新規アポトーシス誘導タンパク質及びそれをコードする遺伝子
【課題】アポトーシス誘導活性を有する新規タンパク質、これをコードするＤＮＡからなる遺伝子、前記タンパク質に対する抗体、前記遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターが導入された形質転換体、アポトーシス誘導剤等を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するタンパク質や、該タンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子や、前記タンパク質に対する抗体や、前記遺伝子を含む組換えベクターや、該組換えベクターが導入された形質転換体を利用する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するタンパク質や、該タンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子や、前記タンパク質に対する抗体や、前記遺伝子を含む組換えベクターや、該組換えベクターが導入された形質転換体を利用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス誘導活性を有する新規タンパク質及びこれをコードするＤＮＡからなる遺伝子に関する。また本発明は、上記タンパク質に対する抗体、上記遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターが導入された形質転換体に関する。さらに本発明は、上記タンパク質、上記遺伝子又は上記組換えベクターを含有するアポトーシス誘導剤や、上記タンパク質、上記遺伝子又は上記組換えベクターを有効成分とする医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、エネルギー生産、増殖、アポトーシスなどの様々な細胞過程に関与する極めて重要な細胞器官である（非特許文献１）。ミトコンドリアは、分裂及び融合により形態を頻繁に変化させる（非特許文献２）。ミトコンドリアの分裂及び融合に関与するタンパク質は、下等真核生物及び高等真核生物で保存されており、またこのタンパク質は、ミトコンドリア依存性のアポトーシスを制御している（非特許文献３）。これらのタンパク質に加えて、ミトコンドリア特異的なリン脂質であるカルジオリピン（ＣＬ：cardiolipin）が、ミトコンドリアの膜の内側から外側に移動した後、ミトコンドリアの分裂及び融合の調節因子として機能することが明らかにされた（非特許文献４〜８）。ミトコンドリアの分裂及び融合のメカニズムは徐々に明らかとされつつあるが、生細胞中のミトコンドリアのネットワーク形成についてはほとんど研究が進んでいない。
【０００３】
一方、細胞のアポトーシス（細胞死）は、生体組織を正常な状態に保つうえで重要な現象として知られる。例えばがん細胞は、アポトーシスの機構が正常に機能せずに無限に分裂増殖を行う細胞と規定することができる。
アポトーシス（細胞死）は、種々の物質によって誘導されることが知られている。従って、そのような物質を標的細胞（例えばがん細胞、ウイルス感染細胞）に付与することによって人為的にアポトーシスを誘導し、当該標的細胞を死滅させることが可能である。アポトーシスを誘導し得る物質として例えば、特許文献１には、アポトーシスを誘導し得る物質としてデング熱ウイルス由来のタンパク質が記載されており、特許文献２には、クサリヘビ科のヘビの毒腺由来のアポトーシス誘導性タンパク質が記載されており、特許文献３には、細胞表面レセプターであるＦａｓを介した細胞のアポトーシス誘導を増強し得るポリペプチドが記載されている。
【０００４】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００１／０９６３７６号パンフレット
【特許文献２】特開平１１−１４９６号公報
【特許文献３】特開２００１−１９３号公報
【非特許文献１】D. D. Newmeyer et al., Cell 112, 481 (2003)
【非特許文献２】M. P. Yaffe et al., Science 283, 1493 (1999)
【非特許文献３】R. J. Youle et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 657 (2005)
【非特許文献４】B. Jeanie et al., Biochim. Biophys. Acta. 1585, 97 (2002)
【非特許文献５】M. Garcia-Fernandez et al., Cell Growth Differ. 13, 449 (2002)
【非特許文献６】M. Sorice et al., Cell Death Differ. 11, 1133 (2004)
【非特許文献７】M. D. Esposti et al., Cell Death Differ. 10, 1300 (2003)
【非特許文献８】S. Y. Chioi et al., Nat. Cell Biol. 8, 1255 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、アポトーシス誘導活性を有する新規タンパク質、これをコードするＤＮＡからなる遺伝子、前記タンパク質に対する抗体、前記遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターが導入された形質転換体、アポトーシス誘導剤等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）で刺激したＡ４３１細胞の溶解物を用いたタンパク質リン酸化シグナル解析を行うことによって、ＣＬ及びホスファチジン酸に対する結合活性を有するタンパク質（cardiolipin and phosphatidic acid binding protein；以下、「ＣＬＰＡＢＰ」という。）を同定し、該ＣＬＰＡＢＰのｃＤＮＡが、ヒトゲノム解析計画によりクローン化されたgi No. 14149786（Genbank Accession No. NM_032129_1）であることを見い出し、さらには、該ＣＬＰＡＢＰを細胞内で過剰発現させるとアポトーシスが誘導されることを見い出し、本発明を完成するに至った。該ＣＬＰＡＢＰの推定アミノ酸配列を図１（配列番号２）に記載する。また、該ＣＬＰＡＢＰの推定機能領域と考えられる、２つのプレックストリン相同（ＰＨ）領域の位置を図２に示す。
【０００７】
すなわち本発明は、（１）(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子や、（２）配列番号１に示される塩基配列の塩基番号３６−１８６８の塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡからなる遺伝子や、（３）前記（２）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子や、（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の遺伝子を含み、かつアポトーシス誘導タンパク質を発現することができる組換えベクターや、（５）前記（４）に記載の組換えベクターが導入され、かつアポトーシス誘導タンパク質を発現する形質転換体や、（６）形質転換体が動物であることを特徴とする前記（５）に記載の形質転換体に関する。
【０００８】
また本発明は、（７）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を有し、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質や、（９）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質や、（１０）配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質や、（１１）配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号６１−３１８のアミノ酸配列又はアミノ酸番号８５−３１８のアミノ酸配列である前記（８）又は（１０）に記載のタンパク質や、（１２）前記（７）〜（１１）のいずれかに記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質や、（１３）前記（７）〜（１１）のいずれかに記載のタンパク質、又は前記（１２）に記載の融合タンパク質に対する抗体や、（１４）前記（７）〜（１１）のいずれかに記載のタンパク質、又は前記（１２）に記載の融合タンパク質を含有するアポトーシス誘導剤や、（１５）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の遺伝子、又は前記（４）に記載の組換えベクターを含有するアポトーシス誘導剤に関する。
【０００９】
さらに本発明は、（１６）前記（７）〜（１１）のいずれかに記載のタンパク質、又は前記（１２）に記載の融合タンパク質を、対象とする細胞に発現させることにより、該細胞のアポトーシスを誘導する方法や、（１７）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の遺伝子を、対象とする細胞に導入することにより上記タンパク質を発現させる、前記（１６）に記載の方法や、（１８）前記（７）〜（１１）のいずれかに記載のタンパク質、又は前記（１２）に記載の融合タンパク質を有効成分とする医薬や、（１９）アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である前記（１８）記載の医薬や、（２０）疾患が、がん、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器過形成、血管形成術後再狭窄及びがん切除術後の再発からなる群より選択される前記（１９）記載の医薬に関する。
【発明の効果】
【００１０】
アポトーシス誘導活性を有する本発明のタンパク質や、該タンパク質をコードする本発明の遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、本発明のタンパク質に対する抗体等は、ミトコンドリアネットワーク形成やアポトーシスの分子レベルでの機構の解明に利用することができる。また、本発明のタンパク質や、該タンパク質をコードする本発明の遺伝子や、該遺伝子を含む組換えベクター等を用いると、アポトーシスを誘導させることができるので、本発明のタンパク質や遺伝子等を用いて疾患細胞においてアポトーシスを誘導することにより、疾患の予防・治療に応用できる可能性がある。また、本発明のタンパク質はそれ自身が、細胞内においてミトコンドリアやアポトゾーム（アポトーシスの実行場所）に局在する性質を有しているため、他のアポトーシス誘導剤に比べてより効果的な細胞内ターゲティングが可能であると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の遺伝子としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子や、配列番号１に示される塩基配列の塩基番号３６−１８６８の塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡからなる遺伝子や、配列番号１に示される塩基配列の塩基番号３６−１８６８の塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子を例示することができる。なお、配列番号１に示される塩基配列の塩基番号３６−１８６８は、配列番号２に示されるアミノ酸配列のコード領域である。
【００１２】
本発明の遺伝子の由来は特に制限されないが、例えばヒト（gi No. 14149786；Genbank Accession No. NM_032129_1）、アカゲザル(gi No. 108995452；Genbank Accession No. XR_010934)、イヌ(gi No. 73956457；Genbank Accession No. XM_546726)、ウシ(gi No. 76637790；Genbank Accession No. XM_598312)、ラット(gi No. 109477818；Genbank Accession No. XM_001078287)、マウス(gi No. 22749601；Genbank Accession No. BC031374)等の哺乳類や、フグ(gi No. 47228599；Genbank Accession No. CAAE01014991)、ゼブラフィッシュ(gi No. 125852117；Genbank Accession No. XM_001345356)等の魚類や、アフリカツメガエル(gi No. 50415259, 49118112；Genbank Accession No. BC077452, BC073066)等の両生類などを例示することができる。本発明の遺伝子は、これらのＤＮＡ配列情報等に基づき、例えばヒト等の遺伝子ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーなどから公知の方法、例えば全ＲＮＡを用いるＲＡＣＥ法により調製することができる。
【００１３】
また、上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００１４】
また、上記「配列番号１に示される塩基配列の塩基番号３６−１８６８の塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」は、配列番号１に示される塩基配列の塩基番号３６−１８６８の塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより得ることもできる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１５】
例えば、上記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００１６】
また、上記「配列の一部」とは、該一部の配列又はその配列に相補的な配列が、アポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードする限り特に制限されず、配列番号１に示される塩基配列の塩基番号２１６−９８９の塩基配列（配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号６１−３１８のアミノ酸配列に対応）や、配列番号１に示される塩基配列の塩基番号２８８−９８９の塩基配列（配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８５−３１８のアミノ酸配列に対応）を例示することができる。ヒト由来のＣＬＰＡＢＰの場合、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８５−１９２及び２１１−３１８がプレックストリン相同領域（それぞれＰＨ１領域及びＰＨ２領域）として知られている。他の生物由来のＣＬＰＡＢＰにおけるＰＨ領域の有無は未だ確認されていないが、ヒトＣＬＰＡＢＰのＰＨ領域に対して相同性の高い領域が存在していることが予想される。
【００１７】
本発明のタンパク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を有し、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質を例示することができる。ここで、上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号６１−３１８のアミノ酸配列やアミノ酸番号８５−３１８のアミノ酸配列を好ましく例示することができる。なお、本発明のタンパク質はそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができる。本発明のタンパク質の由来は特に制限されるものではないが、例えばヒト、アカゲザル、イヌ、ウシ、ラット、マウス等の哺乳類や、フグ、ゼブラフィッシュ等の魚類や、アフリカツメガエル等の両生類などを例示することができる。
【００１８】
あるタンパク質がアポトーシス誘導活性を有しているか否かは、そのタンパク質で処理したり、そのタンパク質を細胞内で発現させたりした場合に、そのような処理を行わなかった場合又は細胞内で発現させなかった場合に比べて、アポトーシスが生じる細胞の割合が向上するかどうかにより確認することができる。アポトーシスが生じる細胞の割合については、アポトーシスに伴うＤＮＡ断片化や細胞膜構造変化やミトコンドリア膜電位消失やアポトーシス関連の酵素活性を指標とする公知の検出法により容易に行うことができる。
【００１９】
本発明の融合タンパク質としては、本件タンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のタンパク質等の精製や、本発明のタンパク質と相互作用するタンパク質の検出や、本発明のタンパク質等に対する抗体の定量用などとしても有用である。
【００２０】
本発明の抗体としては、上記本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体（本発明のタンパク質に対する抗体）であれば特に制限はされず、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらはＣＬＰＡＢＰ等の本発明のタンパク質又はその一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、本発明のタンパク質の細胞内での発現を定量や、該タンパク質の細胞内での発現の有無を検出に用いることができるほか、ミトコンドリアネットワーク形成の分子レベルでの機構を解明する上でも有用である。
【００２１】
上記の本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のタンパク質若しくはエピトープを含むその断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００２２】
本発明のタンパク質に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本発明のタンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。
【００２３】
また前記モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本発明のタンパク質の機能解析を行うことができる。また本発明の抗体を用いる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２４】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明の遺伝子を含み、かつアポトーシス誘導活性を有する本発明のタンパク質を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。例えば、本発明の遺伝子の５'と３'側双方の非翻訳領域を除いたＯＲＦ部分のｃＤＮＡ（配列番号１の塩基番号３６〜１８６８）を適切なプロモーターの下流につないだコンストラクトを好適に例示することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、動物細胞用発現ベクター、酵母用発現ベクター、細菌用発現ベクター等を用いることができるが、動物細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましい。
【００２５】
動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、pcDNA3（Stratagene社製）、pCMV-FLAG6a（Sigma社製)、pEGFP-C3（Clontech社製)、pcDM8（フナコシ社より市販)、pAGE107〔特開平3-22979; Cytotechnology, 3, 133,(1990)〕、pAS3-3（特開平2-227075)、pCDM8〔Nature, 329, 840,(1987)〕、pcDNAI/Amp（Invitrogen社製)、pREP4（Invitrogen社製)、pAGE103〔J.Blochem., 101, 1307(1987)〕、pAGE210等を例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCMV)のIE（immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。
【００２６】
酵母用の発現ベクターとして、例えば、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、Ycp5O(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を例示することができる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
【００２７】
細菌用の発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2(いずれもべーリンガーマンハイム社より市販)、pGEX4T(Amersham Bioscience社製)、pKK233-2(Pharmacia社製)、pSE280(Invitrogen社製)、pGEMEX-1(Promega社製)、pQE-8(QIAGEN社製)、pQE-30(QIAGEN社製)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200〔Agrc.Biol.Chem., 48, 669(1984)〕、PLSA1〔Agrc. Blo1. Chem., 53, 277(1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII SK(+)、pBluescriptII SK(-)(Stratagene社製)、pTrS30(FERMBP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX(Pharmacia社製)、pET-3(Novagen社製)、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔Gene, 33, 103(1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103(1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29(宝酒造社製)、pUC118(宝酒造社製)、pQE-30(QIAGEN社製)等が挙げられる。細菌用のプロモーターとしては、例えば、trpプロモーター(P trp)、lacプロモーター(P lac)、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。
【００２８】
本発明の形質転換体としては、本発明の組換えベクターが導入され、かつアポトーシス誘導活性を有する本発明のタンパク質を発現する形質転換体である限り特に制限されず、形質転換動物（細胞、組織、個体）、形質転換酵母、形質転換細菌、を挙げることができるが、形質転換動物（細胞、組織、個体）が好ましい。本発明の形質転換体における宿主細胞として、より具体的には、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、シロイヌナズナ等の植物細胞等を挙げることができる。
【００２９】
また、本発明の組換えベクターの宿主細胞への導入方法は、宿主細胞の種類に応じて適切な方法を用いることができる。該導入方法として、具体的には、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染等を例示することができる。
【００３０】
本発明のタンパク質（及び融合タンパク質）は少なくとも一種の細胞に対して高いアポトーシス誘導活性を有し得る。従って、本発明のタンパク質（及び融合タンパク質）を始めとして、これら本発明のタンパク質等をコードする本発明の遺伝子や、これら本発明のタンパク質等を発現し得る本発明の組換えベクターは、アポトーシス誘導剤の主成分として好適に用いることができる。よって、本発明のアポトーシス誘導剤は、本発明のタンパク質、本発明の融合タンパク質、本発明の遺伝子、及び本発明の組換えベクターからなる群から選ばれる１つ又は２つ以上を含有する。
【００３１】
本発明によって提供されるアポトーシス誘導剤は、生体内又は生体外において、標的細胞（例えばヒトその他の哺乳動物細胞）にアポトーシスを起こすために用いられ得る組成物（医薬）であり得る。本発明のアポトーシス誘導剤は、アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤として用いることができる。該疾患としては、がん、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器過形成、血管形成術後再狭窄及びがん切除術後の再発等を例示することができる。
【００３２】
本発明のタンパク質や融合タンパク質の他、アポトーシス誘導剤に含まれる担体すなわち副次的成分（典型的には用途に応じて薬学的に許容され得るもの）としては、アポトーシス誘導剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、水（例えば生理食塩水、種々の緩衝液であり得る。）、有機溶媒、種々の充填剤、増量剤、結合剤、滑剤、付湿剤、表面活性剤、賦形剤、着色剤、保存剤、緩衝剤、香料等が挙げられる。
【００３３】
アポトーシス誘導剤の形態に関しては特に限定はない。内用剤若しくは外用剤の典型的な形態として、軟膏、液剤（例えば点眼薬、注射液）、懸濁剤、乳剤、エアロゾル（スプレー剤）、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、ゲル、等が挙げられる。かかる誘導剤（組成物）の形態に応じて、主成分たる本発明のタンパク質と組み合わせるべき担体その他の副次的成分の内容（種類）は異なり得る。例えば、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液（注射液等）を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、本発明のアポトーシス誘導剤の有効成分（本発明のタンパク質、本発明の融合タンパク質、本発明の遺伝子又は本発明の組換えベクター）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。
【００３４】
本発明のアポトーシス誘導剤は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。例えば、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射或いは灌腸によって患者に投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。また、体外において使用する場合は、適量の本発明の有効成分（本発明のタンパク質、本発明の融合タンパク質、本発明の遺伝子又は本発明の組換えベクター）を含有する液剤を対象物（皮膚表面の患部等）の表面に直接スプレーするか、或いは、当該液剤で濡れた布や紙で対象物の表面を拭くとよい。これらは例示にすぎず、従来のアポトーシス誘導剤と同じ形態及び／又は使用方法を適用することができる。また、ＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）の適用により、標的とする患部（器官、組織、細胞等）に、本発明のアポトーシス誘導剤を局所的に高濃度に供給することが可能となる。また、アポトーシス誘導剤（医薬）の用量は、投与方法、投与の目的、疾患の種類、症状、患者の性別、体重、年齢等に応じて個々に設定されればよく、特に限定されない。
【００３５】
なお、本発明のアポトーシス誘導剤のうち、その有効成分が本発明の遺伝子や本発明の組換えベクターである場合、そのアポトーシス誘導剤は、いわゆる遺伝子治療に使用する素材として用い得る。例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子（典型的にはＤＮＡセグメント、或いはＲＮＡセグメント）を適当なベクターに組み込み、標的とする患部（器官、組織、細胞等）に導入することにより、生体（細胞）内で本発明のタンパク質や融合タンパク質を発現させることが可能となる。したがって、本発明のタンパク質や融合タンパク質を有効成分とするアポトーシス誘導剤と同様に、アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤として用い得る。
本発明の遺伝子や組換えベクターを有効成分とするアポトーシス誘導剤（医薬）は、標的とする患部の細胞に選択的に導入することにより、他の正常細胞を損傷させることなく、患部の細胞を選択的に死滅させることが可能となる点で、本発明のタンパク質や融合タンパク質を有効成分とするアポトーシス誘導剤に比べて好ましい。
【００３６】
本発明の方法は、本発明のタンパク質又は本発明の融合タンパク質を、対象とする細胞に発現させることにより、該細胞のアポトーシスを誘導する方法であれば特に制限されないが、本発明の遺伝子を、対象とする細胞に導入することにより本発明のタンパク質を発現させることにより、該細胞のアポトーシスを誘導する方法を好ましく例示することができる。本発明のタンパク質等を対象とする細胞に発現させる方法は特に制限されず、例えば本発明の組換えベクターを公知の方法で対象細胞に形質転換するなどの方法を用いることができる。
【００３７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
［各種ヒト臓器及び培養細胞におけるＣＬＰＡＢＰ遺伝子の発現］
ＣＬＰＡＢＰ遺伝子（配列番号１）の配列に基づいて、ＰＣＲ用のプライマーを設計した。フォワードプライマー（gtttggatcctctgtgcctgcctctgaccct：配列番号３）は、ＣＬＰＡＢＰの塩基配列（配列番号１）の塩基番号１５３６−１５５６に対応する配列を含んでおり、リバースプライマー（gaaagaattctctcagatccactgcacaagccc：配列番号４）はＣＬＰＡＢＰの塩基配列（配列番号１）の塩基番号１８５１−１８７１に対応する配列を含んでいる。市販のヒト由来の各種のｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社製のＭＴＣパネル）を鋳型とし、前述の両プライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応の条件は、９４℃で１分間保持した後、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間を１サイクルとしてこれを３０サイクル行い、次いで、７２℃で５分間保持するという条件であった。
【００３９】
得られたそれぞれのＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。前述の両プライマーにより特異的に増幅されたと考えられる転写産物（３５５ｂｐ）のバンドを図３に示す。図３に示されているように、ＣＬＰＡＢＰ遺伝子は各種のヒト臓器由来の細胞においてほぼ同程度に発現しており（図３左）、また、各種の培養細胞においても同様に発現している（図３右）ことが分かった。
【実施例２】
【００４０】
［内因性ＣＬＰＡＢＰ及び組換えＣＬＰＡＢＰの培養細胞における発現］
RZPD German Resource Center for Genome Researchより購入したＣＬＰＡＢＰ遺伝子を鋳型としたＰＣＲや、ＰＣＲ産物の制限酵素による切断によって、ＣＬＰＡＢＰ遺伝子断片を得た。該断片を、該遺伝子が発現し得るように、ｐｃＤＮＡ３ ｖｅｃｔｏｒ（Stratagene社製）やｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ６ａ（Sigma社製）（アミノ末端側にＦＬＡＧタグを付加しうるベクター）に組み込んだ。得られた両プラスミドを、それぞれｐｃＤＮＡ３−ＣＬＰＡＢＰ、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰと命名した。これらの両プラスミドを、エレクトロポーレーション法によりそれぞれＣＯＳ−７細胞へ導入し、ＣＯＳ−７／ｐｃＤＮＡ３−ＣＬＰＡＢＰ細胞と、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ細胞を得た。
【００４１】
次に、これら３種の細胞について、以下のようなウエスタンブロット解析を行った。ダルベッコ改変イーグル培地に１０％の牛胎児血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍｌアンピシリンを加えた培地に、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７／ｐｃＤＮＡ３−ＣＬＰＡＢＰ細胞、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ細胞をそれぞれ添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃にて培養した。これらの培養液を遠心分離して、各細胞の菌体をそれぞれ回収し、該菌体に抽出液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）； １ｍＭ ＥＤＴＡ； １０ｍＭ ＤＴＴ； １％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００； １５０ｍＭ ＮａＣｌ； １０ｍＭ ＮａＦ； １ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４； protease inhibitor cocktail（Roche社製））を添加して混合し、菌体を破砕して細胞抽出液をそれぞれ得た。得られた細胞抽出液にＳＤＳサンプル溶液を添加した後９５℃で３分間変性し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ＰＶＤＦ膜（Immobilon-P：ミリポア社製）に電気的に転写した。
【００４２】
ＣＬＰＡＢＰの発現を検出する際に用いる抗体は以下のような方法で作製した。ＣＬＰＡＢＰのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸番号５００−６１１のアミノ酸配列（以下、「５００−６１１タンパク質」という）に対応する塩基配列からなるＤＮＡ断片を、ＧＳＴ融合タンパク質発現用プラスミドベクターに組み込み、得られたプラスミドを大腸菌に導入した。該大腸菌を培養し、得られた菌体からＧＳＴ融合５００−６１１タンパク質を精製した。得られたＧＳＴ融合５００−６１１タンパク質を抗原としてウサギに免疫し、このウサギから抗血清を採取した。採取した抗血清について、ＧＳＴ融合５００−６１１タンパク質抗原を用いたアフィニティー精製を行い、精製抗体（抗ＣＬＰＡＢＰ一次抗体）を得た。
【００４３】
得られたこの抗ＣＬＰＡＢＰ一次抗体を前述のＰＤＶＦ膜と反応させ、該ＰＤＶＦ膜を洗浄した後、ＨＲＰ（HorseRadish Peroxydase）標識二次抗体（アマシャムバイオサイエンス社製）を反応させ、該標識二次抗体に対するＥＣＬ反応により検出した。検出機器としては、イメージアナライザー「ＬＡＳ３０００」（富士フィルム社製）を用いた。その結果を図４に示す。図４から分かるように、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７／ｐｃＤＮＡ３−ＣＬＰＡＢＰ細胞、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ細胞いずれの細胞でもＣＬＰＡＢＰが発現しており、また、ＣＯＳ−７／ｐｃＤＮＡ３−ＣＬＰＡＢＰ細胞やＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ細胞では、ＣＬＰＡＢＰが実際に過剰発現していることが示された。
【実施例３】
【００４４】
［内在性ＣＬＰＡＢＰの培養細胞内における局在］
ＨＥＫ２９３細胞内のＣＬＰＡＢＰの局在を調べるために、前述の抗ＣＬＰＡＢＰ一次抗体やCMX-Rosamine（「Mito-Tracker Red」（登録商標））を用いて、ＨＥＫ細胞について蛍光染色を行った。
具体的には、ＣＬＰＡＢＰの局在については、ＨＥＫ２９３細胞を、５％ホルムアルデヒド存在下で１０分間固定し、次いで、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳにて洗浄ならびに膜透過処理を行い、前述の抗ＣＬＰＡＢＰ一次抗体を加え１時間静置した。その後洗浄し、２次抗体を加え４５分間静置した。２次抗体はMolecular Probes社のAlexaシリーズを用いた。次いで、洗浄処理を行い、その後の該ＨＥＫ２９３細胞を、ＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss社製）にて観察した。また、ミトコンドリアの局在については、ＨＥＫ２９３細胞を、５％ホルムアルデヒド存在下で１０分間固定し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳにて洗浄ならびに膜透過処理を行い、次いで、CMX-Rosamine（「Mito-Tracker Red」（登録商標））で処理した後、前述の顕微鏡で観察した。
前述の精製抗体（抗ＣＬＰＡＢＰ抗体）を用いた結果を図５の左（ａ及びｄ）に、CMX-Rosamineを用いた結果を図５の中央（ｂ及びｅ）に示した。また、図５のａとｂを重ね合わせたものをｃに、ｄとｅを重ね合わせたものをｆに示した。図５から分かるように、ＣＬＰＡＢＰはミトコンドリアの周囲に主に観察された。
【実施例４】
【００４５】
［ＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰの細胞内局在］
上記実施例２におけるＣＬＰＡＢＰ遺伝子断片を、該遺伝子が発現し得るように、ｐＥＧＦＰ−Ｃ３（アミノ末端側にＧＦＰを付加しうるベクター；Clontech社製)に組み込んだ。得られたプラスミド（ｐＧＦＰ−ＣＬＰＡＢＰ）を、エレクトロポーレーション法によりそれぞれＣＯＳ−７細胞へ導入し、ＣＯＳ−７／ｐＧＦＰ−ＣＬＰＡＢＰ細胞を得た。該細胞を、５％ホルムアルデヒド存在下で１０分間固定し、次いで、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳにて洗浄ならびに膜透過処理を行い、CMX-Rosamine（「Mito-Tracker Red」（登録商標））で処理した後、前述のＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss社製）で観察した。ＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰの細胞内の局在を観察した結果を図６のａ及びｄに示す。また、CMX-Rosamineで染色により、ミトコンドリアの局在を観察した結果を図６のｂ及びｅに示す。さらに、図６のａとｂを重ね合わせたものをｃに、ｄとｅを重ね合わせたものをｆに示した。図６の結果から、ＣＬＰＡＢＰはミトコンドリア上に存在することが示唆された。また、ＣＬＰＡＢＰは、小胞構造を形成し、それらは図６のｄ−ｆに示されているように、自己集合することにより、ミトコンドリアネットワークに貫入するように存在した。
【実施例５】
【００４６】
［ＣＬＰＡＢＰのミトコンドリアネットワーク形成における影響］
ミトコンドリアは一般的に融合と分裂を繰り返し、そのネットワーク構造を形成することが知られる。前記図５及び図６の結果から、ＣＬＰＡＢＰはチューブ状のミトコンドリア近傍に存在し、そのネットワーク形成においてＣＬＰＡＢＰが何らかの位置情報を提示していることが予想された。そこで、ＣＬＰＡＢＰとミトコンドリアの局在を経時的に観察し、その関係について解析した。
ミトコンドリア局在配列を融合したＤｓＲｅｄタンパク質を発現し得るｐＤｓＲｅｄ２−Ｍｉｔｏ（Clontech社製）プラスミドと、前述のｐＧＦＰ−ＣＬＰＡＢＰとを、エレクトロポーレーション法によりＣＯＳ−７細胞へ同時導入し、ＣＯＳ−７／ｐＧＦＰ−ＣＬＰＡＢＰ：ｐＤｓＲｅｄ２−Ｍｉｔｏ細胞を得た。該細胞を５％ホルムアルデヒド存在下で１０分間固定し、該固定細胞中に発現しているＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰの蛍光、及び、ミトコンドリア局在配列を融合したＤｓＲｅｄタンパク質の蛍光を、Ｂｉｏｚｅｒｏ蛍光顕微鏡システム（Keyence社製）で３０秒ごとに１５０秒間観察した。その結果を図７に示す。図７において、線状（赤色）のものがミトコンドリアを表し、ドット状（緑色）のものがＣＬＰＡＢＰを表す。小さな矢印で示された部分は、ＣＬＰＡＢＰの小胞に向かって、チューブ状のミトコンドリアが新たに伸長した部分である。また、「０」と「１５０ｓ」の上方の四角で囲まれた部分は、撮影開始時（「０」）にはミトコンドリアが分断されていたが、１５０秒後には、伸長してチューブ状ミトコンドリアとして融合したことを示している。
【００４７】
また、図７で観察したのと同じ細胞の別の部位を観察した結果を図８に示す。図８の矢印で示された部分は、ＣＬＰＡＢＰの小胞をかいくぐるように細胞内を移動するミトコンドリアである。また、四角で囲まれた部分は、撮影開始時（「０」）には３つの独立したＣＬＰＡＢＰ小胞であったが、１２０秒後には、互いがまとまりアッセンブルしたことを示している。
【００４８】
図７及び図８の結果から、ＣＬＰＡＢＰ小胞は、ミトコンドリアがネットワークを形成時に融合や移動する際に、細胞内において道標のような機能を果たしていることが示唆された。
【実施例６】
【００４９】
［ＲＮＡｉによるＣＬＰＡＢＰのノックダウン実験］
図５〜図８の結果から、ＣＬＰＡＢＰは、ミトコンドリアネットワーク形成に関与していることが示唆された。このことを裏付けるために、ＲＮＡｉによるＣＬＰＡＢＰのノックダウンを試みた。
まず、ＣＬＰＡＢＰに対するＲＮＡｉ（ＣＬＰＡＢＰ−ｓｉＲＮＡ）として、二本鎖ＲＮＡ（センス配列：aaggagaagcagauccgcuccuu：配列番号５）を作製した。この配列は、ＣＬＰＡＢＰの塩基配列（配列番号１）の塩基番号８６７−８８９に対応している。また、コントロール用のＲＮＡｉとして、ＧＦＰに対するＲＮＡｉ（Cat#S5C-0201； B-Bridge International, Inc. 製）を用意した。Invitrogen社のOligofectamineを用いて、ＣＬＰＡＢＰに対するＲＮＡｉを一過性にＨｅＬａ細胞に導入し、ＨｅＬａ／ＣＬＰＡＢＰ−ｓｉＲＮＡ細胞を得た。また、ＧＦＰに対するＲＮＡｉを同様に一過性にＨｅＬａ細胞に導入し、ＨｅＬａ／ｃｏｎｔｒｏｌ細胞を得た。
【００５０】
ＨｅＬａ／ＣＬＰＡＢＰ−ｓｉＲＮＡ細胞及びＨｅＬａ／ｃｏｎｔｒｏｌ細胞について以下のようなウエスタンブロット解析を行った。
ダルベッコ改変イーグル培地に１０％の牛胎児血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍｌアンピシリンを加えた培地に、ＨｅＬａ／ＣＬＰＡＢＰ−ｓｉＲＮＡ細胞、ＨｅＬａ／ｃｏｎｔｒｏｌ細胞をそれぞれ添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃にて培養した。これらの培養液を遠心分離して、各細胞の菌体をそれぞれ回収し、該菌体に抽出液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）； １ｍＭ ＥＤＴＡ； １０ｍＭ ＤＴＴ； １％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００； １５０ｍＭ ＮａＣｌ； １０ｍＭ ＮａＦ； １ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４； protease inhibitor cocktail（Roche社製））を添加して混合し、菌体を破砕して細胞抽出液をそれぞれ得た。得られた細胞抽出液にＳＤＳサンプル溶液を添加した後９５℃で３分間で変性し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ＰＶＤＦ膜（Immobilon-P：ミリポア社製）に電気的に転写した。
【００５１】
上記実施例２に記載したのと同様の抗ＣＬＰＡＢＰ一次抗体を前述のＰＤＶＦ膜と反応させ、該ＰＤＶＦ膜を洗浄した後、ＨＲＰ（HorseRadish Peroxydase）標識二次抗体（アマシャムバイオサイエンス社製）を反応させ、該標識二次抗体に対するＥＣＬ反応により検出した。検出機器としては、イメージアナライザー「ＬＡＳ３０００」（富士フィルム社製）を用いた。その結果を図９の左パネルに示す。図９の左パネルから分かるように、ＨｅＬａ／ＣＬＰＡＢＰ−ｓｉＲＮＡ細胞においては、ＨｅＬａ／ｃｏｎｔｒｏｌ細胞に比べて、ＣＬＰＡＢＰの発現量の減少していることが示された。
【００５２】
また、ＨｅＬａ／ＣＬＰＡＢＰ−ｓｉＲＮＡ細胞やＨｅＬａ／ｃｏｎｔｒｏｌ細胞における、ＣＬＰＡＢＰやミトコンドリアの局在を調べるために、前述の抗ＣＬＰＡＢＰ一次抗体やCMX-Rosamine（「Mito-Tracker Red」（登録商標））を用いて、実施例３と同様の方法で、両細胞について蛍光染色を行った。蛍光染色した両細胞の観察結果を図９の中央パネル及び右パネルに示す。図９のこれら２パネルから分かるように、ＣＬＰＡＢＰの発現が減少している（図９の中央パネル）ＨｅＬａ／ＣＬＰＡＢＰ−ｓｉＲＮＡ細胞（矢印で示された細胞）においては、周囲のＨｅＬａ／ｃｏｎｔｒｏｌ細胞とは異なり、ミトコンドリアの断片化が生じている（図９の右パネル）。
【実施例７】
【００５３】
［ＣＬＰＡＢＰ結合タンパク質の解析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）］
図５〜図８の結果から、ＣＬＰＡＢＰは細胞内において小胞構造を形成することが明らかとなった。その小胞構造の形成には、ＣＬＰＡＢＰのほかに、ＣＬＡＰＡＢＰに対する何らかの特異的結合タンパク質が関与していることが予想された。そこで、ＣＬＰＡＢＰに対する結合タンパク質の同定を試みた。
上記実施例２におけるＣＬＰＡＢＰ遺伝子断片を、該遺伝子が発現し得るように、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ（アミノ末端側にＦＬＡＧタグを付加しうるベクター）に組み込んだ。得られたプラスミド（ｐＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ）を、エレクトロポーレーション法によりそれぞれＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ導入し、ＨＥＫ２９３Ｔ／ｐＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ細胞を得た。該細胞は、ＦＬＡＧタグＣＬＰＡＢＰを一過性に発現する細胞である。このＨＥＫ２９３Ｔ／ｐＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ細胞を培養し、１×１０８個の該細胞の菌体を得た。その菌体に、実施例２記載の抽出液を添加して混合し、菌体を破砕して細胞抽出液を得た。該細胞抽出液中のＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ複合体を、Sigma社製の抗ＦＬＡＧアフィニティーゲルを用いて免疫沈降した。免疫沈降の際の遠心は、１４０００ｒｐｍで１０分間、低温で行った。免疫沈降して得られた沈殿を数回洗浄した後、０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３）緩衝液で前記複合体を溶出し、すぐにｐＨを中性に戻した。この溶液をタンパク質サンプル溶液として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った後、該ＳＤＳ−ＰＡＧＥをＣＢＢ染色した。検出した主なバンド部分のゲルを切り出し、脱色後、還元アルキル化反応を行った。次いで、トリプシンを用いてゲル内消化を行い、溶出されたペプチドについて質量分析を行った。質量分析装置としては、Q-Tof-type hybrid mass spectrometer（Micromass社製）を用い、サンプルアプライの前にWaters-Micromass modular CapLC HPLCシステム（Micromass社製）によりペプチドの分離を行った。得られた測定データをMatrix science（Matrix science社製）にて解析し、解析の結果算出された分子量から、バンド部分に含まれるタンパク質を同定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動結果と、質量分析によるタンパク質の同定結果を図１０に示す。図１０の結果から、ＣＬＰＡＢＰには、一般的に発現量の多いタンパク質（Ｈｓｐ７０、１４−３−３ε、ａｃｔｉｎ、及びｔｕｂｕｌｉｎ）と共に、ミトコンドリアマトリックスタンパク質ｐ３２（ｐ３２Ｍｐ）が結合することが示唆された。
【実施例８】
【００５４】
［ＣＬＰＡＢＰにおけるｐ３２Ｍｐ結合部位の同定］
図１０の結果から、ＣＬＰＡＢＰには、一般的に発現量の多いタンパク質と共に、ミトコンドリアマトリックスタンパク質ｐ３２（ｐ３２Ｍｐ）が結合することが示唆された。そこで、ＣＬＰＡＢＰのどの部分にｐ３２Ｍｐが結合するかについて以下のような解析を行った。
【００５５】
RZPD German Resource Center for Genome Researchより購入したＣＬＰＡＢＰ遺伝子を鋳型としたＰＣＲや、ＰＣＲ産物の制限酵素による切断によって、ＣＬＰＡＢＰの全長のアミノ酸配列又はそのアミノ末端欠失変異体をコードするＤＮＡ断片を得た。
具体的には、ＣＬＰＡＢＰのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸番号１−６１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片、前記アミノ酸番号６１−６１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片、前記アミノ酸番号１０１−６１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片、前記アミノ酸番号１８１−６１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を作製した。これらの４種類のＤＮＡ断片を、該遺伝子が発現し得るように、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ６ａ（Sigma社製）（アミノ末端側にＦＬＡＧタグを付加しうるベクター）にそれぞれ組み込んだ。得られた４種類のプラスミドを、それぞれｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １−６１１、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ ６１−６１１、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １０１−６１１、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １８１−６１１と命名した。これらの４種類のプラスミドを、エレクトロポーレーション法によりそれぞれＣＯＳ−７細胞へ導入し、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １−６１１細胞（「１−６１１」）、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ ６１−６１１細胞（「６１−６１１」）、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １０１−６１１細胞（「１０１−６１１」）、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １８１−６１１（「１８１−６１１」）細胞を得た。また、ネガティブコントロールとして、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ６ａ（Sigma社製）そのものをＣＯＳ−７細胞に導入した、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ６ａ（「ｖｅｃｔｏｒ」）を作製した。
【００５６】
上記の計５種類の細胞について、以下のようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った。
上記の計５種類の細胞を培養し、それぞれ１×１０８個の該細胞の菌体を得た。それぞれの菌体に、実施例２記載の抽出液を添加して混合し、菌体を破砕して細胞抽出液を得た。該細胞抽出液中のＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ（又はＣＬＰＡＢＰアミノ末端変異体）複合体を、抗ＦＬＡＧ抗体ビーズ（Sigma社製）を用いて免疫沈降した。免疫沈降の際の遠心は、１４０００ｒｐｍで１０分間、低温で行った。免疫沈降して得られた該ビーズを洗浄した後、これを緩衝液に懸濁し、タンパク質サンプル溶液を得た。該タンパク質サンプル溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した後、該ＳＤＳ−ＰＡＧＥをＣＢＢ染色した。その結果を図１１の上のパネルに示す。
【００５７】
また、前記の計５種類の細胞について、実施例２と同様の方法で、抗ｐ３２Ｍｐ抗体（SC-23885：Santa-Cruz社製）を用いたウエスタンブロット解析を行った。その結果を図１１の下のパネルに示す。この結果から、ＣＬＰＡＢＰにおけるｐ３２Ｍｐ結合部位は、ＣＬＰＡＢＰのアミノ酸番号６１から１００の間にあることが示唆された。
【実施例９】
【００５８】
［ＣＬＰＡＢＰの細胞内局在に対する、ＣＬＰＡＢＰのドメインの影響］
ＣＬＰＡＢＰとｐ３２Ｍｐの結合と、ＣＬＰＡＢＰの細胞内局在との関係を調べるため、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １−６１１、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ ６１−６１１、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １０１−６１１の３種類の細胞について、上記実施例３と同様の方法で、抗ＦＬＡＧ抗体や抗ミトコンドリア抗体（抗cytochrome c抗体：SC-7159：Santa-Cruz社製）を用いた蛍光染色を行った。
【００５９】
抗ＦＬＡＧ抗体を用いた蛍光染色の結果を図１２の左の３つのパネルに示し、抗ミトコンドリア抗体を用いた蛍光染色の結果を図１２の中央の３つのパネルに示す。また、図１２の左のパネルの図と中央のパネルの図を重ね合わせたものをそれぞれ右のパネル示す。なお、図１２の上段の３つのパネルは、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １−６１１（ＣＬＰＡＢＰ ｆｕｌｌ １−６１１）の結果を示し、中段の３つのパネルは、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ ６１−６１１（６１−６１１））の結果を示し、下段の３つのパネルは、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １０１−６１１（１０１−６１１）の結果を示す。
図１２から分かるように、ｐ３２Ｍｐ結合部位を持つＣＬＰＡＢＰやＣＬＰＡＢＰアミノ末端欠失変異体（ＣＬＰＡＢＰ ｆｕｌｌ １−６１１及び６１−６１１）は、ミトコンドリア近傍に小胞構造形成能を有するが、ｐ３２Ｍｐ結合部位を欠くＣＬＰＡＢＰアミノ末端欠失変異体（１０１−６１１）はわずかに小胞形成が認められるものの、細胞内全体に拡散する傾向が見られ、全長ＣＬＰＡＢＰとは極めて異なる局在を示した。このことから、ＣＬＰＡＢＰの特徴的な細胞内局在様式には、ｐ３２Ｍｐとの結合が必要であることが示唆された。
【実施例１０】
【００６０】
［ＣＬＰＡＢＰのＰＨ領域に結合する脂質の同定］
図２に示したように、ＣＬＰＡＢＰは分子内に２箇所ＰＨ領域を持つ。一般的にＰＨ領域は脂質結合能を有し、細胞膜や小胞体などのオルガネラへのタンパク質移行に寄与することが知られている。しかし、本願実施例における、ＣＬＰＡＢＰの細胞内の局在実験の結果から、ＣＬＰＡＢＰのＰＨ領域はこれまで知られたものとは異なる性質を示すことが考えられた。そこで、ＣＬＰＡＢＰのＰＨ領域に結合する脂質の同定を以下のように行った。
【００６１】
実施例２で用いたのと同様のＣＬＰＡＢＰ遺伝子を鋳型としたＰＣＲにより、ＣＬＰＡＢＰのＰＨ１領域のタンパク質（配列番号２のアミノ酸番号８５−１９２のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡ断片、及び、ＰＨ２領域のタンパク質（配列番号２のアミノ酸番号２１１−３２０のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。上記ＰＨ１領域のタンパク質をコードするＤＮＡ断片に増幅には、フォワードプライマー（gtttggatcccggcggagggtgcctgtgagg：配列番号６）とリバースプライマー（gaaagaattcgagggccgtctgcttctccag：配列番号７）を用い、上記ＰＨ２領域のタンパク質をコードするＤＮＡ断片に増幅には、フォワードプライマー（gtttggatcccggacggcgtcagggcacgaa：配列番号８）とリバースプライマー（gaaagaattcctacccctccctgtgggtgacagc：配列番号９）を用いた。
増幅したこれらのＤＮＡ断片をそれぞれｐＧＥＸ４Ｔベクター（Amersham Bioscience社製）（ＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクター）に挿入し、得られた両組換えベクターをそれぞれ大腸菌に導入した。これらの大腸菌を培養し、得られた菌体からGlutathion-Sepharoseビーズを用いて、ＧＳＴ融合ＰＨ１領域タンパク質やＧＳＴ融合ＰＨ２領域タンパク質を精製した。図１３の上段のパネルは、精製したＧＳＴ融合ＰＨ１領域タンパク質やＧＳＴ融合ＰＨ２領域タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ＣＢＢ染色した結果を示す。
【００６２】
また、生体内に存在する１５種類の脂質が一定量スポットされたメンブレン（図１３の下段左）として、Membrane lipid strips（Echelon社製）を用意した。このメンブレンを脂肪酸無含有の３％ＢＳＡでブロッキングした後、ＴＢＳ−Ｔ（ｐＨ ８．０の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ； １５０ ｍＭ ＮａＣｌ； ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）中にて、０．５ｍｇ／ｍｌのＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ融合ＰＨ１領域タンパク質又はＧＳＴ融合ＰＨ２領域タンパク質）と３時間インキュベートした。次いでこのメンブレンを洗浄した後、抗ＧＳＴ抗体（ＭＢＬ社製）と２時間インキュベートした。このメンブレンを洗浄した後、ＨＲＰ標識２次抗体をさらに加えてインキュベートし、ＥＣＬ反応によって脂質とＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ融合ＰＨ１領域タンパク質又はＧＳＴ融合ＰＨ２領域タンパク質）の結合を検出した。その結果、図１３の下段右に示されているように、ＰＨ１領域タンパク質には、cardiolipinとphosphatidic acidが、ＰＨ２領域タンパク質にはそれらに加えてさらに、phosphatidylserineとphosphatidylinositol-4 phsphateが結合することが判明した。
【実施例１１】
【００６３】
［ＣＬＰＡＢＰとcardiolipinの細胞内における共局在］
ＣＬＰＡＢＰとcardiolipinの細胞内における共局在を調べるために、抗cardiolipin抗体（MBL社製）を用いて、上記実施例３記載の方法と同様の方法で、上記実施例４記載のＣＯＳ−７／ｐＧＦＰ−ＣＬＰＡＢＰ細胞について蛍光染色を行った。
ＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰの観察結果を図１４の左パネルに示し、抗cardiolipin抗体による蛍光染色の結果を図１４の中央パネルに示し、図１４の左パネルと中央パネルを重ね合わせたものを右パネルに示す。図１４の結果から、cardiolipinは、ＣＬＰＡＢＰが形成する小胞に共局在することが示された。
【実施例１２】
【００６４】
［ＣＬＰＡＢＰの細胞内局在におけるＰＨ領域の影響］
図１２の結果から、ＣＬＰＡＢＰの細胞内局在、すなわちミトコンドリア近傍に小胞を形成するユニークな局在には、ｐ３２Ｍｐ結合部位が重要であることが示されたが、さらに、ＣＬＰＡＢＰの別の特定の領域（ＰＨ１領域やＰＨ２領域）が、ＣＬＰＡＢＰの細胞内局在にどのような影響を与えるかを調べるために、以下のようなアッセイを行った。
【００６５】
実施例２で用いたのと同様のＣＬＰＡＢＰ遺伝子を鋳型としたＰＣＲにより、ＣＬＰＡＢＰのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸番号１−４５０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片と、該アミノ酸番号２５１−６１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を増幅した。配列番号２のアミノ酸番号１−４５０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片に増幅には、フォワードプライマー（gtttaagcttatggggaacagccactgtgtc：配列番号１０）とリバースプライマー（gaaagaattcctatgtttccgaagtgtggtc：配列番号１１）を用い、配列番号２のアミノ酸番号２５１−６１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片に増幅には、フォワードプライマー（gtttaagcttgccattttctccgaggag：配列番号１２）とリバースプライマー（gaaagaattctcagatccactgcacaagccc：配列番号１３）を用いた。
増幅したこれらの２種類のＤＮＡ断片を、該遺伝子が発現し得るように、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ６ａ（Sigma社製）（アミノ末端側にＦＬＡＧタグを付加しうるベクター）にそれぞれ組み込んだ。得られた２種類のプラスミドを、それぞれｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １−４５０、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ ２５１−６１１と命名した。これらの２種類のプラスミドを、エレクトロポーレーション法によりそれぞれＣＯＳ−７細胞へ導入し、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １−４５０細胞（「１−４５０」）、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ ２５１−６１１細胞（「２５１−６１１」）を得た。
【００６６】
これら２種類の細胞について、上記実施例３と同様の方法で、抗ＦＬＡＧ抗体や抗ミトコンドリア抗体（抗cytochrome c抗体：SC-7159：Santa-Cruz社製）を用いた蛍光染色を行った。
抗ＦＬＡＧ抗体を用いた蛍光染色の結果を図１５の左の２つのパネルに示し、抗ミトコンドリア抗体を用いた蛍光染色の結果を図１５の中央の２つのパネルに示す。また、図１５の左のパネルの図と中央のパネルの図を重ね合わせたものをそれぞれ右のパネル示す。なお、図１５の上段の３つのパネルは、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ ２５１−６１１（２５−６１１）の結果を示し、下段の３つのパネルは、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １−４５０（１−４５０））の結果を示す。
【００６７】
図１５から分かるように、ＰＨ２領域のアミノ末端側まで欠失したＣＬＰＡＢＰ変異体（２５１−６１１）では、小胞形成能及びミトコンドリア近傍への局在能を完全に消失していた（図１５の上段パネル）。一方、ＣＬＰＡＢＰのＣ末端を約１６０アミノ酸欠失しているものの、ｐ３２Ｍｐ結合領域や２つのＰＨ領域を有する変異体（１−４５０）は、依然として小胞形成能を有していた（図１５の下段パネル）。
【実施例１３】
【００６８】
［ＣＬＰＡＢＰの過剰発現による、アポトーシスへの影響］
図６〜８の結果から、ＣＬＰＡＢＰはミトコンドリアネットワークの形成に際して重要な役割を果たすことが示唆された。ＣＬＰＡＢＰの過剰発現によって、アポトーシスへどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。
実施例４で用いたＣＯＳ−７／ｐＧＦＰ−ＣＬＰＡＢＰ細胞内において、ＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰを一過性に発現させ、約６０時間培養した後、該細胞をトリプシン処理にて回収し、Annexin V-Alexa594（Molecular Probes社製）を加えアポトーシス細胞を染色した。染色した細胞をガラスプレパラートにマウントし、前述のＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss社製）で、ＧＦＰの緑色の蛍光とAlexa594の青色の蛍光を観察した。ＧＦＰの観察結果を図１６の一番左のパネルに、Alexa594の観察結果を左から２番目のパネルに、一番左のパネルと左から２番目のパネルとを重ね合わせたものを左から３番目のパネルに示した。図１６の左から２番目のパネルから分かるように、ＣＬＰＡＢＰ発現細胞は、長時間の培養後にアポトーシスを引き起こした。
また、左の３つのパネルの観察結果を定量し、ＧＦＰとAlexa594の両方が観察された細胞の割合（％）を算出した結果を図１６の一番右のパネルに示す。なお、コントロールとして、ＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰではなく、ＧＦＰを一過性に発現するＣＯＳ−７細胞において、ＧＦＰとAlexa594の両方が観察された細胞の割合（％）を示す。図１６の一番右のパネルから分かるように、ＣＬＰＡＢＰの過剰発現により、アポトーシスが著しく誘導されることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ヒトＣＬＰＡＢＰの推定アミノ酸配列を示す図である。
【図２】ヒトＣＬＰＡＢＰの推定機能領域であるＰＨ領域の位置を示す図である。図中の数字はアミノ酸番号を表す。
【図３】各種ヒト臓器及び培養細胞におけるＣＬＰＡＢＰ遺伝子の発現を示す図（エチジウムブロマイド染色）である。
【図４】内在性及び組換え型ＣＬＰＡＢＰの培養細胞における発現を示す図（ウエスタンブロット解析）である。
【図５】内在性ＣＬＰＡＢＰ等の培養細胞内における局在を示す図（蛍光染色）である。
【図６】ＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰ等の細胞内における局在を示す図である。
【図７】ＣＬＰＡＢＰのミトコンドリアネットワーク形成における影響を示す図である。
【図８】ＣＬＰＡＢＰのミトコンドリアネットワーク形成における影響を示す図である。
【図９】左パネルは、ＲＮＡｉによるＣＬＰＡＢＰのノックダウン細胞におけるＣＬＰＡＢＰの発現を示す図（ウエスタンブロット解析）である。また、中央パネルや右パネルは、ＲＮＡｉによるＣＬＰＡＢＰのノックダウン細胞内におけるＣＬＰＡＢＰ等の局在を示す図である（蛍光染色）。
【図１０】ＣＬＰＡＢＰ及びその結合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。図の右に記載されたタンパク質名は、質量分析により同定された結果を示す。
【図１１】上パネルは、免疫沈降したＣＬＰＡＢＰ及びＣＬＰＡＢＰアミノ末端変異体の泳動結果を示す図である。下パネルは、抗ｐ３２Ｍｐ抗体によるウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図１２】ＣＬＰＡＢＰやＣＬＰＡＢＰアミノ末端変異体を発現する細胞内におけるＣＬＰＡＢＰ又はＣＬＰＡＢＰアミノ末端変異体等の局在を示す図である（蛍光染色）。
【図１３】上段のパネルは、精製したＧＳＴ融合ＰＨ１領域タンパク質やＧＳＴ融合ＰＨ２領域タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ＣＢＢ染色した結果を示す図である。下段左のパネルは、生体内に存在する１５種類の脂質が一定量スポットされたメンブレンを示す図である。また、下段右のパネルは、脂質とＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ融合ＰＨ１領域タンパク質又はＧＳＴ融合ＰＨ２領域タンパク質）との結合をＥＣＬ反応によって検出した結果を示す図である。
【図１４】ＣＬＰＡＢＰやcardiolipinの細胞内における局在を示す図である。
【図１５】ＣＬＰＡＢＰの変異体（ＰＨ領域を含む変異体及びＰＨ領域を含まない変異体）等の細胞内局在を示す図（蛍光染色）である。
【図１６】左から１〜３番目のパネルは、ＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰの細胞内での局在や、アポトーシス細胞を蛍光染色した結果を示す図である。一番右のパネルは６０時間培養後におけるアポトーシス細胞の割合を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス誘導活性を有する新規タンパク質及びこれをコードするＤＮＡからなる遺伝子に関する。また本発明は、上記タンパク質に対する抗体、上記遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターが導入された形質転換体に関する。さらに本発明は、上記タンパク質、上記遺伝子又は上記組換えベクターを含有するアポトーシス誘導剤や、上記タンパク質、上記遺伝子又は上記組換えベクターを有効成分とする医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、エネルギー生産、増殖、アポトーシスなどの様々な細胞過程に関与する極めて重要な細胞器官である（非特許文献１）。ミトコンドリアは、分裂及び融合により形態を頻繁に変化させる（非特許文献２）。ミトコンドリアの分裂及び融合に関与するタンパク質は、下等真核生物及び高等真核生物で保存されており、またこのタンパク質は、ミトコンドリア依存性のアポトーシスを制御している（非特許文献３）。これらのタンパク質に加えて、ミトコンドリア特異的なリン脂質であるカルジオリピン（ＣＬ：cardiolipin）が、ミトコンドリアの膜の内側から外側に移動した後、ミトコンドリアの分裂及び融合の調節因子として機能することが明らかにされた（非特許文献４〜８）。ミトコンドリアの分裂及び融合のメカニズムは徐々に明らかとされつつあるが、生細胞中のミトコンドリアのネットワーク形成についてはほとんど研究が進んでいない。
【０００３】
一方、細胞のアポトーシス（細胞死）は、生体組織を正常な状態に保つうえで重要な現象として知られる。例えばがん細胞は、アポトーシスの機構が正常に機能せずに無限に分裂増殖を行う細胞と規定することができる。
アポトーシス（細胞死）は、種々の物質によって誘導されることが知られている。従って、そのような物質を標的細胞（例えばがん細胞、ウイルス感染細胞）に付与することによって人為的にアポトーシスを誘導し、当該標的細胞を死滅させることが可能である。アポトーシスを誘導し得る物質として例えば、特許文献１には、アポトーシスを誘導し得る物質としてデング熱ウイルス由来のタンパク質が記載されており、特許文献２には、クサリヘビ科のヘビの毒腺由来のアポトーシス誘導性タンパク質が記載されており、特許文献３には、細胞表面レセプターであるＦａｓを介した細胞のアポトーシス誘導を増強し得るポリペプチドが記載されている。
【０００４】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００１／０９６３７６号パンフレット
【特許文献２】特開平１１−１４９６号公報
【特許文献３】特開２００１−１９３号公報
【非特許文献１】D. D. Newmeyer et al., Cell 112, 481 (2003)
【非特許文献２】M. P. Yaffe et al., Science 283, 1493 (1999)
【非特許文献３】R. J. Youle et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 657 (2005)
【非特許文献４】B. Jeanie et al., Biochim. Biophys. Acta. 1585, 97 (2002)
【非特許文献５】M. Garcia-Fernandez et al., Cell Growth Differ. 13, 449 (2002)
【非特許文献６】M. Sorice et al., Cell Death Differ. 11, 1133 (2004)
【非特許文献７】M. D. Esposti et al., Cell Death Differ. 10, 1300 (2003)
【非特許文献８】S. Y. Chioi et al., Nat. Cell Biol. 8, 1255 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、アポトーシス誘導活性を有する新規タンパク質、これをコードするＤＮＡからなる遺伝子、前記タンパク質に対する抗体、前記遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターが導入された形質転換体、アポトーシス誘導剤等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）で刺激したＡ４３１細胞の溶解物を用いたタンパク質リン酸化シグナル解析を行うことによって、ＣＬ及びホスファチジン酸に対する結合活性を有するタンパク質（cardiolipin and phosphatidic acid binding protein；以下、「ＣＬＰＡＢＰ」という。）を同定し、該ＣＬＰＡＢＰのｃＤＮＡが、ヒトゲノム解析計画によりクローン化されたgi No. 14149786（Genbank Accession No. NM_032129_1）であることを見い出し、さらには、該ＣＬＰＡＢＰを細胞内で過剰発現させるとアポトーシスが誘導されることを見い出し、本発明を完成するに至った。該ＣＬＰＡＢＰの推定アミノ酸配列を図１（配列番号２）に記載する。また、該ＣＬＰＡＢＰの推定機能領域と考えられる、２つのプレックストリン相同（ＰＨ）領域の位置を図２に示す。
【０００７】
すなわち本発明は、（１）(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子や、（２）配列番号１に示される塩基配列の塩基番号３６−１８６８の塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡからなる遺伝子や、（３）前記（２）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子や、（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の遺伝子を含み、かつアポトーシス誘導タンパク質を発現することができる組換えベクターや、（５）前記（４）に記載の組換えベクターが導入され、かつアポトーシス誘導タンパク質を発現する形質転換体や、（６）形質転換体が動物であることを特徴とする前記（５）に記載の形質転換体に関する。
【０００８】
また本発明は、（７）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を有し、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質や、（９）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質や、（１０）配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質や、（１１）配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号６１−３１８のアミノ酸配列又はアミノ酸番号８５−３１８のアミノ酸配列である前記（８）又は（１０）に記載のタンパク質や、（１２）前記（７）〜（１１）のいずれかに記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質や、（１３）前記（７）〜（１１）のいずれかに記載のタンパク質、又は前記（１２）に記載の融合タンパク質に対する抗体や、（１４）前記（７）〜（１１）のいずれかに記載のタンパク質、又は前記（１２）に記載の融合タンパク質を含有するアポトーシス誘導剤や、（１５）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の遺伝子、又は前記（４）に記載の組換えベクターを含有するアポトーシス誘導剤に関する。
【０００９】
さらに本発明は、（１６）前記（７）〜（１１）のいずれかに記載のタンパク質、又は前記（１２）に記載の融合タンパク質を、対象とする細胞に発現させることにより、該細胞のアポトーシスを誘導する方法や、（１７）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の遺伝子を、対象とする細胞に導入することにより上記タンパク質を発現させる、前記（１６）に記載の方法や、（１８）前記（７）〜（１１）のいずれかに記載のタンパク質、又は前記（１２）に記載の融合タンパク質を有効成分とする医薬や、（１９）アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である前記（１８）記載の医薬や、（２０）疾患が、がん、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器過形成、血管形成術後再狭窄及びがん切除術後の再発からなる群より選択される前記（１９）記載の医薬に関する。
【発明の効果】
【００１０】
アポトーシス誘導活性を有する本発明のタンパク質や、該タンパク質をコードする本発明の遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、本発明のタンパク質に対する抗体等は、ミトコンドリアネットワーク形成やアポトーシスの分子レベルでの機構の解明に利用することができる。また、本発明のタンパク質や、該タンパク質をコードする本発明の遺伝子や、該遺伝子を含む組換えベクター等を用いると、アポトーシスを誘導させることができるので、本発明のタンパク質や遺伝子等を用いて疾患細胞においてアポトーシスを誘導することにより、疾患の予防・治療に応用できる可能性がある。また、本発明のタンパク質はそれ自身が、細胞内においてミトコンドリアやアポトゾーム（アポトーシスの実行場所）に局在する性質を有しているため、他のアポトーシス誘導剤に比べてより効果的な細胞内ターゲティングが可能であると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の遺伝子としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子や、配列番号１に示される塩基配列の塩基番号３６−１８６８の塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡからなる遺伝子や、配列番号１に示される塩基配列の塩基番号３６−１８６８の塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子を例示することができる。なお、配列番号１に示される塩基配列の塩基番号３６−１８６８は、配列番号２に示されるアミノ酸配列のコード領域である。
【００１２】
本発明の遺伝子の由来は特に制限されないが、例えばヒト（gi No. 14149786；Genbank Accession No. NM_032129_1）、アカゲザル(gi No. 108995452；Genbank Accession No. XR_010934)、イヌ(gi No. 73956457；Genbank Accession No. XM_546726)、ウシ(gi No. 76637790；Genbank Accession No. XM_598312)、ラット(gi No. 109477818；Genbank Accession No. XM_001078287)、マウス(gi No. 22749601；Genbank Accession No. BC031374)等の哺乳類や、フグ(gi No. 47228599；Genbank Accession No. CAAE01014991)、ゼブラフィッシュ(gi No. 125852117；Genbank Accession No. XM_001345356)等の魚類や、アフリカツメガエル(gi No. 50415259, 49118112；Genbank Accession No. BC077452, BC073066)等の両生類などを例示することができる。本発明の遺伝子は、これらのＤＮＡ配列情報等に基づき、例えばヒト等の遺伝子ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーなどから公知の方法、例えば全ＲＮＡを用いるＲＡＣＥ法により調製することができる。
【００１３】
また、上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００１４】
また、上記「配列番号１に示される塩基配列の塩基番号３６−１８６８の塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」は、配列番号１に示される塩基配列の塩基番号３６−１８６８の塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより得ることもできる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１５】
例えば、上記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００１６】
また、上記「配列の一部」とは、該一部の配列又はその配列に相補的な配列が、アポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードする限り特に制限されず、配列番号１に示される塩基配列の塩基番号２１６−９８９の塩基配列（配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号６１−３１８のアミノ酸配列に対応）や、配列番号１に示される塩基配列の塩基番号２８８−９８９の塩基配列（配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８５−３１８のアミノ酸配列に対応）を例示することができる。ヒト由来のＣＬＰＡＢＰの場合、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８５−１９２及び２１１−３１８がプレックストリン相同領域（それぞれＰＨ１領域及びＰＨ２領域）として知られている。他の生物由来のＣＬＰＡＢＰにおけるＰＨ領域の有無は未だ確認されていないが、ヒトＣＬＰＡＢＰのＰＨ領域に対して相同性の高い領域が存在していることが予想される。
【００１７】
本発明のタンパク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を有し、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質を例示することができる。ここで、上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号６１−３１８のアミノ酸配列やアミノ酸番号８５−３１８のアミノ酸配列を好ましく例示することができる。なお、本発明のタンパク質はそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができる。本発明のタンパク質の由来は特に制限されるものではないが、例えばヒト、アカゲザル、イヌ、ウシ、ラット、マウス等の哺乳類や、フグ、ゼブラフィッシュ等の魚類や、アフリカツメガエル等の両生類などを例示することができる。
【００１８】
あるタンパク質がアポトーシス誘導活性を有しているか否かは、そのタンパク質で処理したり、そのタンパク質を細胞内で発現させたりした場合に、そのような処理を行わなかった場合又は細胞内で発現させなかった場合に比べて、アポトーシスが生じる細胞の割合が向上するかどうかにより確認することができる。アポトーシスが生じる細胞の割合については、アポトーシスに伴うＤＮＡ断片化や細胞膜構造変化やミトコンドリア膜電位消失やアポトーシス関連の酵素活性を指標とする公知の検出法により容易に行うことができる。
【００１９】
本発明の融合タンパク質としては、本件タンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のタンパク質等の精製や、本発明のタンパク質と相互作用するタンパク質の検出や、本発明のタンパク質等に対する抗体の定量用などとしても有用である。
【００２０】
本発明の抗体としては、上記本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体（本発明のタンパク質に対する抗体）であれば特に制限はされず、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらはＣＬＰＡＢＰ等の本発明のタンパク質又はその一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、本発明のタンパク質の細胞内での発現を定量や、該タンパク質の細胞内での発現の有無を検出に用いることができるほか、ミトコンドリアネットワーク形成の分子レベルでの機構を解明する上でも有用である。
【００２１】
上記の本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のタンパク質若しくはエピトープを含むその断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００２２】
本発明のタンパク質に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本発明のタンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。
【００２３】
また前記モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本発明のタンパク質の機能解析を行うことができる。また本発明の抗体を用いる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２４】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明の遺伝子を含み、かつアポトーシス誘導活性を有する本発明のタンパク質を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。例えば、本発明の遺伝子の５'と３'側双方の非翻訳領域を除いたＯＲＦ部分のｃＤＮＡ（配列番号１の塩基番号３６〜１８６８）を適切なプロモーターの下流につないだコンストラクトを好適に例示することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、動物細胞用発現ベクター、酵母用発現ベクター、細菌用発現ベクター等を用いることができるが、動物細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましい。
【００２５】
動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、pcDNA3（Stratagene社製）、pCMV-FLAG6a（Sigma社製)、pEGFP-C3（Clontech社製)、pcDM8（フナコシ社より市販)、pAGE107〔特開平3-22979; Cytotechnology, 3, 133,(1990)〕、pAS3-3（特開平2-227075)、pCDM8〔Nature, 329, 840,(1987)〕、pcDNAI/Amp（Invitrogen社製)、pREP4（Invitrogen社製)、pAGE103〔J.Blochem., 101, 1307(1987)〕、pAGE210等を例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCMV)のIE（immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等を挙げることができる。
【００２６】
酵母用の発現ベクターとして、例えば、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、Ycp5O(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を例示することができる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
【００２７】
細菌用の発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2(いずれもべーリンガーマンハイム社より市販)、pGEX4T(Amersham Bioscience社製)、pKK233-2(Pharmacia社製)、pSE280(Invitrogen社製)、pGEMEX-1(Promega社製)、pQE-8(QIAGEN社製)、pQE-30(QIAGEN社製)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200〔Agrc.Biol.Chem., 48, 669(1984)〕、PLSA1〔Agrc. Blo1. Chem., 53, 277(1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII SK(+)、pBluescriptII SK(-)(Stratagene社製)、pTrS30(FERMBP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX(Pharmacia社製)、pET-3(Novagen社製)、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔Gene, 33, 103(1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103(1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29(宝酒造社製)、pUC118(宝酒造社製)、pQE-30(QIAGEN社製)等が挙げられる。細菌用のプロモーターとしては、例えば、trpプロモーター(P trp)、lacプロモーター(P lac)、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。
【００２８】
本発明の形質転換体としては、本発明の組換えベクターが導入され、かつアポトーシス誘導活性を有する本発明のタンパク質を発現する形質転換体である限り特に制限されず、形質転換動物（細胞、組織、個体）、形質転換酵母、形質転換細菌、を挙げることができるが、形質転換動物（細胞、組織、個体）が好ましい。本発明の形質転換体における宿主細胞として、より具体的には、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、シロイヌナズナ等の植物細胞等を挙げることができる。
【００２９】
また、本発明の組換えベクターの宿主細胞への導入方法は、宿主細胞の種類に応じて適切な方法を用いることができる。該導入方法として、具体的には、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染等を例示することができる。
【００３０】
本発明のタンパク質（及び融合タンパク質）は少なくとも一種の細胞に対して高いアポトーシス誘導活性を有し得る。従って、本発明のタンパク質（及び融合タンパク質）を始めとして、これら本発明のタンパク質等をコードする本発明の遺伝子や、これら本発明のタンパク質等を発現し得る本発明の組換えベクターは、アポトーシス誘導剤の主成分として好適に用いることができる。よって、本発明のアポトーシス誘導剤は、本発明のタンパク質、本発明の融合タンパク質、本発明の遺伝子、及び本発明の組換えベクターからなる群から選ばれる１つ又は２つ以上を含有する。
【００３１】
本発明によって提供されるアポトーシス誘導剤は、生体内又は生体外において、標的細胞（例えばヒトその他の哺乳動物細胞）にアポトーシスを起こすために用いられ得る組成物（医薬）であり得る。本発明のアポトーシス誘導剤は、アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤として用いることができる。該疾患としては、がん、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器過形成、血管形成術後再狭窄及びがん切除術後の再発等を例示することができる。
【００３２】
本発明のタンパク質や融合タンパク質の他、アポトーシス誘導剤に含まれる担体すなわち副次的成分（典型的には用途に応じて薬学的に許容され得るもの）としては、アポトーシス誘導剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、水（例えば生理食塩水、種々の緩衝液であり得る。）、有機溶媒、種々の充填剤、増量剤、結合剤、滑剤、付湿剤、表面活性剤、賦形剤、着色剤、保存剤、緩衝剤、香料等が挙げられる。
【００３３】
アポトーシス誘導剤の形態に関しては特に限定はない。内用剤若しくは外用剤の典型的な形態として、軟膏、液剤（例えば点眼薬、注射液）、懸濁剤、乳剤、エアロゾル（スプレー剤）、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、ゲル、等が挙げられる。かかる誘導剤（組成物）の形態に応じて、主成分たる本発明のタンパク質と組み合わせるべき担体その他の副次的成分の内容（種類）は異なり得る。例えば、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液（注射液等）を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、本発明のアポトーシス誘導剤の有効成分（本発明のタンパク質、本発明の融合タンパク質、本発明の遺伝子又は本発明の組換えベクター）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。
【００３４】
本発明のアポトーシス誘導剤は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。例えば、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射或いは灌腸によって患者に投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。また、体外において使用する場合は、適量の本発明の有効成分（本発明のタンパク質、本発明の融合タンパク質、本発明の遺伝子又は本発明の組換えベクター）を含有する液剤を対象物（皮膚表面の患部等）の表面に直接スプレーするか、或いは、当該液剤で濡れた布や紙で対象物の表面を拭くとよい。これらは例示にすぎず、従来のアポトーシス誘導剤と同じ形態及び／又は使用方法を適用することができる。また、ＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）の適用により、標的とする患部（器官、組織、細胞等）に、本発明のアポトーシス誘導剤を局所的に高濃度に供給することが可能となる。また、アポトーシス誘導剤（医薬）の用量は、投与方法、投与の目的、疾患の種類、症状、患者の性別、体重、年齢等に応じて個々に設定されればよく、特に限定されない。
【００３５】
なお、本発明のアポトーシス誘導剤のうち、その有効成分が本発明の遺伝子や本発明の組換えベクターである場合、そのアポトーシス誘導剤は、いわゆる遺伝子治療に使用する素材として用い得る。例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子（典型的にはＤＮＡセグメント、或いはＲＮＡセグメント）を適当なベクターに組み込み、標的とする患部（器官、組織、細胞等）に導入することにより、生体（細胞）内で本発明のタンパク質や融合タンパク質を発現させることが可能となる。したがって、本発明のタンパク質や融合タンパク質を有効成分とするアポトーシス誘導剤と同様に、アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤として用い得る。
本発明の遺伝子や組換えベクターを有効成分とするアポトーシス誘導剤（医薬）は、標的とする患部の細胞に選択的に導入することにより、他の正常細胞を損傷させることなく、患部の細胞を選択的に死滅させることが可能となる点で、本発明のタンパク質や融合タンパク質を有効成分とするアポトーシス誘導剤に比べて好ましい。
【００３６】
本発明の方法は、本発明のタンパク質又は本発明の融合タンパク質を、対象とする細胞に発現させることにより、該細胞のアポトーシスを誘導する方法であれば特に制限されないが、本発明の遺伝子を、対象とする細胞に導入することにより本発明のタンパク質を発現させることにより、該細胞のアポトーシスを誘導する方法を好ましく例示することができる。本発明のタンパク質等を対象とする細胞に発現させる方法は特に制限されず、例えば本発明の組換えベクターを公知の方法で対象細胞に形質転換するなどの方法を用いることができる。
【００３７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
［各種ヒト臓器及び培養細胞におけるＣＬＰＡＢＰ遺伝子の発現］
ＣＬＰＡＢＰ遺伝子（配列番号１）の配列に基づいて、ＰＣＲ用のプライマーを設計した。フォワードプライマー（gtttggatcctctgtgcctgcctctgaccct：配列番号３）は、ＣＬＰＡＢＰの塩基配列（配列番号１）の塩基番号１５３６−１５５６に対応する配列を含んでおり、リバースプライマー（gaaagaattctctcagatccactgcacaagccc：配列番号４）はＣＬＰＡＢＰの塩基配列（配列番号１）の塩基番号１８５１−１８７１に対応する配列を含んでいる。市販のヒト由来の各種のｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社製のＭＴＣパネル）を鋳型とし、前述の両プライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応の条件は、９４℃で１分間保持した後、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間を１サイクルとしてこれを３０サイクル行い、次いで、７２℃で５分間保持するという条件であった。
【００３９】
得られたそれぞれのＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。前述の両プライマーにより特異的に増幅されたと考えられる転写産物（３５５ｂｐ）のバンドを図３に示す。図３に示されているように、ＣＬＰＡＢＰ遺伝子は各種のヒト臓器由来の細胞においてほぼ同程度に発現しており（図３左）、また、各種の培養細胞においても同様に発現している（図３右）ことが分かった。
【実施例２】
【００４０】
［内因性ＣＬＰＡＢＰ及び組換えＣＬＰＡＢＰの培養細胞における発現］
RZPD German Resource Center for Genome Researchより購入したＣＬＰＡＢＰ遺伝子を鋳型としたＰＣＲや、ＰＣＲ産物の制限酵素による切断によって、ＣＬＰＡＢＰ遺伝子断片を得た。該断片を、該遺伝子が発現し得るように、ｐｃＤＮＡ３ ｖｅｃｔｏｒ（Stratagene社製）やｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ６ａ（Sigma社製）（アミノ末端側にＦＬＡＧタグを付加しうるベクター）に組み込んだ。得られた両プラスミドを、それぞれｐｃＤＮＡ３−ＣＬＰＡＢＰ、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰと命名した。これらの両プラスミドを、エレクトロポーレーション法によりそれぞれＣＯＳ−７細胞へ導入し、ＣＯＳ−７／ｐｃＤＮＡ３−ＣＬＰＡＢＰ細胞と、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ細胞を得た。
【００４１】
次に、これら３種の細胞について、以下のようなウエスタンブロット解析を行った。ダルベッコ改変イーグル培地に１０％の牛胎児血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍｌアンピシリンを加えた培地に、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７／ｐｃＤＮＡ３−ＣＬＰＡＢＰ細胞、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ細胞をそれぞれ添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃にて培養した。これらの培養液を遠心分離して、各細胞の菌体をそれぞれ回収し、該菌体に抽出液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）； １ｍＭ ＥＤＴＡ； １０ｍＭ ＤＴＴ； １％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００； １５０ｍＭ ＮａＣｌ； １０ｍＭ ＮａＦ； １ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４； protease inhibitor cocktail（Roche社製））を添加して混合し、菌体を破砕して細胞抽出液をそれぞれ得た。得られた細胞抽出液にＳＤＳサンプル溶液を添加した後９５℃で３分間変性し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ＰＶＤＦ膜（Immobilon-P：ミリポア社製）に電気的に転写した。
【００４２】
ＣＬＰＡＢＰの発現を検出する際に用いる抗体は以下のような方法で作製した。ＣＬＰＡＢＰのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸番号５００−６１１のアミノ酸配列（以下、「５００−６１１タンパク質」という）に対応する塩基配列からなるＤＮＡ断片を、ＧＳＴ融合タンパク質発現用プラスミドベクターに組み込み、得られたプラスミドを大腸菌に導入した。該大腸菌を培養し、得られた菌体からＧＳＴ融合５００−６１１タンパク質を精製した。得られたＧＳＴ融合５００−６１１タンパク質を抗原としてウサギに免疫し、このウサギから抗血清を採取した。採取した抗血清について、ＧＳＴ融合５００−６１１タンパク質抗原を用いたアフィニティー精製を行い、精製抗体（抗ＣＬＰＡＢＰ一次抗体）を得た。
【００４３】
得られたこの抗ＣＬＰＡＢＰ一次抗体を前述のＰＤＶＦ膜と反応させ、該ＰＤＶＦ膜を洗浄した後、ＨＲＰ（HorseRadish Peroxydase）標識二次抗体（アマシャムバイオサイエンス社製）を反応させ、該標識二次抗体に対するＥＣＬ反応により検出した。検出機器としては、イメージアナライザー「ＬＡＳ３０００」（富士フィルム社製）を用いた。その結果を図４に示す。図４から分かるように、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７／ｐｃＤＮＡ３−ＣＬＰＡＢＰ細胞、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ細胞いずれの細胞でもＣＬＰＡＢＰが発現しており、また、ＣＯＳ−７／ｐｃＤＮＡ３−ＣＬＰＡＢＰ細胞やＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ細胞では、ＣＬＰＡＢＰが実際に過剰発現していることが示された。
【実施例３】
【００４４】
［内在性ＣＬＰＡＢＰの培養細胞内における局在］
ＨＥＫ２９３細胞内のＣＬＰＡＢＰの局在を調べるために、前述の抗ＣＬＰＡＢＰ一次抗体やCMX-Rosamine（「Mito-Tracker Red」（登録商標））を用いて、ＨＥＫ細胞について蛍光染色を行った。
具体的には、ＣＬＰＡＢＰの局在については、ＨＥＫ２９３細胞を、５％ホルムアルデヒド存在下で１０分間固定し、次いで、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳにて洗浄ならびに膜透過処理を行い、前述の抗ＣＬＰＡＢＰ一次抗体を加え１時間静置した。その後洗浄し、２次抗体を加え４５分間静置した。２次抗体はMolecular Probes社のAlexaシリーズを用いた。次いで、洗浄処理を行い、その後の該ＨＥＫ２９３細胞を、ＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss社製）にて観察した。また、ミトコンドリアの局在については、ＨＥＫ２９３細胞を、５％ホルムアルデヒド存在下で１０分間固定し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳにて洗浄ならびに膜透過処理を行い、次いで、CMX-Rosamine（「Mito-Tracker Red」（登録商標））で処理した後、前述の顕微鏡で観察した。
前述の精製抗体（抗ＣＬＰＡＢＰ抗体）を用いた結果を図５の左（ａ及びｄ）に、CMX-Rosamineを用いた結果を図５の中央（ｂ及びｅ）に示した。また、図５のａとｂを重ね合わせたものをｃに、ｄとｅを重ね合わせたものをｆに示した。図５から分かるように、ＣＬＰＡＢＰはミトコンドリアの周囲に主に観察された。
【実施例４】
【００４５】
［ＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰの細胞内局在］
上記実施例２におけるＣＬＰＡＢＰ遺伝子断片を、該遺伝子が発現し得るように、ｐＥＧＦＰ−Ｃ３（アミノ末端側にＧＦＰを付加しうるベクター；Clontech社製)に組み込んだ。得られたプラスミド（ｐＧＦＰ−ＣＬＰＡＢＰ）を、エレクトロポーレーション法によりそれぞれＣＯＳ−７細胞へ導入し、ＣＯＳ−７／ｐＧＦＰ−ＣＬＰＡＢＰ細胞を得た。該細胞を、５％ホルムアルデヒド存在下で１０分間固定し、次いで、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳにて洗浄ならびに膜透過処理を行い、CMX-Rosamine（「Mito-Tracker Red」（登録商標））で処理した後、前述のＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss社製）で観察した。ＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰの細胞内の局在を観察した結果を図６のａ及びｄに示す。また、CMX-Rosamineで染色により、ミトコンドリアの局在を観察した結果を図６のｂ及びｅに示す。さらに、図６のａとｂを重ね合わせたものをｃに、ｄとｅを重ね合わせたものをｆに示した。図６の結果から、ＣＬＰＡＢＰはミトコンドリア上に存在することが示唆された。また、ＣＬＰＡＢＰは、小胞構造を形成し、それらは図６のｄ−ｆに示されているように、自己集合することにより、ミトコンドリアネットワークに貫入するように存在した。
【実施例５】
【００４６】
［ＣＬＰＡＢＰのミトコンドリアネットワーク形成における影響］
ミトコンドリアは一般的に融合と分裂を繰り返し、そのネットワーク構造を形成することが知られる。前記図５及び図６の結果から、ＣＬＰＡＢＰはチューブ状のミトコンドリア近傍に存在し、そのネットワーク形成においてＣＬＰＡＢＰが何らかの位置情報を提示していることが予想された。そこで、ＣＬＰＡＢＰとミトコンドリアの局在を経時的に観察し、その関係について解析した。
ミトコンドリア局在配列を融合したＤｓＲｅｄタンパク質を発現し得るｐＤｓＲｅｄ２−Ｍｉｔｏ（Clontech社製）プラスミドと、前述のｐＧＦＰ−ＣＬＰＡＢＰとを、エレクトロポーレーション法によりＣＯＳ−７細胞へ同時導入し、ＣＯＳ−７／ｐＧＦＰ−ＣＬＰＡＢＰ：ｐＤｓＲｅｄ２−Ｍｉｔｏ細胞を得た。該細胞を５％ホルムアルデヒド存在下で１０分間固定し、該固定細胞中に発現しているＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰの蛍光、及び、ミトコンドリア局在配列を融合したＤｓＲｅｄタンパク質の蛍光を、Ｂｉｏｚｅｒｏ蛍光顕微鏡システム（Keyence社製）で３０秒ごとに１５０秒間観察した。その結果を図７に示す。図７において、線状（赤色）のものがミトコンドリアを表し、ドット状（緑色）のものがＣＬＰＡＢＰを表す。小さな矢印で示された部分は、ＣＬＰＡＢＰの小胞に向かって、チューブ状のミトコンドリアが新たに伸長した部分である。また、「０」と「１５０ｓ」の上方の四角で囲まれた部分は、撮影開始時（「０」）にはミトコンドリアが分断されていたが、１５０秒後には、伸長してチューブ状ミトコンドリアとして融合したことを示している。
【００４７】
また、図７で観察したのと同じ細胞の別の部位を観察した結果を図８に示す。図８の矢印で示された部分は、ＣＬＰＡＢＰの小胞をかいくぐるように細胞内を移動するミトコンドリアである。また、四角で囲まれた部分は、撮影開始時（「０」）には３つの独立したＣＬＰＡＢＰ小胞であったが、１２０秒後には、互いがまとまりアッセンブルしたことを示している。
【００４８】
図７及び図８の結果から、ＣＬＰＡＢＰ小胞は、ミトコンドリアがネットワークを形成時に融合や移動する際に、細胞内において道標のような機能を果たしていることが示唆された。
【実施例６】
【００４９】
［ＲＮＡｉによるＣＬＰＡＢＰのノックダウン実験］
図５〜図８の結果から、ＣＬＰＡＢＰは、ミトコンドリアネットワーク形成に関与していることが示唆された。このことを裏付けるために、ＲＮＡｉによるＣＬＰＡＢＰのノックダウンを試みた。
まず、ＣＬＰＡＢＰに対するＲＮＡｉ（ＣＬＰＡＢＰ−ｓｉＲＮＡ）として、二本鎖ＲＮＡ（センス配列：aaggagaagcagauccgcuccuu：配列番号５）を作製した。この配列は、ＣＬＰＡＢＰの塩基配列（配列番号１）の塩基番号８６７−８８９に対応している。また、コントロール用のＲＮＡｉとして、ＧＦＰに対するＲＮＡｉ（Cat#S5C-0201； B-Bridge International, Inc. 製）を用意した。Invitrogen社のOligofectamineを用いて、ＣＬＰＡＢＰに対するＲＮＡｉを一過性にＨｅＬａ細胞に導入し、ＨｅＬａ／ＣＬＰＡＢＰ−ｓｉＲＮＡ細胞を得た。また、ＧＦＰに対するＲＮＡｉを同様に一過性にＨｅＬａ細胞に導入し、ＨｅＬａ／ｃｏｎｔｒｏｌ細胞を得た。
【００５０】
ＨｅＬａ／ＣＬＰＡＢＰ−ｓｉＲＮＡ細胞及びＨｅＬａ／ｃｏｎｔｒｏｌ細胞について以下のようなウエスタンブロット解析を行った。
ダルベッコ改変イーグル培地に１０％の牛胎児血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍｌアンピシリンを加えた培地に、ＨｅＬａ／ＣＬＰＡＢＰ−ｓｉＲＮＡ細胞、ＨｅＬａ／ｃｏｎｔｒｏｌ細胞をそれぞれ添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃にて培養した。これらの培養液を遠心分離して、各細胞の菌体をそれぞれ回収し、該菌体に抽出液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）； １ｍＭ ＥＤＴＡ； １０ｍＭ ＤＴＴ； １％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００； １５０ｍＭ ＮａＣｌ； １０ｍＭ ＮａＦ； １ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４； protease inhibitor cocktail（Roche社製））を添加して混合し、菌体を破砕して細胞抽出液をそれぞれ得た。得られた細胞抽出液にＳＤＳサンプル溶液を添加した後９５℃で３分間で変性し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ＰＶＤＦ膜（Immobilon-P：ミリポア社製）に電気的に転写した。
【００５１】
上記実施例２に記載したのと同様の抗ＣＬＰＡＢＰ一次抗体を前述のＰＤＶＦ膜と反応させ、該ＰＤＶＦ膜を洗浄した後、ＨＲＰ（HorseRadish Peroxydase）標識二次抗体（アマシャムバイオサイエンス社製）を反応させ、該標識二次抗体に対するＥＣＬ反応により検出した。検出機器としては、イメージアナライザー「ＬＡＳ３０００」（富士フィルム社製）を用いた。その結果を図９の左パネルに示す。図９の左パネルから分かるように、ＨｅＬａ／ＣＬＰＡＢＰ−ｓｉＲＮＡ細胞においては、ＨｅＬａ／ｃｏｎｔｒｏｌ細胞に比べて、ＣＬＰＡＢＰの発現量の減少していることが示された。
【００５２】
また、ＨｅＬａ／ＣＬＰＡＢＰ−ｓｉＲＮＡ細胞やＨｅＬａ／ｃｏｎｔｒｏｌ細胞における、ＣＬＰＡＢＰやミトコンドリアの局在を調べるために、前述の抗ＣＬＰＡＢＰ一次抗体やCMX-Rosamine（「Mito-Tracker Red」（登録商標））を用いて、実施例３と同様の方法で、両細胞について蛍光染色を行った。蛍光染色した両細胞の観察結果を図９の中央パネル及び右パネルに示す。図９のこれら２パネルから分かるように、ＣＬＰＡＢＰの発現が減少している（図９の中央パネル）ＨｅＬａ／ＣＬＰＡＢＰ−ｓｉＲＮＡ細胞（矢印で示された細胞）においては、周囲のＨｅＬａ／ｃｏｎｔｒｏｌ細胞とは異なり、ミトコンドリアの断片化が生じている（図９の右パネル）。
【実施例７】
【００５３】
［ＣＬＰＡＢＰ結合タンパク質の解析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）］
図５〜図８の結果から、ＣＬＰＡＢＰは細胞内において小胞構造を形成することが明らかとなった。その小胞構造の形成には、ＣＬＰＡＢＰのほかに、ＣＬＡＰＡＢＰに対する何らかの特異的結合タンパク質が関与していることが予想された。そこで、ＣＬＰＡＢＰに対する結合タンパク質の同定を試みた。
上記実施例２におけるＣＬＰＡＢＰ遺伝子断片を、該遺伝子が発現し得るように、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ（アミノ末端側にＦＬＡＧタグを付加しうるベクター）に組み込んだ。得られたプラスミド（ｐＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ）を、エレクトロポーレーション法によりそれぞれＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ導入し、ＨＥＫ２９３Ｔ／ｐＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ細胞を得た。該細胞は、ＦＬＡＧタグＣＬＰＡＢＰを一過性に発現する細胞である。このＨＥＫ２９３Ｔ／ｐＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ細胞を培養し、１×１０８個の該細胞の菌体を得た。その菌体に、実施例２記載の抽出液を添加して混合し、菌体を破砕して細胞抽出液を得た。該細胞抽出液中のＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ複合体を、Sigma社製の抗ＦＬＡＧアフィニティーゲルを用いて免疫沈降した。免疫沈降の際の遠心は、１４０００ｒｐｍで１０分間、低温で行った。免疫沈降して得られた沈殿を数回洗浄した後、０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３）緩衝液で前記複合体を溶出し、すぐにｐＨを中性に戻した。この溶液をタンパク質サンプル溶液として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った後、該ＳＤＳ−ＰＡＧＥをＣＢＢ染色した。検出した主なバンド部分のゲルを切り出し、脱色後、還元アルキル化反応を行った。次いで、トリプシンを用いてゲル内消化を行い、溶出されたペプチドについて質量分析を行った。質量分析装置としては、Q-Tof-type hybrid mass spectrometer（Micromass社製）を用い、サンプルアプライの前にWaters-Micromass modular CapLC HPLCシステム（Micromass社製）によりペプチドの分離を行った。得られた測定データをMatrix science（Matrix science社製）にて解析し、解析の結果算出された分子量から、バンド部分に含まれるタンパク質を同定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動結果と、質量分析によるタンパク質の同定結果を図１０に示す。図１０の結果から、ＣＬＰＡＢＰには、一般的に発現量の多いタンパク質（Ｈｓｐ７０、１４−３−３ε、ａｃｔｉｎ、及びｔｕｂｕｌｉｎ）と共に、ミトコンドリアマトリックスタンパク質ｐ３２（ｐ３２Ｍｐ）が結合することが示唆された。
【実施例８】
【００５４】
［ＣＬＰＡＢＰにおけるｐ３２Ｍｐ結合部位の同定］
図１０の結果から、ＣＬＰＡＢＰには、一般的に発現量の多いタンパク質と共に、ミトコンドリアマトリックスタンパク質ｐ３２（ｐ３２Ｍｐ）が結合することが示唆された。そこで、ＣＬＰＡＢＰのどの部分にｐ３２Ｍｐが結合するかについて以下のような解析を行った。
【００５５】
RZPD German Resource Center for Genome Researchより購入したＣＬＰＡＢＰ遺伝子を鋳型としたＰＣＲや、ＰＣＲ産物の制限酵素による切断によって、ＣＬＰＡＢＰの全長のアミノ酸配列又はそのアミノ末端欠失変異体をコードするＤＮＡ断片を得た。
具体的には、ＣＬＰＡＢＰのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸番号１−６１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片、前記アミノ酸番号６１−６１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片、前記アミノ酸番号１０１−６１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片、前記アミノ酸番号１８１−６１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を作製した。これらの４種類のＤＮＡ断片を、該遺伝子が発現し得るように、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ６ａ（Sigma社製）（アミノ末端側にＦＬＡＧタグを付加しうるベクター）にそれぞれ組み込んだ。得られた４種類のプラスミドを、それぞれｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １−６１１、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ ６１−６１１、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １０１−６１１、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １８１−６１１と命名した。これらの４種類のプラスミドを、エレクトロポーレーション法によりそれぞれＣＯＳ−７細胞へ導入し、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １−６１１細胞（「１−６１１」）、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ ６１−６１１細胞（「６１−６１１」）、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １０１−６１１細胞（「１０１−６１１」）、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １８１−６１１（「１８１−６１１」）細胞を得た。また、ネガティブコントロールとして、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ６ａ（Sigma社製）そのものをＣＯＳ−７細胞に導入した、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ６ａ（「ｖｅｃｔｏｒ」）を作製した。
【００５６】
上記の計５種類の細胞について、以下のようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った。
上記の計５種類の細胞を培養し、それぞれ１×１０８個の該細胞の菌体を得た。それぞれの菌体に、実施例２記載の抽出液を添加して混合し、菌体を破砕して細胞抽出液を得た。該細胞抽出液中のＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ（又はＣＬＰＡＢＰアミノ末端変異体）複合体を、抗ＦＬＡＧ抗体ビーズ（Sigma社製）を用いて免疫沈降した。免疫沈降の際の遠心は、１４０００ｒｐｍで１０分間、低温で行った。免疫沈降して得られた該ビーズを洗浄した後、これを緩衝液に懸濁し、タンパク質サンプル溶液を得た。該タンパク質サンプル溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した後、該ＳＤＳ−ＰＡＧＥをＣＢＢ染色した。その結果を図１１の上のパネルに示す。
【００５７】
また、前記の計５種類の細胞について、実施例２と同様の方法で、抗ｐ３２Ｍｐ抗体（SC-23885：Santa-Cruz社製）を用いたウエスタンブロット解析を行った。その結果を図１１の下のパネルに示す。この結果から、ＣＬＰＡＢＰにおけるｐ３２Ｍｐ結合部位は、ＣＬＰＡＢＰのアミノ酸番号６１から１００の間にあることが示唆された。
【実施例９】
【００５８】
［ＣＬＰＡＢＰの細胞内局在に対する、ＣＬＰＡＢＰのドメインの影響］
ＣＬＰＡＢＰとｐ３２Ｍｐの結合と、ＣＬＰＡＢＰの細胞内局在との関係を調べるため、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １−６１１、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ ６１−６１１、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １０１−６１１の３種類の細胞について、上記実施例３と同様の方法で、抗ＦＬＡＧ抗体や抗ミトコンドリア抗体（抗cytochrome c抗体：SC-7159：Santa-Cruz社製）を用いた蛍光染色を行った。
【００５９】
抗ＦＬＡＧ抗体を用いた蛍光染色の結果を図１２の左の３つのパネルに示し、抗ミトコンドリア抗体を用いた蛍光染色の結果を図１２の中央の３つのパネルに示す。また、図１２の左のパネルの図と中央のパネルの図を重ね合わせたものをそれぞれ右のパネル示す。なお、図１２の上段の３つのパネルは、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １−６１１（ＣＬＰＡＢＰ ｆｕｌｌ １−６１１）の結果を示し、中段の３つのパネルは、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ ６１−６１１（６１−６１１））の結果を示し、下段の３つのパネルは、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １０１−６１１（１０１−６１１）の結果を示す。
図１２から分かるように、ｐ３２Ｍｐ結合部位を持つＣＬＰＡＢＰやＣＬＰＡＢＰアミノ末端欠失変異体（ＣＬＰＡＢＰ ｆｕｌｌ １−６１１及び６１−６１１）は、ミトコンドリア近傍に小胞構造形成能を有するが、ｐ３２Ｍｐ結合部位を欠くＣＬＰＡＢＰアミノ末端欠失変異体（１０１−６１１）はわずかに小胞形成が認められるものの、細胞内全体に拡散する傾向が見られ、全長ＣＬＰＡＢＰとは極めて異なる局在を示した。このことから、ＣＬＰＡＢＰの特徴的な細胞内局在様式には、ｐ３２Ｍｐとの結合が必要であることが示唆された。
【実施例１０】
【００６０】
［ＣＬＰＡＢＰのＰＨ領域に結合する脂質の同定］
図２に示したように、ＣＬＰＡＢＰは分子内に２箇所ＰＨ領域を持つ。一般的にＰＨ領域は脂質結合能を有し、細胞膜や小胞体などのオルガネラへのタンパク質移行に寄与することが知られている。しかし、本願実施例における、ＣＬＰＡＢＰの細胞内の局在実験の結果から、ＣＬＰＡＢＰのＰＨ領域はこれまで知られたものとは異なる性質を示すことが考えられた。そこで、ＣＬＰＡＢＰのＰＨ領域に結合する脂質の同定を以下のように行った。
【００６１】
実施例２で用いたのと同様のＣＬＰＡＢＰ遺伝子を鋳型としたＰＣＲにより、ＣＬＰＡＢＰのＰＨ１領域のタンパク質（配列番号２のアミノ酸番号８５−１９２のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡ断片、及び、ＰＨ２領域のタンパク質（配列番号２のアミノ酸番号２１１−３２０のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。上記ＰＨ１領域のタンパク質をコードするＤＮＡ断片に増幅には、フォワードプライマー（gtttggatcccggcggagggtgcctgtgagg：配列番号６）とリバースプライマー（gaaagaattcgagggccgtctgcttctccag：配列番号７）を用い、上記ＰＨ２領域のタンパク質をコードするＤＮＡ断片に増幅には、フォワードプライマー（gtttggatcccggacggcgtcagggcacgaa：配列番号８）とリバースプライマー（gaaagaattcctacccctccctgtgggtgacagc：配列番号９）を用いた。
増幅したこれらのＤＮＡ断片をそれぞれｐＧＥＸ４Ｔベクター（Amersham Bioscience社製）（ＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクター）に挿入し、得られた両組換えベクターをそれぞれ大腸菌に導入した。これらの大腸菌を培養し、得られた菌体からGlutathion-Sepharoseビーズを用いて、ＧＳＴ融合ＰＨ１領域タンパク質やＧＳＴ融合ＰＨ２領域タンパク質を精製した。図１３の上段のパネルは、精製したＧＳＴ融合ＰＨ１領域タンパク質やＧＳＴ融合ＰＨ２領域タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ＣＢＢ染色した結果を示す。
【００６２】
また、生体内に存在する１５種類の脂質が一定量スポットされたメンブレン（図１３の下段左）として、Membrane lipid strips（Echelon社製）を用意した。このメンブレンを脂肪酸無含有の３％ＢＳＡでブロッキングした後、ＴＢＳ−Ｔ（ｐＨ ８．０の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ； １５０ ｍＭ ＮａＣｌ； ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）中にて、０．５ｍｇ／ｍｌのＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ融合ＰＨ１領域タンパク質又はＧＳＴ融合ＰＨ２領域タンパク質）と３時間インキュベートした。次いでこのメンブレンを洗浄した後、抗ＧＳＴ抗体（ＭＢＬ社製）と２時間インキュベートした。このメンブレンを洗浄した後、ＨＲＰ標識２次抗体をさらに加えてインキュベートし、ＥＣＬ反応によって脂質とＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ融合ＰＨ１領域タンパク質又はＧＳＴ融合ＰＨ２領域タンパク質）の結合を検出した。その結果、図１３の下段右に示されているように、ＰＨ１領域タンパク質には、cardiolipinとphosphatidic acidが、ＰＨ２領域タンパク質にはそれらに加えてさらに、phosphatidylserineとphosphatidylinositol-4 phsphateが結合することが判明した。
【実施例１１】
【００６３】
［ＣＬＰＡＢＰとcardiolipinの細胞内における共局在］
ＣＬＰＡＢＰとcardiolipinの細胞内における共局在を調べるために、抗cardiolipin抗体（MBL社製）を用いて、上記実施例３記載の方法と同様の方法で、上記実施例４記載のＣＯＳ−７／ｐＧＦＰ−ＣＬＰＡＢＰ細胞について蛍光染色を行った。
ＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰの観察結果を図１４の左パネルに示し、抗cardiolipin抗体による蛍光染色の結果を図１４の中央パネルに示し、図１４の左パネルと中央パネルを重ね合わせたものを右パネルに示す。図１４の結果から、cardiolipinは、ＣＬＰＡＢＰが形成する小胞に共局在することが示された。
【実施例１２】
【００６４】
［ＣＬＰＡＢＰの細胞内局在におけるＰＨ領域の影響］
図１２の結果から、ＣＬＰＡＢＰの細胞内局在、すなわちミトコンドリア近傍に小胞を形成するユニークな局在には、ｐ３２Ｍｐ結合部位が重要であることが示されたが、さらに、ＣＬＰＡＢＰの別の特定の領域（ＰＨ１領域やＰＨ２領域）が、ＣＬＰＡＢＰの細胞内局在にどのような影響を与えるかを調べるために、以下のようなアッセイを行った。
【００６５】
実施例２で用いたのと同様のＣＬＰＡＢＰ遺伝子を鋳型としたＰＣＲにより、ＣＬＰＡＢＰのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸番号１−４５０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片と、該アミノ酸番号２５１−６１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を増幅した。配列番号２のアミノ酸番号１−４５０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片に増幅には、フォワードプライマー（gtttaagcttatggggaacagccactgtgtc：配列番号１０）とリバースプライマー（gaaagaattcctatgtttccgaagtgtggtc：配列番号１１）を用い、配列番号２のアミノ酸番号２５１−６１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片に増幅には、フォワードプライマー（gtttaagcttgccattttctccgaggag：配列番号１２）とリバースプライマー（gaaagaattctcagatccactgcacaagccc：配列番号１３）を用いた。
増幅したこれらの２種類のＤＮＡ断片を、該遺伝子が発現し得るように、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ６ａ（Sigma社製）（アミノ末端側にＦＬＡＧタグを付加しうるベクター）にそれぞれ組み込んだ。得られた２種類のプラスミドを、それぞれｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １−４５０、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ ２５１−６１１と命名した。これらの２種類のプラスミドを、エレクトロポーレーション法によりそれぞれＣＯＳ−７細胞へ導入し、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １−４５０細胞（「１−４５０」）、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ ２５１−６１１細胞（「２５１−６１１」）を得た。
【００６６】
これら２種類の細胞について、上記実施例３と同様の方法で、抗ＦＬＡＧ抗体や抗ミトコンドリア抗体（抗cytochrome c抗体：SC-7159：Santa-Cruz社製）を用いた蛍光染色を行った。
抗ＦＬＡＧ抗体を用いた蛍光染色の結果を図１５の左の２つのパネルに示し、抗ミトコンドリア抗体を用いた蛍光染色の結果を図１５の中央の２つのパネルに示す。また、図１５の左のパネルの図と中央のパネルの図を重ね合わせたものをそれぞれ右のパネル示す。なお、図１５の上段の３つのパネルは、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ ２５１−６１１（２５−６１１）の結果を示し、下段の３つのパネルは、ＣＯＳ−７／ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＣＬＰＡＢＰ １−４５０（１−４５０））の結果を示す。
【００６７】
図１５から分かるように、ＰＨ２領域のアミノ末端側まで欠失したＣＬＰＡＢＰ変異体（２５１−６１１）では、小胞形成能及びミトコンドリア近傍への局在能を完全に消失していた（図１５の上段パネル）。一方、ＣＬＰＡＢＰのＣ末端を約１６０アミノ酸欠失しているものの、ｐ３２Ｍｐ結合領域や２つのＰＨ領域を有する変異体（１−４５０）は、依然として小胞形成能を有していた（図１５の下段パネル）。
【実施例１３】
【００６８】
［ＣＬＰＡＢＰの過剰発現による、アポトーシスへの影響］
図６〜８の結果から、ＣＬＰＡＢＰはミトコンドリアネットワークの形成に際して重要な役割を果たすことが示唆された。ＣＬＰＡＢＰの過剰発現によって、アポトーシスへどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。
実施例４で用いたＣＯＳ−７／ｐＧＦＰ−ＣＬＰＡＢＰ細胞内において、ＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰを一過性に発現させ、約６０時間培養した後、該細胞をトリプシン処理にて回収し、Annexin V-Alexa594（Molecular Probes社製）を加えアポトーシス細胞を染色した。染色した細胞をガラスプレパラートにマウントし、前述のＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss社製）で、ＧＦＰの緑色の蛍光とAlexa594の青色の蛍光を観察した。ＧＦＰの観察結果を図１６の一番左のパネルに、Alexa594の観察結果を左から２番目のパネルに、一番左のパネルと左から２番目のパネルとを重ね合わせたものを左から３番目のパネルに示した。図１６の左から２番目のパネルから分かるように、ＣＬＰＡＢＰ発現細胞は、長時間の培養後にアポトーシスを引き起こした。
また、左の３つのパネルの観察結果を定量し、ＧＦＰとAlexa594の両方が観察された細胞の割合（％）を算出した結果を図１６の一番右のパネルに示す。なお、コントロールとして、ＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰではなく、ＧＦＰを一過性に発現するＣＯＳ−７細胞において、ＧＦＰとAlexa594の両方が観察された細胞の割合（％）を示す。図１６の一番右のパネルから分かるように、ＣＬＰＡＢＰの過剰発現により、アポトーシスが著しく誘導されることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ヒトＣＬＰＡＢＰの推定アミノ酸配列を示す図である。
【図２】ヒトＣＬＰＡＢＰの推定機能領域であるＰＨ領域の位置を示す図である。図中の数字はアミノ酸番号を表す。
【図３】各種ヒト臓器及び培養細胞におけるＣＬＰＡＢＰ遺伝子の発現を示す図（エチジウムブロマイド染色）である。
【図４】内在性及び組換え型ＣＬＰＡＢＰの培養細胞における発現を示す図（ウエスタンブロット解析）である。
【図５】内在性ＣＬＰＡＢＰ等の培養細胞内における局在を示す図（蛍光染色）である。
【図６】ＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰ等の細胞内における局在を示す図である。
【図７】ＣＬＰＡＢＰのミトコンドリアネットワーク形成における影響を示す図である。
【図８】ＣＬＰＡＢＰのミトコンドリアネットワーク形成における影響を示す図である。
【図９】左パネルは、ＲＮＡｉによるＣＬＰＡＢＰのノックダウン細胞におけるＣＬＰＡＢＰの発現を示す図（ウエスタンブロット解析）である。また、中央パネルや右パネルは、ＲＮＡｉによるＣＬＰＡＢＰのノックダウン細胞内におけるＣＬＰＡＢＰ等の局在を示す図である（蛍光染色）。
【図１０】ＣＬＰＡＢＰ及びその結合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。図の右に記載されたタンパク質名は、質量分析により同定された結果を示す。
【図１１】上パネルは、免疫沈降したＣＬＰＡＢＰ及びＣＬＰＡＢＰアミノ末端変異体の泳動結果を示す図である。下パネルは、抗ｐ３２Ｍｐ抗体によるウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図１２】ＣＬＰＡＢＰやＣＬＰＡＢＰアミノ末端変異体を発現する細胞内におけるＣＬＰＡＢＰ又はＣＬＰＡＢＰアミノ末端変異体等の局在を示す図である（蛍光染色）。
【図１３】上段のパネルは、精製したＧＳＴ融合ＰＨ１領域タンパク質やＧＳＴ融合ＰＨ２領域タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ＣＢＢ染色した結果を示す図である。下段左のパネルは、生体内に存在する１５種類の脂質が一定量スポットされたメンブレンを示す図である。また、下段右のパネルは、脂質とＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ融合ＰＨ１領域タンパク質又はＧＳＴ融合ＰＨ２領域タンパク質）との結合をＥＣＬ反応によって検出した結果を示す図である。
【図１４】ＣＬＰＡＢＰやcardiolipinの細胞内における局在を示す図である。
【図１５】ＣＬＰＡＢＰの変異体（ＰＨ領域を含む変異体及びＰＨ領域を含まない変異体）等の細胞内局在を示す図（蛍光染色）である。
【図１６】左から１〜３番目のパネルは、ＧＦＰ融合ＣＬＰＡＢＰの細胞内での局在や、アポトーシス細胞を蛍光染色した結果を示す図である。一番右のパネルは６０時間培養後におけるアポトーシス細胞の割合を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質
【請求項２】
配列番号１に示される塩基配列の塩基番号３６−１８６８の塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡからなる遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子を含み、かつアポトーシス誘導タンパク質を発現することができる組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターが導入され、かつアポトーシス誘導タンパク質を発現する形質転換体。
【請求項６】
形質転換体が動物であることを特徴とする請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を有し、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質。
【請求項９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号６１−３１８のアミノ酸配列又はアミノ酸番号８５−３１８のアミノ酸配列である請求項８又は１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれかに記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項７〜１１のいずれかに記載のタンパク質、又は請求項１２に記載の融合タンパク質に対する抗体。
【請求項１４】
請求項７〜１１のいずれかに記載のタンパク質、又は請求項１２に記載の融合タンパク質を含有するアポトーシス誘導剤。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子、又は請求項４に記載の組換えベクターを含有するアポトーシス誘導剤。
【請求項１６】
請求項７〜１１のいずれかに記載のタンパク質、又は請求項１２に記載の融合タンパク質を、対象とする細胞に発現させることにより、該細胞のアポトーシスを誘導する方法。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子を、対象とする細胞に導入することにより、請求項７〜１１のいずれかに記載のタンパク質、又は請求項１２に記載の融合タンパク質を発現させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項７〜１１のいずれかに記載のタンパク質、又は請求項１２に記載の融合タンパク質を有効成分とする医薬。
【請求項１９】
アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である請求項１８記載の医薬。
【請求項２０】
疾患が、がん、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器過形成、血管形成術後再狭窄及びがん切除術後の再発からなる群より選択される請求項１９記載の医薬。
【請求項１】
以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質
【請求項２】
配列番号１に示される塩基配列の塩基番号３６−１８６８の塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡからなる遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子を含み、かつアポトーシス誘導タンパク質を発現することができる組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターが導入され、かつアポトーシス誘導タンパク質を発現する形質転換体。
【請求項６】
形質転換体が動物であることを特徴とする請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を有し、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質。
【請求項９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号６１−３１８のアミノ酸配列又はアミノ酸番号８５−３１８のアミノ酸配列である請求項８又は１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれかに記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項７〜１１のいずれかに記載のタンパク質、又は請求項１２に記載の融合タンパク質に対する抗体。
【請求項１４】
請求項７〜１１のいずれかに記載のタンパク質、又は請求項１２に記載の融合タンパク質を含有するアポトーシス誘導剤。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子、又は請求項４に記載の組換えベクターを含有するアポトーシス誘導剤。
【請求項１６】
請求項７〜１１のいずれかに記載のタンパク質、又は請求項１２に記載の融合タンパク質を、対象とする細胞に発現させることにより、該細胞のアポトーシスを誘導する方法。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子を、対象とする細胞に導入することにより、請求項７〜１１のいずれかに記載のタンパク質、又は請求項１２に記載の融合タンパク質を発現させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項７〜１１のいずれかに記載のタンパク質、又は請求項１２に記載の融合タンパク質を有効成分とする医薬。
【請求項１９】
アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である請求項１８記載の医薬。
【請求項２０】
疾患が、がん、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器過形成、血管形成術後再狭窄及びがん切除術後の再発からなる群より選択される請求項１９記載の医薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２００８−２３７０３０（Ｐ２００８−２３７０３０Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−７７８９６（Ｐ２００７−７７８９６）
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【出願人】（３０４０２０２９２）国立大学法人徳島大学 (307)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【出願人】（３０４０２０２９２）国立大学法人徳島大学 (307)
【Ｆターム（参考）】
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