新規タンパク質及びそれをコードするＤＮＡ
【課題】カタログ化された完全長ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンの塩基配列を解析し、このうち配列が新規なものについては、これがコードするタンパク質の生理活性を特定し、該生理活性に基づくタンパク質およびそれをコードするＤＮＡの利用方法を提案する。
【解決手段】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。（ａ）特定の配列のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）特定の配列のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質。
【解決手段】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。（ａ）特定の配列のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）特定の配列のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えベクター、該ＤＮＡの部分配列から成るオリゴヌクレオチド、該ＤＮＡを導入した遺伝子導入細胞、及び該タンパク質に特異的に結合する抗体等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ｃＤＮＡの取得及びその塩基配列解析は、生体内に発現するタンパク質の生理活性を解析し、その活性に基づくタンパク質の利用方法を開発するうえで不可欠である。さらに、全遺伝子種に対応する完全長ｃＤＮＡをカタログ化したライブラリーの作製は、ヒトゲノムプロジェクトの重要な課題の一つである。カタログ化したライブラリーとは、ライブラリーに含まれるｃＤＮＡに重複がないという意味であり、各ｃＤＮＡが１種類ずつ含まれているライブラリーのことである。
【０００３】
完全長ｃＤＮＡクローニング法については、特開平９−２４８１８７号公報及び特開平１０−１２７２９１号公報に記載されている。この方法は、ｍＲＮＡの５’キャップサイトに存在するジオール構造にタグになる分子を結合させる工程、前記タグ分子を結合させたｍＲＮＡを鋳型とし、ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして逆転写によりＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を作製し、この複合体の内、ｍＲＮＡの完全長に対応するＤＮＡを有するものをタグ分子の機能を利用して分離する工程を含むことを特徴とする方法である。
【０００４】
また効率のよい逆転写法として、鋳型が高次構造を形成しないような高温で行うための方法も開発されている（特開平１０−８４９６１号公報）。さらに、合成された完全長ｃＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡ断片についてその鎖長に関わらず一律にクローニングすることができるクローニングベクターも開発されている（特開平１１−９２７３号公報）。
【０００５】
このような技術により作製された完全長ｃＤＮＡライブラリーは、ライブラリーの個々の要素として全て均等に異なるものが含まれている訳ではなく、存在割合の高いクローンや逆に極微量にしか存在しないクローンもある。この極微量にしか存在しないクローンは新規である可能性が高いため、このようなクローンを濃縮するためのサブトラクション法やノーマライゼーション法も開発されている（特開２０００−３２５０８０号公報；Ｃａｒｎｉｎｃｉ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ３７， ３２７−３３６（１９９６））。
【０００６】
かくして得られるカタログ化された完全長ｃＤＮＡライブラリーの各クローンについて公知の方法により塩基配列の解析を行えばその塩基配列は同定されるが、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質の生理活性は依然不明のままである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、カタログ化された完全長ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンの塩基配列を解析し、このうち配列が新規なものについては、これがコードするタンパク質の生理活性を特定し、該生理活性に基づくタンパク質およびそれをコードするＤＮＡの利用方法を提案することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、マウス完全長ｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡクローンが有する塩基配列を解析し、該配列の相同性に基づきデータベースを検索したところ、該配列にタンパク質相互作用活性を有するタンパク質に特異的な配列を見出し、これらのｃＤＮＡがコードするタンパク質がタンパク質相互作用活性を有するタンパク質であると同定した。また該ｃＤＮＡの各組織における発現量を解析し、さらに該ｃＤＮＡがコードするタンパク質を実際に発現させてその相互作用活性を解析した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００９】
すなわち本発明によれば、以下の（１）〜（１５）に記載の発明が提供される。
（１） 以下の （ａ） または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号５〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号５〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質。
【００１０】
（２） （１）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３） （１）に記載のタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ。
（４） 以下の （ａ）、（ｂ）または（ｃ）の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１１】
（５） （２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（６） （２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（５）に記載の組み換えベクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。
（７） （６）に記載の細胞により産生される、（１）に記載のタンパク質。
【００１２】
（８） （２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
【００１３】
（９） （１）または（７）に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメント。
（１０） 抗体がモノクローナル抗体である（９）に記載の抗体。
（１１） モノクローナル抗体が（１）または（７）に記載のタンパク質のタンパク質相互作用活性を中和する作用を有することを特徴とする（１０）に記載の抗体。
【００１４】
（１２） （１）または（７）に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。
（１３） （６）に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞に導入されているＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング方法。
（１４） （１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも１以上のアミノ配列情報、および／または（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列から選択される少なくとも１以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。
（１５） （１）に記載のタンパク質、および／または（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを結合させた担体。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１）完全長ｃＤＮＡの取得及び塩基配列の解析
本発明のＤＮＡは、以下の （ａ） 又は（ｂ）の何れかのＤＮＡである。
（ａ）配列番号５〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号５〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列または上記アミノ酸配列において、１若しくは数個（ここで言う数個の数は特には限定されないが、例えば２０個以下、好ましくは１５個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下を意味する）のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、若しくは逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードし得るＤＮＡ。
具体的には、該アミノ酸配列をコードする翻訳領域のみでも、あるいはそのｃＤＮＡの全長を含むものでもよい。
【００１６】
ｃＤＮＡの全長を含むＤＮＡとしては、例えば、配列番号１〜４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号１の塩基番号４３〜１７８８、配列番号２の塩基番号８４〜１８８３、配列番号３の塩基番号２０４〜１００４、配列番号４の塩基番号１１７〜２３８７に示される配列を有するものが挙げられる。さらに上記のｃＤＮＡの全長でなくても、上記翻訳領域とその３’及び／または５’端に隣接する、翻訳領域の発現に最低限必要な部分を含むもの等も本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１７】
本発明のＤＮＡは、これを取得できる方法であれば如何なる方法により取得したものでもよいが、具体的には、例えば次に述べる方法により取得することができる。まず、適当な動物、好ましくは哺乳動物の組織等からそれ自体既知の通常用いられる方法によりｍＲＮＡを調製する。次に、このｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成するが、このとき完全長のｃＤＮＡを合成するために５’キャップ（７ＭｅＧｐｐｐＮ）サイトに特異的なジオール構造にタグになる分子を化学結合させ、このｍＲＮＡを鋳型としてｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして逆転写した後に、タグ分子の機能を利用して完全長のｃＤＮＡのみを分離する方法（特開平９−２４８１８７号公報；特開平１０−１２７２９１号公報）を用いることが好ましい。また、逆転写の際には、鋳型が高次構造を形成して逆転写の効率が低下することを阻止するために、トレハロース等の存在下で、耐熱性逆転写酵素を用いて高温下で逆転写を行う方法（特開平１０−８４９６１号公報）を用いるのが好ましい。ここで、高温下とは４０〜８０℃を意味する。
【００１８】
このようにして取得されたｃＤＮＡは、これを適当なクローニングベクターに挿入してクローニングを行う。ここで用いられるベクターとしては、様々な鎖長のＤＮＡを一律にクローニングすることが可能な、クローニングサイトの両末端にリコンビナーゼ認識配列を有し、感染以外の方法で宿主に挿入される直鎖状のベクター（特開平１１−９２７３号公報）が好ましく用いられる。かくして得られるｃＤＮＡライブラリーは、全てのクローンが均一に存在している（以下、これを「カタログ化されている」と称することがある）訳ではなく、このライブラリー中に極微量にしか存在しないクローンこそ新規である確率が高い。そこで、このようなクローンを濃縮するためのサブトラクション法やノーマライゼーション法（特開２０００−３２５０８０号公報；Ｃａｒｎｉｎｃｉ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ３７， ３２７−３３６（１９９６））を用いることが好ましい。
【００１９】
カタログ化されたｃＤＮＡライブラリーは、それ自体既知の通常用いられる方法により塩基配列の解析を行う。本発明のＤＮＡは、ｃＤＮＡ全長の場合にはその末端１００ベースの配列について得られた塩基配列を、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を用いて、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ等のデータベースについて検索し、最も高い相同性を示す配列でも一致度が３０％以下であるものを新規として以下の解析に供することとした。
【００２０】
このような完全長ｃＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、前記した通り、配列番号１〜４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号１の塩基番号４３〜１７８８、配列番号２の塩基番号８４〜１８８３、配列番号３の塩基番号２０４〜１００４、配列番号４の塩基番号１１７〜２３８７に示される配列を有するものが挙げられる。
【００２１】
かくして取得された新規な塩基配列を、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５， ４０３−４１０（１９９０）） による相同性検索 （ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈ）や、ＨＭＭＥＲ（隠れＭａｒｋｏｖモデルによる配列解析手法； Ｅｄｄｙ， Ｓ． Ｒ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４， ７５５−７６３ （１９９８）） の機能群のひとつである ＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索 （ｐｒｏｆｉｌｅ ｓｅａｒｃｈ：ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）等を行うことにより、該塩基配列がコードするタンパク質の機能を推定することができる。
【００２２】
ＢＬＡＳＴによる相同性検索においては、検索の結果、得られた相同性が十分有意なヒット配列に付随する種々のアノテーション情報から、解析対象としているクローンの機能を推定することができる。ここで、十分有意なヒット配列とは、登録されているアミノ酸配列の機能ドメイン部分と本発明のＤＮＡがコードするアミノ酸配列のこれに対応する部分との一致度がｅ−ｖａｌｕｅとして１０−４以下のものか、あるいは３０％以上のものを示す。
【００２３】
例えば、上位にヒットした機能ドメイン配列の多くがタンパク質結合活性を確認されたものであるならば、それと配列上類似である解析対象クローンもまた同じ機能、即ち、タンパク質結合活性を持つであろうという予測が成り立つ。
【００２４】
ＨＭＭＰＦＡＭでは、Ｐｆａｍというタンパク質プロファイルを集積したデータベース中にあるエントリーが有する配列の特徴を、解析対象である配列が有するかどうかを洗い出す方法による解析が行われる。プロファイルは一連の同一特徴を持つタンパク質群から抽出されており、一配列対一配列の全長に亘る比較では明確化できない構造でも、配列中にその特徴領域があればこれを見出し、機能予測ができる。かくして行われるタンパク質の機能予測の具体的な例を以下に説明する。
【００２５】
配列番号１に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴサーチにより、Ｒａｔ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ＣＣＡ３， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．とｅ−ｖａｌｕｅ：０．０、５４２アミノ酸残基に亘り６１％の相同性を、またＲＣＣ１−ｌｉｋｅ Ｇ ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＲＬＧとｅ−ｖａｌｕｅ：４×１０−１２、１５２アミノ酸残基に亘り２６％の一致度でヒットする。
また、配列番号１に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行うと３８３〜４９９のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）が見出され、またａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ（Ｐｆａｍエントリーａｎｋ）も３ヶ所に見出される。
これらの結果より、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測される。さらに、このタンパク質は、文献情報（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９８ Ｎｏｖ １５；５４（１）：９９−１０６）からＲＣＣ１−ｒｅｌａｔｅｄ ＧＥＦ ｆａｍｉｌｙらしいことが推測される。
【００２６】
配列番号２に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴサーチにより、Ｒａｔ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ＣＣＡ３， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．とｅ−ｖａｌｕｅ：０．０、５６０アミノ酸残基に亘り６１％の一致度で、またＲＣＣ１−ｌｉｋｅ Ｇ ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＲＬＧと、ｅ−ｖａｌｕｅ：４×１０−１２、１５２アミノ酸残基に亘り２６％の一致度でヒットする。
また、配列番号２に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行うと４０１〜５１７のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）が見出され、またａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ（Ｐｆａｍエントリーａｎｋ）も３ヶ所に見出される。
これらの結果より、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測さる。さらに、このタンパク質は、文献情報（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９８ Ｎｏｖ １５；５４（１）：９９−１０６）からＲＣＣ１−ｒｅｌａｔｅｄ ＧＥＦ ｆａｍｉｌｙらしいことが推測される。
【００２７】
配列番号３に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴサーチにより、ｎｏｖｅｌ ＢＴＢ／ＰＯＺ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎとｅ−ｖａｌｕｅ：３×１０−９２、２３３アミノ酸残基に亘り７４％の一致度で、またＺｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １５１とｅ−ｖａｌｕｅ：８×１０−１５、２５５アミノ酸残基に亘り２７％の一致度でヒットする。
また、配列番号３に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行うと８〜１１７のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）が見出される。
これらの結果より、配列番号７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測される。さらに、このタンパク質は、文献情報（Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７；２２４：１３７−４６）からＭｙｃ蛋白質と相互作用することが推測される。
【００２８】
配列番号４に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴサーチにより、Ｕｎｋｎｏｗｎ （ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ＭＧＣ：１７３６８）とｅ−ｖａｌｕｅ：５×１０−１１０、２４８アミノ酸残基に亘り７８％の一致度で、またｍｙｏｎｅｕｒｉｎとｅ−ｖａｌｕｅ：３×１０−７１、６６５アミノ酸残基に亘り２８％の一致度でヒットする。
また、配列番号４に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行うと９〜１２１のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）が見出され、またＺｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ （Ｐｆａｍのｚｆ−Ｃ２Ｈ２エントリー）も７ヶ所で見出される。
これらの結果より、配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測された。さらに、このタンパク質は、文献情報（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０００ Ｊｕｎ ２４；２７３（１）：３８５−９１）から、様々な種で転写の活性化と抑制の両方に関わることが推測される。
【００２９】
本発明のＤＮＡは、翻訳配列中に塩基の欠失もしくは挿入を有した状態で取得されることがあるが、上記のような相同性検索やタンパク質特徴検索を行った結果、該ＤＮＡの塩基配列中の欠失もしくは挿入が推測された場合には、当業者において通常用いられているライブラリースクリーニングやＰＣＲクローニング等の方法を用いて塩基の欠失もしくは挿入の無い完全長ｃＤＮＡを取得することができる。かくして得られる完全長ｃＤＮＡを用いて本発明のタンパク質を発現させ、これを機能解析に用いることができる。
【００３０】
かくして取得され、塩基配列が決定され、また機能が推定される本発明のＤＮＡは、上記の配列番号１〜４に記載の塩基配列、あるいはその翻訳領域として上記に示した塩基配列を有するものだけでなく、これらの塩基配列において、１若しくは数個（ここで言う数個の数は特には限定されないが、例えば６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１０個以下、特に好ましくは５個以下を意味する。）の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに、これらＤＮＡあるいはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等も含まれる。
これらＤＮＡには前記したとおり、配列番号５〜８に記載のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。
【００３１】
ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列またはその相補配列とＢＬＡＳＴ解析で８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡ等が挙げられる。また、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃等で反応を行い、塩濃度が１５ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは１５ｍＭ〜６０ｍＭ等の洗浄液中で洗浄を行う方法に従って行うことができる。
【００３２】
さらに、本発明のＤＮＡは、上述の方法により取得されたものでも、また合成されたものでもよい。ＤＮＡの塩基配列の置換は、例えばサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット（宝酒造社製）や、クイックチェンジサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット（ストラタジーン社製）等の市販キットで容易に行うことができる。
【００３３】
また、配列番号１〜４に記載の塩基配列は、マウスを由来とするものであるが、上記したｃＤＮＡライブラリーの作製法に従ってヒトのｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ライブラリーに対して配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしたハイブリダイゼーションを行うことにより、配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列がコードするタンパク質のヒトのホモログタンパク質をコードするＤＮＡを取得することもできる。本発明の配列番号１〜４のいずれかに記載のＤＮＡあるいはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡには、このようなヒトのホモログＤＮＡや下述するヒトのオルソログＤＮＡも含まれる。
【００３４】
また、インフォマティックスを利用して、ヒトホモログＤＮＡが有する塩基配列を予測し、該塩基配列を基に上記のヒトｃＤＮＡライブラリーなどからヒトホモログＤＮＡを取得することもできる。
【００３５】
一般的に、インフォマティックスを利用して目的とするタンパク質のホモログタンパク質をコードする塩基配列を予測する方法としては、例えば、（ｉ）目的とするｃＤＮＡの塩基配列をクエリーとして、ヒト等のｃＤＮＡデータベース（インフォマティックスにより予測されるｃＤＮＡデータベースを含む）に対しＢＬＡＳＴなどを用いて相同性検索を行う方法や、（ｉｉ）目的とするｃＤＮＡの塩基配列をクエリーとしてヒト等のＥＳＴデータベースに対しＢＬＡＳＴなどを用いて相同性検索を行い、ヒットしたＥＳＴが有する配列を目的とするｃＤＮＡの塩基配列を参照して連結する方法、さらに（ｉｉｉ）目的とするｃＤＮＡの塩基配列をクエリーとして、ヒトなどのゲノムデータベースに対しＢＬＡＳＴなどを用いて相同性検索を行い、目的とするｃＤＮＡの遺伝子が存在するゲノム上の位置を特定し、そのゲノム領域に対してＧｅｎｓｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ ｇｅｎｅｓ． ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）やＳｉｍ４（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， ８： ９７６−７４ （１９９８））等を用いて、該ゲノム中の遺伝子部分の塩基配列を予測する方法等が挙げられる。
【００３６】
マウス由来ｃＤＮＡのヒトホモログＤＮＡの塩基配列を予測する場合、上記の方法のいずれも用いることができるが、本発明の配列番号１〜４に記載の塩基配列を有するｃＤＮＡはいずれも新規であり、上記（ｉ）の方法では、ヒトホモログＤＮＡの塩基配列を取得できないと考えられるため、（ｉｉ）あるいは（ｉｉｉ）に記載の方法などを用いるのが好ましい。
【００３７】
かくして予測されたヒトホモログＤＮＡの塩基配列を基に、上記のヒトｃＤＮＡライブラリーから、配列番号１〜４に記載の塩基配列がコードするタンパク質のヒトのホモログタンパク質をコードするＤＮＡを取得することもできる。具体的な取得方法としては、例えば、予測されたヒトホモログＤＮＡの５’端および３’端の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを用いて、上記ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行う方法や、予測されたヒトホモログＤＮＡの一部の配列をプローブとして、上記ヒトｃＤＮＡライブラリーに対してハイブリダイゼーションを行う方法等が挙げられる。
【００３８】
一般的に、目的遺伝子が有する塩基配列とホモロジーの高い塩基配列を有する類似遺伝子を「ホモログ」と呼び、上記の方法においてもヒトホモログの取得を目的としているが、遺伝子の機能解析においては、塩基配列が類似していることだけではなく、ホモログとして取得された遺伝子が、目的遺伝子のファミリーメンバーであることを確認することが重要である。２種類の生物間で「ホモログ」として取得された遺伝子は、共通の祖先遺伝子から進化した同一の遺伝子である「オルソログ」である可能性と、また、共通の祖先遺伝子からの重複によって生じた異なる遺伝子である「パラログ」である可能性がある。
【００３９】
つまり、上記でホモログとして取得されたヒト由来のＤＮＡは、これを、本発明のタンパク質と同一の機能を有すると解するには、また、該ヒト由来のＤＮＡがコードするタンパク質の機能を、本発明のタンパク質のマウスにおける機能として推定検証するには、上記ヒトホモログが本発明のマウス遺伝子の近縁種のオルソログであることを確認することが好ましい。
【００４０】
オルソログであることの確認方法は、例えば、以下の方法などが用いられる。（ｉ）まず、本発明のｃＤＮＡの塩基配列と、取得されたヒトホモログＤＮＡの塩基配列について相同性を解析する。次に、本発明のｃＤＮＡの塩基配列をクエリーとして、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋなどの国際塩基配列データベースや、特許データベースに含まれるヒト塩基配列について相同性検索を行い、取得されたヒトホモログＤＮＡの塩基配列とクエリーの塩基配列の一致度が、データベースから得られた塩基配列とクエリーの塩基配列の一致度より高いことを確認する。さらに、（ｉｉ）取得されたヒトホモログＤＮＡの塩基配列と、対応する本発明のｃＤＮＡの塩基配列について相同性を解析する。次に、取得されたヒトホモログＤＮＡの塩基配列をクエリーとして、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋなどの国際塩基配列データベースや、特許データベースに含まれるマウス塩基配列について相同性検索を行い、本発明のｃＤＮＡの塩基配列とクエリーの塩基配列の一致度が、データベースから得られた塩基配列とクエリーの塩基配列との一致度より高いことを確認する。上記（ｉ）および（ｉｉ）を確認することにより、取得されたヒトホモログが、本発明のｃＤＮＡに対応するヒトオルソログであると同定することができる。上記（ｉ）および（ｉｉ）に記載した相同性の解析はアミノ酸配列の比較を用いても良く、また、分子進化系統樹を描いて検討することもできる。また、上記（ｉ）および（ｉｉ）に記載した相同性解析による一致度は、クエリーの全長にわたる一致度として解析することが好ましい。
【００４１】
かくして取得されたヒトホモログＤＮＡあるいはオルソログＤＮＡの塩基配列を、ＢＬＡＳＴによる相同性検索やＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索等を行うことにより、該塩基配列がコードするタンパク質の機能を推定することができる。
【００４２】
かくして得られる完全長ｃＤＮＡを用いて本発明のタンパク質を発現させ、これを活性の確認および機能解析等に用いることができる。また、本発明のＤＮＡによりコードされるタンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用活性（タンパク質結合活性）を有するものであり、細胞内蛋白質相互作用ネットワークを解明するためのツールとして、またこれらタンパク質の異常に起因する疾患の治療薬開発の標的タンパク質として有用である。
【００４３】
（２）新規ｃＤＮＡがコードするタンパク質
本発明のＤＮＡがコードするタンパク質の翻訳領域は、例えば、該ＤＮＡが有する塩基配列について３種類の読み枠によりアミノ酸に変換していき、最も長いポリペプチドをコードする範囲を本発明の翻訳領域としてそのアミノ酸配列を決定すること等ができる。このようなアミノ酸配列として、例えば、配列番号５〜８に記載のもの等が挙げられる。また、本発明のタンパク質は、上記のアミノ酸配列に限られるものではなく、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンパク質結合活性を有するものも含まれる。
【００４４】
本発明のタンパク質の取得方法としては、上記（１）に記載の本発明のＤＮＡを適当な方法により転写／翻訳する方法が好ましく用いられる。具体的には、適当な発現用ベクター若しくは適当なベクターに、適当なプロモーターとともに挿入した組換えベクターを作製し、この組換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換したり、適当な培養細胞に導入することにより発現させ、これを精製することにより取得することができる。
【００４５】
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には遊離体、又は他の塩に変換することができる。この様な本発明のタンパク質の塩も本発明のタンパク質に含まれる。また、上記形質転換体が産生するタンパク質を、精製前、又は後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾タンパク質とすることができる。これらの修飾タンパク質もタンパク質結合活性を有するものであれば本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
本発明のタンパク質の産生を行う際、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターの作製に用いるベクターとしては、形質転換体内で該ＤＮＡが発現されるものであれば特に制限はなく、プラスミドベクター、ファージベクターのいずれでもよい。これらのうち通常は、該ＤＮＡが導入される宿主に適したプロモーター等の発現制御領域ＤＮＡが既に挿入されている市販のタンパク質発現用ベクターを用いる。このようなタンパク質発現用ベクターとして、具体的には、例えば、宿主が大腸菌の場合では、ｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（ストラタジーン社製）ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられ、酵母の場合ではｐＥＳＰ−Ｉエクスプレッションベクター（ストラタジーン社製）等が挙げられ、さらに昆虫細胞の場合ではＢａｃＰＡＫ６（クロンテック社製）等が挙げられる。また宿主が動物細胞の場合では、例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられる。
【００４７】
発現制御領域が挿入されていないベクターを用いる場合には、発現制御領域として少なくともプロモーターを挿入する必要がある。ここでプロモーターとしては、宿主微生物、または培養細胞が保有するプロモーターを用いることができるが、これに限られるものではなく、具体的には、例えば、宿主が大腸菌の場合にはＴ３、Ｔ７、ｔａｃ、ｌａｃプロモーター等を用いることができ、酵母の場合には、例えば、ｎｍｔ１プロモーター、Ｇａｌ１プロモーター等を用いることができる。また宿主が動物細胞の場合にはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が好ましく用いられる。
【００４８】
また哺乳動物由来のプロモーターが機能可能な宿主を用いる場合には、本発明の遺伝子に固有のプロモーターを用いることもできる。これらのベクターへの本発明のＤＮＡの挿入は、該ＤＮＡまたはこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流に該遺伝子ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を連結して行えばよい。
【００４９】
このようにして作製した組換えベクターは、それ自体既知の方法により後述する宿主を形質転換して、ＤＮＡ導入体を作製することができる。宿主への該ベクターの導入方法として、具体的には、ヒートショック法（Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５４， （１９７０））、リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１，５５１， （１９８３））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５，１６６，（１９８２））、インビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２，５８１，（１９７５））、ウィルスベクター法（Ｃｅｌｌ，３７，１０５３，（１９８４））、および電気パルス法（Ｃｈｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５，１３３１（１９８７））等が挙げられる。
【００５０】
ＤＮＡ導入体を作製するための宿主としては、本発明のＤＮＡが体内で発現するものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）−昆虫細胞、あるいは動物細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではＢＬ２１、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）等、酵母ではＳＰ−Ｑ０１（ストラタジーン社製）等、バキュロウィルスではＡｃＮＰＶ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４０６，（１９８８））とその宿主であるＳｆ−９細胞（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４０６，（１９８８））等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞Ｃ１２７（Ｊ．Ｖｉｏｌ．，２６，２９１，（１９７８））やチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７７，４２１６， （１９８０））等が挙げられるが、発現量やスクリーニングの簡便さから好ましくはアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１：アメリカン タイプ カルチャー コレクション保存細胞）ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）またはヒト子宮頸部癌ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）が用いられる。
【００５１】
上記したようなタンパク質発現用ベクターを用いる発現方法の他に、プロモーターを連結した本発明のＤＮＡ断片を宿主微生物の染色体中に直接挿入する相同組換え技術（Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７，２０３６，（１９９３））、あるいはトランスポゾンや挿入配列（Ａ．Ａ． Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ． ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１，７３９， （１９９４））等を用いてＤＮＡ導入体を作製することもできる。
【００５２】
得られた培養物は細胞、あるいは菌体を遠心分離等の方法により収集し、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム、および／または凍結融解等のそれ自体既知の適当な方法により破壊した後、遠心分離や濾過等によりタンパク質粗精製液を得、さらに適当な精製方法を組み合わせることにより精製することができる。かくして、本発明のタンパク質が取得される。上記したタンパク質発現組換えベクターを用いる発現方法の他に、上記（１）で取得された本発明のＤＮＡを無細胞転写翻訳系に供することによりタンパク質発現を誘導し、本発明のタンパク質を取得することができる。本発明で用いられる無細胞転写翻訳系とは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写、およびｍＲＮＡからタンパク質への翻訳に必要な全ての要素を含む系であり、そこにＤＮＡを加えることによってそのＤＮＡがコードしているタンパク質が合成されるようなあらゆる系を指す。無細胞転写翻訳系の具体例としては、真核細胞、およびバクテリア細胞、又はそれらの一部からの抽出液に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられ、特に好ましい具体例としては、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽、大腸菌からの抽出液（大腸菌Ｓ３０抽出液）に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられる。
【００５３】
得られた無細胞転写翻訳系の転写翻訳産物からの、本発明のタンパク質の分離、および精製は、それ自体既知の通常用いられる方法で行うことができる。具体的には、例えばエピトープペプチド、ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質等をコードするＤＮＡ領域を、前記した転写翻訳されるべきＤＮＡに導入し、前記の通り発現させ、該タンパク質と親和性を有する物質とのアフィニティーを利用して精製することができる。
【００５４】
目的とするタンパク質の発現は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等で分離し、クマシーブリリアントブルー（シグマ社製）等で染色するか、または後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体により検出する方法等によって確認できる。また一般的に、発現されたタンパク質は生体内に存在するタンパク質分解酵素により切断されること（プロセッシング）が知られている。本発明のタンパク質も当然のことながら切断されたアミノ酸配列の部分断片であっても、タンパク質結合活性を有するものであれば、本発明のタンパク質に含まれる。
【００５５】
かくして得られたタンパク質は、他のタンパク質、ＤＮＡとの相互作用等を解析することにより、生体内における多面的な機能を知ることができる。上記相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法等が挙げられる。
【００５６】
（３）オリゴヌクレオチドの調製
上記（１）に記載の方法で取得した本発明のＤＮＡまたはその断片を用いて、ＤＮＡ合成機などを用いる常法により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。
【００５７】
該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。具体例としては、配列番号１で表される塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記のオリゴヌクレオチドが好ましい。また、配列の長さは、一般的には５〜１００塩基であり、好ましくは１０〜６０塩基であり、より好ましくは１５〜５０塩基である。
【００５８】
また、これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等を挙げることができる。
【００５９】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、これを２本鎖ＲＮＡとして調製し、被導入体へ導入し、標的遺伝子の発現を阻害するＲＮＡインターフェアレンス法に用いることができる。ＲＮＡインターフェアレンス法については、例えば、（Ｅｌｂａｓｈｉｒ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ４９４−４９８（２００１））に記載の方法等を用いることができる。また、上記２本鎖ＲＮＡは必ずしも全てがＲＮＡである必要はなく、例えば、ＷＯ０２／１０３７４号公報に記載のもの等も用いることができる。
【００６０】
ここで、標的遺伝子としては、本発明のＤＮＡであれば、如何なるものであってもよい。これらＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一な配列からなる２本鎖ＲＮＡ（以下、これを「２本鎖ポリヌクレオチド」と称することがある）とは、標的遺伝子の塩基配列のうち、いずれの部分でもよい１５ｂｐ以上の配列と実質的に同一な配列からなるものである。ここで、実質的に同一とは、標的遺伝子の配列と８０％以上の相同性を有することを意味する。ヌクレオチドの鎖長は１５ｂｐから標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長までの如何なる長さでもよいが、１５〜５００ｂｐ程度のものが好ましく用いられる。ただし、哺乳類動物由来の細胞おいては、３０ｂｐ以上の長い２本鎖ＲＮＡに反応して活性化するシグナル伝達系の存在が知られている。これはインターフェロン反応と呼ばれており（Ｍａｒｅｕｓ， Ｐ． Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ， ５， １１５−１８０（１９８３））、該２本鎖ＲＮＡが細胞内に侵入すると、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ：Ｂａｓｓ， Ｂ．Ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ４２８−４２９（２００１））を介して多くの遺伝子の翻訳開始が非特異的に阻害され、それと同時に２’，５’ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｂａｓｓ， Ｂ．Ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ４２８−４２９（２００１））を介してＲＮａｓｅＬの活性化が起こり、細胞内のＲＮＡの非特異的な分解が惹起される。これらの非特異的な反応のために、標的遺伝子の特異的反応が隠蔽されてしまう。従って哺乳類動物、または該動物由来の細胞、あるいは組織を被導入体として用いる場合には１５〜３０ｂｐ、好ましくは１９〜２４ｂｐ、最も好ましくは２１ｂｐの２本鎖ポリヌクレオチドを用いることが好ましい。２本鎖ポリヌクレオチドはその全体が２本鎖である必要はなく、５’または３’末端が一部突出したものも含むが、３’末端が２塩基突出したものを用いることが好ましい。２本鎖ポリヌクレオチドは相補性を有する２本鎖のポリヌクレオチドを意味するが、自己相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドが自己アニーリングしたものでもよい。自己相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドとしては、例えば、逆方向反復配列を有するもの等が挙げられる。
【００６１】
２本鎖ポリヌクレオチドの調製方法としては、特に制限はないが、それ自体既知の化学合成方法を用いることが好ましい。化学合成は、相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドを別個に合成し、これを適当な方法で会合させることにより２本鎖とすることができる。会合の方法として具体的には、例えば、合成した１本鎖ポリヌクレオチドを混合し、２本鎖が解離する温度にまで加熱し、その後徐々に冷却する方法等が挙げられる。会合した２本鎖ポリヌクレオチドは、アガロースゲル等を用いて確認し、残存する１本鎖ポリヌクレオチドを適当な酵素により分解する等して除去する。
【００６２】
このようにして調製した２本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写、またはタンパク質に翻訳を受け得るものであれば如何なるものであってもよいが、具体的には、植物、動物、原生動物、ウィルス、バクテリア、または真菌種に属するものが挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってよい。好ましい微生物は、農業または工業で使用されるものであり、そして植物または動物に対して病原性のものである。真菌には、カビ及び酵母形態両方での生物体が含まれる。脊椎動物の例には、魚類、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット及びヒトを含む哺乳動物が含まれ、無脊椎動物には、線虫類及び他の虫類、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、及び他の昆虫が含まれる。好ましくは、細胞は脊椎動物細胞である。
【００６３】
被導入体は、細胞、組織、あるいは個体を意味する。ここで細胞とは、生殖系列または体性、分化全能、または多分化能、分割または非分割、実質組織または上皮、不滅化したものまたは形質転換したもの等からであってよい。細胞は、配偶子または胚であってよく、胚の場合、単一細胞胚または構成性細胞、または多重細胞胚からの細胞であり、胎児組織を含む。さらには、幹細胞のような未分化細胞、または胎児組織を含む器官または組織の細胞からのような分化細胞、または生物内に存在する任意の他の細胞であってよい。分化している細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌腺または外分泌腺の細胞が含まれる。
【００６４】
被導入体への２本鎖ポリヌクレオチドの導入法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、２本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウィスル感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、非経口（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウィルス感染等が用いられる。経口導入のための方法には、２本鎖ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合することができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、２本鎖ポリヌクレオチドを導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。
【００６５】
導入する２本鎖ポリヌクレオチドの量は、導入体や、標的遺伝子によって適宜選択することができるが、細胞あたり少なくとも１コピー導入されるに充分量を導入することが好ましい。具体的には、例えば、被導入体がヒト培養細胞で、カルシウムフォスフェート法により２本鎖ポリヌクレオチドを導入する場合、０．１〜１０００ｎＭが好ましい。
ＲＮＡインターフェアレンスによる本発明の遺伝子の導入体内での発現抑制により、本発明の遺伝子がコードするタンパク質の機能の確認、あるいは新たな機能の解析等を行うことができる。
【００６６】
（４）本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体
本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体の調製方法としては、通常用いられる公知の方法を用いることができ、抗原として用いられるポリペプチドについても、公知の方法に従って抗原性が高くエピトープ（抗原決定基）として適した配列を選択して用いることができる。エピトープの選択方法としては、例えばＥｐｉｔｏｐｅ Ａｄｖｉｓｅｒ（富士通九州システムエンジニアリング社製）等の市販のソフトウェアを用いることができる。
【００６７】
上記の抗原として用いるポリペプチドは、公知の方法に従って合成した合成ペプチドでも、また本発明のタンパク質そのものを用いることもできる。抗原となるポリペプチドは、公知の方法に従って適当な溶液等に調製して、哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ラット等に免疫を行えばよいが、安定的な免疫を行ったり抗体価を高めるために抗原ペプチドを適当なキャリアタンパク質とのコンジュゲートにして用いたり、アジュバント等を加えて免疫を行うのが好ましい。
【００６８】
免疫に際しての抗原の投与経路は特に限定されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、あるいは筋肉内等のいずれの経路を用いてもよい。具体的には、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスに抗原ポリペプチドを数日〜数週間おきに数回接種する方法等が用いられる。また、抗原の摂取量としては、抗原がポリペプチドの場合０．３〜０．５ｍｇ／１回程度が好ましいが、ポリペプチドの種類、また免疫する動物種によっては適宜調節される。
【００６９】
免疫後、適宜試験的に採血を行って固相酵素免疫検定法（以下、これを「ＥＬＩＳＡ法」と称することがある）やウエスタンブロッティング等の方法で抗体価の上昇を確認し、十分に抗体価の上昇した動物から採血を行う。これに抗体の調製に用いられる適当な処理を行えばポリクローナル抗体を得ることができる。具体的には、例えば、公知の方法に従い血清から抗体成分を精製した精製抗体を取得する方法等が挙げられる。抗体成分の精製は、遠析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いることができる。
【００７０】
また、該動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを用いて公知の方法に従って融合させたハイブリドーマを用いる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６， ４９５（１９７５））ことによりモノクローナル抗体を作製することもできる。モノクローナル抗体は、例えば以下の方法により取得することができる。
【００７１】
まず、上記した抗原の免疫により抗体価の高まった動物から抗体産生細胞を取得する。抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体の何れから取得してもよいが、好ましくは脾臓、リンパ節、末梢血等から取得する。これらの細胞と融合させるミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来等）ミエローマ細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８０）、Ｐ３−ＮＳ１／１Ａｇ４．１（理研セルバンク：ＲＣＢ００９５）等が好ましく用いられる。細胞の融合は、抗体産生細胞とミエローマ細胞を適当な割合で混合し、適当な細胞融合培地、例えばＲＰＭＩ１６４０やイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、あるいはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等に、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を溶解したもの等を用いることにより行うことができる。また電気融合法（Ｕ． Ｚｉｍｍｅｒ− ｍａｎｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ，６８， ５７７（１９８１））によっても行うことができる。
【００７２】
ハイブリドーマは、用いたミエローマ細胞株が８−アザグアニン耐性株であることを利用して適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液を含む正常培地（ＨＡＴ培地）中で５％ＣＯ２、３７℃で適当時間培養することにより選択することができる。この選択方法は用いるミエローマ細胞株によって適宜選択して用いることができる。選択されたハイブリドーマが産生する抗体の抗体価を上記した方法により解析し、抗体価の高い抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等により分離し、分離した融合細胞を適当な培地で培養して得られる培養上清から硫安分画、アフィニティクロマトググラフィー等の適当な方法により精製してモノクローナル抗体を得ることができる。また精製には市販のモノクローナル抗体精製キットを用いることもできる。さらには、免疫した動物と同系統の動物、またはヌードマウス等の腹腔内で上記で得られた抗体産生ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることもできる。
【００７３】
また、本発明のタンパク質としてヒト由来のものを取得した場合には、かかるポリペプチド、あるいはその部分ペプチドを抗原として、ヒト末梢血リンパ球を移植したＳｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに上記した方法と同様にして免疫し、該免疫動物の抗体産生細胞とヒトのミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製することによってもヒト型抗体を作製することができる（Ｍｏｓｉｅｒ， Ｄ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ３３５， ２５６−２５９ （１９８８）； Ｄｕｃｈｏｓａｌ， Ｍ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５５， ２５８−２６２ （１９９２））。
【００７４】
また、取得したヒト型抗体を産生するハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、目的のヒト型抗体をコードする遺伝子をクローニングして、この遺伝子を適当なベクターに挿入し、これを適当な宿主に導入して発現させることにより、さらに大量にヒト型抗体を作製することができる。ここで、抗原との結合性の低い抗体は、それ自体既知の進化工学的手法を用いることによりさらに結合性の高い抗体として取得することもできる。一価性抗体等の部分フラグメントは、例えばパパイン等を用いてＦａｂ部分とＦｃ部分を切断し、アフィニティカラム等を用いてＦａｂ部分を回収することによって作製することができる。
【００７５】
かくして得られる本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体は、本発明のタンパク質に特異的に結合することによって該タンパク質が有するタンパク質結合活性を阻害する中和抗体として用いることもできる。タンパク質が有する活性を阻害するものの選択方法としては特に制限はないが、例えば、上記（２）で作製したＤＮＡ導入体に抗体を接触させ、導入体中の目的タンパク質の機能が阻害されるか否かを解析する方法等が挙げられる。
【００７６】
かかる中和抗体は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【００７７】
（５）本発明のタンパク質が有する活性の確認および機能の解析
本発明のタンパク質は、これを上記（２）のとおり組み換えタンパク質として作製し、これを解析することにより上記（１）で推測した活性を有していることを確認することができる。さらに上記（４）のとおりに作製した抗体等との組み合わせにより解析することもできる。
タンパク質−タンパク質結合活性の確認は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ とタンパク質−タンパク質結合アッセイによって次の通り行うことができる （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５， ７８９４−７９０１ （２０００））。
結合活性を測定しようとする該タンパク質をＡとし、その相手をＢとする。Ａの完全長ｃＤＮＡとＢの完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＧＥＭ−ＡとプラスミドｐＧＳＴ−Ｂ （Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２１， ２０８−２１４ （１９９６）） を、Ｐｒｏｍｅｇａ社ＴＮＴ ＳＰ６ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ｓｙｓｔｅｍによるｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎとｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎに用いる。そのとき、［３５Ｓ］ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ （Ａｍｅｒｓｈａｍ社） ４０μＣｉを全容量５０μｌに加えることにより、放射性物質標識することができる。
【００７８】
翻訳産物はｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質−タンパク質結合に供する。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合に関しては、例えば、５０μｌの［３５Ｓ］ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅラベルしたタンパク質Ａを、ＧＳＴとＢの融合タンパク質ＧＳＴ−Ｂ ４−５μｇを含むグルタチオン樹脂でインキュベートする。
反応は、ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ （１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０，５０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ （ｐＨ ７．５））、１ ｍＭ ＰＭＳＦ、タンパク質分解酵素阻害剤を用いて、４ ℃、４時間、緩やかに揺することで行うことができる。
【００７９】
樹脂表面に形成されたタンパク質−タンパク質複合体は、４ ℃で、１４，０００ ｒｐｍ １分間超遠心分離し、樹脂は４ ℃で１ ｍｌのｃｏｌｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄する。樹脂に結合したＧＳＴ融合タンパク質Ｂと結合したタンパク質Ａは、ＳＤＳ−１２％ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ上で分離され，ｇｅｌを乾燥した後、ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙを実施することにより、タンパク質ＡとＢの結合活性を検討することができる。
これらの機能アッセイ系は、後述する本発明のタンパク質の機能賦活物質や機能阻害物質のスクリーニングや本発明のタンパク質の発現調節物質のスクリーニングにも用いることができる。なお、本発明のタンパク質が有する活性の確認はこれらの方法に限定されない。
【００８０】
本発明のタンパク質の機能解析方法として、一般的には、例えば、（ｉ）各組織、疾患、あるいは発生段階における発現状態を比較解析する方法、（ｉｉ）他のタンパク質、ＤＮＡとの相互作用を解析する方法、（ｉｉｉ）適当な細胞あるいは個体へ導入し、表現型の変化を解析する方法、（ｉｖ）適当な細胞あるいは個体において該タンパク質の発現を阻害して表現型の変化を解析する方法などが挙げられる。また、このような方法によれば、対象タンパク質に特異的な活性を多面的に解析することができる。
【００８１】
上記（ｉ）の方法においては、本発明のタンパク質の発現を、ｍＲＮＡレベルあるいはタンパク質レベルで解析することができる。ｍＲＮＡレベルで発現量を解析する場合は、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．， Ｅｄ． ｂｙ Ｈａｒｒｉｓ， Ｎ． ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ， Ｄ． Ｇ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９０））、ＤＮＡチップを利用したハイブリダイゼーション法、定量ＰＣＲ法等が用いられる。また、タンパク質レベルで解析する場合には、後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法や組織染色法などが挙げられる。ここで、解析の対象タンパク質に公知のバリアントが存在する場合には、解析対象タンパク質をコードするｃＤＮＡにのみ存在し、公知のバリアントをコードするｃＤＮＡとはハイブリダイズしないプローブを用いることが好ましい。定量ＰＣＲ法の場合には、対象ｃＤＮＡと公知バリアント間で異なる長さの増幅断片ができるプライマーを選択して行う方法（Ｗｏｎｇ， Ｙ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔ．， ３２０： １４１−１４５ （２００２））等が挙げられる。また、タンパク質レベルで解析する場合にも、対象タンパク質にのみ反応し、公知のバリアントには反応しない抗体を用いることが好ましい。
【００８２】
上記（ｉｉ）の方法においては、本発明のタンパク質と既知のタンパク質との相互作用の有無を調べて、本発明のタンパク質の機能を解析することができる。相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法等が挙げられる。該方法においても、解析対象タンパク質に公知のバリアントが存在する場合には、公知のバリアントも同様にして相互作用する物質を解析し、対象タンパク質特異的に相互作用する物質を同定することが好ましい。
【００８３】
上記（ｉｉｉ）の方法では、本発明のｃＤＮＡを導入する細胞は特に制限はないが、ヒト培養細胞等が特に好ましく用いられる。ＤＮＡの細胞への導入法としては、上記（２）に記載のものが挙げられる。さらに導入細胞の表現型としては、細胞の生死、細胞の増殖速度、細胞の分化、細胞が神経細胞の場合には神経突起の伸長度、細胞内タンパク質の局在や移行など顕微鏡等で観察可能なものや、細胞内の特定タンパク質の発現変化など生化学的実験により解析可能なものも含む。これらの表現型は、対象タンパク質に公知のバリアントが存在する場合には、本発明のＤＮＡあるいは公知のバリアントをコードするＤＮＡを同様に細胞へ導入し、比較解析することにより、対象タンパク質が関連する表現型を同定することができる。また、本発明のタンパク質はタンパク質結合活性を有するものであることがわかっているので、タンパク質結合活性が関連する疾患に見られる表現型等に注目して解析することも好ましい。
【００８４】
上記（ｉｖ）の方法では、後述するオリゴヌクレオチドを用いた方法や、ＲＮＡインターフェアレンス法により効率的に行うことができる。この方法においても、解析する対象タンパク質に、公知のバリアントが存在する場合には、公知のバリアントやその他のバリアントについても同様の解析を行い、比較解析することにより対象タンパク質特異的な機能を同定することができる。
【００８５】
（６）本発明のタンパク質が有する活性を調節する分子のスクリーニング
本発明のタンパク質に特異的に結合し、かつ本発明のタンパク質の機能（活性）を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質をスクリーニングすることにより本発明のタンパク質の機能調節物質（以下、これを「調節物質」と称することがある）を得ることができる。
【００８６】
この調節物質のスクリーニング方法は、本発明のタンパク質に特異的に結合し、且つ該タンパク質の活性を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質が得られる方法であれば如何なるものであってもよい。例えば、まず本発明のタンパク質と被検物質とを接触させ、該タンパク質との結合性を指標として選抜した後に、本発明のタンパク質が有する活性の変化を指標として被検物質を選抜する方法を用いることができる。
【００８７】
被検物質としては、本発明のタンパク質と相互作用して、該タンパク質が有する活性に影響を及ぼす可能性のある物質であれば如何なるものであってもよいが、具体的には、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。これらの物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。被検物質と本発明のタンパク質の相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法、免疫沈降法、プルダウンアッセイ、あるいは上記（４）に記載した抗体との競合解析法等が挙げられる。このような方法により、本発明のタンパク質に結合する活性を見いだされた物質は、次に該物質の存在下で本発明のタンパク質が有する活性がどのような影響を受けるかを解析することによって、調節物質として用いられるか否かが同定される。
【００８８】
ここで、医薬活性成分のスクリーニングを目的とするために用いる本発明のＤＮＡあるいは組み換えタンパク質については、上記したヒトのホモログタンパク質またはオルソログタンパク質を用いることが好ましい。さらに上記方法によってスクリーニングされた物質は、これらの生体内でのスクリーニングによって医薬候補としての選択を行ってもよい。
【００８９】
そこで、本スクリーニング方法により同定できる化合物は、例えば、循環器疾患、精神・神経疾患、代謝性疾患、癌、免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患等の治療剤として用いられ得るものである。
【００９０】
かかる調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【００９１】
（７）本発明のＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング
スクリーニングの方法としては、被検物質の存在下で本発明のタンパク質、あるいはそれをコードするｍＲＮＡの発現量を解析する方法等が挙げられる。具体的には、例えば、上記（２）に記載した本発明のタンパク質を発現する細胞を被検物質を含む適当な培地で培養し、該細胞内に発現している本発明のタンパク質量をＥＬＩＳＡ等の常法を用いて解析するか、あるいは該細胞内の本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を、定量的逆転写ＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等により解析することにより行うことができる。
【００９２】
被検物質としては、上記（６）に記載の物質を用いることができる。この解析により、被検物質の非存在下で培養された当該細胞内で発現されたタンパク質、あるいはｍＲＮＡ量と比べてその量が増加すれば、物質は本発明のＤＮＡの発現促進物質として機能する可能性があり、逆に減少した場合には、物質は本発明のＤＮＡの発現阻害物質として用いられ得ると判断することができる。
【００９３】
かかる発現調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【００９４】
（８）本発明のＤＮＡ導入動物
上記（１）に記載の、本発明のＤＮＡを含む導入ＤＮＡを構築し、ヒト以外の哺乳動物の受精卵に導入して、これを雌個体子宮に移植して発生させることにより、本発明のＤＮＡが導入された非ヒト哺乳動物を作製することができる。より具体的には、例えば、雌個体をホルモン投与により過剰排卵させた後、雄と交配し、交配後１日目の卵管から受精卵を摘出し、該受精卵に導入ＤＮＡをマイクロインジェクション等の方法により導入する。この後、適当な方法で培養した後、生存している受精卵を、偽妊娠させた雌個体（仮親）の子宮に移植して出産させる。新生仔に目的のＤＮＡが導入されているか否かは、該個体の細胞から抽出したＤＮＡのサザンブロット解析を行うことにより同定することができる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられる。
【００９５】
かくして得られた本発明のＤＮＡ導入動物は、この個体を交配し、導入されたＤＮＡが安定的に保持されていることを確認しながら通常の飼育環境で継代飼育することによりその子孫を得ることができる。また、体外受精を繰り返すことによりその子孫を得て、系統を維持することもできる。
本発明のＤＮＡが導入された非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの生体内における機能の解析や、またこれを調節する物質のスクリーニング系等として用いることができる。
【００９６】
（９）本発明のタンパク質及びそれをコードする塩基配列を含むＤＮＡの他の利用
本発明のタンパク質は、それを基盤上に結合させた担体として利用することができる。また、本発明のタンパク質をコードする塩基配列、例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ及びその部分断片は、それらを基板上に結合させた担体として用いることができる。これらを、以下、「プロテインチップ」、「ＤＮＡチップ」または「ＤＮＡアレイ」（ＤＮＡマイクロアレイ及びＤＮＡマクロアレイ）と称することがある。これらのプロテインチップ、又はＤＮＡチップもしくはアレイには、本発明のタンパク質やＤＮＡ以外に、他のタンパク質やＤＮＡが含まれていてもよい。
【００９７】
ここで、タンパク質やＤＮＡを結合させる基盤としては、ナイロン膜、ポリプロピレン膜等の樹脂基板、ニトロセルロース膜、ガラスプレート、シリコンプレート等が用いられるが、ハイブリダイゼーションの検出を非ＲＩ的に、例えば、蛍光物質等を用いて行う場合には、蛍光物質を含まないガラスプレート、シリコンプレート等が好適に用いられる。また該基盤へのタンパク質、あるいはＤＮＡの結合は、それ自体公知の通常用いられる方法により容易に行うことができる。これらのプロテインチップ、ＤＮＡチップ、あるいはＤＮＡアレイも、本発明の範囲に含まれる。
【００９８】
また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列及びＤＮＡの塩基配列は、配列情報としても用いることができる。ここで、ＤＮＡの塩基配列には、対応するＲＮＡの塩基配列も含まれる。すなわち、得られたアミノ酸配列や塩基配列をコンピュータが読みとり可能な所定の形式で適当な記録媒体に格納することにより、アミノ酸配列や塩基配列のデータベースが構築できる。このデータベースには、他の種類のタンパク質やそれをコードするＤＮＡの塩基配列が含まれていてもよい。また、本発明においてデータベースとは、上記配列を適当な記録媒体に書き込み、所定のプログラムに従って検索を行うコンピュータシステムをも意味する。ここで適当な記録媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ等の光ディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。
【００９９】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１ ｃＤＮＡライブラリーの調製
（１）ｍＲＮＡの調製
ｍＲＮＡ調製マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）各器官または組織０．５〜１ｇを１０ｍｌの懸濁液でホモジェナイズし、ｐＨ４．０ の２Ｍ 酢酸ナトリウム１ｍｌ と、同量のフェノール／ クロロホルム（体積比５：１）混液を加え抽出した。抽出後水層に同量のイソプロパノールを加えると、ＲＮＡが水相から分離沈澱した。この試料を氷の上で１時間インキュベーションした後、１５分間４，０００ｒｐｍで冷却遠心機にかけ、沈澱物を回収した。この検体を７０％エタノールで洗い、８ｍｌの水に溶解後２ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、１ ％ ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙ− ｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、４Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓを含むｐＨ７．０ の水溶液１６ｍｌを加えることでＲＮＡを沈澱させ、ポリサッカライドを除いた（ＣＴＡＢ沈澱）。
【０１００】
続いて室温で４，０００ｒｐｍ、１５分間遠心機にかけ、ＲＮＡを４ｍｌの７Ｍグアニジン−Ｃ１に溶解した。そして２倍量のエタノールを加えた後、氷上で１時間インキュベーションし、４，０００ｒｐｍ、１５分間遠心機にかけ、生じた沈澱物を７０％エタノールで洗いＲＮＡを回収した、これを再度水に溶解し、ＲＮＡの純度をＯＤ比２６０／２８０（＞１．８）と２３０／２６０（＜０．４５）を読むことによって計測した。
【０１０１】
（２）第１鎖ｃＤＮＡの調製
上記（１）で調製したｍＲＮＡ １５μｇを使って逆転写酵素３，０００ｕｎｉｔ により、最終容量１６５μｌの反応液中で、５−メチル−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰを各々０．５４ｍＭ、０．６Ｍトレハロース、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、５２ｎｇ／μｌ ＢＳＡ、ＲＮａｓｅインヒビター ５ｕｎｉｔの条件下で逆転写反応を行った。制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含むオリゴヌクレオチド（配列番号９）（配列中、ＶはＡ，Ｇ，又はＣを示し、ＮはＡ，Ｇ，Ｃ，又はＴを示す）１２．６μｌをプライマーとして用いた。
【０１０２】
この反応を始める際、反応液の１／４を採取し、それに１．５μｌの［α−３２Ｐ］−ｄＧＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０μＣｉ／μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を加えることにより、第１鎖ｃＤＮＡの合成効率を測定した。ＲＩ標識した反応液の０．５μｌをＤＥ−８１ペーパー上にスポットし、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗った前後のＲＩ活性を測定し、計算した。その後、ＲＩ標識した反応液と非標識の反応液を混合し、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ８μｌ、１０％ＳＤＳ ２μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ ２０μｇを加え、４５℃で１５分間加熱した。フェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱後、沈澱をＲＮａｓｅ フリーに処理してある水（以下ＲＮａｓｅフリー水とする）４７μｌに溶解した。
【０１０３】
（３）５’キャップ構造及び３’末端へのビオチン付加
ＲＮＡジオールのビオチン化ＲＮＡのジオール部位（Ｃａｐ構造のある５’末端と、ポリＡ鎖のある３’末端のリボースの双方に存在）にビオチンを結合させるために、２段階の反応を行った。それらは、ジオール基の酸化とそれに続くビオチンヒドラジドと酸化ＲＮＡ体のカップリング反応である。まず、逆転写反応で得られたＲＮＡ−第１鎖ｃＤＮＡ複合体１５μｇを、６．６ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）と、酸化剤として過ヨウ素酸ナトリウムを用いて５０μｌの反応液中で処理した。この酸化反応は遮光条件下、氷上で４５分間行った。
【０１０４】
続いて、５Ｍ塩化ナトリウム１１μｌ、１０％ＳＤＳ ０．５μｌ、そして同量のイソプロパノールを加え、６０分間氷上に放置した後、４℃で１５分間１５，０００ｒｐｍ遠心し沈澱を取得した。沈澱物は７０％エタノールで洗い、ＲＮａｓｅフリー水５０μｌに再溶解させた。その試料に１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）５μｌ、１０％ＳＤＳ ５μｌ、１０ｍＭビオチンヒドラジド（Ｓｉｇｍａ社製）１５０μｌを加え、室温（２２〜２６℃）で終夜反応させた。最後に、５μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）７５μｌ、及び２．５倍量のエタノールを加え、１時間の氷上冷却後、４℃において１５分間遠心し、ビオチン化した。反応後、反応液を１５分間遠心し、再度ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を沈澱させた。沈澱物は７０％エタノールで１回、更に８０％エタノールで１回洗い、ＲＮａｓｅフリー水７０μｌに溶解した。
【０１０５】
（４）ＲＮａｓｅ Ｉによる完全長ｃＤＮＡの選択
上記（３）で取得したビオチン化ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体について、１本鎖ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅ Ｉで処理することにより、逆転写反応時に完全なｃＤＮＡの伸長が得られなかったｍＲＮＡ、およびｍＲＮＡの３’末端に標識されたビオチン残基を取り除いた。具体的には、上記（３）で得られた試料７０μｌに１０×ＲＮａｓｅ Ｉバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＯＡｃ）１０μｌ、ＲＮａｓｅ Ｉ（ＲＮａｓｅ ＯｎｅＴＭ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）２００ｕｎｉｔを加えて、３７℃で１５分間１本鎖ＲＮＡを消化した。
【０１０６】
（５）完全長ｃＤＮＡの採取
ストレプトアビジンコートしたマグネティックビーズにｃＤＮＡが非特異的吸着するのを防止するため、１００μｇの酵母ｔＲＮＡ（ＤＮａｓｅ Ｉ処理したもの）を５ｍｇ（５００μｌ）のマグネティックビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐｏｒｏｕｓ ｇｌａｓｓ（ＭＰＧ）ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＣＰＧ，ＮＪ））に加え、１時間氷上に放置した後、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌの溶液にて洗った。
【０１０７】
このビーズを５０ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌの溶液５００μｌ中に懸濁し、（４）で取得したＲＮａｓｅ Ｉ処理を施されたｃＤＮＡを加えた。室温にて３０分間撹拌することで、マグネティックビーズと完全長ｃＤＮＡを結合させた。完全長ｃＤＮＡを捕獲したビーズを５０ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌの溶液で４回、０．４％ＳＤＳ、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡで１回、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０％ グリセロールで１回、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡ水溶液で１回、ＲＮａｓｅ Ｈ バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、 ２０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で１回洗浄した後、ＲＮａｓｅ Ｈ用バッファー１００μｌに懸濁し、ＲＮａｓｅ Ｈ ３ｕｎｉｔを加え、３７℃下３０分間加温した。その後、１０％ＳＤＳ １μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ２μｌを加えて、１０分間、６５℃に曝し、その上清を回収した。
【０１０８】
このようにして回収された１本鎖完全長ｃＤＮＡはフェノール／クロロホルムで抽出され、スピードバッグにて液量を１００μｌ以下に減じてからＧ２５／Ｇ１００Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーに付した。ＲＩ活性を持った分画はシリコン処理したマイクロチューブに収集するとともに、グリコーゲン２μｇ を加え、エタノール沈澱にて得られた沈澱物を３０μｌの超純水に溶解した。
【０１０９】
（６）１本鎖ｃＤＮＡへのオリゴｄＧ付加
上記（５）で回収された１本鎖ｃＤＮＡ３０μｌは、最終容量５０μｌの反応液中で、２００ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．９）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣｏＣｌ２、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１００μＭ ｄＧＴＰの条件のもと、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）３２ｕｎｉｔを用いて３７℃で３０分間のオリゴｄＧ付加反応に付した。反応終了時にＥＤＴＡを５０ｍＭとなるように加え、一連のフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱を経て、３１μｌの超純水に溶解した。
【０１１０】
（７）第２鎖ｃＤＮＡ合成
第１鎖ｃＤＮＡを鋳型にした第２鎖ｃＤＮＡの合成は以下のように行った。最終容量６０μｌの反応系で、第２鎖低バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍｇ／μｌＢＳＡ）３μｌ、第２鎖高バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、６００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２）３μｌ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ各々０．２５ｍＭ、β−ＮＡＤＨ ６μｌ、オリゴｄＧ付加された第１鎖ｃＤＮＡ３１μｌ、第２鎖プライマー−アダプター（配列番号１０）６００ｎｇ を加え、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ；ＴａＫａＲａ社製）１５ｕｎｉｔ、耐熱性ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）１５０ｕｎｉｔ、耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）３ｕｎｉｔによって第２鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１１１】
０．５Ｍ ＥＤＴＡを１μｌ加えることで反応を停止させ、更にタンパク成分を溶解するために、１０％ＳＤＳ １μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ １０μｇの存在下に４５℃で１５分間加熱し、最終的にフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱にて精製した２本鎖完全長ｃＤＮＡを得た。
【０１１２】
（８）ライブラリーの調製
以上の方法により得られた二本鎖完全長ｃＤＮＡは、λＺＡＰＩＩＩベクターに挿入し、ライブラリーとして回収した。λＺＡＰＩＩＩベクターはλＺＡＰＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）ベクターのマルチクローニングサイトの一部の配列である配列番号１１を配列番号１２に改変し、二つのＳｆｉＩサイトを新たに導入したものである。
【０１１３】
さらにλＰＳ（ＲＩＫＥＮ）ベクターを作製し、ｃＤＮＡを挿入した。λＰＳ（ＲＩＫＥＮ）（λ−ＦＬＣ−１と命名（ＦＬＣとはＦＵＬＬ−ＬＥＮＧＴＨ ｃＤＮＡを意味する））とは、ＭｏＢｉＴｅｃ社（ドイツ）のλＰＳベクターをｃＤＮＡ用に改変したものである。即ち１０ｋｂｐ ｓｔｕｆｆｅｒの両側に存在するクローニングサイトにｃＤＮＡ挿入に便利なＢａｍＨＩならびにＳａｌＩを各々導入するとともに、０．５ｋｂから１３ｋｂ程度までのｃＤＮＡがクローニングできるようにＸｂａＩサイトに６ｋｂのＤＮＡ断片を挿入したものである（特開２０００−３２５０８０号公報）。このλ−ＦＬＣ−１を用いると、例えば肺臓ｃＤＮＡライブラリーの場合には、インサートの平均鎖長は２．５７ｋｂとなり、実際に０．５ｋｂから１２ｋｂまでのインサートをクローニングすることが出来た。従来法のλＺＡＰの場合には、インサートの平均鎖長は０．９７ｋｂであったことから、λ−ＦＬＣ−１を用いることによって、サイズの大きなｃＤＮＡもλＺＡＰに比べて効率よくクローニングできることがわかる。
【０１１４】
実施例２ 完全長ｃＤＮＡライブラリーのノーマライゼーション／サブトラクション
（１）ドライバーの調製
実施例１（１）で作製したｍＲＮＡ（以下、これを「（ａ）ＲＮＡドライバー」と称することがある）、及びｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応で作成したＲＮＡをドライバーとして用いた。後者のＲＮＡはさらに２種類（以下、これを「（ｂ）ＲＮＡドライバー、及び「（ｃ）ＲＮＡドライバー」と称する）に分けられる。１つはノーマライゼーションにより除かれたＲＮＡ−ｃＤＮＡからｃＤＮＡを回収し、ファージベクターにクローニングしたものである。大腸菌に感染後１つの出発材料あたり１０００から２０００プラークを混ぜ合わせて１つのライブラリー（ミニライブラリー）とし、常法によりプラスミドＤＮＡに変換する（ファージをヘルパーファージとともに再度大腸菌に感染させ、ファージミドとし、さらにもう一度感染させてプラスミドＤＮＡを得る）。
【０１１５】
得られたＤＮＡについてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応（Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる）を行い、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＲＱ１−ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理後、フェノール／クロロホルム抽出をして（ｂ）ＲＮＡドライバーを得た。この際、通常出発材料としては９種類（すい臓、肝臓、肺、腎臓、脳、脾臓、睾丸、小腸、胃）の組織からそれぞれミニライブラリーを作成して、９種類のミニライブラリーを混合してＲＮＡを得る。もう一つのＲＮＡはすでに重複のないクローンとして保存されているライブラリー（クローン数約２万個）を培養し、得られたＤＮＡについて（ｂ）ＲＮＡドライバーと同様にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を行い（ｃ）ＲＮＡドライバーとした。
【０１１６】
これら３種のＲＮＡは、Ｌａｂｅｌ−ＩＴ Ｂｉｏｔｉｎ ＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いてビオチン化標識を行ったあと、１：１：１の割合でテスターｃＤＮＡに添加し、Ｒｏｔ１０での反応（４２℃）を行い、ストレプトアビジンビーズ（ＣＰＧ）処理を行って回収した上清について、第２鎖の合成を行った。
【０１１７】
実施例３ 完全長ｃＤＮＡクローンの塩基配列決定
（１）クローンのｒｅａｒｒａｙ
各クラスタからひとつの代表クローンを選んだ。代表クローンはＱ−ｂｏｔ（ＧＥＮＥＴＩＸ ＬＩＭＩＴＥＤ製）で選択し、３８４穴プレートにａｒｒａｙ化した。その際、大腸菌は３０℃で１８〜２４時間、５０μｌのＬＢ培地で培養した。このとき、ｃＤＮＡライブラリーがＰＳベクターに導入され大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換している場合には１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを添加し、Ｚａｐベクターに導入し、ＳＯＬＲシステムに導入している場合には１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び２５ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジンを添加して行った。
【０１１８】
（２）プラスミドの抽出とＩｎｓＳｉｚｉｎｇ
上記（１）で培養した各クローンは、さらに１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１．３ｍｌのＨＴ液中で培養され、遠心分離により菌体を回収した後、ＱＩＡｐｒｅｐ ９６ Ｔｕｒｂｏ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを回収、精製した。取得されたプラスミド中に挿入されているｃＤＮＡの鎖長を調べるために、上記で取得したプラスミドＤＮＡの１／３０を制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、１％のａｇａｒｏｓｅゲル電気泳動を行った。
【０１１９】
（３）配列決定
かくして取得されたプラスミド中に挿入された完全長ｃＤＮＡの全長の塩基配列解析には、３種類のシークエンサを用いた。また、プラスミドは挿入配列の長さが２．５ｋｂより短いものと長いものの２つのカテゴリに分けた。このうち２．５ｋｂより短い挿入配列を有するクローンについては両端から塩基配列を解析した。その際、プラスミドはベクターがＰＳの場合には配列番号１３（センス鎖）、及び１４（アンチセンス鎖）に記載のプライマーを用いて、またベクターがＺａｐの場合には配列番号１５（センス鎖）、及び１６（アンチセンス鎖）に記載のプライマーを用いてＴｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で反応し、Ｌｉｃｏｒ ＤＮＡ４２００（ｌｏｎｇ ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて解析した。
【０１２０】
上記塩基配列解析により解析ができなかったギャップは、プライマウォーキング法により決定した。その際、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３７７及び／またはＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．製）とＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔとＣｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．製）を用いた。
【０１２１】
また、挿入されているｃＤＮＡが２．５ｋｂより長いクローンの配列決定は、ショットガン法によった。その際、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＲＩＳＡ ３８４とＤＹＥｎａｍｉｃ ＥＴ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いた。ショットガンライブラリを作製するために、４８の独立な代表クローンからＰＣＲで増殖した４８のＤＮＡフラグメントを用いた。増幅されたＤＮＡ断片の末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化した。
このＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１８ベクターへ挿入し、更に該組み換えベクターにより大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。この大腸菌から上記（２）と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１２２】
それらの代表クローンについては、両末端からの塩基配列解析によって塩基配列を決定し、該塩基配列をコンピューター上で連結した後、Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｈｅａｒｉｎｇ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｆｉｏｒｅ Ｉｎｃ．製）によるｓｈｅａｒｉｎｇを行った。ショットガン法による塩基配列決定は、１２〜１５クローンの重複をもって行った。この塩基配列決定により配列が決定できなかったギャップは、上記と同様にプライマウォーキングによって決定した。
【０１２３】
実施例４ 塩基配列の解析
（１）ｄｎａｆｏｒｍ３５３６３（配列番号１、５）
ｄｎａｆｏｒｍ３５３６３は、配列番号１に示すように、３１３３塩基から成り、そのうち塩基番号４３〜１７８８までがオープンリーディングフレーム （終止コドンを含む） になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、５８１アミノ酸残基から成る （配列番号５）。配列番号１に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＳＰＴＲ蛋白質データベース （ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ蛋白質配列データベースとＴｒＥＭＢＬ核酸翻訳データベースを統合したもの） 中に、（ｉ）データベース登録記号ＡＢ０００２１６、Ｒａｔ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ＣＣＡ３， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．が、ｅ−ｖａｌｕｅ：０．０で、また５４２アミノ酸残基に亘り６１％の一致度で、（ｉｉ）データベース登録記号ＡＦ０６０２１９、ＲＣＣ１−ｌｉｋｅ Ｇ ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＲＬＧが、ｅ−ｖａｌｕｅ：４×１０−１２で、１５２アミノ酸残基に亘り２６％の一致度でヒットした。これらの結果より、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測された。
【０１２４】
また、上記（ｉｉ）のタンパク質は、データベース中の文献情報（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９８ Ｎｏｖ １５；５４（１）：９９−１０６）からＲＣＣ１−ｒｅｌａｔｅｄ ＧＥＦ ｆａｍｉｌｙらしいことが明らかとなった。
また、配列番号１に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行ったところ３８３〜４９９のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）を見出した。また、ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ（Ｐｆａｍエントリーａｎｋ）も３ヶ所に見出された。
これらのことから配列番号１に示す塩基配列がコードするタンパク質は細胞内蛋白質相互作用ネットワークを解明するためのツールとして有用であることが推測された。
【０１２５】
（２）ｄｎａｆｏｒｍ４８０６０（配列番号２、６）
ｄｎａｆｏｒｍ４８０６０は、配列番号２に示すように、３８２４塩基から成り、そのうち塩基番号８４〜１８８３までがオープンリーディングフレーム （終止コドンを含む） になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、５９９アミノ酸残基から成る （配列番号６）。配列番号２がコードするアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＳＰＴＲ蛋白質データベース （ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ蛋白質配列データベースとＴｒＥＭＢＬ核酸翻訳データベースを統合したもの） 中に、（ｉ）データベース登録記号ＡＢ０００２１６、Ｒａｔ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ＣＣＡ３， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．が、ｅ−ｖａｌｕｅ：０．０で、また５６０アミノ酸残基に亘り６１％の一致度で、（ｉｉ）データベース登録記号ＡＦ０６０２１９、ＲＣＣ１−ｌｉｋｅ Ｇ ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＲＬＧが、ｅ−ｖａｌｕｅ：４×１０−１２で、１５２アミノ酸残基に亘り２６％の一致度でヒットした。これらの結果より、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測された。
【０１２６】
また、上記（ｉｉ）のタンパク質は、データベース中の文献情報（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９８ Ｎｏｖ １５；５４（１）：９９−１０６）からＲＣＣ１−ｒｅｌａｔｅｄ ＧＥＦ ｆａｍｉｌｙらしいことが明らかとなった。
さらに、配列番号２に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行ったところ４０１〜５１７のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）を見出した。また、ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ（Ｐｆａｍエントリーａｎｋ）も３ヶ所に見出した。
これらのことから、配列番号２に示す塩基配列がコードするタンパク質は細胞内蛋白質相互作用ネットワークを解明するためのツールとして有用であることが推測された。
【０１２７】
（３）ｄｎａｆｏｒｍ４０３３１（配列番号３、７）
ｄｎａｆｏｒｍ４０３３１は、配列番号３に示すように、４４４６塩基から成り、そのうち塩基番号２０４〜１００４までがオープンリーディングフレーム （終止コドンを含む） になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、２６６アミノ酸残基から成る （配列番号７）。配列番号３に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＳＰＴＲ蛋白質データベース （ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ蛋白質配列データベースとＴｒＥＭＢＬ核酸翻訳データベースを統合したもの） 中に、（ｉ）データベース登録記号ＡＬ０３５７０３、ｎｏｖｅｌ ＢＴＢ／ＰＯＺ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎが、ｅ−ｖａｌｕｅ：３×１０−９２で、また２３３アミノ酸残基に亘り７４％の一致度で、（ｉｉ）データベース登録記号Ｑ１３１０５、Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １５１が、ｅ−ｖａｌｕｅ：８×１０−１５で、２５５アミノ酸残基に亘り２７％の一致度でヒットした。これらの結果より、配列番号７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測された。
【０１２８】
また、上記（ｉｉ）のタンパク質は、データベース中の文献情報（Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７；２２４：１３７−４６）からＭｙｃ蛋白質と相互作用することが明らかとなった。
さらに、配列番号３に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行ったところ８〜１１７のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）を見出した。
これらのことから、配列番号３に示す塩基配列がコードするタンパク質は細胞内蛋白質相互作用ネットワークを解明するためのツールとして有用であることが推測された。
【０１２９】
（４）ｄｎａｆｏｒｍ３９５４０（配列番号４、８）
ｄｎａｆｏｒｍ３９５４０は、配列番号４に示すように、２７５２塩基から成り、そのうち塩基番号１１７〜２３８７までがオープンリーディングフレーム （終止コドンを含む） になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、７５６アミノ酸残基から成る （配列番号８）。配列番号４がコードするアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＳＰＴＲ蛋白質データベース （ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ蛋白質配列データベースとＴｒＥＭＢＬ核酸翻訳データベースを統合したもの） 中に、（ｉ）データベース登録記号ＢＣ０１６４７７、Ｕｎｋｎｏｗｎ （ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ＭＧＣ：１７３６８）が、ｅ−ｖａｌｕｅ：５×１０−１１０で、また２４８アミノ酸残基に亘り７８％の一致度で、（ｉｉ）データベース登録記号ＡＦ３４９５６１、ｍｙｏｎｅｕｒｉｎが、ｅ−ｖａｌｕｅ：３×１０−７１で、６６５アミノ酸残基に亘り２８％の一致度でヒットした。これらの結果より、配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測された。
【０１３０】
また、上記（ｉｉ）のタンパク質は、データベース中の文献情報（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０００ Ｊｕｎ ２４；２７３（１）：３８５−３９１）から、様々な種で転写の活性化と抑制の両方に関わることが明らかとなった。
さらに、配列番号４に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行ったところ９〜１２１のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）を見出した。また，Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ （Ｐｆａｍのｚｆ−Ｃ２Ｈ２エントリー）も７ヶ所で見出した。
これらのことから、配列番号４に示す塩基配列がコードするタンパク質は細胞内蛋白質相互作用ネットワークを解明するためのツールとして有用であることが推測された。
【０１３１】
実施例５ ＤＮＡマイクロアレーを用いた組織発現解析
組織発現解析は、Ｍｉｋｉ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９８， ２１９９−２２０４ （２００１）の記載に従って行った。
（１）ＤＮＡマイクロアレーの作成
解析対象のマウス完全長ｃＤＮＡの塩基配列（ｄｎａｆｏｒｍ３５３６３およびｄｎａｆｏｒｍ４８０６０）と同じクラスタに属するマウスｃＤＮＡライブラリーＦＡＮＴＯＭ（ ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／ ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／）由来のｃＤＮＡの塩基配列（ＦＡＮＴＯＭ ＮＯ：６３３０４０４Ｅ１６）を、Ｍ１３フォワードおよびリバースプライマーを用いて増幅後、このＰＣＲ産物をイソプロパノールにて沈澱させ１５μｌの３×ＳＳＣ液に溶解した。このＤＮＡ溶液をポリＬリジンコートしたガラススライドに、１６チップ（ＳＭＰ３、ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）のＤＮＡアレイヤーを用いてスポットし、ＤＮＡマイクロアレーを作成した（方法の詳細は ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｍｇｕｉｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｍｇｕｉｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌに記載されている）。この場合、マウスβアクチンとグリセルアルデヒド‐３‐フォスフェートデヒドロゲナーゼのｃＤＮＡをポジティブコントロールとし、シロイヌナズナのｃＤＮＡをネガティブコントロールとして用いた。
【０１３２】
このＤＮＡマイクロアレーの検出感度は、１細胞当たりｍＲＮＡ １ないし３コピーであった。ターゲット配列との一致度がおよそ８０％のクローンのシグナル強度は、完全に配列が一致するクローンの１０分の１であった。ターゲット配列との一致度が８０％未満のクローンのシグナル強度は、バックグランドレベルであった。
【０１３３】
（２）プローブの調製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胎児、新生仔、アダルトの２２組織（腎臓、脳、脾臓、肺、肝臓、精巣、膵臓、胃、小腸、結腸、胎盤、心臓、胸腺、小脳、子宮、骨、筋肉、背側腎臓由来脂肪細胞、副精巣由来脂肪細胞、内臓脂肪、１０日齢新生児小脳、１０日齢新生児皮膚）から抽出したｍＲＮＡ １μｇを定法に従いランダムプライム逆転写反応を行い蛍光色素Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を取りこませた。他方、１７．５日齢の胎児全身から抽出したｍＲＮＡ １μｇをランダムプライム逆転写反応を行い、蛍光色素Ｃｙ５を取りこませ発現解析の対照とした。ＣｙＤｙｅ標識ｃＤＮＡプローブは、ＣｙＳｃｒｉｂｅ ＧＦＸ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて精製し、滅菌水１７μｌにてカラムから溶出した。これに３μｌの１０μｇ／μｌ ｏｌｉｇｏ（ｄＡ），３μｌの酵母ｔＲＮＡ２０μｇ／μｌ，１μｌの２０μｇ／μｌマウスＣｏｔ１ ＤＮＡ，５．１μｌの２０ＸＳＳＣ，および０．９μｌの１０％ＳＤＳからなるブロッキング溶液を混和してＣｙＤｙｅ標識ｃＤＮＡプローブを調製した。
【０１３４】
（３）ＤＮＡマイクロアレーのハイブリダイゼイション
発現解析対象組織由来ｃＤＮＡプローブ（Ｃｙ３標識）と対照の１７．５日齢胎児由来ｃＤＮＡプローブ（Ｃｙ５標識）を混和した溶液３０μｌを９５℃にて１分間熱処理を行い室温にて冷却した。ＤＮＡマイクロアレーに上記プローブ溶液を添加しカバースリップを被せ、Ｈｙｂｒｉｃａｓｅｔｔｅ（ＡｒｒａｙＩｔ社）中にて６５℃一晩ハイブリダイズさせた。次に、ＤＮＡマイクロアレーを２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳを用いて洗浄し、続いて１ＸＳＳＣにて２分間、０．１ＸＳＳＣにて２分間リンスした。マイクロアレーはＳｃａｎＡｒｒａｙ５０００共焦点レーザースキャナーを用いてスキャンし、画像をＩＭＡＧＥＮＥ（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ社）で解析した。
【０１３５】
（４）データ解析
各組織中のｍＲＮＡ量（Ｃｙ３標識）は、対照の１７．５日齢の胎児全身ｍＲＮＡ量（Ｃｙ５標識）との比（Ｃｙ３／Ｃｙ５）を対数（ｌｏｇ２）で表示した。すなわち、解析対象とする各マウス全長ｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡ発現量が、対照組織中よりも各組識中の方が多い場合は正の数値で、少ない場合は負の数値で、等しい場合は０で示される。データの正確性を増すために実験は独立に２回行い、再現性の有る結果を採用した。その結果を表１に示す。
【０１３６】
一般的に、ＤＮＡアレーを使用した発現解析では、２倍程度の増減は実験誤差とみなされる。このことから、表１に示す結果の数値が１以上の場合にはある組織中のｍＲＮＡ量が対照である１７．５日齢の胎児全身のｍＲＮＡ量と比較して２倍以上であり、有意に増加していると解釈した。逆に、結果の数値が−１以下の場合は、ある組織中のｍＲＮＡ量が対照である１７．５日齢の胎児全身のｍＲＮＡ量と比較して２分の１以下であり、有意に減少していると解釈した。また、任意の組織間のｍＲＮＡ発現量を比較検討する際は、各組織における数値の差が１であればｍＲＮＡ量は２倍、２であればｍＲＮＡ量は４倍であり、逆に、組織間の数値の差が−１であればｍＲＮＡ量は１／２倍、−２であればｍＲＮＡ量は１／４倍であることを意味する。
【０１３７】
なお、マイクロアレイにスポットしたＤＮＡ（ＦＡＮＴＯＭ ＮＯ：６３３０４０Ｅ１６）は、解析対象ｃＤＮＡと同じクラスタに属し、該ＤＮＡと少なくとも２００塩基に亘り８０％以上の塩基配列の一致度を有する領域を有するので、表１には、マイクロアレイにスポットしたＤＮＡの測定結果の数値を、解析対象ｃＤＮＡ（ｄｎａｆｏｒｍ３５３６３およびｄｎａｆｏｒｍ４８０６０）の結果として記載した。
【０１３８】
【表１】
【０１３９】
表１から明らかなとおり、ｄｎａｆｏｒｍ３５３６３とｄｎａｆｏｒｍ４８０６０は、精巣と副精巣由来脂肪細胞において、他の組織に比べて約１／２倍の発現の減少が考えられる。
【０１４０】
実施例６ タンパク質−タンパク質相互作用解析
哺乳動物細胞におけるｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １１， １７５８−１７６５ （２００１））を用いて、１種類のマウス完全長ｃＤＮＡの塩基配列（ｄｎａｆｏｒｍ３９５４０）がコードするタンパク質のタンパク質−タンパク質相互作用を網羅的に解析した。
（１）ＰＣＲ法を用いた迅速なサンプル調製
哺乳動物細胞でのｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ実験は、ＣｈｅｃｋＭａｔｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を利用した。タンパク質−タンパク質相互解析用のサンプルは、ＣＭＶプロモーターの下流にＧａｌ４遺伝子のＤＮＡ結合領域を挿入したプラスミドベクターｐＢＩＮＤ、ＣＭＶプロモーターの下流にＶＰ１６遺伝子の転写活性化領域を挿入したプラスミドベクターｐＡＣＴ，および５個のＧａｌ４結合領域とＴＡＴＡボックスの下流にレポーターであるルシフェラーゼ遺伝子を挿入したプラスミドベクターｐＧ５ｌｕｃを鋳型として調製した。Ｇａｌ４遺伝子と１種類のマウス完全長ｃＤＮＡの塩基配列（ｄｎａｆｏｒｍ３９５４０）のタンパク質コード配列との融合遺伝子、並びにＶＰ１６遺伝子とマウスｃＤＮＡライブラリーＦＡＮＴＯＭ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／）の各クローンが有する完全長ｃＤＮＡのタンパク質コード配列との融合遺伝子は、基本的にＰｒｏｍｅｇａ社のプロトコールに従い共通配列部分を用いた連結と２段階ＰＣＲ法を組み合わせて作成した（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １１， １７５８−１７６５ （２００１）の図１参照）。
【０１４１】
マウスｃＤＮＡのタンパク質コード配列を、５’側に共通配列をもち３’側に遺伝子特異的な配列をもつフォワードプライマーおよびＭ１３ユニバーサルプライマーとを用いてＰＣＲ増幅した後、上記増幅産物とｐＢＩＮＤまたはｐＡＣＴのＰＣＲ増幅産物（３’側に共通配列を付加した）とを混和し、それぞれネスティドプライマーを用いて第２段のＰＣＲ増幅を行い、Ｇａｌ４とマウスタンパク質の融合タンパク質を発現させるベクター（ＢＩＮＤサンプル）またはＶＰ１６とマウスタンパク質の融合タンパク質を発現させるベクター（ＡＣＴサンプル）を構築した。
【０１４２】
（２）ハイスループットな哺乳動物細胞でのｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ実験
ＰＣＲ法で調製したＢＩＮＤおよびＡＣＴサンプルは、それ以上の精製を行わずに直接使用した。ＢＩＮＤサンプルおよびＡＣＴサンプルのそれぞれ０．２５μｌ、３０ｎｇのｐＧ５ｌｕｃ、および９．５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社）を３８４ウェルプレートに分注した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地にて３２倍希釈したＬＦ２０００トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社）１０μｌをウェルに加えて混和し２０分間インキュベーション後、Ｆ１２培地にて１，３００細胞／μｌに懸濁したＣＨＯ−Ｋ１チャイニーズハムスター細胞液２０μｌを加えて良く懸濁した。アッセイサンプルをＣＯ２インキュベーター内で２０時間培養後、ルシフェラーゼ活性はＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定し、相互作用を確認した。その結果を表２に示す。
【０１４３】
【表２】
【０１４４】
表２から明らかなとおり、マウス完全長ｃＤＮＡの塩基配列（ｄｎａｆｏｒｍ３９５４０）によりコードされるタンパク質は、マウスｃＤＮＡライブラリーＦＡＮＴＯＭ（ ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／ ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／）の特定のクローンが有するｃＤＮＡの塩基配列によりコードされるタンパク質と相互作用を有することが明らかとなった。
【０１４５】
即ち、ｄｎａｆｏｒｍ３９５４０によりコードされるタンパク質は、ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨＳＰＣ２０６と相互作用することが認められた。このＨＳＰＣ２０６は、ＣＤ３４＋ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓから取られた遺伝子である（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２０００， １０（１０）： １５４６−６０）。このようにＨＳＰＣ２０６は、造血幹細胞から得られていることから、ｄｎａｆｏｒｍ３９５４０によりコードされるタンパク質は、該組織における細胞分化や増殖、また、癌、免疫、炎症、アレルギー等に関わる可能性が推測された。本タンパク質の発現制御物質、機能賦活物質、あるいは機能阻害物質は、癌、免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患等の治療薬として開発できる可能性がある。
【０１４６】
【発明の効果】
本発明のタンパク質は、タンパク質相互作用活性等を有することから、該タンパク質あるいはそれをコードするＤＮＡを用いて、タンパク質相互作用のネットワーク解析に用いることができる。また該タンパク質が関連する疾患等の治療薬の開発に用いることができる。
本出願は、２００２年４月３０日付けの日本特許出願（特願２００２−１２８４４７）および２００２年１２月４日付けの日本特許出願（特願２００２−３５２５８８）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。また、本明細書にて引用した文献の内容もここに参照として取り込まれる。
【０１４７】
【配列表】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えベクター、該ＤＮＡの部分配列から成るオリゴヌクレオチド、該ＤＮＡを導入した遺伝子導入細胞、及び該タンパク質に特異的に結合する抗体等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ｃＤＮＡの取得及びその塩基配列解析は、生体内に発現するタンパク質の生理活性を解析し、その活性に基づくタンパク質の利用方法を開発するうえで不可欠である。さらに、全遺伝子種に対応する完全長ｃＤＮＡをカタログ化したライブラリーの作製は、ヒトゲノムプロジェクトの重要な課題の一つである。カタログ化したライブラリーとは、ライブラリーに含まれるｃＤＮＡに重複がないという意味であり、各ｃＤＮＡが１種類ずつ含まれているライブラリーのことである。
【０００３】
完全長ｃＤＮＡクローニング法については、特開平９−２４８１８７号公報及び特開平１０−１２７２９１号公報に記載されている。この方法は、ｍＲＮＡの５’キャップサイトに存在するジオール構造にタグになる分子を結合させる工程、前記タグ分子を結合させたｍＲＮＡを鋳型とし、ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして逆転写によりＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を作製し、この複合体の内、ｍＲＮＡの完全長に対応するＤＮＡを有するものをタグ分子の機能を利用して分離する工程を含むことを特徴とする方法である。
【０００４】
また効率のよい逆転写法として、鋳型が高次構造を形成しないような高温で行うための方法も開発されている（特開平１０−８４９６１号公報）。さらに、合成された完全長ｃＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡ断片についてその鎖長に関わらず一律にクローニングすることができるクローニングベクターも開発されている（特開平１１−９２７３号公報）。
【０００５】
このような技術により作製された完全長ｃＤＮＡライブラリーは、ライブラリーの個々の要素として全て均等に異なるものが含まれている訳ではなく、存在割合の高いクローンや逆に極微量にしか存在しないクローンもある。この極微量にしか存在しないクローンは新規である可能性が高いため、このようなクローンを濃縮するためのサブトラクション法やノーマライゼーション法も開発されている（特開２０００−３２５０８０号公報；Ｃａｒｎｉｎｃｉ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ３７， ３２７−３３６（１９９６））。
【０００６】
かくして得られるカタログ化された完全長ｃＤＮＡライブラリーの各クローンについて公知の方法により塩基配列の解析を行えばその塩基配列は同定されるが、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質の生理活性は依然不明のままである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、カタログ化された完全長ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンの塩基配列を解析し、このうち配列が新規なものについては、これがコードするタンパク質の生理活性を特定し、該生理活性に基づくタンパク質およびそれをコードするＤＮＡの利用方法を提案することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、マウス完全長ｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡクローンが有する塩基配列を解析し、該配列の相同性に基づきデータベースを検索したところ、該配列にタンパク質相互作用活性を有するタンパク質に特異的な配列を見出し、これらのｃＤＮＡがコードするタンパク質がタンパク質相互作用活性を有するタンパク質であると同定した。また該ｃＤＮＡの各組織における発現量を解析し、さらに該ｃＤＮＡがコードするタンパク質を実際に発現させてその相互作用活性を解析した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００９】
すなわち本発明によれば、以下の（１）〜（１５）に記載の発明が提供される。
（１） 以下の （ａ） または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号５〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号５〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質。
【００１０】
（２） （１）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３） （１）に記載のタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ。
（４） 以下の （ａ）、（ｂ）または（ｃ）の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１１】
（５） （２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（６） （２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（５）に記載の組み換えベクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。
（７） （６）に記載の細胞により産生される、（１）に記載のタンパク質。
【００１２】
（８） （２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
【００１３】
（９） （１）または（７）に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメント。
（１０） 抗体がモノクローナル抗体である（９）に記載の抗体。
（１１） モノクローナル抗体が（１）または（７）に記載のタンパク質のタンパク質相互作用活性を中和する作用を有することを特徴とする（１０）に記載の抗体。
【００１４】
（１２） （１）または（７）に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。
（１３） （６）に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞に導入されているＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング方法。
（１４） （１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも１以上のアミノ配列情報、および／または（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列から選択される少なくとも１以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。
（１５） （１）に記載のタンパク質、および／または（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを結合させた担体。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１）完全長ｃＤＮＡの取得及び塩基配列の解析
本発明のＤＮＡは、以下の （ａ） 又は（ｂ）の何れかのＤＮＡである。
（ａ）配列番号５〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号５〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列または上記アミノ酸配列において、１若しくは数個（ここで言う数個の数は特には限定されないが、例えば２０個以下、好ましくは１５個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下を意味する）のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、若しくは逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードし得るＤＮＡ。
具体的には、該アミノ酸配列をコードする翻訳領域のみでも、あるいはそのｃＤＮＡの全長を含むものでもよい。
【００１６】
ｃＤＮＡの全長を含むＤＮＡとしては、例えば、配列番号１〜４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号１の塩基番号４３〜１７８８、配列番号２の塩基番号８４〜１８８３、配列番号３の塩基番号２０４〜１００４、配列番号４の塩基番号１１７〜２３８７に示される配列を有するものが挙げられる。さらに上記のｃＤＮＡの全長でなくても、上記翻訳領域とその３’及び／または５’端に隣接する、翻訳領域の発現に最低限必要な部分を含むもの等も本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１７】
本発明のＤＮＡは、これを取得できる方法であれば如何なる方法により取得したものでもよいが、具体的には、例えば次に述べる方法により取得することができる。まず、適当な動物、好ましくは哺乳動物の組織等からそれ自体既知の通常用いられる方法によりｍＲＮＡを調製する。次に、このｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成するが、このとき完全長のｃＤＮＡを合成するために５’キャップ（７ＭｅＧｐｐｐＮ）サイトに特異的なジオール構造にタグになる分子を化学結合させ、このｍＲＮＡを鋳型としてｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして逆転写した後に、タグ分子の機能を利用して完全長のｃＤＮＡのみを分離する方法（特開平９−２４８１８７号公報；特開平１０−１２７２９１号公報）を用いることが好ましい。また、逆転写の際には、鋳型が高次構造を形成して逆転写の効率が低下することを阻止するために、トレハロース等の存在下で、耐熱性逆転写酵素を用いて高温下で逆転写を行う方法（特開平１０−８４９６１号公報）を用いるのが好ましい。ここで、高温下とは４０〜８０℃を意味する。
【００１８】
このようにして取得されたｃＤＮＡは、これを適当なクローニングベクターに挿入してクローニングを行う。ここで用いられるベクターとしては、様々な鎖長のＤＮＡを一律にクローニングすることが可能な、クローニングサイトの両末端にリコンビナーゼ認識配列を有し、感染以外の方法で宿主に挿入される直鎖状のベクター（特開平１１−９２７３号公報）が好ましく用いられる。かくして得られるｃＤＮＡライブラリーは、全てのクローンが均一に存在している（以下、これを「カタログ化されている」と称することがある）訳ではなく、このライブラリー中に極微量にしか存在しないクローンこそ新規である確率が高い。そこで、このようなクローンを濃縮するためのサブトラクション法やノーマライゼーション法（特開２０００−３２５０８０号公報；Ｃａｒｎｉｎｃｉ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ３７， ３２７−３３６（１９９６））を用いることが好ましい。
【００１９】
カタログ化されたｃＤＮＡライブラリーは、それ自体既知の通常用いられる方法により塩基配列の解析を行う。本発明のＤＮＡは、ｃＤＮＡ全長の場合にはその末端１００ベースの配列について得られた塩基配列を、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を用いて、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ等のデータベースについて検索し、最も高い相同性を示す配列でも一致度が３０％以下であるものを新規として以下の解析に供することとした。
【００２０】
このような完全長ｃＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、前記した通り、配列番号１〜４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号１の塩基番号４３〜１７８８、配列番号２の塩基番号８４〜１８８３、配列番号３の塩基番号２０４〜１００４、配列番号４の塩基番号１１７〜２３８７に示される配列を有するものが挙げられる。
【００２１】
かくして取得された新規な塩基配列を、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５， ４０３−４１０（１９９０）） による相同性検索 （ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈ）や、ＨＭＭＥＲ（隠れＭａｒｋｏｖモデルによる配列解析手法； Ｅｄｄｙ， Ｓ． Ｒ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４， ７５５−７６３ （１９９８）） の機能群のひとつである ＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索 （ｐｒｏｆｉｌｅ ｓｅａｒｃｈ：ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）等を行うことにより、該塩基配列がコードするタンパク質の機能を推定することができる。
【００２２】
ＢＬＡＳＴによる相同性検索においては、検索の結果、得られた相同性が十分有意なヒット配列に付随する種々のアノテーション情報から、解析対象としているクローンの機能を推定することができる。ここで、十分有意なヒット配列とは、登録されているアミノ酸配列の機能ドメイン部分と本発明のＤＮＡがコードするアミノ酸配列のこれに対応する部分との一致度がｅ−ｖａｌｕｅとして１０−４以下のものか、あるいは３０％以上のものを示す。
【００２３】
例えば、上位にヒットした機能ドメイン配列の多くがタンパク質結合活性を確認されたものであるならば、それと配列上類似である解析対象クローンもまた同じ機能、即ち、タンパク質結合活性を持つであろうという予測が成り立つ。
【００２４】
ＨＭＭＰＦＡＭでは、Ｐｆａｍというタンパク質プロファイルを集積したデータベース中にあるエントリーが有する配列の特徴を、解析対象である配列が有するかどうかを洗い出す方法による解析が行われる。プロファイルは一連の同一特徴を持つタンパク質群から抽出されており、一配列対一配列の全長に亘る比較では明確化できない構造でも、配列中にその特徴領域があればこれを見出し、機能予測ができる。かくして行われるタンパク質の機能予測の具体的な例を以下に説明する。
【００２５】
配列番号１に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴサーチにより、Ｒａｔ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ＣＣＡ３， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．とｅ−ｖａｌｕｅ：０．０、５４２アミノ酸残基に亘り６１％の相同性を、またＲＣＣ１−ｌｉｋｅ Ｇ ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＲＬＧとｅ−ｖａｌｕｅ：４×１０−１２、１５２アミノ酸残基に亘り２６％の一致度でヒットする。
また、配列番号１に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行うと３８３〜４９９のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）が見出され、またａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ（Ｐｆａｍエントリーａｎｋ）も３ヶ所に見出される。
これらの結果より、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測される。さらに、このタンパク質は、文献情報（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９８ Ｎｏｖ １５；５４（１）：９９−１０６）からＲＣＣ１−ｒｅｌａｔｅｄ ＧＥＦ ｆａｍｉｌｙらしいことが推測される。
【００２６】
配列番号２に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴサーチにより、Ｒａｔ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ＣＣＡ３， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．とｅ−ｖａｌｕｅ：０．０、５６０アミノ酸残基に亘り６１％の一致度で、またＲＣＣ１−ｌｉｋｅ Ｇ ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＲＬＧと、ｅ−ｖａｌｕｅ：４×１０−１２、１５２アミノ酸残基に亘り２６％の一致度でヒットする。
また、配列番号２に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行うと４０１〜５１７のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）が見出され、またａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ（Ｐｆａｍエントリーａｎｋ）も３ヶ所に見出される。
これらの結果より、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測さる。さらに、このタンパク質は、文献情報（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９８ Ｎｏｖ １５；５４（１）：９９−１０６）からＲＣＣ１−ｒｅｌａｔｅｄ ＧＥＦ ｆａｍｉｌｙらしいことが推測される。
【００２７】
配列番号３に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴサーチにより、ｎｏｖｅｌ ＢＴＢ／ＰＯＺ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎとｅ−ｖａｌｕｅ：３×１０−９２、２３３アミノ酸残基に亘り７４％の一致度で、またＺｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １５１とｅ−ｖａｌｕｅ：８×１０−１５、２５５アミノ酸残基に亘り２７％の一致度でヒットする。
また、配列番号３に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行うと８〜１１７のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）が見出される。
これらの結果より、配列番号７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測される。さらに、このタンパク質は、文献情報（Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７；２２４：１３７−４６）からＭｙｃ蛋白質と相互作用することが推測される。
【００２８】
配列番号４に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴサーチにより、Ｕｎｋｎｏｗｎ （ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ＭＧＣ：１７３６８）とｅ−ｖａｌｕｅ：５×１０−１１０、２４８アミノ酸残基に亘り７８％の一致度で、またｍｙｏｎｅｕｒｉｎとｅ−ｖａｌｕｅ：３×１０−７１、６６５アミノ酸残基に亘り２８％の一致度でヒットする。
また、配列番号４に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行うと９〜１２１のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）が見出され、またＺｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ （Ｐｆａｍのｚｆ−Ｃ２Ｈ２エントリー）も７ヶ所で見出される。
これらの結果より、配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測された。さらに、このタンパク質は、文献情報（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０００ Ｊｕｎ ２４；２７３（１）：３８５−９１）から、様々な種で転写の活性化と抑制の両方に関わることが推測される。
【００２９】
本発明のＤＮＡは、翻訳配列中に塩基の欠失もしくは挿入を有した状態で取得されることがあるが、上記のような相同性検索やタンパク質特徴検索を行った結果、該ＤＮＡの塩基配列中の欠失もしくは挿入が推測された場合には、当業者において通常用いられているライブラリースクリーニングやＰＣＲクローニング等の方法を用いて塩基の欠失もしくは挿入の無い完全長ｃＤＮＡを取得することができる。かくして得られる完全長ｃＤＮＡを用いて本発明のタンパク質を発現させ、これを機能解析に用いることができる。
【００３０】
かくして取得され、塩基配列が決定され、また機能が推定される本発明のＤＮＡは、上記の配列番号１〜４に記載の塩基配列、あるいはその翻訳領域として上記に示した塩基配列を有するものだけでなく、これらの塩基配列において、１若しくは数個（ここで言う数個の数は特には限定されないが、例えば６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１０個以下、特に好ましくは５個以下を意味する。）の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに、これらＤＮＡあるいはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等も含まれる。
これらＤＮＡには前記したとおり、配列番号５〜８に記載のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。
【００３１】
ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１〜４の何れかに記載の塩基配列またはその相補配列とＢＬＡＳＴ解析で８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡ等が挙げられる。また、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃等で反応を行い、塩濃度が１５ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは１５ｍＭ〜６０ｍＭ等の洗浄液中で洗浄を行う方法に従って行うことができる。
【００３２】
さらに、本発明のＤＮＡは、上述の方法により取得されたものでも、また合成されたものでもよい。ＤＮＡの塩基配列の置換は、例えばサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット（宝酒造社製）や、クイックチェンジサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット（ストラタジーン社製）等の市販キットで容易に行うことができる。
【００３３】
また、配列番号１〜４に記載の塩基配列は、マウスを由来とするものであるが、上記したｃＤＮＡライブラリーの作製法に従ってヒトのｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ライブラリーに対して配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしたハイブリダイゼーションを行うことにより、配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列がコードするタンパク質のヒトのホモログタンパク質をコードするＤＮＡを取得することもできる。本発明の配列番号１〜４のいずれかに記載のＤＮＡあるいはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡには、このようなヒトのホモログＤＮＡや下述するヒトのオルソログＤＮＡも含まれる。
【００３４】
また、インフォマティックスを利用して、ヒトホモログＤＮＡが有する塩基配列を予測し、該塩基配列を基に上記のヒトｃＤＮＡライブラリーなどからヒトホモログＤＮＡを取得することもできる。
【００３５】
一般的に、インフォマティックスを利用して目的とするタンパク質のホモログタンパク質をコードする塩基配列を予測する方法としては、例えば、（ｉ）目的とするｃＤＮＡの塩基配列をクエリーとして、ヒト等のｃＤＮＡデータベース（インフォマティックスにより予測されるｃＤＮＡデータベースを含む）に対しＢＬＡＳＴなどを用いて相同性検索を行う方法や、（ｉｉ）目的とするｃＤＮＡの塩基配列をクエリーとしてヒト等のＥＳＴデータベースに対しＢＬＡＳＴなどを用いて相同性検索を行い、ヒットしたＥＳＴが有する配列を目的とするｃＤＮＡの塩基配列を参照して連結する方法、さらに（ｉｉｉ）目的とするｃＤＮＡの塩基配列をクエリーとして、ヒトなどのゲノムデータベースに対しＢＬＡＳＴなどを用いて相同性検索を行い、目的とするｃＤＮＡの遺伝子が存在するゲノム上の位置を特定し、そのゲノム領域に対してＧｅｎｓｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ ｇｅｎｅｓ． ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）やＳｉｍ４（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， ８： ９７６−７４ （１９９８））等を用いて、該ゲノム中の遺伝子部分の塩基配列を予測する方法等が挙げられる。
【００３６】
マウス由来ｃＤＮＡのヒトホモログＤＮＡの塩基配列を予測する場合、上記の方法のいずれも用いることができるが、本発明の配列番号１〜４に記載の塩基配列を有するｃＤＮＡはいずれも新規であり、上記（ｉ）の方法では、ヒトホモログＤＮＡの塩基配列を取得できないと考えられるため、（ｉｉ）あるいは（ｉｉｉ）に記載の方法などを用いるのが好ましい。
【００３７】
かくして予測されたヒトホモログＤＮＡの塩基配列を基に、上記のヒトｃＤＮＡライブラリーから、配列番号１〜４に記載の塩基配列がコードするタンパク質のヒトのホモログタンパク質をコードするＤＮＡを取得することもできる。具体的な取得方法としては、例えば、予測されたヒトホモログＤＮＡの５’端および３’端の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを用いて、上記ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行う方法や、予測されたヒトホモログＤＮＡの一部の配列をプローブとして、上記ヒトｃＤＮＡライブラリーに対してハイブリダイゼーションを行う方法等が挙げられる。
【００３８】
一般的に、目的遺伝子が有する塩基配列とホモロジーの高い塩基配列を有する類似遺伝子を「ホモログ」と呼び、上記の方法においてもヒトホモログの取得を目的としているが、遺伝子の機能解析においては、塩基配列が類似していることだけではなく、ホモログとして取得された遺伝子が、目的遺伝子のファミリーメンバーであることを確認することが重要である。２種類の生物間で「ホモログ」として取得された遺伝子は、共通の祖先遺伝子から進化した同一の遺伝子である「オルソログ」である可能性と、また、共通の祖先遺伝子からの重複によって生じた異なる遺伝子である「パラログ」である可能性がある。
【００３９】
つまり、上記でホモログとして取得されたヒト由来のＤＮＡは、これを、本発明のタンパク質と同一の機能を有すると解するには、また、該ヒト由来のＤＮＡがコードするタンパク質の機能を、本発明のタンパク質のマウスにおける機能として推定検証するには、上記ヒトホモログが本発明のマウス遺伝子の近縁種のオルソログであることを確認することが好ましい。
【００４０】
オルソログであることの確認方法は、例えば、以下の方法などが用いられる。（ｉ）まず、本発明のｃＤＮＡの塩基配列と、取得されたヒトホモログＤＮＡの塩基配列について相同性を解析する。次に、本発明のｃＤＮＡの塩基配列をクエリーとして、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋなどの国際塩基配列データベースや、特許データベースに含まれるヒト塩基配列について相同性検索を行い、取得されたヒトホモログＤＮＡの塩基配列とクエリーの塩基配列の一致度が、データベースから得られた塩基配列とクエリーの塩基配列の一致度より高いことを確認する。さらに、（ｉｉ）取得されたヒトホモログＤＮＡの塩基配列と、対応する本発明のｃＤＮＡの塩基配列について相同性を解析する。次に、取得されたヒトホモログＤＮＡの塩基配列をクエリーとして、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋなどの国際塩基配列データベースや、特許データベースに含まれるマウス塩基配列について相同性検索を行い、本発明のｃＤＮＡの塩基配列とクエリーの塩基配列の一致度が、データベースから得られた塩基配列とクエリーの塩基配列との一致度より高いことを確認する。上記（ｉ）および（ｉｉ）を確認することにより、取得されたヒトホモログが、本発明のｃＤＮＡに対応するヒトオルソログであると同定することができる。上記（ｉ）および（ｉｉ）に記載した相同性の解析はアミノ酸配列の比較を用いても良く、また、分子進化系統樹を描いて検討することもできる。また、上記（ｉ）および（ｉｉ）に記載した相同性解析による一致度は、クエリーの全長にわたる一致度として解析することが好ましい。
【００４１】
かくして取得されたヒトホモログＤＮＡあるいはオルソログＤＮＡの塩基配列を、ＢＬＡＳＴによる相同性検索やＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索等を行うことにより、該塩基配列がコードするタンパク質の機能を推定することができる。
【００４２】
かくして得られる完全長ｃＤＮＡを用いて本発明のタンパク質を発現させ、これを活性の確認および機能解析等に用いることができる。また、本発明のＤＮＡによりコードされるタンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用活性（タンパク質結合活性）を有するものであり、細胞内蛋白質相互作用ネットワークを解明するためのツールとして、またこれらタンパク質の異常に起因する疾患の治療薬開発の標的タンパク質として有用である。
【００４３】
（２）新規ｃＤＮＡがコードするタンパク質
本発明のＤＮＡがコードするタンパク質の翻訳領域は、例えば、該ＤＮＡが有する塩基配列について３種類の読み枠によりアミノ酸に変換していき、最も長いポリペプチドをコードする範囲を本発明の翻訳領域としてそのアミノ酸配列を決定すること等ができる。このようなアミノ酸配列として、例えば、配列番号５〜８に記載のもの等が挙げられる。また、本発明のタンパク質は、上記のアミノ酸配列に限られるものではなく、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンパク質結合活性を有するものも含まれる。
【００４４】
本発明のタンパク質の取得方法としては、上記（１）に記載の本発明のＤＮＡを適当な方法により転写／翻訳する方法が好ましく用いられる。具体的には、適当な発現用ベクター若しくは適当なベクターに、適当なプロモーターとともに挿入した組換えベクターを作製し、この組換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換したり、適当な培養細胞に導入することにより発現させ、これを精製することにより取得することができる。
【００４５】
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には遊離体、又は他の塩に変換することができる。この様な本発明のタンパク質の塩も本発明のタンパク質に含まれる。また、上記形質転換体が産生するタンパク質を、精製前、又は後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾タンパク質とすることができる。これらの修飾タンパク質もタンパク質結合活性を有するものであれば本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
本発明のタンパク質の産生を行う際、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターの作製に用いるベクターとしては、形質転換体内で該ＤＮＡが発現されるものであれば特に制限はなく、プラスミドベクター、ファージベクターのいずれでもよい。これらのうち通常は、該ＤＮＡが導入される宿主に適したプロモーター等の発現制御領域ＤＮＡが既に挿入されている市販のタンパク質発現用ベクターを用いる。このようなタンパク質発現用ベクターとして、具体的には、例えば、宿主が大腸菌の場合では、ｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（ストラタジーン社製）ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられ、酵母の場合ではｐＥＳＰ−Ｉエクスプレッションベクター（ストラタジーン社製）等が挙げられ、さらに昆虫細胞の場合ではＢａｃＰＡＫ６（クロンテック社製）等が挙げられる。また宿主が動物細胞の場合では、例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられる。
【００４７】
発現制御領域が挿入されていないベクターを用いる場合には、発現制御領域として少なくともプロモーターを挿入する必要がある。ここでプロモーターとしては、宿主微生物、または培養細胞が保有するプロモーターを用いることができるが、これに限られるものではなく、具体的には、例えば、宿主が大腸菌の場合にはＴ３、Ｔ７、ｔａｃ、ｌａｃプロモーター等を用いることができ、酵母の場合には、例えば、ｎｍｔ１プロモーター、Ｇａｌ１プロモーター等を用いることができる。また宿主が動物細胞の場合にはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が好ましく用いられる。
【００４８】
また哺乳動物由来のプロモーターが機能可能な宿主を用いる場合には、本発明の遺伝子に固有のプロモーターを用いることもできる。これらのベクターへの本発明のＤＮＡの挿入は、該ＤＮＡまたはこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流に該遺伝子ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を連結して行えばよい。
【００４９】
このようにして作製した組換えベクターは、それ自体既知の方法により後述する宿主を形質転換して、ＤＮＡ導入体を作製することができる。宿主への該ベクターの導入方法として、具体的には、ヒートショック法（Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５４， （１９７０））、リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１，５５１， （１９８３））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５，１６６，（１９８２））、インビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２，５８１，（１９７５））、ウィルスベクター法（Ｃｅｌｌ，３７，１０５３，（１９８４））、および電気パルス法（Ｃｈｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５，１３３１（１９８７））等が挙げられる。
【００５０】
ＤＮＡ導入体を作製するための宿主としては、本発明のＤＮＡが体内で発現するものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）−昆虫細胞、あるいは動物細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではＢＬ２１、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）等、酵母ではＳＰ−Ｑ０１（ストラタジーン社製）等、バキュロウィルスではＡｃＮＰＶ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４０６，（１９８８））とその宿主であるＳｆ−９細胞（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４０６，（１９８８））等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞Ｃ１２７（Ｊ．Ｖｉｏｌ．，２６，２９１，（１９７８））やチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７７，４２１６， （１９８０））等が挙げられるが、発現量やスクリーニングの簡便さから好ましくはアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１：アメリカン タイプ カルチャー コレクション保存細胞）ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）またはヒト子宮頸部癌ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）が用いられる。
【００５１】
上記したようなタンパク質発現用ベクターを用いる発現方法の他に、プロモーターを連結した本発明のＤＮＡ断片を宿主微生物の染色体中に直接挿入する相同組換え技術（Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７，２０３６，（１９９３））、あるいはトランスポゾンや挿入配列（Ａ．Ａ． Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ． ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１，７３９， （１９９４））等を用いてＤＮＡ導入体を作製することもできる。
【００５２】
得られた培養物は細胞、あるいは菌体を遠心分離等の方法により収集し、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム、および／または凍結融解等のそれ自体既知の適当な方法により破壊した後、遠心分離や濾過等によりタンパク質粗精製液を得、さらに適当な精製方法を組み合わせることにより精製することができる。かくして、本発明のタンパク質が取得される。上記したタンパク質発現組換えベクターを用いる発現方法の他に、上記（１）で取得された本発明のＤＮＡを無細胞転写翻訳系に供することによりタンパク質発現を誘導し、本発明のタンパク質を取得することができる。本発明で用いられる無細胞転写翻訳系とは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写、およびｍＲＮＡからタンパク質への翻訳に必要な全ての要素を含む系であり、そこにＤＮＡを加えることによってそのＤＮＡがコードしているタンパク質が合成されるようなあらゆる系を指す。無細胞転写翻訳系の具体例としては、真核細胞、およびバクテリア細胞、又はそれらの一部からの抽出液に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられ、特に好ましい具体例としては、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽、大腸菌からの抽出液（大腸菌Ｓ３０抽出液）に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられる。
【００５３】
得られた無細胞転写翻訳系の転写翻訳産物からの、本発明のタンパク質の分離、および精製は、それ自体既知の通常用いられる方法で行うことができる。具体的には、例えばエピトープペプチド、ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質等をコードするＤＮＡ領域を、前記した転写翻訳されるべきＤＮＡに導入し、前記の通り発現させ、該タンパク質と親和性を有する物質とのアフィニティーを利用して精製することができる。
【００５４】
目的とするタンパク質の発現は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等で分離し、クマシーブリリアントブルー（シグマ社製）等で染色するか、または後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体により検出する方法等によって確認できる。また一般的に、発現されたタンパク質は生体内に存在するタンパク質分解酵素により切断されること（プロセッシング）が知られている。本発明のタンパク質も当然のことながら切断されたアミノ酸配列の部分断片であっても、タンパク質結合活性を有するものであれば、本発明のタンパク質に含まれる。
【００５５】
かくして得られたタンパク質は、他のタンパク質、ＤＮＡとの相互作用等を解析することにより、生体内における多面的な機能を知ることができる。上記相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法等が挙げられる。
【００５６】
（３）オリゴヌクレオチドの調製
上記（１）に記載の方法で取得した本発明のＤＮＡまたはその断片を用いて、ＤＮＡ合成機などを用いる常法により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。
【００５７】
該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。具体例としては、配列番号１で表される塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記のオリゴヌクレオチドが好ましい。また、配列の長さは、一般的には５〜１００塩基であり、好ましくは１０〜６０塩基であり、より好ましくは１５〜５０塩基である。
【００５８】
また、これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等を挙げることができる。
【００５９】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、これを２本鎖ＲＮＡとして調製し、被導入体へ導入し、標的遺伝子の発現を阻害するＲＮＡインターフェアレンス法に用いることができる。ＲＮＡインターフェアレンス法については、例えば、（Ｅｌｂａｓｈｉｒ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ４９４−４９８（２００１））に記載の方法等を用いることができる。また、上記２本鎖ＲＮＡは必ずしも全てがＲＮＡである必要はなく、例えば、ＷＯ０２／１０３７４号公報に記載のもの等も用いることができる。
【００６０】
ここで、標的遺伝子としては、本発明のＤＮＡであれば、如何なるものであってもよい。これらＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一な配列からなる２本鎖ＲＮＡ（以下、これを「２本鎖ポリヌクレオチド」と称することがある）とは、標的遺伝子の塩基配列のうち、いずれの部分でもよい１５ｂｐ以上の配列と実質的に同一な配列からなるものである。ここで、実質的に同一とは、標的遺伝子の配列と８０％以上の相同性を有することを意味する。ヌクレオチドの鎖長は１５ｂｐから標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長までの如何なる長さでもよいが、１５〜５００ｂｐ程度のものが好ましく用いられる。ただし、哺乳類動物由来の細胞おいては、３０ｂｐ以上の長い２本鎖ＲＮＡに反応して活性化するシグナル伝達系の存在が知られている。これはインターフェロン反応と呼ばれており（Ｍａｒｅｕｓ， Ｐ． Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ， ５， １１５−１８０（１９８３））、該２本鎖ＲＮＡが細胞内に侵入すると、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ：Ｂａｓｓ， Ｂ．Ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ４２８−４２９（２００１））を介して多くの遺伝子の翻訳開始が非特異的に阻害され、それと同時に２’，５’ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｂａｓｓ， Ｂ．Ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１， ４２８−４２９（２００１））を介してＲＮａｓｅＬの活性化が起こり、細胞内のＲＮＡの非特異的な分解が惹起される。これらの非特異的な反応のために、標的遺伝子の特異的反応が隠蔽されてしまう。従って哺乳類動物、または該動物由来の細胞、あるいは組織を被導入体として用いる場合には１５〜３０ｂｐ、好ましくは１９〜２４ｂｐ、最も好ましくは２１ｂｐの２本鎖ポリヌクレオチドを用いることが好ましい。２本鎖ポリヌクレオチドはその全体が２本鎖である必要はなく、５’または３’末端が一部突出したものも含むが、３’末端が２塩基突出したものを用いることが好ましい。２本鎖ポリヌクレオチドは相補性を有する２本鎖のポリヌクレオチドを意味するが、自己相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドが自己アニーリングしたものでもよい。自己相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドとしては、例えば、逆方向反復配列を有するもの等が挙げられる。
【００６１】
２本鎖ポリヌクレオチドの調製方法としては、特に制限はないが、それ自体既知の化学合成方法を用いることが好ましい。化学合成は、相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドを別個に合成し、これを適当な方法で会合させることにより２本鎖とすることができる。会合の方法として具体的には、例えば、合成した１本鎖ポリヌクレオチドを混合し、２本鎖が解離する温度にまで加熱し、その後徐々に冷却する方法等が挙げられる。会合した２本鎖ポリヌクレオチドは、アガロースゲル等を用いて確認し、残存する１本鎖ポリヌクレオチドを適当な酵素により分解する等して除去する。
【００６２】
このようにして調製した２本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写、またはタンパク質に翻訳を受け得るものであれば如何なるものであってもよいが、具体的には、植物、動物、原生動物、ウィルス、バクテリア、または真菌種に属するものが挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってよい。好ましい微生物は、農業または工業で使用されるものであり、そして植物または動物に対して病原性のものである。真菌には、カビ及び酵母形態両方での生物体が含まれる。脊椎動物の例には、魚類、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット及びヒトを含む哺乳動物が含まれ、無脊椎動物には、線虫類及び他の虫類、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、及び他の昆虫が含まれる。好ましくは、細胞は脊椎動物細胞である。
【００６３】
被導入体は、細胞、組織、あるいは個体を意味する。ここで細胞とは、生殖系列または体性、分化全能、または多分化能、分割または非分割、実質組織または上皮、不滅化したものまたは形質転換したもの等からであってよい。細胞は、配偶子または胚であってよく、胚の場合、単一細胞胚または構成性細胞、または多重細胞胚からの細胞であり、胎児組織を含む。さらには、幹細胞のような未分化細胞、または胎児組織を含む器官または組織の細胞からのような分化細胞、または生物内に存在する任意の他の細胞であってよい。分化している細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌腺または外分泌腺の細胞が含まれる。
【００６４】
被導入体への２本鎖ポリヌクレオチドの導入法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、２本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウィスル感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、非経口（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウィルス感染等が用いられる。経口導入のための方法には、２本鎖ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合することができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、２本鎖ポリヌクレオチドを導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。
【００６５】
導入する２本鎖ポリヌクレオチドの量は、導入体や、標的遺伝子によって適宜選択することができるが、細胞あたり少なくとも１コピー導入されるに充分量を導入することが好ましい。具体的には、例えば、被導入体がヒト培養細胞で、カルシウムフォスフェート法により２本鎖ポリヌクレオチドを導入する場合、０．１〜１０００ｎＭが好ましい。
ＲＮＡインターフェアレンスによる本発明の遺伝子の導入体内での発現抑制により、本発明の遺伝子がコードするタンパク質の機能の確認、あるいは新たな機能の解析等を行うことができる。
【００６６】
（４）本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体
本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体の調製方法としては、通常用いられる公知の方法を用いることができ、抗原として用いられるポリペプチドについても、公知の方法に従って抗原性が高くエピトープ（抗原決定基）として適した配列を選択して用いることができる。エピトープの選択方法としては、例えばＥｐｉｔｏｐｅ Ａｄｖｉｓｅｒ（富士通九州システムエンジニアリング社製）等の市販のソフトウェアを用いることができる。
【００６７】
上記の抗原として用いるポリペプチドは、公知の方法に従って合成した合成ペプチドでも、また本発明のタンパク質そのものを用いることもできる。抗原となるポリペプチドは、公知の方法に従って適当な溶液等に調製して、哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ラット等に免疫を行えばよいが、安定的な免疫を行ったり抗体価を高めるために抗原ペプチドを適当なキャリアタンパク質とのコンジュゲートにして用いたり、アジュバント等を加えて免疫を行うのが好ましい。
【００６８】
免疫に際しての抗原の投与経路は特に限定されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、あるいは筋肉内等のいずれの経路を用いてもよい。具体的には、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスに抗原ポリペプチドを数日〜数週間おきに数回接種する方法等が用いられる。また、抗原の摂取量としては、抗原がポリペプチドの場合０．３〜０．５ｍｇ／１回程度が好ましいが、ポリペプチドの種類、また免疫する動物種によっては適宜調節される。
【００６９】
免疫後、適宜試験的に採血を行って固相酵素免疫検定法（以下、これを「ＥＬＩＳＡ法」と称することがある）やウエスタンブロッティング等の方法で抗体価の上昇を確認し、十分に抗体価の上昇した動物から採血を行う。これに抗体の調製に用いられる適当な処理を行えばポリクローナル抗体を得ることができる。具体的には、例えば、公知の方法に従い血清から抗体成分を精製した精製抗体を取得する方法等が挙げられる。抗体成分の精製は、遠析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いることができる。
【００７０】
また、該動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを用いて公知の方法に従って融合させたハイブリドーマを用いる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６， ４９５（１９７５））ことによりモノクローナル抗体を作製することもできる。モノクローナル抗体は、例えば以下の方法により取得することができる。
【００７１】
まず、上記した抗原の免疫により抗体価の高まった動物から抗体産生細胞を取得する。抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体の何れから取得してもよいが、好ましくは脾臓、リンパ節、末梢血等から取得する。これらの細胞と融合させるミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来等）ミエローマ細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８０）、Ｐ３−ＮＳ１／１Ａｇ４．１（理研セルバンク：ＲＣＢ００９５）等が好ましく用いられる。細胞の融合は、抗体産生細胞とミエローマ細胞を適当な割合で混合し、適当な細胞融合培地、例えばＲＰＭＩ１６４０やイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、あるいはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等に、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を溶解したもの等を用いることにより行うことができる。また電気融合法（Ｕ． Ｚｉｍｍｅｒ− ｍａｎｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ，６８， ５７７（１９８１））によっても行うことができる。
【００７２】
ハイブリドーマは、用いたミエローマ細胞株が８−アザグアニン耐性株であることを利用して適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液を含む正常培地（ＨＡＴ培地）中で５％ＣＯ２、３７℃で適当時間培養することにより選択することができる。この選択方法は用いるミエローマ細胞株によって適宜選択して用いることができる。選択されたハイブリドーマが産生する抗体の抗体価を上記した方法により解析し、抗体価の高い抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等により分離し、分離した融合細胞を適当な培地で培養して得られる培養上清から硫安分画、アフィニティクロマトググラフィー等の適当な方法により精製してモノクローナル抗体を得ることができる。また精製には市販のモノクローナル抗体精製キットを用いることもできる。さらには、免疫した動物と同系統の動物、またはヌードマウス等の腹腔内で上記で得られた抗体産生ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることもできる。
【００７３】
また、本発明のタンパク質としてヒト由来のものを取得した場合には、かかるポリペプチド、あるいはその部分ペプチドを抗原として、ヒト末梢血リンパ球を移植したＳｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに上記した方法と同様にして免疫し、該免疫動物の抗体産生細胞とヒトのミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製することによってもヒト型抗体を作製することができる（Ｍｏｓｉｅｒ， Ｄ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ３３５， ２５６−２５９ （１９８８）； Ｄｕｃｈｏｓａｌ， Ｍ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５５， ２５８−２６２ （１９９２））。
【００７４】
また、取得したヒト型抗体を産生するハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、目的のヒト型抗体をコードする遺伝子をクローニングして、この遺伝子を適当なベクターに挿入し、これを適当な宿主に導入して発現させることにより、さらに大量にヒト型抗体を作製することができる。ここで、抗原との結合性の低い抗体は、それ自体既知の進化工学的手法を用いることによりさらに結合性の高い抗体として取得することもできる。一価性抗体等の部分フラグメントは、例えばパパイン等を用いてＦａｂ部分とＦｃ部分を切断し、アフィニティカラム等を用いてＦａｂ部分を回収することによって作製することができる。
【００７５】
かくして得られる本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体は、本発明のタンパク質に特異的に結合することによって該タンパク質が有するタンパク質結合活性を阻害する中和抗体として用いることもできる。タンパク質が有する活性を阻害するものの選択方法としては特に制限はないが、例えば、上記（２）で作製したＤＮＡ導入体に抗体を接触させ、導入体中の目的タンパク質の機能が阻害されるか否かを解析する方法等が挙げられる。
【００７６】
かかる中和抗体は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【００７７】
（５）本発明のタンパク質が有する活性の確認および機能の解析
本発明のタンパク質は、これを上記（２）のとおり組み換えタンパク質として作製し、これを解析することにより上記（１）で推測した活性を有していることを確認することができる。さらに上記（４）のとおりに作製した抗体等との組み合わせにより解析することもできる。
タンパク質−タンパク質結合活性の確認は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ とタンパク質−タンパク質結合アッセイによって次の通り行うことができる （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５， ７８９４−７９０１ （２０００））。
結合活性を測定しようとする該タンパク質をＡとし、その相手をＢとする。Ａの完全長ｃＤＮＡとＢの完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＧＥＭ−ＡとプラスミドｐＧＳＴ−Ｂ （Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２１， ２０８−２１４ （１９９６）） を、Ｐｒｏｍｅｇａ社ＴＮＴ ＳＰ６ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ｓｙｓｔｅｍによるｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎとｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎに用いる。そのとき、［３５Ｓ］ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ （Ａｍｅｒｓｈａｍ社） ４０μＣｉを全容量５０μｌに加えることにより、放射性物質標識することができる。
【００７８】
翻訳産物はｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質−タンパク質結合に供する。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合に関しては、例えば、５０μｌの［３５Ｓ］ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅラベルしたタンパク質Ａを、ＧＳＴとＢの融合タンパク質ＧＳＴ−Ｂ ４−５μｇを含むグルタチオン樹脂でインキュベートする。
反応は、ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ （１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０，５０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ （ｐＨ ７．５））、１ ｍＭ ＰＭＳＦ、タンパク質分解酵素阻害剤を用いて、４ ℃、４時間、緩やかに揺することで行うことができる。
【００７９】
樹脂表面に形成されたタンパク質−タンパク質複合体は、４ ℃で、１４，０００ ｒｐｍ １分間超遠心分離し、樹脂は４ ℃で１ ｍｌのｃｏｌｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄する。樹脂に結合したＧＳＴ融合タンパク質Ｂと結合したタンパク質Ａは、ＳＤＳ−１２％ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ上で分離され，ｇｅｌを乾燥した後、ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙを実施することにより、タンパク質ＡとＢの結合活性を検討することができる。
これらの機能アッセイ系は、後述する本発明のタンパク質の機能賦活物質や機能阻害物質のスクリーニングや本発明のタンパク質の発現調節物質のスクリーニングにも用いることができる。なお、本発明のタンパク質が有する活性の確認はこれらの方法に限定されない。
【００８０】
本発明のタンパク質の機能解析方法として、一般的には、例えば、（ｉ）各組織、疾患、あるいは発生段階における発現状態を比較解析する方法、（ｉｉ）他のタンパク質、ＤＮＡとの相互作用を解析する方法、（ｉｉｉ）適当な細胞あるいは個体へ導入し、表現型の変化を解析する方法、（ｉｖ）適当な細胞あるいは個体において該タンパク質の発現を阻害して表現型の変化を解析する方法などが挙げられる。また、このような方法によれば、対象タンパク質に特異的な活性を多面的に解析することができる。
【００８１】
上記（ｉ）の方法においては、本発明のタンパク質の発現を、ｍＲＮＡレベルあるいはタンパク質レベルで解析することができる。ｍＲＮＡレベルで発現量を解析する場合は、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．， Ｅｄ． ｂｙ Ｈａｒｒｉｓ， Ｎ． ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ， Ｄ． Ｇ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９０））、ＤＮＡチップを利用したハイブリダイゼーション法、定量ＰＣＲ法等が用いられる。また、タンパク質レベルで解析する場合には、後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法や組織染色法などが挙げられる。ここで、解析の対象タンパク質に公知のバリアントが存在する場合には、解析対象タンパク質をコードするｃＤＮＡにのみ存在し、公知のバリアントをコードするｃＤＮＡとはハイブリダイズしないプローブを用いることが好ましい。定量ＰＣＲ法の場合には、対象ｃＤＮＡと公知バリアント間で異なる長さの増幅断片ができるプライマーを選択して行う方法（Ｗｏｎｇ， Ｙ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔ．， ３２０： １４１−１４５ （２００２））等が挙げられる。また、タンパク質レベルで解析する場合にも、対象タンパク質にのみ反応し、公知のバリアントには反応しない抗体を用いることが好ましい。
【００８２】
上記（ｉｉ）の方法においては、本発明のタンパク質と既知のタンパク質との相互作用の有無を調べて、本発明のタンパク質の機能を解析することができる。相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法等が挙げられる。該方法においても、解析対象タンパク質に公知のバリアントが存在する場合には、公知のバリアントも同様にして相互作用する物質を解析し、対象タンパク質特異的に相互作用する物質を同定することが好ましい。
【００８３】
上記（ｉｉｉ）の方法では、本発明のｃＤＮＡを導入する細胞は特に制限はないが、ヒト培養細胞等が特に好ましく用いられる。ＤＮＡの細胞への導入法としては、上記（２）に記載のものが挙げられる。さらに導入細胞の表現型としては、細胞の生死、細胞の増殖速度、細胞の分化、細胞が神経細胞の場合には神経突起の伸長度、細胞内タンパク質の局在や移行など顕微鏡等で観察可能なものや、細胞内の特定タンパク質の発現変化など生化学的実験により解析可能なものも含む。これらの表現型は、対象タンパク質に公知のバリアントが存在する場合には、本発明のＤＮＡあるいは公知のバリアントをコードするＤＮＡを同様に細胞へ導入し、比較解析することにより、対象タンパク質が関連する表現型を同定することができる。また、本発明のタンパク質はタンパク質結合活性を有するものであることがわかっているので、タンパク質結合活性が関連する疾患に見られる表現型等に注目して解析することも好ましい。
【００８４】
上記（ｉｖ）の方法では、後述するオリゴヌクレオチドを用いた方法や、ＲＮＡインターフェアレンス法により効率的に行うことができる。この方法においても、解析する対象タンパク質に、公知のバリアントが存在する場合には、公知のバリアントやその他のバリアントについても同様の解析を行い、比較解析することにより対象タンパク質特異的な機能を同定することができる。
【００８５】
（６）本発明のタンパク質が有する活性を調節する分子のスクリーニング
本発明のタンパク質に特異的に結合し、かつ本発明のタンパク質の機能（活性）を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質をスクリーニングすることにより本発明のタンパク質の機能調節物質（以下、これを「調節物質」と称することがある）を得ることができる。
【００８６】
この調節物質のスクリーニング方法は、本発明のタンパク質に特異的に結合し、且つ該タンパク質の活性を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質が得られる方法であれば如何なるものであってもよい。例えば、まず本発明のタンパク質と被検物質とを接触させ、該タンパク質との結合性を指標として選抜した後に、本発明のタンパク質が有する活性の変化を指標として被検物質を選抜する方法を用いることができる。
【００８７】
被検物質としては、本発明のタンパク質と相互作用して、該タンパク質が有する活性に影響を及ぼす可能性のある物質であれば如何なるものであってもよいが、具体的には、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。これらの物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。被検物質と本発明のタンパク質の相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法、免疫沈降法、プルダウンアッセイ、あるいは上記（４）に記載した抗体との競合解析法等が挙げられる。このような方法により、本発明のタンパク質に結合する活性を見いだされた物質は、次に該物質の存在下で本発明のタンパク質が有する活性がどのような影響を受けるかを解析することによって、調節物質として用いられるか否かが同定される。
【００８８】
ここで、医薬活性成分のスクリーニングを目的とするために用いる本発明のＤＮＡあるいは組み換えタンパク質については、上記したヒトのホモログタンパク質またはオルソログタンパク質を用いることが好ましい。さらに上記方法によってスクリーニングされた物質は、これらの生体内でのスクリーニングによって医薬候補としての選択を行ってもよい。
【００８９】
そこで、本スクリーニング方法により同定できる化合物は、例えば、循環器疾患、精神・神経疾患、代謝性疾患、癌、免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患等の治療剤として用いられ得るものである。
【００９０】
かかる調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【００９１】
（７）本発明のＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング
スクリーニングの方法としては、被検物質の存在下で本発明のタンパク質、あるいはそれをコードするｍＲＮＡの発現量を解析する方法等が挙げられる。具体的には、例えば、上記（２）に記載した本発明のタンパク質を発現する細胞を被検物質を含む適当な培地で培養し、該細胞内に発現している本発明のタンパク質量をＥＬＩＳＡ等の常法を用いて解析するか、あるいは該細胞内の本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を、定量的逆転写ＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等により解析することにより行うことができる。
【００９２】
被検物質としては、上記（６）に記載の物質を用いることができる。この解析により、被検物質の非存在下で培養された当該細胞内で発現されたタンパク質、あるいはｍＲＮＡ量と比べてその量が増加すれば、物質は本発明のＤＮＡの発現促進物質として機能する可能性があり、逆に減少した場合には、物質は本発明のＤＮＡの発現阻害物質として用いられ得ると判断することができる。
【００９３】
かかる発現調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【００９４】
（８）本発明のＤＮＡ導入動物
上記（１）に記載の、本発明のＤＮＡを含む導入ＤＮＡを構築し、ヒト以外の哺乳動物の受精卵に導入して、これを雌個体子宮に移植して発生させることにより、本発明のＤＮＡが導入された非ヒト哺乳動物を作製することができる。より具体的には、例えば、雌個体をホルモン投与により過剰排卵させた後、雄と交配し、交配後１日目の卵管から受精卵を摘出し、該受精卵に導入ＤＮＡをマイクロインジェクション等の方法により導入する。この後、適当な方法で培養した後、生存している受精卵を、偽妊娠させた雌個体（仮親）の子宮に移植して出産させる。新生仔に目的のＤＮＡが導入されているか否かは、該個体の細胞から抽出したＤＮＡのサザンブロット解析を行うことにより同定することができる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられる。
【００９５】
かくして得られた本発明のＤＮＡ導入動物は、この個体を交配し、導入されたＤＮＡが安定的に保持されていることを確認しながら通常の飼育環境で継代飼育することによりその子孫を得ることができる。また、体外受精を繰り返すことによりその子孫を得て、系統を維持することもできる。
本発明のＤＮＡが導入された非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの生体内における機能の解析や、またこれを調節する物質のスクリーニング系等として用いることができる。
【００９６】
（９）本発明のタンパク質及びそれをコードする塩基配列を含むＤＮＡの他の利用
本発明のタンパク質は、それを基盤上に結合させた担体として利用することができる。また、本発明のタンパク質をコードする塩基配列、例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ及びその部分断片は、それらを基板上に結合させた担体として用いることができる。これらを、以下、「プロテインチップ」、「ＤＮＡチップ」または「ＤＮＡアレイ」（ＤＮＡマイクロアレイ及びＤＮＡマクロアレイ）と称することがある。これらのプロテインチップ、又はＤＮＡチップもしくはアレイには、本発明のタンパク質やＤＮＡ以外に、他のタンパク質やＤＮＡが含まれていてもよい。
【００９７】
ここで、タンパク質やＤＮＡを結合させる基盤としては、ナイロン膜、ポリプロピレン膜等の樹脂基板、ニトロセルロース膜、ガラスプレート、シリコンプレート等が用いられるが、ハイブリダイゼーションの検出を非ＲＩ的に、例えば、蛍光物質等を用いて行う場合には、蛍光物質を含まないガラスプレート、シリコンプレート等が好適に用いられる。また該基盤へのタンパク質、あるいはＤＮＡの結合は、それ自体公知の通常用いられる方法により容易に行うことができる。これらのプロテインチップ、ＤＮＡチップ、あるいはＤＮＡアレイも、本発明の範囲に含まれる。
【００９８】
また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列及びＤＮＡの塩基配列は、配列情報としても用いることができる。ここで、ＤＮＡの塩基配列には、対応するＲＮＡの塩基配列も含まれる。すなわち、得られたアミノ酸配列や塩基配列をコンピュータが読みとり可能な所定の形式で適当な記録媒体に格納することにより、アミノ酸配列や塩基配列のデータベースが構築できる。このデータベースには、他の種類のタンパク質やそれをコードするＤＮＡの塩基配列が含まれていてもよい。また、本発明においてデータベースとは、上記配列を適当な記録媒体に書き込み、所定のプログラムに従って検索を行うコンピュータシステムをも意味する。ここで適当な記録媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ等の光ディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。
【００９９】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１ ｃＤＮＡライブラリーの調製
（１）ｍＲＮＡの調製
ｍＲＮＡ調製マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）各器官または組織０．５〜１ｇを１０ｍｌの懸濁液でホモジェナイズし、ｐＨ４．０ の２Ｍ 酢酸ナトリウム１ｍｌ と、同量のフェノール／ クロロホルム（体積比５：１）混液を加え抽出した。抽出後水層に同量のイソプロパノールを加えると、ＲＮＡが水相から分離沈澱した。この試料を氷の上で１時間インキュベーションした後、１５分間４，０００ｒｐｍで冷却遠心機にかけ、沈澱物を回収した。この検体を７０％エタノールで洗い、８ｍｌの水に溶解後２ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、１ ％ ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙ− ｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、４Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓを含むｐＨ７．０ の水溶液１６ｍｌを加えることでＲＮＡを沈澱させ、ポリサッカライドを除いた（ＣＴＡＢ沈澱）。
【０１００】
続いて室温で４，０００ｒｐｍ、１５分間遠心機にかけ、ＲＮＡを４ｍｌの７Ｍグアニジン−Ｃ１に溶解した。そして２倍量のエタノールを加えた後、氷上で１時間インキュベーションし、４，０００ｒｐｍ、１５分間遠心機にかけ、生じた沈澱物を７０％エタノールで洗いＲＮＡを回収した、これを再度水に溶解し、ＲＮＡの純度をＯＤ比２６０／２８０（＞１．８）と２３０／２６０（＜０．４５）を読むことによって計測した。
【０１０１】
（２）第１鎖ｃＤＮＡの調製
上記（１）で調製したｍＲＮＡ １５μｇを使って逆転写酵素３，０００ｕｎｉｔ により、最終容量１６５μｌの反応液中で、５−メチル−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰを各々０．５４ｍＭ、０．６Ｍトレハロース、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、５２ｎｇ／μｌ ＢＳＡ、ＲＮａｓｅインヒビター ５ｕｎｉｔの条件下で逆転写反応を行った。制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含むオリゴヌクレオチド（配列番号９）（配列中、ＶはＡ，Ｇ，又はＣを示し、ＮはＡ，Ｇ，Ｃ，又はＴを示す）１２．６μｌをプライマーとして用いた。
【０１０２】
この反応を始める際、反応液の１／４を採取し、それに１．５μｌの［α−３２Ｐ］−ｄＧＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０μＣｉ／μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を加えることにより、第１鎖ｃＤＮＡの合成効率を測定した。ＲＩ標識した反応液の０．５μｌをＤＥ−８１ペーパー上にスポットし、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗った前後のＲＩ活性を測定し、計算した。その後、ＲＩ標識した反応液と非標識の反応液を混合し、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ８μｌ、１０％ＳＤＳ ２μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ ２０μｇを加え、４５℃で１５分間加熱した。フェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱後、沈澱をＲＮａｓｅ フリーに処理してある水（以下ＲＮａｓｅフリー水とする）４７μｌに溶解した。
【０１０３】
（３）５’キャップ構造及び３’末端へのビオチン付加
ＲＮＡジオールのビオチン化ＲＮＡのジオール部位（Ｃａｐ構造のある５’末端と、ポリＡ鎖のある３’末端のリボースの双方に存在）にビオチンを結合させるために、２段階の反応を行った。それらは、ジオール基の酸化とそれに続くビオチンヒドラジドと酸化ＲＮＡ体のカップリング反応である。まず、逆転写反応で得られたＲＮＡ−第１鎖ｃＤＮＡ複合体１５μｇを、６．６ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）と、酸化剤として過ヨウ素酸ナトリウムを用いて５０μｌの反応液中で処理した。この酸化反応は遮光条件下、氷上で４５分間行った。
【０１０４】
続いて、５Ｍ塩化ナトリウム１１μｌ、１０％ＳＤＳ ０．５μｌ、そして同量のイソプロパノールを加え、６０分間氷上に放置した後、４℃で１５分間１５，０００ｒｐｍ遠心し沈澱を取得した。沈澱物は７０％エタノールで洗い、ＲＮａｓｅフリー水５０μｌに再溶解させた。その試料に１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）５μｌ、１０％ＳＤＳ ５μｌ、１０ｍＭビオチンヒドラジド（Ｓｉｇｍａ社製）１５０μｌを加え、室温（２２〜２６℃）で終夜反応させた。最後に、５μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）７５μｌ、及び２．５倍量のエタノールを加え、１時間の氷上冷却後、４℃において１５分間遠心し、ビオチン化した。反応後、反応液を１５分間遠心し、再度ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を沈澱させた。沈澱物は７０％エタノールで１回、更に８０％エタノールで１回洗い、ＲＮａｓｅフリー水７０μｌに溶解した。
【０１０５】
（４）ＲＮａｓｅ Ｉによる完全長ｃＤＮＡの選択
上記（３）で取得したビオチン化ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体について、１本鎖ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅ Ｉで処理することにより、逆転写反応時に完全なｃＤＮＡの伸長が得られなかったｍＲＮＡ、およびｍＲＮＡの３’末端に標識されたビオチン残基を取り除いた。具体的には、上記（３）で得られた試料７０μｌに１０×ＲＮａｓｅ Ｉバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＯＡｃ）１０μｌ、ＲＮａｓｅ Ｉ（ＲＮａｓｅ ＯｎｅＴＭ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）２００ｕｎｉｔを加えて、３７℃で１５分間１本鎖ＲＮＡを消化した。
【０１０６】
（５）完全長ｃＤＮＡの採取
ストレプトアビジンコートしたマグネティックビーズにｃＤＮＡが非特異的吸着するのを防止するため、１００μｇの酵母ｔＲＮＡ（ＤＮａｓｅ Ｉ処理したもの）を５ｍｇ（５００μｌ）のマグネティックビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐｏｒｏｕｓ ｇｌａｓｓ（ＭＰＧ）ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＣＰＧ，ＮＪ））に加え、１時間氷上に放置した後、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌの溶液にて洗った。
【０１０７】
このビーズを５０ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌの溶液５００μｌ中に懸濁し、（４）で取得したＲＮａｓｅ Ｉ処理を施されたｃＤＮＡを加えた。室温にて３０分間撹拌することで、マグネティックビーズと完全長ｃＤＮＡを結合させた。完全長ｃＤＮＡを捕獲したビーズを５０ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌの溶液で４回、０．４％ＳＤＳ、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡで１回、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０％ グリセロールで１回、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡ水溶液で１回、ＲＮａｓｅ Ｈ バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、 ２０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で１回洗浄した後、ＲＮａｓｅ Ｈ用バッファー１００μｌに懸濁し、ＲＮａｓｅ Ｈ ３ｕｎｉｔを加え、３７℃下３０分間加温した。その後、１０％ＳＤＳ １μｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ２μｌを加えて、１０分間、６５℃に曝し、その上清を回収した。
【０１０８】
このようにして回収された１本鎖完全長ｃＤＮＡはフェノール／クロロホルムで抽出され、スピードバッグにて液量を１００μｌ以下に減じてからＧ２５／Ｇ１００Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーに付した。ＲＩ活性を持った分画はシリコン処理したマイクロチューブに収集するとともに、グリコーゲン２μｇ を加え、エタノール沈澱にて得られた沈澱物を３０μｌの超純水に溶解した。
【０１０９】
（６）１本鎖ｃＤＮＡへのオリゴｄＧ付加
上記（５）で回収された１本鎖ｃＤＮＡ３０μｌは、最終容量５０μｌの反応液中で、２００ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．９）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣｏＣｌ２、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１００μＭ ｄＧＴＰの条件のもと、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）３２ｕｎｉｔを用いて３７℃で３０分間のオリゴｄＧ付加反応に付した。反応終了時にＥＤＴＡを５０ｍＭとなるように加え、一連のフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱を経て、３１μｌの超純水に溶解した。
【０１１０】
（７）第２鎖ｃＤＮＡ合成
第１鎖ｃＤＮＡを鋳型にした第２鎖ｃＤＮＡの合成は以下のように行った。最終容量６０μｌの反応系で、第２鎖低バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍｇ／μｌＢＳＡ）３μｌ、第２鎖高バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、６００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２）３μｌ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ各々０．２５ｍＭ、β−ＮＡＤＨ ６μｌ、オリゴｄＧ付加された第１鎖ｃＤＮＡ３１μｌ、第２鎖プライマー−アダプター（配列番号１０）６００ｎｇ を加え、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ；ＴａＫａＲａ社製）１５ｕｎｉｔ、耐熱性ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）１５０ｕｎｉｔ、耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）３ｕｎｉｔによって第２鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１１１】
０．５Ｍ ＥＤＴＡを１μｌ加えることで反応を停止させ、更にタンパク成分を溶解するために、１０％ＳＤＳ １μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ １０μｇの存在下に４５℃で１５分間加熱し、最終的にフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱にて精製した２本鎖完全長ｃＤＮＡを得た。
【０１１２】
（８）ライブラリーの調製
以上の方法により得られた二本鎖完全長ｃＤＮＡは、λＺＡＰＩＩＩベクターに挿入し、ライブラリーとして回収した。λＺＡＰＩＩＩベクターはλＺＡＰＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）ベクターのマルチクローニングサイトの一部の配列である配列番号１１を配列番号１２に改変し、二つのＳｆｉＩサイトを新たに導入したものである。
【０１１３】
さらにλＰＳ（ＲＩＫＥＮ）ベクターを作製し、ｃＤＮＡを挿入した。λＰＳ（ＲＩＫＥＮ）（λ−ＦＬＣ−１と命名（ＦＬＣとはＦＵＬＬ−ＬＥＮＧＴＨ ｃＤＮＡを意味する））とは、ＭｏＢｉＴｅｃ社（ドイツ）のλＰＳベクターをｃＤＮＡ用に改変したものである。即ち１０ｋｂｐ ｓｔｕｆｆｅｒの両側に存在するクローニングサイトにｃＤＮＡ挿入に便利なＢａｍＨＩならびにＳａｌＩを各々導入するとともに、０．５ｋｂから１３ｋｂ程度までのｃＤＮＡがクローニングできるようにＸｂａＩサイトに６ｋｂのＤＮＡ断片を挿入したものである（特開２０００−３２５０８０号公報）。このλ−ＦＬＣ−１を用いると、例えば肺臓ｃＤＮＡライブラリーの場合には、インサートの平均鎖長は２．５７ｋｂとなり、実際に０．５ｋｂから１２ｋｂまでのインサートをクローニングすることが出来た。従来法のλＺＡＰの場合には、インサートの平均鎖長は０．９７ｋｂであったことから、λ−ＦＬＣ−１を用いることによって、サイズの大きなｃＤＮＡもλＺＡＰに比べて効率よくクローニングできることがわかる。
【０１１４】
実施例２ 完全長ｃＤＮＡライブラリーのノーマライゼーション／サブトラクション
（１）ドライバーの調製
実施例１（１）で作製したｍＲＮＡ（以下、これを「（ａ）ＲＮＡドライバー」と称することがある）、及びｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応で作成したＲＮＡをドライバーとして用いた。後者のＲＮＡはさらに２種類（以下、これを「（ｂ）ＲＮＡドライバー、及び「（ｃ）ＲＮＡドライバー」と称する）に分けられる。１つはノーマライゼーションにより除かれたＲＮＡ−ｃＤＮＡからｃＤＮＡを回収し、ファージベクターにクローニングしたものである。大腸菌に感染後１つの出発材料あたり１０００から２０００プラークを混ぜ合わせて１つのライブラリー（ミニライブラリー）とし、常法によりプラスミドＤＮＡに変換する（ファージをヘルパーファージとともに再度大腸菌に感染させ、ファージミドとし、さらにもう一度感染させてプラスミドＤＮＡを得る）。
【０１１５】
得られたＤＮＡについてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応（Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる）を行い、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＲＱ１−ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理後、フェノール／クロロホルム抽出をして（ｂ）ＲＮＡドライバーを得た。この際、通常出発材料としては９種類（すい臓、肝臓、肺、腎臓、脳、脾臓、睾丸、小腸、胃）の組織からそれぞれミニライブラリーを作成して、９種類のミニライブラリーを混合してＲＮＡを得る。もう一つのＲＮＡはすでに重複のないクローンとして保存されているライブラリー（クローン数約２万個）を培養し、得られたＤＮＡについて（ｂ）ＲＮＡドライバーと同様にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を行い（ｃ）ＲＮＡドライバーとした。
【０１１６】
これら３種のＲＮＡは、Ｌａｂｅｌ−ＩＴ Ｂｉｏｔｉｎ ＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いてビオチン化標識を行ったあと、１：１：１の割合でテスターｃＤＮＡに添加し、Ｒｏｔ１０での反応（４２℃）を行い、ストレプトアビジンビーズ（ＣＰＧ）処理を行って回収した上清について、第２鎖の合成を行った。
【０１１７】
実施例３ 完全長ｃＤＮＡクローンの塩基配列決定
（１）クローンのｒｅａｒｒａｙ
各クラスタからひとつの代表クローンを選んだ。代表クローンはＱ−ｂｏｔ（ＧＥＮＥＴＩＸ ＬＩＭＩＴＥＤ製）で選択し、３８４穴プレートにａｒｒａｙ化した。その際、大腸菌は３０℃で１８〜２４時間、５０μｌのＬＢ培地で培養した。このとき、ｃＤＮＡライブラリーがＰＳベクターに導入され大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換している場合には１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを添加し、Ｚａｐベクターに導入し、ＳＯＬＲシステムに導入している場合には１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び２５ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジンを添加して行った。
【０１１８】
（２）プラスミドの抽出とＩｎｓＳｉｚｉｎｇ
上記（１）で培養した各クローンは、さらに１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１．３ｍｌのＨＴ液中で培養され、遠心分離により菌体を回収した後、ＱＩＡｐｒｅｐ ９６ Ｔｕｒｂｏ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを回収、精製した。取得されたプラスミド中に挿入されているｃＤＮＡの鎖長を調べるために、上記で取得したプラスミドＤＮＡの１／３０を制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、１％のａｇａｒｏｓｅゲル電気泳動を行った。
【０１１９】
（３）配列決定
かくして取得されたプラスミド中に挿入された完全長ｃＤＮＡの全長の塩基配列解析には、３種類のシークエンサを用いた。また、プラスミドは挿入配列の長さが２．５ｋｂより短いものと長いものの２つのカテゴリに分けた。このうち２．５ｋｂより短い挿入配列を有するクローンについては両端から塩基配列を解析した。その際、プラスミドはベクターがＰＳの場合には配列番号１３（センス鎖）、及び１４（アンチセンス鎖）に記載のプライマーを用いて、またベクターがＺａｐの場合には配列番号１５（センス鎖）、及び１６（アンチセンス鎖）に記載のプライマーを用いてＴｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で反応し、Ｌｉｃｏｒ ＤＮＡ４２００（ｌｏｎｇ ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて解析した。
【０１２０】
上記塩基配列解析により解析ができなかったギャップは、プライマウォーキング法により決定した。その際、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３７７及び／またはＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．製）とＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔとＣｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．製）を用いた。
【０１２１】
また、挿入されているｃＤＮＡが２．５ｋｂより長いクローンの配列決定は、ショットガン法によった。その際、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＲＩＳＡ ３８４とＤＹＥｎａｍｉｃ ＥＴ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いた。ショットガンライブラリを作製するために、４８の独立な代表クローンからＰＣＲで増殖した４８のＤＮＡフラグメントを用いた。増幅されたＤＮＡ断片の末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化した。
このＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１８ベクターへ挿入し、更に該組み換えベクターにより大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。この大腸菌から上記（２）と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１２２】
それらの代表クローンについては、両末端からの塩基配列解析によって塩基配列を決定し、該塩基配列をコンピューター上で連結した後、Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｈｅａｒｉｎｇ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｆｉｏｒｅ Ｉｎｃ．製）によるｓｈｅａｒｉｎｇを行った。ショットガン法による塩基配列決定は、１２〜１５クローンの重複をもって行った。この塩基配列決定により配列が決定できなかったギャップは、上記と同様にプライマウォーキングによって決定した。
【０１２３】
実施例４ 塩基配列の解析
（１）ｄｎａｆｏｒｍ３５３６３（配列番号１、５）
ｄｎａｆｏｒｍ３５３６３は、配列番号１に示すように、３１３３塩基から成り、そのうち塩基番号４３〜１７８８までがオープンリーディングフレーム （終止コドンを含む） になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、５８１アミノ酸残基から成る （配列番号５）。配列番号１に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＳＰＴＲ蛋白質データベース （ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ蛋白質配列データベースとＴｒＥＭＢＬ核酸翻訳データベースを統合したもの） 中に、（ｉ）データベース登録記号ＡＢ０００２１６、Ｒａｔ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ＣＣＡ３， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．が、ｅ−ｖａｌｕｅ：０．０で、また５４２アミノ酸残基に亘り６１％の一致度で、（ｉｉ）データベース登録記号ＡＦ０６０２１９、ＲＣＣ１−ｌｉｋｅ Ｇ ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＲＬＧが、ｅ−ｖａｌｕｅ：４×１０−１２で、１５２アミノ酸残基に亘り２６％の一致度でヒットした。これらの結果より、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測された。
【０１２４】
また、上記（ｉｉ）のタンパク質は、データベース中の文献情報（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９８ Ｎｏｖ １５；５４（１）：９９−１０６）からＲＣＣ１−ｒｅｌａｔｅｄ ＧＥＦ ｆａｍｉｌｙらしいことが明らかとなった。
また、配列番号１に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行ったところ３８３〜４９９のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）を見出した。また、ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ（Ｐｆａｍエントリーａｎｋ）も３ヶ所に見出された。
これらのことから配列番号１に示す塩基配列がコードするタンパク質は細胞内蛋白質相互作用ネットワークを解明するためのツールとして有用であることが推測された。
【０１２５】
（２）ｄｎａｆｏｒｍ４８０６０（配列番号２、６）
ｄｎａｆｏｒｍ４８０６０は、配列番号２に示すように、３８２４塩基から成り、そのうち塩基番号８４〜１８８３までがオープンリーディングフレーム （終止コドンを含む） になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、５９９アミノ酸残基から成る （配列番号６）。配列番号２がコードするアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＳＰＴＲ蛋白質データベース （ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ蛋白質配列データベースとＴｒＥＭＢＬ核酸翻訳データベースを統合したもの） 中に、（ｉ）データベース登録記号ＡＢ０００２１６、Ｒａｔ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ＣＣＡ３， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．が、ｅ−ｖａｌｕｅ：０．０で、また５６０アミノ酸残基に亘り６１％の一致度で、（ｉｉ）データベース登録記号ＡＦ０６０２１９、ＲＣＣ１−ｌｉｋｅ Ｇ ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＲＬＧが、ｅ−ｖａｌｕｅ：４×１０−１２で、１５２アミノ酸残基に亘り２６％の一致度でヒットした。これらの結果より、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測された。
【０１２６】
また、上記（ｉｉ）のタンパク質は、データベース中の文献情報（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９８ Ｎｏｖ １５；５４（１）：９９−１０６）からＲＣＣ１−ｒｅｌａｔｅｄ ＧＥＦ ｆａｍｉｌｙらしいことが明らかとなった。
さらに、配列番号２に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行ったところ４０１〜５１７のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）を見出した。また、ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ（Ｐｆａｍエントリーａｎｋ）も３ヶ所に見出した。
これらのことから、配列番号２に示す塩基配列がコードするタンパク質は細胞内蛋白質相互作用ネットワークを解明するためのツールとして有用であることが推測された。
【０１２７】
（３）ｄｎａｆｏｒｍ４０３３１（配列番号３、７）
ｄｎａｆｏｒｍ４０３３１は、配列番号３に示すように、４４４６塩基から成り、そのうち塩基番号２０４〜１００４までがオープンリーディングフレーム （終止コドンを含む） になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、２６６アミノ酸残基から成る （配列番号７）。配列番号３に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＳＰＴＲ蛋白質データベース （ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ蛋白質配列データベースとＴｒＥＭＢＬ核酸翻訳データベースを統合したもの） 中に、（ｉ）データベース登録記号ＡＬ０３５７０３、ｎｏｖｅｌ ＢＴＢ／ＰＯＺ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎが、ｅ−ｖａｌｕｅ：３×１０−９２で、また２３３アミノ酸残基に亘り７４％の一致度で、（ｉｉ）データベース登録記号Ｑ１３１０５、Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １５１が、ｅ−ｖａｌｕｅ：８×１０−１５で、２５５アミノ酸残基に亘り２７％の一致度でヒットした。これらの結果より、配列番号７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測された。
【０１２８】
また、上記（ｉｉ）のタンパク質は、データベース中の文献情報（Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７；２２４：１３７−４６）からＭｙｃ蛋白質と相互作用することが明らかとなった。
さらに、配列番号３に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行ったところ８〜１１７のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）を見出した。
これらのことから、配列番号３に示す塩基配列がコードするタンパク質は細胞内蛋白質相互作用ネットワークを解明するためのツールとして有用であることが推測された。
【０１２９】
（４）ｄｎａｆｏｒｍ３９５４０（配列番号４、８）
ｄｎａｆｏｒｍ３９５４０は、配列番号４に示すように、２７５２塩基から成り、そのうち塩基番号１１７〜２３８７までがオープンリーディングフレーム （終止コドンを含む） になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、７５６アミノ酸残基から成る （配列番号８）。配列番号４がコードするアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＳＰＴＲ蛋白質データベース （ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ蛋白質配列データベースとＴｒＥＭＢＬ核酸翻訳データベースを統合したもの） 中に、（ｉ）データベース登録記号ＢＣ０１６４７７、Ｕｎｋｎｏｗｎ （ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ＭＧＣ：１７３６８）が、ｅ−ｖａｌｕｅ：５×１０−１１０で、また２４８アミノ酸残基に亘り７８％の一致度で、（ｉｉ）データベース登録記号ＡＦ３４９５６１、ｍｙｏｎｅｕｒｉｎが、ｅ−ｖａｌｕｅ：３×１０−７１で、６６５アミノ酸残基に亘り２８％の一致度でヒットした。これらの結果より、配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は蛋白質相互作用に関わることが推測された。
【０１３０】
また、上記（ｉｉ）のタンパク質は、データベース中の文献情報（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０００ Ｊｕｎ ２４；２７３（１）：３８５−３９１）から、様々な種で転写の活性化と抑制の両方に関わることが明らかとなった。
さらに、配列番号４に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによる蛋白質特徴検索を行ったところ９〜１２１のアミノ酸配列に蛋白質二量化に関わる特徴を示す配列（ＰｆａｍにＢＴＢとしてエントリーされる配列）を見出した。また，Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ （Ｐｆａｍのｚｆ−Ｃ２Ｈ２エントリー）も７ヶ所で見出した。
これらのことから、配列番号４に示す塩基配列がコードするタンパク質は細胞内蛋白質相互作用ネットワークを解明するためのツールとして有用であることが推測された。
【０１３１】
実施例５ ＤＮＡマイクロアレーを用いた組織発現解析
組織発現解析は、Ｍｉｋｉ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９８， ２１９９−２２０４ （２００１）の記載に従って行った。
（１）ＤＮＡマイクロアレーの作成
解析対象のマウス完全長ｃＤＮＡの塩基配列（ｄｎａｆｏｒｍ３５３６３およびｄｎａｆｏｒｍ４８０６０）と同じクラスタに属するマウスｃＤＮＡライブラリーＦＡＮＴＯＭ（ ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／ ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／）由来のｃＤＮＡの塩基配列（ＦＡＮＴＯＭ ＮＯ：６３３０４０４Ｅ１６）を、Ｍ１３フォワードおよびリバースプライマーを用いて増幅後、このＰＣＲ産物をイソプロパノールにて沈澱させ１５μｌの３×ＳＳＣ液に溶解した。このＤＮＡ溶液をポリＬリジンコートしたガラススライドに、１６チップ（ＳＭＰ３、ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）のＤＮＡアレイヤーを用いてスポットし、ＤＮＡマイクロアレーを作成した（方法の詳細は ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｍｇｕｉｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｍｇｕｉｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌに記載されている）。この場合、マウスβアクチンとグリセルアルデヒド‐３‐フォスフェートデヒドロゲナーゼのｃＤＮＡをポジティブコントロールとし、シロイヌナズナのｃＤＮＡをネガティブコントロールとして用いた。
【０１３２】
このＤＮＡマイクロアレーの検出感度は、１細胞当たりｍＲＮＡ １ないし３コピーであった。ターゲット配列との一致度がおよそ８０％のクローンのシグナル強度は、完全に配列が一致するクローンの１０分の１であった。ターゲット配列との一致度が８０％未満のクローンのシグナル強度は、バックグランドレベルであった。
【０１３３】
（２）プローブの調製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胎児、新生仔、アダルトの２２組織（腎臓、脳、脾臓、肺、肝臓、精巣、膵臓、胃、小腸、結腸、胎盤、心臓、胸腺、小脳、子宮、骨、筋肉、背側腎臓由来脂肪細胞、副精巣由来脂肪細胞、内臓脂肪、１０日齢新生児小脳、１０日齢新生児皮膚）から抽出したｍＲＮＡ １μｇを定法に従いランダムプライム逆転写反応を行い蛍光色素Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を取りこませた。他方、１７．５日齢の胎児全身から抽出したｍＲＮＡ １μｇをランダムプライム逆転写反応を行い、蛍光色素Ｃｙ５を取りこませ発現解析の対照とした。ＣｙＤｙｅ標識ｃＤＮＡプローブは、ＣｙＳｃｒｉｂｅ ＧＦＸ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて精製し、滅菌水１７μｌにてカラムから溶出した。これに３μｌの１０μｇ／μｌ ｏｌｉｇｏ（ｄＡ），３μｌの酵母ｔＲＮＡ２０μｇ／μｌ，１μｌの２０μｇ／μｌマウスＣｏｔ１ ＤＮＡ，５．１μｌの２０ＸＳＳＣ，および０．９μｌの１０％ＳＤＳからなるブロッキング溶液を混和してＣｙＤｙｅ標識ｃＤＮＡプローブを調製した。
【０１３４】
（３）ＤＮＡマイクロアレーのハイブリダイゼイション
発現解析対象組織由来ｃＤＮＡプローブ（Ｃｙ３標識）と対照の１７．５日齢胎児由来ｃＤＮＡプローブ（Ｃｙ５標識）を混和した溶液３０μｌを９５℃にて１分間熱処理を行い室温にて冷却した。ＤＮＡマイクロアレーに上記プローブ溶液を添加しカバースリップを被せ、Ｈｙｂｒｉｃａｓｅｔｔｅ（ＡｒｒａｙＩｔ社）中にて６５℃一晩ハイブリダイズさせた。次に、ＤＮＡマイクロアレーを２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳを用いて洗浄し、続いて１ＸＳＳＣにて２分間、０．１ＸＳＳＣにて２分間リンスした。マイクロアレーはＳｃａｎＡｒｒａｙ５０００共焦点レーザースキャナーを用いてスキャンし、画像をＩＭＡＧＥＮＥ（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ社）で解析した。
【０１３５】
（４）データ解析
各組織中のｍＲＮＡ量（Ｃｙ３標識）は、対照の１７．５日齢の胎児全身ｍＲＮＡ量（Ｃｙ５標識）との比（Ｃｙ３／Ｃｙ５）を対数（ｌｏｇ２）で表示した。すなわち、解析対象とする各マウス全長ｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡ発現量が、対照組織中よりも各組識中の方が多い場合は正の数値で、少ない場合は負の数値で、等しい場合は０で示される。データの正確性を増すために実験は独立に２回行い、再現性の有る結果を採用した。その結果を表１に示す。
【０１３６】
一般的に、ＤＮＡアレーを使用した発現解析では、２倍程度の増減は実験誤差とみなされる。このことから、表１に示す結果の数値が１以上の場合にはある組織中のｍＲＮＡ量が対照である１７．５日齢の胎児全身のｍＲＮＡ量と比較して２倍以上であり、有意に増加していると解釈した。逆に、結果の数値が−１以下の場合は、ある組織中のｍＲＮＡ量が対照である１７．５日齢の胎児全身のｍＲＮＡ量と比較して２分の１以下であり、有意に減少していると解釈した。また、任意の組織間のｍＲＮＡ発現量を比較検討する際は、各組織における数値の差が１であればｍＲＮＡ量は２倍、２であればｍＲＮＡ量は４倍であり、逆に、組織間の数値の差が−１であればｍＲＮＡ量は１／２倍、−２であればｍＲＮＡ量は１／４倍であることを意味する。
【０１３７】
なお、マイクロアレイにスポットしたＤＮＡ（ＦＡＮＴＯＭ ＮＯ：６３３０４０Ｅ１６）は、解析対象ｃＤＮＡと同じクラスタに属し、該ＤＮＡと少なくとも２００塩基に亘り８０％以上の塩基配列の一致度を有する領域を有するので、表１には、マイクロアレイにスポットしたＤＮＡの測定結果の数値を、解析対象ｃＤＮＡ（ｄｎａｆｏｒｍ３５３６３およびｄｎａｆｏｒｍ４８０６０）の結果として記載した。
【０１３８】
【表１】
【０１３９】
表１から明らかなとおり、ｄｎａｆｏｒｍ３５３６３とｄｎａｆｏｒｍ４８０６０は、精巣と副精巣由来脂肪細胞において、他の組織に比べて約１／２倍の発現の減少が考えられる。
【０１４０】
実施例６ タンパク質−タンパク質相互作用解析
哺乳動物細胞におけるｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １１， １７５８−１７６５ （２００１））を用いて、１種類のマウス完全長ｃＤＮＡの塩基配列（ｄｎａｆｏｒｍ３９５４０）がコードするタンパク質のタンパク質−タンパク質相互作用を網羅的に解析した。
（１）ＰＣＲ法を用いた迅速なサンプル調製
哺乳動物細胞でのｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ実験は、ＣｈｅｃｋＭａｔｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を利用した。タンパク質−タンパク質相互解析用のサンプルは、ＣＭＶプロモーターの下流にＧａｌ４遺伝子のＤＮＡ結合領域を挿入したプラスミドベクターｐＢＩＮＤ、ＣＭＶプロモーターの下流にＶＰ１６遺伝子の転写活性化領域を挿入したプラスミドベクターｐＡＣＴ，および５個のＧａｌ４結合領域とＴＡＴＡボックスの下流にレポーターであるルシフェラーゼ遺伝子を挿入したプラスミドベクターｐＧ５ｌｕｃを鋳型として調製した。Ｇａｌ４遺伝子と１種類のマウス完全長ｃＤＮＡの塩基配列（ｄｎａｆｏｒｍ３９５４０）のタンパク質コード配列との融合遺伝子、並びにＶＰ１６遺伝子とマウスｃＤＮＡライブラリーＦＡＮＴＯＭ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／）の各クローンが有する完全長ｃＤＮＡのタンパク質コード配列との融合遺伝子は、基本的にＰｒｏｍｅｇａ社のプロトコールに従い共通配列部分を用いた連結と２段階ＰＣＲ法を組み合わせて作成した（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １１， １７５８−１７６５ （２００１）の図１参照）。
【０１４１】
マウスｃＤＮＡのタンパク質コード配列を、５’側に共通配列をもち３’側に遺伝子特異的な配列をもつフォワードプライマーおよびＭ１３ユニバーサルプライマーとを用いてＰＣＲ増幅した後、上記増幅産物とｐＢＩＮＤまたはｐＡＣＴのＰＣＲ増幅産物（３’側に共通配列を付加した）とを混和し、それぞれネスティドプライマーを用いて第２段のＰＣＲ増幅を行い、Ｇａｌ４とマウスタンパク質の融合タンパク質を発現させるベクター（ＢＩＮＤサンプル）またはＶＰ１６とマウスタンパク質の融合タンパク質を発現させるベクター（ＡＣＴサンプル）を構築した。
【０１４２】
（２）ハイスループットな哺乳動物細胞でのｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ実験
ＰＣＲ法で調製したＢＩＮＤおよびＡＣＴサンプルは、それ以上の精製を行わずに直接使用した。ＢＩＮＤサンプルおよびＡＣＴサンプルのそれぞれ０．２５μｌ、３０ｎｇのｐＧ５ｌｕｃ、および９．５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社）を３８４ウェルプレートに分注した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地にて３２倍希釈したＬＦ２０００トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社）１０μｌをウェルに加えて混和し２０分間インキュベーション後、Ｆ１２培地にて１，３００細胞／μｌに懸濁したＣＨＯ−Ｋ１チャイニーズハムスター細胞液２０μｌを加えて良く懸濁した。アッセイサンプルをＣＯ２インキュベーター内で２０時間培養後、ルシフェラーゼ活性はＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定し、相互作用を確認した。その結果を表２に示す。
【０１４３】
【表２】
【０１４４】
表２から明らかなとおり、マウス完全長ｃＤＮＡの塩基配列（ｄｎａｆｏｒｍ３９５４０）によりコードされるタンパク質は、マウスｃＤＮＡライブラリーＦＡＮＴＯＭ（ ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／ ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／）の特定のクローンが有するｃＤＮＡの塩基配列によりコードされるタンパク質と相互作用を有することが明らかとなった。
【０１４５】
即ち、ｄｎａｆｏｒｍ３９５４０によりコードされるタンパク質は、ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨＳＰＣ２０６と相互作用することが認められた。このＨＳＰＣ２０６は、ＣＤ３４＋ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓから取られた遺伝子である（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２０００， １０（１０）： １５４６−６０）。このようにＨＳＰＣ２０６は、造血幹細胞から得られていることから、ｄｎａｆｏｒｍ３９５４０によりコードされるタンパク質は、該組織における細胞分化や増殖、また、癌、免疫、炎症、アレルギー等に関わる可能性が推測された。本タンパク質の発現制御物質、機能賦活物質、あるいは機能阻害物質は、癌、免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患等の治療薬として開発できる可能性がある。
【０１４６】
【発明の効果】
本発明のタンパク質は、タンパク質相互作用活性等を有することから、該タンパク質あるいはそれをコードするＤＮＡを用いて、タンパク質相互作用のネットワーク解析に用いることができる。また該タンパク質が関連する疾患等の治療薬の開発に用いることができる。
本出願は、２００２年４月３０日付けの日本特許出願（特願２００２−１２８４４７）および２００２年１２月４日付けの日本特許出願（特願２００２−３５２５８８）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。また、本明細書にて引用した文献の内容もここに参照として取り込まれる。
【０１４７】
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号５〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号５〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ。
【請求項４】
以下の （ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項５に記載の組み換えベクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞により産生される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１または７に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメント。
【請求項１０】
抗体がモノクローナル抗体である請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体が請求項１または７に記載のタンパク質相互作用活性を中和する作用を有することを特徴とする請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１または７に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項６に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞に導入されているＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも１以上のアミノ酸配列情報、および／または請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列から選択される少なくとも１以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。
【請求項１５】
請求項１に記載のタンパク質、および／または請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを結合させた担体。
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号５〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号５〜８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ。
【請求項４】
以下の （ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１〜４のいずれかに記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつタンパク質相互作用活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項５に記載の組み換えベクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞により産生される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１または７に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメント。
【請求項１０】
抗体がモノクローナル抗体である請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体が請求項１または７に記載のタンパク質相互作用活性を中和する作用を有することを特徴とする請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１または７に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項６に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞に導入されているＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも１以上のアミノ酸配列情報、および／または請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列から選択される少なくとも１以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。
【請求項１５】
請求項１に記載のタンパク質、および／または請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを結合させた担体。
【公開番号】特開２００４−２２９６４６（Ｐ２００４−２２９６４６Ａ）
【公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−１２４８２６（Ｐ２００３−１２４８２６）
【出願日】平成１５年４月３０日（２００３．４．３０）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０１２９３６６６）株式会社ダナフォーム (25)
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年４月３０日（２００３．４．３０）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０１２９３６６６）株式会社ダナフォーム (25)
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
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