新規オリゴ糖、新規オリゴ糖を添加した食品、その製造方法、非う蝕性食品組成物、及びビフィズス菌増殖組成物
【課題】新規な構造を持つオリゴ糖を提供し、ピラノース型でフルクトース転移活性を有する酵素の反応を利用して新規オリゴ糖の製造方法を提供する。
【解決手段】本発明の新規オリゴ糖は、下記一般式(1)で表される化合物。
(式中、R1 は、水素原子、又は位置番号3で結合するグルコース、R2 は、水素原子、又は位置番号1で結合するグルコースを表し、R1 とR2 は同時にグルコースではない。)
【解決手段】本発明の新規オリゴ糖は、下記一般式(1)で表される化合物。
(式中、R1 は、水素原子、又は位置番号3で結合するグルコース、R2 は、水素原子、又は位置番号1で結合するグルコースを表し、R1 とR2 は同時にグルコースではない。)
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規オリゴ糖、新規オリゴ糖を添加した食品、新規オリゴ糖の製造方法及びその機能性に関し、詳しくはグルコースの6位にフルクトースがピラノース型でβ結合した新規オリゴ糖、新規オリゴ糖を添加してなる食品、グルコースとフルクトースあるいはラミナリビオースとフルクトースの高濃度液にβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることによって得られる新規オリゴ糖の製造方法、及び該オリゴ糖を含有する非う蝕性組成物、ビフィズス菌増殖組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
末端のフルクトース残基がピラノース構造のオリゴ糖はいくつか報告されているが、グルコースと結合したフルクトース残基がピラノース構造をとるものは少なく、ツラノース、ロイクロースが知られている程度である。又、末端のフルクトース残基がピラノース構造のオリゴ糖の機能性についての報告も知られていない。またβ−フルクトフラノシダーゼを、高糖濃度のグルコースとフルクトースの条件下で作用させると、グルコースの6位にピラノース型でフルクトースを結合させる反応は報告されていない。
【0003】
ところで、ネオケストースを部分加水分解することにより、グルコースとフルクトースが2−6結合したオリゴ糖として、β−D−フルクトフラノシル−(2→6)−α−D−グルコピラノースが得られることは非特許文献1により知られているが、該オリゴ糖はフルクトース部分がフラノース型となっており、ピラノース型ではない。
【0004】
ビフィズス菌の効用として、腸内腐敗菌による腐敗の抑制作用、発ガン抑制作用、毒性アミンの産生防止作用、病原菌による感染症に対する抑止作用等が広く知られている。腸内でビフィズス菌を増殖させるためには、摂取されてから途中で消化されずに回腸や大腸に到達すること、ビフィズス菌以外の菌に利用されないことおよびビフィズス菌が良く利用することの諸条件を満たすことが必要であることが知られている。
【0005】
近年、いわゆる虫歯と呼ばれるう蝕の原因が、口腔内でう蝕原因菌であるストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans, St. mutans)やストレプトコッカス・ソブリナス(St. sobrinus)によって産生されるグルコース転移酵素(glucosyltransferase, GTase)の作用によって、蔗糖から不溶性でかつ付着性のあるグルカンが生成され、この不溶性付着性グルカンが歯牙に結合した後、さらにミュータンス菌などの細菌をグルカンの中に引き込んで歯垢を形成し、この歯垢内の細菌が酸を生成することにあることが明らかにされている。甘味、物理的性状の点で優れており、甘味料として広く飲食物に使用されている蔗糖は、歯質を脱灰する酸の基質となるだけでなく、歯垢中に酸を停滞させ、脱灰を持続させる働きを有する不溶性付着性グルカンの基質ともなるものであり、ミュータンス菌のう蝕原因性因子の多くが、蔗糖の存在によって発現されることが証明されている。
【非特許文献1】Journal of Chromatography A, 920(2001)299-308
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、新規な構造を持つオリゴ糖を提供することを課題とする。また本発明は、ピラノース型でフルクトース転移活性を有する酵素の反応を利用して新規オリゴ糖の製造方法を確立することを目的とする。
【0007】
さらに本発明は、人体に難消化性で、ビフィズス菌にのみ特異的に消化されるビフィズス菌増殖用組成物を提供することを目的とする。さら本発明は、虫歯形成の予防に有用な非う蝕性組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、植物エキス発酵液中の新規オリゴ糖について検索し、分離し、TOF−MS分析、メチル化糖のGC−MS分析およびNMR分析した結果、いかなる標品とも一致しない未知のオリゴ糖を検出した。このオリゴ糖は植物エキス発酵液の発酵前ではほとんど見られず、発酵熟成後に検出される。
【0009】
このオリゴ糖はピラノース型フルクトースがグルコースに2−6結合したオリゴ糖を基本骨格とする。
【0010】
ところで、前記背景技術で示したように、ネオケストースを部分加水分解することにより得られるオリゴ糖は、β−D−フルクトフラノシル−(2→6)−α−D−グルコピラノースである(非特許文献1)が、該オリゴ糖はフルクトース部分がフラノース型となっており、本発明のオリゴ糖の基本骨格におけるフルクトース部分がピラノース型であるものとは、異なる。
【0011】
即ち、本発明の新規オリゴ糖は、下記一般式(1)で表される化合物である。
【0012】
【化1】
(式中、R1 は、水素原子、又は位置番号3で結合するグルコース、R2 は、水素原子、又は位置番号1で結合するグルコースを表す。)
【0013】
前記一般式(1)に属する具体的な本発明のオリゴ糖は、下記式(2)で表されるβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−D−グルコピラノースである。
【0014】
【化2】
【0015】
前記一般式(1)に属する本発明の別の具体的なオリゴ糖は、下記式(3)で表されるβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−Ο−β−D−グルコピラノシル(1→3)−D−グルコピラノースである。下記式(3)のオリゴ糖は、ラミナリビオースの非還元末端のグルコース残基の6位にフルクトースがピラノース型で結合した化合物に相当する。
【0016】
【化3】
【0017】
前記一般式(1)に属する本発明のさらに別の具体的なオリゴ糖は、下記式(4)で表されるβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−Ο−[β−D−グルコピラノシル(1→3)]−D−グルコピラノースである。下記式(4)の化合物は、ラミナリビオースの還元末端のグルコース残基の6位にフルクトースがピラノース型で結合した化合物に相当する。
【0018】
【化4】
【0019】
本発明のオリゴ糖の製造方法は、植物を切断したものに原料重量の1/10量以上2倍量以下、好ましくは、1/5量以上2倍量以下、最も好ましくは、1/4量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスを自然発酵させることにより、該抽出エキス中に前記式(1)〜式(4)で表される本発明の何れかのオリゴ糖を生成させ、得られた植物発酵エキス中からオリゴ糖を採取することを特徴とする。
【0020】
植物発酵エキスは、以下の様に製造される。植物原料としては、リンゴ、ニンジン、大根、キャベツ、セロリ、キュウリ、バナナ、タマネギ、ゴボウ、ホウレン草、ナシ、ミカンの皮、トマト、ピーマン、ブラックマッペモヤシ、ナス、レンコン、カボチャ、シイタケ、ショウガ、レタス、ニンニク、三つ葉、ウド、アスパラガス、熊笹、クローバー、昆布、フキノトウ、タンポポ、オオバコ、エンドウモヤシ、スギ葉、パセリ、カブ、パイナップル、ブドウ、イチゴ、イタドリの若芽、アサツキ、白菜、エノキタケ、サラダ菜、シュンギク、ヨモギ、セリ、ニラ、トドマツ葉、青シソ、ワカメ等が挙げられ、これらの植物原料のうち2種以上、好ましくは、多種類が用いられる。
【0021】
上記植物原料の配合割合として、例えばリンゴでは植物原料総重量の0.1から50%、ニンジンでは0.1から50%、大根では0.05から40%、キャベツでは0.05から40%、セロリやキュウリでは0.01から30%、バナナ、タマネギ、ゴボウ、ホウレン草では0.01から30%とすることが望ましいが、特に制限されるものではない。
【0022】
これらの植物原料を1〜5cm幅、好ましくは1〜4cm幅、最も好ましくは2〜3cm幅に切断し、全ての原料を杉樽中に入れ、これに、ショ糖を混合し、圧搾せずに浸透圧を利用して、3日間から3週間抽出する。ショ糖の混合割合については、全体として1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにし、好ましくは、植物原料とほぼ等量のショ糖を添加して混合することが望ましい。同時に、数ppm程度の濃度となるように若干量の食塩を添加混合してもよい。
【0023】
圧搾せずに回収した抽出エキスを37℃で暗所で保存すると主として酵母(例えば、Saccharomyces 属に属する微生物)および乳酸球菌(例えば、Leuconostoc 属に属する微生物)により自然発酵する。発酵後、さらに37℃で約半年間以上熟成させると褐色、粘稠性液体の植物発酵エキスが得られる。得られた植物発酵エキスから以下のようにして、本発明のオリゴ糖を採取することができる。或いは、得られた植物発酵エキスを食品とすることができる。
【0024】
植物発酵エキスをカラムクロマトグラフィーに通し、溶出することにより本発明のオリゴ糖を採取することができる。得られたオリゴ糖をさらにHPLCにかけることにより分離、精製し、凍結乾燥することにより、精製された粉末状の本発明のオリゴ糖を得ることができる。
【0025】
植物発酵エキスを製造しない、効率的な本発明のオリゴ糖の製造方法は、10質量%以上80質量%以下、好ましくは、20質量%以上80質量%以下、最も好ましくは、25質量%以上80質量%以下の糖質を含む基質溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより前記式(1)〜式(4)で表される新規オリゴ糖を生成させ、該溶液中から該新規オリゴ糖を採取することを特徴とする。
【0026】
本発明のオリゴ糖の製造方法で使用するβ−フルクトフラノシダーゼについては、市販のβ−フルクトフラノシダーゼを使用することができ、或いは、β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する酵母、乳酸菌等から抽出し、精製した酵素が用いられる。市販のβ−フルクトフラノシダーゼには、例えば、β−フルクトフラノシダーゼ(シグマ社製、Invertase from Baker’s yeast Grade VII:商品名)を用いることができる。β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物については、酵母及び乳酸菌から選ばれた1種以上を用いることができる。
【0027】
本発明で使用することができる酵母としては、Saccharomyces 属に属する微生物、Pichia属に属する微生物、Candida 属に属する微生物、Hansenulau属に属する微生物が挙げられる。さらに具体的な酵母の種としては、Saccharomyces cerevisiae、Pichia anomalaが挙げられる。さらに具体的な酵母の菌株としては、Pichia anomala(Ferm AP−20504)、Pichia anomala JCM3585が挙げられる。
【0028】
本発明で使用することができる乳酸菌としては、Leuconostoc 属に属する微生物、Bifidobacterium 属に属する微生物、Lactobacillus 属に属する微生物、Streptococcus 属に属する微生物、Pediocuccus 属に属する微生物、Lactocossus 属に属する微生物が挙げられる。さらに具体的な乳酸菌の種としては、Leuconostoc mesenteroides が挙げられる。ができる。
【0029】
また、本発明のオリゴ糖の製造方法は、前記精製した酵素を用いたオリゴ糖の製造方法において、精製した酵素に代えて、前記β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物からβ−フルクトフラノシダーゼを抽出し、粗精製した酵素を用いて、同様にオリゴ糖を製造することができる。即ち、本発明のオリゴ糖の製造方法は、10質量%以上80質量%以下、好ましくは、20質量%以上80質量%以下、最も好ましくは、25質量%以上80質量%以下の糖質を含む基質溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られたβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有する粗精製酵素を作用させることにより前記式(1)〜式(4)で表される新規オリゴ糖を生成させ、該溶液中から該新規オリゴ糖を採取することを特徴とする。
【0030】
またさらに別の効率的な本発明のオリゴ糖の製造方法は、精製したβ−フルクトフラノシダーゼ或いは粗精製のβ−フルクトフラノシダーゼを用いずに、直接、β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物を用いる方法であり、即ち、10質量%以上80質量%以下、好ましくは、20質量%以上80質量%以下、最も好ましくは、25質量%以上80質量%以下の糖質を含む培地溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させて発酵させ、培地中に前記式(1)〜式(4)で表される新規オリゴ糖を生成させ、該培地中から該新規オリゴ糖を採取することを特徴とする。
【0031】
粗精製酵素を製造する方法には、例えば、培養液を遠心分離して菌体を集め超音波で破砕し、さらに遠心分離して上澄みを回収するか、或いは、培養液を遠心分離して菌体を集め乳鉢で破砕し、さらに遠心分離して上澄みを回収するか、或いは、培養液を遠心分離して菌体を集めてビーズビーダーで破砕し、さらに遠心分離して上澄みを回収するか、或いは、培養液を遠心分離して、その上澄みを透析した内液を回収する方法が挙げられる。
【0032】
精製した酵素を製造する方法には、粗精製酵素を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを1種類以上を組み合わせて精製する方法があげられる。
【0033】
該微生物を用いる方法において使用するβ−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物は、前記に列挙したβ−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物を用いることができる。
【0034】
前記培養による本発明のオリゴ糖の製造方法において用いる糖質としてはショ糖が好ましい。前記のオリゴ糖の製造方法において、微生物の培溶液、或いは酵素の基質溶液等の出発原料の糖濃度は、通常の発酵プロセスにおいて培養液中に含まれる糖濃度に比べて、本発明の場合は極めて高濃度であり、本発明において特有な範囲である。基質溶液或いは培養液の糖濃度が10質量%未満ではオリゴ糖の合成量が少なく効率的ではなく、70質量%を超えると酵母の増殖が困難となる。これは、高糖濃度による高浸透圧となるからと考えられる。
【0035】
図1は、糖質としてグルコースとフルクトースの質量比を1:1とし、種々の糖濃度の溶液を調製し、該溶液1mLに対してβ−フルクトフラノシダーゼ20ユニットを添加し、37℃で168時間反応させたときの各種糖濃度(横軸)に対するオリゴ糖の相対合成量(縦軸)を表すグラフである。図1における相対合成量については、糖濃度が80%のとき、オリゴ糖の合成量が最大となったので、これを相対合成量100%と定義した。
【0036】
図1のグラフによれば、糖濃度が低ければ、本発明のオリゴ糖の合成量は少ないが、糖濃度が高ければ、合成されるオリゴ糖も、糖濃度が80%迄は比例して多くなり、80%が最大の合成量となるが、90質量%となるとオリゴ糖の合成量が低下することがわかる。
【0037】
本発明の式(1)又は式(2)で表されるオリゴ糖は、ビフィズス菌増殖用組成物の有効成分、或いは非う蝕性組成物の有効成分である。
【0038】
本発明のオリゴ糖の製造方法で使用する糖質については、植物を切断したものを原料とする場合には、植物中に含まれる糖と、添加するショ糖が用いられる。また、基質溶液又は培地を原料とする場合には、これらに添加する糖には、グルコースとフルクトースの組み合わせ、或いはラミナリビオースとフルクトースの組み合わせが用いられる。
【0039】
本発明の培養によるオリゴ糖の製造方法で使用する、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物については、前記した微生物を用いることができる。
【0040】
本発明は前記新規なオリゴ糖を添加した食品又は飼料としても有用である。食品又は飼料に添加される本発明のオリゴ糖の添加量は、食品又は飼料に含まれる消化性糖の全質量の0.05以上30質量%以下となるように添加することが、食品又は飼料中に含まれる消化性糖の過剰摂取を防止する目的のために好ましい。
【0041】
本発明の食品の製造方法の別の方法は、植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスにβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより、前記オリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造する方法である。
【0042】
本発明の食品の製造方法のさらに別の方法は、植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して、抽出することにより抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られた粗精製酵素を作用させることにより、前記オリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造する方法である。
【0043】
本発明の食品の製造方法のさらに別の製造方法は、植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させ、抽出エキス中に前記オリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造する方法である。
【0044】
本発明のオリゴ糖は、酵素反応液又は培養液を濾過、精製して液状で使用することも、また、濃縮してシラップ状で利用することも、更に、乾燥し固体状で用いることもできる。さらに、精製工程を経て、夾雑糖類を除去して本発明のオリゴ糖の高含有画分を採取したもの、或いはさらに精製し、粉末化或いは結晶化したものを用いることができる。粉末状製品は、そのままで、又は必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成型して使用することもできる。
【0045】
式(1)で表されるオリゴ糖は、ショ糖の甘味度の約1/5程度であり、乳糖やβ−ガラクトースに近い甘味であり、概ねさっぱりとした甘味である。
【発明の効果】
【0046】
本発明のオリゴ糖は、新規化合物として有用である。本発明の式(1)、式(2)で表されるオリゴ糖は、難消化性であるので、高血糖症状及び高血糖に起因する肥満症や糖尿病など種々の疾患の改善に有用である。
【0047】
本発明の式(1)、式(2)で表されるオリゴ糖はビフィズス菌増殖作用を有するので、該オリゴ糖を添加した食品は、腸内腐敗菌による腐敗の抑制、発ガン抑制、毒性アミンの産生防止、病原菌による感染症に対する抑止等に用いることができる。
【0048】
本発明の式(1)、式(2)で表されるオリゴ糖はう蝕誘発菌などによって発酵されにくく、う蝕誘発菌による蔗糖からの不溶性グルカン合成を阻害するので、虫歯を起こしにくいオリゴ糖として、う蝕抑制剤(非抗蝕剤)などに有利に利用できる。
【0049】
また、本発明の式(1)、式(2)で表されるオリゴ糖は甘味料として利用可能である。
【0050】
さらに、本発明の式(1)、式(2)で表されるのオリゴ糖は、肥満症や糖尿病など種々の疾患の改善作用、ビフィズス菌増殖作用、非う蝕作用を付与する能性食品として食品素材、医薬品素材、口腔用組成物への利用が可能である。
【実施例1】
【0051】
植物発酵エキスの調製
植物抽出エキスの原料として以下の配合の材料を2〜3cm幅に切断したものを使用した。
【0052】
リンゴ 植物原料総重量の20%
ニンジン 同 16%
大根 同 12%
キャベツ 同 10%
セロリ 同 9%
キュウリ 同 9%
バナナ 同 6%
玉ねぎ 同 6%
ゴボウ 同 6%
ホウレン草 同 6%
【0053】
これらの植物原料全重量に対して、当量のショ糖を加えて一週間抽出し、抽出液を上記微生物により自然発酵させた後、37℃で約半年間熟成させることにより、褐色の粘稠性の液状の植物発酵エキスを得た。
【0054】
オリゴ糖の測定
植物エキス発酵液の発酵前及び発酵後の液10μLにABEE標識試薬(J−オイルミルズ社製)40μL加え、80℃1時間反応させた。200μL蒸留水及び200μLクロロホルムを加えよく撹拌した後、遠心分離しその上清を適当に希釈した。標識化された糖をHonenpak C18カラム(J−オイルミルズ)を用いたHPLC(カラムサイズ:4.6mm×7.5cm、溶出:0.1M酢酸アンモニウム緩衝液、カラム温度:室温、流速:0.5mL/min、検出:UV305nm)により分析した。その結果をHPLCのチャートとして図2に示す。図2によれば、発酵前と発酵後を比較すると、発酵後のチャートでは糖の溶出時間の経過において、フルクトースとグルコースの間にはどの標品とも一致しない、未知の糖が増加していることが確認できた。
【0055】
未知の糖成分の分画、精製
発酵後の植物エキス発酵液を活性炭セライトカラムクロマトグラフィー(4.5cm×35cm)に添加し、エタノールのステップワイズグラジエントで溶出した。未知の糖1は、5%エタノールで溶出され、未知の糖2及び未知の糖3は15%エタノールで順次溶出された。さらにAmide−80(東ソー:カラムサイズ:4.6mm×25cm、溶出:80%アセトニトリル、カラム温度:80℃、流速:1mL/min、検出:示差屈折計)およびODS−80Tsカラム(東ソー:カラムサイズ:4.6mm×25cm、溶出:蒸留水、カラム温度: 室温、流速:0.5mL/min、検出:示差屈折計)を用いたHPLCによりさらに、糖1、糖2、糖3を各々分離、精製し、各々の凍結乾燥粉末を得た。
【0056】
化学構造の決定
前記工程において分離、精製した糖1、糖2、糖3の各々について、機器分析を行い、その化学構造を以下のように決定した。これらの糖をPositiveイオンモードで質量分析(MALDI−TOF−MS)した結果、糖1は365の〔M+Na〕+ のイオンピークを与えた(図3)。糖2及び糖3は527の〔M+Na〕+ のイオンピークを与えた(図4)。糖1を酸加水分解後、HPAEC分析し、構成糖を調査したところ、グルコースとフルクトースのみから構成され、モル比は1:1であった。従って糖1はグルコース1分子とフルクトース1分子からなる2糖類であると決定した。糖2及び糖3を同様に調査した結果、グルコースとフルクトースのみから構成され、モル比は2:1であった。従って糖2及び糖3はグルコース2分子とフルクトース1分子からなる3糖類であると決定した。
【0057】
糖1はβ−フルクトフラノシダーゼ、α−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼいずれによっても分解されなかった。糖1をHakomoriの方法でメチル化しメタノール分解した試料をGC−MS分析した結果、methyl 2,3,4−tri−O−
methyl−D−glucoside、methyl 1,3,4,5−tetra−O−methyl−D−fructosideが検出され(図5)、MS/MS分析のフラグメントパターンは、いずれもピラノース型のシグナルと一致した。
【0058】
糖1のNMR解析は、COSY、HSQC、HSQC−TOCSY、HMBC、ct−HMBC、J−res HMBCの2次元NMRで行った(図6−図11)。糖2は、COSY、HSQC、HSQC−TOCSY、CH2 −HSQC−TOCSY、ct−HMBCの2次元NMRで行った(図12−図16)。糖3は、COSY、HSQC、HSQC−TOCSY、HMBC、ct−HMBCの2次元NMRで行った(図17−図21)。
【0059】
また糖1のケミカルシフトを表1に、糖2及び糖3のケミカルシフトを表2及び表3に示す。
【0060】
【表1】
【0061】
【表2】
【0062】
【表3】
【0063】
以上の結果から糖1は、前記式(2)に示すβ−D−フルクトピラノシル(2→6)D−グルコピラノース、糖2は、前記式(3)に示すβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−O−β−D−グルコピラノシル(1→3)D−グルコピラノース、糖3は、前記式(4)に示すβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−O−[β−D−グルコピラノシル(1→3)]D−グルコピラノースであると決定した。
【実施例2】
【0064】
製造方法1−1:市販酵素を用いた糖1の製造方法
20%グルコース(シグマ社製)及び20%フルクトース(シグマ社製)を含む水溶液100mLに、0.2M酢酸緩衝液(pH5.0、10mL)に溶解したβ−フルクトフラノシダーゼ(シグマ社製、Invertase from Baker’s
yeast Grade VII :商品名)2000ユニットを添加した。さらに少量のトルエンを防腐のため加えた。37℃で24時間以上加温し反応生成物を得た。反応生成物を前記実施例1と同様にして精製して凍結乾燥粉末を得た。得られた凍結乾燥品を前記実施例1と同様にしてTOF−MSおよびNMR解析により反応生成物の構造を確認したところ、前記式(2)で表される糖1のβ−D−フルクトピラノシル(2→6)D−グルコピラノースであった。
【実施例3】
【0065】
製造方法1−2:市販酵素を用いた糖2及び糖3の製造方法
20%ラミナリビオース(シグマ社製)及び20%フルクトース(シグマ社製)を含む水溶液100mLに0.2M酢酸緩衝液(pH5.0、10mL)に溶解したβ−フルクトフラノシダーゼ(シグマ社製、invertase from Baker’s yeast Grade VII:商品名)2000ユニットを添加した。さらに少量のトルエンを防腐のため加えた。37℃で24時間以上加温し反応生成物を得た。反応生成物を前記実施例1と同様にして精製して凍結乾燥粉末を得た。得られた凍結乾燥品を前記実施例1と同様にしてTOF−MSおよびNMR解析により反応生成物の構造を確認したところ、前記式(3)で表される糖2のβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−O−β−D−グルコピラノシル(1→3)D−グルコピラノース、及び前記式(4)で表される糖3のβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−O−[β−D−グルコピラノシル(1→3)]D−グルコピラノースであった。
【実施例4】
【0066】
製造方法2−1:市販菌を用いた発酵による製造方法
グルコース40g、ポリぺプトン(日本製薬製)4g、酵母エキス(オリエンタル酵母) 2gに蒸留水を加えて100mLとし、オートクレーブで滅菌後、除菌濾過した40%フルクトース溶液100mLと混合し培養液とした。これにSaccharomyces cerevisiae JCM 1499(独立行政法人 理化学研究所により頒布)を一白金耳添加して30℃で48時間以上培養し、培養液を得た。培養液を前記実施例1と同様に分離精製して反応生成物を得た。前実施例1と同様にしてTOF−MSおよびNMR解析により反応生成物の構造を確認したところ、前記式(2)で表される糖1のβ−D−フルクトピラノシル(2→6)D−グルコピラノース、前記式(3)で表される糖2のβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−O−β−D−グルコピラノシル(1→3)D−グルコピラノース、及び前記式(4)で表される糖3のβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−O−[β−D−グルコピラノシル(1→3)]D−グルコピラノースであった。
【実施例5】
【0067】
製造方法2−2:分離菌株を用いた発酵による製造方法
前記実施例4において、微生物として菌株Pichia anomala Ferm
P−20504(2005年4月13日に独立行政法人 産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託)を用いた以外は前記実施例4と同じようにして培養し、培養液から本発明の糖1、糖2、糖3を得た。該菌株は、伊達市北稀府町121番地の大高酵素株式会社 伊達工場内の発酵タンク内の発酵液から採取し、分離したものである。
【実施例6】
【0068】
製造方法3−1:粗精製酵素液を用いた製造方法
Saccharomyces cerevisiae JCM 1499をYPD培地(酵母エキス1%、ペプトン2%、グルコース2%)で72時間培養した液を9,000×gで遠心分離した。得られた沈殿に0.9%食塩水を加えて撹拌し遠心分離し、この操作を2回繰り返した。沈殿を10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁し超音波破砕した後、遠心分離し上清を10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に対し透析した。得られた液を粗精製酵素液とした。
【0069】
20%グルコース(シグマ社製)及び20%フルクトース(シグマ社製)を含む水溶液100mLに前記工程で得られた粗精製酵素液10mLと加え、37℃で24時間以上加温し反応生成物を得た。前記実施例1と同様にして得られた反応生成物を精製して本発明の糖1を得た。
【実施例7】
【0070】
本発明の糖1を添加したバターロールの製造例
以下の材料を用いて常法によりバターロールを製造した。
【0071】
強力粉 500g
食塩 5g
牛乳 150mL
卵黄 10g
前記式(2)で表されるオリゴ糖(糖1) 20g
生イースト 12.5g
【実施例8】
【0072】
本発明の糖1を添加したハードキャンディーの製造例
ショ糖110gに蒸留水43.5gを加え、30分間で177℃まで加熱した。その後100℃に保ち、前記式(2)で表されるオリゴ糖(糖1)の2.5gを3回に分け加え、よく撹拌した。その後あらかじめ用意した型に流し込み放冷することにより、ハードキャンディーを得た。
【実施例9】
【0073】
本発明の糖1を添加した産卵鶏用飼料の製造例
トウモロコシ100g、大麦120g、小麦100g、コウリャン110g、米糠110g、ふすま200g、大麦ふすま100g、大豆かす30g、魚粉70g、炭酸カルシウム54.5g、食塩5g、粉末肝油0.5gに前記式(2)で表されるオリゴ糖(糖1)を2%となるように添加し混合することにより産卵鶏用飼料を得た。
【実施例10】
【0074】
本発明の糖1の消化性
人工胃液、ラット小腸アセトン粉末、酵母由来α−グルコシダーゼによる本発明の糖1の分解性について下記のように試験した。
【0075】
人工胃液による分解性は、2%本発明の糖1の50μLと50mM HCl・KCl緩衝液(pH2.0)25μLを加えて、37℃で100分間反応後、10mM NaOHを30μL添加し中和した。混合後、直ちに中和したものを対照とした。この反応液をHPLC分析し、分解物を調べた。
【0076】
ラット小腸アセトン粉末の調製は、ラット小腸アセトン粉末(sigma社製)300mgに10mMリン酸緩衝液(pH7.0)2.7mLを加えてガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズし、10,000xg、15分間4℃で遠心分離し、得られた上澄みを酵素液とした。マルターゼ活性として1mLあたり4ユニットとなるように希釈した酵素液25μL、4%の本発明の糖1を25μL、水50μLを加えて、37℃10分間反応させ100℃で5分間加熱し、反応を停止した。
【0077】
酵母由来のα−グルコシダーゼも同様に、1mLあたり4ユニットとなるように調製したα―グルコシダーゼ25μL、水50μLを加えて、37℃10分間反応させ100℃で5分間加熱し、反応を停止した。
【0078】
これらの試験の結果、全ての反応において本発明の糖1は殆ど分解されなかった。したがって、本発明の糖1は、難消化性糖質であることがわかる。
【実施例11】
【0079】
本発明の糖1のう蝕性
宮村(歯学、60、717〜731、1973)の方法に準じ、水1mL、又は、各1.25%の本発明の糖1、グルコース又はパラチノース各1mLに、それぞれハートインフージョンブイヨン1mLと新鮮唾液3mLを添加してなる4種類の溶液について、37℃におけるpHの経時変化を調べた。また、該方法において、新鮮唾液の代わりに、
Streptococcus mutans JCM5705を接種したものについても同様にpHの経時変化を調べた。この結果を新鮮唾液に関しては図22、Streptococcusmutans JCM5705を接種したものについて図23に横軸に時間縦軸にpHをとったグラフにして示す。
【0080】
これらのグラフによれば、グルコースでは培養10時間前後から酸の産生によるpHの低下が認められたのに対して、本発明の糖1ではpHの低下が殆どなく、その低下は非う蝕性糖質であるパラチノースとほぼ同等であった。
【実施例12】
【0081】
本発明の糖1のヒト由由来腸内細菌の代表株による資化性
ヒト由来腸内細菌の代表株を用い、本発明の糖1の資化性について次のようにして試験を行った。なお、比較のため、グルコース、スクロース、ラクトース、メリビオース、パラチノース、ツラノース、ラフィノース、1−ケストースも同様に試験を行った。供試菌株は、Bifidobacterium 属に属する微生物5株(B.adolescentis、B.bifidum、B.breve、
B.infantis、B.longum)、Lactobacillus属に属する微生物3株(L.acidophilus、
L.casei、L.fermentum)、その他の微生物株4株(Enterobacter cloacae、Echerichia
coli、Enterococcus faecalis、Clostridium perfringens)を用いた。
【0082】
各菌株の前培養には、炭素源を0.5%グルコースとしたLB培地を用いた。次にLB培地を用いて資化性試験を行った(「腸内菌の世界」、光岡知足著、叢文社発行の方法に準じた。)
【0083】
LB培地の組成は、Proteose peptone No.3(10g)、Trypticase(5g)、Yeast extract(3g)、Tween 80(1g)、Solution B(5mL)、L-cysteine HCl・H2 O(0.2g)、寒天(1.5g)をBacto-Liver浸出液1Lに溶解し、pH7.2に調製後、滅菌処理した。
【0084】
前記Solution Bとは、4.0%MgSO4・7H2O、0.2%FeSO4・7H2O、0.2%NaCl、0.135%Mn SO4 となるように精製水に溶解したものである。
【0085】
前記Bacto-Liver浸出液とは、Bacto-Liver5.5gに1050mLの精製水を加え、50〜60℃の温浴中で時々撹拌しながら1時間浸出した後、濾紙でろ過したものである。
【0086】
本実施例で用いたLB培地は、滅菌処理後、最終濃度が0.5%になるように前記各糖を加えた。前記各糖は、メンブランフィルターでろ過して滅菌処理を行った。一方、前培養した各菌株は、遠心分離(3000rpm、15分)し、得られた沈殿に、0.8%生理食塩水を2mL加え、よく撹拌して洗菌し、同様の条件で遠心分離した。この作業を2度繰返し、最終段階で、各菌株濃度が同じになるように生理食塩水を加え、LB培地に接種した。接種したLB培地は、嫌気ジャーを用い、窒素ガス下で嫌気的に37℃で、72時間培養した。
【0087】
発酵試験培地に前記各種菌株を接種し、72時間の培養後、30℃のウォーターバス内で加温しながら培地のpHを測定した。資化性の有無、または強弱はpHの低下で判定した。糖を加えていない培地に菌株を接種したもののpHを対照として、判定基準は、pHが4.5未満のものを(+++)、pHが4.5以上5.0未満のものを(++)、pHが5.0以上5.5未満のものを(+)、pHが5.5以上6.0未満のものを(±)、pHが6.0以上のものを(−)とした。
資化性の結果を下記の表4に示す。
【0088】
【表4】
【0089】
表4によれば、本発明の糖1はBifidobacterium属に属する数種の菌種によってのみ利用され、他の属に属する菌種では資化されにくい糖質であることがわかる。したがって、本発明の糖1は、ビフィズス菌増殖用の糖質として利用できることがわかる。
【実施例13】
【0090】
甘味度及び甘味の質
本発明の糖1の5%溶液と、0.5%〜3.0%のショ糖溶液を調製し、5人の被験者による官能試験により甘味度と甘味の質を判定した。その結果、ショ糖の甘味度を100とした場合、本発明の糖1の甘味度は約20であった。この甘味度は乳糖及びβ−ガラクトースに近いものであり、概ね、さっぱりとした甘味であった。
【産業上の利用可能性】
【0091】
本発明のオリゴ糖は難消化性の甘味料として有用である。さらに、本発明のオリゴ糖は、ビフィズス菌増殖作用、非う蝕作用を付与する能性食品として食品素材、或いは医薬品素材、口腔用組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【0092】
【図1】糖質としてグルコースとフルクトースの質量比を1:1とし、種々の糖濃度の液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを反応させて得られた本発明のオリゴ糖の相対合成量を求めた結果を示すグラフである。
【図2】本発明のオリゴ糖をHPLCにより分析したHPLCのチャートを表す。
【図3】本発明の糖1をPositiveイオンモードで質量分析(MALDI−TOF−MS)した結果のチャートを表す。
【図4】本発明の糖2及び糖3をPositiveイオンモードで質量分析(MALDI−TOF−MS)した結果のチャートを表す。
【図5】糖1をHakomoriの方法でメチル化しメタノール分解した試料をGC−MS分析した結果のチャートを表す。
【図6】糖1をCOSYによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図7】糖1のHSQCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図8】糖1をHSQC−TOCSYによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図9】糖1をHMBCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図10】糖1をct−HMBCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図11】糖1をJ−res HMBCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図12】糖2をCOSYによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図13】糖2をHCQCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図14】糖2をHSQC−TOCSYによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図15】糖2をCH2 −HSQC−TOCSYによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図16】糖2をct−HMBCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図17】糖3をCOSYによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図18】糖3をHCQCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図19】糖3をHSQC−TOCSYによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図20】糖3をHMBCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図21】糖3をct−HMBCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図22】糖1について新鮮唾液を用いたう蝕性試験の結果を示すグラフである。
【図23】糖1についてStreptococcus mutans JCM5705を用いたう蝕性試験の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規オリゴ糖、新規オリゴ糖を添加した食品、新規オリゴ糖の製造方法及びその機能性に関し、詳しくはグルコースの6位にフルクトースがピラノース型でβ結合した新規オリゴ糖、新規オリゴ糖を添加してなる食品、グルコースとフルクトースあるいはラミナリビオースとフルクトースの高濃度液にβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることによって得られる新規オリゴ糖の製造方法、及び該オリゴ糖を含有する非う蝕性組成物、ビフィズス菌増殖組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
末端のフルクトース残基がピラノース構造のオリゴ糖はいくつか報告されているが、グルコースと結合したフルクトース残基がピラノース構造をとるものは少なく、ツラノース、ロイクロースが知られている程度である。又、末端のフルクトース残基がピラノース構造のオリゴ糖の機能性についての報告も知られていない。またβ−フルクトフラノシダーゼを、高糖濃度のグルコースとフルクトースの条件下で作用させると、グルコースの6位にピラノース型でフルクトースを結合させる反応は報告されていない。
【0003】
ところで、ネオケストースを部分加水分解することにより、グルコースとフルクトースが2−6結合したオリゴ糖として、β−D−フルクトフラノシル−(2→6)−α−D−グルコピラノースが得られることは非特許文献1により知られているが、該オリゴ糖はフルクトース部分がフラノース型となっており、ピラノース型ではない。
【0004】
ビフィズス菌の効用として、腸内腐敗菌による腐敗の抑制作用、発ガン抑制作用、毒性アミンの産生防止作用、病原菌による感染症に対する抑止作用等が広く知られている。腸内でビフィズス菌を増殖させるためには、摂取されてから途中で消化されずに回腸や大腸に到達すること、ビフィズス菌以外の菌に利用されないことおよびビフィズス菌が良く利用することの諸条件を満たすことが必要であることが知られている。
【0005】
近年、いわゆる虫歯と呼ばれるう蝕の原因が、口腔内でう蝕原因菌であるストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans, St. mutans)やストレプトコッカス・ソブリナス(St. sobrinus)によって産生されるグルコース転移酵素(glucosyltransferase, GTase)の作用によって、蔗糖から不溶性でかつ付着性のあるグルカンが生成され、この不溶性付着性グルカンが歯牙に結合した後、さらにミュータンス菌などの細菌をグルカンの中に引き込んで歯垢を形成し、この歯垢内の細菌が酸を生成することにあることが明らかにされている。甘味、物理的性状の点で優れており、甘味料として広く飲食物に使用されている蔗糖は、歯質を脱灰する酸の基質となるだけでなく、歯垢中に酸を停滞させ、脱灰を持続させる働きを有する不溶性付着性グルカンの基質ともなるものであり、ミュータンス菌のう蝕原因性因子の多くが、蔗糖の存在によって発現されることが証明されている。
【非特許文献1】Journal of Chromatography A, 920(2001)299-308
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、新規な構造を持つオリゴ糖を提供することを課題とする。また本発明は、ピラノース型でフルクトース転移活性を有する酵素の反応を利用して新規オリゴ糖の製造方法を確立することを目的とする。
【0007】
さらに本発明は、人体に難消化性で、ビフィズス菌にのみ特異的に消化されるビフィズス菌増殖用組成物を提供することを目的とする。さら本発明は、虫歯形成の予防に有用な非う蝕性組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、植物エキス発酵液中の新規オリゴ糖について検索し、分離し、TOF−MS分析、メチル化糖のGC−MS分析およびNMR分析した結果、いかなる標品とも一致しない未知のオリゴ糖を検出した。このオリゴ糖は植物エキス発酵液の発酵前ではほとんど見られず、発酵熟成後に検出される。
【0009】
このオリゴ糖はピラノース型フルクトースがグルコースに2−6結合したオリゴ糖を基本骨格とする。
【0010】
ところで、前記背景技術で示したように、ネオケストースを部分加水分解することにより得られるオリゴ糖は、β−D−フルクトフラノシル−(2→6)−α−D−グルコピラノースである(非特許文献1)が、該オリゴ糖はフルクトース部分がフラノース型となっており、本発明のオリゴ糖の基本骨格におけるフルクトース部分がピラノース型であるものとは、異なる。
【0011】
即ち、本発明の新規オリゴ糖は、下記一般式(1)で表される化合物である。
【0012】
【化1】
(式中、R1 は、水素原子、又は位置番号3で結合するグルコース、R2 は、水素原子、又は位置番号1で結合するグルコースを表す。)
【0013】
前記一般式(1)に属する具体的な本発明のオリゴ糖は、下記式(2)で表されるβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−D−グルコピラノースである。
【0014】
【化2】
【0015】
前記一般式(1)に属する本発明の別の具体的なオリゴ糖は、下記式(3)で表されるβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−Ο−β−D−グルコピラノシル(1→3)−D−グルコピラノースである。下記式(3)のオリゴ糖は、ラミナリビオースの非還元末端のグルコース残基の6位にフルクトースがピラノース型で結合した化合物に相当する。
【0016】
【化3】
【0017】
前記一般式(1)に属する本発明のさらに別の具体的なオリゴ糖は、下記式(4)で表されるβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−Ο−[β−D−グルコピラノシル(1→3)]−D−グルコピラノースである。下記式(4)の化合物は、ラミナリビオースの還元末端のグルコース残基の6位にフルクトースがピラノース型で結合した化合物に相当する。
【0018】
【化4】
【0019】
本発明のオリゴ糖の製造方法は、植物を切断したものに原料重量の1/10量以上2倍量以下、好ましくは、1/5量以上2倍量以下、最も好ましくは、1/4量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスを自然発酵させることにより、該抽出エキス中に前記式(1)〜式(4)で表される本発明の何れかのオリゴ糖を生成させ、得られた植物発酵エキス中からオリゴ糖を採取することを特徴とする。
【0020】
植物発酵エキスは、以下の様に製造される。植物原料としては、リンゴ、ニンジン、大根、キャベツ、セロリ、キュウリ、バナナ、タマネギ、ゴボウ、ホウレン草、ナシ、ミカンの皮、トマト、ピーマン、ブラックマッペモヤシ、ナス、レンコン、カボチャ、シイタケ、ショウガ、レタス、ニンニク、三つ葉、ウド、アスパラガス、熊笹、クローバー、昆布、フキノトウ、タンポポ、オオバコ、エンドウモヤシ、スギ葉、パセリ、カブ、パイナップル、ブドウ、イチゴ、イタドリの若芽、アサツキ、白菜、エノキタケ、サラダ菜、シュンギク、ヨモギ、セリ、ニラ、トドマツ葉、青シソ、ワカメ等が挙げられ、これらの植物原料のうち2種以上、好ましくは、多種類が用いられる。
【0021】
上記植物原料の配合割合として、例えばリンゴでは植物原料総重量の0.1から50%、ニンジンでは0.1から50%、大根では0.05から40%、キャベツでは0.05から40%、セロリやキュウリでは0.01から30%、バナナ、タマネギ、ゴボウ、ホウレン草では0.01から30%とすることが望ましいが、特に制限されるものではない。
【0022】
これらの植物原料を1〜5cm幅、好ましくは1〜4cm幅、最も好ましくは2〜3cm幅に切断し、全ての原料を杉樽中に入れ、これに、ショ糖を混合し、圧搾せずに浸透圧を利用して、3日間から3週間抽出する。ショ糖の混合割合については、全体として1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにし、好ましくは、植物原料とほぼ等量のショ糖を添加して混合することが望ましい。同時に、数ppm程度の濃度となるように若干量の食塩を添加混合してもよい。
【0023】
圧搾せずに回収した抽出エキスを37℃で暗所で保存すると主として酵母(例えば、Saccharomyces 属に属する微生物)および乳酸球菌(例えば、Leuconostoc 属に属する微生物)により自然発酵する。発酵後、さらに37℃で約半年間以上熟成させると褐色、粘稠性液体の植物発酵エキスが得られる。得られた植物発酵エキスから以下のようにして、本発明のオリゴ糖を採取することができる。或いは、得られた植物発酵エキスを食品とすることができる。
【0024】
植物発酵エキスをカラムクロマトグラフィーに通し、溶出することにより本発明のオリゴ糖を採取することができる。得られたオリゴ糖をさらにHPLCにかけることにより分離、精製し、凍結乾燥することにより、精製された粉末状の本発明のオリゴ糖を得ることができる。
【0025】
植物発酵エキスを製造しない、効率的な本発明のオリゴ糖の製造方法は、10質量%以上80質量%以下、好ましくは、20質量%以上80質量%以下、最も好ましくは、25質量%以上80質量%以下の糖質を含む基質溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより前記式(1)〜式(4)で表される新規オリゴ糖を生成させ、該溶液中から該新規オリゴ糖を採取することを特徴とする。
【0026】
本発明のオリゴ糖の製造方法で使用するβ−フルクトフラノシダーゼについては、市販のβ−フルクトフラノシダーゼを使用することができ、或いは、β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する酵母、乳酸菌等から抽出し、精製した酵素が用いられる。市販のβ−フルクトフラノシダーゼには、例えば、β−フルクトフラノシダーゼ(シグマ社製、Invertase from Baker’s yeast Grade VII:商品名)を用いることができる。β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物については、酵母及び乳酸菌から選ばれた1種以上を用いることができる。
【0027】
本発明で使用することができる酵母としては、Saccharomyces 属に属する微生物、Pichia属に属する微生物、Candida 属に属する微生物、Hansenulau属に属する微生物が挙げられる。さらに具体的な酵母の種としては、Saccharomyces cerevisiae、Pichia anomalaが挙げられる。さらに具体的な酵母の菌株としては、Pichia anomala(Ferm AP−20504)、Pichia anomala JCM3585が挙げられる。
【0028】
本発明で使用することができる乳酸菌としては、Leuconostoc 属に属する微生物、Bifidobacterium 属に属する微生物、Lactobacillus 属に属する微生物、Streptococcus 属に属する微生物、Pediocuccus 属に属する微生物、Lactocossus 属に属する微生物が挙げられる。さらに具体的な乳酸菌の種としては、Leuconostoc mesenteroides が挙げられる。ができる。
【0029】
また、本発明のオリゴ糖の製造方法は、前記精製した酵素を用いたオリゴ糖の製造方法において、精製した酵素に代えて、前記β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物からβ−フルクトフラノシダーゼを抽出し、粗精製した酵素を用いて、同様にオリゴ糖を製造することができる。即ち、本発明のオリゴ糖の製造方法は、10質量%以上80質量%以下、好ましくは、20質量%以上80質量%以下、最も好ましくは、25質量%以上80質量%以下の糖質を含む基質溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られたβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有する粗精製酵素を作用させることにより前記式(1)〜式(4)で表される新規オリゴ糖を生成させ、該溶液中から該新規オリゴ糖を採取することを特徴とする。
【0030】
またさらに別の効率的な本発明のオリゴ糖の製造方法は、精製したβ−フルクトフラノシダーゼ或いは粗精製のβ−フルクトフラノシダーゼを用いずに、直接、β−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物を用いる方法であり、即ち、10質量%以上80質量%以下、好ましくは、20質量%以上80質量%以下、最も好ましくは、25質量%以上80質量%以下の糖質を含む培地溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させて発酵させ、培地中に前記式(1)〜式(4)で表される新規オリゴ糖を生成させ、該培地中から該新規オリゴ糖を採取することを特徴とする。
【0031】
粗精製酵素を製造する方法には、例えば、培養液を遠心分離して菌体を集め超音波で破砕し、さらに遠心分離して上澄みを回収するか、或いは、培養液を遠心分離して菌体を集め乳鉢で破砕し、さらに遠心分離して上澄みを回収するか、或いは、培養液を遠心分離して菌体を集めてビーズビーダーで破砕し、さらに遠心分離して上澄みを回収するか、或いは、培養液を遠心分離して、その上澄みを透析した内液を回収する方法が挙げられる。
【0032】
精製した酵素を製造する方法には、粗精製酵素を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを1種類以上を組み合わせて精製する方法があげられる。
【0033】
該微生物を用いる方法において使用するβ−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物は、前記に列挙したβ−フルクトフラノシダーゼ生産能を有する微生物を用いることができる。
【0034】
前記培養による本発明のオリゴ糖の製造方法において用いる糖質としてはショ糖が好ましい。前記のオリゴ糖の製造方法において、微生物の培溶液、或いは酵素の基質溶液等の出発原料の糖濃度は、通常の発酵プロセスにおいて培養液中に含まれる糖濃度に比べて、本発明の場合は極めて高濃度であり、本発明において特有な範囲である。基質溶液或いは培養液の糖濃度が10質量%未満ではオリゴ糖の合成量が少なく効率的ではなく、70質量%を超えると酵母の増殖が困難となる。これは、高糖濃度による高浸透圧となるからと考えられる。
【0035】
図1は、糖質としてグルコースとフルクトースの質量比を1:1とし、種々の糖濃度の溶液を調製し、該溶液1mLに対してβ−フルクトフラノシダーゼ20ユニットを添加し、37℃で168時間反応させたときの各種糖濃度(横軸)に対するオリゴ糖の相対合成量(縦軸)を表すグラフである。図1における相対合成量については、糖濃度が80%のとき、オリゴ糖の合成量が最大となったので、これを相対合成量100%と定義した。
【0036】
図1のグラフによれば、糖濃度が低ければ、本発明のオリゴ糖の合成量は少ないが、糖濃度が高ければ、合成されるオリゴ糖も、糖濃度が80%迄は比例して多くなり、80%が最大の合成量となるが、90質量%となるとオリゴ糖の合成量が低下することがわかる。
【0037】
本発明の式(1)又は式(2)で表されるオリゴ糖は、ビフィズス菌増殖用組成物の有効成分、或いは非う蝕性組成物の有効成分である。
【0038】
本発明のオリゴ糖の製造方法で使用する糖質については、植物を切断したものを原料とする場合には、植物中に含まれる糖と、添加するショ糖が用いられる。また、基質溶液又は培地を原料とする場合には、これらに添加する糖には、グルコースとフルクトースの組み合わせ、或いはラミナリビオースとフルクトースの組み合わせが用いられる。
【0039】
本発明の培養によるオリゴ糖の製造方法で使用する、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物については、前記した微生物を用いることができる。
【0040】
本発明は前記新規なオリゴ糖を添加した食品又は飼料としても有用である。食品又は飼料に添加される本発明のオリゴ糖の添加量は、食品又は飼料に含まれる消化性糖の全質量の0.05以上30質量%以下となるように添加することが、食品又は飼料中に含まれる消化性糖の過剰摂取を防止する目的のために好ましい。
【0041】
本発明の食品の製造方法の別の方法は、植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスにβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより、前記オリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造する方法である。
【0042】
本発明の食品の製造方法のさらに別の方法は、植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して、抽出することにより抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られた粗精製酵素を作用させることにより、前記オリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造する方法である。
【0043】
本発明の食品の製造方法のさらに別の製造方法は、植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させ、抽出エキス中に前記オリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造する方法である。
【0044】
本発明のオリゴ糖は、酵素反応液又は培養液を濾過、精製して液状で使用することも、また、濃縮してシラップ状で利用することも、更に、乾燥し固体状で用いることもできる。さらに、精製工程を経て、夾雑糖類を除去して本発明のオリゴ糖の高含有画分を採取したもの、或いはさらに精製し、粉末化或いは結晶化したものを用いることができる。粉末状製品は、そのままで、又は必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成型して使用することもできる。
【0045】
式(1)で表されるオリゴ糖は、ショ糖の甘味度の約1/5程度であり、乳糖やβ−ガラクトースに近い甘味であり、概ねさっぱりとした甘味である。
【発明の効果】
【0046】
本発明のオリゴ糖は、新規化合物として有用である。本発明の式(1)、式(2)で表されるオリゴ糖は、難消化性であるので、高血糖症状及び高血糖に起因する肥満症や糖尿病など種々の疾患の改善に有用である。
【0047】
本発明の式(1)、式(2)で表されるオリゴ糖はビフィズス菌増殖作用を有するので、該オリゴ糖を添加した食品は、腸内腐敗菌による腐敗の抑制、発ガン抑制、毒性アミンの産生防止、病原菌による感染症に対する抑止等に用いることができる。
【0048】
本発明の式(1)、式(2)で表されるオリゴ糖はう蝕誘発菌などによって発酵されにくく、う蝕誘発菌による蔗糖からの不溶性グルカン合成を阻害するので、虫歯を起こしにくいオリゴ糖として、う蝕抑制剤(非抗蝕剤)などに有利に利用できる。
【0049】
また、本発明の式(1)、式(2)で表されるオリゴ糖は甘味料として利用可能である。
【0050】
さらに、本発明の式(1)、式(2)で表されるのオリゴ糖は、肥満症や糖尿病など種々の疾患の改善作用、ビフィズス菌増殖作用、非う蝕作用を付与する能性食品として食品素材、医薬品素材、口腔用組成物への利用が可能である。
【実施例1】
【0051】
植物発酵エキスの調製
植物抽出エキスの原料として以下の配合の材料を2〜3cm幅に切断したものを使用した。
【0052】
リンゴ 植物原料総重量の20%
ニンジン 同 16%
大根 同 12%
キャベツ 同 10%
セロリ 同 9%
キュウリ 同 9%
バナナ 同 6%
玉ねぎ 同 6%
ゴボウ 同 6%
ホウレン草 同 6%
【0053】
これらの植物原料全重量に対して、当量のショ糖を加えて一週間抽出し、抽出液を上記微生物により自然発酵させた後、37℃で約半年間熟成させることにより、褐色の粘稠性の液状の植物発酵エキスを得た。
【0054】
オリゴ糖の測定
植物エキス発酵液の発酵前及び発酵後の液10μLにABEE標識試薬(J−オイルミルズ社製)40μL加え、80℃1時間反応させた。200μL蒸留水及び200μLクロロホルムを加えよく撹拌した後、遠心分離しその上清を適当に希釈した。標識化された糖をHonenpak C18カラム(J−オイルミルズ)を用いたHPLC(カラムサイズ:4.6mm×7.5cm、溶出:0.1M酢酸アンモニウム緩衝液、カラム温度:室温、流速:0.5mL/min、検出:UV305nm)により分析した。その結果をHPLCのチャートとして図2に示す。図2によれば、発酵前と発酵後を比較すると、発酵後のチャートでは糖の溶出時間の経過において、フルクトースとグルコースの間にはどの標品とも一致しない、未知の糖が増加していることが確認できた。
【0055】
未知の糖成分の分画、精製
発酵後の植物エキス発酵液を活性炭セライトカラムクロマトグラフィー(4.5cm×35cm)に添加し、エタノールのステップワイズグラジエントで溶出した。未知の糖1は、5%エタノールで溶出され、未知の糖2及び未知の糖3は15%エタノールで順次溶出された。さらにAmide−80(東ソー:カラムサイズ:4.6mm×25cm、溶出:80%アセトニトリル、カラム温度:80℃、流速:1mL/min、検出:示差屈折計)およびODS−80Tsカラム(東ソー:カラムサイズ:4.6mm×25cm、溶出:蒸留水、カラム温度: 室温、流速:0.5mL/min、検出:示差屈折計)を用いたHPLCによりさらに、糖1、糖2、糖3を各々分離、精製し、各々の凍結乾燥粉末を得た。
【0056】
化学構造の決定
前記工程において分離、精製した糖1、糖2、糖3の各々について、機器分析を行い、その化学構造を以下のように決定した。これらの糖をPositiveイオンモードで質量分析(MALDI−TOF−MS)した結果、糖1は365の〔M+Na〕+ のイオンピークを与えた(図3)。糖2及び糖3は527の〔M+Na〕+ のイオンピークを与えた(図4)。糖1を酸加水分解後、HPAEC分析し、構成糖を調査したところ、グルコースとフルクトースのみから構成され、モル比は1:1であった。従って糖1はグルコース1分子とフルクトース1分子からなる2糖類であると決定した。糖2及び糖3を同様に調査した結果、グルコースとフルクトースのみから構成され、モル比は2:1であった。従って糖2及び糖3はグルコース2分子とフルクトース1分子からなる3糖類であると決定した。
【0057】
糖1はβ−フルクトフラノシダーゼ、α−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼいずれによっても分解されなかった。糖1をHakomoriの方法でメチル化しメタノール分解した試料をGC−MS分析した結果、methyl 2,3,4−tri−O−
methyl−D−glucoside、methyl 1,3,4,5−tetra−O−methyl−D−fructosideが検出され(図5)、MS/MS分析のフラグメントパターンは、いずれもピラノース型のシグナルと一致した。
【0058】
糖1のNMR解析は、COSY、HSQC、HSQC−TOCSY、HMBC、ct−HMBC、J−res HMBCの2次元NMRで行った(図6−図11)。糖2は、COSY、HSQC、HSQC−TOCSY、CH2 −HSQC−TOCSY、ct−HMBCの2次元NMRで行った(図12−図16)。糖3は、COSY、HSQC、HSQC−TOCSY、HMBC、ct−HMBCの2次元NMRで行った(図17−図21)。
【0059】
また糖1のケミカルシフトを表1に、糖2及び糖3のケミカルシフトを表2及び表3に示す。
【0060】
【表1】
【0061】
【表2】
【0062】
【表3】
【0063】
以上の結果から糖1は、前記式(2)に示すβ−D−フルクトピラノシル(2→6)D−グルコピラノース、糖2は、前記式(3)に示すβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−O−β−D−グルコピラノシル(1→3)D−グルコピラノース、糖3は、前記式(4)に示すβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−O−[β−D−グルコピラノシル(1→3)]D−グルコピラノースであると決定した。
【実施例2】
【0064】
製造方法1−1:市販酵素を用いた糖1の製造方法
20%グルコース(シグマ社製)及び20%フルクトース(シグマ社製)を含む水溶液100mLに、0.2M酢酸緩衝液(pH5.0、10mL)に溶解したβ−フルクトフラノシダーゼ(シグマ社製、Invertase from Baker’s
yeast Grade VII :商品名)2000ユニットを添加した。さらに少量のトルエンを防腐のため加えた。37℃で24時間以上加温し反応生成物を得た。反応生成物を前記実施例1と同様にして精製して凍結乾燥粉末を得た。得られた凍結乾燥品を前記実施例1と同様にしてTOF−MSおよびNMR解析により反応生成物の構造を確認したところ、前記式(2)で表される糖1のβ−D−フルクトピラノシル(2→6)D−グルコピラノースであった。
【実施例3】
【0065】
製造方法1−2:市販酵素を用いた糖2及び糖3の製造方法
20%ラミナリビオース(シグマ社製)及び20%フルクトース(シグマ社製)を含む水溶液100mLに0.2M酢酸緩衝液(pH5.0、10mL)に溶解したβ−フルクトフラノシダーゼ(シグマ社製、invertase from Baker’s yeast Grade VII:商品名)2000ユニットを添加した。さらに少量のトルエンを防腐のため加えた。37℃で24時間以上加温し反応生成物を得た。反応生成物を前記実施例1と同様にして精製して凍結乾燥粉末を得た。得られた凍結乾燥品を前記実施例1と同様にしてTOF−MSおよびNMR解析により反応生成物の構造を確認したところ、前記式(3)で表される糖2のβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−O−β−D−グルコピラノシル(1→3)D−グルコピラノース、及び前記式(4)で表される糖3のβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−O−[β−D−グルコピラノシル(1→3)]D−グルコピラノースであった。
【実施例4】
【0066】
製造方法2−1:市販菌を用いた発酵による製造方法
グルコース40g、ポリぺプトン(日本製薬製)4g、酵母エキス(オリエンタル酵母) 2gに蒸留水を加えて100mLとし、オートクレーブで滅菌後、除菌濾過した40%フルクトース溶液100mLと混合し培養液とした。これにSaccharomyces cerevisiae JCM 1499(独立行政法人 理化学研究所により頒布)を一白金耳添加して30℃で48時間以上培養し、培養液を得た。培養液を前記実施例1と同様に分離精製して反応生成物を得た。前実施例1と同様にしてTOF−MSおよびNMR解析により反応生成物の構造を確認したところ、前記式(2)で表される糖1のβ−D−フルクトピラノシル(2→6)D−グルコピラノース、前記式(3)で表される糖2のβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−O−β−D−グルコピラノシル(1→3)D−グルコピラノース、及び前記式(4)で表される糖3のβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−O−[β−D−グルコピラノシル(1→3)]D−グルコピラノースであった。
【実施例5】
【0067】
製造方法2−2:分離菌株を用いた発酵による製造方法
前記実施例4において、微生物として菌株Pichia anomala Ferm
P−20504(2005年4月13日に独立行政法人 産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託)を用いた以外は前記実施例4と同じようにして培養し、培養液から本発明の糖1、糖2、糖3を得た。該菌株は、伊達市北稀府町121番地の大高酵素株式会社 伊達工場内の発酵タンク内の発酵液から採取し、分離したものである。
【実施例6】
【0068】
製造方法3−1:粗精製酵素液を用いた製造方法
Saccharomyces cerevisiae JCM 1499をYPD培地(酵母エキス1%、ペプトン2%、グルコース2%)で72時間培養した液を9,000×gで遠心分離した。得られた沈殿に0.9%食塩水を加えて撹拌し遠心分離し、この操作を2回繰り返した。沈殿を10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁し超音波破砕した後、遠心分離し上清を10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に対し透析した。得られた液を粗精製酵素液とした。
【0069】
20%グルコース(シグマ社製)及び20%フルクトース(シグマ社製)を含む水溶液100mLに前記工程で得られた粗精製酵素液10mLと加え、37℃で24時間以上加温し反応生成物を得た。前記実施例1と同様にして得られた反応生成物を精製して本発明の糖1を得た。
【実施例7】
【0070】
本発明の糖1を添加したバターロールの製造例
以下の材料を用いて常法によりバターロールを製造した。
【0071】
強力粉 500g
食塩 5g
牛乳 150mL
卵黄 10g
前記式(2)で表されるオリゴ糖(糖1) 20g
生イースト 12.5g
【実施例8】
【0072】
本発明の糖1を添加したハードキャンディーの製造例
ショ糖110gに蒸留水43.5gを加え、30分間で177℃まで加熱した。その後100℃に保ち、前記式(2)で表されるオリゴ糖(糖1)の2.5gを3回に分け加え、よく撹拌した。その後あらかじめ用意した型に流し込み放冷することにより、ハードキャンディーを得た。
【実施例9】
【0073】
本発明の糖1を添加した産卵鶏用飼料の製造例
トウモロコシ100g、大麦120g、小麦100g、コウリャン110g、米糠110g、ふすま200g、大麦ふすま100g、大豆かす30g、魚粉70g、炭酸カルシウム54.5g、食塩5g、粉末肝油0.5gに前記式(2)で表されるオリゴ糖(糖1)を2%となるように添加し混合することにより産卵鶏用飼料を得た。
【実施例10】
【0074】
本発明の糖1の消化性
人工胃液、ラット小腸アセトン粉末、酵母由来α−グルコシダーゼによる本発明の糖1の分解性について下記のように試験した。
【0075】
人工胃液による分解性は、2%本発明の糖1の50μLと50mM HCl・KCl緩衝液(pH2.0)25μLを加えて、37℃で100分間反応後、10mM NaOHを30μL添加し中和した。混合後、直ちに中和したものを対照とした。この反応液をHPLC分析し、分解物を調べた。
【0076】
ラット小腸アセトン粉末の調製は、ラット小腸アセトン粉末(sigma社製)300mgに10mMリン酸緩衝液(pH7.0)2.7mLを加えてガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズし、10,000xg、15分間4℃で遠心分離し、得られた上澄みを酵素液とした。マルターゼ活性として1mLあたり4ユニットとなるように希釈した酵素液25μL、4%の本発明の糖1を25μL、水50μLを加えて、37℃10分間反応させ100℃で5分間加熱し、反応を停止した。
【0077】
酵母由来のα−グルコシダーゼも同様に、1mLあたり4ユニットとなるように調製したα―グルコシダーゼ25μL、水50μLを加えて、37℃10分間反応させ100℃で5分間加熱し、反応を停止した。
【0078】
これらの試験の結果、全ての反応において本発明の糖1は殆ど分解されなかった。したがって、本発明の糖1は、難消化性糖質であることがわかる。
【実施例11】
【0079】
本発明の糖1のう蝕性
宮村(歯学、60、717〜731、1973)の方法に準じ、水1mL、又は、各1.25%の本発明の糖1、グルコース又はパラチノース各1mLに、それぞれハートインフージョンブイヨン1mLと新鮮唾液3mLを添加してなる4種類の溶液について、37℃におけるpHの経時変化を調べた。また、該方法において、新鮮唾液の代わりに、
Streptococcus mutans JCM5705を接種したものについても同様にpHの経時変化を調べた。この結果を新鮮唾液に関しては図22、Streptococcusmutans JCM5705を接種したものについて図23に横軸に時間縦軸にpHをとったグラフにして示す。
【0080】
これらのグラフによれば、グルコースでは培養10時間前後から酸の産生によるpHの低下が認められたのに対して、本発明の糖1ではpHの低下が殆どなく、その低下は非う蝕性糖質であるパラチノースとほぼ同等であった。
【実施例12】
【0081】
本発明の糖1のヒト由由来腸内細菌の代表株による資化性
ヒト由来腸内細菌の代表株を用い、本発明の糖1の資化性について次のようにして試験を行った。なお、比較のため、グルコース、スクロース、ラクトース、メリビオース、パラチノース、ツラノース、ラフィノース、1−ケストースも同様に試験を行った。供試菌株は、Bifidobacterium 属に属する微生物5株(B.adolescentis、B.bifidum、B.breve、
B.infantis、B.longum)、Lactobacillus属に属する微生物3株(L.acidophilus、
L.casei、L.fermentum)、その他の微生物株4株(Enterobacter cloacae、Echerichia
coli、Enterococcus faecalis、Clostridium perfringens)を用いた。
【0082】
各菌株の前培養には、炭素源を0.5%グルコースとしたLB培地を用いた。次にLB培地を用いて資化性試験を行った(「腸内菌の世界」、光岡知足著、叢文社発行の方法に準じた。)
【0083】
LB培地の組成は、Proteose peptone No.3(10g)、Trypticase(5g)、Yeast extract(3g)、Tween 80(1g)、Solution B(5mL)、L-cysteine HCl・H2 O(0.2g)、寒天(1.5g)をBacto-Liver浸出液1Lに溶解し、pH7.2に調製後、滅菌処理した。
【0084】
前記Solution Bとは、4.0%MgSO4・7H2O、0.2%FeSO4・7H2O、0.2%NaCl、0.135%Mn SO4 となるように精製水に溶解したものである。
【0085】
前記Bacto-Liver浸出液とは、Bacto-Liver5.5gに1050mLの精製水を加え、50〜60℃の温浴中で時々撹拌しながら1時間浸出した後、濾紙でろ過したものである。
【0086】
本実施例で用いたLB培地は、滅菌処理後、最終濃度が0.5%になるように前記各糖を加えた。前記各糖は、メンブランフィルターでろ過して滅菌処理を行った。一方、前培養した各菌株は、遠心分離(3000rpm、15分)し、得られた沈殿に、0.8%生理食塩水を2mL加え、よく撹拌して洗菌し、同様の条件で遠心分離した。この作業を2度繰返し、最終段階で、各菌株濃度が同じになるように生理食塩水を加え、LB培地に接種した。接種したLB培地は、嫌気ジャーを用い、窒素ガス下で嫌気的に37℃で、72時間培養した。
【0087】
発酵試験培地に前記各種菌株を接種し、72時間の培養後、30℃のウォーターバス内で加温しながら培地のpHを測定した。資化性の有無、または強弱はpHの低下で判定した。糖を加えていない培地に菌株を接種したもののpHを対照として、判定基準は、pHが4.5未満のものを(+++)、pHが4.5以上5.0未満のものを(++)、pHが5.0以上5.5未満のものを(+)、pHが5.5以上6.0未満のものを(±)、pHが6.0以上のものを(−)とした。
資化性の結果を下記の表4に示す。
【0088】
【表4】
【0089】
表4によれば、本発明の糖1はBifidobacterium属に属する数種の菌種によってのみ利用され、他の属に属する菌種では資化されにくい糖質であることがわかる。したがって、本発明の糖1は、ビフィズス菌増殖用の糖質として利用できることがわかる。
【実施例13】
【0090】
甘味度及び甘味の質
本発明の糖1の5%溶液と、0.5%〜3.0%のショ糖溶液を調製し、5人の被験者による官能試験により甘味度と甘味の質を判定した。その結果、ショ糖の甘味度を100とした場合、本発明の糖1の甘味度は約20であった。この甘味度は乳糖及びβ−ガラクトースに近いものであり、概ね、さっぱりとした甘味であった。
【産業上の利用可能性】
【0091】
本発明のオリゴ糖は難消化性の甘味料として有用である。さらに、本発明のオリゴ糖は、ビフィズス菌増殖作用、非う蝕作用を付与する能性食品として食品素材、或いは医薬品素材、口腔用組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【0092】
【図1】糖質としてグルコースとフルクトースの質量比を1:1とし、種々の糖濃度の液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを反応させて得られた本発明のオリゴ糖の相対合成量を求めた結果を示すグラフである。
【図2】本発明のオリゴ糖をHPLCにより分析したHPLCのチャートを表す。
【図3】本発明の糖1をPositiveイオンモードで質量分析(MALDI−TOF−MS)した結果のチャートを表す。
【図4】本発明の糖2及び糖3をPositiveイオンモードで質量分析(MALDI−TOF−MS)した結果のチャートを表す。
【図5】糖1をHakomoriの方法でメチル化しメタノール分解した試料をGC−MS分析した結果のチャートを表す。
【図6】糖1をCOSYによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図7】糖1のHSQCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図8】糖1をHSQC−TOCSYによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図9】糖1をHMBCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図10】糖1をct−HMBCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図11】糖1をJ−res HMBCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図12】糖2をCOSYによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図13】糖2をHCQCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図14】糖2をHSQC−TOCSYによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図15】糖2をCH2 −HSQC−TOCSYによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図16】糖2をct−HMBCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図17】糖3をCOSYによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図18】糖3をHCQCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図19】糖3をHSQC−TOCSYによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図20】糖3をHMBCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図21】糖3をct−HMBCによる2次元NMR解析した結果のチャートを表す。
【図22】糖1について新鮮唾液を用いたう蝕性試験の結果を示すグラフである。
【図23】糖1についてStreptococcus mutans JCM5705を用いたう蝕性試験の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記一般式(1)で表されるオリゴ糖。
【化1】
(式中、R1 は、水素原子、又は位置番号3で結合するグルコース、R2 は、水素原子、又は位置番号1で結合するグルコースを表す。)
【請求項2】
請求項1記載のオリゴ糖が、下記式(2)で表されるβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−D−グルコピラノース。
【化2】
【請求項3】
請求項1記載のオリゴ糖が、下記式(3)で表されるβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−Ο−β−D−グルコピラノシル(1→3)−D−グルコピラノース。
【化3】
【請求項4】
請求項1記載のオリゴ糖が、下記式(4)で表されるβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−Ο−[β−D−グルコピラノシル(1→3)]−D−グルコピラノース。
【化4】
【請求項5】
10質量%以上80質量%以下の糖質を含む基質溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより、請求項1乃至4の何れか1項に記載のオリゴ糖を生成し、該溶液から該オリゴ糖を得ることを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項6】
前記β−フルクトフラノシダーゼが、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られた粗精製β−フルクトフラノシダーゼである請求項5記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項7】
10質量%以上80質量%以下の糖質を含む培地に対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させ、培地中に請求項1乃至4の何れか1項に記載のオリゴ糖を生成させ、該培地中からオリゴ糖を採取することを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項8】
前記糖質が、グルコース及びフルクトースを含むものである請求項5乃至7の何れか1項に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項9】
前記糖質が、ラミナリビオース及びフルクトースを含むものである請求項5乃至7の何れか1項に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項10】
前記微生物が酵母及び乳酸菌から選ばれた1種以上である請求項6又は7に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項11】
前記酵母が、Saccharomyces 属に属する微生物又はPichia属に属する微生物ある請求項10に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項12】
前記酵母が、Saccharomyces cerevisiaeに属する微生物である請求項10に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項13】
前記酵母が、Saccharomyces cerevisiaeJCM1499である請求項10に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項14】
前記酵母が、Pichia anomalaに属する微生物である請求項10に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項15】
前記酵母が、Pichia anomala Ferm AP−20504 である請求項10に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項16】
前記酵母が、Pichia anomala JCM3585である請求項10に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項17】
植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスを自然発酵させることにより、該抽出エキス中に請求項1乃至4の何れか1項に記載のオリゴ糖を生成させ、生成されたオリゴ糖を採取することを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項18】
植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスを自然発酵させることにより、該抽出エキス中に請求項1乃至4の何れか1項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項19】
植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスにβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより、請求項1乃至4の何れか1項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項20】
植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られた粗精製酵素を作用させることにより、請求項1乃至4の何れか1項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項21】
植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させ、該抽出エキス中に請求項1乃至4の何れか1項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項22】
請求項18乃至21の何れか1項から選ばれた製造方法により得られた食品。
【請求項23】
請求項1又は2に記載のオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とするビフィズス菌増殖用組成物。
【請求項24】
請求項1又は2に記載のオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする非う蝕性組成物。
【請求項25】
請求項1、2、3及び4に記載のオリゴ糖から選ばれた1種以上のオリゴ糖を添加してなる飲食品。
【請求項26】
請求項1、2、3及び4に記載のオリゴ糖から選ばれた1種以上のオリゴ糖を添加してなる飼料。
【請求項1】
下記一般式(1)で表されるオリゴ糖。
【化1】
(式中、R1 は、水素原子、又は位置番号3で結合するグルコース、R2 は、水素原子、又は位置番号1で結合するグルコースを表す。)
【請求項2】
請求項1記載のオリゴ糖が、下記式(2)で表されるβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−D−グルコピラノース。
【化2】
【請求項3】
請求項1記載のオリゴ糖が、下記式(3)で表されるβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−Ο−β−D−グルコピラノシル(1→3)−D−グルコピラノース。
【化3】
【請求項4】
請求項1記載のオリゴ糖が、下記式(4)で表されるβ−D−フルクトピラノシル(2→6)−Ο−[β−D−グルコピラノシル(1→3)]−D−グルコピラノース。
【化4】
【請求項5】
10質量%以上80質量%以下の糖質を含む基質溶液に対して、β−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより、請求項1乃至4の何れか1項に記載のオリゴ糖を生成し、該溶液から該オリゴ糖を得ることを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項6】
前記β−フルクトフラノシダーゼが、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られた粗精製β−フルクトフラノシダーゼである請求項5記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項7】
10質量%以上80質量%以下の糖質を含む培地に対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させ、培地中に請求項1乃至4の何れか1項に記載のオリゴ糖を生成させ、該培地中からオリゴ糖を採取することを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項8】
前記糖質が、グルコース及びフルクトースを含むものである請求項5乃至7の何れか1項に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項9】
前記糖質が、ラミナリビオース及びフルクトースを含むものである請求項5乃至7の何れか1項に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項10】
前記微生物が酵母及び乳酸菌から選ばれた1種以上である請求項6又は7に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項11】
前記酵母が、Saccharomyces 属に属する微生物又はPichia属に属する微生物ある請求項10に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項12】
前記酵母が、Saccharomyces cerevisiaeに属する微生物である請求項10に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項13】
前記酵母が、Saccharomyces cerevisiaeJCM1499である請求項10に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項14】
前記酵母が、Pichia anomalaに属する微生物である請求項10に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項15】
前記酵母が、Pichia anomala Ferm AP−20504 である請求項10に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項16】
前記酵母が、Pichia anomala JCM3585である請求項10に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項17】
植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスを自然発酵させることにより、該抽出エキス中に請求項1乃至4の何れか1項に記載のオリゴ糖を生成させ、生成されたオリゴ糖を採取することを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項18】
植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスを自然発酵させることにより、該抽出エキス中に請求項1乃至4の何れか1項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項19】
植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスにβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより、請求項1乃至4の何れか1項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項20】
植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物から得られた粗精製酵素を作用させることにより、請求項1乃至4の何れか1項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項21】
植物を切断したものに1/10量以上2倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して抽出エキスを得、該抽出エキスに対して、β−フルクトフラノシダーゼを産生する微生物を作用させ、該抽出エキス中に請求項1乃至4の何れか1項に記載のオリゴ糖を生成させてオリゴ糖を含む食品を製造することを特徴とする食品の製造方法。
【請求項22】
請求項18乃至21の何れか1項から選ばれた製造方法により得られた食品。
【請求項23】
請求項1又は2に記載のオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とするビフィズス菌増殖用組成物。
【請求項24】
請求項1又は2に記載のオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする非う蝕性組成物。
【請求項25】
請求項1、2、3及び4に記載のオリゴ糖から選ばれた1種以上のオリゴ糖を添加してなる飲食品。
【請求項26】
請求項1、2、3及び4に記載のオリゴ糖から選ばれた1種以上のオリゴ糖を添加してなる飼料。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図2】
【図3】
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【図6】
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【図11】
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【図15】
【図16】
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【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【公開番号】特開2007−1973(P2007−1973A)
【公開日】平成19年1月11日(2007.1.11)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−141688(P2006−141688)
【出願日】平成18年5月22日(2006.5.22)
【出願人】(303027335)大高酵素株式会社 (9)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成19年1月11日(2007.1.11)
【国際特許分類】
【出願日】平成18年5月22日(2006.5.22)
【出願人】(303027335)大高酵素株式会社 (9)
【Fターム(参考)】
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