持続型エリスロポエチン結合体の液剤
本発明は、生体内の持続性及び安定性が向上した持続型エリスロポエチン（ＥＰＯ）結合体が長期間保存時に安定して維持される液剤に関する。前記液剤は、緩衝溶液及びマンニトールを特徴とする安定化剤を含む。前記液剤は、ヒト血清アルブミン及び他の人体に潜在的に有害な因子を含まないので、ウイルス感染の恐れなく持続型ＥＰＯ結合体の優れた保存安定性を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロポエチン（Erythropoietin，ＥＰＯ）、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンＦｃフラグメントが共有結合し、かつ野生型に比べて増加した作用持続期間を示す持続型エリスロポエチン結合体が長期間安定して維持される液剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、糖タンパク質であり、１６５個のアミノ酸からなり、骨髄において赤血球前駆細胞に対してサイトカインとして作用し、よって赤血球生成の調節に関与する。ＥＰＯは主に腎臓細胞で合成され、肝臓でも少量生成される。慢性腎不全（ＣＲＦ）で見られるように、腎臓機能の損失は典型的に、例えばＥＰＯ生成の減少及びそれに伴う赤血球の減少を引き起こす。現在、ＥＰＯは、慢性腎疾患による貧血や他の重症疾病の治療及び手術を受ける予定の患者への投与に利用されている（Mijakeら, J.Biol. Chem. 25: 5558-5564, 1977;, Eschbachら, New Engl. J.Med. 316: 73-78, 1987; Sanford B.K, Blood, 177: 419-434, 1991; 国際出願公開ＷＯ８５−０２６１０号）。
【０００３】
ヒト尿ＥＰＯは、再生不良性貧血患者からミヤケら（Miyakeら, J.Biol. Chem., 252: 5558, 1977）により最初に精製されたが、この供給源から得られたＥＰＯの量は貧血の治療用途には十分でなかった。ヒトＥＰＯ遺伝子の同定及びクローン化、及び組換えＥＰＯタンパク質の発現が米国特許第４，７０３，００８号に開示されて以降、様々な遺伝子操作によりＥＰＯが大量産生できるようになった。
【０００４】
ポリペプチドは一般に安定性が低いため変性しやすく、血液内のタンパク質加水分解酵素により分解して腎臓や肝臓から容易に通過するので、薬効成分としてポリペプチドを含むタンパク質医薬品は、好ましい血中濃度及び力価を維持するためにタンパク質薬物を患者に頻繁に投与する必要がある。しかし、このようなタンパク質医薬品の投与、特に注射剤形態は、患者に苦痛をもたらす。
【０００５】
このような問題を解決するために、タンパク質薬物の血清安定性を増加させて血中薬物濃度を高い濃度に長期間持続するための多くの努力がなされ、こうして薬物の薬効を最大化しようとした。持続性製剤の使用のために、タンパク質薬物は、患者に免疫反応を誘発することなく高い安定性を有し、薬物自体の力価が十分に高く維持されなければならない。
【０００６】
タンパク質を安定化して腎臓による酵素的分解及びクリアランスを防止するために、従来はポリエチレングリコール（polyethylene glycol，ＰＥＧ）などの溶解度の高いポリマーにタンパク質薬物の表面を化学的に変形させる方法が利用されていた。標的タンパク質の特定部位又は各種部位に結合することにより、ＰＥＧは特に副作用を起こすことなくタンパク質を安定化し、加水分解を防止する（Sadaら, J.Fermentation Bioengineering, 71: 137-139, 1991）。しかし、タンパク質安定性を増加させる能力はあるものの、ＰＥＧ化には生理活性タンパク質の力価を大きく減少させるという問題がある。また、ＰＥＧの分子量の増加による収率の減少はタンパク質の反応性を減少させる原因となる。
【０００７】
生理活性タンパク質の生体内の安定性を向上させる代案的な一方法においては、遺伝子組換えにより血清安定性の高いタンパク質をコードする遺伝子に生理活性タンパク質遺伝子を連結し、前記組換え遺伝子に形質転換された細胞を培養して融合タンパク質を産生する。例えば、融合タンパク質は、タンパク質の安定性を増加させる上で最も効果的であることが知られているタンパク質であるアルブミン又はそのフラグメントを、遺伝子組換えにより標的生理活性タンパク質に結合することにより製作することができる（国際出願公開ＷＯ９３／１５１９９号及びＷＯ９３／１５２００号，欧州特許公開ＥＰ４１３，６２２号）。
【０００８】
他の方法は、免疫グロブリンを利用するものである。米国特許第５，０４５，３１２号に記載されているように、ヒト成長ホルモンに架橋剤を利用してウシ血清アルブミン（bovine serum albumin：ＢＳＡ）又はマウス免疫グロブリンを結合する。前記結合体は変形していない成長ホルモンに比べて増加した活性を有する。架橋剤としてはカルボジイミド（carbodiimide）又はグルタルアルデヒド（glutaraldehyde）が使用される。しかし、タンパク質に対する非特異的な結合は、そのような低分子量の架橋剤が均質な結合体の形成を不可能にすると共に生体内で毒性がある。また、前記特許は成長ホルモンの化学的カップリングによりその活性を増加させることができることを示すにすぎない。上記特許の方法は様々な種類のポリペプチド薬物に対しては活性増加効果を保証できないので、上記特許は持続時間や血中半減期などのタンパク質の安定性との関連性については認識さえしていない。
【０００９】
近年、生体内で持続時間と安定性の両方を向上させた持続性タンパク質薬物製剤が提案されている。前記持続型薬物製剤の使用のために、タンパク質結合体は生理活性ポリペプチド、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンＦｃフラグメントを共有結合することにより製造される（韓国特許登録第１０−０５６７９０２号及び第１０−０７２５３１５号）。
【００１０】
この方法において、ＥＰＯは、生理活性ポリペプチドとして使用され、持続型ＥＰＯ結合体を提供することができる。持続型ＥＰＯ結合体を薬物製品として適用するために、保存及び運送過程において光、熱又は添加剤による変性、凝集、吸着、加水分解などの物理化学的な変化を抑制しつつ生体内の薬効を維持することが必須である。持続型ＥＰＯ結合体は体積が大きく、分子量が増加しているので、ＥＰＯポリペプチド自体より安定化するのは困難である。
【００１１】
一般に、タンパク質はその半減期が非常に短く、不適当な温度、水−空気の界面、高圧、物理的／機械的ストレス、有機溶媒、微生物による汚染などに露出すると、単量体の凝集、凝集による沈殿、容器表面への吸着などの変性現象が現れる。変性すると、タンパク質は本来の物理化学的特性及び生理活性を失う。一度変性すると、変性が比可逆的であるので、タンパク質はそれらの物理化学的特性及び本来の特性をほとんど回復することができない。特に、ＥＰＯのように注射１本当たり数百マイクログラムの微量で投与されるタンパク質の場合は、安定性を失い、容器の表面に吸着すると比較的大きな損失をもたらす。また、吸着したタンパク質は変性過程で凝集しやすく、変性したタンパク質の凝集体は、身体に投与されると、生体内で合成されたタンパク質とは異なり、抗原のように作用する。従って、タンパク質は安定した状態で投与しなければならない。溶液中のタンパク質の変性を防止する様々な方法が研究されている（John Geigert, J.Parenteral Sci. Tech., 43(5): 220-224, 1989; David Wong, Pharm. Tech., 34-48, 1997; Wei Wang., Int. J. Pharm., 185: 129-188, 1999; Willem Norde, Adv. Colloid Interface Sci., 25: 267-340, 1986; Michelleら, Int. J. Pharm. 120: 179-188, 1995）。
【００１２】
一部のタンパク質薬物は凍結乾燥方法で安定性問題を解決している。しかし、凍結乾燥製品は使用する際に再び注射用水（injection water）に溶解しなければならないという不便がある。また、凍結乾燥過程が産生工程に含まれ、大容量の凍結乾燥器を使用しなければならないなど、大規模な投資を必要とする。噴霧乾燥器を使用してタンパク質を粉末化する方法も提案されている。しかし、この方法は、収率が低いので経済的に好ましくない。また、噴霧乾燥段階でタンパク質が高温に露出するので、タンパク質の安定性に悪影響を及ぼす。
【００１３】
このような限界を解決する代案として、溶液状態のタンパク質に安定化剤を添加し、タンパク質薬物の物理化学的変化を抑制しつつ長期間保存を行った後も生体内で薬効を維持する研究を行った。このような安定化剤には、炭水化物、アミノ酸、タンパク質、界面活性剤、ポリマー及び塩がある。このうち、ヒト血清アルブミンは様々なタンパク質薬物の安定化剤として幅広く使用されており、その性能が立証されている（Edward Tarelliら, Biologicals, 26: 331-346, 1998）。
【００１４】
ヒト血清アルブミンは、典型的な精製工程において、マイコプラズマ、プリオン、バクテリア、ウイルスなどの生物学的汚染物を不活性化する過程、又は少なくとも１つの生物学的汚染物もしくは病原体をスクリーニングもしくは検査する過程を行う。しかし、生物学的汚染物が完全に除去又は不活性化されるわけではないので、患者が生物学的汚染物に露出する危険性が常に存在する。例えば、提供者からのヒト血液は特定ウイルスを含むか否かの検査のためにスクリーニングされる。しかし、このような過程が常に信頼できるわけではない。特に、非常に少数で存在する特定ウイルスを検出することはできない。
【００１５】
近年、組換えアルブミン（韓国公開特許第１０−２００４−０１１１３５１号公報）及びアルブミンフリーのエリスロポエチン（韓国特許登録第１０−０５６０６９７号及び第１０−０５９６６１０号）を含むヒト血清アルブミンの代案が提示されている。
【００１６】
アルブミンを含有しない安定化剤を使用するとしても、異なるタンパク質はそれらの化学的相違点により、保存期間中に異なる比率及び異なる条件下で注入されるので、徐々に不活性化される。タンパク質の保存期間による安定化剤の効果はタンパク質に応じて異なる。すなわち、各種安定化剤が標的タンパク質の物理化学的特性に応じて異なる割合で使用される。
【００１７】
さらに、異なる安定化剤を併用すると、それらの競争及び副作用により逆効果をもたらすことがある。タンパク質は保存中に本質が変化したり、濃度が変化するので、異なる安定化剤の組み合わせが異なる効果を引き起こすこともある。それぞれの安定化剤は特定の範囲の濃度で好適にその安定性を示すので、異なる安定化剤の種類及び濃度を組み合わせるのに多くの努力と注意を要する。
【００１８】
特に、生体内の持続性及び安定性を向上させた持続型ＥＰＯ結合体の場合、生理活性ペプチドＥＰＯと、非ペプチドポリマーと、免疫グロブリンＦｃフラグメントとからなるので、それらの分子量及び体積が一般的なエリスロポエチンと大きく異なる。よって、ＥＰＯの安定化剤とは異なる、特別な組成を有する安定化剤が持続型ＥＰＯ結合体に求められている。
【００１９】
本発明は、ウイルス感染の恐れなく長期間薬効を維持できる、持続型ＥＰＯ結合体の安定した液剤を開発するために、集中的かつ詳細な研究の結果、緩衝溶液及び高濃度のマンニトールを含む安定化剤が持続型ＥＰＯ結合体の安定性を増大させ、かつ持続型ＥＰＯ結合体の経済的で安定した液剤を形成できることを見出した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
よって、本発明は、ＥＰＯ、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンＦｃフラグメントが共有結合した持続型エリスロポエチン結合体と、緩衝溶液及びマンニトールを含むアルブミンフリー安定化剤とを含む液剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
一実施形態によれば、本発明は、ＥＰＯ、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンＦｃフラグメントが共有結合した持続型エリスロポエチン結合体と、緩衝溶液及びマンニトールを含むアルブミンフリー安定化剤とを含む液剤を提供する。
【００２２】
本発明で使用された「持続型エリスロポエチン結合体」又は「持続型ＥＰＯ結合体」という用語は、生理活性のＥＰＯ、少なくとも１つの非ペプチドポリマー、及び少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃフラグメントが共有結合した形態のタンパク質であって、野生型ＥＰＯに比べて作用持続期間が増加したものを意味する。
【００２３】
本発明で使用された「持続型」という用語は、作用持続期間が野生型に比べて増加したものを意味する。「結合体」という用語は、エリスロポエチン、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンＦｃフラグメントが共有結合した構成を意味する。
【００２４】
本発明に使用されるＥＰＯは、ヒトエリスロポエチン又はこれに密接に関連する類似体のアミノ酸配列を有する。本発明に有用なＥＰＯは、天然に存在するタンパク質でもよく、組換えタンパク質でもよい。また、ＥＰＯは、本来の生物学的活性に大きく影響を及ぼさない範囲で変異したアミノ酸の置換、除去又は挿入による変異体でもよい。
【００２５】
本発明に有用なヒトＥＰＯ又はその類似体は、脊椎動物から抽出されてもよく、化学的に合成されてもよい。あるいは、ＥＰＯ又はその類似体は、遺伝子組換え手法を用いてＥＰＯ又はその類似体をコードする遺伝子に形質転換された原核又は真核生物から得てもよい。これに関連して、大腸菌（例えば、E.coli）、酵母（例えば、S. cerevisiae）、又は哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サル細胞）を宿主として使用してもよい。使用した宿主に応じて、組換えＥＰＯ又はその類似体は、哺乳動物又は他の真核動物の炭水化物とグリコシル化されてもよく、グリコシル化されなくてもよい。発現される場合、組換えＥＰＯ又はその類似体は初期のメチオニン残基を含んでもよい（位置−１）。組換えヒトＥＰＯ（ＨｕＥＰＯ）は、ＣＨＯ細胞を宿主として利用して製造されることが好ましい。
【００２６】
本発明に使用される免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ヒト免疫グロブリンＦｃフラグメント又はこれに密接に関連する類似体のアミノ酸配列を有する。Ｆｃフラグメントは、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット及びモルモットが含まれる動物から分離した天然形態でもよい。また、免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭ由来のもの又はそれらの組み合わせ（combination）もしくはハイブリッド（hybrid）によるＦｃフラグメントでもよい。ヒト血液に最も豊富なタンパク質であるＩｇＧ又はＩｇＭ由来のものが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが知られているＩｇＧ由来のものが最も好ましい。ここで、免疫グロブリンＦｃは、ヒト又は動物の有機体から全免疫グロブリンを分離することにより天然の免疫グロブリンから得てタンパク質分解酵素で処理して製造したものでもよく、形質転換された動物細胞又は微生物から得られた組換え体又はその誘導体でもよい。大腸菌（E.coli）形質転換体から製造した組換えヒト免疫グロブリンＦｃであることが好ましい。
【００２７】
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブクラスに分けられ、本発明にはこれらの組み合わせ又はハイブリッドも含まれる。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスが好ましく、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ，Complementdependent cytotoxicity）などのエフェクター機能（effector function）のほとんどないＩｇＧ４のＦｃフラグメントが最も好ましい。すなわち、最も好ましい本発明の薬物キャリア用免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ４由来のグリコシル化されていないＦｃフラグメントである。ヒト生体で抗原として作用し、抗原に対して新たな抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こし得る非ヒト由来のＦｃフラグメントに比べて、ヒト由来のＦｃフラグメントが好ましい。
【００２８】
本発明に有用な持続型ＥＰＯ結合体は、ＥＰＯと免疫グロブリンＦｃフラグメントを共に結合して製造する。これに関連して、ＥＰＯと免疫グロブリンＦｃフラグメントは、非ペプチドポリマーにより架橋してもよく、組換え技術を用いて融合タンパク質を形成してもよい。
【００２９】
架橋の際に使用される非ペプチドポリマーは、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。生分解性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸グリコール酸）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。ポリエチレングリコールが好ましく、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）が最も好ましい。また、当該分野で既に知られているこれらの誘導体や、当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体なども本発明の範囲に含まれる。
【００３０】
本発明に有用な持続型ＥＰＯ結合体は、韓国特許登録第１０−０７２５３１５号に記載されているように、遺伝工学的方法を用いて製造することができる。
【００３１】
本発明による液剤は、治療学的有効量の持続型ＥＰＯ結合体を含む。一般に、ＥＰＯの治療学的有効量は、単回使用バイアル（single-use vial）１本当たり２，０００〜１０，０００国際単位（international unit，ＩＵ）の範囲である。本発明で使用される持続型ＥＰＯ結合体の濃度は１〜５，０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜３，０００μｇ／ｍｌである。
【００３２】
本発明で使用された「安定化剤」という用語は、持続型ＥＰＯ結合体が安定して保存されるようにする物質を意味する。「安定化」という用語は、所定時間の間、保存条件下で、活性成分の損失が特定量未満、一般に１０％未満であることを意味する。１０℃で２年間、２５℃で６カ月間又は４０℃で１〜２週間の保存後にＥＰＯが９０％以上、好ましくは９５％以上の初期活性を維持する場合、このような製剤は安定しているものと解される。ＥＰＯなどのタンパク質において、保存安定性は正確な投与量を保証するためだけでなく、ＥＰＯ型の抗原性物質の潜在的な生成を抑制するためにも重要である。保存期間の間、ＥＰＯ活性が約１０％の損失を示すが、これはＥＰＯが組成物内で凝集体やフラグメントになって抗原性物質を形成しない限り、投与の際に許容されるものと解される。
【００３３】
本発明における好ましい前記安定化剤は、持続型ＥＰＯ結合体に安定性を付与するために考案された緩衝溶液及びマンニトールを含む。
【００３４】
また、本発明による安定化剤は、アルブミンを含有しないことが好ましい。タンパク質の安定化剤として利用されるヒト血清アルブミンは、人体の血液から製造されるので、ヒト由来の病原性ウイルスによる汚染可能性がある。ゼラチンやウシ血清アルブミンは、疾患を引き起こしたり、一部の患者にアレルギー反応を引き起こす可能性がある。本発明のアルブミンフリー安定化剤は、ヒト又は動物由来の血清アルブミンや精製されたゼラチンなどの異種タンパク質を含有しないので、ウイルス感染の恐れがない。
【００３５】
糖アルコールの一種であるマンニトールは、持続型ＥＰＯ結合体の安定性を増大させる役割を果たすので、本発明の安定化剤として使用された。マンニトールは、好ましくは液剤の総体積比で１〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは３〜１２％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは５〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。
【００３６】
本発明の一実施形態によれば、リン酸緩衝溶液の存在下でマンニトールを安定化剤として使用すると、持続型ＥＰＯ結合体の保存安定性がソルビトール、マルトース、ＰＥＧ４００及びアミノ酸が含まれる市販の安定化剤を使用する場合より増加するという結果が確認された（表１参照）。また、特開２００９−２４９２９２号においてＥＰＯの安定化剤として使用されているマルトースを本発明に適用すると、保存期間が長くなるほど持続型ＥＰＯ結合体の安定性を減少させることを見出した（表８参照）。
【００３７】
これらの結果は、他の安定化物質と比較して持続型ＥＰＯ結合体の安定化剤としてのマンニトールの特異性を明らかにし、安定化の対象に応じて異なる安定化剤を適用しなければならないことを示す。
【００３８】
前記安定化剤に含まれる緩衝溶液は、液剤のｐＨが急激に変化しないように溶液のｐＨを維持し、持続型ＥＰＯ結合体を安定化する役割を果たす。本発明の緩衝溶液は、アルカリ塩（リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウム又はそれらの水素塩もしくは二水素塩）、クエン酸ナトリウム／クエン酸、酢酸ナトリウム／酢酸及びそれらの組み合わせが含まれる薬学的に許容可能なｐＨ緩衝剤を含んでもよい。本発明に好適な緩衝溶液としては、クエン酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、酒石酸緩衝溶液、炭酸緩衝溶液、コハク酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液があり、そのうちリン酸緩衝溶液（phosphate buffer）及びクエン酸緩衝溶液（citrate buffer）が好ましく、リン酸緩衝溶液がより好ましい。リン酸緩衝溶液において、リン酸塩は、好ましくは５〜１００ｍＭ、より好ましくは１０〜５０ｍＭの濃度である。緩衝溶液は、好ましくは４．０〜８．０、より好ましくは５．０〜７．０のｐＨを有する。
【００３９】
本発明の他の実施形態において、本発明に有用な安定化剤は、緩衝溶液及びマンニトールに加えて、等張化剤、多価アルコール、糖類、非イオン性界面活性剤及び中性アミノ酸からなる群から選択された少なくとも１つの成分をさらに含んでもよい。
【００４０】
等張化剤は、持続型ＥＰＯ結合体を溶液状で体内に投与すると浸透圧を適切に維持するだけでなく、持続型ＥＰＯ結合体を溶液状でより安定化する役割を果たす。前記等張化剤としては水溶性無機塩が挙げられる。それらは、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びそれらの組み合わせである。塩化ナトリウムが最も好ましい。
【００４１】
等張化剤の濃度は５〜２００ｍＭであることが好ましい。この範囲内であれば、等張化剤の濃度は液剤が等張液になるように剤形に含まれる成分の種類及び量に応じて調節することができる。
【００４２】
本発明の一実施形態によれば、緩衝溶液の存在下で持続型ＥＰＯ結合体の安定性に及ぼす影響を様々な種類の塩について分析した。その結果、リン酸緩衝溶液と共に、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、又は硫酸ナトリウムと塩化ナトリウムの組み合わせを含む液剤は、塩を添加しない対照群に比べて持続型ＥＰＯ結合体の安定性が増大することが確認された（表２参照）。これらの結果から、本発明による持続型ＥＰＯ結合体は、使用される塩の種類により安定化する程度が異なり、特定の塩においてより大きな安定性を示すことが分かる。
【００４３】
持続型ＥＰＯ結合体の保存安定性を増大させるためにさらに含まれる糖類の好ましい例としては、マンノース、グルコース、フルクトース、キシロースなどの単糖類と、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デキストランなどの多糖類がある。液剤において、前記糖類は、好ましくは１〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは５〜２０％（ｗ／ｖ）の量で使用される。本発明に有用な多価アルコールの例としては、プロピレングリコール、低分子量のポリエチレングリコール、グリセロール、及び低分子量のポリプロピレングリコールが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。また、前記液剤において、これらの濃度は、好ましくは１〜１５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは５〜１５％（ｗ／ｖ）である。
【００４４】
非イオン性界面活性剤は、タンパク質溶液の表面張力を低減し、疎水性表面へのタンパク質の吸着や凝集を防止する。本発明に好適な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート系非イオン性界面活性剤及びポロキサマー系非イオン性界面活性剤が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。ポリソルベート系非イオン性界面活性剤がより好ましい。そのうち、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０及びポリソルベート８０が好ましく、ポリソルベート８０がより好ましい。
【００４５】
前記非イオン性界面活性剤を液剤に高濃度で使用することは好ましくない。非イオン性界面活性剤が高濃度で存在すると、ＵＶ分光法や等焦点法などに干渉を誘発し、タンパク質の濃度や安定性の正確な評価が困難になるからである。従って、本発明の液剤には、前記非イオン性界面活性剤が好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）又はそれ未満、より好ましくは０．０１〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で含まれる。
【００４６】
本発明の一実施形態によれば、リン酸緩衝溶液の存在下で非イオン性界面活性剤がタンパク質の安定性に及ぼす影響を試験した。１週間の短い保存期間では、非イオン性界面活性剤は持続型ＥＰＯ結合体の安定性に特に影響を及ぼさないことを確認した（表３参照）。また、非イオン性界面活性剤としてポリソルベート８０を使用すると、持続型ＥＰＯ結合体は、０．１％のポリソルベート８０よりも０．０１％のポリソルベート８０を含む安定化剤組成のほうが、保存中により安定化されることが確認された（表４参照）。
【００４７】
前記液剤の安定化剤として使用できるアミノ酸は、溶液状態でＥＰＯの周辺により多くの水分子を引き寄せ、ＥＰＯの最外部の親水性アミノ酸分子をより安定化する（Wang, Int. J. Pharm. 185: 129-188, 1999）。これに関連して、電荷を有するアミノ酸は、ＥＰＯとの静電気的結合を誘導することができ、ＥＰＯの凝集を促進することができる。従って、一般にグリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシンなどの中性アミノ酸を安定化剤として添加して使用する。液剤において、中性アミノ酸は、好ましくは０．１〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【００４８】
本発明の一実施形態においては、マルトースは単独で使用した場合よりもグリシンと組み合わせて使用した場合に、持続型ＥＰＯ結合体の高い保存安定性を保証した。しかし、マンニトールを３〜１２％（ｗ／ｖ）の高濃度で処理した場合、マルトースとグリシンの組み合わせで処理した場合より、中性アミノ酸を添加しなくても高い安定性を提供することを確認した（表１０参照）。
【００４９】
従って、持続型ＥＰＯ結合体に高い安定性を付与する液剤は、中性アミノ酸を添加しなくても、高濃度のマンニトールを利用することにより製作することができる。しかし、２０％（ｗ／ｖ）以上のマンニトール濃度は等張範囲を超える。従って、液剤において、マンニトールは１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは３〜１２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは５〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。
【００５０】
緩衝溶液、等張化剤、糖アルコール、中性アミノ酸及び非イオン性界面活性剤が含まれる前述した成分以外にも、本発明の液剤には、本発明の効果を失わない範囲内で当業界で公知の他の成分が選択的にさらに含まれてもよい。
【００５１】
本発明の好ましい一実施形態において、液剤は、アルブミンを含有せず、緩衝溶液、マンニトール、等張化剤及び非イオン性界面活性剤を含む。
【００５２】
より具体的には、本発明は、持続型ＥＰＯ結合体及び安定化剤を含む液剤を提供するが、前記安定化剤はリン酸又はクエン酸緩衝溶液、マンニトール、等張化剤及びポリソルベート８０を含み、前記等張化剤は塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。前記液剤は、５〜１００ｍＭの濃度のリン酸又はクエン酸緩衝溶液、１〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトール、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択される５〜２００ｍＭの濃度の等張化剤、並びに０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を含むことが好ましい。前記液剤は、５〜１００ｍＭの濃度のリン酸緩衝溶液、３〜１２％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトール、１００〜２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、及び０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を含むことがより好ましい。前記液剤は、１０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）、５〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトール、１００〜２００ｍＭの濃度のナトリウム、及び０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を含み、中性アミノ酸を含まないことが最も好ましい。
【００５３】
本発明の一実施形態によれば、１０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）、５〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトール、１００〜２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、及び０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を含む持続型ＥＰＯ結合体の液剤におけるＥＰＯの保存安定性を、公知のＥＰＯ製剤であるロシュ社のレコルモン（Recormon）と比較した。ＥＰＯは、商業的に利用可能な製剤より、本発明の液剤のほうが安定していることを確認した（表６及び表１４参照）。
【００５４】
また、本発明によるＥＰＯの液剤におけるＥＰＯの保存安定性を、現在貧血治療剤として使用されているアムジェン社のアラネスプ（Aranesp）、リウマチ関節炎治療剤として使用されているアムジェン社のエンブレル（Enbrel，ＴＮＦＲ−Ｆｃ）、ＰＢＳのみ含まれるものなどの他の剤形と比較した。その結果、本発明の持続型ＥＰＯ結合体の液剤が他の液剤より高い安定性を示すことを確認した（表１７参照）。
【００５５】
他の実施形態において、本発明による持続型ＥＰＯ結合体の液剤の長期保存安定性を分析し、持続型ＥＰＯ結合体が１２カ月間安定性を維持し、加速条件下で６カ月間保存しても少なくとも９２．５％の活性を有することを確認した（表１９〜表２１参照）。
【００５６】
これらの結果から、緩衝溶液及び１〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトールを含む液剤は、中性アミノ酸を添加しなくても、持続型ＥＰＯ結合体を１２カ月以上安定して保存できることが分かる。
【発明の効果】
【００５７】
本発明による持続型エリスロポエチン結合体の液剤は、緩衝溶液及びマンニトールを含有する安定化剤を含み、ヒト血清アルブミン及び他の人体に潜在的に有害な因子を含まないので、ウイルス感染の恐れがなく、ＥＰＯと免疫グロブリンＦｃフラグメントの結合により構成されるので、野生型ＥＰＯに比べて分子量が大きく、作用持続期間が増加した持続型ＥＰＯ結合体の優れた保存安定性を提供する。また、中性アミノ酸を含まなくても、本発明の液剤はＥＰＯの高い安定性を提供することができるので、他の安定化剤や凍結乾燥製剤に比べて経済的により有利である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】安定化剤の組成を変えた持続型ＥＰＯ結合体の液剤と、市販のＥＰＯの液剤であるレコルモン（Recormon）を４０℃で４週間保存し、１週間間隔でＥＰＯの安定性を逆相クロマトグラフィーにより分析したグラフである。
【図２】ｐＨ６．５のリン酸緩衝溶液、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート８０を含む持続型ＥＰＯ結合体の液剤を４℃で１２カ月間保存し、２カ月間隔で持続型ＥＰＯ結合体の安定性を逆相クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーにより分析したグラフである。
【図３】ｐＨ６．５のリン酸緩衝溶液、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート８０を含む持続型ＥＰＯ結合体の液剤を４℃で１２カ月間保存し、２カ月間隔で持続型ＥＰＯ結合体の安定性をインビトロ（in vitro）で確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
以下、下記実施例により本発明をより詳細に説明するが、下記実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【００６０】
（実施例１）
持続型ＥＰＯ結合体の製造
＜１−１＞免疫グロブリンを利用した免疫グロブリンＦｃフラグメントの製造
本実施例に有用な免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ヒト非グリコシル化ＩｇＧ４Ｆｃフラグメントであり、韓国特許登録第７２５３１４号に記載された方法により大腸菌形質転換体から発現されたものである。
【００６１】
＜１−２＞組換えヒトエリスロポエチンの製造
本実施例に使用されたヒトＥＰ０は、韓国登録特許第８８０５０９号に記載された方法により得られた。このために、遺伝子の転写調節配列であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（dihydrofolate reductase）遺伝子プロモータを人為的に弱体化させ、遺伝子の増幅効率を大きく改善できるベクターで形質転換された動物細胞株を利用してヒトＥＰＯタンパク質を発現するように培養した。高グリコシル化されたタンパク質のみ精製して使用した。
【００６２】
＜１−３＞免疫グロブリンＦｃフラグメントを利用した持続型ＥＰＯ結合体の製造
本実施例における持続型ＥＰＯ結合体は、ヒトエリスロポエチンと免疫グロブリンＦｃフラグメントを非ペプチドポリマーで共有結合して製造した。また、前記結合体は、韓国登録特許第７２５３１５号及び第７７５３４３号に記載された方法により得られた。
【００６３】
（実施例２）
各種安定化剤による持続型ＥＰＯ結合体の安定性評価
リン酸緩衝溶液存在下で、糖類、糖アルコール、多価アルコール及びアミノ酸が含まれる各種安定化剤における持続型ＥＰＯ結合体の安定化能力を分析した。
【００６４】
分析のために、リン酸緩衝溶液としてリン酸ナトリウム（Na-phosphate）緩衝溶液を、糖アルコールとしてマンニトール（mannitol）又はソルビトール（sorbitol）を、アミノ酸としてヒスチジン（histidine）又はメチオニン（methionine）を、糖類としてマルトース（maltose）を、多価アルコールとしてＰＥＧ４００を使用した。
【００６５】
下記表１の組成のものを４０℃で１週間保存し、その後逆相クロマトグラフィー（reverse phase chromatography，ＲＰＣ）で分析した。結果を下記表１に示す。ＲＰＣ（％）（面積％／初期面積％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
表１に示すように、安定化剤としてマンニトールを使用すると、持続型ＥＰＯ結合体が最も安定して維持された。
【００６８】
（実施例３）
塩による持続型ＥＰＯ結合体の安定性評価
リン酸緩衝溶液の存在下で、各種塩の持続型ＥＰＯ結合体を安定化する能力を分析するために下記実験を行った。アルカリ塩、無機塩などの塩は、ｐＨ緩衝剤として持続型結合体にさらなるｐＨ安定性を付与するだけでなく、等張化剤として浸透圧を適切に維持する役割を果たす。
【００６９】
下記表２の組成のものを４０℃で１週間保存し、その後逆相クロマトグラフィーで分析した。分析のために、緩衝溶液としてリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）を、塩として塩化銅（II）、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及び炭酸ナトリウムを使用した。結果を下記表２に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【００７０】
【表２】
【００７１】
表２に示すように、持続型ＥＰＯ結合体の安定性は、リン酸緩衝溶液の条件下で、塩を添加しない対照群に比べて、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、又は硫酸ナトリウムと塩化ナトリウムの組み合わせを使用すると増加した。それに対して、持続型ＥＰＯ結合体の安定性は、塩化銅（II）を使用すると、対照群に比べて低下した。
【００７２】
これらの結果から、本発明の持続型ＥＰＯ結合体は、使用される塩の種類により安定化する程度が異なり、特定の塩においてより高い安定性を示すことが分かる。
【００７３】
（実施例４）
非イオン性界面活性剤による持続型ＥＰＯ結合体の安定性評価
リン酸緩衝溶液の存在下で、各種非イオン性界面活性剤の持続型ＥＰＯ結合体を安定化する能力を分析するために下記実験を行った。
【００７４】
分析のために、非イオン性リン酸緩衝溶液としてポリソルベート８０を使用し、塩、糖アルコール及び糖類を含み、持続型ＥＰＯ結合体に安定性を付与することが示された他の製剤を適切に組み合わせた。
【００７５】
単純化のために、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムが含まれる検証された塩から塩化ナトリウムを選択した。また、実施例１において最も高い安定性を示すことが確認されたマンニトールを使用した。ＥＰＯの濃度を２００μｇ／ｍｌとし、緩衝溶液として１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を使用する同一条件下で、下記表３の組成を有する本発明の持続型ＥＰＯ結合体を４０℃で１週間保存し、その後逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表３に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【００７６】
【表３】
【００７７】
表３に示すように、リン酸緩衝溶液条件下で、ＥＰＯは非イオン性界面活性剤の存在に関係なく、ＥＰＯの安定性に大きく影響を与えないことが確認され、これは、非イオン性界面活性剤が１週間の短い保存期間ではＥＰＯ安定性に特に影響を及ぼさないことを示す。
【００７８】
また、持続型ＥＰＯ結合体の安定性に対して非イオン性界面活性剤の濃度が及ぼす影響を実験した。ＥＰＯの濃度を２００μｇ／ｍｌとし、緩衝溶液として１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を使用する同一条件下で、下記表４の組成のものを本発明の持続型ＥＰＯ結合体の安定化剤として使用し、４０℃で２週間保存し、その後逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表４に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【００７９】
【表４】
【００８０】
表４に示すように、２週の保存期間の間、持続型ＥＰＯ結合体は、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）緩衝溶液に５％マンニトール及び１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む液剤において、０．１％ポリソルベート８０を補充した場合より、０．０１％ポリソルベート８０を補充した場合のほうが安定性が高かった。
【００８１】
（実施例５）
持続型ＥＰＯ結合体の液剤の比較（Ｉ）
保存安定性について、市販のＥＰＯ液剤であるロシュ社のレコルモン（Roche）を、本発明の持続型ＥＰＯ結合体の液剤と比較した。レコルモンの組成は明らかでないが、緩衝溶液としてのリン酸ナトリウム、界面活性剤としてのポリソルベート２０、塩としての塩化ナトリウム、並びに安定化物質としてのウレア、塩化カルシウム（CaCl）、グリシン（glycine）、ロイシン（leucine）、イソロイシン（isoleucine）、トレオニン（threonine）、グルタミン酸（glutamic acid）及びフェニルアラニン（phenylalanine）を含む。
【００８２】
本発明の持続型ＥＰＯ結合体の液剤は、界面活性剤として０．１〜０．００５％の様々な濃度のポリソルベート８０を、塩として１５０及び２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを、安定化剤として１〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトール又はウレアを使用した。本発明の持続型ＥＰＯ結合体は、下記表５の組成のものを４０℃で２週間保存し、その後逆相クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィー（Size exclusion chromatography，ＳＥ−ＨＰＬＣ）で分析した。結果を下記表６に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）及びＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【００８３】
【表５】
【００８４】
【表６】
【００８５】
表６に示すように、２週間の保存期間の間、本発明の持続型ＥＰＯ結合体の液剤のうち、界面活性剤として０．１％ポリソルベート８０を有する５番液剤と、安定化剤としてウレアを有する７番液剤を除いて、本発明の全ての持続型ＥＰＯ結合体の液剤がレコルモンより高い保存安定性を示した。
【００８６】
（実施例６）
持続型ＥＰＯ結合体に保存安定性を付与する安定化剤の探索
持続型ＥＰＯ結合体に長期間の保存安定性を付与する安定化剤を探索するために、持続型ＥＰＯ結合体の液剤を下記表７の組成で製造した。これに関連して、グリシンとメチオニンをそれぞれ界面活性剤−塩化ナトリウム−マルトースの組成に添加して長期間の保存安定性に対するアミノ酸の影響を試験した。また、前記液剤において、ＥＰＯの濃度を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）中で２００μｇ／ｍｌにした。
【００８７】
４０℃で４週間保存し、持続型ＥＰＯ結合体の液剤を一週間毎に逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表８に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【００８８】
【表７】
【００８９】
【表８】
【００９０】
表８に示すように、４週間の保存期間の間、持続型ＥＰＯ結合体は、塩化ナトリウムと共にマルトースとグリシンを安定化剤として組み合わせた液剤において、安定性が最も高く維持されることが確認された。２週間保存し、その後安定化剤として１０％マルトースを単独で使用した液剤は、１０％マルトース及び１％グリシンを組み合わせて使用した液剤と同程度の保存安定性を示した。しかし、１０％マルトースを単独で使用した液剤は、４週間の保存後の保存安定性が著しく低下した。それに対して、１０％マルトース及び１％グリシンを使用した液剤は、４週間の保存後も高い安定性を維持することが確認された。
【００９１】
２番液剤と３番液剤を比較すると、メチオニンが持続型ＥＰＯ結合体の安定性を大きく低下させたが、これは中性アミノ酸、特にグリシンが持続型ＥＰＯ結合体の長期間の保存安定性を大きく増大させることを示すものである。
【００９２】
（実施例７）
持続型ＥＰＯ結合体の長期間の保存安定性に対するマンニトール及びマルトースの評価
実施例６で持続型ＥＰＯ結合体の最も大きな安定性を示したマルトース−グリシンを含む液剤、同一条件でマルトースの代わりにマンニトールを含む液剤、及びマンニトールのみを含む液剤の３種類の液剤を下記表９のように製造した。これらの長期間の保存安定性を評価した。液剤において、ＥＰＯの濃度を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）中で２００μｇ／ｍｌにした。
【００９３】
４０℃で４週間保存し、一週間毎に逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表１０に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。また、表１０の結果を図１にグラフで示し、市販のＥＰＯ液剤であるレコルモンの値を外挿した。
【００９４】
【表９】
【００９５】
【表１０】
【００９６】
表１０に示すように、５週間の保存期間の間、持続型ＥＰＯ結合体は、安定化剤としてマルトース−グリシンを含む液剤より、マンニトール−グリシンを含む液剤の保存安定性のほうが高いことが確認された。また、マンニトールのみを含む液剤も同程度の保存安定性を示した。
【００９７】
これらの結果は、マルトースのみを含む液剤がマルトース−グリシン製剤に比べて保存安定性が大きく低下したのとは際立って対照的に、マンニトールが中性アミノ酸の助けなしに持続型ＥＰＯ結合体に長期間の保存安定性を付与することを示すものである。また、マンニトールを５〜１５％（ｗ／ｖ）の高濃度で使用すると、中性アミノ酸が存在しなくてもＥＰＯ結合体を高い安定性で長期間保存できることを示す。
【００９８】
（実施例８）
持続型ＥＰＯ結合体の長期間の保存安定性に対する緩衝溶液の評価
緩衝溶液の持続型ＥＰ０結合体を安定化する能力について評価した。持続型ＥＰＯ結合体の安定性と塩及び糖アルコールの容量の関係について試験するために下記実験を行った。
【００９９】
まず、緩衝溶液の持続型ＥＰＯ結合体の安定性に対する影響を確認するために、０．０１％ポリソルベート、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、及びリン酸緩衝溶液又はクエン酸緩衝溶液を調合して下記表１１のように液剤を製造した（１番及び２番）。液剤組成には、安定化剤として高濃度（５％）のマンニトールを含み、いかなるアミノ酸も含まず、持続型ＥＰＯ結合体を２００μｇ／ｍｌの濃度で添加した。持続型ＥＰＯ結合体の液剤を４０℃で４週間保存し、保存中の１週間後及び４週間後に逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表１２に示す（１番及び２番）。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【０１００】
実施例７のマンニトールを含む液剤、リン酸緩衝溶液の代わりにクエン酸緩衝溶液を含む液剤、及び塩と糖アルコールの容量を半分にした液剤について、持続型ＥＰＯ結合体の安定性に対する影響を実験した。
【０１０１】
液剤において、持続型ＥＰＯ結合体の濃度を２００μｇ／ｍｌにして下記表１１の安定化剤を使用した。持続型ＥＰＯ結合体の液剤を４０℃で４週間保存し、保存中の１週間後及び４週間後に逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表１２に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【０１０２】
【表１１】
【０１０３】
【表１２】
【０１０４】
表１２のデータから分かるように、液剤がマンニトールを含む場合、持続型ＥＰＯ結合体の保存安定性の水準は液剤に含まれる緩衝溶液の種類に大きく影響を受けない。これらの結果は、リン酸緩衝溶液以外の通常の緩衝溶液を利用しても、持続型ＥＰＯ結合体に長期間の保存安定性を付与する液剤を製造できることを意味する。
【０１０５】
（実施例９）
持続型ＥＰＯ結合体の液剤の保存安定性の比較（II）
保存安定性について、実施例２〜８で安定化能力が証明された、リン酸緩衝溶液（ｐＨ６．５）、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート８０で製造された液剤を、市販のＥＰＯ液剤であるロシュ社のレコルモンと比較した。本発明の液剤とレコルモンの組成を下記表１３に示す。これらを４０℃で４週間保存し、持続型ＥＰＯ結合体の液剤を保存中の２週間後及び４週間後に逆相クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表１４に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）とＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【０１０６】
【表１３】
【０１０７】
【表１４】
【０１０８】
表１４から分かるように、安定化剤として高濃度のマンニトールを含む液剤は、様々な種類の中性アミノ酸を含むレコルモンよりも優れたＥＰＯの保存安定性を示す。これらの結果から、本発明の液剤は持続型ＥＰＯ結合体に特異的に優れた保存安定性を提供できることが分かる。
【０１０９】
（実施例１０）
各種液剤組成間の保存安定性の比較
保存安定性について、実施例２〜８で保存安定性が証明された、リン酸緩衝溶液（ｐＨ６．５）、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート８０で製造された液剤を、市販されている様々な種類の剤形の組成を持続型ＥＰＯ結合体に適用して製造された液剤と比較した。
【０１１０】
下記表１５に開示される液剤を本実施例に使用した。表１５において、１番は現在貧血治療剤として使用されているアムジェン社製のアラネスプ（Aranesp）であり、２番はリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．５）、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート８０を含む安定化剤組成で製造された液剤であり、３番はアラネスプにおいて薬物を持続型ＥＰＯ結合体に代えた液剤であり、４番は関節リウマチ治療剤であるアムジェン社製のエンブレル（Enbrel，ＴＮＦＲ−Ｆｃ）において薬物を本発明の持続型ＥＰＯ結合体に代えた液剤であり、５番はＰＢＳのみ含む液剤である。
【０１１１】
４０℃で３週間保存し、持続型ＥＰＯ結合体の液剤を１週間毎に逆相クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表１７に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）とＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【０１１２】
【表１５】
【０１１３】
【表１６】
【０１１４】
【表１７】
【０１１５】
表１７から分かるように、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）、０．００５％ポリソルベート８０、１０％マンニトール及び２００ｎＭ塩化ナトリウムを含む本発明の液剤を除く全ての液剤において、３週間の保存中に凝集（aggregation）が観察された。従って、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）、０．００５％ポリソルベート８０、１０％マンニトール及び２００ｎＭ塩化ナトリウムを含む本発明の液剤は、持続型ＥＰＯ結合体の長期保存において最も有望な製剤である。
【０１１６】
（実施例１１）
持続型ＥＰＯ結合体の液剤の長期保存及び加速安定性の試験
長期保存安定性及びその加速安定性を確認するために、最も優れた保存安定性を示すことが確認された安定化剤組成であるリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．５）、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート８０を含む持続型ＥＰＯ結合体の液剤を４℃で１２カ月間保存して試料の保存安定性を分析した。保存の具体的な条件を下記表１８に示す。分析結果を下記表１９及び図２に示す。表１９において、ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）及びＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【０１１７】
また、前述した持続型ＥＰＯ結合体の液剤を４℃で１２カ月間保存した試料の保存安定性を試験管内（in vitro）で確認した（図３）。
【０１１８】
本実施例に使用された持続型ＥＰＯ結合体の試験管内の力価確認にはＴＦ−１細胞株（ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ ２００３）を用いた。ＴＦ−１細胞を窒素タンクに保存し、細胞を所定量に培養して細胞数を測定した。ＢＲＰ−ＥＰＯと持続型ＥＰＯ結合体を所定比率で混合して５０μＬ／ウェルずつ９６ウェルプレートに入れた。既に細胞数が確認された細胞を利用して４００００細胞／ｍＬとなるようにアッセイ培地で希釈し、これを５０μＬ／ウェルずつ９６ウェルプレートに入れた。３７℃のＣＯ２インキュベーターで７２時間培養し、その後９６ウェルプレートにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＲＯＭＥＧＡ，Ｇ３５８Ｂ）をそれぞれ１５μＬずつ添加した。さらに、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４時間培養した。軽いピペッティング（pipeting）で染色試薬を除去し、その後４９０ｎｍで吸光度を測定してＥＣ５０を計算した。計算されたＥＣ５０値から比活性度を得た。
【０１１９】
【表１８】
【０１２０】
【表１９】
【０１２１】
表１９に示すように、持続型ＥＰＯ結合体は、本発明による安定化剤組成を含む液剤において１２カ月間高い安定性を維持することが確認された。
【０１２２】
また、前述した安定化剤組成からなる持続型ＥＰＯ結合体の液剤を４℃で１２カ月間保存し、その後２５℃で６カ月間保存して試料の保存安定性を分析した。結果を下記表２０及び表２１に示す。表２０及び表２１において、ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（％）、タンパク質含有量（％）及び生物学的不活性試験（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【０１２３】
【表２０】
【０１２４】
【表２１】
【０１２５】
表２０及び表２１に示すように、持続型ＥＰＯ結合体は、本発明による安定化剤組成の液剤において１２カ月間高い安定性を維持し、加速条件で６カ月間保存しても初期活性の９２．５％を有することが確認された。従って、本発明による持続型ＥＰＯ結合体の液剤の効果的な保存安定性が確認された。
【０１２６】
本発明の好ましい実現例が例示的な目的で記載されたとしても、当業者であれば添付の請求の範囲に記載された本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、様々な変更、追加又は置換が可能であることを理解するであろう。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明により持続型ＥＰＯ結合体に特異的に保存安定性を提供する液剤は、ヒト血清アルブミンフリーであると共に、ウイルス感染の恐れがない。前記製剤は簡単な剤形であるので、他の安定化剤や凍結乾燥製剤に比べて経済的な提供が可能であるという利点がある。また、前記液剤は、野生型に比べて作用持続期間が延長された持続型ＥＰＯ結合体を含み、かつタンパク質活性を長期間維持できるので、効率的な薬物システムとして利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロポエチン（Erythropoietin，ＥＰＯ）、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンＦｃフラグメントが共有結合し、かつ野生型に比べて増加した作用持続期間を示す持続型エリスロポエチン結合体が長期間安定して維持される液剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、糖タンパク質であり、１６５個のアミノ酸からなり、骨髄において赤血球前駆細胞に対してサイトカインとして作用し、よって赤血球生成の調節に関与する。ＥＰＯは主に腎臓細胞で合成され、肝臓でも少量生成される。慢性腎不全（ＣＲＦ）で見られるように、腎臓機能の損失は典型的に、例えばＥＰＯ生成の減少及びそれに伴う赤血球の減少を引き起こす。現在、ＥＰＯは、慢性腎疾患による貧血や他の重症疾病の治療及び手術を受ける予定の患者への投与に利用されている（Mijakeら, J.Biol. Chem. 25: 5558-5564, 1977;, Eschbachら, New Engl. J.Med. 316: 73-78, 1987; Sanford B.K, Blood, 177: 419-434, 1991; 国際出願公開ＷＯ８５−０２６１０号）。
【０００３】
ヒト尿ＥＰＯは、再生不良性貧血患者からミヤケら（Miyakeら, J.Biol. Chem., 252: 5558, 1977）により最初に精製されたが、この供給源から得られたＥＰＯの量は貧血の治療用途には十分でなかった。ヒトＥＰＯ遺伝子の同定及びクローン化、及び組換えＥＰＯタンパク質の発現が米国特許第４，７０３，００８号に開示されて以降、様々な遺伝子操作によりＥＰＯが大量産生できるようになった。
【０００４】
ポリペプチドは一般に安定性が低いため変性しやすく、血液内のタンパク質加水分解酵素により分解して腎臓や肝臓から容易に通過するので、薬効成分としてポリペプチドを含むタンパク質医薬品は、好ましい血中濃度及び力価を維持するためにタンパク質薬物を患者に頻繁に投与する必要がある。しかし、このようなタンパク質医薬品の投与、特に注射剤形態は、患者に苦痛をもたらす。
【０００５】
このような問題を解決するために、タンパク質薬物の血清安定性を増加させて血中薬物濃度を高い濃度に長期間持続するための多くの努力がなされ、こうして薬物の薬効を最大化しようとした。持続性製剤の使用のために、タンパク質薬物は、患者に免疫反応を誘発することなく高い安定性を有し、薬物自体の力価が十分に高く維持されなければならない。
【０００６】
タンパク質を安定化して腎臓による酵素的分解及びクリアランスを防止するために、従来はポリエチレングリコール（polyethylene glycol，ＰＥＧ）などの溶解度の高いポリマーにタンパク質薬物の表面を化学的に変形させる方法が利用されていた。標的タンパク質の特定部位又は各種部位に結合することにより、ＰＥＧは特に副作用を起こすことなくタンパク質を安定化し、加水分解を防止する（Sadaら, J.Fermentation Bioengineering, 71: 137-139, 1991）。しかし、タンパク質安定性を増加させる能力はあるものの、ＰＥＧ化には生理活性タンパク質の力価を大きく減少させるという問題がある。また、ＰＥＧの分子量の増加による収率の減少はタンパク質の反応性を減少させる原因となる。
【０００７】
生理活性タンパク質の生体内の安定性を向上させる代案的な一方法においては、遺伝子組換えにより血清安定性の高いタンパク質をコードする遺伝子に生理活性タンパク質遺伝子を連結し、前記組換え遺伝子に形質転換された細胞を培養して融合タンパク質を産生する。例えば、融合タンパク質は、タンパク質の安定性を増加させる上で最も効果的であることが知られているタンパク質であるアルブミン又はそのフラグメントを、遺伝子組換えにより標的生理活性タンパク質に結合することにより製作することができる（国際出願公開ＷＯ９３／１５１９９号及びＷＯ９３／１５２００号，欧州特許公開ＥＰ４１３，６２２号）。
【０００８】
他の方法は、免疫グロブリンを利用するものである。米国特許第５，０４５，３１２号に記載されているように、ヒト成長ホルモンに架橋剤を利用してウシ血清アルブミン（bovine serum albumin：ＢＳＡ）又はマウス免疫グロブリンを結合する。前記結合体は変形していない成長ホルモンに比べて増加した活性を有する。架橋剤としてはカルボジイミド（carbodiimide）又はグルタルアルデヒド（glutaraldehyde）が使用される。しかし、タンパク質に対する非特異的な結合は、そのような低分子量の架橋剤が均質な結合体の形成を不可能にすると共に生体内で毒性がある。また、前記特許は成長ホルモンの化学的カップリングによりその活性を増加させることができることを示すにすぎない。上記特許の方法は様々な種類のポリペプチド薬物に対しては活性増加効果を保証できないので、上記特許は持続時間や血中半減期などのタンパク質の安定性との関連性については認識さえしていない。
【０００９】
近年、生体内で持続時間と安定性の両方を向上させた持続性タンパク質薬物製剤が提案されている。前記持続型薬物製剤の使用のために、タンパク質結合体は生理活性ポリペプチド、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンＦｃフラグメントを共有結合することにより製造される（韓国特許登録第１０−０５６７９０２号及び第１０−０７２５３１５号）。
【００１０】
この方法において、ＥＰＯは、生理活性ポリペプチドとして使用され、持続型ＥＰＯ結合体を提供することができる。持続型ＥＰＯ結合体を薬物製品として適用するために、保存及び運送過程において光、熱又は添加剤による変性、凝集、吸着、加水分解などの物理化学的な変化を抑制しつつ生体内の薬効を維持することが必須である。持続型ＥＰＯ結合体は体積が大きく、分子量が増加しているので、ＥＰＯポリペプチド自体より安定化するのは困難である。
【００１１】
一般に、タンパク質はその半減期が非常に短く、不適当な温度、水−空気の界面、高圧、物理的／機械的ストレス、有機溶媒、微生物による汚染などに露出すると、単量体の凝集、凝集による沈殿、容器表面への吸着などの変性現象が現れる。変性すると、タンパク質は本来の物理化学的特性及び生理活性を失う。一度変性すると、変性が比可逆的であるので、タンパク質はそれらの物理化学的特性及び本来の特性をほとんど回復することができない。特に、ＥＰＯのように注射１本当たり数百マイクログラムの微量で投与されるタンパク質の場合は、安定性を失い、容器の表面に吸着すると比較的大きな損失をもたらす。また、吸着したタンパク質は変性過程で凝集しやすく、変性したタンパク質の凝集体は、身体に投与されると、生体内で合成されたタンパク質とは異なり、抗原のように作用する。従って、タンパク質は安定した状態で投与しなければならない。溶液中のタンパク質の変性を防止する様々な方法が研究されている（John Geigert, J.Parenteral Sci. Tech., 43(5): 220-224, 1989; David Wong, Pharm. Tech., 34-48, 1997; Wei Wang., Int. J. Pharm., 185: 129-188, 1999; Willem Norde, Adv. Colloid Interface Sci., 25: 267-340, 1986; Michelleら, Int. J. Pharm. 120: 179-188, 1995）。
【００１２】
一部のタンパク質薬物は凍結乾燥方法で安定性問題を解決している。しかし、凍結乾燥製品は使用する際に再び注射用水（injection water）に溶解しなければならないという不便がある。また、凍結乾燥過程が産生工程に含まれ、大容量の凍結乾燥器を使用しなければならないなど、大規模な投資を必要とする。噴霧乾燥器を使用してタンパク質を粉末化する方法も提案されている。しかし、この方法は、収率が低いので経済的に好ましくない。また、噴霧乾燥段階でタンパク質が高温に露出するので、タンパク質の安定性に悪影響を及ぼす。
【００１３】
このような限界を解決する代案として、溶液状態のタンパク質に安定化剤を添加し、タンパク質薬物の物理化学的変化を抑制しつつ長期間保存を行った後も生体内で薬効を維持する研究を行った。このような安定化剤には、炭水化物、アミノ酸、タンパク質、界面活性剤、ポリマー及び塩がある。このうち、ヒト血清アルブミンは様々なタンパク質薬物の安定化剤として幅広く使用されており、その性能が立証されている（Edward Tarelliら, Biologicals, 26: 331-346, 1998）。
【００１４】
ヒト血清アルブミンは、典型的な精製工程において、マイコプラズマ、プリオン、バクテリア、ウイルスなどの生物学的汚染物を不活性化する過程、又は少なくとも１つの生物学的汚染物もしくは病原体をスクリーニングもしくは検査する過程を行う。しかし、生物学的汚染物が完全に除去又は不活性化されるわけではないので、患者が生物学的汚染物に露出する危険性が常に存在する。例えば、提供者からのヒト血液は特定ウイルスを含むか否かの検査のためにスクリーニングされる。しかし、このような過程が常に信頼できるわけではない。特に、非常に少数で存在する特定ウイルスを検出することはできない。
【００１５】
近年、組換えアルブミン（韓国公開特許第１０−２００４−０１１１３５１号公報）及びアルブミンフリーのエリスロポエチン（韓国特許登録第１０−０５６０６９７号及び第１０−０５９６６１０号）を含むヒト血清アルブミンの代案が提示されている。
【００１６】
アルブミンを含有しない安定化剤を使用するとしても、異なるタンパク質はそれらの化学的相違点により、保存期間中に異なる比率及び異なる条件下で注入されるので、徐々に不活性化される。タンパク質の保存期間による安定化剤の効果はタンパク質に応じて異なる。すなわち、各種安定化剤が標的タンパク質の物理化学的特性に応じて異なる割合で使用される。
【００１７】
さらに、異なる安定化剤を併用すると、それらの競争及び副作用により逆効果をもたらすことがある。タンパク質は保存中に本質が変化したり、濃度が変化するので、異なる安定化剤の組み合わせが異なる効果を引き起こすこともある。それぞれの安定化剤は特定の範囲の濃度で好適にその安定性を示すので、異なる安定化剤の種類及び濃度を組み合わせるのに多くの努力と注意を要する。
【００１８】
特に、生体内の持続性及び安定性を向上させた持続型ＥＰＯ結合体の場合、生理活性ペプチドＥＰＯと、非ペプチドポリマーと、免疫グロブリンＦｃフラグメントとからなるので、それらの分子量及び体積が一般的なエリスロポエチンと大きく異なる。よって、ＥＰＯの安定化剤とは異なる、特別な組成を有する安定化剤が持続型ＥＰＯ結合体に求められている。
【００１９】
本発明は、ウイルス感染の恐れなく長期間薬効を維持できる、持続型ＥＰＯ結合体の安定した液剤を開発するために、集中的かつ詳細な研究の結果、緩衝溶液及び高濃度のマンニトールを含む安定化剤が持続型ＥＰＯ結合体の安定性を増大させ、かつ持続型ＥＰＯ結合体の経済的で安定した液剤を形成できることを見出した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
よって、本発明は、ＥＰＯ、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンＦｃフラグメントが共有結合した持続型エリスロポエチン結合体と、緩衝溶液及びマンニトールを含むアルブミンフリー安定化剤とを含む液剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
一実施形態によれば、本発明は、ＥＰＯ、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンＦｃフラグメントが共有結合した持続型エリスロポエチン結合体と、緩衝溶液及びマンニトールを含むアルブミンフリー安定化剤とを含む液剤を提供する。
【００２２】
本発明で使用された「持続型エリスロポエチン結合体」又は「持続型ＥＰＯ結合体」という用語は、生理活性のＥＰＯ、少なくとも１つの非ペプチドポリマー、及び少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃフラグメントが共有結合した形態のタンパク質であって、野生型ＥＰＯに比べて作用持続期間が増加したものを意味する。
【００２３】
本発明で使用された「持続型」という用語は、作用持続期間が野生型に比べて増加したものを意味する。「結合体」という用語は、エリスロポエチン、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンＦｃフラグメントが共有結合した構成を意味する。
【００２４】
本発明に使用されるＥＰＯは、ヒトエリスロポエチン又はこれに密接に関連する類似体のアミノ酸配列を有する。本発明に有用なＥＰＯは、天然に存在するタンパク質でもよく、組換えタンパク質でもよい。また、ＥＰＯは、本来の生物学的活性に大きく影響を及ぼさない範囲で変異したアミノ酸の置換、除去又は挿入による変異体でもよい。
【００２５】
本発明に有用なヒトＥＰＯ又はその類似体は、脊椎動物から抽出されてもよく、化学的に合成されてもよい。あるいは、ＥＰＯ又はその類似体は、遺伝子組換え手法を用いてＥＰＯ又はその類似体をコードする遺伝子に形質転換された原核又は真核生物から得てもよい。これに関連して、大腸菌（例えば、E.coli）、酵母（例えば、S. cerevisiae）、又は哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サル細胞）を宿主として使用してもよい。使用した宿主に応じて、組換えＥＰＯ又はその類似体は、哺乳動物又は他の真核動物の炭水化物とグリコシル化されてもよく、グリコシル化されなくてもよい。発現される場合、組換えＥＰＯ又はその類似体は初期のメチオニン残基を含んでもよい（位置−１）。組換えヒトＥＰＯ（ＨｕＥＰＯ）は、ＣＨＯ細胞を宿主として利用して製造されることが好ましい。
【００２６】
本発明に使用される免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ヒト免疫グロブリンＦｃフラグメント又はこれに密接に関連する類似体のアミノ酸配列を有する。Ｆｃフラグメントは、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット及びモルモットが含まれる動物から分離した天然形態でもよい。また、免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭ由来のもの又はそれらの組み合わせ（combination）もしくはハイブリッド（hybrid）によるＦｃフラグメントでもよい。ヒト血液に最も豊富なタンパク質であるＩｇＧ又はＩｇＭ由来のものが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが知られているＩｇＧ由来のものが最も好ましい。ここで、免疫グロブリンＦｃは、ヒト又は動物の有機体から全免疫グロブリンを分離することにより天然の免疫グロブリンから得てタンパク質分解酵素で処理して製造したものでもよく、形質転換された動物細胞又は微生物から得られた組換え体又はその誘導体でもよい。大腸菌（E.coli）形質転換体から製造した組換えヒト免疫グロブリンＦｃであることが好ましい。
【００２７】
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブクラスに分けられ、本発明にはこれらの組み合わせ又はハイブリッドも含まれる。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスが好ましく、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ，Complementdependent cytotoxicity）などのエフェクター機能（effector function）のほとんどないＩｇＧ４のＦｃフラグメントが最も好ましい。すなわち、最も好ましい本発明の薬物キャリア用免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ４由来のグリコシル化されていないＦｃフラグメントである。ヒト生体で抗原として作用し、抗原に対して新たな抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こし得る非ヒト由来のＦｃフラグメントに比べて、ヒト由来のＦｃフラグメントが好ましい。
【００２８】
本発明に有用な持続型ＥＰＯ結合体は、ＥＰＯと免疫グロブリンＦｃフラグメントを共に結合して製造する。これに関連して、ＥＰＯと免疫グロブリンＦｃフラグメントは、非ペプチドポリマーにより架橋してもよく、組換え技術を用いて融合タンパク質を形成してもよい。
【００２９】
架橋の際に使用される非ペプチドポリマーは、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。生分解性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸グリコール酸）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。ポリエチレングリコールが好ましく、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）が最も好ましい。また、当該分野で既に知られているこれらの誘導体や、当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体なども本発明の範囲に含まれる。
【００３０】
本発明に有用な持続型ＥＰＯ結合体は、韓国特許登録第１０−０７２５３１５号に記載されているように、遺伝工学的方法を用いて製造することができる。
【００３１】
本発明による液剤は、治療学的有効量の持続型ＥＰＯ結合体を含む。一般に、ＥＰＯの治療学的有効量は、単回使用バイアル（single-use vial）１本当たり２，０００〜１０，０００国際単位（international unit，ＩＵ）の範囲である。本発明で使用される持続型ＥＰＯ結合体の濃度は１〜５，０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜３，０００μｇ／ｍｌである。
【００３２】
本発明で使用された「安定化剤」という用語は、持続型ＥＰＯ結合体が安定して保存されるようにする物質を意味する。「安定化」という用語は、所定時間の間、保存条件下で、活性成分の損失が特定量未満、一般に１０％未満であることを意味する。１０℃で２年間、２５℃で６カ月間又は４０℃で１〜２週間の保存後にＥＰＯが９０％以上、好ましくは９５％以上の初期活性を維持する場合、このような製剤は安定しているものと解される。ＥＰＯなどのタンパク質において、保存安定性は正確な投与量を保証するためだけでなく、ＥＰＯ型の抗原性物質の潜在的な生成を抑制するためにも重要である。保存期間の間、ＥＰＯ活性が約１０％の損失を示すが、これはＥＰＯが組成物内で凝集体やフラグメントになって抗原性物質を形成しない限り、投与の際に許容されるものと解される。
【００３３】
本発明における好ましい前記安定化剤は、持続型ＥＰＯ結合体に安定性を付与するために考案された緩衝溶液及びマンニトールを含む。
【００３４】
また、本発明による安定化剤は、アルブミンを含有しないことが好ましい。タンパク質の安定化剤として利用されるヒト血清アルブミンは、人体の血液から製造されるので、ヒト由来の病原性ウイルスによる汚染可能性がある。ゼラチンやウシ血清アルブミンは、疾患を引き起こしたり、一部の患者にアレルギー反応を引き起こす可能性がある。本発明のアルブミンフリー安定化剤は、ヒト又は動物由来の血清アルブミンや精製されたゼラチンなどの異種タンパク質を含有しないので、ウイルス感染の恐れがない。
【００３５】
糖アルコールの一種であるマンニトールは、持続型ＥＰＯ結合体の安定性を増大させる役割を果たすので、本発明の安定化剤として使用された。マンニトールは、好ましくは液剤の総体積比で１〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは３〜１２％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは５〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。
【００３６】
本発明の一実施形態によれば、リン酸緩衝溶液の存在下でマンニトールを安定化剤として使用すると、持続型ＥＰＯ結合体の保存安定性がソルビトール、マルトース、ＰＥＧ４００及びアミノ酸が含まれる市販の安定化剤を使用する場合より増加するという結果が確認された（表１参照）。また、特開２００９−２４９２９２号においてＥＰＯの安定化剤として使用されているマルトースを本発明に適用すると、保存期間が長くなるほど持続型ＥＰＯ結合体の安定性を減少させることを見出した（表８参照）。
【００３７】
これらの結果は、他の安定化物質と比較して持続型ＥＰＯ結合体の安定化剤としてのマンニトールの特異性を明らかにし、安定化の対象に応じて異なる安定化剤を適用しなければならないことを示す。
【００３８】
前記安定化剤に含まれる緩衝溶液は、液剤のｐＨが急激に変化しないように溶液のｐＨを維持し、持続型ＥＰＯ結合体を安定化する役割を果たす。本発明の緩衝溶液は、アルカリ塩（リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウム又はそれらの水素塩もしくは二水素塩）、クエン酸ナトリウム／クエン酸、酢酸ナトリウム／酢酸及びそれらの組み合わせが含まれる薬学的に許容可能なｐＨ緩衝剤を含んでもよい。本発明に好適な緩衝溶液としては、クエン酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、酒石酸緩衝溶液、炭酸緩衝溶液、コハク酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液があり、そのうちリン酸緩衝溶液（phosphate buffer）及びクエン酸緩衝溶液（citrate buffer）が好ましく、リン酸緩衝溶液がより好ましい。リン酸緩衝溶液において、リン酸塩は、好ましくは５〜１００ｍＭ、より好ましくは１０〜５０ｍＭの濃度である。緩衝溶液は、好ましくは４．０〜８．０、より好ましくは５．０〜７．０のｐＨを有する。
【００３９】
本発明の他の実施形態において、本発明に有用な安定化剤は、緩衝溶液及びマンニトールに加えて、等張化剤、多価アルコール、糖類、非イオン性界面活性剤及び中性アミノ酸からなる群から選択された少なくとも１つの成分をさらに含んでもよい。
【００４０】
等張化剤は、持続型ＥＰＯ結合体を溶液状で体内に投与すると浸透圧を適切に維持するだけでなく、持続型ＥＰＯ結合体を溶液状でより安定化する役割を果たす。前記等張化剤としては水溶性無機塩が挙げられる。それらは、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びそれらの組み合わせである。塩化ナトリウムが最も好ましい。
【００４１】
等張化剤の濃度は５〜２００ｍＭであることが好ましい。この範囲内であれば、等張化剤の濃度は液剤が等張液になるように剤形に含まれる成分の種類及び量に応じて調節することができる。
【００４２】
本発明の一実施形態によれば、緩衝溶液の存在下で持続型ＥＰＯ結合体の安定性に及ぼす影響を様々な種類の塩について分析した。その結果、リン酸緩衝溶液と共に、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、又は硫酸ナトリウムと塩化ナトリウムの組み合わせを含む液剤は、塩を添加しない対照群に比べて持続型ＥＰＯ結合体の安定性が増大することが確認された（表２参照）。これらの結果から、本発明による持続型ＥＰＯ結合体は、使用される塩の種類により安定化する程度が異なり、特定の塩においてより大きな安定性を示すことが分かる。
【００４３】
持続型ＥＰＯ結合体の保存安定性を増大させるためにさらに含まれる糖類の好ましい例としては、マンノース、グルコース、フルクトース、キシロースなどの単糖類と、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デキストランなどの多糖類がある。液剤において、前記糖類は、好ましくは１〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは５〜２０％（ｗ／ｖ）の量で使用される。本発明に有用な多価アルコールの例としては、プロピレングリコール、低分子量のポリエチレングリコール、グリセロール、及び低分子量のポリプロピレングリコールが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。また、前記液剤において、これらの濃度は、好ましくは１〜１５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは５〜１５％（ｗ／ｖ）である。
【００４４】
非イオン性界面活性剤は、タンパク質溶液の表面張力を低減し、疎水性表面へのタンパク質の吸着や凝集を防止する。本発明に好適な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート系非イオン性界面活性剤及びポロキサマー系非イオン性界面活性剤が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。ポリソルベート系非イオン性界面活性剤がより好ましい。そのうち、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０及びポリソルベート８０が好ましく、ポリソルベート８０がより好ましい。
【００４５】
前記非イオン性界面活性剤を液剤に高濃度で使用することは好ましくない。非イオン性界面活性剤が高濃度で存在すると、ＵＶ分光法や等焦点法などに干渉を誘発し、タンパク質の濃度や安定性の正確な評価が困難になるからである。従って、本発明の液剤には、前記非イオン性界面活性剤が好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）又はそれ未満、より好ましくは０．０１〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で含まれる。
【００４６】
本発明の一実施形態によれば、リン酸緩衝溶液の存在下で非イオン性界面活性剤がタンパク質の安定性に及ぼす影響を試験した。１週間の短い保存期間では、非イオン性界面活性剤は持続型ＥＰＯ結合体の安定性に特に影響を及ぼさないことを確認した（表３参照）。また、非イオン性界面活性剤としてポリソルベート８０を使用すると、持続型ＥＰＯ結合体は、０．１％のポリソルベート８０よりも０．０１％のポリソルベート８０を含む安定化剤組成のほうが、保存中により安定化されることが確認された（表４参照）。
【００４７】
前記液剤の安定化剤として使用できるアミノ酸は、溶液状態でＥＰＯの周辺により多くの水分子を引き寄せ、ＥＰＯの最外部の親水性アミノ酸分子をより安定化する（Wang, Int. J. Pharm. 185: 129-188, 1999）。これに関連して、電荷を有するアミノ酸は、ＥＰＯとの静電気的結合を誘導することができ、ＥＰＯの凝集を促進することができる。従って、一般にグリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシンなどの中性アミノ酸を安定化剤として添加して使用する。液剤において、中性アミノ酸は、好ましくは０．１〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度である。
【００４８】
本発明の一実施形態においては、マルトースは単独で使用した場合よりもグリシンと組み合わせて使用した場合に、持続型ＥＰＯ結合体の高い保存安定性を保証した。しかし、マンニトールを３〜１２％（ｗ／ｖ）の高濃度で処理した場合、マルトースとグリシンの組み合わせで処理した場合より、中性アミノ酸を添加しなくても高い安定性を提供することを確認した（表１０参照）。
【００４９】
従って、持続型ＥＰＯ結合体に高い安定性を付与する液剤は、中性アミノ酸を添加しなくても、高濃度のマンニトールを利用することにより製作することができる。しかし、２０％（ｗ／ｖ）以上のマンニトール濃度は等張範囲を超える。従って、液剤において、マンニトールは１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは３〜１２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは５〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される。
【００５０】
緩衝溶液、等張化剤、糖アルコール、中性アミノ酸及び非イオン性界面活性剤が含まれる前述した成分以外にも、本発明の液剤には、本発明の効果を失わない範囲内で当業界で公知の他の成分が選択的にさらに含まれてもよい。
【００５１】
本発明の好ましい一実施形態において、液剤は、アルブミンを含有せず、緩衝溶液、マンニトール、等張化剤及び非イオン性界面活性剤を含む。
【００５２】
より具体的には、本発明は、持続型ＥＰＯ結合体及び安定化剤を含む液剤を提供するが、前記安定化剤はリン酸又はクエン酸緩衝溶液、マンニトール、等張化剤及びポリソルベート８０を含み、前記等張化剤は塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。前記液剤は、５〜１００ｍＭの濃度のリン酸又はクエン酸緩衝溶液、１〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトール、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択される５〜２００ｍＭの濃度の等張化剤、並びに０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を含むことが好ましい。前記液剤は、５〜１００ｍＭの濃度のリン酸緩衝溶液、３〜１２％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトール、１００〜２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、及び０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を含むことがより好ましい。前記液剤は、１０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）、５〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトール、１００〜２００ｍＭの濃度のナトリウム、及び０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を含み、中性アミノ酸を含まないことが最も好ましい。
【００５３】
本発明の一実施形態によれば、１０ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）、５〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトール、１００〜２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、及び０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を含む持続型ＥＰＯ結合体の液剤におけるＥＰＯの保存安定性を、公知のＥＰＯ製剤であるロシュ社のレコルモン（Recormon）と比較した。ＥＰＯは、商業的に利用可能な製剤より、本発明の液剤のほうが安定していることを確認した（表６及び表１４参照）。
【００５４】
また、本発明によるＥＰＯの液剤におけるＥＰＯの保存安定性を、現在貧血治療剤として使用されているアムジェン社のアラネスプ（Aranesp）、リウマチ関節炎治療剤として使用されているアムジェン社のエンブレル（Enbrel，ＴＮＦＲ−Ｆｃ）、ＰＢＳのみ含まれるものなどの他の剤形と比較した。その結果、本発明の持続型ＥＰＯ結合体の液剤が他の液剤より高い安定性を示すことを確認した（表１７参照）。
【００５５】
他の実施形態において、本発明による持続型ＥＰＯ結合体の液剤の長期保存安定性を分析し、持続型ＥＰＯ結合体が１２カ月間安定性を維持し、加速条件下で６カ月間保存しても少なくとも９２．５％の活性を有することを確認した（表１９〜表２１参照）。
【００５６】
これらの結果から、緩衝溶液及び１〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトールを含む液剤は、中性アミノ酸を添加しなくても、持続型ＥＰＯ結合体を１２カ月以上安定して保存できることが分かる。
【発明の効果】
【００５７】
本発明による持続型エリスロポエチン結合体の液剤は、緩衝溶液及びマンニトールを含有する安定化剤を含み、ヒト血清アルブミン及び他の人体に潜在的に有害な因子を含まないので、ウイルス感染の恐れがなく、ＥＰＯと免疫グロブリンＦｃフラグメントの結合により構成されるので、野生型ＥＰＯに比べて分子量が大きく、作用持続期間が増加した持続型ＥＰＯ結合体の優れた保存安定性を提供する。また、中性アミノ酸を含まなくても、本発明の液剤はＥＰＯの高い安定性を提供することができるので、他の安定化剤や凍結乾燥製剤に比べて経済的により有利である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】安定化剤の組成を変えた持続型ＥＰＯ結合体の液剤と、市販のＥＰＯの液剤であるレコルモン（Recormon）を４０℃で４週間保存し、１週間間隔でＥＰＯの安定性を逆相クロマトグラフィーにより分析したグラフである。
【図２】ｐＨ６．５のリン酸緩衝溶液、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート８０を含む持続型ＥＰＯ結合体の液剤を４℃で１２カ月間保存し、２カ月間隔で持続型ＥＰＯ結合体の安定性を逆相クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーにより分析したグラフである。
【図３】ｐＨ６．５のリン酸緩衝溶液、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート８０を含む持続型ＥＰＯ結合体の液剤を４℃で１２カ月間保存し、２カ月間隔で持続型ＥＰＯ結合体の安定性をインビトロ（in vitro）で確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
以下、下記実施例により本発明をより詳細に説明するが、下記実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【００６０】
（実施例１）
持続型ＥＰＯ結合体の製造
＜１−１＞免疫グロブリンを利用した免疫グロブリンＦｃフラグメントの製造
本実施例に有用な免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ヒト非グリコシル化ＩｇＧ４Ｆｃフラグメントであり、韓国特許登録第７２５３１４号に記載された方法により大腸菌形質転換体から発現されたものである。
【００６１】
＜１−２＞組換えヒトエリスロポエチンの製造
本実施例に使用されたヒトＥＰ０は、韓国登録特許第８８０５０９号に記載された方法により得られた。このために、遺伝子の転写調節配列であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（dihydrofolate reductase）遺伝子プロモータを人為的に弱体化させ、遺伝子の増幅効率を大きく改善できるベクターで形質転換された動物細胞株を利用してヒトＥＰＯタンパク質を発現するように培養した。高グリコシル化されたタンパク質のみ精製して使用した。
【００６２】
＜１−３＞免疫グロブリンＦｃフラグメントを利用した持続型ＥＰＯ結合体の製造
本実施例における持続型ＥＰＯ結合体は、ヒトエリスロポエチンと免疫グロブリンＦｃフラグメントを非ペプチドポリマーで共有結合して製造した。また、前記結合体は、韓国登録特許第７２５３１５号及び第７７５３４３号に記載された方法により得られた。
【００６３】
（実施例２）
各種安定化剤による持続型ＥＰＯ結合体の安定性評価
リン酸緩衝溶液存在下で、糖類、糖アルコール、多価アルコール及びアミノ酸が含まれる各種安定化剤における持続型ＥＰＯ結合体の安定化能力を分析した。
【００６４】
分析のために、リン酸緩衝溶液としてリン酸ナトリウム（Na-phosphate）緩衝溶液を、糖アルコールとしてマンニトール（mannitol）又はソルビトール（sorbitol）を、アミノ酸としてヒスチジン（histidine）又はメチオニン（methionine）を、糖類としてマルトース（maltose）を、多価アルコールとしてＰＥＧ４００を使用した。
【００６５】
下記表１の組成のものを４０℃で１週間保存し、その後逆相クロマトグラフィー（reverse phase chromatography，ＲＰＣ）で分析した。結果を下記表１に示す。ＲＰＣ（％）（面積％／初期面積％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
表１に示すように、安定化剤としてマンニトールを使用すると、持続型ＥＰＯ結合体が最も安定して維持された。
【００６８】
（実施例３）
塩による持続型ＥＰＯ結合体の安定性評価
リン酸緩衝溶液の存在下で、各種塩の持続型ＥＰＯ結合体を安定化する能力を分析するために下記実験を行った。アルカリ塩、無機塩などの塩は、ｐＨ緩衝剤として持続型結合体にさらなるｐＨ安定性を付与するだけでなく、等張化剤として浸透圧を適切に維持する役割を果たす。
【００６９】
下記表２の組成のものを４０℃で１週間保存し、その後逆相クロマトグラフィーで分析した。分析のために、緩衝溶液としてリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）を、塩として塩化銅（II）、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及び炭酸ナトリウムを使用した。結果を下記表２に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【００７０】
【表２】
【００７１】
表２に示すように、持続型ＥＰＯ結合体の安定性は、リン酸緩衝溶液の条件下で、塩を添加しない対照群に比べて、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、又は硫酸ナトリウムと塩化ナトリウムの組み合わせを使用すると増加した。それに対して、持続型ＥＰＯ結合体の安定性は、塩化銅（II）を使用すると、対照群に比べて低下した。
【００７２】
これらの結果から、本発明の持続型ＥＰＯ結合体は、使用される塩の種類により安定化する程度が異なり、特定の塩においてより高い安定性を示すことが分かる。
【００７３】
（実施例４）
非イオン性界面活性剤による持続型ＥＰＯ結合体の安定性評価
リン酸緩衝溶液の存在下で、各種非イオン性界面活性剤の持続型ＥＰＯ結合体を安定化する能力を分析するために下記実験を行った。
【００７４】
分析のために、非イオン性リン酸緩衝溶液としてポリソルベート８０を使用し、塩、糖アルコール及び糖類を含み、持続型ＥＰＯ結合体に安定性を付与することが示された他の製剤を適切に組み合わせた。
【００７５】
単純化のために、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムが含まれる検証された塩から塩化ナトリウムを選択した。また、実施例１において最も高い安定性を示すことが確認されたマンニトールを使用した。ＥＰＯの濃度を２００μｇ／ｍｌとし、緩衝溶液として１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を使用する同一条件下で、下記表３の組成を有する本発明の持続型ＥＰＯ結合体を４０℃で１週間保存し、その後逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表３に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【００７６】
【表３】
【００７７】
表３に示すように、リン酸緩衝溶液条件下で、ＥＰＯは非イオン性界面活性剤の存在に関係なく、ＥＰＯの安定性に大きく影響を与えないことが確認され、これは、非イオン性界面活性剤が１週間の短い保存期間ではＥＰＯ安定性に特に影響を及ぼさないことを示す。
【００７８】
また、持続型ＥＰＯ結合体の安定性に対して非イオン性界面活性剤の濃度が及ぼす影響を実験した。ＥＰＯの濃度を２００μｇ／ｍｌとし、緩衝溶液として１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を使用する同一条件下で、下記表４の組成のものを本発明の持続型ＥＰＯ結合体の安定化剤として使用し、４０℃で２週間保存し、その後逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表４に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【００７９】
【表４】
【００８０】
表４に示すように、２週の保存期間の間、持続型ＥＰＯ結合体は、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）緩衝溶液に５％マンニトール及び１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む液剤において、０．１％ポリソルベート８０を補充した場合より、０．０１％ポリソルベート８０を補充した場合のほうが安定性が高かった。
【００８１】
（実施例５）
持続型ＥＰＯ結合体の液剤の比較（Ｉ）
保存安定性について、市販のＥＰＯ液剤であるロシュ社のレコルモン（Roche）を、本発明の持続型ＥＰＯ結合体の液剤と比較した。レコルモンの組成は明らかでないが、緩衝溶液としてのリン酸ナトリウム、界面活性剤としてのポリソルベート２０、塩としての塩化ナトリウム、並びに安定化物質としてのウレア、塩化カルシウム（CaCl）、グリシン（glycine）、ロイシン（leucine）、イソロイシン（isoleucine）、トレオニン（threonine）、グルタミン酸（glutamic acid）及びフェニルアラニン（phenylalanine）を含む。
【００８２】
本発明の持続型ＥＰＯ結合体の液剤は、界面活性剤として０．１〜０．００５％の様々な濃度のポリソルベート８０を、塩として１５０及び２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを、安定化剤として１〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトール又はウレアを使用した。本発明の持続型ＥＰＯ結合体は、下記表５の組成のものを４０℃で２週間保存し、その後逆相クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィー（Size exclusion chromatography，ＳＥ−ＨＰＬＣ）で分析した。結果を下記表６に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）及びＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【００８３】
【表５】
【００８４】
【表６】
【００８５】
表６に示すように、２週間の保存期間の間、本発明の持続型ＥＰＯ結合体の液剤のうち、界面活性剤として０．１％ポリソルベート８０を有する５番液剤と、安定化剤としてウレアを有する７番液剤を除いて、本発明の全ての持続型ＥＰＯ結合体の液剤がレコルモンより高い保存安定性を示した。
【００８６】
（実施例６）
持続型ＥＰＯ結合体に保存安定性を付与する安定化剤の探索
持続型ＥＰＯ結合体に長期間の保存安定性を付与する安定化剤を探索するために、持続型ＥＰＯ結合体の液剤を下記表７の組成で製造した。これに関連して、グリシンとメチオニンをそれぞれ界面活性剤−塩化ナトリウム−マルトースの組成に添加して長期間の保存安定性に対するアミノ酸の影響を試験した。また、前記液剤において、ＥＰＯの濃度を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）中で２００μｇ／ｍｌにした。
【００８７】
４０℃で４週間保存し、持続型ＥＰＯ結合体の液剤を一週間毎に逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表８に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【００８８】
【表７】
【００８９】
【表８】
【００９０】
表８に示すように、４週間の保存期間の間、持続型ＥＰＯ結合体は、塩化ナトリウムと共にマルトースとグリシンを安定化剤として組み合わせた液剤において、安定性が最も高く維持されることが確認された。２週間保存し、その後安定化剤として１０％マルトースを単独で使用した液剤は、１０％マルトース及び１％グリシンを組み合わせて使用した液剤と同程度の保存安定性を示した。しかし、１０％マルトースを単独で使用した液剤は、４週間の保存後の保存安定性が著しく低下した。それに対して、１０％マルトース及び１％グリシンを使用した液剤は、４週間の保存後も高い安定性を維持することが確認された。
【００９１】
２番液剤と３番液剤を比較すると、メチオニンが持続型ＥＰＯ結合体の安定性を大きく低下させたが、これは中性アミノ酸、特にグリシンが持続型ＥＰＯ結合体の長期間の保存安定性を大きく増大させることを示すものである。
【００９２】
（実施例７）
持続型ＥＰＯ結合体の長期間の保存安定性に対するマンニトール及びマルトースの評価
実施例６で持続型ＥＰＯ結合体の最も大きな安定性を示したマルトース−グリシンを含む液剤、同一条件でマルトースの代わりにマンニトールを含む液剤、及びマンニトールのみを含む液剤の３種類の液剤を下記表９のように製造した。これらの長期間の保存安定性を評価した。液剤において、ＥＰＯの濃度を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）中で２００μｇ／ｍｌにした。
【００９３】
４０℃で４週間保存し、一週間毎に逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表１０に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。また、表１０の結果を図１にグラフで示し、市販のＥＰＯ液剤であるレコルモンの値を外挿した。
【００９４】
【表９】
【００９５】
【表１０】
【００９６】
表１０に示すように、５週間の保存期間の間、持続型ＥＰＯ結合体は、安定化剤としてマルトース−グリシンを含む液剤より、マンニトール−グリシンを含む液剤の保存安定性のほうが高いことが確認された。また、マンニトールのみを含む液剤も同程度の保存安定性を示した。
【００９７】
これらの結果は、マルトースのみを含む液剤がマルトース−グリシン製剤に比べて保存安定性が大きく低下したのとは際立って対照的に、マンニトールが中性アミノ酸の助けなしに持続型ＥＰＯ結合体に長期間の保存安定性を付与することを示すものである。また、マンニトールを５〜１５％（ｗ／ｖ）の高濃度で使用すると、中性アミノ酸が存在しなくてもＥＰＯ結合体を高い安定性で長期間保存できることを示す。
【００９８】
（実施例８）
持続型ＥＰＯ結合体の長期間の保存安定性に対する緩衝溶液の評価
緩衝溶液の持続型ＥＰ０結合体を安定化する能力について評価した。持続型ＥＰＯ結合体の安定性と塩及び糖アルコールの容量の関係について試験するために下記実験を行った。
【００９９】
まず、緩衝溶液の持続型ＥＰＯ結合体の安定性に対する影響を確認するために、０．０１％ポリソルベート、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、及びリン酸緩衝溶液又はクエン酸緩衝溶液を調合して下記表１１のように液剤を製造した（１番及び２番）。液剤組成には、安定化剤として高濃度（５％）のマンニトールを含み、いかなるアミノ酸も含まず、持続型ＥＰＯ結合体を２００μｇ／ｍｌの濃度で添加した。持続型ＥＰＯ結合体の液剤を４０℃で４週間保存し、保存中の１週間後及び４週間後に逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表１２に示す（１番及び２番）。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【０１００】
実施例７のマンニトールを含む液剤、リン酸緩衝溶液の代わりにクエン酸緩衝溶液を含む液剤、及び塩と糖アルコールの容量を半分にした液剤について、持続型ＥＰＯ結合体の安定性に対する影響を実験した。
【０１０１】
液剤において、持続型ＥＰＯ結合体の濃度を２００μｇ／ｍｌにして下記表１１の安定化剤を使用した。持続型ＥＰＯ結合体の液剤を４０℃で４週間保存し、保存中の１週間後及び４週間後に逆相クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表１２に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【０１０２】
【表１１】
【０１０３】
【表１２】
【０１０４】
表１２のデータから分かるように、液剤がマンニトールを含む場合、持続型ＥＰＯ結合体の保存安定性の水準は液剤に含まれる緩衝溶液の種類に大きく影響を受けない。これらの結果は、リン酸緩衝溶液以外の通常の緩衝溶液を利用しても、持続型ＥＰＯ結合体に長期間の保存安定性を付与する液剤を製造できることを意味する。
【０１０５】
（実施例９）
持続型ＥＰＯ結合体の液剤の保存安定性の比較（II）
保存安定性について、実施例２〜８で安定化能力が証明された、リン酸緩衝溶液（ｐＨ６．５）、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート８０で製造された液剤を、市販のＥＰＯ液剤であるロシュ社のレコルモンと比較した。本発明の液剤とレコルモンの組成を下記表１３に示す。これらを４０℃で４週間保存し、持続型ＥＰＯ結合体の液剤を保存中の２週間後及び４週間後に逆相クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表１４に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）とＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【０１０６】
【表１３】
【０１０７】
【表１４】
【０１０８】
表１４から分かるように、安定化剤として高濃度のマンニトールを含む液剤は、様々な種類の中性アミノ酸を含むレコルモンよりも優れたＥＰＯの保存安定性を示す。これらの結果から、本発明の液剤は持続型ＥＰＯ結合体に特異的に優れた保存安定性を提供できることが分かる。
【０１０９】
（実施例１０）
各種液剤組成間の保存安定性の比較
保存安定性について、実施例２〜８で保存安定性が証明された、リン酸緩衝溶液（ｐＨ６．５）、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート８０で製造された液剤を、市販されている様々な種類の剤形の組成を持続型ＥＰＯ結合体に適用して製造された液剤と比較した。
【０１１０】
下記表１５に開示される液剤を本実施例に使用した。表１５において、１番は現在貧血治療剤として使用されているアムジェン社製のアラネスプ（Aranesp）であり、２番はリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．５）、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート８０を含む安定化剤組成で製造された液剤であり、３番はアラネスプにおいて薬物を持続型ＥＰＯ結合体に代えた液剤であり、４番は関節リウマチ治療剤であるアムジェン社製のエンブレル（Enbrel，ＴＮＦＲ−Ｆｃ）において薬物を本発明の持続型ＥＰＯ結合体に代えた液剤であり、５番はＰＢＳのみ含む液剤である。
【０１１１】
４０℃で３週間保存し、持続型ＥＰＯ結合体の液剤を１週間毎に逆相クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。結果を下記表１７に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）とＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【０１１２】
【表１５】
【０１１３】
【表１６】
【０１１４】
【表１７】
【０１１５】
表１７から分かるように、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）、０．００５％ポリソルベート８０、１０％マンニトール及び２００ｎＭ塩化ナトリウムを含む本発明の液剤を除く全ての液剤において、３週間の保存中に凝集（aggregation）が観察された。従って、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）、０．００５％ポリソルベート８０、１０％マンニトール及び２００ｎＭ塩化ナトリウムを含む本発明の液剤は、持続型ＥＰＯ結合体の長期保存において最も有望な製剤である。
【０１１６】
（実施例１１）
持続型ＥＰＯ結合体の液剤の長期保存及び加速安定性の試験
長期保存安定性及びその加速安定性を確認するために、最も優れた保存安定性を示すことが確認された安定化剤組成であるリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．５）、塩化ナトリウム、マンニトール及びポリソルベート８０を含む持続型ＥＰＯ結合体の液剤を４℃で１２カ月間保存して試料の保存安定性を分析した。保存の具体的な条件を下記表１８に示す。分析結果を下記表１９及び図２に示す。表１９において、ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）及びＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【０１１７】
また、前述した持続型ＥＰＯ結合体の液剤を４℃で１２カ月間保存した試料の保存安定性を試験管内（in vitro）で確認した（図３）。
【０１１８】
本実施例に使用された持続型ＥＰＯ結合体の試験管内の力価確認にはＴＦ−１細胞株（ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ ２００３）を用いた。ＴＦ−１細胞を窒素タンクに保存し、細胞を所定量に培養して細胞数を測定した。ＢＲＰ−ＥＰＯと持続型ＥＰＯ結合体を所定比率で混合して５０μＬ／ウェルずつ９６ウェルプレートに入れた。既に細胞数が確認された細胞を利用して４００００細胞／ｍＬとなるようにアッセイ培地で希釈し、これを５０μＬ／ウェルずつ９６ウェルプレートに入れた。３７℃のＣＯ２インキュベーターで７２時間培養し、その後９６ウェルプレートにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＲＯＭＥＧＡ，Ｇ３５８Ｂ）をそれぞれ１５μＬずつ添加した。さらに、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４時間培養した。軽いピペッティング（pipeting）で染色試薬を除去し、その後４９０ｎｍで吸光度を測定してＥＣ５０を計算した。計算されたＥＣ５０値から比活性度を得た。
【０１１９】
【表１８】
【０１２０】
【表１９】
【０１２１】
表１９に示すように、持続型ＥＰＯ結合体は、本発明による安定化剤組成を含む液剤において１２カ月間高い安定性を維持することが確認された。
【０１２２】
また、前述した安定化剤組成からなる持続型ＥＰＯ結合体の液剤を４℃で１２カ月間保存し、その後２５℃で６カ月間保存して試料の保存安定性を分析した。結果を下記表２０及び表２１に示す。表２０及び表２１において、ＲＰ−ＨＰＬＣ（％）、ＳＥ−ＨＰＬＣ（％）、タンパク質含有量（％）及び生物学的不活性試験（％）は初期値に対する持続型ＥＰＯ結合体の残存率を示す。
【０１２３】
【表２０】
【０１２４】
【表２１】
【０１２５】
表２０及び表２１に示すように、持続型ＥＰＯ結合体は、本発明による安定化剤組成の液剤において１２カ月間高い安定性を維持し、加速条件で６カ月間保存しても初期活性の９２．５％を有することが確認された。従って、本発明による持続型ＥＰＯ結合体の液剤の効果的な保存安定性が確認された。
【０１２６】
本発明の好ましい実現例が例示的な目的で記載されたとしても、当業者であれば添付の請求の範囲に記載された本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、様々な変更、追加又は置換が可能であることを理解するであろう。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明により持続型ＥＰＯ結合体に特異的に保存安定性を提供する液剤は、ヒト血清アルブミンフリーであると共に、ウイルス感染の恐れがない。前記製剤は簡単な剤形であるので、他の安定化剤や凍結乾燥製剤に比べて経済的な提供が可能であるという利点がある。また、前記液剤は、野生型に比べて作用持続期間が延長された持続型ＥＰＯ結合体を含み、かつタンパク質活性を長期間維持できるので、効率的な薬物システムとして利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンＦｃフラグメントが共有結合した治療学的有効量の持続型エリスロポエチン結合体と、緩衝溶液及びマンニトールを含むアルブミンフリー安定化剤とを含む持続型エリスロポエチン（ＥＰＯ）結合体の液剤。
【請求項２】
前記マンニトールが、液剤の総体積比で１〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度を有するものである請求項１に記載の液剤。
【請求項３】
前記緩衝溶液が、クエン酸、リン酸、酒石酸、炭酸、コハク酸、乳酸及び酢酸緩衝溶液からなる群から選択されるものである請求項１に記載の液剤。
【請求項４】
前記緩衝溶液が、５〜１００ｍＭの濃度を有するものである請求項１に記載の液剤。
【請求項５】
前記緩衝溶液が、４〜８のｐＨを有するものである請求項１に記載の液剤。
【請求項６】
前記アルブミンフリー安定化剤が、等張化剤、多価アルコール、糖類、非イオン性界面活性剤、中性アミノ酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択された成分をさらに含むものである請求項１に記載の液剤。
【請求項７】
前記等張化剤が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択された塩である請求項６に記載の液剤。
【請求項８】
前記等張化剤が、５〜２００ｍＭの濃度を有するものである請求項６に記載の液剤。
【請求項９】
前記非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート系又はポロキサマー系非イオン性界面活性剤である請求項６に記載の液剤。
【請求項１０】
前記ポリソルベート系非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０及びポリソルベート８０からなる群から選択されるものである請求項９に記載の液剤。
【請求項１１】
前記非イオン性界面活性剤が、液剤の総体積比で０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度を有するものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１２】
前記糖類が、マンノース、グルコース、フコース（fucose）、キシロース（xylose）、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デキストラン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１３】
前記糖類が、液剤の総体積比で１〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度を有するものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１４】
前記多価アルコールが、プロピレングリコール、低分子量ポリエチレングリコール、グリセロール、低分子量ポリプロピレン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１５】
前記多価アルコールが、液剤において１〜１５％（ｗ／ｖ）の濃度を有するものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１６】
前記中性アミノ酸が、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１７】
前記中性アミノ酸が、液剤において０．１〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度を有するものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１８】
前記アルブミンフリー安定化剤が、３〜１２％（ｗ／ｖ）の量のマンニトールを含み、中性アミノ酸を含まないものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１９】
前記アルブミンフリー安定化剤が、５〜１００ｍＭの濃度のリン酸緩衝溶液、１〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトール、５〜２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、及び０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を含むものである請求項１に記載の液剤。
【請求項２０】
前記ＥＰＯが、野生型ＥＰＯから１つもしくは複数のアミノ酸が置換、除去もしくは挿入されることにより変異した変異体ＥＰＯタンパク質、又は野生型ＥＰＯと同程度の活性を示すペプチド類似体である請求項１に記載の液剤。
【請求項２１】
前記持続型ＥＰＯ結合体が、１〜５００μｇ／ｍｌの濃度を有するものである請求項１に記載の液剤。
【請求項２２】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項１に記載の液剤。
【請求項２３】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群からの異種由来のドメインからなるハイブリッド（hybrid）フラグメントである請求項２２に記載の液剤。
【請求項２４】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントが、同種由来のドメインからなる一本鎖免疫グロブリンで構成される二量体又は多量体形態である請求項２２に記載の液剤。
【請求項２５】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントがＩｇＧ４Ｆｃフラグメントである請求項２２に記載の液剤。
【請求項２６】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントがヒト非グリコシル化ＩｇＧ４Ｆｃフラグメントである請求項２５に記載の液剤。
【請求項２７】
前記非ペプチドポリマーが、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項１に記載の液剤。
【請求項２８】
前記生分解性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸グリコール酸）からなる群から選択されるものである請求項２７に記載の液剤。
【請求項１】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）、非ペプチドポリマー及び免疫グロブリンＦｃフラグメントが共有結合した治療学的有効量の持続型エリスロポエチン結合体と、緩衝溶液及びマンニトールを含むアルブミンフリー安定化剤とを含む持続型エリスロポエチン（ＥＰＯ）結合体の液剤。
【請求項２】
前記マンニトールが、液剤の総体積比で１〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度を有するものである請求項１に記載の液剤。
【請求項３】
前記緩衝溶液が、クエン酸、リン酸、酒石酸、炭酸、コハク酸、乳酸及び酢酸緩衝溶液からなる群から選択されるものである請求項１に記載の液剤。
【請求項４】
前記緩衝溶液が、５〜１００ｍＭの濃度を有するものである請求項１に記載の液剤。
【請求項５】
前記緩衝溶液が、４〜８のｐＨを有するものである請求項１に記載の液剤。
【請求項６】
前記アルブミンフリー安定化剤が、等張化剤、多価アルコール、糖類、非イオン性界面活性剤、中性アミノ酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択された成分をさらに含むものである請求項１に記載の液剤。
【請求項７】
前記等張化剤が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択された塩である請求項６に記載の液剤。
【請求項８】
前記等張化剤が、５〜２００ｍＭの濃度を有するものである請求項６に記載の液剤。
【請求項９】
前記非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート系又はポロキサマー系非イオン性界面活性剤である請求項６に記載の液剤。
【請求項１０】
前記ポリソルベート系非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０及びポリソルベート８０からなる群から選択されるものである請求項９に記載の液剤。
【請求項１１】
前記非イオン性界面活性剤が、液剤の総体積比で０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度を有するものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１２】
前記糖類が、マンノース、グルコース、フコース（fucose）、キシロース（xylose）、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デキストラン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１３】
前記糖類が、液剤の総体積比で１〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度を有するものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１４】
前記多価アルコールが、プロピレングリコール、低分子量ポリエチレングリコール、グリセロール、低分子量ポリプロピレン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１５】
前記多価アルコールが、液剤において１〜１５％（ｗ／ｖ）の濃度を有するものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１６】
前記中性アミノ酸が、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１７】
前記中性アミノ酸が、液剤において０．１〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度を有するものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１８】
前記アルブミンフリー安定化剤が、３〜１２％（ｗ／ｖ）の量のマンニトールを含み、中性アミノ酸を含まないものである請求項６に記載の液剤。
【請求項１９】
前記アルブミンフリー安定化剤が、５〜１００ｍＭの濃度のリン酸緩衝溶液、１〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトール、５〜２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、及び０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を含むものである請求項１に記載の液剤。
【請求項２０】
前記ＥＰＯが、野生型ＥＰＯから１つもしくは複数のアミノ酸が置換、除去もしくは挿入されることにより変異した変異体ＥＰＯタンパク質、又は野生型ＥＰＯと同程度の活性を示すペプチド類似体である請求項１に記載の液剤。
【請求項２１】
前記持続型ＥＰＯ結合体が、１〜５００μｇ／ｍｌの濃度を有するものである請求項１に記載の液剤。
【請求項２２】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項１に記載の液剤。
【請求項２３】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群からの異種由来のドメインからなるハイブリッド（hybrid）フラグメントである請求項２２に記載の液剤。
【請求項２４】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントが、同種由来のドメインからなる一本鎖免疫グロブリンで構成される二量体又は多量体形態である請求項２２に記載の液剤。
【請求項２５】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントがＩｇＧ４Ｆｃフラグメントである請求項２２に記載の液剤。
【請求項２６】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントがヒト非グリコシル化ＩｇＧ４Ｆｃフラグメントである請求項２５に記載の液剤。
【請求項２７】
前記非ペプチドポリマーが、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項１に記載の液剤。
【請求項２８】
前記生分解性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸グリコール酸）からなる群から選択されるものである請求項２７に記載の液剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１３−５１７３２５（Ｐ２０１３−５１７３２５Ａ）
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４９９４０（Ｐ２０１２−５４９９４０）
【出願日】平成２３年１月１８日（２０１１．１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１１／０００３７０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９０３０６
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５１２１８８７２０）ハンミ サイエンス カンパニー リミテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】ＨＡＮＭＩ ＳＣＩＥＮＣＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】５５０，Ｄｏｎｇｔａｎｇｉｈｅｕｎｇ−ｒｏ，Ｄｏｎｇｔａｎ−ｍｙｅｏｎ，Ｈｗａｓｅｏｎｇ−ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ ４４５−８１３，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１８日（２０１１．１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１１／０００３７０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９０３０６
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５１２１８８７２０）ハンミ サイエンス カンパニー リミテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】ＨＡＮＭＩ ＳＣＩＥＮＣＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】５５０，Ｄｏｎｇｔａｎｇｉｈｅｕｎｇ−ｒｏ，Ｄｏｎｇｔａｎ−ｍｙｅｏｎ，Ｈｗａｓｅｏｎｇ−ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ ４４５−８１３，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
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