻る。一度細胞が休止にあると見えれば、試験化合物ありまたはなしの一次ＭＬＲフラスコから得た細胞は、遠心分離で回収され、４ｘ１０６ｍｌで供与体Ａ血漿１０％を持つＲＰＭＩ １６４０に再懸濁することができる。新鮮ＰＢＬは供与体Ｂからのヘパリン化全血からフィコール密度勾配により調製されたマイトマイシンＣで再び不活性化され、不活性化供与体Ｂ細胞は、供与対Ａ血漿１０％を持つＲＰＭＩ １６４０で４ｘ１０６／ｍｌに調節される。二次ＭＬＲに対して、等量の一次ＭＬＲ細胞（試験化合物不在下で行われた一次ＭＬＲからの細胞）は、マイトマイシン不活化供与体Ｂ細胞と混合される。
【０１７７】
一次ＭＬＲ細胞（試験化合物不在下で行われたＭＬＲから得られた細胞）が、緑蛍光染料であるＣＦＳＥ，これは生体細胞に移入され、そこで酵素により作用を受け、次いで細胞タンパク質と反応するが、このＣＦＳＥで標識されると、標識細胞で時間にわたり経験した細胞分裂数は、各細胞と結合する緑標識の減少に反映される。もしＣＦＳＥ標識ＭＬＲ細胞が、試験化合物誘導ＭＬＲ細胞に対して２：１乃至１０：１ＭＬＲの比率で試験化合物が処理一次ＭＬＲから誘導れた細胞に加えられた二次ＭＬＲで刺激される場合には、ＣＦＳＥ標識ＭＬＲ細胞増殖の阻害が、試験化化合物誘導細胞の不在下で二次ＭＬＲで刺激されるＣＦＳＥ標識ＭＬＲ細胞の増殖と対比した場合に、刺激の３−４日以内で二次ＭＬＲで観察されるであろう。
【０１７８】
一次ＭＬＲおよび二次ＭＬＲで産生された細胞（ならびに対照ＭＬＲで提供された細胞）は、前記記載のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を分析される。
【０１７９】
対照と比較してＴＲＸ１が前に記載の通り試験された場合、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は一次ＭＬＲで６０％以上減少し、二次ＭＬＲでは２０％以上減少し、また二次ＭＬＲでは、対照と比較してＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−１２の産生は基本的に除去され、ＩＬ−５，ＩＬ−１３，ＩＦＮガンマおよびＴＮＦアルファの産生は４０％以上も削減された。
【０１８０】
実施例６
非枯渇抗ＣＤ４モノクローナル抗体であるＴＲＸ１の使用による非ヒト霊長類での抗原特異的免疫寛容の誘導は、下記の研究で実証された。ヒヒ（Ｐａｐｉｏ ａｎｕｂｕｓ）が任意に３匹の動物の７グループに分割された。７グループは４個の実験グループ，４，６，７および８より成り、３個の対照グループ１，５および９が指定された。本研究は２フェーズより成り、まず免疫化／免疫寛容フェーズがあり、次いで攻撃誘発フェーズであった。
【０１８１】
本研究の免疫化／免疫寛容フェーズに関して、グループ４，６，７および８は第０日、第４日および第８日それぞれ１用量で抗原１（生理食塩水で１０ｍｇ）を３用量使って免疫化された。抗原１は最初の用量が静脈内（ｉｖ）、続くすべての用量が皮下（ＳＣ）で投与される多価集合体ホースＩｇＧ（抗蛇毒素）である。プロトコルのこのフェーズの間、グループ４，６，７および８は、更に非枯渇抗ＣＤ４モノクローナル抗体、ＴＲＸ１の４用量を以下の通り静脈内で受けた。すなわちグループ４は、第１日、第４日、第８日および第１２日に２０ｍｇ／Ｋｇの４用量を受け入れた。グループ６は、第１日、第３日、第８日および第１２日にＴＲＸ１の１ｍｇ／Ｋｇを受けた。グループ７は、第１日、第３日、第８日および第１２日に１０ｍｇ／Ｋｇを受けた。グループ８は、第１日、第３日、第８日および第１２日に４０ｍｇ／Ｋｇを受けた。
【０１８２】
対照グループ１および５は、プロトコルの免疫化／免疫寛容フェーズの間に下記の通り処置された。グループ１は、抗原１を１０ｍｇ／Ｋｇで３用量を受け、第０日、第４日および第８日に各１用量であった。グループ５は、２０ｍｇ／ＫｇのＴＲＸ１抗体の４用量を静脈内で受け、第１日、第４日、第８日および第１２日各１用量であった。グループ９は４０ｍｇ／ＫｇのＴＲＸ１抗体を静脈内で４用量受け、第１日、第４日、第８日および第１２日各１用量であった。
【０１８３】
血液は、ＥＬＩＳＡによるＴＲＸ１の血清水準、循環リンパ球サブセット水準に対するＴＲＸ１処置の薬力学効果、同じくフローサイトメトリーによるＣＤ４受容体占有率、ならびにＥＬＩＳＡによる抗原１のヒヒ抗体応答などを評価するために、抗原１およびまたはＴＲＸ１の各注入の前、およびその１週間後に収集された。
【０１８４】
抗体価（抗体力価）などで測定されるグループ１，４，６，７および８の研究で最初の６８日間にわたる抗蛇毒素の免疫応答が図５で示される。
【０１８５】
本研究の改正誘発フェーズは、ＴＲＸ１の血清水準が検出不能水準に達してすぐ開始された。攻撃誘発フェーズとしては、すべてのグループのすべての動物は、抗原１（１０ｍｇ／Ｋｇ、皮下）および抗原２（１．７ｍｌ／Ｋｇ）で（第６８日に）攻撃誘発された。抗原２は、１用量で静脈内に与えられるヒツジ赤血球細胞の１０％生理食塩水である。抗原１による攻撃誘発は、対照グループ５および９、ならびに試験グループ４および８に対し、第９５日および第１３５日に反復された。血液は、抗原１、ＴＲＸ１の血清水準、および抗原１ならびに抗原２に対するヒヒ抗体応答を評価するために、各攻撃誘発前に収集された。
【０１８６】
図６は、最初の攻撃誘発（第６８日−第９５日）後に、すべてのグループに対して抗体価の測定による抗蛇毒素に対する免疫応答を示す。図７は、攻撃誘発１、攻撃誘発２、および攻撃誘発３の行われた後、グループ１，４，５，８および９に対する抗体価の測定による抗蛇毒素に対する免疫応答を示す。
【０１８７】
ヒツジ赤血球細胞に対するグループ１，４および５の免疫応答の結果は、図８で示される。
【０１８８】
すべての特許、刊行物（公開特許出願を含む）、寄託、アクセッション番号、およびデータベースアクセッション番号は、あたかも各特許、刊行物、寄託アクセッション番号、およびデータベースアクセッション番号が、特異的かつ個別的に引用例としてここに組み込まれるものと同じ範囲で、引用例としてここに組み込まれる。
【０１８９】
実施例７
薬剤、処置または方法と組合されたＴＲＸ１の投与による免疫寛容の誘導は、下記の通り例示される。必ずしも限定されないが、セルセプトＴＭ（Ｃｅｌｌ ＣｅｐｔＴＭ）などの薬剤、処置または方法は、必ずしもそれに限定されないが齧歯目などの哺乳網への免疫寛容を誘発するために、必ずしもそれに限定されないが、ＴＲＸ１などの本発明の化合物と連係して使用することができる。
【０１９０】
必ずしもそれに限定されないが、Ｃ５７ＢＬ６などの齧歯目のグループは、それに対し免疫寛容が必要とされるヒト免疫グロブリンＧ（ｈＩｇＧ）などの抗原の特発用量で処置することができる。ｈＩｇＧの適切な単一用量（例えば２ｍｇ／Ｋｇ）は、例えば免疫寛容処方の２４日前に静脈内注射により与えられるであろう。
【０１９１】
第２５日に、免疫寛容フェーズは、マウスがＴＲＸ１またはＴＲＸ１とセルセプトＴＭの組合せで、またｈＩｇＧの追加用量の投入で処置されることで開始する。用量処方は下記の通りである。グループＩは、第１日、第３日、第５日、第７日、第９日および第１１日に５０ｍｇ／Ｋｇの用量でＴＲＸ１単独で与えられる。グループＩＩは、前記のＴＲＸ１に加えて、第２−第１４日にセルセプトＴＭ（５０ｍｇ／Ｋｇ）の注射を受ける。グループＩＩＩは、前記の用量でセルセプトＴＭのみを受ける。グループＩ，ＩＩおよびＩＩＩは、前記の用量に加えて、第０日、第４日および第８日にｈＩｇＧを１０ｍｇ／Ｋｇで受ける。グループＩＶは前記の用量でｈＩｇＧのみを受ける。すべての用量は、例えば静脈内注射により与えられるであろう。
【０１９２】
攻撃誘発フェーズは、各グループが例えば５ｍｇ／ＫｇでｈＩｇＧの静脈内注射を与えられる第１１８日に開始する。血清が集められ、処置された動物がｈＩｇＧに対する抗体応答を仕掛けることができるかどうかを確認するために、数多くの従来の技術で認められた方法のいずれかで血清は評価される。追加攻撃誘発は、例えば５ｍｇ／ＫｇのｈＩｇＧおよび５ｍｇ／Ｋｇのオボアルブミンの静脈内注射を用いて第１５２日および第１８０日に仕掛けられる。もし動物がｈＩｇＧに免疫寛容化された場合には、処置されたグループ（グループＩ，ＩＩおよびＩＩＩ）でのｈＩｇＧに特異的な抗体水準は、対照グループ（グループＩＶ）と比較して減少することであろう。
【０１９３】
しかし本発明の範囲は、前に記載の特異的な実施例に限定されるものでないことは理解されねばならない。本発明は特に記載されたもの以外にも実施することができ、またそれでも冒頭に掲げた請求範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１Ａ】ＴＲＸ１抗体の第１実施例の軽鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す図
【図１Ｂ】ＴＲＸ１抗体の第１実施例の軽鎖核酸配列を示す図
【図１Ｃ】ＴＲＸ１抗体の第１実施例のハイライトＣＤＲｓを持つ軽鎖アミノ酸配列を示す図
【図１Ｄ】ＴＲＸ１抗体の第１実施例のグリコシル化部位を含む重鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す図
【図１Ｅ】ＴＲＸ１抗体の第１実施例の重鎖ヌクレオチド配列を示す図
【図１Ｆ】ＴＲＸ１抗体の第１実施例のハイライトＣＤＲｓを持ちグリコシル化部位を含む重鎖アミノ酸配列を示す図
【図２Ａ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の軽鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す図
【図２Ｂ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の軽鎖核酸配列を示す図
【図２Ｃ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例のハイライトＣＤＲｓを持つ軽鎖アミノ酸配列を示す図
【図２Ｄ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の重鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す図
【図２Ｅ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の重鎖ヌクレオチド配列を示す図
【図２Ｆ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例のハイライトＣＤＲｓを持つ重鎖アミノ酸配列を示す図
【図３Ａ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の軽鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列示す図
【図３Ｂ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の軽鎖核酸配列を示す図
【図３Ｃ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例のハイライトＣＤＲｓを持つ軽鎖アミノ酸配列を示す図
【図３Ｄ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例のグリコシル化部位を含む重鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す図
【図３Ｅ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の重鎖ヌクレオチド配列を示す図
【図３Ｆ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例のハイライトＣＤＲｓを持ちグリコシル化部位を含む重鎖アミノ酸配列を示す図
【図４Ａ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の軽鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す図
【図４Ｂ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の軽鎖核酸配列を示す図
【図４Ｃ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例のハイライトＣＤＲｓを持つ軽鎖アミノ酸配列を示す図
【図４Ｄ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の重鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す図
【図４Ｅ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の重鎖ヌクレオチド配列を示す図
【図４Ｆ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例のハイライトＣＤＲｓを持つ重鎖アミノ酸配列を示す図
【図５】抗蛇毒素のみまたはＴＲＸ１抗体を組合せたものを与えられたヒヒグループ研究の最初の６８日間（すなわち免疫寛容化フェーズ）での抗蛇毒素に対する免疫応答を示す図
【図６】攻撃誘発の６８日前に抗蛇毒素のみ、またはＴＲＸ１を組合せて与えられたヒヒグループに対する抗蛇毒素およびヒツジ赤血球攻撃誘発に続く抗蛇毒素に対する免疫応答を示す図
【図７】最初の攻撃誘発の６８日の後に抗蛇毒素のみまたはＴＲＸ１抗体を組合せて与えられたヒヒグループに対する各３回の抗蛇毒素の攻撃誘発に続く抗蛇毒素に対する免疫応答を示す図
【図８】抗蛇毒素に対するＴＲＸ１免疫寛容化後のヒツジ赤血球への免疫応答を描く図
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年６月１４日付け英国出願番号０１１４５１７．６号の優先権を主張する合衆国出願番号１０／１７１，４５２号（係属中），２００１年９月２０日付英国出願番号０１２２７２４．８号，２００１年１０月１９日付合衆国暫定出願番号６０／３４５，１９４号，２００２年４月１８日付合衆国暫定出願番号６０／３７３，４７０号，および２００２年４月１８日付合衆国暫定出願番号６０／３７３，４７１号の継続出願であり、これらの内容は本発明の引用例としてここに組み込まれている。
【０００２】
本発明は、抗原に対する免疫応答を阻害し、予防しまたは改善するために適用可能である。このような抗原に対する免疫応答の阻害、予防または改善は、抗原に対する免疫寛容を誘導することを含む。本発明は、更に免疫寛容誘導、およびまたはＴ細胞活性化および増殖の予防または阻害および、より詳細には霊長類への免疫寛容の誘導を含む。
【０００３】
外来抗原または組織、あるいは自己抗原または組織に対する免疫寛容は、さもなくば正常、成熟免疫系が特異的にその抗原／組織に攻撃的に応答できず、従って、それは正常（非疾病）体組織／成分のように扱う状態であり、しかも同時にそれは、外来または疾病抗原／組織に対し攻撃的に応答することができ、それらに対し免疫系は、自己免疫寛容の自然な過程により、またはｉｎ ｖｉｖｏでの免疫寛容許容環境を創出することにより、特異的に免疫寛容化されてきていなかった。
【発明の開示】
【０００４】
本発明の一つの見地に従って、１個の化合物、または少なくとも２個の化合物の組合せの使用により、免疫寛容を誘導する一つのプロセスが提供され、ここで化合物または組合わせは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験された場合にある種の特性を有し、望ましい実施例における前記化合物の限定されない例としては、ＣＤ４抗体が存在する。
【０００５】
「少なくとも２個の化合物の組合せ」という用語は、化合物が相互に混合されて投与されねばならない、ということを意味するものではないことは理解されねばならない。かくして、このような組合せでの、またはそれを使用することによる処置は、化合物の混合物、または化合物の別個の投与を包含するものであり、また同じ日あるいは別の日での投与も含む。かくして「組合せ」という用語は、２個またはそれ以上の化合物が、個別にあるいは相互に混合されるかのいずれかで処置のために使用されることを意味する。「化合物」という用語は、広い感覚で使用されており、遺伝子治療で使用されるような物質（例えば治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター）などの物質を包含する。
【０００６】
本発明のもう一つの見地に従って、新規なＣＤ４抗体およびその使用法が提供される。
【０００７】
本発明の更なる見地に従って、霊長類に免疫寛容を誘導するための１個の化合物または少なくとも２個の化合物の組合せが提供される。
【０００８】
本発明の更なる見地に従って、薬剤、処置または方法と組合せた新規なＣＤ４抗体が提供される。
【０００９】
本発明の更なる見地に従って、１個の化合物または少なくとも２個の化合物の組合せの使用により、霊長類での免疫寛容を誘導するプロセスが提供され、ここで化合物または組合せは、霊長類でのこのような免疫寛容を誘導する用量処方の使用によるある特性を持ち、望ましい実施例での前記化合物の限定されない例としてはＣＤ４抗体がある。
【００１０】
本発明の更なる見地に従って、１個またはそれ以上の抗原に対する免疫寛容を誘導するのに有用な化合物、または化合物の組合せを同定するためのスクリーニングまたは試験が提供される。
【００１１】
本発明の更なる見地に従って、必ずしもそれに限定されないが、移植片拒絶、移植片対宿主病、必ずしもそれに限定されないが、慢性関節リュウマチ、糖尿病、および多発性硬化などを含む自己免疫疾患、炎症性過程と関連する炎症性疾病と疾患、アレルギー、アナフィラキシー、およびアナフィラキシーと関連する疾病、喘息、がん、および必ずしもそれに限定されないが、ウイルス性感染を含む感染症などを含む疾病または病的状態と関連する症状を処置し、治療しまたは改善する新規な方法が提供される。
【００１２】
本発明の更なる見地に従って、治療薬、例えばタンパク質、ペプチド、細胞、遺伝子治療薬などの治療薬に免疫寛容を誘導する新規な方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の一つの見地に従って、以下に記載の通り１個の化合物または少なくとも２個の化合物の組合せの使用により、抗原に対し霊長類を免疫寛容にするプロセスが提供される。化合物、または組合せは、霊長類に免疫寛容を誘導するのに有効な量および有効な用量処方に従って投与される。化合物、または少なくとも２個の化合物の組合せは、化合物、または前記組合せが不在の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）と比較して一次混合リンパ球反応に存在する場合に、混合リンパ球反応から生じるＣＤ４およびＣＤ２５（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞）両方に正である細胞量を減少させる化合物、または組合せである。望ましい実施例において、化合物、または前記組合せは、このようなＣＤ４＋ＣＤ２５細胞を少なくとも４０％および望ましくは少なくとも６０％、またより望ましくは少なくとも７０％減少させる化合物、または前記組合せである。
【００１４】
望ましい実施例におい、このような化合物、または前記組合せは、一次ＭＬＲで産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を減少させることで（化合物、または薬剤、処置あるいは方法と組合せた前記化合物にこれまで露出されなかった細胞で実行された）一次混合リンパ球反応を阻害する細胞集団を産生する。望ましい実施例において、少なくと１０％の減少があり、望ましく少なくとも２０％の減少がある。ここで記載された混合リンパ球反応を行うプロトコルは、実施例５に記載されている。
【００１５】
更に、望ましい実施例において、化合物、または前記組合せは、一次混合リンパ球反応で産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量を減少させ、細胞集団が二次混合リンパ球反応を阻害するそのような一次混合リンパ球反応で細胞集団を生成する化合物、または前記組合せである。望ましい実施例において、細胞は、化合物、または前記組合せの存在下で実行される一次混合リンパ球反応で生成され、その細胞は、二次混合リンパ球反応に加えられた場合に、付加される細胞が不在である二次混合リンパ球反応の場合と比較して、少なくとも２０％、より望ましくは少なくとも３５％、またより望ましくは少なくとも５０％、このような二次混合リンパ球反応で生成されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を減少させる。
【００１６】
このような細胞集団による一次または二次ＭＬＲのいずれかの阻害は、その細胞集団の不在下で行われるＭＬＲと比較して、ＭＬＲで産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量の減少により立証される。
【００１７】
かくして本発明の一つの見地に従って、霊長類は前に記載の特性（一次およびまたは二次ＭＬＲでｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の量を減少し、また一次および二次ＭＬＲ両方でこのような減少を望ましくはもたらす細胞集団を生成するこのような一次ＭＬＲで、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの一次ＭＬＲで産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量の減少）を持つ１個の化合物または少なくとも２個の化合物の組合せで処置される。
【００１８】
一つの実施例において、化合物、または前記組合せの存在下で一次ＭＬＲで生成される細胞は、二次ＭＬＲに加えられる時（付加される細胞なしでの二次ＭＬＲと比較すると）、１個またはそれ以上のサイトカイン、とりわけ二次ＭＬＲで１個またはそれ以上のＩＬ−２，ＩＬ−４およびＩＬ−１２の生成を減少し、およびまたは排除する細胞である。一般にＩＬ−２，ＩＬ−４およびＩＬ−１２のこのような少なくとも１個の減少は、少なくとも４０％、望ましくは少なくとも６０％である。
【００１９】
かくして望ましい化合物、または望ましい組合せは、一次ＭＬＲで細胞を生成し、対照と比較して二次ＭＬＲでＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞またはＩＬ−２，ＩＬ−４およびＩＬ−１２の１個またはそれ以上あるいはすべて（望ましくはすべて）の産生を減少させ、また望ましくはこのような細胞およびサイトカイン両方の産生を減少させるものである。
【００２０】
更なる見地に従って、Ｔ細胞を刺激し、増殖を起こす条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞が物質または化合物に露出され、免疫寛容を誘導する能力を試験される化合物、または少なくとも２個の化合物の存在下でこのような露出が行われるスクリーニングまたは試験が提供される。Ｔ細胞増殖試験は、混合リンパ球反応であり、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）あるいはＴＣＲ複合体の成分、例えばＣＤ３成分を通じて非抗原特異的刺激によりＴ細胞が増殖を起こす試験である。典型的には、Ｔ細胞を刺激し、それに増殖を起こすために使用されるのは、抗ＣＤ３モノクローナル抗体である。ＴＣＲ複合体を経由する刺激に加えて、ＣＤ２８などの共刺激分子と結合する抗体の付加により、共刺激シグナルが時には提供される。試験される化合物または薬剤、処置または方法と組合される前記化合物の存在下または不在下で増殖を起こす原因となったＴ細胞は、化合物、または前記組合せの存在が、Ｔ細胞サブセットの産生を阻害したかどうかを確認するために、ＣＤ４正（ＣＤ４＋）およびＣＤ２５正（ＣＤ２５＋）であるＴ細胞のサブセットを確認するように試験される。
【００２１】
免疫寛容誘導活性のための化合物、または前記組合せを試験するために使用されるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、望ましくは混合リンパ球反応（ＭＬＲ）である。混合リンパ球反応は、一般に従来の技術で公知であり、そのプロトコルは実施例５で以下に記載されているが、発明の範囲はそれにより限定されるものではない。
【００２２】
最初の試験で産生される細胞集団は、次いで更に少なくとも１回試験され、ここでｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞は、このような細胞集団がＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の産生を阻害するかどうかを確認するために、増殖を起こしている試験である。
【００２３】
少なくとも更なる１回の試験は、混合リンパ球反応（一次または二次リンパ球反応）であってもよく、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）あるいはＴＣＲ複合体の成分を通じて、もしくはＴＣＲを通じて抗原特異的刺激を擬態する共刺激での非抗原特異的刺激に応答してＴ細胞が増殖を起こす試験であってもよい。
【００２４】
このような試験のプロトコルは、実施例５に記載されているが、本発明の範囲はそれにより限定されるものではない。
【００２５】
望ましい実施例において、免疫寛容を誘導するために使用される化合物、または少なくとも２個の異なる化合物の組合せを確認するスクリーニングまたは試験は、ＭＬＲなどのようなｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖試験で、化合物、または前記組合せが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を減少させるかどうかを確認する最初の試験、および最初の試験で産生された細胞が、一次およびまたは二次ＭＬＲ、更にとりわけ二次ＭＬＲおよびまたは二次ＭＬＲでのサイトカインの産生などの二次Ｔ細胞増殖試験でＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の産生を阻害するかどうかを確認する次の試験、の両方を含む。
【００２６】
望ましい実施例に従って、免疫寛容を誘導するために選択される化合物、または前記組合せは、最初の試験でＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の産生の減少を起こし、前に記載したように第２の試験でこのようなＴ細胞サブセットの産生を減少させる細胞集団を産生し、およびまたはサイトカインの産生および、とりわけ第２試験で１個またはそれ以上のＩＬ−２，ＩＬ−４およびＩＬ−１２を削減する化合物または前記化合物の組合せである。
【００２７】
かくして本発明の一つの見地に従って、選択された化合物、または少なくとも２個の化合物の組合せは、化合物、または前記組合せの不在下での混合リンパ球反応と比較して、一時混合リンパ球反応（ＭＬＲ）などのＴ細胞増殖検定で存在する場合に、混合リンパ球反応から生じるＣＤ４およびＣＤ２５（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞）両方に正である細胞量を減少させる化合物、または組合せである。望ましい実施例において、化合物、または前記組合せは、そのようなＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を少なくとも４０％、また望ましくは少なくとも６０％、また更により望ましくは少なくとも７０％減少させる化合物、または組合せである。
【００２８】
加えて、望ましい実施例において、選択された化合物または組合せは、一次混合リンパ球反応で産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量を減少させ、そのような一次混合リンパ球反応で細胞集団を生成し、その細胞集団が二次混合リンパ球反応を阻害する化合物または組合せである。望ましい実施例において、細胞は、化合物、または前記組合せの存在下で行われる一次混合リンパ球反応で生成され、その細胞は、二次混合リンパ球反応に加えられた時に（付加される細胞の不在下での二次混合リンパ球反応と比較して）、少なくとも２０％、より望ましくは少なくとも３５％、またより望ましくは少なくとも５０％、このような二次混合リンパ球反応で生成されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を望ましくは減少させる。望ましい実施例において、二次ＭＬＲでのこのような細胞は、対照と比較して、ＩＬ−２，ＩＬ−４およびＩＬ−１２の少なくとも１個の産生を少なくとも４０％、また望ましくは少なくとも６０％減少させる。
【００２９】
このような細胞集団による一次ＭＬＲまたは二次ＭＬＲのいずれかの阻害は、このような細胞集団の存在下で行われるＭＬＲと比較してＭＬＲで産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の減少により立証され、また二次ＭＬＲに関連してＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の減少またはサイトカイン産生の減少および望ましくはその両方により立証される。
【００３０】
一つの実施例において、霊長類に免疫寛容を誘導するのに使用される化合物は、抗体（またはその断片）あいは抗体（またはその断片）ともう一つの抗体との組合せ、もしくは抗体以外の化合物である。しかし本発明は、このような抗体の使用に限定させるものではない。
【００３１】
かくして霊長類に免疫寛容を誘導する一つの見地と関連する本発明は、前記特性を持ち、霊長類に免疫寛容を誘導できる化合物の使用を考慮し、その化合物は、単独でまたは１個あるいはそれ以上の他の化合物と組合せて使用することができ、この１個あるいはそれ以上の他の化合物は前記の特性を持つこともあり、または持たないこともあり得る。加えて本発明は、少なくとも２個の化合物の組合せの使用を考慮し、ここで１個またはそれ以上の化合物は、前記の特性を持ち、またはここでこのような組合せの化合物のいずれもが個別には前記の特性を持たないが、組合せられた場合にはこのような特性を持つ。かくして少なくとも２個の化合物の組合せは、その１個またはそれ以上の化合物がそのような特性を持つ結果として、あるいは２個またはそれ以上の化合物の組合せがこのような特性を与える結果として、前記の特性を持つことができる。
【００３２】
ある場合には、本発明の化合物は、免疫抑制剤である化合物と組合せて使用される。免疫抑制剤である化合物は、一般化された免疫抑制をもたらすのに必要な量以下の用量で使用でき、または一般免疫抑制をもたらす用量で使用される。使用される化合物の組合せおよび化合物の相対的量は、霊長類に免疫寛容を誘導するのに有効である。
【００３３】
霊長類に免疫寛容を誘導する前に記載の特性を持つ化合物と組合せて使用される化合物のいくつかの例は、必ずしもそれに限定されないが、リツキサンＴＭ（ジェネンテク）；Ｂ細胞と特異的に結合する抗体；ＩＤ４（リサーチ・ダイアグノスティックス）に限定されないが、それを含むプラズマ細胞に特異的な抗体；セルセプトＴＭ（ロシュ）；シクロスポリン；抗ＣＤ４０Ｌ；抗ＩＬ１２；抗ＩＬ１８；抗インターフェロンガンマ；プロテオソーム阻害薬；ＣＸＣＲ３拮抗薬；１５デオキシスペルグアリン：ＦＫ５０６；ＣＤ２，ＣＤ８およびＣＤ２８などの共刺激分子に向けられる抗モノクローナル抗体、ならびに付着分子に向けられるモノクローナル抗体を含む。
【００３４】
組合せで使用される化合物の更なる限定されない例は、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質を発現する遺伝子治療物質、ペプチド擬似体、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー、ペプチド、小有機分子および抗体を含む。
【００３５】
ここで使用されるように、抗原と関連して「免疫寛容化する」または「免疫寛容である」という用語は、全総合免疫抑制を必要とせずに、処置が停止し、抗原での続く攻撃誘発がなされ、およびまたは抗原が霊長類に存在していても、一定期間にわたり抗原に対する逆免疫応答を産生せず、他の抗原に対する免疫応答を提供できることを意味する。
【００３６】
免疫寛容化または免疫寛容状態は、前に記載のように、本発明の化合物または少なくとも２個の化合物の組合せの有効用量を投与することにより、霊長類に導入することができる。前に記載のように、化合物の組合せを用いる場合には、それらは同時にまたは順次に投与される。
【００３７】
免疫寛容を導入させる抗原は、自己抗原または外来抗原である。
【００３８】
外来抗原は、１個またはそれ以上の下記の型の抗原である。
【００３９】
（ｉ）移植片が同種または異種である器官に存在する組織または細胞を含む移植組織または細胞に存在する外来抗原、
（ｉｉ）霊長類に免疫応答を産生する治療薬（疾病予防に使用される治療薬も含む）であり、その免疫応答が治療薬として機能する薬剤の性能を減少させる治療薬。このような薬剤には、必ずしもそれに限定されないが、遺伝子治療に使用されるベクターなどの送達担体、モノクローナル抗体などの組換えタンパク質、酵素、凝固因子およびいくつかの小分子薬剤、または遺伝子治療薬などの霊長類に送達される薬剤から産生されるタンパク質、
がそれである。
【００４０】
本発明に従って、免疫寛容が誘導される外来抗原は、宿主に感染する疾病の原因となる細菌、真菌、ウイルスなどに存在する外来抗原ではなく、すなわち外来抗原という用語は、霊長類に感染し疾病または疾患を起こす生体の部分としての外来抗原を含まない。
【００４１】
一つの見地に従って、霊長類は、そのような免疫寛容を提供するのに有効な量と時間で、少なくとも１個のＣＤ４抗体またはその断片で、またはもう一つの化合物（ＣＤ４抗体以外の化合物あるいは異なるＣＤ４抗体）と組合せる少なくとも１個のＣＤ４抗体またはその断片で、霊長類を処置することにより、抗原に対し免疫寛容を産生するように処置され、そのような抗原が霊長類に更に存在する場合に霊長類に抗体が存在し、そのような処置で霊長類が抗原に免疫寛容になるようにする。このようなＣＤ４抗体またはその断片、あるいはもう一つの化合物と組合されるＣＤ４抗体またはその断片は、ＭＬＲでｉｎ ｖｉｔｒｏで試験された際に（一次または二次ＭＬＲの少なくとも一つでｉｎ ｖｉｔｒｏで試験された際にそこに産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量を減少させる一次ＭＬＲで産生される細胞集団で、一次ＭＬＲで産生されるＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量を減少させる）前に記載の特性を持つ。
【００４２】
ＣＤ４抗体は、望ましくはモノクローナル抗体（またはＣＤ４に結合する能力を持つその断片）である。抗体はヒト抗体または非ヒト抗体であることができ、非ヒト抗体はヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体などを含む。
【００４３】
ＣＤ４抗体またはその断片、あるいはもう一つの化合物と組合される少なくとも１個のＣＤ４抗体またはその断片は、外来抗原または自己抗原および望ましくは外来抗原に免疫寛容を誘導するのに有効な量と時間で霊長類に投与される。
【００４４】
望ましい実施例に従って、ＣＤ４抗体またはその断片は、このような抗体または断片の適切な水準を霊長類で維持するために、あるいは前記抗体または断片が前に記載のもう一つの化合物と組合せて免疫寛容を誘導するのに十分な期間にわたり前記組合せの有効用量で使用される場合にその期間にわたり投与される。
【００４５】
一般に抗体（またはその断片）は、少なくとも約４０ｍｇ、望ましくは少なくとも約５０ｍｇおよびより望ましくは少なくとも約７０ｍｇを単独で、またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて最初の用量で投与される。
【００４６】
望ましい実施例において、当初用量は少なくとも４００ｍｇ，望ましくは少なくとも約５００ｍｇ、および特定の実施例で少なくとも約７００ｍｇの量であり、単独、または前に記載のもう一つの化合物と組合される。
【００４７】
当初の用量は２４時間に１回またはそれ以上の用量で、および望ましくは２４時間に１回の用量で、単独または前に記載のもう一つの化合物と組合せて投与される。
【００４８】
用量がここで使用されるように、２４時間に１回以上単独またはここで記載のもう一つの化合物と組合せて投与される場合であっても、用量は２４時間にわたり投与される抗体の全量である。
【００４９】
大抵の場合、当初用量の後に、ＣＤ４抗体（またはその適当な断片）は、数日間１個もしくはそれ以上の追跡用量で投与され、各追跡用量は２４時間で１個またはそれ以上の用量で単独またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて投与される。追跡用量は、抗体の血清水準を当初用量で達成された水準に戻す量で単独またはここに記載されたもう一つの化合物と組合せて提供される。
【００５０】
望ましい実施例において、最小追跡用量は、ここに記載の量に少なくとも等しい量であり、もとのまたは当初用量単独あるいはここに記載のもう一つの化合物と組合せて与えられる用量と同じであり、またはそうでない場合もある。かくして追跡用量は、一般に少なくとも４０ｍｇ、望ましくは少なくとも５０ｍｇ、およびより望ましくは少なくとも７０ｍｇを単独であるいはここに記載のもう一つの化合物と組合せる量である。前に記載の通り、一つの望ましい実施例において、追跡用量は少なくとも４００ｍｇ、望ましくは少なくとも５００ｍｇ、また特定の実施例では、少なくとも７００ｍｇ、単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合された量である。ある場合には、追跡用量は、単独またはここで記載されたもう一つの化合物と併用して最小量以下の場合もある。
【００５１】
１個以上の追跡用量がある場合には、２４時間にわたるこのような各追跡用量は、単独またはここで記載のもう一つの化合物と組合されるもう一つの追跡用量と同じまたは異なる場合もある。
【００５２】
追跡用量の回数は変化するが、望ましい実施例において、一般に少なくとも１回の追跡用量、および大抵の場合７回以下の追跡用量があり、すなわち用量の回数は単独でまたはここで記載されたもう一つの化合物との組合せで８回の用量を越えることはない。
【００５３】
抗体が投与される全期間は、一般に４週を越えることはなく、より望ましくは単独でまたはここで記載されたもう一つの化合物との組合せで３週を越えない。多くの場合免疫寛容は、当初用量および１回またはそれ以上の追跡用量を、単独またはここで記載されたもう一つの化合物との組合せで２週間を越えない期間に使用することで達成される。
【００５４】
本発明に従って、抗原に対する当初の免疫寛容は４週以下の期間で霊長類で達成できるけれども、ある場合には免疫寛容を維持するために、抗体単独でまたはここで記載されたもう一つの化合物と組合せで周期的な追跡処置が必要とされる場合もある。
【００５５】
前に記載されたように、少なくとも１個のＣＤ４抗体（またはその適切な断片）は、抗原に対し、また望ましい実施例では外来抗原に対し、単独でまたはここに記載したもう一つの化合物と組合せて、霊長類に免疫寛容を誘導するのに十分な量で送達される。最大量は勿論安全を考慮して限定される。一般に抗体の１日用量は、単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合せて６０００ｍｇ以下となるであろう。
【００５６】
追跡用量の回数とその間隔とりは、部分的には少なくとも１個のＣＤ４抗体の半減期により決定される。本発明はそれにより限定されるものではないが、ＣＤ４抗体は処置される霊長類のすべてのＣＤ４を飽和するのに必要な量を超える抗体血清水準を達成する量で当初送達され、追跡用量は単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合せて抗原に対し霊長類に免疫寛容を誘導する期間にわたりそのような超過を維持するために時々与えられる。
【００５７】
望ましい実施例において、ＣＤ４抗体は、ヒトＩｇＧ１と比較して減少エフェクター（すなわち溶解）機能を持つＣＤ４抗体である。減少エフェクター機能を持つ代表的な例としては、非糖鎖付加Ｆｃ部分を持ち、およびまたはＦｃ受容体へ結合が減少し、およびまたは非溶解性である抗体を挙げることができる。
【００５８】
一つの実施例では、減少エフェクター機能を持つＣＤ４抗体は、非枯渇ＣＤ４抗体である。ここで使用されるように、「非枯渇Ｃ４抗体」はＣＤ４細胞を５０％以下枯渇する抗体であり、望ましくはＣＤ４細胞を１０％以下枯渇する抗体である。
【００５９】
霊長類、およびとりわけヒトを処置する場合、ＣＤ４抗体は薬理許容担体のみと組合せ、あるいはここに記載のもう一つの化合物と組合せて採用される。ＣＤ４抗体を含む組成物は、他の成分、例えば安定剤およびまたは他の活性剤単独であるいはここに記載のもう一つの化合物を組合せて含むこともある。
【００６０】
本発明に従って、霊長類の抗原に免疫寛容を誘導するＣＤ４抗体単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合わせるＣＤ４抗体の使用法は、１個またはそれ以上の抗原に免疫寛容を提供し、霊長類は他の抗原に免疫学的に応答することができる。かくしてこの点に関し、霊長類は、１個またはそれ以上の抗原に免疫寛容化され、また免疫系は、他の外来抗原に対し免疫応答を提供することが可能となり、このため霊長類な免疫無防備ではなくなる。
【００６１】
免疫寛容が抗原に対して導入される望ましい実施例において、ＣＤ４抗体は、抗原が単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合せて送達される前に、それと同時に、または送達後に霊長類に投与される。望ましい実施例において、霊長類は、抗体が霊長類に存在するようにＣＤ４抗体を単独で、またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて一度に投与される。とりわけ望ましい実施例において、単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合されるＣＤ４抗体（またはその断片）は、その後、数時間または１日以下で霊長類が免疫寛容になる抗原に霊長類を接触させる前に霊長類に送達される。望ましい実施例において、抗体単独またはここに記載されたもう一つの化合物と併用された抗体は、抗原を受け入れる霊長類に対し、約２日前、望ましくは１日前に投与される。
【００６２】
前に記載したように、一つの実施例において、霊長類は、霊長類を処置するのに使用される治療用タンパク質に対し免疫寛容化される。このような治療用タンパク質は（ＣＤ４抗体以外の）治療用抗体であり、この治療用抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または非ヒト抗体；代償療法で使用されるものなどの酵素；ホルモン；凝固因子；遺伝子治療で産生されるタンパク質；単独またはここで記載されたもう一つの化合物と組合せて遺伝子治療で使用されるベクターなどの遺伝子治療送達伝達体（例えばアデノウイルスベクター）などであることができる。
【００６３】
本発明は、更に免疫寛容が、化合物またはここに記載された２個またはそれ以上の化合物の組合せで誘導され、そのような化合物または組合せが治療用タンパク質に対し免疫寛容を誘導するような治療用タンパク質を含むキットまたはパッケージを考慮する。
【００６４】
外来抗原は、移植された器官，細胞治療に使用された移植細胞、または皮膚などの他の組織移植片に存在する。
【００６５】
霊長類をＣＤ４の使用により外来抗原に対し免疫寛容にするために、霊長類、とりわけヒトの処置は、外来抗原の免疫およびまたはＴ細胞の枯渇およびまたは免疫抑制を促進するための骨髄移植などのようなアジュバンド治療なしである場合には達成することができる。
【００６６】
限定されない一つの実施例において、抗体は望ましくはＴＲＸ１抗体（ここで以下に記載したもの）、すなわちここで以下に記載されているＴＲＸ１と同じエピトープに結合する抗体であり、このような抗体は、単独でまたはここで記載された薬剤、処置または方法と組合せてここで記載された用量処方で望ましくは使用される。
【００６７】
本発明の見地に従って、図１で示されるヒト化抗体、および図２で示されるヒト化抗体、更に図３で示されるヒト化抗体、また図４で示されるヒト化抗体より成るグループから選択されるヒト化抗体としてヒトリンパ球と同じエピトープ（またはその部分）と結合する分子（望ましくはヒト化抗体またはその断片）が提供される。
【００６８】
抗体は、以下で時々ＴＲＸ１として引用される。「分子」または「ＴＲＸ１と同じエピトープに結合する抗体」はＴＲＸ１を含む。「ＴＲＸ１」という用語は、図１で示される抗体、図２で示される抗体、および図３で示される抗体の一つおよび図４で示される抗体の一つを含み、例えば組み換え技術で産生されるそれらと同一のものを含む。
【００６９】
望ましい抗体はＴＲＸ１であるけれども、ここでの教示から当業者はＴＲＸ１に同等の抗体を産生することができる。そのようなＴＲＸ１同等抗体の代表的で限定されない例として、以下のものがある。
【００７０】
１）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するヒト化抗体、
２）ＴＲＸ１と同じＣＤＲｓを持つが、異なるヒト化フレームワークおよびまたは異なるヒト定常領域を持つヒト化抗体、
３）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するヒト化抗体であって、ここで、ＴＲＸ１の１個またはそれ以上のＣＤＲｓの１個またはそれ以上のアミノ酸が変化しており（望ましくは必ずしも保存アミノ酸置換である必要はなく）、またここで、フレームワークは、ＴＲＸ１と同じフレームワークであってもよく、あるいは異なるヒト化フレームワークを持つこともあり、あるいはここでＴＲＸ１のフレームワーク領域の１個またはそれ以上のアミノ酸が変化しており、およびまたはここで、定常領域がＴＲＸ１と同じまたは異なっていてもよいヒト化抗体、
４）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するヒト化抗体であって、ここで抗体が受容体のＦｃ領域に結合しないヒト化抗体、
５）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するヒト化抗体であって、ここでそのＣＤＲｓがグリコシル化（糖鎖付加）部位を含まないヒト化抗体、
６）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合し、また受容体のＦｃ領域と結合せず、更に、ＣＤＲｓはグリコシル化（糖鎖付加）部位を含まないヒト化抗体、
７）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するキメラ抗体、および
８）ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するマウス抗体。
【００７１】
ＴＲＸ１と同等である抗体は、ＴＲＸ１と同じやり方でまた同じ目的に使用することができる。
【００７２】
本発明の分子または抗体は、動物、とりわけヒトを処置する方法に使用され、とりわけ抗原に免疫応答に誘導することを含む、外来抗原または自己抗原である抗原への免疫応答を阻害し、改善し、または減少する用途に使用することができる。分子または抗体は、クラスＩ提示抗原およびまたはクラスＩＩ提示抗原への免疫応答を阻害し、改善し、または減少するのに使用できる。分子または抗体は、このような抗原への免疫応答を阻害し、改善し、または減少するのに使用される。移植片の場合、例えばクラスＩおよびクラスＩＩ主要組織適合（ＭＨＣ）抗原および非ＭＨＣまたは副組織適合抗原が提示される。移植抗原とは別に、分子または抗体は、球状タンパク質、免疫グロブリンなどの糖タンパク質、花粉タンパク質などの粒子を運搬する物質、インターフェロン、インターロイキン２または腫瘍懐死因子などの治療用途を意図したポリペプチド、または黄体ホルモン、その類似体および拮抗薬などのホルモン置換物、などの免疫応答を阻害し、改善し、または減少するために使用することができる。免疫応答が阻害され、改善され、または減少されることのできる更なる特異的抗原は、受容体遮断を助けるために使用されるタンパク質治療薬の合成ペプチド相似体、および同種抗原は、組織移植または皮膚移植における外来組織の拒絶の原因となる。ここで使用される「抗原」という用語は、動物、望ましく霊長類、より望ましくはヒトにおける免疫応答に免疫寛容を誘導するサブスタンス物質である。免疫応答は、体液性応答を伴い、または伴わないＴ細胞応答である。
【００７３】
本発明の分子または抗体は、Ｔ細胞活性化および増殖を阻害し、およびまたは変更し、また出願人は、Ｔ細胞活性化を刺激する薬剤を単独で、あるいはここに記載の薬剤、処置または方法と組合せる薬剤の前または後のいずれかに本発明の分子または抗体を加えることで、そのような阻害を実現できることを発見した。
【００７４】
本発明の分子または抗体は、ＣＤ４抗原（ＣＤ４正ヒトＴ細胞）のエピトープに結合する特性を持つが、しかし抗体がＴ細胞上でＣＤ４抗原に結合するというように機能するものと考えられているけれども、抗体は他の細胞、例えば単球上のＣＤ４抗原と結合することで機能する、ということは理解されねばならない。結果として、Ｔ細胞の活性化または増殖を阻害し、およびまたは変更するこのような分子または抗体の能力は、ＣＤ４正細胞との結合を通して実行される場合もあり、そうでない場合もある。
【００７５】
本発明のもう一つの見地に従って、以下でＴＲＸ１（またはその断片あるいは誘導体）として引用する抗体、またはＴＲＸ１と同じエピトープに結合するこのような抗体または誘導体あるいはその断片を擬態するいずれかの分子の患者への投与を通じて、ヒト患者に進行中の免疫応答を予防しおよびまたは阻害する方法が提供される。
【００７６】
本出願を通じてここで使用される「阻害する」という用語は、一つまたはそれ以上の抗原に対する免疫応答の予防、または阻害、あるいは発病度の減少、もしくは改善を意味することを意図する。抗原は、外来抗原または自己抗原である。本出願の目的のためにここで使用される「移植」という用語は、必ずしもそれに限定されないが、同種移植または異種移植を含むいずれかまたはすべての移植を意味する。このような移植は、例として必ずしもそれに限定されないが、細胞、骨髄、組織、固形器官、骨などの移植を含む。
【００７７】
ここで使用される「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞活性化および増殖に依存する免疫応答を意味することを意図し、それは細胞性効果とＴ細胞依存性抗体の両方を含み、例としてまた限定されないものとして、（ｉ）移植片、（ｉｉ）移植片対宿主病、（ｉｉｉ）例によりまた必ずしもそれに限定されないが、慢性関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性硬化、真性糖尿病などを含む自己免疫疾患で生じる自己抗原などに対し応答して引出されるものである。
【００７８】
本発明で採用される化合物は、ＴＲＸ１ヒト化抗体と同じエピトープ（またはそのエピトープの一部）と結合する化合物である。「ＴＲＸ１ヒト化抗体と同じエピトープに結合する」という用語は、必ずしもＴＲＸ１ヒト化抗体だけでなく、ＴＲＸ１ヒト化抗体と同じエピトープに結合する他の抗体、その断片または誘導体あるいは分子を記載するものと意図される。
【００７９】
このような分子は望ましくは抗体であるが、核酸アプタマーも含む。望ましい実施例において、抗体は抗体のＦｃ領域を通じてＦｃ受容体と結合せず、またＣＤＲｓはグリコシル化部位を含まない。
【００８０】
定常領域は、グリコシル化部位を含むことができ、または含まないこともある。一つの実施例において、定常領域はグリコシル化部位を含む。グリコシル化部位を含む重鎖配列の一つの例は、図１Ｄおよび図１Ｆまた図３Ｄならびに図３Ｆで示される。もう一つの実施例において、定常領域はグリコシル化部位を含まない。グリコシル化部位を含まない重鎖配列の１例は、図２Ｄおよび図２Ｆまたは図４Ｄならびに図４Ｆで示される。
【００８１】
このような他の抗体は、例によってまたそれに限定されないが、ラット、マウス、ブタ、ウシ、ヒト、キメラ、ヒト化などの抗体、またはその断片あるいは誘導体である。
【００８２】
ここで使用される「断片」という用語は、抗体の部分を意味するが、例に従ってこのような抗体の部分は、必ずしもそれに限定されないが、ＴＲＸ１で認識される同じエピトープまたはそのいずれかの部分に結合するＣＤＲ、Ｆａｂ、またはそのような他の部分を含む。
【００８３】
ここで使用される「抗体」という用語は、ヒト化抗体ＴＲＸ１により認識される同じエピトープまたはその部分に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体、同じく抗体断片および誘導体、同じく組換え技術により調製される抗体、例えばキメラまたはヒト化抗体、一本鎖または二重特異性抗体、などを含む。「分子」という用語は、例に従いまた限定されることなく、抗体を擬態し、または抗体断片あるいはその誘導体の同じエピトープまたはその部分と結合するいずれかの源から誘導されるペプチド、オリゴヌクレオチドまたは他のそのような化合物を含む。
【００８４】
本発明のもう一つの実施例は、ＴＲＸ１抗体単独で、またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて同じエピトープ（またはその部分）と結合するＴＲＸ１抗体、または抗体、あるいはその誘導体または断片もしくは分子と同じエピトープ（またはその部分）より成るグループから選択される少なくとも１個の部材の有効量で移植片移植を受けるまたは既に受けている患者を処置する方法が提供されている。この処置は、望ましくは全あるいは無償ＴＲＸ１抗体単独で、またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて実行される。
【００８５】
一つの実施例において、抗体は、ヒト抗体の修飾された定常領域および軽鎖と重鎖フレームワーク領域およびＣＤＲ領域を含むヒト化抗体であるＴＲＸ１であり、ここで軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域として一致し、またマウスモノクローナル抗体から誘導されるＣＤＲｓは、ＮＳＭ４．７．２．４と名付けられる。ＴＲＸ１抗体は図１で示される。図１Ａは、ＴＲＸ１軽鎖のアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図１Ｂは、ＴＲＸ１軽鎖核酸配列を示す。図１Ｃは、ハイライトＣＤＲｓを持つＴＲＸ１軽鎖アミノ酸配列を示す。図１Ｄは、グリコシル化部位を含むＴＲＸ１重鎖のアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図１Ｅは、ＴＲＸ１重鎖ヌクレオチド配列を示す。図１Ｆは、ＴＲＸ１重鎖アミノ酸配列を示し、それはハイライトＣＤＲｓを持つグリコシル化部位を含む。
【００８６】
もう一つの実施例において、抗体はＴＲＸ１であり、これはヒト抗体の修飾定常領域および軽鎖、重鎖フレームワーク更にＣＤＲ領域を含み、ここで軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域のフレームワークに一致し、またマウスモノクローナル抗体から誘導されたＣＤＲは、ＮＳＭ４．７．２．４と名付けられる。ＴＲＸ１抗体は、図３で示される。図３Ａは、ＴＲＸ１軽鎖のアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図３Ｂは、ＴＲＸ１軽鎖核酸配列を示す。図３Ｃは、ハイライトＣＤＲｓを持つＴＲＸ１軽鎖アミノ酸配列を示す。図３Ｄは、グリコシル化部位を含むＴＲＸ１重鎖のアミノ酸およびＤＮＡ配列を含む。図３Ｅは、ＴＲＸ１重鎖ヌクレオチド配列を示す。図３ＦはＴＲＸ１重鎖アミノ酸配列を示し、それはハイライトＣＤＲｓを持つグリコシル化部位を含む。
【００８７】
ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例は、図２で示される。図２Ａは軽鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図２Ｂは、軽鎖核酸配列を示す。図２Ｃは、ハイライトＣＤＲｓを持つ軽鎖アミノ酸配列を示す。図２Ｄは、重鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図２Ｅは、重鎖ヌクレオチド配列を示す。図２Ｆは、ハイライトＣＤＲｓを持つ重鎖アミノ酸配列を示す。
【００８８】
ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例は、図４で示される。図４Ａは、軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図４Ｂは、軽鎖核酸配列を示す。図４Ｃは、ハイライトＣＤＲｓを持つ軽鎖アミノ酸配列を示す。図４Ｄは、重鎖のアミノ酸およびＤＮＡ配列を示す。図４Ｅは、重鎖ヌクレオチド配列を示す。図４Ｆは、ハイライトＣＤＲｓを持つ重鎖アミノ酸配列を示す。
【００８９】
各図においては、アミノ酸残基１は、各重鎖および軽鎖でリーダー配列後の第１アミノ酸である。それは更に配列内でのＦＲ１の第１残基である。
【００９０】
本発明の目的に適したＴＲＸ１ヒト化抗体の調製は、ここでの教示から従来の技術に習熟した人にとっては明らかなものである。このような抗体は、当業者に公知の組換え技術により調製することができる。
【００９１】
本発明の抗体は、単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合せてこのような免疫応答を阻害する有効量で抗体（またはその断片）を投与することで動物の免疫応答を阻害するのに使用することができる。
【００９２】
例えばある場合には、治療薬を用いる処置は、治療薬に対する免疫応答を含む。このような治療薬の代表的な例として、レオプロおよびＯＫＴ３などのモノクローナル抗体、必ずしもそれに限定されないが、ゴシエ病用グルコセレブロシダーゼなどの代償療法のための酵素および因子ＶＩＩＩなどの凝固因子、およびアデノウイルス誘導ベクターなどの遺伝子治療および遺伝子治療送達伝達体などがあげられる。
【００９３】
本発明の一つの見地に従って、前に記載の抗体（またはこのような抗体の断片）は、このような治療薬で処置される患者に投与され、抗体（または断片）は治療薬に対し免疫応答を阻害する有効量で投与される。抗体は治療薬の投与の前に、またはそれと組合わせて、あるいはその投与の後で投与される。投与の方法は、必ずしもそれに限定されないが、特異的な徴候、特異的な治療薬および最適用量スケジュールを含む各種の因子に依存する。治療薬の投与の前に投与される場合には、抗体は治療薬の投与の約１時間乃至約１０日前、望ましくは治療薬投与の約１時間乃至約２４時間前に投与される。治療薬の投与の後に投与される場合には、抗体は治療薬投与の約１時間乃至約１０日後、望ましくは治療薬投与の約１時間乃至約２４時間後に投与される。
【００９４】
投与される抗体の量、抗体が投与される用量スケジュールおよび回数は、治療薬および治療薬で患者を処置するために使用される処方に依存する。
【００９５】
一般に抗体は、提供される用量当り０．１ｍｇ乃至３ｍｇの量で使用されるが、霊長類に免疫寛容を誘導するに際しては、抗体は望ましくは前に記載の量で使用される。
【００９６】
本発明の抗体は、更に自己抗原およびまたは外来抗原に対し、例えば移植片（例えば移植片拒絶）に対し、免疫応答を阻害するため、およびまたは移植片対宿主の免疫応答を阻害または改善するために使用することができる。
【００９７】
本発明の抗体は、更に遺伝子治療産物に対する免疫応答、同じく遺伝子治療の有効性を制限するアデノウイルス誘導ベクターなどの遺伝子治療送達伝達体に対する免疫応答を阻害するために使用することができる。
【００９８】
かくして宿主にある抗原への免疫応答は、ＴＲＸ１抗体を抗原と共に投与することにより、阻害し、改善しまたは減少することができる。患者は器官移植片または骨髄移植片などの組織移植片を与えられ、およびその拒絶を阻害するために、移植片と共にＴＲＸ１抗体を与えられる。長期の特異的免疫寛容は、自己免役疾病を処置するために自己抗原または抗原に誘導することができる。
【００９９】
免疫寛容を維持するために、持続的または周期的な抗原の存在が必要とされる。例えば、組織移植片は、それ自身に免疫寛容を維持するために抗原を供給する。アレルゲンなどの異質外来抗原の場合には、抗原「催促状」（抗原継続投与）を決まった間隔で与えることができる。
【０１００】
本発明に従って、前に記載のタイプの抗体またはその断片あるいは分子は、Ｔ細胞の活性化および増殖を阻害し、細胞表面の機能的ＣＤ４発現の密度を減少させ、およびまたはシグナル伝達に影響を与えてこれによりＣＤ４＋Ｔリンパ球の機能性およびまたはＣＤ４＋Ｔリンパ球数を減少させるために、ｉｎ ｖｉｖｏ単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合せて投与することができる。
【０１０１】
かくして例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの手順において、このような抗体は、免疫応答を予防およびまたは阻害し、それによりＴ細胞活性化おえび増殖を阻害するために投与される。
【０１０２】
本発明の一つの見地に従って、前に記載のタイプの抗体またはその断片あるいは分子は、細胞表面の機能的ＣＤ４＋発現の密度を減少しおよびまたはシグナル伝達に影響を与え、かくしてＣＤ４＋Ｔリンパ球の機能性およびまたは供与者体細胞のＣＤ４＋細胞数を減少するために、ｅｘ ｖｉｖｏで単独またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて投与することができる。例に従い、また制限することなく、ｅｘ ｖｉｖｏでの手順において、このような抗体またはその断片あるいは誘導体もしくは分子は、移植にあたり移植片対宿主病の発症を予防するために、移植の前に供与体の骨髄に注入されることとなる。
【０１０３】
抗体またはその断片は、単独またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて薬理許容担体で一般に投与される。このような薬理担体の代表的な例として、通常の生理食塩水、緩衝液などを言及することができる。このような薬理担体は、従来の技術で公知であり、適切な担体の選択は、ここに含まれる教示から通常の知識を有する人の範囲内にあるものと見做される。
【０１０４】
本発明のＴＲＸ１抗体または他の抗体は、単独またはここに記載の薬剤、処置または方法と組合せて静脈内、皮下、または筋肉内投与でｉｎ ｖｉｖｏで投与される。
【０１０５】
前に記載したように、本発明のＴＲＸ１抗体または他の抗体は、単独またはここに記載のもう一つの化合物と組合せて抗原に対する免疫応答を阻害する有効量でｉｎ ｖｉｖｏで投与される。本出願の目的のための「有効量」という用語は、望ましい効果を産生できる抗体量を意味する。一般にこのような抗体は、用量当り少なくとも０．１ｍｇの量で投与される。それより少ない量でも使用できることも理解されねばならない。当初の処置後更に、前に記載の量は、続く処置の段階がもし必要であればその段階で減少される。発明の範囲は、このような量で限定されるものではない。しかし霊長類に免疫寛容を誘導するために、抗体は前に記載の量で使用されねばならない。
【０１０６】
本発明のＴＲＸ１抗体または他の抗体は、抗原に免疫寛容を誘導するために、単独でまたはここに記載のもう一つの化合物と組合せて採用することができる。ここで使用される「免疫寛容」という用語は、Ｔ細胞非応答が、攻撃誘発の場合にあってさえ、抗体処置の停止後においても抗原に対して持続することを意味する。しかしもし必要である場合には、このような免疫寛容を維持するために、抗体のブースターまたは追加抗原投与用量を与えることができる。
【０１０７】
Ｔ細胞の活性化を阻害する本発明の技術は、単独でまたは他の処置、薬剤、方法、例えばＴ細胞の活性化を阻害する他の処置、薬剤または方法、あるいは移植体拒絶または移植片対宿主病を阻害し、あるいは各種の自己免役疾病を処置する、などの他の処置、薬剤または方法と組合せて採用することができる。霊長類に免疫寛容を誘導する化合物と組合わせて使用されるこのような薬剤、処置または方法のいくつかの例は、必ずしもそれに限定されないが、リツキサンＴＭ（ジェネテック）；Ｂ細胞に特異的な抗体；限定されないがＩＤ４（リサーチ・ダイアグノスティクスを含むプラズマ細胞に特異的な抗体；セルセプトＴＭ（ロシュ）；シクロスポリン；ラパマイシン；抗ＣＤ４０Ｌ；抗ＩＬ１２；抗ＩＬ１８；抗インターフェロンガンマ；プロテオソーム阻害薬；ＣＸＣＲ３拮抗薬；１５デオキシスペルグアリン；ＦＫ５０６；ＣＤ２，ＣＤ８およびＣＤ２８などの共刺激分子に向けられるモノクローナル抗体並びに付着分子に向けられるモノクローナル抗体を含む。
【０１０８】
本発明の抗体は、更に例えば血液試料などの試料でＣＤ４正細胞の存在を決定するための選択方法で採用される。このような方法においては、試料は分子または抗体と接触され、またＣＤ４正細胞の存在が確認され、およびまたはＣＤ４正細胞は、次いで試料から選択または単離することができる。
【０１０９】
望ましい実施例において、ＴＲＸ１と同じエピトープに結合するＴＲＸ１抗体または抗体は、霊長類（とりわけヒト）での抗原に対する免疫寛容を誘導するために、単独またはここで記載の薬剤、処置または方法と組合せて採用される。
【実施例】
【０１１０】
本発明は、これから以下の実施例と関連して記載される。しかし本発明の範囲は、それにより制限されることを意図するものではない。
【０１１１】
実施例１
ｃＤＮＡライブラリーが、製造メーカの示唆するプロトコルに従って、スーパースクリプトプラスミドシステム（ジブコ／ＢＲＬ，カタログ番号８２４８５Ａ）を用いてマウスハイブリドーマＮＳＭ４．７．２．４から構築された。重鎖および軽鎖ｃＤＮＡは、ラットハイブリドーマＹＴＳ１７７からのラット重鎖および軽鎖遺伝子ｃＤＮＡをプローブとして使用するＤＮＡハイブリダイゼーションにより、ライブラリーからクローンされた。
【０１１２】
ＹＴＳ１７７のラット重鎖および軽鎖遺伝子ｃＤＮＡｓは、ＢａｍＨＩ／Ｓａ１Ｉ断片として発現ベクターｐＨＡ Ｐｒ−１から単離され、３２Ｐで標識され、標準分子生物学的手法を用いてＮＳＭ４．７．２．４．ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために個別に使用された（サムブルック，他，分子クローニング，実験室マニュアル，第３版，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（２００１年）；オースベル，他、分子生物学における現行のプロトコル，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ，ニューヨーク（２００１年）．ＮＳＭ４．７．２．４．ｃＤＮＡライブラリーから誘導されたｃＤＮＡｓの配列分析は、ＮＳＭ４．７．２．４重鎖がマウスガンマ−１サブクラスであり、ＮＳＭ４．７．２．４軽鎖がカッパであることを確認した。ＮＳＭ４．７．２．４重鎖および軽鎖Ｖ領域（それぞれＶＨおよびＶＬ）はヒトＶＨおよびＶＬ領域に「ベストフィット」すなわちマウスのそれとフレームワーク領域で最高の類似性を持つように変形された。軽鎖として、７９％の配列類似性を持つヒト抗体ＨＳＩＧＫＡＷ（ＥＭＢＬよりのもの）が使用された（ＬＡ スパッツ他，１９９０年，免疫学ジャーナル，１４４巻：２８２１−２８２８ページ）．ＨＳＩＧＫＡＷ ＶＬの配列は以下の通りである。
【０１１３】
【０１１４】
フレームワーク１の出発点Ｄ（アミノ酸残基）
ＱのＧへの変化
重鎖として、７４％の配列類似性を持つヒト抗体Ａ３２４８３（ジェンバンクよりのもの）が使用された（ラリック，他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１６０巻；１２５０−１２５６ページ（１９８９年））。Ａ３２４８３ ＶＨの配列は以下の通りである。
【０１１５】
【０１１６】
フレームワーク１の出発点Ｑ（アミノ酸残基）
ヒト化過程として、抗ＣＤ４軽鎖クローン７７．５３．１．２（１キロベースの挿入サイズ）および抗ＣＤ４重鎖クローン５８．５９．１（１．７キロベースの挿入サイズ）が、Ｓａ１Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ断片としてｐＳｐｏｒｔベクターから単離されたｃＤＮＡライブラリーおよび挿入片から選択され、配列化のための一本鎖ＤＮＡおよび突然変異誘発のための鋳型を産生するために、Ｍ１３ｍｐ１８ベクターにクローンされた。ＮＳＭ４．７．２．４のヒト化は、製造業者指示のプロトコルに従って、エイマシャム・インターナショナルのキット（ＲＰＮ１５２３）を用いてマウスｃＤＮＡの部位指向突然変異誘発で行われた。
【０１１７】
ＶＬ遺伝子フレームワーク領域の突然変異誘発は、２９乃至７６塩基の長さにわたる５個のオリゴヌクレオチドを用いて行われた。使用されたオリゴヌクレオチドは以下のものであった。
【０１１８】
【０１１９】
オリゴヌクレオチドは、リン酸化され、下記の手順に従って変化を導入するために、突然変異誘発が各ステップで２個以下のオリゴヌクレオチドを用いて３ステップで行われた。
【０１２０】
（１）リン酸化突然変異体オリゴヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡ鋳型へのアニーリング
（２）重合
（３）一本鎖ＤＮＡを除去するための濾過
（４）Ｎｃｉ Ｉでの非突然変異鎖のニッキング
（５）Ｅｘｏ ＩＩＩでの非突然変異鎖の消化
（６）ギャップＤＮＡの再重合
（７）コンピテントＪＭ１０１の形質転換
（８）クローンの配列化
突然変異は、Ｍ１３プライマー−２０および−４０、ならびに突然変異誘発プライマー＃１９９９および＃２０００を用いて、一本鎖ＤＮＡ配列化により確認された。
【０１２１】
可変領域の５′末端でのＳａｌ Ｉ部位は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｋｐｎ Ｉ他断片としての可変領域のＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈの軽鎖定常領域へのクローニングを許すことで、リンカーオリゴヌクレオチド＃２３３４および＃２３３５によりＨｉｎｄ ＩＩＩに変更された。
【０１２２】
【０１２３】
ＶＨ遺伝子フレームワーク領域の突然変異誘発は、２４乃至７５塩基長にわたる５個のオリゴヌクレオチドを用いて行われた。使用されるオリゴヌクレオチドは以下の通りである。
【０１２４】
【０１２５】
突然変異誘発は、変化を導入するため時に応じて２個以下のオリゴヌクレオチドを用いて、前に記載のように再び軽鎖に対して行われた。突然変異は、Ｍ１３プライマー−２０および−４０同じく突然変異誘発プライマー＃２００２および＃２００４を用いる一本鎖ＤＮＡ配列化により確認された。
【０１２６】
プライマー＃２００２は、開始クローン５８．５９．１でのリーディングフレームワークのエラーを訂正するために使用された。
【０１２７】
【０１２８】
プライマー＃２３８０は、最初の配列化で外された＃２００４を加えた余分の突然変異を訂正するために使用された。
【０１２９】
【０１３０】
軽鎖と同じように、重鎖５′Ｓａ１ Ｉ部位は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｓｐｅ Ｉ（プライマー＃２００７により導入された部位）断片として重鎖可変領域のＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈの重鎖定常領域へのクローニングを許すことで、リンカーオリゴヌクレオチド＃２３３４および＃２３３５を用いてＨｉｎｄ ＩＩＩに変更された。
【０１３１】
重鎖の構築
ＤＮＡの下記の試料が使用された。
【０１３２】
１．プラスミド１９９０
ｐＵＣ１８にクローンされたヒトガンマ−１重鎖定常領域遺伝子
（ウエルカム・ファンデーション・リミテッド；マーティン・シムズより入手）
２．プラスミド２３８７
ヒトフレームワーク領域およびマウスガンマ１定常領域を含むＮＳＭ４．７．２．４の再形成重鎖
【０１３３】
再形成ＣＤ４重鎖でのＳａｌ Ｉ部位は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位に変更された。可変領域遺伝子は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｓｐｅ Ｉでの消化により切りとられ、完全なヒト化重鎖（プラスミド２４８６）を与えるためにプラスミド１９９０の定常領域遺伝子と結合された。重鎖遺伝子はＨｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲ Ｉでこのプラスミドから切断され、発現ベクターｐＥＥ６と結合された。
【０１３４】
軽鎖の構築
ＤＮＡの下記の試料が使用された
１．プラスミド２０２８
ＳａｌＩ／ＢａｎＨ Ｉ制限部位でＭ１３ｍｐ１８にクローンされたＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ軽鎖遺伝子
２．プラスミド２１９７
ヒトフレームワーク領域およびマウスカッパ定常領域を含むＮＳＭ４．７．２．４の再形成軽鎖のＫｐｎ Ｉ部位は既にこの遺伝子の可変部分と定常部分の間に導入されている。
【０１３５】
Ｋｐｎ Ｉ制限部位は、プラスミド２１９７にある部位と対応するＣＡＭＰＡＴＨ １Ｈ軽鎖遺伝子に導入され、ＥｃｏＲ Ｉ部位は定常領域の３′末端で導入された。定常領域遺伝子は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｋｐｎ Ｉの消化によりこのプラスミド（２５０２）から切り取られた。
【０１３６】
その間にプラスミド２１９７のＳａｌ Ｉ部位は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位に変更された（このステップは繰り返されねばならなかったが、その理由は、フレームシフト突然変異が故意にではなく初めて導入されたためであった）。新プラスミド（２７３６）は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｋｐｎ Ｉで消化された。ＣＤ４可変領域断片は、完全ヒト化軽鎖（プラスミド２５４８）を与えるために、プラスミド２５０２からのカッパ定常領域遺伝子を含むプラスミドにクローンされた。軽鎖遺伝子はＨｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲ Ｉでこのプラスミドから切断され、プラスミド２７９８を与えるために発現ベクターｐＥＥと結合された。
【０１３７】
重鎖と軽鎖の結合およびＮＳＯ細胞での発現
重鎖遺伝子はＳａｌ Ｉ／Ｂｇｌ ＩＩでの消化によりｐＥＥ６ベクターから切り取られ、ＢａｍＨ Ｉ／Ｓａｌ Ｉで消化された軽鎖ｐＥＥ１２にクローンされた。
【０１３８】
最終ベクター構築物は、７００塩基対軽鎖、１４００塩基対重鎖、ｐＥＥ６の２３００塩基対断片およびｐＥＥ１２の７０００塩基対断片を含む予期された断片の存在を知るために、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ，ＥｃｏＲ Ｉ，Ｓａｌ Ｉ，ＢａｎＨ Ｉ，Ｂｇ Ｉ ＩＩおよびＳｐｅ Ｉでの制限消化により調べられた。
【０１３９】
ｐＥＥ１２ベクターは、Ｓａｌ Ｉでの消化により線形化され、標準プロトコル（セルテック、１９９１）に従って電気穿孔法によりＮＳＯ細胞に形質移入されたが、ＤＭＥＭよりもＩＭＤＭをベースとして選択培地は若干修飾された。形質移入物はグルタミンを欠いた培地で、推奨されたように透析ＦＣＳ，リボヌクレオシド、グルタミン酸、およびアスパラギンを補充して選択された。
【０１４０】
形質移入混合物は３個の９６ウエル平板で培養され、内３６個の増殖中のウエルが試験され、５個はヒト重鎖および軽鎖の産生が強く正であった（他の１８個は一方または他方が正であるか、または両方について僅かに正であった。）。
【０１４１】
ＳＤＧ／Ｂ７Ｂ．Ａ．７と名付けられたクローンが選択され、凍結保存されたが、この野生型抗体にはこれ以上の特徴付けは行われなかった。
【０１４２】
エフェクター機能を廃止するよう指示された突然変位体ＩｇＧｌ抗体の構築
各種臨床試験で報告された他のＣＤ４抗体の副作用に関する懸念の理由から、Ｆｃ受容体と係合する可能性を避けることが望ましいと考えられた。ヒトＩｇＧ４は、最小のＦｃ結合能力または補体活性能を持つものと考えられる。しかし実験によれば、それはいくつかの個体にあるＦｃ受容体と係合し（グリーンウッド，他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３巻，１０９８−１１０４ページ，１９９３年）、またＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈに対するヒトＩｇＧ４変異体についての臨床研究は、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞を死滅させる能力を提示した（アイザック，他，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０６巻、４２７−４３３ページ（１９９６年））ことが示された。Ｆｃ受容体への結合の可能性を排除するために、構築物はＩｇＧｌ重鎖定常領域で突然変異が作られた。
【０１４３】
ＴＲＸ１は、図１Ｄおよび図１Ｅ、また図３Ｄおよび図３Ｅで示されるように、Ｌｅｕ２３６からＡｌａ、およびＧｌｙ２３８からＡｌａへの突然変異体を持つ。これらの特殊な残基が選ばれたのは、ＩｇＧに対するヒトＦｃ受容体の３個の型すべてへの結合を最大限途絶させると予測されたためであった。いずれかの突然変異はＦｃＲＩ（ウーフ、他、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３２巻，５６３−５６４ページ，１９８６；ダンカン，他，Ｎａｔｕｒｅ，３３２巻、５６３−５６４ページ，１９８８年；ランド，他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７巻，２６５７−２６６２ページ，１９９１）またはＦｃＲＩＩ（ランド，他，１９９１；サーメイ、他、Ｍｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９巻、６３３−６３９ページ、１９９２年）への結合を減少させるのに十分であったが、一方Ｇｌｙ２３８からＡｌａへの突然変異は、Ｆｃ ＲＩＩＩ（サーメイ、他、１９９２年）への結合に最大の効果を有している。
【０１４４】
ＤＮＡの下記の試料が使用された
１．プラスミド２５５５およびプラスミド２５５５Ｍｕｔ
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｓｐｅ Ｉ制限部位でｐＥＥ６発現ベクターにクローンされたＮＳＭ４．７．２．４のヒト化ＶＨ領域。プラスミド２５５５は、次いで図１Ｄおよび図１Ｅ、または図３Ｄおよび図３Ｅで示されるアミノ酸残基Ａｓｎ１０１がＡｓｐ１０１に変化するように、部位指向突然変異誘発により突然変異された。
【０１４５】
２．プラスミド２７９８
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲ ＩでｐＥＥ１２発現ベクターにクローンされた約７００塩基対を与えるヒトカッパ定常領域に会合されたＮＳＭ４．７．２．４のヒト化ＶＨ領域。
【０１４６】
３．プラスミドＭＦ４２６０
Ｌｅｕ２３６からＡｌａ、およびＧｌｙ２３８からＡｌａへの突然変異並びにフレームワーク領域４に導入されｐＵＣ１８にクローンされたＳｐｅ Ｉ制限部位を持ちヒト化ＣＤ１８ＶＨ領域と会合されたヒトＩｇＧｌ重鎖。
【０１４７】
ＳｐｅＩ制限部位の目的は、異なる可変領域の分離と組換えを可能にすることであろう。
【０１４８】
ＣＤ１８ＶＨ領域は、Ｓｐｅ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩでの消化によりプラスミドＭＦ４２６０から切り取られ、今や関連重鎖定常領域のみを持つ残存ベクターは、ジェネクリーンを用いて精製された。それは、同じようにプラスミド２５５５Ｍｕｔから単離されたＮＳＭ４．７．２．４のヒト化ＶＨ領域ＤＮＡと連結された。産物は「シュア（Ｓｕｒｅ）」細胞に形質転換するために使用され、またコロニーは予期された１４００塩基対完全重鎖挿入断片の存在を調べられた。
【０１４９】
完全ＶＨおよび定常領域挿入断片は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＥｃｏＲ Ｉでの消化によりｐＵＣベクターから切り取られた。１４００塩基対断片はキエックスＩＩ（キアーゲン）を用いて精製され、次いで前に同じ酵素から切断されたベクターｐＥＥ６に連結された。
【０１５０】
次ぎのステップは、ｐＥＥ６ベクターからＣＤ４重鎖遺伝子を切除し、それを、ヒト化ＣＤ４軽鎖遺伝子を既に含むｐＥＥ１２（プラスミド２７９８）にクローンすることであった。ｐＥＥ６ベクターはＳａｌ ＩおよびＢｇＩ ＩＩで消化され、ｐＥＥ１２ベクターは再結合に適切な部位を創り出すためにＳａｌ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで消化された。
【０１５１】
最終ベクター構築物は、予期される断片、すなわちｐＥＥ６の７００塩基対軽鎖、１４００塩基対重鎖、２３００塩基対断片、およびｐＥＥ１２の７０００塩基対断片の存在を確認するために、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ，ＥｃｏＲ Ｉ，Ｓａｌ ＩおよびＳｐｅ Ｉの制限消化で調べられた。
【０１５２】
ｐＥＥ１２ベクターは、Ｓａｌ Ｉでの消化により線形化された、前記の電気穿孔法でＮＳＯ細胞に形質移入された。形質移入混合物は、６個の９６ウエル平板で培養され、試験された９０増殖ウエルですべてがヒト重鎖および軽鎖の産生に正であった。この段階でｐＥＥ１２ベクターＤＮＡの試料はＳａｌ Ｉで消化され、エタノールで沈殿し、セラピューティック・アンティボディ・センター（ＴＡＣ）に移された。
【０１５３】
最終形質移入のための標的細胞
ＮＳＯ細胞は、ＥＣＡＣＣから直接得られた（クローンＣＢ１７８２，マクセッション番号８５１１０５０３）。マスターセルバンク（ＭＣＢ）は、英国、オクスフォード、チャーチヒルホスピタル、セラピューティック・アンティボディ・センターで調製された。
【０１５４】
形質移入および最終トランスフェクタントの選択
ｐＥＥ１２ベクターは前に記載の電気穿孔法により、ＭＣＢからＮＳＯ細胞に形質移入された。２ｘ１０７細胞全体が８０μｇの線形プラスミドＤＮＡで形質移入され、最終量は２．０ｍｌであった。形質移入混合物は１２個の９６ウエル平板に移され、標準プロトコルに従って、選択培地で培養された（セルテック，グルタミンシンセターゼ遺伝子発現システム、バージョン２−骨髄腫細胞からの発現、改訂６版）。６個の平板は１０メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を含む選択培地を受け入れた。
【０１５５】
抗体の精製
培地上澄みは下記の３ステップでバイオパイロットクロマトグラフィーシステムを用いて精製される。
【０１５６】
（１）タンパク質Ａ−セファローズ・ファスト・フローカラムでのアフィニティークロマトグラフィー
（２）Ｓ−セファロース・ファスト・フローでのイオン交換クロマトグラフィー
（３）スーパーデックス２０でのサイズ排除クロマトグラフィー
精製産物は濾過され、単一バイオコンテナーにプールされた。
【０１５７】
精製工程を通して、システムが無菌を保つように注意が払われる。すべての緩衝液と試薬は０．２ミクロン膜フィルターを通され、精製産物もプールの前に０．２ミクロンフィルターを通される。抗体１バッチが加工された後、全クロマトグラフィーシステムおよびカラムは０．５ＭのＮａＯＨで殺菌され、無菌ＰＢＳで洗浄され、２０％エタノールに貯蔵される。それが再使用される前に、エタノールは無菌ＰＢＳで洗浄され、完全な試験走行が行われる。緩衝液の試料とカラム溶離液は内毒素水準で調べられる。
【０１５８】
実施例２
ヌクレオチド配列から出発するＴＲＸ１抗体の構築
ヒト定常領域のクローニング
重鎖定常領域
ヒトガンマ１重鎖定常領域（Ｉｇ Ｇｌ）は、下記のプライマーセットを使用してヒト白血球ｃＤＮＡ（ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ＴＭ ｃＤＮＡ，カタログ番号７１８２−１，クロンテック）から増幅され、ｐＣＲ−スクリプト（ストラータジーン）にクローンされる。ｐＣＲ−スクリプトにヒトガンマ１重鎖定常領域を含むプラスミドは、ｐＨＣγ−１と命名される。
【０１５９】
【０１６０】
非Ｆｃ結合突然変異（Ｌｅｕ２３６Ａｌａ，Ｇｌｙ２３８Ａｌａ）は、下記のプライマーおよびクロンテックからのトランスフォーマーＴＭ部位指向突然変異誘発キット（カタログ番号Ｋ１６００−１）を使用する部位指向突然変異誘発により重鎖定常領域で作られる。ｐＣＲ−スクリプトにヒトガンマ１重鎖非Ｆｃ結合突然変異体定常領域を含むプラスミドは、ｐＨＣγ−１Ｆｃｍｕｔと命名される。
【０１６１】
【０１６２】
軽鎖定常領域
ヒトカッパ軽鎖定常領域は、下記のプライマーセットを使用してヒト白血球ｃＤＮＡ（Ｑｕｉｃｋ−ＣｌｏｎｅＴＭ ｃＤＮＡ，カタログ番号７１８２−１，クロンテック）から増幅され、ｐＣＲ−スクリプト（ストラータジーン）にクローンされる。ｐＣＲ−スクリプトにヒトカッパ軽鎖定常領域を含むプラスミドは、ｐＬＣκ−１と命名される。
【０１６３】
【０１６４】
ＴＲＸ１可変領域の合成、構築およびクローニング
重鎖および軽鎖可変領域は、全可変領域を含む一連の部分的にオーバーラップする相補的合成オリゴヌクレオチドから構築される。各可変領域で使用されるオリゴヌクレオチドは、以下で示される。
【０１６５】
重鎖可変領域合成オリゴヌクレオチド
【０１６６】
【０１６７】
【０１６８】
ＨＰＬＣ精製と有機溶媒の除去の後、オリゴヌクレオチドはＴＥｐＨ８．０に再懸濁されリン酸化される。それぞれの可変領域セットでの各オリゴヌクレオチドのアリコートは、次いで等モル量に組合される。オリゴヌクレオチド混合物は、６８℃で１０分加熱され、その後ゆっくりと室温まで冷却される。アニーリングされたオリゴヌクレオチドは、ついで二本鎖可変領域ＤＮＡを産生するよう拡張される。この拡張のため、ｄＮＴＰｓが０．２５ｍＭの最終濃度に加えられ、次いで５Ｘ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの適当量［トリスアセテート，ｐＨ７．９，１６５ｎＭ，酢酸ナトリウム３３０ｍＭ，酢酸マグネシウム５０ｍＭ，ＢＳＡ５００ｇ／ｍｌ，ＤＴＴ２．５ｍＭ］およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ，４ユニットが続けて加える。混合物は３７℃で１時間培養され、次いでＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの熱不活化が６５℃で５分続く。
【０１６９】
二本鎖ＤＮＡはエタノール沈殿させ、同量のＴＥ ｐＨ８．０で再懸濁される。適当量の５Ｘ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液［トリス塩酸，ｐＨ７．６，２５０ｍＭ，塩化マグネシウム５０ｍＭ，ＡＴＰ５ｍＭ，ＤＴＴ５ｍＭ，２５％ ｗ／ｖポリエチレングリコール−８０００］が次いで二本鎖ＤＮＡに加えられ、またＴ４ ＤＮＡリガーゼ２ユニットが続き、混合物は拡張断片を連結するために１時間３７℃で培養された。次いでＴ４ ＤＮＡリガーゼは、６５℃で１０分加熱不活化される。可変領域ＤＮＡ断片は、次いでフェノール抽出、エタノール沈殿、ＴＥ，ｐＨ８．０に再懸濁され、ｐＣＲ−スクリプト（ストラータジーン）にクローンされる。重鎖可変領域を含む生成プラスミドはｐＨＶ−１と命名され、軽鎖可変領域を含むプラスミドはｐＬＶ−１と命名された。
【０１７０】
最終重鎖および軽鎖発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１で構築される（インバイトロジェン）。重鎖発現ベクターについては、Ｆｃ突然変異定常領域は、Ｓｐｅ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉでの消化によりプラスミドｐＨＣ−１Ｆｃｍｕｔから放出され、アガロースゲル電気泳動により単離される。重鎖可変領域は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＳｐｅ Ｉでの消化によりプラスミドｐＨＶ−１から放出され、アガロースゲル電子泳動により単離される。同一モル量の２個の断片は、通常の分子生物学手法を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インバイトロジェン）のＨｉｎｄ ＩＩＩ／ＥｃｏＲ Ｉ部位に連結される。生成ＴＲＸ１重鎖発現ベクターは、ｐＴＲＸ１／ＨＣと命名される。
【０１７１】
同様に、軽鎖発現ベクターについては、軽鎖定常領域は、Ｋｐｎ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩでの消化によりプラスミドｐＬＣ−１から放出され、次いでアガロースゲル精製が行われる。軽鎖可変領域は、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎ Ｉでの消化によりｐＬＶ−１から放出され、次いでアガロースゲル精製が続く。等モル量の２個の軽鎖断片は、通常の分子生物学手法を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（インバイトロジェン）のＥｃｏＲ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位に連結され、ＴＲＸ１軽鎖発現ベクターｐＴＲＸ１／ＬＣを産出する。
【０１７２】
ＴＲＸ１抗体の産生については、ＴＲＸ１重鎖およびＴＲＸ１軽鎖発現プラスミドは通常の分子生物学手法を用いてＣＨＯ細胞に同時形質移入される。
【０１７３】
実施例３
図２Ａ，図２Ｃ，図２Ｄおよび、図２Ｆで示されるヒト化抗体は、実施例１のものと同じ手順で産生される。ヒト化抗体は、非グリコシル化（非糖鎖付加）抗体である。
【０１７４】
実施例４
図４Ａ，図４Ｃ，図４Ｄおよび、また図４Ｆで示されるヒト化抗体は、実施例１のものと同じ手順で産生される。ヒト化抗体は、非グリコシル化（非糖鎖付加）抗体である。
【０１７５】
実施例５
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、外来ヒト組織適合抗原を認識する特発されたヒトリンパ球を生成するために使用される。この反応を創り出すために、ヒト末梢血リンパ球がフィコール密度勾配遠心分離法または類似の方法を用いて異なる２個の個体（供与体Ａと供与体Ｂ）からヘパリン化全血から単離された。供与体Ｂからのリンパ球は、血清はないがマイトマイシンＣ５０ｕｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ １６４０培地で１０７／ｍｌに調節される。細胞は３７℃で３０分培養され、次いで供与体Ａ血漿１０％でＲＰＭＩ １６４０で３回遠心分離でマイトマイシンＣを持つ培地を洗浄される。マイトマイシンＣで処理されなかった供与体Ａからの細胞は、供与体Ａ血漿１０％でＲＰＭＩ １６４０で４ｘ１０６／ｍｌに調節される。洗浄後、供与体ＢからのマイトマイシンＣ処理リンパ球は、供与体Ａ血漿１０％でＲＰＭＩで４ｘ１０６／ｍｌに調節される。供与体Ａと供与体Ｂの細胞の等量が混合され、適切な大きさの組織培養フラスコで試験される化合物、あるいは薬剤、処置または方法と組み合わされた前記化合物（「試験化合物」）に配置される。試験化合物のあるまたはないフラスコは、次いで３７℃で空気中炭酸ガス濃度５％で７−１０日間培養される。これは一次混合リンパ球反応である。
【０１７６】
一次ＭＬＲにおける細胞が活性化され、３−７日の間に分裂を開始し、活性増殖の期間に続いて細胞がより休止状態に戻るのを観察することができる。この期間は変化させることができるが、細胞は通常７−１０日の間に休止に戻る。一度細胞が休止にあると見えれば、試験化合物ありまたはなしの一次ＭＬＲフラスコから得た細胞は、遠心分離で回収され、４ｘ１０６ｍｌで供与体Ａ血漿１０％を持つＲＰＭＩ １６４０に再懸濁することができる。新鮮ＰＢＬは供与体Ｂからのヘパリン化全血からフィコール密度勾配により調製されたマイトマイシンＣで再び不活性化され、不活性化供与体Ｂ細胞は、供与対Ａ血漿１０％を持つＲＰＭＩ １６４０で４ｘ１０６／ｍｌに調節される。二次ＭＬＲに対して、等量の一次ＭＬＲ細胞（試験化合物不在下で行われた一次ＭＬＲからの細胞）は、マイトマイシン不活化供与体Ｂ細胞と混合される。
【０１７７】
一次ＭＬＲ細胞（試験化合物不在下で行われたＭＬＲから得られた細胞）が、緑蛍光染料であるＣＦＳＥ，これは生体細胞に移入され、そこで酵素により作用を受け、次いで細胞タンパク質と反応するが、このＣＦＳＥで標識されると、標識細胞で時間にわたり経験した細胞分裂数は、各細胞と結合する緑標識の減少に反映される。もしＣＦＳＥ標識ＭＬＲ細胞が、試験化合物誘導ＭＬＲ細胞に対して２：１乃至１０：１ＭＬＲの比率で試験化合物が処理一次ＭＬＲから誘導れた細胞に加えられた二次ＭＬＲで刺激される場合には、ＣＦＳＥ標識ＭＬＲ細胞増殖の阻害が、試験化化合物誘導細胞の不在下で二次ＭＬＲで刺激されるＣＦＳＥ標識ＭＬＲ細胞の増殖と対比した場合に、刺激の３−４日以内で二次ＭＬＲで観察されるであろう。
【０１７８】
一次ＭＬＲおよび二次ＭＬＲで産生された細胞（ならびに対照ＭＬＲで提供された細胞）は、前記記載のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を分析される。
【０１７９】
対照と比較してＴＲＸ１が前に記載の通り試験された場合、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は一次ＭＬＲで６０％以上減少し、二次ＭＬＲでは２０％以上減少し、また二次ＭＬＲでは、対照と比較してＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−１２の産生は基本的に除去され、ＩＬ−５，ＩＬ−１３，ＩＦＮガンマおよびＴＮＦアルファの産生は４０％以上も削減された。
【０１８０】
実施例６
非枯渇抗ＣＤ４モノクローナル抗体であるＴＲＸ１の使用による非ヒト霊長類での抗原特異的免疫寛容の誘導は、下記の研究で実証された。ヒヒ（Ｐａｐｉｏ ａｎｕｂｕｓ）が任意に３匹の動物の７グループに分割された。７グループは４個の実験グループ，４，６，７および８より成り、３個の対照グループ１，５および９が指定された。本研究は２フェーズより成り、まず免疫化／免疫寛容フェーズがあり、次いで攻撃誘発フェーズであった。
【０１８１】
本研究の免疫化／免疫寛容フェーズに関して、グループ４，６，７および８は第０日、第４日および第８日それぞれ１用量で抗原１（生理食塩水で１０ｍｇ）を３用量使って免疫化された。抗原１は最初の用量が静脈内（ｉｖ）、続くすべての用量が皮下（ＳＣ）で投与される多価集合体ホースＩｇＧ（抗蛇毒素）である。プロトコルのこのフェーズの間、グループ４，６，７および８は、更に非枯渇抗ＣＤ４モノクローナル抗体、ＴＲＸ１の４用量を以下の通り静脈内で受けた。すなわちグループ４は、第１日、第４日、第８日および第１２日に２０ｍｇ／Ｋｇの４用量を受け入れた。グループ６は、第１日、第３日、第８日および第１２日にＴＲＸ１の１ｍｇ／Ｋｇを受けた。グループ７は、第１日、第３日、第８日および第１２日に１０ｍｇ／Ｋｇを受けた。グループ８は、第１日、第３日、第８日および第１２日に４０ｍｇ／Ｋｇを受けた。
【０１８２】
対照グループ１および５は、プロトコルの免疫化／免疫寛容フェーズの間に下記の通り処置された。グループ１は、抗原１を１０ｍｇ／Ｋｇで３用量を受け、第０日、第４日および第８日に各１用量であった。グループ５は、２０ｍｇ／ＫｇのＴＲＸ１抗体の４用量を静脈内で受け、第１日、第４日、第８日および第１２日各１用量であった。グループ９は４０ｍｇ／ＫｇのＴＲＸ１抗体を静脈内で４用量受け、第１日、第４日、第８日および第１２日各１用量であった。
【０１８３】
血液は、ＥＬＩＳＡによるＴＲＸ１の血清水準、循環リンパ球サブセット水準に対するＴＲＸ１処置の薬力学効果、同じくフローサイトメトリーによるＣＤ４受容体占有率、ならびにＥＬＩＳＡによる抗原１のヒヒ抗体応答などを評価するために、抗原１およびまたはＴＲＸ１の各注入の前、およびその１週間後に収集された。
【０１８４】
抗体価（抗体力価）などで測定されるグループ１，４，６，７および８の研究で最初の６８日間にわたる抗蛇毒素の免疫応答が図５で示される。
【０１８５】
本研究の改正誘発フェーズは、ＴＲＸ１の血清水準が検出不能水準に達してすぐ開始された。攻撃誘発フェーズとしては、すべてのグループのすべての動物は、抗原１（１０ｍｇ／Ｋｇ、皮下）および抗原２（１．７ｍｌ／Ｋｇ）で（第６８日に）攻撃誘発された。抗原２は、１用量で静脈内に与えられるヒツジ赤血球細胞の１０％生理食塩水である。抗原１による攻撃誘発は、対照グループ５および９、ならびに試験グループ４および８に対し、第９５日および第１３５日に反復された。血液は、抗原１、ＴＲＸ１の血清水準、および抗原１ならびに抗原２に対するヒヒ抗体応答を評価するために、各攻撃誘発前に収集された。
【０１８６】
図６は、最初の攻撃誘発（第６８日−第９５日）後に、すべてのグループに対して抗体価の測定による抗蛇毒素に対する免疫応答を示す。図７は、攻撃誘発１、攻撃誘発２、および攻撃誘発３の行われた後、グループ１，４，５，８および９に対する抗体価の測定による抗蛇毒素に対する免疫応答を示す。
【０１８７】
ヒツジ赤血球細胞に対するグループ１，４および５の免疫応答の結果は、図８で示される。
【０１８８】
すべての特許、刊行物（公開特許出願を含む）、寄託、アクセッション番号、およびデータベースアクセッション番号は、あたかも各特許、刊行物、寄託アクセッション番号、およびデータベースアクセッション番号が、特異的かつ個別的に引用例としてここに組み込まれるものと同じ範囲で、引用例としてここに組み込まれる。
【０１８９】
実施例７
薬剤、処置または方法と組合されたＴＲＸ１の投与による免疫寛容の誘導は、下記の通り例示される。必ずしも限定されないが、セルセプトＴＭ（Ｃｅｌｌ ＣｅｐｔＴＭ）などの薬剤、処置または方法は、必ずしもそれに限定されないが齧歯目などの哺乳網への免疫寛容を誘発するために、必ずしもそれに限定されないが、ＴＲＸ１などの本発明の化合物と連係して使用することができる。
【０１９０】
必ずしもそれに限定されないが、Ｃ５７ＢＬ６などの齧歯目のグループは、それに対し免疫寛容が必要とされるヒト免疫グロブリンＧ（ｈＩｇＧ）などの抗原の特発用量で処置することができる。ｈＩｇＧの適切な単一用量（例えば２ｍｇ／Ｋｇ）は、例えば免疫寛容処方の２４日前に静脈内注射により与えられるであろう。
【０１９１】
第２５日に、免疫寛容フェーズは、マウスがＴＲＸ１またはＴＲＸ１とセルセプトＴＭの組合せで、またｈＩｇＧの追加用量の投入で処置されることで開始する。用量処方は下記の通りである。グループＩは、第１日、第３日、第５日、第７日、第９日および第１１日に５０ｍｇ／Ｋｇの用量でＴＲＸ１単独で与えられる。グループＩＩは、前記のＴＲＸ１に加えて、第２−第１４日にセルセプトＴＭ（５０ｍｇ／Ｋｇ）の注射を受ける。グループＩＩＩは、前記の用量でセルセプトＴＭのみを受ける。グループＩ，ＩＩおよびＩＩＩは、前記の用量に加えて、第０日、第４日および第８日にｈＩｇＧを１０ｍｇ／Ｋｇで受ける。グループＩＶは前記の用量でｈＩｇＧのみを受ける。すべての用量は、例えば静脈内注射により与えられるであろう。
【０１９２】
攻撃誘発フェーズは、各グループが例えば５ｍｇ／ＫｇでｈＩｇＧの静脈内注射を与えられる第１１８日に開始する。血清が集められ、処置された動物がｈＩｇＧに対する抗体応答を仕掛けることができるかどうかを確認するために、数多くの従来の技術で認められた方法のいずれかで血清は評価される。追加攻撃誘発は、例えば５ｍｇ／ＫｇのｈＩｇＧおよび５ｍｇ／Ｋｇのオボアルブミンの静脈内注射を用いて第１５２日および第１８０日に仕掛けられる。もし動物がｈＩｇＧに免疫寛容化された場合には、処置されたグループ（グループＩ，ＩＩおよびＩＩＩ）でのｈＩｇＧに特異的な抗体水準は、対照グループ（グループＩＶ）と比較して減少することであろう。
【０１９３】
しかし本発明の範囲は、前に記載の特異的な実施例に限定されるものでないことは理解されねばならない。本発明は特に記載されたもの以外にも実施することができ、またそれでも冒頭に掲げた請求範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１Ａ】ＴＲＸ１抗体の第１実施例の軽鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す図
【図１Ｂ】ＴＲＸ１抗体の第１実施例の軽鎖核酸配列を示す図
【図１Ｃ】ＴＲＸ１抗体の第１実施例のハイライトＣＤＲｓを持つ軽鎖アミノ酸配列を示す図
【図１Ｄ】ＴＲＸ１抗体の第１実施例のグリコシル化部位を含む重鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す図
【図１Ｅ】ＴＲＸ１抗体の第１実施例の重鎖ヌクレオチド配列を示す図
【図１Ｆ】ＴＲＸ１抗体の第１実施例のハイライトＣＤＲｓを持ちグリコシル化部位を含む重鎖アミノ酸配列を示す図
【図２Ａ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の軽鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す図
【図２Ｂ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の軽鎖核酸配列を示す図
【図２Ｃ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例のハイライトＣＤＲｓを持つ軽鎖アミノ酸配列を示す図
【図２Ｄ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の重鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す図
【図２Ｅ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の重鎖ヌクレオチド配列を示す図
【図２Ｆ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例のハイライトＣＤＲｓを持つ重鎖アミノ酸配列を示す図
【図３Ａ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の軽鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列示す図
【図３Ｂ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の軽鎖核酸配列を示す図
【図３Ｃ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例のハイライトＣＤＲｓを持つ軽鎖アミノ酸配列を示す図
【図３Ｄ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例のグリコシル化部位を含む重鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す図
【図３Ｅ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の重鎖ヌクレオチド配列を示す図
【図３Ｆ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例のハイライトＣＤＲｓを持ちグリコシル化部位を含む重鎖アミノ酸配列を示す図
【図４Ａ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の軽鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す図
【図４Ｂ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の軽鎖核酸配列を示す図
【図４Ｃ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例のハイライトＣＤＲｓを持つ軽鎖アミノ酸配列を示す図
【図４Ｄ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の重鎖アミノ酸およびＤＮＡ配列を示す図
【図４Ｅ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例の重鎖ヌクレオチド配列を示す図
【図４Ｆ】ＴＲＸ１抗体のもう一つの実施例のハイライトＣＤＲｓを持つ重鎖アミノ酸配列を示す図
【図５】抗蛇毒素のみまたはＴＲＸ１抗体を組合せたものを与えられたヒヒグループ研究の最初の６８日間（すなわち免疫寛容化フェーズ）での抗蛇毒素に対する免疫応答を示す図
【図６】攻撃誘発の６８日前に抗蛇毒素のみ、またはＴＲＸ１を組合せて与えられたヒヒグループに対する抗蛇毒素およびヒツジ赤血球攻撃誘発に続く抗蛇毒素に対する免疫応答を示す図
【図７】最初の攻撃誘発の６８日の後に抗蛇毒素のみまたはＴＲＸ１抗体を組合せて与えられたヒヒグループに対する各３回の抗蛇毒素の攻撃誘発に続く抗蛇毒素に対する免疫応答を示す図
【図８】抗蛇毒素に対するＴＲＸ１免疫寛容化後のヒツジ赤血球への免疫応答を描く図
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個の抗原に免疫寛容を誘導するために霊長類を処置する一つのプロセスであって、
一つの霊長類に１個の化合物、または少なくとも２個の化合物の組合せを投与することにより霊長類を処置し、前記化合物または前記組合せは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの一次混合リンパ球反応において、前記混合リンパ球反応で産生されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量を減少させ、また一次および二次混合リンパ球反応の少なくとも１個でｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量（ｘ）と、二次混合リンパ球反応でのＩＬ−２，ＩＬ−４およびＩＬ−１２の少なくとも１個の量（ｙ）の少なくとも１個を減少させる細胞集団を生成する化合物または組合せであり、前記化合物または前記組合せは、前記少なくとも１個の抗原に対し免疫寛容を誘導するための有効量および有効時間に投与され、前記少なくとも１個の抗原が前記霊長類に存在する場合に、前記化合物または前記組合せが前記霊長類に存在する、
ことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項２】
請求項１記載のプロセスであって、ここで前記化合物または組合せの少なくとも１個の化合物が抗体であることを特徴とするプロセス。
【請求項３】
請求項２記載のプロセスであって、ここで前記抗体がＣＤ４抗体であることを特徴とするプロセス。
【請求項４】
少なくとも１個の抗原に免疫寛容を誘導するために霊長類を処置する一つのプロセスであって、
少なくとも１個の抗原に対し免疫寛容を誘導するための有効量および有効時間に、ＣＤ４抗体またはＣＤ４結合断片を単独またはもう一つの化合物と組合わせて霊長類に投与することにより霊長類を処置し、前記抗原が前記霊長類に存在する場合に前記ＣＤ４抗体または断片が前記霊長類に存在し、また少なくとも４０ｍｇの当初用量で投与される場合に、前記処置が少なくとも１個の抗原に免疫寛容を誘導する、
ことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項５】
請求項４記載のプロセスであって、ここで前記ＣＤ４抗体が単独でまたはもう一つの化合物と組合せて少なくとも１回の追跡用量で投与され、前記追跡用量は少なくとも４０ｍｇであることを特徴とするプロセス。
【請求項６】
請求項４記載のプロセスであって、ここで前記少なくとも１個の抗原が外来抗原であることを特徴とするプロセス。
【請求項７】
請求項５記載のプロセスであって、ここでＣＤ４抗体が非糖鎖付加Ｆｃ部分を持つことを特徴とするプロセス。
【請求項８】
請求項５，６または７のいずれか１項記載のプロセスであって、ここで抗体が図１で示される抗体、図２で知れさめる抗体および図３で示される抗体および図４で示される抗体より成るグループから選択される抗体と同じエピトープと結合するＣＤ４抗体であることを特徴とするプロセス。
【請求項９】
請求項８記載のプロセスであって、ここで抗体がヒト化抗体またはその断片であることを特徴とするプロセス。
【請求項１０】
請求項８記載のプロセスであって、ここで抗体がＦｃ受容体と結合しないことを特徴とするプロセス。
【請求項１１】
一つの抗体であって、図１で示されるヒト化抗体および図２で示されるヒト化抗体および図３で示されるヒト化抗体および図４で示されるヒト化抗体より成るグループから選択されるヒト化抗体と同じエピトープと結合することを特徴とする抗体。
【請求項１２】
一つの組成物であって、
（ａ）請求項１１記載の抗体、および
（ｂ）薬理許容担体
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１３】
患者にある抗原に免疫寛容を誘導する一つのプロセスであって、
請求項１１記載の抗体を単独でまたはもう一つの化合物と組合せて前記患者に投与することにより前記患者を処置し、前記抗体または前記組合わせが前記患者に免疫寛容を誘導する有効量で投与される、
ことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１４】
患者にある免疫応答を阻害する一つのプロセスであって、
請求項１１記載の抗体を単独またはもう一つの化合物と組合せてその有効量を前記患者に投与することにより前記患者を処置する、
ことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１５】
ヒト患者における移植片拒絶を阻害する一つのプロセスであって、
請求項１１記載の抗体を単独でまたはもう一つの化合物と組合せて前記患者に投与することにより前記患者を処置し、ここで前記抗体またはその組合わせが前記移植片の拒絶を阻害する有効量で投与される、
ことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１６】
免疫寛容を誘導するのに使用される１個の化合物、または少なくとも２個の化合物の組合わせをスクリーニングするための一つのプロセスであって、
（ａ）免疫寛容を誘導する能力を試験される前記化合物、または前記組合わせの存在下で、Ｔ細胞を刺激しその増殖をもたらし、また
（ｂ）前記化合物または前記組合わせが前記細胞の減少に正であるいずれもＣＤ４およびＣＤ２５であるそのような細胞の産生を減少させたかどうかを決定するために、いずれも正のＣＤ４およびＣＤ２５である細胞の存在を決定し、前記化合物または前記組合わせが免疫寛容を誘導できることを示す、
ことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１７】
請求項１６記載のプロセスであって、更にステップ（ａ）で産生された細胞の存在下で２次混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を実施し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞（ｘ）とＩＬ−２，ＩＬ−４およびＩＬ−１２の少なくとも１個（ｙ）の少なくとも１個、ならびに（ｘ）または（ｙ）の少なくとも１個の減少を確認し、前記化合物または前記組合わせが免疫寛容を誘導できることを示すことを特徴とするプロセス。
【請求項１】
少なくとも１個の抗原に免疫寛容を誘導するために霊長類を処置する一つのプロセスであって、
一つの霊長類に１個の化合物、または少なくとも２個の化合物の組合せを投与することにより霊長類を処置し、前記化合物または前記組合せは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの一次混合リンパ球反応において、前記混合リンパ球反応で産生されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量を減少させ、また一次および二次混合リンパ球反応の少なくとも１個でｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞量（ｘ）と、二次混合リンパ球反応でのＩＬ−２，ＩＬ−４およびＩＬ−１２の少なくとも１個の量（ｙ）の少なくとも１個を減少させる細胞集団を生成する化合物または組合せであり、前記化合物または前記組合せは、前記少なくとも１個の抗原に対し免疫寛容を誘導するための有効量および有効時間に投与され、前記少なくとも１個の抗原が前記霊長類に存在する場合に、前記化合物または前記組合せが前記霊長類に存在する、
ことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項２】
請求項１記載のプロセスであって、ここで前記化合物または組合せの少なくとも１個の化合物が抗体であることを特徴とするプロセス。
【請求項３】
請求項２記載のプロセスであって、ここで前記抗体がＣＤ４抗体であることを特徴とするプロセス。
【請求項４】
少なくとも１個の抗原に免疫寛容を誘導するために霊長類を処置する一つのプロセスであって、
少なくとも１個の抗原に対し免疫寛容を誘導するための有効量および有効時間に、ＣＤ４抗体またはＣＤ４結合断片を単独またはもう一つの化合物と組合わせて霊長類に投与することにより霊長類を処置し、前記抗原が前記霊長類に存在する場合に前記ＣＤ４抗体または断片が前記霊長類に存在し、また少なくとも４０ｍｇの当初用量で投与される場合に、前記処置が少なくとも１個の抗原に免疫寛容を誘導する、
ことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項５】
請求項４記載のプロセスであって、ここで前記ＣＤ４抗体が単独でまたはもう一つの化合物と組合せて少なくとも１回の追跡用量で投与され、前記追跡用量は少なくとも４０ｍｇであることを特徴とするプロセス。
【請求項６】
請求項４記載のプロセスであって、ここで前記少なくとも１個の抗原が外来抗原であることを特徴とするプロセス。
【請求項７】
請求項５記載のプロセスであって、ここでＣＤ４抗体が非糖鎖付加Ｆｃ部分を持つことを特徴とするプロセス。
【請求項８】
請求項５，６または７のいずれか１項記載のプロセスであって、ここで抗体が図１で示される抗体、図２で知れさめる抗体および図３で示される抗体および図４で示される抗体より成るグループから選択される抗体と同じエピトープと結合するＣＤ４抗体であることを特徴とするプロセス。
【請求項９】
請求項８記載のプロセスであって、ここで抗体がヒト化抗体またはその断片であることを特徴とするプロセス。
【請求項１０】
請求項８記載のプロセスであって、ここで抗体がＦｃ受容体と結合しないことを特徴とするプロセス。
【請求項１１】
一つの抗体であって、図１で示されるヒト化抗体および図２で示されるヒト化抗体および図３で示されるヒト化抗体および図４で示されるヒト化抗体より成るグループから選択されるヒト化抗体と同じエピトープと結合することを特徴とする抗体。
【請求項１２】
一つの組成物であって、
（ａ）請求項１１記載の抗体、および
（ｂ）薬理許容担体
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１３】
患者にある抗原に免疫寛容を誘導する一つのプロセスであって、
請求項１１記載の抗体を単独でまたはもう一つの化合物と組合せて前記患者に投与することにより前記患者を処置し、前記抗体または前記組合わせが前記患者に免疫寛容を誘導する有効量で投与される、
ことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１４】
患者にある免疫応答を阻害する一つのプロセスであって、
請求項１１記載の抗体を単独またはもう一つの化合物と組合せてその有効量を前記患者に投与することにより前記患者を処置する、
ことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１５】
ヒト患者における移植片拒絶を阻害する一つのプロセスであって、
請求項１１記載の抗体を単独でまたはもう一つの化合物と組合せて前記患者に投与することにより前記患者を処置し、ここで前記抗体またはその組合わせが前記移植片の拒絶を阻害する有効量で投与される、
ことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１６】
免疫寛容を誘導するのに使用される１個の化合物、または少なくとも２個の化合物の組合わせをスクリーニングするための一つのプロセスであって、
（ａ）免疫寛容を誘導する能力を試験される前記化合物、または前記組合わせの存在下で、Ｔ細胞を刺激しその増殖をもたらし、また
（ｂ）前記化合物または前記組合わせが前記細胞の減少に正であるいずれもＣＤ４およびＣＤ２５であるそのような細胞の産生を減少させたかどうかを決定するために、いずれも正のＣＤ４およびＣＤ２５である細胞の存在を決定し、前記化合物または前記組合わせが免疫寛容を誘導できることを示す、
ことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１７】
請求項１６記載のプロセスであって、更にステップ（ａ）で産生された細胞の存在下で２次混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を実施し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞（ｘ）とＩＬ−２，ＩＬ−４およびＩＬ−１２の少なくとも１個（ｙ）の少なくとも１個、ならびに（ｘ）または（ｙ）の少なくとも１個の減少を確認し、前記化合物または前記組合わせが免疫寛容を誘導できることを示すことを特徴とするプロセス。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００６−５１９２２８（Ｐ２００６−５１９２２８Ａ）
【公表日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０３１８４（Ｐ２００６−５０３１８４）
【出願日】平成１６年１月２８日（２００４．１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００２６４３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６７５５４
【国際公開日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【出願人】（５０５２８７１６２）トラークス，インコーポレイテッド (2)
【出願人】（５０２１２５０４９）アイシス インノベーション リミテッド (1)
【出願人】（５０３４２１５７５）ケンブリッジ・ユニバーシティ・テクニカル・サービシズ・リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１月２８日（２００４．１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００２６４３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６７５５４
【国際公開日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【出願人】（５０５２８７１６２）トラークス，インコーポレイテッド (2)
【出願人】（５０２１２５０４９）アイシス インノベーション リミテッド (1)
【出願人】（５０３４２１５７５）ケンブリッジ・ユニバーシティ・テクニカル・サービシズ・リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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