新規なジオバチルス微生物
【課題】工業用途に適した耐熱性リパーゼを効率的に生産する。
【解決手段】耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子を有するジオバチルス属Ｔ１株およびその単離方法、シグナルペプチドを含むもしくは含まない、またはＧＳＴタグが融合されたもしくはされていない耐熱性Ｔ１リパーゼを発現する形質転換体およびその作製方法、および、同菌株または形質転換体を用いて耐熱性Ｔ１リパーゼを産生する方法。
【解決手段】耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子を有するジオバチルス属Ｔ１株およびその単離方法、シグナルペプチドを含むもしくは含まない、またはＧＳＴタグが融合されたもしくはされていない耐熱性Ｔ１リパーゼを発現する形質転換体およびその作製方法、および、同菌株または形質転換体を用いて耐熱性Ｔ１リパーゼを産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な微生物およびその製造方法に関する。より具体的には、本発明は耐熱性リパーゼＴ１を産生する新規な微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼは、通常の生物体のための極めて重要な代謝酵素であり、脂肪を加水分解して遊離脂肪酸を産生することができる。リパーゼまたはアシルグリセロールヒドロラーゼは、長鎖トリグリセリドを、ジアシルグリセリド、モノグリセリド、グリセロールおよび遊離脂肪酸に加水分解する酵素である。しかしながら、リパーゼはまた、アルコールおよび脂肪酸からの、またはエステル交換を介してのエステルの形成において、加水分解の逆反応を触媒することもできる。
【０００３】
リパーゼは、食品加工において風味ある乳製品に対しての、医薬において消化剤としての、脂肪および油の改善などのための酵素として、幅広く用いられている。リパーゼは、各用途のために種々の特性を有することが要求されており、耐熱性リパーゼは、広範な分野に適用され、様々に用いられることが要求されている。
【０００４】
微生物細胞外リパーゼは、通常、動物性または植物性リパーゼよりもより耐熱性である。微生物細胞外リパーゼは、工業および診断薬において潜在的な用途を有する。商業用酵素における主要な要求は熱安定性であるが、これは、熱変性が酵素不活性化の一般的な原因であるからである。さらに、酵素の熱安定性を高めることにより、より高温で酵素反応を行うことができるようになるが、これは変換速度、基質溶解性を増大させ、そして微生物の増殖の可能性および反応媒体の粘度を低減する一助となる。
【０００５】
好熱菌は、耐熱性酵素を産生するよい候補となり得るが、収率が低いことや、高温発酵装置が必要となる可能性があることから、実用的でない場合が多い。この問題を克服するために、遺伝子工学による分子学的アプローチが、原核細胞系を介した経済的な大量生産のための高レベルの発現を達成する良好な代替手段となっている。これまでのところ、数種の耐熱性リパーゼのクローニングおよび異種宿主の細胞内での発現に成功している。
【０００６】
基礎研究および商業的目的において、原核細胞系における外来タンパク質の発現が、高レベルの発現を達成するために最も広く用いられている。発現ベクターおよび宿主は、クローニングされた遺伝子の最大限の発現を達成するのに重要な問題であり、外来遺伝子の分子学的クローニングは当該遺伝子の発現の成功を保証するものではない。
【非特許文献１】Leow et al., Biosci Biotechnol Biochem. 2004;68(1):96〜103
【非特許文献２】Frangioni and Neel, Anal Biochem. 1993;210(1):179〜87
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、工業用途に適した耐熱性リパーゼを効率的に産生することを目的の１つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明においては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術による耐熱性リパーゼの迅速なクローニング、および様々な種類のプロモーターを用いて原核細胞系により発現される耐熱性リパーゼＴ１遺伝子の操作を提供する。
【０００９】
本発明において用いられる細菌株、ジオバチルス属Ｔ１株（Geobacillus sp.Ｔ１株）は、耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子を提供するものであり、本発明はこれを製造する方法を含む。本発明はまた、耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子を発現する宿主細胞を包含する形質転換体、およびその製造方法を提供する。
【００１０】
すなわち、本発明は、パーム油廃液から単離され、リパーゼを産生することができる細菌、ジオバチルスＴ１株の生物学的に純粋な菌株であって、該細菌が、以下の特性を有するものに関する：
a)活動温度範囲および活動温度
活動温度範囲が２０℃から７５℃であり、最適温度が少なくとも７０℃であり、
b)活動ｐＨ
ｐＨ５〜６の範囲の活動ｐＨを有し、
c)形態学的および生理学的活性
好気性、グラム陽性、内生胞子形成性の桿菌状細菌であり、幅０．８〜１．０μｍおよび長さ２．５〜６．０μｍを有し、２％のＮａＣｌに耐性であり、クエン酸および硝酸塩試験について陽性であり、
d)酸性活性
作用糖類として、Ｄ−フルクトース、Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロースを有し、このうちＤ−フルクトースに対して高い酸性活性を有し、
f)細胞脂肪酸
イソ分枝ペンタデカン酸（イソＣ１５）、ヘキサデカン酸（イソＣ１６）およびヘプタデカン酸（イソＣ１７）を７８．３３％の割合で有し、このうちイソＣ１５およびイソＣ１７が豊富であり、
g)分類学的同定
Geobacillus kaustophilus(ＤＳＭ７２６３Ｔ)と６４．９％の類似性を有し、およびGeobacillus thermoleovorans (ＤＳＭ５３６６Ｔ)と６８．８％の類似性を有し、
h)種の同定
リボプリント（RiboPrint）パターンを用いた場合、種の同一性は０％である。
【００１１】
本発明はまた、ジオバチルスＴ１株が、パーム油廃液から、ＮａＣｌを含むｐＨ７．０の強化培地中に６０℃の温度にて単離されたものである、上記菌株に関する。
本発明はさらに、ジオバチルスＴ１株が、ＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen：ドイツ微生物・細胞カルチャーコレクション)に、ＤＳＭ１７１３９として寄託されたものである、上記菌株に関する。
本発明はさらにまた、ジオバチルスＴ１株を同定する方法であって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含み、ここで耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅が、以下の工程：
a)少なくとも９４℃での少なくとも４分間の予備変性工程、
b)少なくとも９４℃での少なくとも１分間の変性工程、
c)５６℃〜７０℃での少なくとも２分間のアニーリング工程、
d)少なくとも７２℃での少なくとも１分間の伸長工程、
e)少なくとも９４℃での少なくとも７分間の最終伸長工程
を含む方法に関する。
【００１２】
また、本発明は、ＰＣＲ増幅サイクルが、２５〜４５サイクル反復される、上記同定方法に関する。
さらに、本発明は、ジオバチルスＴ１株を、栄養ブロス０．８％、寒天１．５％、ビクトリアブルー０．０１％、トリオレイン０．２５％（ｖ／ｖ）を含むトリオレイン寒天にて培養することを含む、リパーゼを産生する方法に関する。
さらにまた、本発明は、ｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクターを用いて、単離された組換え耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子を作製する方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、以下の特徴を有する、シグナルペプチドを有する融合タンパク質を製造する方法に関する：
a)ｐＢＡＤ、ｐＧＥＸ−４Ｔ１、ｐＲＳＥＴ ＣまたはｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを含む原核細胞系における、シグナルペプチドを有する耐熱性Ｔ１リパーゼの発現、
b)ａｒａＣ、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃまたはｔａｃプロモーターを有すること、
c)ｔａｃプロモーターにより制御されているｐＧＥＸ−４Ｔ１からの高レベルの発現を有すること、
d)０．０５ｍＭのＩＰＴＧで少なくとも８時間誘導した場合に、１１，７０８Ｕ／ｌのリパーゼ活性を有すること、
e)２０％〜２８％のＴ１リパーゼ回収率および少なくとも７．３倍のＴ１リパーゼ精製倍率を有すること、
f)少なくとも３０．１９２Ｕ／ｍｇの精製融合リパーゼ活性を有すること。
【００１４】
本発明はさらに、以下の特徴を有する、シグナルペプチドを有しない融合タンパク質を製造する方法に関する：
a)０．０２５ｍＭのＩＰＴＧで少なくとも１２時間誘導した場合に４１，９０２Ｕ／ｌのリパーゼ活性を有すること、
b)少なくとも２７９倍の発現レベルの増加を有すること、
c)７０％〜７５％のリパーゼ回収率、および少なくとも２．８７倍の精製倍率を有すること、
d)少なくとも２９７．９２９Ｕ／ｍｇの精製融合リパーゼ活性を有すること、
e)Ｔ１成熟リパーゼを有すること。
【００１５】
本発明はさらにまた、以下の特徴を有する、Ｔ１成熟リパーゼを製造する方法に関する：
a)活動温度活性および安定性
６０℃〜８０℃の範囲の温度で活動し、最適温度が約７０℃であること、
b)活動ｐＨ活性および安定性
ｐＨ６〜１０で３０分間活動し安定であり、最適なアルカリｐＨが９であること、
c)作用金属イオン
Ｎａ＋、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋で作用し、
Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋に対して少なくとも３０分間安定であり、
Ｃｕ２＋およびＦｅ２＋で、それぞれ約５２％および６０％のリパーゼ活性を少なくとも３０分間有すること、
d)作用界面活性剤のリパーゼ活性への影響
６３％〜８８％の割合で、０〜３０分間作用すること、
e)基質特異性
オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、パーム油およびトリグリセリドなどの天然油に作用し、天然油が好ましい基質であること、
f)リパーゼ阻害剤
金属キレート剤、還元剤、セリンプロテアーゼ阻害剤およびアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤と共に作用し、かつ触媒メカニズムがセリンおよびアスパラギン酸残基に関連すること。
【００１６】
また、本発明は、工業用途における触媒として使用するための、ジオバチルスＴ１株から単離された耐熱性Ｔ１リパーゼの製造方法に関する。
さらに、本発明は、以下の特性を有する、安定性のある耐熱性Ｔ１リパーゼを製造する方法に関する：
a)融合リパーゼについては６５℃、成熟リパーゼについては７０℃の最適温度を有すること、
b)８〜９の間の最適ｐＨを有すること、
c)ｐＨ６〜１２で安定性を有すること。
さらにまた、本発明は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合リパーゼＴ１を製造する方法であって、該融合リパーゼＴ１が約６３ｋＤａの分子量を有する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ジオバチルス属Ｔ１株のスクリーニング
ジオバチルス属Ｔ１株の単離および同定は好熱菌種に関する本発明の基礎となるものである。ジオバチルス属Ｔ１株の培養物は、Enzyme and Microbial Technology Research Department of Biochemistry and Microbiology, Faculty of Science and Environmental Studies, Universiti Putra Malaysiaから得ることができる。
【００１８】
マレーシアのパーム油廃液からリパーゼ産生菌をスクリーニングする過程で、トリオレイン寒天プレートにおいて陽性の結果をもたらすＴ１を単離した。このリパーゼ産生菌の系統学的な位置を確認するために、形態学的および生理学的特徴、１６Ｓ ｒＲＮＡ分析、細胞脂肪酸分析、ＤＮＡ組成分析、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション分析およびリボプリント分析を行った。
【００１９】
ジオバチルス属Ｔ１株の単離および同定
サンプルは、マレーシアのセランゴールにて、パーム油廃液から採取した。ジオバチルス属Ｔ１株は、６０℃、１５０ｒｐｍの振盪条件下の、ＮａＣｌ ０．２％、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ０．０４％、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０７％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０５％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．０３％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０３％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．０５％、そして唯一の炭素源としてオリーブ油（２％）を含む強化培地から単離した。これを、リパーゼ産生菌のスクリーニングのためにトリオレイン寒天プレート上に播種した。
【００２０】
本発明の別な態様においては、ジオバチルスＴ１株は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含む方法により同定することができる。典型的には耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ増幅は、
a)少なくとも９４℃での少なくとも４分間の予備変性工程、
b)少なくとも９４℃での少なくとも１分間の変性工程、
c)５６℃〜７０℃での少なくとも２分間のアニーリング工程、
d)少なくとも７２℃での少なくとも１分間の伸長工程、
e)少なくとも９４℃での少なくとも７分間の最終伸長工程
の各工程を含むことができる。また、ＰＣＲ増幅サイクルは、２５〜４５サイクル反復してもよい。
【００２１】
形態学的研究のために、純粋な細菌株を栄養寒天プレート上に画線し、６０℃でインキュベートした後、グラム染色を施し、染色結果を光学顕微鏡で観察した。形態学的および生理学的特徴を、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen：ドイツ微生物・細胞カルチャーコレクション）に送付し、本菌株は同機関に、ＤＭＳ１７１３９として寄託された。生理学的特徴の検討は、カタラーゼおよびオキシダーゼ試験、嫌気性増殖、Voges-Proskauer試験、３０℃、４０℃および７０℃での増殖、ｐＨ５．７、ＮａＣｌ２％、５％またはリゾチームブロスを含む培地での増殖、Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトールおよびＤ−フルクトースの発酵、デンプン、ゼラチン、カゼインおよびＴｗｅｅｎ８０の加水分解、チロシンの分解、クエン酸塩およびプロピオン酸塩の利用、硝酸塩の還元、インドールの産生、フェニルアラニンデアミナーゼおよびアルギニンジヒドロラーゼ試験を行った。脂肪酸は、Sherlock微生物同定システムの指示書にしたがって抽出および分析した。
【００２２】
１６Ｓ ｒＤＮＡを、２個のユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ産物を精製した。精製したＰＣＲ産物を、TOPO TA PCR 2.1クローニングベクター（Invitrogen）にクローニングした。組換えプラスミドを抽出し、そして次に、ABI PRISM 377 ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems）を用いてシーケンシングした。
【００２３】
染色体ＤＮＡを単離および精製し、そしてＧ＋Ｃ含量を、クロマトグラフィー条件を用いて決定した。ＤＮＡを加水分解し、そして得られたヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣで分析した。ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションは、２６００型分光光度計を用いて分析した。
【００２４】
標準化自動リボタイピング（standarized, automated ribotyping）は、Ｑｕａｌｉｃｏｎ（登録商標）リボプリンター（RiboPrinter）システムを用いて行った。リボプリンターシステムは、リボタイピングのための分子処理工程を、独立した自動機器内で組み合わせたものである。工程は、細胞溶解、制限酵素ＥｃｏＲ１による染色体ＤＮＡの消化、電気泳動による断片の分離、ＤＮＡ断片のナイロンメンブレンへのトランスファー、大腸菌由来のｒｒｎＢオペロンから生成したプローブへのハイブリダイゼーション、ｒｒｎオペロン配列を含む断片に対するプローブの化学発光による検出、画像検出およびリボプリントパターンのコンピュータ解析を含む。
【００２５】
単離したＴ１株は、好気性、グラム陽性、内生胞子形成性の桿菌であった（幅０．８〜１．０μｍおよび長さ２．５〜６．０μｍ）（図１）。Ｔ１株のＤＮＡ塩基組成は、およそ５２．６％ｍｏｌＧ＋Ｃであった。円筒形の内生胞子は、菌端の膨大した胞子嚢に出現する。Ｔ１株は７０℃でさえも増殖するが、３０℃および４０℃では増殖は認められなかった。同株は、２％までのＮａＣｌの存在に耐性であった。酸は、Ｄ−フルクトースからは産生されたが、Ｄ−グルコースおよびＤ−マンニトールからは産生されなかった。クエン酸塩および硝酸塩試験の結果は陽性を示した。形態学的および生理学的特徴は、表１および２に示してある。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
＋：陽性、−：陰性、ｗ：弱い反応、n.d.：検出せず、n.g.：増殖せず
【００２８】
【表３】
＋：陽性、−：陰性、ｗ：弱い反応、n.d.：検出せず、Ｃ：円筒形、Ｏ：楕円形、Ｔ：菌端。分類は以下のように示した：１．Geobacillus zalihaii、２．Geobacillus thermoleovorans（Zarilla & Perry, Syst Appl Microbiol. 1987;9:258〜264）、３．Geobacillus kaustophilus（White et al., Antonie Van Leeuwenhoek. 1993-94;64(3-4):357〜86）。
【００２９】
１５１９ｂｐの完全１６ＳｒＤＮＡ配列（ＡＹ１６６６０３：配列番号１）は、以下のように決定した。
【表４】
【００３０】
Ｔ１株の細胞脂肪酸の大半はイソ脂肪酸であった（表３）。このうち、イソ分枝ペンタデカン酸（イソＣ１５）、ヘキサデカン酸（イソＣ１６）およびヘプタデカン酸（イソＣ１７）が、全脂肪酸の７８．３３％を占めており、特にイソＣ１５およびイソＣ１７が豊富であった。この脂肪酸プロファイルにより、ジオバチルス属は、Bacillus Alicyclobacillus、Brevibacillus、Aneurinibacillus、SulfobacillusおよびThermobacillus属の他の中温菌および好熱菌と明確に区別される。Ｔ１株およびGeobacillus thermoleovorans ＤＳＭ５３６６Ｔは、Bacillus ｒＲＮＡ群５の典型的な脂肪酸プロファイルを共有するが、表３に示すとおり、イソＣ１６の脂肪酸組成における％により区別することができる。
【００３１】
【表５】
【００３２】
ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションの検討を、Ｔ１株と系統学的な近縁種との間の分類上の関連性を確認するために行った。Ｔ１株と標準株Geobacillus kaustophilus ＤＳＭ７２６３ＴおよびGeobacillus thermoleovorans ＤＳＭ５３６６Ｔとの間のゲノムＤＮＡ／ＤＮＡの近縁性は、それぞれ６４．９および６８．８であった（表４）。
【表６】
【００３３】
ＤＮＡ／ＤＮＡ再会合値は、種の定義のためのＤＮＡ／ＤＮＡ類似性の閾値である７０％を下回った。リボプリント分析を、Ｔ１株の近縁関係（affiliation）の決定のために行った。しかしながら、Ｔ１株のリボプリントパターンは、Ｄｕｐｏｎｔ同定ライブラリーによっては、種のレベルでの同定（＞０．８５）がなされるようには同定されなかった。そのリボプリントパターンは、Geobacillus kaustophilus ＤＳＭ７２６３Ｔに対して最も高い類似性を示した（０．６９）。Geobacillus therleovorans ＤＳＭ５３６６Ｔのパターンの類似性はいくらか低かった（０．５７）。Geobacillus kaustophilus ＤＳＭ７２６３ＴおよびGeobacillus thermoleovorans ＤＳＭ５３６６Ｔのパターンは、０．６４のバイナリーな類似性（binary similarity）を示した。
【００３４】
結果として、Ｔ１株は、形態学的および生理学的検討、細胞脂肪酸組成、ＤＮＡ組成、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションおよびリボプリント分析により、新種の成員として認められるに値するものである。したがって、我々は、Ｔ１Ｔ株について、新種、Geobacillus zalihae sp. nov.の創設を提案する（za.li.’hae N.L. gen. n. zalihae of zalihaは、極限微生物について多大な貢献を行ったUniversiti Putra Malaysiaの科学者に敬意を表したものである）。細胞は桿菌状であり、幅０．８〜１．０μｍ、長さ２．５〜６．０μｍの、グラム陽性細菌である。菌端芽胞は円筒形であり、胞子嚢は膨大している。Ｔ１株のＤＮＡ塩基組成は、およそ５２．６％ｍｏｌＧ＋Ｃであった。同株は、多量のイソ脂肪酸を含んでおり、このうちイソＣ１５およびイソＣ１７が豊富であった（７７．１９％）。増殖は好気性であり、７０℃でも増殖し続け、２％までのＮａＣｌに耐性があるが、嫌気性に増殖することはできない。カタラーゼおよび硝酸塩試験は陽性である。Ｄ−グルコースおよびＤ−マンニトールから酸は産生しないが、クエン酸塩を利用することができる。デンプンを加水分解するが、ゼラチンおよびカゼインは加水分解しない。
【００３５】
ジオバチルス属Ｔ１株からの耐熱性リパーゼ遺伝子のクローニングおよびシーケンシング
細菌株およびプラスミド
耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドｐＢＡＤ／Ｔ１（非特許文献１）を、サブクローニングの給源として用いた。大腸菌株はＬＢ培地中、３７℃で増殖させた。ｐＲＳＥＴ Ｃ（Invitrogen）、ｐＥＴ２２ｂ（＋）（Novagen）およびｐＧＥＸ−４Ｔ１（Amersham Bioscience、United Kingdom、England）を、サブクローニングおよび発現に用いた。
【００３６】
ＤＮＡ操作
プラスミドＤＮＡは、QIAGEN miniprep spin kit（QIAGEN、Hilden、Germany）により、製造者の説明書にしたがって単離した。ＰＣＲ産物は、GeneClean Kit（Qbiogene、Carlsbad、USA）により、供給者の説明通りに精製した。大腸菌のコンピテント細胞は、慣用のＣａＣｌ２法により調製した。
【００３７】
耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子のサブクローニングおよび発現
Ｔ１リパーゼ遺伝子のサブクローニングは、制限酵素サイトＢａｍＨ１／ＥｃｏＲ１を組み込んだプライマーのセット、すなわち、Ｔ１リパーゼのオープンリーディングフレームをサブクローニングするためのｐＧＥＸ−Ｆｏｒ：5’-GAA GGG ATC CGT GAT GAA ATG CTG TCG GAT TAT G-3’（配列番号２）およびｐＧＥＸ−Ｒｅｖ：5’-AAT AGA ATT CTT AAG GCT GCA AGC TCG CCA A-3’（配列番号３）、およびＴ１成熟リパーゼ遺伝子をサブクローニングするためのＥＨ２−Ｆｏｒ：5’-GAC GGG ATC CGC ATC CCT ACG CGC CAA TGA T-3’（配列番号４）およびｐＧＥＸ−Ｒｅｖ：5’-AAT AGA ATT CTT AAG GCT GCA AGC TCG CCA A-3’（配列番号３）を設計することにより行った。ライゲーションしたプラスミドを大腸菌株を形質転換するのに用い、適切な抗生物質を含むトリブチリンＬＢ寒天プレートによりスクリーニングした。組換えプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１（Ｄｅ３）ｐｌｙｓＳを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加した２００ｍｌのＬＢ培地を含む１ｌのブルーキャップボトル中、ロータリーシェーカー上（２００ｒｐｍ）、３７℃で増殖させた。
【００３８】
シグナルペプチドを有する組換えクローンとシグナルペプチドを有しない組換えクローンとを、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により、ＯＤ６００ｎｍ〜０．５にて、様々な誘導期間（０、４、８、１２、２０、２８、３６および４４時間）誘導した。これを、ＩＰＴＧの濃度（ｗ／ｏ、０．０２５、０．０５、０．１、０．５、１．０、１．５および２．０ｍＭ）および誘導ＯＤ６００ｎｍ（０．２５、０．５０、０．７５および１．００）を変化させることにより、さらに最適化した。培養物（１０ｍｌ）を遠心分離により回収し、５０ｍＭのリン酸カルシウムバッファー（ｐＨ７．０）２ｍｌで再懸濁し、その後超音波処理（Branson 250 sonifier：出力２、デューティサイクル３０％、２分）を施し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分）により澄明化した。粗製透明溶解液をリパーゼアッセイに用いた。
【００３９】
電気泳動
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを１２％のゲル上で行い、これによりタンパク質を分析した。広範囲のタンパク質標準物質（MBI Fermentas、St. Leon-Rot、Germany）を、分子量マーカーとして用いた。
【００４０】
Ｔ１リパーゼの精製
４００ｍｌの組換え培養物を遠心分離により回収し、超音波処理の前に４０ｍｌに濃縮した。粗製細胞溶解液を、１０ｍｌのカラム容積を有する、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）で平衡化したグルタチオン−セファロースＨＰカラム（ＸＫ１６／２０）に、０．２ｍｌ／分の流速で負荷した。カラムは、タンパク質が検出されなくなるまで同じバッファーで洗浄した。結合したリパーゼは、１０ｍＭの還元グルタチオンが添加されたトロンビン開裂バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍｌのＮａＣｌおよび０．３３ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ８．４）により溶出した。融合タンパク質を２０ーＣにて２０時間トロンビン開裂に供し、そしてバッファーをセファデックスＧ−２５に交換した後、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）に対して透析した。ＧＳＴタグおよびトロンビン酵素は、グルタチオン−セファロースＨＰ、ＨｉＴｒａｐグルタチオン４ＦＦおよびＨｉＴｒａｐベンズアミジンを連続的に用いることによりさらに除去した。
【００４１】
シグナルペプチドを含むＴ１リパーゼの発現は、それぞれａｒａＣ、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃまたはｔａｃプロモーターの制御下にある、ｐＢＡＤ、ｐＲＳＥＴ Ｃ、ｐＥＴ２２ｂ（＋）またはｐＧＥＸ−４Ｔ１を含む原核細胞系によって行った。これらのうち、高レベルの発現を誘導することに関して、ｔａｃプロモーターの制御下にあるｐＧＥＸ−４Ｔ１発現系により比較的高レベルの発現が達成され、これをさらなる研究のために選択した。シグナルペプチドを有する組換えプラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ１を含む組換えクローンの可溶性たんぱく質を増大させるために、簡単な最適化を行った。合計１１，７０８Ｕのリパーゼ活性が、０．０５ｍＭのＩＰＴＧによりＯＤ６００ｎｍ〜０．５にて８時間誘導した場合に検出され、このときの比活性は３０．１９２Ｕ／ｍｇであった（表５）。
【００４２】
【表７】
注記：組換えプラスミドｐＧＥＸ／Ｔ１またはｐＧＥＸ／Ｔ１Ｓを含む宿主ＢＬ２１（Ｄｅ３）ｐｌｙｓＳを、１ｍＭのＩＰＴＧによりＯＤ６００ｎｍ〜０．５にて種々の時間誘導した。括弧内の数字はそれぞれのパラメータの最適値を示す。総活性は、１ｌの培養物をベースに算出した。
【００４３】
理論的には、Ｔ１リパーゼをＧＳＴ融合タンパク質として原核細胞系で発現させることにより、アフィニティークロマトグラフィーを用いた組換えリパーゼの迅速な精製が可能となる。しかしながら、我々は、高レベルの活性が検出されたにもかかわらず、組換えリパーゼの可溶性画分がグルタチオンセファロース４ＦＦに結合しなかったため、これを精製することができなかった。これは、ＧＳＴおよびシグナルペプチドの高疎水性領域により、立体構造の変化やＧＳＴドメインの不適切な折畳みが起こるためと思われた。幾つかのケースでは、ＧＳＴ融合タンパク質は、完全にまたは部分的に不溶性であった。さらに、高レベルの発現が、部分的な、高度に不溶性の融合タンパク質の不適切な折畳みに寄与し、それにより融合タンパク質のアフィニティーカラムへの結合が妨げられる可能性があった。
【００４４】
FrangioniおよびNeel（非特許文献２）によれば、ＧＳＴ融合タンパク質の不溶性はよく起こるものである。このため、サルコシル溶解法を、部分的に不適切に折り畳まれた活性なＴ１融合リパーゼを可溶化するのに用いた。可溶化融合タンパク質を正しい折畳みに折畳み直し、これによりＧＳＴ融合タンパク質がアフィニティーグルタチオンセファロース４ＦＦに結合できるようにする目的で、非イオン界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を、サルコシルを抑制（sequester）するために用いた。表６に示すとおり、融合タンパク質を陰イオン界面活性剤と非イオン界面活性剤とで処理することにより、約２５％の回収率、および７．３培の精製倍率が得られた。
【００４５】
【表８】
注記：融合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーでの結合のために、２％の陰イオン界面活性剤サルコシルと１％の非イオン界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とにより可溶化した。
【００４６】
シグナルペプチドは、真核細胞および原核細胞の両方において、ほぼすべてのタンパク質が分泌経路に入るのを制御しており、タンパク質が膜を介して輸送されるときに切除される。しかしながら、シグナルペプチドは、耐熱性Ｔ１リパーゼの構造遺伝子に寄与しない。したがって、我々は、マトリックス支持体に不動化されたグルタチオンへのＧＳＴ融合タンパク質のアフィニティー結合を妨げることなく、ＧＳＴタグおよびＴ１成熟リパーゼの折畳みおよび相互作用を改善する目的で、シグナルペプチドを除いてＴ１リパーゼを発現させることを試みた。
【００４７】
合計２８個のアミノ酸残基がＧＳＴ部分をカバーするＴ１リパーゼの動きを制限していたため、シグナルペプチドの除去は融合リパーゼを硬化させた。Ｔ１リパーゼ遺伝子の操作は、発現レベルを、誘導時間および誘導剤濃度について、それぞれ４．２５倍および２．７０倍と顕著に改善した（表５）。発現のさらなる最適化により、０．０２５ｍＭのＩＰＴＧでＯＤ６００ｎｍ〜０．７５にて１２時間誘導した場合、培養物において４１，９０２Ｕ／ｌの発現レベルが得られた。これは、野生型ジオバチルス属Ｔ１株と比較した場合、発現レベルの約２７９倍の増加である。
【００４８】
融合タンパク質からシグナルペプチドを除去することにより、活性なＴ１リパーゼの収率が改善されるばかりでなく、また、グルタチオンセファロース４ＦＦカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによる、均質になるまでの精製が簡易化された（図２）。表７に示すとおり、およそ７２．５５％の回収率と、２．８７倍の精製倍率が得られた。融合リパーゼの精製により、比活性が１０３．７６２Ｕ／ｍｇ（粗製細胞溶解液）から２９７．９２９Ｕ／ｍｇ（精製融合リパーゼ）へと増加した。
【００４９】
Ｔ１成熟リパーゼは、次の精製工程により得た（表８）。融合リパーゼは、トロンビンプロテアーゼにより、２０℃、２０時間で切断し、そして透析の前に、バッファーをＰＢＳ（ｐＨ７．３）に交換し、かつ遊離グルタチオンを除去するためにセファデックスＧ−２５に供した。ＧＳＴタグおよびトロンビン酵素を除去するために、これをグルタチオンセファロースＨＰ、ＨｉＴｒａｐグルタチオンセファロース４ＦＦおよびベンズアミジンＦＦ（high sub）でのアフィニティークロマトグラフィーに順次供した。
【００５０】
【表９】
注記：融合タンパク質の直接精製は、界面活性剤を一切含まないアフィニティーグルタチオンセファロース４ＦＦカラムにより行った。
【００５１】
【表１０】
注記：Ｔ１成熟リパーゼの精製は、アフィニティークロマトグラフィーによって行った。アフィニティー１は、グルタチオンセファロースＨＰを表す。アフィニティー２は、連続して設置されたグルタチオンセファロースＨＰ、ＨｉＴｒａｐグルタチオンセファロース４ＦＦおよびＨｉｔｒａｐベンズアミジン（high sub）を表す。
【００５２】
Ｔ１融合リパーゼおよびＴ１成熟リパーゼの特徴化
Ｔ１リパーゼを、４０℃から８０℃までの範囲の５℃間隔の温度で、３０分間、酵素活性について試験した。温度安定性試験は、種々の温度で様々な時間について行った。組換えＴ１リパーゼはまた、ｐＨ活性および安定性の決定のためにｐＨ４〜１２の範囲の広範囲のｐＨ値に保った。バッファー系として、５０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ４〜６）、リン酸カルシウムバッファー（ｐＨ６〜８）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８〜９）、グリシン−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ９〜１１）、およびＮａ２ＨＰＯ３／ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１１〜１２）を用いた。エフェクター（金属イオン、界面活性剤）および阻害剤の効果は、ペプスタチン（１．０ｍＭ）を除き、それぞれ１ｍＭおよび５ｍＭの濃度で、５０℃、３０分の条件で検討した。
【００５３】
温度の活性および安定性に対する影響は、種々の温度で３０分間試験した。６０℃〜８０℃の温度範囲で最も活性が高く、最大活性は７０℃で得られた（図２）。リパーゼの活性および安定性に対するｐＨの影響は、種々のｐＨで３０分間、振盪条件下で試験した。図３に示すとおり、広いｐＨ範囲、特にｐＨ６〜１０で活性があり、オリーブ油を基質に用いた場合、最適ｐＨは９であった。ｐＨによる処理により、Ｔ１成熟リパーゼがアルカリｐＨで比較的安定であることが示された（図４）。
【００５４】
終濃度１ｍＭの金属イオンの影響を、５０℃、３０分間の処理で試験した。図５に示すとおり、Ｎａ＋、Ｍｎ２＋およびＫ＋は、リパーゼ活性を、１５分間の処理の後で若干高めた。Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｋ＋およびＺｎ２＋、特にＣａ２＋は、３０分間の処理の後でさえ、酵素活性を有意に低下させることなく安定化効果を示した。しかしながら、Ｆｅ２＋およびＣｕ２＋は、３０分後にリパーゼ活性を６０％および５２％と、強く抑制した。リパーゼ活性への界面活性剤の影響は、０．１％の濃度で検討した（図６）。０．１％のＴｗｅｅｎの添加により明確な向上が見られ、特にＴｗｅｅｎ８０は、０および３０分の処理の後、リパーゼ活性をそれぞれ６３％および８８％増加させた。
【００５５】
基質のリパーゼ活性への影響について、種々のトリグリセリドおよび天然油を、基質特異性を検討するために用いた。図７は、Ｔ１リパーゼにとって、天然油が、トリグリセリドに比べて基質として好ましいことを示している。同酵素は、オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油およびパーム油などの長い炭素鎖を有する天然油に対してより選択的であった。これは、Ｔ１リパーゼの工業用触媒としての良好な可能性を示すものである。
【００５６】
いくつかの金属キレート剤、還元剤、セリンプロテアーゼ阻害剤およびアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤などの阻害剤のリパーゼ活性への影響を、Ｔ１成熟リパーゼに対する抑制効果の検討に用いた。ＥＤＴＡが５ｍＭにおいてもリパーゼ活性にわずかな影響しか示さなかったことから、同酵素は金属酵素ではなかった。また、β−メルカプトエタノールおよびＤＴＴなどの還元剤は、Ｔ１リパーゼに対し、わずかな抑制効果しか示さなかった。一方、同リパーゼは、５ｍＭのＰＭＳＦおよび１ｍＭのペプスタチンの添加により強く抑制され、これはセリンおよびアスパラギン酸残基が触媒メカニズムに重要な役割を演じていることを示すものである（図８）。なお、Bacillus stearothermophilusからのＰ１リパーゼは、１０ｍＭのＰＭＳＦにより７７％の抑制を示した（Sunchaikul et al., Protein Expr Purif. 2001;22(3):388〜98）。
【００５７】
精製したＴ１融合リパーゼおよびＴ１成熟リパーゼの特性を、リパーゼ活性に対するＧＳＴタグの影響を検討するために比較した。両方のリパーゼを精製し、その生理化学的特性を検討した（表９）。融合パートナーの存在により、最適温度およびｐＨは、それぞれ６５℃およびｐＨ８と若干低下した。一方、金属イオンおよび基質については、有意な差異は観察されなかった。しかしながら、Ｔｗｅｅｎ２０〜８０は、Ｔ１成熟リパーゼに対して向上効果をもたらしたが、融合パートナーの存在下でのみ安定であった。いずれのリパーゼも、試験した濃度のセリンプロテアーゼ阻害剤およびアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤により抑制された。
【００５８】
【表１１】
【００５９】
ＧＳＴタグは、シグナルペプチドを有しないＴ１成熟リパーゼに硬く融合されているため、３次元構造および生物活性に最小限の影響を与えたにすぎず、生理化学的特性に有意な変化をもたらさなかった。Ｔ１成熟リパーゼの方が、わずかにｐＨ１単位および５℃高かった最適ｐＨおよび最適温度以外は、Ｔ１融合リパーゼおよび成熟リパーゼとの間に有意な差異はなかった。Ｔ１融合リパーゼおよび成熟リパーゼの、セリンプロテアーゼ阻害剤およびアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤に対する挙動は同じであった。このことから、我々は、融合タンパク質の精製が簡易化され、より大量かつ経済的に製造されるＧＳＴタグと融合したＴ１リパーゼを、工業用途、特に温水洗濯用の洗剤向けに提案する。さらに、高濃度の融合リパーゼにおける凝集により形成される融合タンパク質の沈殿は、これを、融合リパーゼのpIからかけ離れたｐＨ９のバッファーに溶解することにより、容易に可溶化された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によるＴ１リパーゼ、特にＴ１融合リパーゼは、耐熱性であり、精製が容易であるため、工業用途、特に温水洗濯用の洗剤などに適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】Ｔ１株の顕微鏡写真を示す写真図である。
【図２】成熟Ｔ１リパーゼの温度による活性を示す図である。精製Ｔ１リパーゼを、種々の温度で３０分間、２５０ｒｐｍの振盪速度で、オリーブ油を基質としてアッセイした。
【図３】Ｔ１リパーゼの活性試験を示す図である。同酵素を、ｐＨ４〜ｐＨ１２の様々なｐＨで、比色法によりアッセイした。用いた記号は以下のとおりである。◆：酢酸バッファー、△：リン酸カルシウムバッファー、■：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、×：グリシンバッファー、○：Ｎａ２ＨＰＯ３／ＮａＯＨバッファー。安定性試験では、Ｔ１リパーゼは、様々なｐＨ（１：１、ｖ／ｖ）でのプレインキュベーションの後に、７０℃で３０分間アッセイした。
【００６２】
【図４】Ｔ１リパーゼの安定性を示す図である。同酵素を、ｐＨ４からｐＨ１２までの様々なｐＨで３０分間前処理した後に、Ｔ１リパーゼの残存活性をアッセイした。用いた記号は以下のとおりである。◆：酢酸バッファー、△：リン酸カルシウムバッファー、■：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、×：グリシンバッファー、○：Ｎａ２ＨＰＯ３／ＮａＯＨバッファー。安定性試験では、Ｔ１リパーゼは、様々なｐＨ（１：１、ｖ／ｖ）でのプレインキュベーションの後に、７０℃で３０分間アッセイした。
【図５】リパーゼ活性に対する金属イオンの影響を示した図である。
【図６】リパーゼ活性に対する界面活性剤の影響を示した図である。
【図７】リパーゼ活性に対する基質の影響を示した図である。
【図８】リパーゼ活性に対する阻害剤の影響を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な微生物およびその製造方法に関する。より具体的には、本発明は耐熱性リパーゼＴ１を産生する新規な微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼは、通常の生物体のための極めて重要な代謝酵素であり、脂肪を加水分解して遊離脂肪酸を産生することができる。リパーゼまたはアシルグリセロールヒドロラーゼは、長鎖トリグリセリドを、ジアシルグリセリド、モノグリセリド、グリセロールおよび遊離脂肪酸に加水分解する酵素である。しかしながら、リパーゼはまた、アルコールおよび脂肪酸からの、またはエステル交換を介してのエステルの形成において、加水分解の逆反応を触媒することもできる。
【０００３】
リパーゼは、食品加工において風味ある乳製品に対しての、医薬において消化剤としての、脂肪および油の改善などのための酵素として、幅広く用いられている。リパーゼは、各用途のために種々の特性を有することが要求されており、耐熱性リパーゼは、広範な分野に適用され、様々に用いられることが要求されている。
【０００４】
微生物細胞外リパーゼは、通常、動物性または植物性リパーゼよりもより耐熱性である。微生物細胞外リパーゼは、工業および診断薬において潜在的な用途を有する。商業用酵素における主要な要求は熱安定性であるが、これは、熱変性が酵素不活性化の一般的な原因であるからである。さらに、酵素の熱安定性を高めることにより、より高温で酵素反応を行うことができるようになるが、これは変換速度、基質溶解性を増大させ、そして微生物の増殖の可能性および反応媒体の粘度を低減する一助となる。
【０００５】
好熱菌は、耐熱性酵素を産生するよい候補となり得るが、収率が低いことや、高温発酵装置が必要となる可能性があることから、実用的でない場合が多い。この問題を克服するために、遺伝子工学による分子学的アプローチが、原核細胞系を介した経済的な大量生産のための高レベルの発現を達成する良好な代替手段となっている。これまでのところ、数種の耐熱性リパーゼのクローニングおよび異種宿主の細胞内での発現に成功している。
【０００６】
基礎研究および商業的目的において、原核細胞系における外来タンパク質の発現が、高レベルの発現を達成するために最も広く用いられている。発現ベクターおよび宿主は、クローニングされた遺伝子の最大限の発現を達成するのに重要な問題であり、外来遺伝子の分子学的クローニングは当該遺伝子の発現の成功を保証するものではない。
【非特許文献１】Leow et al., Biosci Biotechnol Biochem. 2004;68(1):96〜103
【非特許文献２】Frangioni and Neel, Anal Biochem. 1993;210(1):179〜87
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、工業用途に適した耐熱性リパーゼを効率的に産生することを目的の１つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明においては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術による耐熱性リパーゼの迅速なクローニング、および様々な種類のプロモーターを用いて原核細胞系により発現される耐熱性リパーゼＴ１遺伝子の操作を提供する。
【０００９】
本発明において用いられる細菌株、ジオバチルス属Ｔ１株（Geobacillus sp.Ｔ１株）は、耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子を提供するものであり、本発明はこれを製造する方法を含む。本発明はまた、耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子を発現する宿主細胞を包含する形質転換体、およびその製造方法を提供する。
【００１０】
すなわち、本発明は、パーム油廃液から単離され、リパーゼを産生することができる細菌、ジオバチルスＴ１株の生物学的に純粋な菌株であって、該細菌が、以下の特性を有するものに関する：
a)活動温度範囲および活動温度
活動温度範囲が２０℃から７５℃であり、最適温度が少なくとも７０℃であり、
b)活動ｐＨ
ｐＨ５〜６の範囲の活動ｐＨを有し、
c)形態学的および生理学的活性
好気性、グラム陽性、内生胞子形成性の桿菌状細菌であり、幅０．８〜１．０μｍおよび長さ２．５〜６．０μｍを有し、２％のＮａＣｌに耐性であり、クエン酸および硝酸塩試験について陽性であり、
d)酸性活性
作用糖類として、Ｄ−フルクトース、Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロースを有し、このうちＤ−フルクトースに対して高い酸性活性を有し、
f)細胞脂肪酸
イソ分枝ペンタデカン酸（イソＣ１５）、ヘキサデカン酸（イソＣ１６）およびヘプタデカン酸（イソＣ１７）を７８．３３％の割合で有し、このうちイソＣ１５およびイソＣ１７が豊富であり、
g)分類学的同定
Geobacillus kaustophilus(ＤＳＭ７２６３Ｔ)と６４．９％の類似性を有し、およびGeobacillus thermoleovorans (ＤＳＭ５３６６Ｔ)と６８．８％の類似性を有し、
h)種の同定
リボプリント（RiboPrint）パターンを用いた場合、種の同一性は０％である。
【００１１】
本発明はまた、ジオバチルスＴ１株が、パーム油廃液から、ＮａＣｌを含むｐＨ７．０の強化培地中に６０℃の温度にて単離されたものである、上記菌株に関する。
本発明はさらに、ジオバチルスＴ１株が、ＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen：ドイツ微生物・細胞カルチャーコレクション)に、ＤＳＭ１７１３９として寄託されたものである、上記菌株に関する。
本発明はさらにまた、ジオバチルスＴ１株を同定する方法であって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含み、ここで耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅が、以下の工程：
a)少なくとも９４℃での少なくとも４分間の予備変性工程、
b)少なくとも９４℃での少なくとも１分間の変性工程、
c)５６℃〜７０℃での少なくとも２分間のアニーリング工程、
d)少なくとも７２℃での少なくとも１分間の伸長工程、
e)少なくとも９４℃での少なくとも７分間の最終伸長工程
を含む方法に関する。
【００１２】
また、本発明は、ＰＣＲ増幅サイクルが、２５〜４５サイクル反復される、上記同定方法に関する。
さらに、本発明は、ジオバチルスＴ１株を、栄養ブロス０．８％、寒天１．５％、ビクトリアブルー０．０１％、トリオレイン０．２５％（ｖ／ｖ）を含むトリオレイン寒天にて培養することを含む、リパーゼを産生する方法に関する。
さらにまた、本発明は、ｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクターを用いて、単離された組換え耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子を作製する方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、以下の特徴を有する、シグナルペプチドを有する融合タンパク質を製造する方法に関する：
a)ｐＢＡＤ、ｐＧＥＸ−４Ｔ１、ｐＲＳＥＴ ＣまたはｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを含む原核細胞系における、シグナルペプチドを有する耐熱性Ｔ１リパーゼの発現、
b)ａｒａＣ、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃまたはｔａｃプロモーターを有すること、
c)ｔａｃプロモーターにより制御されているｐＧＥＸ−４Ｔ１からの高レベルの発現を有すること、
d)０．０５ｍＭのＩＰＴＧで少なくとも８時間誘導した場合に、１１，７０８Ｕ／ｌのリパーゼ活性を有すること、
e)２０％〜２８％のＴ１リパーゼ回収率および少なくとも７．３倍のＴ１リパーゼ精製倍率を有すること、
f)少なくとも３０．１９２Ｕ／ｍｇの精製融合リパーゼ活性を有すること。
【００１４】
本発明はさらに、以下の特徴を有する、シグナルペプチドを有しない融合タンパク質を製造する方法に関する：
a)０．０２５ｍＭのＩＰＴＧで少なくとも１２時間誘導した場合に４１，９０２Ｕ／ｌのリパーゼ活性を有すること、
b)少なくとも２７９倍の発現レベルの増加を有すること、
c)７０％〜７５％のリパーゼ回収率、および少なくとも２．８７倍の精製倍率を有すること、
d)少なくとも２９７．９２９Ｕ／ｍｇの精製融合リパーゼ活性を有すること、
e)Ｔ１成熟リパーゼを有すること。
【００１５】
本発明はさらにまた、以下の特徴を有する、Ｔ１成熟リパーゼを製造する方法に関する：
a)活動温度活性および安定性
６０℃〜８０℃の範囲の温度で活動し、最適温度が約７０℃であること、
b)活動ｐＨ活性および安定性
ｐＨ６〜１０で３０分間活動し安定であり、最適なアルカリｐＨが９であること、
c)作用金属イオン
Ｎａ＋、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋で作用し、
Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋に対して少なくとも３０分間安定であり、
Ｃｕ２＋およびＦｅ２＋で、それぞれ約５２％および６０％のリパーゼ活性を少なくとも３０分間有すること、
d)作用界面活性剤のリパーゼ活性への影響
６３％〜８８％の割合で、０〜３０分間作用すること、
e)基質特異性
オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、パーム油およびトリグリセリドなどの天然油に作用し、天然油が好ましい基質であること、
f)リパーゼ阻害剤
金属キレート剤、還元剤、セリンプロテアーゼ阻害剤およびアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤と共に作用し、かつ触媒メカニズムがセリンおよびアスパラギン酸残基に関連すること。
【００１６】
また、本発明は、工業用途における触媒として使用するための、ジオバチルスＴ１株から単離された耐熱性Ｔ１リパーゼの製造方法に関する。
さらに、本発明は、以下の特性を有する、安定性のある耐熱性Ｔ１リパーゼを製造する方法に関する：
a)融合リパーゼについては６５℃、成熟リパーゼについては７０℃の最適温度を有すること、
b)８〜９の間の最適ｐＨを有すること、
c)ｐＨ６〜１２で安定性を有すること。
さらにまた、本発明は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合リパーゼＴ１を製造する方法であって、該融合リパーゼＴ１が約６３ｋＤａの分子量を有する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ジオバチルス属Ｔ１株のスクリーニング
ジオバチルス属Ｔ１株の単離および同定は好熱菌種に関する本発明の基礎となるものである。ジオバチルス属Ｔ１株の培養物は、Enzyme and Microbial Technology Research Department of Biochemistry and Microbiology, Faculty of Science and Environmental Studies, Universiti Putra Malaysiaから得ることができる。
【００１８】
マレーシアのパーム油廃液からリパーゼ産生菌をスクリーニングする過程で、トリオレイン寒天プレートにおいて陽性の結果をもたらすＴ１を単離した。このリパーゼ産生菌の系統学的な位置を確認するために、形態学的および生理学的特徴、１６Ｓ ｒＲＮＡ分析、細胞脂肪酸分析、ＤＮＡ組成分析、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション分析およびリボプリント分析を行った。
【００１９】
ジオバチルス属Ｔ１株の単離および同定
サンプルは、マレーシアのセランゴールにて、パーム油廃液から採取した。ジオバチルス属Ｔ１株は、６０℃、１５０ｒｐｍの振盪条件下の、ＮａＣｌ ０．２％、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ０．０４％、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０７％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０５％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．０３％、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０３％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．０５％、そして唯一の炭素源としてオリーブ油（２％）を含む強化培地から単離した。これを、リパーゼ産生菌のスクリーニングのためにトリオレイン寒天プレート上に播種した。
【００２０】
本発明の別な態様においては、ジオバチルスＴ１株は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含む方法により同定することができる。典型的には耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ増幅は、
a)少なくとも９４℃での少なくとも４分間の予備変性工程、
b)少なくとも９４℃での少なくとも１分間の変性工程、
c)５６℃〜７０℃での少なくとも２分間のアニーリング工程、
d)少なくとも７２℃での少なくとも１分間の伸長工程、
e)少なくとも９４℃での少なくとも７分間の最終伸長工程
の各工程を含むことができる。また、ＰＣＲ増幅サイクルは、２５〜４５サイクル反復してもよい。
【００２１】
形態学的研究のために、純粋な細菌株を栄養寒天プレート上に画線し、６０℃でインキュベートした後、グラム染色を施し、染色結果を光学顕微鏡で観察した。形態学的および生理学的特徴を、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen：ドイツ微生物・細胞カルチャーコレクション）に送付し、本菌株は同機関に、ＤＭＳ１７１３９として寄託された。生理学的特徴の検討は、カタラーゼおよびオキシダーゼ試験、嫌気性増殖、Voges-Proskauer試験、３０℃、４０℃および７０℃での増殖、ｐＨ５．７、ＮａＣｌ２％、５％またはリゾチームブロスを含む培地での増殖、Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトールおよびＤ−フルクトースの発酵、デンプン、ゼラチン、カゼインおよびＴｗｅｅｎ８０の加水分解、チロシンの分解、クエン酸塩およびプロピオン酸塩の利用、硝酸塩の還元、インドールの産生、フェニルアラニンデアミナーゼおよびアルギニンジヒドロラーゼ試験を行った。脂肪酸は、Sherlock微生物同定システムの指示書にしたがって抽出および分析した。
【００２２】
１６Ｓ ｒＤＮＡを、２個のユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ産物を精製した。精製したＰＣＲ産物を、TOPO TA PCR 2.1クローニングベクター（Invitrogen）にクローニングした。組換えプラスミドを抽出し、そして次に、ABI PRISM 377 ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems）を用いてシーケンシングした。
【００２３】
染色体ＤＮＡを単離および精製し、そしてＧ＋Ｃ含量を、クロマトグラフィー条件を用いて決定した。ＤＮＡを加水分解し、そして得られたヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣで分析した。ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションは、２６００型分光光度計を用いて分析した。
【００２４】
標準化自動リボタイピング（standarized, automated ribotyping）は、Ｑｕａｌｉｃｏｎ（登録商標）リボプリンター（RiboPrinter）システムを用いて行った。リボプリンターシステムは、リボタイピングのための分子処理工程を、独立した自動機器内で組み合わせたものである。工程は、細胞溶解、制限酵素ＥｃｏＲ１による染色体ＤＮＡの消化、電気泳動による断片の分離、ＤＮＡ断片のナイロンメンブレンへのトランスファー、大腸菌由来のｒｒｎＢオペロンから生成したプローブへのハイブリダイゼーション、ｒｒｎオペロン配列を含む断片に対するプローブの化学発光による検出、画像検出およびリボプリントパターンのコンピュータ解析を含む。
【００２５】
単離したＴ１株は、好気性、グラム陽性、内生胞子形成性の桿菌であった（幅０．８〜１．０μｍおよび長さ２．５〜６．０μｍ）（図１）。Ｔ１株のＤＮＡ塩基組成は、およそ５２．６％ｍｏｌＧ＋Ｃであった。円筒形の内生胞子は、菌端の膨大した胞子嚢に出現する。Ｔ１株は７０℃でさえも増殖するが、３０℃および４０℃では増殖は認められなかった。同株は、２％までのＮａＣｌの存在に耐性であった。酸は、Ｄ−フルクトースからは産生されたが、Ｄ−グルコースおよびＤ−マンニトールからは産生されなかった。クエン酸塩および硝酸塩試験の結果は陽性を示した。形態学的および生理学的特徴は、表１および２に示してある。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
＋：陽性、−：陰性、ｗ：弱い反応、n.d.：検出せず、n.g.：増殖せず
【００２８】
【表３】
＋：陽性、−：陰性、ｗ：弱い反応、n.d.：検出せず、Ｃ：円筒形、Ｏ：楕円形、Ｔ：菌端。分類は以下のように示した：１．Geobacillus zalihaii、２．Geobacillus thermoleovorans（Zarilla & Perry, Syst Appl Microbiol. 1987;9:258〜264）、３．Geobacillus kaustophilus（White et al., Antonie Van Leeuwenhoek. 1993-94;64(3-4):357〜86）。
【００２９】
１５１９ｂｐの完全１６ＳｒＤＮＡ配列（ＡＹ１６６６０３：配列番号１）は、以下のように決定した。
【表４】
【００３０】
Ｔ１株の細胞脂肪酸の大半はイソ脂肪酸であった（表３）。このうち、イソ分枝ペンタデカン酸（イソＣ１５）、ヘキサデカン酸（イソＣ１６）およびヘプタデカン酸（イソＣ１７）が、全脂肪酸の７８．３３％を占めており、特にイソＣ１５およびイソＣ１７が豊富であった。この脂肪酸プロファイルにより、ジオバチルス属は、Bacillus Alicyclobacillus、Brevibacillus、Aneurinibacillus、SulfobacillusおよびThermobacillus属の他の中温菌および好熱菌と明確に区別される。Ｔ１株およびGeobacillus thermoleovorans ＤＳＭ５３６６Ｔは、Bacillus ｒＲＮＡ群５の典型的な脂肪酸プロファイルを共有するが、表３に示すとおり、イソＣ１６の脂肪酸組成における％により区別することができる。
【００３１】
【表５】
【００３２】
ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションの検討を、Ｔ１株と系統学的な近縁種との間の分類上の関連性を確認するために行った。Ｔ１株と標準株Geobacillus kaustophilus ＤＳＭ７２６３ＴおよびGeobacillus thermoleovorans ＤＳＭ５３６６Ｔとの間のゲノムＤＮＡ／ＤＮＡの近縁性は、それぞれ６４．９および６８．８であった（表４）。
【表６】
【００３３】
ＤＮＡ／ＤＮＡ再会合値は、種の定義のためのＤＮＡ／ＤＮＡ類似性の閾値である７０％を下回った。リボプリント分析を、Ｔ１株の近縁関係（affiliation）の決定のために行った。しかしながら、Ｔ１株のリボプリントパターンは、Ｄｕｐｏｎｔ同定ライブラリーによっては、種のレベルでの同定（＞０．８５）がなされるようには同定されなかった。そのリボプリントパターンは、Geobacillus kaustophilus ＤＳＭ７２６３Ｔに対して最も高い類似性を示した（０．６９）。Geobacillus therleovorans ＤＳＭ５３６６Ｔのパターンの類似性はいくらか低かった（０．５７）。Geobacillus kaustophilus ＤＳＭ７２６３ＴおよびGeobacillus thermoleovorans ＤＳＭ５３６６Ｔのパターンは、０．６４のバイナリーな類似性（binary similarity）を示した。
【００３４】
結果として、Ｔ１株は、形態学的および生理学的検討、細胞脂肪酸組成、ＤＮＡ組成、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションおよびリボプリント分析により、新種の成員として認められるに値するものである。したがって、我々は、Ｔ１Ｔ株について、新種、Geobacillus zalihae sp. nov.の創設を提案する（za.li.’hae N.L. gen. n. zalihae of zalihaは、極限微生物について多大な貢献を行ったUniversiti Putra Malaysiaの科学者に敬意を表したものである）。細胞は桿菌状であり、幅０．８〜１．０μｍ、長さ２．５〜６．０μｍの、グラム陽性細菌である。菌端芽胞は円筒形であり、胞子嚢は膨大している。Ｔ１株のＤＮＡ塩基組成は、およそ５２．６％ｍｏｌＧ＋Ｃであった。同株は、多量のイソ脂肪酸を含んでおり、このうちイソＣ１５およびイソＣ１７が豊富であった（７７．１９％）。増殖は好気性であり、７０℃でも増殖し続け、２％までのＮａＣｌに耐性があるが、嫌気性に増殖することはできない。カタラーゼおよび硝酸塩試験は陽性である。Ｄ−グルコースおよびＤ−マンニトールから酸は産生しないが、クエン酸塩を利用することができる。デンプンを加水分解するが、ゼラチンおよびカゼインは加水分解しない。
【００３５】
ジオバチルス属Ｔ１株からの耐熱性リパーゼ遺伝子のクローニングおよびシーケンシング
細菌株およびプラスミド
耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドｐＢＡＤ／Ｔ１（非特許文献１）を、サブクローニングの給源として用いた。大腸菌株はＬＢ培地中、３７℃で増殖させた。ｐＲＳＥＴ Ｃ（Invitrogen）、ｐＥＴ２２ｂ（＋）（Novagen）およびｐＧＥＸ−４Ｔ１（Amersham Bioscience、United Kingdom、England）を、サブクローニングおよび発現に用いた。
【００３６】
ＤＮＡ操作
プラスミドＤＮＡは、QIAGEN miniprep spin kit（QIAGEN、Hilden、Germany）により、製造者の説明書にしたがって単離した。ＰＣＲ産物は、GeneClean Kit（Qbiogene、Carlsbad、USA）により、供給者の説明通りに精製した。大腸菌のコンピテント細胞は、慣用のＣａＣｌ２法により調製した。
【００３７】
耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子のサブクローニングおよび発現
Ｔ１リパーゼ遺伝子のサブクローニングは、制限酵素サイトＢａｍＨ１／ＥｃｏＲ１を組み込んだプライマーのセット、すなわち、Ｔ１リパーゼのオープンリーディングフレームをサブクローニングするためのｐＧＥＸ−Ｆｏｒ：5’-GAA GGG ATC CGT GAT GAA ATG CTG TCG GAT TAT G-3’（配列番号２）およびｐＧＥＸ−Ｒｅｖ：5’-AAT AGA ATT CTT AAG GCT GCA AGC TCG CCA A-3’（配列番号３）、およびＴ１成熟リパーゼ遺伝子をサブクローニングするためのＥＨ２−Ｆｏｒ：5’-GAC GGG ATC CGC ATC CCT ACG CGC CAA TGA T-3’（配列番号４）およびｐＧＥＸ−Ｒｅｖ：5’-AAT AGA ATT CTT AAG GCT GCA AGC TCG CCA A-3’（配列番号３）を設計することにより行った。ライゲーションしたプラスミドを大腸菌株を形質転換するのに用い、適切な抗生物質を含むトリブチリンＬＢ寒天プレートによりスクリーニングした。組換えプラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１（Ｄｅ３）ｐｌｙｓＳを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加した２００ｍｌのＬＢ培地を含む１ｌのブルーキャップボトル中、ロータリーシェーカー上（２００ｒｐｍ）、３７℃で増殖させた。
【００３８】
シグナルペプチドを有する組換えクローンとシグナルペプチドを有しない組換えクローンとを、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により、ＯＤ６００ｎｍ〜０．５にて、様々な誘導期間（０、４、８、１２、２０、２８、３６および４４時間）誘導した。これを、ＩＰＴＧの濃度（ｗ／ｏ、０．０２５、０．０５、０．１、０．５、１．０、１．５および２．０ｍＭ）および誘導ＯＤ６００ｎｍ（０．２５、０．５０、０．７５および１．００）を変化させることにより、さらに最適化した。培養物（１０ｍｌ）を遠心分離により回収し、５０ｍＭのリン酸カルシウムバッファー（ｐＨ７．０）２ｍｌで再懸濁し、その後超音波処理（Branson 250 sonifier：出力２、デューティサイクル３０％、２分）を施し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分）により澄明化した。粗製透明溶解液をリパーゼアッセイに用いた。
【００３９】
電気泳動
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを１２％のゲル上で行い、これによりタンパク質を分析した。広範囲のタンパク質標準物質（MBI Fermentas、St. Leon-Rot、Germany）を、分子量マーカーとして用いた。
【００４０】
Ｔ１リパーゼの精製
４００ｍｌの組換え培養物を遠心分離により回収し、超音波処理の前に４０ｍｌに濃縮した。粗製細胞溶解液を、１０ｍｌのカラム容積を有する、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）で平衡化したグルタチオン−セファロースＨＰカラム（ＸＫ１６／２０）に、０．２ｍｌ／分の流速で負荷した。カラムは、タンパク質が検出されなくなるまで同じバッファーで洗浄した。結合したリパーゼは、１０ｍＭの還元グルタチオンが添加されたトロンビン開裂バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍｌのＮａＣｌおよび０．３３ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ８．４）により溶出した。融合タンパク質を２０ーＣにて２０時間トロンビン開裂に供し、そしてバッファーをセファデックスＧ−２５に交換した後、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）に対して透析した。ＧＳＴタグおよびトロンビン酵素は、グルタチオン−セファロースＨＰ、ＨｉＴｒａｐグルタチオン４ＦＦおよびＨｉＴｒａｐベンズアミジンを連続的に用いることによりさらに除去した。
【００４１】
シグナルペプチドを含むＴ１リパーゼの発現は、それぞれａｒａＣ、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃまたはｔａｃプロモーターの制御下にある、ｐＢＡＤ、ｐＲＳＥＴ Ｃ、ｐＥＴ２２ｂ（＋）またはｐＧＥＸ−４Ｔ１を含む原核細胞系によって行った。これらのうち、高レベルの発現を誘導することに関して、ｔａｃプロモーターの制御下にあるｐＧＥＸ−４Ｔ１発現系により比較的高レベルの発現が達成され、これをさらなる研究のために選択した。シグナルペプチドを有する組換えプラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ１を含む組換えクローンの可溶性たんぱく質を増大させるために、簡単な最適化を行った。合計１１，７０８Ｕのリパーゼ活性が、０．０５ｍＭのＩＰＴＧによりＯＤ６００ｎｍ〜０．５にて８時間誘導した場合に検出され、このときの比活性は３０．１９２Ｕ／ｍｇであった（表５）。
【００４２】
【表７】
注記：組換えプラスミドｐＧＥＸ／Ｔ１またはｐＧＥＸ／Ｔ１Ｓを含む宿主ＢＬ２１（Ｄｅ３）ｐｌｙｓＳを、１ｍＭのＩＰＴＧによりＯＤ６００ｎｍ〜０．５にて種々の時間誘導した。括弧内の数字はそれぞれのパラメータの最適値を示す。総活性は、１ｌの培養物をベースに算出した。
【００４３】
理論的には、Ｔ１リパーゼをＧＳＴ融合タンパク質として原核細胞系で発現させることにより、アフィニティークロマトグラフィーを用いた組換えリパーゼの迅速な精製が可能となる。しかしながら、我々は、高レベルの活性が検出されたにもかかわらず、組換えリパーゼの可溶性画分がグルタチオンセファロース４ＦＦに結合しなかったため、これを精製することができなかった。これは、ＧＳＴおよびシグナルペプチドの高疎水性領域により、立体構造の変化やＧＳＴドメインの不適切な折畳みが起こるためと思われた。幾つかのケースでは、ＧＳＴ融合タンパク質は、完全にまたは部分的に不溶性であった。さらに、高レベルの発現が、部分的な、高度に不溶性の融合タンパク質の不適切な折畳みに寄与し、それにより融合タンパク質のアフィニティーカラムへの結合が妨げられる可能性があった。
【００４４】
FrangioniおよびNeel（非特許文献２）によれば、ＧＳＴ融合タンパク質の不溶性はよく起こるものである。このため、サルコシル溶解法を、部分的に不適切に折り畳まれた活性なＴ１融合リパーゼを可溶化するのに用いた。可溶化融合タンパク質を正しい折畳みに折畳み直し、これによりＧＳＴ融合タンパク質がアフィニティーグルタチオンセファロース４ＦＦに結合できるようにする目的で、非イオン界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を、サルコシルを抑制（sequester）するために用いた。表６に示すとおり、融合タンパク質を陰イオン界面活性剤と非イオン界面活性剤とで処理することにより、約２５％の回収率、および７．３培の精製倍率が得られた。
【００４５】
【表８】
注記：融合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーでの結合のために、２％の陰イオン界面活性剤サルコシルと１％の非イオン界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とにより可溶化した。
【００４６】
シグナルペプチドは、真核細胞および原核細胞の両方において、ほぼすべてのタンパク質が分泌経路に入るのを制御しており、タンパク質が膜を介して輸送されるときに切除される。しかしながら、シグナルペプチドは、耐熱性Ｔ１リパーゼの構造遺伝子に寄与しない。したがって、我々は、マトリックス支持体に不動化されたグルタチオンへのＧＳＴ融合タンパク質のアフィニティー結合を妨げることなく、ＧＳＴタグおよびＴ１成熟リパーゼの折畳みおよび相互作用を改善する目的で、シグナルペプチドを除いてＴ１リパーゼを発現させることを試みた。
【００４７】
合計２８個のアミノ酸残基がＧＳＴ部分をカバーするＴ１リパーゼの動きを制限していたため、シグナルペプチドの除去は融合リパーゼを硬化させた。Ｔ１リパーゼ遺伝子の操作は、発現レベルを、誘導時間および誘導剤濃度について、それぞれ４．２５倍および２．７０倍と顕著に改善した（表５）。発現のさらなる最適化により、０．０２５ｍＭのＩＰＴＧでＯＤ６００ｎｍ〜０．７５にて１２時間誘導した場合、培養物において４１，９０２Ｕ／ｌの発現レベルが得られた。これは、野生型ジオバチルス属Ｔ１株と比較した場合、発現レベルの約２７９倍の増加である。
【００４８】
融合タンパク質からシグナルペプチドを除去することにより、活性なＴ１リパーゼの収率が改善されるばかりでなく、また、グルタチオンセファロース４ＦＦカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによる、均質になるまでの精製が簡易化された（図２）。表７に示すとおり、およそ７２．５５％の回収率と、２．８７倍の精製倍率が得られた。融合リパーゼの精製により、比活性が１０３．７６２Ｕ／ｍｇ（粗製細胞溶解液）から２９７．９２９Ｕ／ｍｇ（精製融合リパーゼ）へと増加した。
【００４９】
Ｔ１成熟リパーゼは、次の精製工程により得た（表８）。融合リパーゼは、トロンビンプロテアーゼにより、２０℃、２０時間で切断し、そして透析の前に、バッファーをＰＢＳ（ｐＨ７．３）に交換し、かつ遊離グルタチオンを除去するためにセファデックスＧ−２５に供した。ＧＳＴタグおよびトロンビン酵素を除去するために、これをグルタチオンセファロースＨＰ、ＨｉＴｒａｐグルタチオンセファロース４ＦＦおよびベンズアミジンＦＦ（high sub）でのアフィニティークロマトグラフィーに順次供した。
【００５０】
【表９】
注記：融合タンパク質の直接精製は、界面活性剤を一切含まないアフィニティーグルタチオンセファロース４ＦＦカラムにより行った。
【００５１】
【表１０】
注記：Ｔ１成熟リパーゼの精製は、アフィニティークロマトグラフィーによって行った。アフィニティー１は、グルタチオンセファロースＨＰを表す。アフィニティー２は、連続して設置されたグルタチオンセファロースＨＰ、ＨｉＴｒａｐグルタチオンセファロース４ＦＦおよびＨｉｔｒａｐベンズアミジン（high sub）を表す。
【００５２】
Ｔ１融合リパーゼおよびＴ１成熟リパーゼの特徴化
Ｔ１リパーゼを、４０℃から８０℃までの範囲の５℃間隔の温度で、３０分間、酵素活性について試験した。温度安定性試験は、種々の温度で様々な時間について行った。組換えＴ１リパーゼはまた、ｐＨ活性および安定性の決定のためにｐＨ４〜１２の範囲の広範囲のｐＨ値に保った。バッファー系として、５０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ４〜６）、リン酸カルシウムバッファー（ｐＨ６〜８）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８〜９）、グリシン−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ９〜１１）、およびＮａ２ＨＰＯ３／ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１１〜１２）を用いた。エフェクター（金属イオン、界面活性剤）および阻害剤の効果は、ペプスタチン（１．０ｍＭ）を除き、それぞれ１ｍＭおよび５ｍＭの濃度で、５０℃、３０分の条件で検討した。
【００５３】
温度の活性および安定性に対する影響は、種々の温度で３０分間試験した。６０℃〜８０℃の温度範囲で最も活性が高く、最大活性は７０℃で得られた（図２）。リパーゼの活性および安定性に対するｐＨの影響は、種々のｐＨで３０分間、振盪条件下で試験した。図３に示すとおり、広いｐＨ範囲、特にｐＨ６〜１０で活性があり、オリーブ油を基質に用いた場合、最適ｐＨは９であった。ｐＨによる処理により、Ｔ１成熟リパーゼがアルカリｐＨで比較的安定であることが示された（図４）。
【００５４】
終濃度１ｍＭの金属イオンの影響を、５０℃、３０分間の処理で試験した。図５に示すとおり、Ｎａ＋、Ｍｎ２＋およびＫ＋は、リパーゼ活性を、１５分間の処理の後で若干高めた。Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｋ＋およびＺｎ２＋、特にＣａ２＋は、３０分間の処理の後でさえ、酵素活性を有意に低下させることなく安定化効果を示した。しかしながら、Ｆｅ２＋およびＣｕ２＋は、３０分後にリパーゼ活性を６０％および５２％と、強く抑制した。リパーゼ活性への界面活性剤の影響は、０．１％の濃度で検討した（図６）。０．１％のＴｗｅｅｎの添加により明確な向上が見られ、特にＴｗｅｅｎ８０は、０および３０分の処理の後、リパーゼ活性をそれぞれ６３％および８８％増加させた。
【００５５】
基質のリパーゼ活性への影響について、種々のトリグリセリドおよび天然油を、基質特異性を検討するために用いた。図７は、Ｔ１リパーゼにとって、天然油が、トリグリセリドに比べて基質として好ましいことを示している。同酵素は、オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油およびパーム油などの長い炭素鎖を有する天然油に対してより選択的であった。これは、Ｔ１リパーゼの工業用触媒としての良好な可能性を示すものである。
【００５６】
いくつかの金属キレート剤、還元剤、セリンプロテアーゼ阻害剤およびアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤などの阻害剤のリパーゼ活性への影響を、Ｔ１成熟リパーゼに対する抑制効果の検討に用いた。ＥＤＴＡが５ｍＭにおいてもリパーゼ活性にわずかな影響しか示さなかったことから、同酵素は金属酵素ではなかった。また、β−メルカプトエタノールおよびＤＴＴなどの還元剤は、Ｔ１リパーゼに対し、わずかな抑制効果しか示さなかった。一方、同リパーゼは、５ｍＭのＰＭＳＦおよび１ｍＭのペプスタチンの添加により強く抑制され、これはセリンおよびアスパラギン酸残基が触媒メカニズムに重要な役割を演じていることを示すものである（図８）。なお、Bacillus stearothermophilusからのＰ１リパーゼは、１０ｍＭのＰＭＳＦにより７７％の抑制を示した（Sunchaikul et al., Protein Expr Purif. 2001;22(3):388〜98）。
【００５７】
精製したＴ１融合リパーゼおよびＴ１成熟リパーゼの特性を、リパーゼ活性に対するＧＳＴタグの影響を検討するために比較した。両方のリパーゼを精製し、その生理化学的特性を検討した（表９）。融合パートナーの存在により、最適温度およびｐＨは、それぞれ６５℃およびｐＨ８と若干低下した。一方、金属イオンおよび基質については、有意な差異は観察されなかった。しかしながら、Ｔｗｅｅｎ２０〜８０は、Ｔ１成熟リパーゼに対して向上効果をもたらしたが、融合パートナーの存在下でのみ安定であった。いずれのリパーゼも、試験した濃度のセリンプロテアーゼ阻害剤およびアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤により抑制された。
【００５８】
【表１１】
【００５９】
ＧＳＴタグは、シグナルペプチドを有しないＴ１成熟リパーゼに硬く融合されているため、３次元構造および生物活性に最小限の影響を与えたにすぎず、生理化学的特性に有意な変化をもたらさなかった。Ｔ１成熟リパーゼの方が、わずかにｐＨ１単位および５℃高かった最適ｐＨおよび最適温度以外は、Ｔ１融合リパーゼおよび成熟リパーゼとの間に有意な差異はなかった。Ｔ１融合リパーゼおよび成熟リパーゼの、セリンプロテアーゼ阻害剤およびアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤に対する挙動は同じであった。このことから、我々は、融合タンパク質の精製が簡易化され、より大量かつ経済的に製造されるＧＳＴタグと融合したＴ１リパーゼを、工業用途、特に温水洗濯用の洗剤向けに提案する。さらに、高濃度の融合リパーゼにおける凝集により形成される融合タンパク質の沈殿は、これを、融合リパーゼのpIからかけ離れたｐＨ９のバッファーに溶解することにより、容易に可溶化された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によるＴ１リパーゼ、特にＴ１融合リパーゼは、耐熱性であり、精製が容易であるため、工業用途、特に温水洗濯用の洗剤などに適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】Ｔ１株の顕微鏡写真を示す写真図である。
【図２】成熟Ｔ１リパーゼの温度による活性を示す図である。精製Ｔ１リパーゼを、種々の温度で３０分間、２５０ｒｐｍの振盪速度で、オリーブ油を基質としてアッセイした。
【図３】Ｔ１リパーゼの活性試験を示す図である。同酵素を、ｐＨ４〜ｐＨ１２の様々なｐＨで、比色法によりアッセイした。用いた記号は以下のとおりである。◆：酢酸バッファー、△：リン酸カルシウムバッファー、■：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、×：グリシンバッファー、○：Ｎａ２ＨＰＯ３／ＮａＯＨバッファー。安定性試験では、Ｔ１リパーゼは、様々なｐＨ（１：１、ｖ／ｖ）でのプレインキュベーションの後に、７０℃で３０分間アッセイした。
【００６２】
【図４】Ｔ１リパーゼの安定性を示す図である。同酵素を、ｐＨ４からｐＨ１２までの様々なｐＨで３０分間前処理した後に、Ｔ１リパーゼの残存活性をアッセイした。用いた記号は以下のとおりである。◆：酢酸バッファー、△：リン酸カルシウムバッファー、■：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、×：グリシンバッファー、○：Ｎａ２ＨＰＯ３／ＮａＯＨバッファー。安定性試験では、Ｔ１リパーゼは、様々なｐＨ（１：１、ｖ／ｖ）でのプレインキュベーションの後に、７０℃で３０分間アッセイした。
【図５】リパーゼ活性に対する金属イオンの影響を示した図である。
【図６】リパーゼ活性に対する界面活性剤の影響を示した図である。
【図７】リパーゼ活性に対する基質の影響を示した図である。
【図８】リパーゼ活性に対する阻害剤の影響を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーム油廃液から単離され、リパーゼを産生することができる細菌、ジオバチルスＴ１株の生物学的に純粋な菌株であって、該細菌が、以下の特性を有する前記菌株：
a)活動温度範囲および活動温度
活動温度範囲が２０℃から７５℃であり、最適温度が少なくとも７０℃であり、
b)活動ｐＨ
ｐＨ５〜６の範囲の活動ｐＨを有し、
c)形態学的および生理学的活性
好気性、グラム陽性、内生胞子形成性の桿菌状細菌であり、幅０．８〜１．０μｍおよび長さ２．５〜６．０μｍを有し、２％のＮａＣｌに耐性であり、クエン酸および硝酸塩試験について陽性であり、
d)酸性活性
作用糖類として、Ｄ−フルクトース、Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロースを有し、このうちＤ−フルクトースに対して高い酸性活性を有し、
f)細胞脂肪酸
イソ分枝ペンタデカン酸（イソＣ１５）、ヘキサデカン酸（イソＣ１６）およびヘプタデカン酸（イソＣ１７）を７８．３３％の割合で有し、このうちイソＣ１５およびイソＣ１７が豊富であり、
g)分類学的同定
Geobacillus kaustophilus(ＤＳＭ７２６３Ｔ)と６４．９％の類似性を有し、およびGeobacillus thermoleovorans (ＤＳＭ５３６６Ｔ)と６８．８％の類似性を有し、
h)種の同定
リボプリントパターンを用いた場合、種の同一性は０％である。
【請求項２】
ジオバチルスＴ１株が、パーム油廃液から、ＮａＣｌを含むｐＨ７．０の強化培地中に６０℃の温度にて単離されたものである、請求項１に記載の生物学的に純粋な菌株。
【請求項３】
ジオバチルスＴ１株が、ＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen：ドイツ微生物・細胞カルチャーコレクション)に、ＤＳＭ１７１３９として寄託されたものである、請求項１に記載の生物学的に純粋な菌株。
【請求項４】
ジオバチルスＴ１株を同定する方法であって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含み、ここで耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅が、以下の工程：
a)少なくとも９４℃での少なくとも４分間の予備変性工程、
b)少なくとも９４℃での少なくとも１分間の変性工程、
c)５６℃〜７０℃での少なくとも２分間のアニーリング工程、
d)少なくとも７２℃での少なくとも１分間の伸長工程、
e)少なくとも９４℃での少なくとも７分間の最終伸長工程
を含む、前記方法。
【請求項５】
ＰＣＲ増幅サイクルが、２５〜４５サイクル反復される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ジオバチルスＴ１株を、栄養ブロス０．８％、寒天１．５％、ビクトリアブルー０．０１％、トリオレイン０．２５％（ｖ／ｖ）を含むトリオレイン寒天にて培養することを含む、リパーゼを産生する方法。
【請求項７】
ｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクターを用いて、単離された組換え耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子を作製する方法。
【請求項８】
以下の特徴を有する、シグナルペプチドを有する融合タンパク質を製造する方法：
a)ｐＢＡＤ、ｐＧＥＸ−４Ｔ１、ｐＲＳＥＴ ＣまたはｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを含む原核細胞系における、シグナルペプチドを有する耐熱性Ｔ１リパーゼの発現、
b)ａｒａＣ、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃまたはｔａｃプロモーターを有すること、
c)ｔａｃプロモーターにより制御されているｐＧＥＸ−４Ｔ１からの高レベルの発現を有すること、
d)０．０５ｍＭのＩＰＴＧで少なくとも８時間誘導した場合に、１１，７０８Ｕ／ｌのリパーゼ活性を有すること、
e)２０％〜２８％のＴ１リパーゼ回収率および少なくとも７．３倍のＴ１リパーゼ精製倍率を有すること、
f)少なくとも３０．１９２Ｕ／ｍｇの精製融合リパーゼ活性を有すること。
【請求項９】
以下の特徴を有する、シグナルペプチドを有しない融合タンパク質を製造する方法：
a)０．０２５ｍＭのＩＰＴＧで少なくとも１２時間誘導した場合に４１，９０２Ｕ／ｌのリパーゼ活性を有すること、
b)少なくとも２７９倍の発現レベルの増加を有すること、
c)７０％〜７５％のリパーゼ回収率、および少なくとも２．８７倍の精製倍率を有すること、
d)少なくとも２９７．９２９Ｕ／ｍｇの精製融合リパーゼ活性を有すること、
e)Ｔ１成熟リパーゼを有すること。
【請求項１０】
以下の特徴を有する、Ｔ１成熟リパーゼを製造する方法：
a)活動温度活性および安定性
６０℃〜８０℃の範囲の温度で活動し、最適温度が約７０℃であること、
b)活動ｐＨ活性および安定性
ｐＨ６〜１０で３０分間活動し安定であり、最適なアルカリｐＨが９であること、
c)作用金属イオン
Ｎａ＋、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋で作用し、
Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋に対して少なくとも３０分間安定であり、
Ｃｕ２＋およびＦｅ２＋で、それぞれ約５２％および６０％のリパーゼ活性を少なくとも３０分間有すること、
d)作用界面活性剤のリパーゼ活性への影響
６３％〜８８％の割合で、０〜３０分間作用すること、
e)基質特異性
オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、パーム油およびトリグリセリドなどの天然油に作用し、天然油が好ましい基質であること、
f)リパーゼ阻害剤
金属キレート剤、還元剤、セリンプロテアーゼ阻害剤およびアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤と共に作用し、かつ触媒メカニズムがセリンおよびアスパラギン酸残基に関連すること。
【請求項１１】
工業用途における触媒として使用するための、ジオバチルスＴ１株から単離された耐熱性Ｔ１リパーゼの製造方法。
【請求項１２】
以下の特性を有する、安定性のある耐熱性Ｔ１リパーゼを製造する方法：
a)融合リパーゼについては６５℃、成熟リパーゼについては７０℃の最適温度を有すること、
b)８〜９の間の最適ｐＨを有すること、
c)ｐＨ６〜１２で安定性を有すること。
【請求項１３】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合リパーゼＴ１を製造する方法であって、該融合リパーゼＴ１が約６３ｋＤａの分子量を有する、前記方法。
【請求項１】
パーム油廃液から単離され、リパーゼを産生することができる細菌、ジオバチルスＴ１株の生物学的に純粋な菌株であって、該細菌が、以下の特性を有する前記菌株：
a)活動温度範囲および活動温度
活動温度範囲が２０℃から７５℃であり、最適温度が少なくとも７０℃であり、
b)活動ｐＨ
ｐＨ５〜６の範囲の活動ｐＨを有し、
c)形態学的および生理学的活性
好気性、グラム陽性、内生胞子形成性の桿菌状細菌であり、幅０．８〜１．０μｍおよび長さ２．５〜６．０μｍを有し、２％のＮａＣｌに耐性であり、クエン酸および硝酸塩試験について陽性であり、
d)酸性活性
作用糖類として、Ｄ−フルクトース、Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロースを有し、このうちＤ−フルクトースに対して高い酸性活性を有し、
f)細胞脂肪酸
イソ分枝ペンタデカン酸（イソＣ１５）、ヘキサデカン酸（イソＣ１６）およびヘプタデカン酸（イソＣ１７）を７８．３３％の割合で有し、このうちイソＣ１５およびイソＣ１７が豊富であり、
g)分類学的同定
Geobacillus kaustophilus(ＤＳＭ７２６３Ｔ)と６４．９％の類似性を有し、およびGeobacillus thermoleovorans (ＤＳＭ５３６６Ｔ)と６８．８％の類似性を有し、
h)種の同定
リボプリントパターンを用いた場合、種の同一性は０％である。
【請求項２】
ジオバチルスＴ１株が、パーム油廃液から、ＮａＣｌを含むｐＨ７．０の強化培地中に６０℃の温度にて単離されたものである、請求項１に記載の生物学的に純粋な菌株。
【請求項３】
ジオバチルスＴ１株が、ＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen：ドイツ微生物・細胞カルチャーコレクション)に、ＤＳＭ１７１３９として寄託されたものである、請求項１に記載の生物学的に純粋な菌株。
【請求項４】
ジオバチルスＴ１株を同定する方法であって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含み、ここで耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅が、以下の工程：
a)少なくとも９４℃での少なくとも４分間の予備変性工程、
b)少なくとも９４℃での少なくとも１分間の変性工程、
c)５６℃〜７０℃での少なくとも２分間のアニーリング工程、
d)少なくとも７２℃での少なくとも１分間の伸長工程、
e)少なくとも９４℃での少なくとも７分間の最終伸長工程
を含む、前記方法。
【請求項５】
ＰＣＲ増幅サイクルが、２５〜４５サイクル反復される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ジオバチルスＴ１株を、栄養ブロス０．８％、寒天１．５％、ビクトリアブルー０．０１％、トリオレイン０．２５％（ｖ／ｖ）を含むトリオレイン寒天にて培養することを含む、リパーゼを産生する方法。
【請求項７】
ｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクターを用いて、単離された組換え耐熱性Ｔ１リパーゼ遺伝子を作製する方法。
【請求項８】
以下の特徴を有する、シグナルペプチドを有する融合タンパク質を製造する方法：
a)ｐＢＡＤ、ｐＧＥＸ−４Ｔ１、ｐＲＳＥＴ ＣまたはｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを含む原核細胞系における、シグナルペプチドを有する耐熱性Ｔ１リパーゼの発現、
b)ａｒａＣ、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃまたはｔａｃプロモーターを有すること、
c)ｔａｃプロモーターにより制御されているｐＧＥＸ−４Ｔ１からの高レベルの発現を有すること、
d)０．０５ｍＭのＩＰＴＧで少なくとも８時間誘導した場合に、１１，７０８Ｕ／ｌのリパーゼ活性を有すること、
e)２０％〜２８％のＴ１リパーゼ回収率および少なくとも７．３倍のＴ１リパーゼ精製倍率を有すること、
f)少なくとも３０．１９２Ｕ／ｍｇの精製融合リパーゼ活性を有すること。
【請求項９】
以下の特徴を有する、シグナルペプチドを有しない融合タンパク質を製造する方法：
a)０．０２５ｍＭのＩＰＴＧで少なくとも１２時間誘導した場合に４１，９０２Ｕ／ｌのリパーゼ活性を有すること、
b)少なくとも２７９倍の発現レベルの増加を有すること、
c)７０％〜７５％のリパーゼ回収率、および少なくとも２．８７倍の精製倍率を有すること、
d)少なくとも２９７．９２９Ｕ／ｍｇの精製融合リパーゼ活性を有すること、
e)Ｔ１成熟リパーゼを有すること。
【請求項１０】
以下の特徴を有する、Ｔ１成熟リパーゼを製造する方法：
a)活動温度活性および安定性
６０℃〜８０℃の範囲の温度で活動し、最適温度が約７０℃であること、
b)活動ｐＨ活性および安定性
ｐＨ６〜１０で３０分間活動し安定であり、最適なアルカリｐＨが９であること、
c)作用金属イオン
Ｎａ＋、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋で作用し、
Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋に対して少なくとも３０分間安定であり、
Ｃｕ２＋およびＦｅ２＋で、それぞれ約５２％および６０％のリパーゼ活性を少なくとも３０分間有すること、
d)作用界面活性剤のリパーゼ活性への影響
６３％〜８８％の割合で、０〜３０分間作用すること、
e)基質特異性
オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、パーム油およびトリグリセリドなどの天然油に作用し、天然油が好ましい基質であること、
f)リパーゼ阻害剤
金属キレート剤、還元剤、セリンプロテアーゼ阻害剤およびアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤と共に作用し、かつ触媒メカニズムがセリンおよびアスパラギン酸残基に関連すること。
【請求項１１】
工業用途における触媒として使用するための、ジオバチルスＴ１株から単離された耐熱性Ｔ１リパーゼの製造方法。
【請求項１２】
以下の特性を有する、安定性のある耐熱性Ｔ１リパーゼを製造する方法：
a)融合リパーゼについては６５℃、成熟リパーゼについては７０℃の最適温度を有すること、
b)８〜９の間の最適ｐＨを有すること、
c)ｐＨ６〜１２で安定性を有すること。
【請求項１３】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合リパーゼＴ１を製造する方法であって、該融合リパーゼＴ１が約６３ｋＤａの分子量を有する、前記方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【公開番号】特開２００６−４２８２０（Ｐ２００６−４２８２０Ａ）
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２２３８７２（Ｐ２００５−２２３８７２）
【出願日】平成１７年８月２日（２００５．８．２）
【出願人】（５０５２９１４１３）ユニバーシティー プトラ マレーシア (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月２日（２００５．８．２）
【出願人】（５０５２９１４１３）ユニバーシティー プトラ マレーシア (11)
【Ｆターム（参考）】
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