改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
【課題】公知の血糖センサ用酵素と比較して、さらに実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供する。
【解決手段】野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、好ましくは真核生物由来、さらに好ましくは糸状菌由来、さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来のＦＡＤＧＤＨであり、特定のアミノ酸配列を有するＦＡＤＧＤＨにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された一次構造を有する改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【解決手段】野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、好ましくは真核生物由来、さらに好ましくは糸状菌由来、さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来のＦＡＤＧＤＨであり、特定のアミノ酸配列を有するＦＡＤＧＤＨにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された一次構造を有する改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は熱安定性が改良された改変型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）に関し、また、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とする改変型ＦＡＤＧＤＨ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）、その製造方法及びグルコースセンサーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００３】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン（本書ではピロロキノリンキノンをＰＱＱとも記載する。）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７）が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＮＡＤＧＤＨとも記載する。）は安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨとも記載する。）は、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
【０００４】
また、特許文献１にはアスペルギルス属由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨとも記載する。）が開示されている。本酵素は、キシロースに対する作用性がグルコースに対する作用性の１０％程度あるため、キシロース負荷試験を受けている人の血糖を測定する場合、測定値の正確性を損ねてしまう可能性がある。熱安定性については５０℃、１５分処理で８９％程度の活性残存率であり安定性についても優れているとされている。特許文献２には、その遺伝子配列、アミノ酸配列が報告されている。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】アスペルオリゼ由来 ＷＴ（野生型）、改変型ＦＡＤＧＤＨ精製標品のｐＨ安定性を示す。ｐＨ３．５〜６．３：酢酸バッファー、ｐＨ６．３〜７．３、ＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ７．３〜８．８：トリス塩酸バッファー、ｐＨ６．０〜７．７：リン酸バッファーをそれぞれ用いた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は組み換えＦＡＤＧＤＨよりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨを含む。
【００２８】
配列番号２で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨは、以下の方法により入手した。
【００２９】
本発明者らは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下ＮＣＢＩと表記）のデータベースを利用し、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を推定、取得し、該遺伝子を用い、大腸菌よりアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを取得できることを見出した。
【００３０】
アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨ遺伝子を取得するために、自社保有のアスペルギルス・オリゼＴＩ株の培養上清から、各種クロマトグラフィーを用いてＧＤＨの精製を試みたが、高純度のＧＤＨを得るのは困難であり、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。しかしながら、我々はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１株がＧＤＨを生産することを見出し、精製酵素を用いて部分アミノ酸配列の決定に成功した。ついで、決定したアミノ酸配列を元に、ＰＣＲ法により、Ｐ．ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。最終的に、この塩基配列を元に、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子を推定、取得した。その概要を以下の＜実験例１＞＜実験例２＞に示す。
【００３１】
＜実験例１＞、
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨとも記載）遺伝子の推定］
［１］アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの取得
アスペルギルス・オリゼＴＩ株のＬ乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌して放冷した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、３０℃、通気攪拌培養を行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去してＧＤＨ活性を含む濾過液を回収した。回収した上清を限外ろ過膜（分子量１０，０００カット）により低分子物質を除去した。次いで、硫酸アンモニウムを６０％飽和度となるように添加、溶解し、硫安分画を行い、遠心機によりＧＤＨを含む上清画分を回収後、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて脱塩を行った後、６０％飽和度の硫酸アンモニウムを添加、溶解し、これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。更にこれを５０℃で４５分加温した後、遠心分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製ＧＤＨ標品（ＡＯＧＤＨ）とした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用した。さらに、ＡＯＧＤＨの部分アミノ酸配列を決定するため、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる高純度の精製標品を得ることはできなかった。
【００３２】
［２］ペニシリウム属糸状菌由来ＧＤＨの取得
ペニシリウム属糸状菌由来のＧＤＨ生産菌としてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１を用い、上記アスペルギルス・オリゼＴＩ株と同用の手順に従って、培養および精製を行い、ＳＤＳ電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。
［ｃＤＮＡの作製］
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１について上記方法に従い（ただしジャーファーメンターでの培養時間は２４時間）培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル（東洋紡社製）を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾールＲＮＡ Ｉ（ナカライテスク社製）を用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡからはＯｒｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（第一化学薬品社製）をもちいてｍＲＮＡを精製し、これをテンプレートにＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ（東洋紡社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた産物はアガロース電気泳動を行い、鎖長０．５〜４．０ｋｂに相当する部分を切り出した。切り出したゲル断片からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを抽出・精製してｃＤＮＡサンプルとした。
［ＧＤＨ遺伝子部分配列の決定］
上記で精製したＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨを０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、ここにＧｌｕ特異的Ｖ８エンドプロテアーゼを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し３７℃１６時間インキュベートすることで部分分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度１６％のゲルを用いて電気泳動してペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー（１．４％グリシン、０．３％トリス、２０％エタノール）を用いてセミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜上に転写したペプチドはＣＢＢ染色キット（ＰＩＥＲＣＥ社製ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分２箇所を切り取ってペプチドシーケンサーにより内部アミノ酸配列の解析を行った。得られたアミノ酸配列はＩＧＧＶＶＤＴＳＬＫＶＹＧＴ（配列番号３７）およびＷＧＧＧＴＫＱＴＶＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴ（配列番号３８）であった。この配列を元にミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製し、ＮＢＲＣ６２３１由来ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ増幅産物が得られ、アガロースゲル電気泳動により確認したところ１．４ｋｂ程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡製ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−を用いて抽出・精製した。精製ＤＮＡ断片はＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）によりＴＡクローニングし、得られたベクターで大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社製）をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡社製）を用いてプラスミドをミニプレップ抽出・精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。
［ＡＯＧＤＨ遺伝子の推定］
決定した塩基配列を元に「ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ」のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からホモロジー検索を実施し、ＡＯＧＤＨ遺伝子を推定した。検索により推定したＡＯＧＤＨとＰ．ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は４９％であった。
【００３３】
＜実験例２＞
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得、大腸菌への導入］
ＡＯＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼＴＩ株の菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号３９、４０に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いてＡＯＧＤＨ遺伝子増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換体より、常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号４１）。この結果、ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は５９３アミノ酸（配列番号４２）からなることが明らかとなった。データベース予想されるＧＤＨは５８８アミノ酸でありＴＩ株 ＧＤＨとアミノ酸残基数が異なることが示唆された。なお、該遺伝子については、ＴＩ株ゲノムＤＮＡを用いて配列を確認し、遺伝子隣接領域についてもＲＡＣＥ法を用いて確認を行った。また、ＰＣＲ法を用いて、データベースに基づくＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。これら形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ）２００ｍｌ中で、３０℃、１６時間振とう培養を行った。菌体破砕液についてＧＤＨ活性を確認したところ、データベースより推定したＧＤＨの配列を有する形質転換体ではＧＤＨ活性が確認できなかったが、ＴＩ株由来ＧＤＨの配列を有する形質転換体については菌体内に培養液１ｍｌ当たり８．０ＵのＧＤＨ活性が得られた。尚、実施例１で実施したアスペルギルス・オリゼＴＩ株の培養上清のＧＤＨ活性は、０．２Ｕ／ｍｌであった。
【００３４】
＜実験例３＞
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨと示す）遺伝子の大腸菌への導入］
シグナルペプチド切断後のＦＡＤ−ＧＤＨをｍＦＡＤ−ＧＤＨとした場合、ｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端にＭのみ付加してｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端が１アミノ酸分のびた形態となっているものをＳ２と表現した。
【００３５】
Ｓ２では、配列番号４３のオリゴヌクレオチドをＮ末端側プライマーとして、配列番号４４のプライマーとの組合せでＰＣＲを行い、同様手順にて、Ｓ２をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。
【００３６】
なお、この改変ＦＡＤ−ＧＤＨのＤＮＡ配列を持つプラスミドは、ＤＮＡシーケンシングにて配列上誤りがないことを確かめた。
【００３７】
この形質転換体をＴＢ培地にて１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて１〜２日間液体培養した。各培養フェーズの菌体を集菌した後、超音波破砕してＧＤＨ活性を確認した。シグナルペプチドと思われるアミノ酸配列を削除することにより、そのＧＤＨ生産性が増大した。
【００３８】
配列番号４６で示される野生型のアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨは、以下の方法により入手した。
【００３９】
＜実験例４＞
ｃＤＮＡの調製
アスペルギルス・テレウス ＮＢＲＣ３３０２６（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）Ｌ乾標本をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元させた。５００ｍｌ 坂口フラスコに１．５％大豆ペプチド、２％グルコース、１％マルトエキスｐＨ６．５を５０ｍｌ調製し、復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収して植菌し、３０℃，２４時間振とう培養を行い、菌体を回収した。得られた菌体は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、東洋紡製クールミルを用いて、粉砕した。粉砕菌体より直ちにナカライテスク社製セパゾールＲＮＡ Ｉを用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出し、これをテンプレートに東洋紡製ＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭを用いてＲＴ−ＰＣＲを行いｃＤＮＡを調製した。
【００４０】
＜実験例５＞
ＧＤＨ遺伝子の配列決定
我々はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ 、およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｉｔａｌｉｃｕｍ由来 ＧＤＨ遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列情報を取得している。アスペルギルス・テレウスよりＧＤＨ遺伝子をクローニングするために、上記３種のＧＤＨの推定アミノ酸配列をアラインさせ、相同性の高い領域の配列をもとに、ディジェネレートプライマーを作製した。＜実験例４＞で作製したゲノムＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ、増幅産物が認められた。増幅産物をサブクローニングし、塩基配列を決定した。決定したＧＤＨ部分配列を元に、該配列部分の５’側および３’側隣接領域をＲＡＣＥ法により決定した。決定した遺伝子領域の開始コドンから終始コドンまでの配列を配列番号４５に、また、本配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号４６に示す。なお、特許文献１に示されているアスペルギルス・テレウス ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７８由来補酵素結合型グルコース脱水素酵素とは、アミノ酸レベルで約９８．５％と非常に高い相同性をもち、本質的に同等であると考えられる。「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮しうるものである）における、オーバーラップする全アミノ酸に対する、同一アミノ酸残基の割合（％）を意味する。このようなアルゴリズムの例としては、非特許文献１〜４に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
＜実験例６＞
ＧＤＨ組換えプラスミドおよび組換え体の作製
配列番号４５のＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列について、ＳｉｇｎａｌＰ ３．０ Ｓｅｒｖｅｒを利用して、シグナルペプチド予測を行った。この結果を元に、シグナルペプチドを除去すべく、Ｎ末端配列２５コドンが削除され、開始コドン（ＡＴＧ）を付加した配列増幅が増幅されるようにＰＣＲプライマーを作製した（配列番号４７、４８）。これらのプライマーを用いて、ＮＢＲＣ３３０２６ ｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）により遺伝子増幅を実施した。増幅断片は制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンＡＴＧに合わせＮｄｅＩ認識配列のＡＴＧを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイト間に挿入し、組換えプラスミドを構築した（ｐＡｔＧＤＨ−ｓ２−７）。この組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換し、アスペルギルス・テレウス由来 ＧＤＨ 組換え体を取得した。該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ）２００ｍｌ中で、３０℃、１６時間振とう培養を行った。菌体破砕液についてＧＤＨ活性を確認したところ、菌体内に培養液１ｍｌ当たり１．０ＵのＧＤＨ活性が得られた。
【００４２】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、配列番号２または配列番号４６のアミノ酸配列におけ
る上記で示されるいずれか位置においてアミノ酸置換を行うことにより得られる。
【００４３】
例えば、「配列番号２のアミノ酸配列と同等の位置」とは、配列番号２アミノ酸配列と、配列番号２と相同性（好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）を持つアミノ酸配列を有する他のＧＤＨとを、アラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。
【００４４】
基質特異性、及び／または、熱安定性の改良された本発明は、配列番号２のアミノ酸配
列において、５３位、１６３位、１６７位、位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。
配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸置換がＧ５３Ｈ、Ｇ５３Ｎ、Ｇ５３Ｋ、Ｇ５３Ｍ、Ｇ５３Ｔ、Ｇ５３Ｖ、Ｇ５３Ｃ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ｃからなる群から選ばれる改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【００４５】
ここで、「Ｇ５３Ｈ」は、５３位のＧ（Ｇｌｙ）を（Ｈｉｓ）に置換することを意味する。特に、Ｇ５３Ｈ、Ｇ５３Ｎ、Ｇ５３Ｋ、Ｇ５３Ｍ、Ｇ５３Ｔ、Ｇ５３Ｖ、Ｇ５３Ｃのアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの基質特異性の向上に寄与し、Ｇ５３Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ、Ｇ５３Ｎ＋Ｓ１６７Ｐ、Ｇ５３Ｎ＋Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃのアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの基質特異性、及び／または、安定性の向上に寄与する。
【００４６】
熱安定性の改良された本発明は、配列番号２のアミノ酸配列において、１２０位、１６０位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１８０位、３２９位、３３１位、３６９位、４７１位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。上記のうち、１６２位、１６３位、１６７位、位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【００４７】
配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸置換がＫ１２０Ｅ、Ｇ１６０Ｅ、Ｇ１６０Ｉ、Ｇ１６０Ｐ、Ｇ１６０Ｓ、Ｇ１６０Ｑ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１６２Ｃ、Ｓ１６２Ｄ、Ｓ１６２Ｅ、Ｓ１６２Ｆ、Ｓ１６２Ｈ、Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６２Ｐ、Ｇ１６３Ｄ、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６４Ｆ、Ｓ１６４Ｔ、Ｓ１６４Ｙ、Ｌ１６５Ａ、Ｌ１６５Ｉ、Ｌ１６５Ｎ、Ｌ１６５Ｐ、Ｌ１６５Ｖ、Ａ１６６Ｃ、Ａ１６６Ｉ、Ａ１６６Ｋ、Ａ１６６Ｌ、Ａ１６６Ｍ、Ａ１６６Ｐ、Ａ１６６Ｓ、１６７Ａ、Ｓ１６７Ｐ、Ｓ１６７Ｒ、Ｓ１６７Ｖ、Ｎ１６９Ｋ、Ｎ１６９Ｐ、Ｎ１６９Ｙ、Ｎ１６９Ｗ、Ｌ１７０Ｃ、Ｌ１７０Ｆ、Ｓ１７１Ｉ、Ｓ１７１Ｋ、Ｓ１７１Ｍ、Ｓ１７１Ｑ、Ｓ１７１Ｖ、Ｖ１７２Ａ、Ｖ１７２Ｃ、Ｖ１７２Ｅ、Ｖ１７２Ｉ、Ｖ１７２Ｍ、Ｖ１７２Ｓ、Ｖ１７２Ｗ、Ｖ１７２Ｙ、Ａ１８０Ｇ、Ｖ３２９Ｑ、Ａ３３１Ｃ、Ａ３３１Ｄ、Ａ３３１Ｉ、Ａ３３１Ｋ、Ａ３３１Ｌ、Ａ３３１Ｍ、Ｑ３３１Ｖ、Ｋ３６９Ｒ、Ｋ４７１Ｒ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｔ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙからなる群から選ばれる改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【００４８】
ここで、「Ｋ１２０Ｅ」は、１２０位のＫ（Ｌｙｓ）をＥ（Ｇｌｕ）に置換することを意味する。
【００４９】
特に、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６０Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｖ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｗ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの熱安定性の向上に寄与する。
【００５０】
また、配列番号４６のアミノ酸配列において、１１６位、１５９位、１６１位、１６４位、１６６位、１６７位、１７５位、３２５位、３２７位、３６５位及び５４７位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。
【００５１】
好ましくは配列番号４６のアミノ酸配列において、アミノ酸置換がＫ１１６Ｄ、Ｋ１１６Ｇ、Ｋ１１６Ｌ、Ｋ１１６Ｆ、Ｋ１１６Ｑ、Ｑ１５９Ａ、Ｑ１５９Ｋ、Ｑ１５９Ｎ、Ｑ１５９Ｐ、Ｑ１５９Ｖ、Ｑ１５９Ｌ、Ｅ１６１Ｃ、Ｎ１６４Ｙ、Ｎ１６４Ｖ、Ｎ１６４Ｃ、Ｔ１６６Ｆ、Ｔ１６６Ｙ、Ｔ１６６Ｗ、Ｔ１６７Ｌ、Ｔ１６７Ｖ、Ｔ１６７Ｓ、Ｇ１７５Ｋ、Ｓ３２５Ａ、Ｓ３２５Ｇ、Ｓ３２５Ｋ、Ｓ３２５Ｑ、Ｓ３２５Ｒ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ３２５Ｖ、Ｓ３２５Ｙ、Ｓ３２７Ｅ、Ｑ３６５Ｒ、Ｖ５４７Ｓ、Ｖ５４７Ｃ、Ｖ５４７Ａ、Ｖ５４７Ｑからなる群から選ばれる改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。
【００５２】
ここで、「Ｋ１１６Ｄ」は１１６位のＫ （Ｌｙｓ）をＤ （Ａｓｐ）に置換することを意味する。
【００５３】
配列番号２で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨを改変した改変型ＦＡＤＧＤＨの製造法または、配列番号４６で示される野生型のアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨを改変した改変型ＦＡＤＧＤＨの製造法は特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。ＦＡＤＧＤＨを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社， ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製， Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００５４】
作製された改変型ＦＡＤＧＤＨの遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物に移入され、改変型ＦＡＤＧＤＨを生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５・、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００などが利用できる。宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばコンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００５５】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変型ＦＡＤＧＤＨを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素減としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分怪物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培地温度は菌が発育し、改変型ＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適日変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養温度は条件によって多少異なるが、改変型ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し改変体タンパク質を生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００５６】
培養物中の改変型ＦＡＤＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従って改変型ＦＡＤＧＤＨが培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、改変タンパク質の含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変タンパク質が菌体内に存在する場合には得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して改変型ＦＡＤＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００５７】
このようにして得られた改変型ＦＡＤＧＤＨ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに、硫酸アンモニム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加温処理や東電点処理も有効な生成手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製された改変型ＦＡＤＧＤＨを得ることができる。
【００５８】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００５９】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００６０】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００６１】
本発明において、ＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
［試験例］
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１６３ｍＭ ＰＭＳ溶液
６．８ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．６ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
＜測定条件＞
反応試薬２．９ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００６２】
実施例１：グルコース測定系を用いた改変型ＦＡＤＧＤＨ熱安定性の検討
検討は、先述の試験例のＦＡＤＧＤＨ活性の測定方法に準じて行った。
まず、アスペルギルス・オリゼまたはアスペルギルス・テレウス由来改変型ＦＡＤＧＤＨを約２Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて溶解したものを５０ｍｌ用意した。この酵素溶液を１．０ｍｌとしたものを２本用意した。コントロールには、夫々の改変型ＦＡＤＧＤＨ（各種化合物の代わりに蒸留水０．１ｍｌを添加したものを２本用意した。
【００６３】
２本のうち、１本は４℃で保存し、もう１本は、５０℃、１５分間処理を施した。処理後、夫々のサンプルのＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００として、５０℃、１５分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％）として算出した。
【００６４】
実施例２：アスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子への変異導入
野生型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子（配列番号１）を含む組み換えプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）を摂取し、３０℃で一晩振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調整した。該プラスミドを鋳型として用いＤｉｖｅｒｓｉｆｙＴＭＰＣＲ Ｒａｍｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた変異処理をそのプロトコールに従って実施し、グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００６５】
実施例３：アスペルギルス・オリゼ由来改変型ＦＡＤＧＤＨを含む粗酵素液の調整
実施例２で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩振とう培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００６６】
実施例４：熱安定性が向上した変異体のスクリーニング
実施例３の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、３種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら３種の改変体をコードするプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４と命名した。
【００６７】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４の変異箇所を同定するためにＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１で配列番号２記載の１６２番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２では１６７番目のセリンがプロリンに４７１番目のリジンがアルギニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３では１８０番目のアラニンがグリシンに５５１番目のバリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４では１２０番目のリジンがグルタミン酸に１６７番目のセリンがプロリンに３６９番目のリジンがアルギニンに置換されていることが確認された。結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】
【００６９】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２のプラスミドを鋳型として、１６０番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６１番目のトリプトファンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６２番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６４番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６５番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６６番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６７番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６８番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６９番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７１番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７２番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３２９番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３１番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１８の合成オリゴヌクレオチド、５５１番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調整した。
【００７０】
実施例４で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、実施例３と同様に粗酵素液を調製した。
【００７１】
上記の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、１６種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら１６種の改変体をコードするプラスミドを、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１９と命名した。
【００７２】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１９の変異箇所を同定するためにＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５で配列番号２記載の１６０番目のグリシンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６では１６３番目のグリシンがリジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７では１６３番目のグリシンがロイシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８では１６３番目のグリシンがアルギニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９では１６７番目のセリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０では１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１１では１６７番目のセリンがアルギニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１２では１６７番目のセリンがバリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１３では１７１番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１４では５５１番目のバリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５では５５１番目のバリンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１６では５５１番目のバリンがスレオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１７では５５１番目のバリンがグルタミン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１８では５５１番目のバリンがセリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１９では５５１番目のバリンがチロシンに置換されていることが確認された。結果を表２に示す。
【００７３】
【表２】
【００７４】
実施例５；多重変異体の作製と熱安定性
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０のプラスミドを鋳型として、１６０番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６１番目のトリプトファンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６２番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６４番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６５番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６６番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６８番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６９番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７１番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７２番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３２９番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３１番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３４の合成オリゴヌクレオチド、５５１番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００７５】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５のプラスミドを鋳型として、１６３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００７６】
実施例４で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、実施例３と同様に粗酵素液を調製した。
【００７７】
上記の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、５７種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら５７種の改変体をコードするプラスミドを、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３９ ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６と命名した。
【００７８】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６の変異箇所を同定するためにＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ ； Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２０で配列番号２記載の１６０番目のグリシンがグルタミン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２１では１６０番目のグリシンがイソロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２２では１６０番目のグリシンがセリングルタミンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２３では１６０番目のグリシンがグルタミンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２４では１６２番目のセリンがアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２５では１６２番目のセリンがシステインに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２６では１６２番目のセリンがアスパラギン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２７では１６２番目のセリンがグルタミン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２８では１６２番目のセリンがフェニルアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２９では１６２番目のセリンがヒスチジンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３０では１６２番目のセリンがロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３１では１６３番目のグリシンがアスパラギン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３２では１６４番目のセリンがフェニルアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３３では１６４番目のセリンがスレオニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３４では１６４番目のセリンがチロシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３５では１６５番目のロイシンがアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３６では１６５番目のロイシンがイソロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３７では１６５番目のロイシンがアスパラギンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３８では１６５番目のロイシンがプロリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３９では１６５番目のロイシンがバリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４０では１６６番目のアラニンがシステインに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４１では１６６番目のアラニンがイソロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４２では１６６番目のアラニンがリジンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４３では１６６番目のアラニンがロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４４では１６６番目のアラニンがメチオニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４５では１６６番目のアラニンがプロリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４６では１６６番目のアラニンがセリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４７では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがリジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４８では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４９では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがチロシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５０では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがトリプトファン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５１では１６７番目のセリンがプロリンに１７０番目のロイシンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５２では１６７番目のセリンがプロリンに１７０番目のロイシンがフェニルアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５３では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがイソロイシンに、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５４では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがリジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５５では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがメチオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５６では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがグルタミン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５７では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがバリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５８では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５９では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがシステインに、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６０では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがグルタミン酸、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６１では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがイソロイシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６２では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがメチオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６３では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６４では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがグルタミン酸、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６５では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがトリプトファン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６６では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがにチロシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６７では１６７番目のセリンがプロリンに３２９番目のバリンがグルタミン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６８では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６９では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがアスパラギン酸、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７０では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがイソロイシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７１では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがリジンｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７２では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがロイシン、ＡＯＧＤＨ−Ｍ７３では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがメチオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７４では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがバリンに置換されていることが確認された。結果を表３に示す。
【００７９】
【表３】
【００８０】
実施例６：アスペルギルス・オリゼ由来改変型ＦＡＤＧＤＨの取得
改変型ＦＡＤＧＤＨ生産菌として、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した。得られた形質転換体を１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、ＴＢ培地に培養温度２５℃で２４時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｏｃｔｙｌ−セファロースカラムおよびＰｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型ＦＡＤＧＤＨサンプルとした。表４に示すように精製標品においても熱安定性が向上していることが確認された。
【００８１】
【表４】
【００８２】
実施例７：ｐＨ安定性
実施例６で得た精製標品についてｐＨ安定性を知るために、ｐＨ３．５〜８．５の範囲の緩衝液（ｐＨ３．５〜６．３：０．１Ｍ 酢酸バッファー、ｐＨ６．３〜７．３、０．１Ｍ ＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ７．３〜８．５：０．１Ｍ トリス塩酸バッファー、ｐＨ６．０〜７．７：０．１Ｍ リン酸バッファー）を調製し、これらを用いて各ＧＤＨを酵素濃度１Ｕ／ｍｌとなるよう希釈した。希釈液を２５℃で１６時間インキュベートしてインキュベート前後の活性を比較した。インキュベート前の活性に対するインキュベート後の活性残存率を示したグラフを図１に示す。図１に示すようにｐＨ安定域の幅が広がっていることが確認された。
【００８３】
実施例８：アスペルギルス・テレウス由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子への変異導入
我々はアスペルギルス・オリゼ由来 ＧＤＨ遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列情報を取得している。また、熱安定性を指標としたスクリーニングを実施し、熱安定性向上に効果のあるアミノ酸部位を同定している。そこで、アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの推定アミノ酸配列とアスペルギルス・テレウス由来ＧＤＨの推定アミノ酸配列をアラインさせ、アスペルギルス・テレウス由来ＧＤＨにおいて、アスペルギルス・オリゼＦＡＤＧＤＨで熱安定性向上に効果のあった部位に対応するアミノ残基を同定した。
【００８４】
実験例６で作製した組換えプラスミドｐＡｔＧＤＨ−ｓ２−７を鋳型として用い、１１６番目のリジンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１５９番目のグルタミンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６１番目のグルタミン酸を複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６４番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６６番目のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６７番目のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７５番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３２５番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３２７番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３６５番目のグルタミンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５４７番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
【００８５】
実施例９：アスペルギルス・テレウス由来改変型ＦＡＤＧＤＨを含む粗酵素液の調整
得られたコロニーをさらにアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００８６】
実施例１０：熱安定性が向上した変異体のスクリーニング
実施例９の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。
【００８７】
これらＦＡＤＧＤＨの遺伝子配列については、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）により配列確認を実施した。加熱処理前の活性に対する加熱処理後の残存活性率（％）を表５に示した。この結果より、組換え体を用いて熱安定性が向上したアスペルギルス・テレウス由来グルコースデヒドロゲナーゼを取得すること可能となった。
【００８８】
【表５】
【００８９】
また、種々の糖類に対する基質特異性については、上記の活性測定方法に従い、酵素活性を測定した。グルコースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値とそれに代えて同じモル濃度の比較対象の糖類（例えばマルトース）を基質溶液とした場合の脱水素酵素活性
値を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合の相対値を求めた。
【００９０】
上記で得られた種々の変異体の基質特異性は良好であった。
【００９１】
実施例１１：ＦＡＤＧＤＨ遺伝子への変異導入
野生型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子（配列番号１）を含む組み換えプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、形質転換体をアンピシリン（５０・ｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）を摂取し、３０℃で一晩振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調整した。該プラスミドを鋳型として５３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号４９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００９２】
実施例１２：改変型ＦＡＤＧＤＨを含む粗酵素液の調製
実施例２で調整したプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩振とう培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００９３】
実施例１３：基質特異性が向上した変異体のスクリーニング
実施例３の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースならびにキシロースを基質として活性を測定したところ、７種の基質特異性が向上した変異体を取得した。これら７種の改変体をコードするプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７と命名した。
【００９４】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７の変異箇所を同定するためにＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１で配列番号２記載の５３番目のグリシンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２で配列番号２記載の５３番目のグリシンがヒスチジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３で配列番号２記載の５３番目のグリシンがリジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４で配列番号２記載の５３番目のグリシンがメチオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５で配列番号２記載の５３番目のグリシンがアスパラギン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６で配列番号２記載の５３番目のグリシンがスレオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７で配列番号２記載の５３番目のグリシンがバリンに置換されていることが確認された。結果を表１に示す。
【００９５】
【表６】
【００９６】
実施例１４：基質特異性、及び／または、熱安定性が向上した変異体の作製
実施例１３で調整したプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２を鋳型として、１６４番目のセリンをプロリンに置換するよう設計した配列番号５０の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５を鋳型として、１６４番目のセリンをプロリンに置換するよう設計した配列番号５０の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２を鋳型として、１６３番目のグリシンをアルギニンに置換するよう設計した配列番号５１の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、さらに５５１番目のバリンをシステインに置換するよう設計した配列番号５２の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチドをもとに実施例２の方法と同様に変異操作を行い、基質特異性、及び／または、熱安定性に優れた改変型ＦＡＤＧＤＨを作製し上記の方法と同様にプラスミドを調整した。変異箇所を同定するため実施例４の方法と同様にＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８で配列番号２記載の５３番目のグリシンがヒスチジンに、１６７番目のセリンがプロリンに、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９で配列番号２記載の５３番目のグリシンがアスパラギンに、１６７番目のセリンがプロリンに、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０で配列番号２記載の５３番目のグリシンがアスパラギンに、１６３番目のグリシンがアルギニンに、５５１番目のバリンがシステインに置換していることが確認された。実施例４と同様の活性測定法により、グルコースならびにキシロースを基質として活性を測定したところ、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０は基質特異性が向上していることが確認された。熱安定性を測定するため実施例３の方法と同様に、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０の粗酵素液を調整し、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０は熱安定性が向上していることが確認された。結果を表２に示す。
【００９７】
【表７】
【００９８】
実施例１５：改変型ＦＡＤＧＤＨの取得
改変型ＦＡＤＧＤＨ生産菌として、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した。得られた形質転換体を１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、ＴＢ培地に培養温度２５℃で２４時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｏｃｔｙｌ−セファロースカラムおよびＰｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型ＦＡＤＧＤＨサンプルとした。表３に示すように精製標品においても熱安定性が向上していることが確認された。
【００９９】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明により、ＦＡＤ−ＧＤＨにおいて熱安定性向上に関与しているアミノ酸残基を見出すことができ、あらゆる属、種のＦＡＤ−ＧＤＨにもあてはまる可能が示された。また、本発明によるＦＡＤＧＤＨの安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサー作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にし、医療関連分野などの産業に貢献するところ大である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は熱安定性が改良された改変型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）に関し、また、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とする改変型ＦＡＤＧＤＨ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）、その製造方法及びグルコースセンサーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００３】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン（本書ではピロロキノリンキノンをＰＱＱとも記載する。）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７）が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＮＡＤＧＤＨとも記載する。）は安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨとも記載する。）は、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
【０００４】
また、特許文献１にはアスペルギルス属由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨとも記載する。）が開示されている。本酵素は、キシロースに対する作用性がグルコースに対する作用性の１０％程度あるため、キシロース負荷試験を受けている人の血糖を測定する場合、測定値の正確性を損ねてしまう可能性がある。熱安定性については５０℃、１５分処理で８９％程度の活性残存率であり安定性についても優れているとされている。特許文献２には、その遺伝子配列、アミノ酸配列が報告されている。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】アスペルオリゼ由来 ＷＴ（野生型）、改変型ＦＡＤＧＤＨ精製標品のｐＨ安定性を示す。ｐＨ３．５〜６．３：酢酸バッファー、ｐＨ６．３〜７．３、ＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ７．３〜８．８：トリス塩酸バッファー、ｐＨ６．０〜７．７：リン酸バッファーをそれぞれ用いた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は組み換えＦＡＤＧＤＨよりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨを含む。
【００２８】
配列番号２で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨは、以下の方法により入手した。
【００２９】
本発明者らは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下ＮＣＢＩと表記）のデータベースを利用し、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を推定、取得し、該遺伝子を用い、大腸菌よりアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを取得できることを見出した。
【００３０】
アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨ遺伝子を取得するために、自社保有のアスペルギルス・オリゼＴＩ株の培養上清から、各種クロマトグラフィーを用いてＧＤＨの精製を試みたが、高純度のＧＤＨを得るのは困難であり、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。しかしながら、我々はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１株がＧＤＨを生産することを見出し、精製酵素を用いて部分アミノ酸配列の決定に成功した。ついで、決定したアミノ酸配列を元に、ＰＣＲ法により、Ｐ．ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。最終的に、この塩基配列を元に、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子を推定、取得した。その概要を以下の＜実験例１＞＜実験例２＞に示す。
【００３１】
＜実験例１＞、
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨとも記載）遺伝子の推定］
［１］アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの取得
アスペルギルス・オリゼＴＩ株のＬ乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌して放冷した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、３０℃、通気攪拌培養を行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去してＧＤＨ活性を含む濾過液を回収した。回収した上清を限外ろ過膜（分子量１０，０００カット）により低分子物質を除去した。次いで、硫酸アンモニウムを６０％飽和度となるように添加、溶解し、硫安分画を行い、遠心機によりＧＤＨを含む上清画分を回収後、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて脱塩を行った後、６０％飽和度の硫酸アンモニウムを添加、溶解し、これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。更にこれを５０℃で４５分加温した後、遠心分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製ＧＤＨ標品（ＡＯＧＤＨ）とした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用した。さらに、ＡＯＧＤＨの部分アミノ酸配列を決定するため、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる高純度の精製標品を得ることはできなかった。
【００３２】
［２］ペニシリウム属糸状菌由来ＧＤＨの取得
ペニシリウム属糸状菌由来のＧＤＨ生産菌としてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１を用い、上記アスペルギルス・オリゼＴＩ株と同用の手順に従って、培養および精製を行い、ＳＤＳ電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。
［ｃＤＮＡの作製］
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１について上記方法に従い（ただしジャーファーメンターでの培養時間は２４時間）培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル（東洋紡社製）を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾールＲＮＡ Ｉ（ナカライテスク社製）を用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡからはＯｒｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（第一化学薬品社製）をもちいてｍＲＮＡを精製し、これをテンプレートにＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ（東洋紡社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた産物はアガロース電気泳動を行い、鎖長０．５〜４．０ｋｂに相当する部分を切り出した。切り出したゲル断片からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを抽出・精製してｃＤＮＡサンプルとした。
［ＧＤＨ遺伝子部分配列の決定］
上記で精製したＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨを０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、ここにＧｌｕ特異的Ｖ８エンドプロテアーゼを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し３７℃１６時間インキュベートすることで部分分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度１６％のゲルを用いて電気泳動してペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー（１．４％グリシン、０．３％トリス、２０％エタノール）を用いてセミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜上に転写したペプチドはＣＢＢ染色キット（ＰＩＥＲＣＥ社製ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分２箇所を切り取ってペプチドシーケンサーにより内部アミノ酸配列の解析を行った。得られたアミノ酸配列はＩＧＧＶＶＤＴＳＬＫＶＹＧＴ（配列番号３７）およびＷＧＧＧＴＫＱＴＶＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴ（配列番号３８）であった。この配列を元にミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製し、ＮＢＲＣ６２３１由来ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ増幅産物が得られ、アガロースゲル電気泳動により確認したところ１．４ｋｂ程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡製ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−を用いて抽出・精製した。精製ＤＮＡ断片はＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）によりＴＡクローニングし、得られたベクターで大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社製）をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡社製）を用いてプラスミドをミニプレップ抽出・精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。
［ＡＯＧＤＨ遺伝子の推定］
決定した塩基配列を元に「ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ」のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からホモロジー検索を実施し、ＡＯＧＤＨ遺伝子を推定した。検索により推定したＡＯＧＤＨとＰ．ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は４９％であった。
【００３３】
＜実験例２＞
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得、大腸菌への導入］
ＡＯＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼＴＩ株の菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号３９、４０に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いてＡＯＧＤＨ遺伝子増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換体より、常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号４１）。この結果、ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は５９３アミノ酸（配列番号４２）からなることが明らかとなった。データベース予想されるＧＤＨは５８８アミノ酸でありＴＩ株 ＧＤＨとアミノ酸残基数が異なることが示唆された。なお、該遺伝子については、ＴＩ株ゲノムＤＮＡを用いて配列を確認し、遺伝子隣接領域についてもＲＡＣＥ法を用いて確認を行った。また、ＰＣＲ法を用いて、データベースに基づくＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。これら形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ）２００ｍｌ中で、３０℃、１６時間振とう培養を行った。菌体破砕液についてＧＤＨ活性を確認したところ、データベースより推定したＧＤＨの配列を有する形質転換体ではＧＤＨ活性が確認できなかったが、ＴＩ株由来ＧＤＨの配列を有する形質転換体については菌体内に培養液１ｍｌ当たり８．０ＵのＧＤＨ活性が得られた。尚、実施例１で実施したアスペルギルス・オリゼＴＩ株の培養上清のＧＤＨ活性は、０．２Ｕ／ｍｌであった。
【００３４】
＜実験例３＞
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨと示す）遺伝子の大腸菌への導入］
シグナルペプチド切断後のＦＡＤ−ＧＤＨをｍＦＡＤ−ＧＤＨとした場合、ｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端にＭのみ付加してｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端が１アミノ酸分のびた形態となっているものをＳ２と表現した。
【００３５】
Ｓ２では、配列番号４３のオリゴヌクレオチドをＮ末端側プライマーとして、配列番号４４のプライマーとの組合せでＰＣＲを行い、同様手順にて、Ｓ２をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。
【００３６】
なお、この改変ＦＡＤ−ＧＤＨのＤＮＡ配列を持つプラスミドは、ＤＮＡシーケンシングにて配列上誤りがないことを確かめた。
【００３７】
この形質転換体をＴＢ培地にて１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて１〜２日間液体培養した。各培養フェーズの菌体を集菌した後、超音波破砕してＧＤＨ活性を確認した。シグナルペプチドと思われるアミノ酸配列を削除することにより、そのＧＤＨ生産性が増大した。
【００３８】
配列番号４６で示される野生型のアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨは、以下の方法により入手した。
【００３９】
＜実験例４＞
ｃＤＮＡの調製
アスペルギルス・テレウス ＮＢＲＣ３３０２６（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）Ｌ乾標本をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元させた。５００ｍｌ 坂口フラスコに１．５％大豆ペプチド、２％グルコース、１％マルトエキスｐＨ６．５を５０ｍｌ調製し、復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収して植菌し、３０℃，２４時間振とう培養を行い、菌体を回収した。得られた菌体は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、東洋紡製クールミルを用いて、粉砕した。粉砕菌体より直ちにナカライテスク社製セパゾールＲＮＡ Ｉを用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出し、これをテンプレートに東洋紡製ＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭを用いてＲＴ−ＰＣＲを行いｃＤＮＡを調製した。
【００４０】
＜実験例５＞
ＧＤＨ遺伝子の配列決定
我々はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ 、およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｉｔａｌｉｃｕｍ由来 ＧＤＨ遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列情報を取得している。アスペルギルス・テレウスよりＧＤＨ遺伝子をクローニングするために、上記３種のＧＤＨの推定アミノ酸配列をアラインさせ、相同性の高い領域の配列をもとに、ディジェネレートプライマーを作製した。＜実験例４＞で作製したゲノムＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ、増幅産物が認められた。増幅産物をサブクローニングし、塩基配列を決定した。決定したＧＤＨ部分配列を元に、該配列部分の５’側および３’側隣接領域をＲＡＣＥ法により決定した。決定した遺伝子領域の開始コドンから終始コドンまでの配列を配列番号４５に、また、本配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号４６に示す。なお、特許文献１に示されているアスペルギルス・テレウス ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７８由来補酵素結合型グルコース脱水素酵素とは、アミノ酸レベルで約９８．５％と非常に高い相同性をもち、本質的に同等であると考えられる。「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮しうるものである）における、オーバーラップする全アミノ酸に対する、同一アミノ酸残基の割合（％）を意味する。このようなアルゴリズムの例としては、非特許文献１〜４に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
＜実験例６＞
ＧＤＨ組換えプラスミドおよび組換え体の作製
配列番号４５のＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列について、ＳｉｇｎａｌＰ ３．０ Ｓｅｒｖｅｒを利用して、シグナルペプチド予測を行った。この結果を元に、シグナルペプチドを除去すべく、Ｎ末端配列２５コドンが削除され、開始コドン（ＡＴＧ）を付加した配列増幅が増幅されるようにＰＣＲプライマーを作製した（配列番号４７、４８）。これらのプライマーを用いて、ＮＢＲＣ３３０２６ ｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）により遺伝子増幅を実施した。増幅断片は制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンＡＴＧに合わせＮｄｅＩ認識配列のＡＴＧを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイト間に挿入し、組換えプラスミドを構築した（ｐＡｔＧＤＨ−ｓ２−７）。この組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換し、アスペルギルス・テレウス由来 ＧＤＨ 組換え体を取得した。該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ）２００ｍｌ中で、３０℃、１６時間振とう培養を行った。菌体破砕液についてＧＤＨ活性を確認したところ、菌体内に培養液１ｍｌ当たり１．０ＵのＧＤＨ活性が得られた。
【００４２】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、配列番号２または配列番号４６のアミノ酸配列におけ
る上記で示されるいずれか位置においてアミノ酸置換を行うことにより得られる。
【００４３】
例えば、「配列番号２のアミノ酸配列と同等の位置」とは、配列番号２アミノ酸配列と、配列番号２と相同性（好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）を持つアミノ酸配列を有する他のＧＤＨとを、アラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。
【００４４】
基質特異性、及び／または、熱安定性の改良された本発明は、配列番号２のアミノ酸配
列において、５３位、１６３位、１６７位、位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。
配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸置換がＧ５３Ｈ、Ｇ５３Ｎ、Ｇ５３Ｋ、Ｇ５３Ｍ、Ｇ５３Ｔ、Ｇ５３Ｖ、Ｇ５３Ｃ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ｃからなる群から選ばれる改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【００４５】
ここで、「Ｇ５３Ｈ」は、５３位のＧ（Ｇｌｙ）を（Ｈｉｓ）に置換することを意味する。特に、Ｇ５３Ｈ、Ｇ５３Ｎ、Ｇ５３Ｋ、Ｇ５３Ｍ、Ｇ５３Ｔ、Ｇ５３Ｖ、Ｇ５３Ｃのアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの基質特異性の向上に寄与し、Ｇ５３Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ、Ｇ５３Ｎ＋Ｓ１６７Ｐ、Ｇ５３Ｎ＋Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃのアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの基質特異性、及び／または、安定性の向上に寄与する。
【００４６】
熱安定性の改良された本発明は、配列番号２のアミノ酸配列において、１２０位、１６０位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１８０位、３２９位、３３１位、３６９位、４７１位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。上記のうち、１６２位、１６３位、１６７位、位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【００４７】
配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸置換がＫ１２０Ｅ、Ｇ１６０Ｅ、Ｇ１６０Ｉ、Ｇ１６０Ｐ、Ｇ１６０Ｓ、Ｇ１６０Ｑ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１６２Ｃ、Ｓ１６２Ｄ、Ｓ１６２Ｅ、Ｓ１６２Ｆ、Ｓ１６２Ｈ、Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６２Ｐ、Ｇ１６３Ｄ、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６４Ｆ、Ｓ１６４Ｔ、Ｓ１６４Ｙ、Ｌ１６５Ａ、Ｌ１６５Ｉ、Ｌ１６５Ｎ、Ｌ１６５Ｐ、Ｌ１６５Ｖ、Ａ１６６Ｃ、Ａ１６６Ｉ、Ａ１６６Ｋ、Ａ１６６Ｌ、Ａ１６６Ｍ、Ａ１６６Ｐ、Ａ１６６Ｓ、１６７Ａ、Ｓ１６７Ｐ、Ｓ１６７Ｒ、Ｓ１６７Ｖ、Ｎ１６９Ｋ、Ｎ１６９Ｐ、Ｎ１６９Ｙ、Ｎ１６９Ｗ、Ｌ１７０Ｃ、Ｌ１７０Ｆ、Ｓ１７１Ｉ、Ｓ１７１Ｋ、Ｓ１７１Ｍ、Ｓ１７１Ｑ、Ｓ１７１Ｖ、Ｖ１７２Ａ、Ｖ１７２Ｃ、Ｖ１７２Ｅ、Ｖ１７２Ｉ、Ｖ１７２Ｍ、Ｖ１７２Ｓ、Ｖ１７２Ｗ、Ｖ１７２Ｙ、Ａ１８０Ｇ、Ｖ３２９Ｑ、Ａ３３１Ｃ、Ａ３３１Ｄ、Ａ３３１Ｉ、Ａ３３１Ｋ、Ａ３３１Ｌ、Ａ３３１Ｍ、Ｑ３３１Ｖ、Ｋ３６９Ｒ、Ｋ４７１Ｒ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｔ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙからなる群から選ばれる改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【００４８】
ここで、「Ｋ１２０Ｅ」は、１２０位のＫ（Ｌｙｓ）をＥ（Ｇｌｕ）に置換することを意味する。
【００４９】
特に、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６０Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｖ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｗ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの熱安定性の向上に寄与する。
【００５０】
また、配列番号４６のアミノ酸配列において、１１６位、１５９位、１６１位、１６４位、１６６位、１６７位、１７５位、３２５位、３２７位、３６５位及び５４７位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。
【００５１】
好ましくは配列番号４６のアミノ酸配列において、アミノ酸置換がＫ１１６Ｄ、Ｋ１１６Ｇ、Ｋ１１６Ｌ、Ｋ１１６Ｆ、Ｋ１１６Ｑ、Ｑ１５９Ａ、Ｑ１５９Ｋ、Ｑ１５９Ｎ、Ｑ１５９Ｐ、Ｑ１５９Ｖ、Ｑ１５９Ｌ、Ｅ１６１Ｃ、Ｎ１６４Ｙ、Ｎ１６４Ｖ、Ｎ１６４Ｃ、Ｔ１６６Ｆ、Ｔ１６６Ｙ、Ｔ１６６Ｗ、Ｔ１６７Ｌ、Ｔ１６７Ｖ、Ｔ１６７Ｓ、Ｇ１７５Ｋ、Ｓ３２５Ａ、Ｓ３２５Ｇ、Ｓ３２５Ｋ、Ｓ３２５Ｑ、Ｓ３２５Ｒ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ３２５Ｖ、Ｓ３２５Ｙ、Ｓ３２７Ｅ、Ｑ３６５Ｒ、Ｖ５４７Ｓ、Ｖ５４７Ｃ、Ｖ５４７Ａ、Ｖ５４７Ｑからなる群から選ばれる改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。
【００５２】
ここで、「Ｋ１１６Ｄ」は１１６位のＫ （Ｌｙｓ）をＤ （Ａｓｐ）に置換することを意味する。
【００５３】
配列番号２で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨを改変した改変型ＦＡＤＧＤＨの製造法または、配列番号４６で示される野生型のアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨを改変した改変型ＦＡＤＧＤＨの製造法は特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。ＦＡＤＧＤＨを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社， ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製， Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００５４】
作製された改変型ＦＡＤＧＤＨの遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物に移入され、改変型ＦＡＤＧＤＨを生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５・、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００などが利用できる。宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばコンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００５５】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変型ＦＡＤＧＤＨを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素減としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分怪物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培地温度は菌が発育し、改変型ＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適日変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養温度は条件によって多少異なるが、改変型ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し改変体タンパク質を生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００５６】
培養物中の改変型ＦＡＤＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従って改変型ＦＡＤＧＤＨが培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、改変タンパク質の含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変タンパク質が菌体内に存在する場合には得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して改変型ＦＡＤＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００５７】
このようにして得られた改変型ＦＡＤＧＤＨ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに、硫酸アンモニム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加温処理や東電点処理も有効な生成手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製された改変型ＦＡＤＧＤＨを得ることができる。
【００５８】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００５９】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００６０】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００６１】
本発明において、ＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
［試験例］
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１６３ｍＭ ＰＭＳ溶液
６．８ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．６ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
＜測定条件＞
反応試薬２．９ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００６２】
実施例１：グルコース測定系を用いた改変型ＦＡＤＧＤＨ熱安定性の検討
検討は、先述の試験例のＦＡＤＧＤＨ活性の測定方法に準じて行った。
まず、アスペルギルス・オリゼまたはアスペルギルス・テレウス由来改変型ＦＡＤＧＤＨを約２Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて溶解したものを５０ｍｌ用意した。この酵素溶液を１．０ｍｌとしたものを２本用意した。コントロールには、夫々の改変型ＦＡＤＧＤＨ（各種化合物の代わりに蒸留水０．１ｍｌを添加したものを２本用意した。
【００６３】
２本のうち、１本は４℃で保存し、もう１本は、５０℃、１５分間処理を施した。処理後、夫々のサンプルのＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００として、５０℃、１５分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％）として算出した。
【００６４】
実施例２：アスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子への変異導入
野生型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子（配列番号１）を含む組み換えプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）を摂取し、３０℃で一晩振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調整した。該プラスミドを鋳型として用いＤｉｖｅｒｓｉｆｙＴＭＰＣＲ Ｒａｍｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた変異処理をそのプロトコールに従って実施し、グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００６５】
実施例３：アスペルギルス・オリゼ由来改変型ＦＡＤＧＤＨを含む粗酵素液の調整
実施例２で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩振とう培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００６６】
実施例４：熱安定性が向上した変異体のスクリーニング
実施例３の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、３種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら３種の改変体をコードするプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４と命名した。
【００６７】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４の変異箇所を同定するためにＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１で配列番号２記載の１６２番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２では１６７番目のセリンがプロリンに４７１番目のリジンがアルギニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３では１８０番目のアラニンがグリシンに５５１番目のバリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４では１２０番目のリジンがグルタミン酸に１６７番目のセリンがプロリンに３６９番目のリジンがアルギニンに置換されていることが確認された。結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】
【００６９】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２のプラスミドを鋳型として、１６０番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６１番目のトリプトファンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６２番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６４番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６５番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６６番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６７番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６８番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６９番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７１番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７２番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３２９番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３１番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１８の合成オリゴヌクレオチド、５５１番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調整した。
【００７０】
実施例４で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、実施例３と同様に粗酵素液を調製した。
【００７１】
上記の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、１６種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら１６種の改変体をコードするプラスミドを、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１９と命名した。
【００７２】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１９の変異箇所を同定するためにＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５で配列番号２記載の１６０番目のグリシンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６では１６３番目のグリシンがリジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７では１６３番目のグリシンがロイシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８では１６３番目のグリシンがアルギニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９では１６７番目のセリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０では１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１１では１６７番目のセリンがアルギニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１２では１６７番目のセリンがバリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１３では１７１番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１４では５５１番目のバリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５では５５１番目のバリンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１６では５５１番目のバリンがスレオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１７では５５１番目のバリンがグルタミン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１８では５５１番目のバリンがセリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１９では５５１番目のバリンがチロシンに置換されていることが確認された。結果を表２に示す。
【００７３】
【表２】
【００７４】
実施例５；多重変異体の作製と熱安定性
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０のプラスミドを鋳型として、１６０番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６１番目のトリプトファンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６２番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６４番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２４の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６５番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６６番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６８番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２７の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６９番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２８の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号２９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７１番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３０の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７２番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３２９番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３２の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３０番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３３の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３３１番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３４の合成オリゴヌクレオチド、５５１番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３５の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００７５】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５のプラスミドを鋳型として、１６３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号３６の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００７６】
実施例４で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、実施例３と同様に粗酵素液を調製した。
【００７７】
上記の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、５７種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら５７種の改変体をコードするプラスミドを、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３９ ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６と命名した。
【００７８】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６７、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６の変異箇所を同定するためにＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ ； Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２０で配列番号２記載の１６０番目のグリシンがグルタミン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２１では１６０番目のグリシンがイソロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２２では１６０番目のグリシンがセリングルタミンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２３では１６０番目のグリシンがグルタミンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２４では１６２番目のセリンがアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２５では１６２番目のセリンがシステインに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２６では１６２番目のセリンがアスパラギン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２７では１６２番目のセリンがグルタミン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２８では１６２番目のセリンがフェニルアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２９では１６２番目のセリンがヒスチジンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３０では１６２番目のセリンがロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３１では１６３番目のグリシンがアスパラギン酸に１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３２では１６４番目のセリンがフェニルアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３３では１６４番目のセリンがスレオニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３４では１６４番目のセリンがチロシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３５では１６５番目のロイシンがアラニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３６では１６５番目のロイシンがイソロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３７では１６５番目のロイシンがアスパラギンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３８では１６５番目のロイシンがプロリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３９では１６５番目のロイシンがバリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４０では１６６番目のアラニンがシステインに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４１では１６６番目のアラニンがイソロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４２では１６６番目のアラニンがリジンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４３では１６６番目のアラニンがロイシンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４４では１６６番目のアラニンがメチオニンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４５では１６６番目のアラニンがプロリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４６では１６６番目のアラニンがセリンに１６７番目のセリンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４７では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがリジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４８では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがプロリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４９では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがチロシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５０では１６７番目のセリンがプロリンに１６９番目のアスパラギンがトリプトファン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５１では１６７番目のセリンがプロリンに１７０番目のロイシンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５２では１６７番目のセリンがプロリンに１７０番目のロイシンがフェニルアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５３では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがイソロイシンに、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５４では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがリジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５５では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがメチオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５６では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがグルタミン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５７では１６７番目のセリンがプロリンに１７１番目のロイシンがバリン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５８では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがアラニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５９では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがシステインに、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６０では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがグルタミン酸、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６１では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがイソロイシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６２では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがメチオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６３では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６４では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがグルタミン酸、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６５では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがトリプトファン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６６では１６７番目のセリンがプロリンに１７２番目のバリンがにチロシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６７では１６７番目のセリンがプロリンに３２９番目のバリンがグルタミン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６８では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６９では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがアスパラギン酸、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７０では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがイソロイシン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７１では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがリジンｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７２では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがロイシン、ＡＯＧＤＨ−Ｍ７３では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがメチオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７４では１６７番目のセリンがプロリンに３３１番目のアラニンがバリンに置換されていることが確認された。結果を表３に示す。
【００７９】
【表３】
【００８０】
実施例６：アスペルギルス・オリゼ由来改変型ＦＡＤＧＤＨの取得
改変型ＦＡＤＧＤＨ生産菌として、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７６で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した。得られた形質転換体を１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、ＴＢ培地に培養温度２５℃で２４時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｏｃｔｙｌ−セファロースカラムおよびＰｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型ＦＡＤＧＤＨサンプルとした。表４に示すように精製標品においても熱安定性が向上していることが確認された。
【００８１】
【表４】
【００８２】
実施例７：ｐＨ安定性
実施例６で得た精製標品についてｐＨ安定性を知るために、ｐＨ３．５〜８．５の範囲の緩衝液（ｐＨ３．５〜６．３：０．１Ｍ 酢酸バッファー、ｐＨ６．３〜７．３、０．１Ｍ ＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ７．３〜８．５：０．１Ｍ トリス塩酸バッファー、ｐＨ６．０〜７．７：０．１Ｍ リン酸バッファー）を調製し、これらを用いて各ＧＤＨを酵素濃度１Ｕ／ｍｌとなるよう希釈した。希釈液を２５℃で１６時間インキュベートしてインキュベート前後の活性を比較した。インキュベート前の活性に対するインキュベート後の活性残存率を示したグラフを図１に示す。図１に示すようにｐＨ安定域の幅が広がっていることが確認された。
【００８３】
実施例８：アスペルギルス・テレウス由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子への変異導入
我々はアスペルギルス・オリゼ由来 ＧＤＨ遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列情報を取得している。また、熱安定性を指標としたスクリーニングを実施し、熱安定性向上に効果のあるアミノ酸部位を同定している。そこで、アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの推定アミノ酸配列とアスペルギルス・テレウス由来ＧＤＨの推定アミノ酸配列をアラインさせ、アスペルギルス・テレウス由来ＧＤＨにおいて、アスペルギルス・オリゼＦＡＤＧＤＨで熱安定性向上に効果のあった部位に対応するアミノ残基を同定した。
【００８４】
実験例６で作製した組換えプラスミドｐＡｔＧＤＨ−ｓ２−７を鋳型として用い、１１６番目のリジンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１５９番目のグルタミンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６１番目のグルタミン酸を複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６４番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６６番目のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１６７番目のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、１７５番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３２５番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３２７番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、３６５番目のグルタミンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、５４７番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換し、アンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩培養した。
【００８５】
実施例９：アスペルギルス・テレウス由来改変型ＦＡＤＧＤＨを含む粗酵素液の調整
得られたコロニーをさらにアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００８６】
実施例１０：熱安定性が向上した変異体のスクリーニング
実施例９の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。
【００８７】
これらＦＡＤＧＤＨの遺伝子配列については、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）により配列確認を実施した。加熱処理前の活性に対する加熱処理後の残存活性率（％）を表５に示した。この結果より、組換え体を用いて熱安定性が向上したアスペルギルス・テレウス由来グルコースデヒドロゲナーゼを取得すること可能となった。
【００８８】
【表５】
【００８９】
また、種々の糖類に対する基質特異性については、上記の活性測定方法に従い、酵素活性を測定した。グルコースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値とそれに代えて同じモル濃度の比較対象の糖類（例えばマルトース）を基質溶液とした場合の脱水素酵素活性
値を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合の相対値を求めた。
【００９０】
上記で得られた種々の変異体の基質特異性は良好であった。
【００９１】
実施例１１：ＦＡＤＧＤＨ遺伝子への変異導入
野生型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子（配列番号１）を含む組み換えプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、形質転換体をアンピシリン（５０・ｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）を摂取し、３０℃で一晩振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調整した。該プラスミドを鋳型として５３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号４９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００９２】
実施例１２：改変型ＦＡＤＧＤＨを含む粗酵素液の調製
実施例２で調整したプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩振とう培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００９３】
実施例１３：基質特異性が向上した変異体のスクリーニング
実施例３の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースならびにキシロースを基質として活性を測定したところ、７種の基質特異性が向上した変異体を取得した。これら７種の改変体をコードするプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７と命名した。
【００９４】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７の変異箇所を同定するためにＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１で配列番号２記載の５３番目のグリシンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２で配列番号２記載の５３番目のグリシンがヒスチジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３で配列番号２記載の５３番目のグリシンがリジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４で配列番号２記載の５３番目のグリシンがメチオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５で配列番号２記載の５３番目のグリシンがアスパラギン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６で配列番号２記載の５３番目のグリシンがスレオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７で配列番号２記載の５３番目のグリシンがバリンに置換されていることが確認された。結果を表１に示す。
【００９５】
【表６】
【００９６】
実施例１４：基質特異性、及び／または、熱安定性が向上した変異体の作製
実施例１３で調整したプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２を鋳型として、１６４番目のセリンをプロリンに置換するよう設計した配列番号５０の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５を鋳型として、１６４番目のセリンをプロリンに置換するよう設計した配列番号５０の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２を鋳型として、１６３番目のグリシンをアルギニンに置換するよう設計した配列番号５１の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、さらに５５１番目のバリンをシステインに置換するよう設計した配列番号５２の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチドをもとに実施例２の方法と同様に変異操作を行い、基質特異性、及び／または、熱安定性に優れた改変型ＦＡＤＧＤＨを作製し上記の方法と同様にプラスミドを調整した。変異箇所を同定するため実施例４の方法と同様にＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３７００ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８で配列番号２記載の５３番目のグリシンがヒスチジンに、１６７番目のセリンがプロリンに、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９で配列番号２記載の５３番目のグリシンがアスパラギンに、１６７番目のセリンがプロリンに、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０で配列番号２記載の５３番目のグリシンがアスパラギンに、１６３番目のグリシンがアルギニンに、５５１番目のバリンがシステインに置換していることが確認された。実施例４と同様の活性測定法により、グルコースならびにキシロースを基質として活性を測定したところ、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０は基質特異性が向上していることが確認された。熱安定性を測定するため実施例３の方法と同様に、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０の粗酵素液を調整し、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０は熱安定性が向上していることが確認された。結果を表２に示す。
【００９７】
【表７】
【００９８】
実施例１５：改変型ＦＡＤＧＤＨの取得
改変型ＦＡＤＧＤＨ生産菌として、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した。得られた形質転換体を１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、ＴＢ培地に培養温度２５℃で２４時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｏｃｔｙｌ−セファロースカラムおよびＰｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型ＦＡＤＧＤＨサンプルとした。表３に示すように精製標品においても熱安定性が向上していることが確認された。
【００９９】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明により、ＦＡＤ−ＧＤＨにおいて熱安定性向上に関与しているアミノ酸残基を見出すことができ、あらゆる属、種のＦＡＤ−ＧＤＨにもあてはまる可能が示された。また、本発明によるＦＡＤＧＤＨの安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサー作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にし、医療関連分野などの産業に貢献するところ大である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型のアスペルギルス属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも基質特異性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、以下の（１）または（２）の位置においてアミノ酸置換を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ。
（１）配列番号２のアミノ酸配列における５３位。
（２）配列番号２以外のアミノ酸配列であって、該配列と配列番号２のアミノ酸配列とをアラインさせることにより同定した、配列番号２のアミノ酸配列における５３位と同等の位置。
【請求項２】
基質特異性の向上が、キシロースに対する作用性がグルコースに対して５％以下に低減された点にある、請求項１の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列における５３位のアミノ酸置換が、５３位のグリシン（Ｇ）のシステイン（Ｃ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）およびバリン（Ｖ）のうちいずれかである、請求項１または２の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＦＡＤＧＤＨの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースセンサー。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコース測定法。
【請求項１】
野生型のアスペルギルス属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも基質特異性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、以下の（１）または（２）の位置においてアミノ酸置換を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ。
（１）配列番号２のアミノ酸配列における５３位。
（２）配列番号２以外のアミノ酸配列であって、該配列と配列番号２のアミノ酸配列とをアラインさせることにより同定した、配列番号２のアミノ酸配列における５３位と同等の位置。
【請求項２】
基質特異性の向上が、キシロースに対する作用性がグルコースに対して５％以下に低減された点にある、請求項１の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列における５３位のアミノ酸置換が、５３位のグリシン（Ｇ）のシステイン（Ｃ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）およびバリン（Ｖ）のうちいずれかである、請求項１または２の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＦＡＤＧＤＨの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースセンサー。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコース測定法。
【図１】
【公開番号】特開２００９−２２５８００（Ｐ２００９−２２５８００Ａ）
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２６１４２（Ｐ２００９−１２６１４２）
【出願日】平成２１年５月２６日（２００９．５．２６）
【分割の表示】特願２００７−２９３３２５（Ｐ２００７−２９３３２５）の分割
【原出願日】平成１９年１１月１２日（２００７．１１．１２）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２６日（２００９．５．２６）
【分割の表示】特願２００７−２９３３２５（Ｐ２００７−２９３３２５）の分割
【原出願日】平成１９年１１月１２日（２００７．１１．１２）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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