抗老化転写因子活性化剤及びその利用
【課題】カロリー制限とは異なる手法による新たな抗老化アプローチを提供する。
【解決手段】転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤として、クルクミノイド類を有効成分として含有する。クルクミノイド類が転写因子FOXO又はその相同体を活性化して、老化形質を発現するのを抑制することができる。
【解決手段】転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤として、クルクミノイド類を有効成分として含有する。クルクミノイド類が転写因子FOXO又はその相同体を活性化して、老化形質を発現するのを抑制することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クルクミノイド類に関し、詳しくは、クルクミノイド類を抗老化転写因子の活性化剤として利用する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
カロリーの過剰摂取は、肥満のほか、老年病につながるメタボリックシンドロームに係わることがよく知られている。これに対して、抗老化、換言すれば寿命を延長させる一つの手法として、カロリー制限が挙げられている。カロリー制限は、酵母、線虫、げっ歯類という幅広い生物種に対して寿命延長モデルとして確立されている。
【０００３】
一方、ウコン（ターメリック）に含まれるテトラヒドロクルミンやクルクミンを含むクルクミノイド類が様々な生理作用を有することが報告されている。例えば、その抗酸化作用、血中中性脂肪の増加抑制作用、抗白内障作用等が知られている（特許文献１、２、３等）。また、クルクミノイド類をヒト細胞に投与した際の発現プロファイリングも報告されている（特許文献４）。
【特許文献１】特開平２−４９７４７号公報
【特許文献２】特開２００３−２８２７号公報
【特許文献３】特開平１１−３４３２３４号公報
【特許文献４】特開２００５−１９８６４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、本発明者らによれば、カロリー制限が、ヒトには必ずしも当てはまらないこともわかってきている。例えば、BMI係数と平均寿命との関係が逆Ｕ字型を呈することも知られている。また、カロリー制限は、精神的ストレスを増加し、感染に対する抵抗性も低下させると考えられる。したがって、カロリー制限に替わる老年病のからの防御法、すなわち、抗老化法を確立することが要請されている。
【０００５】
クルクミノイド類の抗老化に関する生理作用やクルクミノイド類投与時の発現量が既に開示されているが、クルクミノイド類がこうした生理作用を発現させるのにあたって係わる、より直接的なターゲットは未だ同定されていない。低分子化合物であるクルミノイド類の作用対象あるいはそれに近いターゲットが判明すれば、そのターゲットが関連する遺伝子やタンパク質に関連する疾患の予防・治療や生理状態の改善が可能となる。また、ターゲットに対してより効果的な化合物の探索することや設計することも可能となる。さらに、クルミノイド類の存在下、そのターゲットの活性や発現量を増大させる化合物を探索することも可能となる。
【０００６】
そこで、本発明は、カロリー制限とは異なる手法による新たな抗老化アプローチを提供することを一つの目的とする。また、本発明は、こうした抗老化アプローチに基づく、新規な抗老化作用を有する薬剤や食品等、その抗老化作用の発現方法、抗老化作用を有する薬剤のスクリーニング方法、転写因子FOXO及びその相同体が関連する遺伝子産物の製造方法を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、カロリー制限に替えて寿命を延長する手法を見出すため、寿命を延長できる食品成分を探索し、さらに、カロリー制限時における寿命延長効果に関連する転写因子であるDAF-16/FOXO（Forkhead Box Class O）に着目した。そして、研究を重ねた結果、クルクミノイド類がFOXOを介して寿命延長作用を発揮していることを見出し、本発明を完成した。本発明によれば以下の手段が提供される。
【０００８】
本発明によれば、クルクミノイド類を有効成分として含有する転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤が提供される。前記クルクミノイド類は、式（１）
【化３】
（式（１）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、水素、ヒドロキシ又は低級アルコキシを表す。）で表されるクルクミン又はクルクミン誘導体とすることもできるし、式（２）
【化４】
（式（２）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、水素、ヒドロキシ又は低級アルコキシを表す。）で表されるテトラヒドロクルクミン又はテトラヒドロクルクミン誘導体とすることもできる。
【０００９】
本発明によれば、転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防・治療剤であって、上記いずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、予防・治療剤が提供される。
【００１０】
また、本発明によれば、転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な食品であって、上記いずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、食品が提供される。
【００１１】
本発明によれば、転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な食品添加物であって、上記いずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、食品添加物が提供される。
【００１２】
本発明によれば、転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な飼料であって、上記いずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、飼料が提供される。
【００１３】
本発明によれば、転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な飼料添加物であって、上記いずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、飼料添加物が提供される。
【００１４】
本発明によれば、上記いずれかに記載のクルクミノイド類を有効成分として含有する、抗老化剤が提供される。
【００１５】
本発明によれば、クルクミノイド類による転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現方法であって、非ヒト動物細胞に対して前記クルクミノイド類を供給して、前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現を促進する工程を備える、発現方法が提供される。
【００１６】
本発明によれば、クルクミノイド類による転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現方法であって、動物から採取された細胞に前記クルクミノイド類を供給して前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現を促進する工程を備える、発現方法が提供される。
【００１７】
本発明によれば、転写因子FOXO又はその相同体が関連する疾患の予防、治療又は改善する成分のスクリーニング方法であって、非ヒト動物又は動物から採取された細胞にクルクミノイド類と被験化合物とを供給して前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現量を測定する工程を備える、方法が提供される。さらに、このスクリーニング方法においては、測定した前記発現量を指標として前記被験化合物の前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現に対する作用を評価する工程を備えることもできる。
【００１８】
本発明によれば、転写因子FOXO又はその相同体が関連する疾患の予防、治療又は改善する成分のスクリーニング方法であって、非ヒト動物又は動物から採取された細胞に、クルクミノイド類である被験化合物を供給して前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現量を測定する工程を備える、方法が提供される。
【００１９】
本発明によれば、転写因子FOXO及びその相同体が関連する遺伝子産物の製造方法であって、クルクミノイド類を前記転写因子FOXO及びその相同体を有する細胞に供給して、前記遺伝子産物を産生させる工程を備える、製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤は、クルクミノイド類を有効成分として含有することができる。本発明の活性化剤によれば、クルクミノイド類が転写因子FOXO又はその相同体（以下、単に転写因子FOXOという。）を活性化して、老化形質を発現するのを抑制することができる。
【００２１】
ここで、転写因子FOXOを活性化するとは、結果として転写因子FOXOが抗老化方向に各種遺伝子の転写を活性化又は不活性化することを意味する。図１に、老化（寿命）関連遺伝子のシグナル伝達系を示す。昆虫からヒトに到るまで保存されている老化（寿命）関連遺伝子のシグナル伝達系として、インスリン／成長ホルモン受容体からフォスファチジルイノシトール−３−キナーゼを介するシグナル伝達系がある。このシグナルの活性化が最終的に転写因子FOXOの活性化により寿命を延長すると報告されている。クルクミノイド類が転写印紙FOXOを活性化する機序に特に限定はない。例えば、これらのシグナル伝達系のいずれかにおいて又は転写因子FOXOに対して、転写因子FOXOを活性化するように作用するものであってもよい。本発明を拘束するものではないが、転写因子FOXOが転写を活性化する遺伝子は、老化形質発現を抑制する傾向があると考えられ、転写因子FOXOが転写を不活性化する遺伝子は、老化形質発現を促進する傾向があると考えられる。
【００２２】
転写因子FOXOは哺乳類等の動物における老化・寿命関連遺伝子へのシグナル伝達に係わるフォークヘッド型転写因子であり、線虫において最もよく研究された。FOXOの相同遺伝子は、ショウジョウバエ、マウス及びヒトに存在し、かつ進化上よく保存されている。哺乳類のFOXOファミリーには、FOXO1、FOXO3a、FOXO4の3種が報告されている。転写因子FOXOの相同体は、米国の国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）が提供するデータベースGenBankにより開示され、かつBLASTなどの検索アルゴリズムによっても抽出することができる。哺乳類のFOXO遺伝子及び相同遺伝子として以下のものが挙げられる（GenBankのアクセッション番号で示す）。FOXO1a: NP-02006 (homo sapiens)、FOXO1:
NM-019739 (Mus musculus)、FOXO3a: NM-019740 (Mus
musculus)、FOXO-3: DQ-459992 (Bos Taurus)、FOXO3A: DQ-288236 (Sus scrofa)、FOXg1:
NM-012560 (Rattus norvegicus)
【００２３】
以下、本発明の実施の実施形態である、転写因子FOXO活性化剤、予防・治療剤等、遺伝子発現方法、スクリーニング方法、遺伝子産物製造方法等について詳細に説明する。
【００２４】
（転写因子FOXO活性化剤）
本活性化剤は、クルクミノイド類を有効成分として含有することができる。クルクミノイド類は、熱帯性の生姜科ウコン属に属する植物に含まれる黄色色素としてよく知られている。
【００２５】
クルクミノイド類としては、ウコン属植物に含まれる黄色色素であれば特に限定されないが、式（１）及び式（２）に挙げるクルクミノイド類が挙げられる。式（１）及び式（２）におけるＲ1 、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 の低級アルコキシのアルキル部分は、炭素数１〜６の直鎖又は分岐のアルキルであり、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。アルコキシとしては、炭素数１〜２のメトキシ、エトキシが好ましい。また、式（１）及び（２）において、Ｒ2 及びＲ4 としては、ヒドロキシである化合物が好ましい。
【００２６】
クルクミノイド類としては、例えば、THU1［1,7-ビス(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)-3,5-ヘプタンジオン、以下単にテトラヒドロクルクミンというときもある］、THU2［1-(4-ヒドロキシフェニル)-7-(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)-3,5-ヘプタンジオン］、THU3［1,7-ビス(4-ヒドロキシフェニル)-3,5-ヘプタンジオン］、THDMU1［1,7-ビス(3,4-ジメトキシフェニル)-3,5-ヘプタンジオン］、THDHU1［1,7-ビス(3,4-ジヒドロキシフェニル)-3,5-ヘプタンジオン］等のテトラヒドロクルクミン及びその誘導体が挙げられる。
【００２７】
また、これらのテトラヒドロクルクミン類は、それぞれＵ１［ジフェルロイルメタン（diferuloylmethane）、(E,E)-1,7-ビス(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)-1,6-ヘプタジエン-3,5-ジオン、以下単にクルクミンというときもある］、Ｕ２［デメトキシクルクミン（demethoxycurcumin）、ビス(4-ヒドロキシ-3-メトキシシンナモイル)メタン］、Ｕ３［ビスデメトキシクルクミン（bisdemethoxycurcumin）、ビス(4-ヒドロキシシンナモイル)メタン］、ＤＭＵ１［(E,E)-1,7-ビス(3,4-ジメトキシフェニル)-1,6-ヘプタジエン-3,5-ジオン］、ＤＨＵ１［(E,E)-1,7-ビス(3,4-ジヒドロキシフェニル)-1,6-ヘプタジエン-3,5-ジオン］等のクルクミン類を還元して得ることができる。これらのクルクミン類及びその誘導体もクルクミノイド類に含まれる。
【００２８】
クルクミン類としては、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３及びＤＨＵ１が好ましく用いられ、Ｕ１及びＤＨＵ１が特に好ましく用いられる。Ｕ１は、還元により、また、哺乳類の腸管上皮細胞で代謝されてＴＨＵ１になるため、合成上においてもまた哺乳類においても好ましい形態である。テトラヒドロクルクミン類としては、テトラヒドロクルクミンが好ましい。テトラヒドロクルクミンは哺乳類においてより直接的である点で好ましく、また、哺乳類以外の動物に有効である点でも好ましい。
【００２９】
これらクルクミノイド類は、熱帯性の生姜科植物ターメリックに含まれる黄色色素であるため、ターメリックの根茎の乾燥粉末およびそれから精製したクルクミンが商業的に利用可能である。本発明における有効成分であるテトラヒドロクルクミンなどのクルクミン以外のクルクミノイド類の製造原料や製造方法に制限は全くないが、例えば、バイオケミカル・ファーマコロジー（Biochemical Pharmacology）, 52, 519 (1996)に記載されているごとく、金属触媒を用いた水素添加法でクルクミン類を還元することによって得ることができる。
【００３０】
また、テトラヒドロクルクミン類はクルクミン類を微生物を利用してテトラヒドロクルクミン類に変換することによって得ることもできる。例えば、デバリョマイセス・ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii） ATCC-20261株を用いてクルクミン をテトラヒドロクルクミン に変換できる。具体的には、該菌株をYM培地（DIFCO 社）中で、30℃、48時間振とう培養（130 rpm）して得られる菌体の懸濁液にクルクミン 類の溶液（溶媒：エタノール等）を加え30℃で3 時間振とうした後、反応液を酢酸エチルで抽出して、酢酸エチル抽出物を得る。該酢酸エチル抽出物を濃縮後、シリカゲルカラム（ワコーゲルC-200、和光純薬社製）を用いｎ−ヘキサン- 酢酸エチル（10% ステップワイズ法）混合液で展開、分画する。溶出される50%及び60% 酢酸エチル- ｎ−ヘキサン画分を濃縮し、これをｎ−ヘキサン-
酢酸エチル（1：1、V/V）を展開溶媒とした分取薄層クロマトグラフィーで分画してRf値が0.4 〜0.5 の画分を得る。該画分をｎ−ヘキサン- アセトン（2：1、V/V）を展開溶媒とした分取薄層クロマトグラフィーで分画してRf値が0.25から0.3の画分を得る。該画分をさらにトルエン-アセトン（3：1、V/V）を展開溶媒とした分取薄層クロマトグラフィーで分画してRf値が0.5の画分を得て、この画分を濃縮乾固することによりテトラヒドロクルクミン を得ることができる。
【００３１】
本活性化剤は、転写因子FOXOに関する疾患の予防・治療剤として用いることができる。ここで、転写因子FOXOが関する疾患とは、転写因子FOXOの活性が低下したことによる結果、転写が活性化又は不活性化された遺伝子産物によって引き起こされる疾患が挙げられる。転写因子FOXOによって転写量が影響される遺伝子としては、表１及び表２に示す各種遺伝子が挙げられる（J. Biol. Chem.Volume 281, Number15,）。表１は、転写因子FOXOが過剰に発現しているとき（活性化されているとき）に発現量が増える遺伝子群の一例を示し、表２には転写因子FOXOが過剰発現しているとき、発現量が低下する遺伝子群の一例を示す。
【００３２】
【表１】
【表２】
【００３３】
例えば、転写因子FOXOに関する疾患としては、いわゆる老年病である、メタボリックシンドローム関連疾患、特に糖尿病（耐糖能低下）、高脂血症、動脈硬化などや、癌、神経変性疾患のような老化に伴う疾患が挙げられる。
【００３４】
また、本活性化剤は、転写因子FOXOに関する疾患（生理状態）の治療、予防又は改善に有効な、医薬品、食品（飲料を含む）、食品添加物、飼料及び飼料添加物等の各種組成物に用いることができる。組成物の形態は特に問わない。医薬品としては、ヒトを含む動物用及び魚類を含む水産用の医薬品を包含している。
【００３５】
本活性化剤を上記各用途に適用する場合には、クルクミノイド類を関連する疾患（生理状態）の予防又は治療を実質的に有効量のクルクミノイド類を含有すればよい。
【００３６】
医薬品として用いる場合は、クルクミノイド類を転写因子FOXOが関連する疾患の予防又は治療に有効量含んでいればどのような形態であってもよい。クルクミノイド類は、単独あるいは適当な希釈剤や他の添加剤と共に各種の製剤形態に公知方法で製剤化して使用される。剤形としては、経口剤、例えばカプセル剤、丸剤、顆粒剤、乳剤、散剤、トローチ、シロップ剤等の他、点眼剤、点滴あるいは注射用製剤の形態をあげることができ、必要に応じてさらに防腐剤、結合剤、矯味剤、安定化剤など、通常の医薬品製造で使用される物質を添加することができる。
【００３７】
使用する製剤用担体としては、例えば、水、注射用蒸留水、生理食塩水、グルコース、白糖、マンニット、ラクトース、澱粉、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アルギン酸、タルク、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、尿素、シリコン樹脂、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン酸エステル等があげられる。
【００３８】
本発明の予防または治療剤は、これを必要とする患者に対し経口もしくは非経口的にその所定量を単回もしくは複数回に分けて投与するか、連続的に投与する。クルクミノイド類の一日当たりの投与量としては、患者の年齢、性別、症状により適宜調整されるが、患者の体重1kgあたり、0.1mg〜5g、好ましくは0.4mg〜4g、さらに好ましくは1mg〜2gで投与される。また、製剤の全組成を100%とした時の配合量(重量比）は0.01%〜100%で、好ましくは0.1%〜99.9%、さらに好ましく１%〜99.0%である。
【００３９】
こうした製剤には、適宜、クルクミノイド類と組み合わせることができる他の有効成分を含めることができる。
【００４０】
食品、飲料、食品添加物、飼料又は飼料添加物として用いる場合は、クルクミノイド類を含有して、転写因子FOXOが関連する生理状態を予防または改善するのに有効であればどのような形態であってもよい。食品としては、例えば固形食品、半流動食品、ゲル状食品などがあげられる。飲料としては、清涼飲料、アルコール飲料などがあげられる。飼料としては、粉体、固体いずれの形状のものでもよい。
【００４１】
本発明の飲料、食品または動物飼料は、これを必要とする患者もしくは動物に対し経口的にその所定量を単回もしくは複数回に分けて投与する。クルクミノイド類の一日当たりの投与量としては、ヒト患者もしくは動物の年齢、性別、症状により適宜調整されるが、患者もしくは動物の体重1kgあたり、0.1mg〜5g、好ましくは0.4mg〜4g、さらに好ましくは1mg〜2gで投与される。配合する場合において、クルクミノイド類を重量比で0.001％〜100%で、好ましくは0.1％〜99.9％で、さらに好ましくは1%〜99.0%の範囲で配合する。
【００４２】
飲料または食品としては特に制限はないが例えば、チョコレート、ガム、ヨーグルト、清涼飲料、コーヒー、紅茶、アルコール飲料、ビスケット、ゼリーなどがあげられる。飲料または食品の製造においては、必要に応じて種々の物質を添加することが可能である。例えば、しょ糖、果糖、ブドウ等などの糖類、キシリトールなどの糖アルコール、アミノ酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸などの有機酸、トコフェロール、フラボノイド、カテキンなどの抗酸化物質の他、ゼラチン、ビタミン類、色素、香料、カルシウム剤、グリセリン脂肪酸エステル、ペクチンなど、食品の通常の製造で用いられる任意の物質を適宜配合して用いることができる。
【００４３】
飲料または食品としては、クルクミン類をテトラヒドロクルクミン類に変換する活性を有する微生物を利用した醗酵飲料または醗酵製品も用いうる。動物飼料としてはたとえば、養魚用飼料、家畜用飼料等がげられる。動物飼料の製造においては、通常動物の飼料に用いられている組成物にクルクミノイド類を重量比で0.001％〜10.0%の範囲で、さらに好ましくは0.1%〜5.0%の範囲で配合することにより製造できるが、これに限定されない。本発明における疾患の予防または改善を可能とする配合量のすべてを使用できる。動物飼料の製造においては、飼料の形態や目的に応じて種々の物質を利用することが可能である。例えば、しょ糖、果糖、ブドウ等などの糖類、キシリトールなどの糖アルコール、アミノ酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸などの有機酸、トコフェロール、フラボノイド、カテキンなどの抗酸化物質の他、ゼラチン、ビタミン類、色素、香料、カルシウム剤、グリセリン脂肪酸エステル、ペクチンなど、食品や動物飼料に添加可能な成分を適宜配合して用いることができる。飼料にクルクミノイド類を添加する場合は、精製品を用いることもできるが、例えば、クルクミノイド類を含有する微生物またはその処理物を飼料に混合することもできる。
【００４４】
（遺伝子の発現方法）
本発明の遺伝子発現方法は、非ヒト動物細胞に対して前記クルクミノイド類を供給して、前記転写因子FOXOが関連する遺伝子の発現を促進又は抑制する工程を備えることができる。また、動物から採取された細胞に前記クルクミノイド類を供給して前記転写因子FOXOが関連する遺伝子の発現を促進又は抑制する工程を備えることもできる。
【００４５】
遺伝子の発現方法としては特に限定されない。天然の非ヒト動物個体や細胞を用いてクルクミノイド類を供給して関連する遺伝子を発現又は抑制してもよい。また、クルクミノイド類に対して反応性よく関連する遺伝子産物を産生又は分泌する非ヒトトランスジェニック動物の作製、形質転換したヒト細胞、非ヒト動物細胞等をした細胞培養によってもよい。さらに、遺伝子の発現を抑制する方法としては、FOXO遺伝子の複製、転写の抑制のほかFOXOに変異を導入することなどによっても可能であり、こうした発現抑制を実現するには公知の各種方法を適宜採用することができる。
【００４６】
（スクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、転写因子FOXOが関連する疾患の予防、治療又は改善する成分のスクリーニング方法である。この方法は、非ヒト動物又は動物から採取された細胞にクルクミノイド類と被験化合物とを供給して前記転写因子FOXO等が関連する遺伝子の発現量を測定する工程を備えることができる。本発明のスクリーニング方法によれば、転写因子FOXOに対してクルクミノイド類とともに作用して転写因子FOXOを活性化することのできる化合物を効率的に探索することができる。また、本スクリーニング方法は、測定した前記発現量を指標として前記被験化合物の前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現に対する作用を評価する工程を備えることができる。こうした評価工程を備えることで、転写因子FOXOを活性化するのに有効な化合物を効率的に探索できる。
【００４７】
本スクリーニング方法は、非ヒト動物又は動物から採取された細胞に、クルクミノイド類である被験化合物を供給して前記転写因子FOXOが関連する遺伝子の発現量を測定する工程を備えることができる。このスクリーニング方法によれば、転写因子FOXOが関連する遺伝子の発現量を増加し又は低下させることのできる又はそうした作用の高いクルクミノイド類を容易に見出すことができる。また、細胞レベルで容易にスクリーニングが可能であるのでハイスループットなスクリーニングが可能となる。こうしたアッセイには、特にDNAチップ等を用いた発現プロファイリングが効果的である。
【００４８】
遺伝子の発現量や発現した遺伝子の種類を測定するには、例えば、DNAチップやPCRなどのｍRNAに基づくもののほか、発現したタンパク質によるものなど、公知の各種手法を特に限定することなく採用することができる。なお、転写因子FOXO等が関連する疾患等の予防又は治療等に有効な成分のスクリーニングは、関連遺伝子の発現量だけでなく、細胞における老化又は抗老化の指標を測定することによっても行うことができる。さらに、転写因子FOXOが関連する疾患を予防又は治療等が可能なクルクミノイド類又はクルクミノイド類とともに作用する化合物をスクリーニングするには、非ヒト動物にこれらを供給して、個体等における寿命や組織や細胞のその他の老化又は抗老化の指標を用いてその作用を評価することもできる。
【００４９】
（抗老化に関与する遺伝子産物の製造方法）
転写因子FOXO等が関連する遺伝子産物の製造方法は、クルクミノイド類を前記転写因子FOXOを有する細胞に供給して、前記遺伝子産物を産生させる工程を備えることができる。本発明によれば、老化抑制に有効なタンパク質などの遺伝子産物を効果的に取得することができる。遺伝子産物としては、タンパク質が典型的であるが、ｍRNA等であってもよいし、さらに、産生されるタンパク質によって合成等される化合物であってもよい。
【００５０】
抗老化に関与するタンパク質等の遺伝子産物の製造は、例えば、遺伝子の発現方法と同様に、動物の個体あるいは細胞を用いることができる。また、こうしたタンパク質から製造される産物にあっては、形質転換した動物個体又は細胞から取得することができる。
【００５１】
以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例の限定されるものではない。
【実施例１】
【００５２】
（酵母K6001におけるクルクミノイド類の寿命延長効果）
（クルクミンとテトラヒドロクルクミンの酵母の複製回数に対する影響）
３％ガラクトース、２％ポリペプトン、1%酵母抽出液を含む培地にK6001酵母を加え、30℃、160 rpmで2日間振とう培養を行なった。この酵母を含む培養液を遠心分離し、10回洗浄した。2％グルコース、2％
ポリペプトン、1％酵母抽出液を含む溶液に予め100mMクルクミノイド溶液をエタノールに溶解したものを加えて最終濃度を合わせ、さらに2％のアガロースを加え、無菌プレート上にアガロース培地を作成した。ここに10x1000個の酵母を接種し、30℃で3日間培養し、１つの母細胞から分裂した娘細胞の数を顕微鏡下で測定した。なお、同様に、レスベラトロールも図２Ａ及び図２Ｂに示す濃度で同様に酵母細胞に適用した。結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。
【００５３】
図２Ａ及び図２Ｂに示すように、テトラヒドロクルクミンは、既に寿命延長効果が認められているレスベラトロールと同等かそれ以上の効果を示した。
【実施例２】
【００５４】
（ショウジョウバエにおけるクルクミノイド類の寿命延長効果）
クルクミノイド類のショウジョウバエにおける寿命延長効果について、通常の飼育下と酸化ストレス負荷下で試験した。まず、通常飼育群では、ショウジョウバエのエサ(ペレット)にクルクミノイド類を図３Ａ及び図３Ｂに示す各濃度となるよう混和し、２〜３日おきにエサを交換しつつ２５℃で全期間60日程度の飼育を行なった。また、酸化ストレス負荷群では、図４に示す各濃度でクルクミノイド類を混和するとともに、パラコート（paraquat）を7.5 mMとなるようにエサに混和して投与を行なった。10日前後の全実験期間、エサの交換は行わなかった。いずれの群においても、レスベラトロールをそれぞれの図に示す濃度で同様にショウジョウバエに適用した試験も行った。なお、各実験において、１群あたりのショウジョウバエの数は20匹とし、４回の繰り返し実験を行った。ハエの死亡率は、毎日落ちているハエの数を肉眼的にカウントすることにより行なった。通常飼育群の結果を図３Ａ及び図３Ｂに示し、酸化ストレス負荷群の結果を図４に示す。
【００５５】
図３Ａ及び図３Ｂ並びに図４に示すように、テトラヒドロクルクミンは、レスベラトロールと同等あるいはそれ以上に寿命延長効果を示した。
【実施例３】
【００５６】
（転写因子FOXOのホモ欠損変異ショウジョウバエにおけるクルクミノイド類の寿命延長効果）
クルクミノイド類及びレスベラトロールの濃度を５０μＭに固定する以外は、実施例２の酸化ストレス負荷群と同様にして、FOXOをホモ欠損変異ショウジョウバエ（Ernst Harfen教授より入手した）における寿命延長効果を評価した。結果を図５に示す。
【００５７】
図５に示すように、FOXOをホモ欠損したショウジョウバエではクルクミノイド類の効果は認められなかった。以上のことから、クルクミノイド類は、FOXOを介して寿命延長効果を奏することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】老化（寿命）関連遺伝子のシグナル伝達系の一例を示す図。
【図２Ａ】クルクミノイド類の酵母の複製回数に対する効果についての評価結果を示すグラフ図。
【図２Ｂ】クルクミノイド類の酵母の複製回数に対する効果についての評価結果を示すグラフ図。
【図３Ａ】通常の飼育下でのショウジョウバエにおけるクルクミノイド類（クルクミン）の寿命延長効果を評価したグラフ図。
【図３Ｂ】通常の飼育下でのショウジョウバエにおけるクルクミノイド類（テトラヒドロクルクミン）の寿命延長効果を評価したグラフ図。
【図４】酸化ストレスを負荷したショウジョウバエにおけるクルクミノイド類（クルクミン及びテトラヒドロクルクミン）の寿命延長効果を評価したグラフ図。
【図５】酸化ストレスを負荷したFOXOホモ欠損のショウジョウバエにおけるクルクミノイド類の寿命延長効果を評価したグラフ図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クルクミノイド類に関し、詳しくは、クルクミノイド類を抗老化転写因子の活性化剤として利用する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
カロリーの過剰摂取は、肥満のほか、老年病につながるメタボリックシンドロームに係わることがよく知られている。これに対して、抗老化、換言すれば寿命を延長させる一つの手法として、カロリー制限が挙げられている。カロリー制限は、酵母、線虫、げっ歯類という幅広い生物種に対して寿命延長モデルとして確立されている。
【０００３】
一方、ウコン（ターメリック）に含まれるテトラヒドロクルミンやクルクミンを含むクルクミノイド類が様々な生理作用を有することが報告されている。例えば、その抗酸化作用、血中中性脂肪の増加抑制作用、抗白内障作用等が知られている（特許文献１、２、３等）。また、クルクミノイド類をヒト細胞に投与した際の発現プロファイリングも報告されている（特許文献４）。
【特許文献１】特開平２−４９７４７号公報
【特許文献２】特開２００３−２８２７号公報
【特許文献３】特開平１１−３４３２３４号公報
【特許文献４】特開２００５−１９８６４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、本発明者らによれば、カロリー制限が、ヒトには必ずしも当てはまらないこともわかってきている。例えば、BMI係数と平均寿命との関係が逆Ｕ字型を呈することも知られている。また、カロリー制限は、精神的ストレスを増加し、感染に対する抵抗性も低下させると考えられる。したがって、カロリー制限に替わる老年病のからの防御法、すなわち、抗老化法を確立することが要請されている。
【０００５】
クルクミノイド類の抗老化に関する生理作用やクルクミノイド類投与時の発現量が既に開示されているが、クルクミノイド類がこうした生理作用を発現させるのにあたって係わる、より直接的なターゲットは未だ同定されていない。低分子化合物であるクルミノイド類の作用対象あるいはそれに近いターゲットが判明すれば、そのターゲットが関連する遺伝子やタンパク質に関連する疾患の予防・治療や生理状態の改善が可能となる。また、ターゲットに対してより効果的な化合物の探索することや設計することも可能となる。さらに、クルミノイド類の存在下、そのターゲットの活性や発現量を増大させる化合物を探索することも可能となる。
【０００６】
そこで、本発明は、カロリー制限とは異なる手法による新たな抗老化アプローチを提供することを一つの目的とする。また、本発明は、こうした抗老化アプローチに基づく、新規な抗老化作用を有する薬剤や食品等、その抗老化作用の発現方法、抗老化作用を有する薬剤のスクリーニング方法、転写因子FOXO及びその相同体が関連する遺伝子産物の製造方法を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、カロリー制限に替えて寿命を延長する手法を見出すため、寿命を延長できる食品成分を探索し、さらに、カロリー制限時における寿命延長効果に関連する転写因子であるDAF-16/FOXO（Forkhead Box Class O）に着目した。そして、研究を重ねた結果、クルクミノイド類がFOXOを介して寿命延長作用を発揮していることを見出し、本発明を完成した。本発明によれば以下の手段が提供される。
【０００８】
本発明によれば、クルクミノイド類を有効成分として含有する転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤が提供される。前記クルクミノイド類は、式（１）
【化３】
（式（１）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、水素、ヒドロキシ又は低級アルコキシを表す。）で表されるクルクミン又はクルクミン誘導体とすることもできるし、式（２）
【化４】
（式（２）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、水素、ヒドロキシ又は低級アルコキシを表す。）で表されるテトラヒドロクルクミン又はテトラヒドロクルクミン誘導体とすることもできる。
【０００９】
本発明によれば、転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防・治療剤であって、上記いずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、予防・治療剤が提供される。
【００１０】
また、本発明によれば、転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な食品であって、上記いずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、食品が提供される。
【００１１】
本発明によれば、転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な食品添加物であって、上記いずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、食品添加物が提供される。
【００１２】
本発明によれば、転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な飼料であって、上記いずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、飼料が提供される。
【００１３】
本発明によれば、転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な飼料添加物であって、上記いずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、飼料添加物が提供される。
【００１４】
本発明によれば、上記いずれかに記載のクルクミノイド類を有効成分として含有する、抗老化剤が提供される。
【００１５】
本発明によれば、クルクミノイド類による転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現方法であって、非ヒト動物細胞に対して前記クルクミノイド類を供給して、前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現を促進する工程を備える、発現方法が提供される。
【００１６】
本発明によれば、クルクミノイド類による転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現方法であって、動物から採取された細胞に前記クルクミノイド類を供給して前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現を促進する工程を備える、発現方法が提供される。
【００１７】
本発明によれば、転写因子FOXO又はその相同体が関連する疾患の予防、治療又は改善する成分のスクリーニング方法であって、非ヒト動物又は動物から採取された細胞にクルクミノイド類と被験化合物とを供給して前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現量を測定する工程を備える、方法が提供される。さらに、このスクリーニング方法においては、測定した前記発現量を指標として前記被験化合物の前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現に対する作用を評価する工程を備えることもできる。
【００１８】
本発明によれば、転写因子FOXO又はその相同体が関連する疾患の予防、治療又は改善する成分のスクリーニング方法であって、非ヒト動物又は動物から採取された細胞に、クルクミノイド類である被験化合物を供給して前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現量を測定する工程を備える、方法が提供される。
【００１９】
本発明によれば、転写因子FOXO及びその相同体が関連する遺伝子産物の製造方法であって、クルクミノイド類を前記転写因子FOXO及びその相同体を有する細胞に供給して、前記遺伝子産物を産生させる工程を備える、製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤は、クルクミノイド類を有効成分として含有することができる。本発明の活性化剤によれば、クルクミノイド類が転写因子FOXO又はその相同体（以下、単に転写因子FOXOという。）を活性化して、老化形質を発現するのを抑制することができる。
【００２１】
ここで、転写因子FOXOを活性化するとは、結果として転写因子FOXOが抗老化方向に各種遺伝子の転写を活性化又は不活性化することを意味する。図１に、老化（寿命）関連遺伝子のシグナル伝達系を示す。昆虫からヒトに到るまで保存されている老化（寿命）関連遺伝子のシグナル伝達系として、インスリン／成長ホルモン受容体からフォスファチジルイノシトール−３−キナーゼを介するシグナル伝達系がある。このシグナルの活性化が最終的に転写因子FOXOの活性化により寿命を延長すると報告されている。クルクミノイド類が転写印紙FOXOを活性化する機序に特に限定はない。例えば、これらのシグナル伝達系のいずれかにおいて又は転写因子FOXOに対して、転写因子FOXOを活性化するように作用するものであってもよい。本発明を拘束するものではないが、転写因子FOXOが転写を活性化する遺伝子は、老化形質発現を抑制する傾向があると考えられ、転写因子FOXOが転写を不活性化する遺伝子は、老化形質発現を促進する傾向があると考えられる。
【００２２】
転写因子FOXOは哺乳類等の動物における老化・寿命関連遺伝子へのシグナル伝達に係わるフォークヘッド型転写因子であり、線虫において最もよく研究された。FOXOの相同遺伝子は、ショウジョウバエ、マウス及びヒトに存在し、かつ進化上よく保存されている。哺乳類のFOXOファミリーには、FOXO1、FOXO3a、FOXO4の3種が報告されている。転写因子FOXOの相同体は、米国の国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）が提供するデータベースGenBankにより開示され、かつBLASTなどの検索アルゴリズムによっても抽出することができる。哺乳類のFOXO遺伝子及び相同遺伝子として以下のものが挙げられる（GenBankのアクセッション番号で示す）。FOXO1a: NP-02006 (homo sapiens)、FOXO1:
NM-019739 (Mus musculus)、FOXO3a: NM-019740 (Mus
musculus)、FOXO-3: DQ-459992 (Bos Taurus)、FOXO3A: DQ-288236 (Sus scrofa)、FOXg1:
NM-012560 (Rattus norvegicus)
【００２３】
以下、本発明の実施の実施形態である、転写因子FOXO活性化剤、予防・治療剤等、遺伝子発現方法、スクリーニング方法、遺伝子産物製造方法等について詳細に説明する。
【００２４】
（転写因子FOXO活性化剤）
本活性化剤は、クルクミノイド類を有効成分として含有することができる。クルクミノイド類は、熱帯性の生姜科ウコン属に属する植物に含まれる黄色色素としてよく知られている。
【００２５】
クルクミノイド類としては、ウコン属植物に含まれる黄色色素であれば特に限定されないが、式（１）及び式（２）に挙げるクルクミノイド類が挙げられる。式（１）及び式（２）におけるＲ1 、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 の低級アルコキシのアルキル部分は、炭素数１〜６の直鎖又は分岐のアルキルであり、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。アルコキシとしては、炭素数１〜２のメトキシ、エトキシが好ましい。また、式（１）及び（２）において、Ｒ2 及びＲ4 としては、ヒドロキシである化合物が好ましい。
【００２６】
クルクミノイド類としては、例えば、THU1［1,7-ビス(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)-3,5-ヘプタンジオン、以下単にテトラヒドロクルクミンというときもある］、THU2［1-(4-ヒドロキシフェニル)-7-(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)-3,5-ヘプタンジオン］、THU3［1,7-ビス(4-ヒドロキシフェニル)-3,5-ヘプタンジオン］、THDMU1［1,7-ビス(3,4-ジメトキシフェニル)-3,5-ヘプタンジオン］、THDHU1［1,7-ビス(3,4-ジヒドロキシフェニル)-3,5-ヘプタンジオン］等のテトラヒドロクルクミン及びその誘導体が挙げられる。
【００２７】
また、これらのテトラヒドロクルクミン類は、それぞれＵ１［ジフェルロイルメタン（diferuloylmethane）、(E,E)-1,7-ビス(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)-1,6-ヘプタジエン-3,5-ジオン、以下単にクルクミンというときもある］、Ｕ２［デメトキシクルクミン（demethoxycurcumin）、ビス(4-ヒドロキシ-3-メトキシシンナモイル)メタン］、Ｕ３［ビスデメトキシクルクミン（bisdemethoxycurcumin）、ビス(4-ヒドロキシシンナモイル)メタン］、ＤＭＵ１［(E,E)-1,7-ビス(3,4-ジメトキシフェニル)-1,6-ヘプタジエン-3,5-ジオン］、ＤＨＵ１［(E,E)-1,7-ビス(3,4-ジヒドロキシフェニル)-1,6-ヘプタジエン-3,5-ジオン］等のクルクミン類を還元して得ることができる。これらのクルクミン類及びその誘導体もクルクミノイド類に含まれる。
【００２８】
クルクミン類としては、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３及びＤＨＵ１が好ましく用いられ、Ｕ１及びＤＨＵ１が特に好ましく用いられる。Ｕ１は、還元により、また、哺乳類の腸管上皮細胞で代謝されてＴＨＵ１になるため、合成上においてもまた哺乳類においても好ましい形態である。テトラヒドロクルクミン類としては、テトラヒドロクルクミンが好ましい。テトラヒドロクルクミンは哺乳類においてより直接的である点で好ましく、また、哺乳類以外の動物に有効である点でも好ましい。
【００２９】
これらクルクミノイド類は、熱帯性の生姜科植物ターメリックに含まれる黄色色素であるため、ターメリックの根茎の乾燥粉末およびそれから精製したクルクミンが商業的に利用可能である。本発明における有効成分であるテトラヒドロクルクミンなどのクルクミン以外のクルクミノイド類の製造原料や製造方法に制限は全くないが、例えば、バイオケミカル・ファーマコロジー（Biochemical Pharmacology）, 52, 519 (1996)に記載されているごとく、金属触媒を用いた水素添加法でクルクミン類を還元することによって得ることができる。
【００３０】
また、テトラヒドロクルクミン類はクルクミン類を微生物を利用してテトラヒドロクルクミン類に変換することによって得ることもできる。例えば、デバリョマイセス・ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii） ATCC-20261株を用いてクルクミン をテトラヒドロクルクミン に変換できる。具体的には、該菌株をYM培地（DIFCO 社）中で、30℃、48時間振とう培養（130 rpm）して得られる菌体の懸濁液にクルクミン 類の溶液（溶媒：エタノール等）を加え30℃で3 時間振とうした後、反応液を酢酸エチルで抽出して、酢酸エチル抽出物を得る。該酢酸エチル抽出物を濃縮後、シリカゲルカラム（ワコーゲルC-200、和光純薬社製）を用いｎ−ヘキサン- 酢酸エチル（10% ステップワイズ法）混合液で展開、分画する。溶出される50%及び60% 酢酸エチル- ｎ−ヘキサン画分を濃縮し、これをｎ−ヘキサン-
酢酸エチル（1：1、V/V）を展開溶媒とした分取薄層クロマトグラフィーで分画してRf値が0.4 〜0.5 の画分を得る。該画分をｎ−ヘキサン- アセトン（2：1、V/V）を展開溶媒とした分取薄層クロマトグラフィーで分画してRf値が0.25から0.3の画分を得る。該画分をさらにトルエン-アセトン（3：1、V/V）を展開溶媒とした分取薄層クロマトグラフィーで分画してRf値が0.5の画分を得て、この画分を濃縮乾固することによりテトラヒドロクルクミン を得ることができる。
【００３１】
本活性化剤は、転写因子FOXOに関する疾患の予防・治療剤として用いることができる。ここで、転写因子FOXOが関する疾患とは、転写因子FOXOの活性が低下したことによる結果、転写が活性化又は不活性化された遺伝子産物によって引き起こされる疾患が挙げられる。転写因子FOXOによって転写量が影響される遺伝子としては、表１及び表２に示す各種遺伝子が挙げられる（J. Biol. Chem.Volume 281, Number15,）。表１は、転写因子FOXOが過剰に発現しているとき（活性化されているとき）に発現量が増える遺伝子群の一例を示し、表２には転写因子FOXOが過剰発現しているとき、発現量が低下する遺伝子群の一例を示す。
【００３２】
【表１】
【表２】
【００３３】
例えば、転写因子FOXOに関する疾患としては、いわゆる老年病である、メタボリックシンドローム関連疾患、特に糖尿病（耐糖能低下）、高脂血症、動脈硬化などや、癌、神経変性疾患のような老化に伴う疾患が挙げられる。
【００３４】
また、本活性化剤は、転写因子FOXOに関する疾患（生理状態）の治療、予防又は改善に有効な、医薬品、食品（飲料を含む）、食品添加物、飼料及び飼料添加物等の各種組成物に用いることができる。組成物の形態は特に問わない。医薬品としては、ヒトを含む動物用及び魚類を含む水産用の医薬品を包含している。
【００３５】
本活性化剤を上記各用途に適用する場合には、クルクミノイド類を関連する疾患（生理状態）の予防又は治療を実質的に有効量のクルクミノイド類を含有すればよい。
【００３６】
医薬品として用いる場合は、クルクミノイド類を転写因子FOXOが関連する疾患の予防又は治療に有効量含んでいればどのような形態であってもよい。クルクミノイド類は、単独あるいは適当な希釈剤や他の添加剤と共に各種の製剤形態に公知方法で製剤化して使用される。剤形としては、経口剤、例えばカプセル剤、丸剤、顆粒剤、乳剤、散剤、トローチ、シロップ剤等の他、点眼剤、点滴あるいは注射用製剤の形態をあげることができ、必要に応じてさらに防腐剤、結合剤、矯味剤、安定化剤など、通常の医薬品製造で使用される物質を添加することができる。
【００３７】
使用する製剤用担体としては、例えば、水、注射用蒸留水、生理食塩水、グルコース、白糖、マンニット、ラクトース、澱粉、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アルギン酸、タルク、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、尿素、シリコン樹脂、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン酸エステル等があげられる。
【００３８】
本発明の予防または治療剤は、これを必要とする患者に対し経口もしくは非経口的にその所定量を単回もしくは複数回に分けて投与するか、連続的に投与する。クルクミノイド類の一日当たりの投与量としては、患者の年齢、性別、症状により適宜調整されるが、患者の体重1kgあたり、0.1mg〜5g、好ましくは0.4mg〜4g、さらに好ましくは1mg〜2gで投与される。また、製剤の全組成を100%とした時の配合量(重量比）は0.01%〜100%で、好ましくは0.1%〜99.9%、さらに好ましく１%〜99.0%である。
【００３９】
こうした製剤には、適宜、クルクミノイド類と組み合わせることができる他の有効成分を含めることができる。
【００４０】
食品、飲料、食品添加物、飼料又は飼料添加物として用いる場合は、クルクミノイド類を含有して、転写因子FOXOが関連する生理状態を予防または改善するのに有効であればどのような形態であってもよい。食品としては、例えば固形食品、半流動食品、ゲル状食品などがあげられる。飲料としては、清涼飲料、アルコール飲料などがあげられる。飼料としては、粉体、固体いずれの形状のものでもよい。
【００４１】
本発明の飲料、食品または動物飼料は、これを必要とする患者もしくは動物に対し経口的にその所定量を単回もしくは複数回に分けて投与する。クルクミノイド類の一日当たりの投与量としては、ヒト患者もしくは動物の年齢、性別、症状により適宜調整されるが、患者もしくは動物の体重1kgあたり、0.1mg〜5g、好ましくは0.4mg〜4g、さらに好ましくは1mg〜2gで投与される。配合する場合において、クルクミノイド類を重量比で0.001％〜100%で、好ましくは0.1％〜99.9％で、さらに好ましくは1%〜99.0%の範囲で配合する。
【００４２】
飲料または食品としては特に制限はないが例えば、チョコレート、ガム、ヨーグルト、清涼飲料、コーヒー、紅茶、アルコール飲料、ビスケット、ゼリーなどがあげられる。飲料または食品の製造においては、必要に応じて種々の物質を添加することが可能である。例えば、しょ糖、果糖、ブドウ等などの糖類、キシリトールなどの糖アルコール、アミノ酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸などの有機酸、トコフェロール、フラボノイド、カテキンなどの抗酸化物質の他、ゼラチン、ビタミン類、色素、香料、カルシウム剤、グリセリン脂肪酸エステル、ペクチンなど、食品の通常の製造で用いられる任意の物質を適宜配合して用いることができる。
【００４３】
飲料または食品としては、クルクミン類をテトラヒドロクルクミン類に変換する活性を有する微生物を利用した醗酵飲料または醗酵製品も用いうる。動物飼料としてはたとえば、養魚用飼料、家畜用飼料等がげられる。動物飼料の製造においては、通常動物の飼料に用いられている組成物にクルクミノイド類を重量比で0.001％〜10.0%の範囲で、さらに好ましくは0.1%〜5.0%の範囲で配合することにより製造できるが、これに限定されない。本発明における疾患の予防または改善を可能とする配合量のすべてを使用できる。動物飼料の製造においては、飼料の形態や目的に応じて種々の物質を利用することが可能である。例えば、しょ糖、果糖、ブドウ等などの糖類、キシリトールなどの糖アルコール、アミノ酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸などの有機酸、トコフェロール、フラボノイド、カテキンなどの抗酸化物質の他、ゼラチン、ビタミン類、色素、香料、カルシウム剤、グリセリン脂肪酸エステル、ペクチンなど、食品や動物飼料に添加可能な成分を適宜配合して用いることができる。飼料にクルクミノイド類を添加する場合は、精製品を用いることもできるが、例えば、クルクミノイド類を含有する微生物またはその処理物を飼料に混合することもできる。
【００４４】
（遺伝子の発現方法）
本発明の遺伝子発現方法は、非ヒト動物細胞に対して前記クルクミノイド類を供給して、前記転写因子FOXOが関連する遺伝子の発現を促進又は抑制する工程を備えることができる。また、動物から採取された細胞に前記クルクミノイド類を供給して前記転写因子FOXOが関連する遺伝子の発現を促進又は抑制する工程を備えることもできる。
【００４５】
遺伝子の発現方法としては特に限定されない。天然の非ヒト動物個体や細胞を用いてクルクミノイド類を供給して関連する遺伝子を発現又は抑制してもよい。また、クルクミノイド類に対して反応性よく関連する遺伝子産物を産生又は分泌する非ヒトトランスジェニック動物の作製、形質転換したヒト細胞、非ヒト動物細胞等をした細胞培養によってもよい。さらに、遺伝子の発現を抑制する方法としては、FOXO遺伝子の複製、転写の抑制のほかFOXOに変異を導入することなどによっても可能であり、こうした発現抑制を実現するには公知の各種方法を適宜採用することができる。
【００４６】
（スクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、転写因子FOXOが関連する疾患の予防、治療又は改善する成分のスクリーニング方法である。この方法は、非ヒト動物又は動物から採取された細胞にクルクミノイド類と被験化合物とを供給して前記転写因子FOXO等が関連する遺伝子の発現量を測定する工程を備えることができる。本発明のスクリーニング方法によれば、転写因子FOXOに対してクルクミノイド類とともに作用して転写因子FOXOを活性化することのできる化合物を効率的に探索することができる。また、本スクリーニング方法は、測定した前記発現量を指標として前記被験化合物の前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現に対する作用を評価する工程を備えることができる。こうした評価工程を備えることで、転写因子FOXOを活性化するのに有効な化合物を効率的に探索できる。
【００４７】
本スクリーニング方法は、非ヒト動物又は動物から採取された細胞に、クルクミノイド類である被験化合物を供給して前記転写因子FOXOが関連する遺伝子の発現量を測定する工程を備えることができる。このスクリーニング方法によれば、転写因子FOXOが関連する遺伝子の発現量を増加し又は低下させることのできる又はそうした作用の高いクルクミノイド類を容易に見出すことができる。また、細胞レベルで容易にスクリーニングが可能であるのでハイスループットなスクリーニングが可能となる。こうしたアッセイには、特にDNAチップ等を用いた発現プロファイリングが効果的である。
【００４８】
遺伝子の発現量や発現した遺伝子の種類を測定するには、例えば、DNAチップやPCRなどのｍRNAに基づくもののほか、発現したタンパク質によるものなど、公知の各種手法を特に限定することなく採用することができる。なお、転写因子FOXO等が関連する疾患等の予防又は治療等に有効な成分のスクリーニングは、関連遺伝子の発現量だけでなく、細胞における老化又は抗老化の指標を測定することによっても行うことができる。さらに、転写因子FOXOが関連する疾患を予防又は治療等が可能なクルクミノイド類又はクルクミノイド類とともに作用する化合物をスクリーニングするには、非ヒト動物にこれらを供給して、個体等における寿命や組織や細胞のその他の老化又は抗老化の指標を用いてその作用を評価することもできる。
【００４９】
（抗老化に関与する遺伝子産物の製造方法）
転写因子FOXO等が関連する遺伝子産物の製造方法は、クルクミノイド類を前記転写因子FOXOを有する細胞に供給して、前記遺伝子産物を産生させる工程を備えることができる。本発明によれば、老化抑制に有効なタンパク質などの遺伝子産物を効果的に取得することができる。遺伝子産物としては、タンパク質が典型的であるが、ｍRNA等であってもよいし、さらに、産生されるタンパク質によって合成等される化合物であってもよい。
【００５０】
抗老化に関与するタンパク質等の遺伝子産物の製造は、例えば、遺伝子の発現方法と同様に、動物の個体あるいは細胞を用いることができる。また、こうしたタンパク質から製造される産物にあっては、形質転換した動物個体又は細胞から取得することができる。
【００５１】
以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例の限定されるものではない。
【実施例１】
【００５２】
（酵母K6001におけるクルクミノイド類の寿命延長効果）
（クルクミンとテトラヒドロクルクミンの酵母の複製回数に対する影響）
３％ガラクトース、２％ポリペプトン、1%酵母抽出液を含む培地にK6001酵母を加え、30℃、160 rpmで2日間振とう培養を行なった。この酵母を含む培養液を遠心分離し、10回洗浄した。2％グルコース、2％
ポリペプトン、1％酵母抽出液を含む溶液に予め100mMクルクミノイド溶液をエタノールに溶解したものを加えて最終濃度を合わせ、さらに2％のアガロースを加え、無菌プレート上にアガロース培地を作成した。ここに10x1000個の酵母を接種し、30℃で3日間培養し、１つの母細胞から分裂した娘細胞の数を顕微鏡下で測定した。なお、同様に、レスベラトロールも図２Ａ及び図２Ｂに示す濃度で同様に酵母細胞に適用した。結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。
【００５３】
図２Ａ及び図２Ｂに示すように、テトラヒドロクルクミンは、既に寿命延長効果が認められているレスベラトロールと同等かそれ以上の効果を示した。
【実施例２】
【００５４】
（ショウジョウバエにおけるクルクミノイド類の寿命延長効果）
クルクミノイド類のショウジョウバエにおける寿命延長効果について、通常の飼育下と酸化ストレス負荷下で試験した。まず、通常飼育群では、ショウジョウバエのエサ(ペレット)にクルクミノイド類を図３Ａ及び図３Ｂに示す各濃度となるよう混和し、２〜３日おきにエサを交換しつつ２５℃で全期間60日程度の飼育を行なった。また、酸化ストレス負荷群では、図４に示す各濃度でクルクミノイド類を混和するとともに、パラコート（paraquat）を7.5 mMとなるようにエサに混和して投与を行なった。10日前後の全実験期間、エサの交換は行わなかった。いずれの群においても、レスベラトロールをそれぞれの図に示す濃度で同様にショウジョウバエに適用した試験も行った。なお、各実験において、１群あたりのショウジョウバエの数は20匹とし、４回の繰り返し実験を行った。ハエの死亡率は、毎日落ちているハエの数を肉眼的にカウントすることにより行なった。通常飼育群の結果を図３Ａ及び図３Ｂに示し、酸化ストレス負荷群の結果を図４に示す。
【００５５】
図３Ａ及び図３Ｂ並びに図４に示すように、テトラヒドロクルクミンは、レスベラトロールと同等あるいはそれ以上に寿命延長効果を示した。
【実施例３】
【００５６】
（転写因子FOXOのホモ欠損変異ショウジョウバエにおけるクルクミノイド類の寿命延長効果）
クルクミノイド類及びレスベラトロールの濃度を５０μＭに固定する以外は、実施例２の酸化ストレス負荷群と同様にして、FOXOをホモ欠損変異ショウジョウバエ（Ernst Harfen教授より入手した）における寿命延長効果を評価した。結果を図５に示す。
【００５７】
図５に示すように、FOXOをホモ欠損したショウジョウバエではクルクミノイド類の効果は認められなかった。以上のことから、クルクミノイド類は、FOXOを介して寿命延長効果を奏することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】老化（寿命）関連遺伝子のシグナル伝達系の一例を示す図。
【図２Ａ】クルクミノイド類の酵母の複製回数に対する効果についての評価結果を示すグラフ図。
【図２Ｂ】クルクミノイド類の酵母の複製回数に対する効果についての評価結果を示すグラフ図。
【図３Ａ】通常の飼育下でのショウジョウバエにおけるクルクミノイド類（クルクミン）の寿命延長効果を評価したグラフ図。
【図３Ｂ】通常の飼育下でのショウジョウバエにおけるクルクミノイド類（テトラヒドロクルクミン）の寿命延長効果を評価したグラフ図。
【図４】酸化ストレスを負荷したショウジョウバエにおけるクルクミノイド類（クルクミン及びテトラヒドロクルクミン）の寿命延長効果を評価したグラフ図。
【図５】酸化ストレスを負荷したFOXOホモ欠損のショウジョウバエにおけるクルクミノイド類の寿命延長効果を評価したグラフ図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クルクミノイド類を有効成分として含有する転写因子フォークヘッド型クラスＯ（Forkhead Box Class O、以下単に、FOXOという。）又はその相同体の活性化剤。
【請求項２】
前記クルクミノイド類は、式（１）
【化１】
（式（１）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、水素、ヒドロキシ又は低級アルコキシを表す。）で表されるクルクミン又はクルクミン誘導体である、請求項１に記載の活性化剤。
【請求項３】
前記クルクミノイド類は、式（２）
【化２】
（式（２）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、水素、ヒドロキシ又は低級アルコキシを表す。）で表されるテトラヒドロクルクミン又はテトラヒドロクルクミン誘導体である、請求項１に記載の活性化剤。
【請求項４】
転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防・治療剤であって、
請求項１〜３のいずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、予防・治療剤。
【請求項５】
転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な食品であって、
請求項１〜３のいずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、食品。
【請求項６】
転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な食品添加物であって、
請求項１〜３のいずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、食品添加物。
【請求項７】
転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な飼料であって、
請求項１〜３のいずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、飼料。
【請求項８】
転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な飼料添加物であって、
請求項１〜３のいずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、飼料添加物。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のクルクミノイド類を有効成分として含有する、抗老化剤。
【請求項１０】
クルクミノイド類による転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現方法であって、
非ヒト動物細胞に対して前記クルクミノイド類を供給して、前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現を促進又は抑制する工程を備える、発現方法。
【請求項１１】
クルクミノイド類による転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現方法であって、
動物から採取された細胞に前記クルクミノイド類を供給して前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現を促進又は抑制する工程を備える、発現方法。
【請求項１２】
転写因子FOXO又はその相同体が関連する疾患の予防、治療又は改善する成分のスクリーニング方法であって、
非ヒト動物又は動物から採取された細胞にクルクミノイド類と被験化合物とを供給して前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現量を測定する工程を備える、方法。
【請求項１３】
測定した前記発現量を指標として前記被験化合物の前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現に対する作用を評価する工程を備える、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
転写因子FOXO又はその相同体が関連する疾患の予防、治療又は改善する成分のスクリーニング方法であって、
非ヒト動物又は動物から採取された細胞に、クルクミノイド類である被験化合物を供給して前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現量を測定する工程を備える、方法。
【請求項１５】
転写因子FOXO及びその相同体が関連する遺伝子産物の製造方法であって、
クルクミノイド類を前記転写因子FOXO及びその相同体を有する細胞に供給して、前記遺伝子産物を産生させる工程を備える、製造方法。
【請求項１】
クルクミノイド類を有効成分として含有する転写因子フォークヘッド型クラスＯ（Forkhead Box Class O、以下単に、FOXOという。）又はその相同体の活性化剤。
【請求項２】
前記クルクミノイド類は、式（１）
【化１】
（式（１）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、水素、ヒドロキシ又は低級アルコキシを表す。）で表されるクルクミン又はクルクミン誘導体である、請求項１に記載の活性化剤。
【請求項３】
前記クルクミノイド類は、式（２）
【化２】
（式（２）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、同一又は異なって、水素、ヒドロキシ又は低級アルコキシを表す。）で表されるテトラヒドロクルクミン又はテトラヒドロクルクミン誘導体である、請求項１に記載の活性化剤。
【請求項４】
転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防・治療剤であって、
請求項１〜３のいずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、予防・治療剤。
【請求項５】
転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な食品であって、
請求項１〜３のいずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、食品。
【請求項６】
転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な食品添加物であって、
請求項１〜３のいずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、食品添加物。
【請求項７】
転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な飼料であって、
請求項１〜３のいずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、飼料。
【請求項８】
転写因子FOXO又はその相同体に関する疾患の予防又は改善に有効な飼料添加物であって、
請求項１〜３のいずれかに記載の転写因子FOXO又はその相同体の活性化剤を含有する、飼料添加物。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のクルクミノイド類を有効成分として含有する、抗老化剤。
【請求項１０】
クルクミノイド類による転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現方法であって、
非ヒト動物細胞に対して前記クルクミノイド類を供給して、前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現を促進又は抑制する工程を備える、発現方法。
【請求項１１】
クルクミノイド類による転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現方法であって、
動物から採取された細胞に前記クルクミノイド類を供給して前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現を促進又は抑制する工程を備える、発現方法。
【請求項１２】
転写因子FOXO又はその相同体が関連する疾患の予防、治療又は改善する成分のスクリーニング方法であって、
非ヒト動物又は動物から採取された細胞にクルクミノイド類と被験化合物とを供給して前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現量を測定する工程を備える、方法。
【請求項１３】
測定した前記発現量を指標として前記被験化合物の前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現に対する作用を評価する工程を備える、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
転写因子FOXO又はその相同体が関連する疾患の予防、治療又は改善する成分のスクリーニング方法であって、
非ヒト動物又は動物から採取された細胞に、クルクミノイド類である被験化合物を供給して前記転写因子FOXO又はその相同体が関連する遺伝子の発現量を測定する工程を備える、方法。
【請求項１５】
転写因子FOXO及びその相同体が関連する遺伝子産物の製造方法であって、
クルクミノイド類を前記転写因子FOXO及びその相同体を有する細胞に供給して、前記遺伝子産物を産生させる工程を備える、製造方法。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図１】
【公開番号】特開２００８−１２０７２６（Ｐ２００８−１２０７２６Ａ）
【公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３０６０６１（Ｐ２００６−３０６０６１）
【出願日】平成１８年１１月１０日（２００６．１１．１０）
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月１０日（２００６．１１．１０）
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]