新規なタンパク質配合物
【課題】 本発明は、治療剤、予防剤および／もしくは化粧剤として用いることを意図する、エナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体ならびに／またはエナメルマトリックスタンパク質などの、新規かつ改良された活性エナメル物質の低濃度配合物を提供することを目的とする。
【解決手段】 本発明では、前記活性エナメル物質を高分子マトリックス内に取り込ませ、これは、細胞内殖に適しているか、または細胞閉塞性のどちらかである。高分子マトリックスの分解、酵素作用および／または拡散によって放出されるように、活性エナメル物質を高分子マトリックス内に取り込ませることができる。したがって、本発明には、特に、配合物内の活性エナメル物質の総濃度がより低い新規薬剤配合物および／または化粧配合物が含まれ、前記活性エナメル物質の放出の空間的および／または選択的な調節により、より高い割合の活性エナメル物質が適切な細胞活性時に放出されることが可能となる。
【解決手段】 本発明では、前記活性エナメル物質を高分子マトリックス内に取り込ませ、これは、細胞内殖に適しているか、または細胞閉塞性のどちらかである。高分子マトリックスの分解、酵素作用および／または拡散によって放出されるように、活性エナメル物質を高分子マトリックス内に取り込ませることができる。したがって、本発明には、特に、配合物内の活性エナメル物質の総濃度がより低い新規薬剤配合物および／または化粧配合物が含まれ、前記活性エナメル物質の放出の空間的および／または選択的な調節により、より高い割合の活性エナメル物質が適切な細胞活性時に放出されることが可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療剤、予防剤および／または化粧剤として用いることを意図する、エナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質などの、新規かつ改良された活性エナメル物質の低濃度配合物に関する。本発明では、前記活性エナメル物質を高分子マトリックス内に取り込ませ、特に、組織の修復、再生および／または再構築において用いること、生きた石灰化組織の部分間の結合を誘導すること、生きた石灰化組織の小片を他の生組織の小片上の結合部位に結合させること、皮膚または粘膜の創傷の治癒を改善すること、感染症もしくは炎症状態を予防または治療すること、象牙質を形成または再生させること、移植片の生着を促進すること、上皮由来の良性、半悪性または悪性の新生物を治療すること、アポトーシスを誘導すること、あるいは細胞減少手術などの処置および／もしくは外傷後の創腔ならびに／または組織欠陥を埋めることを意図する。
【０００２】
本発明では、高分子マトリックスの分解、酵素作用および／または拡散によって放出されるように、活性エナメル物質を高分子マトリックス内に取り込ませることができる。前記高分子マトリックスは、細胞内殖に適しているか、または細胞閉塞性のどちらかである。
【０００３】
したがって、本発明には、特に、配合物内の活性エナメル物質の総濃度がより低い新規薬剤配合物および／または化粧配合物が含まれ、前記活性エナメル物質の放出の空間的および／または選択的な調節により、より高い割合の活性エナメル物質が適切な細胞活性時に放出されることが可能となる。
【背景技術】
【０００４】
本発明の活性エナメル物質（用語「活性エナメル物質」は、本明細書の文脈中ではエナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質について用いる）は、天然ではエナメルマトリックスの近隣に発生する組織中で見つかる因子を、１つだけでなく因子の統合されたカスケードを誘導することができる。これらは発生中の組織の自然環境を模倣し、したがって組織再生、細胞分化および／または成熟の自然刺激を模倣する。
【０００５】
エナメルマトリックス中に存在するエナメルマトリックスタンパク質は、エナメルの前駆体として最もよく知られている。エナメルマトリックスタンパク質は、セメント質形成の前に発生中の歯根の先端部の根表面上に堆積される。堆積したエナメルマトリックスがセメント質形成の開始因子である証拠が存在する。ここでも、セメント質の形成自体が歯根膜および歯槽骨の発生に関連している。したがって、本発明以前に本発明者らによって示されているように、エナメルマトリックスタンパク質は、歯中における天然の付着の発生を模倣することによって歯周部再生を促進することができる（Ｇｅｓｔｒｅｌｉｕｓ Ｓ、Ｌｙｎｇｓｔａｄａａｓ ＳＰ、Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ Ｌ．Ｅｍｄｏｇａｉｎ−ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂｉｏｍｉｍｉｃｒｙ．Ｃｌｉｎ Ｏｒａｌ Ｉｎｖｅｓｔ、４：１２０〜１２５（２０００））。
【０００６】
エナメルマトリックスは、アメロゲニン、エナメリン、タフト（ｔｕｆｔ）タンパク質、プロテアーゼ、およびアルブミンなどのいくつかのタンパク質からなる。エナメルマトリックスの主な構成要素であるアメロゲニンは、選択的スプライシングおよび制御された翻訳後分泌プロセッシングによって単一の遺伝子に由来する、疎水性タンパク質のファミリーである。これらは脊椎動物の進化の間ずっと高度に保存されており、検査したすべて
の高等脊椎動物のすべてにわたって高い全体的な配列相同性レベルを実証している（約８０％）。実際、ブタおよびヒトのアメロゲニン遺伝子転写物の配列では塩基の４％しか異ならない。したがって、エナメルマトリックスタンパク質は、ブタ起源ではあるが、人体と遭遇した際に「自己」であるとみなされ、アレルギー応答または他の望ましくない反応を始動させることなくヒトにおいて歯の再生を促進することができる。
【０００７】
ブタエナメルマトリックスから精製したタンパク質の酸抽出物の形態のエナメルマトリックス誘導体（例えばＥＭＤ）は、重篤な歯付着喪失に罹患している患者における、機能的な歯根膜、セメント質および歯槽骨を回復させるための使用が以前に成功している（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ他、１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ、２４、６５８〜６６８）。
【０００８】
さらに、培養歯根膜細胞（ＰＤＬ）の研究において、ＥＭＤが培養中に存在していた場合、これらの細胞の付着速度、成長および代謝が顕著に増加したことが示されている。また、ＥＭＤに曝した細胞は、対照と比較した場合に細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達および成長因子のオートクリン産生の増加を示した。対照的に、上皮細胞では、ＥＭＤが存在する場合にｃＡＭＰシグナル伝達および成長因子の分泌は増加したが、増殖および成長がどちらも阻害された（Ｌｙｎｇｓｔａｄａａｓ他、２００１、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ、２８、１８１〜１８８）。
【０００９】
エナメルマトリックスタンパク質およびエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）は、以前に特許文献中に硬組織形成を誘導すること（例えばエナメル形成、米国特許第４,６７
２,０３２号（Ｓｌａｖｋｉｎ））、硬組織間の結合を支持すること（ＥＰ−Ｂ−０ ３
３７ ９６７号およびＥＰ−Ｂ−０ ２６３ ０８６号）、皮膚および粘膜などの開放創治癒を促進すること、感染症および炎症性疾患の治療に対して有益効果を有すること（ＥＰＯ１、１０５９９３４号およびＥＰＯＩＩ、０１２０１９１５．４号）、象牙質の再生を誘導すること（ＷＯ０１／９７８３４号）、移植片の生着を促進すること（ＷＯ００／５３１９７号）、新生物の治療においてアポトーシスを誘導すること（ＷＯ００／５３１９６号）、ならびに細胞減少手術などの処置および／もしくは外傷後の創腔および／または組織欠陥を埋めることを促進すること（ＷＯ０２／０８０９９４号）が可能であると記載されている。
【００１０】
組織の修復または再生には、上述のＥＭＤの医療適用に例示したように、細胞は創傷床内に遊走し、増殖し、分化し、最終的な組織形状を形成しなければならない。多くの場合、複数の細胞集団がこの形態形成応答に参加しなければならない。
【００１１】
それにもかかわらず、エナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質などの活性エナメル物質の上述の効果または使用の任意のものは、比較的高い濃度の活性エナメル物質の配合物について記載されている。典型的な濃度は１０〜３０ｍｇ／ｍｌである。これまで、より低い濃度の活性エナメル物質の配合物で効果を観察することができていない。本発明を特定の理論に限定することを望まないが、これは、これまで用いられてきたすべての薬剤配合物および／または化粧配合物が非制御の様式で活性エナメル物質を放出するように設計されていることが原因である可能性がある。
【００１２】
同様に、投与する塩基性線維芽細胞成長因子の用量を低下させることを可能にするために、成長因子を隔離するための固定ヘパリンの使用に基づいた制御送達装置が設計された。例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ他（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９１年９月；１２（７）：６１９〜２６）は、アルギン酸内にヘパリンとコンジュゲートさせたＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ビーズを用いた。ビーズは、塩基性線維芽細胞成長因子（「ｂＦＧＦ」）とヘ
パリンとの結合および解離に基づいてｂＦＧＦをゆっくりと放出するリザーバとして役割を果たした。
【００１３】
また、ＸＩＩＩａ因子基質配列および生物活性ペプチド配列を含む二重ドメインペプチドをフィブリンゲル内に架橋結合させることができ、生物活性ペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏでその細胞活性を保持しているということが実証されている（Ｓｃｈｅｎｓｅ，Ｊ．Ｃ．他（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、１０：７５〜８１）。
【００１４】
さらに、（ＵＳ２００３／０１８７２３２号およびＵＳ２００３／０１６６８３３号）では、共有または非共有方法のどちらかによってヘパリンをマトリックスに結合させてヘパリン−マトリックスを形成することに基づいて、成長因子タンパク質全体をタンパク質または多糖マトリックス内に取り込ませることが示されている。その後、ヘパリンは、ヘパリン結合成長因子をタンパク質マトリックスに非共有結合させた。また、ＸＩＩＩａ因子基質などの架橋結合領域およびネイティブタンパク質配列を含む融合タンパク質も示されている。マトリックスと生物活性因子との間に分解性結合を取り込むことは、長期的な薬物送達に特に有用であると想定された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第４，６７２，０３２号（Ｓｌａｖｋｉｎ）
【特許文献２】ＥＰ−Ｂ−０ ３３７ ９６７号
【特許文献３】ＥＰ−Ｂ−０ ２６３ ０８６号
【特許文献４】ＥＰＯ１、１０５９９３４号
【特許文献５】ＥＰＯＩＩ、０１２０１９１５．４号
【特許文献６】ＷＯ０１／９７８３４号
【特許文献７】ＷＯ００／５３１９７号
【特許文献８】ＷＯ００／５３１９６号
【特許文献９】ＷＯ０２／０８０９９４号
【特許文献１０】ＵＳ２００３／０１８７２３２号
【特許文献１１】ＵＳ２００３／０１６６８３３号
【特許文献１２】米国特許第６，３３１，４２２号
【特許文献１３】米国特許第５，８７４，５００号
【特許文献１４】ＷＯ００／４４８０８号
【特許文献１５】ＷＯ０３／０５２０９１号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｇｅｓｔｒｅｌｉｕｓ Ｓ、Ｌｙｎｇｓｔａｄａａｓ ＳＰ、Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ Ｌ．Ｅｍｄｏｇａｉｎ−ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂｉｏｍｉｍｉｃｒｙ．Ｃｌｉｎ Ｏｒａｌ Ｉｎｖｅｓｔ、４：１２０〜１２５（２０００）
【非特許文献２】Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ他、１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ、２４、６５８〜６６８
【非特許文献３】Ｌｙｎｇｓｔａｄａａｓ他、２００１、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ、２８、１８１〜１８８
【非特許文献４】Ｅｄｅｌｍａｎ他（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９１年９月；１２（７）：６１９〜２６）
【非特許文献５】Ｓｃｈｅｎｓｅ，Ｊ．Ｃ．他（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、１０：７５〜８１
【非特許文献６】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９
【非特許文献７】Ｔｅｎ Ｃａｔｅ：Ｏｒａｌ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ、１９９４
【非特許文献８】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年１月、１０６ Ｓｕｐｐｌ．、１：２８２〜９１
【非特許文献９】Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ他（１９９４）
【非特許文献１０】Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．他（１９９０）
【非特許文献１１】ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．他、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．他（１９９０）
【非特許文献１２】「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、１９９０
【非特許文献１３】Ｓｉｅｒｒａ，Ｄ．Ｈ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、７：３０９〜３５２（１９９３）
【非特許文献１４】Ｗｉｌｌｉａｍｓ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２６４：２８４〜２９０（１９８７）
【非特許文献１５】Ｆｒａｎｃｉｓ他、Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ、１９：２９１〜３０７、１９９３
【非特許文献１６】Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＹ、１９７５
【非特許文献１７】Ａｏｋｉ，Ｎ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ、２１：２６７〜２８６、１９７９
【非特許文献１８】Ｓａｋａｔａ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、６５：２９０〜２９７、１９８０
【非特許文献１９】Ａｏｋｉ他、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、３９：２２〜３１、１９７８
【非特許文献２０】Ｈｅｍ他、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、３９：２６６〜２７６（１９９８）
【非特許文献２１】ＴａｋａｇｉおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１４：５１４９〜５１５６
【非特許文献２２】ＴａｋａｉおよびＤｏｌｉｔｔｌｅ、１９７５
【非特許文献２３】Ｓｍｉｔｈ他、（１９９５）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：６４４０〜６４４９
【非特許文献２４】Ｂｅｓｓｏｎ他、（１９９６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３７：２１６〜２２３
【非特許文献２５】Ｎｅｔｚｅｌ−Ａｍｅｔｔ他、（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：６７４７〜６７５５
【非特許文献２６】Ｃｏｏｍｂｓ他、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３〜４３２３〜４３２８
【非特許文献２７】Ｔｙｌｅｒ−Ｃｒｏｓｓ，Ｒ．他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ．３：６２０〜６２７
【非特許文献２８】ＺｕｃｋｅｒおよびＫａｔｚ、（１９９１）．Ｅｘｐｅｒ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．：６９３〜７０２
【非特許文献２９】Ｋａｉｌａｐｕｒ他、Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（１９９２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：５３８〜５４８
【非特許文献３０】Ｈａｕｇｅｎ他、（１９９２）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：２０３４〜２０４２
【非特許文献３１】Ｈａｔａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４４７〜８４５７
【非特許文献３２】Ｃａｒｅｙ、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、５３：１６１〜１７７、１９９１
【非特許文献３３】Ｌａｎｄｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２：１８９〜１９５、１９８９
【非特許文献３４】Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２：８５１〜８６９、１９８７
【非特許文献３５】Ｍａｒｔｉｎ、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：５７〜８５、１９８７
【非特許文献３６】Ｇｒａｆ他、Ｃｅｌｌ、４８：９８９〜９９６、１９８７
【非特許文献３７】Ｋｌｅｉｎｍａｎ他、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２７２：３９〜４５、１９８９
【非特許文献３８】Ｍａｓｓｉａ他、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：８０５３〜８０５９、１９９３
【非特許文献３９】Ｉｇｎａｔｉｕｓ他、Ｊ．ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１１１：７０９〜７２０、１９９０
【非特許文献４０】Ｔａｓｈｉｒｏ他、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１６１７４〜１６１８２、１９８９
【非特許文献４１】Ｌｉｅｓｉ他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２４４：１４１〜１４８、１９８９
【非特許文献４２】ＢＩＯＲＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔ ９／８８
【非特許文献４３】Ｋｏｏ他、２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本出願は、上述のすべての医療、治療および化粧上の使用に適用可能な活性エナメル物質の新規かつ改良された配合物の有益効果に関し、前記活性エナメル物質を、活性エナメル物質がマトリックスの分解および／または酵素作用および／または拡散によって放出され、したがって配合物中の必要な総用量が有効に低下され、放出の空間的な調節が容易となり、それにより、より高い割合の活性エナメル物質が適切な細胞活性時に放出されることが可能となるように、前述のマトリックスの２つもしくはそれ以上の組合せを含めた、ＵＳ２００３／０１８７２３２号およびＵＳ２００３／０１６６８３３号に示したマトリックスに類似のタンパク質マトリックス、合成マトリックスならびに／または多糖マトリックス内に取り込ませる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、細胞の成長もしくは内殖に適しているか、または細胞閉塞性であることができる高分子マトリックスと、少なくとも１つの活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための低濃度の薬剤配合物、治療配合物および／または化粧配合物を初めて開示しており、配合物中の前記活性エナメル物質の濃度は、約５ｍｇなどの５ｍｇ／ｍｌ超えない濃度、または４.９ｍｇ／ｍｌ、４.５ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、３.５ｍｇ
／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、２.５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、１.５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、もしくは１μｇ／ｍｌなどの５ｍｇ／ｍｌ未満の濃度である。
【００１９】
本発明は、放出可能に取り込ませたまたは内部に封入した活性エナメル物質を有する天然および／もしくは合成高分子マトリックスを用いた、硬組織および軟組織の修復、再生、または再構築、特に骨および歯の成長のための生成物ならびに方法を提供する。高分子マトリックスは生体適合性かつ／または生分解性である。これらは、移植時にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで形成することができる。典型的な高分子マトリックスは、マトリックスの孔径次第で、細胞の成長もしくは内殖に適しているか、または細胞閉塞性のどちらかである。活性エナメル物質は、その完全な生物活性を保持したままで、高分子
マトリックス内に取り込ませる、付着させる、および／または封入することができる。さらに、活性エナメル物質は、放出の時点および／もしくは活性エナメル物質が放出される度合の制御を提供する技術を用いて、放出可能に取り込ませる、付着させる、かつ／または封入することができる。そのような配合物は、例えば、徐放性ビヒクルなどの高分子マトリックスを用いて、組織修復に直接または間接的に用いることができる。
【００２０】
本発明以前に記載されている活性エナメル物質を含む配合物は、最も一般的には、前記活性エナメル物質の濃度が少なくとも３０ｍｇ／ｍｌなど、本明細書中で想定している濃度よりも相当に高い濃度で投与する。さらに、５ｍｇのタンパク質／ｍｌ未満を含む配合物は、従来のＰＧＡゲル中に配合するＥＭＤについて実施例１に記載したように、実際に現場では不十分であることが確立されている。
【００２１】
実施例に文書的に説得力のあるものとして記載したように、本発明者らは、驚くべきことに、高分子マトリックスおよび活性エナメル物質を含む新規低濃度配合物により、活性エナメル物質の必要な濃度を、１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ〜２５０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ〜１５０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、またはそれ以下などの１μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌまで下げることが可能になることを実証することができた。
【００２２】
本発明に関連する高分子マトリックスは、イオン結合、共有結合、もしくはそれらの組合せによって前駆体分子を高分子ネットワークに架橋結合させることによって、または１つもしくはそれ以上の高分子材料の膨潤によって、または物理的架橋結合によって、例えば、相もしくは溶解度の差異によるエンドブロックの凝集により形成される架橋結合点によって、形成する。本発明の第１の実施形態では、前記マトリックスは、マトリックス内への細胞の成長、内殖および／または遊走を可能にするために十分なポリマー間間隔を有する高分子ネットワークを形成する。典型的には、この特定の実施形態では、架橋結合した高分子マトリックスはゲルを形成する。本発明の第２の実施形態では、前記マトリックスは、マトリックス内への細胞の内殖および／または遊走を塞ぎ、マトリックス内の活性エナメル物質を制限するために十分に狭い、狭い孔径を有する高分子ネットワークを形成する。さらに、さらなる別の実施形態では、前記第２の実施形態は、経時的に分解されて、マトリックス内への細胞の成長、内殖および／または遊走を可能にするために、十分なポリマー間間隔を含むことができる。
【００２３】
上述の本発明の２つの具体的な実施形態は、異なるかつ具体的な役割を果たし、したがって、活性エナメル物質の低濃度配合物の意図する使用次第で、二者択一的に好ましい。例えば、細胞閉塞性のマトリックス形態は、使用の意図が、周辺軟組織と保護する領域との相互作用することを防ぎ、それにより例えば創傷の感染症を予防する、生分解性の障壁を提供することである場合に、好ましい場合がある。別の例では、この形態は、移植床の欠損などの有効な骨再生の完全な治癒時間中に障壁機能が求められる場合に特に好ましい。このような実施形態は膜の形態をとることができる。さらに、そのような好ましいマトリックスは、例えば、予定された酵素分解または加水分解の部位を含めることで、将来的に細胞侵襲性となるように設計することができる。他方で、例えば、細胞減少手術の結果生じた軟組織の創傷または創腔を、活性エナメル物質を含む低濃度配合物で埋める場合は、細胞の内殖および／または遊走が前記創傷の治癒に有益であり、したがって、典型的には、細胞の内殖および／または遊走を可能にするために十分に大きい孔径を有するゲル配合物が好ましい。ここでも、典型的なＰＥＧゲルは、最初は必ずしも細胞の内殖および／または遊走を可能にするために十分大きな孔径ではないが、将来的、例えば、浸潤もしくは隣接細胞によって放出された酵素による酵素分解、または加水分解もしくは機械的分解ののちに細胞の内殖および／または遊走を可能にするために十分に大きな孔径を含むよう
に、設計することができる。また、一部の適用では、前記２つの具体的な形態は相互に変化可能であるか、または一緒に用い得る。
【００２４】
一実施形態では、高分子マトリックスはタンパク質、好ましくは高分子マトリックスを移植する患者中に天然に存在するタンパク質から形成される。特に好ましい天然高分子マトリックスタンパク質はフィブリンであるが、コラーゲンおよびゼラチンなどの他のタンパク質から形成された高分子マトリックスを用いることもできる。多糖類および糖タンパク質も高分子マトリックスを形成するために用い得る。
【００２５】
別の同等に好ましい実施形態では、合成ポリマーを用いて、イオン結合または共有結合または物理的結合によって架橋結合した高分子マトリックスを形成する。
【００２６】
高分子マトリックス材料は、天然に存在する酵素または加水分解によって生分解性であることが好ましい。分解速度は、架橋結合の度合および高分子マトリックス中にプロテアーゼ阻害剤を含めることによってさらに操作することができる。分解性部位により、マトリックスからの活性エナメル物質の放出をより具体的にすることができる。例えば、酵素活性に基づいた分解により、活性エナメル物質の放出が、ゲルを通った活性エナメル物質の拡散ではなく、局所タンパク質分解などの細胞工程によって制御されることが可能となる。分解性の部位または結合は、高分子マトリックスを浸潤するまたはそれを取り囲む細胞から放出された酵素によって切断される。これにより、材料内／材料に隣接する細胞の位置に応じて、活性エナメル物質が同一材料内から異なる速度で放出されることが可能となる。
【００２７】
細胞特異的タンパク質分解活性は、例えば長期間にわたって起こる用途において、重要である。本明細書中に記載の活性エナメル物質の徐放性は、その放出は細胞工程によって制御されているので、必要な活性エナメル物質の総量を有効に低下させる。活性エナメル物質の保存およびその生体利用度は、最初の爆発放出によって顕著な量の活性エナメル物質の損失を特徴的にもたらす拡散徐放性装置の使用に勝る、細胞特異的タンパク質分解活性を開拓することの明確な利点である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】周辺骨およびセメント質の回復対ゲル中のＥＭＤの濃度を示す図である。
【図２】挿入したゲル中のＥＭＤの濃度の関数としての、ラット頭蓋骨における危険な大きさの骨欠損の治癒を示す図である（ｎ＝４〜５）。
【図３】ＣＥＪから欠損の先端部までミリメートルで測定したポケットの深度を示す図である。*Ｐ＜０.０５（ボンフェローニ調整ずみ一元配置分散分析試験）
【図４】標準の組織形態計測技術を適用した、管内および管壁に沿った骨密度の定量的な評価を示す図である。
【図５】標準の組織形態計測技術を適用した、管内および管壁に沿った骨密度の定量的な評価を示す図である。***Ｐ＜０.００１（ボンフェローニ調整ずみ一元配置分散分析試験）
【図６】ミニブタの歯周部裂開モデル、手術の設定を示す図である。
【図７】よく器質化された歯根膜によって新しいセメントから分離された成熟骨および層状骨の再生の組織学を示す図である。Ａ：Ｅｍｄｏｇａｉｎ、Ｂ：ＰＥＧ／Ｅｃ。
【図８】ＰＥＧ／Ｅｃの成熟骨および層状骨の再生の組織学を示す図である。
【図９】ＰＥＧ−Ｅｃを用いた治療（ＣＭＣ）後の歯根膜の存在の組織学的な観察を示す図である。
【図１０】ＰＥＧ−Ｅｃを用いた治療（ＣＭＣ）後の歯根膜の存在の組織学的な観察を示す図である。
【図１１】骨回復の定量的測定のミクロＸ線を示す図である。Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）が、ＰＥＧ−ＥｃまたはＰＥＧ−Ｅｋと比較して、統計的に有意に最も高い性能に達した（約４ｍｍ）（ｐ＜０.００５）。
【図１２】２種類のＰＥＧ−ＥｃまたはＰＥＧ−ＥｋとＥｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）とで異なっていた再生された骨構造の形態学の組織学を示す図である。
【図１３】犬におけるクラス３歯根分岐部欠損の治療の手術の設定を示す図である。図において、それぞれの矢印は約５ｍｍに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
活性エナメル物質
エナメルマトリックスはエナメルの前駆体であり、任意の関連する天然源、すなわち、歯が発生中の哺乳動物から得られ得る。適切な由来源は、例えば子ウシ、ブタまたは子ヒツジなどの屠殺した動物からの発生中の歯である。別の由来源は、例えば魚の皮膚である。本発明の文脈では、用語「活性エナメル物質」とは、その由来源を区別せずにエナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質を包含するために用いる。
【００３０】
エナメルマトリックスは、以前に記載されているように発生中の歯から製造することができる（ＥＰ−Ｂ−０ ３３７ ９６７号およびＥＰ−Ｂ−０ ２６３ ０８６号）。エナメルマトリックスを掻爬し、例えば、希酸もしくは希塩基または水／溶媒混合液などの水溶液を用いた抽出、次いでサイズ排除、脱塩または他の精製工程、あるいは次いで凍結乾燥によって、エナメルマトリックス誘導体を製造する。あるいは、熱または溶媒を用いた処理によって酵素を失活させてもよく、この場合は、誘導体を凍結乾燥せずに液状で保管し得る。
【００３１】
エナメルマトリックス誘導体またはタンパク質の代替由来源として、当業者に周知の一般に適用可能な合成経路を用いるか、またはＤＮＡ技術によって改変した培養真核および／もしくは原核細胞を用いてもよい。したがって、エナメルマトリックスタンパク質は組換えおよび／または合成起源のものであり得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９参照）。
【００３２】
したがって、本発明の一態様は、高分子マトリックスと化学修飾することができる活性エナメル物質の群から選択された少なくとも１つの組換えもしくは合成タンパク質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療配合物に関する。好ましい実施形態では、前記タンパク質は、前記タンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置する少なくとも１つのシステイン残基を有する。
【００３３】
本発明の文脈では、エナメルマトリックス誘導体は、選択的スプライシングもしくはプロセッシングによって、または天然の長さのタンパク質の酵素切断もしくは化学切断のどちらかによって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでのポリペプチドの合成（例えば組換えＤＮＡ方法および／もしくは二倍体細胞の培養）によって自然に産生させた、１つもしくは複数のエナメルマトリックスタンパク質またはそのようなタンパク質の部分もしくは断片を含むエナメルマトリックスの誘導体である。エナメルマトリックスタンパク質誘導体には、エナメルマトリックスに関連するポリペプチドまたはタンパク質も含まれる。ポリペプチドまたはタンパク質は、ポリアミン酸もしくは多糖類、またはそれらの組合せなどの適切な生分解性担体分子に結合していてもよい。さらに、用語エナメルマトリックス誘導体は、合成類似物質も包含する。
【００３４】
タンパク質とは、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基によって構成される生物学的巨大分子である。アミノ酸の直鎖状ポリマーとしてのタンパク質は、ポリペ
プチドとも呼ばれる。典型的には、タンパク質は５０〜８００個のアミノ酸残基を有しており、したがって、約６,０００〜約数十万ダルトンの範囲またはそれ以上の分子量を有
する。小さなタンパク質はペプチドまたはオリゴペプチドと呼ばれる。
【００３５】
エナメルマトリックスタンパク質とは、通常はエナメルマトリックス中に存在するタンパク質、すなわち、エナメルの前駆体（Ｔｅｎ Ｃａｔｅ：Ｏｒａｌ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ、１９９４；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年１月、１０６ Ｓｕｐｐｌ．、１：２８２〜９１）、もしくはタンパク質、ペプチドまたはそのようなタンパク質の切断によって得ることができるそのようなタンパク質の断片である。一般に、そのようなタンパク質は１２０,０００ダルトン未満の分子量を有し、ア
メロゲニン、非アメロゲニン、プロリンリッチな非アメロゲニンおよびタフテリン（ｔｕｆｔｅｌｉｎ）が含まれる。
【００３６】
本発明に従って用いるタンパク質の例は、アメロゲニン、プロリンリッチな非アメロゲニン、タフテリン、タフトタンパク質、血清タンパク質、唾液タンパク質、アメロブラスチン、シースリン、それらの断片および誘導体、ならびにそれらの混合物である。本発明に従って用いる活性エナメル物質を含む製剤は、前述のタンパク質物質も少なくとも２つ含み得る。さらに、本発明に従って用いる他のタンパク質は、市販の商品ＥＭＤＯＧＡＩＮ（登録商標）（ＢＩＯＲＡ ＡＢ、スウェーデン）中に見つかる。
【００３７】
当分野で周知のエナメルマトリックス誘導体であるＥＭＤＯＧＡＩＮ（登録商標）（ＢＩＯＲＡ ＡＢ、Ｓ−２０５ １２ Ｍａｌｍｏｅ、スウェーデン）は、１ｍｌのビヒクル溶液（アルギン酸プロピレングリコール）あたり、３０ｍｇの、残留プロテアーゼを失活させるために３時間約８０℃で加熱したエナメルマトリックスタンパク質を含み、これらは、タンパク質およびビヒクルを個別に試験する場合を除いて、適用の前に混合する。主なタンパク質ピーク２０、１４および５ｋＤａの重量比は、それぞれ約８０／８／１２である。
【００３８】
一般に、エナメルマトリックスの主要なタンパク質はアメロゲニンとして知られている。これらはマトリックスタンパク質の約９０％ｗ／ｗを構成する。残りの１０％ｗ／ｗにはプロリンリッチな非アメロゲニン、タフテリン、タフトタンパク質、血清タンパク質および少なくとも１つの唾液タンパク質が含まれるが、例えばエナメルマトリックスと関連して同定されているアメリン（アメロブラスチン、シースリン）などの、他のタンパク質も存在していてよい。さらに、様々なタンパク質をいくつかの異なる大きさ（すなわち異なる分子量）で合成および／または加工し得る。したがって、エナメルマトリックス中の支配的なタンパク質であるアメロゲニンは、いくつかの異なる大きさで存在することが判明しており、これらが一緒になって上記分子凝集体を形成する。これらは、生理的条件下で凝集体を形成する、著しく疎水性の物質である。これらは、他のタンパク質もしくはペプチドを保有するか、またはそれらの担体であり得る。凝集体の大きさは変動し、含まれる平均的な大きさは約１０ｎｍ〜１００μｍ、１００ｎｍ〜１０μｍ、または５０ｎｍ〜１μｍであり、多くの場合はより大きく、例えば１００ｎｍ〜１００μｍ、２０ｎｍ〜１００μｍ、２５ｎｍ〜１００μｍ、５０ｎｍ〜１００μｍ、１０〜１００ｎｍ、１０〜２５ｎｍ、１００〜５０ｎｍ、２０〜３０ｎｍ、２０〜５０ｎｍ、２０〜６０ｎｍ、２５〜４５ｎｍ、２５ｎｍ〜５０ｎｍ、２５ｎｍ〜７５ｎｍ、５０ｎｍ〜７５ｎｍなどである。一般に、凝集体の大きさは変動することができ、これは、所定の溶液／マトリックス中のタンパク質、ペプチドおよび／または断片の濃度ならびにマトリックス中の他の物質の存在にも依存する。
【００３９】
したがって、本発明の今回の好ましい実施形態は、アメロゲニンならびに／またはアメロゲニンの少なくとも断片および／もしくは細断片を含む、薬剤配合物、化粧配合物およ
び／または治療配合物に関する。
【００４０】
別の同等に好ましい実施形態は、さらに、プリ−プロアメロゲニンを含む薬剤配合物および／または治療配合物に関する。
【００４１】
他のタンパク質／ポリペプチド物質も、本発明に従った使用に適していることが企図される。例には、タンパク質またはプロリンリッチなタンパク質およびポリプロリンなどのタンパク質の断片が含まれる。
【００４２】
本発明に従った使用に適していることが企図される物質の他の例は、そのようなタンパク質、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質の凝集体、ならびにエナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体およびエナメルマトリックスタンパク質の代謝物である。代謝物は、タンパク質の大きさから短いペプチドの大きさの範囲の、任意の大きさであってよい。
【００４３】
本発明に関連するタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／またはそれらの細断片は、実質的に単離または精製した形態であり得る。タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／またはそれらの細断片は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／もしくはそれらの細断片の意図する目的に干渉せず、混合後も実質的に単離したとみなされる担体または希釈剤と混合し得ることを理解されたい。そのような実質的に精製した形態は、一般に、製剤中にタンパク質、ペプチドおよび／またはその断片を含み、製剤中のタンパク質の９０％を超える量、例えば９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％が本発明のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／または断片である。
【００４４】
さらに、本発明による活性エナメル物質のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／または細断片のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一である任意のアミノ酸配列、例えば少なくとも７２％、７５％、７７％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列も本発明の範囲内にあるとみなされる。
【００４５】
参照アミノ酸配列と少なくとも、例えば９５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／またはその断片とは、例えばポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であるが、ただし、アミノ酸配列が、参照アミノ酸配列のアミノ酸１００あたり５までの点突然変異を含み得ることを意図する。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸の５％までが欠失しているか、もしくは別のアミノ酸で置換されていてもよく、または参照配列中の全アミノ酸の５％までのいくつかのアミノ酸が参照配列中に挿入されていてもよい。参照配列のこのような突然変異は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置で起こってもよく、あるいはこれらの末端位置間の任意の場所で参照配列中のアミノ酸にわたって個々に、または参照配列内の１つもしくはそれ以上の連続的な集団で散在していてもよい。
【００４６】
本発明では、同一性を決定するためには局所アルゴリズムプログラムが最も適している。局所アルゴリズムプログラム（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎなど）では、１つの配列中の部分配列を第２の配列中の部分配列と比較し、最も高い全体類似度スコアを与える部分配列の組合せおよびそのような部分配列のアラインメントを見つける。可能な場合は、内部ギャップにペナルティを与える。局所アルゴリズムは、単一のドメインを有するか、または単に共通の結合部位を有するだけの２つの複数ドメインタンパク質の比較に良好である。
【００４７】
同一性および類似度を決定する方法は、公的に利用可能なプログラムで体系化されている。２つの配列間の同一性および類似度を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法には、それだけには限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ他（１９９４））ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．他（１９９０））が含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の供給者から公的に利用可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．他、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．他（１９９０））。それぞれの配列解析プログラムは初期設定のスコアマトリックスおよび初期設定ギャップペナルティを有する。一般に、分子生物学者は用いるソフトウェアプログラムによって確立されたデフォルト設定を用いることが期待される。
【００４８】
エナメルマトリックスのタンパク質は高分子量部分および低分子量部分に分けることができ、エナメルマトリックスタンパク質の明確に定義された画分は歯周部の欠損（すなわち歯周部の創傷）の治療に関して貴重な特性を有することが判明した。この画分は、一般にアメロゲニンと呼ばれる酢酸で抽出可能なタンパク質を含み、エナメルマトリックスの低分子量部分を構成する（ＥＰ−Ｂ−０ ３３７ ９６７号およびＥＰ−Ｂ−０ ２６３
０８６号を参照）。
【００４９】
エナメルマトリックスの低分子量部分は、歯周部の欠損中の硬組織間の結合を誘導するために適切な活性を有する。しかし、本発明の文脈では、活性タンパク質はエナメルマトリックスの低分子量部分に限定されない。現在、好ましいタンパク質には、約６０,００
０ダルトン未満の分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで測定）を有するアメロゲニン、タフテリンなどのエナメルマトリックスタンパク質が含まれるが、６０,
０００ダルトンを超える分子量を有するタンパク質も、例えば結合組織の成長を促進するための候補として有望な特性を有する。
【００５０】
上述のように、本発明に従って用いるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、典型的には、ＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動で決定した最大で約１２０ｋＤａ、例えば、最大で１００ｋＤａ、９０ｋＤａ、８０ｋＤａ、７０ｋＤａまたは６０ｋＤａなどの分子量を有する。
【００５１】
本発明に従って用いる活性エナメル物質の製剤は、異なる分子量の活性エナメル物質の混合物も含み得る。
【００５２】
したがって、本発明に従って用いる活性エナメル物質は、約４０,０００までの分子量、例えば約５,０００〜約２５,０００の分子量などを有することが企図される。
【００５３】
タンパク質を、例えば沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、調製用電気泳動、ゲル浸透クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによって分離することによって、異なる分子量のアメロゲニンを精製することができる。
【００５４】
分子量アメロゲニンの組合せは、支配的な２０ｋＤａの化合物から４０〜５ｋＤａの多くの異なる分子量を有するアメロゲニン凝集体、支配的な５ｋＤａの化合物まで変動し得る。通常はエナメルマトリックス中に見つかるタフテリンまたはタンパク質分解酵素などの他のエナメルマトリックスタンパク質を加え、アメロゲニン凝集体に保有させることができる。
【００５５】
一般に、エナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体およびエナメルマトリックスタンパク質は疎水性物質である、すなわち、特に高温で水への可溶性が低い。典型的
には、これらのタンパク質は非生理的ｐＨ値かつ約４〜２０℃などの低温で可溶性であり、一方で、体温（３５〜３７℃）かつ中性ｐＨで凝集および沈殿する。
【００５６】
したがって、特に好ましい実施形態では、本発明に従って用いる活性エナメル物質の低濃度配合物は、少なくとも部分的に凝集している、かつ／またはｉｎ ｖｉｖｏでの施用後に凝集体を形成することができる活性エナメル物質を含む。前記凝集体の粒子径は、約２００μｍ〜約１０ｎｍ、例えば１００μｍ〜１０ｎｍ、１０μｍ〜１００ｎｍ、１μｍ〜２０ｎｍ、１μｍ〜１０ｎｍ、５μｍ〜１０ｎｍ、１０μｍ〜１ｎｍ、１００μｍ〜１０ｎｍ、１００μｍ〜１ｎｍ、１μｍ〜１ｎｍ、１μｍ〜５ｎｍ、１μｍ〜１５ｎｍなどの範囲内にある。
【００５７】
本発明中に関連する高分子マトリックスは前駆体分子を高分子ネットワークに架橋結合させることによって形成するので、前記マトリックスは、活性エナメル物質の凝集体をマトリックス内に拘束することを可能にするために十分に狭いポリマー間間隔を有する高分子ネットワークを形成することができる。本発明の好ましい実施形態では、そのような十分に狭い孔径を有する高分子ネットワークは、中性ｐＨで、かつ／またはｉｎ ｓｉｔｕで、前駆体分子を患者の身体に施用したあとに形成され、したがって活性エナメル物質の凝集および／または沈殿が自動的に引き起こされる。
【００５８】
本発明に従って、活性エナメル物質を、例えば抗細菌物質、抗炎症物質、抗ウイルス物質、抗真菌物質などの他の活性薬物物質と一緒に、または局所化学療法、アポトーシス誘導剤、例えばＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ケラチノサイト成長因子またはそのペプチド類似体などの成長因子と組み合わせて用い得る。エナメルマトリックスもしくはその製造物中に内在するか、または加えた酵素、特にプロテアーゼも、エナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質と組み合わせて用い得る。
【００５９】
活性エナメル物質の使用に応じて、組成物は薬剤組成物および／もしくは治療組成物、または化粧組成物であり得る。以下では、用語「薬剤組成物および／または治療組成物」は、化粧組成物、およびいわゆる医薬品と化粧品とのあいまいな部分、すなわち薬用化粧品に属する組成物も包含することを意図する。
【００６０】
活性エナメル物質を含む薬剤組成物および／または治療組成物は、薬物送達系として役割を果たす。本発明の文脈では、用語「薬物送達系」とは、投与の際にヒトまたは動物の身体に活性物質を提示する薬剤組成物および／または治療組成物（薬剤配合物および／または治療の配合物または剤形）を意味する。
【００６１】
活性エナメル物質および高分子マトリックス以外に、本発明に従って用いる薬剤組成物および／または治療組成物は、もちろん、さらなる製薬上または化粧上許容される賦形剤も含み得る。
【００６２】
製薬上または化粧上許容される賦形剤とは、現在、組成物を投与する個体に実質的に無害である物質として定義されている。そのような賦形剤は、通常は国の保健機関によって与えられる要件を満たしている。例えば英国薬局方、米国薬局方および欧州薬局方などの公式の薬局方が、製薬上許容される賦形剤の基準を設定している。
【００６３】
本発明に従って用いる組成物中の製薬上許容される賦形剤の選択およびその最適濃度は、一般に予測することができず、最終組成物の実験的評価に基づいて決定しなければならない。しかし、薬剤配合物および／または治療配合物の当業者は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版、Ｍａｃ
ｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、１９９０に指針を見つけることができる。
【００６４】
フィブリンマトリックス
フィブリンとは、いくつかの生物医学の適用が報告されている天然材料である。フィブリンは、Ｈｕｂｂｅｌｌ他の米国特許第６,３３１,４２２号に細胞内殖マトリックスの材料として記載されている。フィブリンゲルは、多くの組織に結合するその能力および創傷治癒における天然の役割が理由で、以前にシーラントして用いられている。一部の具体的な適用には、血管移植片の付着、心臓弁の付着、骨折および腱の修復での骨の配置におけるシーラントとしての使用が含まれる（Ｓｉｅｒｒａ，Ｄ．Ｈ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、７：３０９〜３５２（１９９３））。さらに、これらのゲルは、薬物送達デバイスとして、および神経の再生用に用いられている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２６４：２８４〜２９０（１９８７））。
【００６５】
フィブリノーゲンをフィブリン内に重合させる方法も特徴づけられている。最初に、プロテアーゼが二量体フィブリノーゲン分子を２つの対称的な部位で切断する。トロンビン、レプチラーゼ、およびプロテアーゼＩＩＩを含めた、フィブリノーゲンを切断することができるいくつかの可能なプロテアーゼが存在し、そのそれぞれが異なる部位でタンパク質を切断する（Ｆｒａｎｃｉｓ他、Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ、１９：２９１〜３０７、１９９３）。フィブリノーゲンが切断されたあと、フィブリノーゲン単量体が一緒になって非共有的に架橋結合したポリマーゲルを形成する自己重合工程が起こる（Ｓｉｅｒｒａ、１９９３）。この自己構築が起こるのは、プロテアーゼ切断が起こったあとに結合部位が露出するからである。これらが露出したあと、分子の中心にあるこれらの結合部位は、ペプチド鎖の末端に存在するフィブリノーゲン鎖の他の部位に結合することができる（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＹ、１９７５）。このようにして、ポリマーネットワークが形成される。その後、トロンビンタンパク質分解によってＸＩＩＩ因子から活性化されるトランスグルタミナーゼであるＸＩＩＩａ因子がポリマーネットワークを共有的に架橋結合し得る。他のトランスグルタミナーゼも存在し、それらもフィブリンネットワークへの共有架橋結合および移植に関与し得る。
【００６６】
架橋結合したフィブリンゲルが形成されたあと、続く分解は細かく制御する。フィブリンの分解を制御するにあたって重要な分子の１つは、α２−プラスミン阻害剤である（Ａｏｋｉ，Ｎ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ、２１：２６７〜２８６、１９７９）。この分子は、ＸＩＩＩａ因子の作用を介してフィブリンのα鎖に架橋結合することによって作用する（Ｓａｋａｔａ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、６５：２９０〜２９７、１９８０）。それ自身をゲルに付着させることによって、高濃度の阻害剤をゲルに局在化することができる。その後、阻害剤は、プラスミノーゲンとフィブリンとの結合を妨げ（Ａｏｋｉ他、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、３９：２２〜３１、１９７８）、プラスミンを失活させることによって（Ａｏｋｉ、１９７９）作用する。α２−プラスミン阻害剤はグルタミン基質を含む。正確な配列は、ＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号１２）と同定されており、最初のグルタミンが架橋結合のための活性アミノ酸である。
【００６７】
ＸＩＩＩａ因子基質配列および生物活性ペプチド配列を含む二重ドメインペプチドをフィブリンゲル内に架橋結合させることができ、この生物活性ペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏでその細胞活性を保持しているということが実証されている（Ｓｃｈｅｎｓｅ，Ｊ．Ｃ．他（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、１０：７５〜８１）。
【００６８】
したがって、本発明の好ましい薬剤配合物および／または治療配合物は、細胞の成長もしくは内殖に適しているか、または細胞閉塞性である高分子マトリックスと、活性エナメル物質の群から選択された少なくとも１つのタンパク質とを含み、前記活性エナメル物質の濃度は配合物１ｍｌあたり５ｍｇを超えず、高分子マトリックスはフィブリンを含む。前記薬剤配合物および／または治療配合物では、本発明による活性エナメル物質をＸＩＩＩａ因子基質配列などのトランスグルタミナーゼ基質ドメインにカップリングさせることができる。
【００６９】
このＸＩＩＩａ因子基質配列には、例えば、ＧＡＫＤＶ、ＫＫＫＫ、またはＮＱＥＱＶＳＰＬが含まれ得る。活性エナメル物質とトランスグルタミナーゼ基質ドメインとのカップリングは化学合成によって行うことができる。
【００７０】
あるいは、トランスグルタミナーゼ基質ドメインは、ＸＩＩＩａ因子以外のトランスグルタミナーゼの基質であることができる。最も好ましいＸＩＩＩａ因子基質ドメインは、ＮＱＥＱＶＳＰＬのアミノ酸配列を有するが、フィブロネクチンなど、トランスグルタミナーゼが認識する他のタンパク質も、トランスグルタミナーゼ基質ペプチドにカップリングさせることができる。
【００７１】
【表１】
【００７２】
合成マトリックス
身体内に施用する合成マトリックスを形成するための架橋結合反応には、（ｉ）Ｈｅｍ他、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、３９：２６６〜２７６（１９９８）に記載のように、不飽和二重結合を含む２つまたはそれ以上の前駆体間のフリーラジカル重合、（ｉｉ）Ｒｈｅｅ他の米国特許第５,８７４,５００号に開示されているように、例えばアミン基を含む前駆体とスクシンイミジル基を含む前駆体との間の求核置換反応、（ｉｉｉ）縮合および付加反応、ならびに（ｉｖ）強力な求核剤とコンジュゲートした不飽和基または結合（強力な求電子剤など）とのマイケル型付加反応が含まれる。求核基としてチオールまたはアミン基を有する前駆体分子と求電子基としてアクリル基またはビニルスルホン基を含む前駆体分子との間の反応が特に好ましい。求核基として最も好ましいのはチオール基である。マイケル型付加反応はＷＯ００／４４８０８号（Ｈｕｂｂｅｌｌ他）に記載されている。マイケル型付加反応は、敏感な生体物質の存在下においても、生理的条件下で、自己選択的な様式で少なくとも第１および第２の前駆体成分のｉｎ ｓｉｔｕ架橋結合を可能にする。前駆体成分の１つが少なくとも２つの官能性を有し、残りの前駆体
成分のうちの少なくとも１つが２つを超える官能性を有する場合は、この系は自己選択的に反応して架橋結合した三次元生体材料を形成する。
【００７３】
したがって、本発明の一態様は、細胞の成長、内殖および／もしくは遊走に適しているか、または細胞閉塞性のどちらかである高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療配合物に関し、前記マトリックスは、強力な求核剤とコンジュゲートした不飽和結合、またはコンジュゲートした不飽和基との間の求核付加反応によって形成される。
【００７４】
好ましくは、コンジュゲートした不飽和基またはコンジュゲートした不飽和結合は、アクリレート、ビニルスルホン、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、ビニルスルホン、２−もしくは４−ビニルピリジニウム、マレイミド、またはキノンである。
【００７５】
求核基は、好ましくはチオール基、アミノ基またはヒドロキシル基である。チオール基は、プロトン化されていないアミン基よりも相当高い反応性を有する。この考察にはｐＨが重要である。脱プロトン化されたチオールはプロトン化されたチオールよりも相当高い反応性を有する。したがって、２つの前駆体成分を１つの高分子マトリックスへと変換するための、チオールを用いた、アクリレートまたはキノンなどのコンジュゲートした不飽和に関与する付加反応は、多くの場合、約８のｐＨで最も素早くかつ自己選択的に実施することが最良である。約８のｐＨでは、有意な数の目的チオールが脱プロトン化されており（したがって反応性がより高くなる）、目的アミンのほとんどがプロトン化されたままである（したがって反応性がより低くなる）。チオールを第１の前駆体分子として用いる場合は、その反応性がアミンよりもチオールに対して選択的であるコンジュゲート構造が非常に望ましい。
【００７６】
適切な第１および第２の前駆体分子には、タンパク質、ペプチド、ポリオキシアルキレン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−アクリル酸）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレン−コ−ビニルピロリドン）、ポリ（マレイン酸）、ポリ（エチレン−コ−マレイン酸）、ポリ（アクリルアミド）、およびポリ（酸化エチレン）−コ−ｄ（酸化プロピレン）ブロックコポリマーが含まれる。特に好ましい前駆体分子はポリエチレングリコールである。
【００７７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、好都合な基礎単位ブロックを提供する。直鎖状（すなわち末端が２つ）もしくは分枝鎖状（すなわち末端が３つ以上）のＰＥＧを容易に購入または合成し、その後、ＰＥＧの末端基を官能化してチオールなどの強力な求核剤またはアクリレートもしくはビニルスルホンなどのコンジュゲートした構造のどちらかを導入することができる。わずかに塩基性の環境中でこれらの成分を互いまたは対応する成分のどちらかと混合した場合、第１および第２の前駆体成分の間の反応によってマトリックスが形成される。ＰＥＧ成分を非ＰＥＧ成分と反応させることができ、どちらの成分の分子量または親水性も、生じる生体材料の機械的特徴、透過性、および含水量を操作するために制御することができる。
【００７８】
したがって、本発明の特に好ましい実施形態は、細胞の内殖および／もしくは遊走に適しているか、または細胞閉塞性であることができる高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療配合物であり、前記活性エナメル物質の濃度は配合物１ｍｌあたり５ｍｇ未満であり、前記マトリックスはポリエチレングリコールを含む。
【００７９】
例として、２つまたはそれ以上のシステイン残基を含むペプチドの合成は簡単であり、その後、この成分は容易に求核基との第１の前駆体成分として役割を果たすことができる。例えば、２つの遊離システイン残基を有するペプチドは、生理的ｐＨまたはそれよりわずかに高いｐＨ（例えば８〜９）でＰＥＧトリ−ビニルスルホン（３本のアームを有し、そのアームのそれぞれにビニルスルホンを有するＰＥＧ）と混合した場合に容易にマトリックスを形成する。ゲル化はまたより高いｐＨでさえも良好に進行することができるが、自己選択性を犠牲にする可能性がある。２つの液体前駆体成分、すなわち溶解した前駆体成分を一緒に混合した場合、これらは数秒間から数分間かけて反応して、ネットワークの節を有するＰＥＧ鎖のネットワークからなり、連結リンクとしてペプチドを有する弾性ゲルを形成する。ペプチドは、フィブリンマトリックスなどのタンパク質系ネットワーク中で行われるようにネットワークが細胞によって浸潤かつ分解されることができるように、プロテアーゼ基質として選択することができる。好ましくは、ドメイン中の配列は細胞遊走に関与する酵素の基質であるが（例えば、コラゲナーゼ、プラスミン、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）またはエラスターゼなどの酵素の基質として）、適切なドメインはこれらの配列に限定されない。１つの特に有用な配列は、酵素プラスミンの基質である。ゲルの分解特徴は、架橋結合の節として役割を果たすペプチドの詳細を変更することによって操作することができる。コラゲナーゼによっては分解可能であるがプラスミンでは可能でない、またはプラスミンによっては分解可能であるがコラゲナーゼによっては可能でないゲルを作製し得る。さらに、単純にアミノ酸配列を変更して酵素反応のＫｍもしくはｋｃａｔ、または両方を変化させることによって、このような酵素に応答してゲルがより速くまたはより遅く分解するようにすることが可能である。したがって、細胞の通常の再構築特徴、例えばプロテアーゼプラスミンに重要な基質部位を示すことによって再構築されることができるという点でバイオミメティックである生体材料を、作製することができる。ペプチドとＰＥＧとのゲル化は自己選択的である。
【００８０】
場合により、他の種（例えば組織表面）との化学結合をもたらすために、二官能性薬剤をマトリックス内に取り込ませることができる。マトリックスをＰＥＧビニルスルホンから形成する場合は、プロテアーゼ基質をマトリックス内に取り込ませることが重要である。ＰＥＧアクリレートとＰＥＧチオールとの反応から形成したマトリックス以外は、ＰＥＧビニルスルホンおよびＰＥＧチオールから形成したマトリックスは加水分解性の結合を含まない。したがって、プロテアーゼ基質を取り込ませることにより、マトリックスが身体内で分解することが可能となる。
【００８１】
合成マトリックスは、操作上形成が単純である。２つの液体前駆体を混合する；一方の前駆体は求核基を有する前駆体分子を含み、他方の前駆体分子は求電子基を含む。生理食塩水が溶媒として役割を果たすことができる。反応によって最小限の熱しか発生しない。したがって、ゲル化は、不都合な毒性なしに、組織と直接接触させてｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。したがって、遠位を修飾した（ｔｅｌｅｃｈｅｌｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）、またはその側基を修飾したどちらかの、ＰＥＧ以外のポリマーを用い得る。
【００８２】
したがって、本発明は、高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療配合物に関し、前記活性エナメル物質の濃度は配合物１ｍｌあたり５ｍｇ未満であり、前記マトリックスは事前に形成するか、または前記マトリックスはｉｎ ｓｉｔｕで形成する。
【００８３】
本発明の１つの具体的な態様では、ＰＥＧマトリックスの外殻および凝集した活性エナメル物質を含む内核を有するマイクロカプセルを形成する。マイクロカプセルは、ＰＥＧおよび活性エナメル物質を含む混合物でのＰＥＧの重合中に、ｐＨをｐＨ５〜ｐＨ９.５
の範囲で用いた場合に形成される。マイクロカプセル殻は、活性エナメル物質の凝集体を
封入する重合したＰＥＧによって形成される。活性エナメル物質の凝集体は、重合に用いられるｐＨ５〜ｐＨ９.５の範囲のｐＨによって形成される。活性エナメル物質の凝集体
はＰＥＧマトリックス殻の孔を透過するには大きすぎる。これにより、ＰＥＧマトリックス殻が分解されるまで活性エナメル物質はマイクロカプセルから放出されない。
【００８４】
ほとんどの治癒指標には、細胞内殖またはマトリックス内への細胞遊走の速度と適応したマトリックスの分解速度との組合せが全体的な治癒応答に重要である。非加水分解性のマトリックスが細胞によって浸潤される潜在性は、主にネットワーク密度の関数である。分岐点もしくは節の間の既存の空間が細胞の大きさに対して小さすぎる場合、またはマトリックス内により多くの空間の作製をもたらすマトリックスの分解の速度が遅すぎる場合は、非常に限定された治癒応答が観察される。天然に見つかる治癒マトリックス、例えば身体中の傷害に対する応答として形成されるフィブリンマトリックスは、細胞が非常に容易に浸潤することができる非常に緩いネットワークからなることが知られている。浸潤は、フィブリンネットワークに組み込まれた一部である細胞接着用のリガンドによって促進される。
【００８５】
ポリエテングリコールなどの合成親水性前駆体分子から作製したマトリックスは、高分子ネットワークの形成後に水性環境中で膨潤する。十分に短いゲル化時間（７〜８のｐＨ、３６〜３８℃の範囲の温度で３〜１０分）および身体中におけるマトリックスのｉｎ ｓｉｔｕ形成中の定量的反応を達成するためには、前駆体分子の開始濃度は十分に高くなければならない。そのような条件下では、必要な開始濃度は、マトリックスが水性環境中で分解可能でない場合は細胞の浸潤には密すぎる、マトリックスをもたらす。したがって高分子ネットワークの膨潤は、分岐点間の空間を拡張および拡大するために重要である。
【００８６】
前駆体分子の開始濃度には無関係に、４本アームのＰＥＧビニルスルホンおよびＳＨ基を有するペプチドなど、同じ合成前駆体分子から作製したヒドロゲルは、平衡状態において同じ含水量まで膨潤する。これは、前駆体分子の開始濃度が高ければ高いほど、その平衡状態に達した際にヒドロゲルの最終体積が大きくなることを意味する。身体中で利用可能な空間が十分な膨潤を許容するには小さすぎる場合、特に前駆体成分から形成された結合が加水分解可能でない場合は、細胞の浸潤および治癒応答の速度は低下する。その結果、身体に施用するための２つの相反する要件の間の最適値を探さなければならない。良好な細胞の浸潤および続く治癒応答が、分子量が実質的に類似している少なくとも３本のアームを有する三官能性分枝鎖状ポリマーと少なくとも二官能性の分子である第２の前駆体分子との反応から形成した三次元高分子ネットワークで観察されている。第１および第２の前駆体分子の官能基の当量比は０.９〜１.１である。第１の前駆体分子のアームの分子量、第２の前駆体分子の分子量、および分岐点の官能性は、生じる高分子ネットワークの含水量が、水の取込みが完了した後の高分子ネットワークの全重量平衡の質量％〜９２質量％となるように選択する。好ましくは、含水量は、水の取込みが完了した後の高分子ネットワークおよび水の全重量の９３〜９５質量％である。水の取込みの完了は、平衡濃度に達した場合、または生体材料中の利用可能な空間がそれ以上の体積の増加を許容しない場合に、達することができる。したがって、可能な限り低い前駆体成分の開始濃度を選択することが好ましい。これは、すべての膨潤性マトリックスについて当てはまるが、細胞に媒介される分解を受け、高分子ネットワーク中に加水分解性の結合を含まないマトリックスに特に当てはまる。
【００８７】
ゲル化時間と低い開始濃度とのバランスは、特に非加水分解性のゲルについては、前駆体分子の構造に基づいて最適化すべきである。具体的には、第１の前駆体分子のアームの分子量、第２の前駆体分子の分子量および分岐の度合、すなわち分岐点の官能性を、相応に調節しなければならない。実際の反応機構はこの相互関係にわずかな影響しか与えない。
【００８８】
第１の前駆体分子がそれぞれのアームの末端に官能基を有する３本または４本アームのポリマーであり、第２の前駆体分子が直鎖状の二官能性分子、好ましくは少なくとも２つのシステイン基を含むペプチドである場合は、第１の前駆体分子のアームの分子量および第２の前駆体分子の分子量は、ネットワークの形成後の分岐点間の連結が１０〜１３ｋＤａ（連結が分枝鎖状ではなく直鎖状であるという条件下で）、好ましくは１１〜１２ｋＤａの範囲の分子量を有するように選択することが好ましい。これにより、第１および第２の前駆体分子の合わせた開始濃度を、溶液中の第１および第２の前駆体分子の全重量の８〜１２質量％、好ましくは９〜１０質量％の範囲とすることが可能となる（ネットワーク形成前）。第１の前駆体成分の分岐度合を８に増加し、第２の前駆体分子が直鎖状の二官能性分子のままである場合は、分岐点間の連結の分子量を１８〜２４ｋＤａの分子量まで増加することが好ましい。第２の前駆体分子の分岐度合を直鎖状から３本または４本アームの前駆体成分まで増加する場合は、分子量、すなわち連結の長さを相応に増加する。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態では、第１の前駆体分子として三官能性の３本アームの１５ｋＤａポリマーを含み（すなわちそれぞれのアームが５ｋＤａの分子量を有する）、第２の前駆体分子として０.５〜１.５ｋＤａの範囲、さらにより好ましくは約１ｋＤａの分子量の二官能性の直鎖状分子を含む組成物を選択する。好ましくは、第１および第２の前駆体成分はポリエチレングリコールである。
【００９０】
別の好ましい実施形態では、第１の前駆体成分は、官能基としてコンジュゲートした不飽和基または結合、最も好ましくはアクリレートまたはビニルスルホンを含み、第２の前駆体分子の官能基は、求核基、好ましくはチオールまたはアミノ基を含む。
【００９１】
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、第１の前駆体分子は、それぞれのアームの末端に官能基を有する、４本アームの２０ｋＤａのポリマー（それぞれのアームの分子量が５ｋＤａ）であり、第２の前駆体分子は、１〜３ｋＤａ、好ましくは１.５〜２ｋＤａ
の範囲の分子量の二官能性の直鎖状分子である。好ましくは、第１の前駆体分子はビニルスルホン基を有するポリエチレングリコールであり、第２の前駆体分子はシステイン基を有するペプチドである。どちらの好ましい実施形態でも、第１および第２の前駆体分子の合わせた開始濃度の範囲は、第１および第２の前駆体分子ならびに水の全質量の８〜１１質量％、好ましくは９〜１０質量％（高分子ネットワーク形成前）、１０分未満のゲル化時間を達成するためには好ましくは５〜８質量％である。これらの組成物は、ｐＨ８.０
、３７℃で、混合後約１〜１０分、例えば２〜１０分、または３〜１０分などのゲル化時間を有する。
【００９２】
適切な合成ゲルは、例えばＷＯ０３／０５２０９１号に記載されている。そのような例の１つは、４つのビニルスルホン末端基および配列Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙのジチオールペプチドで官能化した、４本アームの分枝鎖状ＰＥＧから形成した酵素分解性ゲルである。ＷＯ０３／０５２０９１号からの別の例は、アクリル化した４本アームのポリエチレングリコール（分子量１５,０００）を直鎖状ポリエチレングリコールジチオール（分子量３４００）と混合することによって形成した加水分解性のゲルであり、これらはマイケル型反応を介して互いに共有結合している。
【００９３】
マトリックスが、例えばアクリレートとチオールとの好ましい反応によって形成した加水分解性の結合を含む場合、細胞の浸潤に関するネットワーク密度は最初に特に重要であるが、水性環境では、結合が加水分解されてネットワークが緩み、細胞の浸潤が可能となる。高分子ネットワークの全体的な分岐度合の増加に伴って、連結の分子量、すなわち連結の長さが増加しなければならない。
【００９４】
本発明の具体的な実施形態では、活性エナメル物質と細胞閉塞性である高分子マトリックスとを含む低濃度配合物は、水の存在下における少なくとも２つの前駆体の反応によって得る。前記配合物は、例えば当分野で「誘導骨再生」として周知の治療において、移植部位で骨形成を促進するために特に好ましい。本発明では、非骨原性の軟組織細胞が部位に侵入することを阻害する障壁によって骨形成が望まれる部位を周辺組織から分離し、これにより骨髄からの細胞がそれを満たすことが可能となる。そのような膜を形成する本発明による高分子マトリックスは、２つまたはそれ以上前駆体の反応によって得ることができ、前駆体の鎖の隣接する交差点は、１００００個未満の原子、例えば５０００、１０００、９００、８００、７５０個未満の原子など、またはさらにより好ましくは６７０個未満の原子、例えば２５０〜３５０個の原子、例えば３００個の原子を有する鎖によって結合されている。
【００９５】
詳細には、第１の前駆体は、コンジュゲートした不飽和末端基またはコンジュゲートした不飽和末端結合を有する２本もしくはそれ以上の鎖を保有する核を含む。核は、炭素もしくは窒素原子などの単一原子、または酸化エチレン単位などの小分子、糖、ペンタ−エリスリトールなどの多官能性アルコール、ヘキサグリセリンなどのグリセリンもしくはオリゴグリセリンであることができる。鎖は、場合により異種原子、アミド基もしくはエステル基を含む直鎖状ポリマーまたは直鎖状もしくは分枝鎖状アルキル鎖である。鎖以外に、核は、直鎖状もしくは分枝鎖状アルキル残基または末端のコンジュゲートした不飽和基もしくは結合を有さないポリマーでさらに置換されていてもよい。本発明の１つの好ましい実施形態では、第１の前駆体は、２〜１０本の鎖、最も好ましくは２〜６または４〜８本の鎖を有する。末端のコンジュゲートした不飽和結合は、好ましくは、マレイミド、アクリレート、アクリルアミド、キニーネ、および２−または４−ビニルピリジニウムである。同等に好ましい実施形態では、第１の前駆体は２〜１０本の鎖、最も好ましくは３〜８本の鎖、例えば３〜６本の鎖を有する。
【００９６】
第２の前駆体は、鎖の末端の最後の２０個の原子の任意のものにチオール基がそれぞれ付着した、２本またはそれ以上の鎖を保有する核を含む。例えば、システイン残基を鎖内に取り込ませ得る。好ましくは、チオール基が末端にある。核は、炭素もしくは窒素原子などの単一原子、または酸化エチレン単位などの小分子、糖、ペンタ−エリスリトールなどの多官能性アルコール、ヘキサグリセリンなどのグリセリンもしくはオリゴグリセリンであることができる。鎖は、場合により異種原子、アミド基もしくはエステル基を含む直鎖状ポリマーまたは直鎖状もしくは分枝鎖状アルキル鎖である。鎖以外に、核は、直鎖状もしくは分枝鎖状アルキル残基、または末端のコンジュゲートした不飽和基もしくは結合を有さないポリマーでさらに置換されていてもよい。好ましい実施形態では、第２の前駆体は、２〜１０本の鎖、最も好ましくは２〜６または４〜８本の鎖を有する。同等に好ましい実施形態では、第２の前駆体は、２〜１０本の鎖、最も好ましくは３〜８本の鎖、例えば３〜６本の鎖を有する。
【００９７】
第１および第２の前駆体の鎖の合計は、密な三次元ネットワークを得るために、５本以上、例えば６本以上、好ましくは８本以上である。
【００９８】
前駆体のそれぞれの核は交差点を形成する。隣接する交差点は、１００００個未満の原子、例えば５０００、１０００、９００、８００、７５０個未満の原子、またはさらにより好ましくは６７０個未満の原子、例えば２５０〜３５０個の原子、例えば３００個の原子を有する鎖によって結合されており、前記原子とは鎖の主鎖中の原子のことだけを指しており、これは置換基またはＨ原子を考慮していないことを意味する。好ましくは、２つの隣接する交差点間の原子の数は約３３０個未満の原子、最も好ましくは３０〜１２０個の原子である。言い換えれば、生じる三次元ネットワークの網目構造は、細胞の寸法（１
〜１００μｍ）よりも、また中性ｐＨで活性エナメル物質によって形成される、例えば１０ｎｍ〜１００μｍであることができる凝集体よりも数桁小さく、したがって保持される。
【００９９】
したがって、本発明の現在の好ましい実施形態では、ネットワークの網目構造は１０ｎｍ〜１０μｍである、すなわち、孔は平均して約１μｍよりも小さい、またはそれより大きくない、例えば５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、１０ｎｍよりも小さい。好ましい孔径は、１０μｍ〜１０ｎｍ、例えば１０μｍ〜１００ｎｍ、１０μｍ〜１０ｎｍ、１μｍ〜１００ｎｍ、５００ｎｍ〜１０ｎｍ、５００ｎｍ〜２５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１０ｎｍなどとなるように選択する。
【０１００】
活性エナメル物質の高分子マトリックスへの取込み
本発明の別の同等に好ましい実施形態は、特に、高分子マトリックスと共有もしくは非共有結合によって前記マトリックスに連結した活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための低濃度薬剤配合物および／または治療配合物に関する。具体的には、前記活性エナメル物質は、タンパク質、ポリペプチドまたはその細断片であることができる前記活性エナメル物質中の少なくとも１つのシステイン残基と、マトリックスの成分のうち少なくとも１つのコンジュゲートした不飽和基との求核付加反応によって、前記マトリックスに連結することができ、前記少なくとも１つのシステイン残基は前記タンパク質、ポリペプチドまたはその細断片のＣ末端もしくはＮ末端のどちらかに位置する。この実施形態は、前記高分子マトリックスが、マトリックス内への細胞の成長、内殖および／または遊走を可能にするために十分なポリマー間間隔を有する高分子ネットワークを形成する場合に、特に好ましい。典型的には、この特定の実施形態では、架橋結合した高分子マトリックスはゲルを形成する。
【０１０１】
したがって、活性エナメル物質を合成前駆体成分から形成したマトリックス内に取り込ませるためには、活性エナメル物質の融合ペプチド、もしくは取り込ませる任意の他のペプチドを、架橋結合可能な基質ドメインとして少なくとも１つの追加のシステイン基（−ＳＨ）を用いて合成するか、またはそれを含むように化学的に変更することができる。その後、遊離システイン基がマイケル型付加反応で前駆体成分のコンジュゲートした不飽和基と反応する。システインのチオール基は、合成ポリマー上のコンジュゲートした不飽和結合と反応して共有結合を形成することができる。
【０１０２】
したがって、一実施形態では、前記活性エナメル物質を、少なくとも１つの追加のシステイン基（−ＳＨ）を含むように化学修飾する。
【０１０３】
システインは、活性エナメル物質に直接付着しているか、またはリンカー配列を介して付着しているかのどちらかであることができ、これはさらに、活性エナメル物質を例えば実質的にネイティブな形の酵素によってマトリックスから切断できるように、タンパク質分解させる配列などの酵素分解可能なアミノ酸配列、または多糖分解の基質および／もしくはプラスミン分解性配列、またはエステル結合などの非特異的な加水分解によって分解可能な配列を含んでいることができる。
【０１０４】
分解性結合
一般に、本発明の薬剤配合物および／または治療配合物からの活性エナメル物質の徐放性により、必要な活性エナメル物質の総量が低下する。特に、この効果は、その放出が細胞工程によって制御される場合にさらに最適化される。活性エナメル物質の保存およびその生体利用度は、初期バースト放出によって顕著な量の活性エナメル物質の損失を特徴的にもたらす拡散徐放性デバイスの使用に勝る、細胞特異的タンパク質分解活性を開拓する
ことの明確な利点である。マトリックスに共有結合した活性エナメル物質を用いた骨欠損の強力な治癒の１つの潜在的な説明では、活性エナメル物質を局所的に長時間かけて投与するが（すなわち、単一のパルス用量だけではない）、これを連続的な様式で行うことが重要であると考えられている。これは、マトリックスの酵素切断または加水分解切断のどちらかによるゆっくりとした分解によって達成される。このようにして、その後に分子が持続的な一定期間をかけて起こる偽パルス効果によって送達される。例えば、前駆細胞がマトリックスを浸潤する際、これは活性エナメル物質分子に遭遇し、そこで前骨芽細胞へと分化することができる。しかし、特定のその細胞が結合した活性エナメル物質をマトリックスから解放し続けない場合、これは有効に骨芽細胞へと変換されて骨マトリックスを産生し始める。最後に、活性エナメル物質の治療効果は欠損領域に局在化しており、したがって次いで増幅される。
【０１０５】
マトリックスを形成している単量体、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、またはそれらの細断片のうちの任意のものを、分解性結合を含めることによって改変することができる。典型的には、これらは、トロンビンによる切断の部位などの酵素切断部位となる。
【０１０６】
さらに、マトリックスに架橋結合した活性エナメル物質の融合タンパク質またはペプチドキメラは、第１のドメイン中の生物活性タンパク質と第２のドメイン中の付着部位との間に分解性部位を含み得る（例えば、システイン、ＸＩＩＩａ因子基質またはヘパリン結合ドメイン）。これらの分解性部位は、非特異的な加水分解によって分解され得るか（すなわちエステル結合）、または特異的な酵素分解（タンパク質分解もしくは多糖分解）の基質であり得る。
【０１０７】
分解部位により、一次タンパク質配列にわずかな修飾しか与えずに、またはそれを修飾せずに、活性エナメル物質が放出されることが可能となり、これは、より高い活性エナメル物質の活性をもたらし得る。さらに、分解性部位により、フィブリンゲルなどのマトリックスからの活性エナメル物質のより特異的な放出が可能となる。例えば、酵素活性に基づいて分解により、活性エナメル物質の放出が、何らかの多孔性材料からの活性エナメル物質の拡散によってではなく局在化したタンパク質分解などの細胞工程によって制御されることが可能となる。分解性の部位または結合は、マトリックスを浸潤する細胞から放出された酵素によって切断される。これにより、材料内の細胞の位置に次第で、同一材料内で活性エナメル物質が異なる速度で放出されることが可能となる。長期間にわたって起こるそのような適用には細胞特異的タンパク質分解活性が重要である。
【０１０８】
タンパク質分解に用いることができる酵素は多数ある。タンパク質分解性部位には、コラゲナーゼ、プラスミン、エラスターゼ、ストロメライシン、またはプラスミノーゲン活性化剤の基質が含まれる。例示的な基質を表２に記載する。Ｐ１〜Ｐ５は、タンパク質分解が起こる部位からタンパク質のアミノ酸末端に向かって１〜５個のアミノ酸の位置を示す。Ｐ１'〜Ｐ４'は、タンパク質分解が起こる部位からタンパク質のカルボキシ末端に向かって１〜４個のアミノ酸の位置を示す。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
別の好ましい実施形態では、オリゴ−エステルドメインを第１および第２のドメインの間に挿入することができる。これは、乳酸オリゴマーなどのオリゴ−エステルを用いて達成することができる。
【０１１１】
非酵素分解基質は、酸または塩基に触媒される機構による加水分解を受ける任意の結合からなることができる。このような基質には、乳酸またはグリコール酸のオリゴマーなどのオリゴ−エステルが含まれることができる。これらの材料の分解速度は、オリゴマーの選択を介して制御することができる。
【０１１２】
多糖基質
酵素分解はさらに、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、およびコンドロイチナーゼＡＢＣなどの酵素の多糖基質で起こることができる。これらの酵素のそれぞれが多糖基質を有する。ヘパリン結合系のすべてにヘパリンが存在するおかげで、ヘパリナーゼの基質はこれらの系に既に組み込まれている。
【０１１３】
したがって、高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療配合物が同様に想定され、前記活性エナメル物質の濃度は配合物１ｍｌあたり５ｍｇ以下であり、前記活性エナメル物質は、少なくとも１つのヘパリン結合断片を介して前記マトリックスに共有結合または非共有結合している。
【０１１４】
タンパク質分解性基質を、活性エナメル物質キメラまたはヘパリン活性エナメル物質キメラのどちらかのペプチド合成中に加えることができる。ヘパリン結合活性エナメル物質キメラは、プラスミンの配列（例えば表２参照）などのプロテアーゼ基質をＸＩＩＩａ因子基質とヘパリン結合ドメインとの間に挿入することによって、タンパク質分解配列を含むように改変することができる。高いＫmおよび低いｋcatを有する基質を用いて、切断を遅延させる一方でプロテアーゼの活性部位を占有することができる。プラスミンのもの以外の切断基質を用いて、活性エナメル物質の放出をマトリックス分解に非依存性にすることができる。
【０１１５】
同時に、オリゴ−エステルドメインも、ペプチドの合成工程中にＸＩＩＩａ因子基質などの第２のドメインと活性エナメル物質もしくはヘパリン結合ドメインのどちらかである第１のドメイン、またはキメラのヘパリンドメインとの間に挿入することができる。これは、乳酸オリゴマーなどのオリゴ−エステルを用いて達成することができる。
【０１１６】
非酵素分解基質は、酸または塩基に触媒される機構による加水分解を受ける任意の結合からなることができる。このような基質には、乳酸またはグリコール酸のオリゴマーなどのオリゴ−エステルが含まれることができる。これらの材料の分解速度は、オリゴマーの選択を介して制御することができる。
【０１１７】
ヘパリン；ヘパリン結合ペプチド
本発明による高分子マトリックスは、ヘパリンおよび／またはヘパリンに結合するタンパク質に直接もしくは間接的に結合するヘパリン結合断片を含めることによって、さらに改変することができる。後者の場合、タンパク質がヘパリンに結合することができ、その後、これがヘパリン結合部位を含む活性エナメル物質への結合に利用可能となるか、または、活性エナメル物質自体が、特定のヘパリン結合活性エナメル物質によって結合されているヘパリン部分を含むことができる。これらは、以下にさらに詳細に記載するように標準の技術を用いて、マトリックス材料に付着させることができる。
【０１１８】
したがって、本出願の想定される一実施形態は、細胞の成長もしくは内殖に適している、または細胞閉塞性である高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための低濃度薬剤配合物および／または治療配合物であり、前記活性エナメル物質の濃度は配合物１ｍｌあたり５ｍｇ未満であり、前記マトリックスは、少なくとも１つのヘパリンおよび／または少なくとも１つのヘパリン結合断片を含めることによって改変する。
【０１１９】
好ましい実施形態では、ペプチドキメラおよびヘパリン自体からなる二部系を用いて、ヘパリンを非共有的にフィブリンゲルに付着させる。ペプチドキメラは、２つのドメイン
、すなわちＸＩＩＩａ因子基質および多糖結合ドメインからなる。ペプチドキメラがフィブリンゲルに架橋結合したのち、これは非共有相互作用によってヘパリン（または他の多糖類）に付着する。
【０１２０】
多数のタンパク質がヘパリン結合親和性を有することが判明している。例は以下の表３中に見つけることができる。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】
想定される代替実施形態では、活性エナメル物質自体が、表３に例示した物質などのヘパリン結合親和性を有する結合基質に対する親和性を示す。そのような実施形態では、活性エナメル物質が上述のように共有的または非共有的に高分子マトリックス内に結合し、したがって、任意の他の物質とヘパリン結合親和性との非共有相互作用のためのヘパリン様ドメインが提供される。
【０１２３】
細胞付着部位
細胞は、細胞表面におけるタンパク質−タンパク質、タンパク質−オリゴ糖およびタンパク質−多糖の相互作用を介してその環境と相互作用する。細胞外マトリックスタンパク
質は、細胞に大量の生物活性シグナルを提供する。この密なネットワークが細胞の支援に必要であり、マトリックス中の多くのタンパク質が細胞の接着、拡大、遊走および分化を調節することが示されている（Ｃａｒｅｙ、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、５３：１６１〜１７７、１９９１）。とりわけ活性があることが示されている特異的タンパク質の一部には、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フィブリン、フィブリノーゲンおよびコラーゲンが含まれる（Ｌａｎｄｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２：１８９〜１９５、１９８９）。ラミニンの研究が数多く実施されており、ラミニンが、ｉｎ
ｖｉｖｏでの神経およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経細胞の発生および再生（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２：８５１〜８６９、１９８７）、ならびに血管形成にも重要な役割を果たすことが示されている。
【０１２４】
細胞受容体と直接相互作用して接着、拡大またはシグナル伝達のいずれかを引き起こす特異的配列の一部が同定されている。
【０１２５】
大きな複数ドメインタンパク質であるラミニンは（Ｍａｒｔｉｎ、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：５７〜８５、１９８７）、３本の鎖からなり、いくつかの受容体結合ドメインを有することが示されている。これらの受容体結合ドメインには、ラミニンＢ１鎖のＹＩＧＳＲ配列（Ｇｒａｆ他、Ｃｅｌｌ、４８：９８９〜９９６、１９８７；Ｋｌｅｉｎｍａｎ他、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２７２：３９〜４５、１９８９；およびＭａｓｓｉａ他、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：８０５３〜８０５９、１９９３）、ラミニンＡ鎖のＬＲＧＤＮ（Ｉｇｎａｔｉｕｓ他、Ｊ．ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１１１：７０９〜７２０、１９９０）およびラミニンＢ１鎖ＰＤＧＳＲ（Ｋｌｅｉｎｍａｎ他、１９８９）が含まれる。いくつかの他の細胞認識配列も同定されている。それらには、ラミニンＡ鎖のＩＫＶＡＶ（Ｔａｓｈｉｒｏ他、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１６１７４〜１６１８２、１９８９）およびラミニンＢ２鎖の配列ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ（Ｌｉｅｓｉ他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２４４：１４１〜１４８、１９８９）が含まれる。
【０１２６】
さらなる好ましい実施形態では、細胞接着のためのペプチド部位をマトリックス内に、すなわち、細胞表面上の接着促進受容体に結合するペプチドを本発明の生体材料内に取り込ませる。そのような接着促進ペプチドは上述の群から選択することができる。特に好ましいのは、フィブロネクチン由来のＲＧＤ配列およびラミニン由来のＹＩＧＳＲ配列である。細胞付着部位の取込みは合成マトリックスの特に好ましい実施形態であるが、天然マトリックスの一部に含めることもできる。取込みは、例えば、単純に、システイン含有細胞付着ペプチドをＰＥＧアクリレート、ＰＥＧアクリルアミドまたはＰＥＧビニルスルホンなどのコンジュゲートした不飽和基を含む前駆体分子と、数分間混合し、その後、チオール含有前駆体成分などの求核基を含む残りの前駆体成分と混合することによって行うことができる。細胞付着部位がシステインを含まない場合は、含むように化学合成を行うことができる。この最初の工程中、接着促進ペプチドは、コンジュゲートした不飽和で多重官能化された前駆体の一方の末端内に取り込まれる。残りの複数チオールを系に加えた際、架橋結合したネットワークが形成される。ここでネットワークが製造される方法の別の重要な暗示は、接着シグナルなどのペンダント生物活性リガンドの取込みの効率である。例えば、結合していないリガンド（例えば接着部位）が細胞とマトリックスとの相互作用を阻害する可能性があるので、この工程は定量的でなければならない。そのようなペンダントオリゴペプチドを用いた前駆体の誘導体化は、最初の工程において、複数アームの求電子性前駆体がチオールよりも化学量論的に大過剰であるようにして実施し（最低４０倍）、したがって明確に定量的である。望ましくない阻害の予防の他に、この成果は生物学的にさらに顕著である：細胞の挙動はリガンド密度の小さな変化に非常に敏感であり、取
り込ませるリガンドの正確な知識により、細胞−マトリックスの相互作用の設計および理解が助けられる。要約すると、マトリックス内に共有結合した接着部位の濃度は、細胞の浸潤の速度に顕著な影響を与える。例えば、所定のヒドロゲルについて、ＲＧＤ濃度範囲を、細胞内殖および細胞遊走を最適な様式で支持するマトリックス内に取り込ませることができる。
【０１２７】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、細胞の成長もしくは内殖に適している高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための低濃度薬剤配合物および／または治療配合物であり、前記活性エナメル物質の濃度は配合物１ｍｌあたり５ｍｇ未満であり、前記マトリックスはＲＧＤを含めることによって改変する。例えば、実験セクションの実施例２および４を参照されたい。
【０１２８】
使用方法
本発明は、放出可能に取り込ませたかつ／もしくは内部に封入した活性エナメル物質を有する天然および／または合成マトリックスを用いて、硬組織ならびに軟組織の修復、再生または再構築、特に骨および歯の成長を行うための、活性エナメル物質の低濃度配合物を提供する。マトリックスは生体適合性かつ／または生分解性であり、移植時にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで形成されることができる。活性エナメル物質をマトリックス内に取り込ませるかつ／または封入することができ、これはその完全な生物活性を保持している。さらに、概要を上述した通り、どのようにして、いつ、およびどの程度の活性エナメル物質が放出されるかの制御をもたらす技術を用いて、活性エナメル物質を放出可能に取り込ませることができ、これにより、マトリックスを徐放性ビヒクルとして用いてマトリックスを直接または間接的な組織修復に用いることができる。
【０１２９】
本明細書中に記載の新規低濃度薬剤配合物、化粧配合物および／または治療配合物は、移植前あるいは移植時において、組織の修復、再生、および／もしくは再構築、ならびに／または活性エナメル物質の放出に用いることができる。一部の実施形態では、移植部位においてマトリックスを組織と合わせるために、投与部位で架橋結合を誘導することが望ましい。他の実施形態では、移植前にマトリックスを製造することが好都合である。
【０１３０】
また、移植前もしくは移植時に、またはさらには移植に続いて、ポリマーを架橋結合させてマトリックスを形成するときまたはそれに続いたときのどちらかに、細胞を薬剤配合物および／または治療配合物に加えることもできる。これは、マトリックスを架橋結合させて細胞の増殖もしくは内殖を促進するために設計された間質間隔を生じさせることに加えて、またはそれの代わりであり得る。
【０１３１】
ほとんどの場合は、細胞の成長もしくは増殖を促進するために薬剤配合物および／または治療配合物を導入することが望ましいが、一部の潜在的なシナリオでは、活性エナメル物質を用いて細胞増殖の速度を阻害する。具体的な適用は、手術後に接着の形成を阻害すること、および移植の配置後に線維芽細胞の創傷床内への内殖を阻害することである。
【０１３２】
特定の一態様では、本明細書中に記載の新規かつ改良されたエナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質の低濃度配合物は、治療剤、予防剤および／または化粧剤などの医薬品として用いること、特に、組織の修復、再生および／または再構築において用いること、生きた石灰化組織の部分間の結合を誘導すること、生きた石灰化組織の小片を他の生組織の小片上の結合部位に結合させること、皮膚または粘膜の創傷の治癒を改善すること、感染症もしくは炎症状態を予防または治療すること、象牙質を形成または再生させること、移植片の生着を促進すること、上皮由来の良性、やや悪性または悪性の新生物を治療すること、アポトーシスを誘導すること、あるいは細胞減少手術などの処置および／もしくは外傷後の創腔ならびに／または
組織欠陥を埋めることを意図する。
【０１３３】
第２の態様では、そのような薬剤配合物および／または治療配合物を、骨、軟骨および歯などの石灰化組織を修復するための、軟組織および粘膜などの非石灰化組織を修復するための、炎症および／または感染症に関与する状態を治療するための、象牙質を形成または再生するための、移植片の生着を促進するための、上皮由来の良性、半悪性または悪性の新生物を治療するための、アポトーシスを誘導するための、あるいは細胞減少手術などの処置および／または外傷後の創腔および／または組織欠陥を埋めるための医薬品の製造に用いる。
【０１３４】
歯周部組織の治癒ならびに再生、特に石灰化組織の再成長のために本明細書中に記載の新規かつ改良されたエナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質の低濃度配合物をブタの歯周部裂開モデルに施用することによって（実験セクションの実施例５参照）、驚くべきことに、再生された骨構造の形態学が、標準的な高濃度配合物（ＰＧＡ中に３０ｍｇ／ｍｌ）中のエナメルマトリックス誘導体を用いた場合に再生された構造と異なることが判明した。したがって、新規配合物は、初めて哺乳動物の身体内において骨成長または骨再成長の誘導などの石灰化組織の誘導新生を可能にすることが、判明した。
【０１３５】
本発明を特定の科学理論に限定することを望まずに、新しく形成される骨構造は、細胞の内殖および／もしくは遊走に適した高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療配合物内で形成されることが想定される。したがって、この新規マトリックスの体積、形状および位置を用いて、対応する骨発生の体積、形状および位置のモデリングを行うことができ、これにより、そのような配合物中の活性エナメル物質の実際の濃度に無関係に、このようなマトリックスの新規かつ複雑な適用が可能となる。当業者は、エナメルマトリックスの前記濃度は、それぞれの具体的な必要性に最も適するように調節することができることを理解するであろう。
【０１３６】
細胞の内殖および／もしくは遊走に適した高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む本発明の活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療配合物の、潜在的な新規の医薬ならびに／あるいは歯科の適用は、例えば、歯根分岐部欠損などの大きなもしくは複雑な歯の欠損の治療、または骨格中もしくは哺乳動物の身体の関節中の損失した骨構造の再成長である。さらに、この配合物を、骨の新生もしくは再成長をｉｎ
ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、または哺乳動物の身体外、および哺乳動物の身体の非末端位置で特定の形状へと誘導することに使用できることも想定されており、そのような新規骨構造は、哺乳動物の身体内への移植に容易に用いることができる。
【０１３７】
本発明の好ましい実施形態では、概要を上述した新規の医療適用に用いる活性エナメル物質の配合物は、ポリエチレングリコールと配合物１ｍｌあたり５ｍｇ未満である濃度の前記活性エナメル物質とを含む。それでもなお、このような新規な医療適用には、もちろん、ポリエチレングリコールまたは細胞の内殖および／もしくは遊走に適した任意の他の高分子マトリックスを含む、活性エナメル物質の配合物の使用も含まれていることができ、活性エナメル物質の濃度は５ｍｇ／ｍｌを超え、例えば、１０、２０もしくは３０ｍｇ／ｍｌを超える、またはさらに高い濃度などである。
【０１３８】
本発明による薬剤配合物および／または治療配合物とＥＭＤＯＧＡＩＮ（登録商標）とを含む、両配合物を同時に施用するためのキット、ならびにそのようなコンビナトリアルキットの医薬品としての使用がさらに想定される。
【０１３９】
本発明の持続放出配合物の利点
高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む本発明の薬剤配合物および／または治療配合物は持続放出配合物として用いることができる。タンパク質／ポリペプチドの生物学的半減期は多くの場合短く、したがって、身体に投与した場合はそれらの生物活性が迅速に失われる。また、一般的な配合物では、本明細書中に記載の持続放出配合物とは対照的に、投与後に最初に放出される大量の物質が原因で最初に物質の活性のバーストがあり、その後、生物活性は経時的に低下する。対照的に、本発明の薬剤配合物および／または治療配合物を用いることによって、放出時間および濃度放出のどちらに関しても活性エナメル物質の放出を制御することができる。また、本発明の薬剤配合物および／または治療配合物を用いることによって、活性エナメル物質の放出は局在化された放出であり、放出は所望の身体部位で制御された様式で起こる。本発明の配合物はまた、均一な量の活性エナメル物質が持続した期間、望ましい場合は数日間および数週間にさえわたって放出されることも可能にする。したがって、創傷治癒方法が改善される。
【０１４０】
活性エナメル物質が放出される期間および時間単位あたりの放出量は、ポリマーの濃度、ポリマーと活性エナメル物質との架橋結合の度合、配合物中の活性エナメル物質の濃度、酵素切断部位および本明細書中の他の箇所に記載したポリマーネットワークの分解速度に影響を与える他の生物活性のある物質の取込みに関して、薬剤配合物ならびに／または治療配合物の組成を変更することによって調節することができる。したがって、それぞれの具体的な適用について所望に応じて放出プロフィールを調節することができる。
【０１４１】
さらに、本明細書中に記載の新規配合物の一部は、例えばＰＧＡゲル中の標準的なエナメルマトリックス誘導体の配合物よりも形状安定性が高く、また、これらが細胞の内殖にも適するように設計されている場合は、これらは初めて、石灰化組織を特定の形状、体積および／または局在化への特異的な再成長の誘導に用いることができる。
【０１４２】
施用方法
一実施形態では、薬剤配合物および／または治療配合物を、身体内のｉｎ ｓｉｔｕもしくは身体上でゲル化させる。別の実施形態では、薬剤配合物および／または治療配合物を身体外で事前に形成し、その後、事前に形成した形状で施用することができる。
【０１４３】
上述のように、マトリックス材料は合成または天然の前駆体成分から作製することができる。用いる前駆体成分の種類に無関係に、成分の重合もしくはゲル化を可能とする条件下における互いの組合せまたは接触を防ぐために、混合物を身体に施用する前に前駆体成分は分離すべきである。投与前の接触を防止するために、組成物を互いから分離するキットを用い得る。重合を可能にする条件下で混合したのち、組成物は、活性エナメル物質が添加された三次元ネットワークを形成する。前駆体成分およびその濃度次第では、ゲル化は混合後ほぼ瞬時に起こることができる。
【０１４４】
一実施形態では、マトリックスはフィブリノーゲンから形成される。フィブリノーゲンは、適切な温度およびｐＨでトロンビンならびにカルシウム源に接触させた場合に、様々な反応カスケードを介したゲル化によりマトリックスを形成する。フィブリノーゲン、トロンビン、およびカルシウム源の３つの成分は別々に保管すべきである。しかし、３つの成分のうち少なくとも１つを分離しておけば、他の２つの成分を投与前に混合してもよい。フィブリノーゲンは、生理的ｐＨ（ｐＨ６.５〜８.０、好ましくはｐＨ７.０〜７.５の範囲）の緩衝溶液中に溶かし（これは安定を増加させるためにさらにアプロチニンを含んでいてよい）、塩化カルシウム緩衝液中のトロンビンの溶液（例えば４０〜５０ｍＭの濃度範囲）とは別に保管することができる。フィブリノーゲンの緩衝溶液は、追加で１５０ｍＭの好ましい濃度のＮａＣｌを含む５０ｍＭの好ましい濃度のヒスチジン緩衝溶液、またはトリス緩衝液生理食塩水（好ましくは３３ｍＭの濃度）であることができる。好まし
い実施形態では、活性エナメル物質、フィブリノーゲン、トロンビン、およびカルシウム源を含むキットを提供する。場合により、キットはＸＩＩＩａ因子などの架橋結合酵素も含み得る。活性エナメル物質は、活性エナメル物質の生物活性ドメイン、架橋結合酵素の基質ドメインおよび基質ドメインと生物活性ドメインとの分解部位を含む融合タンパク質であることができる。融合タンパク質は、フィブリノーゲンまたはトロンビンの溶液のどちらか中に存在し得る。好ましい実施形態では、フィブリノーゲン溶液が融合タンパク質を含む。
【０１４５】
溶液は、混合チャンバおよび／もしくは針ならびに／またはスタティックミキサーによって両方のシリンジの内容物を圧迫することで混合を行う、２方向シリンジ装置によって混合することが好ましい。他の同等に好ましい選択肢は、２つの溶液を容器に入れ、内部でそれらを混合し、例えばシリンジに移し、その後に施用することである。最適には、両方の溶液をシリンジ１内のわずかに酸性の緩衝液に溶かし、その後、塩基（および代わりに粘度調整剤）を含むメスルアーを備えたシリンジに取り付け、シリンジ−シリンジの混合によって混合することができる。
【０１４６】
本発明の好ましい実施形態では、フィブリノーゲンおよびトロンビンはどちらも凍結乾燥した形態で別々に保管する。２つのうちのどちらかが融合タンパク質を含むことができる。使用前にトリスまたはヒスチジン緩衝液をフィブリノーゲンに加え、緩衝液はさらにアプロチニンを含んでいてよい。凍結乾燥したトロンビンを塩化カルシウム溶液に溶かす。次いで、フィブリノーゲンおよびトロンビン溶液を別々の容器／バイアル／シリンジ体に入れ、２方向シリンジなどの２方向連結装置によって混合する。場合により、容器／バイアル／シリンジ体は２分されており、したがって、シリンジ体の壁に垂直な調節可能な隔壁によって分離されている２つのチャンバを有する。一方のチャンバは凍結乾燥した凍結乾燥したフィブリノーゲンまたはトロンビンを含み、他方のチャンバは適切な緩衝溶液を含む。プランジャーを下に押すと、隔壁が移動し、緩衝液をフィブリノーゲンチャンバ内に放出してフィブリノーゲンを溶かす。フィブリノーゲンおよびトロンビンがどちらも溶解したあと、両方の２分したシリンジ体が２方向連結装置に取り付けられており、連結装置に取り付けられた注入針を介して内容物を圧迫することによって混合する。場合により、連結装置は内容物の混合を向上するためにスタティックミキサーを含む。
【０１４７】
別の同等に好ましい実施形態では、混合前にフィブリノーゲンを８倍希釈し、トロンビンを２０倍希釈する。この比により、約１分のゲル化時間がもたらされる。
【０１４８】
さらなる実施形態では、本発明の低濃度配合物中に含まれる高分子マトリックスは、マイケル付加反応を受けることができる合成前駆体成分から形成される。求核性前駆体成分（マルチチオール）は塩基性ｐＨでのみマルチアクセプター成分（コンジュゲートした不飽和基）と反応するので、混合前に別々に保管しなければならない３つの成分は、塩基、求核性成分およびマルチアクセプター成分である。マルチアクセプターおよびマルチチオール成分は、どちらも緩衝液または酸中の溶液として保管することができる。ＰＥＧ−アクリレートは、通常は乾燥保管する。したがって、代替方法では、どちらのＰＥＧも乾燥保管し、使用前に塩基性緩衝液に溶かすか（実施例２に記載のように）、または、ＰＥＧ−チオールを酸性緩衝液中で保管し、使用前にＰＥＧ−アクリレートと混合し、次いで塩基と混合する（実施例３参照）。どちらの組成物も、細胞付着部位およびさらに活性エナメル物質を含むことができる。したがって、この系の第１の組成物は例えば求核性成分の溶液を含むことができ、系の第２の組成物はマルチアクセプター成分の溶液を含むことができる。２つの組成物のどちらかまたは両方が塩基を含むことができる。別の実施形態では、マルチアクセプターおよびマルチチオールを溶液として第１の組成物に含めることができ、第２の組成物が塩基を含むことができる。連結および混合は、フィブリノーゲンについて事前に記載したものと同じ方法で起こる。２分したシリンジ体は、同様に合成前駆
体成分に適している。フィブリノーゲンおよびトロンビンの代わりに、マルチアクセプターおよびマルチチオール成分を粉砕形態で一方のチャンバに保管し、他方のチャンバが塩基性緩衝液を含む。他の同等に好ましい選択肢は、２つの溶液を容器に入れ、内部でそれらを混合し、例えばシリンジに移し、その後に施用することである。最適には、両方のＰＥＧをシリンジ１内のわずかに酸性の緩衝液に溶かし、その後、塩基（および代わりに粘度調整剤）を含むメスルアーを備えたシリンジに取り付け、シリンジ−シリンジの混合によって混合することができる。
【０１４９】
定義
本明細書中で一般的に用いる「生体材料」とは、生物学系と作用を及ぼしあって、身体の任意の組織、器官もしくは機能の評価、処置、増強、または置換を、材料に応じて持続的あるいは一時的に行うことを意図する材料をいう。用語「生体材料」および「マトリックス」は本明細書中では同義で用いられ、マトリックスの性質に応じて、水で膨潤させることができるが水に溶解しない、すなわち、特定の一定期間の間身体内に留まって外傷または欠損した軟組織および／もしくは硬組織の特定の支援機能を満たすヒドロゲルを形成することができる、架橋結合した高分子ネットワークを意味する。
【０１５０】
用語「タンパク質マトリックス」とは、イオン結合、共有結合、もしくはそれらの組合せによるタンパク質前駆体分子と高分子ネットワークとの架橋結合、または１つもしくはそれ以上の高分子材料、すなわちマトリックスを膨潤させて高分子ネットワークを形成することによって形成したマトリックスを意味する。
【０１５１】
「多糖マトリックス」とは、イオン結合、共有結合、もしくはそれらの組合せによる多糖前駆体分子と高分子ネットワークとの架橋結合、または１つもしくはそれ以上の高分子材料、すなわちマトリックスを膨潤させて高分子ネットワークを形成することによって形成したマトリックスを記載するために用いる。
【０１５２】
「合成マトリックス」とは、イオン結合、共有結合、もしくはそれらの組合せによる合成前駆体分子と高分子ネットワークとの架橋結合、または１つもしくはそれ以上の高分子材料、すなわちマトリックスを膨潤させて高分子ネットワークを形成することによって形成したマトリックスを意味する。
【０１５３】
用語「高分子マトリックス」とは、上述のタンパク質、多糖および合成マトリックスのいずれかを含めるために用いる。ポリマー自体は、少なくとも５つの単量体の連合によって形成した大分子である。
【０１５４】
本明細書中で用いる「エナメルマトリックス」とは、任意の関連する天然源、すなわち、歯が発生中の哺乳動物から得ることができる、エナメルの前駆体を意味する。適切な由来源は、例えば子ウシ、ブタまたは子ヒツジなどの屠殺した動物からの発生中の歯である。別の由来源は、例えば魚の皮膚である。本発明の文脈では、用語「活性エナメル物質」とは、その由来源を区別せずにエナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質を包含するために用いる。用語「エナメルマトリックス」、「エナメルマトリックス誘導体」（ＥＭＤ）、「エナメルマトリックスタンパク質」などを上述のポリマーマトリックスと混同してはならない。
【０１５５】
本明細書中で一般的に用いる「強力な求核剤」とは、極性の結合を形成する反応において求電子剤に電子対を提供できる分子をいう。好ましくは、強力な求核剤は生理的ｐＨで水よりも求核性が高い。強力な求核剤の例はチオールおよびアミンである。
【０１５６】
本明細書中で一般的に用いる「コンジュゲートした不飽和結合」とは、炭素−炭素、炭
素−異種原子もしくは異種原子−異種原子の多重結合を単結合に変化させること、または合成ポリマーもしくはタンパク質などの巨大分子に官能基を連結させることをいう。そのような結合は、付加反応を受けることができる。
【０１５７】
本明細書中で一般的に用いる「コンジュゲートした不飽和基」とは、炭素−炭素、炭素−異種原子もしくは異種原子−異種原子の多重結合から単結合への変化を含み、付加反応を受けることができる多重結合を有する、分子または分子の領域をいう。コンジュゲートした不飽和基の例には、それだけには限定されないが、ビニルスルホン、アクリレート、アクリルアミド、キノン、およびビニルピリジニウム、例えば２−または４−ビニルピリジニウムならびにイタコネートが含まれる。
【０１５８】
本明細書中で一般的に用いる「合成前駆体分子」とは、天然に存在しない分子をいう。
本明細書中で一般的に用いる「天然に存在する前駆体成分またはポリマー」とは、天然に見つけることができる分子をいう。
【０１５９】
本明細書中で一般的に用いる「官能化」とは、官能基または部分の付着をもたらす様式の分子の改変をいう。例えば、分子を強力な求核剤またはコンジュゲートした不飽和にする分子を導入することによって、分子を官能化し得る。好ましくは、分子、例えばＰＥＧを官能化して、チオール、アミン、アクリレート、またはキノンにする。特に、ジスルフィド結合を部分的または完全に還元して遊離チオールを作製することによって、タンパク質も有効に官能化し得る。
【０１６０】
本明細書中で一般的に用いる「官能性」とは、分子上の反応性部位の数をいう。
本明細書中で一般的に用いる「分岐点の官能性」とは、分子中の１点から伸びるアームの数をいう。
【０１６１】
本明細書中で一般的に用いる「接着部位または細胞付着部位」とは、分子、例えば細胞表面上の接着促進受容体が結合するペプチド配列をいう。接着部位の例には、それだけには限定されないが、フィブロネクチンからのＲＧＤ配列およびラミニンからのＹＩＧＳＲ配列が含まれる。好ましくは、マトリックスに架橋結合可能な基質ドメインを含めることによって接着部位を生体材料内に取り込ませる。
【０１６２】
本明細書中で一般的に用いる「生物活性」とは、目的タンパク質によって媒介される機能的事象をいう。一部の実施形態では、これには、ポリペプチドと別のポリペプチドとの相互作用を測定することによってアッセイが行われる事象が含まれる。また、これには、目的タンパク質が細胞の成長、分化、死、遊走、接着、他のタンパク質との相互作用、酵素活性、タンパク質リン酸化もしくは脱リン酸化、転写、または翻訳に対して有する効果のアッセイを行うことも含まれる。
【０１６３】
本明細書中で一般的に用いる「再生」とは、硬組織または軟組織、特に骨もしくは歯組織など、何かの一部分あるいは全体を成長させて元に戻すことを意味する。
【０１６４】
本明細書中で一般的に用いる「多官能性」とは、１個の分子（すなわち、単量体、オリゴマーおよびポリマー）あたり複数の求電子性ならびに／または求核性の官能基であることをいう。
【０１６５】
本明細書中で一般的に用いる「自己選択的反応」とは、組成物の第１の前駆体成分が組成物の第２の前駆体成分と、およびその逆も、混合物中または反応部位に存在する他の化合物とよりもはるかに速く反応することを意味する。本明細書中で用いるように、他の生体化合物より、求核剤は優先的に求電子剤に結合し、求電子剤は優先的に強力な求核剤に
結合する。
【０１６６】
本明細書中で一般的に用いる「架橋結合」とは、共有結合の形成を意味する。しかし、イオン結合、または共有結合および非共有結合の組合せなどの、非共有結合の形成を言う場合もある。
【０１６７】
「ゲル」とは、水溶液の連続的な相によって有限に膨潤させた、架橋結合したポリマーネットワークの材料である。
【０１６８】
本明細書中で一般的に用いる「高分子ネットワーク」とは、単量体、オリゴマーまたはポリマーの実質的にすべてがその利用可能な官能基を介した分子間共有結合によって結合して１つの巨大な分子をもたらす方法の生成物を意味する。
【０１６９】
本明細書中で一般的に用いる「生理的」とは、生きた脊椎動物中で見つけることができる通りの条件を意味する。特に、生理的条件とは、温度、ｐＨなどの人体中の条件をいう。生理的温度とは、特に３５℃〜４２℃、好ましくは約３７℃の温度範囲を意味する。
【０１７０】
本明細書中で一般的に用いる「架橋結合密度」とは、それぞれの分子の２つの架橋結合間の平均分子量（Ｍc）をいう。
【０１７１】
本明細書中で一般的に用いる「当量」とは、物質１ｇあたりの官能基のｍｍｏｌをいう。
【０１７２】
本明細書中で一般的に用いる「膨潤」とは、生体材料による水の取込みによる、体積および質量の増加をいう。用語「水の取込み」および「膨潤」は、本出願を通して同義で用いられている。
【０１７３】
本明細書中で一般的に用いる「平衡状態」とは、水または緩衝液中の一定条件下で保管した場合に、ヒドロゲルが質量の増加も低下も受けない状態をいう。
【０１７４】
本発明の文脈では、用語「細胞閉塞性」とは、前記マトリックスによって形成された区画から細胞を閉鎖または遮断することができ、細胞が本質的に前記区画内または外へ横断することができないようにする、高分子マトリックスの特徴を説明するために用いる。例えばこの障壁様の機能は、事実上膜としての形状を有し、前記区画への入出を遮断することを意図する細胞よりも小さな孔径を有する高分子マトリックスによって、容易にすることができる。当然のことながら、孔の正確な寸法は遮断する細胞の大きさに依存する。
【０１７５】
〔実施例１〕
実験セクション
サルにおける歯支持組織の再生
本研究の目的は、ビヒクルのアルギン酸プロピレングリコールと混合した様々な濃度のエナメルマトリックス誘導体の、歯支持組織の再生に対する効果を評価すること、およびその生物学的安全性を評価することであった。本発明で用いたエナメルマトリックス誘導体は、標準のエナメルマトリックス調節物の低分子量タンパク質画分からなっていた。
【０１７６】
材料および方法
試験物質：エナメルマトリックス誘導体、バッチＰＥＵ８０１。
由来源；エナメルマトリックスをブタの歯胚から単離し、ホモジナイズし、低分子量タンパク質画分を抽出した。
ビヒクル；アルギン酸プロピレングリコール溶液２.５％ｗ／ｖ、バッチＰＧＡ８０３。
試験物質およびビヒクルの保管；試験物質およびビヒクルは−１８℃で保管した。物質およびビヒクルを含む瓶は、使用前に室温と平衡化させた。
【０１７７】
試験製剤の投与；層流フード下で無菌的に物質をビヒクルに溶かし、サルに個別に用いた。試験物質の最終濃度を実験前に決定し、再構成した溶液１ｍｌあたりのタンパク質のｍｇとして表した（表４）。
【０１７８】
動物：３〜４歳の７匹のサル（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））をＰｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、スウェーデンＳｏｌｎａから購入し、動物は実験を通して収容した。それぞれの動物に個別の同定コードを与えた。動物は制御された環境下で個別のケージ内に入れておいた：
温度：１８〜２２℃
相対湿度：４０〜７０％
光：午前６時〜午後６時
動物には標準のサル用食餌（Ｒ３、Ｅｗｏｓ ＡＢ、スウェーデンＳｏｄｅｒｔａｅｌｊｅ）および水道水を無制限に与えた。食餌には毎日新鮮な果実を補足した。
【０１７９】
実験の設計：それぞれのサルの歯を試験または対照群に割り当てた。改変ウィドマン技術に従った歯周部手術を行った。皮弁を再配置および縫合する前に、試験製剤を試験歯の根表面に施用した。対照歯には擬似手術を行ったが、任意の試験製剤は与えなかった。工程毎の様式の手順は以下の通りである。
【０１８０】
１．手術の３０分前、試験物質を含むバイアルを製造した。２本の歯のそれぞれの群について、１つの試験物質のバイアルを用いた。試験物質が溶解するために２０分間を許容した。溶液を３ｍｌのシリンジでとり、プランジャーまで沈ませた。プランジャーを押すことによってシリンジから空気を丁寧に取り除いた。
２．ペントバルビタールナトリウムを用いて動物に麻酔を行い、手術用に選択した領域に局所麻酔を行って消毒した。歯の口および顔側の全層皮弁（粘膜骨膜弁）を持ち上げた。
３．大きな円形バー（ｂｕｒｒ）を用いて、滅菌生理食塩水で常に洗浄しながら頬側骨板を取り除いた。この領域を滅菌生理食塩水で十分にすすぎ、暴露した歯根を３０秒間、３７％のオルトリン酸またはクエン酸（ｐＨ１）でエッチングした。最後に滅菌生理食塩水ですすいだ。過剰の液体はスワブで拭き取った。
４．試験製剤をすぐに施用し、骨欠損の最も先端部分から開始して暴露した根表面全体を被覆した。
５．皮弁を再配置し、縫合した。歯周部の包帯剤は用いなかった。
６．対照および実験歯の周辺の局所的な臨床的所見ならびにサルの一般的な挙動を毎日記録した。
【０１８１】
最終研究；５６日（８週間）後、過量のペントバルビタールナトリウムによってサルを屠殺し、対照歯および試験歯を組織学的に評価した。
【０１８２】
組織学的標本：実験および対照歯ならびに周辺の歯槽骨および軟組織を解剖して取り出し、光学顕微鏡の検査に用いた。標本を１０％の冷緩衝ホルマリン中で４８時間固定し、５％のギ酸中で脱石灰化し、パラフィン中に包埋し、歯の長軸に平行に、頬−舌の方向に切片を作製した。２０μｍ間隔のレベルで連続切片を作製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。その後、これらを透過した通常光および偏光中で検査した。
【０１８３】
評価：暴露した根表面上の組織反応を記録し、新しい歯槽骨および新しいセメント質で
被覆された、暴露した根表面の割合で示した距離を測定した（図１参照）。
【０１８４】
統計的方法：非パラメトリック統計的方法、すなわちウィルコクソンの順位和検定およびマン−ホイットニーＵ試験を用いて、試験および対照部位間の差異の有意性を評価した。有意性のレベルは以下のように示す：
１．ＮＳ 有意ではない
２．* ｐ＜０.０５
３．** ｐ＜０.０１
４．*** ｐ＜０.００１
【０１８５】
データおよび標本の保管；この研究のすべての生データ、標本、プロトコルおよび最終報告書は、ＢＩＯＲＡ ＡＢ、Ｋｒｏｋｕｓｖａｅｇｅｎ １２、１８１ ３１ Ｌｉｄｉｎｇｏｅ、スウェーデンのアーカイブに保管されている。
関連参考文献：ＢＩＯＲＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔ ９／８８。
【０１８６】
結果
臨床観察：すべての動物は試験期間の間中健康を保っており、注目すべき有害な副作用はなかった。試験歯および対照歯のどちらの治癒も平穏であった。
一般的な挙動：すべての動物が通常通りの挙動であり、個々の動物間で明らかな差異はなかった。
食物消費：食物および水の消費は通常通りに見受けられ、個々の動物間で明らかな差異はなかった。
【０１８７】
最終研究：
巨視的検査：全体の外見から、すべての試験歯の周辺の歯肉が健康であったことが明らかとなり、明らかな歯肉炎症はなかった。注目すべき有害な副作用もなかった。すべての対照歯の頬側歯肉が、歯肉縁部がもたれかかった中等度の炎症を示した。
顕微鏡検査；顕微鏡検査および形態計測検査により、試験歯および対照歯の群の間で有意な差異が明らかとなった（表４および５）。
装着した根表面にしっかりと付着した新しいセメント質は、試験歯中で様々な度合まで形成されていた。偏光顕微鏡観察に明らかになったように、セメント質層は、歯周部膜に関連する機能的に方向づけられた歯周部線維を含んでいた。さらに、歯周部膜に付着した歯槽骨は、暴露された実験根表面上に様々な度合で存在していた（表４および５）。接合部上皮は新しく形成されたセメント質層よりも遠くまで増殖しておらず、歯肉炎症は事実上存在していなかった。
対照歯では、新しい歯槽骨も任意の有意な新しいセメント質も、どちらも形成されていなかった。最初に暴露した根表面は、根の約半分まで退縮した長い接合部上皮によって被覆されていた。中等度の歯肉炎症が頬側口腔粘膜中に存在していた。
統計的解析；試験歯および対照歯の群の間の差異は、様々なレベルで有意であることが判明した（表４および５）。
【０１８８】
考察
本研究の目的は、ビヒクルのアルギン酸プロピレングリコールと混合した様々な濃度のエナメルマトリックス誘導体の、歯支持組織の再生に対する効果を評価すること、およびその生物学的安全性を評価することであった。本研究で用いたモデルは、エナメルマトリックス誘導体の臨床的使用を意図した臨床設定とほぼ同一である。試験製剤を、手術の補助剤として、従来の歯周部手術中に投与した。投与した用量は、体重に基づいて、ヒトでの使用を意図する用量である同等の大きさの単一の施用中にタンパク質７.５ｍｇより、
低いものも高いものもあった。擬似手術が対照として用いられた。
【０１８９】
歯支持組織（セメント質、歯周部膜および歯槽骨）は、通常は周辺歯周病の治療後に再生しない。その代わりに、暴露した根表面は、根の機能的な付着を提供しない上皮細胞の層によって被覆される。したがって、歯周病によって損失した歯支持組織は従来の方法で再生することができない。これは、対照歯について記録された結果によって確認された。しかし、５.３、１０.７および２６.７ｍｇのタンパク質／ｍｌの試験製剤で整えた根表
面では、明らかに新しい歯周部付着器官が発生していた。歯根表面の形成に関する最近の研究により、これが、セメント質だけでなく、エナメル様組織の薄い層でも被覆されていることが示された。このエナメル様組織は、セメント質の形成の前に、根の発生中に形成される。これは、セメント質を形成する細胞が成長することができる適切な表面を提供していると考えられる。したがって、セメント質がエナメル様組織上に堆積され、適切な付着器官が発生する。
【０１９０】
本研究は、削り取った（装着した）根表面を、１０ｍｇを超えるエナメルマトリックス誘導体の用量で条件づける（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）ことによって、正常な接着セメント質および関連する歯周部膜（機能的歯根膜）が形成されることを示した。さらに、歯周部膜に関連する歯槽骨が形成されていた。これらの構造は、通常は従来の歯周部手術後に形成されない。そのようではなくて、歯肉からの上皮が暴露した根表面を被覆し、周辺骨レベルは、最良でも同じに保たれる。このことは、本研究の発見に基づいた成功した歯周部再生の新規定義の必要性を強調している。
【０１９１】
成功した歯周部再生は、装着した根表面にしっかりと付着した新しいセメント質の形成を含まなければならない。セメント質層は、歯周部膜に関連する機能的に方向づけられた歯周部線維を含まなければならない。さらに、新しく形成された歯周部膜に付着した歯槽骨が存在しなければならない。
【０１９２】
また、新しい付着および関連する歯槽骨の回復が、再配置された口内軟組織によって被覆された根表面レベルにのみ起こることも、明らかである。根表面が冠状方向により高く被覆されていればいる程、周辺骨のより高い増加が可能である。さらに、結果から、ＰＧＡ中に溶解したエナメルマトリックス誘導体の濃度、すなわち５ｍｇのタンパク質／ｍｌ未満は、歯周部再生の成功の誘導には不十分であることを結論づけることができる。しかし、この濃度を超えれば、根表面の十分な被覆が可能であると考えられる。
【０１９３】
【表４】
【０１９４】
表５
対照群と実験群との統計的比較
試験群
試験部位の数：２０
【０１９５】
【表５】
【０１９６】
【表６】
【０１９７】
対照群
対照部位の数：８
周辺骨の平均増加：０.０％
セメント質の平均増加：１.１％
【０１９８】
統計的有意性試験
非パラメトリック統計的方法、マン−ホイットニーＵ試験を用いて、試験および対照部位間の差異の有意性を評価した。セメント質および周辺骨の両方の回復に関して、試験群と対照群とを比較した場合の有意性のレベルは以下であることが判明した。
【表７】
【０１９９】
〔実施例２〕
ラットの危険な大きさの頭蓋欠損
ラット頭蓋手術
この動物実験プロトコルは、スイス連邦法に従って（Ｎｒ．１５２／１９９７号）、チューリッヒ州の獣医学当局によって評価および許可されている。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙシロネズミを用いた（８４〜９２日齢、すべて雌）。これらは、４匹以下の動物の群で収容し、標準の食餌を維持した。
【０２００】
Ｈａｌｏｔｈａｎ／Ｏ2を導入および維持することによって２７匹の動物に麻酔した。
手術領域をクリップで挟み、Ｂｅｔａｄｉｎｅで無菌的手術の準備を行った。経鼻骨から正中矢状稜までの直線状の切開を行った。軟組織を反転し、骨膜を部位から解剖した（後頭骨、前頭骨、および頭頂骨）。硬膜の穿孔を注意深く回避しながら、歯科用ハンドピース中でトレフィンを用いて８ｍｍの開頭術欠損を作製した。その後、手術領域に生理食塩水を流して骨細片を除去し、事前に形成したゲルを欠損内に配置した。その後、スキンステープラーで軟組織を閉じた。手術後、ブプレノルフィン（０.１ｍｇ／ｋｇ）の皮下注
射によって鎮痛を提供した。その後、移植後の適切な時期にラットをＣＯ2窒息によって
屠殺した。５ｍｍの連続的な骨を有する開頭術部位を頭蓋骨から回収し、４０％のエタノールに入れるか、または固定培地に入れた（４％のパラホルムアルデヒド）。
すべての工程において、手術者は欠損の治療に関して盲検であった。
【０２０１】
ゲルの製造
ＥＭＤを０.１０％の酢酸に溶かし、最終ゲルの所望するＥＭＤ含有量に応じて様々な
濃度のストック溶液を得た。システイン−ＲＧＤ、ＰＥＧ−ジチオール３.４ｋ、および
４本のアームのＰＥＧ−アクリレート１５ｋを、０.３０Ｍのトリエタノールアミン／Ｈ
Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８.５に溶かした。すべての溶液を混合して、等モル数のアクリル基お
よびチオール基、システイン−ＲＧＤ８μｇおよび０〜２５０μｇのＥＭＤを有する約１５質量％のＰＥＧを含む２０μｌの溶液を得ることによって、ＰＥＧ−ＥＭＤゲルを注型した。溶液を１時間３７℃でゲル化させ、その後、ゲルをＰＢＳ、ｐＨ７.４に移した。
数時間後、これらは１００μｌの体積および８ｍｍの直径まで膨潤していた。
【０２０２】
Ｘ線撮影
屠殺および周囲５ｍｍの連続的な骨を有する欠損部位の除去後に得られた標本を、歯科用Ｘ線撮影ユニットを用いて、超高速歯科用フィルムで画像撮影した（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国ＮＹ）。その後、Ｘ線像のスキャニングを行い、デジタル画像を画像解析プログラムで処理した（Ｌｅｉｃａ（登録商標）Ｑ−Ｗｉｎ）。欠損の内部および外部に形成された新しい骨の面積を、異なる配合物の治癒速度と比較した最初の欠損面積の割合として計算した（図２参照）。
【０２０３】
〔実施例３〕
ブタにおける歯支持組織の再生
目的：
擬似対照歯と比較して、顎における治癒および再生方法に対するエナメルマトリックス誘導体および／または移植材料、ＰＥＧゲルを用いた治療の局所効果を臨床的、定量的ならびに組織学的に比較するために、裂開モデルを用いることである。
動物：
ミニブタＳｕｓ ｓｃｒｏｆａの成体（＞１８カ月）、雌。手術前に動物を環境馴化させ、地域の動物施設内で観察した。
【０２０４】
実験の説明：
１．動物を麻酔下で維持する（筋肉内のＫｅｔａｌａｒ＋静脈内のＰｅｎｔｏｔａｌおよびＤｏｒｍｉｃｕｍ）。キシロカイン−アドレナリンを用いた局所麻酔（歯科用）。
２．動物を検査した。
３．必要な場合、ブタの口の周りを剪毛し、その後、皮膚をクロルヘキシジン（登録商標）で洗浄した（６０％のＥｔＯＨ中５ｍｇ／ｍｌ）。手術領域を写真撮影した。
４．Ｑ１から開始する：浸潤麻酔を頬粘膜ひだに施用した。歯間乳頭および周辺歯肉領域への注入は避けるべきである。
５．炎症の度合を評価し、歯垢および歯石を除去した。
６．第１小臼歯から第１臼歯まで、末端を垂直な解放切開として周辺切開を行った。歯槽骨を暴露するために粘膜骨膜弁を持ち上げた。
７．バーおよび手動装置を用いて、それぞれの歯根から頬側骨を注意深く取り除き、深さ約６ｍｍおよび幅２ｍｍの裂開欠損を作製した。滅菌生理食塩水で常に洗浄しながら、第２小臼歯から第４小臼歯まで、ＣＥＪから６ｍｍの距離まで、暴露した根表面から歯根膜およびセメント質を除去した。欠損の先端部（ＡＥＤ）を、切痕で印つけた。それぞれの四半部について合計で６つの欠損を作製した（すなわちそれぞれの顎／動物で１２個）。
８．靱帯およびセメント質を取り除いたあと、歯の表面をＰｒｅｆＧｅｌ（登録商標）（ＢＩＯＲＡ、スウェーデン）で２分間処理し、その後、十分な量の滅菌生理食塩水で洗浄した。
９．ＣＥＪからＡＥＤの距離を測定し、記録し、そして写真撮影によって文書化した。
１０．試験材料（治療リスト参照、擬似＝無し）を欠損に施用し、写真撮影によって文書化した。
１１．皮弁をすぐに再配置し、ｖｉｃｒｙｌ縫合糸で閉じた。皮弁は骨欠損を完全に被覆し、皮弁は徹底的に再配置および修復されており、これを再度写真撮影によって文書化した。
１２．第４〜１４項に従って、手順をＱ２用に繰り返した。
【０２０５】
治療後：
動物には手術後１週間、軟い食餌を与えた。抗生物質（ストレプトシリン（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｉｌｌｉｎ）、５ミリ単位／日）を手術から２日間投与した。鎮痛剤（ボルタレン、手術後に２５ｍｇ）。
【０２０６】
観察：
４、６および８週間目に、動物を鎮静させ、実験的欠損の治癒を検査した。標準のポケットプローブ（ヒトの臨床）を用いて欠損の深さの調査を行い、それぞれの欠損について「ポケットプローブでの深度」をミリメートルで、歯肉退縮の程度（存在する場合）と一緒に記録した。治癒を写真撮影によって文書化した。すべての有害事象を記録した。
【０２０７】
終止：
実験を終わらせ、８週間の観察ののちに動物を屠殺した：
１．２９０ｇ／１０００ｍｌの強アルコール中の４０ｍｌのペントバルビタールナトリウム１００ｍｇ／ｍｌを、食間に、試験スキームに従って手術後８週間、動物に与えた。
２．完全な根を有する実験歯のみが含まれる区域をそれぞれの実験顎から切り出した。
３．分離された区域は、すぐに大量の（２００ｍｌ）新しく製造した、冷蔵した（４℃）リン酸緩衝ホルマリン、ｐＨ７.４に浸した。容器には、動物番号、四半部番号、手術
者および日付を注意して標識しなければならない。良好な固定を保証するために、ホルマリンを４時間に１回交換した。
４．試料は、可能な限り速くエポキシ中への包埋および粉砕による切片形成のために処理する。処理が可能となるまでは、ホルマリンで固定した試料は冷蔵庫で保管した。
【０２０８】
キットの製造
すべての材料は無菌的条件下で取り扱った。
【０２０９】
ＰＥＧ−チオール／ＥＭＤ溶液：
４本アームのＰＥＧ−チオール２ｋ（Ｎｅｋｔａｒ）１.２０ｇを滅菌した０.０５％酢酸水溶液２０ｍｌに溶かした。この溶液を濾過によって滅菌した。滅菌ＥＭＤ０.５２０
ｇを滅菌した０.０５％酢酸水溶液１０ｍｌに溶かした。両方の溶液を合わせ、滅菌した
ガラス製シリンジをそれぞれＰＥＧ−チオール／ＥＭＤ溶液３００μｌで満たした。（シリンジ１個あたり４本アームのＰＥＧ−チオール２ｋ１２ｍｇおよびＥＭＤ５.２ｍｇ）
【０２１０】
活性化剤の溶液：
トリエタノールアミン１.８６５ｇ（Ｍｅｒｃｋ、ＰｈＥｕｒ）をＷＦＩ２５０ｍｌに
溶かし（０.０５０Ｍ）、ＨＣｌを用いて溶液のｐＨをｐＨ８.６に調節した。
【０２１１】
強い攪拌の下で、Ｋｅｌｔｏｎｅ ＨＶＣＲ（ＩＳＰ）５.０ｇをトリエタノールアミ
ン／ＨＣｌ溶液９５ｍｌに溶かした。生じた溶液を、メスルアーを備えたプラスチック製シリンジに満たした（６７８ｍｇ）。強い攪拌下で、Ｃｅｋｏｌ １０'０００（Ｎｏｖ
ｉａｎｔ；Ｓ１４０８）３.０ｇをトリエタノールアミン／ＨＣｌ溶液８０ｍｌに溶かし
た。生じた溶液を、メスルアーを備えたプラスチック製シリンジに満たした（６７８ｍｇ）。活性化剤のシリンジを個別にピール・バッグ内に入れ、蒸気滅菌した（１２１℃／１５分間）。
【０２１２】
ＰＥＧ−アクリレートのバイアル：
４本アームのＰＥＧ−アクリレート１５ｋ（Ｎｅｋｔａｒ）３.６ｇをＷＦＩ３５ｍｌ
に溶かした。クリーンルーム内で、この溶液の０.７０ｍｌのアリコートをバイアルに満
たし、凍結乾燥した。凍結乾燥後、バイアルに窒素を満たして閉じた。（バイアル１個あたり４本アームのＰＥＧ−アクリレート１５ｋ７２ｍｇ）
【０２１３】
ＰＥＧ／ＥＭＤゲルの製造（ゲル１ｇあたり４.９ｍｇのＥＭＤ）：
施用の直前に、凍結乾燥したＰＥＧ−アクリレートをＰＥＧ−チオール／ＥＭＤ溶液で再構成し、生じた溶液をガラス製シリンジに移して戻し、その後、これを活性化剤のシリンジと連結した。プランジャーを約１５回往復移動させることによって両シリンジの内容物を混合した。混合後、生成物を約２分間、完全にゲル化する前に施用することができる。
【０２１４】
【表８】
【０２１５】
すべての欠損は、試験物質を施用する前にＰｒｅｆＧｅｌ（登録商標）を用いて１分間で処理し、次いで生理食塩水で十分にすすいだ。
【０２１６】
用いた物質のリスト：
ＰｒｅｆＧｅｌ ロット１００８
Ｅｍｄｏｇａｉｎ ３０ｍｇ／ｍｌ ロットＥＴＰ３１０２
ＰＧＡ ロットＦｏＵ ２１１３、１.５ｍｌのバイアル中
ＥＭＤ９.５ｍｇ／バイアル ロット９１０２
骨セラミック ロットＬＫ ０４０１０９
【０２１７】
結果
表７から明らかに見られるように、ＧＬＰ４１／４７中の４.９ｍｇ／ｍｌの濃度の活
性エナメル物質誘導体（ＥＭＤ）は、実験的欠損の治癒に対して、３０ｍｇ／ｍｌのＥｍｄｏｇａｉｎと同等の、またはさらにはより明白な効果を有していた。結果を図３に要約した。また、図３で推論できるように、空、ＥｍｄｏｇａｉｎおよびＫｅｌｔｏｎｅまたはＣｅｌｃｏゲルのどちらか中の４.９ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＭＤを比較すると、４週間
後に、ＥｍｄｏｇａｉｎはＫｅｌｔｏｎｅまたはＣｅｌｃｏのゲルのどちらか中の４.９
ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＭＤよりも幾分か良好な性能を示したが、６週間後にはこれらは概ね同等の性能を示し、８週間後には、ＫｅｌｔｏｎｅまたはＣｅｌｃｏゲルのどちらか中の４.９ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＭＤの方がより良好な性能を示した。これは、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでのこの種のゲルについて判明した（３７℃、ｐＨ７.４）、４週間の分解時間に
非常によく対応していた。ＰＥＧゲルが存在している限りは、それが一定の度合まで、骨の欠損の充填を妨害することが予測された。
【０２１８】
【表９】
【０２１９】
〔実施例４〕
ウサギ頭蓋円柱状ドリル欠損
この実験の結果は、誘導骨再生に対する新しい生物活性骨の代用品の効果に関する情報を提供するものである。
【０２２０】
仮説：
活性エナメル物質と最適化された細胞内殖能力を有する新しく発生したマトリックスとを結合させることの効果は、標準の移植手順（正の対照）および自発性治癒（負の対照）と比較して骨組織の再生が増強したことである。
【０２２１】
材料および方法：
動物
２４匹の体重３〜４ｋのニュージーランドホワイトウサギの成体を本研究で用いた。動物は目的に合うように設計した実験動物用の部屋に保ち、標準の実験用の食餌を与えた。
【０２２２】
外科的処置および材料：
直線状の切開を２４匹のニュージーランドホワイトウサギの前頭部（頭蓋冠）に施し、２つの皮膚弁を持ち上げ、外側に折り返した。同様に、骨膜を切断して折り返し、頭蓋骨の最上部を暴露した。右および左の頭頂骨ならびに前頭骨の領域に、１ｍｍのドリルの深さしか許容しないスリーブを備えたトレフィンドリルを用いて、円形の溝を製造した。この円形内の外部皮質板が絶対に除去されないように注意を払った。チャンバ中の骨髄により良好に接近できるように、５つの小さな円形ドリル欠損を最上部皮質板の円形内に作製した。次いで、一次安定性のために、深さ１ｍｍの糸模様の切痕を有するチタンからなる円柱状の管を溝のそれぞれに配置した。４本の管が、その内部に機械加工の表面を示した。管の測定値は、高さ６ｍｍおよび外径６ｍｍであった。
【０２２３】
材料の分布は、それぞれの個別の研究に依存していた。しかし、それぞれの研究において、管のうち１本が陰性対照として役割を果たし、空のままにした。残りの３本の材料には、試験材料、および適切な場合は陽性対照も含まれる。陽性対照を用いた場合は、標準の移植材料を用いた。１つの選択肢は、標準のヒト移植手順において現在用いられているウシ由来骨ミネラル塩を使用することである（Ｂｉｏ−Ｏｓｓ（登録商標）、Ｇｅｉｓｔ
ｌｉｃｈ ＡＧ、スイスＷｏｌｈｕｓｅｎ）。それぞれの動物において前側および後側にあるシリンダーの数が同じであり、左側および右側にある数が同じであるように、それぞれの動物において材料をシリンダー間で分配した。最後に、全身効果を制御するために、一連の投薬を行った場合は、異なる用量の活性因子を有するどの材料も２つを同一動物中に与えることはせず、一部の対照試料を活性エナメル物質の治療を受けたことのない動物に意図的に与えた。前側および後側の同一の材料が組となるように、個々の動物においてそれぞれの試料を対にした。
【０２２４】
管は、骨側は開いたままとしたが、被覆する皮膚−骨皮弁の側はチタンの蓋で閉じた。骨膜および皮膚弁を適合させて縫合した。４、８および１６週間後、８匹の動物を屠殺した。それぞれの治療のそれぞれの時点における試料の数は８つであった。
【０２２５】
マトリックスおよび成長因子
基本的に、２つの異なるマトリックスをこの治験で用いた。ヒトフィブリノーゲンに由来するフィブリンマトリックスおよび合成系のＰＥＧゲルは、どちらも高い細胞内殖能力を有するように特異的に改変した。ゲルは、特異的活性エナメル物質を含んでおり、活性エナメル物質がその送達マトリックスと相互作用（共有結合）して、移植後に特異的な放出プロフィールを達成した。あるいは、ゲルを合成リン酸カルシウム顆粒と混合した。用いた顆粒は、ヒトの手術において、移植手順でパテ様の再構築材料を達成するために幅広く使用されている多孔性のリン酸三カルシウム／ヒドロキシアパタイトの混合物からなっていた（比４０：６０）。
【０２２６】
ＥＭＤは２つの濃度および２種類のゲルとして製造した：
ＰＥＧ＋１００μｇ／ｍｌのＥＭＤおよびＰＥＧ＋５００μｇ／ｍｌのＥＭＤデータおよびＰＥＧ／ＲＧＤ＋５００μｇ／ｍｌのＥＭＤ
【０２２７】
組織学的標本および組織形態計測
脱石灰化しない粉砕した切片の標準の手順に従って標本を加工した。標準の組織形態計測技術を適用して管内および管壁に沿った骨密度を定量的に評価した。
【０２２８】
統計学
ボンフェローニ調整ずみ一元配置分散分析試験を用いて、試験および対照の差異、ならびに試験または対照に関する経時的差異を検出した。すべての統計的検定における有意性レベルはα＝０.０５を選択した。
【０２２９】
結果
図４および５は、ＰＥＧ／ＲＧＤ＋５００μｇ／ｍｌのＥＭＤが骨の再成長に対して最良の効果を有することを明確に実証している。したがって、活性エナメル物質と最適化された細胞内殖能力を有する新しく発生したマトリックスとを結合させることにより、骨組織の再生が増強される。
【０２３０】
〔実施例５〕
ミニブタの歯周部裂開モデル
１．導入および理論的根拠
本調査では、２つの新規担体（アルギン酸またはカルボキシメチルセルロースを有するＰＥＧ）を用いて製造したエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）を試験した。ミニブタ裂開モデルは、歯周部組織の治癒および再生方法に関してエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）を用いた治療の局所効果の臨床的、定量的ならびに組織学的な比較において、歴史上の記述である。
【０２３１】
３．目的
追及すべき主な目的は、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）および２つの新規担体（アルギン酸またはカルボキシメチルセルロースを有するＰＥＧ）を用いて製造したエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）の、歯周部再生の比較評価からなっていた。
【０２３２】
４．調査した変数
４．１．一次変数
・一次変数は、歯周部のポケットプローブでの深度の減少の臨床評価からなっていた。
【０２３３】
４．２．二次変数
・骨欠損の深さの減少、セメントの高さ、歯根膜の存在、骨面積の評価に基づいた記述的組織学および組織形態計測が、二次変数の第１の群を形成していた。
【０２３４】
石灰化組織の定量的評価に関して言えば、ミクロＸ線での骨の測定値により、石灰化組織のみが切片上に表示されるので、組織形態計測手法の品質を大いに改善された。このことが、本研究において組織学的切片から得られたミクロＸ線の組織形態計測を実施した理由である。
【０２３５】
・炎症のグレード（なし、緩和、中等度、重篤）、退縮の長さおよび幅（セメント質−エナメルの接合部から歯肉の最上部までをｍｍで測定した）は、二次変数の第２の群に属していた。
【０２３６】
５．材料および方法
５．１．動物
ミニブタＳｕｓ ｓｃｒｏｆａの成体（＞１８カ月）、雌。手術前に動物を環境馴化させ、地域の動物施設内で観察した。
【０２３７】
５．２．手術および手術後
５．２．１．手術
動物を全身麻酔下で維持した（筋肉内のＫｅｔａｌａｒ＋静脈内のＤｏｒｍｉｃｕｍ）。さらに、キシロカイン−アドレナリンを用いた局所麻酔を局所的に行った。
【０２３８】
この手順の様々な工程は、以下の通りであった。
−動物の検査および記録用紙の１ページ目に記録した。
−ブタの口の周りを剪毛し、その後、皮膚をクロルヘキシジン（登録商標）で洗浄した（６０％のＥｔＯＨ中５ｍｇ／ｍｌ）。
−Ｑ１から開始：頬粘膜ひだの浸潤麻酔は、歯間乳頭および周辺歯肉領域への注入を回避することによって行った。
炎症の度合を評価し、歯垢および歯石を除去した。
−第１小臼歯から第１臼歯まで、末端を垂直な解放切開として周辺切開を行ったあと、上顎の歯槽骨を暴露するために粘膜骨膜弁を持ち上げた。
−バーおよび手動装置の助けによって、滅菌生理食塩水で常に洗浄しながら、頬側骨板ならびに歯根膜およびセメント質の「窓」を、第２小臼歯から第４小臼歯まで取り除いた。それぞれの歯の根の主軸中に、ＣＥＪから５〜６ｍｍの距離まで垂直方向の欠損を作製した。欠損の先端部（ＡＥＤ）を、切痕で印つけた。
欠損の平均最終寸法は、高さ＝６ｍｍ、幅＝２ｍｍ、深さ＝３ｍｍであった。
−靱帯およびセメント質を取り除いたあと、歯の表面をＰｒｅｆＧｅｌで２分間処理し、その後、十分な量の滅菌生理食塩水で洗浄した。
−ＣＥＪからＡＥＤの距離を測定して記録した。
−試験材料（擬似＝無し）を欠損内に施用した。
−皮弁を再配置したあと、手術部位をｖｉｃｒｙｌ縫合糸で閉じた。皮弁が骨欠損を完全に被覆し、それが徹底的に再配置および修復されていることを確実にするために特に注意を払った。
−同じ手順を第２の四半部について繰り返した。
図６は典型的な手術創傷を示す。
【０２３９】
５．２．２．手術後
動物には手術後１週間、軟食を与えた。抗生物質（ストレプトシリン、５ミリ単位／日）を手術から２日間投与し、鎮痛剤（ボルタレン、２５ｍｇ）を手術後に投与した。
５．３．試験および対照の群
合計１０匹の動物をこの研究に含めたが、１匹は試験材料の１つの移植とは関連しない理由により死亡した。
それぞれの上顎骨歯に２つの欠損を製造し、それぞれの動物で６本の歯を用いたので、それぞれの動物における欠損の合計数は１２であった。
【０２４０】
より関連する群では（以下参照）、それぞれの治療の種類について合計４８個の欠損を評価した。
【０２４１】
以下の群を調査した。
５．３．１．試験群
ＰＥＧ−Ｅｃ＝ＰＥＧ（ＣＭＣを有する）＋ＥＭＤ（４.９ｍｇ／ｍｌの濃度）：４匹
の動物
ＰＥＧ−Ｅｋ＝ＰＥＧ（Ａｌｇを有する）＋ＥＭＤ（４.９ｍｇ／ｍｌの濃度）：３匹
の動物
５．３．２．正の対照群
Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）（市販、ＥＭＤの濃度は３０ｍｇ／ｍｌ）：１匹の動物５．３．３．負の対照群
【０２４２】
【表１０】
【０２４３】
５．４．治癒時間
Ｓｔｒａｕｍａｎｎ−Ｂｉｏｒａ（Ｍａｌｍｏ）で入手可能な以前のデータによると、臨床的状態を評価し、４、６および８週間後に歯周部の測定を行うことは予測されていた。さらに、組織学的な評価（定性的および定量的）を８週間の治癒期間後に実施した。
５．５．終止
２９０ｇ／１０００ｍｌの強アルコール中の４０ｍｌのペントバルビタールナトリウム
１００ｍｇ／ｍｌの注入を、食間に、試験スキームに従って手術後８週間、動物に与えた。
完全な根を有する実験歯のみが含まれる区域を、実験のそれぞれの上顎から切り出した。
５．６．分析方法
５．６．１．歯周部のプロービング
プローブを用いて行った歯周部のプロービングは、手術の日ならびに４、６および８週間後にポケットの深度を評価することを意図していた。これらの測定は、「盲験方法」の標準的な規則に従って行った。検査官は、検査中の動物がどの群に属していたかを知らなかった。
５．６．２．組織学
分離された区域は、すぐに大量の（２００ｍｌ）新しく製造した、冷蔵した（４℃）リン酸緩衝ホルマリン、ｐＨ７.４に浸した。良好な固定を保証するために、ホルマリンを
４時間に１回交換した。
試料をエポキシ中への包埋および粉砕による切片形成（約２５μｍの厚さ）用に加工した。
試料は、標準的な非脱石灰化製造方法、次いでメチルメタクリレートへの包埋、切片形成（Ｐｏｌｙｃｕｔ−Ｓ、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびトルイジンブルーを用いた染色によって加工した。
組織学切片は、移植した部位内の歯根膜の存在を定義することを意図した定性的および半定量的分析に用いた。
５．６．３．マイクロラジオグラフィー
骨の高さおよび面積を評価するために最終粉砕を試みて（厚さ５０μｍ）光学顕微鏡観察下で定量的に分析する前に、Ｘ線発生器を用いて組織学的切片のミクロＸ線撮影を行った。
【０２４４】
６．結果
６．１．臨床的歯周部プロービングおよび退縮の測定
ポケットの深度の測定に関連する結果のみをここに要約する。
６．１．１．臨床的な歯周部プロービング
これらの臨床的測定により、それぞれの治療がそれ自体で、ポケットの深度の減少に関して有益であることが実証された。これは、それぞれの群内で、手術日から第８週目まで、第６週および第４週にわたって、進行性のポケットの深度の減少を存在する。それぞれの群内で、これらの異なる時点間において、差異は統計的に有意である。唯一の例外は、Ｅｍｄｏｇａｉｎ群の第４週から第８週の定常期の存在である。
一部の例では、差異は、１つの群と別の群との対応する時点を比較する場合にも統計的に有意である。
【０２４５】
【表１１】
【０２４６】
６．２．組織学（定性的および半定量的分析）
定性的には、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）群は、よく器質化された歯根膜によって新しいセメントから分離された成熟骨および層状骨の再生を示した。
一般に、ＰＥＧ−ＥｋおよびＰＥＧ−Ｅｃの群により、手術中２ＰＥＧマトリックスが位置づけられていた位置を保持していると考えられた成熟していない、かつ密な血管新生化した新しい骨の存在が実証された（図７および８参照）。
ＰＥＧ−Ｅｃ（ＣＭＣ）の場合、歯根膜の存在が、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）群中に見つかるものと同等であることが観察された（図９および１０参照）。
【０２４７】
疑わしい例は、以下の表に含めなかった。
【表１２】
歯根膜の存在の評価に関する疑わしい例の量：
擬似＝５ ＰＥＧ−Ｅｋ＝９
Ｅｍｄｏｇａｉｎ＝４ ＰＥＧ−Ｅｃ＝１０
【０２４８】
６．３．ミクロＸ線（定量分析）
骨の高さ
すべての群が、少なくとも２ｍｍの有意な骨の増加を経験した。Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）が最も高い性能に達し（約４ｍｍ）、統計的有意性は２つのＥｍｄｏｇａｉｎＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ２群に匹敵する（ｐ＜０.００５）。
擬似群は、性能がＥｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）よりも低かったが、ＰＥＧ−Ｅｃまた
はＰＥＧ−Ｅｋ群よりも高かった。図１１も参照されたい。
骨の面積
４つの群において、その４つの条件に統計的な差異なしに相当量の骨が再生された（約３ｍｍ２）。
【０２４９】
【表１３】
【０２５０】
７．考察
骨の高さに関して、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）の性能は既存かつ既に公開された文献の結果の通りであった。偽群はｓＥｍｄｏｇａｉｎＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ２よりも良好な結果を示した。
ＰＥＧ−Ｅｃは、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）と同等であるが、約２ｍｍと概算を推定することしかできない長さの歯根膜の存在を示した。
再生された骨構造の形態学は、ＰＥＧ−ＥｃまたはＰＥＧ−Ｅｋの２つで異なっていたが（例えば図１２参照）、ＰＥＧ−ＥｃおよびＰＥＧ−Ｅｋの使用により、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）によって再生された量と同様の骨量の形成がもたらされたと考えられた。この新しく形成された骨の再生は、ＥＭＤを添加した２つのＰＥＧマトリックス内で実際起こったという仮説が立てられている。その場合、移植日のこれらのマトリックスの体積および位置が対応する骨再生の体積ならびに高さに作用することができる。
【０２５１】
〔実施例６〕
歯周部再生用の新規活性エナメル誘導体配合物（ＰＥＧ−ＥＭＤ）の評価。犬におけるクラス３歯根分岐部欠損の実験的研究。
１．技術水準および理論的根拠
本研究は、以下のことが報告されているパイロット研究に続くことを意図する（「Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ２の評価：ミニブタの歯周部裂開モデルのパイロット研究」）。
「再生された骨構造の形態学は、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ２およびＥｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）の２種類で異なっていたが、ＰＥＧ−ＥｃおよびＰＥＧ−Ｅｋ（どちらもＰＥＧ−ＥＭＤと呼ばれる）の使用により、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）によって再生された量と同様の骨量の形成がもたらされたと考えられた。
この新しく形成された骨の再生は、ＥＭＤを添加した２つのＰＥＧマトリックス内で実際起こったという仮説が立てられている。その場合、移植日のこれらのマトリックスの体積および位置が対応する骨再生の体積および高さに作用することができる」。
【０２５２】
２．仮説
ＰＥＧ−ＥＭＤは、歯根分岐部（クラス３Ｈａｍｐ）欠損の治療において施用した場合
に、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）の使用によって得られた歯周部再生に劣らない歯周部再生（骨、靱帯）を誘導する。
【０２５３】
３．目的
３．１．主要目的
本研究の主な目的は、犬モデルにおいて、クラス３歯根分岐部欠損の治療に用いた場合、ＰＥＧ−ＥＭＤがＥｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）よりも定量的により高い骨再生を誘導することを実証することであろう。
３．２．補助目的
第２の目的としては、ＰＥＧ−ＥＭＤを施用したあとの歯根膜の再生は、上述のモデルにおいてＥｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）を用いることによって得られたものに劣らないことを示すことであろう。
【０２５４】
４．変数
４．１．一次変数
ベースラインと終点との間に、および比較的試験対照（ＰＥＧ−ＥＭＤ）群と正の対照（Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標））群との間に積み上げられた、新しい骨の高さの差異。４．２．二次変数
歯根分岐部の周辺の少なくとも１つの根上の表面を裏打ちする歯根膜の存在。
４．３．三次変数
一緒にすると骨、歯根膜、セメント質および軟組織の構造の完全な説明を与える定性的データ。
【０２５５】
５．動物モデルおよび管理
５．１．動物モデル
ハウンドドッグ、年齢約１６カ月、体重約２５ｋｇ
Ｐ１ならびにＭ１、Ｐ２およびＰ３の抜歯はそのままである。
３カ月後：Ｐ２およびＰ３に高さ５ｍｍの歯根分岐部欠損を作製（Ｋｏｏ他、２００４）。（典型的な手術の設定には図１３を参照されたい。図では、それぞれの矢印は５ｍｍに対応している。）
５．２．動物の管理
動物の小屋、外科的処置および経過観察は、以下の実験手術施設でのＧＬＰ規則に従って実施する：
ＢｉｏｍａｔｅｃｈＮＡＭＳＡ、Ｃｈａｓｓｅ ｓｕｒ Ｒｈｏｎｅ（Ｌｙｏｎ）、フランス。
【０２５６】
６．予測される結果および能力の計算
文献では、ベースラインにおけるクラス３歯根分岐内の欠損の平均の高さは４.７ｍｍ
（＋／−０.２）であることを報告している。４週間後の自発性治癒が、１.８ｍｍ（＋／−０.３）の骨の高さの増加をもたらすことが予測される。（Ｋｏｏ他、２００４）→負
の対照群：ブランクおよびＰＥＧ
同様の結果が対照群（Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標））から、４週間後に予想される。２カ月後および４カ月後、増加は限定されたままであるはずであった、約１.５ｍｍ（＋
／−０.５）
試験群（ＰＥＧ−ＥＭＤ）は、４週間後に２.０ｍｍ（＋／−０.５）、２カ月後に２.
５ｍｍ（＋／−０.５）および４カ月後に３.０ｍｍ（＋／−１.０）の骨増加を示すはず
である。
【０２５７】
７．材料および方法
７．１．材料
７．１．１．試験材料
ＰＥＧ−ＥＭＤ：
７２ｍｇの凍結乾燥した４本アームのＰＥＧ−アクリレート１５ｋを含むバイアル
１２ｍｇの４本アームのＰＥＧ−チオール２ｋの３００μｌ溶液および０.０５ｗｔ％
の酢酸水溶液中の５.２ｍｇのＥＭＤを含むシリンジ。
６８０±１０ｍｇの０.０５Ｍの水性トリエタノールアミン／ＨＣｌを含むシリンジ、
Ｃｅｋｏｌ １０'０００を３.６質量％含むｐＨ８.５±０.１
ＰＥＧ中のＥＭＤの最終濃度：４.９ｍｇ／ｍｌ
７．１．２．正の対照
Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）
ＰＧＡ中のＥＭＤの濃度：３０ｍｇ／ｍｌ
７．１．３．負の対照
空
ＰＥＧ
７．１．４．補助材料
補助材料なし
７．２．方法
７．２．１．研究設計およびスケジュール
ｔ０：
Ｐ１およびＭ１の抜歯
ｔ３カ月：歯槽隆起の粉砕、Ｐ２およびＰ３でクラス３歯根分岐部欠損の作製
ｔ４カ月：１カ月の観察時間後に屠殺
ｔ５カ月：２カ月の観察時間後に屠殺
ｔ７カ月：４カ月の観察時間後に屠殺
７．２．２．手術前段階
歯の抜歯、
治癒時間：３カ月
７．２．３．手術段階
動物１匹あたりそれぞれの下顎側面に２つのクラス３歯根分岐部欠損の作製。
歯根分岐部欠損を試験または対照材料で充填。
縫合は重要である
７．２．４．手術後段階
１４日間の治癒後に縫合糸を除去。
手術の６週間後に、手術後のプラー久コントロールを行う。
７．２．５．観察および分析
ミクロで計算した断層撮影、組織学および組織形態計測
８．終点および最終手順
動物を手術の１、２および４カ月後に屠殺する。
【０２５８】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療剤、予防剤および／または化粧剤として用いることを意図する、エナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質などの、新規かつ改良された活性エナメル物質の低濃度配合物に関する。本発明では、前記活性エナメル物質を高分子マトリックス内に取り込ませ、特に、組織の修復、再生および／または再構築において用いること、生きた石灰化組織の部分間の結合を誘導すること、生きた石灰化組織の小片を他の生組織の小片上の結合部位に結合させること、皮膚または粘膜の創傷の治癒を改善すること、感染症もしくは炎症状態を予防または治療すること、象牙質を形成または再生させること、移植片の生着を促進すること、上皮由来の良性、半悪性または悪性の新生物を治療すること、アポトーシスを誘導すること、あるいは細胞減少手術などの処置および／もしくは外傷後の創腔ならびに／または組織欠陥を埋めることを意図する。
【０００２】
本発明では、高分子マトリックスの分解、酵素作用および／または拡散によって放出されるように、活性エナメル物質を高分子マトリックス内に取り込ませることができる。前記高分子マトリックスは、細胞内殖に適しているか、または細胞閉塞性のどちらかである。
【０００３】
したがって、本発明には、特に、配合物内の活性エナメル物質の総濃度がより低い新規薬剤配合物および／または化粧配合物が含まれ、前記活性エナメル物質の放出の空間的および／または選択的な調節により、より高い割合の活性エナメル物質が適切な細胞活性時に放出されることが可能となる。
【背景技術】
【０００４】
本発明の活性エナメル物質（用語「活性エナメル物質」は、本明細書の文脈中ではエナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質について用いる）は、天然ではエナメルマトリックスの近隣に発生する組織中で見つかる因子を、１つだけでなく因子の統合されたカスケードを誘導することができる。これらは発生中の組織の自然環境を模倣し、したがって組織再生、細胞分化および／または成熟の自然刺激を模倣する。
【０００５】
エナメルマトリックス中に存在するエナメルマトリックスタンパク質は、エナメルの前駆体として最もよく知られている。エナメルマトリックスタンパク質は、セメント質形成の前に発生中の歯根の先端部の根表面上に堆積される。堆積したエナメルマトリックスがセメント質形成の開始因子である証拠が存在する。ここでも、セメント質の形成自体が歯根膜および歯槽骨の発生に関連している。したがって、本発明以前に本発明者らによって示されているように、エナメルマトリックスタンパク質は、歯中における天然の付着の発生を模倣することによって歯周部再生を促進することができる（Ｇｅｓｔｒｅｌｉｕｓ Ｓ、Ｌｙｎｇｓｔａｄａａｓ ＳＰ、Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ Ｌ．Ｅｍｄｏｇａｉｎ−ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂｉｏｍｉｍｉｃｒｙ．Ｃｌｉｎ Ｏｒａｌ Ｉｎｖｅｓｔ、４：１２０〜１２５（２０００））。
【０００６】
エナメルマトリックスは、アメロゲニン、エナメリン、タフト（ｔｕｆｔ）タンパク質、プロテアーゼ、およびアルブミンなどのいくつかのタンパク質からなる。エナメルマトリックスの主な構成要素であるアメロゲニンは、選択的スプライシングおよび制御された翻訳後分泌プロセッシングによって単一の遺伝子に由来する、疎水性タンパク質のファミリーである。これらは脊椎動物の進化の間ずっと高度に保存されており、検査したすべて
の高等脊椎動物のすべてにわたって高い全体的な配列相同性レベルを実証している（約８０％）。実際、ブタおよびヒトのアメロゲニン遺伝子転写物の配列では塩基の４％しか異ならない。したがって、エナメルマトリックスタンパク質は、ブタ起源ではあるが、人体と遭遇した際に「自己」であるとみなされ、アレルギー応答または他の望ましくない反応を始動させることなくヒトにおいて歯の再生を促進することができる。
【０００７】
ブタエナメルマトリックスから精製したタンパク質の酸抽出物の形態のエナメルマトリックス誘導体（例えばＥＭＤ）は、重篤な歯付着喪失に罹患している患者における、機能的な歯根膜、セメント質および歯槽骨を回復させるための使用が以前に成功している（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ他、１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ、２４、６５８〜６６８）。
【０００８】
さらに、培養歯根膜細胞（ＰＤＬ）の研究において、ＥＭＤが培養中に存在していた場合、これらの細胞の付着速度、成長および代謝が顕著に増加したことが示されている。また、ＥＭＤに曝した細胞は、対照と比較した場合に細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達および成長因子のオートクリン産生の増加を示した。対照的に、上皮細胞では、ＥＭＤが存在する場合にｃＡＭＰシグナル伝達および成長因子の分泌は増加したが、増殖および成長がどちらも阻害された（Ｌｙｎｇｓｔａｄａａｓ他、２００１、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ、２８、１８１〜１８８）。
【０００９】
エナメルマトリックスタンパク質およびエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）は、以前に特許文献中に硬組織形成を誘導すること（例えばエナメル形成、米国特許第４,６７
２,０３２号（Ｓｌａｖｋｉｎ））、硬組織間の結合を支持すること（ＥＰ−Ｂ−０ ３
３７ ９６７号およびＥＰ−Ｂ−０ ２６３ ０８６号）、皮膚および粘膜などの開放創治癒を促進すること、感染症および炎症性疾患の治療に対して有益効果を有すること（ＥＰＯ１、１０５９９３４号およびＥＰＯＩＩ、０１２０１９１５．４号）、象牙質の再生を誘導すること（ＷＯ０１／９７８３４号）、移植片の生着を促進すること（ＷＯ００／５３１９７号）、新生物の治療においてアポトーシスを誘導すること（ＷＯ００／５３１９６号）、ならびに細胞減少手術などの処置および／もしくは外傷後の創腔および／または組織欠陥を埋めることを促進すること（ＷＯ０２／０８０９９４号）が可能であると記載されている。
【００１０】
組織の修復または再生には、上述のＥＭＤの医療適用に例示したように、細胞は創傷床内に遊走し、増殖し、分化し、最終的な組織形状を形成しなければならない。多くの場合、複数の細胞集団がこの形態形成応答に参加しなければならない。
【００１１】
それにもかかわらず、エナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質などの活性エナメル物質の上述の効果または使用の任意のものは、比較的高い濃度の活性エナメル物質の配合物について記載されている。典型的な濃度は１０〜３０ｍｇ／ｍｌである。これまで、より低い濃度の活性エナメル物質の配合物で効果を観察することができていない。本発明を特定の理論に限定することを望まないが、これは、これまで用いられてきたすべての薬剤配合物および／または化粧配合物が非制御の様式で活性エナメル物質を放出するように設計されていることが原因である可能性がある。
【００１２】
同様に、投与する塩基性線維芽細胞成長因子の用量を低下させることを可能にするために、成長因子を隔離するための固定ヘパリンの使用に基づいた制御送達装置が設計された。例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ他（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９１年９月；１２（７）：６１９〜２６）は、アルギン酸内にヘパリンとコンジュゲートさせたＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ビーズを用いた。ビーズは、塩基性線維芽細胞成長因子（「ｂＦＧＦ」）とヘ
パリンとの結合および解離に基づいてｂＦＧＦをゆっくりと放出するリザーバとして役割を果たした。
【００１３】
また、ＸＩＩＩａ因子基質配列および生物活性ペプチド配列を含む二重ドメインペプチドをフィブリンゲル内に架橋結合させることができ、生物活性ペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏでその細胞活性を保持しているということが実証されている（Ｓｃｈｅｎｓｅ，Ｊ．Ｃ．他（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、１０：７５〜８１）。
【００１４】
さらに、（ＵＳ２００３／０１８７２３２号およびＵＳ２００３／０１６６８３３号）では、共有または非共有方法のどちらかによってヘパリンをマトリックスに結合させてヘパリン−マトリックスを形成することに基づいて、成長因子タンパク質全体をタンパク質または多糖マトリックス内に取り込ませることが示されている。その後、ヘパリンは、ヘパリン結合成長因子をタンパク質マトリックスに非共有結合させた。また、ＸＩＩＩａ因子基質などの架橋結合領域およびネイティブタンパク質配列を含む融合タンパク質も示されている。マトリックスと生物活性因子との間に分解性結合を取り込むことは、長期的な薬物送達に特に有用であると想定された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第４，６７２，０３２号（Ｓｌａｖｋｉｎ）
【特許文献２】ＥＰ−Ｂ−０ ３３７ ９６７号
【特許文献３】ＥＰ−Ｂ−０ ２６３ ０８６号
【特許文献４】ＥＰＯ１、１０５９９３４号
【特許文献５】ＥＰＯＩＩ、０１２０１９１５．４号
【特許文献６】ＷＯ０１／９７８３４号
【特許文献７】ＷＯ００／５３１９７号
【特許文献８】ＷＯ００／５３１９６号
【特許文献９】ＷＯ０２／０８０９９４号
【特許文献１０】ＵＳ２００３／０１８７２３２号
【特許文献１１】ＵＳ２００３／０１６６８３３号
【特許文献１２】米国特許第６，３３１，４２２号
【特許文献１３】米国特許第５，８７４，５００号
【特許文献１４】ＷＯ００／４４８０８号
【特許文献１５】ＷＯ０３／０５２０９１号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｇｅｓｔｒｅｌｉｕｓ Ｓ、Ｌｙｎｇｓｔａｄａａｓ ＳＰ、Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ Ｌ．Ｅｍｄｏｇａｉｎ−ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂｉｏｍｉｍｉｃｒｙ．Ｃｌｉｎ Ｏｒａｌ Ｉｎｖｅｓｔ、４：１２０〜１２５（２０００）
【非特許文献２】Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ他、１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ、２４、６５８〜６６８
【非特許文献３】Ｌｙｎｇｓｔａｄａａｓ他、２００１、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ、２８、１８１〜１８８
【非特許文献４】Ｅｄｅｌｍａｎ他（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９１年９月；１２（７）：６１９〜２６）
【非特許文献５】Ｓｃｈｅｎｓｅ，Ｊ．Ｃ．他（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、１０：７５〜８１
【非特許文献６】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９
【非特許文献７】Ｔｅｎ Ｃａｔｅ：Ｏｒａｌ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ、１９９４
【非特許文献８】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年１月、１０６ Ｓｕｐｐｌ．、１：２８２〜９１
【非特許文献９】Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ他（１９９４）
【非特許文献１０】Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．他（１９９０）
【非特許文献１１】ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．他、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．他（１９９０）
【非特許文献１２】「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、１９９０
【非特許文献１３】Ｓｉｅｒｒａ，Ｄ．Ｈ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、７：３０９〜３５２（１９９３）
【非特許文献１４】Ｗｉｌｌｉａｍｓ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２６４：２８４〜２９０（１９８７）
【非特許文献１５】Ｆｒａｎｃｉｓ他、Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ、１９：２９１〜３０７、１９９３
【非特許文献１６】Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＹ、１９７５
【非特許文献１７】Ａｏｋｉ，Ｎ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ、２１：２６７〜２８６、１９７９
【非特許文献１８】Ｓａｋａｔａ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、６５：２９０〜２９７、１９８０
【非特許文献１９】Ａｏｋｉ他、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、３９：２２〜３１、１９７８
【非特許文献２０】Ｈｅｍ他、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、３９：２６６〜２７６（１９９８）
【非特許文献２１】ＴａｋａｇｉおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１４：５１４９〜５１５６
【非特許文献２２】ＴａｋａｉおよびＤｏｌｉｔｔｌｅ、１９７５
【非特許文献２３】Ｓｍｉｔｈ他、（１９９５）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：６４４０〜６４４９
【非特許文献２４】Ｂｅｓｓｏｎ他、（１９９６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３７：２１６〜２２３
【非特許文献２５】Ｎｅｔｚｅｌ−Ａｍｅｔｔ他、（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：６７４７〜６７５５
【非特許文献２６】Ｃｏｏｍｂｓ他、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３〜４３２３〜４３２８
【非特許文献２７】Ｔｙｌｅｒ−Ｃｒｏｓｓ，Ｒ．他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ．３：６２０〜６２７
【非特許文献２８】ＺｕｃｋｅｒおよびＫａｔｚ、（１９９１）．Ｅｘｐｅｒ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．：６９３〜７０２
【非特許文献２９】Ｋａｉｌａｐｕｒ他、Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（１９９２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：５３８〜５４８
【非特許文献３０】Ｈａｕｇｅｎ他、（１９９２）．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：２０３４〜２０４２
【非特許文献３１】Ｈａｔａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４４７〜８４５７
【非特許文献３２】Ｃａｒｅｙ、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、５３：１６１〜１７７、１９９１
【非特許文献３３】Ｌａｎｄｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２：１８９〜１９５、１９８９
【非特許文献３４】Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２：８５１〜８６９、１９８７
【非特許文献３５】Ｍａｒｔｉｎ、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：５７〜８５、１９８７
【非特許文献３６】Ｇｒａｆ他、Ｃｅｌｌ、４８：９８９〜９９６、１９８７
【非特許文献３７】Ｋｌｅｉｎｍａｎ他、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２７２：３９〜４５、１９８９
【非特許文献３８】Ｍａｓｓｉａ他、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：８０５３〜８０５９、１９９３
【非特許文献３９】Ｉｇｎａｔｉｕｓ他、Ｊ．ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１１１：７０９〜７２０、１９９０
【非特許文献４０】Ｔａｓｈｉｒｏ他、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１６１７４〜１６１８２、１９８９
【非特許文献４１】Ｌｉｅｓｉ他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２４４：１４１〜１４８、１９８９
【非特許文献４２】ＢＩＯＲＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔ ９／８８
【非特許文献４３】Ｋｏｏ他、２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本出願は、上述のすべての医療、治療および化粧上の使用に適用可能な活性エナメル物質の新規かつ改良された配合物の有益効果に関し、前記活性エナメル物質を、活性エナメル物質がマトリックスの分解および／または酵素作用および／または拡散によって放出され、したがって配合物中の必要な総用量が有効に低下され、放出の空間的な調節が容易となり、それにより、より高い割合の活性エナメル物質が適切な細胞活性時に放出されることが可能となるように、前述のマトリックスの２つもしくはそれ以上の組合せを含めた、ＵＳ２００３／０１８７２３２号およびＵＳ２００３／０１６６８３３号に示したマトリックスに類似のタンパク質マトリックス、合成マトリックスならびに／または多糖マトリックス内に取り込ませる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、細胞の成長もしくは内殖に適しているか、または細胞閉塞性であることができる高分子マトリックスと、少なくとも１つの活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための低濃度の薬剤配合物、治療配合物および／または化粧配合物を初めて開示しており、配合物中の前記活性エナメル物質の濃度は、約５ｍｇなどの５ｍｇ／ｍｌ超えない濃度、または４.９ｍｇ／ｍｌ、４.５ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、３.５ｍｇ
／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、２.５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、１.５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、もしくは１μｇ／ｍｌなどの５ｍｇ／ｍｌ未満の濃度である。
【００１９】
本発明は、放出可能に取り込ませたまたは内部に封入した活性エナメル物質を有する天然および／もしくは合成高分子マトリックスを用いた、硬組織および軟組織の修復、再生、または再構築、特に骨および歯の成長のための生成物ならびに方法を提供する。高分子マトリックスは生体適合性かつ／または生分解性である。これらは、移植時にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで形成することができる。典型的な高分子マトリックスは、マトリックスの孔径次第で、細胞の成長もしくは内殖に適しているか、または細胞閉塞性のどちらかである。活性エナメル物質は、その完全な生物活性を保持したままで、高分子
マトリックス内に取り込ませる、付着させる、および／または封入することができる。さらに、活性エナメル物質は、放出の時点および／もしくは活性エナメル物質が放出される度合の制御を提供する技術を用いて、放出可能に取り込ませる、付着させる、かつ／または封入することができる。そのような配合物は、例えば、徐放性ビヒクルなどの高分子マトリックスを用いて、組織修復に直接または間接的に用いることができる。
【００２０】
本発明以前に記載されている活性エナメル物質を含む配合物は、最も一般的には、前記活性エナメル物質の濃度が少なくとも３０ｍｇ／ｍｌなど、本明細書中で想定している濃度よりも相当に高い濃度で投与する。さらに、５ｍｇのタンパク質／ｍｌ未満を含む配合物は、従来のＰＧＡゲル中に配合するＥＭＤについて実施例１に記載したように、実際に現場では不十分であることが確立されている。
【００２１】
実施例に文書的に説得力のあるものとして記載したように、本発明者らは、驚くべきことに、高分子マトリックスおよび活性エナメル物質を含む新規低濃度配合物により、活性エナメル物質の必要な濃度を、１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ〜２５０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ〜１５０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、またはそれ以下などの１μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌまで下げることが可能になることを実証することができた。
【００２２】
本発明に関連する高分子マトリックスは、イオン結合、共有結合、もしくはそれらの組合せによって前駆体分子を高分子ネットワークに架橋結合させることによって、または１つもしくはそれ以上の高分子材料の膨潤によって、または物理的架橋結合によって、例えば、相もしくは溶解度の差異によるエンドブロックの凝集により形成される架橋結合点によって、形成する。本発明の第１の実施形態では、前記マトリックスは、マトリックス内への細胞の成長、内殖および／または遊走を可能にするために十分なポリマー間間隔を有する高分子ネットワークを形成する。典型的には、この特定の実施形態では、架橋結合した高分子マトリックスはゲルを形成する。本発明の第２の実施形態では、前記マトリックスは、マトリックス内への細胞の内殖および／または遊走を塞ぎ、マトリックス内の活性エナメル物質を制限するために十分に狭い、狭い孔径を有する高分子ネットワークを形成する。さらに、さらなる別の実施形態では、前記第２の実施形態は、経時的に分解されて、マトリックス内への細胞の成長、内殖および／または遊走を可能にするために、十分なポリマー間間隔を含むことができる。
【００２３】
上述の本発明の２つの具体的な実施形態は、異なるかつ具体的な役割を果たし、したがって、活性エナメル物質の低濃度配合物の意図する使用次第で、二者択一的に好ましい。例えば、細胞閉塞性のマトリックス形態は、使用の意図が、周辺軟組織と保護する領域との相互作用することを防ぎ、それにより例えば創傷の感染症を予防する、生分解性の障壁を提供することである場合に、好ましい場合がある。別の例では、この形態は、移植床の欠損などの有効な骨再生の完全な治癒時間中に障壁機能が求められる場合に特に好ましい。このような実施形態は膜の形態をとることができる。さらに、そのような好ましいマトリックスは、例えば、予定された酵素分解または加水分解の部位を含めることで、将来的に細胞侵襲性となるように設計することができる。他方で、例えば、細胞減少手術の結果生じた軟組織の創傷または創腔を、活性エナメル物質を含む低濃度配合物で埋める場合は、細胞の内殖および／または遊走が前記創傷の治癒に有益であり、したがって、典型的には、細胞の内殖および／または遊走を可能にするために十分に大きい孔径を有するゲル配合物が好ましい。ここでも、典型的なＰＥＧゲルは、最初は必ずしも細胞の内殖および／または遊走を可能にするために十分大きな孔径ではないが、将来的、例えば、浸潤もしくは隣接細胞によって放出された酵素による酵素分解、または加水分解もしくは機械的分解ののちに細胞の内殖および／または遊走を可能にするために十分に大きな孔径を含むよう
に、設計することができる。また、一部の適用では、前記２つの具体的な形態は相互に変化可能であるか、または一緒に用い得る。
【００２４】
一実施形態では、高分子マトリックスはタンパク質、好ましくは高分子マトリックスを移植する患者中に天然に存在するタンパク質から形成される。特に好ましい天然高分子マトリックスタンパク質はフィブリンであるが、コラーゲンおよびゼラチンなどの他のタンパク質から形成された高分子マトリックスを用いることもできる。多糖類および糖タンパク質も高分子マトリックスを形成するために用い得る。
【００２５】
別の同等に好ましい実施形態では、合成ポリマーを用いて、イオン結合または共有結合または物理的結合によって架橋結合した高分子マトリックスを形成する。
【００２６】
高分子マトリックス材料は、天然に存在する酵素または加水分解によって生分解性であることが好ましい。分解速度は、架橋結合の度合および高分子マトリックス中にプロテアーゼ阻害剤を含めることによってさらに操作することができる。分解性部位により、マトリックスからの活性エナメル物質の放出をより具体的にすることができる。例えば、酵素活性に基づいた分解により、活性エナメル物質の放出が、ゲルを通った活性エナメル物質の拡散ではなく、局所タンパク質分解などの細胞工程によって制御されることが可能となる。分解性の部位または結合は、高分子マトリックスを浸潤するまたはそれを取り囲む細胞から放出された酵素によって切断される。これにより、材料内／材料に隣接する細胞の位置に応じて、活性エナメル物質が同一材料内から異なる速度で放出されることが可能となる。
【００２７】
細胞特異的タンパク質分解活性は、例えば長期間にわたって起こる用途において、重要である。本明細書中に記載の活性エナメル物質の徐放性は、その放出は細胞工程によって制御されているので、必要な活性エナメル物質の総量を有効に低下させる。活性エナメル物質の保存およびその生体利用度は、最初の爆発放出によって顕著な量の活性エナメル物質の損失を特徴的にもたらす拡散徐放性装置の使用に勝る、細胞特異的タンパク質分解活性を開拓することの明確な利点である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】周辺骨およびセメント質の回復対ゲル中のＥＭＤの濃度を示す図である。
【図２】挿入したゲル中のＥＭＤの濃度の関数としての、ラット頭蓋骨における危険な大きさの骨欠損の治癒を示す図である（ｎ＝４〜５）。
【図３】ＣＥＪから欠損の先端部までミリメートルで測定したポケットの深度を示す図である。*Ｐ＜０.０５（ボンフェローニ調整ずみ一元配置分散分析試験）
【図４】標準の組織形態計測技術を適用した、管内および管壁に沿った骨密度の定量的な評価を示す図である。
【図５】標準の組織形態計測技術を適用した、管内および管壁に沿った骨密度の定量的な評価を示す図である。***Ｐ＜０.００１（ボンフェローニ調整ずみ一元配置分散分析試験）
【図６】ミニブタの歯周部裂開モデル、手術の設定を示す図である。
【図７】よく器質化された歯根膜によって新しいセメントから分離された成熟骨および層状骨の再生の組織学を示す図である。Ａ：Ｅｍｄｏｇａｉｎ、Ｂ：ＰＥＧ／Ｅｃ。
【図８】ＰＥＧ／Ｅｃの成熟骨および層状骨の再生の組織学を示す図である。
【図９】ＰＥＧ−Ｅｃを用いた治療（ＣＭＣ）後の歯根膜の存在の組織学的な観察を示す図である。
【図１０】ＰＥＧ−Ｅｃを用いた治療（ＣＭＣ）後の歯根膜の存在の組織学的な観察を示す図である。
【図１１】骨回復の定量的測定のミクロＸ線を示す図である。Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）が、ＰＥＧ−ＥｃまたはＰＥＧ−Ｅｋと比較して、統計的に有意に最も高い性能に達した（約４ｍｍ）（ｐ＜０.００５）。
【図１２】２種類のＰＥＧ−ＥｃまたはＰＥＧ−ＥｋとＥｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）とで異なっていた再生された骨構造の形態学の組織学を示す図である。
【図１３】犬におけるクラス３歯根分岐部欠損の治療の手術の設定を示す図である。図において、それぞれの矢印は約５ｍｍに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
活性エナメル物質
エナメルマトリックスはエナメルの前駆体であり、任意の関連する天然源、すなわち、歯が発生中の哺乳動物から得られ得る。適切な由来源は、例えば子ウシ、ブタまたは子ヒツジなどの屠殺した動物からの発生中の歯である。別の由来源は、例えば魚の皮膚である。本発明の文脈では、用語「活性エナメル物質」とは、その由来源を区別せずにエナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質を包含するために用いる。
【００３０】
エナメルマトリックスは、以前に記載されているように発生中の歯から製造することができる（ＥＰ−Ｂ−０ ３３７ ９６７号およびＥＰ−Ｂ−０ ２６３ ０８６号）。エナメルマトリックスを掻爬し、例えば、希酸もしくは希塩基または水／溶媒混合液などの水溶液を用いた抽出、次いでサイズ排除、脱塩または他の精製工程、あるいは次いで凍結乾燥によって、エナメルマトリックス誘導体を製造する。あるいは、熱または溶媒を用いた処理によって酵素を失活させてもよく、この場合は、誘導体を凍結乾燥せずに液状で保管し得る。
【００３１】
エナメルマトリックス誘導体またはタンパク質の代替由来源として、当業者に周知の一般に適用可能な合成経路を用いるか、またはＤＮＡ技術によって改変した培養真核および／もしくは原核細胞を用いてもよい。したがって、エナメルマトリックスタンパク質は組換えおよび／または合成起源のものであり得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９参照）。
【００３２】
したがって、本発明の一態様は、高分子マトリックスと化学修飾することができる活性エナメル物質の群から選択された少なくとも１つの組換えもしくは合成タンパク質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療配合物に関する。好ましい実施形態では、前記タンパク質は、前記タンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置する少なくとも１つのシステイン残基を有する。
【００３３】
本発明の文脈では、エナメルマトリックス誘導体は、選択的スプライシングもしくはプロセッシングによって、または天然の長さのタンパク質の酵素切断もしくは化学切断のどちらかによって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでのポリペプチドの合成（例えば組換えＤＮＡ方法および／もしくは二倍体細胞の培養）によって自然に産生させた、１つもしくは複数のエナメルマトリックスタンパク質またはそのようなタンパク質の部分もしくは断片を含むエナメルマトリックスの誘導体である。エナメルマトリックスタンパク質誘導体には、エナメルマトリックスに関連するポリペプチドまたはタンパク質も含まれる。ポリペプチドまたはタンパク質は、ポリアミン酸もしくは多糖類、またはそれらの組合せなどの適切な生分解性担体分子に結合していてもよい。さらに、用語エナメルマトリックス誘導体は、合成類似物質も包含する。
【００３４】
タンパク質とは、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基によって構成される生物学的巨大分子である。アミノ酸の直鎖状ポリマーとしてのタンパク質は、ポリペ
プチドとも呼ばれる。典型的には、タンパク質は５０〜８００個のアミノ酸残基を有しており、したがって、約６,０００〜約数十万ダルトンの範囲またはそれ以上の分子量を有
する。小さなタンパク質はペプチドまたはオリゴペプチドと呼ばれる。
【００３５】
エナメルマトリックスタンパク質とは、通常はエナメルマトリックス中に存在するタンパク質、すなわち、エナメルの前駆体（Ｔｅｎ Ｃａｔｅ：Ｏｒａｌ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ、１９９４；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年１月、１０６ Ｓｕｐｐｌ．、１：２８２〜９１）、もしくはタンパク質、ペプチドまたはそのようなタンパク質の切断によって得ることができるそのようなタンパク質の断片である。一般に、そのようなタンパク質は１２０,０００ダルトン未満の分子量を有し、ア
メロゲニン、非アメロゲニン、プロリンリッチな非アメロゲニンおよびタフテリン（ｔｕｆｔｅｌｉｎ）が含まれる。
【００３６】
本発明に従って用いるタンパク質の例は、アメロゲニン、プロリンリッチな非アメロゲニン、タフテリン、タフトタンパク質、血清タンパク質、唾液タンパク質、アメロブラスチン、シースリン、それらの断片および誘導体、ならびにそれらの混合物である。本発明に従って用いる活性エナメル物質を含む製剤は、前述のタンパク質物質も少なくとも２つ含み得る。さらに、本発明に従って用いる他のタンパク質は、市販の商品ＥＭＤＯＧＡＩＮ（登録商標）（ＢＩＯＲＡ ＡＢ、スウェーデン）中に見つかる。
【００３７】
当分野で周知のエナメルマトリックス誘導体であるＥＭＤＯＧＡＩＮ（登録商標）（ＢＩＯＲＡ ＡＢ、Ｓ−２０５ １２ Ｍａｌｍｏｅ、スウェーデン）は、１ｍｌのビヒクル溶液（アルギン酸プロピレングリコール）あたり、３０ｍｇの、残留プロテアーゼを失活させるために３時間約８０℃で加熱したエナメルマトリックスタンパク質を含み、これらは、タンパク質およびビヒクルを個別に試験する場合を除いて、適用の前に混合する。主なタンパク質ピーク２０、１４および５ｋＤａの重量比は、それぞれ約８０／８／１２である。
【００３８】
一般に、エナメルマトリックスの主要なタンパク質はアメロゲニンとして知られている。これらはマトリックスタンパク質の約９０％ｗ／ｗを構成する。残りの１０％ｗ／ｗにはプロリンリッチな非アメロゲニン、タフテリン、タフトタンパク質、血清タンパク質および少なくとも１つの唾液タンパク質が含まれるが、例えばエナメルマトリックスと関連して同定されているアメリン（アメロブラスチン、シースリン）などの、他のタンパク質も存在していてよい。さらに、様々なタンパク質をいくつかの異なる大きさ（すなわち異なる分子量）で合成および／または加工し得る。したがって、エナメルマトリックス中の支配的なタンパク質であるアメロゲニンは、いくつかの異なる大きさで存在することが判明しており、これらが一緒になって上記分子凝集体を形成する。これらは、生理的条件下で凝集体を形成する、著しく疎水性の物質である。これらは、他のタンパク質もしくはペプチドを保有するか、またはそれらの担体であり得る。凝集体の大きさは変動し、含まれる平均的な大きさは約１０ｎｍ〜１００μｍ、１００ｎｍ〜１０μｍ、または５０ｎｍ〜１μｍであり、多くの場合はより大きく、例えば１００ｎｍ〜１００μｍ、２０ｎｍ〜１００μｍ、２５ｎｍ〜１００μｍ、５０ｎｍ〜１００μｍ、１０〜１００ｎｍ、１０〜２５ｎｍ、１００〜５０ｎｍ、２０〜３０ｎｍ、２０〜５０ｎｍ、２０〜６０ｎｍ、２５〜４５ｎｍ、２５ｎｍ〜５０ｎｍ、２５ｎｍ〜７５ｎｍ、５０ｎｍ〜７５ｎｍなどである。一般に、凝集体の大きさは変動することができ、これは、所定の溶液／マトリックス中のタンパク質、ペプチドおよび／または断片の濃度ならびにマトリックス中の他の物質の存在にも依存する。
【００３９】
したがって、本発明の今回の好ましい実施形態は、アメロゲニンならびに／またはアメロゲニンの少なくとも断片および／もしくは細断片を含む、薬剤配合物、化粧配合物およ
び／または治療配合物に関する。
【００４０】
別の同等に好ましい実施形態は、さらに、プリ−プロアメロゲニンを含む薬剤配合物および／または治療配合物に関する。
【００４１】
他のタンパク質／ポリペプチド物質も、本発明に従った使用に適していることが企図される。例には、タンパク質またはプロリンリッチなタンパク質およびポリプロリンなどのタンパク質の断片が含まれる。
【００４２】
本発明に従った使用に適していることが企図される物質の他の例は、そのようなタンパク質、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質の凝集体、ならびにエナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体およびエナメルマトリックスタンパク質の代謝物である。代謝物は、タンパク質の大きさから短いペプチドの大きさの範囲の、任意の大きさであってよい。
【００４３】
本発明に関連するタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／またはそれらの細断片は、実質的に単離または精製した形態であり得る。タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／またはそれらの細断片は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／もしくはそれらの細断片の意図する目的に干渉せず、混合後も実質的に単離したとみなされる担体または希釈剤と混合し得ることを理解されたい。そのような実質的に精製した形態は、一般に、製剤中にタンパク質、ペプチドおよび／またはその断片を含み、製剤中のタンパク質の９０％を超える量、例えば９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％が本発明のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／または断片である。
【００４４】
さらに、本発明による活性エナメル物質のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／または細断片のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一である任意のアミノ酸配列、例えば少なくとも７２％、７５％、７７％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列も本発明の範囲内にあるとみなされる。
【００４５】
参照アミノ酸配列と少なくとも、例えば９５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／またはその断片とは、例えばポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であるが、ただし、アミノ酸配列が、参照アミノ酸配列のアミノ酸１００あたり５までの点突然変異を含み得ることを意図する。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸の５％までが欠失しているか、もしくは別のアミノ酸で置換されていてもよく、または参照配列中の全アミノ酸の５％までのいくつかのアミノ酸が参照配列中に挿入されていてもよい。参照配列のこのような突然変異は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置で起こってもよく、あるいはこれらの末端位置間の任意の場所で参照配列中のアミノ酸にわたって個々に、または参照配列内の１つもしくはそれ以上の連続的な集団で散在していてもよい。
【００４６】
本発明では、同一性を決定するためには局所アルゴリズムプログラムが最も適している。局所アルゴリズムプログラム（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎなど）では、１つの配列中の部分配列を第２の配列中の部分配列と比較し、最も高い全体類似度スコアを与える部分配列の組合せおよびそのような部分配列のアラインメントを見つける。可能な場合は、内部ギャップにペナルティを与える。局所アルゴリズムは、単一のドメインを有するか、または単に共通の結合部位を有するだけの２つの複数ドメインタンパク質の比較に良好である。
【００４７】
同一性および類似度を決定する方法は、公的に利用可能なプログラムで体系化されている。２つの配列間の同一性および類似度を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法には、それだけには限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ他（１９９４））ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．他（１９９０））が含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の供給者から公的に利用可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．他、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．他（１９９０））。それぞれの配列解析プログラムは初期設定のスコアマトリックスおよび初期設定ギャップペナルティを有する。一般に、分子生物学者は用いるソフトウェアプログラムによって確立されたデフォルト設定を用いることが期待される。
【００４８】
エナメルマトリックスのタンパク質は高分子量部分および低分子量部分に分けることができ、エナメルマトリックスタンパク質の明確に定義された画分は歯周部の欠損（すなわち歯周部の創傷）の治療に関して貴重な特性を有することが判明した。この画分は、一般にアメロゲニンと呼ばれる酢酸で抽出可能なタンパク質を含み、エナメルマトリックスの低分子量部分を構成する（ＥＰ−Ｂ−０ ３３７ ９６７号およびＥＰ−Ｂ−０ ２６３
０８６号を参照）。
【００４９】
エナメルマトリックスの低分子量部分は、歯周部の欠損中の硬組織間の結合を誘導するために適切な活性を有する。しかし、本発明の文脈では、活性タンパク質はエナメルマトリックスの低分子量部分に限定されない。現在、好ましいタンパク質には、約６０,００
０ダルトン未満の分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで測定）を有するアメロゲニン、タフテリンなどのエナメルマトリックスタンパク質が含まれるが、６０,
０００ダルトンを超える分子量を有するタンパク質も、例えば結合組織の成長を促進するための候補として有望な特性を有する。
【００５０】
上述のように、本発明に従って用いるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、典型的には、ＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動で決定した最大で約１２０ｋＤａ、例えば、最大で１００ｋＤａ、９０ｋＤａ、８０ｋＤａ、７０ｋＤａまたは６０ｋＤａなどの分子量を有する。
【００５１】
本発明に従って用いる活性エナメル物質の製剤は、異なる分子量の活性エナメル物質の混合物も含み得る。
【００５２】
したがって、本発明に従って用いる活性エナメル物質は、約４０,０００までの分子量、例えば約５,０００〜約２５,０００の分子量などを有することが企図される。
【００５３】
タンパク質を、例えば沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、調製用電気泳動、ゲル浸透クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによって分離することによって、異なる分子量のアメロゲニンを精製することができる。
【００５４】
分子量アメロゲニンの組合せは、支配的な２０ｋＤａの化合物から４０〜５ｋＤａの多くの異なる分子量を有するアメロゲニン凝集体、支配的な５ｋＤａの化合物まで変動し得る。通常はエナメルマトリックス中に見つかるタフテリンまたはタンパク質分解酵素などの他のエナメルマトリックスタンパク質を加え、アメロゲニン凝集体に保有させることができる。
【００５５】
一般に、エナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体およびエナメルマトリックスタンパク質は疎水性物質である、すなわち、特に高温で水への可溶性が低い。典型的
には、これらのタンパク質は非生理的ｐＨ値かつ約４〜２０℃などの低温で可溶性であり、一方で、体温（３５〜３７℃）かつ中性ｐＨで凝集および沈殿する。
【００５６】
したがって、特に好ましい実施形態では、本発明に従って用いる活性エナメル物質の低濃度配合物は、少なくとも部分的に凝集している、かつ／またはｉｎ ｖｉｖｏでの施用後に凝集体を形成することができる活性エナメル物質を含む。前記凝集体の粒子径は、約２００μｍ〜約１０ｎｍ、例えば１００μｍ〜１０ｎｍ、１０μｍ〜１００ｎｍ、１μｍ〜２０ｎｍ、１μｍ〜１０ｎｍ、５μｍ〜１０ｎｍ、１０μｍ〜１ｎｍ、１００μｍ〜１０ｎｍ、１００μｍ〜１ｎｍ、１μｍ〜１ｎｍ、１μｍ〜５ｎｍ、１μｍ〜１５ｎｍなどの範囲内にある。
【００５７】
本発明中に関連する高分子マトリックスは前駆体分子を高分子ネットワークに架橋結合させることによって形成するので、前記マトリックスは、活性エナメル物質の凝集体をマトリックス内に拘束することを可能にするために十分に狭いポリマー間間隔を有する高分子ネットワークを形成することができる。本発明の好ましい実施形態では、そのような十分に狭い孔径を有する高分子ネットワークは、中性ｐＨで、かつ／またはｉｎ ｓｉｔｕで、前駆体分子を患者の身体に施用したあとに形成され、したがって活性エナメル物質の凝集および／または沈殿が自動的に引き起こされる。
【００５８】
本発明に従って、活性エナメル物質を、例えば抗細菌物質、抗炎症物質、抗ウイルス物質、抗真菌物質などの他の活性薬物物質と一緒に、または局所化学療法、アポトーシス誘導剤、例えばＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ケラチノサイト成長因子またはそのペプチド類似体などの成長因子と組み合わせて用い得る。エナメルマトリックスもしくはその製造物中に内在するか、または加えた酵素、特にプロテアーゼも、エナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質と組み合わせて用い得る。
【００５９】
活性エナメル物質の使用に応じて、組成物は薬剤組成物および／もしくは治療組成物、または化粧組成物であり得る。以下では、用語「薬剤組成物および／または治療組成物」は、化粧組成物、およびいわゆる医薬品と化粧品とのあいまいな部分、すなわち薬用化粧品に属する組成物も包含することを意図する。
【００６０】
活性エナメル物質を含む薬剤組成物および／または治療組成物は、薬物送達系として役割を果たす。本発明の文脈では、用語「薬物送達系」とは、投与の際にヒトまたは動物の身体に活性物質を提示する薬剤組成物および／または治療組成物（薬剤配合物および／または治療の配合物または剤形）を意味する。
【００６１】
活性エナメル物質および高分子マトリックス以外に、本発明に従って用いる薬剤組成物および／または治療組成物は、もちろん、さらなる製薬上または化粧上許容される賦形剤も含み得る。
【００６２】
製薬上または化粧上許容される賦形剤とは、現在、組成物を投与する個体に実質的に無害である物質として定義されている。そのような賦形剤は、通常は国の保健機関によって与えられる要件を満たしている。例えば英国薬局方、米国薬局方および欧州薬局方などの公式の薬局方が、製薬上許容される賦形剤の基準を設定している。
【００６３】
本発明に従って用いる組成物中の製薬上許容される賦形剤の選択およびその最適濃度は、一般に予測することができず、最終組成物の実験的評価に基づいて決定しなければならない。しかし、薬剤配合物および／または治療配合物の当業者は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版、Ｍａｃ
ｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、１９９０に指針を見つけることができる。
【００６４】
フィブリンマトリックス
フィブリンとは、いくつかの生物医学の適用が報告されている天然材料である。フィブリンは、Ｈｕｂｂｅｌｌ他の米国特許第６,３３１,４２２号に細胞内殖マトリックスの材料として記載されている。フィブリンゲルは、多くの組織に結合するその能力および創傷治癒における天然の役割が理由で、以前にシーラントして用いられている。一部の具体的な適用には、血管移植片の付着、心臓弁の付着、骨折および腱の修復での骨の配置におけるシーラントとしての使用が含まれる（Ｓｉｅｒｒａ，Ｄ．Ｈ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、７：３０９〜３５２（１９９３））。さらに、これらのゲルは、薬物送達デバイスとして、および神経の再生用に用いられている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２６４：２８４〜２９０（１９８７））。
【００６５】
フィブリノーゲンをフィブリン内に重合させる方法も特徴づけられている。最初に、プロテアーゼが二量体フィブリノーゲン分子を２つの対称的な部位で切断する。トロンビン、レプチラーゼ、およびプロテアーゼＩＩＩを含めた、フィブリノーゲンを切断することができるいくつかの可能なプロテアーゼが存在し、そのそれぞれが異なる部位でタンパク質を切断する（Ｆｒａｎｃｉｓ他、Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ、１９：２９１〜３０７、１９９３）。フィブリノーゲンが切断されたあと、フィブリノーゲン単量体が一緒になって非共有的に架橋結合したポリマーゲルを形成する自己重合工程が起こる（Ｓｉｅｒｒａ、１９９３）。この自己構築が起こるのは、プロテアーゼ切断が起こったあとに結合部位が露出するからである。これらが露出したあと、分子の中心にあるこれらの結合部位は、ペプチド鎖の末端に存在するフィブリノーゲン鎖の他の部位に結合することができる（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＹ、１９７５）。このようにして、ポリマーネットワークが形成される。その後、トロンビンタンパク質分解によってＸＩＩＩ因子から活性化されるトランスグルタミナーゼであるＸＩＩＩａ因子がポリマーネットワークを共有的に架橋結合し得る。他のトランスグルタミナーゼも存在し、それらもフィブリンネットワークへの共有架橋結合および移植に関与し得る。
【００６６】
架橋結合したフィブリンゲルが形成されたあと、続く分解は細かく制御する。フィブリンの分解を制御するにあたって重要な分子の１つは、α２−プラスミン阻害剤である（Ａｏｋｉ，Ｎ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ、２１：２６７〜２８６、１９７９）。この分子は、ＸＩＩＩａ因子の作用を介してフィブリンのα鎖に架橋結合することによって作用する（Ｓａｋａｔａ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、６５：２９０〜２９７、１９８０）。それ自身をゲルに付着させることによって、高濃度の阻害剤をゲルに局在化することができる。その後、阻害剤は、プラスミノーゲンとフィブリンとの結合を妨げ（Ａｏｋｉ他、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、３９：２２〜３１、１９７８）、プラスミンを失活させることによって（Ａｏｋｉ、１９７９）作用する。α２−プラスミン阻害剤はグルタミン基質を含む。正確な配列は、ＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号１２）と同定されており、最初のグルタミンが架橋結合のための活性アミノ酸である。
【００６７】
ＸＩＩＩａ因子基質配列および生物活性ペプチド配列を含む二重ドメインペプチドをフィブリンゲル内に架橋結合させることができ、この生物活性ペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏでその細胞活性を保持しているということが実証されている（Ｓｃｈｅｎｓｅ，Ｊ．Ｃ．他（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、１０：７５〜８１）。
【００６８】
したがって、本発明の好ましい薬剤配合物および／または治療配合物は、細胞の成長もしくは内殖に適しているか、または細胞閉塞性である高分子マトリックスと、活性エナメル物質の群から選択された少なくとも１つのタンパク質とを含み、前記活性エナメル物質の濃度は配合物１ｍｌあたり５ｍｇを超えず、高分子マトリックスはフィブリンを含む。前記薬剤配合物および／または治療配合物では、本発明による活性エナメル物質をＸＩＩＩａ因子基質配列などのトランスグルタミナーゼ基質ドメインにカップリングさせることができる。
【００６９】
このＸＩＩＩａ因子基質配列には、例えば、ＧＡＫＤＶ、ＫＫＫＫ、またはＮＱＥＱＶＳＰＬが含まれ得る。活性エナメル物質とトランスグルタミナーゼ基質ドメインとのカップリングは化学合成によって行うことができる。
【００７０】
あるいは、トランスグルタミナーゼ基質ドメインは、ＸＩＩＩａ因子以外のトランスグルタミナーゼの基質であることができる。最も好ましいＸＩＩＩａ因子基質ドメインは、ＮＱＥＱＶＳＰＬのアミノ酸配列を有するが、フィブロネクチンなど、トランスグルタミナーゼが認識する他のタンパク質も、トランスグルタミナーゼ基質ペプチドにカップリングさせることができる。
【００７１】
【表１】
【００７２】
合成マトリックス
身体内に施用する合成マトリックスを形成するための架橋結合反応には、（ｉ）Ｈｅｍ他、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、３９：２６６〜２７６（１９９８）に記載のように、不飽和二重結合を含む２つまたはそれ以上の前駆体間のフリーラジカル重合、（ｉｉ）Ｒｈｅｅ他の米国特許第５,８７４,５００号に開示されているように、例えばアミン基を含む前駆体とスクシンイミジル基を含む前駆体との間の求核置換反応、（ｉｉｉ）縮合および付加反応、ならびに（ｉｖ）強力な求核剤とコンジュゲートした不飽和基または結合（強力な求電子剤など）とのマイケル型付加反応が含まれる。求核基としてチオールまたはアミン基を有する前駆体分子と求電子基としてアクリル基またはビニルスルホン基を含む前駆体分子との間の反応が特に好ましい。求核基として最も好ましいのはチオール基である。マイケル型付加反応はＷＯ００／４４８０８号（Ｈｕｂｂｅｌｌ他）に記載されている。マイケル型付加反応は、敏感な生体物質の存在下においても、生理的条件下で、自己選択的な様式で少なくとも第１および第２の前駆体成分のｉｎ ｓｉｔｕ架橋結合を可能にする。前駆体成分の１つが少なくとも２つの官能性を有し、残りの前駆体
成分のうちの少なくとも１つが２つを超える官能性を有する場合は、この系は自己選択的に反応して架橋結合した三次元生体材料を形成する。
【００７３】
したがって、本発明の一態様は、細胞の成長、内殖および／もしくは遊走に適しているか、または細胞閉塞性のどちらかである高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療配合物に関し、前記マトリックスは、強力な求核剤とコンジュゲートした不飽和結合、またはコンジュゲートした不飽和基との間の求核付加反応によって形成される。
【００７４】
好ましくは、コンジュゲートした不飽和基またはコンジュゲートした不飽和結合は、アクリレート、ビニルスルホン、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、ビニルスルホン、２−もしくは４−ビニルピリジニウム、マレイミド、またはキノンである。
【００７５】
求核基は、好ましくはチオール基、アミノ基またはヒドロキシル基である。チオール基は、プロトン化されていないアミン基よりも相当高い反応性を有する。この考察にはｐＨが重要である。脱プロトン化されたチオールはプロトン化されたチオールよりも相当高い反応性を有する。したがって、２つの前駆体成分を１つの高分子マトリックスへと変換するための、チオールを用いた、アクリレートまたはキノンなどのコンジュゲートした不飽和に関与する付加反応は、多くの場合、約８のｐＨで最も素早くかつ自己選択的に実施することが最良である。約８のｐＨでは、有意な数の目的チオールが脱プロトン化されており（したがって反応性がより高くなる）、目的アミンのほとんどがプロトン化されたままである（したがって反応性がより低くなる）。チオールを第１の前駆体分子として用いる場合は、その反応性がアミンよりもチオールに対して選択的であるコンジュゲート構造が非常に望ましい。
【００７６】
適切な第１および第２の前駆体分子には、タンパク質、ペプチド、ポリオキシアルキレン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−アクリル酸）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレン−コ−ビニルピロリドン）、ポリ（マレイン酸）、ポリ（エチレン−コ−マレイン酸）、ポリ（アクリルアミド）、およびポリ（酸化エチレン）−コ−ｄ（酸化プロピレン）ブロックコポリマーが含まれる。特に好ましい前駆体分子はポリエチレングリコールである。
【００７７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、好都合な基礎単位ブロックを提供する。直鎖状（すなわち末端が２つ）もしくは分枝鎖状（すなわち末端が３つ以上）のＰＥＧを容易に購入または合成し、その後、ＰＥＧの末端基を官能化してチオールなどの強力な求核剤またはアクリレートもしくはビニルスルホンなどのコンジュゲートした構造のどちらかを導入することができる。わずかに塩基性の環境中でこれらの成分を互いまたは対応する成分のどちらかと混合した場合、第１および第２の前駆体成分の間の反応によってマトリックスが形成される。ＰＥＧ成分を非ＰＥＧ成分と反応させることができ、どちらの成分の分子量または親水性も、生じる生体材料の機械的特徴、透過性、および含水量を操作するために制御することができる。
【００７８】
したがって、本発明の特に好ましい実施形態は、細胞の内殖および／もしくは遊走に適しているか、または細胞閉塞性であることができる高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療配合物であり、前記活性エナメル物質の濃度は配合物１ｍｌあたり５ｍｇ未満であり、前記マトリックスはポリエチレングリコールを含む。
【００７９】
例として、２つまたはそれ以上のシステイン残基を含むペプチドの合成は簡単であり、その後、この成分は容易に求核基との第１の前駆体成分として役割を果たすことができる。例えば、２つの遊離システイン残基を有するペプチドは、生理的ｐＨまたはそれよりわずかに高いｐＨ（例えば８〜９）でＰＥＧトリ−ビニルスルホン（３本のアームを有し、そのアームのそれぞれにビニルスルホンを有するＰＥＧ）と混合した場合に容易にマトリックスを形成する。ゲル化はまたより高いｐＨでさえも良好に進行することができるが、自己選択性を犠牲にする可能性がある。２つの液体前駆体成分、すなわち溶解した前駆体成分を一緒に混合した場合、これらは数秒間から数分間かけて反応して、ネットワークの節を有するＰＥＧ鎖のネットワークからなり、連結リンクとしてペプチドを有する弾性ゲルを形成する。ペプチドは、フィブリンマトリックスなどのタンパク質系ネットワーク中で行われるようにネットワークが細胞によって浸潤かつ分解されることができるように、プロテアーゼ基質として選択することができる。好ましくは、ドメイン中の配列は細胞遊走に関与する酵素の基質であるが（例えば、コラゲナーゼ、プラスミン、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）またはエラスターゼなどの酵素の基質として）、適切なドメインはこれらの配列に限定されない。１つの特に有用な配列は、酵素プラスミンの基質である。ゲルの分解特徴は、架橋結合の節として役割を果たすペプチドの詳細を変更することによって操作することができる。コラゲナーゼによっては分解可能であるがプラスミンでは可能でない、またはプラスミンによっては分解可能であるがコラゲナーゼによっては可能でないゲルを作製し得る。さらに、単純にアミノ酸配列を変更して酵素反応のＫｍもしくはｋｃａｔ、または両方を変化させることによって、このような酵素に応答してゲルがより速くまたはより遅く分解するようにすることが可能である。したがって、細胞の通常の再構築特徴、例えばプロテアーゼプラスミンに重要な基質部位を示すことによって再構築されることができるという点でバイオミメティックである生体材料を、作製することができる。ペプチドとＰＥＧとのゲル化は自己選択的である。
【００８０】
場合により、他の種（例えば組織表面）との化学結合をもたらすために、二官能性薬剤をマトリックス内に取り込ませることができる。マトリックスをＰＥＧビニルスルホンから形成する場合は、プロテアーゼ基質をマトリックス内に取り込ませることが重要である。ＰＥＧアクリレートとＰＥＧチオールとの反応から形成したマトリックス以外は、ＰＥＧビニルスルホンおよびＰＥＧチオールから形成したマトリックスは加水分解性の結合を含まない。したがって、プロテアーゼ基質を取り込ませることにより、マトリックスが身体内で分解することが可能となる。
【００８１】
合成マトリックスは、操作上形成が単純である。２つの液体前駆体を混合する；一方の前駆体は求核基を有する前駆体分子を含み、他方の前駆体分子は求電子基を含む。生理食塩水が溶媒として役割を果たすことができる。反応によって最小限の熱しか発生しない。したがって、ゲル化は、不都合な毒性なしに、組織と直接接触させてｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。したがって、遠位を修飾した（ｔｅｌｅｃｈｅｌｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）、またはその側基を修飾したどちらかの、ＰＥＧ以外のポリマーを用い得る。
【００８２】
したがって、本発明は、高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療配合物に関し、前記活性エナメル物質の濃度は配合物１ｍｌあたり５ｍｇ未満であり、前記マトリックスは事前に形成するか、または前記マトリックスはｉｎ ｓｉｔｕで形成する。
【００８３】
本発明の１つの具体的な態様では、ＰＥＧマトリックスの外殻および凝集した活性エナメル物質を含む内核を有するマイクロカプセルを形成する。マイクロカプセルは、ＰＥＧおよび活性エナメル物質を含む混合物でのＰＥＧの重合中に、ｐＨをｐＨ５〜ｐＨ９.５
の範囲で用いた場合に形成される。マイクロカプセル殻は、活性エナメル物質の凝集体を
封入する重合したＰＥＧによって形成される。活性エナメル物質の凝集体は、重合に用いられるｐＨ５〜ｐＨ９.５の範囲のｐＨによって形成される。活性エナメル物質の凝集体
はＰＥＧマトリックス殻の孔を透過するには大きすぎる。これにより、ＰＥＧマトリックス殻が分解されるまで活性エナメル物質はマイクロカプセルから放出されない。
【００８４】
ほとんどの治癒指標には、細胞内殖またはマトリックス内への細胞遊走の速度と適応したマトリックスの分解速度との組合せが全体的な治癒応答に重要である。非加水分解性のマトリックスが細胞によって浸潤される潜在性は、主にネットワーク密度の関数である。分岐点もしくは節の間の既存の空間が細胞の大きさに対して小さすぎる場合、またはマトリックス内により多くの空間の作製をもたらすマトリックスの分解の速度が遅すぎる場合は、非常に限定された治癒応答が観察される。天然に見つかる治癒マトリックス、例えば身体中の傷害に対する応答として形成されるフィブリンマトリックスは、細胞が非常に容易に浸潤することができる非常に緩いネットワークからなることが知られている。浸潤は、フィブリンネットワークに組み込まれた一部である細胞接着用のリガンドによって促進される。
【００８５】
ポリエテングリコールなどの合成親水性前駆体分子から作製したマトリックスは、高分子ネットワークの形成後に水性環境中で膨潤する。十分に短いゲル化時間（７〜８のｐＨ、３６〜３８℃の範囲の温度で３〜１０分）および身体中におけるマトリックスのｉｎ ｓｉｔｕ形成中の定量的反応を達成するためには、前駆体分子の開始濃度は十分に高くなければならない。そのような条件下では、必要な開始濃度は、マトリックスが水性環境中で分解可能でない場合は細胞の浸潤には密すぎる、マトリックスをもたらす。したがって高分子ネットワークの膨潤は、分岐点間の空間を拡張および拡大するために重要である。
【００８６】
前駆体分子の開始濃度には無関係に、４本アームのＰＥＧビニルスルホンおよびＳＨ基を有するペプチドなど、同じ合成前駆体分子から作製したヒドロゲルは、平衡状態において同じ含水量まで膨潤する。これは、前駆体分子の開始濃度が高ければ高いほど、その平衡状態に達した際にヒドロゲルの最終体積が大きくなることを意味する。身体中で利用可能な空間が十分な膨潤を許容するには小さすぎる場合、特に前駆体成分から形成された結合が加水分解可能でない場合は、細胞の浸潤および治癒応答の速度は低下する。その結果、身体に施用するための２つの相反する要件の間の最適値を探さなければならない。良好な細胞の浸潤および続く治癒応答が、分子量が実質的に類似している少なくとも３本のアームを有する三官能性分枝鎖状ポリマーと少なくとも二官能性の分子である第２の前駆体分子との反応から形成した三次元高分子ネットワークで観察されている。第１および第２の前駆体分子の官能基の当量比は０.９〜１.１である。第１の前駆体分子のアームの分子量、第２の前駆体分子の分子量、および分岐点の官能性は、生じる高分子ネットワークの含水量が、水の取込みが完了した後の高分子ネットワークの全重量平衡の質量％〜９２質量％となるように選択する。好ましくは、含水量は、水の取込みが完了した後の高分子ネットワークおよび水の全重量の９３〜９５質量％である。水の取込みの完了は、平衡濃度に達した場合、または生体材料中の利用可能な空間がそれ以上の体積の増加を許容しない場合に、達することができる。したがって、可能な限り低い前駆体成分の開始濃度を選択することが好ましい。これは、すべての膨潤性マトリックスについて当てはまるが、細胞に媒介される分解を受け、高分子ネットワーク中に加水分解性の結合を含まないマトリックスに特に当てはまる。
【００８７】
ゲル化時間と低い開始濃度とのバランスは、特に非加水分解性のゲルについては、前駆体分子の構造に基づいて最適化すべきである。具体的には、第１の前駆体分子のアームの分子量、第２の前駆体分子の分子量および分岐の度合、すなわち分岐点の官能性を、相応に調節しなければならない。実際の反応機構はこの相互関係にわずかな影響しか与えない。
【００８８】
第１の前駆体分子がそれぞれのアームの末端に官能基を有する３本または４本アームのポリマーであり、第２の前駆体分子が直鎖状の二官能性分子、好ましくは少なくとも２つのシステイン基を含むペプチドである場合は、第１の前駆体分子のアームの分子量および第２の前駆体分子の分子量は、ネットワークの形成後の分岐点間の連結が１０〜１３ｋＤａ（連結が分枝鎖状ではなく直鎖状であるという条件下で）、好ましくは１１〜１２ｋＤａの範囲の分子量を有するように選択することが好ましい。これにより、第１および第２の前駆体分子の合わせた開始濃度を、溶液中の第１および第２の前駆体分子の全重量の８〜１２質量％、好ましくは９〜１０質量％の範囲とすることが可能となる（ネットワーク形成前）。第１の前駆体成分の分岐度合を８に増加し、第２の前駆体分子が直鎖状の二官能性分子のままである場合は、分岐点間の連結の分子量を１８〜２４ｋＤａの分子量まで増加することが好ましい。第２の前駆体分子の分岐度合を直鎖状から３本または４本アームの前駆体成分まで増加する場合は、分子量、すなわち連結の長さを相応に増加する。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態では、第１の前駆体分子として三官能性の３本アームの１５ｋＤａポリマーを含み（すなわちそれぞれのアームが５ｋＤａの分子量を有する）、第２の前駆体分子として０.５〜１.５ｋＤａの範囲、さらにより好ましくは約１ｋＤａの分子量の二官能性の直鎖状分子を含む組成物を選択する。好ましくは、第１および第２の前駆体成分はポリエチレングリコールである。
【００９０】
別の好ましい実施形態では、第１の前駆体成分は、官能基としてコンジュゲートした不飽和基または結合、最も好ましくはアクリレートまたはビニルスルホンを含み、第２の前駆体分子の官能基は、求核基、好ましくはチオールまたはアミノ基を含む。
【００９１】
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、第１の前駆体分子は、それぞれのアームの末端に官能基を有する、４本アームの２０ｋＤａのポリマー（それぞれのアームの分子量が５ｋＤａ）であり、第２の前駆体分子は、１〜３ｋＤａ、好ましくは１.５〜２ｋＤａ
の範囲の分子量の二官能性の直鎖状分子である。好ましくは、第１の前駆体分子はビニルスルホン基を有するポリエチレングリコールであり、第２の前駆体分子はシステイン基を有するペプチドである。どちらの好ましい実施形態でも、第１および第２の前駆体分子の合わせた開始濃度の範囲は、第１および第２の前駆体分子ならびに水の全質量の８〜１１質量％、好ましくは９〜１０質量％（高分子ネットワーク形成前）、１０分未満のゲル化時間を達成するためには好ましくは５〜８質量％である。これらの組成物は、ｐＨ８.０
、３７℃で、混合後約１〜１０分、例えば２〜１０分、または３〜１０分などのゲル化時間を有する。
【００９２】
適切な合成ゲルは、例えばＷＯ０３／０５２０９１号に記載されている。そのような例の１つは、４つのビニルスルホン末端基および配列Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙのジチオールペプチドで官能化した、４本アームの分枝鎖状ＰＥＧから形成した酵素分解性ゲルである。ＷＯ０３／０５２０９１号からの別の例は、アクリル化した４本アームのポリエチレングリコール（分子量１５,０００）を直鎖状ポリエチレングリコールジチオール（分子量３４００）と混合することによって形成した加水分解性のゲルであり、これらはマイケル型反応を介して互いに共有結合している。
【００９３】
マトリックスが、例えばアクリレートとチオールとの好ましい反応によって形成した加水分解性の結合を含む場合、細胞の浸潤に関するネットワーク密度は最初に特に重要であるが、水性環境では、結合が加水分解されてネットワークが緩み、細胞の浸潤が可能となる。高分子ネットワークの全体的な分岐度合の増加に伴って、連結の分子量、すなわち連結の長さが増加しなければならない。
【００９４】
本発明の具体的な実施形態では、活性エナメル物質と細胞閉塞性である高分子マトリックスとを含む低濃度配合物は、水の存在下における少なくとも２つの前駆体の反応によって得る。前記配合物は、例えば当分野で「誘導骨再生」として周知の治療において、移植部位で骨形成を促進するために特に好ましい。本発明では、非骨原性の軟組織細胞が部位に侵入することを阻害する障壁によって骨形成が望まれる部位を周辺組織から分離し、これにより骨髄からの細胞がそれを満たすことが可能となる。そのような膜を形成する本発明による高分子マトリックスは、２つまたはそれ以上前駆体の反応によって得ることができ、前駆体の鎖の隣接する交差点は、１００００個未満の原子、例えば５０００、１０００、９００、８００、７５０個未満の原子など、またはさらにより好ましくは６７０個未満の原子、例えば２５０〜３５０個の原子、例えば３００個の原子を有する鎖によって結合されている。
【００９５】
詳細には、第１の前駆体は、コンジュゲートした不飽和末端基またはコンジュゲートした不飽和末端結合を有する２本もしくはそれ以上の鎖を保有する核を含む。核は、炭素もしくは窒素原子などの単一原子、または酸化エチレン単位などの小分子、糖、ペンタ−エリスリトールなどの多官能性アルコール、ヘキサグリセリンなどのグリセリンもしくはオリゴグリセリンであることができる。鎖は、場合により異種原子、アミド基もしくはエステル基を含む直鎖状ポリマーまたは直鎖状もしくは分枝鎖状アルキル鎖である。鎖以外に、核は、直鎖状もしくは分枝鎖状アルキル残基または末端のコンジュゲートした不飽和基もしくは結合を有さないポリマーでさらに置換されていてもよい。本発明の１つの好ましい実施形態では、第１の前駆体は、２〜１０本の鎖、最も好ましくは２〜６または４〜８本の鎖を有する。末端のコンジュゲートした不飽和結合は、好ましくは、マレイミド、アクリレート、アクリルアミド、キニーネ、および２−または４−ビニルピリジニウムである。同等に好ましい実施形態では、第１の前駆体は２〜１０本の鎖、最も好ましくは３〜８本の鎖、例えば３〜６本の鎖を有する。
【００９６】
第２の前駆体は、鎖の末端の最後の２０個の原子の任意のものにチオール基がそれぞれ付着した、２本またはそれ以上の鎖を保有する核を含む。例えば、システイン残基を鎖内に取り込ませ得る。好ましくは、チオール基が末端にある。核は、炭素もしくは窒素原子などの単一原子、または酸化エチレン単位などの小分子、糖、ペンタ−エリスリトールなどの多官能性アルコール、ヘキサグリセリンなどのグリセリンもしくはオリゴグリセリンであることができる。鎖は、場合により異種原子、アミド基もしくはエステル基を含む直鎖状ポリマーまたは直鎖状もしくは分枝鎖状アルキル鎖である。鎖以外に、核は、直鎖状もしくは分枝鎖状アルキル残基、または末端のコンジュゲートした不飽和基もしくは結合を有さないポリマーでさらに置換されていてもよい。好ましい実施形態では、第２の前駆体は、２〜１０本の鎖、最も好ましくは２〜６または４〜８本の鎖を有する。同等に好ましい実施形態では、第２の前駆体は、２〜１０本の鎖、最も好ましくは３〜８本の鎖、例えば３〜６本の鎖を有する。
【００９７】
第１および第２の前駆体の鎖の合計は、密な三次元ネットワークを得るために、５本以上、例えば６本以上、好ましくは８本以上である。
【００９８】
前駆体のそれぞれの核は交差点を形成する。隣接する交差点は、１００００個未満の原子、例えば５０００、１０００、９００、８００、７５０個未満の原子、またはさらにより好ましくは６７０個未満の原子、例えば２５０〜３５０個の原子、例えば３００個の原子を有する鎖によって結合されており、前記原子とは鎖の主鎖中の原子のことだけを指しており、これは置換基またはＨ原子を考慮していないことを意味する。好ましくは、２つの隣接する交差点間の原子の数は約３３０個未満の原子、最も好ましくは３０〜１２０個の原子である。言い換えれば、生じる三次元ネットワークの網目構造は、細胞の寸法（１
〜１００μｍ）よりも、また中性ｐＨで活性エナメル物質によって形成される、例えば１０ｎｍ〜１００μｍであることができる凝集体よりも数桁小さく、したがって保持される。
【００９９】
したがって、本発明の現在の好ましい実施形態では、ネットワークの網目構造は１０ｎｍ〜１０μｍである、すなわち、孔は平均して約１μｍよりも小さい、またはそれより大きくない、例えば５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、１０ｎｍよりも小さい。好ましい孔径は、１０μｍ〜１０ｎｍ、例えば１０μｍ〜１００ｎｍ、１０μｍ〜１０ｎｍ、１μｍ〜１００ｎｍ、５００ｎｍ〜１０ｎｍ、５００ｎｍ〜２５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１０ｎｍなどとなるように選択する。
【０１００】
活性エナメル物質の高分子マトリックスへの取込み
本発明の別の同等に好ましい実施形態は、特に、高分子マトリックスと共有もしくは非共有結合によって前記マトリックスに連結した活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための低濃度薬剤配合物および／または治療配合物に関する。具体的には、前記活性エナメル物質は、タンパク質、ポリペプチドまたはその細断片であることができる前記活性エナメル物質中の少なくとも１つのシステイン残基と、マトリックスの成分のうち少なくとも１つのコンジュゲートした不飽和基との求核付加反応によって、前記マトリックスに連結することができ、前記少なくとも１つのシステイン残基は前記タンパク質、ポリペプチドまたはその細断片のＣ末端もしくはＮ末端のどちらかに位置する。この実施形態は、前記高分子マトリックスが、マトリックス内への細胞の成長、内殖および／または遊走を可能にするために十分なポリマー間間隔を有する高分子ネットワークを形成する場合に、特に好ましい。典型的には、この特定の実施形態では、架橋結合した高分子マトリックスはゲルを形成する。
【０１０１】
したがって、活性エナメル物質を合成前駆体成分から形成したマトリックス内に取り込ませるためには、活性エナメル物質の融合ペプチド、もしくは取り込ませる任意の他のペプチドを、架橋結合可能な基質ドメインとして少なくとも１つの追加のシステイン基（−ＳＨ）を用いて合成するか、またはそれを含むように化学的に変更することができる。その後、遊離システイン基がマイケル型付加反応で前駆体成分のコンジュゲートした不飽和基と反応する。システインのチオール基は、合成ポリマー上のコンジュゲートした不飽和結合と反応して共有結合を形成することができる。
【０１０２】
したがって、一実施形態では、前記活性エナメル物質を、少なくとも１つの追加のシステイン基（−ＳＨ）を含むように化学修飾する。
【０１０３】
システインは、活性エナメル物質に直接付着しているか、またはリンカー配列を介して付着しているかのどちらかであることができ、これはさらに、活性エナメル物質を例えば実質的にネイティブな形の酵素によってマトリックスから切断できるように、タンパク質分解させる配列などの酵素分解可能なアミノ酸配列、または多糖分解の基質および／もしくはプラスミン分解性配列、またはエステル結合などの非特異的な加水分解によって分解可能な配列を含んでいることができる。
【０１０４】
分解性結合
一般に、本発明の薬剤配合物および／または治療配合物からの活性エナメル物質の徐放性により、必要な活性エナメル物質の総量が低下する。特に、この効果は、その放出が細胞工程によって制御される場合にさらに最適化される。活性エナメル物質の保存およびその生体利用度は、初期バースト放出によって顕著な量の活性エナメル物質の損失を特徴的にもたらす拡散徐放性デバイスの使用に勝る、細胞特異的タンパク質分解活性を開拓する
ことの明確な利点である。マトリックスに共有結合した活性エナメル物質を用いた骨欠損の強力な治癒の１つの潜在的な説明では、活性エナメル物質を局所的に長時間かけて投与するが（すなわち、単一のパルス用量だけではない）、これを連続的な様式で行うことが重要であると考えられている。これは、マトリックスの酵素切断または加水分解切断のどちらかによるゆっくりとした分解によって達成される。このようにして、その後に分子が持続的な一定期間をかけて起こる偽パルス効果によって送達される。例えば、前駆細胞がマトリックスを浸潤する際、これは活性エナメル物質分子に遭遇し、そこで前骨芽細胞へと分化することができる。しかし、特定のその細胞が結合した活性エナメル物質をマトリックスから解放し続けない場合、これは有効に骨芽細胞へと変換されて骨マトリックスを産生し始める。最後に、活性エナメル物質の治療効果は欠損領域に局在化しており、したがって次いで増幅される。
【０１０５】
マトリックスを形成している単量体、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、またはそれらの細断片のうちの任意のものを、分解性結合を含めることによって改変することができる。典型的には、これらは、トロンビンによる切断の部位などの酵素切断部位となる。
【０１０６】
さらに、マトリックスに架橋結合した活性エナメル物質の融合タンパク質またはペプチドキメラは、第１のドメイン中の生物活性タンパク質と第２のドメイン中の付着部位との間に分解性部位を含み得る（例えば、システイン、ＸＩＩＩａ因子基質またはヘパリン結合ドメイン）。これらの分解性部位は、非特異的な加水分解によって分解され得るか（すなわちエステル結合）、または特異的な酵素分解（タンパク質分解もしくは多糖分解）の基質であり得る。
【０１０７】
分解部位により、一次タンパク質配列にわずかな修飾しか与えずに、またはそれを修飾せずに、活性エナメル物質が放出されることが可能となり、これは、より高い活性エナメル物質の活性をもたらし得る。さらに、分解性部位により、フィブリンゲルなどのマトリックスからの活性エナメル物質のより特異的な放出が可能となる。例えば、酵素活性に基づいて分解により、活性エナメル物質の放出が、何らかの多孔性材料からの活性エナメル物質の拡散によってではなく局在化したタンパク質分解などの細胞工程によって制御されることが可能となる。分解性の部位または結合は、マトリックスを浸潤する細胞から放出された酵素によって切断される。これにより、材料内の細胞の位置に次第で、同一材料内で活性エナメル物質が異なる速度で放出されることが可能となる。長期間にわたって起こるそのような適用には細胞特異的タンパク質分解活性が重要である。
【０１０８】
タンパク質分解に用いることができる酵素は多数ある。タンパク質分解性部位には、コラゲナーゼ、プラスミン、エラスターゼ、ストロメライシン、またはプラスミノーゲン活性化剤の基質が含まれる。例示的な基質を表２に記載する。Ｐ１〜Ｐ５は、タンパク質分解が起こる部位からタンパク質のアミノ酸末端に向かって１〜５個のアミノ酸の位置を示す。Ｐ１'〜Ｐ４'は、タンパク質分解が起こる部位からタンパク質のカルボキシ末端に向かって１〜４個のアミノ酸の位置を示す。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
別の好ましい実施形態では、オリゴ−エステルドメインを第１および第２のドメインの間に挿入することができる。これは、乳酸オリゴマーなどのオリゴ−エステルを用いて達成することができる。
【０１１１】
非酵素分解基質は、酸または塩基に触媒される機構による加水分解を受ける任意の結合からなることができる。このような基質には、乳酸またはグリコール酸のオリゴマーなどのオリゴ−エステルが含まれることができる。これらの材料の分解速度は、オリゴマーの選択を介して制御することができる。
【０１１２】
多糖基質
酵素分解はさらに、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、およびコンドロイチナーゼＡＢＣなどの酵素の多糖基質で起こることができる。これらの酵素のそれぞれが多糖基質を有する。ヘパリン結合系のすべてにヘパリンが存在するおかげで、ヘパリナーゼの基質はこれらの系に既に組み込まれている。
【０１１３】
したがって、高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療配合物が同様に想定され、前記活性エナメル物質の濃度は配合物１ｍｌあたり５ｍｇ以下であり、前記活性エナメル物質は、少なくとも１つのヘパリン結合断片を介して前記マトリックスに共有結合または非共有結合している。
【０１１４】
タンパク質分解性基質を、活性エナメル物質キメラまたはヘパリン活性エナメル物質キメラのどちらかのペプチド合成中に加えることができる。ヘパリン結合活性エナメル物質キメラは、プラスミンの配列（例えば表２参照）などのプロテアーゼ基質をＸＩＩＩａ因子基質とヘパリン結合ドメインとの間に挿入することによって、タンパク質分解配列を含むように改変することができる。高いＫmおよび低いｋcatを有する基質を用いて、切断を遅延させる一方でプロテアーゼの活性部位を占有することができる。プラスミンのもの以外の切断基質を用いて、活性エナメル物質の放出をマトリックス分解に非依存性にすることができる。
【０１１５】
同時に、オリゴ−エステルドメインも、ペプチドの合成工程中にＸＩＩＩａ因子基質などの第２のドメインと活性エナメル物質もしくはヘパリン結合ドメインのどちらかである第１のドメイン、またはキメラのヘパリンドメインとの間に挿入することができる。これは、乳酸オリゴマーなどのオリゴ−エステルを用いて達成することができる。
【０１１６】
非酵素分解基質は、酸または塩基に触媒される機構による加水分解を受ける任意の結合からなることができる。このような基質には、乳酸またはグリコール酸のオリゴマーなどのオリゴ−エステルが含まれることができる。これらの材料の分解速度は、オリゴマーの選択を介して制御することができる。
【０１１７】
ヘパリン；ヘパリン結合ペプチド
本発明による高分子マトリックスは、ヘパリンおよび／またはヘパリンに結合するタンパク質に直接もしくは間接的に結合するヘパリン結合断片を含めることによって、さらに改変することができる。後者の場合、タンパク質がヘパリンに結合することができ、その後、これがヘパリン結合部位を含む活性エナメル物質への結合に利用可能となるか、または、活性エナメル物質自体が、特定のヘパリン結合活性エナメル物質によって結合されているヘパリン部分を含むことができる。これらは、以下にさらに詳細に記載するように標準の技術を用いて、マトリックス材料に付着させることができる。
【０１１８】
したがって、本出願の想定される一実施形態は、細胞の成長もしくは内殖に適している、または細胞閉塞性である高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための低濃度薬剤配合物および／または治療配合物であり、前記活性エナメル物質の濃度は配合物１ｍｌあたり５ｍｇ未満であり、前記マトリックスは、少なくとも１つのヘパリンおよび／または少なくとも１つのヘパリン結合断片を含めることによって改変する。
【０１１９】
好ましい実施形態では、ペプチドキメラおよびヘパリン自体からなる二部系を用いて、ヘパリンを非共有的にフィブリンゲルに付着させる。ペプチドキメラは、２つのドメイン
、すなわちＸＩＩＩａ因子基質および多糖結合ドメインからなる。ペプチドキメラがフィブリンゲルに架橋結合したのち、これは非共有相互作用によってヘパリン（または他の多糖類）に付着する。
【０１２０】
多数のタンパク質がヘパリン結合親和性を有することが判明している。例は以下の表３中に見つけることができる。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】
想定される代替実施形態では、活性エナメル物質自体が、表３に例示した物質などのヘパリン結合親和性を有する結合基質に対する親和性を示す。そのような実施形態では、活性エナメル物質が上述のように共有的または非共有的に高分子マトリックス内に結合し、したがって、任意の他の物質とヘパリン結合親和性との非共有相互作用のためのヘパリン様ドメインが提供される。
【０１２３】
細胞付着部位
細胞は、細胞表面におけるタンパク質−タンパク質、タンパク質−オリゴ糖およびタンパク質−多糖の相互作用を介してその環境と相互作用する。細胞外マトリックスタンパク
質は、細胞に大量の生物活性シグナルを提供する。この密なネットワークが細胞の支援に必要であり、マトリックス中の多くのタンパク質が細胞の接着、拡大、遊走および分化を調節することが示されている（Ｃａｒｅｙ、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、５３：１６１〜１７７、１９９１）。とりわけ活性があることが示されている特異的タンパク質の一部には、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フィブリン、フィブリノーゲンおよびコラーゲンが含まれる（Ｌａｎｄｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２：１８９〜１９５、１９８９）。ラミニンの研究が数多く実施されており、ラミニンが、ｉｎ
ｖｉｖｏでの神経およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経細胞の発生および再生（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２：８５１〜８６９、１９８７）、ならびに血管形成にも重要な役割を果たすことが示されている。
【０１２４】
細胞受容体と直接相互作用して接着、拡大またはシグナル伝達のいずれかを引き起こす特異的配列の一部が同定されている。
【０１２５】
大きな複数ドメインタンパク質であるラミニンは（Ｍａｒｔｉｎ、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：５７〜８５、１９８７）、３本の鎖からなり、いくつかの受容体結合ドメインを有することが示されている。これらの受容体結合ドメインには、ラミニンＢ１鎖のＹＩＧＳＲ配列（Ｇｒａｆ他、Ｃｅｌｌ、４８：９８９〜９９６、１９８７；Ｋｌｅｉｎｍａｎ他、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２７２：３９〜４５、１９８９；およびＭａｓｓｉａ他、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：８０５３〜８０５９、１９９３）、ラミニンＡ鎖のＬＲＧＤＮ（Ｉｇｎａｔｉｕｓ他、Ｊ．ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１１１：７０９〜７２０、１９９０）およびラミニンＢ１鎖ＰＤＧＳＲ（Ｋｌｅｉｎｍａｎ他、１９８９）が含まれる。いくつかの他の細胞認識配列も同定されている。それらには、ラミニンＡ鎖のＩＫＶＡＶ（Ｔａｓｈｉｒｏ他、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１６１７４〜１６１８２、１９８９）およびラミニンＢ２鎖の配列ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ（Ｌｉｅｓｉ他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２４４：１４１〜１４８、１９８９）が含まれる。
【０１２６】
さらなる好ましい実施形態では、細胞接着のためのペプチド部位をマトリックス内に、すなわち、細胞表面上の接着促進受容体に結合するペプチドを本発明の生体材料内に取り込ませる。そのような接着促進ペプチドは上述の群から選択することができる。特に好ましいのは、フィブロネクチン由来のＲＧＤ配列およびラミニン由来のＹＩＧＳＲ配列である。細胞付着部位の取込みは合成マトリックスの特に好ましい実施形態であるが、天然マトリックスの一部に含めることもできる。取込みは、例えば、単純に、システイン含有細胞付着ペプチドをＰＥＧアクリレート、ＰＥＧアクリルアミドまたはＰＥＧビニルスルホンなどのコンジュゲートした不飽和基を含む前駆体分子と、数分間混合し、その後、チオール含有前駆体成分などの求核基を含む残りの前駆体成分と混合することによって行うことができる。細胞付着部位がシステインを含まない場合は、含むように化学合成を行うことができる。この最初の工程中、接着促進ペプチドは、コンジュゲートした不飽和で多重官能化された前駆体の一方の末端内に取り込まれる。残りの複数チオールを系に加えた際、架橋結合したネットワークが形成される。ここでネットワークが製造される方法の別の重要な暗示は、接着シグナルなどのペンダント生物活性リガンドの取込みの効率である。例えば、結合していないリガンド（例えば接着部位）が細胞とマトリックスとの相互作用を阻害する可能性があるので、この工程は定量的でなければならない。そのようなペンダントオリゴペプチドを用いた前駆体の誘導体化は、最初の工程において、複数アームの求電子性前駆体がチオールよりも化学量論的に大過剰であるようにして実施し（最低４０倍）、したがって明確に定量的である。望ましくない阻害の予防の他に、この成果は生物学的にさらに顕著である：細胞の挙動はリガンド密度の小さな変化に非常に敏感であり、取
り込ませるリガンドの正確な知識により、細胞−マトリックスの相互作用の設計および理解が助けられる。要約すると、マトリックス内に共有結合した接着部位の濃度は、細胞の浸潤の速度に顕著な影響を与える。例えば、所定のヒドロゲルについて、ＲＧＤ濃度範囲を、細胞内殖および細胞遊走を最適な様式で支持するマトリックス内に取り込ませることができる。
【０１２７】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、細胞の成長もしくは内殖に適している高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための低濃度薬剤配合物および／または治療配合物であり、前記活性エナメル物質の濃度は配合物１ｍｌあたり５ｍｇ未満であり、前記マトリックスはＲＧＤを含めることによって改変する。例えば、実験セクションの実施例２および４を参照されたい。
【０１２８】
使用方法
本発明は、放出可能に取り込ませたかつ／もしくは内部に封入した活性エナメル物質を有する天然および／または合成マトリックスを用いて、硬組織ならびに軟組織の修復、再生または再構築、特に骨および歯の成長を行うための、活性エナメル物質の低濃度配合物を提供する。マトリックスは生体適合性かつ／または生分解性であり、移植時にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで形成されることができる。活性エナメル物質をマトリックス内に取り込ませるかつ／または封入することができ、これはその完全な生物活性を保持している。さらに、概要を上述した通り、どのようにして、いつ、およびどの程度の活性エナメル物質が放出されるかの制御をもたらす技術を用いて、活性エナメル物質を放出可能に取り込ませることができ、これにより、マトリックスを徐放性ビヒクルとして用いてマトリックスを直接または間接的な組織修復に用いることができる。
【０１２９】
本明細書中に記載の新規低濃度薬剤配合物、化粧配合物および／または治療配合物は、移植前あるいは移植時において、組織の修復、再生、および／もしくは再構築、ならびに／または活性エナメル物質の放出に用いることができる。一部の実施形態では、移植部位においてマトリックスを組織と合わせるために、投与部位で架橋結合を誘導することが望ましい。他の実施形態では、移植前にマトリックスを製造することが好都合である。
【０１３０】
また、移植前もしくは移植時に、またはさらには移植に続いて、ポリマーを架橋結合させてマトリックスを形成するときまたはそれに続いたときのどちらかに、細胞を薬剤配合物および／または治療配合物に加えることもできる。これは、マトリックスを架橋結合させて細胞の増殖もしくは内殖を促進するために設計された間質間隔を生じさせることに加えて、またはそれの代わりであり得る。
【０１３１】
ほとんどの場合は、細胞の成長もしくは増殖を促進するために薬剤配合物および／または治療配合物を導入することが望ましいが、一部の潜在的なシナリオでは、活性エナメル物質を用いて細胞増殖の速度を阻害する。具体的な適用は、手術後に接着の形成を阻害すること、および移植の配置後に線維芽細胞の創傷床内への内殖を阻害することである。
【０１３２】
特定の一態様では、本明細書中に記載の新規かつ改良されたエナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質の低濃度配合物は、治療剤、予防剤および／または化粧剤などの医薬品として用いること、特に、組織の修復、再生および／または再構築において用いること、生きた石灰化組織の部分間の結合を誘導すること、生きた石灰化組織の小片を他の生組織の小片上の結合部位に結合させること、皮膚または粘膜の創傷の治癒を改善すること、感染症もしくは炎症状態を予防または治療すること、象牙質を形成または再生させること、移植片の生着を促進すること、上皮由来の良性、やや悪性または悪性の新生物を治療すること、アポトーシスを誘導すること、あるいは細胞減少手術などの処置および／もしくは外傷後の創腔ならびに／または
組織欠陥を埋めることを意図する。
【０１３３】
第２の態様では、そのような薬剤配合物および／または治療配合物を、骨、軟骨および歯などの石灰化組織を修復するための、軟組織および粘膜などの非石灰化組織を修復するための、炎症および／または感染症に関与する状態を治療するための、象牙質を形成または再生するための、移植片の生着を促進するための、上皮由来の良性、半悪性または悪性の新生物を治療するための、アポトーシスを誘導するための、あるいは細胞減少手術などの処置および／または外傷後の創腔および／または組織欠陥を埋めるための医薬品の製造に用いる。
【０１３４】
歯周部組織の治癒ならびに再生、特に石灰化組織の再成長のために本明細書中に記載の新規かつ改良されたエナメルマトリックス、エナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質の低濃度配合物をブタの歯周部裂開モデルに施用することによって（実験セクションの実施例５参照）、驚くべきことに、再生された骨構造の形態学が、標準的な高濃度配合物（ＰＧＡ中に３０ｍｇ／ｍｌ）中のエナメルマトリックス誘導体を用いた場合に再生された構造と異なることが判明した。したがって、新規配合物は、初めて哺乳動物の身体内において骨成長または骨再成長の誘導などの石灰化組織の誘導新生を可能にすることが、判明した。
【０１３５】
本発明を特定の科学理論に限定することを望まずに、新しく形成される骨構造は、細胞の内殖および／もしくは遊走に適した高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療配合物内で形成されることが想定される。したがって、この新規マトリックスの体積、形状および位置を用いて、対応する骨発生の体積、形状および位置のモデリングを行うことができ、これにより、そのような配合物中の活性エナメル物質の実際の濃度に無関係に、このようなマトリックスの新規かつ複雑な適用が可能となる。当業者は、エナメルマトリックスの前記濃度は、それぞれの具体的な必要性に最も適するように調節することができることを理解するであろう。
【０１３６】
細胞の内殖および／もしくは遊走に適した高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む本発明の活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療配合物の、潜在的な新規の医薬ならびに／あるいは歯科の適用は、例えば、歯根分岐部欠損などの大きなもしくは複雑な歯の欠損の治療、または骨格中もしくは哺乳動物の身体の関節中の損失した骨構造の再成長である。さらに、この配合物を、骨の新生もしくは再成長をｉｎ
ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、または哺乳動物の身体外、および哺乳動物の身体の非末端位置で特定の形状へと誘導することに使用できることも想定されており、そのような新規骨構造は、哺乳動物の身体内への移植に容易に用いることができる。
【０１３７】
本発明の好ましい実施形態では、概要を上述した新規の医療適用に用いる活性エナメル物質の配合物は、ポリエチレングリコールと配合物１ｍｌあたり５ｍｇ未満である濃度の前記活性エナメル物質とを含む。それでもなお、このような新規な医療適用には、もちろん、ポリエチレングリコールまたは細胞の内殖および／もしくは遊走に適した任意の他の高分子マトリックスを含む、活性エナメル物質の配合物の使用も含まれていることができ、活性エナメル物質の濃度は５ｍｇ／ｍｌを超え、例えば、１０、２０もしくは３０ｍｇ／ｍｌを超える、またはさらに高い濃度などである。
【０１３８】
本発明による薬剤配合物および／または治療配合物とＥＭＤＯＧＡＩＮ（登録商標）とを含む、両配合物を同時に施用するためのキット、ならびにそのようなコンビナトリアルキットの医薬品としての使用がさらに想定される。
【０１３９】
本発明の持続放出配合物の利点
高分子マトリックスと活性エナメル物質とを含む本発明の薬剤配合物および／または治療配合物は持続放出配合物として用いることができる。タンパク質／ポリペプチドの生物学的半減期は多くの場合短く、したがって、身体に投与した場合はそれらの生物活性が迅速に失われる。また、一般的な配合物では、本明細書中に記載の持続放出配合物とは対照的に、投与後に最初に放出される大量の物質が原因で最初に物質の活性のバーストがあり、その後、生物活性は経時的に低下する。対照的に、本発明の薬剤配合物および／または治療配合物を用いることによって、放出時間および濃度放出のどちらに関しても活性エナメル物質の放出を制御することができる。また、本発明の薬剤配合物および／または治療配合物を用いることによって、活性エナメル物質の放出は局在化された放出であり、放出は所望の身体部位で制御された様式で起こる。本発明の配合物はまた、均一な量の活性エナメル物質が持続した期間、望ましい場合は数日間および数週間にさえわたって放出されることも可能にする。したがって、創傷治癒方法が改善される。
【０１４０】
活性エナメル物質が放出される期間および時間単位あたりの放出量は、ポリマーの濃度、ポリマーと活性エナメル物質との架橋結合の度合、配合物中の活性エナメル物質の濃度、酵素切断部位および本明細書中の他の箇所に記載したポリマーネットワークの分解速度に影響を与える他の生物活性のある物質の取込みに関して、薬剤配合物ならびに／または治療配合物の組成を変更することによって調節することができる。したがって、それぞれの具体的な適用について所望に応じて放出プロフィールを調節することができる。
【０１４１】
さらに、本明細書中に記載の新規配合物の一部は、例えばＰＧＡゲル中の標準的なエナメルマトリックス誘導体の配合物よりも形状安定性が高く、また、これらが細胞の内殖にも適するように設計されている場合は、これらは初めて、石灰化組織を特定の形状、体積および／または局在化への特異的な再成長の誘導に用いることができる。
【０１４２】
施用方法
一実施形態では、薬剤配合物および／または治療配合物を、身体内のｉｎ ｓｉｔｕもしくは身体上でゲル化させる。別の実施形態では、薬剤配合物および／または治療配合物を身体外で事前に形成し、その後、事前に形成した形状で施用することができる。
【０１４３】
上述のように、マトリックス材料は合成または天然の前駆体成分から作製することができる。用いる前駆体成分の種類に無関係に、成分の重合もしくはゲル化を可能とする条件下における互いの組合せまたは接触を防ぐために、混合物を身体に施用する前に前駆体成分は分離すべきである。投与前の接触を防止するために、組成物を互いから分離するキットを用い得る。重合を可能にする条件下で混合したのち、組成物は、活性エナメル物質が添加された三次元ネットワークを形成する。前駆体成分およびその濃度次第では、ゲル化は混合後ほぼ瞬時に起こることができる。
【０１４４】
一実施形態では、マトリックスはフィブリノーゲンから形成される。フィブリノーゲンは、適切な温度およびｐＨでトロンビンならびにカルシウム源に接触させた場合に、様々な反応カスケードを介したゲル化によりマトリックスを形成する。フィブリノーゲン、トロンビン、およびカルシウム源の３つの成分は別々に保管すべきである。しかし、３つの成分のうち少なくとも１つを分離しておけば、他の２つの成分を投与前に混合してもよい。フィブリノーゲンは、生理的ｐＨ（ｐＨ６.５〜８.０、好ましくはｐＨ７.０〜７.５の範囲）の緩衝溶液中に溶かし（これは安定を増加させるためにさらにアプロチニンを含んでいてよい）、塩化カルシウム緩衝液中のトロンビンの溶液（例えば４０〜５０ｍＭの濃度範囲）とは別に保管することができる。フィブリノーゲンの緩衝溶液は、追加で１５０ｍＭの好ましい濃度のＮａＣｌを含む５０ｍＭの好ましい濃度のヒスチジン緩衝溶液、またはトリス緩衝液生理食塩水（好ましくは３３ｍＭの濃度）であることができる。好まし
い実施形態では、活性エナメル物質、フィブリノーゲン、トロンビン、およびカルシウム源を含むキットを提供する。場合により、キットはＸＩＩＩａ因子などの架橋結合酵素も含み得る。活性エナメル物質は、活性エナメル物質の生物活性ドメイン、架橋結合酵素の基質ドメインおよび基質ドメインと生物活性ドメインとの分解部位を含む融合タンパク質であることができる。融合タンパク質は、フィブリノーゲンまたはトロンビンの溶液のどちらか中に存在し得る。好ましい実施形態では、フィブリノーゲン溶液が融合タンパク質を含む。
【０１４５】
溶液は、混合チャンバおよび／もしくは針ならびに／またはスタティックミキサーによって両方のシリンジの内容物を圧迫することで混合を行う、２方向シリンジ装置によって混合することが好ましい。他の同等に好ましい選択肢は、２つの溶液を容器に入れ、内部でそれらを混合し、例えばシリンジに移し、その後に施用することである。最適には、両方の溶液をシリンジ１内のわずかに酸性の緩衝液に溶かし、その後、塩基（および代わりに粘度調整剤）を含むメスルアーを備えたシリンジに取り付け、シリンジ−シリンジの混合によって混合することができる。
【０１４６】
本発明の好ましい実施形態では、フィブリノーゲンおよびトロンビンはどちらも凍結乾燥した形態で別々に保管する。２つのうちのどちらかが融合タンパク質を含むことができる。使用前にトリスまたはヒスチジン緩衝液をフィブリノーゲンに加え、緩衝液はさらにアプロチニンを含んでいてよい。凍結乾燥したトロンビンを塩化カルシウム溶液に溶かす。次いで、フィブリノーゲンおよびトロンビン溶液を別々の容器／バイアル／シリンジ体に入れ、２方向シリンジなどの２方向連結装置によって混合する。場合により、容器／バイアル／シリンジ体は２分されており、したがって、シリンジ体の壁に垂直な調節可能な隔壁によって分離されている２つのチャンバを有する。一方のチャンバは凍結乾燥した凍結乾燥したフィブリノーゲンまたはトロンビンを含み、他方のチャンバは適切な緩衝溶液を含む。プランジャーを下に押すと、隔壁が移動し、緩衝液をフィブリノーゲンチャンバ内に放出してフィブリノーゲンを溶かす。フィブリノーゲンおよびトロンビンがどちらも溶解したあと、両方の２分したシリンジ体が２方向連結装置に取り付けられており、連結装置に取り付けられた注入針を介して内容物を圧迫することによって混合する。場合により、連結装置は内容物の混合を向上するためにスタティックミキサーを含む。
【０１４７】
別の同等に好ましい実施形態では、混合前にフィブリノーゲンを８倍希釈し、トロンビンを２０倍希釈する。この比により、約１分のゲル化時間がもたらされる。
【０１４８】
さらなる実施形態では、本発明の低濃度配合物中に含まれる高分子マトリックスは、マイケル付加反応を受けることができる合成前駆体成分から形成される。求核性前駆体成分（マルチチオール）は塩基性ｐＨでのみマルチアクセプター成分（コンジュゲートした不飽和基）と反応するので、混合前に別々に保管しなければならない３つの成分は、塩基、求核性成分およびマルチアクセプター成分である。マルチアクセプターおよびマルチチオール成分は、どちらも緩衝液または酸中の溶液として保管することができる。ＰＥＧ−アクリレートは、通常は乾燥保管する。したがって、代替方法では、どちらのＰＥＧも乾燥保管し、使用前に塩基性緩衝液に溶かすか（実施例２に記載のように）、または、ＰＥＧ−チオールを酸性緩衝液中で保管し、使用前にＰＥＧ−アクリレートと混合し、次いで塩基と混合する（実施例３参照）。どちらの組成物も、細胞付着部位およびさらに活性エナメル物質を含むことができる。したがって、この系の第１の組成物は例えば求核性成分の溶液を含むことができ、系の第２の組成物はマルチアクセプター成分の溶液を含むことができる。２つの組成物のどちらかまたは両方が塩基を含むことができる。別の実施形態では、マルチアクセプターおよびマルチチオールを溶液として第１の組成物に含めることができ、第２の組成物が塩基を含むことができる。連結および混合は、フィブリノーゲンについて事前に記載したものと同じ方法で起こる。２分したシリンジ体は、同様に合成前駆
体成分に適している。フィブリノーゲンおよびトロンビンの代わりに、マルチアクセプターおよびマルチチオール成分を粉砕形態で一方のチャンバに保管し、他方のチャンバが塩基性緩衝液を含む。他の同等に好ましい選択肢は、２つの溶液を容器に入れ、内部でそれらを混合し、例えばシリンジに移し、その後に施用することである。最適には、両方のＰＥＧをシリンジ１内のわずかに酸性の緩衝液に溶かし、その後、塩基（および代わりに粘度調整剤）を含むメスルアーを備えたシリンジに取り付け、シリンジ−シリンジの混合によって混合することができる。
【０１４９】
定義
本明細書中で一般的に用いる「生体材料」とは、生物学系と作用を及ぼしあって、身体の任意の組織、器官もしくは機能の評価、処置、増強、または置換を、材料に応じて持続的あるいは一時的に行うことを意図する材料をいう。用語「生体材料」および「マトリックス」は本明細書中では同義で用いられ、マトリックスの性質に応じて、水で膨潤させることができるが水に溶解しない、すなわち、特定の一定期間の間身体内に留まって外傷または欠損した軟組織および／もしくは硬組織の特定の支援機能を満たすヒドロゲルを形成することができる、架橋結合した高分子ネットワークを意味する。
【０１５０】
用語「タンパク質マトリックス」とは、イオン結合、共有結合、もしくはそれらの組合せによるタンパク質前駆体分子と高分子ネットワークとの架橋結合、または１つもしくはそれ以上の高分子材料、すなわちマトリックスを膨潤させて高分子ネットワークを形成することによって形成したマトリックスを意味する。
【０１５１】
「多糖マトリックス」とは、イオン結合、共有結合、もしくはそれらの組合せによる多糖前駆体分子と高分子ネットワークとの架橋結合、または１つもしくはそれ以上の高分子材料、すなわちマトリックスを膨潤させて高分子ネットワークを形成することによって形成したマトリックスを記載するために用いる。
【０１５２】
「合成マトリックス」とは、イオン結合、共有結合、もしくはそれらの組合せによる合成前駆体分子と高分子ネットワークとの架橋結合、または１つもしくはそれ以上の高分子材料、すなわちマトリックスを膨潤させて高分子ネットワークを形成することによって形成したマトリックスを意味する。
【０１５３】
用語「高分子マトリックス」とは、上述のタンパク質、多糖および合成マトリックスのいずれかを含めるために用いる。ポリマー自体は、少なくとも５つの単量体の連合によって形成した大分子である。
【０１５４】
本明細書中で用いる「エナメルマトリックス」とは、任意の関連する天然源、すなわち、歯が発生中の哺乳動物から得ることができる、エナメルの前駆体を意味する。適切な由来源は、例えば子ウシ、ブタまたは子ヒツジなどの屠殺した動物からの発生中の歯である。別の由来源は、例えば魚の皮膚である。本発明の文脈では、用語「活性エナメル物質」とは、その由来源を区別せずにエナメルマトリックス誘導体および／またはエナメルマトリックスタンパク質を包含するために用いる。用語「エナメルマトリックス」、「エナメルマトリックス誘導体」（ＥＭＤ）、「エナメルマトリックスタンパク質」などを上述のポリマーマトリックスと混同してはならない。
【０１５５】
本明細書中で一般的に用いる「強力な求核剤」とは、極性の結合を形成する反応において求電子剤に電子対を提供できる分子をいう。好ましくは、強力な求核剤は生理的ｐＨで水よりも求核性が高い。強力な求核剤の例はチオールおよびアミンである。
【０１５６】
本明細書中で一般的に用いる「コンジュゲートした不飽和結合」とは、炭素−炭素、炭
素−異種原子もしくは異種原子−異種原子の多重結合を単結合に変化させること、または合成ポリマーもしくはタンパク質などの巨大分子に官能基を連結させることをいう。そのような結合は、付加反応を受けることができる。
【０１５７】
本明細書中で一般的に用いる「コンジュゲートした不飽和基」とは、炭素−炭素、炭素−異種原子もしくは異種原子−異種原子の多重結合から単結合への変化を含み、付加反応を受けることができる多重結合を有する、分子または分子の領域をいう。コンジュゲートした不飽和基の例には、それだけには限定されないが、ビニルスルホン、アクリレート、アクリルアミド、キノン、およびビニルピリジニウム、例えば２−または４−ビニルピリジニウムならびにイタコネートが含まれる。
【０１５８】
本明細書中で一般的に用いる「合成前駆体分子」とは、天然に存在しない分子をいう。
本明細書中で一般的に用いる「天然に存在する前駆体成分またはポリマー」とは、天然に見つけることができる分子をいう。
【０１５９】
本明細書中で一般的に用いる「官能化」とは、官能基または部分の付着をもたらす様式の分子の改変をいう。例えば、分子を強力な求核剤またはコンジュゲートした不飽和にする分子を導入することによって、分子を官能化し得る。好ましくは、分子、例えばＰＥＧを官能化して、チオール、アミン、アクリレート、またはキノンにする。特に、ジスルフィド結合を部分的または完全に還元して遊離チオールを作製することによって、タンパク質も有効に官能化し得る。
【０１６０】
本明細書中で一般的に用いる「官能性」とは、分子上の反応性部位の数をいう。
本明細書中で一般的に用いる「分岐点の官能性」とは、分子中の１点から伸びるアームの数をいう。
【０１６１】
本明細書中で一般的に用いる「接着部位または細胞付着部位」とは、分子、例えば細胞表面上の接着促進受容体が結合するペプチド配列をいう。接着部位の例には、それだけには限定されないが、フィブロネクチンからのＲＧＤ配列およびラミニンからのＹＩＧＳＲ配列が含まれる。好ましくは、マトリックスに架橋結合可能な基質ドメインを含めることによって接着部位を生体材料内に取り込ませる。
【０１６２】
本明細書中で一般的に用いる「生物活性」とは、目的タンパク質によって媒介される機能的事象をいう。一部の実施形態では、これには、ポリペプチドと別のポリペプチドとの相互作用を測定することによってアッセイが行われる事象が含まれる。また、これには、目的タンパク質が細胞の成長、分化、死、遊走、接着、他のタンパク質との相互作用、酵素活性、タンパク質リン酸化もしくは脱リン酸化、転写、または翻訳に対して有する効果のアッセイを行うことも含まれる。
【０１６３】
本明細書中で一般的に用いる「再生」とは、硬組織または軟組織、特に骨もしくは歯組織など、何かの一部分あるいは全体を成長させて元に戻すことを意味する。
【０１６４】
本明細書中で一般的に用いる「多官能性」とは、１個の分子（すなわち、単量体、オリゴマーおよびポリマー）あたり複数の求電子性ならびに／または求核性の官能基であることをいう。
【０１６５】
本明細書中で一般的に用いる「自己選択的反応」とは、組成物の第１の前駆体成分が組成物の第２の前駆体成分と、およびその逆も、混合物中または反応部位に存在する他の化合物とよりもはるかに速く反応することを意味する。本明細書中で用いるように、他の生体化合物より、求核剤は優先的に求電子剤に結合し、求電子剤は優先的に強力な求核剤に
結合する。
【０１６６】
本明細書中で一般的に用いる「架橋結合」とは、共有結合の形成を意味する。しかし、イオン結合、または共有結合および非共有結合の組合せなどの、非共有結合の形成を言う場合もある。
【０１６７】
「ゲル」とは、水溶液の連続的な相によって有限に膨潤させた、架橋結合したポリマーネットワークの材料である。
【０１６８】
本明細書中で一般的に用いる「高分子ネットワーク」とは、単量体、オリゴマーまたはポリマーの実質的にすべてがその利用可能な官能基を介した分子間共有結合によって結合して１つの巨大な分子をもたらす方法の生成物を意味する。
【０１６９】
本明細書中で一般的に用いる「生理的」とは、生きた脊椎動物中で見つけることができる通りの条件を意味する。特に、生理的条件とは、温度、ｐＨなどの人体中の条件をいう。生理的温度とは、特に３５℃〜４２℃、好ましくは約３７℃の温度範囲を意味する。
【０１７０】
本明細書中で一般的に用いる「架橋結合密度」とは、それぞれの分子の２つの架橋結合間の平均分子量（Ｍc）をいう。
【０１７１】
本明細書中で一般的に用いる「当量」とは、物質１ｇあたりの官能基のｍｍｏｌをいう。
【０１７２】
本明細書中で一般的に用いる「膨潤」とは、生体材料による水の取込みによる、体積および質量の増加をいう。用語「水の取込み」および「膨潤」は、本出願を通して同義で用いられている。
【０１７３】
本明細書中で一般的に用いる「平衡状態」とは、水または緩衝液中の一定条件下で保管した場合に、ヒドロゲルが質量の増加も低下も受けない状態をいう。
【０１７４】
本発明の文脈では、用語「細胞閉塞性」とは、前記マトリックスによって形成された区画から細胞を閉鎖または遮断することができ、細胞が本質的に前記区画内または外へ横断することができないようにする、高分子マトリックスの特徴を説明するために用いる。例えばこの障壁様の機能は、事実上膜としての形状を有し、前記区画への入出を遮断することを意図する細胞よりも小さな孔径を有する高分子マトリックスによって、容易にすることができる。当然のことながら、孔の正確な寸法は遮断する細胞の大きさに依存する。
【０１７５】
〔実施例１〕
実験セクション
サルにおける歯支持組織の再生
本研究の目的は、ビヒクルのアルギン酸プロピレングリコールと混合した様々な濃度のエナメルマトリックス誘導体の、歯支持組織の再生に対する効果を評価すること、およびその生物学的安全性を評価することであった。本発明で用いたエナメルマトリックス誘導体は、標準のエナメルマトリックス調節物の低分子量タンパク質画分からなっていた。
【０１７６】
材料および方法
試験物質：エナメルマトリックス誘導体、バッチＰＥＵ８０１。
由来源；エナメルマトリックスをブタの歯胚から単離し、ホモジナイズし、低分子量タンパク質画分を抽出した。
ビヒクル；アルギン酸プロピレングリコール溶液２.５％ｗ／ｖ、バッチＰＧＡ８０３。
試験物質およびビヒクルの保管；試験物質およびビヒクルは−１８℃で保管した。物質およびビヒクルを含む瓶は、使用前に室温と平衡化させた。
【０１７７】
試験製剤の投与；層流フード下で無菌的に物質をビヒクルに溶かし、サルに個別に用いた。試験物質の最終濃度を実験前に決定し、再構成した溶液１ｍｌあたりのタンパク質のｍｇとして表した（表４）。
【０１７８】
動物：３〜４歳の７匹のサル（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））をＰｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、スウェーデンＳｏｌｎａから購入し、動物は実験を通して収容した。それぞれの動物に個別の同定コードを与えた。動物は制御された環境下で個別のケージ内に入れておいた：
温度：１８〜２２℃
相対湿度：４０〜７０％
光：午前６時〜午後６時
動物には標準のサル用食餌（Ｒ３、Ｅｗｏｓ ＡＢ、スウェーデンＳｏｄｅｒｔａｅｌｊｅ）および水道水を無制限に与えた。食餌には毎日新鮮な果実を補足した。
【０１７９】
実験の設計：それぞれのサルの歯を試験または対照群に割り当てた。改変ウィドマン技術に従った歯周部手術を行った。皮弁を再配置および縫合する前に、試験製剤を試験歯の根表面に施用した。対照歯には擬似手術を行ったが、任意の試験製剤は与えなかった。工程毎の様式の手順は以下の通りである。
【０１８０】
１．手術の３０分前、試験物質を含むバイアルを製造した。２本の歯のそれぞれの群について、１つの試験物質のバイアルを用いた。試験物質が溶解するために２０分間を許容した。溶液を３ｍｌのシリンジでとり、プランジャーまで沈ませた。プランジャーを押すことによってシリンジから空気を丁寧に取り除いた。
２．ペントバルビタールナトリウムを用いて動物に麻酔を行い、手術用に選択した領域に局所麻酔を行って消毒した。歯の口および顔側の全層皮弁（粘膜骨膜弁）を持ち上げた。
３．大きな円形バー（ｂｕｒｒ）を用いて、滅菌生理食塩水で常に洗浄しながら頬側骨板を取り除いた。この領域を滅菌生理食塩水で十分にすすぎ、暴露した歯根を３０秒間、３７％のオルトリン酸またはクエン酸（ｐＨ１）でエッチングした。最後に滅菌生理食塩水ですすいだ。過剰の液体はスワブで拭き取った。
４．試験製剤をすぐに施用し、骨欠損の最も先端部分から開始して暴露した根表面全体を被覆した。
５．皮弁を再配置し、縫合した。歯周部の包帯剤は用いなかった。
６．対照および実験歯の周辺の局所的な臨床的所見ならびにサルの一般的な挙動を毎日記録した。
【０１８１】
最終研究；５６日（８週間）後、過量のペントバルビタールナトリウムによってサルを屠殺し、対照歯および試験歯を組織学的に評価した。
【０１８２】
組織学的標本：実験および対照歯ならびに周辺の歯槽骨および軟組織を解剖して取り出し、光学顕微鏡の検査に用いた。標本を１０％の冷緩衝ホルマリン中で４８時間固定し、５％のギ酸中で脱石灰化し、パラフィン中に包埋し、歯の長軸に平行に、頬−舌の方向に切片を作製した。２０μｍ間隔のレベルで連続切片を作製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。その後、これらを透過した通常光および偏光中で検査した。
【０１８３】
評価：暴露した根表面上の組織反応を記録し、新しい歯槽骨および新しいセメント質で
被覆された、暴露した根表面の割合で示した距離を測定した（図１参照）。
【０１８４】
統計的方法：非パラメトリック統計的方法、すなわちウィルコクソンの順位和検定およびマン−ホイットニーＵ試験を用いて、試験および対照部位間の差異の有意性を評価した。有意性のレベルは以下のように示す：
１．ＮＳ 有意ではない
２．* ｐ＜０.０５
３．** ｐ＜０.０１
４．*** ｐ＜０.００１
【０１８５】
データおよび標本の保管；この研究のすべての生データ、標本、プロトコルおよび最終報告書は、ＢＩＯＲＡ ＡＢ、Ｋｒｏｋｕｓｖａｅｇｅｎ １２、１８１ ３１ Ｌｉｄｉｎｇｏｅ、スウェーデンのアーカイブに保管されている。
関連参考文献：ＢＩＯＲＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔ ９／８８。
【０１８６】
結果
臨床観察：すべての動物は試験期間の間中健康を保っており、注目すべき有害な副作用はなかった。試験歯および対照歯のどちらの治癒も平穏であった。
一般的な挙動：すべての動物が通常通りの挙動であり、個々の動物間で明らかな差異はなかった。
食物消費：食物および水の消費は通常通りに見受けられ、個々の動物間で明らかな差異はなかった。
【０１８７】
最終研究：
巨視的検査：全体の外見から、すべての試験歯の周辺の歯肉が健康であったことが明らかとなり、明らかな歯肉炎症はなかった。注目すべき有害な副作用もなかった。すべての対照歯の頬側歯肉が、歯肉縁部がもたれかかった中等度の炎症を示した。
顕微鏡検査；顕微鏡検査および形態計測検査により、試験歯および対照歯の群の間で有意な差異が明らかとなった（表４および５）。
装着した根表面にしっかりと付着した新しいセメント質は、試験歯中で様々な度合まで形成されていた。偏光顕微鏡観察に明らかになったように、セメント質層は、歯周部膜に関連する機能的に方向づけられた歯周部線維を含んでいた。さらに、歯周部膜に付着した歯槽骨は、暴露された実験根表面上に様々な度合で存在していた（表４および５）。接合部上皮は新しく形成されたセメント質層よりも遠くまで増殖しておらず、歯肉炎症は事実上存在していなかった。
対照歯では、新しい歯槽骨も任意の有意な新しいセメント質も、どちらも形成されていなかった。最初に暴露した根表面は、根の約半分まで退縮した長い接合部上皮によって被覆されていた。中等度の歯肉炎症が頬側口腔粘膜中に存在していた。
統計的解析；試験歯および対照歯の群の間の差異は、様々なレベルで有意であることが判明した（表４および５）。
【０１８８】
考察
本研究の目的は、ビヒクルのアルギン酸プロピレングリコールと混合した様々な濃度のエナメルマトリックス誘導体の、歯支持組織の再生に対する効果を評価すること、およびその生物学的安全性を評価することであった。本研究で用いたモデルは、エナメルマトリックス誘導体の臨床的使用を意図した臨床設定とほぼ同一である。試験製剤を、手術の補助剤として、従来の歯周部手術中に投与した。投与した用量は、体重に基づいて、ヒトでの使用を意図する用量である同等の大きさの単一の施用中にタンパク質７.５ｍｇより、
低いものも高いものもあった。擬似手術が対照として用いられた。
【０１８９】
歯支持組織（セメント質、歯周部膜および歯槽骨）は、通常は周辺歯周病の治療後に再生しない。その代わりに、暴露した根表面は、根の機能的な付着を提供しない上皮細胞の層によって被覆される。したがって、歯周病によって損失した歯支持組織は従来の方法で再生することができない。これは、対照歯について記録された結果によって確認された。しかし、５.３、１０.７および２６.７ｍｇのタンパク質／ｍｌの試験製剤で整えた根表
面では、明らかに新しい歯周部付着器官が発生していた。歯根表面の形成に関する最近の研究により、これが、セメント質だけでなく、エナメル様組織の薄い層でも被覆されていることが示された。このエナメル様組織は、セメント質の形成の前に、根の発生中に形成される。これは、セメント質を形成する細胞が成長することができる適切な表面を提供していると考えられる。したがって、セメント質がエナメル様組織上に堆積され、適切な付着器官が発生する。
【０１９０】
本研究は、削り取った（装着した）根表面を、１０ｍｇを超えるエナメルマトリックス誘導体の用量で条件づける（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）ことによって、正常な接着セメント質および関連する歯周部膜（機能的歯根膜）が形成されることを示した。さらに、歯周部膜に関連する歯槽骨が形成されていた。これらの構造は、通常は従来の歯周部手術後に形成されない。そのようではなくて、歯肉からの上皮が暴露した根表面を被覆し、周辺骨レベルは、最良でも同じに保たれる。このことは、本研究の発見に基づいた成功した歯周部再生の新規定義の必要性を強調している。
【０１９１】
成功した歯周部再生は、装着した根表面にしっかりと付着した新しいセメント質の形成を含まなければならない。セメント質層は、歯周部膜に関連する機能的に方向づけられた歯周部線維を含まなければならない。さらに、新しく形成された歯周部膜に付着した歯槽骨が存在しなければならない。
【０１９２】
また、新しい付着および関連する歯槽骨の回復が、再配置された口内軟組織によって被覆された根表面レベルにのみ起こることも、明らかである。根表面が冠状方向により高く被覆されていればいる程、周辺骨のより高い増加が可能である。さらに、結果から、ＰＧＡ中に溶解したエナメルマトリックス誘導体の濃度、すなわち５ｍｇのタンパク質／ｍｌ未満は、歯周部再生の成功の誘導には不十分であることを結論づけることができる。しかし、この濃度を超えれば、根表面の十分な被覆が可能であると考えられる。
【０１９３】
【表４】
【０１９４】
表５
対照群と実験群との統計的比較
試験群
試験部位の数：２０
【０１９５】
【表５】
【０１９６】
【表６】
【０１９７】
対照群
対照部位の数：８
周辺骨の平均増加：０.０％
セメント質の平均増加：１.１％
【０１９８】
統計的有意性試験
非パラメトリック統計的方法、マン−ホイットニーＵ試験を用いて、試験および対照部位間の差異の有意性を評価した。セメント質および周辺骨の両方の回復に関して、試験群と対照群とを比較した場合の有意性のレベルは以下であることが判明した。
【表７】
【０１９９】
〔実施例２〕
ラットの危険な大きさの頭蓋欠損
ラット頭蓋手術
この動物実験プロトコルは、スイス連邦法に従って（Ｎｒ．１５２／１９９７号）、チューリッヒ州の獣医学当局によって評価および許可されている。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙシロネズミを用いた（８４〜９２日齢、すべて雌）。これらは、４匹以下の動物の群で収容し、標準の食餌を維持した。
【０２００】
Ｈａｌｏｔｈａｎ／Ｏ2を導入および維持することによって２７匹の動物に麻酔した。
手術領域をクリップで挟み、Ｂｅｔａｄｉｎｅで無菌的手術の準備を行った。経鼻骨から正中矢状稜までの直線状の切開を行った。軟組織を反転し、骨膜を部位から解剖した（後頭骨、前頭骨、および頭頂骨）。硬膜の穿孔を注意深く回避しながら、歯科用ハンドピース中でトレフィンを用いて８ｍｍの開頭術欠損を作製した。その後、手術領域に生理食塩水を流して骨細片を除去し、事前に形成したゲルを欠損内に配置した。その後、スキンステープラーで軟組織を閉じた。手術後、ブプレノルフィン（０.１ｍｇ／ｋｇ）の皮下注
射によって鎮痛を提供した。その後、移植後の適切な時期にラットをＣＯ2窒息によって
屠殺した。５ｍｍの連続的な骨を有する開頭術部位を頭蓋骨から回収し、４０％のエタノールに入れるか、または固定培地に入れた（４％のパラホルムアルデヒド）。
すべての工程において、手術者は欠損の治療に関して盲検であった。
【０２０１】
ゲルの製造
ＥＭＤを０.１０％の酢酸に溶かし、最終ゲルの所望するＥＭＤ含有量に応じて様々な
濃度のストック溶液を得た。システイン−ＲＧＤ、ＰＥＧ−ジチオール３.４ｋ、および
４本のアームのＰＥＧ−アクリレート１５ｋを、０.３０Ｍのトリエタノールアミン／Ｈ
Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８.５に溶かした。すべての溶液を混合して、等モル数のアクリル基お
よびチオール基、システイン−ＲＧＤ８μｇおよび０〜２５０μｇのＥＭＤを有する約１５質量％のＰＥＧを含む２０μｌの溶液を得ることによって、ＰＥＧ−ＥＭＤゲルを注型した。溶液を１時間３７℃でゲル化させ、その後、ゲルをＰＢＳ、ｐＨ７.４に移した。
数時間後、これらは１００μｌの体積および８ｍｍの直径まで膨潤していた。
【０２０２】
Ｘ線撮影
屠殺および周囲５ｍｍの連続的な骨を有する欠損部位の除去後に得られた標本を、歯科用Ｘ線撮影ユニットを用いて、超高速歯科用フィルムで画像撮影した（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国ＮＹ）。その後、Ｘ線像のスキャニングを行い、デジタル画像を画像解析プログラムで処理した（Ｌｅｉｃａ（登録商標）Ｑ−Ｗｉｎ）。欠損の内部および外部に形成された新しい骨の面積を、異なる配合物の治癒速度と比較した最初の欠損面積の割合として計算した（図２参照）。
【０２０３】
〔実施例３〕
ブタにおける歯支持組織の再生
目的：
擬似対照歯と比較して、顎における治癒および再生方法に対するエナメルマトリックス誘導体および／または移植材料、ＰＥＧゲルを用いた治療の局所効果を臨床的、定量的ならびに組織学的に比較するために、裂開モデルを用いることである。
動物：
ミニブタＳｕｓ ｓｃｒｏｆａの成体（＞１８カ月）、雌。手術前に動物を環境馴化させ、地域の動物施設内で観察した。
【０２０４】
実験の説明：
１．動物を麻酔下で維持する（筋肉内のＫｅｔａｌａｒ＋静脈内のＰｅｎｔｏｔａｌおよびＤｏｒｍｉｃｕｍ）。キシロカイン−アドレナリンを用いた局所麻酔（歯科用）。
２．動物を検査した。
３．必要な場合、ブタの口の周りを剪毛し、その後、皮膚をクロルヘキシジン（登録商標）で洗浄した（６０％のＥｔＯＨ中５ｍｇ／ｍｌ）。手術領域を写真撮影した。
４．Ｑ１から開始する：浸潤麻酔を頬粘膜ひだに施用した。歯間乳頭および周辺歯肉領域への注入は避けるべきである。
５．炎症の度合を評価し、歯垢および歯石を除去した。
６．第１小臼歯から第１臼歯まで、末端を垂直な解放切開として周辺切開を行った。歯槽骨を暴露するために粘膜骨膜弁を持ち上げた。
７．バーおよび手動装置を用いて、それぞれの歯根から頬側骨を注意深く取り除き、深さ約６ｍｍおよび幅２ｍｍの裂開欠損を作製した。滅菌生理食塩水で常に洗浄しながら、第２小臼歯から第４小臼歯まで、ＣＥＪから６ｍｍの距離まで、暴露した根表面から歯根膜およびセメント質を除去した。欠損の先端部（ＡＥＤ）を、切痕で印つけた。それぞれの四半部について合計で６つの欠損を作製した（すなわちそれぞれの顎／動物で１２個）。
８．靱帯およびセメント質を取り除いたあと、歯の表面をＰｒｅｆＧｅｌ（登録商標）（ＢＩＯＲＡ、スウェーデン）で２分間処理し、その後、十分な量の滅菌生理食塩水で洗浄した。
９．ＣＥＪからＡＥＤの距離を測定し、記録し、そして写真撮影によって文書化した。
１０．試験材料（治療リスト参照、擬似＝無し）を欠損に施用し、写真撮影によって文書化した。
１１．皮弁をすぐに再配置し、ｖｉｃｒｙｌ縫合糸で閉じた。皮弁は骨欠損を完全に被覆し、皮弁は徹底的に再配置および修復されており、これを再度写真撮影によって文書化した。
１２．第４〜１４項に従って、手順をＱ２用に繰り返した。
【０２０５】
治療後：
動物には手術後１週間、軟い食餌を与えた。抗生物質（ストレプトシリン（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｉｌｌｉｎ）、５ミリ単位／日）を手術から２日間投与した。鎮痛剤（ボルタレン、手術後に２５ｍｇ）。
【０２０６】
観察：
４、６および８週間目に、動物を鎮静させ、実験的欠損の治癒を検査した。標準のポケットプローブ（ヒトの臨床）を用いて欠損の深さの調査を行い、それぞれの欠損について「ポケットプローブでの深度」をミリメートルで、歯肉退縮の程度（存在する場合）と一緒に記録した。治癒を写真撮影によって文書化した。すべての有害事象を記録した。
【０２０７】
終止：
実験を終わらせ、８週間の観察ののちに動物を屠殺した：
１．２９０ｇ／１０００ｍｌの強アルコール中の４０ｍｌのペントバルビタールナトリウム１００ｍｇ／ｍｌを、食間に、試験スキームに従って手術後８週間、動物に与えた。
２．完全な根を有する実験歯のみが含まれる区域をそれぞれの実験顎から切り出した。
３．分離された区域は、すぐに大量の（２００ｍｌ）新しく製造した、冷蔵した（４℃）リン酸緩衝ホルマリン、ｐＨ７.４に浸した。容器には、動物番号、四半部番号、手術
者および日付を注意して標識しなければならない。良好な固定を保証するために、ホルマリンを４時間に１回交換した。
４．試料は、可能な限り速くエポキシ中への包埋および粉砕による切片形成のために処理する。処理が可能となるまでは、ホルマリンで固定した試料は冷蔵庫で保管した。
【０２０８】
キットの製造
すべての材料は無菌的条件下で取り扱った。
【０２０９】
ＰＥＧ−チオール／ＥＭＤ溶液：
４本アームのＰＥＧ−チオール２ｋ（Ｎｅｋｔａｒ）１.２０ｇを滅菌した０.０５％酢酸水溶液２０ｍｌに溶かした。この溶液を濾過によって滅菌した。滅菌ＥＭＤ０.５２０
ｇを滅菌した０.０５％酢酸水溶液１０ｍｌに溶かした。両方の溶液を合わせ、滅菌した
ガラス製シリンジをそれぞれＰＥＧ−チオール／ＥＭＤ溶液３００μｌで満たした。（シリンジ１個あたり４本アームのＰＥＧ−チオール２ｋ１２ｍｇおよびＥＭＤ５.２ｍｇ）
【０２１０】
活性化剤の溶液：
トリエタノールアミン１.８６５ｇ（Ｍｅｒｃｋ、ＰｈＥｕｒ）をＷＦＩ２５０ｍｌに
溶かし（０.０５０Ｍ）、ＨＣｌを用いて溶液のｐＨをｐＨ８.６に調節した。
【０２１１】
強い攪拌の下で、Ｋｅｌｔｏｎｅ ＨＶＣＲ（ＩＳＰ）５.０ｇをトリエタノールアミ
ン／ＨＣｌ溶液９５ｍｌに溶かした。生じた溶液を、メスルアーを備えたプラスチック製シリンジに満たした（６７８ｍｇ）。強い攪拌下で、Ｃｅｋｏｌ １０'０００（Ｎｏｖ
ｉａｎｔ；Ｓ１４０８）３.０ｇをトリエタノールアミン／ＨＣｌ溶液８０ｍｌに溶かし
た。生じた溶液を、メスルアーを備えたプラスチック製シリンジに満たした（６７８ｍｇ）。活性化剤のシリンジを個別にピール・バッグ内に入れ、蒸気滅菌した（１２１℃／１５分間）。
【０２１２】
ＰＥＧ−アクリレートのバイアル：
４本アームのＰＥＧ−アクリレート１５ｋ（Ｎｅｋｔａｒ）３.６ｇをＷＦＩ３５ｍｌ
に溶かした。クリーンルーム内で、この溶液の０.７０ｍｌのアリコートをバイアルに満
たし、凍結乾燥した。凍結乾燥後、バイアルに窒素を満たして閉じた。（バイアル１個あたり４本アームのＰＥＧ−アクリレート１５ｋ７２ｍｇ）
【０２１３】
ＰＥＧ／ＥＭＤゲルの製造（ゲル１ｇあたり４.９ｍｇのＥＭＤ）：
施用の直前に、凍結乾燥したＰＥＧ−アクリレートをＰＥＧ−チオール／ＥＭＤ溶液で再構成し、生じた溶液をガラス製シリンジに移して戻し、その後、これを活性化剤のシリンジと連結した。プランジャーを約１５回往復移動させることによって両シリンジの内容物を混合した。混合後、生成物を約２分間、完全にゲル化する前に施用することができる。
【０２１４】
【表８】
【０２１５】
すべての欠損は、試験物質を施用する前にＰｒｅｆＧｅｌ（登録商標）を用いて１分間で処理し、次いで生理食塩水で十分にすすいだ。
【０２１６】
用いた物質のリスト：
ＰｒｅｆＧｅｌ ロット１００８
Ｅｍｄｏｇａｉｎ ３０ｍｇ／ｍｌ ロットＥＴＰ３１０２
ＰＧＡ ロットＦｏＵ ２１１３、１.５ｍｌのバイアル中
ＥＭＤ９.５ｍｇ／バイアル ロット９１０２
骨セラミック ロットＬＫ ０４０１０９
【０２１７】
結果
表７から明らかに見られるように、ＧＬＰ４１／４７中の４.９ｍｇ／ｍｌの濃度の活
性エナメル物質誘導体（ＥＭＤ）は、実験的欠損の治癒に対して、３０ｍｇ／ｍｌのＥｍｄｏｇａｉｎと同等の、またはさらにはより明白な効果を有していた。結果を図３に要約した。また、図３で推論できるように、空、ＥｍｄｏｇａｉｎおよびＫｅｌｔｏｎｅまたはＣｅｌｃｏゲルのどちらか中の４.９ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＭＤを比較すると、４週間
後に、ＥｍｄｏｇａｉｎはＫｅｌｔｏｎｅまたはＣｅｌｃｏのゲルのどちらか中の４.９
ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＭＤよりも幾分か良好な性能を示したが、６週間後にはこれらは概ね同等の性能を示し、８週間後には、ＫｅｌｔｏｎｅまたはＣｅｌｃｏゲルのどちらか中の４.９ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＭＤの方がより良好な性能を示した。これは、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでのこの種のゲルについて判明した（３７℃、ｐＨ７.４）、４週間の分解時間に
非常によく対応していた。ＰＥＧゲルが存在している限りは、それが一定の度合まで、骨の欠損の充填を妨害することが予測された。
【０２１８】
【表９】
【０２１９】
〔実施例４〕
ウサギ頭蓋円柱状ドリル欠損
この実験の結果は、誘導骨再生に対する新しい生物活性骨の代用品の効果に関する情報を提供するものである。
【０２２０】
仮説：
活性エナメル物質と最適化された細胞内殖能力を有する新しく発生したマトリックスとを結合させることの効果は、標準の移植手順（正の対照）および自発性治癒（負の対照）と比較して骨組織の再生が増強したことである。
【０２２１】
材料および方法：
動物
２４匹の体重３〜４ｋのニュージーランドホワイトウサギの成体を本研究で用いた。動物は目的に合うように設計した実験動物用の部屋に保ち、標準の実験用の食餌を与えた。
【０２２２】
外科的処置および材料：
直線状の切開を２４匹のニュージーランドホワイトウサギの前頭部（頭蓋冠）に施し、２つの皮膚弁を持ち上げ、外側に折り返した。同様に、骨膜を切断して折り返し、頭蓋骨の最上部を暴露した。右および左の頭頂骨ならびに前頭骨の領域に、１ｍｍのドリルの深さしか許容しないスリーブを備えたトレフィンドリルを用いて、円形の溝を製造した。この円形内の外部皮質板が絶対に除去されないように注意を払った。チャンバ中の骨髄により良好に接近できるように、５つの小さな円形ドリル欠損を最上部皮質板の円形内に作製した。次いで、一次安定性のために、深さ１ｍｍの糸模様の切痕を有するチタンからなる円柱状の管を溝のそれぞれに配置した。４本の管が、その内部に機械加工の表面を示した。管の測定値は、高さ６ｍｍおよび外径６ｍｍであった。
【０２２３】
材料の分布は、それぞれの個別の研究に依存していた。しかし、それぞれの研究において、管のうち１本が陰性対照として役割を果たし、空のままにした。残りの３本の材料には、試験材料、および適切な場合は陽性対照も含まれる。陽性対照を用いた場合は、標準の移植材料を用いた。１つの選択肢は、標準のヒト移植手順において現在用いられているウシ由来骨ミネラル塩を使用することである（Ｂｉｏ−Ｏｓｓ（登録商標）、Ｇｅｉｓｔ
ｌｉｃｈ ＡＧ、スイスＷｏｌｈｕｓｅｎ）。それぞれの動物において前側および後側にあるシリンダーの数が同じであり、左側および右側にある数が同じであるように、それぞれの動物において材料をシリンダー間で分配した。最後に、全身効果を制御するために、一連の投薬を行った場合は、異なる用量の活性因子を有するどの材料も２つを同一動物中に与えることはせず、一部の対照試料を活性エナメル物質の治療を受けたことのない動物に意図的に与えた。前側および後側の同一の材料が組となるように、個々の動物においてそれぞれの試料を対にした。
【０２２４】
管は、骨側は開いたままとしたが、被覆する皮膚−骨皮弁の側はチタンの蓋で閉じた。骨膜および皮膚弁を適合させて縫合した。４、８および１６週間後、８匹の動物を屠殺した。それぞれの治療のそれぞれの時点における試料の数は８つであった。
【０２２５】
マトリックスおよび成長因子
基本的に、２つの異なるマトリックスをこの治験で用いた。ヒトフィブリノーゲンに由来するフィブリンマトリックスおよび合成系のＰＥＧゲルは、どちらも高い細胞内殖能力を有するように特異的に改変した。ゲルは、特異的活性エナメル物質を含んでおり、活性エナメル物質がその送達マトリックスと相互作用（共有結合）して、移植後に特異的な放出プロフィールを達成した。あるいは、ゲルを合成リン酸カルシウム顆粒と混合した。用いた顆粒は、ヒトの手術において、移植手順でパテ様の再構築材料を達成するために幅広く使用されている多孔性のリン酸三カルシウム／ヒドロキシアパタイトの混合物からなっていた（比４０：６０）。
【０２２６】
ＥＭＤは２つの濃度および２種類のゲルとして製造した：
ＰＥＧ＋１００μｇ／ｍｌのＥＭＤおよびＰＥＧ＋５００μｇ／ｍｌのＥＭＤデータおよびＰＥＧ／ＲＧＤ＋５００μｇ／ｍｌのＥＭＤ
【０２２７】
組織学的標本および組織形態計測
脱石灰化しない粉砕した切片の標準の手順に従って標本を加工した。標準の組織形態計測技術を適用して管内および管壁に沿った骨密度を定量的に評価した。
【０２２８】
統計学
ボンフェローニ調整ずみ一元配置分散分析試験を用いて、試験および対照の差異、ならびに試験または対照に関する経時的差異を検出した。すべての統計的検定における有意性レベルはα＝０.０５を選択した。
【０２２９】
結果
図４および５は、ＰＥＧ／ＲＧＤ＋５００μｇ／ｍｌのＥＭＤが骨の再成長に対して最良の効果を有することを明確に実証している。したがって、活性エナメル物質と最適化された細胞内殖能力を有する新しく発生したマトリックスとを結合させることにより、骨組織の再生が増強される。
【０２３０】
〔実施例５〕
ミニブタの歯周部裂開モデル
１．導入および理論的根拠
本調査では、２つの新規担体（アルギン酸またはカルボキシメチルセルロースを有するＰＥＧ）を用いて製造したエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）を試験した。ミニブタ裂開モデルは、歯周部組織の治癒および再生方法に関してエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）を用いた治療の局所効果の臨床的、定量的ならびに組織学的な比較において、歴史上の記述である。
【０２３１】
３．目的
追及すべき主な目的は、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）および２つの新規担体（アルギン酸またはカルボキシメチルセルロースを有するＰＥＧ）を用いて製造したエナメルマトリックス誘導体（ＥＭＤ）の、歯周部再生の比較評価からなっていた。
【０２３２】
４．調査した変数
４．１．一次変数
・一次変数は、歯周部のポケットプローブでの深度の減少の臨床評価からなっていた。
【０２３３】
４．２．二次変数
・骨欠損の深さの減少、セメントの高さ、歯根膜の存在、骨面積の評価に基づいた記述的組織学および組織形態計測が、二次変数の第１の群を形成していた。
【０２３４】
石灰化組織の定量的評価に関して言えば、ミクロＸ線での骨の測定値により、石灰化組織のみが切片上に表示されるので、組織形態計測手法の品質を大いに改善された。このことが、本研究において組織学的切片から得られたミクロＸ線の組織形態計測を実施した理由である。
【０２３５】
・炎症のグレード（なし、緩和、中等度、重篤）、退縮の長さおよび幅（セメント質−エナメルの接合部から歯肉の最上部までをｍｍで測定した）は、二次変数の第２の群に属していた。
【０２３６】
５．材料および方法
５．１．動物
ミニブタＳｕｓ ｓｃｒｏｆａの成体（＞１８カ月）、雌。手術前に動物を環境馴化させ、地域の動物施設内で観察した。
【０２３７】
５．２．手術および手術後
５．２．１．手術
動物を全身麻酔下で維持した（筋肉内のＫｅｔａｌａｒ＋静脈内のＤｏｒｍｉｃｕｍ）。さらに、キシロカイン−アドレナリンを用いた局所麻酔を局所的に行った。
【０２３８】
この手順の様々な工程は、以下の通りであった。
−動物の検査および記録用紙の１ページ目に記録した。
−ブタの口の周りを剪毛し、その後、皮膚をクロルヘキシジン（登録商標）で洗浄した（６０％のＥｔＯＨ中５ｍｇ／ｍｌ）。
−Ｑ１から開始：頬粘膜ひだの浸潤麻酔は、歯間乳頭および周辺歯肉領域への注入を回避することによって行った。
炎症の度合を評価し、歯垢および歯石を除去した。
−第１小臼歯から第１臼歯まで、末端を垂直な解放切開として周辺切開を行ったあと、上顎の歯槽骨を暴露するために粘膜骨膜弁を持ち上げた。
−バーおよび手動装置の助けによって、滅菌生理食塩水で常に洗浄しながら、頬側骨板ならびに歯根膜およびセメント質の「窓」を、第２小臼歯から第４小臼歯まで取り除いた。それぞれの歯の根の主軸中に、ＣＥＪから５〜６ｍｍの距離まで垂直方向の欠損を作製した。欠損の先端部（ＡＥＤ）を、切痕で印つけた。
欠損の平均最終寸法は、高さ＝６ｍｍ、幅＝２ｍｍ、深さ＝３ｍｍであった。
−靱帯およびセメント質を取り除いたあと、歯の表面をＰｒｅｆＧｅｌで２分間処理し、その後、十分な量の滅菌生理食塩水で洗浄した。
−ＣＥＪからＡＥＤの距離を測定して記録した。
−試験材料（擬似＝無し）を欠損内に施用した。
−皮弁を再配置したあと、手術部位をｖｉｃｒｙｌ縫合糸で閉じた。皮弁が骨欠損を完全に被覆し、それが徹底的に再配置および修復されていることを確実にするために特に注意を払った。
−同じ手順を第２の四半部について繰り返した。
図６は典型的な手術創傷を示す。
【０２３９】
５．２．２．手術後
動物には手術後１週間、軟食を与えた。抗生物質（ストレプトシリン、５ミリ単位／日）を手術から２日間投与し、鎮痛剤（ボルタレン、２５ｍｇ）を手術後に投与した。
５．３．試験および対照の群
合計１０匹の動物をこの研究に含めたが、１匹は試験材料の１つの移植とは関連しない理由により死亡した。
それぞれの上顎骨歯に２つの欠損を製造し、それぞれの動物で６本の歯を用いたので、それぞれの動物における欠損の合計数は１２であった。
【０２４０】
より関連する群では（以下参照）、それぞれの治療の種類について合計４８個の欠損を評価した。
【０２４１】
以下の群を調査した。
５．３．１．試験群
ＰＥＧ−Ｅｃ＝ＰＥＧ（ＣＭＣを有する）＋ＥＭＤ（４.９ｍｇ／ｍｌの濃度）：４匹
の動物
ＰＥＧ−Ｅｋ＝ＰＥＧ（Ａｌｇを有する）＋ＥＭＤ（４.９ｍｇ／ｍｌの濃度）：３匹
の動物
５．３．２．正の対照群
Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）（市販、ＥＭＤの濃度は３０ｍｇ／ｍｌ）：１匹の動物５．３．３．負の対照群
【０２４２】
【表１０】
【０２４３】
５．４．治癒時間
Ｓｔｒａｕｍａｎｎ−Ｂｉｏｒａ（Ｍａｌｍｏ）で入手可能な以前のデータによると、臨床的状態を評価し、４、６および８週間後に歯周部の測定を行うことは予測されていた。さらに、組織学的な評価（定性的および定量的）を８週間の治癒期間後に実施した。
５．５．終止
２９０ｇ／１０００ｍｌの強アルコール中の４０ｍｌのペントバルビタールナトリウム
１００ｍｇ／ｍｌの注入を、食間に、試験スキームに従って手術後８週間、動物に与えた。
完全な根を有する実験歯のみが含まれる区域を、実験のそれぞれの上顎から切り出した。
５．６．分析方法
５．６．１．歯周部のプロービング
プローブを用いて行った歯周部のプロービングは、手術の日ならびに４、６および８週間後にポケットの深度を評価することを意図していた。これらの測定は、「盲験方法」の標準的な規則に従って行った。検査官は、検査中の動物がどの群に属していたかを知らなかった。
５．６．２．組織学
分離された区域は、すぐに大量の（２００ｍｌ）新しく製造した、冷蔵した（４℃）リン酸緩衝ホルマリン、ｐＨ７.４に浸した。良好な固定を保証するために、ホルマリンを
４時間に１回交換した。
試料をエポキシ中への包埋および粉砕による切片形成（約２５μｍの厚さ）用に加工した。
試料は、標準的な非脱石灰化製造方法、次いでメチルメタクリレートへの包埋、切片形成（Ｐｏｌｙｃｕｔ−Ｓ、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびトルイジンブルーを用いた染色によって加工した。
組織学切片は、移植した部位内の歯根膜の存在を定義することを意図した定性的および半定量的分析に用いた。
５．６．３．マイクロラジオグラフィー
骨の高さおよび面積を評価するために最終粉砕を試みて（厚さ５０μｍ）光学顕微鏡観察下で定量的に分析する前に、Ｘ線発生器を用いて組織学的切片のミクロＸ線撮影を行った。
【０２４４】
６．結果
６．１．臨床的歯周部プロービングおよび退縮の測定
ポケットの深度の測定に関連する結果のみをここに要約する。
６．１．１．臨床的な歯周部プロービング
これらの臨床的測定により、それぞれの治療がそれ自体で、ポケットの深度の減少に関して有益であることが実証された。これは、それぞれの群内で、手術日から第８週目まで、第６週および第４週にわたって、進行性のポケットの深度の減少を存在する。それぞれの群内で、これらの異なる時点間において、差異は統計的に有意である。唯一の例外は、Ｅｍｄｏｇａｉｎ群の第４週から第８週の定常期の存在である。
一部の例では、差異は、１つの群と別の群との対応する時点を比較する場合にも統計的に有意である。
【０２４５】
【表１１】
【０２４６】
６．２．組織学（定性的および半定量的分析）
定性的には、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）群は、よく器質化された歯根膜によって新しいセメントから分離された成熟骨および層状骨の再生を示した。
一般に、ＰＥＧ−ＥｋおよびＰＥＧ−Ｅｃの群により、手術中２ＰＥＧマトリックスが位置づけられていた位置を保持していると考えられた成熟していない、かつ密な血管新生化した新しい骨の存在が実証された（図７および８参照）。
ＰＥＧ−Ｅｃ（ＣＭＣ）の場合、歯根膜の存在が、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）群中に見つかるものと同等であることが観察された（図９および１０参照）。
【０２４７】
疑わしい例は、以下の表に含めなかった。
【表１２】
歯根膜の存在の評価に関する疑わしい例の量：
擬似＝５ ＰＥＧ−Ｅｋ＝９
Ｅｍｄｏｇａｉｎ＝４ ＰＥＧ−Ｅｃ＝１０
【０２４８】
６．３．ミクロＸ線（定量分析）
骨の高さ
すべての群が、少なくとも２ｍｍの有意な骨の増加を経験した。Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）が最も高い性能に達し（約４ｍｍ）、統計的有意性は２つのＥｍｄｏｇａｉｎＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ２群に匹敵する（ｐ＜０.００５）。
擬似群は、性能がＥｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）よりも低かったが、ＰＥＧ−Ｅｃまた
はＰＥＧ−Ｅｋ群よりも高かった。図１１も参照されたい。
骨の面積
４つの群において、その４つの条件に統計的な差異なしに相当量の骨が再生された（約３ｍｍ２）。
【０２４９】
【表１３】
【０２５０】
７．考察
骨の高さに関して、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）の性能は既存かつ既に公開された文献の結果の通りであった。偽群はｓＥｍｄｏｇａｉｎＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ２よりも良好な結果を示した。
ＰＥＧ−Ｅｃは、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）と同等であるが、約２ｍｍと概算を推定することしかできない長さの歯根膜の存在を示した。
再生された骨構造の形態学は、ＰＥＧ−ＥｃまたはＰＥＧ−Ｅｋの２つで異なっていたが（例えば図１２参照）、ＰＥＧ−ＥｃおよびＰＥＧ−Ｅｋの使用により、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）によって再生された量と同様の骨量の形成がもたらされたと考えられた。この新しく形成された骨の再生は、ＥＭＤを添加した２つのＰＥＧマトリックス内で実際起こったという仮説が立てられている。その場合、移植日のこれらのマトリックスの体積および位置が対応する骨再生の体積ならびに高さに作用することができる。
【０２５１】
〔実施例６〕
歯周部再生用の新規活性エナメル誘導体配合物（ＰＥＧ−ＥＭＤ）の評価。犬におけるクラス３歯根分岐部欠損の実験的研究。
１．技術水準および理論的根拠
本研究は、以下のことが報告されているパイロット研究に続くことを意図する（「Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ２の評価：ミニブタの歯周部裂開モデルのパイロット研究」）。
「再生された骨構造の形態学は、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ２およびＥｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）の２種類で異なっていたが、ＰＥＧ−ＥｃおよびＰＥＧ−Ｅｋ（どちらもＰＥＧ−ＥＭＤと呼ばれる）の使用により、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）によって再生された量と同様の骨量の形成がもたらされたと考えられた。
この新しく形成された骨の再生は、ＥＭＤを添加した２つのＰＥＧマトリックス内で実際起こったという仮説が立てられている。その場合、移植日のこれらのマトリックスの体積および位置が対応する骨再生の体積および高さに作用することができる」。
【０２５２】
２．仮説
ＰＥＧ−ＥＭＤは、歯根分岐部（クラス３Ｈａｍｐ）欠損の治療において施用した場合
に、Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）の使用によって得られた歯周部再生に劣らない歯周部再生（骨、靱帯）を誘導する。
【０２５３】
３．目的
３．１．主要目的
本研究の主な目的は、犬モデルにおいて、クラス３歯根分岐部欠損の治療に用いた場合、ＰＥＧ−ＥＭＤがＥｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）よりも定量的により高い骨再生を誘導することを実証することであろう。
３．２．補助目的
第２の目的としては、ＰＥＧ−ＥＭＤを施用したあとの歯根膜の再生は、上述のモデルにおいてＥｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）を用いることによって得られたものに劣らないことを示すことであろう。
【０２５４】
４．変数
４．１．一次変数
ベースラインと終点との間に、および比較的試験対照（ＰＥＧ−ＥＭＤ）群と正の対照（Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標））群との間に積み上げられた、新しい骨の高さの差異。４．２．二次変数
歯根分岐部の周辺の少なくとも１つの根上の表面を裏打ちする歯根膜の存在。
４．３．三次変数
一緒にすると骨、歯根膜、セメント質および軟組織の構造の完全な説明を与える定性的データ。
【０２５５】
５．動物モデルおよび管理
５．１．動物モデル
ハウンドドッグ、年齢約１６カ月、体重約２５ｋｇ
Ｐ１ならびにＭ１、Ｐ２およびＰ３の抜歯はそのままである。
３カ月後：Ｐ２およびＰ３に高さ５ｍｍの歯根分岐部欠損を作製（Ｋｏｏ他、２００４）。（典型的な手術の設定には図１３を参照されたい。図では、それぞれの矢印は５ｍｍに対応している。）
５．２．動物の管理
動物の小屋、外科的処置および経過観察は、以下の実験手術施設でのＧＬＰ規則に従って実施する：
ＢｉｏｍａｔｅｃｈＮＡＭＳＡ、Ｃｈａｓｓｅ ｓｕｒ Ｒｈｏｎｅ（Ｌｙｏｎ）、フランス。
【０２５６】
６．予測される結果および能力の計算
文献では、ベースラインにおけるクラス３歯根分岐内の欠損の平均の高さは４.７ｍｍ
（＋／−０.２）であることを報告している。４週間後の自発性治癒が、１.８ｍｍ（＋／−０.３）の骨の高さの増加をもたらすことが予測される。（Ｋｏｏ他、２００４）→負
の対照群：ブランクおよびＰＥＧ
同様の結果が対照群（Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標））から、４週間後に予想される。２カ月後および４カ月後、増加は限定されたままであるはずであった、約１.５ｍｍ（＋
／−０.５）
試験群（ＰＥＧ−ＥＭＤ）は、４週間後に２.０ｍｍ（＋／−０.５）、２カ月後に２.
５ｍｍ（＋／−０.５）および４カ月後に３.０ｍｍ（＋／−１.０）の骨増加を示すはず
である。
【０２５７】
７．材料および方法
７．１．材料
７．１．１．試験材料
ＰＥＧ−ＥＭＤ：
７２ｍｇの凍結乾燥した４本アームのＰＥＧ−アクリレート１５ｋを含むバイアル
１２ｍｇの４本アームのＰＥＧ−チオール２ｋの３００μｌ溶液および０.０５ｗｔ％
の酢酸水溶液中の５.２ｍｇのＥＭＤを含むシリンジ。
６８０±１０ｍｇの０.０５Ｍの水性トリエタノールアミン／ＨＣｌを含むシリンジ、
Ｃｅｋｏｌ １０'０００を３.６質量％含むｐＨ８.５±０.１
ＰＥＧ中のＥＭＤの最終濃度：４.９ｍｇ／ｍｌ
７．１．２．正の対照
Ｅｍｄｏｇａｉｎ（登録商標）
ＰＧＡ中のＥＭＤの濃度：３０ｍｇ／ｍｌ
７．１．３．負の対照
空
ＰＥＧ
７．１．４．補助材料
補助材料なし
７．２．方法
７．２．１．研究設計およびスケジュール
ｔ０：
Ｐ１およびＭ１の抜歯
ｔ３カ月：歯槽隆起の粉砕、Ｐ２およびＰ３でクラス３歯根分岐部欠損の作製
ｔ４カ月：１カ月の観察時間後に屠殺
ｔ５カ月：２カ月の観察時間後に屠殺
ｔ７カ月：４カ月の観察時間後に屠殺
７．２．２．手術前段階
歯の抜歯、
治癒時間：３カ月
７．２．３．手術段階
動物１匹あたりそれぞれの下顎側面に２つのクラス３歯根分岐部欠損の作製。
歯根分岐部欠損を試験または対照材料で充填。
縫合は重要である
７．２．４．手術後段階
１４日間の治癒後に縫合糸を除去。
手術の６週間後に、手術後のプラー久コントロールを行う。
７．２．５．観察および分析
ミクロで計算した断層撮影、組織学および組織形態計測
８．終点および最終手順
動物を手術の１、２および４カ月後に屠殺する。
【０２５８】
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49. WO 02/080994
50. Zucker and Katz, (1991). Exper. Biol. Med.: 693-702
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性エナメル物質の濃度が配合物１ｍｌあたり約５ｍｇ以下である、高分子マトリックスと該活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２】
活性エナメル物質の濃度が２５０μｇ／ｍｌ未満である、請求項１に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項３】
活性エナメル物質の濃度が１００μｇ／ｍｌ未満である、請求項２に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項４】
活性エナメル物質の濃度が５０μｇ／ｍｌ未満、例えば、最大で２５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、または１μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項５】
活性エナメル物質の濃度が１μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項６】
活性エナメル物質の濃度が１０μｇ／ｍｌ〜２５０μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項７】
活性エナメル物質の濃度が１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項８】
高分子マトリックスと共有結合または非共有結合によって該マトリックスに連結された活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項９】
高分子マトリックスが、強力な求核剤とコンジュゲートした不飽和結合、またはコンジュゲートした不飽和基との求核付加反応によって形成される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１０】
マトリックスが細胞の内殖または遊走に適している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１１】
マトリックスが細胞閉塞性である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１２】
マトリックスを事前に形成する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１３】
マトリックスをｉｎ ｓｉｔｕで形成する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１４】
活性エナメル物質がアメロゲニンである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１５】
活性エナメル物質が少なくともアメロゲニンの断片を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１６】
活性エナメル物質が、少なくとも１つのシステイン残基とマトリックスの成分のうち少なくとも１つのコンジュゲートした不飽和基との求核付加反応によって該マトリックスに連結している、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１７】
少なくとも１つのシステイン残基が活性エナメル物質のＣ末端中に位置する、請求項１６に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１８】
少なくとも１つのシステイン残基が活性エナメル物質のＮ末端に位置する、請求項１６に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１９】
活性エナメル物質が化学修飾されている、請求項１６〜１８のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２０】
システインがリンカー配列によって活性エナメル物質に付着している、請求項１６〜１８のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２１】
リンカー配列が酵素分解可能なアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２２】
リンカーがタンパク質分解させる配列を含む、請求項２０に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２３】
配列がプラスミン分解可能配列である、請求項２０に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２４】
リンカー配列が非特異的な加水分解によって分解可能な配列をさらに含む、請求項２０〜２３のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２５】
配列がエステル結合を含む、請求項２４に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２６】
リンカーが多糖分解の基質を含む、請求項２０〜２５のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２７】
トランスグルタミナーゼ基質ドメインを介して活性エナメル物質を高分子マトリックス内に取り込ませる、請求項１〜１５のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２８】
トランスグルタミナーゼドメインがＸＩＩＩａ因子基質ドメインである、請求項２７に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２９】
少なくとも１つのヘパリンおよび／またはヘパリン結合断片を含めることによって高分子マトリックスを改変する、請求項１〜１５のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項３０】
活性エナメル物質が少なくとも１つのヘパリン結合断片を介して高分子マトリックスに共有結合または非共有結合している、請求項２９に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項３１】
高分子マトリックスがポリエチレングリコールを含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項３２】
高分子マトリックスがフィブリンを含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項３３】
医薬品として用いる、請求項１〜３２のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項３４】
骨、軟骨および歯などの石灰化組織を修復するための医薬品を製造するための、請求項１〜３２のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物の使用。
【請求項３５】
軟組織および粘膜などの非石灰化組織の組織修復を行うための医薬品を製造するための、請求項１〜３２のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物の使用。
【請求項３６】
炎症を伴う状態を治療するための医薬品を製造するための、請求項１〜３２のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物の使用。
【請求項３７】
感染症を伴う状態を治療するための医薬品を製造するための、請求項１〜３２のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物の使用。
【請求項３８】
３０ｍｇのエナメルマトリックスタンパク質および１ｍｌのアルギン酸プロピレングリコールを含み、主なタンパク質ピーク２０、１４および５ｋＤａの重量比がそれぞれ約８０／８／１２である薬剤組成物および／または治療用組成物をさらに含む、請求項１〜３３のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物を含む薬剤組成物および／または治療用組成物。
【請求項１】
活性エナメル物質の濃度が配合物１ｍｌあたり約５ｍｇ以下である、高分子マトリックスと該活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２】
活性エナメル物質の濃度が２５０μｇ／ｍｌ未満である、請求項１に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項３】
活性エナメル物質の濃度が１００μｇ／ｍｌ未満である、請求項２に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項４】
活性エナメル物質の濃度が５０μｇ／ｍｌ未満、例えば、最大で２５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、または１μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項５】
活性エナメル物質の濃度が１μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項６】
活性エナメル物質の濃度が１０μｇ／ｍｌ〜２５０μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項７】
活性エナメル物質の濃度が１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項８】
高分子マトリックスと共有結合または非共有結合によって該マトリックスに連結された活性エナメル物質とを含む、活性エナメル物質を投与するための薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項９】
高分子マトリックスが、強力な求核剤とコンジュゲートした不飽和結合、またはコンジュゲートした不飽和基との求核付加反応によって形成される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１０】
マトリックスが細胞の内殖または遊走に適している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１１】
マトリックスが細胞閉塞性である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１２】
マトリックスを事前に形成する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１３】
マトリックスをｉｎ ｓｉｔｕで形成する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１４】
活性エナメル物質がアメロゲニンである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１５】
活性エナメル物質が少なくともアメロゲニンの断片を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１６】
活性エナメル物質が、少なくとも１つのシステイン残基とマトリックスの成分のうち少なくとも１つのコンジュゲートした不飽和基との求核付加反応によって該マトリックスに連結している、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１７】
少なくとも１つのシステイン残基が活性エナメル物質のＣ末端中に位置する、請求項１６に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１８】
少なくとも１つのシステイン残基が活性エナメル物質のＮ末端に位置する、請求項１６に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項１９】
活性エナメル物質が化学修飾されている、請求項１６〜１８のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２０】
システインがリンカー配列によって活性エナメル物質に付着している、請求項１６〜１８のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２１】
リンカー配列が酵素分解可能なアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２２】
リンカーがタンパク質分解させる配列を含む、請求項２０に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２３】
配列がプラスミン分解可能配列である、請求項２０に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２４】
リンカー配列が非特異的な加水分解によって分解可能な配列をさらに含む、請求項２０〜２３のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２５】
配列がエステル結合を含む、請求項２４に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２６】
リンカーが多糖分解の基質を含む、請求項２０〜２５のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２７】
トランスグルタミナーゼ基質ドメインを介して活性エナメル物質を高分子マトリックス内に取り込ませる、請求項１〜１５のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２８】
トランスグルタミナーゼドメインがＸＩＩＩａ因子基質ドメインである、請求項２７に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項２９】
少なくとも１つのヘパリンおよび／またはヘパリン結合断片を含めることによって高分子マトリックスを改変する、請求項１〜１５のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項３０】
活性エナメル物質が少なくとも１つのヘパリン結合断片を介して高分子マトリックスに共有結合または非共有結合している、請求項２９に記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項３１】
高分子マトリックスがポリエチレングリコールを含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項３２】
高分子マトリックスがフィブリンを含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項３３】
医薬品として用いる、請求項１〜３２のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物。
【請求項３４】
骨、軟骨および歯などの石灰化組織を修復するための医薬品を製造するための、請求項１〜３２のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物の使用。
【請求項３５】
軟組織および粘膜などの非石灰化組織の組織修復を行うための医薬品を製造するための、請求項１〜３２のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物の使用。
【請求項３６】
炎症を伴う状態を治療するための医薬品を製造するための、請求項１〜３２のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物の使用。
【請求項３７】
感染症を伴う状態を治療するための医薬品を製造するための、請求項１〜３２のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物の使用。
【請求項３８】
３０ｍｇのエナメルマトリックスタンパク質および１ｍｌのアルギン酸プロピレングリコールを含み、主なタンパク質ピーク２０、１４および５ｋＤａの重量比がそれぞれ約８０／８／１２である薬剤組成物および／または治療用組成物をさらに含む、請求項１〜３３のいずれかに記載の薬剤配合物および／または治療用配合物を含む薬剤組成物および／または治療用組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１１−２１９４９２（Ｐ２０１１−２１９４９２Ａ）
【公開日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５０５８１（Ｐ２０１１−１５０５８１）
【出願日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【分割の表示】特願２００７−５４５０２１（Ｐ２００７−５４５０２１）の分割
【原出願日】平成１７年１２月１２日（２００５．１２．１２）
【出願人】（５０５１０４８３６）シュトラウマン・ホールディング・アクチェンゲゼルシャフト (18)
【氏名又は名称原語表記】ＳＴＲＡＵＭＡＮＮ ＨＯＬＤＩＮＧ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【分割の表示】特願２００７−５４５０２１（Ｐ２００７−５４５０２１）の分割
【原出願日】平成１７年１２月１２日（２００５．１２．１２）
【出願人】（５０５１０４８３６）シュトラウマン・ホールディング・アクチェンゲゼルシャフト (18)
【氏名又は名称原語表記】ＳＴＲＡＵＭＡＮＮ ＨＯＬＤＩＮＧ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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