新規の正イオン性脂質、それの製造方法、およびそれを含む伝達体
本発明の正イオン性脂質は、核酸または負イオン性生理活性タンパク質伝達体の製造のために用いられる。本発明の正イオン性脂質は、製造および精製工程が簡便で大量生産時の経済性が高い。また、本発明の正イオン性脂質を含む核酸またはタンパク質伝達体は、細胞内に伝達しようとするデオキシリボ核酸、リボ核酸、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー(ａｐｔａｍｅｒ)等の核酸医薬や生理活性を保有した負イオン性タンパク質を細胞内に輸送する効率を顕著に増強させるだけでなく、細胞毒性を減少させて核酸またはタンパク質素材の医薬の治療効能を増強させる用途で有用にに用いられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の正イオン性脂質、それの製造方法、およびそれを含む伝達体に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、プラスミドデオキシリボ核酸(ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ)、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)、マイクロリボ核酸(ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ)など、各種核酸物質の医薬的用途が糾明されることに伴ってこれら核酸物質を細胞内へ効率的に伝達する核酸伝達物質の重要性も増大しつつある。
【０００３】
細胞内へ核酸物質を伝達するための核酸伝達体は、大きくウイルス性ベクターと非ウイルス性ベクターとに区分することができる。
【０００４】
非ウイルス性ベクターとしては、リポソーム、正イオン性高分子をはじめ、ミセル、エマルション、ナノ粒子などの多様な剤形を用いることができる。これら剤形において、正イオン性脂質は負電荷の核酸物質と静電気的に結合する力を提供するため、核酸伝達体設計の核心物質である。正イオン性脂質は、負イオン性核酸物質と安定したイオン結合による複合体粒子を形成し、このように形成された複合体は細胞膜融合や細胞内飲食作用(ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ)によって細胞内へ輸送されるようになる。
【０００５】
従来に開発された正イオン性脂質は、中性の脂肪酸鎖に１級アミン(ｐｒｉｍａｒｙ ａｍｉｎｅ)、２級アミン(ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｍｉｎｅ)、３級アミン(ｔｅｒｔｉａｒｙ ａｍｉｎｅ)、または４級アンモニウム塩(ｑａｕａｒｔｅｒｎａｒｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ)などのアミン保有化合物を結合させて正イオン性を付与する方法を用いた。
【０００６】
初期段階の核酸伝達用正イオン性脂質としては、１９８７年 Ｆｅｌｇｎｅｒ博士研究陣が合成した正イオン性４級アミノ脂質であるＮ−[１−(２，３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド(Ｎ−[１−(２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ)ｐｒｏｐｙｌ]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ;ＤＯＴＭＡ)がある。ＤＯＴＭＡは、細胞膜融合活性を有するものとして知られたジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；ＤＯＰＥ)と正イオン性リポソームを形成して遺伝子伝達に利用されている。ＤＯＴＭＡの疏水性基は、二重結合を有する炭素数１８個の脂肪族化合物グループ(ａｌｉｐｈａｔｉｃ ｇｒｏｕｐ)であり、スペイサーアーム(ｓｐａｃｅｒ ａｒｍ)とエーテル結合(ｅｔｈｅｒ ｌｉｎｋｅｒ ｂｏｎｄ)を通じて化学的に連結された疏水性基の反対側に４級アンモニウム塩が結合されている。ＤＯＴＭＡの場合、遺伝子伝達効率は、比較的高い細胞毒性を有していて、多い工程の合成過程を経なければならないという短所を有している。
【０００７】
ＤＯＴＭＡの高い毒性を解決し、細胞内への核酸伝達効率をより高めるためにＤＯＴＭＡの他の形態の誘導体である１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド(１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ；ＤＭＲＩＥ)、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（Ｎ−[１−(２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ)ｐｒｏｐｙｌ]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ；ＤＯＴＡＰ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２−（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｅ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ；ＤＯＳＰＡ）などが開発された。
【０００８】
また、コレステロール(ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ)誘導体である３β−[Ｎ−(Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール(３−[Ｎ−(Ｎ'，Ｎ'−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ)ｃａｒｂａｍｏｙｌ]ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ；ＤＣ−Ｃｈｏｌ)、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロマイド(ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ；ＤＤＡＢ)、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロライド(Ｎ−(α−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏａｃｅｔｙｌ)−ｄｉｄｏｄｅｃｙｌ Ｄ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＴＭＡＣ)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｏｇｌｙｃｙｌｓｐｅｒｍｉｎｅ；ＤＯＧＳ)などが合成されてデオキシリボ核酸などの核酸物質の伝達を目的として利用されている。
【０００９】
これら正イオン性脂質は、４級アミン、３級アミン、またはヒドロキシエチル化４級アミンなどが脂質のヘッド部分に連結されて一つの正電荷を提供する種類(ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＤＡＢ、ＴＭＡＣなど)と、スペルミン(ｓｐｅｒｍｉｎｅ)などのポリアミン(ｐｏｌｙａｍｉｎｅ)物質が連結されて多数の正電荷を提供する種類(ＤＯＧＳ)とに区分することもできる。
【００１０】
核酸伝達に用いられる正イオン性脂質の更に他の例は４級アンモニウム塩(ｑｕａｒｔｅｒｎａｒｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ)の界面活性剤(ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ)である。これらは、単一鎖、例えば、セトリメチルアンモニウムブロマイド(ｃｅｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ)または二重鎖、例えば、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド(ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ)等の界面活性剤であり、全て動物細胞に核酸伝達が可能である。 これら４級アンモニウム塩正イオン性脂質の場合、両親媒性 (ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ)に属するアミン基(ａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ)は４級であり、スペーサーアーム(ｓｐａｃｅｒ ａｒｍ)や連結結合(ｌｉｎｋｅｒ ｂｏｎｄ)なしに脂質の単一鎖が１級アミン基についている。しかし、これら両親媒性界面活性剤を用いた剤形もまた一般的に細胞毒性が深刻である問題点を有している。また他の両親媒性物質としてはＤＯＴＭＡの構造に類似な１，２−ジオレオイル−３−(４'−トリメチルアンモニオ)ブタノイル−グリセロル(１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−（４’−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｂｕｔａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ)、コレステリル(４'−トリメチルアンモニオ)ブタノエート（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ（４’−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｂｕｔａｎｏａｔｅ）、１，２−ジオレオイル−３−スクシニル−グリセロルコリンエステル（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｃｈｏｌｉｎｅ ｅｓｔｅｒ）等があるが、これら両親媒性物質は、細胞内の核酸伝達効率(ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ)が一般的に低い。
【００１１】
非ウイルス性ベクターのうち、正イオン性脂質は、レンチウイルスやアデノウイルスなどのウイルス性核酸輸送体に比べて製造方法が簡便で、ウイルスのキャプシドタンパク質による反復投与による免疫副作用が少なく、ウイルスそのものが有する遺伝子による体内安全性の問題が提起されなくて、製造コストまたは製造工程においても産業的に有利という長所がある。しかし、従来に開示されたいろんな核酸伝達用正イオン性脂質は、合成方法、細胞毒性、および細胞内への核酸伝達効率面からまだ補完されなければならない点が多い。よって、合成工程が短くて、細胞毒性の小さく、かつ細胞内へ効率的に核酸物質を伝達する技術の開発が要求される。
【００１２】
核酸物質の外に生理活性タンパク質の場合にも生体内の短い半減期によって薬物動力学的な滞留時間が低く、頻繁な反復投与が要求されることが問題点として指摘されている。生理活性タンパク質の場合、ポリエチレングリコールのような高分子物質との化学的な接合によって生体内の滞留時間を増強させる技術が用いられている。 しかし、このような化学的な接合の場合、タンパク質の生理活性部位が化学的接合によって変形されてタンパク質本来の生理活性が減少する場合が多い。したがって、生理活性タンパク質に化学的な変形を与えず、かつ生体内でタンパク質が分解酵素によって迅速に分解されることを防止しうる伝達体の開発が必要である。特に、負イオン性生理活性タンパク質であるヘパリンなどの場合、正イオン性伝達体と静電気的複合体を形成する場合、化学的な構造の変形なしにも生体内の薬物動力学的な特徴を変化させることができる。
【００１３】
前記問題を解決する為の様々な過度の試験および研究の結果、本発明者は、今までの一般的な正イオン性脂質の合成方法とは異なる、アミン構造を有する脂肪酸誘導体に負イオン性アミノ酸を結合させて正イオン性を付与する方法を開発して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
そこで、本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的とするところは、新規の正イオン性脂質、それの製造方法、およびそれを含む伝達体を提供することにある。
本発明の正イオン性脂質は多様な形態の核酸伝達体または生理活性を保有した負イオン性タンパク質の伝達体で製剤化して細胞内へ目的する物質の伝達を増強させることに用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、下記の一般式（Ｉ）の正イオン性脂質を提供する。
【００１６】
【化１】
【００１７】
前記式において、
【００１８】
ｎは１または２であり、
【００１９】
Ｒ１とＲ２は、それぞれ炭素数１２〜２０個の飽和または不飽和炭化水素である。
【００２０】
本発明の一具体例で、前記Ｒ１とＲ２は、それぞれ炭素数１６個の飽和または不飽和炭化水素であってもよい。
【００２１】
本発明の他の具体例で、前記Ｒ１とＲ２は、それぞれ炭素数１８個の飽和または不飽和炭化水素であってもよい。
【００２２】
前記一般式（Ｉ）で示す本発明の正イオン性脂質は、負電荷を有するアミノ酸グループと疎水性であるＣ１２〜Ｃ２０の飽和または不飽和脂肪酸アミン誘導体とが結合して構成される。
【００２３】
本発明の正イオン性脂質は、親水性のアミノ酸グループと疏水性の脂肪酸部位で構成された両親媒性化合物としてアミノ酸のカルボキシ(−ＣＯＯＨ)グループと脂肪酸誘導体のアミングループ(−ＮＨ２)とのアミド(ａｍｉｄｅ)結合からなる。
【００２４】
よって、本発明は、また、負イオン性アミノ酸のカルボキシルグループ(−ＣＯＯＨ)を脂肪酸アミン誘導体のアミングループ(−ＮＨ２)にアミド結合(ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ)で連結して前記化学式(Ｉ)の正イオン性脂質を製造する方法を提供する。
【００２５】
本発明の正イオン性脂質を構成する脂肪酸アミン誘導体は、炭素数１２〜２０個の飽和または不飽和脂肪酸であればいかなるものであっても可能である。前記脂肪酸アミン誘導体は、例えば、オレイルアミン(ｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ)、ミリスチルアミン(ｍｙｒｉｓｔｙｌａｍｉｎｅ)、パルミチルアミン(ｐａｌｍｉｔｙｌａｍｉｎｅ)、ステアリルアミン(ａｔｅａｒｙｌａｍｉｎｅ)、ラウリルアミン(ｌａｕｒｙｌａｍｉｎｅ)、リノレイルアミン(ｌｉｎｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ)、アラキジルアミン(ａｒａｃｈｉｄｙｌａｍｉｎｅ)などを含む。
【００２６】
本発明の正イオン性脂質を構成するアミノ酸グループとしては、負電荷を有するアミノ酸のうち、炭素数１０個以下のいかなるアミノ酸でも可能であるが、グルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，Ｅ)またはアスパラギン酸(Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ)を用いることが望ましい。
【００２７】
前記一般式(Ｉ)で、ｎ＝１である場合は、アミン構造を有する脂肪酸誘導体をアスパラギン酸と結合させて正イオン性脂質を合成した場合であり、ｎ＝２である場合は、アミン構造を有する脂肪酸誘導体をグルタミン酸と結合させて正イオン性脂質を合成した場合である。
【００２８】
本発明の正イオン性脂質は、生体タンパク質の構成成分であるアミノ酸を用いて簡単な工程で高い収率の合成が可能である。本発明の正イオン性脂質の場合、正常な生体内環境の中性領域ｐＨにてグルタミン酸とアスパラギン酸のアミン基が正電荷の形態で存在するようになるため、前記一般式(Ｉ)の正イオン性脂質は、全体的に細胞内で正電荷の電荷状態を保有するようになる。前記正イオン性脂質の正イオン電荷は、中性領域ｐＨで負電荷を有している各種核酸物質と複合体を形成することを可能にし、また生体内で相対的に負電荷を保有している標的細胞膜との接触を増加させるのに役に立つ。したがって、本発明の正イオン性脂質は、核酸伝達用途のリポソーム、ミセル、エマルションなど多様な形態の核酸伝達体剤形(ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｏｒｍｕａｌｔｉｏｎ)を製造するために用いることができる。
【００２９】
よって、本発明は、また前記化学式(Ｉ)の正イオン性脂質を含む核酸伝達体(ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ)を提供する。本発明において、核酸伝達体は、陰電荷を有する核酸配列との相互作用によって通常的に核酸と結合して細胞内へ流入しうる複合体を形成できる核酸運搬媒介体を示す。
【００３０】
本発明において、核酸は、リボ核酸(ＲＮＡ)、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ)、アンチセンス オリゴヌクレオチド(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ)、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、アプタマー(ａｐｔａｍｅｒ)等を含む。
【００３１】
本発明の具体例で、本発明の正イオン性脂質を含む核酸伝達体は、リボ核酸(ＲＮＡ)、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ)、アンチセンス オリゴヌクレオチド(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ)、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、アプタマー(ａｐｔａｍｅｒ)等を含む核酸の細胞内への運搬を媒介する。
【００３２】
本発明の核酸伝達体は、リポソーム、ミセル、エマルション、およびナノ粒子で構成される群より選択される剤形（製剤、ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）からなることができる。
【００３３】
また、前記核酸伝達体は、本発明の正イオン性脂質成分の他にもガラクトース脂質誘導体、マンノース脂質誘導体、葉酸脂質誘導体、ポリエチレングリコール脂質誘導体、ビオチン脂質誘導体を更に含むことができる。
【００３４】
本発明の一具体例で、前記核酸伝達体は、前記正イオン性脂質および細胞融合性リン脂質を含有するリポソーム剤形からなるものであってもよい。前記細胞融合性リン脂質は、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；ＤＯＰＥ)、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン(１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ)等を含む。
【００３５】
本発明の他の具体例で、前記核酸伝達体は、前記正イオン性脂質および界面活性剤を含有するミセル剤形からなるものであってもよい。前記界面活性剤は、例えば、ツイン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリエチレングリコールモノオレイルエーテル(ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｍｏｎｏｏｌｅｙｌ ｅｔｈｅｒ)、エチレングリコールモノドデシルエーテル(ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｍｏｎｏｄｏｄｅｃｙｌ ｅｔｈｅｒ)、ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル(ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｍｏｎｏｈｅｘｙｌ ｅｔｈｅｒ)、トリメチルヘキサデシルアンモニウムクロライド（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｄｅｃｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ｄｏｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、シクロヘキシルメチルβ−Ｄ−マルトシド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｍｅｔｈｙｌβ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ）、ペンタエリスリチルパルミテート（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ラウリルジメチルアミンオキサイド(ｌａｕｒｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ−ｏｘｉｄｅ)、またはＮ−ラウロイルサルコシンソジウム塩(Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ)などを含む。
【００３６】
本発明の他の具体例で、前記核酸伝達体は、前記正イオン性脂質および界面活性剤を含有するエマルション剤形からなるものであってもよい。エマルション剤形として使用できる界面活性剤は、正イオン性(ｃａｔｉｏｎｉｃ)、両性イオン性(ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ)、非イオン性(ｎｏｎｉｏｎｉｃ)等に分類される。正イオン性界面活性剤としては、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ｃｅｔｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）などを用いることができ、両性イオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシルベタイン(ｄｏｄｅｃｙｌ ｂｅｔａｉｎｅ)、ドデシルジメチルアミン酸化物(ｄｏｄｅｃｙｌ ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ)、ジメチルパルミチルアンモニオプロパンスルホネート（３−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｙｌｐａｌｍｉｔｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）などを用いることができ、非イオン性界面活性剤としては、ツイン−２０(Ｔｗｅｅｎ ２０)、ツイン−８０(Ｔｗｅｅｎ ８０)、トリトンＸ−１００(Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００)、ポリエチレングリコールモノオレイルエーテル(ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｍｏｎｏｏｌｅｙｌ ｅｔｈｅｒ)、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル(ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｍｏｎｏｄｏｄｅｃｙｌ ｅｔｈｅｒ)、オクチルグルコシド(ｏｃｔｙｌ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ)、またはノナノイルメチルグルカミン(Ｎ−ｎｏｎａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｎｅ)などを用いることができる。
【００３７】
正イオン性リポソーム、ミセル、エマルションなどの剤形からなる本発明の核酸伝達体は、動物細胞内に目的とする核酸の輸送効率を著しく増強させることができ、細胞に対する毒性も減少させる。
【００３８】
本発明の正イオン性脂質を含有した核酸伝達体は、伝達しようとする核酸の使用目的によっていかなる動物細胞へも核酸伝達が可能である。下記の実施例では、前記核酸伝達体の腫瘍細胞(人の子宮頸癌の上皮細胞であるＳｉＨａ細胞株、肺癌細胞であるＡ５４９細胞株、膣粘膜ケラチン細胞株であるＶＫ２細胞株、ネズミの肝癌細胞株であるＨｅｐａ１−６)への核酸伝達効率を評価する。
【００３９】
蛍光標識のついているｄｓＲＮＡであるＢｌｏｃｋ ｉＴ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ)を用いて正イオン性脂質を含有する多様な剤形と複合体を形成して細胞内に伝達してこれを蛍光顕微鏡で観察すると、前記正イオン性脂質の細胞内へ伝達される核酸輸送能力を具体的に測定することができる。また、本発明の核酸伝達体の細胞毒性は、ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅを用いた発色方法(ＭＴＴ)を用いて評価することができる。
【００４０】
本発明で記述された正イオン性脂質を含むリポソーム、ミセル、エマルションなどの核酸伝達体は、多様な細胞において核酸伝達の効率を増強させる目的から既に使われてきた正イオン性脂質であるＤＣ−Ｃｈｏｌを含有した正イオン性リン脂質リポソームより細胞内の輸送度を増加させるだけでなく細胞毒性も著しく減少させることができるため、デオキシリボ核酸、リボ核酸、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー(ａｐｔａｍｅｒ)等の核酸医薬を用いた治療療法などに効果的に使用することができる。
【００４１】
また、本発明は、前記核酸伝達体と核酸の複合体を提供する。リポソーム、ミセル、エマルション、ナノ粒子などの剤形を有する本発明の核酸伝達体は、正イオン性脂質によって正電荷を有するようになるため、核酸伝達体の正電荷と核酸の負イオン性電荷によって単純な混合(ｍｉｘ)によって静電気結合を通じて核酸伝達体と核酸との複合体を形成することができる。
【００４２】
前記核酸伝達体と核酸の複合体は、腫瘍、関節炎、心血管系、内分泌系疾患のような病因性タンパク質の過多発現から発生する各種疾患の治療のために細胞内へ導入されることが可能である。本発明の核酸伝達体は、核酸伝達効率が優秀なだけでなく細胞毒性が低いため、病因性タンパク質の細胞内過多発現を抑制して優秀な疾患治療の効果を得ることができる。
【００４３】
よって、本発明は、また前記核酸伝達体と核酸の複合体を有効性分として含む病因性タンパク質の細胞内過多発現から発生する疾患を予防または治療するための組成物などの核酸医薬治療剤、核酸医薬治療剤の製造のための前記核酸伝達体と核酸複合体の使用、および治療上有効量の前記核酸伝達体と核酸複合体を対象体の細胞内へ導入することを含む腫瘍、関節炎、心血管系、内分泌系疾患などのような病因性タンパク質の過多発現から発生する各種疾患の予防または治療方法を提供する。
【００４４】
本発明の核酸医薬治療剤により、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、細胞内部に目的とする核酸を導入するようになると、標的タンパク質の発現を選択的に減少させるか、あるいは標的遺伝子に発生した変異を修正する役割を果たして病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患や標的遺伝子によって発生した疾患などを治療できるようになる。
【００４５】
本発明において、前記核酸伝達体と核酸の複合体の治療上有効量は、疾患治療の効果を期待するために投与に要求される量を意味する。したがって、疾患の種類、疾患の重症度、投与される核酸の種類、剤形の種類、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および治療期間、同時に使われる化学抗癌剤などの薬品をはじめて多様な因子によって調節されることが可能である。成人に前記核酸医薬治療剤を、例えば、１日１回投与する時、０．００１ ｍｇ／Ｋｇ〜１００ｍｇ／Ｋｇの容量で投与することが望ましい。
【００４６】
代替的には、本発明の正イオン性脂質は、核酸の代わりに負イオン性タンパク質と複合体を形成して負イオン性タンパク質を細胞内に伝達する用途でも利用可能である。
【００４７】
本発明は、前記タンパク質伝達体と負イオン性タンパク質の複合体を提供する。本発明の核酸伝達体の剤形と同様に前記タンパク質伝達体もまたリポソーム、ミセル、エマルション、ナノ粒子などの剤形を有することができ、正イオン性脂質成分の他に核酸伝達体が追加で包含できるもので例示した構成成分をまた含むことができる。本発明のタンパク質伝達体は、正イオン性脂質によって正電荷を有するようになるため、伝達体の正電荷と輸送されるタンパク質の負イオン性電荷によって単純な混合(ｍｉｘ)によって静電気結合を通じて伝達体と負イオン性タンパク質との複合体を形成することができる。
【００４８】
前記タンパク質伝達体と負イオン性タンパク質の複合体は、腫瘍、関節炎、心血管系、内分泌系疾患などに対する治療効能を有する負イオン性生理活性タンパク質の生体内の安全性および有効性の増加のために導入することができる。本発明の正イオン性脂質で構成されたタンパク質伝達体は、負イオン性タンパク質と複合体の形成によって生体内でタンパク質分解酵素に対する抵抗性を付与することができ、細胞毒性が低いため生体内で向上された治療効果を得ることができる。
【００４９】
よって、本発明は、また前記タンパク質伝達体と負イオン性タンパク質の複合体を有効性分として含むタンパク質医薬治療剤、タンパク医薬治療剤の製造のための前記伝達体と負イオン性タンパク質との複合体の使用および治療上有効量の前記伝達体とタンパク質の複合体を対象体の細胞内に導入することを含む腫瘍、関節炎、心血管系、内分泌系疾患などを含む各種疾患の治療方法を提供する。
【００５０】
また、本発明の正イオン性脂質は、ｅｘ ｖｉｖｏで核酸アプタマーを用いる診断キットの構成成分としても利用することができる。例えば、診断用プレートの表面を正イオン性脂質でコーティングし、このコーティング面の上にアプタマーを結合させる場合、試料中のアプタマーと選択的に反応する物質の存在を診断するのに使用可能である。したがって、本発明は、本発明の正イオン性脂質でコーティングされたプレートを含む診断キットを提供する。前記診断キットの正イオン性脂質コーティング面には、アプタマーが結合されていることがある。
【発明の効果】
【００５１】
上述した通り、本発明の正イオン性脂質は、製造および精製工程が簡便で大量生産時の経済性が高い。また、本発明の正イオン性脂質を含む核酸またはタンパク質伝達体は、目的するデオキシリボ核酸、リボ核酸、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー(ａｐｔａｍｅｒ)等の核酸医薬や生理活性を保有した負イオン性タンパク質を細胞内に輸送する効率を顕著に増強させるだけでなく、細胞毒性を減少させて核酸またはタンパク質医薬の治療効能を増強させる用途で有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例１でグルタミン酸とオレインアミンとを結合して製造した正イオン性脂質ジオレオイルグルタミド（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ）の水素核磁気共鳴分光器（１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)の測定結果を示した図である。
【図２】蛍光標識のついているｄｓＲＮＡを用いて比較例１の正イオン性リポソームと複合体形態で伝達した場合(Ａ，Ｃ)と、本発明の正イオン性脂質を含む実施例１１のリポソーム剤形を用いた場合(Ｂ，Ｄ)のｄｓＲＮＡの伝達程度を人の肺腫瘍細胞株のＡ５４９細胞株にて位相差顕微鏡(Ａ，Ｂ)と蛍光顕微鏡(Ｃ，Ｄ)を用いてそれぞれ観察した写真である。
【図３】蛍光標識のついているｄｓＲＮＡを用いて比較例１の正イオン性リポソームと複合体形態で伝達した場合(Ａ，Ｃ)と、本発明の正イオン性リン脂質を含む実施例１３のリポソーム剤形を用いた場合(Ｂ，Ｄ)のｄｓＲＮＡの伝達程度を人の子宮頸癌の上皮細胞であるＳｉＨａ細胞株にて位相差顕微鏡(Ａ，Ｂ)と蛍光顕微鏡(Ｃ，Ｄ)を用いてそれぞれ観察した写真である。
【図４】蛍光標識のついているｄｓＲＮＡを用いて比較例１の正イオン性リポソームと複合体形態で伝達した場合(Ｂ，Ｄ)と、本発明の正イオン性リン脂質を含む実施例１４のミセル剤形を用いた場合(Ｃ，Ｅ)のｄｓＲＮＡの伝達程度を人の子宮癌細胞のＶＫ２細胞株にて位相差顕微鏡(Ｂ，Ｃ)と蛍光顕微鏡(Ｄ，Ｅ)を用いてそれぞれ観察した写真である(図４Ａは、対照群として何も処理していないＶＫ２細胞株の位相差顕微鏡の写真である)。
【図５】蛍光標識のついているｄｓＲＮＡを用いて比較例１の正イオン性リポソームと複合体形態で伝達した場合(Ａ，Ｃ)と、本発明の正イオン性脂質を含む実施例１６のエマルション剤形を用いた場合(Ｂ，Ｄ)のｄｓＲＮＡの伝達程度をネズミの肝癌細胞株のＨｅｐａ１−６細胞株にて位相差顕微鏡(Ａ，Ｂ)と蛍光顕微鏡(Ｃ，Ｄ)を用いて観察した写真である。
【図６】比較例１、２のリポソーム剤形(Ｄ，Ｃ)と本発明の正イオン性脂質を含む実施例１２、１４、１７のリポソーム、ミセル、エマルション剤形をそれぞれ用いた場合(Ｅ，Ｆ、Ｇ)の、スタット３(ｓｔａｔ３)選択的ｄｓＲＮＡの人の肺癌細胞株であるＡ５４９細胞内への伝達効能をＲＴ−ＰＣＲで評価した、ターゲット遺伝子のスタット３の転写体発現をＧＡＰＤＨ(ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ)の転写体発現と比較した写真である(Ａは、何も処理していない細胞そのものを用いた対照群、Ｂは、スタット３選択的低分子干渉ＲＮＡの単独処理群を示す)。
【図７】比較例１、２のリポソーム剤形(Ｄ，Ｃ)と本発明の正イオン性脂質を含む実施例１１、１６、２０のリポソーム、エマルション、ミセル剤形をそれぞれ用いた場合(Ｅ，Ｆ，Ｇ)の、スタット３(ｓｔａｔ３)選択的ｄｓＲＮＡの人の子宮頸癌細胞株であるＨｅＬａ細胞内への伝達効能を、ＲＴ−ＰＣＲで評価した、ターゲット遺伝子であるスタット３の転写体発現をＧＡＰＤＨ(ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ)の転写体(ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ)発現と比較した写真である(Ａは、何も処理していない細胞そのものを用いた対照群、Ｂは、スタット３選択的低分子干渉ＲＮＡ単独処理群を示す。
【図８】ターゲット遺伝子であるｂｃｌ−２に選択的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて比較例１、２のリポソーム剤形(Ｄ，Ｃ)と本発明の正イオン性脂質を含む実施例１２、１５、１７のリポソーム、ミセル、エマルション剤形をそれぞれ用いた場合(Ｅ，Ｆ，Ｇ)の、ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内の伝達効能を、ＲＴ−ＰＣＲを実施して、ターゲットであるｂｃｌ−２転写体(ｔｒａｓｃｒｉｐｔ)発現抑制を比較した写真である(Ａは、何も処理していない細胞自体を用いた対照群、Ｂは、ｂｃｌ−２選択的アンチセンスオリゴヌクレオチド単独処理群を示す)。
【図９】緑色蛍光タンパク質(ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ)の発現を選択的に抑制するｓｉＲＮＡを用いて比較例２のリポソーム剤形(Ｂ，Ｅ)と本発明の正イオン性脂質を含む実施例１２のリポソーム剤形を用いた場合(Ｃ，Ｆ)の、ｓｉＲＮＡの人の腎臓細胞株である２９３Ｔ細胞内への伝達効能を、緑色蛍光タンパク質の発現抑制程度として位相差顕微鏡(Ｂ，Ｃ)および蛍光顕微鏡(Ｅ，Ｆ)でそれぞれ比較した写真である(図９Ａは、何も処理していない２９３Ｔ細胞の位相差顕微鏡の観察結果であり、図９Ｄは、蛍光顕微鏡の観察結果を示す)。
【図１０】本発明の正イオン性脂質を含む実施例１１、１３、１６のリポソーム、エマルション剤形とｄｓＲＮＡの複合体を肺癌細胞株であるＡ５４９に対して細胞毒性実験を実施した結果である。
【図１１】本発明の正イオン性脂質を含む実施例１２、１８、１９のリポソーム剤形とｄｓＲＮＡの複合体を人の子宮頸癌細胞株であるＳｉＨａに対して細胞毒性実験を実施した結果である。
【図１２】本発明の正イオン性脂質を含む実施例１１、１４、１７のリポソーム、ミセル、エマルション剤形とｄｓＲＮＡの複合体を人の膣粘膜ケラチン細胞株(ｖａｇｉｎａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ)のＶＫ２に対して細胞毒性実験を実施した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明の利点及び特徴、そしてそれを達成する方法は、添付する図面とともに詳細に後述されている実施例を参照すると、明確となるだろう。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるのではなく、他の異なる形態に多様に具現することができる。本実施例はただ、本発明の開示が完全になるようにし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範囲を完全に知らせるために提供されるのであり、本発明は、請求項の範囲によって定義されるだけである。
【実施例】
【００５４】
＜新規の正イオン性脂質の合成＞
（実施例１．ジオレオイルグルタミド(ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)の合成）
１-１)．１当量(１．４７ｇ，１０ｍｍｏｌ)のグルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)をトリフルオロ酢酸(ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ) ５ｍｌとジクロロメタン(ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ)５ｍｌに入れて、４０℃にて１時間の撹はんを行った。撹はんの後、反応物にアイスバス中でＳＯＣｌ２３当量(２．１８ｍｌ，３０ｍｍｏｌ)を徐々に滴下させて、０〜４０℃で６時間反応させた。反応の後、トリフルオロ酢酸とジクロロメタンを減圧濃縮して除去して薄層クロマトグラフィー法(ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＴＣＬ)で反応可否を確認した。
【００５５】
１-２)．実施例１-１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、オレイルアミン(ｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ) １．５当量(４．０１ｇ，１５ｍｍｏｌ)をジクロロメタンに溶かして徐々に滴下させた。アイスバス中で１時間の撹はんの後、トリエチルアミン(ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ) ３ｍｌを滴下させて０〜５０℃で４時間反応させた。反応の後、トリエチルアミンとジクロロメタンを減圧濃縮して除去させた後、得られた生成物をエチルアセテート(ｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ)に溶かして過飽和塩化ナトリウム溶液で２回洗浄して未反応グルタミン酸を除去させた。生成物が溶けているエチルアセテート中の微量の水分を塩化マグネシウム(ＭｇＣｌ２)で除去した後、ＴＬＣで反応可否を確認した。生成物が溶けているエチルアセテートを減圧濃縮して除去させた後、真空状態で一夜乾燥して淡い茶色の強い粘度を有した液体生成物(４．１２ｇ，収得率９２．８％)を得た。最終的に得られた生成物の正確な構造を水素核磁気共鳴分光器（１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。図１は、グルタミン酸とオレイルアミンのアミド結合(ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ)部分の水素が８．０ｐｐｍで検出され、グルタミン酸によるアミンの水素が２．０ｐｐｍで検出され、オレイルアミンの特徴的な二重結合の部分の水素が５．４２ｐｐｍで検出されることを示す。
【００５６】
１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ):８．０(１Ｈ，グルタミン酸とオレイルアミンの−ＮＨ−ＣＯ)
２．０(２Ｈ，グルタミン酸の−ＮＨ２)
５．４２(２Ｈ，オレイルアミンの−ＣＨ＝ＣＨ−)
【００５７】
下記の反応式１に前記実施例１の反応過程を示した。
【化２】
前記反応式１のＲ１とＲ２は、それぞれ炭素数１８の不飽和(Ｃ９)炭化水素である。
【００５８】
（実施例２．ジミリストイルグルタミド(ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)の合成）
２-１)．２当量のグルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
【００５９】
２-２)．実施例２-１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、ミリスチルアミン(ｍｙｒｉｓｔｙｌａｍｉｎｅ)１．５当量(３．２０ｇ，１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の固体生成物(３．２２ｇ，収得率８５．７％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を利用して確認した。
【００６０】
１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ):８．０(１Ｈ，グルタミン酸とミリスチルアミンの−ＮＨ−ＣＯ)
２．０(２Ｈ，グルタミン酸の−ＮＨ２)
１．２９(２Ｈ，ミリスチルアミンの−ＣＨ２−)
【００６１】
下記の反応式２に前記実施例２の反応過程を示した。
【化３】
前記反応式２のＲ１とＲ２は、それぞれ炭素数１４の飽和炭化水素である。
【００６２】
（実施例３．ジパルミトイルグルタミド（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｇｌｕｔａｍｉｄｅ)の合成）
３−１)．２当量のグルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
【００６３】
３−２)．実施例３−１）で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、パルミチルアミン(ｐａｌｍｉｔｙｌａｍｉｎｅ) １．５当量(３．６２ｇ，１５ｍｍｏｌを用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の固体生成物(３．７４ｇ，収得率９０．１％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を利用して確認した。
【００６４】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）：８．０(１Ｈ，グルタミン酸とパルミチルアミンの−ＮＨ−ＣＯ)
２．０(２Ｈ，グルタミン酸の−ＮＨ２)
１．２９(２Ｈ，パルミチルアミンの−ＣＨ２−)
【００６５】
下記反応式３に前記実施例３の反応過程を示した。
【化４】
前記反応式３のＲ１とＲ２はそれぞれ炭素数１６の飽和炭化水素である。
【００６６】
（実施例４．ジステアロイルグルタミド(ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)の合成）
４−１)．２当量のグルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
【００６７】
４-２)．実施例４-１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、ステアリルアミン（ｓｔｅａｒｙｌａｍｉｎｅ）１．５当量(４．０４ｇ，１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の固体生成物(３．９６ｇ，収得率８７．１％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。
【００６８】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）:８．０(１Ｈ，グルタミン酸とステアリルアミンの−ＮＨ−ＣＯ)
２．０(２Ｈ，グルタミン酸の−ＮＨ２)
１．２９(２Ｈ，ステアリルアミンの−ＣＨ２−)
【００６９】
下記の反応式４に前記実施例４の反応過程を示した。
【化５】
前記反応式４のＲ１とＲ２はそれぞれ炭素数１８の飽和炭化水素である。
【００７０】
（実施例５．ジラウロイルグルタミド(ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)の合成）
５-１)．２当量のグルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
【００７１】
５−２)．実施例５−１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、ラウリルアミン(ｌａｕｒｙｌａｍｉｎｅ) １．5当量(２．７８ｇ，１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の固体生成物(３．３２ｇ，収得率９１．９％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。
【００７２】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）:８．０(１Ｈ，グルタミン酸とオレイルアミンの−ＮＨ−ＣＯ)
２．０(２Ｈ，グルタミン酸の−ＮＨ２)
１．２９(２Ｈ，ラウリルアミンの−ＣＨ２−)
【００７３】
下記反応式５に前記実施例５の反応過程を示した。
【化６】
前記反応式５のＲ１とＲ２は、それぞれ炭素数１２の飽和炭化水素である。
【００７４】
（実施例６．ジリノレオイルグルタミド(ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌｇｌｕｔａｍｉｄｅ)の合成）
６−１)．２当量のグルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
【００７５】
６-２)．実施例６−１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、リノレイルアミン(ｌｉｎｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ) １．５当量(３．９８ｇ，１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１−２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の強い粘度を有した液体生成物(３．７２ｇ，収得率８２．８％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。
【００７６】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）:８．０(１Ｈ，グルタミン酸とリノレイルアミンの−ＮＨ−ＣＯ)
２．０(２Ｈ，グルタミン酸の−ＮＨ２)
５．４９，２．６３(３Ｈ，リノレイルアミンの＝ＣＨ−ＣＨ２-)
【００７７】
下記反応式６に前記実施例６の反応過程を示した。
【化７】
前記反応式６のＲ１とＲ２は、それぞれ炭素数１８の二重不飽和(Ｃ９，Ｃ１２)炭化水素である。
【００７８】
（実施例７．ジアラキドイルグルタミド(ｄｉａｒａｃｈｉｄｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)の合成）
７-１)．２当量のグルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
【００７９】
７-２)．実施例７-１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、アラキジルアミン(ａｒａｃｈｉｄｙｌａｍｉｎｅ) １．５当量(４．４６ｇ，１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の固体生成物(３．９５ｇ，収得率８０．２％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。
【００８０】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）:８．０(１Ｈ，グルタミン酸とアラキジルアミンの−ＮＨ−ＣＯ)
２．０(２Ｈ，グルタミン酸の−ＮＨ２)
１．２９(２Ｈ，アラキジルアミンの−ＣＨ２−)
【００８１】
下記反応式７に前記実施例７の反応過程を示した。
【化８】
前記反応式７のＲ１とＲ２はそれぞれ炭素数２０の飽和炭化水素である。
【００８２】
（実施例８．ジパルミトイルアスパルタミド(ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ)の合成）
８-１)．２当量のアスパラギン酸(ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてアスパラギン酸誘導体生成物を得た。
【００８３】
８-２)．実施例８−１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、パルミチルアミン(ｐａｌｍｉｔｙｌａｍｉｎｅ) １．５当量(３．６２ｇ，１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の固体生成物(３．５９ｇ，収得率８８．６％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。
【００８４】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）:８．０(１Ｈ，アスパラギン酸とパルミチルアミンの−ＮＨ−ＣＯ-)
２．０(２Ｈ、アスパラギン酸の−ＮＨ２)
１．２９(２Ｈ、パルミチルアミンの−ＣＨ２−)
【００８５】
下記反応式８に前記実施例８の反応過程を示した。
【化９】
前記反応式８のＲ１とＲ２はそれぞれ炭素数１６の飽和炭化水素である。
【００８６】
（実施例９．ジステアロイルアスパルタミド(ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ)の合成）
９−１)．２当量のアスパラギン酸(ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてアスパラギン酸誘導体生成物を得た。
【００８７】
９−２)． 実施例９−１）で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、ステアリルアミン(ｓｔｅａｒｙｌａｍｉｎｅ) １．５当量(４．０４ｇ，１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の固体生成物(４．０２ｇ，収得率９０．４％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。
【００８８】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）: ８．０(１Ｈ，アスパラギン酸とステアリルアミンの−ＮＨ−ＣＯ-)
２．０(２Ｈ，アスパラギン酸の−ＮＨ２)
１．２９(２Ｈ、ステアリルアミンの−ＣＨ２−)
【００８９】
下記反応式９に前記実施例９の反応過程を示した。
【化１０】
前記反応式９のＲ１とＲ２は、それぞれ炭素数１８の飽和炭化水素である。
【００９０】
（実施例１０．ジオレオイルアスパルタミド(ｄｉｏｌｅｏｙｌ ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ)の合成）
１０-１．２当量のアスパラギン酸(ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてアスパラギン酸誘導体生成物を得た。
【００９１】
１０-２)．実施例１０-１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、オレイルアミン(ｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ) １．５当量(４．０１ｇ、１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の強い粘度を有した液体生成物(４．０７ｇ，収得率９２．１％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。
【００９２】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）:８．０(１Ｈ、アスパラギン酸とオレイルアミンの−ＮＨ−ＣＯ-)
２．０(２Ｈ，アスパラギン酸の−ＮＨ２)
５．４２(２Ｈ，オレイルアミンの−ＣＨ＝ＣＨ−)
【００９３】
下記反応式１０に前記実施例１０の反応過程を示した。
【化１１】
前記反応式１０のＲ１とＲ２はそれぞれ炭素数１８の不飽和(Ｃ９)炭化水素である。
【００９４】
＜正イオン性脂質を含有する核酸伝達体の製造＞
（実施例１１．ジオレイルグルタミドを含有する正イオン性リポソームの製造）
実施例１で製造した正イオン性脂質のジオレオイルグルタミド(ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)と細胞融合性リン脂質のＤＯＰＥ(Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ)をそれぞれ１ｍｌのクロロホルムに溶かした後、モル比１:１の割合でパイレックス（登録商標）１０ｍｌガラス隔膜バイアルに入れて混合した後、窒素環境ですべてのクロロホルムが蒸発する時まで低い速度で回転蒸発させて脂質薄膜フィルムを製造した。多重層の脂質膜を有するリポソーム(ｌｉｐｉｄ ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ)を製造するためにこの薄膜フィルムにリン酸緩衝溶液１ｍｌを添加してバイアルを３７℃にして密封後３分間撹はん(ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ)した。均一な大きさを作るためにこれをエクストルーダー(ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｃ．，Ｃａｎａｄａ)を用いて０．２μｍポリカーボネート膜を３回通過させて製造した。得られた正イオン性リポソームは用いる前まで４℃で保管した。
【００９５】
（実施例１２．ジミリストイルグルタミドを含有する正イオン性リポソームの製造）
実施例２で製造した正イオン性脂質であるジミリストイルグルタミド(ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)と細胞融合性リン脂質であるＤＯＰＥ(Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ)をそれぞれ１ｍｌのクロロホルムに溶かした後、モル比１:１の割合でパイレックス（登録商標）１０mlガラス隔膜バイアルに入れて混合した後、実施例１１と同じ方法で正イオン性リポソームを製造した。
【００９６】
（実施例１３．ジステアロイルグルタミドを含有する正イオン性リン脂質リポソーム製造）
実施例４で製造した正イオン性脂質のジステアロイルグルタミド(ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)と細胞融合性リン脂質である１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン，ＤｐｈＰＥ（１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ） （Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）をそれぞれ１ｍｌのクロロホルムに溶かした後、モル比１:１の割合でパイレックス（登録商標）１０ｍｌガラス隔膜バイアルに入れて混合した後、実施例１１と同じ方法で正イオン性リポソームを製造した。
【００９７】
（実施例１４．ジミリストイルグルタミドを含有する正イオン性ミセル(ｍｉｃｅｌｌｅ)の製造）
実施例２で製造した正イオン性脂質のジミリストイルグルタミド(ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)と界面活性剤のＴｗｅｅｎ ２０を１:１のモル割合で混合した後、混合液対比リン酸緩衝溶液を１:１０の体積割合で混合して数回振とう混合(ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ)した後、約１分間、超音波発生器を使って正イオン性ミセルを製造した。
【００９８】
（実施例１５．ジアラキドイルグルタミドを含有する正イオン性ミセル(ｍｉｃｅｌｌｅ)製造）
実施例７で製造した正イオン性脂質であるジアラキドイルグルタミド(ｄｉａｒａｃｈｉｄｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)と界面活性剤のポリエチレングリコールモノオレイルエーテル（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｍｏｎｏｏｌｅｙｌ ｅｔｈｅｒ）を１:２のモル割合で混合した後、混合液対比リン酸緩衝溶液を１:１０の体積割合で混合して数回振とう混合(ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ)した後、約１分間、超音波発生器を使って正イオン性ミセルを製造した。
【００９９】
（実施例１６．ジパルミトイルアスパルタミドを含有する正イオン性エマルション(ｅｍｕｌｓｉｏｎ)製造）
実施例８で製造した正イオン性脂質のジパルミトイルアスパルタミド(ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ)とＴｗｅｅｎ８０を１:０．１のモル割合で混合して混合物をリン酸緩衝溶液に１:１０の体積割合で加えた後、ホモジナイザー(ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ)を用いて約２分間均質化させて油滴が水内に分散された水中油型(ｏ／ｗ型)正イオン性エマルションを製造した。
【０１００】
（実施例１７．ジオレオイルアスパルタミドを含有する正イオン性エマルション(ｅｍｕｌｓｉｏｎ)製造）
実施例１０で製造した正イオン性脂質のジオレオイルアスパルタミド(ｄｉｏｌｅｏｙｌ ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ)とＴｗｅｅｎ８０を１:０．１のモル割合で混合して混合物をリン酸緩衝溶液に１:１０の体積割合で加えた後、ホモジナイザーを用いて約２分間均質化させて油滴が水内に分散した水中油型(ｏ／ｗ型)正イオン性エマルションを製造した。
【０１０１】
（実施例１８．ジパルミトイルグルタミドおよびガラクトース脂質誘導体を含有する正イオン性リポソーム製造）
実施例３で製造した正イオン性脂質のジパルミトイルグルタミド(ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)、細胞融合性リン脂質であるＤｐｈＰＥ(Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｄ．，ＵＳＡ)、およびガラクトース脂質誘導体のセレブロシド(ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ) (Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｄ．，ＵＳＡ)をそれぞれ１ｍｌのクロロホルムに溶かした後１:１:０．０５のモル割合で実施例１１と同じ方法で正イオン性リポソームを製造して表面にガラクトース残基(ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｍｏｉｅｔｙ)が存在する正イオン性リポソームを製造した。
【０１０２】
（実施例１９．ジアラキドイルグルタミドおよびポリエチレングリコール脂質誘導体を含有する正イオン性リン脂質リポソームの製造）
実施例７で製造した正イオン性脂質であるジアラキドイルグルタミド(ｄｉａｒａｃｈｉｄｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)と細胞融合性リン脂質であるＤＯＰＥ(Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｄ．，ＵＳＡ)、ポリエチレングリコール脂質誘導体の１，２−ｄｉａｃｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［ｍｅｔｈｏｘｙ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−３０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｄ．，ＵＳＡ)をそれぞれ１ｍｌのクロロホルムに溶かした後、１:１:０．０５のモル割合で実施例１１と同じ方法で正イオン性リポソームを製造して表面にポリエチレングリコール グループが存在する正イオン性リポソームを製造した。
【０１０３】
（実施例２０．ジステアロイルアスパルタミドおよび葉酸脂質誘導体を含有する正イオン性リン脂質ミセルの製造）
実施例９で製造した正イオン性脂質のジステアロイルアスパルタミド(ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ)と葉酸脂質誘導体１，２-ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−[ｆｏｌａｔｅ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ)−２０００ (Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｄ．，ＵＳＡ)および界面活性剤のＴｗｅｅｎ ２０をそれぞれ１:０．０５:１のモル割合で混合した後、１:１０の混合液：リン酸緩衝溶液の体積割合で混合して数回振とう混合(ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ)した後、約１分間、超音波発生器を使って正イオン性ミセルを製造した。
【０１０４】
[比較例１]既存の正イオン性脂質を用いたリポソーム製造
正イオン性脂質であるＤＣ−Ｃｈｏｌ (Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｄ．，ＵＳＡ)と細胞融合性リン脂質のＤＯＰＥ(Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｄ．，ＵＳＡ)をそれぞれ１ｍｌのクロロホルムに溶かした後、モル比１:１の割合でパイレックス（登録商標）１０mlガラス隔膜バイアルに入れて混合した後、窒素環境ですべてのクロロホルムが蒸発される時まで低い速度で回転蒸発させて脂質薄膜フィルムを製造した。多重層の脂質膜を有するリポソーム(ｌｉｐｉｄ ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ)を製造するためにこの薄膜フィルムにリン酸緩衝溶液１ｍｌを添加してバイアルを３７℃にして密封後３分間撹はん(ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ)した。均一な大きさを作るためにこれをエクストルーダー(ｅｘｔｒｕｄｅｒ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｃ．，Ｃａｎａｄａ)を用いて０．２μｍポリカーボネート膜を３回通過させて製造した。得られた正イオン性リポソームは用いる前まで４℃で保管した。
【０１０５】
[比較例２]既存の市販品である正イオン性リポソーム
既存の販売されている正イオン性リポソームであるＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を購入して説明書に記載された方法のとおりに使った。
【０１０６】
[実験例]正イオン性脂質含有核酸伝達体の核酸伝達効率評価
（細胞培養）
人の子宮癌細胞株であるＳｉＨａおよびＨｅＬａ、人の膣粘膜ケラチン細胞株(ｖａｇｉｎａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ)であるＶＫ２、人の肺癌細胞株であるＡ５４９、人の腎臓細胞株である２９３Ｔ、ネズミ(ｍｏｕｓｅ)の肝癌細胞株であるＨｅｐａ１−６は米国細胞株銀行(Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ，ＵＳＡ)から購入して使った。ＳｉＨａ、Ｈｅｐａ１−６細胞株は１０％ウシ胎児血清ｗ／ｖ (ＣｙＣｌｏｎｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，ＵＳＡ)と１００ ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリンまたは１００μg／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ(Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅｓ ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ)に培養した。Ａ５４９細胞株は、１０％のウシ胎児血清とペニシリン、ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０(Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ)で培養した。ＶＫ２細胞株は、０．１ ｎｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ再組合上皮細胞成長因子(Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ)、０．０５ｍｇ／ｍｌウシ脳下垂体抽出物(ｂｏｖｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＰＥ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ)）と１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリンまたは１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ(Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ)培地に培養した。
【０１０７】
[実験例Ｉ] 蛍光標識のついている低分子干渉ＲＮＡを用いた核酸伝達効率評価
Ｉ-１．Ａ５４９細胞株における低分子干渉ＲＮＡの伝達効率評価
Ａ５４９細胞株を実験前日、２４ウェルプレートにウェル当たり８×１０４個ずつ播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)し、各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル当たり５００μｌずつ添加した。エッペンドルフ チューブに血清が含まれていない培地５０μｌずつを入れて蛍光標識のついている低分子干渉ＲＮＡ物質であるＢｌｏｃｋ−ｉＴ(２０μｍｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ)２μｌずつと比較例１と実施例１１で製造された正イオン性リポソーム１０μｌをそれぞれ添加した。これらを徐々にピペット操作(ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ)して混合した後、室温で２０分間放置した。このように製造された複合体をウェルプレートに添加して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。培養された細胞のメディアをウェル当たり５００μｌずつ新しいメディアに交換した後、蛍光顕微鏡で遺伝子伝達効率を観察した。図２は、比較例１(Ａ，Ｃ)と実施例１１(Ｂ，Ｄ)から製造された正イオン性リポソームの核酸伝達効率を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡で観察したものであって、Ａは比較例処理時の位相差顕微鏡の写真であり、Ｂは実施例１１の組成処理時の位相差顕微鏡の写真である。またＣは、比較例処理時の蛍光マーカーで表示された低分子干渉ＲＮＡの細胞内への伝達を見せる蛍光顕微鏡の写真であり、Ｄは実施例１１の組成処理時の蛍光顕微鏡の写真である。本図面から実施例１１で本発明の正イオン性脂質を含有して製造された正イオン性リポソームが比較例１で製造された公知組成のリポソームよりＡ５４９細胞内で低分子干渉ＲＮＡの伝達効率を増加させることが分かる。
【０１０８】
Ｉ-２．ＳｉＨａ細胞株における低分子干渉ＲＮＡの伝達効率評価
ＳｉＨａ細胞株を実験前日２４ウェルプレートにウェル当たり８×１０４個ずつ播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)した。各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル当たり５００μｌずつ添加した。実験例Ｉ-１と同様の方法で比較例１および実施例１３の正イオン性リポソームとＢｌｏｃｋ ｉＴとの複合体をそれぞれ製造してウェルプレートに添加して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。培養された細胞のメディアをウェル当たり５００μｌずつ新しいメディアに交換した後、蛍光顕微鏡で核酸伝達効率を観察した。図３は、比較例１(Ａ，Ｃ)と実施例１３(Ｂ，Ｄ)から製造された正イオン性リポソームの核酸伝達効率を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡とでそれぞれ観察したものであって、Ａは比較例１のリポソーム処理時の位相差顕微鏡の写真であり、Ｂは実施例１３のリポソーム処理時の位相差顕微鏡の写真である。またＣは、比較例処理時の蛍光標識のついている低分子干渉ＲＮＡの細胞内の伝達を見せる蛍光顕微鏡の写真であり、Ｄは実施例１３のリポソーム処理時の蛍光顕微鏡の写真である。 本図面から実施例１３で製造された新規の正イオン性脂質含有リポソームが比較例１の公知の正イオン性脂質含有リポソームよりＳｉＨａ細胞内で低分子干渉ＲＮＡの伝達効率を増加させることがわかる。
【０１０９】
Ｉ−３．ＶＫ２細胞株における低分子干渉ＲＮＡの伝達効率評価
ＶＫ２細胞株を実験前日２４ウェルプレートにウェル当たり８×１０４個ずつ播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)し、各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル当たり５００μｌずつ添加した。実験例Ｉ-１と同様の方法で比較例１の正イオン性リポソームおよび実施例１４の正イオン性ミセルとＢｌｏｃｋ ｉＴとの複合体をそれぞれ製造してウェルプレートに添加して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。 培養された細胞のメディアをウェル当たり５００μｌずつ新しいメディアに交換した後、蛍光顕微鏡で核酸伝達効率を観察した。図４は比較例１(Ｂ，Ｄ)の正イオン性リポソームと実施例１４(Ｃ，Ｅ)から製造された正イオン性リン脂質ミセルの核酸伝達効率を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡で観察したもので、本図面から実施例１４で製造された正イオン性脂質含有ミセル(図４Ｅ)が比較例１で使われた公知の正イオン性脂質含有リポソーム(図４Ｄ)よりＶＫ２細胞内で低分子干渉ＲＮＡの伝達効率を増加させることがわかる。また位相差顕微鏡で観察される細胞の形態の側面からも比較例１の組成を処理した場合の細胞状態(図４Ｂ)は、細胞が形の収縮した形態が多く、何も処理していない対照群状態の図４Ａに比べて細胞の形態が変形されたものが観察される反面、実施例１４の正イオン性ミセル処理時の細胞状態は、図４Ｃに示されるように何も処理していない対照群状態の図４Ａの細胞と類似の様相を示して細胞形態面から細胞毒性が顕著に減少したことが分かる。
【０１１０】
Ｉ−４．Ｈｅｐａ １−６細胞株における低分子干渉ＲＮＡの伝達効率評価
Ｈｅｐａ １−６細胞株を実験前日２４ウェルプレートにウェル当たり８×１０４個ずつ播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)し、各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル当たり５００μｌずつ添加した。実験例Ｉ-１と同様の方法で比較例１の正イオン性リポソームおよび実施例１６の正イオン性エマルションとＢｌｏｃｋ ｉＴとの複合体をそれぞれ製造してウェルプレートに添加して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。培養された細胞のメディアをウェル当たり５００μｌずつ新しいメディアに交換した後、蛍光顕微鏡で核酸伝達効率を観察した。図５は比較例１(Ａ，Ｃ)の正イオン性リポソームと実施例１６(Ｂ，Ｄ)から製造された正イオン性リン脂質エマルションの核酸伝達効率を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡で観察したもので、Ａは比較例１のリポソーム処理時の位相差顕微鏡の写真であり、Ｂは実施例１６の正イオン性エマルション処理時の位相差顕微鏡の写真である。またＣは、比較例１のリポソーム処理時の蛍光標識のついている低分子干渉ＲＮＡの細胞内伝達を示す蛍光顕微鏡の写真であり、Ｄは、実施例１６の正イオン性エマルション処理時の蛍光顕微鏡の写真である。前記図５から実施例１６で製造された新規の正イオン性脂質含有エマルションが比較例１で製造された既存の正イオン性脂質含有製剤よりＨｅｐａ１−６細胞内で低分子干渉ＲＮＡの伝達効率を増加させるということがわかる。
【０１１１】
[実験例ＩＩ] 遺伝子発現確認を通した核酸伝達効能評価
ＩＩ-１．Ａ５４９細胞株における低分子干渉ＲＮＡ伝達効能評価
Ａ５４９細胞株を実験前日、２４ウェルプレートにウェル当たり細胞を８×１０４ずつ播種(ｓｅｅｄｎｉｎｇ)した。各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル(ｗｅｌｌ)当たり２５０μｌずつ添加した。エッペンドルフチューブに血清が含まれていない培地５０μｌずつを入れてスタット３に選択的な低分子干渉ＲＮＡと比較例１、２と実施例１２、１４、１７で製造された正イオン性リポソーム、ミセル、エマルションの複合体をそれぞれ添加した。スタット３(Ｓｔａｔ３)遺伝子(Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿２１３６６２)の発現抑制を誘導するためのｓｉＲＮＡはｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（Ｄａｈｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡ）を用いて製作した。 メディアに含まれた低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の最終濃度は、１００ｎＭとなるようにした。これらを徐々にピペット操作(ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ)して混合した後、室温で２０分間放置し、このように製造された複合体をウェルプレートに添加して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。２４時間の後、Ｔｒｉｚｏｌ試薬(Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ)を用いて細胞内に存在する全体リボ核酸(ＲＮＡ)を分離し、このＲＮＡはＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＲＴ ＰｒｅＭｉｘ(Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ)を用いてｃＤＮＡに逆転写した。スタット３(Ｓｔａｔ３)に特異的なプライマーの配列は５'−ＡＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧ−３’（左側）、５’−ＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＡＡＡ−３’(右側)であり、ＰＣＲ生成物の大きさは３４８塩基対であった。スタット３(Ｓｔａｔ３)転写体(ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ)発現の程度は、スタット３特異的なＰＣＲ生成物のバンド密度をＧＡＰＤＨ(ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ)遺伝子を増幅して示されるバンド密度に補正して定量的な発現の変化を測定した。図６は、それぞれの組成を処理した場合の、ＳｉＨａ細胞内でターゲット遺伝子スタット３の転写体発現を比較したものであって、Ａは対照群、Ｂは低分子干渉ＲＮＡ単独処理群、Ｃは比較例２処理群、Ｄは比較例１処理群、Ｅは実施例１２処理群、Ｆは実施例１４処理群、Ｇは実施例１７処理群である。 対照群(Ａ)と低分子干渉ＲＮＡ単独処理群（Ｂ)は、低分子干渉ＲＮＡが細胞内に伝達されなくてスタット３転写体の発現に変化がなく、比較例１で製造されたリポソームは、実施例１２、１４、１７で製造されたリポソーム、ミセル、エマルションより、スタット３転写体の発現の減少が少なかった。また実施例１２、１４、１７で製造されたリポソーム、ミセル、エマルションは、市販品の比較例２の組成と同じように、スタット３転写体発現を効率的に減少させた。よって、図６から実施例１２、１４、１７で製造された正イオン性脂質含有リポソーム、ミセル、エマルションが、それぞれＳｉＨａ細胞内に低分子干渉ＲＮＡ物質を効率的に伝達して標的タンパク質の発現を選択的に抑制させることが分かる。
【０１１２】
ＩＩ-２．ＨｅＬａ細胞株における低分子干渉ＲＮＡ伝達効能評価
ＨｅＬａ細胞株を実験前日２４ウェルプレートにウェル当たり８×１０４個ずつ播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)した。各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート中の培地を除去して新しい培地をウェル当たり２５０μｌずつ添加した。エッペンドルフ チューブに血清の含まれていない培地５０μｌずつを入れてスタット３選択的な低分子干渉ＲＮＡと比較例１、２と実施例１１、１６、２０で製造された正イオン性脂質含有リポソーム、エマルション、およびミセルとの複合体をそれぞれ添加した後、実験例ＩＩ-１と同様の方法と条件で実験を遂行した。図７は、それぞれの組成で処理した場合の、ＨｅＬａ細胞内でターゲット遺伝子スタット３の転写体発現を比較したもので、Ａは対照群、Ｂは低分子干渉ＲＮＡ単独処理群、Ｃは比較例２処理群、Ｄは比較例１処理群、Ｅは実施例１１処理群、Ｆは実施例１６処理群、Ｇは実施例２０処理群である。 対照群(Ａ)と低分子干渉ＲＮＡ単独処理群(Ｂ)は、細胞内への伝達効率が低くてスタット３転写体の発現に変化がなく、比較例１で製造されたリポソームは、実施例１１、１６、２０で製造されたリポソーム、エマルション、ミセル剤形より、スタット３転写体の発現の減少が少なかった。したがって、図７から実施例１１、１６、２０で製造された正イオン性脂質含有剤形は、それぞれＨｅＬａ細胞内に低分子干渉ＲＮＡ物質を効率的に伝達して標的タンパク質の発現を選択的に抑制させることが分かる。
【０１１３】
ＩＩ−３．ＳｉＨａ細胞株におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内伝達効率測定
ＳｉＨａ細胞株を実験前日２４ウェルプレートにウェル当たり細胞を８×１０４ずつ播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)した。各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル(ｗｅｌｌ)当たり２５０μｌずつ添加した。エッペンドルフチューブに血清が含まれていない培地５０μｌずつを入れてアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較例１、２と実施例１２、１５、１７で製造された正イオン性脂質含有リポソーム、ミセル、エマルションとの複合体をそれぞれ添加した。Ｂｃｌ２遺伝子(Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿０００６３３)の発現抑制を誘導するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドではバイオニーア（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ)で合成注文したもの(５'−ＴＣＴ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＴＧ ＣＧＣ ＣＡＴ−３’)を使った。メディアに含まれたアンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度は１００ｎＭとなるようにした。これらを徐々にピペット操作(ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ)して混合した後、室温で２０分間放置してこのように製造された複合体をウェルプレートに添加し３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。２４時間の後、Ｔｒｉｚｏｌ試薬(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ)を使って細胞内に存在する全体リボ核酸(ＲＮＡ)を分離し、このＲＮＡはＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＲＴ ＰｒｅＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）を使ってｃＤＮＡに逆転写した。Ｂｃｌ２に特異的なプライマーの配列は５'−ＡＴＧ ＧＣＧ ＣＡＣ ＧＣＴ ＧＧＧ ＡＧＡ ＡＣ−３’（左側）、５'−ＧＣＧ ＧＴＡ ＧＣＧ ＧＣＧＧＧＡ ＧＡＡ ＧＴ−３’(右側)であり、ＰＣＲ生成物の大きさは３４８塩基対であった。Ｂｃｌ２転写体発現の程度はＢｃｌ２特異的なＰＣＲ生成物のバンド密度をｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を増幅して示されるバンド密度に補正して定量的な発現の変化を測定した。図８は、それぞれの組成で処理した場合の、ＳｉＨａ細胞内でターゲット遺伝子Ｂｃｌ２の転写体発現を比較したものであって、Ａは対照群、ＢはＢｃｌ２選択的アンチセンスオリゴヌクレオチド単独処理群、Ｃは比較例２とアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体処理群、Ｄは比較例１のリポソームとアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体処理群、Ｅは実施例１２の正イオン性リポソームとアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体処理群、Ｆは実施例１５の正イオン性ミセルとアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体処理群、Ｇは実施例１７の正イオン性エマルションとアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体処理群である。細胞に何も処理していない対照群である図８Ａに比べてアンチセンスオリゴヌクレオチド単独処理群(図８Ｂ)は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞内に伝達されなくてＢｃｌ２転写体の量に変化がなかった。市販品である比較例２の組成や(図８Ｃ)、比較例１で製造されたリポソーム(図８Ｄ)と比較した場合、本発明の実施例１２、１５、１７で製造された正イオン性脂質含有剤形は、細胞内でＢｃｌ２転写体の量を効果的に減少させた。したがって、図８から実施例１２、１５、１７で製造された正イオン性脂質含有剤形はＳｉＨａ細胞内にアンチセンスオリゴヌクレオチド物質を伝達して標的物質であるＢｃｌ-２の細胞内発現を効果的に抑制させることが分かる。
【０１１４】
[実験例ＩＩＩ] 蛍光タンパク質発現細胞株２９３Ｔ−ＧＦＰを用いた低分子干渉ＲＮＡの伝達効率評価
緑色蛍光タンパク質を発現する２９３Ｔ−ＧＦＰ細胞株を実験前日２４ウェルプレートにウェル当たり８×１０４個ずつ播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)して各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート中の培地を除去して新しい培地をウェル当たり５００μｌずつ添加した。エッペンドルフチューブに血清が含まれていない培地２５μｌずつを入れて緑色蛍光が発現するプラスミドの発現を抑制するｓｉＲＮＡと比較例２および実施例１２で製造された正イオン性リポソームをそれぞれ添加して複合体を製造してウェルプレートに添加して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。培養された細胞のメディアをウェル当たり５００μｌずつ新しいメディアに交換した後、蛍光顕微鏡で遺伝子伝達効率を観察した。緑色蛍光タンパク質の発現を抑制するための低分子干渉ＲＮＡは、バイオニーア(Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ)で販売する製品を用い、その配列は５'−ＧＣＡ ＵＣＡ ＡＧＧ ＵＧＡ ＡＣＵ ＵＣＡ Ａ−３’（正方向）、５'−ＵＵＧ ＡＡＧ ＵＵＣ ＡＣＣ ＵＵＧ ＡＵＧ Ｃ−３’（逆方向）であった。メディアに含まれた低分子干渉ＲＮＡの最終濃度は、３００ｎＭとなるようにした。図９は、それぞれの組成で処理した場合の、２９３Ｔ細胞内で緑色蛍光タンパク質の発現を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡で観察したものであって、Ａは緑色蛍光タンパク質発現２９３Ｔ細胞を何も処理していない場合の位相差顕微鏡の写真であり、Ｂは比較例２組成処理時の位相差顕微鏡の写真であり、Ｃは実施例１２の組成処理時の位相差顕微鏡の写真である。またＤは、何も処理していない２９３Ｔ細胞の蛍光顕微鏡の写真であり、Ｅは比較例２の組成処理時の蛍光顕微鏡の写真であり、Ｆは実施例１２組成処理時の蛍光顕微鏡の写真である。何も処理していない２９３Ｔ細胞は、緑色蛍光タンパク質の発現が抑制されなくて蛍光発現が蛍光顕微鏡下で明確に観察されるのに対して、比較例２と実施例１２の組成で処理した細胞は、蛍光タンパク質の発現を抑制する低分子干渉ＲＮＡが細胞内に伝達されて緑色蛍光の発現が抑制されることが分かる。
【０１１５】
[実験例ＩＶ] 正イオン性脂質含有核酸伝達体の毒性評価
ＩＶ−１．正イオン性脂質含有核酸伝達体のＡ５４９細胞株に対する毒性評価
本発明の新規正イオン性脂質を含む核酸伝達体の細胞毒性に関する評価をするために下記のような方法で実験を実施した。
人の肺癌細胞株であるＡ５４９細胞を、実施例１１、１３、１６で製造した正イオン性脂質含有リポソーム、エマルションと低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の複合体組成、そして低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)遺伝子単独組成で処理して細胞毒性を評価した。核酸伝達体のみの細胞毒性を明確に評価するために低分子干渉ＲＮＡは、細胞内で活性がないスクランブルＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ＲＮＡ）を用いた。細胞毒性は、３−(４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ−２−ｙｌ)）−２、５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）試薬による方法で評価した。
【０１１６】
細胞をウェル当たり２×１０４細胞となるように４８ウェル(ｗｅｌｌ)に播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)して１２時間培養した後、実施例１１、１３、１６で製造した正イオン性脂質含有リポソーム、エマルションと低分子干渉ＲＮＡの複合体組成そして低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)のみでそれぞれ処理した。２４時間経過後、それぞれＭＴＴ溶液を培地の１０％となるように加えて、さらに４時間培養した後、上層液を除去して０．０４Ｎ塩酸イソプロパノール溶液を添加した後にＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒを用いて５７０ｎｍで吸光度を測定した。対照群では何も処理していない細胞が使われた。図１０は、実施例１１、１３、１６で製造された正イオン性脂質含有リポソーム、エマルションと低分子干渉ＲＮＡ複合体の肺癌細胞株(Ａ５４９)で細胞毒性実験を実施した結果であって、実施例１１、１３、１６の正イオン性リポソーム、エマルションと低分子干渉ＲＮＡの複合体は、対照群と比較して大きい細胞毒性を示さなかった。よって、図１０から実施例１１、１３、１６で製造された本発明の正イオン性脂質含有リポソームやエマルション剤形は、人の肺癌細胞株に対して深刻な毒性を示さないということが分かる。
【０１１７】
ＩＶ−２．正イオン性脂質含有核酸伝達体のＳｉＨａ細胞株に対する毒性評価
ＳｉＨａ細胞に実験例１２、１８、１９で製造した正イオン性リン脂質リポソームと低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の複合体組成、そして低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)遺伝子自体の組成を製造し、実験例ＩＶ−１に記載されたものと同様の方法で細胞毒性を評価した。 図１１は、実施例１２、１８、１９でそれぞれ製造された正イオン性脂質含有リポソームとスクランブル低分子干渉ＲＮＡ複合体のＳｉＨａ細胞に対する毒性実験を遂行した結果であって、実施例１２、１８、１９の正イオン性リポソームと低分子干渉ＲＮＡの複合体は対照群と比較して大きい細胞毒性を示さなかった。よって、本図面から実施例１２、１８、１９で製造された本発明の正イオン性脂質含有リポソームは、子宮頸癌細胞株にて深刻な細胞毒性を示さないことが分かる。
【０１１８】
ＩＶ−３．正イオン性脂質含有核酸伝達体のＶＫ２細胞株に対する毒性評価
ＶＫ２細胞に実施例１１、１４、１７で製造した正イオン性リン脂質リポソーム、ミセル、エマルションと低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の複合体組成、そして低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)遺伝子自体組成を製造し、実験例ＩＶ−１に記載されたのと同様の方法で細胞毒性を評価した。図１２は、実施例１１、１４、１７で製造された正イオン性リポソーム、ミセル、エマルション組成物とスクランブルＲＮＡの膣粘膜ケラチン細胞株であるＶＫ２で細胞毒性実験を実施した結果であって、実施例１１、１４、１７の正イオン性リポソーム、ミセル、エマルションと低分子干渉ＲＮＡの複合体は、対照群と比較して大きい細胞毒性を示さなかった。よって、本図面から実施例１１、１４、１７で製造された正イオン性脂質含有リポソーム、ミセル、エマルション剤形はＶＫ２で深刻な細胞毒性を示さないことが分かる。
【０１１９】
以上、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明はかかる例に限定されない。本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範囲内において、各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、これらについても、当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
上述した通り、本発明の正イオン性脂質は、製造および精製工程が簡便で大量生産時の経済性が高い。また、本発明の正イオン性脂質を含む核酸またはタンパク質伝達体は、目的とするデオキシリボ核酸、リボ核酸、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー(ａｐｔａｍｅｒ)等の核酸医薬や生理活性を保有した負イオン性タンパク質を細胞内に輸送する効率を顕著に増強させるだけでなく、細胞毒性を減少させて核酸またはタンパク質素材の医薬の治療効能を増強させる用途で有用に用いられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の正イオン性脂質、それの製造方法、およびそれを含む伝達体に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、プラスミドデオキシリボ核酸(ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ)、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)、マイクロリボ核酸(ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ)など、各種核酸物質の医薬的用途が糾明されることに伴ってこれら核酸物質を細胞内へ効率的に伝達する核酸伝達物質の重要性も増大しつつある。
【０００３】
細胞内へ核酸物質を伝達するための核酸伝達体は、大きくウイルス性ベクターと非ウイルス性ベクターとに区分することができる。
【０００４】
非ウイルス性ベクターとしては、リポソーム、正イオン性高分子をはじめ、ミセル、エマルション、ナノ粒子などの多様な剤形を用いることができる。これら剤形において、正イオン性脂質は負電荷の核酸物質と静電気的に結合する力を提供するため、核酸伝達体設計の核心物質である。正イオン性脂質は、負イオン性核酸物質と安定したイオン結合による複合体粒子を形成し、このように形成された複合体は細胞膜融合や細胞内飲食作用(ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ)によって細胞内へ輸送されるようになる。
【０００５】
従来に開発された正イオン性脂質は、中性の脂肪酸鎖に１級アミン(ｐｒｉｍａｒｙ ａｍｉｎｅ)、２級アミン(ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｍｉｎｅ)、３級アミン(ｔｅｒｔｉａｒｙ ａｍｉｎｅ)、または４級アンモニウム塩(ｑａｕａｒｔｅｒｎａｒｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ)などのアミン保有化合物を結合させて正イオン性を付与する方法を用いた。
【０００６】
初期段階の核酸伝達用正イオン性脂質としては、１９８７年 Ｆｅｌｇｎｅｒ博士研究陣が合成した正イオン性４級アミノ脂質であるＮ−[１−(２，３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド(Ｎ−[１−(２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ)ｐｒｏｐｙｌ]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ;ＤＯＴＭＡ)がある。ＤＯＴＭＡは、細胞膜融合活性を有するものとして知られたジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；ＤＯＰＥ)と正イオン性リポソームを形成して遺伝子伝達に利用されている。ＤＯＴＭＡの疏水性基は、二重結合を有する炭素数１８個の脂肪族化合物グループ(ａｌｉｐｈａｔｉｃ ｇｒｏｕｐ)であり、スペイサーアーム(ｓｐａｃｅｒ ａｒｍ)とエーテル結合(ｅｔｈｅｒ ｌｉｎｋｅｒ ｂｏｎｄ)を通じて化学的に連結された疏水性基の反対側に４級アンモニウム塩が結合されている。ＤＯＴＭＡの場合、遺伝子伝達効率は、比較的高い細胞毒性を有していて、多い工程の合成過程を経なければならないという短所を有している。
【０００７】
ＤＯＴＭＡの高い毒性を解決し、細胞内への核酸伝達効率をより高めるためにＤＯＴＭＡの他の形態の誘導体である１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド(１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ；ＤＭＲＩＥ)、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（Ｎ−[１−(２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ)ｐｒｏｐｙｌ]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ；ＤＯＴＡＰ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２−（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｅ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ；ＤＯＳＰＡ）などが開発された。
【０００８】
また、コレステロール(ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ)誘導体である３β−[Ｎ−(Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール(３−[Ｎ−(Ｎ'，Ｎ'−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ)ｃａｒｂａｍｏｙｌ]ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ；ＤＣ−Ｃｈｏｌ)、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロマイド(ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ；ＤＤＡＢ)、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロライド(Ｎ−(α−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏａｃｅｔｙｌ)−ｄｉｄｏｄｅｃｙｌ Ｄ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＴＭＡＣ)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｏｇｌｙｃｙｌｓｐｅｒｍｉｎｅ；ＤＯＧＳ)などが合成されてデオキシリボ核酸などの核酸物質の伝達を目的として利用されている。
【０００９】
これら正イオン性脂質は、４級アミン、３級アミン、またはヒドロキシエチル化４級アミンなどが脂質のヘッド部分に連結されて一つの正電荷を提供する種類(ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＤＡＢ、ＴＭＡＣなど)と、スペルミン(ｓｐｅｒｍｉｎｅ)などのポリアミン(ｐｏｌｙａｍｉｎｅ)物質が連結されて多数の正電荷を提供する種類(ＤＯＧＳ)とに区分することもできる。
【００１０】
核酸伝達に用いられる正イオン性脂質の更に他の例は４級アンモニウム塩(ｑｕａｒｔｅｒｎａｒｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ)の界面活性剤(ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ)である。これらは、単一鎖、例えば、セトリメチルアンモニウムブロマイド(ｃｅｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ)または二重鎖、例えば、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド(ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ)等の界面活性剤であり、全て動物細胞に核酸伝達が可能である。 これら４級アンモニウム塩正イオン性脂質の場合、両親媒性 (ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ)に属するアミン基(ａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ)は４級であり、スペーサーアーム(ｓｐａｃｅｒ ａｒｍ)や連結結合(ｌｉｎｋｅｒ ｂｏｎｄ)なしに脂質の単一鎖が１級アミン基についている。しかし、これら両親媒性界面活性剤を用いた剤形もまた一般的に細胞毒性が深刻である問題点を有している。また他の両親媒性物質としてはＤＯＴＭＡの構造に類似な１，２−ジオレオイル−３−(４'−トリメチルアンモニオ)ブタノイル−グリセロル(１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−（４’−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｂｕｔａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ)、コレステリル(４'−トリメチルアンモニオ)ブタノエート（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ（４’−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｂｕｔａｎｏａｔｅ）、１，２−ジオレオイル−３−スクシニル−グリセロルコリンエステル（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｃｈｏｌｉｎｅ ｅｓｔｅｒ）等があるが、これら両親媒性物質は、細胞内の核酸伝達効率(ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ)が一般的に低い。
【００１１】
非ウイルス性ベクターのうち、正イオン性脂質は、レンチウイルスやアデノウイルスなどのウイルス性核酸輸送体に比べて製造方法が簡便で、ウイルスのキャプシドタンパク質による反復投与による免疫副作用が少なく、ウイルスそのものが有する遺伝子による体内安全性の問題が提起されなくて、製造コストまたは製造工程においても産業的に有利という長所がある。しかし、従来に開示されたいろんな核酸伝達用正イオン性脂質は、合成方法、細胞毒性、および細胞内への核酸伝達効率面からまだ補完されなければならない点が多い。よって、合成工程が短くて、細胞毒性の小さく、かつ細胞内へ効率的に核酸物質を伝達する技術の開発が要求される。
【００１２】
核酸物質の外に生理活性タンパク質の場合にも生体内の短い半減期によって薬物動力学的な滞留時間が低く、頻繁な反復投与が要求されることが問題点として指摘されている。生理活性タンパク質の場合、ポリエチレングリコールのような高分子物質との化学的な接合によって生体内の滞留時間を増強させる技術が用いられている。 しかし、このような化学的な接合の場合、タンパク質の生理活性部位が化学的接合によって変形されてタンパク質本来の生理活性が減少する場合が多い。したがって、生理活性タンパク質に化学的な変形を与えず、かつ生体内でタンパク質が分解酵素によって迅速に分解されることを防止しうる伝達体の開発が必要である。特に、負イオン性生理活性タンパク質であるヘパリンなどの場合、正イオン性伝達体と静電気的複合体を形成する場合、化学的な構造の変形なしにも生体内の薬物動力学的な特徴を変化させることができる。
【００１３】
前記問題を解決する為の様々な過度の試験および研究の結果、本発明者は、今までの一般的な正イオン性脂質の合成方法とは異なる、アミン構造を有する脂肪酸誘導体に負イオン性アミノ酸を結合させて正イオン性を付与する方法を開発して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
そこで、本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的とするところは、新規の正イオン性脂質、それの製造方法、およびそれを含む伝達体を提供することにある。
本発明の正イオン性脂質は多様な形態の核酸伝達体または生理活性を保有した負イオン性タンパク質の伝達体で製剤化して細胞内へ目的する物質の伝達を増強させることに用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、下記の一般式（Ｉ）の正イオン性脂質を提供する。
【００１６】
【化１】
【００１７】
前記式において、
【００１８】
ｎは１または２であり、
【００１９】
Ｒ１とＲ２は、それぞれ炭素数１２〜２０個の飽和または不飽和炭化水素である。
【００２０】
本発明の一具体例で、前記Ｒ１とＲ２は、それぞれ炭素数１６個の飽和または不飽和炭化水素であってもよい。
【００２１】
本発明の他の具体例で、前記Ｒ１とＲ２は、それぞれ炭素数１８個の飽和または不飽和炭化水素であってもよい。
【００２２】
前記一般式（Ｉ）で示す本発明の正イオン性脂質は、負電荷を有するアミノ酸グループと疎水性であるＣ１２〜Ｃ２０の飽和または不飽和脂肪酸アミン誘導体とが結合して構成される。
【００２３】
本発明の正イオン性脂質は、親水性のアミノ酸グループと疏水性の脂肪酸部位で構成された両親媒性化合物としてアミノ酸のカルボキシ(−ＣＯＯＨ)グループと脂肪酸誘導体のアミングループ(−ＮＨ２)とのアミド(ａｍｉｄｅ)結合からなる。
【００２４】
よって、本発明は、また、負イオン性アミノ酸のカルボキシルグループ(−ＣＯＯＨ)を脂肪酸アミン誘導体のアミングループ(−ＮＨ２)にアミド結合(ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ)で連結して前記化学式(Ｉ)の正イオン性脂質を製造する方法を提供する。
【００２５】
本発明の正イオン性脂質を構成する脂肪酸アミン誘導体は、炭素数１２〜２０個の飽和または不飽和脂肪酸であればいかなるものであっても可能である。前記脂肪酸アミン誘導体は、例えば、オレイルアミン(ｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ)、ミリスチルアミン(ｍｙｒｉｓｔｙｌａｍｉｎｅ)、パルミチルアミン(ｐａｌｍｉｔｙｌａｍｉｎｅ)、ステアリルアミン(ａｔｅａｒｙｌａｍｉｎｅ)、ラウリルアミン(ｌａｕｒｙｌａｍｉｎｅ)、リノレイルアミン(ｌｉｎｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ)、アラキジルアミン(ａｒａｃｈｉｄｙｌａｍｉｎｅ)などを含む。
【００２６】
本発明の正イオン性脂質を構成するアミノ酸グループとしては、負電荷を有するアミノ酸のうち、炭素数１０個以下のいかなるアミノ酸でも可能であるが、グルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，Ｅ)またはアスパラギン酸(Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ)を用いることが望ましい。
【００２７】
前記一般式(Ｉ)で、ｎ＝１である場合は、アミン構造を有する脂肪酸誘導体をアスパラギン酸と結合させて正イオン性脂質を合成した場合であり、ｎ＝２である場合は、アミン構造を有する脂肪酸誘導体をグルタミン酸と結合させて正イオン性脂質を合成した場合である。
【００２８】
本発明の正イオン性脂質は、生体タンパク質の構成成分であるアミノ酸を用いて簡単な工程で高い収率の合成が可能である。本発明の正イオン性脂質の場合、正常な生体内環境の中性領域ｐＨにてグルタミン酸とアスパラギン酸のアミン基が正電荷の形態で存在するようになるため、前記一般式(Ｉ)の正イオン性脂質は、全体的に細胞内で正電荷の電荷状態を保有するようになる。前記正イオン性脂質の正イオン電荷は、中性領域ｐＨで負電荷を有している各種核酸物質と複合体を形成することを可能にし、また生体内で相対的に負電荷を保有している標的細胞膜との接触を増加させるのに役に立つ。したがって、本発明の正イオン性脂質は、核酸伝達用途のリポソーム、ミセル、エマルションなど多様な形態の核酸伝達体剤形(ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｏｒｍｕａｌｔｉｏｎ)を製造するために用いることができる。
【００２９】
よって、本発明は、また前記化学式(Ｉ)の正イオン性脂質を含む核酸伝達体(ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ)を提供する。本発明において、核酸伝達体は、陰電荷を有する核酸配列との相互作用によって通常的に核酸と結合して細胞内へ流入しうる複合体を形成できる核酸運搬媒介体を示す。
【００３０】
本発明において、核酸は、リボ核酸(ＲＮＡ)、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ)、アンチセンス オリゴヌクレオチド(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ)、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、アプタマー(ａｐｔａｍｅｒ)等を含む。
【００３１】
本発明の具体例で、本発明の正イオン性脂質を含む核酸伝達体は、リボ核酸(ＲＮＡ)、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ)、アンチセンス オリゴヌクレオチド(ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ)、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、アプタマー(ａｐｔａｍｅｒ)等を含む核酸の細胞内への運搬を媒介する。
【００３２】
本発明の核酸伝達体は、リポソーム、ミセル、エマルション、およびナノ粒子で構成される群より選択される剤形（製剤、ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）からなることができる。
【００３３】
また、前記核酸伝達体は、本発明の正イオン性脂質成分の他にもガラクトース脂質誘導体、マンノース脂質誘導体、葉酸脂質誘導体、ポリエチレングリコール脂質誘導体、ビオチン脂質誘導体を更に含むことができる。
【００３４】
本発明の一具体例で、前記核酸伝達体は、前記正イオン性脂質および細胞融合性リン脂質を含有するリポソーム剤形からなるものであってもよい。前記細胞融合性リン脂質は、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；ＤＯＰＥ)、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン(１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ)等を含む。
【００３５】
本発明の他の具体例で、前記核酸伝達体は、前記正イオン性脂質および界面活性剤を含有するミセル剤形からなるものであってもよい。前記界面活性剤は、例えば、ツイン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリエチレングリコールモノオレイルエーテル(ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｍｏｎｏｏｌｅｙｌ ｅｔｈｅｒ)、エチレングリコールモノドデシルエーテル(ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｍｏｎｏｄｏｄｅｃｙｌ ｅｔｈｅｒ)、ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル(ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｍｏｎｏｈｅｘｙｌ ｅｔｈｅｒ)、トリメチルヘキサデシルアンモニウムクロライド（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｄｅｃｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ｄｏｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、シクロヘキシルメチルβ−Ｄ−マルトシド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｍｅｔｈｙｌβ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ）、ペンタエリスリチルパルミテート（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ラウリルジメチルアミンオキサイド(ｌａｕｒｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ−ｏｘｉｄｅ)、またはＮ−ラウロイルサルコシンソジウム塩(Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ)などを含む。
【００３６】
本発明の他の具体例で、前記核酸伝達体は、前記正イオン性脂質および界面活性剤を含有するエマルション剤形からなるものであってもよい。エマルション剤形として使用できる界面活性剤は、正イオン性(ｃａｔｉｏｎｉｃ)、両性イオン性(ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ)、非イオン性(ｎｏｎｉｏｎｉｃ)等に分類される。正イオン性界面活性剤としては、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ｃｅｔｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）などを用いることができ、両性イオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシルベタイン(ｄｏｄｅｃｙｌ ｂｅｔａｉｎｅ)、ドデシルジメチルアミン酸化物(ｄｏｄｅｃｙｌ ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ)、ジメチルパルミチルアンモニオプロパンスルホネート（３−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｙｌｐａｌｍｉｔｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）などを用いることができ、非イオン性界面活性剤としては、ツイン−２０(Ｔｗｅｅｎ ２０)、ツイン−８０(Ｔｗｅｅｎ ８０)、トリトンＸ−１００(Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００)、ポリエチレングリコールモノオレイルエーテル(ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｍｏｎｏｏｌｅｙｌ ｅｔｈｅｒ)、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル(ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｍｏｎｏｄｏｄｅｃｙｌ ｅｔｈｅｒ)、オクチルグルコシド(ｏｃｔｙｌ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ)、またはノナノイルメチルグルカミン(Ｎ−ｎｏｎａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｎｅ)などを用いることができる。
【００３７】
正イオン性リポソーム、ミセル、エマルションなどの剤形からなる本発明の核酸伝達体は、動物細胞内に目的とする核酸の輸送効率を著しく増強させることができ、細胞に対する毒性も減少させる。
【００３８】
本発明の正イオン性脂質を含有した核酸伝達体は、伝達しようとする核酸の使用目的によっていかなる動物細胞へも核酸伝達が可能である。下記の実施例では、前記核酸伝達体の腫瘍細胞(人の子宮頸癌の上皮細胞であるＳｉＨａ細胞株、肺癌細胞であるＡ５４９細胞株、膣粘膜ケラチン細胞株であるＶＫ２細胞株、ネズミの肝癌細胞株であるＨｅｐａ１−６)への核酸伝達効率を評価する。
【００３９】
蛍光標識のついているｄｓＲＮＡであるＢｌｏｃｋ ｉＴ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ)を用いて正イオン性脂質を含有する多様な剤形と複合体を形成して細胞内に伝達してこれを蛍光顕微鏡で観察すると、前記正イオン性脂質の細胞内へ伝達される核酸輸送能力を具体的に測定することができる。また、本発明の核酸伝達体の細胞毒性は、ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅを用いた発色方法(ＭＴＴ)を用いて評価することができる。
【００４０】
本発明で記述された正イオン性脂質を含むリポソーム、ミセル、エマルションなどの核酸伝達体は、多様な細胞において核酸伝達の効率を増強させる目的から既に使われてきた正イオン性脂質であるＤＣ−Ｃｈｏｌを含有した正イオン性リン脂質リポソームより細胞内の輸送度を増加させるだけでなく細胞毒性も著しく減少させることができるため、デオキシリボ核酸、リボ核酸、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー(ａｐｔａｍｅｒ)等の核酸医薬を用いた治療療法などに効果的に使用することができる。
【００４１】
また、本発明は、前記核酸伝達体と核酸の複合体を提供する。リポソーム、ミセル、エマルション、ナノ粒子などの剤形を有する本発明の核酸伝達体は、正イオン性脂質によって正電荷を有するようになるため、核酸伝達体の正電荷と核酸の負イオン性電荷によって単純な混合(ｍｉｘ)によって静電気結合を通じて核酸伝達体と核酸との複合体を形成することができる。
【００４２】
前記核酸伝達体と核酸の複合体は、腫瘍、関節炎、心血管系、内分泌系疾患のような病因性タンパク質の過多発現から発生する各種疾患の治療のために細胞内へ導入されることが可能である。本発明の核酸伝達体は、核酸伝達効率が優秀なだけでなく細胞毒性が低いため、病因性タンパク質の細胞内過多発現を抑制して優秀な疾患治療の効果を得ることができる。
【００４３】
よって、本発明は、また前記核酸伝達体と核酸の複合体を有効性分として含む病因性タンパク質の細胞内過多発現から発生する疾患を予防または治療するための組成物などの核酸医薬治療剤、核酸医薬治療剤の製造のための前記核酸伝達体と核酸複合体の使用、および治療上有効量の前記核酸伝達体と核酸複合体を対象体の細胞内へ導入することを含む腫瘍、関節炎、心血管系、内分泌系疾患などのような病因性タンパク質の過多発現から発生する各種疾患の予防または治療方法を提供する。
【００４４】
本発明の核酸医薬治療剤により、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、細胞内部に目的とする核酸を導入するようになると、標的タンパク質の発現を選択的に減少させるか、あるいは標的遺伝子に発生した変異を修正する役割を果たして病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患や標的遺伝子によって発生した疾患などを治療できるようになる。
【００４５】
本発明において、前記核酸伝達体と核酸の複合体の治療上有効量は、疾患治療の効果を期待するために投与に要求される量を意味する。したがって、疾患の種類、疾患の重症度、投与される核酸の種類、剤形の種類、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および治療期間、同時に使われる化学抗癌剤などの薬品をはじめて多様な因子によって調節されることが可能である。成人に前記核酸医薬治療剤を、例えば、１日１回投与する時、０．００１ ｍｇ／Ｋｇ〜１００ｍｇ／Ｋｇの容量で投与することが望ましい。
【００４６】
代替的には、本発明の正イオン性脂質は、核酸の代わりに負イオン性タンパク質と複合体を形成して負イオン性タンパク質を細胞内に伝達する用途でも利用可能である。
【００４７】
本発明は、前記タンパク質伝達体と負イオン性タンパク質の複合体を提供する。本発明の核酸伝達体の剤形と同様に前記タンパク質伝達体もまたリポソーム、ミセル、エマルション、ナノ粒子などの剤形を有することができ、正イオン性脂質成分の他に核酸伝達体が追加で包含できるもので例示した構成成分をまた含むことができる。本発明のタンパク質伝達体は、正イオン性脂質によって正電荷を有するようになるため、伝達体の正電荷と輸送されるタンパク質の負イオン性電荷によって単純な混合(ｍｉｘ)によって静電気結合を通じて伝達体と負イオン性タンパク質との複合体を形成することができる。
【００４８】
前記タンパク質伝達体と負イオン性タンパク質の複合体は、腫瘍、関節炎、心血管系、内分泌系疾患などに対する治療効能を有する負イオン性生理活性タンパク質の生体内の安全性および有効性の増加のために導入することができる。本発明の正イオン性脂質で構成されたタンパク質伝達体は、負イオン性タンパク質と複合体の形成によって生体内でタンパク質分解酵素に対する抵抗性を付与することができ、細胞毒性が低いため生体内で向上された治療効果を得ることができる。
【００４９】
よって、本発明は、また前記タンパク質伝達体と負イオン性タンパク質の複合体を有効性分として含むタンパク質医薬治療剤、タンパク医薬治療剤の製造のための前記伝達体と負イオン性タンパク質との複合体の使用および治療上有効量の前記伝達体とタンパク質の複合体を対象体の細胞内に導入することを含む腫瘍、関節炎、心血管系、内分泌系疾患などを含む各種疾患の治療方法を提供する。
【００５０】
また、本発明の正イオン性脂質は、ｅｘ ｖｉｖｏで核酸アプタマーを用いる診断キットの構成成分としても利用することができる。例えば、診断用プレートの表面を正イオン性脂質でコーティングし、このコーティング面の上にアプタマーを結合させる場合、試料中のアプタマーと選択的に反応する物質の存在を診断するのに使用可能である。したがって、本発明は、本発明の正イオン性脂質でコーティングされたプレートを含む診断キットを提供する。前記診断キットの正イオン性脂質コーティング面には、アプタマーが結合されていることがある。
【発明の効果】
【００５１】
上述した通り、本発明の正イオン性脂質は、製造および精製工程が簡便で大量生産時の経済性が高い。また、本発明の正イオン性脂質を含む核酸またはタンパク質伝達体は、目的するデオキシリボ核酸、リボ核酸、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー(ａｐｔａｍｅｒ)等の核酸医薬や生理活性を保有した負イオン性タンパク質を細胞内に輸送する効率を顕著に増強させるだけでなく、細胞毒性を減少させて核酸またはタンパク質医薬の治療効能を増強させる用途で有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例１でグルタミン酸とオレインアミンとを結合して製造した正イオン性脂質ジオレオイルグルタミド（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ）の水素核磁気共鳴分光器（１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)の測定結果を示した図である。
【図２】蛍光標識のついているｄｓＲＮＡを用いて比較例１の正イオン性リポソームと複合体形態で伝達した場合(Ａ，Ｃ)と、本発明の正イオン性脂質を含む実施例１１のリポソーム剤形を用いた場合(Ｂ，Ｄ)のｄｓＲＮＡの伝達程度を人の肺腫瘍細胞株のＡ５４９細胞株にて位相差顕微鏡(Ａ，Ｂ)と蛍光顕微鏡(Ｃ，Ｄ)を用いてそれぞれ観察した写真である。
【図３】蛍光標識のついているｄｓＲＮＡを用いて比較例１の正イオン性リポソームと複合体形態で伝達した場合(Ａ，Ｃ)と、本発明の正イオン性リン脂質を含む実施例１３のリポソーム剤形を用いた場合(Ｂ，Ｄ)のｄｓＲＮＡの伝達程度を人の子宮頸癌の上皮細胞であるＳｉＨａ細胞株にて位相差顕微鏡(Ａ，Ｂ)と蛍光顕微鏡(Ｃ，Ｄ)を用いてそれぞれ観察した写真である。
【図４】蛍光標識のついているｄｓＲＮＡを用いて比較例１の正イオン性リポソームと複合体形態で伝達した場合(Ｂ，Ｄ)と、本発明の正イオン性リン脂質を含む実施例１４のミセル剤形を用いた場合(Ｃ，Ｅ)のｄｓＲＮＡの伝達程度を人の子宮癌細胞のＶＫ２細胞株にて位相差顕微鏡(Ｂ，Ｃ)と蛍光顕微鏡(Ｄ，Ｅ)を用いてそれぞれ観察した写真である(図４Ａは、対照群として何も処理していないＶＫ２細胞株の位相差顕微鏡の写真である)。
【図５】蛍光標識のついているｄｓＲＮＡを用いて比較例１の正イオン性リポソームと複合体形態で伝達した場合(Ａ，Ｃ)と、本発明の正イオン性脂質を含む実施例１６のエマルション剤形を用いた場合(Ｂ，Ｄ)のｄｓＲＮＡの伝達程度をネズミの肝癌細胞株のＨｅｐａ１−６細胞株にて位相差顕微鏡(Ａ，Ｂ)と蛍光顕微鏡(Ｃ，Ｄ)を用いて観察した写真である。
【図６】比較例１、２のリポソーム剤形(Ｄ，Ｃ)と本発明の正イオン性脂質を含む実施例１２、１４、１７のリポソーム、ミセル、エマルション剤形をそれぞれ用いた場合(Ｅ，Ｆ、Ｇ)の、スタット３(ｓｔａｔ３)選択的ｄｓＲＮＡの人の肺癌細胞株であるＡ５４９細胞内への伝達効能をＲＴ−ＰＣＲで評価した、ターゲット遺伝子のスタット３の転写体発現をＧＡＰＤＨ(ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ)の転写体発現と比較した写真である(Ａは、何も処理していない細胞そのものを用いた対照群、Ｂは、スタット３選択的低分子干渉ＲＮＡの単独処理群を示す)。
【図７】比較例１、２のリポソーム剤形(Ｄ，Ｃ)と本発明の正イオン性脂質を含む実施例１１、１６、２０のリポソーム、エマルション、ミセル剤形をそれぞれ用いた場合(Ｅ，Ｆ，Ｇ)の、スタット３(ｓｔａｔ３)選択的ｄｓＲＮＡの人の子宮頸癌細胞株であるＨｅＬａ細胞内への伝達効能を、ＲＴ−ＰＣＲで評価した、ターゲット遺伝子であるスタット３の転写体発現をＧＡＰＤＨ(ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ)の転写体(ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ)発現と比較した写真である(Ａは、何も処理していない細胞そのものを用いた対照群、Ｂは、スタット３選択的低分子干渉ＲＮＡ単独処理群を示す。
【図８】ターゲット遺伝子であるｂｃｌ−２に選択的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて比較例１、２のリポソーム剤形(Ｄ，Ｃ)と本発明の正イオン性脂質を含む実施例１２、１５、１７のリポソーム、ミセル、エマルション剤形をそれぞれ用いた場合(Ｅ，Ｆ，Ｇ)の、ｂｃｌ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内の伝達効能を、ＲＴ−ＰＣＲを実施して、ターゲットであるｂｃｌ−２転写体(ｔｒａｓｃｒｉｐｔ)発現抑制を比較した写真である(Ａは、何も処理していない細胞自体を用いた対照群、Ｂは、ｂｃｌ−２選択的アンチセンスオリゴヌクレオチド単独処理群を示す)。
【図９】緑色蛍光タンパク質(ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ)の発現を選択的に抑制するｓｉＲＮＡを用いて比較例２のリポソーム剤形(Ｂ，Ｅ)と本発明の正イオン性脂質を含む実施例１２のリポソーム剤形を用いた場合(Ｃ，Ｆ)の、ｓｉＲＮＡの人の腎臓細胞株である２９３Ｔ細胞内への伝達効能を、緑色蛍光タンパク質の発現抑制程度として位相差顕微鏡(Ｂ，Ｃ)および蛍光顕微鏡(Ｅ，Ｆ)でそれぞれ比較した写真である(図９Ａは、何も処理していない２９３Ｔ細胞の位相差顕微鏡の観察結果であり、図９Ｄは、蛍光顕微鏡の観察結果を示す)。
【図１０】本発明の正イオン性脂質を含む実施例１１、１３、１６のリポソーム、エマルション剤形とｄｓＲＮＡの複合体を肺癌細胞株であるＡ５４９に対して細胞毒性実験を実施した結果である。
【図１１】本発明の正イオン性脂質を含む実施例１２、１８、１９のリポソーム剤形とｄｓＲＮＡの複合体を人の子宮頸癌細胞株であるＳｉＨａに対して細胞毒性実験を実施した結果である。
【図１２】本発明の正イオン性脂質を含む実施例１１、１４、１７のリポソーム、ミセル、エマルション剤形とｄｓＲＮＡの複合体を人の膣粘膜ケラチン細胞株(ｖａｇｉｎａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ)のＶＫ２に対して細胞毒性実験を実施した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明の利点及び特徴、そしてそれを達成する方法は、添付する図面とともに詳細に後述されている実施例を参照すると、明確となるだろう。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるのではなく、他の異なる形態に多様に具現することができる。本実施例はただ、本発明の開示が完全になるようにし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範囲を完全に知らせるために提供されるのであり、本発明は、請求項の範囲によって定義されるだけである。
【実施例】
【００５４】
＜新規の正イオン性脂質の合成＞
（実施例１．ジオレオイルグルタミド(ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)の合成）
１-１)．１当量(１．４７ｇ，１０ｍｍｏｌ)のグルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)をトリフルオロ酢酸(ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ) ５ｍｌとジクロロメタン(ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ)５ｍｌに入れて、４０℃にて１時間の撹はんを行った。撹はんの後、反応物にアイスバス中でＳＯＣｌ２３当量(２．１８ｍｌ，３０ｍｍｏｌ)を徐々に滴下させて、０〜４０℃で６時間反応させた。反応の後、トリフルオロ酢酸とジクロロメタンを減圧濃縮して除去して薄層クロマトグラフィー法(ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＴＣＬ)で反応可否を確認した。
【００５５】
１-２)．実施例１-１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、オレイルアミン(ｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ) １．５当量(４．０１ｇ，１５ｍｍｏｌ)をジクロロメタンに溶かして徐々に滴下させた。アイスバス中で１時間の撹はんの後、トリエチルアミン(ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ) ３ｍｌを滴下させて０〜５０℃で４時間反応させた。反応の後、トリエチルアミンとジクロロメタンを減圧濃縮して除去させた後、得られた生成物をエチルアセテート(ｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ)に溶かして過飽和塩化ナトリウム溶液で２回洗浄して未反応グルタミン酸を除去させた。生成物が溶けているエチルアセテート中の微量の水分を塩化マグネシウム(ＭｇＣｌ２)で除去した後、ＴＬＣで反応可否を確認した。生成物が溶けているエチルアセテートを減圧濃縮して除去させた後、真空状態で一夜乾燥して淡い茶色の強い粘度を有した液体生成物(４．１２ｇ，収得率９２．８％)を得た。最終的に得られた生成物の正確な構造を水素核磁気共鳴分光器（１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。図１は、グルタミン酸とオレイルアミンのアミド結合(ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ)部分の水素が８．０ｐｐｍで検出され、グルタミン酸によるアミンの水素が２．０ｐｐｍで検出され、オレイルアミンの特徴的な二重結合の部分の水素が５．４２ｐｐｍで検出されることを示す。
【００５６】
１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ):８．０(１Ｈ，グルタミン酸とオレイルアミンの−ＮＨ−ＣＯ)
２．０(２Ｈ，グルタミン酸の−ＮＨ２)
５．４２(２Ｈ，オレイルアミンの−ＣＨ＝ＣＨ−)
【００５７】
下記の反応式１に前記実施例１の反応過程を示した。
【化２】
前記反応式１のＲ１とＲ２は、それぞれ炭素数１８の不飽和(Ｃ９)炭化水素である。
【００５８】
（実施例２．ジミリストイルグルタミド(ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)の合成）
２-１)．２当量のグルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
【００５９】
２-２)．実施例２-１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、ミリスチルアミン(ｍｙｒｉｓｔｙｌａｍｉｎｅ)１．５当量(３．２０ｇ，１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の固体生成物(３．２２ｇ，収得率８５．７％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を利用して確認した。
【００６０】
１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ):８．０(１Ｈ，グルタミン酸とミリスチルアミンの−ＮＨ−ＣＯ)
２．０(２Ｈ，グルタミン酸の−ＮＨ２)
１．２９(２Ｈ，ミリスチルアミンの−ＣＨ２−)
【００６１】
下記の反応式２に前記実施例２の反応過程を示した。
【化３】
前記反応式２のＲ１とＲ２は、それぞれ炭素数１４の飽和炭化水素である。
【００６２】
（実施例３．ジパルミトイルグルタミド（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｇｌｕｔａｍｉｄｅ)の合成）
３−１)．２当量のグルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
【００６３】
３−２)．実施例３−１）で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、パルミチルアミン(ｐａｌｍｉｔｙｌａｍｉｎｅ) １．５当量(３．６２ｇ，１５ｍｍｏｌを用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の固体生成物(３．７４ｇ，収得率９０．１％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を利用して確認した。
【００６４】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）：８．０(１Ｈ，グルタミン酸とパルミチルアミンの−ＮＨ−ＣＯ)
２．０(２Ｈ，グルタミン酸の−ＮＨ２)
１．２９(２Ｈ，パルミチルアミンの−ＣＨ２−)
【００６５】
下記反応式３に前記実施例３の反応過程を示した。
【化４】
前記反応式３のＲ１とＲ２はそれぞれ炭素数１６の飽和炭化水素である。
【００６６】
（実施例４．ジステアロイルグルタミド(ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)の合成）
４−１)．２当量のグルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
【００６７】
４-２)．実施例４-１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、ステアリルアミン（ｓｔｅａｒｙｌａｍｉｎｅ）１．５当量(４．０４ｇ，１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の固体生成物(３．９６ｇ，収得率８７．１％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。
【００６８】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）:８．０(１Ｈ，グルタミン酸とステアリルアミンの−ＮＨ−ＣＯ)
２．０(２Ｈ，グルタミン酸の−ＮＨ２)
１．２９(２Ｈ，ステアリルアミンの−ＣＨ２−)
【００６９】
下記の反応式４に前記実施例４の反応過程を示した。
【化５】
前記反応式４のＲ１とＲ２はそれぞれ炭素数１８の飽和炭化水素である。
【００７０】
（実施例５．ジラウロイルグルタミド(ｄｉｌａｕｒｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)の合成）
５-１)．２当量のグルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
【００７１】
５−２)．実施例５−１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、ラウリルアミン(ｌａｕｒｙｌａｍｉｎｅ) １．5当量(２．７８ｇ，１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の固体生成物(３．３２ｇ，収得率９１．９％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。
【００７２】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）:８．０(１Ｈ，グルタミン酸とオレイルアミンの−ＮＨ−ＣＯ)
２．０(２Ｈ，グルタミン酸の−ＮＨ２)
１．２９(２Ｈ，ラウリルアミンの−ＣＨ２−)
【００７３】
下記反応式５に前記実施例５の反応過程を示した。
【化６】
前記反応式５のＲ１とＲ２は、それぞれ炭素数１２の飽和炭化水素である。
【００７４】
（実施例６．ジリノレオイルグルタミド(ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌｇｌｕｔａｍｉｄｅ)の合成）
６−１)．２当量のグルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
【００７５】
６-２)．実施例６−１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、リノレイルアミン(ｌｉｎｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ) １．５当量(３．９８ｇ，１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１−２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の強い粘度を有した液体生成物(３．７２ｇ，収得率８２．８％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。
【００７６】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）:８．０(１Ｈ，グルタミン酸とリノレイルアミンの−ＮＨ−ＣＯ)
２．０(２Ｈ，グルタミン酸の−ＮＨ２)
５．４９，２．６３(３Ｈ，リノレイルアミンの＝ＣＨ−ＣＨ２-)
【００７７】
下記反応式６に前記実施例６の反応過程を示した。
【化７】
前記反応式６のＲ１とＲ２は、それぞれ炭素数１８の二重不飽和(Ｃ９，Ｃ１２)炭化水素である。
【００７８】
（実施例７．ジアラキドイルグルタミド(ｄｉａｒａｃｈｉｄｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)の合成）
７-１)．２当量のグルタミン酸(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
【００７９】
７-２)．実施例７-１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、アラキジルアミン(ａｒａｃｈｉｄｙｌａｍｉｎｅ) １．５当量(４．４６ｇ，１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の固体生成物(３．９５ｇ，収得率８０．２％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。
【００８０】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）:８．０(１Ｈ，グルタミン酸とアラキジルアミンの−ＮＨ−ＣＯ)
２．０(２Ｈ，グルタミン酸の−ＮＨ２)
１．２９(２Ｈ，アラキジルアミンの−ＣＨ２−)
【００８１】
下記反応式７に前記実施例７の反応過程を示した。
【化８】
前記反応式７のＲ１とＲ２はそれぞれ炭素数２０の飽和炭化水素である。
【００８２】
（実施例８．ジパルミトイルアスパルタミド(ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ)の合成）
８-１)．２当量のアスパラギン酸(ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてアスパラギン酸誘導体生成物を得た。
【００８３】
８-２)．実施例８−１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、パルミチルアミン(ｐａｌｍｉｔｙｌａｍｉｎｅ) １．５当量(３．６２ｇ，１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の固体生成物(３．５９ｇ，収得率８８．６％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。
【００８４】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）:８．０(１Ｈ，アスパラギン酸とパルミチルアミンの−ＮＨ−ＣＯ-)
２．０(２Ｈ、アスパラギン酸の−ＮＨ２)
１．２９(２Ｈ、パルミチルアミンの−ＣＨ２−)
【００８５】
下記反応式８に前記実施例８の反応過程を示した。
【化９】
前記反応式８のＲ１とＲ２はそれぞれ炭素数１６の飽和炭化水素である。
【００８６】
（実施例９．ジステアロイルアスパルタミド(ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ)の合成）
９−１)．２当量のアスパラギン酸(ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてアスパラギン酸誘導体生成物を得た。
【００８７】
９−２)． 実施例９−１）で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、ステアリルアミン(ｓｔｅａｒｙｌａｍｉｎｅ) １．５当量(４．０４ｇ，１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の固体生成物(４．０２ｇ，収得率９０．４％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。
【００８８】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）: ８．０(１Ｈ，アスパラギン酸とステアリルアミンの−ＮＨ−ＣＯ-)
２．０(２Ｈ，アスパラギン酸の−ＮＨ２)
１．２９(２Ｈ、ステアリルアミンの−ＣＨ２−)
【００８９】
下記反応式９に前記実施例９の反応過程を示した。
【化１０】
前記反応式９のＲ１とＲ２は、それぞれ炭素数１８の飽和炭化水素である。
【００９０】
（実施例１０．ジオレオイルアスパルタミド(ｄｉｏｌｅｏｙｌ ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ)の合成）
１０-１．２当量のアスパラギン酸(ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ)を実施例１-１)と同じ方法で反応させてアスパラギン酸誘導体生成物を得た。
【００９１】
１０-２)．実施例１０-１)で得られた反応生成物をジクロロメタンに溶かした後、オレイルアミン(ｏｌｅｙｌａｍｉｎｅ) １．５当量(４．０１ｇ、１５ｍｍｏｌ)を用いて実施例１-２)と同じ方法で反応させた後、淡い茶色の強い粘度を有した液体生成物(４．０７ｇ，収得率９２．１％)を得て正確な構造を水素核磁気共鳴分光器(１ＨＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ)を用いて確認した。
【００９２】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，ｐｐｍ）:８．０(１Ｈ、アスパラギン酸とオレイルアミンの−ＮＨ−ＣＯ-)
２．０(２Ｈ，アスパラギン酸の−ＮＨ２)
５．４２(２Ｈ，オレイルアミンの−ＣＨ＝ＣＨ−)
【００９３】
下記反応式１０に前記実施例１０の反応過程を示した。
【化１１】
前記反応式１０のＲ１とＲ２はそれぞれ炭素数１８の不飽和(Ｃ９)炭化水素である。
【００９４】
＜正イオン性脂質を含有する核酸伝達体の製造＞
（実施例１１．ジオレイルグルタミドを含有する正イオン性リポソームの製造）
実施例１で製造した正イオン性脂質のジオレオイルグルタミド(ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)と細胞融合性リン脂質のＤＯＰＥ(Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ)をそれぞれ１ｍｌのクロロホルムに溶かした後、モル比１:１の割合でパイレックス（登録商標）１０ｍｌガラス隔膜バイアルに入れて混合した後、窒素環境ですべてのクロロホルムが蒸発する時まで低い速度で回転蒸発させて脂質薄膜フィルムを製造した。多重層の脂質膜を有するリポソーム(ｌｉｐｉｄ ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ)を製造するためにこの薄膜フィルムにリン酸緩衝溶液１ｍｌを添加してバイアルを３７℃にして密封後３分間撹はん(ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ)した。均一な大きさを作るためにこれをエクストルーダー(ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｃ．，Ｃａｎａｄａ)を用いて０．２μｍポリカーボネート膜を３回通過させて製造した。得られた正イオン性リポソームは用いる前まで４℃で保管した。
【００９５】
（実施例１２．ジミリストイルグルタミドを含有する正イオン性リポソームの製造）
実施例２で製造した正イオン性脂質であるジミリストイルグルタミド(ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)と細胞融合性リン脂質であるＤＯＰＥ(Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ)をそれぞれ１ｍｌのクロロホルムに溶かした後、モル比１:１の割合でパイレックス（登録商標）１０mlガラス隔膜バイアルに入れて混合した後、実施例１１と同じ方法で正イオン性リポソームを製造した。
【００９６】
（実施例１３．ジステアロイルグルタミドを含有する正イオン性リン脂質リポソーム製造）
実施例４で製造した正イオン性脂質のジステアロイルグルタミド(ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)と細胞融合性リン脂質である１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン，ＤｐｈＰＥ（１，２−ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ） （Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）をそれぞれ１ｍｌのクロロホルムに溶かした後、モル比１:１の割合でパイレックス（登録商標）１０ｍｌガラス隔膜バイアルに入れて混合した後、実施例１１と同じ方法で正イオン性リポソームを製造した。
【００９７】
（実施例１４．ジミリストイルグルタミドを含有する正イオン性ミセル(ｍｉｃｅｌｌｅ)の製造）
実施例２で製造した正イオン性脂質のジミリストイルグルタミド(ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)と界面活性剤のＴｗｅｅｎ ２０を１:１のモル割合で混合した後、混合液対比リン酸緩衝溶液を１:１０の体積割合で混合して数回振とう混合(ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ)した後、約１分間、超音波発生器を使って正イオン性ミセルを製造した。
【００９８】
（実施例１５．ジアラキドイルグルタミドを含有する正イオン性ミセル(ｍｉｃｅｌｌｅ)製造）
実施例７で製造した正イオン性脂質であるジアラキドイルグルタミド(ｄｉａｒａｃｈｉｄｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)と界面活性剤のポリエチレングリコールモノオレイルエーテル（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｍｏｎｏｏｌｅｙｌ ｅｔｈｅｒ）を１:２のモル割合で混合した後、混合液対比リン酸緩衝溶液を１:１０の体積割合で混合して数回振とう混合(ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ)した後、約１分間、超音波発生器を使って正イオン性ミセルを製造した。
【００９９】
（実施例１６．ジパルミトイルアスパルタミドを含有する正イオン性エマルション(ｅｍｕｌｓｉｏｎ)製造）
実施例８で製造した正イオン性脂質のジパルミトイルアスパルタミド(ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ)とＴｗｅｅｎ８０を１:０．１のモル割合で混合して混合物をリン酸緩衝溶液に１:１０の体積割合で加えた後、ホモジナイザー(ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ)を用いて約２分間均質化させて油滴が水内に分散された水中油型(ｏ／ｗ型)正イオン性エマルションを製造した。
【０１００】
（実施例１７．ジオレオイルアスパルタミドを含有する正イオン性エマルション(ｅｍｕｌｓｉｏｎ)製造）
実施例１０で製造した正イオン性脂質のジオレオイルアスパルタミド(ｄｉｏｌｅｏｙｌ ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ)とＴｗｅｅｎ８０を１:０．１のモル割合で混合して混合物をリン酸緩衝溶液に１:１０の体積割合で加えた後、ホモジナイザーを用いて約２分間均質化させて油滴が水内に分散した水中油型(ｏ／ｗ型)正イオン性エマルションを製造した。
【０１０１】
（実施例１８．ジパルミトイルグルタミドおよびガラクトース脂質誘導体を含有する正イオン性リポソーム製造）
実施例３で製造した正イオン性脂質のジパルミトイルグルタミド(ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)、細胞融合性リン脂質であるＤｐｈＰＥ(Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｄ．，ＵＳＡ)、およびガラクトース脂質誘導体のセレブロシド(ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ) (Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｄ．，ＵＳＡ)をそれぞれ１ｍｌのクロロホルムに溶かした後１:１:０．０５のモル割合で実施例１１と同じ方法で正イオン性リポソームを製造して表面にガラクトース残基(ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｍｏｉｅｔｙ)が存在する正イオン性リポソームを製造した。
【０１０２】
（実施例１９．ジアラキドイルグルタミドおよびポリエチレングリコール脂質誘導体を含有する正イオン性リン脂質リポソームの製造）
実施例７で製造した正イオン性脂質であるジアラキドイルグルタミド(ｄｉａｒａｃｈｉｄｏｙｌ ｇｌｕｔａｍｉｄｅ)と細胞融合性リン脂質であるＤＯＰＥ(Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｄ．，ＵＳＡ)、ポリエチレングリコール脂質誘導体の１，２−ｄｉａｃｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［ｍｅｔｈｏｘｙ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−３０００（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｄ．，ＵＳＡ)をそれぞれ１ｍｌのクロロホルムに溶かした後、１:１:０．０５のモル割合で実施例１１と同じ方法で正イオン性リポソームを製造して表面にポリエチレングリコール グループが存在する正イオン性リポソームを製造した。
【０１０３】
（実施例２０．ジステアロイルアスパルタミドおよび葉酸脂質誘導体を含有する正イオン性リン脂質ミセルの製造）
実施例９で製造した正イオン性脂質のジステアロイルアスパルタミド(ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ)と葉酸脂質誘導体１，２-ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−[ｆｏｌａｔｅ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ)−２０００ (Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｄ．，ＵＳＡ)および界面活性剤のＴｗｅｅｎ ２０をそれぞれ１:０．０５:１のモル割合で混合した後、１:１０の混合液：リン酸緩衝溶液の体積割合で混合して数回振とう混合(ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ)した後、約１分間、超音波発生器を使って正イオン性ミセルを製造した。
【０１０４】
[比較例１]既存の正イオン性脂質を用いたリポソーム製造
正イオン性脂質であるＤＣ−Ｃｈｏｌ (Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｄ．，ＵＳＡ)と細胞融合性リン脂質のＤＯＰＥ(Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｄ．，ＵＳＡ)をそれぞれ１ｍｌのクロロホルムに溶かした後、モル比１:１の割合でパイレックス（登録商標）１０mlガラス隔膜バイアルに入れて混合した後、窒素環境ですべてのクロロホルムが蒸発される時まで低い速度で回転蒸発させて脂質薄膜フィルムを製造した。多重層の脂質膜を有するリポソーム(ｌｉｐｉｄ ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ)を製造するためにこの薄膜フィルムにリン酸緩衝溶液１ｍｌを添加してバイアルを３７℃にして密封後３分間撹はん(ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ)した。均一な大きさを作るためにこれをエクストルーダー(ｅｘｔｒｕｄｅｒ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｃ．，Ｃａｎａｄａ)を用いて０．２μｍポリカーボネート膜を３回通過させて製造した。得られた正イオン性リポソームは用いる前まで４℃で保管した。
【０１０５】
[比較例２]既存の市販品である正イオン性リポソーム
既存の販売されている正イオン性リポソームであるＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を購入して説明書に記載された方法のとおりに使った。
【０１０６】
[実験例]正イオン性脂質含有核酸伝達体の核酸伝達効率評価
（細胞培養）
人の子宮癌細胞株であるＳｉＨａおよびＨｅＬａ、人の膣粘膜ケラチン細胞株(ｖａｇｉｎａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ)であるＶＫ２、人の肺癌細胞株であるＡ５４９、人の腎臓細胞株である２９３Ｔ、ネズミ(ｍｏｕｓｅ)の肝癌細胞株であるＨｅｐａ１−６は米国細胞株銀行(Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ，ＵＳＡ)から購入して使った。ＳｉＨａ、Ｈｅｐａ１−６細胞株は１０％ウシ胎児血清ｗ／ｖ (ＣｙＣｌｏｎｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，ＵＳＡ)と１００ ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリンまたは１００μg／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ(Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅｓ ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ)に培養した。Ａ５４９細胞株は、１０％のウシ胎児血清とペニシリン、ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０(Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ)で培養した。ＶＫ２細胞株は、０．１ ｎｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ再組合上皮細胞成長因子(Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ)、０．０５ｍｇ／ｍｌウシ脳下垂体抽出物(ｂｏｖｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＰＥ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ)）と１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリンまたは１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ(Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ)培地に培養した。
【０１０７】
[実験例Ｉ] 蛍光標識のついている低分子干渉ＲＮＡを用いた核酸伝達効率評価
Ｉ-１．Ａ５４９細胞株における低分子干渉ＲＮＡの伝達効率評価
Ａ５４９細胞株を実験前日、２４ウェルプレートにウェル当たり８×１０４個ずつ播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)し、各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル当たり５００μｌずつ添加した。エッペンドルフ チューブに血清が含まれていない培地５０μｌずつを入れて蛍光標識のついている低分子干渉ＲＮＡ物質であるＢｌｏｃｋ−ｉＴ(２０μｍｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ)２μｌずつと比較例１と実施例１１で製造された正イオン性リポソーム１０μｌをそれぞれ添加した。これらを徐々にピペット操作(ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ)して混合した後、室温で２０分間放置した。このように製造された複合体をウェルプレートに添加して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。培養された細胞のメディアをウェル当たり５００μｌずつ新しいメディアに交換した後、蛍光顕微鏡で遺伝子伝達効率を観察した。図２は、比較例１(Ａ，Ｃ)と実施例１１(Ｂ，Ｄ)から製造された正イオン性リポソームの核酸伝達効率を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡で観察したものであって、Ａは比較例処理時の位相差顕微鏡の写真であり、Ｂは実施例１１の組成処理時の位相差顕微鏡の写真である。またＣは、比較例処理時の蛍光マーカーで表示された低分子干渉ＲＮＡの細胞内への伝達を見せる蛍光顕微鏡の写真であり、Ｄは実施例１１の組成処理時の蛍光顕微鏡の写真である。本図面から実施例１１で本発明の正イオン性脂質を含有して製造された正イオン性リポソームが比較例１で製造された公知組成のリポソームよりＡ５４９細胞内で低分子干渉ＲＮＡの伝達効率を増加させることが分かる。
【０１０８】
Ｉ-２．ＳｉＨａ細胞株における低分子干渉ＲＮＡの伝達効率評価
ＳｉＨａ細胞株を実験前日２４ウェルプレートにウェル当たり８×１０４個ずつ播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)した。各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル当たり５００μｌずつ添加した。実験例Ｉ-１と同様の方法で比較例１および実施例１３の正イオン性リポソームとＢｌｏｃｋ ｉＴとの複合体をそれぞれ製造してウェルプレートに添加して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。培養された細胞のメディアをウェル当たり５００μｌずつ新しいメディアに交換した後、蛍光顕微鏡で核酸伝達効率を観察した。図３は、比較例１(Ａ，Ｃ)と実施例１３(Ｂ，Ｄ)から製造された正イオン性リポソームの核酸伝達効率を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡とでそれぞれ観察したものであって、Ａは比較例１のリポソーム処理時の位相差顕微鏡の写真であり、Ｂは実施例１３のリポソーム処理時の位相差顕微鏡の写真である。またＣは、比較例処理時の蛍光標識のついている低分子干渉ＲＮＡの細胞内の伝達を見せる蛍光顕微鏡の写真であり、Ｄは実施例１３のリポソーム処理時の蛍光顕微鏡の写真である。 本図面から実施例１３で製造された新規の正イオン性脂質含有リポソームが比較例１の公知の正イオン性脂質含有リポソームよりＳｉＨａ細胞内で低分子干渉ＲＮＡの伝達効率を増加させることがわかる。
【０１０９】
Ｉ−３．ＶＫ２細胞株における低分子干渉ＲＮＡの伝達効率評価
ＶＫ２細胞株を実験前日２４ウェルプレートにウェル当たり８×１０４個ずつ播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)し、各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル当たり５００μｌずつ添加した。実験例Ｉ-１と同様の方法で比較例１の正イオン性リポソームおよび実施例１４の正イオン性ミセルとＢｌｏｃｋ ｉＴとの複合体をそれぞれ製造してウェルプレートに添加して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。 培養された細胞のメディアをウェル当たり５００μｌずつ新しいメディアに交換した後、蛍光顕微鏡で核酸伝達効率を観察した。図４は比較例１(Ｂ，Ｄ)の正イオン性リポソームと実施例１４(Ｃ，Ｅ)から製造された正イオン性リン脂質ミセルの核酸伝達効率を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡で観察したもので、本図面から実施例１４で製造された正イオン性脂質含有ミセル(図４Ｅ)が比較例１で使われた公知の正イオン性脂質含有リポソーム(図４Ｄ)よりＶＫ２細胞内で低分子干渉ＲＮＡの伝達効率を増加させることがわかる。また位相差顕微鏡で観察される細胞の形態の側面からも比較例１の組成を処理した場合の細胞状態(図４Ｂ)は、細胞が形の収縮した形態が多く、何も処理していない対照群状態の図４Ａに比べて細胞の形態が変形されたものが観察される反面、実施例１４の正イオン性ミセル処理時の細胞状態は、図４Ｃに示されるように何も処理していない対照群状態の図４Ａの細胞と類似の様相を示して細胞形態面から細胞毒性が顕著に減少したことが分かる。
【０１１０】
Ｉ−４．Ｈｅｐａ １−６細胞株における低分子干渉ＲＮＡの伝達効率評価
Ｈｅｐａ １−６細胞株を実験前日２４ウェルプレートにウェル当たり８×１０４個ずつ播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)し、各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル当たり５００μｌずつ添加した。実験例Ｉ-１と同様の方法で比較例１の正イオン性リポソームおよび実施例１６の正イオン性エマルションとＢｌｏｃｋ ｉＴとの複合体をそれぞれ製造してウェルプレートに添加して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。培養された細胞のメディアをウェル当たり５００μｌずつ新しいメディアに交換した後、蛍光顕微鏡で核酸伝達効率を観察した。図５は比較例１(Ａ，Ｃ)の正イオン性リポソームと実施例１６(Ｂ，Ｄ)から製造された正イオン性リン脂質エマルションの核酸伝達効率を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡で観察したもので、Ａは比較例１のリポソーム処理時の位相差顕微鏡の写真であり、Ｂは実施例１６の正イオン性エマルション処理時の位相差顕微鏡の写真である。またＣは、比較例１のリポソーム処理時の蛍光標識のついている低分子干渉ＲＮＡの細胞内伝達を示す蛍光顕微鏡の写真であり、Ｄは、実施例１６の正イオン性エマルション処理時の蛍光顕微鏡の写真である。前記図５から実施例１６で製造された新規の正イオン性脂質含有エマルションが比較例１で製造された既存の正イオン性脂質含有製剤よりＨｅｐａ１−６細胞内で低分子干渉ＲＮＡの伝達効率を増加させるということがわかる。
【０１１１】
[実験例ＩＩ] 遺伝子発現確認を通した核酸伝達効能評価
ＩＩ-１．Ａ５４９細胞株における低分子干渉ＲＮＡ伝達効能評価
Ａ５４９細胞株を実験前日、２４ウェルプレートにウェル当たり細胞を８×１０４ずつ播種(ｓｅｅｄｎｉｎｇ)した。各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル(ｗｅｌｌ)当たり２５０μｌずつ添加した。エッペンドルフチューブに血清が含まれていない培地５０μｌずつを入れてスタット３に選択的な低分子干渉ＲＮＡと比較例１、２と実施例１２、１４、１７で製造された正イオン性リポソーム、ミセル、エマルションの複合体をそれぞれ添加した。スタット３(Ｓｔａｔ３)遺伝子(Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿２１３６６２)の発現抑制を誘導するためのｓｉＲＮＡはｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（Ｄａｈｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡ）を用いて製作した。 メディアに含まれた低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の最終濃度は、１００ｎＭとなるようにした。これらを徐々にピペット操作(ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ)して混合した後、室温で２０分間放置し、このように製造された複合体をウェルプレートに添加して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。２４時間の後、Ｔｒｉｚｏｌ試薬(Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ)を用いて細胞内に存在する全体リボ核酸(ＲＮＡ)を分離し、このＲＮＡはＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＲＴ ＰｒｅＭｉｘ(Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ)を用いてｃＤＮＡに逆転写した。スタット３(Ｓｔａｔ３)に特異的なプライマーの配列は５'−ＡＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧ−３’（左側）、５’−ＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＡＡＡ−３’(右側)であり、ＰＣＲ生成物の大きさは３４８塩基対であった。スタット３(Ｓｔａｔ３)転写体(ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ)発現の程度は、スタット３特異的なＰＣＲ生成物のバンド密度をＧＡＰＤＨ(ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ)遺伝子を増幅して示されるバンド密度に補正して定量的な発現の変化を測定した。図６は、それぞれの組成を処理した場合の、ＳｉＨａ細胞内でターゲット遺伝子スタット３の転写体発現を比較したものであって、Ａは対照群、Ｂは低分子干渉ＲＮＡ単独処理群、Ｃは比較例２処理群、Ｄは比較例１処理群、Ｅは実施例１２処理群、Ｆは実施例１４処理群、Ｇは実施例１７処理群である。 対照群(Ａ)と低分子干渉ＲＮＡ単独処理群（Ｂ)は、低分子干渉ＲＮＡが細胞内に伝達されなくてスタット３転写体の発現に変化がなく、比較例１で製造されたリポソームは、実施例１２、１４、１７で製造されたリポソーム、ミセル、エマルションより、スタット３転写体の発現の減少が少なかった。また実施例１２、１４、１７で製造されたリポソーム、ミセル、エマルションは、市販品の比較例２の組成と同じように、スタット３転写体発現を効率的に減少させた。よって、図６から実施例１２、１４、１７で製造された正イオン性脂質含有リポソーム、ミセル、エマルションが、それぞれＳｉＨａ細胞内に低分子干渉ＲＮＡ物質を効率的に伝達して標的タンパク質の発現を選択的に抑制させることが分かる。
【０１１２】
ＩＩ-２．ＨｅＬａ細胞株における低分子干渉ＲＮＡ伝達効能評価
ＨｅＬａ細胞株を実験前日２４ウェルプレートにウェル当たり８×１０４個ずつ播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)した。各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート中の培地を除去して新しい培地をウェル当たり２５０μｌずつ添加した。エッペンドルフ チューブに血清の含まれていない培地５０μｌずつを入れてスタット３選択的な低分子干渉ＲＮＡと比較例１、２と実施例１１、１６、２０で製造された正イオン性脂質含有リポソーム、エマルション、およびミセルとの複合体をそれぞれ添加した後、実験例ＩＩ-１と同様の方法と条件で実験を遂行した。図７は、それぞれの組成で処理した場合の、ＨｅＬａ細胞内でターゲット遺伝子スタット３の転写体発現を比較したもので、Ａは対照群、Ｂは低分子干渉ＲＮＡ単独処理群、Ｃは比較例２処理群、Ｄは比較例１処理群、Ｅは実施例１１処理群、Ｆは実施例１６処理群、Ｇは実施例２０処理群である。 対照群(Ａ)と低分子干渉ＲＮＡ単独処理群(Ｂ)は、細胞内への伝達効率が低くてスタット３転写体の発現に変化がなく、比較例１で製造されたリポソームは、実施例１１、１６、２０で製造されたリポソーム、エマルション、ミセル剤形より、スタット３転写体の発現の減少が少なかった。したがって、図７から実施例１１、１６、２０で製造された正イオン性脂質含有剤形は、それぞれＨｅＬａ細胞内に低分子干渉ＲＮＡ物質を効率的に伝達して標的タンパク質の発現を選択的に抑制させることが分かる。
【０１１３】
ＩＩ−３．ＳｉＨａ細胞株におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内伝達効率測定
ＳｉＨａ細胞株を実験前日２４ウェルプレートにウェル当たり細胞を８×１０４ずつ播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)した。各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル(ｗｅｌｌ)当たり２５０μｌずつ添加した。エッペンドルフチューブに血清が含まれていない培地５０μｌずつを入れてアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較例１、２と実施例１２、１５、１７で製造された正イオン性脂質含有リポソーム、ミセル、エマルションとの複合体をそれぞれ添加した。Ｂｃｌ２遺伝子(Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿０００６３３)の発現抑制を誘導するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドではバイオニーア（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ)で合成注文したもの(５'−ＴＣＴ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＴＧ ＣＧＣ ＣＡＴ−３’)を使った。メディアに含まれたアンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度は１００ｎＭとなるようにした。これらを徐々にピペット操作(ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ)して混合した後、室温で２０分間放置してこのように製造された複合体をウェルプレートに添加し３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。２４時間の後、Ｔｒｉｚｏｌ試薬(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ)を使って細胞内に存在する全体リボ核酸(ＲＮＡ)を分離し、このＲＮＡはＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＲＴ ＰｒｅＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）を使ってｃＤＮＡに逆転写した。Ｂｃｌ２に特異的なプライマーの配列は５'−ＡＴＧ ＧＣＧ ＣＡＣ ＧＣＴ ＧＧＧ ＡＧＡ ＡＣ−３’（左側）、５'−ＧＣＧ ＧＴＡ ＧＣＧ ＧＣＧＧＧＡ ＧＡＡ ＧＴ−３’(右側)であり、ＰＣＲ生成物の大きさは３４８塩基対であった。Ｂｃｌ２転写体発現の程度はＢｃｌ２特異的なＰＣＲ生成物のバンド密度をｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を増幅して示されるバンド密度に補正して定量的な発現の変化を測定した。図８は、それぞれの組成で処理した場合の、ＳｉＨａ細胞内でターゲット遺伝子Ｂｃｌ２の転写体発現を比較したものであって、Ａは対照群、ＢはＢｃｌ２選択的アンチセンスオリゴヌクレオチド単独処理群、Ｃは比較例２とアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体処理群、Ｄは比較例１のリポソームとアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体処理群、Ｅは実施例１２の正イオン性リポソームとアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体処理群、Ｆは実施例１５の正イオン性ミセルとアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体処理群、Ｇは実施例１７の正イオン性エマルションとアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体処理群である。細胞に何も処理していない対照群である図８Ａに比べてアンチセンスオリゴヌクレオチド単独処理群(図８Ｂ)は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞内に伝達されなくてＢｃｌ２転写体の量に変化がなかった。市販品である比較例２の組成や(図８Ｃ)、比較例１で製造されたリポソーム(図８Ｄ)と比較した場合、本発明の実施例１２、１５、１７で製造された正イオン性脂質含有剤形は、細胞内でＢｃｌ２転写体の量を効果的に減少させた。したがって、図８から実施例１２、１５、１７で製造された正イオン性脂質含有剤形はＳｉＨａ細胞内にアンチセンスオリゴヌクレオチド物質を伝達して標的物質であるＢｃｌ-２の細胞内発現を効果的に抑制させることが分かる。
【０１１４】
[実験例ＩＩＩ] 蛍光タンパク質発現細胞株２９３Ｔ−ＧＦＰを用いた低分子干渉ＲＮＡの伝達効率評価
緑色蛍光タンパク質を発現する２９３Ｔ−ＧＦＰ細胞株を実験前日２４ウェルプレートにウェル当たり８×１０４個ずつ播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)して各プレートの細胞が６０−７０％程度に均一に成長した時、プレート中の培地を除去して新しい培地をウェル当たり５００μｌずつ添加した。エッペンドルフチューブに血清が含まれていない培地２５μｌずつを入れて緑色蛍光が発現するプラスミドの発現を抑制するｓｉＲＮＡと比較例２および実施例１２で製造された正イオン性リポソームをそれぞれ添加して複合体を製造してウェルプレートに添加して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。培養された細胞のメディアをウェル当たり５００μｌずつ新しいメディアに交換した後、蛍光顕微鏡で遺伝子伝達効率を観察した。緑色蛍光タンパク質の発現を抑制するための低分子干渉ＲＮＡは、バイオニーア(Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ)で販売する製品を用い、その配列は５'−ＧＣＡ ＵＣＡ ＡＧＧ ＵＧＡ ＡＣＵ ＵＣＡ Ａ−３’（正方向）、５'−ＵＵＧ ＡＡＧ ＵＵＣ ＡＣＣ ＵＵＧ ＡＵＧ Ｃ−３’（逆方向）であった。メディアに含まれた低分子干渉ＲＮＡの最終濃度は、３００ｎＭとなるようにした。図９は、それぞれの組成で処理した場合の、２９３Ｔ細胞内で緑色蛍光タンパク質の発現を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡で観察したものであって、Ａは緑色蛍光タンパク質発現２９３Ｔ細胞を何も処理していない場合の位相差顕微鏡の写真であり、Ｂは比較例２組成処理時の位相差顕微鏡の写真であり、Ｃは実施例１２の組成処理時の位相差顕微鏡の写真である。またＤは、何も処理していない２９３Ｔ細胞の蛍光顕微鏡の写真であり、Ｅは比較例２の組成処理時の蛍光顕微鏡の写真であり、Ｆは実施例１２組成処理時の蛍光顕微鏡の写真である。何も処理していない２９３Ｔ細胞は、緑色蛍光タンパク質の発現が抑制されなくて蛍光発現が蛍光顕微鏡下で明確に観察されるのに対して、比較例２と実施例１２の組成で処理した細胞は、蛍光タンパク質の発現を抑制する低分子干渉ＲＮＡが細胞内に伝達されて緑色蛍光の発現が抑制されることが分かる。
【０１１５】
[実験例ＩＶ] 正イオン性脂質含有核酸伝達体の毒性評価
ＩＶ−１．正イオン性脂質含有核酸伝達体のＡ５４９細胞株に対する毒性評価
本発明の新規正イオン性脂質を含む核酸伝達体の細胞毒性に関する評価をするために下記のような方法で実験を実施した。
人の肺癌細胞株であるＡ５４９細胞を、実施例１１、１３、１６で製造した正イオン性脂質含有リポソーム、エマルションと低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の複合体組成、そして低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)遺伝子単独組成で処理して細胞毒性を評価した。核酸伝達体のみの細胞毒性を明確に評価するために低分子干渉ＲＮＡは、細胞内で活性がないスクランブルＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ＲＮＡ）を用いた。細胞毒性は、３−(４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ−２−ｙｌ)）−２、５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）試薬による方法で評価した。
【０１１６】
細胞をウェル当たり２×１０４細胞となるように４８ウェル(ｗｅｌｌ)に播種(ｓｅｅｄｉｎｇ)して１２時間培養した後、実施例１１、１３、１６で製造した正イオン性脂質含有リポソーム、エマルションと低分子干渉ＲＮＡの複合体組成そして低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)のみでそれぞれ処理した。２４時間経過後、それぞれＭＴＴ溶液を培地の１０％となるように加えて、さらに４時間培養した後、上層液を除去して０．０４Ｎ塩酸イソプロパノール溶液を添加した後にＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒを用いて５７０ｎｍで吸光度を測定した。対照群では何も処理していない細胞が使われた。図１０は、実施例１１、１３、１６で製造された正イオン性脂質含有リポソーム、エマルションと低分子干渉ＲＮＡ複合体の肺癌細胞株(Ａ５４９)で細胞毒性実験を実施した結果であって、実施例１１、１３、１６の正イオン性リポソーム、エマルションと低分子干渉ＲＮＡの複合体は、対照群と比較して大きい細胞毒性を示さなかった。よって、図１０から実施例１１、１３、１６で製造された本発明の正イオン性脂質含有リポソームやエマルション剤形は、人の肺癌細胞株に対して深刻な毒性を示さないということが分かる。
【０１１７】
ＩＶ−２．正イオン性脂質含有核酸伝達体のＳｉＨａ細胞株に対する毒性評価
ＳｉＨａ細胞に実験例１２、１８、１９で製造した正イオン性リン脂質リポソームと低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の複合体組成、そして低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)遺伝子自体の組成を製造し、実験例ＩＶ−１に記載されたものと同様の方法で細胞毒性を評価した。 図１１は、実施例１２、１８、１９でそれぞれ製造された正イオン性脂質含有リポソームとスクランブル低分子干渉ＲＮＡ複合体のＳｉＨａ細胞に対する毒性実験を遂行した結果であって、実施例１２、１８、１９の正イオン性リポソームと低分子干渉ＲＮＡの複合体は対照群と比較して大きい細胞毒性を示さなかった。よって、本図面から実施例１２、１８、１９で製造された本発明の正イオン性脂質含有リポソームは、子宮頸癌細胞株にて深刻な細胞毒性を示さないことが分かる。
【０１１８】
ＩＶ−３．正イオン性脂質含有核酸伝達体のＶＫ２細胞株に対する毒性評価
ＶＫ２細胞に実施例１１、１４、１７で製造した正イオン性リン脂質リポソーム、ミセル、エマルションと低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の複合体組成、そして低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)遺伝子自体組成を製造し、実験例ＩＶ−１に記載されたのと同様の方法で細胞毒性を評価した。図１２は、実施例１１、１４、１７で製造された正イオン性リポソーム、ミセル、エマルション組成物とスクランブルＲＮＡの膣粘膜ケラチン細胞株であるＶＫ２で細胞毒性実験を実施した結果であって、実施例１１、１４、１７の正イオン性リポソーム、ミセル、エマルションと低分子干渉ＲＮＡの複合体は、対照群と比較して大きい細胞毒性を示さなかった。よって、本図面から実施例１１、１４、１７で製造された正イオン性脂質含有リポソーム、ミセル、エマルション剤形はＶＫ２で深刻な細胞毒性を示さないことが分かる。
【０１１９】
以上、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明はかかる例に限定されない。本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範囲内において、各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、これらについても、当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
上述した通り、本発明の正イオン性脂質は、製造および精製工程が簡便で大量生産時の経済性が高い。また、本発明の正イオン性脂質を含む核酸またはタンパク質伝達体は、目的とするデオキシリボ核酸、リボ核酸、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー(ａｐｔａｍｅｒ)等の核酸医薬や生理活性を保有した負イオン性タンパク質を細胞内に輸送する効率を顕著に増強させるだけでなく、細胞毒性を減少させて核酸またはタンパク質素材の医薬の治療効能を増強させる用途で有用に用いられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式(Ｉ)の正イオン性脂質を含む負イオン性タンパク質伝達体:
【化１】
前記式において、ｎは１または２であり、Ｒ１とＲ２はそれぞれ炭素数１２〜２０個の飽和または不飽和炭化水素である。
【請求項２】
下記の一般式(Ｉ)の正イオン性脂質を含むオリゴ核酸伝達体:
【化２】
前記式において、ｎは１または２であり、Ｒ１とＲ２はそれぞれ炭素数１２〜２０個の飽和または不飽和炭化水素である。
【請求項３】
前記オリゴ核酸伝達体は、低分子干渉ＲＮＡの細胞内の運搬のためのものであることを特徴とする請求項２に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項４】
前記オリゴ核酸伝達体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内の運搬のためのものであることを特徴とする請求項２に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項５】
前記オリゴ核酸伝達体は、アプタマーの細胞内の運搬のためのものであることを特徴とする請求項２に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項６】
前記オリゴ核酸伝達体は、リポソーム、ミセル、エマルション、およびナノ粒子からなる群より選択される剤形からなることを特徴とする請求項２〜請求項５のいずれか一項に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項７】
ガラクトース脂質誘導体、マンノース脂質誘導体、葉酸脂質誘導体、ポリエチレングリコール脂質誘導体、ビオチン脂質誘導体を追加的に含むことを特徴とする請求項６に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項８】
前記オリゴ核酸伝達体は、前記正イオン性脂質および細胞融合性リン脂質を含有するリポソーム剤形からなることを特徴とする請求項６に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項９】
前記細胞融合性リン脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)であることを特徴とする請求項８に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項１０】
前記細胞融合性リン脂質は、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンであることを特徴とする請求項８に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項１１】
前記オリゴ核酸伝達体は、前記正イオン性脂質および界面活性剤を含有するミセル剤形からなることを特徴とする請求項６に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項１２】
前記界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ２０、ポリエチレングリコールモノオレイルエーテル、エチレングリコールモノドデシルエーテル、ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、トリメチルヘキサデシルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、シクロヘキシルメチルβ−Ｄ−マルトシド、ペンタエリスリチルパルミテート、ラウリルジメチルアミンオキサイド、またはＮ−ラウロイルサルコシンソジウム塩であることを特徴とする請求項１１に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項１３】
前記オリゴ核酸伝達体は、前記正イオン性脂質および界面活性剤を含有するエマルション剤形からなることを特徴とする請求項６に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項１４】
前記界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミン酸化物、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホネート、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、トリトンＸ−１００、ポリエチレングリコールモノオレイルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクチルグルコシド、またはＮ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミンであることを特徴とする請求項１３に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項１５】
請求項２のオリゴ核酸伝達体とオリゴヌクレオチドの複合体。
【請求項１６】
請求項１５のオリゴ核酸伝達体とオリゴヌクレオチドの複合体を有効成分として含む病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患の予防および治療用組成物。
【請求項１７】
病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患が、腫瘍、関節炎、心血管系疾患、および内分泌系疾患から選択されたものであることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１５のオリゴ核酸伝達体とオリゴヌクレオチドの複合体を、人間又は人間ではない哺乳類に投与して病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患を予防または治療する方法。
【請求項１９】
病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患が、腫瘍、関節炎、心血管系疾患、および内分泌系疾患から選択されるものであることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患の治療剤を製造するための請求項１５のオリゴ核酸伝達体とオリゴヌクレオチドの複合体の使用。
【請求項２１】
病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患は、腫瘍、関節炎、心血管系疾患、および内分泌系疾患から選択されたものであることを特徴とする請求項２０に記載の使用。
【請求項１】
下記の一般式(Ｉ)の正イオン性脂質を含む負イオン性タンパク質伝達体:
【化１】
前記式において、ｎは１または２であり、Ｒ１とＲ２はそれぞれ炭素数１２〜２０個の飽和または不飽和炭化水素である。
【請求項２】
下記の一般式(Ｉ)の正イオン性脂質を含むオリゴ核酸伝達体:
【化２】
前記式において、ｎは１または２であり、Ｒ１とＲ２はそれぞれ炭素数１２〜２０個の飽和または不飽和炭化水素である。
【請求項３】
前記オリゴ核酸伝達体は、低分子干渉ＲＮＡの細胞内の運搬のためのものであることを特徴とする請求項２に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項４】
前記オリゴ核酸伝達体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内の運搬のためのものであることを特徴とする請求項２に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項５】
前記オリゴ核酸伝達体は、アプタマーの細胞内の運搬のためのものであることを特徴とする請求項２に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項６】
前記オリゴ核酸伝達体は、リポソーム、ミセル、エマルション、およびナノ粒子からなる群より選択される剤形からなることを特徴とする請求項２〜請求項５のいずれか一項に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項７】
ガラクトース脂質誘導体、マンノース脂質誘導体、葉酸脂質誘導体、ポリエチレングリコール脂質誘導体、ビオチン脂質誘導体を追加的に含むことを特徴とする請求項６に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項８】
前記オリゴ核酸伝達体は、前記正イオン性脂質および細胞融合性リン脂質を含有するリポソーム剤形からなることを特徴とする請求項６に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項９】
前記細胞融合性リン脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)であることを特徴とする請求項８に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項１０】
前記細胞融合性リン脂質は、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンであることを特徴とする請求項８に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項１１】
前記オリゴ核酸伝達体は、前記正イオン性脂質および界面活性剤を含有するミセル剤形からなることを特徴とする請求項６に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項１２】
前記界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ２０、ポリエチレングリコールモノオレイルエーテル、エチレングリコールモノドデシルエーテル、ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、トリメチルヘキサデシルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、シクロヘキシルメチルβ−Ｄ−マルトシド、ペンタエリスリチルパルミテート、ラウリルジメチルアミンオキサイド、またはＮ−ラウロイルサルコシンソジウム塩であることを特徴とする請求項１１に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項１３】
前記オリゴ核酸伝達体は、前記正イオン性脂質および界面活性剤を含有するエマルション剤形からなることを特徴とする請求項６に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項１４】
前記界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミン酸化物、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホネート、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、トリトンＸ−１００、ポリエチレングリコールモノオレイルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクチルグルコシド、またはＮ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミンであることを特徴とする請求項１３に記載のオリゴ核酸伝達体。
【請求項１５】
請求項２のオリゴ核酸伝達体とオリゴヌクレオチドの複合体。
【請求項１６】
請求項１５のオリゴ核酸伝達体とオリゴヌクレオチドの複合体を有効成分として含む病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患の予防および治療用組成物。
【請求項１７】
病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患が、腫瘍、関節炎、心血管系疾患、および内分泌系疾患から選択されたものであることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１５のオリゴ核酸伝達体とオリゴヌクレオチドの複合体を、人間又は人間ではない哺乳類に投与して病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患を予防または治療する方法。
【請求項１９】
病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患が、腫瘍、関節炎、心血管系疾患、および内分泌系疾患から選択されるものであることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患の治療剤を製造するための請求項１５のオリゴ核酸伝達体とオリゴヌクレオチドの複合体の使用。
【請求項２１】
病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患は、腫瘍、関節炎、心血管系疾患、および内分泌系疾患から選択されたものであることを特徴とする請求項２０に記載の使用。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１０−５３７９７２（Ｐ２０１０−５３７９７２Ａ）
【公表日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２２７９８（Ｐ２０１０−５２２７９８）
【出願日】平成２０年８月２０日（２００８．８．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００４８１９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２８８２４
【国際公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【出願人】（５１００５６３５３）コリア・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・ビジネス・ファウンデーション (15)
【出願人】（５１０１４０７００）エスエヌユー・アールアンドディービー・ファウンデーション (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２０日（２００８．８．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００４８１９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２８８２４
【国際公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【出願人】（５１００５６３５３）コリア・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・ビジネス・ファウンデーション (15)
【出願人】（５１０１４０７００）エスエヌユー・アールアンドディービー・ファウンデーション (4)
【Ｆターム（参考）】
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