新規な乳酸菌、それを用いた乳酸発酵物及び乳酸発酵物含有飲食品
【課題】優れた胃酸耐性及び胆汁酸耐性を有し、かつ、コレステロール除去能、胆汁酸吸着能及びインターロイキン１２産生誘導能における優れた特性を併せ持つ新規な乳酸菌、及び、この乳酸菌を用いて得られ、摂食することによりコレステロール除去、胆汁酸吸着及びインターロイキン１２産生促進効果が得られる乳酸発酵物及び乳酸発酵物含有飲食品を提供する。
【解決手段】本発明で規定する方法により測定した場合に、胃酸耐性が９０％以上、胆汁酸耐性が９０％以上、コレステロール除去能が８５％以上、胆汁酸吸着能が４０％以上、及びインターロイキン１２産生誘導能が８０％以上であることを特徴とする、ラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌。豆乳に前記乳酸菌を添加し、発酵させることにより得られる乳酸発酵物及び乳酸発酵物含有飲食品。
【解決手段】本発明で規定する方法により測定した場合に、胃酸耐性が９０％以上、胆汁酸耐性が９０％以上、コレステロール除去能が８５％以上、胆汁酸吸着能が４０％以上、及びインターロイキン１２産生誘導能が８０％以上であることを特徴とする、ラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌。豆乳に前記乳酸菌を添加し、発酵させることにより得られる乳酸発酵物及び乳酸発酵物含有飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵食品を取得源とする新規な乳酸菌、それを用いた乳酸発酵物及び乳酸発酵物含有飲食品に関する。より詳細には、優れた、胃酸耐性、胆汁酸耐性、コレステロール除去能、胆汁酸吸着能及びインターロイキン１２（以下、ＩＬ−１２と称する）産生誘導能を有する新規な乳酸菌、その乳酸菌を用いて得られる乳酸発酵物及び乳酸発酵物含有飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、腸内細菌叢を良好な状態に保つことに寄与し、また、免疫賦活等の生理活性効果も有していることが知られており、乳酸菌を用いて乳を発酵させて得られる乳酸発酵食品は、健康志向の飲食品として広く食されている。
【０００３】
従来、漬物等の植物発酵食品を取得源とする乳酸菌の一種ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）を用いて豆乳発酵物を製造する方法が知られている。この乳酸菌は、製品に適度な酸味を与え、製品の酸味・甘味のバランスを好適に保つことができるという利点を有する。例えば、風味・食感にすぐれたヨーグルト様豆乳発酵食品を製造するための乳酸菌スターターとして、ラクトバチルス・プランタラム及びその他４種類の乳酸菌（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・バイオバラエティ・ディアセチラクティス、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイ）を混合使用する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
また、ラクトバチルス・プランタラムＨＯＫＫＡＩＤＯ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６４５）が、豆乳を良好に発酵し、ヒト腸管由来培養細胞への付着能に優れ、また、同細胞への大腸菌Ｏ−１５７の付着を抑制することが知られている（例えば、特許文献２参照）。
【０００５】
あるいは、ラクトバチルス・プランタラムＯＮＣ１４１株を用いて製造した発酵乳が、ヒトにおける胃腸内細菌叢を改善し（例えば、非特許文献１参照）、便秘傾向を有するヒトの排便回数を増加させ（例えば、非特許文献２参照）、また病原性サルモネラ菌（Salmonella typhimurium）の経口感染に対し宿主の抵抗性を増強すること（例えば、非特許文献３参照）が知られている。
【０００６】
また、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９１７菌体がＩＬ−１２産生促進作用（産生誘導能）を有することが知られている（例えば、特許文献３参照）。
【０００７】
一方、ビフィズス菌や乳酸菌などの有用微生物を含む食品を摂取した場合に、これら有用微生物が消化管下部、特に大腸まで生きた状態で到達するためには、強い殺菌作用をもつ胃酸および胆汁を通過する必要があり、この課題に対し、各種の方法が提案されている。例えば、胃酸からの保護に関しては、有用生菌を腸溶性のカプセル内に封入する方法（例えば、特許文献４参照）や、有用生菌粉末を油脂によりコーティングする方法（例えば、特許文献５参照）等が知られている。胆汁からの保護に関しては、大腸で腸内細菌により分解されるキトサンの内層皮膜と、酸性で溶解せず中性で溶解する胃酸耐性素材による外層皮膜からなる構造体内に有用生菌を封入する方法（例えば、特許文献６参照）等が知られている。
【０００８】
しかし、ラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌であって、胃酸や胆汁から菌体を保護するための特別の処理工程を必要としない、優れた胃酸耐性及び胆汁酸耐性を有し、かつ、コレステロール除去能、胆汁酸吸着能及びＩＬ−１２産生誘導能における優れた特性を併せ持つ菌株は、これまでに知られていない。
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−２１８３９０号公報
【特許文献２】特許第３９２５５０２号公報
【特許文献３】特開平１０−１３９６７４号公報
【特許文献４】特開平１１−３０２１５８号公報
【特許文献５】特公平５−６８４４６号公報
【特許文献６】特開平１０−３２４６４２号公報
【非特許文献１】久米村恵、戸羽正道、曽川芳郎、清水精一、川口信三、「腸内細菌学雑誌」、１５，１５（２００１）
【非特許文献２】戸羽正道、久米村恵、宗行哲、曽川芳郎、吉澤久雄、矢島洋一、松田豊、飯島肇、「腸内細菌学雑誌」、１５，２１（２００１）
【非特許文献３】池永武、山平聡子、名知英樹、戸羽正道、岡松洋、Ｍｉｌｋ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．１，ｐｐ．２７−３２（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ラクトバチルス・プランタラムに属し、優れた胃酸耐性及び胆汁酸耐性を有し、かつ、コレステロール除去能、胆汁酸吸着能及びＩＬ−１２産生誘導能における優れた特性を併せ持つ新規な乳酸菌、及び、この乳酸菌を用いて得られ、摂食することによりコレステロール除去、胆汁酸吸着及びＩＬ−１２産生誘導効果が得られる乳酸発酵物及び乳酸発酵物含有飲食品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、ラクトバチルス・プランタラムＹ７株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３４９株）が、上記５つの優れた能力を同時に有する乳酸菌であることを知り、この知見に基づいて本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は以下に示す新規な乳酸菌、その乳酸菌を用いて得られる乳酸発酵食品及びその製造法である。
（１）胃酸耐性が９０％以上、胆汁酸耐性が９０％以上、コレステロール除去能が８５％以上、胆汁酸吸着能が４０％以上、及びＩＬ−１２産生誘導能が８０％以上であることを特徴とする、ラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌。
（２）乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラムＦＥＲＭ Ｐ−２１３４９株である、上記（１）に記載の乳酸菌。
（３）豆乳に上記（１）〜（２）に記載の乳酸菌を添加し、発酵させて得られる乳酸発酵物。
（４）上記（３）記載の乳酸発酵物を含有する乳酸発酵物含有飲食品。
（５）豆乳に上記（１）〜（２）に記載の乳酸菌を添加し、発酵させることを特徴とする、乳酸発酵物の製造方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の乳酸菌の特性を規定するための方法に関し、順に説明する。
＜胃酸耐性＞
本発明で規定する胃酸耐性は、具体的には以下の方法により測定することができる。無調整豆乳（紀文フードケミファ社製）及び５０％（ｗ／ｖ）スクロースを９：１となるように混合して得られる豆乳培地３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養（無攪拌、無通気、静置）する。得られた培養物３ｍｌを、人工胃液基礎培地（０．５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳、０．１２％（ｗ／ｖ）スクロース溶液を９５℃３０分加熱殺菌後、終濃度０．４％（ｗ／ｖ）となるようにペプシン（和光純薬社製、１：１００００、ブタ胃粘膜由来）を添加し、塩酸にてｐＨを２．５に調整して作製）２７ｍｌに添加し、３７℃で３時間インキュベートする。培養開始前及び培養後の被検菌数を測定し、培養開始前の被検菌数に対する培養後の被検菌数の割合（％）を算出する。
【００１４】
＜胆汁酸耐性＞
本発明で規定する胆汁酸耐性とは、具体的には以下の方法により測定することができる。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養する。得られた培養液３００μｌを、３０ｍｌのＭＲＳ培地、及び３０ｍｌの０．３％（ｗ／ｖ）胆汁酸（オキソイド社製）含有ＭＲＳ培地にそれぞれ添加する。３７℃で２４時間培養後、６２０ｎｍにおける吸光度を測定し、胆汁酸非含有ＭＲＳ培地の吸光度に対する、０．３％胆汁酸含有ＭＲＳ培地の吸光度の割合（％）を算出する。
【００１５】
＜コレステロール除去能＞
本発明で規定するコレステロール除去能は、具体的には以下の方法により測定することができる。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養する。得られた培養液３００μｌを、コレステロール培地（３５０ｍｇ／Ｌ コレステロール（和光純薬社製）、０．２％胆汁酸（ｗ／ｖ）を含むＭＲＳ培地）３０ｍｌに添加する。３７℃で２４時間インキュベートした後、４℃、８，０００ｒｐｍにて１０分遠心分離を行い、上清中のコレステロール濃度をデタミナーＦＣ（協和メデックス社製）を用いて測定する。初発のコレステロール培地中に含有されるコレステロール量に対する、培地から除去されたコレステロール量の割合（％）を算出する。
【００１６】
＜胆汁酸吸着能＞
本発明で規定する胆汁酸吸着能は、具体的には以下の方法により測定することができる。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養する。得られた培養液３００μｌを、３０ｍｌの０．３％（ｗ／ｖ）胆汁酸含有ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）に添加する。そして、３７℃で２４時間インキュベート後、４℃、８，０００ｒｐｍにて１０分遠心分離を行い、上清中の胆汁酸濃度をＴＢＡ測定キット（カイノス社製）により測定する。初発の培地中に含有されていた胆汁酸量に対する、培地から除去された胆汁酸量の割合（％）を算出する。
【００１７】
＜ＩＬ−１２産生誘導能＞
本発明で規定するＩＬ−１２産生誘導能は、具体的には以下の方法により測定することができる。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で４８時間培養する。コントロールとして使用するテトラジェノコッカス・ハロフィラス（Tetragenococcus halophilus）Th221株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１０）は、１０％食塩を含有するＭＲＳ培地中で、３０℃、７２時間培養する。各培養液を１０分間煮沸して殺菌後、波長６００ｎｍにおける吸光度が０．１２５、０．０６２、０．０３１、０．０１６になるようにＲＰＭＩ完全培地を用いて希釈し、測定に用いる。ＲＰＭＩ完全培地の組成は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に非働化（５６℃、３０分）したＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１０％添加したものである。なお、Tetragenococcus halophilus Th221株は、菌体または菌体成分を有効成分とするＩＬ−１２誘導能を有することが知られている菌株の１つである（特開２００６−２８０４７号公報参照）。
【００１８】
腹腔滲出マクロファージは、以下のように調製する。チオグリコレート（ＢＤ社製）２ｍｌを腹腔内に投与し、刺激したマウス（８週齢ＢＡＬＢ／ｃ、雄、チャールスリバー）から、投与３日後に無菌的に腹腔滲出マクロファージを採取する。腹腔滲出マクロファージ細胞浮遊液の細胞数を測定した後、ＲＰＭＩ完全培地を用いて細胞数を２×１０６／ｍｌの濃度に調製する。この調製済み腹腔滲出マクロファージ細胞液を９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌ播種する。ここに、予め吸光度を測定して調製した殺菌菌体（１０分間煮沸による加熱殺菌菌体）を添加し、５％炭酸ガス培養器内で３７℃、１日間培養後、培養後の培養上清のＩＬ−１２をエンザイムイムノアッセイで測定する。
【００１９】
エンザイムイムノアッセイは、ラット抗マウスＩＬ−１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を０．２Ｍ、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液を用いて２μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え、室温で一晩放置しラット抗ＩＬ−１２抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行う。このプレートに１穴当たり１００μｌの培養上清を加え、室温で９０分間放置し、培養上清のマウスＩＬ−１２をプレートに付着したラット抗マウスＩＬ−１２抗体と結合させる。洗浄後、ラットビオチン化抗マウスＩＬ−１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を加え、プレートに結合させたマウスＩＬ−１２に結合させる。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ 社製）を加え、ビオチンと結合させる。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ 社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定し、リコンビナントマウスＩＬ−１２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）で作成した標識曲線から、培養上清中のＩＬ−１２の濃度を求める。コントロール菌が産生させるＩＬ−１２量に対する、被検菌が産生させるインターロイキン１２量の割合（％）を算出する。
【００２０】
本発明では、本発明で規定する上述の方法により測定した場合に、胃酸耐性が９０％以上、胆汁酸耐性が９０％以上、コレステロール除去能が８５％以上、胆汁酸吸着能が４０％以上、及びＩＬ−１２産生誘導能が８０％以上の能力を有する乳酸菌を用いることを特徴とする。
【００２１】
このような乳酸菌として、上記５つの能力を併せ持つラクトバチルス・プランタラムに属する微生物が挙げられる。具体的な株としては、例えばラクトバチルス・プランタラムＹ７株が挙げられる。ラクトバチルス・プランタラムＹ７株は、本発明者らが植物発酵物から分離同定したものである。この乳酸菌は豆乳中で増殖し、その結果得られる乳酸発酵物及び乳酸発酵物含有飲食品を摂食することにより、コレステロール除去、胆汁酸吸着及びＩＬ−１２産生誘導効果を得ることができ、並びに、特別な保護手段を必要とせずとも、胃酸や胆汁により死滅しにくく、生きて腸まで届きやすいという多面的な効果を有している。
【００２２】
なお、このラクトバチルス・プランタラムＹ７株（Lactobacillus plantarum Y7、以降Ｙ７株）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３４９として２００７年８月２７日付けで寄託されている。
【００２３】
Ｙ７株の菌学的性質を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
（乳酸発酵物の製造）
本発明の乳酸発酵物を製造するには、豆乳に上記乳酸菌を添加し、発酵すればよい。本発明で使用可能な豆乳としては、通常の豆乳製造法により得られた豆乳（無調整豆乳、調製豆乳、豆乳飲料）及び、加工大豆粉末を温水等に混和し、ホモゲナイズ処理等により乳化して得られる大豆乳が挙げられる。
【００２６】
豆乳の発酵は公知の任意の方法を用いて行うことができ、例えば、上記乳酸菌を前培養して得られるスターターを上記豆乳に０．０１〜１０容量％添加し、２５〜４５℃で、４〜３０時間培養することにより得ることができる。このようにして得られた乳酸発酵食品は、ヨーグルト様の硬さと食感を有しており、しかも前述したように優れた、胃酸耐性、胆汁酸耐性、コレステロール除去能、胆汁酸吸着能及びＩＬ−１２産生誘導能を有する。
【００２７】
（乳酸発酵物含有飲食品の製造）
上記のように得られた本発明の乳酸発酵物は、各種飲食品の原料とすることができる。飲食品は特に限定されないが、例えば、ヨーグルト、ババロア、ゼリー、シャーベット、アイスクリーム、乳酸飲料、清涼飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）、スープ類、ソース類、マヨネーズ、ドレッシング等の各種調味料、蕎麦、うどん、中華麺、即席麺等の麺類、グミ等の半固形状食品、ペースト状食品、ガム、サプリメント等の固形状食品等が挙げられる。
【００２８】
原料として配合する本発明の乳酸発酵物の割合は任意であるが、例えば、飲食品中に、本発明の乳酸菌を所定の個数以上含有するように配合することができる。所定の個数は、その飲食品において目的とする効果を効果的に達成できる個数であることが好ましく、その効果が達成できるのであれば、各飲食品中に存在するＹ７株は、生菌であってもよく、又は死菌であってもよい。
【００２９】
本発明の乳酸発酵物を各種飲食品の原料として利用する場合には、公知の各種その他の原料、糖類、香料、乳化剤及び保存料の一種又は二種以上を適宜含んで製造することができる。本発明の乳酸発酵物をサプリメントとして利用する場合には、公知の各種賦形剤、糖類、香料、乳化剤及び保存料の一種又は二種以上を適宜含んで製造することができ、また、サプリメントの製品形態は特に制限されず、使用形態に合わせて適宜選択でき、例えば錠剤、粉末、顆粒、カプセル剤、ペースト、乳化液、溶液等が挙げられる。
【００３０】
以下、実施例を示して本発明の効果をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによって何ら限定されることはない。
【実施例１】
【００３１】
（食品製造に好適な菌株の選抜）
本発明の乳酸菌は食品製造に使用する目的を有することから、（１）東京農業大学菌株保存室公開株（以下、ＮＲＩＣ株と称する）であって発酵食品から分離された株のうち９６株、及び（２）キッコーマン株式会社研究開発本部にて発酵食品から分離した乳酸菌株（以下、キッコーマン単離株と称する）２３０株から、選抜を実施した。発酵食品からの乳酸菌の分離及び菌株の性質に関する評価試験は、「乳酸菌実験マニュアル−分離から同定まで−」（小崎道雄監修、内田泰、岡田早苗著、朝倉書店）に従い実施した。
【００３２】
本発明の乳酸菌は、幅広く食品に使用することを考慮すると、ガスを発生しないことが望ましい。ＮＲＩＣ株は発酵形式がすでに報告されているため、上記（１）の９６株中から、ホモ発酵株である７８株を選抜した。（２）のキッコーマン単離株に関しては、グルコースからのガス発生を、ダーラム管を用いる方法にて観察し、ガスを発生しない１５３株を選抜した。また、本発明の乳酸菌は豆乳発酵食品の製造に用いる目的を有することから、豆乳を良好に資化するものを選抜した。無調整豆乳（紀文フードケミファ社製）に、５０％（ｗ／ｖ）スクロースを１／９等量及び寒天を１．５％添加して豆乳寒天培地を作製し、各コロニーの生育速度を観察した。その結果、良好な生育を示す株として、ＮＲＩＣ株より５８株、キッコーマン単離株より６５株を選抜した。
【実施例２】
【００３３】
（胃酸耐性測定試験）
実施例１で選抜された、ＮＲＩＣ株５８株、キッコーマン単離株６５株について、胃酸耐性を測定した。無調整豆乳（紀文フードケミファ社製）及び５０％（ｗ／ｖ）スクロースを９：１となるように混合して得られる豆乳培地３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養（無攪拌、無通気、静置）した。得られた培養物３ｍｌを、人工胃液基礎培地（０．５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳、０．１２％（ｗ／ｖ）スクロース溶液を９５℃、３０分加熱殺菌後、終濃度０．４％（ｗ／ｖ）となるようにペプシン（和光純薬社製、１：１００００、ブタ胃粘膜由来）を添加し、塩酸にてｐＨを２．５に調整して作製）２７ｍｌに添加し、３７℃で３時間インキュベートし、培養開始前及び培養後の被検菌数を測定し、培養開始前の被検菌数に対する培養後の被検菌数の割合（％）を算出した。その結果、１０％以上の値を示した株として、ＮＲＩＣ株より５１株を、キッコーマン単離株より４７株を選抜し、以降の選抜工程を進めた。
【実施例３】
【００３４】
（胆汁酸耐性測定試験）
実施例２で選抜された、ＮＲＩＣ株５１株、キッコーマン単離株４７株について胆汁酸耐性を測定した。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養した。得られた培養液３００μｌを、３０ｍｌのＭＲＳ培地、及び３０ｍｌの０．３％（ｗ／ｖ）胆汁酸（オキソイド社製）含有ＭＲＳ培地にそれぞれ添加した。３７℃で２４時間培養後、６２０ｎｍにおける吸光度を測定し、胆汁酸非含有ＭＲＳ培地の吸光度に対する、０．３％胆汁酸含有ＭＲＳ培地の吸光度の割合（％）を算出した。９０％以上の値を示した株として、ＮＲＩＣ株より４１株を、キッコーマン単離株より３３株を選抜し、胆汁酸耐性株とした。
【実施例４】
【００３５】
（コレステロール除去能測定試験）
実施例２で選抜された、ＮＲＩＣ株５１株、キッコーマン単離株４７株についてコレステロール除去能を測定した。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養した。得られた培養液３００μｌを、３０ｍｌのコレステロール培地（３５０ｍｇ／Ｌ コレステロール（和光純薬社製）、０．２％（ｗ／ｖ）胆汁酸を含むＭＲＳ培地）に添加した。そして、３７℃で２４時間インキュベートした後、４℃、８，０００ｒｐｍにて１０分遠心分離を行い、上清中のコレステロール濃度をデタミナーＦＣ（協和メデックス社製）を用いて測定した。初発のコレステロール培地中に含有されるコレステロール量に対する、培地から除去されたコレステロール量の割合（％）を算出し、８５％以上の値を示した株として、ＮＲＩＣ株より８株を、キッコーマン単離株より１１株を選抜し、コレステロール除去能に優れる株とした。
【実施例５】
【００３６】
（胆汁酸吸着能測定試験）
実施例２で選抜された、ＮＲＩＣ株５１株、キッコーマン単離株４７株について胆汁酸吸着能を測定した。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養した。得られた培養液３００μｌを、３０ｍｌの０．３％（ｗ／ｖ）胆汁酸含有ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）に添加した。そして、３７℃で２４時間インキュベートした後、４℃、８０００ｒｐｍにて１０分遠心分離を行い、上清中の胆汁酸濃度をＴＢＡ測定キット（カイノス社製）により測定した。初発の培地中に含有されていた胆汁酸量に対する、培地から除去された胆汁酸量の割合（％）を算出し、４０％以上の値を示した株として、ＮＲＩＣ株より７株を、キッコーマン単離株より６株を選抜し、胆汁酸吸着能に優れる株とした。
【実施例６】
【００３７】
（ＩＬ−１２産生誘導能の測定）
実施例２で選抜された、ＮＲＩＣ株５１株、キッコーマン単離株４７株についてＩＬ−１２産生誘導能を測定した。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で４８時間培養した。コントロールとして使用するTetragenococcus halophilus Th221株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１０、ＩＬ−１２誘導能を有する）は、１０％食塩を含有するＭＲＳ培地中で、３０℃、７２時間培養した。各培養液を１０分間煮沸して殺菌後、波長６００ｎｍにおける吸光度が０．１２５、０．０６２、０．０３１、０．０１６になるようにＲＰＭＩ完全培地を用いて希釈し、測定に用いた。ＲＰＭＩ完全培地の組成は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に非働化（５６℃、３０分）したＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１０％添加したものである。
【００３８】
腹腔滲出マクロファージは、以下のように調製した。チオグリコレート（ＢＤ社製）２ｍｌを腹腔内に投与し、刺激したマウス（８週齢ＢＡＬＢ／ｃ、雄、チャールスリバー）から、投与３日後に無菌的に腹腔滲出マクロファージを採取した。腹腔滲出マクロファージ細胞浮遊液の細胞数を測定した後、細胞数を２×１０６／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ完全培地で調製した。この調製済み腹腔滲出マクロファージ細胞液を９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌ播種する。ここに、予め吸光度を測定して調製した殺菌菌体（１０分間煮沸による加熱殺菌菌体）を添加し、５％炭酸ガス培養器内で３７℃、１日間培養後、培養後の培養上清のＩＬ−１２をエンザイムイムノアッセイで測定した。
【００３９】
エンザイムイムノアッセイは、ラット抗マウスＩＬ−１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を０．２Ｍ、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液で２μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え、室温で一晩放置しラット抗ＩＬ−１２抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行った。１穴当たり１００μｌの培養上清を加え、室温で９０分間放置し、培養上清のマウスＩＬ−１２をプレートに付着したラット抗マウスＩＬ−１２抗体と結合させた。洗浄後、ラットビオチン化抗マウスＩＬ−１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を加え、プレートに結合させたマウスＩＬ−１２に結合させた。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ 社製）を加え、ビオチンと結合させた。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ 社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定し、リコンビナントマウスＩＬ−１２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で作成した標識曲線から、培養上清中のＩＬ−１２の濃度を求めた。コントロール菌が産生させるＩＬ−１２量に対する、被検菌が産生させるＩＬ−１２量の割合（％）を算出した。そして、被検菌が産生させるＩＬ−１２量のコントロール菌が産生させるＩＬ−１２量に対する割合（％）を算出した。８０％以上の値を示した株として、ＮＲＩＣ株より１０株を、キッコーマン単離株より１４株を選抜し、ＩＬ−１２産生誘導能能に優れる株とした。
【実施例７】
【００４０】
（総合的な機能性を有する菌株の選抜）
これまでの測定結果をもとに、総合的な機能性を有する菌株の選抜を行った。
【００４１】
胃酸耐性が９０％以上、胆汁酸耐性が９０％以上、コレステロール除去能が８５％以上、胆汁酸吸着能が４０％以上及びＩＬ−１２産生誘導能が８０％以上の能力を有する株を選抜したところ、キッコーマン単離株のうち、Ｙ７株がこれに該当した。Ｙ７株の同定を行ったところ、菌学的性質および１６ＳｒＤＮＡの塩基配列より、ラクトバチルス・プランタラムと同定された。
【００４２】
なお、実施例２で選抜された、胃酸耐性が１０％以上であった株のうち、ラクトバチルス・プランタラムに属する株の機能性について表２にまとめる。
【００４３】
【表２】
【実施例８】
【００４４】
（ヨーグルト様食品の製造例）
（１）乳酸菌スターターの調製
−８５℃でグリセロール保存しておいたラクトバチルス・プランタラムＹ７株を１０ｍｌのＭＲＳ培地に１白金耳接種し、３０℃で２４時間培養して前培養液を得た。これを遠心分離、生理食塩水中に分散、再度遠心分離した後、１００μｌの生理食塩水に懸濁し、スターターとした。
【００４５】
（２）発酵
１００ｍｌの豆乳培地（無調整豆乳（紀文フードケミファ社製）：５０％（ｗ／ｖ）スクロース＝９：１になるように混合）に上記スターターを添加し、３０℃で２４時間培養することにより、乳酸発酵物を得た。このものは、良好な風味を有するヨーグルト様食品として摂食することができた。
【実施例９】
【００４６】
（Ｙ７株を用いた乳酸発酵物のハムスターを用いた機能性評価）
Ｙ７株を用いて豆乳を発酵させて得られた乳酸発酵物の機能性を、ハムスターを用いた動物試験により評価した。
（１）供試サンプル調製
無調整豆乳（紀文フードケミファ社製）にＹ７株のグリセロールストックを植菌し、３０℃で４８時間培養してＹ７豆乳発酵物を作製した。比較対照として、ヨーグルト製造によく使用されるラクトバチルス・ブルガリカスの標準株であるＮＲＩＣ１６８８株を使用した豆乳発酵物を作製した。無調整豆乳（紀文フードケミファ社製）に、滅菌済みの６０％ラクトースを１／２０量添加し、Ｙ７株のグリセロールストックを植菌し、３０℃で４８時間培養して作製した。豆乳、Ｙ７豆乳発酵物、ＮＲＩＣ１６８８豆乳発酵物は凍結乾燥し、飼料に配合した。凍結乾燥物中の菌数は、Ｙ７豆乳発酵産物が３．１×１０８ｃｆｕ／ｇ、ＮＲＩＣ１６８８豆乳発酵物が８．７×１０５ｃｆｕ／ｇであった。
【００４７】
（２）飼料の調製
表３に示す高コレステロール飼料を、総タンパク量、総脂質量が各群で同一となるように調製した。
【００４８】
【表３】
【００４９】
（３）供試動物
４週齢のシリアンハムスター（雄）を、２週間の予備飼育後、試験に供した。予備飼育期間中、前半１週間はＭＦ固形飼料（オリエンタル酵母工業社製）、後半１週間はＭＦ粉末飼料（オリエンタル酵母工業社製）を用いた。
【００５０】
その後、体重と血清コレステロール値が各群で均等になるように
１．対照群
２．豆乳群
３．植物性乳酸菌豆乳発酵物（Ｙ７株）群
４．動物性乳酸菌豆乳発酵物（ＮＲＩＣ１６８８）群
の４群に分け、各飼料で２週間飼育した。体重、摂餌量を１週間毎に計測した。また、試験終了前日〜試験終了日の２４時間に排泄された糞便を回収した。
【００５１】
試験終了５時間前から絶食させ、全採血するとともに肝臓を摘出した。
【００５２】
（４）脂質の定量
１）血液分析
血液は、全採血後、３，０００ｒｐｍで１５分遠心し、血清を得た。この血清に関して総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、中性脂肪、リン脂質を測定した。総コレステロールはデタミナーＬ ＴＣ（協和メデックス社製）、ＨＤＬコレステロールはＬタイプワコーＨＤＬ−ＣＭ（和光純薬工業社製）、中性脂肪はデタミナーＴＧ（協和メデックス社製）、リン脂質はデタミナーＰＬ（協和メデックス社製）を用いて定量した。ＶＬＤＬ＋ＬＤＬコレステロールは、総コレステロールとＨＤＬコレステロールの差から求めた。Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ Ｉｎｄｅｘ（動脈硬化指数）は、ＶＬＤＬ＋ＬＤＬコレステロール／ＨＤＬコレステロールより求めた。
【００５３】
２）肝臓分析
凍結した肝臓０．５ｇを分取し、クロロホルム／メタノール溶液（クロロホルム:メタノール＝２：１）１０ｍｌで脂質を抽出した。そして、フィルターろ過、０．０５Ｍ ＮａＣｌ溶液で洗浄後、１ｍｌを減圧濃縮し、等量の９０％エタノール溶液に溶解し、コレステロール、中性脂肪、リン脂質、胆汁酸量を測定した。コレステロールは、デタミナーＬ ＴＣ（協和メデックス社製）、中性脂肪はデタミナーＴＧ（協和メデックス社製）、リン脂質はデタミナーＰＬ（協和メデックス社製）、胆汁酸はＴＢＡ測定キット（カイノス社製）により定量した。
【００５４】
３）糞便分析
糞便を凍結乾燥後、０．２５ｇを分取し、クロロホルム／メタノール溶液（クロロホルム:メタノール＝２：１）５ｍｌで脂質を抽出した。
そして、フィルターろ過、０．０５Ｍ ＮａＣｌ溶液で洗浄後、１ｍｌを減圧濃縮し、等量の９０％エタノール溶液に溶解し、コレステロール、胆汁酸量を測定した。
コレステロールはデタミナーＬ ＴＣ（協和メデックス社製）、胆汁酸はＴＢＡ測定キット（カイノス社製）により定量した。
【００５５】
（５）結果
１）体重・摂餌量・肝臓重量・糞便・糞便水分含量の比較
結果を表４に示す。相対肝臓重量がＮＲＩＣ１６８８豆乳発酵物群で若干高い傾向が見られたが、有意な差はなかった。糞便重量は、Ｙ７、ＮＲＩＣ１６８８豆乳発酵物群が、対照群に比べ有意に多かった。
【００５６】
【表４】
【００５７】
２）血液脂質成分量の比較
結果を表５に示す。総コレステロールは、対照群に比べ豆乳群、Ｙ７豆乳発酵物群、ＮＲＩＣ１６８８豆乳発酵物群が有意に低かった。また、ＶＬＤＬ＋ＬＤＬコレステロールも同様の結果となった。総コレステロールにおいては、豆乳群に比べＹ７豆乳発酵物群の方が高い傾向が見られたが、ＶＬＤＬ＋ＬＤＬコレステロールがほぼ同程度の値であることを考えると、これはＨＤＬコレステロールの差によるものと考えられる。
【００５８】
また、中性脂肪についても対照群に比べ他の３群が有意に低下し、中でもＹ７豆乳発酵物群においてより低くなる傾向が見られた。Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ Ｉｎｄｅｘ（動脈硬化指数）は豆乳群（Ｐ＜０．０５）、Ｙ７豆乳発酵物群（Ｐ＜０．０１）が対照群に比べ有意に低く、さらにＹ７豆乳発酵物群は豆乳群に比べて低い傾向が見られた。ＶＬＤＬ＋ＬＤＬコレステロールは同程度まで低下したが、これは豆乳発酵物群においてＨＤＬコレステロールが高くなっていることが原因と考えられる。
【００５９】
【表５】
【００６０】
３）肝臓脂質（コレステロール量）の比較
結果を図１に示す。肝臓中のコレステロール値は、群間で有意な差はなかったものの、Ｙ７発酵物群及びＮＲＩＣ１６８８発酵物群の乳酸菌発酵豆乳群において、対照群及び豆乳群に比べ低い傾向が確認された。
【００６１】
４）糞便脂質（コレステロール量及び胆汁酸量）の比較
糞便中の胆汁酸量の結果を図２に示す。有意差検定には、Ｔｕｋｅｙの多重検定を使用した。糞便中の胆汁酸量は、対照群に比べ他の３群で有意に多かった。さらに、Ｙ７発酵物群は豆乳群に比べても有意（Ｐ＜０．０５）に多かった。糞便中のコレステロール量は対照群に比べ豆乳群、ＮＲＩＣ１６８８発酵物群で有意（Ｐ＜０．０５）に多かった。Ｙ７発酵物群は対照群と比べ増加傾向は見られたものの、豆乳群、ＮＲＩＣ１６８８発酵物群に比べ低い傾向であった。Ｙ７発酵物群は血清中、肝臓中のコレステロール量が他の群に比べて最も低かったが、コレステロール排泄量が豆乳群、ＮＲＩＣ１６８８発酵物群に比べ少ない傾向にあることから、Ｙ７株によるコレステロール資化の可能性が示唆された。
【００６２】
以上の結果から、Ｙ７発酵物を摂食することにより、糞便中の胆汁酸量が有意に増加し、血液中のコレステロール量が有意に低下し、また、肝臓中のコレステロール量が低下傾向を示すことが明らかとなった。
【実施例１０】
【００６３】
（抗原特異的ＩｇＥ量の上昇抑制効果試験）
マウスに対してＹ７株の連続強制経口投与を行い、Ｙ７株の抗原特異的ＩｇＥ量の上昇抑制効果を調べた。具体的には、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雄）にＯＶＡ感作を行ってアレルギーを誘導し、乳酸菌Ｙ７株の摂取が血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量、脾臓細胞のサイトカイン産生能に及ぼす影響を調べた。
（１）供試動物
５週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウス（雄）を、１週間の予備飼育後、試験に供した。予備飼育期間、試験飼育期間中はＭＦ固形飼料（オリエンタル酵母工業社製）を用いた。
その後、
１．対照群（投与なし、ＯＶＡ感作なし）
２．生理食塩水投与群（比較例、ＯＶＡ感作あり）
３．加熱Ｙ７株投与群（本発明、ＯＶＡ感作あり）
４．非加熱Ｙ７株投与群（本発明、ＯＶＡ感作あり）
の４群に分けた。
乳酸菌Ｙ７株を、ＭＲＳ（Ｄｉｆｃｏ社製）培養液で２４時間培養後、その一部を加熱菌体投与用として、生理食塩水にて２回洗浄後、１×１０９個／ｍｌとなるように調製し、１０分間煮沸した。一方、非加熱菌体投与用としては、乳酸菌培養液を生理食塩水にて２回洗浄後、生理食塩水にて２×１０８個／ｍｌとなるように調製した。それぞれをマウスに対し、０．２ｍｌ／日で、連続３５日間、強制経口投与した。
乳酸菌の強制投与初日を試験開始０日目として、０日目、１４日目、２８日目にＯＶＡ感作を行った。具体的には、１ｍｌ生理食塩水あたり、ＯＶＡ（シグマ社製、ＧｒａｄｅＶ）１００μｇ、水酸化アルミニウム（和光純薬工業社製）１０ｍｇを含有する溶液を調製し、これを、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、６週齢、試験開始０日目時点）の腹腔内に０．２ｍｌ投与した。試験開始３５日目にマウスを解剖して脾臓、血液を採取し、脾臓からのＩＦＮ−γ産生量、血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量、総ＩｇＥ量を測定した。
【００６４】
（２）血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量の測定
試験開始３５日目にマウスから採血を行い、１，５００ｒｐｍで３０分間遠心を行って血清を得た。この血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量を、エンザイムイムノアッセイにより測定した。具体的には、ＯＶＡ（シグマ社製、ＧｒａｄｅＶ）を５０μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）中に溶解し、９６穴プレートに５０μｌ／穴となるように入れ、コーティングを行った。洗浄後、緩衝液で１００倍希釈した血清サンプルを、プレート上に５０μｌずつ分注後、１時間インキュベートした。洗浄後、抗マウスＩｇＥ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を１％ＢＳＡ加０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液５００倍希釈した溶液と共に１時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加え、ビオチンと結合させた。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定した。無添加・感作なしの群に対する相対値としてＯＶＡ特異的ＩｇＥ量を定量化した。有意差検定（Ｔ検定）は、生理食塩水投与群に対して行った。
結果を図３に示す。対照群に対し、生理食塩水投与群では、ＯＶＡ感作により血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量が大きく上昇した。一方、加熱Ｙ７株投与群および非加熱Ｙ７株投与群においては、生理食塩水投与群に比べ、血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量の上昇程度が有意に低かった。すなわち、Ｙ７株の投与により、マウス血清中の抗原特異的ＩｇＥ量の上昇が有意に抑制された。
【００６５】
（３）血清中の総ＩｇＥ量の測定
試験開始０日目、１４日目の血清中の総ＩｇＥ量をエンザイムイムノアッセイにより測定した。詳しくは、抗マウスＩｇＥ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を１μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）に溶解し、９６穴プレートに５０μｌ／穴でコーティングした。その後、加熱Ｙ７株摂取群、非加熱Ｙ７株摂取群において、無添加群のマウスより採取した血清サンプルを１００倍希釈し、プレート上に５０μｌずつ分注後に、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、１％ＢＳＡ加０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液にて希釈した抗マウスＩｇＥ抗体溶液(Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、２μｇ／ｍｌの溶液となるよう調整)中で、室温で１時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液を用いて洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加えて、ビオチンと結合させた。その後、ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ 社製）を１穴当たり５０μｌ加え、室温で２０分間反応後に、０．５Ｎ塩酸を用いて反応を停止し、マイクロプレートリーダーによって吸光度４５０ｎｍを測定した。 検量線作成にはＭｏｕｓｅ ＩｇＥ，κ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いた。測定結果は試験開始０日目から３５日目の増加量で表した。生理食塩水投与群に対し、有意差検定（Ｔ検定）を行った。
結果を図４に示す。加熱Ｙ７株摂取群において無添加群に比べ有意に総ＩｇＥ量が低かった。また、非加熱Ｙ７株摂取群においては、無添加群に比べ総ＩｇＥ量の低下傾向が見られた。これらのことから、Ｙ７株の摂取により総ＩｇＥ量の上昇が抑制されたことが示された。
【００６６】
（４）脾臓細胞から産生されるＩＦＮ−γの測定
試験開始３５日目に脾臓を採取後、４００ユニット／ｍｌのタイプ１コラゲナーゼ（シグマ社製）含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ社製）で攪拌、細胞の懸濁を行い、脾臓細胞を回収した。その後、ＯＶＡ（シグマ社製、ＧｒａｄｅＶ）を１００μｇ／ｍｌ含む１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ）加ＲＰＭＩ１６４０培地において３日間培養を行った。培養後、１５００ｒｐｍで５分間遠心を行い、上清を回収し、エンザイムイムノアッセイによりＩＦＮ−γ濃度を測定した。詳しくは抗マウスＩＦＮ−γ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を２μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）に溶解し、９６穴プレートに５０μｌ／穴でコーティングした。その後、血清サンプルを１００倍希釈し、プレート上に５０μｌずつ分注し、１時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン標識抗マウスＩＦＮ−γ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を１％ＢＳＡ加０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液５００倍希釈した溶液で１時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加え、ビオチンと結合させた。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定し、リコンビナントマウスＩＦＮ−γ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で作成した標識曲線から、培養上清中のＩＦＮ−γの濃度を求めた。有意差検定（Ｔ検定）は生理食塩水投与群に対して行った。
結果を図５に示す。加熱Ｙ７株摂取群、非加熱Ｙ７株摂取群において、無添加群に比べ有意にＩＦＮ−γ産生量が増加した。このことから、Ｙ７株摂取によりＴｈ１免疫が増強され、血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量、総ＩｇＥ量の上昇が抑制されていることが示された。
【実施例１１】
【００６７】
（血清中総ＩｇＥ量上昇抑制効果試験及び腸管でのＩｇＡ分泌促進作用試験）
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雄）に１日当たり２×１０８個の非加熱Ｙ７株、加熱Ｙ７株を１４日間連続強制経口投与し、血清中総ＩｇＥ量、腸管でのＩｇＡ分泌促進作用を反映する糞便中のＩｇＡ量を調べた。一方、無添加群には生理食塩水を投与した。
【００６８】
（１）血清中総ＩｇＥ量の測定
実施例１０に記載の方法と同様に、試験開始０日目、１４日目の血清中の総ＩｇＥ量をエンザイムイムノアッセイにより測定した。有意差検定は、Ｔｕｋｅｙの多重検定により行った。
結果を図６に示す。非加熱Ｙ７株摂取群における総ＩｇＥの増加量は、無添加群に比べ有意に抑制された。一方、加熱Ｙ７株摂取群においては、無添加群に比べて総ＩｇＥの増加量が低い傾向が見られたものの、その抑制の度合は非加熱Ｙ７株摂取群ほどではなかった。このことから、Ｙ７株の摂取による総ＩｇＥの増加抑制効果は、加熱された状態（死菌）で摂取するよりも非加熱の状態（生菌）で摂取する方が、その効果が強いことが示された。
【００６９】
（２）糞便中ＩｇＡ量の測定
感染防御作用の指標として、試験開始０日目、１４日目の糞便中の総ＩｇＡ量をエンザイムイムノアッセイにより測定した。詳しくは、糞便１００ｍｇに対し１ｍｌの割合でＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ社製）含有ＰＢＳ溶液を添加し、懸濁後、１２，０００ｒｐｍで遠心分離を行い、上清を抽出サンプルとした。抗マウスＩｇＡ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を０．５μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）に溶解し、９６穴プレートに1穴あたり５０μｌずつをコーティングした。その後、抽出サンプルを１０，０００倍希釈し、プレート上に５０μｌずつ分注し、１時間インキュベートした。洗浄後、抗マウスＩｇＡ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製）を１％ＢＳＡ加０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液にて２０，０００倍希釈した溶液と共に１時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加え、ビオチンと結合させた。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１穴当たり５０μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止後に、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定した。検量線作成にはＭｏｕｓｅ ＩｇＡ（ＢＥＴＨＹＬ社製）を用いた。測定結果は試験開始０日目から１４日目の増加量で表した。有意差検定は、Ｔｕｋｅｙの多重検定により行った
。
【００７０】
結果を図７に示す。非加熱Ｙ７株摂取群における糞便中総ＩｇＡの増加量は、無添加群に比べ有意に高かった。一方、加熱Ｙ７株摂取群においては、無添加群に比べて総ＩｇＡの増加量がやや高い数値が得られたものの、有意な上昇は見られなかった。このことから、Ｙ７株の摂取による腸管でのＩｇＡ分泌促進作用は、加熱された状態（死菌）で摂取するよりも非加熱の状態（生菌）で摂取する方が、その効果が強いことが示された。
【実施例１２】
【００７１】
（へアレスマウスにおける肌水分保持作用効果試験）
へアレスマウスの皮膚にアセトン処理を施し、肌水分量を低下させる試験系を用いて、Ｙ７株摂取による肌水分保持作用における効果を試験した。
（１）材料と方法
５週齢の雌性へアレスマウスＨＯＳ：ＨＲ−１（日本エスエルシー社より購入）１４匹を、体重の分布が同程度になるよう２群に分けた。１週間の馴化を行った後、１群にはコントロール食（ラボＭＲストック、日本農産社製）を、２群には５％豆乳発酵物含有食（Ｙ７株を生菌として５×１０７個／ｇ含有するラボＭＲストック）を自由に与えた。飲料水は両群共に自由に与えた。試験食を７週間摂取させた後、アセトン塗布処理を施し、人為的に乾燥肌を形成させた。具体的なアセトン塗布処理は、アセトンを含有させた脱脂綿を１回につき５秒間皮膚に接触させ、これを５回繰り返す事を１セットとし、朝夕１セットずつ３日間、計６セット実施した。アセトン処理は、マウス片体側部にのみ実施し、反対側の体側部は無処理部分とした。
【００７２】
（２）評価
アセトン塗布処理を終えた翌日に、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（ｃｏｕｒａｇｅ−ｋｈａｚａｋａ社製）を用いて肌水分値を測定した。肌水分値は個体差が比較的大きいため、前述の無処理部分とアセトン塗布処理部分での肌水分値を測定した。有意差検定は、Ｔ検定により行った。
図８に示すように、アセトン塗布部においてはいずれの群においても、無処理部に比べて肌水分値が低下した。しかし、コントロール食を摂取させた１群に比べて、Ｙ７株を摂取した２群においては、アセトン塗布部の肌水分値が有為に高かった。すなわち、Ｙ７株豆乳発酵物の経口摂取により、皮膚への刺激に対する抵抗性が増し、肌水分が保持されたことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】対照群、豆乳群、Ｙ７豆乳発酵物群、１６８８豆乳発酵物群における肝臓中コレステロール量（ｍｇ／ｇ）を示す図である。
【図２】対照群、豆乳群、Ｙ７豆乳発酵物群、１６８８豆乳発酵物群における糞便中の胆汁酸量（ｍｇ／ｄａｙ）を示す図である。（＊Ｐ＜０．０５ ＊＊Ｐ＜０．０１）
【図３】Ｙ７菌体投与なし群、およびＹ７菌体投与群における血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量の測定結果を示す図である。（＊Ｐ＜０．０５）
【図４】Ｙ７菌体投与なし群、およびＹ７菌体投与群における血清中総ＩｇＥ量の測定結果を示す図である。（＊Ｐ＜０．０５）
【図５】Ｙ７菌体投与なし群、およびＹ７菌体投与群における脾臓細胞からのＩＦＮ−γ産生量の測定結果を示す図である。（＊Ｐ＜０．０５）
【図６】Ｙ７菌体投与なし群、およびＹ７菌体投与群における血清中総ＩｇＥ量の測定結果を示す図である。（＊Ｐ＜０．０５）
【図７】Ｙ７菌体投与なし群、およびＹ７菌体投与群における糞便中ＩｇＡ量の測定結果を示す図である。（＊Ｐ＜０．０５）
【図８】Ｙ７菌体投与なし群、およびＹ７菌体投与群における肌水分値の測定結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵食品を取得源とする新規な乳酸菌、それを用いた乳酸発酵物及び乳酸発酵物含有飲食品に関する。より詳細には、優れた、胃酸耐性、胆汁酸耐性、コレステロール除去能、胆汁酸吸着能及びインターロイキン１２（以下、ＩＬ−１２と称する）産生誘導能を有する新規な乳酸菌、その乳酸菌を用いて得られる乳酸発酵物及び乳酸発酵物含有飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、腸内細菌叢を良好な状態に保つことに寄与し、また、免疫賦活等の生理活性効果も有していることが知られており、乳酸菌を用いて乳を発酵させて得られる乳酸発酵食品は、健康志向の飲食品として広く食されている。
【０００３】
従来、漬物等の植物発酵食品を取得源とする乳酸菌の一種ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）を用いて豆乳発酵物を製造する方法が知られている。この乳酸菌は、製品に適度な酸味を与え、製品の酸味・甘味のバランスを好適に保つことができるという利点を有する。例えば、風味・食感にすぐれたヨーグルト様豆乳発酵食品を製造するための乳酸菌スターターとして、ラクトバチルス・プランタラム及びその他４種類の乳酸菌（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・バイオバラエティ・ディアセチラクティス、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイ）を混合使用する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
また、ラクトバチルス・プランタラムＨＯＫＫＡＩＤＯ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６４５）が、豆乳を良好に発酵し、ヒト腸管由来培養細胞への付着能に優れ、また、同細胞への大腸菌Ｏ−１５７の付着を抑制することが知られている（例えば、特許文献２参照）。
【０００５】
あるいは、ラクトバチルス・プランタラムＯＮＣ１４１株を用いて製造した発酵乳が、ヒトにおける胃腸内細菌叢を改善し（例えば、非特許文献１参照）、便秘傾向を有するヒトの排便回数を増加させ（例えば、非特許文献２参照）、また病原性サルモネラ菌（Salmonella typhimurium）の経口感染に対し宿主の抵抗性を増強すること（例えば、非特許文献３参照）が知られている。
【０００６】
また、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９１７菌体がＩＬ−１２産生促進作用（産生誘導能）を有することが知られている（例えば、特許文献３参照）。
【０００７】
一方、ビフィズス菌や乳酸菌などの有用微生物を含む食品を摂取した場合に、これら有用微生物が消化管下部、特に大腸まで生きた状態で到達するためには、強い殺菌作用をもつ胃酸および胆汁を通過する必要があり、この課題に対し、各種の方法が提案されている。例えば、胃酸からの保護に関しては、有用生菌を腸溶性のカプセル内に封入する方法（例えば、特許文献４参照）や、有用生菌粉末を油脂によりコーティングする方法（例えば、特許文献５参照）等が知られている。胆汁からの保護に関しては、大腸で腸内細菌により分解されるキトサンの内層皮膜と、酸性で溶解せず中性で溶解する胃酸耐性素材による外層皮膜からなる構造体内に有用生菌を封入する方法（例えば、特許文献６参照）等が知られている。
【０００８】
しかし、ラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌であって、胃酸や胆汁から菌体を保護するための特別の処理工程を必要としない、優れた胃酸耐性及び胆汁酸耐性を有し、かつ、コレステロール除去能、胆汁酸吸着能及びＩＬ−１２産生誘導能における優れた特性を併せ持つ菌株は、これまでに知られていない。
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−２１８３９０号公報
【特許文献２】特許第３９２５５０２号公報
【特許文献３】特開平１０−１３９６７４号公報
【特許文献４】特開平１１−３０２１５８号公報
【特許文献５】特公平５−６８４４６号公報
【特許文献６】特開平１０−３２４６４２号公報
【非特許文献１】久米村恵、戸羽正道、曽川芳郎、清水精一、川口信三、「腸内細菌学雑誌」、１５，１５（２００１）
【非特許文献２】戸羽正道、久米村恵、宗行哲、曽川芳郎、吉澤久雄、矢島洋一、松田豊、飯島肇、「腸内細菌学雑誌」、１５，２１（２００１）
【非特許文献３】池永武、山平聡子、名知英樹、戸羽正道、岡松洋、Ｍｉｌｋ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．１，ｐｐ．２７−３２（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ラクトバチルス・プランタラムに属し、優れた胃酸耐性及び胆汁酸耐性を有し、かつ、コレステロール除去能、胆汁酸吸着能及びＩＬ−１２産生誘導能における優れた特性を併せ持つ新規な乳酸菌、及び、この乳酸菌を用いて得られ、摂食することによりコレステロール除去、胆汁酸吸着及びＩＬ−１２産生誘導効果が得られる乳酸発酵物及び乳酸発酵物含有飲食品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、ラクトバチルス・プランタラムＹ７株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３４９株）が、上記５つの優れた能力を同時に有する乳酸菌であることを知り、この知見に基づいて本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は以下に示す新規な乳酸菌、その乳酸菌を用いて得られる乳酸発酵食品及びその製造法である。
（１）胃酸耐性が９０％以上、胆汁酸耐性が９０％以上、コレステロール除去能が８５％以上、胆汁酸吸着能が４０％以上、及びＩＬ−１２産生誘導能が８０％以上であることを特徴とする、ラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌。
（２）乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラムＦＥＲＭ Ｐ−２１３４９株である、上記（１）に記載の乳酸菌。
（３）豆乳に上記（１）〜（２）に記載の乳酸菌を添加し、発酵させて得られる乳酸発酵物。
（４）上記（３）記載の乳酸発酵物を含有する乳酸発酵物含有飲食品。
（５）豆乳に上記（１）〜（２）に記載の乳酸菌を添加し、発酵させることを特徴とする、乳酸発酵物の製造方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の乳酸菌の特性を規定するための方法に関し、順に説明する。
＜胃酸耐性＞
本発明で規定する胃酸耐性は、具体的には以下の方法により測定することができる。無調整豆乳（紀文フードケミファ社製）及び５０％（ｗ／ｖ）スクロースを９：１となるように混合して得られる豆乳培地３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養（無攪拌、無通気、静置）する。得られた培養物３ｍｌを、人工胃液基礎培地（０．５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳、０．１２％（ｗ／ｖ）スクロース溶液を９５℃３０分加熱殺菌後、終濃度０．４％（ｗ／ｖ）となるようにペプシン（和光純薬社製、１：１００００、ブタ胃粘膜由来）を添加し、塩酸にてｐＨを２．５に調整して作製）２７ｍｌに添加し、３７℃で３時間インキュベートする。培養開始前及び培養後の被検菌数を測定し、培養開始前の被検菌数に対する培養後の被検菌数の割合（％）を算出する。
【００１４】
＜胆汁酸耐性＞
本発明で規定する胆汁酸耐性とは、具体的には以下の方法により測定することができる。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養する。得られた培養液３００μｌを、３０ｍｌのＭＲＳ培地、及び３０ｍｌの０．３％（ｗ／ｖ）胆汁酸（オキソイド社製）含有ＭＲＳ培地にそれぞれ添加する。３７℃で２４時間培養後、６２０ｎｍにおける吸光度を測定し、胆汁酸非含有ＭＲＳ培地の吸光度に対する、０．３％胆汁酸含有ＭＲＳ培地の吸光度の割合（％）を算出する。
【００１５】
＜コレステロール除去能＞
本発明で規定するコレステロール除去能は、具体的には以下の方法により測定することができる。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養する。得られた培養液３００μｌを、コレステロール培地（３５０ｍｇ／Ｌ コレステロール（和光純薬社製）、０．２％胆汁酸（ｗ／ｖ）を含むＭＲＳ培地）３０ｍｌに添加する。３７℃で２４時間インキュベートした後、４℃、８，０００ｒｐｍにて１０分遠心分離を行い、上清中のコレステロール濃度をデタミナーＦＣ（協和メデックス社製）を用いて測定する。初発のコレステロール培地中に含有されるコレステロール量に対する、培地から除去されたコレステロール量の割合（％）を算出する。
【００１６】
＜胆汁酸吸着能＞
本発明で規定する胆汁酸吸着能は、具体的には以下の方法により測定することができる。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養する。得られた培養液３００μｌを、３０ｍｌの０．３％（ｗ／ｖ）胆汁酸含有ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）に添加する。そして、３７℃で２４時間インキュベート後、４℃、８，０００ｒｐｍにて１０分遠心分離を行い、上清中の胆汁酸濃度をＴＢＡ測定キット（カイノス社製）により測定する。初発の培地中に含有されていた胆汁酸量に対する、培地から除去された胆汁酸量の割合（％）を算出する。
【００１７】
＜ＩＬ−１２産生誘導能＞
本発明で規定するＩＬ−１２産生誘導能は、具体的には以下の方法により測定することができる。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で４８時間培養する。コントロールとして使用するテトラジェノコッカス・ハロフィラス（Tetragenococcus halophilus）Th221株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１０）は、１０％食塩を含有するＭＲＳ培地中で、３０℃、７２時間培養する。各培養液を１０分間煮沸して殺菌後、波長６００ｎｍにおける吸光度が０．１２５、０．０６２、０．０３１、０．０１６になるようにＲＰＭＩ完全培地を用いて希釈し、測定に用いる。ＲＰＭＩ完全培地の組成は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に非働化（５６℃、３０分）したＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１０％添加したものである。なお、Tetragenococcus halophilus Th221株は、菌体または菌体成分を有効成分とするＩＬ−１２誘導能を有することが知られている菌株の１つである（特開２００６−２８０４７号公報参照）。
【００１８】
腹腔滲出マクロファージは、以下のように調製する。チオグリコレート（ＢＤ社製）２ｍｌを腹腔内に投与し、刺激したマウス（８週齢ＢＡＬＢ／ｃ、雄、チャールスリバー）から、投与３日後に無菌的に腹腔滲出マクロファージを採取する。腹腔滲出マクロファージ細胞浮遊液の細胞数を測定した後、ＲＰＭＩ完全培地を用いて細胞数を２×１０６／ｍｌの濃度に調製する。この調製済み腹腔滲出マクロファージ細胞液を９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌ播種する。ここに、予め吸光度を測定して調製した殺菌菌体（１０分間煮沸による加熱殺菌菌体）を添加し、５％炭酸ガス培養器内で３７℃、１日間培養後、培養後の培養上清のＩＬ−１２をエンザイムイムノアッセイで測定する。
【００１９】
エンザイムイムノアッセイは、ラット抗マウスＩＬ−１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を０．２Ｍ、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液を用いて２μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え、室温で一晩放置しラット抗ＩＬ−１２抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行う。このプレートに１穴当たり１００μｌの培養上清を加え、室温で９０分間放置し、培養上清のマウスＩＬ−１２をプレートに付着したラット抗マウスＩＬ−１２抗体と結合させる。洗浄後、ラットビオチン化抗マウスＩＬ−１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を加え、プレートに結合させたマウスＩＬ−１２に結合させる。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ 社製）を加え、ビオチンと結合させる。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ 社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定し、リコンビナントマウスＩＬ−１２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）で作成した標識曲線から、培養上清中のＩＬ−１２の濃度を求める。コントロール菌が産生させるＩＬ−１２量に対する、被検菌が産生させるインターロイキン１２量の割合（％）を算出する。
【００２０】
本発明では、本発明で規定する上述の方法により測定した場合に、胃酸耐性が９０％以上、胆汁酸耐性が９０％以上、コレステロール除去能が８５％以上、胆汁酸吸着能が４０％以上、及びＩＬ−１２産生誘導能が８０％以上の能力を有する乳酸菌を用いることを特徴とする。
【００２１】
このような乳酸菌として、上記５つの能力を併せ持つラクトバチルス・プランタラムに属する微生物が挙げられる。具体的な株としては、例えばラクトバチルス・プランタラムＹ７株が挙げられる。ラクトバチルス・プランタラムＹ７株は、本発明者らが植物発酵物から分離同定したものである。この乳酸菌は豆乳中で増殖し、その結果得られる乳酸発酵物及び乳酸発酵物含有飲食品を摂食することにより、コレステロール除去、胆汁酸吸着及びＩＬ−１２産生誘導効果を得ることができ、並びに、特別な保護手段を必要とせずとも、胃酸や胆汁により死滅しにくく、生きて腸まで届きやすいという多面的な効果を有している。
【００２２】
なお、このラクトバチルス・プランタラムＹ７株（Lactobacillus plantarum Y7、以降Ｙ７株）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３４９として２００７年８月２７日付けで寄託されている。
【００２３】
Ｙ７株の菌学的性質を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
（乳酸発酵物の製造）
本発明の乳酸発酵物を製造するには、豆乳に上記乳酸菌を添加し、発酵すればよい。本発明で使用可能な豆乳としては、通常の豆乳製造法により得られた豆乳（無調整豆乳、調製豆乳、豆乳飲料）及び、加工大豆粉末を温水等に混和し、ホモゲナイズ処理等により乳化して得られる大豆乳が挙げられる。
【００２６】
豆乳の発酵は公知の任意の方法を用いて行うことができ、例えば、上記乳酸菌を前培養して得られるスターターを上記豆乳に０．０１〜１０容量％添加し、２５〜４５℃で、４〜３０時間培養することにより得ることができる。このようにして得られた乳酸発酵食品は、ヨーグルト様の硬さと食感を有しており、しかも前述したように優れた、胃酸耐性、胆汁酸耐性、コレステロール除去能、胆汁酸吸着能及びＩＬ−１２産生誘導能を有する。
【００２７】
（乳酸発酵物含有飲食品の製造）
上記のように得られた本発明の乳酸発酵物は、各種飲食品の原料とすることができる。飲食品は特に限定されないが、例えば、ヨーグルト、ババロア、ゼリー、シャーベット、アイスクリーム、乳酸飲料、清涼飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）、スープ類、ソース類、マヨネーズ、ドレッシング等の各種調味料、蕎麦、うどん、中華麺、即席麺等の麺類、グミ等の半固形状食品、ペースト状食品、ガム、サプリメント等の固形状食品等が挙げられる。
【００２８】
原料として配合する本発明の乳酸発酵物の割合は任意であるが、例えば、飲食品中に、本発明の乳酸菌を所定の個数以上含有するように配合することができる。所定の個数は、その飲食品において目的とする効果を効果的に達成できる個数であることが好ましく、その効果が達成できるのであれば、各飲食品中に存在するＹ７株は、生菌であってもよく、又は死菌であってもよい。
【００２９】
本発明の乳酸発酵物を各種飲食品の原料として利用する場合には、公知の各種その他の原料、糖類、香料、乳化剤及び保存料の一種又は二種以上を適宜含んで製造することができる。本発明の乳酸発酵物をサプリメントとして利用する場合には、公知の各種賦形剤、糖類、香料、乳化剤及び保存料の一種又は二種以上を適宜含んで製造することができ、また、サプリメントの製品形態は特に制限されず、使用形態に合わせて適宜選択でき、例えば錠剤、粉末、顆粒、カプセル剤、ペースト、乳化液、溶液等が挙げられる。
【００３０】
以下、実施例を示して本発明の効果をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによって何ら限定されることはない。
【実施例１】
【００３１】
（食品製造に好適な菌株の選抜）
本発明の乳酸菌は食品製造に使用する目的を有することから、（１）東京農業大学菌株保存室公開株（以下、ＮＲＩＣ株と称する）であって発酵食品から分離された株のうち９６株、及び（２）キッコーマン株式会社研究開発本部にて発酵食品から分離した乳酸菌株（以下、キッコーマン単離株と称する）２３０株から、選抜を実施した。発酵食品からの乳酸菌の分離及び菌株の性質に関する評価試験は、「乳酸菌実験マニュアル−分離から同定まで−」（小崎道雄監修、内田泰、岡田早苗著、朝倉書店）に従い実施した。
【００３２】
本発明の乳酸菌は、幅広く食品に使用することを考慮すると、ガスを発生しないことが望ましい。ＮＲＩＣ株は発酵形式がすでに報告されているため、上記（１）の９６株中から、ホモ発酵株である７８株を選抜した。（２）のキッコーマン単離株に関しては、グルコースからのガス発生を、ダーラム管を用いる方法にて観察し、ガスを発生しない１５３株を選抜した。また、本発明の乳酸菌は豆乳発酵食品の製造に用いる目的を有することから、豆乳を良好に資化するものを選抜した。無調整豆乳（紀文フードケミファ社製）に、５０％（ｗ／ｖ）スクロースを１／９等量及び寒天を１．５％添加して豆乳寒天培地を作製し、各コロニーの生育速度を観察した。その結果、良好な生育を示す株として、ＮＲＩＣ株より５８株、キッコーマン単離株より６５株を選抜した。
【実施例２】
【００３３】
（胃酸耐性測定試験）
実施例１で選抜された、ＮＲＩＣ株５８株、キッコーマン単離株６５株について、胃酸耐性を測定した。無調整豆乳（紀文フードケミファ社製）及び５０％（ｗ／ｖ）スクロースを９：１となるように混合して得られる豆乳培地３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養（無攪拌、無通気、静置）した。得られた培養物３ｍｌを、人工胃液基礎培地（０．５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳、０．１２％（ｗ／ｖ）スクロース溶液を９５℃、３０分加熱殺菌後、終濃度０．４％（ｗ／ｖ）となるようにペプシン（和光純薬社製、１：１００００、ブタ胃粘膜由来）を添加し、塩酸にてｐＨを２．５に調整して作製）２７ｍｌに添加し、３７℃で３時間インキュベートし、培養開始前及び培養後の被検菌数を測定し、培養開始前の被検菌数に対する培養後の被検菌数の割合（％）を算出した。その結果、１０％以上の値を示した株として、ＮＲＩＣ株より５１株を、キッコーマン単離株より４７株を選抜し、以降の選抜工程を進めた。
【実施例３】
【００３４】
（胆汁酸耐性測定試験）
実施例２で選抜された、ＮＲＩＣ株５１株、キッコーマン単離株４７株について胆汁酸耐性を測定した。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養した。得られた培養液３００μｌを、３０ｍｌのＭＲＳ培地、及び３０ｍｌの０．３％（ｗ／ｖ）胆汁酸（オキソイド社製）含有ＭＲＳ培地にそれぞれ添加した。３７℃で２４時間培養後、６２０ｎｍにおける吸光度を測定し、胆汁酸非含有ＭＲＳ培地の吸光度に対する、０．３％胆汁酸含有ＭＲＳ培地の吸光度の割合（％）を算出した。９０％以上の値を示した株として、ＮＲＩＣ株より４１株を、キッコーマン単離株より３３株を選抜し、胆汁酸耐性株とした。
【実施例４】
【００３５】
（コレステロール除去能測定試験）
実施例２で選抜された、ＮＲＩＣ株５１株、キッコーマン単離株４７株についてコレステロール除去能を測定した。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養した。得られた培養液３００μｌを、３０ｍｌのコレステロール培地（３５０ｍｇ／Ｌ コレステロール（和光純薬社製）、０．２％（ｗ／ｖ）胆汁酸を含むＭＲＳ培地）に添加した。そして、３７℃で２４時間インキュベートした後、４℃、８，０００ｒｐｍにて１０分遠心分離を行い、上清中のコレステロール濃度をデタミナーＦＣ（協和メデックス社製）を用いて測定した。初発のコレステロール培地中に含有されるコレステロール量に対する、培地から除去されたコレステロール量の割合（％）を算出し、８５％以上の値を示した株として、ＮＲＩＣ株より８株を、キッコーマン単離株より１１株を選抜し、コレステロール除去能に優れる株とした。
【実施例５】
【００３６】
（胆汁酸吸着能測定試験）
実施例２で選抜された、ＮＲＩＣ株５１株、キッコーマン単離株４７株について胆汁酸吸着能を測定した。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で２４時間培養した。得られた培養液３００μｌを、３０ｍｌの０．３％（ｗ／ｖ）胆汁酸含有ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）に添加した。そして、３７℃で２４時間インキュベートした後、４℃、８０００ｒｐｍにて１０分遠心分離を行い、上清中の胆汁酸濃度をＴＢＡ測定キット（カイノス社製）により測定した。初発の培地中に含有されていた胆汁酸量に対する、培地から除去された胆汁酸量の割合（％）を算出し、４０％以上の値を示した株として、ＮＲＩＣ株より７株を、キッコーマン単離株より６株を選抜し、胆汁酸吸着能に優れる株とした。
【実施例６】
【００３７】
（ＩＬ−１２産生誘導能の測定）
実施例２で選抜された、ＮＲＩＣ株５１株、キッコーマン単離株４７株についてＩＬ−１２産生誘導能を測定した。ＭＲＳ培地（ＢＤ社製）３０ｍｌを５０ｍｌ容ファルコンチューブに入れ、被検菌（グリセロールストック）を接種（１×１０７個／ｍｌ）し、３０℃で４８時間培養した。コントロールとして使用するTetragenococcus halophilus Th221株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１０、ＩＬ−１２誘導能を有する）は、１０％食塩を含有するＭＲＳ培地中で、３０℃、７２時間培養した。各培養液を１０分間煮沸して殺菌後、波長６００ｎｍにおける吸光度が０．１２５、０．０６２、０．０３１、０．０１６になるようにＲＰＭＩ完全培地を用いて希釈し、測定に用いた。ＲＰＭＩ完全培地の組成は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に非働化（５６℃、３０分）したＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１０％添加したものである。
【００３８】
腹腔滲出マクロファージは、以下のように調製した。チオグリコレート（ＢＤ社製）２ｍｌを腹腔内に投与し、刺激したマウス（８週齢ＢＡＬＢ／ｃ、雄、チャールスリバー）から、投与３日後に無菌的に腹腔滲出マクロファージを採取した。腹腔滲出マクロファージ細胞浮遊液の細胞数を測定した後、細胞数を２×１０６／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ完全培地で調製した。この調製済み腹腔滲出マクロファージ細胞液を９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌ播種する。ここに、予め吸光度を測定して調製した殺菌菌体（１０分間煮沸による加熱殺菌菌体）を添加し、５％炭酸ガス培養器内で３７℃、１日間培養後、培養後の培養上清のＩＬ−１２をエンザイムイムノアッセイで測定した。
【００３９】
エンザイムイムノアッセイは、ラット抗マウスＩＬ−１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を０．２Ｍ、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液で２μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え、室温で一晩放置しラット抗ＩＬ−１２抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行った。１穴当たり１００μｌの培養上清を加え、室温で９０分間放置し、培養上清のマウスＩＬ−１２をプレートに付着したラット抗マウスＩＬ−１２抗体と結合させた。洗浄後、ラットビオチン化抗マウスＩＬ−１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を加え、プレートに結合させたマウスＩＬ−１２に結合させた。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ 社製）を加え、ビオチンと結合させた。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ 社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定し、リコンビナントマウスＩＬ−１２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で作成した標識曲線から、培養上清中のＩＬ−１２の濃度を求めた。コントロール菌が産生させるＩＬ−１２量に対する、被検菌が産生させるＩＬ−１２量の割合（％）を算出した。そして、被検菌が産生させるＩＬ−１２量のコントロール菌が産生させるＩＬ−１２量に対する割合（％）を算出した。８０％以上の値を示した株として、ＮＲＩＣ株より１０株を、キッコーマン単離株より１４株を選抜し、ＩＬ−１２産生誘導能能に優れる株とした。
【実施例７】
【００４０】
（総合的な機能性を有する菌株の選抜）
これまでの測定結果をもとに、総合的な機能性を有する菌株の選抜を行った。
【００４１】
胃酸耐性が９０％以上、胆汁酸耐性が９０％以上、コレステロール除去能が８５％以上、胆汁酸吸着能が４０％以上及びＩＬ−１２産生誘導能が８０％以上の能力を有する株を選抜したところ、キッコーマン単離株のうち、Ｙ７株がこれに該当した。Ｙ７株の同定を行ったところ、菌学的性質および１６ＳｒＤＮＡの塩基配列より、ラクトバチルス・プランタラムと同定された。
【００４２】
なお、実施例２で選抜された、胃酸耐性が１０％以上であった株のうち、ラクトバチルス・プランタラムに属する株の機能性について表２にまとめる。
【００４３】
【表２】
【実施例８】
【００４４】
（ヨーグルト様食品の製造例）
（１）乳酸菌スターターの調製
−８５℃でグリセロール保存しておいたラクトバチルス・プランタラムＹ７株を１０ｍｌのＭＲＳ培地に１白金耳接種し、３０℃で２４時間培養して前培養液を得た。これを遠心分離、生理食塩水中に分散、再度遠心分離した後、１００μｌの生理食塩水に懸濁し、スターターとした。
【００４５】
（２）発酵
１００ｍｌの豆乳培地（無調整豆乳（紀文フードケミファ社製）：５０％（ｗ／ｖ）スクロース＝９：１になるように混合）に上記スターターを添加し、３０℃で２４時間培養することにより、乳酸発酵物を得た。このものは、良好な風味を有するヨーグルト様食品として摂食することができた。
【実施例９】
【００４６】
（Ｙ７株を用いた乳酸発酵物のハムスターを用いた機能性評価）
Ｙ７株を用いて豆乳を発酵させて得られた乳酸発酵物の機能性を、ハムスターを用いた動物試験により評価した。
（１）供試サンプル調製
無調整豆乳（紀文フードケミファ社製）にＹ７株のグリセロールストックを植菌し、３０℃で４８時間培養してＹ７豆乳発酵物を作製した。比較対照として、ヨーグルト製造によく使用されるラクトバチルス・ブルガリカスの標準株であるＮＲＩＣ１６８８株を使用した豆乳発酵物を作製した。無調整豆乳（紀文フードケミファ社製）に、滅菌済みの６０％ラクトースを１／２０量添加し、Ｙ７株のグリセロールストックを植菌し、３０℃で４８時間培養して作製した。豆乳、Ｙ７豆乳発酵物、ＮＲＩＣ１６８８豆乳発酵物は凍結乾燥し、飼料に配合した。凍結乾燥物中の菌数は、Ｙ７豆乳発酵産物が３．１×１０８ｃｆｕ／ｇ、ＮＲＩＣ１６８８豆乳発酵物が８．７×１０５ｃｆｕ／ｇであった。
【００４７】
（２）飼料の調製
表３に示す高コレステロール飼料を、総タンパク量、総脂質量が各群で同一となるように調製した。
【００４８】
【表３】
【００４９】
（３）供試動物
４週齢のシリアンハムスター（雄）を、２週間の予備飼育後、試験に供した。予備飼育期間中、前半１週間はＭＦ固形飼料（オリエンタル酵母工業社製）、後半１週間はＭＦ粉末飼料（オリエンタル酵母工業社製）を用いた。
【００５０】
その後、体重と血清コレステロール値が各群で均等になるように
１．対照群
２．豆乳群
３．植物性乳酸菌豆乳発酵物（Ｙ７株）群
４．動物性乳酸菌豆乳発酵物（ＮＲＩＣ１６８８）群
の４群に分け、各飼料で２週間飼育した。体重、摂餌量を１週間毎に計測した。また、試験終了前日〜試験終了日の２４時間に排泄された糞便を回収した。
【００５１】
試験終了５時間前から絶食させ、全採血するとともに肝臓を摘出した。
【００５２】
（４）脂質の定量
１）血液分析
血液は、全採血後、３，０００ｒｐｍで１５分遠心し、血清を得た。この血清に関して総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、中性脂肪、リン脂質を測定した。総コレステロールはデタミナーＬ ＴＣ（協和メデックス社製）、ＨＤＬコレステロールはＬタイプワコーＨＤＬ−ＣＭ（和光純薬工業社製）、中性脂肪はデタミナーＴＧ（協和メデックス社製）、リン脂質はデタミナーＰＬ（協和メデックス社製）を用いて定量した。ＶＬＤＬ＋ＬＤＬコレステロールは、総コレステロールとＨＤＬコレステロールの差から求めた。Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ Ｉｎｄｅｘ（動脈硬化指数）は、ＶＬＤＬ＋ＬＤＬコレステロール／ＨＤＬコレステロールより求めた。
【００５３】
２）肝臓分析
凍結した肝臓０．５ｇを分取し、クロロホルム／メタノール溶液（クロロホルム:メタノール＝２：１）１０ｍｌで脂質を抽出した。そして、フィルターろ過、０．０５Ｍ ＮａＣｌ溶液で洗浄後、１ｍｌを減圧濃縮し、等量の９０％エタノール溶液に溶解し、コレステロール、中性脂肪、リン脂質、胆汁酸量を測定した。コレステロールは、デタミナーＬ ＴＣ（協和メデックス社製）、中性脂肪はデタミナーＴＧ（協和メデックス社製）、リン脂質はデタミナーＰＬ（協和メデックス社製）、胆汁酸はＴＢＡ測定キット（カイノス社製）により定量した。
【００５４】
３）糞便分析
糞便を凍結乾燥後、０．２５ｇを分取し、クロロホルム／メタノール溶液（クロロホルム:メタノール＝２：１）５ｍｌで脂質を抽出した。
そして、フィルターろ過、０．０５Ｍ ＮａＣｌ溶液で洗浄後、１ｍｌを減圧濃縮し、等量の９０％エタノール溶液に溶解し、コレステロール、胆汁酸量を測定した。
コレステロールはデタミナーＬ ＴＣ（協和メデックス社製）、胆汁酸はＴＢＡ測定キット（カイノス社製）により定量した。
【００５５】
（５）結果
１）体重・摂餌量・肝臓重量・糞便・糞便水分含量の比較
結果を表４に示す。相対肝臓重量がＮＲＩＣ１６８８豆乳発酵物群で若干高い傾向が見られたが、有意な差はなかった。糞便重量は、Ｙ７、ＮＲＩＣ１６８８豆乳発酵物群が、対照群に比べ有意に多かった。
【００５６】
【表４】
【００５７】
２）血液脂質成分量の比較
結果を表５に示す。総コレステロールは、対照群に比べ豆乳群、Ｙ７豆乳発酵物群、ＮＲＩＣ１６８８豆乳発酵物群が有意に低かった。また、ＶＬＤＬ＋ＬＤＬコレステロールも同様の結果となった。総コレステロールにおいては、豆乳群に比べＹ７豆乳発酵物群の方が高い傾向が見られたが、ＶＬＤＬ＋ＬＤＬコレステロールがほぼ同程度の値であることを考えると、これはＨＤＬコレステロールの差によるものと考えられる。
【００５８】
また、中性脂肪についても対照群に比べ他の３群が有意に低下し、中でもＹ７豆乳発酵物群においてより低くなる傾向が見られた。Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ Ｉｎｄｅｘ（動脈硬化指数）は豆乳群（Ｐ＜０．０５）、Ｙ７豆乳発酵物群（Ｐ＜０．０１）が対照群に比べ有意に低く、さらにＹ７豆乳発酵物群は豆乳群に比べて低い傾向が見られた。ＶＬＤＬ＋ＬＤＬコレステロールは同程度まで低下したが、これは豆乳発酵物群においてＨＤＬコレステロールが高くなっていることが原因と考えられる。
【００５９】
【表５】
【００６０】
３）肝臓脂質（コレステロール量）の比較
結果を図１に示す。肝臓中のコレステロール値は、群間で有意な差はなかったものの、Ｙ７発酵物群及びＮＲＩＣ１６８８発酵物群の乳酸菌発酵豆乳群において、対照群及び豆乳群に比べ低い傾向が確認された。
【００６１】
４）糞便脂質（コレステロール量及び胆汁酸量）の比較
糞便中の胆汁酸量の結果を図２に示す。有意差検定には、Ｔｕｋｅｙの多重検定を使用した。糞便中の胆汁酸量は、対照群に比べ他の３群で有意に多かった。さらに、Ｙ７発酵物群は豆乳群に比べても有意（Ｐ＜０．０５）に多かった。糞便中のコレステロール量は対照群に比べ豆乳群、ＮＲＩＣ１６８８発酵物群で有意（Ｐ＜０．０５）に多かった。Ｙ７発酵物群は対照群と比べ増加傾向は見られたものの、豆乳群、ＮＲＩＣ１６８８発酵物群に比べ低い傾向であった。Ｙ７発酵物群は血清中、肝臓中のコレステロール量が他の群に比べて最も低かったが、コレステロール排泄量が豆乳群、ＮＲＩＣ１６８８発酵物群に比べ少ない傾向にあることから、Ｙ７株によるコレステロール資化の可能性が示唆された。
【００６２】
以上の結果から、Ｙ７発酵物を摂食することにより、糞便中の胆汁酸量が有意に増加し、血液中のコレステロール量が有意に低下し、また、肝臓中のコレステロール量が低下傾向を示すことが明らかとなった。
【実施例１０】
【００６３】
（抗原特異的ＩｇＥ量の上昇抑制効果試験）
マウスに対してＹ７株の連続強制経口投与を行い、Ｙ７株の抗原特異的ＩｇＥ量の上昇抑制効果を調べた。具体的には、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雄）にＯＶＡ感作を行ってアレルギーを誘導し、乳酸菌Ｙ７株の摂取が血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量、脾臓細胞のサイトカイン産生能に及ぼす影響を調べた。
（１）供試動物
５週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウス（雄）を、１週間の予備飼育後、試験に供した。予備飼育期間、試験飼育期間中はＭＦ固形飼料（オリエンタル酵母工業社製）を用いた。
その後、
１．対照群（投与なし、ＯＶＡ感作なし）
２．生理食塩水投与群（比較例、ＯＶＡ感作あり）
３．加熱Ｙ７株投与群（本発明、ＯＶＡ感作あり）
４．非加熱Ｙ７株投与群（本発明、ＯＶＡ感作あり）
の４群に分けた。
乳酸菌Ｙ７株を、ＭＲＳ（Ｄｉｆｃｏ社製）培養液で２４時間培養後、その一部を加熱菌体投与用として、生理食塩水にて２回洗浄後、１×１０９個／ｍｌとなるように調製し、１０分間煮沸した。一方、非加熱菌体投与用としては、乳酸菌培養液を生理食塩水にて２回洗浄後、生理食塩水にて２×１０８個／ｍｌとなるように調製した。それぞれをマウスに対し、０．２ｍｌ／日で、連続３５日間、強制経口投与した。
乳酸菌の強制投与初日を試験開始０日目として、０日目、１４日目、２８日目にＯＶＡ感作を行った。具体的には、１ｍｌ生理食塩水あたり、ＯＶＡ（シグマ社製、ＧｒａｄｅＶ）１００μｇ、水酸化アルミニウム（和光純薬工業社製）１０ｍｇを含有する溶液を調製し、これを、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、６週齢、試験開始０日目時点）の腹腔内に０．２ｍｌ投与した。試験開始３５日目にマウスを解剖して脾臓、血液を採取し、脾臓からのＩＦＮ−γ産生量、血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量、総ＩｇＥ量を測定した。
【００６４】
（２）血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量の測定
試験開始３５日目にマウスから採血を行い、１，５００ｒｐｍで３０分間遠心を行って血清を得た。この血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量を、エンザイムイムノアッセイにより測定した。具体的には、ＯＶＡ（シグマ社製、ＧｒａｄｅＶ）を５０μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）中に溶解し、９６穴プレートに５０μｌ／穴となるように入れ、コーティングを行った。洗浄後、緩衝液で１００倍希釈した血清サンプルを、プレート上に５０μｌずつ分注後、１時間インキュベートした。洗浄後、抗マウスＩｇＥ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を１％ＢＳＡ加０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液５００倍希釈した溶液と共に１時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加え、ビオチンと結合させた。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定した。無添加・感作なしの群に対する相対値としてＯＶＡ特異的ＩｇＥ量を定量化した。有意差検定（Ｔ検定）は、生理食塩水投与群に対して行った。
結果を図３に示す。対照群に対し、生理食塩水投与群では、ＯＶＡ感作により血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量が大きく上昇した。一方、加熱Ｙ７株投与群および非加熱Ｙ７株投与群においては、生理食塩水投与群に比べ、血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量の上昇程度が有意に低かった。すなわち、Ｙ７株の投与により、マウス血清中の抗原特異的ＩｇＥ量の上昇が有意に抑制された。
【００６５】
（３）血清中の総ＩｇＥ量の測定
試験開始０日目、１４日目の血清中の総ＩｇＥ量をエンザイムイムノアッセイにより測定した。詳しくは、抗マウスＩｇＥ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を１μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）に溶解し、９６穴プレートに５０μｌ／穴でコーティングした。その後、加熱Ｙ７株摂取群、非加熱Ｙ７株摂取群において、無添加群のマウスより採取した血清サンプルを１００倍希釈し、プレート上に５０μｌずつ分注後に、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、１％ＢＳＡ加０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液にて希釈した抗マウスＩｇＥ抗体溶液(Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、２μｇ／ｍｌの溶液となるよう調整)中で、室温で１時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液を用いて洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加えて、ビオチンと結合させた。その後、ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ 社製）を１穴当たり５０μｌ加え、室温で２０分間反応後に、０．５Ｎ塩酸を用いて反応を停止し、マイクロプレートリーダーによって吸光度４５０ｎｍを測定した。 検量線作成にはＭｏｕｓｅ ＩｇＥ，κ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いた。測定結果は試験開始０日目から３５日目の増加量で表した。生理食塩水投与群に対し、有意差検定（Ｔ検定）を行った。
結果を図４に示す。加熱Ｙ７株摂取群において無添加群に比べ有意に総ＩｇＥ量が低かった。また、非加熱Ｙ７株摂取群においては、無添加群に比べ総ＩｇＥ量の低下傾向が見られた。これらのことから、Ｙ７株の摂取により総ＩｇＥ量の上昇が抑制されたことが示された。
【００６６】
（４）脾臓細胞から産生されるＩＦＮ−γの測定
試験開始３５日目に脾臓を採取後、４００ユニット／ｍｌのタイプ１コラゲナーゼ（シグマ社製）含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ社製）で攪拌、細胞の懸濁を行い、脾臓細胞を回収した。その後、ＯＶＡ（シグマ社製、ＧｒａｄｅＶ）を１００μｇ／ｍｌ含む１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ）加ＲＰＭＩ１６４０培地において３日間培養を行った。培養後、１５００ｒｐｍで５分間遠心を行い、上清を回収し、エンザイムイムノアッセイによりＩＦＮ−γ濃度を測定した。詳しくは抗マウスＩＦＮ−γ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を２μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）に溶解し、９６穴プレートに５０μｌ／穴でコーティングした。その後、血清サンプルを１００倍希釈し、プレート上に５０μｌずつ分注し、１時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン標識抗マウスＩＦＮ−γ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を１％ＢＳＡ加０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液５００倍希釈した溶液で１時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加え、ビオチンと結合させた。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定し、リコンビナントマウスＩＦＮ−γ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で作成した標識曲線から、培養上清中のＩＦＮ−γの濃度を求めた。有意差検定（Ｔ検定）は生理食塩水投与群に対して行った。
結果を図５に示す。加熱Ｙ７株摂取群、非加熱Ｙ７株摂取群において、無添加群に比べ有意にＩＦＮ−γ産生量が増加した。このことから、Ｙ７株摂取によりＴｈ１免疫が増強され、血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量、総ＩｇＥ量の上昇が抑制されていることが示された。
【実施例１１】
【００６７】
（血清中総ＩｇＥ量上昇抑制効果試験及び腸管でのＩｇＡ分泌促進作用試験）
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雄）に１日当たり２×１０８個の非加熱Ｙ７株、加熱Ｙ７株を１４日間連続強制経口投与し、血清中総ＩｇＥ量、腸管でのＩｇＡ分泌促進作用を反映する糞便中のＩｇＡ量を調べた。一方、無添加群には生理食塩水を投与した。
【００６８】
（１）血清中総ＩｇＥ量の測定
実施例１０に記載の方法と同様に、試験開始０日目、１４日目の血清中の総ＩｇＥ量をエンザイムイムノアッセイにより測定した。有意差検定は、Ｔｕｋｅｙの多重検定により行った。
結果を図６に示す。非加熱Ｙ７株摂取群における総ＩｇＥの増加量は、無添加群に比べ有意に抑制された。一方、加熱Ｙ７株摂取群においては、無添加群に比べて総ＩｇＥの増加量が低い傾向が見られたものの、その抑制の度合は非加熱Ｙ７株摂取群ほどではなかった。このことから、Ｙ７株の摂取による総ＩｇＥの増加抑制効果は、加熱された状態（死菌）で摂取するよりも非加熱の状態（生菌）で摂取する方が、その効果が強いことが示された。
【００６９】
（２）糞便中ＩｇＡ量の測定
感染防御作用の指標として、試験開始０日目、１４日目の糞便中の総ＩｇＡ量をエンザイムイムノアッセイにより測定した。詳しくは、糞便１００ｍｇに対し１ｍｌの割合でＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ社製）含有ＰＢＳ溶液を添加し、懸濁後、１２，０００ｒｐｍで遠心分離を行い、上清を抽出サンプルとした。抗マウスＩｇＡ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を０．５μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）に溶解し、９６穴プレートに1穴あたり５０μｌずつをコーティングした。その後、抽出サンプルを１０，０００倍希釈し、プレート上に５０μｌずつ分注し、１時間インキュベートした。洗浄後、抗マウスＩｇＡ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製）を１％ＢＳＡ加０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液にて２０，０００倍希釈した溶液と共に１時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加え、ビオチンと結合させた。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１穴当たり５０μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止後に、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定した。検量線作成にはＭｏｕｓｅ ＩｇＡ（ＢＥＴＨＹＬ社製）を用いた。測定結果は試験開始０日目から１４日目の増加量で表した。有意差検定は、Ｔｕｋｅｙの多重検定により行った
。
【００７０】
結果を図７に示す。非加熱Ｙ７株摂取群における糞便中総ＩｇＡの増加量は、無添加群に比べ有意に高かった。一方、加熱Ｙ７株摂取群においては、無添加群に比べて総ＩｇＡの増加量がやや高い数値が得られたものの、有意な上昇は見られなかった。このことから、Ｙ７株の摂取による腸管でのＩｇＡ分泌促進作用は、加熱された状態（死菌）で摂取するよりも非加熱の状態（生菌）で摂取する方が、その効果が強いことが示された。
【実施例１２】
【００７１】
（へアレスマウスにおける肌水分保持作用効果試験）
へアレスマウスの皮膚にアセトン処理を施し、肌水分量を低下させる試験系を用いて、Ｙ７株摂取による肌水分保持作用における効果を試験した。
（１）材料と方法
５週齢の雌性へアレスマウスＨＯＳ：ＨＲ−１（日本エスエルシー社より購入）１４匹を、体重の分布が同程度になるよう２群に分けた。１週間の馴化を行った後、１群にはコントロール食（ラボＭＲストック、日本農産社製）を、２群には５％豆乳発酵物含有食（Ｙ７株を生菌として５×１０７個／ｇ含有するラボＭＲストック）を自由に与えた。飲料水は両群共に自由に与えた。試験食を７週間摂取させた後、アセトン塗布処理を施し、人為的に乾燥肌を形成させた。具体的なアセトン塗布処理は、アセトンを含有させた脱脂綿を１回につき５秒間皮膚に接触させ、これを５回繰り返す事を１セットとし、朝夕１セットずつ３日間、計６セット実施した。アセトン処理は、マウス片体側部にのみ実施し、反対側の体側部は無処理部分とした。
【００７２】
（２）評価
アセトン塗布処理を終えた翌日に、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（ｃｏｕｒａｇｅ−ｋｈａｚａｋａ社製）を用いて肌水分値を測定した。肌水分値は個体差が比較的大きいため、前述の無処理部分とアセトン塗布処理部分での肌水分値を測定した。有意差検定は、Ｔ検定により行った。
図８に示すように、アセトン塗布部においてはいずれの群においても、無処理部に比べて肌水分値が低下した。しかし、コントロール食を摂取させた１群に比べて、Ｙ７株を摂取した２群においては、アセトン塗布部の肌水分値が有為に高かった。すなわち、Ｙ７株豆乳発酵物の経口摂取により、皮膚への刺激に対する抵抗性が増し、肌水分が保持されたことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】対照群、豆乳群、Ｙ７豆乳発酵物群、１６８８豆乳発酵物群における肝臓中コレステロール量（ｍｇ／ｇ）を示す図である。
【図２】対照群、豆乳群、Ｙ７豆乳発酵物群、１６８８豆乳発酵物群における糞便中の胆汁酸量（ｍｇ／ｄａｙ）を示す図である。（＊Ｐ＜０．０５ ＊＊Ｐ＜０．０１）
【図３】Ｙ７菌体投与なし群、およびＹ７菌体投与群における血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量の測定結果を示す図である。（＊Ｐ＜０．０５）
【図４】Ｙ７菌体投与なし群、およびＹ７菌体投与群における血清中総ＩｇＥ量の測定結果を示す図である。（＊Ｐ＜０．０５）
【図５】Ｙ７菌体投与なし群、およびＹ７菌体投与群における脾臓細胞からのＩＦＮ−γ産生量の測定結果を示す図である。（＊Ｐ＜０．０５）
【図６】Ｙ７菌体投与なし群、およびＹ７菌体投与群における血清中総ＩｇＥ量の測定結果を示す図である。（＊Ｐ＜０．０５）
【図７】Ｙ７菌体投与なし群、およびＹ７菌体投与群における糞便中ＩｇＡ量の測定結果を示す図である。（＊Ｐ＜０．０５）
【図８】Ｙ７菌体投与なし群、およびＹ７菌体投与群における肌水分値の測定結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃酸耐性が９０％以上、胆汁酸耐性が９０％以上、コレステロール除去能が８５％以上、胆汁酸吸着能が４０％以上、及びインターロイキン１２産生誘導能が８０％以上であることを特徴とする、ラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌。
【請求項２】
乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラムＦＥＲＭ Ｐ−２１３４９株である、請求項１に記載の乳酸菌。
【請求項３】
豆乳に請求項１〜２記載の乳酸菌を添加し、発酵させて得られる乳酸発酵物。
【請求項４】
請求項３記載の乳酸発酵物を含有する乳酸発酵物含有飲食品。
【請求項５】
豆乳に請求項１〜２記載の乳酸菌を添加し、発酵させることを特徴とする、乳酸発酵物の製造方法。
【請求項１】
胃酸耐性が９０％以上、胆汁酸耐性が９０％以上、コレステロール除去能が８５％以上、胆汁酸吸着能が４０％以上、及びインターロイキン１２産生誘導能が８０％以上であることを特徴とする、ラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌。
【請求項２】
乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラムＦＥＲＭ Ｐ−２１３４９株である、請求項１に記載の乳酸菌。
【請求項３】
豆乳に請求項１〜２記載の乳酸菌を添加し、発酵させて得られる乳酸発酵物。
【請求項４】
請求項３記載の乳酸発酵物を含有する乳酸発酵物含有飲食品。
【請求項５】
豆乳に請求項１〜２記載の乳酸菌を添加し、発酵させることを特徴とする、乳酸発酵物の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−８２１２７（Ｐ２００９−８２１２７Ａ）
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１７５２０８（Ｐ２００８−１７５２０８）
【出願日】平成２０年７月４日（２００８．７．４）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月４日（２００８．７．４）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【Ｆターム（参考）】
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