新規リン酸化ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼ配列、その配列に対する抗体並びにその利用
本発明は少なくとも１０アミノ酸残基断片を含む、あるいはそれにより構成される、次の配列番号１：ＤＲＫＭＥＶＥＥＬＳｐＰＬＡＬＧＲＦＳＬ、のペプチドに関するもので、１０番目の位置のセリン残基はリン酸化されているのを特徴とし、前記断片は前記リン酸化セリン残基含有断片である。また、本発明は前記定義されたペプチド配列を同定できるポリクローナル又はモノクローナル抗体に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明の課題は、新規リン酸化ＣＤＣ２５ＣＢホスファターゼ配列及びこれら配列に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体である。また、本発明の課題は、特に、細胞有糸分裂阻害化合物（すなわち、有糸分裂の開始又はその進行を阻害する化合物）をスクリーニングする試験管内での（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）方法の実施のためのこれら新規リン酸化配列の使用である。
【０００２】
細胞分裂の制御機構には多数の因子が関与し、その活性はキナーゼ及びホスファターゼが関与するリン酸化及び脱リン酸化反応によって制御される。多くの癌において、これらの制御機構の解除が確認されている。それらの同定及び性質が、今や癌の診断及び治療に対する新しい展望を開きつつある。
【０００３】
ＣＤＣ２５Ｂは細胞周期を制御するホスファターゼであり、有糸分裂の開始・継続の制御に必須である。これは、哺乳動物において、異なる遺伝子（ＣＤＣ２５Ａ、Ｂ、及びＣ）によりコードされる３つのメンバーで構成されるファミリーに属する。ＣＤＣ２５Ｂタンパク質は、細胞周期のＧ２期の終わりに発現し、活性化される（Ｂａｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。その細胞内での局在は、ＮＥＳ及びＮＬＳ配列（Ｄａｖｅｚａｃ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、並びに、１４−３−３タンパク質との相互作用（Ｍｉｌｓ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｆｏｒｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， ２００１）により制御されている。ＣＤＣ２５Ｂは、有糸分裂初期反応の“スターター”として作用できることが示唆されている（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。これは、中心体が核転座を起こす前の段階におけるＣＤＣ２／サイクリンＢ複合体の初期の活性化で役割を果たしている可能性がある（Ｋｕｍａｇａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。細胞分裂の進行に必要な構造上並びに生化学的な変化を起こさせるために、ＣＤＣ２５ＢがＣＤＫ／サイクリン複合体を活性化する。その活性は、その発現の変化、制御にかかわる相手との結合、及びリン酸化反応により制御される。従って、シグナル・カスケードにより有糸分裂開始に関与するＣＤＣ２５Ｂの触媒活性が変化する。
【０００４】
本発明の目的の一つは、新規のリン酸化ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼ配列と、前記リン酸化ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼのリン酸化エピトープに対する新規の抗体とを提供することである。
【０００５】
本発明の目的の一つは、有糸細胞分裂（特に、有糸分裂開始）を阻害する化合物をスクリーニングするｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供することであり、前記阻害化合物は、特に、抗癌療法の枠組み（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）での目的で使用されることができる。
【０００６】
本発明は、以下の配列番号１の配列；
ＤＲＫＭＥＶＥＥＬＳｐＰＬＡＬＧＲＦＳＬ（配列番号１）
に由来するアミノ酸少なくとも約１０個の断片を含むか、又はその断片により構成され、１０位のセリン残基はリン酸化されており、前記断片は前記リン酸化セリン残基を含むことを特徴とするペプチド配列に関する。
【０００７】
用語「リン酸化残基」は、リン酸基を担持するアミノ酸を意味する。
【０００８】
有利な実施態様によると、本発明は、以下の配列番号２の配列；
ＭＥＶＥＥＬＳｐＰＬＡＬＧＲ（配列番号２）
の配列を含むか、又はそれにより構成され、前記の７位のセリン残基はリン酸化されていることを特徴とする、前記定義されたペプチド配列に関する。
【０００９】
配列番号２の配列は前記配列番号１の配列の一断片に相当する。より正確には、それは配列番号１の４位のアミノ酸から１６位のアミノ酸までに限定された断片である。
【００１０】
本発明は、以下のいずれかの１つの配列；
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ１であって、前記２３５位のセリン残基がリン酸化されている配列番号３の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２０８位のセリン残基がリン酸化されている配列番号４の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２４９位のセリン残基がリン酸化されている配列番号５の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２５９位のセリン残基がリン酸化されている配列番号６の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２８４位のセリン残基がリン酸化されている配列番号７の配列、
を含むか、又はそれにより構成されることを特徴とする、前記定義されたペプチド配列に関する。
【００１１】
本発明は、また、前記定義されたペプチド配列を認識することのできるポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（但し、前記抗体は、２４９位のセリン残基がリン酸化されていない配列番号８の配列は認識しない）にも関する。
【００１２】
配列番号８の配列は、非リン酸化ＣＤＣ２５Ｂタンパク質配列に相当する。
【００１３】
本発明の有利なポリクローナル抗体は、前記定義された配列番号２の配列を認識することを特徴とする。但し、前記抗体は２４９位のセリン残基がリン酸化されていない配列番号８の配列は認識しない。
【００１４】
配列番号２のリン酸化エピトープに対する前記抗体は、ウサギを前記エピトープで免疫することより製造される。
【００１５】
より正確には、前記エピトープは、担体（carrier）タンパク質（例えば、ヘモシアニン、ＢＳＡ又は卵白アルブミン）へ共有結合で結合している。ウサギを、次に、３ヶ月間にわたり免疫し（合計４回の注射）、最終回の瀉血で約５０ｍｌの血清を回収する。次に、血清はリン酸化ペプチドアフィニティーカラム、次いで、非−リン酸化ペプチドのアフィニティーカラムを用いて二重に精製される。
【００１６】
本発明は前記定義されたモノクローナル抗体、特には、前記定義された配列番号２のペプチド配列に対するモノクローナル抗体の調製する方法に関し、前記抗体は上に定義されたペプチド配列に対する抗体を分泌するハイブリドーマの選択により生じるものであるか、あるいは、抗体の全体又は部分をコードする相補的ＤＮＡの発現バンク（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂａｎｋ）から選択されることで生じることを特徴とする。
【００１７】
本発明は、以下の工程；
−ハイブリドーマを得るために、前記定義されたペプチド配列の注射による免疫動物、特にヒトでないあらかじめ免疫した動物のミエローマと、動物、特にヒトでない動物、の脾臓細胞とを融合する工程、
−この様にして得られたハイブリドーマを培養する工程、
−前記工程において得られ、そして前記定義されたペプチド配列に対する抗体を分泌するハイブリドーマから選択されたハイブリドーマのクローニングによる回収及び精製の工程、
を含むことを特徴とする、特に前記定義された配列番号２のペプチド配列に対する、前記定義されたモノクローナル抗体の製造方法に関する。
【００１８】
免疫段階に使用される動物は、特に、マウスである。
【００１９】
融合用に使用されるミエローマは、特に、マウス由来のものである。
【００２０】
融合用に使用される脾臓細胞は、ミエローマが由来したのと同じ動物種由来のもの、すなわち、特にマウス由来のものである。
【００２１】
ハイブリドーマは、配列番号２のペプチド配列に対する抗体を分泌するものであって、ＥＬＩＳＡ法で免疫に用いたリン酸化ペプチドを認識できるが非リン酸化ペプチドを認識できない抗体を産生していることに基づき選択される。
【００２２】
本発明は前記定義されたモノクローナル抗体、特には前記定義した配列番号２のペプチド配列に対するモノクローナル抗体の製造方法であって、抗体の全体又は一部をコードするｃＤＮＡの発現バンクから選択する工程を含むことを特徴とする製造方法に関する。
【００２３】
前記抗体は、配列番号２のペプチド配列に対し、ＥＬＩＳＡ法において、タンパク質転移（ウエスタンブロット）により、又は任意の他の適当な方法により、免疫に用いられたリン酸化ペプチドを認識するが、非リン酸化ペプチドは認識しない能力に基づき選択される。
【００２４】
本発明は、また、前記定義されたペプチド配列、又は前記定義された抗体を、薬剤学的に許容可能な媒体と組み合わせて、活性成分として含むことを特徴とする医薬組成物に関する。
【００２５】
本発明は、また、過剰増殖性疾患、例えば癌の治療目的の薬剤を製造するための、前記定義されたペプチド配列、又は前記定義された抗体の使用に関する。
【００２６】
本発明は、また、培養細胞からの、又は健常若しくは癌組織の切片からの、前記定義されたペプチド配列を発現する有糸分裂細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出用方法を実施するための、前記定義された抗体の使用に関する。
【００２７】
培養細胞を、抗体の存在下で、固定し、細胞膜を透過性にし、そして、インキュベーションする。抗体の可視化は、蛍光色素を担持する二次抗体（次に、蛍光顕微鏡を用いて観察を行う）か、あるいは、可視光線下で、基質の加水分解及び発色反応の生産を観察可能にすることのできる分子かを用いて実施する。組織切片についても同様の実験方策を用いることができる。
【００２８】
また、本発明は、培養細胞におけるか、又は健常若しくは癌組織の切片、特に乳癌、肺癌あるいは膵臓癌組織の切片における、前記定義されたタンパク質配列の過剰発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出用方法を実施するための、前期適宜された抗体の使用に関する。
【００２９】
ＣＤＣ２５Ｂの過剰発現の実証は、有糸分裂細胞の検出方法と同じ前記の実験方策に基づく。タンパク質転移（ウェスタン・ブロット）か、又は健常細胞若しくは癌細胞から調製される全タンパク質抽出物について目的のタンパク質を定量できる任意のその他方法かによって行うことができる。
【００３０】
また、本発明は、有糸分裂阻害化合物（すなわち、有糸分裂の開始又はその進行を阻害する化合物）のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法であって、前記阻害化合物は、特に抗癌療法のフレームワークで使用されることができ、
−前記化合物と細胞を一緒にすること、及び
−適当な方法、特にＥＬＩＳＡ、タンパク質転移（ウェスタン・ブロット）、又は間接免疫蛍光技術を用いることによって請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド配列を認識することのできる抗体である、前記定義された抗体との結合の欠如を検出することによる阻害化合物の選択、
を含むことを特徴とする前記スクリーニング方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、蛍光抗体法による、異なる細胞周期段階での２４９位セリンリン酸化型ＣＤＣ２５Ｂの検出像を示す。図１Ａは間期に相当し；図１Ｂは前期に相当し；１Ｃは中期に相当し；図１Ｄは後期／終期に相当し；そして、図１ＥはＧ１期に相当する。
【図２】タンパク質転移（ウェスタン・ブロット）による、２４９位セリンリン酸化型ＣＤＣ２５Ｂの検出を示す図である。カラム１は、精製ＣＤＣ２５Ｂタンパク質のみに相当し；カラム２は、リン酸化ペプチドを用いて精製したＣＤＣ２５Ｂタンパク質に相当し；カラム３は、非−リン酸化ペプチドを用いて精製したＣＤＣ２５Ｂタンパク質に相当し；そして、カラム４は、ラムダホスファターゼ処理ＣＤＣ２５Ｂに相当する。
【方法と結果】
【００３２】
《ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼは２４９位セリンがリン酸化されている》
ＣＤＣ２５Ｂの質量分析による解析で、２４９位セリン残基のリン酸化を検出することができた。
その後ＣＤＣ２５Ｂタンパク質はトリプシンにより分解された。ＭＳ／ＭＳ質量分析による解析の結果は、１残基リン酸化ペプチドの存在を示した。このペプチドの断片化により、リン酸基が２４９位のセリンに存在することを同定した。
【００３３】
《２４９位アミノ酸セリンがリン酸化されたＣＤＣ２５Ｂタンパク質に対する抗体の製造》
リン酸化セリンが（ｐ）で示されている、ＭＥＶＥＥＬＳ（ｐ）ＰＬＡＬＧＲの配列を持つペプチド（配列番号２）をウサギの免疫に使用した。動物を安楽死させた後、血清を二段階のクロマトグラフィーで精製した：第一段階は特異的抗体を保持するためにリン酸化ペプチドカラムを用い、次に第二段階として、同一配列よりなる非リン酸化ＭＥＶＥＥＬＳＰＬＡＬＧＲ配列（配列番号９）を持つペプチドカラムを用い、リン酸化された特異的抗体を流出画分として精製した。抗体によるリン酸化ペプチドの認識を、ＥＬＩＳＡ法により評価した。以後、これらの抗体を抗−Ｓ２４９Ｐと称する。
【００３４】
《抗−Ｓ２４９Ｐ抗体は有糸分裂細胞のＣＤＣ２５Ｂタンパク質を認識する》
Ａ）ＨｅＬａ細胞を固定し使用して、これら抗体を用いた免疫蛍光法による分析を実施した。核の位置を確認するために、細胞を、４’−６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。図１に示す像は、多数の細胞で実施した観察の中の代表例である。これらは、２４９位のセリンがリン酸化されたＣＤＣ２５Ｂタンパク質（配列番号２）が有糸分裂中の細胞、特に紡錘体極のレベルで、非常に大量に蓄積していることを示している。免疫に用いたリン酸化ペプチドによる競合テストではこの像は消失するが、非リン酸化ペプチド（ＭＥＶＥＥＬＳＰＬＡＬＧＲ）、又は、関連性の無いリン酸化ペプチドでは像の消失は認められない。
Ｂ）ＣＤＣ２５Ｂタンパク質を、培養細胞より精製した後で、２４９位セリンリン酸化ＣＤＣ２５Ｂタンパク質に対する抗体を用いたタンパク質転移（ウェスタン・ブロット）により解析した。図２に示すように、ＣＤＣ２５Ｂタンパク質はｉｎ ｖｉｖｏで同位にリン酸化されている。ラムダホスファターゼ処理によりこのリン酸化は消失する。免疫に使用したリン酸化ペプチドと競合させると検出できなくなる。
これらの観察は、有糸分裂細胞におけるリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの検出にはこれら抗体が有効であることを示す。
【応用分野】
【００３５】
《Ａ−有糸分裂細胞の指標》
リン酸化型ＣＤＣ２５Ｂのリン酸化の検出により、培養細胞又は癌組織切片での分裂細胞の存在の検出が可能になる。
２４９位セリンのリン酸化型ＣＤＣ２５Ｂは有糸分裂細胞に存在する。それは、前期では核に局在し、次に、後期における赤道への侵入に先立って、中期の２つの有糸分裂半紡錘体に濃縮し、そして、有糸分裂の終了とともに消失する。
前記リン酸化型ＣＤＣ２５Ｂに対するポリクローナル又はモノクローナル抗体により、ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼを発現している任意の有糸分裂細胞の検出も可能になる。
前記有糸分裂細胞の検出は、間接的免疫蛍光又は免疫化学的技術を用い、固定した培養細胞あるいは健常又は癌の組織切片について実施することができる。
従って、前記方法による有糸分裂細胞の検出は、細胞生物学者や解剖病理学者が自由に使いこなすことのできる新規な道具である。
【００３６】
《Ｂ−治療方針決定の補助：》
癌におけるＣＤＣ２５Ｂの発現レベルを考慮に入れることは、治療決定の際の選択（ＣＤＣ２５Ｂタンパク質を標的とする薬剤使用の可否）で大きな利益をもたらす。２４９位セリンのリン酸化型ＣＤＣ２５Ｂの検出は、この応用にあたり大きな利益をもたらす。
ＣＤＣ２５Ｂの発現は組織により異なる。癌（乳癌、肺癌、膵臓癌など）ではこのタンパク質が過剰に発現していることが示されている。膵臓癌の場合には、癌の成長はＣＤＣ２５Ｂの発現と機能に依存している（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。
ＣＤＣ２５Ｂを標的とすることのできる新しい薬剤が最近業界により開発されている（Ｐｒｅｖｏｓｔ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。従って、前記治療を利用するかどうかを決定するために、ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼの発現レベルを考慮することが必須となっている。
２４９位セリンのリン酸化型ＣＤＣ２５Ｂに対する抗体を利用することにより、有糸分裂での（そしておそらく活性化された）前記ホスファターゼの形態を可視化することができる。生検や外科措置の後に採取された組織断片でのこのタンパク質の検出（免疫細胞化学による）を実施することは、ＣＤＣ２５Ｂが過剰発現している場合に、ＣＤＣ２５ホスファターゼ阻害剤の使用を推奨するといった、場合により提供される治療の選択における基本的な情報を提供する。
【００３７】
《Ｃ−ハイスループット・スクリーニングのセットアップ》
細胞周期阻害分子の研究のために、有糸分裂開始阻害を評価する目的で本発明による抗体を利用することができる。
現在、細胞周期の進行を阻害する分子に関する活発な研究が、多くの薬学関連のグループで行われている。
有糸分裂細胞の指標を明らかにすることは、有糸分裂の開始及びその進行の阻害能力をもつ分子の、簡単なそしてハイスループット・スクリーニングによる選択手段を提供することを意味する。
リン酸化型ＣＤＣ２５Ｂに対する抗体はこの需要に対応する。従って、これらの抗体は、免疫細胞化学、フロー・サイトメトリー、又は、リン酸化ＣＤＣ２５Ｂタンパク質の検出を可能にする任意の他の適切な方法にも使用可能である。
《参照文献》
- Ｂａｌｄｉｎ， Ｖ．， Ｃａｎｓ， Ｃ．， Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ， Ｇ． ＆ Ｄｕｃｏｍｍｕｎ， Ｂ （１９９７） Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＣＤＣ２５Ｂ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ． Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ？ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １４， ２４８５−２４９５，
- Ｄａｖｅｚａｃ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤＣ２５Ｂ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １９， ２１７９−８５，
- Ｆｏｒｒｅｓｔ Ａ． ＆ Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ， Ｂ． （２００１） Ｃｄｃ２５Ｂ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ １４−３−３， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２０， ４３９３−４０１，
- Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ， Ｂ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤＣ２５Ｂ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎ ｍｉｔｏｓｉｓ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｃｅｎｔｒｏｓｏｍａｌ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｉｎ ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， １０９， １０８１−１０９３，
- Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ＣＤＣ２５Ｂ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２３， ７１−８１，
- Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ｉ．， Ｃｌａｒｋｅ， Ｐ．， Ｍａｒｃｏｔｅ， Ｍ． Ｊ．， Ｋａｒｓｅｎｔｉ， Ｅ． ＆ Ｄｒａｅｔｔａ， Ｇ． （１９９３） Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｄｃ２５−Ｃ ｂｙ ｃｄｃ２−ｃｙｃｌｉｎ Ｂ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｌｆ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＰＦ ａｔ ｍｉｔｏｓｉｓ， ＥＭＢＯ Ｊ， １２， ５３−６３，
- Ｋｕｍａｇａｉ， Ａ． ＆ Ｄｕｎｐｈｙ， Ｗ． （１９９２） Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｄｃ２５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｉｎ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｅｘｔｒａｃｔｓ， Ｃｅｌｌ， ７０， １３９−１５１，
- Ｍｉｌｓ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ １４．３．３ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＣＤＣ２５Ｂ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １９， １２５７−１２６５，
- Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｉ． ＆ Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ｉ． （２０００） Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｃｄｃ２５ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｆａｍｉｌｙ， Ｐｒｏｇ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｓ， ４， １０７−１４，
- Ｐｒｅｖｏｓｔ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤＣ２５ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ ｉｎ “Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ” Ｅｄ． Ｍｅｉｊｅｒ， Ｌ．， Ｊｅｚｅｑｕｅｌ， Ａ．， Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｍ．， ｖｏｌ． ５， ２２５−２３４．
【発明の分野】
【０００１】
本発明の課題は、新規リン酸化ＣＤＣ２５ＣＢホスファターゼ配列及びこれら配列に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体である。また、本発明の課題は、特に、細胞有糸分裂阻害化合物（すなわち、有糸分裂の開始又はその進行を阻害する化合物）をスクリーニングする試験管内での（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）方法の実施のためのこれら新規リン酸化配列の使用である。
【０００２】
細胞分裂の制御機構には多数の因子が関与し、その活性はキナーゼ及びホスファターゼが関与するリン酸化及び脱リン酸化反応によって制御される。多くの癌において、これらの制御機構の解除が確認されている。それらの同定及び性質が、今や癌の診断及び治療に対する新しい展望を開きつつある。
【０００３】
ＣＤＣ２５Ｂは細胞周期を制御するホスファターゼであり、有糸分裂の開始・継続の制御に必須である。これは、哺乳動物において、異なる遺伝子（ＣＤＣ２５Ａ、Ｂ、及びＣ）によりコードされる３つのメンバーで構成されるファミリーに属する。ＣＤＣ２５Ｂタンパク質は、細胞周期のＧ２期の終わりに発現し、活性化される（Ｂａｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。その細胞内での局在は、ＮＥＳ及びＮＬＳ配列（Ｄａｖｅｚａｃ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、並びに、１４−３−３タンパク質との相互作用（Ｍｉｌｓ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｆｏｒｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， ２００１）により制御されている。ＣＤＣ２５Ｂは、有糸分裂初期反応の“スターター”として作用できることが示唆されている（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。これは、中心体が核転座を起こす前の段階におけるＣＤＣ２／サイクリンＢ複合体の初期の活性化で役割を果たしている可能性がある（Ｋｕｍａｇａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。細胞分裂の進行に必要な構造上並びに生化学的な変化を起こさせるために、ＣＤＣ２５ＢがＣＤＫ／サイクリン複合体を活性化する。その活性は、その発現の変化、制御にかかわる相手との結合、及びリン酸化反応により制御される。従って、シグナル・カスケードにより有糸分裂開始に関与するＣＤＣ２５Ｂの触媒活性が変化する。
【０００４】
本発明の目的の一つは、新規のリン酸化ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼ配列と、前記リン酸化ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼのリン酸化エピトープに対する新規の抗体とを提供することである。
【０００５】
本発明の目的の一つは、有糸細胞分裂（特に、有糸分裂開始）を阻害する化合物をスクリーニングするｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供することであり、前記阻害化合物は、特に、抗癌療法の枠組み（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）での目的で使用されることができる。
【０００６】
本発明は、以下の配列番号１の配列；
ＤＲＫＭＥＶＥＥＬＳｐＰＬＡＬＧＲＦＳＬ（配列番号１）
に由来するアミノ酸少なくとも約１０個の断片を含むか、又はその断片により構成され、１０位のセリン残基はリン酸化されており、前記断片は前記リン酸化セリン残基を含むことを特徴とするペプチド配列に関する。
【０００７】
用語「リン酸化残基」は、リン酸基を担持するアミノ酸を意味する。
【０００８】
有利な実施態様によると、本発明は、以下の配列番号２の配列；
ＭＥＶＥＥＬＳｐＰＬＡＬＧＲ（配列番号２）
の配列を含むか、又はそれにより構成され、前記の７位のセリン残基はリン酸化されていることを特徴とする、前記定義されたペプチド配列に関する。
【０００９】
配列番号２の配列は前記配列番号１の配列の一断片に相当する。より正確には、それは配列番号１の４位のアミノ酸から１６位のアミノ酸までに限定された断片である。
【００１０】
本発明は、以下のいずれかの１つの配列；
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ１であって、前記２３５位のセリン残基がリン酸化されている配列番号３の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２０８位のセリン残基がリン酸化されている配列番号４の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２４９位のセリン残基がリン酸化されている配列番号５の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２５９位のセリン残基がリン酸化されている配列番号６の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２８４位のセリン残基がリン酸化されている配列番号７の配列、
を含むか、又はそれにより構成されることを特徴とする、前記定義されたペプチド配列に関する。
【００１１】
本発明は、また、前記定義されたペプチド配列を認識することのできるポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（但し、前記抗体は、２４９位のセリン残基がリン酸化されていない配列番号８の配列は認識しない）にも関する。
【００１２】
配列番号８の配列は、非リン酸化ＣＤＣ２５Ｂタンパク質配列に相当する。
【００１３】
本発明の有利なポリクローナル抗体は、前記定義された配列番号２の配列を認識することを特徴とする。但し、前記抗体は２４９位のセリン残基がリン酸化されていない配列番号８の配列は認識しない。
【００１４】
配列番号２のリン酸化エピトープに対する前記抗体は、ウサギを前記エピトープで免疫することより製造される。
【００１５】
より正確には、前記エピトープは、担体（carrier）タンパク質（例えば、ヘモシアニン、ＢＳＡ又は卵白アルブミン）へ共有結合で結合している。ウサギを、次に、３ヶ月間にわたり免疫し（合計４回の注射）、最終回の瀉血で約５０ｍｌの血清を回収する。次に、血清はリン酸化ペプチドアフィニティーカラム、次いで、非−リン酸化ペプチドのアフィニティーカラムを用いて二重に精製される。
【００１６】
本発明は前記定義されたモノクローナル抗体、特には、前記定義された配列番号２のペプチド配列に対するモノクローナル抗体の調製する方法に関し、前記抗体は上に定義されたペプチド配列に対する抗体を分泌するハイブリドーマの選択により生じるものであるか、あるいは、抗体の全体又は部分をコードする相補的ＤＮＡの発現バンク（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂａｎｋ）から選択されることで生じることを特徴とする。
【００１７】
本発明は、以下の工程；
−ハイブリドーマを得るために、前記定義されたペプチド配列の注射による免疫動物、特にヒトでないあらかじめ免疫した動物のミエローマと、動物、特にヒトでない動物、の脾臓細胞とを融合する工程、
−この様にして得られたハイブリドーマを培養する工程、
−前記工程において得られ、そして前記定義されたペプチド配列に対する抗体を分泌するハイブリドーマから選択されたハイブリドーマのクローニングによる回収及び精製の工程、
を含むことを特徴とする、特に前記定義された配列番号２のペプチド配列に対する、前記定義されたモノクローナル抗体の製造方法に関する。
【００１８】
免疫段階に使用される動物は、特に、マウスである。
【００１９】
融合用に使用されるミエローマは、特に、マウス由来のものである。
【００２０】
融合用に使用される脾臓細胞は、ミエローマが由来したのと同じ動物種由来のもの、すなわち、特にマウス由来のものである。
【００２１】
ハイブリドーマは、配列番号２のペプチド配列に対する抗体を分泌するものであって、ＥＬＩＳＡ法で免疫に用いたリン酸化ペプチドを認識できるが非リン酸化ペプチドを認識できない抗体を産生していることに基づき選択される。
【００２２】
本発明は前記定義されたモノクローナル抗体、特には前記定義した配列番号２のペプチド配列に対するモノクローナル抗体の製造方法であって、抗体の全体又は一部をコードするｃＤＮＡの発現バンクから選択する工程を含むことを特徴とする製造方法に関する。
【００２３】
前記抗体は、配列番号２のペプチド配列に対し、ＥＬＩＳＡ法において、タンパク質転移（ウエスタンブロット）により、又は任意の他の適当な方法により、免疫に用いられたリン酸化ペプチドを認識するが、非リン酸化ペプチドは認識しない能力に基づき選択される。
【００２４】
本発明は、また、前記定義されたペプチド配列、又は前記定義された抗体を、薬剤学的に許容可能な媒体と組み合わせて、活性成分として含むことを特徴とする医薬組成物に関する。
【００２５】
本発明は、また、過剰増殖性疾患、例えば癌の治療目的の薬剤を製造するための、前記定義されたペプチド配列、又は前記定義された抗体の使用に関する。
【００２６】
本発明は、また、培養細胞からの、又は健常若しくは癌組織の切片からの、前記定義されたペプチド配列を発現する有糸分裂細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出用方法を実施するための、前記定義された抗体の使用に関する。
【００２７】
培養細胞を、抗体の存在下で、固定し、細胞膜を透過性にし、そして、インキュベーションする。抗体の可視化は、蛍光色素を担持する二次抗体（次に、蛍光顕微鏡を用いて観察を行う）か、あるいは、可視光線下で、基質の加水分解及び発色反応の生産を観察可能にすることのできる分子かを用いて実施する。組織切片についても同様の実験方策を用いることができる。
【００２８】
また、本発明は、培養細胞におけるか、又は健常若しくは癌組織の切片、特に乳癌、肺癌あるいは膵臓癌組織の切片における、前記定義されたタンパク質配列の過剰発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出用方法を実施するための、前期適宜された抗体の使用に関する。
【００２９】
ＣＤＣ２５Ｂの過剰発現の実証は、有糸分裂細胞の検出方法と同じ前記の実験方策に基づく。タンパク質転移（ウェスタン・ブロット）か、又は健常細胞若しくは癌細胞から調製される全タンパク質抽出物について目的のタンパク質を定量できる任意のその他方法かによって行うことができる。
【００３０】
また、本発明は、有糸分裂阻害化合物（すなわち、有糸分裂の開始又はその進行を阻害する化合物）のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法であって、前記阻害化合物は、特に抗癌療法のフレームワークで使用されることができ、
−前記化合物と細胞を一緒にすること、及び
−適当な方法、特にＥＬＩＳＡ、タンパク質転移（ウェスタン・ブロット）、又は間接免疫蛍光技術を用いることによって請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド配列を認識することのできる抗体である、前記定義された抗体との結合の欠如を検出することによる阻害化合物の選択、
を含むことを特徴とする前記スクリーニング方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、蛍光抗体法による、異なる細胞周期段階での２４９位セリンリン酸化型ＣＤＣ２５Ｂの検出像を示す。図１Ａは間期に相当し；図１Ｂは前期に相当し；１Ｃは中期に相当し；図１Ｄは後期／終期に相当し；そして、図１ＥはＧ１期に相当する。
【図２】タンパク質転移（ウェスタン・ブロット）による、２４９位セリンリン酸化型ＣＤＣ２５Ｂの検出を示す図である。カラム１は、精製ＣＤＣ２５Ｂタンパク質のみに相当し；カラム２は、リン酸化ペプチドを用いて精製したＣＤＣ２５Ｂタンパク質に相当し；カラム３は、非−リン酸化ペプチドを用いて精製したＣＤＣ２５Ｂタンパク質に相当し；そして、カラム４は、ラムダホスファターゼ処理ＣＤＣ２５Ｂに相当する。
【方法と結果】
【００３２】
《ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼは２４９位セリンがリン酸化されている》
ＣＤＣ２５Ｂの質量分析による解析で、２４９位セリン残基のリン酸化を検出することができた。
その後ＣＤＣ２５Ｂタンパク質はトリプシンにより分解された。ＭＳ／ＭＳ質量分析による解析の結果は、１残基リン酸化ペプチドの存在を示した。このペプチドの断片化により、リン酸基が２４９位のセリンに存在することを同定した。
【００３３】
《２４９位アミノ酸セリンがリン酸化されたＣＤＣ２５Ｂタンパク質に対する抗体の製造》
リン酸化セリンが（ｐ）で示されている、ＭＥＶＥＥＬＳ（ｐ）ＰＬＡＬＧＲの配列を持つペプチド（配列番号２）をウサギの免疫に使用した。動物を安楽死させた後、血清を二段階のクロマトグラフィーで精製した：第一段階は特異的抗体を保持するためにリン酸化ペプチドカラムを用い、次に第二段階として、同一配列よりなる非リン酸化ＭＥＶＥＥＬＳＰＬＡＬＧＲ配列（配列番号９）を持つペプチドカラムを用い、リン酸化された特異的抗体を流出画分として精製した。抗体によるリン酸化ペプチドの認識を、ＥＬＩＳＡ法により評価した。以後、これらの抗体を抗−Ｓ２４９Ｐと称する。
【００３４】
《抗−Ｓ２４９Ｐ抗体は有糸分裂細胞のＣＤＣ２５Ｂタンパク質を認識する》
Ａ）ＨｅＬａ細胞を固定し使用して、これら抗体を用いた免疫蛍光法による分析を実施した。核の位置を確認するために、細胞を、４’−６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。図１に示す像は、多数の細胞で実施した観察の中の代表例である。これらは、２４９位のセリンがリン酸化されたＣＤＣ２５Ｂタンパク質（配列番号２）が有糸分裂中の細胞、特に紡錘体極のレベルで、非常に大量に蓄積していることを示している。免疫に用いたリン酸化ペプチドによる競合テストではこの像は消失するが、非リン酸化ペプチド（ＭＥＶＥＥＬＳＰＬＡＬＧＲ）、又は、関連性の無いリン酸化ペプチドでは像の消失は認められない。
Ｂ）ＣＤＣ２５Ｂタンパク質を、培養細胞より精製した後で、２４９位セリンリン酸化ＣＤＣ２５Ｂタンパク質に対する抗体を用いたタンパク質転移（ウェスタン・ブロット）により解析した。図２に示すように、ＣＤＣ２５Ｂタンパク質はｉｎ ｖｉｖｏで同位にリン酸化されている。ラムダホスファターゼ処理によりこのリン酸化は消失する。免疫に使用したリン酸化ペプチドと競合させると検出できなくなる。
これらの観察は、有糸分裂細胞におけるリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの検出にはこれら抗体が有効であることを示す。
【応用分野】
【００３５】
《Ａ−有糸分裂細胞の指標》
リン酸化型ＣＤＣ２５Ｂのリン酸化の検出により、培養細胞又は癌組織切片での分裂細胞の存在の検出が可能になる。
２４９位セリンのリン酸化型ＣＤＣ２５Ｂは有糸分裂細胞に存在する。それは、前期では核に局在し、次に、後期における赤道への侵入に先立って、中期の２つの有糸分裂半紡錘体に濃縮し、そして、有糸分裂の終了とともに消失する。
前記リン酸化型ＣＤＣ２５Ｂに対するポリクローナル又はモノクローナル抗体により、ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼを発現している任意の有糸分裂細胞の検出も可能になる。
前記有糸分裂細胞の検出は、間接的免疫蛍光又は免疫化学的技術を用い、固定した培養細胞あるいは健常又は癌の組織切片について実施することができる。
従って、前記方法による有糸分裂細胞の検出は、細胞生物学者や解剖病理学者が自由に使いこなすことのできる新規な道具である。
【００３６】
《Ｂ−治療方針決定の補助：》
癌におけるＣＤＣ２５Ｂの発現レベルを考慮に入れることは、治療決定の際の選択（ＣＤＣ２５Ｂタンパク質を標的とする薬剤使用の可否）で大きな利益をもたらす。２４９位セリンのリン酸化型ＣＤＣ２５Ｂの検出は、この応用にあたり大きな利益をもたらす。
ＣＤＣ２５Ｂの発現は組織により異なる。癌（乳癌、肺癌、膵臓癌など）ではこのタンパク質が過剰に発現していることが示されている。膵臓癌の場合には、癌の成長はＣＤＣ２５Ｂの発現と機能に依存している（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。
ＣＤＣ２５Ｂを標的とすることのできる新しい薬剤が最近業界により開発されている（Ｐｒｅｖｏｓｔ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。従って、前記治療を利用するかどうかを決定するために、ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼの発現レベルを考慮することが必須となっている。
２４９位セリンのリン酸化型ＣＤＣ２５Ｂに対する抗体を利用することにより、有糸分裂での（そしておそらく活性化された）前記ホスファターゼの形態を可視化することができる。生検や外科措置の後に採取された組織断片でのこのタンパク質の検出（免疫細胞化学による）を実施することは、ＣＤＣ２５Ｂが過剰発現している場合に、ＣＤＣ２５ホスファターゼ阻害剤の使用を推奨するといった、場合により提供される治療の選択における基本的な情報を提供する。
【００３７】
《Ｃ−ハイスループット・スクリーニングのセットアップ》
細胞周期阻害分子の研究のために、有糸分裂開始阻害を評価する目的で本発明による抗体を利用することができる。
現在、細胞周期の進行を阻害する分子に関する活発な研究が、多くの薬学関連のグループで行われている。
有糸分裂細胞の指標を明らかにすることは、有糸分裂の開始及びその進行の阻害能力をもつ分子の、簡単なそしてハイスループット・スクリーニングによる選択手段を提供することを意味する。
リン酸化型ＣＤＣ２５Ｂに対する抗体はこの需要に対応する。従って、これらの抗体は、免疫細胞化学、フロー・サイトメトリー、又は、リン酸化ＣＤＣ２５Ｂタンパク質の検出を可能にする任意の他の適切な方法にも使用可能である。
《参照文献》
- Ｂａｌｄｉｎ， Ｖ．， Ｃａｎｓ， Ｃ．， Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ， Ｇ． ＆ Ｄｕｃｏｍｍｕｎ， Ｂ （１９９７） Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＣＤＣ２５Ｂ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ． Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ？ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １４， ２４８５−２４９５，
- Ｄａｖｅｚａｃ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤＣ２５Ｂ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １９， ２１７９−８５，
- Ｆｏｒｒｅｓｔ Ａ． ＆ Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ， Ｂ． （２００１） Ｃｄｃ２５Ｂ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ １４−３−３， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２０， ４３９３−４０１，
- Ｇａｂｒｉｅｌｌｉ， Ｂ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤＣ２５Ｂ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎ ｍｉｔｏｓｉｓ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｃｅｎｔｒｏｓｏｍａｌ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｉｎ ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， １０９， １０８１−１０９３，
- Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ＣＤＣ２５Ｂ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２３， ７１−８１，
- Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ｉ．， Ｃｌａｒｋｅ， Ｐ．， Ｍａｒｃｏｔｅ， Ｍ． Ｊ．， Ｋａｒｓｅｎｔｉ， Ｅ． ＆ Ｄｒａｅｔｔａ， Ｇ． （１９９３） Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｄｃ２５−Ｃ ｂｙ ｃｄｃ２−ｃｙｃｌｉｎ Ｂ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｌｆ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＰＦ ａｔ ｍｉｔｏｓｉｓ， ＥＭＢＯ Ｊ， １２， ５３−６３，
- Ｋｕｍａｇａｉ， Ａ． ＆ Ｄｕｎｐｈｙ， Ｗ． （１９９２） Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｄｃ２５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｉｎ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｅｘｔｒａｃｔｓ， Ｃｅｌｌ， ７０， １３９−１５１，
- Ｍｉｌｓ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ １４．３．３ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＣＤＣ２５Ｂ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １９， １２５７−１２６５，
- Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｉ． ＆ Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ｉ． （２０００） Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｃｄｃ２５ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｆａｍｉｌｙ， Ｐｒｏｇ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｓ， ４， １０７−１４，
- Ｐｒｅｖｏｓｔ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤＣ２５ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ ｉｎ “Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ” Ｅｄ． Ｍｅｉｊｅｒ， Ｌ．， Ｊｅｚｅｑｕｅｌ， Ａ．， Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｍ．， ｖｏｌ． ５， ２２５−２３４．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列番号１の配列；
ＤＲＫＭＥＶＥＥＬＳｐＰＬＡＬＧＲＦＳＬ（配列番号１）
に由来するアミノ酸少なくとも約１０個の断片を含むか、又はその断片により構成され、１０位のセリン残基はリン酸化されており、前記断片は前記リン酸化セリン残基を含むことを特徴とするペプチド配列。
【請求項２】
以下の配列番号２の配列；
ＭＥＶＥＥＬＳｐＰＬＡＬＧＲ（配列番号２）
の配列を含むか、又はそれにより構成され、前記の７位のセリン残基はリン酸化されていることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド配列。
【請求項３】
以下のいずれかの１つの配列；
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ１であって、前記２３５位のセリン残基がリン酸化されている配列番号３の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２０８位のセリン残基がリン酸化されている配列番号４の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２４９位のセリン残基がリン酸化されている配列番号５の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２５９位のセリン残基がリン酸化されている配列番号６の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２８４位のセリン残基がリン酸化されている配列番号７の配列、
を含むか、又はそれにより構成されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のペプチド配列。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド配列を認識することのできるポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（但し、前記抗体は、２４９位のセリン残基がリン酸化されていない配列番号８の配列は認識しない）。
【請求項５】
請求項２で定義した配列番号２の配列を認識することのできるポリクローナル抗体（但し、前記抗体は２４９位のセリン残基がリン酸化されていない配列番号８の配列は認識しない）。
【請求項６】
以下の工程；
−ハイブリドーマを得るために、請求項２に記載のペプチド配列の注射による免疫動物、特にヒトでないあらかじめ免疫した動物のミエローマと、動物、特にヒトでない動物、の脾臓細胞とを融合する工程、
−この様にして得られたハイブリドーマを培養する工程、
−前記工程において得られ、そして請求項２に記載のペプチド配列に対する抗体を分泌するハイブリドーマから選択されたハイブリドーマのクローニングによる回収及び精製の工程、
を含むことを特徴とする、特に請求項２で定義された配列番号２のペプチド配列に対する、請求項４のモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項７】
抗体の全体又は一部をコードするｃＤＮＡの発現バンクから選択する工程であって、前記抗体が、ＥＬＩＳＡ法においてか、タンパク質転移によりか、又は任意の他の適当な方法により、免疫に用いられた請求項１〜３のいずれか一項に記載のリン酸化ペプチドを認識するが、非リン酸化ペプチドは認識しない能力に基づき選択される抗体である工程を含むことを特徴とする、請求項４に記載のモノクローナル抗体、特には請求項２で定義した配列番号２のペプチド配列に対するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド配列、又は請求項４若しくは５に記載の抗体を、薬剤学的に許容可能な媒体と組み合わせて、活性成分として含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
過剰増殖性疾患、例えば癌の治療目的の薬剤を製造するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド配列、又は請求項４若しくは５に記載の抗体の使用。
【請求項１０】
培養細胞からの、又は健常若しくは癌組織の切片からの、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド配列を発現する有糸分裂細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出用方法を実施するための、請求項４又は５に記載の抗体の利用。
【請求項１１】
培養細胞におけるか、又は健常若しくは癌組織の切片、特に乳癌、肺癌あるいは膵臓癌組織の切片における、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質配列の過剰発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出用方法を実施するための、請求項４又は５に記載の抗体の使用。
【請求項１２】
有糸分裂阻害化合物（すなわち、有糸分裂の開始又はその進行を阻害する化合物）のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法であって、前記阻害化合物は、特に抗癌療法のフレームワークで使用されることができ、
−前記化合物と細胞を一緒にすること、及び
−適当な方法、特にＥＬＩＳＡ、タンパク質転移（ウェスタン・ブロット）、又は間接免疫蛍光技術を用いることによって請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド配列を認識することのできる抗体である、請求項４又は５に記載の抗体との結合の欠如を検出することによる阻害化合物の選択、
を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１】
以下の配列番号１の配列；
ＤＲＫＭＥＶＥＥＬＳｐＰＬＡＬＧＲＦＳＬ（配列番号１）
に由来するアミノ酸少なくとも約１０個の断片を含むか、又はその断片により構成され、１０位のセリン残基はリン酸化されており、前記断片は前記リン酸化セリン残基を含むことを特徴とするペプチド配列。
【請求項２】
以下の配列番号２の配列；
ＭＥＶＥＥＬＳｐＰＬＡＬＧＲ（配列番号２）
の配列を含むか、又はそれにより構成され、前記の７位のセリン残基はリン酸化されていることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド配列。
【請求項３】
以下のいずれかの１つの配列；
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ１であって、前記２３５位のセリン残基がリン酸化されている配列番号３の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２０８位のセリン残基がリン酸化されている配列番号４の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２４９位のセリン残基がリン酸化されている配列番号５の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２５９位のセリン残基がリン酸化されている配列番号６の配列、
−ヒト由来ＣＤＣ２５Ｂホスファターゼタンパク質のスプライシング変異体ＣＤＣ２５Ｂ２であって、前記２８４位のセリン残基がリン酸化されている配列番号７の配列、
を含むか、又はそれにより構成されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のペプチド配列。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド配列を認識することのできるポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（但し、前記抗体は、２４９位のセリン残基がリン酸化されていない配列番号８の配列は認識しない）。
【請求項５】
請求項２で定義した配列番号２の配列を認識することのできるポリクローナル抗体（但し、前記抗体は２４９位のセリン残基がリン酸化されていない配列番号８の配列は認識しない）。
【請求項６】
以下の工程；
−ハイブリドーマを得るために、請求項２に記載のペプチド配列の注射による免疫動物、特にヒトでないあらかじめ免疫した動物のミエローマと、動物、特にヒトでない動物、の脾臓細胞とを融合する工程、
−この様にして得られたハイブリドーマを培養する工程、
−前記工程において得られ、そして請求項２に記載のペプチド配列に対する抗体を分泌するハイブリドーマから選択されたハイブリドーマのクローニングによる回収及び精製の工程、
を含むことを特徴とする、特に請求項２で定義された配列番号２のペプチド配列に対する、請求項４のモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項７】
抗体の全体又は一部をコードするｃＤＮＡの発現バンクから選択する工程であって、前記抗体が、ＥＬＩＳＡ法においてか、タンパク質転移によりか、又は任意の他の適当な方法により、免疫に用いられた請求項１〜３のいずれか一項に記載のリン酸化ペプチドを認識するが、非リン酸化ペプチドは認識しない能力に基づき選択される抗体である工程を含むことを特徴とする、請求項４に記載のモノクローナル抗体、特には請求項２で定義した配列番号２のペプチド配列に対するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド配列、又は請求項４若しくは５に記載の抗体を、薬剤学的に許容可能な媒体と組み合わせて、活性成分として含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
過剰増殖性疾患、例えば癌の治療目的の薬剤を製造するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド配列、又は請求項４若しくは５に記載の抗体の使用。
【請求項１０】
培養細胞からの、又は健常若しくは癌組織の切片からの、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド配列を発現する有糸分裂細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出用方法を実施するための、請求項４又は５に記載の抗体の利用。
【請求項１１】
培養細胞におけるか、又は健常若しくは癌組織の切片、特に乳癌、肺癌あるいは膵臓癌組織の切片における、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質配列の過剰発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出用方法を実施するための、請求項４又は５に記載の抗体の使用。
【請求項１２】
有糸分裂阻害化合物（すなわち、有糸分裂の開始又はその進行を阻害する化合物）のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法であって、前記阻害化合物は、特に抗癌療法のフレームワークで使用されることができ、
−前記化合物と細胞を一緒にすること、及び
−適当な方法、特にＥＬＩＳＡ、タンパク質転移（ウェスタン・ブロット）、又は間接免疫蛍光技術を用いることによって請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド配列を認識することのできる抗体である、請求項４又は５に記載の抗体との結合の欠如を検出することによる阻害化合物の選択、
を含むことを特徴とする前記方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５１５７７９（Ｐ２００８−５１５７７９Ａ）
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２８９２１（Ｐ２００７−５２８９２１）
【出願日】平成１７年８月２３日（２００５．８．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００２１２６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２４７９６
【国際公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【出願人】（５０５４０９２４７）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ シアンティフィク (16)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月２３日（２００５．８．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００２１２６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２４７９６
【国際公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【出願人】（５０５４０９２４７）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ シアンティフィク (16)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]