新規な標的核酸の増幅キット
【課題】試薬調製を含めた標的核酸分析の所要時間を短縮するために、改良された標的核酸の増幅および検出キットを提供する。
【解決手段】分析項目特異的な成分であるオリゴヌクレオチドプライマーを含む標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一部、もしくは全ての成分があらかじめ固体状態である固体状態の試薬と、該固体状態の試薬を溶解することで標的核酸の増幅が開始される試薬構成となる組成である液体状態の試薬を標的核酸の増幅および検出キットとして提供する。これにより、実験者が標的核酸の増幅試薬の調製に要する時間が短縮し、分析結果を得るまでの所要時間が短縮した。
【解決手段】分析項目特異的な成分であるオリゴヌクレオチドプライマーを含む標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一部、もしくは全ての成分があらかじめ固体状態である固体状態の試薬と、該固体状態の試薬を溶解することで標的核酸の増幅が開始される試薬構成となる組成である液体状態の試薬を標的核酸の増幅および検出キットとして提供する。これにより、実験者が標的核酸の増幅試薬の調製に要する時間が短縮し、分析結果を得るまでの所要時間が短縮した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野に属するものであり、特定塩基配列を含む標的核酸の増幅試薬に関するものである。本発明は遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用であり、さらには、食品中、室内、土壌中、河川中、海洋中等の環境中の微生物の定性又は定量を行う際に有用である。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、感染症の遺伝子診断では、臨床試料中の標的核酸（ウィルスや微生物由来）が極微量なことが多いため、高感度かつ良好な再現性の測定を実現するために、信号強度を向上し高感度化する目的で、標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を増幅する方法がとられる。
【０００３】
標的ＤＮＡを増幅する方法として、ポリメレースチェーンリアクション（ＰＣＲ）法が知られている。標的ＲＮＡの増幅法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法（特許文献１および２、非特許文献１および２参照）、３ＳＲ法（特許文献３、非特許文献３参照）、ＴＲＣ法（特許文献４、非特許文献４参照）などが知られている。ＲＴ−ＰＣＲは基本的に逆転写（ＲＴ）とＰＣＲの独立した２段階の工程が必要であり、一方、ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法、およびＴＲＣ法では、ＲＮＡ増幅産物の方向性および増幅機構に若干の違いがあるものの、概ね以下に示した一段階のＲＮＡ増幅反応だと言える。
【０００４】
一段階のＲＮＡ増幅反応は、まず標的ＲＮＡを鋳型とし、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素、及びリボヌクレエースＨにより、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡが合成され、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメレースにより標的ＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。このようなＲＮＡの増幅法は、一定温度、一段階での増幅反応であるため、自動化へ適用が容易であり、臨床現場での遺伝子診断法として有用性が非常に高い。また、比較的迅速な標的核酸増幅反応であるため、緊急度の高い検査への対応が期待されている。
【０００５】
市販されている、標的核酸の増幅を実施するための検査キットには、標的核酸増幅の原料となるモノヌクレオチド（ＮＴＰやｄＮＴＰ、およびＩＴＰなど）やオリゴヌクレオチド（プライマーなど）、標的核酸増幅に必要な無機塩類、および逆転写酵素、ＤＮＡポリメレースやＲＮＡポリメレースなどの酵素類、さらに、増幅反応を最適化するために添加される物質（例えばジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、ソルビトールなど）が適当に小分けされた状態で構成されている。
【０００６】
たとえば株式会社カイノスから発売されているＮＡＳＢＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットにおいては、測定者が準備する２種類のプライマーをトリス緩衝液とＤＭＳＯからなるＮＡＳＢＡ溶解液に添加し、固体状態のＮＡＳＢＡ試薬（ｄＮＴＰ、ＮＴＰ）を溶解し、標的ＲＮＡの有無を測定する試料数と同数の反応容器へ分注する。次に、各反応容器へサンプルを添加し、所定の温度条件下でインキュベートする。その間、固体状態のＮＡＳＢＡ酵素試薬をヌクレエースフリー水に溶解し、溶解した酵素溶液を各反応容器へ添加する。以上の操作をもって、ＲＮＡ増幅が開始される。
【０００７】
一方、東ソー株式会社から発売されているＴＲＣ遺伝子検査システムの試薬キットは、基質試薬とプライマー試薬を適当量混合し試薬ミックスを調整し、調整した試薬ミックスを標的ＲＮＡの有無を測定する試料数と同数の反応容器に分注し、各反応容器へサンプルを添加後、所定温度条件下でインキュベートする。最後に、反応容器と共に所定温度条件下でインキュベートした酵素試薬を、該反応容器へ一定量ずつ添加する。以上の操作をもって、ＲＮＡ増幅が開始される。
【０００８】
【特許文献１】特許第３２４１７１７号
【特許文献２】特許第２６５０１５９号
【特許文献３】特許第３１５２９２７号
【特許文献４】特開２０００−１４４００号公報
【非特許文献１】Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｊ． Ｎａｔｕｒｅ（１９９１） Ｍａｒ ７；３５０（６３１３）：９１−２
【非特許文献２】Ｒｏｍａｎｏ Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．（１９９６） Ｍａｒ；１６（１）：８９−１０３
【非特許文献３】Ｇｕａｔｅｌｌｉ Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９９０） Ｍａｒ；８７（５）：１８７４−８
【非特許文献４】Ｉｓｈｉｇｒｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００３） ３１４ ：７７−８６
【非特許文献５】Ｓｏｎｇ Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．（１９８７）Ａｕｇ ３１；２２１（１）：１６７−７１
【非特許文献６】Ｓｃｈｍｉｔ Ｃ．Ｋ．ｅｔ ａｌ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ（１９９１）５９：１０６５−１０７３
【非特許文献７】Ｉｓｈｉｇｒｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９９６）２４（２４）：４９９２−４９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
実際に核酸増幅を実施する際には、核酸増幅に至るまでの試薬の調製にある程度の時間を要する。また、精度の高いピペットを用い微量の試薬を正確に測り取ることが必要であり、ある程度の熟練が必要な操作を要求する。たとえば上記した市販されている標的核酸の検査キットにおいては、測定する試料数が多くなるほどに、試薬ミックスの分注やサンプルの添加、および酵素試薬の添加の所要時間が増大し、ＲＮＡ増幅反応の開始に至るまでの所要時間が長くなるという問題がある。
【００１０】
実際に１０個の試料を測定するためのＲＮＡ増幅試薬の調製には、熟練度と準備の差異に依存するものの、概ね２０分から３０分程度の時間を要する。ＲＮＡ増幅反応自体は比較的迅速な反応であるため、増幅に要する時間は早い場合３０分程度であるが、試薬の調製に同等の時間を要するため、全体としての検査所要時間は早くとも１時間程度である。
【００１１】
検査開始から結果の判定までの時間が制約されている場合、特に、手術開始後に患者の検査の必要性が生じた場合には、検査所要時間は短いほど好ましい。そのため、増幅試薬の調製が従来よりも容易で、かつ迅速な検査が可能となる標的核酸の増幅キットの登場が望まれている。
【００１２】
また、検査所要時間の短縮を目的に、核酸増幅試薬をあらかじめ用意しておき、検査の必要性が生じた場合に使用することが考えられるが、必要性がなかった場合は高価な試薬類が無駄となり、また、保険の浪費に繋がり好ましくない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、試料中の標的核酸と、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一部が１つの容器に固体状態で入っている固体状態の試薬と、標的核酸の増幅に必要な残りの試薬成分が１つの容器に液体状態で入っている液体状態の試薬とを混合することで固体状態の試薬が溶解して標的核酸の増幅反応を実施することで、核酸増幅試薬の調製にかかる時間を大幅に短縮可能であることを見出した。これにより、緊急度の高い検査においても迅速に結果の判定が可能となり、臨床現場におけるＲＮＡ増幅反応の有用性が向上した。
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、さらなる迅速性や簡便性が要求されている核酸検査における、標的核酸の増幅試薬の調製に要する時間を短縮させることが可能な試薬構成である標的核酸の増幅キットに関するものであり、核酸増幅反応の種類に特に限定されない。たとえばＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法、または３ＳＲ法などが例示できる。これらの核酸増幅法の中でも、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法および３ＳＲ法については増幅反応の開始から一定温度であり、増幅反応の初期に高温にする必要がないため、高温で活性が低下するような酵素を後から添加する必要がなく、本発明に適した増幅反応である。
【００１６】
本発明の試料は特に限定されないが、臨床診断分野における感染症や病態の検査に本発明を使用する場合には、血液、血清、血漿、組織、その他の体液などの検体が例示できる。また、食品中、室内、土壌中、河川中、海洋中などからの抽出物を試料とすることで、環境中のウイルスや微生物の定性又は定量に本発明を使用することも可能である。
【００１７】
本発明の標的核酸の増幅に必要な試薬成分とは、増幅反応の基質となるモノヌクレオチド（ｄＮＴＰ、ＮＴＰおよびＩＴＰなど）を含む基質試薬、標的核酸またはその相補鎖の配列に相補的結合が可能な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーやオリゴヌクレオチドプローブなどを含むプライマー試薬および増幅反応の触媒となる逆転写酵素、ＤＮＡポリメレース、ＲＮＡポリメレースやその他の酵素（リボヌクレースＨなど）を含む酵素試薬からなる。また、基質試薬、プライマー試薬および酵素試薬にはそれぞれ、核酸増幅反応を最適化するためや試薬の安定性を高めるため、増幅産物の検出をするためなどのその他の試薬（各種無機塩類、ＤＭＳＯ、ソルビトール、インヒビター、ＤＴＴ、検出プローブなど）が含まれていても良い。この標的核酸の増幅に必要な試薬成分を構成する固体状態の試薬および液体状態の試薬と、試料中の標的核酸を混合することで、増幅反応が開始される。
【００１８】
本発明の固体状態の試薬の成分は、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一部または全部を含んでいても良く、含まれる試薬の種類や数には限定されない。したがってたとえば、基質試薬の一部を固体状態の試薬とし、残りの一部を液体状態の試薬として容器に入れていても良い。また各試薬成分は液体状態の試薬および固体状態の試薬の両方に含まれていても良く、特にその他の試薬のうち、試薬の安定性を向上させるという目的のために添加されているものに関しては、液体状態の試薬および固体状態の試薬の両方に含まれることで効果的となることもある。また好ましい態様としては、検査項目に特異的な成分の全部を、固体状態の試薬に含ませておくことにより、試薬の取り違えによる誤診の可能性の低減が期待される。たとえば、検査項目に特異的であるプライマー試薬を、固体状態の試薬に含ませておくことで、測定する試料と固体状態の試薬を正しく組み合わせれば、液体状態の試薬は検査項目に依存せず広く使用できる試薬とすることが可能な場合、試薬の取り違えの可能性が低減することとなる。また、液体状態の試薬についてはその保存性から冷凍保存（−２０℃以下）が望ましいが、試薬を固体状態にすることで常温保存が可能となる。したがって、凍結融解により安定性が損なわれる試薬成分が含まれる場合は、その試薬成分を固体状態の試薬とすることが好ましい。
【００１９】
本発明の固体状態の試薬は常温で固体であり、液体状態の試薬は常温で液体であることを特徴とする。また固体状態の試薬における固体化の方法は特に限定されないが、液体状態の試薬と混合されることで迅速に溶解することが好適であるため、試薬成分が風乾、真空乾燥または凍結乾燥したものであることが好ましい。さらに試薬の固体化を反応容器中で行うことで、反応容器に固体状態の試薬が密着し、実験者の操作をより簡便とすることが可能となる。一方、試薬成分に増粘剤などを添加したり圧縮したりすることで錠剤とすることも例示できる。なお、固体化により酵素試薬の活性が低下するような場合には、酵素試薬を液体状態の試薬とすることが例示できる。
【００２０】
本発明の標的核酸の増幅キットまたは標的核酸の検出キットは、実験者が試薬調製に要する時間を減少させる目的では、必要量の固体状態の試薬があらかじめ反応容器に入った状態のキットであることが好ましく、そのためにキットの製造過程において反応容器に固体状態の試薬の原料を分注後、適当な方法で固体状態とすることとなる。また、固体状態の試薬があらかじめ反応容器に入っていなくても、各反応容器に速やかに入れられるような固体状態、例えば、錠剤のように固体状態の試薬が個別包装された形態で提供することによっても、実験者の試薬調製の所要時間を短縮する効果がある。
【００２１】
一方、本発明の液体状態の試薬は、基本的には固体状態の試薬と補完的であり、液体状態の試薬および固体状態の試薬と、試料中の標的核酸が混合されることにより標的核酸増幅が開始されうる成分を含むものである。たとえば、固体状態の試薬に標的核酸の増幅に必要な成分の全部が含まれている場合、液体状態の試薬は必要なく、実験者が標的核酸を含む試料または適宜希釈して調製した試料を固体状態の試薬と混合し、標的核酸の増幅反応を開始することとなる。したがって、固体状態の試薬に標的核酸の増幅に必要な成分の全部が含まれている場合は、固体状態の試薬のみで本発明の増幅キットを構成することもできるし、固体状態の試薬および試料希釈用の希釈液から構成することもできる。また、固体状態の試薬がプライマー試薬のみからなる場合、液体状態の試薬の成分は酵素試薬、基質試薬およびその他の試薬から構成され、実験者は試料を液体状態の試薬と混合した後に固体状態の試薬と混合することで固体状態の試薬を溶解させたり、または、試料で固体状態の試薬を溶解後、液体状態の試薬と混合するなどの方法を行うこととなる。
【００２２】
さらに、本発明は、標的核酸の増幅に伴い蛍光特性が変化するように設計された検出プローブを固体状態の試薬または液体状態の試薬のどちらか一方、または両方にあらかじめ添加しておくことにより、標的核酸増幅のリアルタイムな測定が可能となるため、検査結果を迅速に得る目的としては非常に有効である。使用する検出プローブは特に限定はされないが、標的核酸の増幅産物と相補的２本鎖を形成可能な核酸プローブとインターカレーター性蛍光色素、もしくは、インターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブで、かつ標的核酸と形成した相補的２本鎖部分に前記インターカレーター性蛍光色素部分がインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブを例示することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、標的核酸の増幅反応のための試薬の調製方法が簡便化され、試薬調製を含めた分析所要時間を短縮することが可能となった。それにより、迅速性が要求される場面における標的核酸の増幅反応の有用性が向上した。さらに、プライマー試薬のような分析項目特異的な成分を、あらかじめ固体状態で反応容器に入れておくことにより、操作が簡便化され実験者による実験誤差の発生を最小限に抑えることが可能である標的核酸の増幅キットおよび標的核酸の検出キットを提供した。
【００２４】
また、本発明では標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一方を固体状態にすることで、凍結融解を繰り返すことで不安定となる試薬を安定して保存することが可能となった。また、固体状態の試薬は常温保存が可能となり、輸送や保存の際にも取り扱いが容易となる。さらに固体状態の試薬は錠剤として使用したり反応容器に密着させて使用したりすることができるため、実験者の操作性をより簡便にし、さらなる分析所要時間の短縮に貢献している。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
実施例１ 固体状態の試薬を用いたＴＲＣ反応における検査所要時間の評価
（１）使用した標準ＲＮＡは、ｍｅｃＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の細胞壁合成酵素ＰＢＰ２’遺伝子配列（非特許文献５参照）を含む２１８３塩基のＲＮＡ）、およびＶＴ２（大腸菌Ｏ−１５７のベロ毒素２型遺伝子配列（非特許文献６参照）を含む１３６１塩基のＲＮＡ）である。これらの配列の標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で１０００コピー／５μｌになるように調製しＲＮＡ試料とした。
【００２７】
（２）本実施例中に記載されているオリゴヌクレオチドの塩基配列は以下の通りである。第一のオリゴヌクレオチド（Ｔ７ＲＮＡポリメレース・プロモーター配列含有センスプライマー）
ｍｅｃＡ用：配列表の配列番号１に記載のもの
ＶＴ２用：配列表の配列番号２に記載のもの
第二のオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）
ｍｅｃＡ用：配列表の配列番号３に記載のもの
ＶＴ２用：配列表の配列番号４に記載のもの
第三のオリゴヌクレオチド（３’末端をアミノ基修飾）
ｍｅｃＡ用：配列表の配列番号５に記載のもの
ＶＴ２用：配列表の配列番号６に記載のもの
第四のオリゴヌクレオチド（増幅ＲＮＡ検出用インターカレーター標識プローブ（プローブの構造は非特許文献７に従った））
ｍｅｃＡ用：配列表の配列番号７に記載の配列中の５’末端から６番目の塩基（Ｇ）と７番目の塩基（Ａ）の間のリン原子に、インターカレーター性蛍光色素としてオキサゾールイエローを標識したもの
ＶＴ２用：配列表の配列番号８に記載の配列中の５’末端から１２番目の塩基（Ｔ）と１３番目の塩基（Ａ）の間のリン原子に、インターカレーター性蛍光色素としてオキサゾールイエローを標識したもの
（３）以下の組成のｍｅｃＡ、ＶＴ２増幅用試薬溶液それぞれ５μｌを、０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に１０本づつ分注し、該ＰＣＲチューブごと凍結乾燥して固体状態の試薬を調製した。
【００２８】
固体状態試薬の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
１．０μＭの第一のオリゴヌクレオチド
１．０μＭの第二のオリゴヌクレオチド
０．１６μＭの第三のオリゴヌクレオチド
２５ｎＭの第四のオリゴヌクレオチド
（４）以下の組成のｍｅｃＡ、ＶＴ２増幅用試薬溶液それぞれ２８０μｌを、０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に１本づつ分注し、液体状態試薬を調製した。
【００２９】
液体状態試薬の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
【００３０】
【表１】
３で調製した固体状態の試薬と４で調製した液体状態の試薬で構成した試薬のセットを、本発明における簡易型ＲＮＡ検査キット（図１）として使用する。
【００３１】
（５）以下の組成のｍｅｃＡ、ＶＴ２増幅用試薬溶液それぞれ１１０μｌを、０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に１本づつ分注し、基質試薬を調製した。
【００３２】
基質試薬の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
【００３３】
【表２】
（６）以下の組成のｍｅｃＡ、ＶＴ２増幅用試薬溶液それぞれ１１０μｌを、０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に１本づつ分注し、プライマー試薬を調製した。
【００３４】
プライマー試薬の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
【００３５】
【表３】
（７）以下の組成のｍｅｃＡ、ＶＴ２増幅用試薬溶液それぞれ６０μｌを、０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に１本づつ分注し、酵素試薬を調製した。
【００３６】
酵素試薬の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
【００３７】
【表４】
５、６、７で調製した試薬のセットを、従来型ＲＮＡ検査キット（図２）として使用する。
【００３８】
（８）簡易型ＲＮＡ検査キットのｍｅｃＡ増幅用固体状態試薬が入った１０本のＰＣＲチューブに、ｍｅｃＡ標準ＲＮＡをそれぞれ５μｌづつ添加し、ｍｅｃＡ増幅用液体状態試薬が入ったＰＣＲチューブと共に４４℃で５分間保温後、液体状態試薬の２５μｌを標準ＲＮＡが添加された固体状態試薬のＰＣＲチューブにそれぞれ分注した。同様の操作を、ＶＴ２においても実施した。
【００３９】
（９）引き続きＰＣＲチューブを４４℃で保温しながら、蛍光強度の変化をモニターした。
【００４０】
（１０）従来型ＲＮＡ検査キットのｍｅｃＡ増幅用の基質試薬とプライマー試薬を、それぞれ１０５μｌづつ量り取り、混合して２１０μｌの試薬ミックスを調製し、０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブの１０本に２０μｌづつ分注した。該ＰＣＲチューブのそれぞれに、ｍｅｃＡ標準ＲＮＡの５μｌを添加した。同様の操作を、ＶＴ２においても実施した。
【００４１】
（１１）１０で調製した２５μｌの試薬が入ったＰＣＲチューブと、ｍｅｃＡ増幅用の酵素試薬５５μｌを４４℃で５分間保温後、酵素試薬の５μｌをそれぞれのＰＣＲチューブに分注した。同様の操作を、ＶＴ２においても実施した。
【００４２】
（１２）引き続きＰＣＲチューブを４４℃で保温しながら、蛍光強度の変化をモニターした。
【００４３】
１から７までは、ＲＮＡ検査キット製造者が行う作業を示し、８以降は現場で実験者が行うＲＮＡ検査のモデルである。実験者がｍｅｃＡ（図３）、ＶＴ２（図４）、それぞれ１０本分の試薬を調製するのに要した時間は、簡易型ＲＮＡ検査キットでは１５分程度であるのに対し、従来型ＲＮＡ検査キットでは３０分を要した。ＲＮＡの増幅効率を反映する蛍光強度の立ち上がり時間を比較した結果、どちらのキットを使用してもほぼ同じ時間（ｍｅｃＡ：１５分、ＶＴ２：３０分）であった。以上のことから、本発明の簡易型ＲＮＡ検査キットによって、試薬調製を含めたＲＮＡ検査の所要時間が最大三分の二に短縮された。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明における簡易型ＲＮＡ検査キットの試薬構成と操作手順を示したものである。
【図２】従来型ＲＮＡ検査キット（ＴＲＣ検査キット）の試薬構成と操作手順を示したものである。
【図３】ｍｅｃＡを標的核酸としたＲＮＡ増幅反応の実施における、ＲＮＡ増幅用試薬の調製開始から結果の判定までの所要時間を示したものである。本発明におけるＲＮＡ検査キットを使用することにより、結果の判定までの所要時間が短縮されたことが示されている。
【図４】ＶＴ２を標的核酸としたＲＮＡ増幅反応の実施における、ＲＮＡ増幅用試薬の調製開始から結果の判定までの所要時間を示したものである。本発明におけるＲＮＡ検査キットを使用することにより、結果の判定までの所要時間が短縮されたことが示されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野に属するものであり、特定塩基配列を含む標的核酸の増幅試薬に関するものである。本発明は遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用であり、さらには、食品中、室内、土壌中、河川中、海洋中等の環境中の微生物の定性又は定量を行う際に有用である。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、感染症の遺伝子診断では、臨床試料中の標的核酸（ウィルスや微生物由来）が極微量なことが多いため、高感度かつ良好な再現性の測定を実現するために、信号強度を向上し高感度化する目的で、標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を増幅する方法がとられる。
【０００３】
標的ＤＮＡを増幅する方法として、ポリメレースチェーンリアクション（ＰＣＲ）法が知られている。標的ＲＮＡの増幅法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法（特許文献１および２、非特許文献１および２参照）、３ＳＲ法（特許文献３、非特許文献３参照）、ＴＲＣ法（特許文献４、非特許文献４参照）などが知られている。ＲＴ−ＰＣＲは基本的に逆転写（ＲＴ）とＰＣＲの独立した２段階の工程が必要であり、一方、ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法、およびＴＲＣ法では、ＲＮＡ増幅産物の方向性および増幅機構に若干の違いがあるものの、概ね以下に示した一段階のＲＮＡ増幅反応だと言える。
【０００４】
一段階のＲＮＡ増幅反応は、まず標的ＲＮＡを鋳型とし、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素、及びリボヌクレエースＨにより、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡが合成され、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメレースにより標的ＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。このようなＲＮＡの増幅法は、一定温度、一段階での増幅反応であるため、自動化へ適用が容易であり、臨床現場での遺伝子診断法として有用性が非常に高い。また、比較的迅速な標的核酸増幅反応であるため、緊急度の高い検査への対応が期待されている。
【０００５】
市販されている、標的核酸の増幅を実施するための検査キットには、標的核酸増幅の原料となるモノヌクレオチド（ＮＴＰやｄＮＴＰ、およびＩＴＰなど）やオリゴヌクレオチド（プライマーなど）、標的核酸増幅に必要な無機塩類、および逆転写酵素、ＤＮＡポリメレースやＲＮＡポリメレースなどの酵素類、さらに、増幅反応を最適化するために添加される物質（例えばジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、ソルビトールなど）が適当に小分けされた状態で構成されている。
【０００６】
たとえば株式会社カイノスから発売されているＮＡＳＢＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットにおいては、測定者が準備する２種類のプライマーをトリス緩衝液とＤＭＳＯからなるＮＡＳＢＡ溶解液に添加し、固体状態のＮＡＳＢＡ試薬（ｄＮＴＰ、ＮＴＰ）を溶解し、標的ＲＮＡの有無を測定する試料数と同数の反応容器へ分注する。次に、各反応容器へサンプルを添加し、所定の温度条件下でインキュベートする。その間、固体状態のＮＡＳＢＡ酵素試薬をヌクレエースフリー水に溶解し、溶解した酵素溶液を各反応容器へ添加する。以上の操作をもって、ＲＮＡ増幅が開始される。
【０００７】
一方、東ソー株式会社から発売されているＴＲＣ遺伝子検査システムの試薬キットは、基質試薬とプライマー試薬を適当量混合し試薬ミックスを調整し、調整した試薬ミックスを標的ＲＮＡの有無を測定する試料数と同数の反応容器に分注し、各反応容器へサンプルを添加後、所定温度条件下でインキュベートする。最後に、反応容器と共に所定温度条件下でインキュベートした酵素試薬を、該反応容器へ一定量ずつ添加する。以上の操作をもって、ＲＮＡ増幅が開始される。
【０００８】
【特許文献１】特許第３２４１７１７号
【特許文献２】特許第２６５０１５９号
【特許文献３】特許第３１５２９２７号
【特許文献４】特開２０００−１４４００号公報
【非特許文献１】Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｊ． Ｎａｔｕｒｅ（１９９１） Ｍａｒ ７；３５０（６３１３）：９１−２
【非特許文献２】Ｒｏｍａｎｏ Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．（１９９６） Ｍａｒ；１６（１）：８９−１０３
【非特許文献３】Ｇｕａｔｅｌｌｉ Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９９０） Ｍａｒ；８７（５）：１８７４−８
【非特許文献４】Ｉｓｈｉｇｒｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００３） ３１４ ：７７−８６
【非特許文献５】Ｓｏｎｇ Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．（１９８７）Ａｕｇ ３１；２２１（１）：１６７−７１
【非特許文献６】Ｓｃｈｍｉｔ Ｃ．Ｋ．ｅｔ ａｌ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ（１９９１）５９：１０６５−１０７３
【非特許文献７】Ｉｓｈｉｇｒｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９９６）２４（２４）：４９９２−４９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
実際に核酸増幅を実施する際には、核酸増幅に至るまでの試薬の調製にある程度の時間を要する。また、精度の高いピペットを用い微量の試薬を正確に測り取ることが必要であり、ある程度の熟練が必要な操作を要求する。たとえば上記した市販されている標的核酸の検査キットにおいては、測定する試料数が多くなるほどに、試薬ミックスの分注やサンプルの添加、および酵素試薬の添加の所要時間が増大し、ＲＮＡ増幅反応の開始に至るまでの所要時間が長くなるという問題がある。
【００１０】
実際に１０個の試料を測定するためのＲＮＡ増幅試薬の調製には、熟練度と準備の差異に依存するものの、概ね２０分から３０分程度の時間を要する。ＲＮＡ増幅反応自体は比較的迅速な反応であるため、増幅に要する時間は早い場合３０分程度であるが、試薬の調製に同等の時間を要するため、全体としての検査所要時間は早くとも１時間程度である。
【００１１】
検査開始から結果の判定までの時間が制約されている場合、特に、手術開始後に患者の検査の必要性が生じた場合には、検査所要時間は短いほど好ましい。そのため、増幅試薬の調製が従来よりも容易で、かつ迅速な検査が可能となる標的核酸の増幅キットの登場が望まれている。
【００１２】
また、検査所要時間の短縮を目的に、核酸増幅試薬をあらかじめ用意しておき、検査の必要性が生じた場合に使用することが考えられるが、必要性がなかった場合は高価な試薬類が無駄となり、また、保険の浪費に繋がり好ましくない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、試料中の標的核酸と、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一部が１つの容器に固体状態で入っている固体状態の試薬と、標的核酸の増幅に必要な残りの試薬成分が１つの容器に液体状態で入っている液体状態の試薬とを混合することで固体状態の試薬が溶解して標的核酸の増幅反応を実施することで、核酸増幅試薬の調製にかかる時間を大幅に短縮可能であることを見出した。これにより、緊急度の高い検査においても迅速に結果の判定が可能となり、臨床現場におけるＲＮＡ増幅反応の有用性が向上した。
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、さらなる迅速性や簡便性が要求されている核酸検査における、標的核酸の増幅試薬の調製に要する時間を短縮させることが可能な試薬構成である標的核酸の増幅キットに関するものであり、核酸増幅反応の種類に特に限定されない。たとえばＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法、または３ＳＲ法などが例示できる。これらの核酸増幅法の中でも、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法および３ＳＲ法については増幅反応の開始から一定温度であり、増幅反応の初期に高温にする必要がないため、高温で活性が低下するような酵素を後から添加する必要がなく、本発明に適した増幅反応である。
【００１６】
本発明の試料は特に限定されないが、臨床診断分野における感染症や病態の検査に本発明を使用する場合には、血液、血清、血漿、組織、その他の体液などの検体が例示できる。また、食品中、室内、土壌中、河川中、海洋中などからの抽出物を試料とすることで、環境中のウイルスや微生物の定性又は定量に本発明を使用することも可能である。
【００１７】
本発明の標的核酸の増幅に必要な試薬成分とは、増幅反応の基質となるモノヌクレオチド（ｄＮＴＰ、ＮＴＰおよびＩＴＰなど）を含む基質試薬、標的核酸またはその相補鎖の配列に相補的結合が可能な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーやオリゴヌクレオチドプローブなどを含むプライマー試薬および増幅反応の触媒となる逆転写酵素、ＤＮＡポリメレース、ＲＮＡポリメレースやその他の酵素（リボヌクレースＨなど）を含む酵素試薬からなる。また、基質試薬、プライマー試薬および酵素試薬にはそれぞれ、核酸増幅反応を最適化するためや試薬の安定性を高めるため、増幅産物の検出をするためなどのその他の試薬（各種無機塩類、ＤＭＳＯ、ソルビトール、インヒビター、ＤＴＴ、検出プローブなど）が含まれていても良い。この標的核酸の増幅に必要な試薬成分を構成する固体状態の試薬および液体状態の試薬と、試料中の標的核酸を混合することで、増幅反応が開始される。
【００１８】
本発明の固体状態の試薬の成分は、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一部または全部を含んでいても良く、含まれる試薬の種類や数には限定されない。したがってたとえば、基質試薬の一部を固体状態の試薬とし、残りの一部を液体状態の試薬として容器に入れていても良い。また各試薬成分は液体状態の試薬および固体状態の試薬の両方に含まれていても良く、特にその他の試薬のうち、試薬の安定性を向上させるという目的のために添加されているものに関しては、液体状態の試薬および固体状態の試薬の両方に含まれることで効果的となることもある。また好ましい態様としては、検査項目に特異的な成分の全部を、固体状態の試薬に含ませておくことにより、試薬の取り違えによる誤診の可能性の低減が期待される。たとえば、検査項目に特異的であるプライマー試薬を、固体状態の試薬に含ませておくことで、測定する試料と固体状態の試薬を正しく組み合わせれば、液体状態の試薬は検査項目に依存せず広く使用できる試薬とすることが可能な場合、試薬の取り違えの可能性が低減することとなる。また、液体状態の試薬についてはその保存性から冷凍保存（−２０℃以下）が望ましいが、試薬を固体状態にすることで常温保存が可能となる。したがって、凍結融解により安定性が損なわれる試薬成分が含まれる場合は、その試薬成分を固体状態の試薬とすることが好ましい。
【００１９】
本発明の固体状態の試薬は常温で固体であり、液体状態の試薬は常温で液体であることを特徴とする。また固体状態の試薬における固体化の方法は特に限定されないが、液体状態の試薬と混合されることで迅速に溶解することが好適であるため、試薬成分が風乾、真空乾燥または凍結乾燥したものであることが好ましい。さらに試薬の固体化を反応容器中で行うことで、反応容器に固体状態の試薬が密着し、実験者の操作をより簡便とすることが可能となる。一方、試薬成分に増粘剤などを添加したり圧縮したりすることで錠剤とすることも例示できる。なお、固体化により酵素試薬の活性が低下するような場合には、酵素試薬を液体状態の試薬とすることが例示できる。
【００２０】
本発明の標的核酸の増幅キットまたは標的核酸の検出キットは、実験者が試薬調製に要する時間を減少させる目的では、必要量の固体状態の試薬があらかじめ反応容器に入った状態のキットであることが好ましく、そのためにキットの製造過程において反応容器に固体状態の試薬の原料を分注後、適当な方法で固体状態とすることとなる。また、固体状態の試薬があらかじめ反応容器に入っていなくても、各反応容器に速やかに入れられるような固体状態、例えば、錠剤のように固体状態の試薬が個別包装された形態で提供することによっても、実験者の試薬調製の所要時間を短縮する効果がある。
【００２１】
一方、本発明の液体状態の試薬は、基本的には固体状態の試薬と補完的であり、液体状態の試薬および固体状態の試薬と、試料中の標的核酸が混合されることにより標的核酸増幅が開始されうる成分を含むものである。たとえば、固体状態の試薬に標的核酸の増幅に必要な成分の全部が含まれている場合、液体状態の試薬は必要なく、実験者が標的核酸を含む試料または適宜希釈して調製した試料を固体状態の試薬と混合し、標的核酸の増幅反応を開始することとなる。したがって、固体状態の試薬に標的核酸の増幅に必要な成分の全部が含まれている場合は、固体状態の試薬のみで本発明の増幅キットを構成することもできるし、固体状態の試薬および試料希釈用の希釈液から構成することもできる。また、固体状態の試薬がプライマー試薬のみからなる場合、液体状態の試薬の成分は酵素試薬、基質試薬およびその他の試薬から構成され、実験者は試料を液体状態の試薬と混合した後に固体状態の試薬と混合することで固体状態の試薬を溶解させたり、または、試料で固体状態の試薬を溶解後、液体状態の試薬と混合するなどの方法を行うこととなる。
【００２２】
さらに、本発明は、標的核酸の増幅に伴い蛍光特性が変化するように設計された検出プローブを固体状態の試薬または液体状態の試薬のどちらか一方、または両方にあらかじめ添加しておくことにより、標的核酸増幅のリアルタイムな測定が可能となるため、検査結果を迅速に得る目的としては非常に有効である。使用する検出プローブは特に限定はされないが、標的核酸の増幅産物と相補的２本鎖を形成可能な核酸プローブとインターカレーター性蛍光色素、もしくは、インターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブで、かつ標的核酸と形成した相補的２本鎖部分に前記インターカレーター性蛍光色素部分がインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計された核酸プローブを例示することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、標的核酸の増幅反応のための試薬の調製方法が簡便化され、試薬調製を含めた分析所要時間を短縮することが可能となった。それにより、迅速性が要求される場面における標的核酸の増幅反応の有用性が向上した。さらに、プライマー試薬のような分析項目特異的な成分を、あらかじめ固体状態で反応容器に入れておくことにより、操作が簡便化され実験者による実験誤差の発生を最小限に抑えることが可能である標的核酸の増幅キットおよび標的核酸の検出キットを提供した。
【００２４】
また、本発明では標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一方を固体状態にすることで、凍結融解を繰り返すことで不安定となる試薬を安定して保存することが可能となった。また、固体状態の試薬は常温保存が可能となり、輸送や保存の際にも取り扱いが容易となる。さらに固体状態の試薬は錠剤として使用したり反応容器に密着させて使用したりすることができるため、実験者の操作性をより簡便にし、さらなる分析所要時間の短縮に貢献している。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
実施例１ 固体状態の試薬を用いたＴＲＣ反応における検査所要時間の評価
（１）使用した標準ＲＮＡは、ｍｅｃＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の細胞壁合成酵素ＰＢＰ２’遺伝子配列（非特許文献５参照）を含む２１８３塩基のＲＮＡ）、およびＶＴ２（大腸菌Ｏ−１５７のベロ毒素２型遺伝子配列（非特許文献６参照）を含む１３６１塩基のＲＮＡ）である。これらの配列の標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で１０００コピー／５μｌになるように調製しＲＮＡ試料とした。
【００２７】
（２）本実施例中に記載されているオリゴヌクレオチドの塩基配列は以下の通りである。第一のオリゴヌクレオチド（Ｔ７ＲＮＡポリメレース・プロモーター配列含有センスプライマー）
ｍｅｃＡ用：配列表の配列番号１に記載のもの
ＶＴ２用：配列表の配列番号２に記載のもの
第二のオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）
ｍｅｃＡ用：配列表の配列番号３に記載のもの
ＶＴ２用：配列表の配列番号４に記載のもの
第三のオリゴヌクレオチド（３’末端をアミノ基修飾）
ｍｅｃＡ用：配列表の配列番号５に記載のもの
ＶＴ２用：配列表の配列番号６に記載のもの
第四のオリゴヌクレオチド（増幅ＲＮＡ検出用インターカレーター標識プローブ（プローブの構造は非特許文献７に従った））
ｍｅｃＡ用：配列表の配列番号７に記載の配列中の５’末端から６番目の塩基（Ｇ）と７番目の塩基（Ａ）の間のリン原子に、インターカレーター性蛍光色素としてオキサゾールイエローを標識したもの
ＶＴ２用：配列表の配列番号８に記載の配列中の５’末端から１２番目の塩基（Ｔ）と１３番目の塩基（Ａ）の間のリン原子に、インターカレーター性蛍光色素としてオキサゾールイエローを標識したもの
（３）以下の組成のｍｅｃＡ、ＶＴ２増幅用試薬溶液それぞれ５μｌを、０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に１０本づつ分注し、該ＰＣＲチューブごと凍結乾燥して固体状態の試薬を調製した。
【００２８】
固体状態試薬の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
１．０μＭの第一のオリゴヌクレオチド
１．０μＭの第二のオリゴヌクレオチド
０．１６μＭの第三のオリゴヌクレオチド
２５ｎＭの第四のオリゴヌクレオチド
（４）以下の組成のｍｅｃＡ、ＶＴ２増幅用試薬溶液それぞれ２８０μｌを、０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に１本づつ分注し、液体状態試薬を調製した。
【００２９】
液体状態試薬の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
【００３０】
【表１】
３で調製した固体状態の試薬と４で調製した液体状態の試薬で構成した試薬のセットを、本発明における簡易型ＲＮＡ検査キット（図１）として使用する。
【００３１】
（５）以下の組成のｍｅｃＡ、ＶＴ２増幅用試薬溶液それぞれ１１０μｌを、０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に１本づつ分注し、基質試薬を調製した。
【００３２】
基質試薬の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
【００３３】
【表２】
（６）以下の組成のｍｅｃＡ、ＶＴ２増幅用試薬溶液それぞれ１１０μｌを、０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に１本づつ分注し、プライマー試薬を調製した。
【００３４】
プライマー試薬の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
【００３５】
【表３】
（７）以下の組成のｍｅｃＡ、ＶＴ２増幅用試薬溶液それぞれ６０μｌを、０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に１本づつ分注し、酵素試薬を調製した。
【００３６】
酵素試薬の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
【００３７】
【表４】
５、６、７で調製した試薬のセットを、従来型ＲＮＡ検査キット（図２）として使用する。
【００３８】
（８）簡易型ＲＮＡ検査キットのｍｅｃＡ増幅用固体状態試薬が入った１０本のＰＣＲチューブに、ｍｅｃＡ標準ＲＮＡをそれぞれ５μｌづつ添加し、ｍｅｃＡ増幅用液体状態試薬が入ったＰＣＲチューブと共に４４℃で５分間保温後、液体状態試薬の２５μｌを標準ＲＮＡが添加された固体状態試薬のＰＣＲチューブにそれぞれ分注した。同様の操作を、ＶＴ２においても実施した。
【００３９】
（９）引き続きＰＣＲチューブを４４℃で保温しながら、蛍光強度の変化をモニターした。
【００４０】
（１０）従来型ＲＮＡ検査キットのｍｅｃＡ増幅用の基質試薬とプライマー試薬を、それぞれ１０５μｌづつ量り取り、混合して２１０μｌの試薬ミックスを調製し、０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブの１０本に２０μｌづつ分注した。該ＰＣＲチューブのそれぞれに、ｍｅｃＡ標準ＲＮＡの５μｌを添加した。同様の操作を、ＶＴ２においても実施した。
【００４１】
（１１）１０で調製した２５μｌの試薬が入ったＰＣＲチューブと、ｍｅｃＡ増幅用の酵素試薬５５μｌを４４℃で５分間保温後、酵素試薬の５μｌをそれぞれのＰＣＲチューブに分注した。同様の操作を、ＶＴ２においても実施した。
【００４２】
（１２）引き続きＰＣＲチューブを４４℃で保温しながら、蛍光強度の変化をモニターした。
【００４３】
１から７までは、ＲＮＡ検査キット製造者が行う作業を示し、８以降は現場で実験者が行うＲＮＡ検査のモデルである。実験者がｍｅｃＡ（図３）、ＶＴ２（図４）、それぞれ１０本分の試薬を調製するのに要した時間は、簡易型ＲＮＡ検査キットでは１５分程度であるのに対し、従来型ＲＮＡ検査キットでは３０分を要した。ＲＮＡの増幅効率を反映する蛍光強度の立ち上がり時間を比較した結果、どちらのキットを使用してもほぼ同じ時間（ｍｅｃＡ：１５分、ＶＴ２：３０分）であった。以上のことから、本発明の簡易型ＲＮＡ検査キットによって、試薬調製を含めたＲＮＡ検査の所要時間が最大三分の二に短縮された。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明における簡易型ＲＮＡ検査キットの試薬構成と操作手順を示したものである。
【図２】従来型ＲＮＡ検査キット（ＴＲＣ検査キット）の試薬構成と操作手順を示したものである。
【図３】ｍｅｃＡを標的核酸としたＲＮＡ増幅反応の実施における、ＲＮＡ増幅用試薬の調製開始から結果の判定までの所要時間を示したものである。本発明におけるＲＮＡ検査キットを使用することにより、結果の判定までの所要時間が短縮されたことが示されている。
【図４】ＶＴ２を標的核酸としたＲＮＡ増幅反応の実施における、ＲＮＡ増幅用試薬の調製開始から結果の判定までの所要時間を示したものである。本発明におけるＲＮＡ検査キットを使用することにより、結果の判定までの所要時間が短縮されたことが示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸を増幅するキットであって、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一部が１つの容器に固体状態で入っている固体状態の試薬と、標的核酸の増幅に必要な残りの試薬成分が１つの容器に液体状態で入っている液体状態の試薬とからなり、試料中の標的核酸と、固体状態の試薬と、液体状態の試薬とを混合することで固体状態の試薬が溶解して標的核酸の増幅が可能となる、標的核酸の増幅キット。
【請求項２】
試料中の標的核酸を増幅するキットであって、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の全部が１つの容器に固体状態で入っている固体状態の試薬からなり、試料中の標的核酸と、固体状態の試薬とを混合することで固体状態の試薬が溶解して標的核酸の増幅が可能となる、標的核酸の増幅キット。
【請求項３】
固体状態の試薬にプライマー試薬を含むことを特徴とする、請求項１または２の標的核酸の増幅キット。
【請求項４】
液体状態の試薬に酵素試薬を含むことを特徴とする、請求項１または３の標的核酸の増幅キット。
【請求項５】
固体状態の試薬および／または液体状態の試薬に、標的核酸の増幅に伴い蛍光特性が変化するように設計された検出プローブを含むことを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかの標的核酸の検出キット。
【請求項６】
試料中の標的核酸の増幅方法であって、試料中の標的核酸と、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一部が１つの容器に固体状態で入っている固体状態の試薬と、標的核酸の増幅に必要な残りの試薬成分が１つの容器に液体状態で入っている液体状態の試薬とを混合することで増幅反応が開始される、標的核酸の増幅方法。
【請求項７】
試料中の標的核酸の増幅方法であって、標的核酸と、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の全部が１つの容器に固体状態で入っている固体状態の試薬とを混合することで増幅反応が開始される、標的核酸の増幅方法。
【請求項８】
増幅反応が一定温度で行われることを特徴とする、請求項６または７の標的核酸の増幅方法。
【請求項１】
試料中の標的核酸を増幅するキットであって、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一部が１つの容器に固体状態で入っている固体状態の試薬と、標的核酸の増幅に必要な残りの試薬成分が１つの容器に液体状態で入っている液体状態の試薬とからなり、試料中の標的核酸と、固体状態の試薬と、液体状態の試薬とを混合することで固体状態の試薬が溶解して標的核酸の増幅が可能となる、標的核酸の増幅キット。
【請求項２】
試料中の標的核酸を増幅するキットであって、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の全部が１つの容器に固体状態で入っている固体状態の試薬からなり、試料中の標的核酸と、固体状態の試薬とを混合することで固体状態の試薬が溶解して標的核酸の増幅が可能となる、標的核酸の増幅キット。
【請求項３】
固体状態の試薬にプライマー試薬を含むことを特徴とする、請求項１または２の標的核酸の増幅キット。
【請求項４】
液体状態の試薬に酵素試薬を含むことを特徴とする、請求項１または３の標的核酸の増幅キット。
【請求項５】
固体状態の試薬および／または液体状態の試薬に、標的核酸の増幅に伴い蛍光特性が変化するように設計された検出プローブを含むことを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかの標的核酸の検出キット。
【請求項６】
試料中の標的核酸の増幅方法であって、試料中の標的核酸と、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の一部が１つの容器に固体状態で入っている固体状態の試薬と、標的核酸の増幅に必要な残りの試薬成分が１つの容器に液体状態で入っている液体状態の試薬とを混合することで増幅反応が開始される、標的核酸の増幅方法。
【請求項７】
試料中の標的核酸の増幅方法であって、標的核酸と、標的核酸の増幅に必要な試薬成分の全部が１つの容器に固体状態で入っている固体状態の試薬とを混合することで増幅反応が開始される、標的核酸の増幅方法。
【請求項８】
増幅反応が一定温度で行われることを特徴とする、請求項６または７の標的核酸の増幅方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−４３９９７（Ｐ２００７−４３９９７Ａ）
【公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３３６９７（Ｐ２００５−２３３６９７）
【出願日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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